CN114072157A - 工程化的嵌合融合蛋白组合物及其使用方法 - Google Patents

工程化的嵌合融合蛋白组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了用于制备和使用工程化吞噬细胞的组合物和方法，所述工程化吞噬细胞表达具有增强的吞噬活性的嵌合抗原受体，用于癌症或感染的免疫治疗。

Description

工程化的嵌合融合蛋白组合物及其使用方法
交叉引用
本申请要求2019年4月30日提交的美国临时申请号62/841,190、2019年4月30日提交的美国临时申请号62/841,183、2020年3月23日提交的美国非临时申请号16/827,381和2020年3月23日提交的美国非临时申请号16/827,302的权益，每个申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
细胞免疫疗法是一种很有前景的新技术，可用于对抗难以治疗的疾病，例如癌症和持续感染以及对其他形式的治疗难以治愈的某些疾病。CAR-T细胞的发现及其在免疫治疗中的潜在用途取得了重大突破。CAR-T细胞是表达嵌合抗原受体的T淋巴细胞，嵌合抗原受体有助于将T细胞靶向特定的患病细胞，例如癌细胞，并且取决于所使用的胞内结构域和共表达的免疫抑制细胞因子可以诱导旨在杀死靶癌细胞或免疫抑制和/或耐受的细胞毒反应。然而，在这个过程中有几个限制减缓了CAR-T细胞的进展，并削弱了其在临床试验中的前景。
了解CAR-T细胞的局限性是利用该技术并继续创新以获得更好的免疫治疗模型的关键。具体地，在T细胞恶性肿瘤中，CAR-T细胞似乎面临着一个主要问题。CAR-T细胞和恶性T细胞在大多数T细胞淋巴瘤(TCL)中共享表面抗原，因此，CAR-T细胞与癌细胞一样受到细胞毒性的影响。在某些情况下，CAR-T产品可能会被恶性T细胞污染。此外，由于CAR-T细胞的长期存在，T细胞发育不全是一个潜在的问题。其他限制包括CAR-T细胞穿透实体瘤的能力较差，以及强大的肿瘤微环境会下调其抗肿瘤潜力。CAR-T细胞功能也受到免疫抑制性肿瘤微环境(TME)的负面影响，导致内源性T细胞失活和衰竭。
髓系细胞，包括巨噬细胞，是源自骨髓谱系的细胞，并且属于先天免疫系统。它们源自骨髓干细胞，骨髓干细胞会进入血液并迁移到组织中。它们的一些主要功能包括吞噬作用、T细胞反应的激活以及细胞碎片和胞外基质的清除。它们还在维持体内平衡以及引发和解决炎症方面发挥重要作用。此外，髓系细胞可以分化为许多下游细胞，包括巨噬细胞，根据它们从周围微环境中接收到的刺激类型，它们可以表现出从促炎到抗炎的不同反应。此外，组织巨噬细胞已被证明对其他免疫细胞类型(包括CDT效应细胞、NK细胞和T调节细胞)发挥广泛的调节和激活作用。巨噬细胞已被证明是恶性肿瘤中的主要免疫浸润，并已被证明对效应免疫浸润和功能具有广泛的免疫抑制影响。
髓系细胞是免疫系统的主要细胞区室，包括单核细胞、树突细胞、组织巨噬细胞和粒细胞。在过去的几年里，人们重新审视了髓系细胞的细胞个体发育、激活、分化和组织特异性功能的模型，并取得了令人惊讶的结果。然而，它们在体内平衡和疾病过程中的巨大适应性和异质性尚不清楚。尽管髓系细胞具有许多功能，包括吞噬作用及其激活T细胞的能力，但利用这些功能进行治疗用途仍然难以解决。因此，寻求使用其他细胞类型开发包括但不限于T细胞恶性肿瘤的改进的疗法的新途径。
工程化的髓系细胞在体内也可能寿命很短、表型多样、敏感、有适应性，并且通常难以在体外进行操作。例如，与非造血细胞中的外源基因表达相比，单核细胞中的外源基因表达一直很困难。与转染髓系细胞(例如，单核细胞/巨噬细胞)相关的技术困难很大。作为专职吞噬细胞，髓系细胞，如单核细胞/巨噬细胞，包含许多有效的降解酶，这些降解酶可以破坏核酸完整性并使基因转移到这些细胞中成为一个低效的过程。激活的巨噬细胞尤其如此，它们在暴露于免疫或炎症刺激后，其生理机能会发生巨大变化。这些细胞的病毒转导受到阻碍，因为巨噬细胞是通常不分裂的终末期细胞；因此，依赖于整合到复制基因组中的一些载体取得了有限的成功。此外，巨噬细胞对“危险信号”非常敏感，因此一些用于基因转移的原始病毒载体在这些细胞中诱导了有效的抗病毒反应，使这些载体不适用于基因传递。
发明内容
髓系细胞的多样化功能使它们成为理想的细胞疗法候选，可以工程化为具有多种治疗效果。本公开涉及使用免疫系统的髓系细胞(例如，CD14+细胞)，特别是吞噬细胞的免疫疗法。使用髓系细胞可以考虑许多治疗适应症。例如，髓系细胞免疫疗法在癌症、自身免疫、纤维化疾病和感染中可能极其重要。本公开涉及使用髓系细胞的免疫疗法，包括免疫系统的吞噬细胞，特别是巨噬细胞。本文公开的本发明的一个目的是利用髓系细胞的这些功能中的一种或多种用于治疗的用途。例如，本文公开的本发明的一个目的是利用髓系细胞(包括工程化髓系细胞)的吞噬活性用于治疗用途。例如，本文公开的本发明的一个目的是利用髓系细胞(包括工程化髓系细胞)促进T细胞激活的能力。例如，本文公开的本发明的一个目的是利用髓系细胞(包括工程化髓系细胞)促进杀肿瘤分子分泌的能力。例如，本文公开的本发明的一个目的是利用髓系细胞(包括工程化髓系细胞)促进免疫细胞和分子的募集和运输的能力。本公开提供了创新的方法和组合物，其可以成功地转染或转导髓系细胞，或以其他方式在髓系细胞中诱导基因修饰，目的是增加髓系细胞的功能方面，另外，不损害细胞的分化能力、成熟潜力和/或其适应性。
本公开涉及制造和使用工程化的髓系细胞(例如，CD14+细胞，例如巨噬细胞或其他吞噬细胞，其可以直接和/或间接地攻击和杀死(ATAK)患病细胞，例如癌细胞和受感染的细胞。工程化的髓系细胞，例如巨噬细胞和其他吞噬细胞，可以通过使用例如重组核酸技术、合成核酸、基因编辑技术(例如，CRISPR)、转导(例如，使用病毒构建体)、电穿孔或核转染将编码嵌合融合蛋白(CFP)的核酸序列(例如，mRNA、质粒、病毒构建体)掺入细胞中来制备，该嵌合融合蛋白具有对疾病相关抗原(例如，癌抗原)具有特异性的胞外结合结构域。已经发现，髓系细胞可以被工程化为具有广泛且多样的活性范围。例如，已经发现髓系细胞可以被工程化为表达含有抗原结合结构域的嵌合融合蛋白(CFP)以具有广泛且多样的活性范围。例如，已经发现髓系细胞可以被工程化为具有增强的吞噬活性，使得在CFP与靶细胞上的抗原结合后，该细胞表现出对靶细胞的吞噬作用增加。还发现，髓系细胞可以被工程化以促进T细胞激活，使得在CFP与靶细胞上的抗原结合后，该细胞促进T细胞的激活，例如肿瘤微环境中的T细胞。工程化的髓系细胞可以被工程化为促进杀肿瘤分子的分泌，使得在CFP与靶细胞上的抗原结合后，细胞促进附近细胞的杀肿瘤分子的分泌。工程化的髓系细胞可以被工程化为促进免疫细胞和分子的募集和运输，使得在CFP与靶细胞上的抗原结合后，该细胞促进免疫细胞和分子向靶细胞或肿瘤微环境的募集和运输。
本公开基于以下重要发现，即，工程化髓系细胞克服了CAR-T细胞的至少一些限制，包括容易被招募到实体瘤；具有可设计的生存时间，因此降低了导致发育不全和免疫缺陷的长期持续存在的风险；髓系细胞不能被T细胞污染；髓系细胞可以避免自相残杀，例如因为它们不表达与恶性T细胞相同的抗原；且髓系细胞具有大量可以部署的抗肿瘤功能。在某些方面，工程化的髓系衍生细胞可以成为更安全的免疫治疗工具，以靶向和破坏患病细胞。
此外，髓系细胞，如巨噬细胞，在肿瘤环境(TME)中无处不在，尤其是某些肿瘤类型中最丰富的细胞。作为它们在免疫系统中作用的一部分，髓系细胞如巨噬细胞自然地参与清除患病细胞。本发明也涉及利用髓系细胞功能，特别是靶向、杀死和直接和/或间接清除患病细胞以及递送有效载荷，例如抗原和细胞因子。
工程化的髓系细胞在体内也可能寿命很短、表型多样、敏感、有适应性，并且通常难以在体外进行操作。例如，与非造血细胞中的外源基因表达相比，单核细胞中的外源基因表达一直很困难。与转染髓系细胞(例如，单核细胞/巨噬细胞)相关的技术困难很大。作为专职吞噬细胞，髓系细胞，如单核细胞/巨噬细胞，包含许多有效的降解酶，这些降解酶可以破坏核酸完整性并使基因转移到这些细胞中成为一个低效的过程。激活的巨噬细胞尤其如此，它们在暴露于免疫或炎症刺激后，其生理机能会发生巨大变化。这些细胞的病毒转导受到阻碍，因为巨噬细胞是通常不分裂的终末期细胞；因此，依赖于整合到复制基因组中的一些载体取得了有限的成功。此外，巨噬细胞对“危险信号”非常敏感，因此一些用于基因转移的原始病毒载体在这些细胞中诱导了有效的抗病毒反应，使这些载体不适用于基因传递。本公开提供了创新的方法和组合物，其可以成功地转染或转导髓系细胞，或以其他方式在髓系细胞中诱导基因修饰，目的是增加髓系细胞的功能方面，另外，不损害细胞的分化能力、成熟潜力和/或其适应性。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指示通过引用并入一样。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别地阐述。通过参考以下详细描述和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了其中利用本发明的原理的说明性实施方案，在附图中：
图1A描绘了显示髓系细胞的一些潜在可工程化功能的图。
图1B描绘了表明在不同类型的癌症中存在各种细胞类型的图。巨噬细胞是所描述的癌症类型中最丰富的细胞。
图2A描绘了显示包含胞外结合结构域、跨膜结构域、第一胞内信号传导结构域和第二胞内信号传导结构域的示例性嵌合受体融合蛋白(CFP)的示意图。信号传导结构域可源自其他受体，并被设计为引发任何数量的细胞功能。
图2B描绘了显示包含胞外结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的示例性CFP(左图)和包含胞外结合结构域、跨膜结构域、第一胞内信号传导结构域、第二胞内信号传导结构域、第三胞内信号传导结构域和一个或多个另外的胞内信号传导结构域的CFP的示意图。信号传导结构域可源自其他受体，并被设计为引发任何数量的细胞功能。
图2C描绘了显示示例性CFP二聚体的示意图，所述CFP二聚体包含抗CD5胞外结合结构域、跨膜结构域和包含源自与PI3K募集结构域融合的FcRγ的胞内结构域的胞内信号传导结构域。
图2D描绘了显示示例性CFP二聚体的示意图，所述CFP二聚体包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和含有吞噬作用结构域、PI3K募集结构域和促炎症结构域的胞内信号传导结构域。
图3是描绘示例性CFP同二聚体以及示例性CFP异二聚体的示意图，在同二聚体中每个亚基包含与结合到单个靶标的scFv融合的胞外结构域(左图)，其中异二聚体的第一亚基包含与第一靶标结合的scFv融合的胞外结构域并且其中异二聚体亚基的第二亚基包含与第二靶标结合的scFv融合的胞外结构域(右图)。
图4A是描述编码包含与抗原特异性scFv融合的信号肽的CFP的示例性重组核酸的示意图，所述抗原特异性scFv与清道夫受体的胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TM)和胞内结构域融合。
图4B是描绘掺入髓系细胞的细胞膜内的图4A的CFP的示意图。所描绘的CFP包含与癌细胞的癌抗原结合的scFv。胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域可以源自一种或多种清道夫受体。
图4C是描绘用空载体(对照)或编码与载有染料的肿瘤细胞共培养的CFP的载体转导的人原代髓系细胞中相对吞噬作用的预期结果的示例性图。使用流式细胞术对吞噬作用进行量化。
图4D是描绘当以指定的效应细胞：靶细胞比例(E:T比)在用空载体(对照)或编码与表达荧光素酶的肿瘤细胞(靶细胞)共培养的CFP的载体转导的人原代髓系细胞(效应细胞)的存在下孵育时，肿瘤细胞的特异性裂解百分比的预期结果的示意性图。
图4E是描述在用空载体(对照)或编码CFP的载体转导的细胞处理后，小鼠异种移植肿瘤模型中存活百分比的预期结果的示例性图。
图5A是描述编码CFP(M1-CAR)的示例性重组核酸的示意图，所述CFP(M1-CAR)包含与抗原特异性scFv融合的信号肽，所述抗原特异性scFv与CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域和含有吞噬作用激活结构域和促炎结构域的胞内结构域融合。
图5B是描绘掺入髓系细胞的细胞膜内的图5A的CFP(M1-CAR)的示意图。所描绘的CFP包含与癌细胞的癌抗原结合的scFv。
图5C是描绘用空载体(对照)或编码与载有染料的肿瘤细胞共培养的CFP(M1-CAR)的载体转导的人原代髓系细胞中相对吞噬作用的预期结果的示例性图。使用流式细胞术量化吞噬作用。
图5D是描绘用载体对照或编码CFP(M1-CAR)的载体转导的髓系细胞中所述细胞因子的产量的倍数增加的预期结果的示例性图。
图5E是描绘用载体对照或编码CFP(M1-CAR)的载体转导的人原代髓系细胞中所述M1标志物的产量的倍数增加的预期结果的示例性图。
图5F是描绘当以指定的效应细胞：靶细胞比例(E:T比)在用空载体(对照)或编码与表达荧光素酶的肿瘤细胞(靶细胞)共培养的CFP(M1-CAR)的载体转导的人原代髓系细胞(效应细胞)的存在下孵育时肿瘤细胞特异性裂解百分比的预期结果的示意性图。使用荧光素酶测定法量化特异性裂解。
图5G是描述在用空载体(对照)或编码CFP(M1-CAR)的载体转导的人原代髓系细胞处理后小鼠异种移植肿瘤模型中存活百分比的预期结果的示例性图。
图6A是描述编码CFP(整合素-CAR)的示例性重组核酸的示意图，所述CFP(整合素-CAR)包含与抗原特异性scFv融合的信号肽，所述抗原特异性scFv与CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域和胞内吞噬作用激活结构域和胞内整合激活结构域融合。
图6B是描绘掺入髓系细胞的细胞膜内的图6A的CFP(整合素-CAR)的示意图。所描绘的CFP包含与癌细胞的癌抗原结合的scFv。
图6C是描绘用空载体(对照)或编码与载有染料的肿瘤细胞共培养的CFP(整合素-CAR)的载体转导的人原代髓系细胞中相对吞噬作用的预期结果的示例性图。使用流式细胞术量化吞噬作用。
图6D是描绘当以指定的效应细胞：靶细胞比例(E:T比)在用空载体(对照)或编码与表达荧光素酶的肿瘤细胞(靶细胞)共培养的CFP(整合素-CAR)的载体转导的人原代髓系细胞(效应细胞)的存在下孵育时肿瘤细胞特异性裂解百分比的预期结果的示意性图。
图6E是描绘用空载体(对照)或编码CFP(整合素-CAR)的载体转导的人原代髓系细胞中相对浸润的预期结果的示例性图。
图6F是描述在用空载体(对照)或编码CFP(整合素-CAR)的载体转导的人原代髓系细胞处理后小鼠异种移植肿瘤模型中存活百分比的预期结果的示例性图。
图7是描绘掺入髓系细胞的细胞膜内的CFP(交叉呈递-CAR)的示意图。所描绘的交叉呈递-CAR包含与癌细胞的癌抗原结合的scFv，该scFv与CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、胞内吞噬作用激活结构域和胞内交叉呈递激活结构域融合。交叉呈递-CAR可以将抗原引导至交叉呈递通路。
图8描绘了在髓系细胞中模拟表达或表达具有胞外结构域(ECD)和抗CD5 scFv的各种构建体之后的示例性流式细胞术数据(侧向散射(SSC)对CD5+)。所描绘的构建体包括含有抗-CD5 scFv的ECD，该抗-CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与CD40胞内结构域融合、与FcRγ胞内结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-CD40-FcR)；含有抗-CD5 scFv的ECD，该抗-CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合、与CD40胞内结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-FcR-CD40)；含有抗-CD5 scFv的ECD，该抗-CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合、与PI3K募集结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-FcR-PI3K)；含有抗-CD5scFv的ECD，该抗-CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-FcR)；含有抗-CD5 scFv的ECD，该抗-CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-无ICD)；含有抗-CD5 scFv的ECD，该抗-CD5 scFv与CD28铰链结构域融合，该CD28铰链结构域与CD28跨膜结构域融合，该CD28跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合，该FcRγ胞内结构域与PI3K募集结构域融合(CD5-CD28h-CD28tm-FcR-PI3K)；含有抗-CD5scFv的ECD，该抗-CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD68跨膜结构域融合，该CD68跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合，该FcRγ胞内结构域与PI3K募集结构域融合(CD5-CD8h-CD68tm-FcR-PI3K)；含有抗-CD5 scFv的ECD，该抗-CD5scFv与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合，该FcRγ胞内结构域与PI3K募集结构域融合(CD5-CD8tm-FcR-PI3K)；含有抗-CD5 scFv的ECD，该抗-CD5 scFv与CD28跨膜结构域融合，该CD28跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合，该FcRγ胞内结构域与PI3K募集结构域融合(CD5-CD28tm-FcR-PI3K)；和含有抗-CD5 scFv的ECD，该抗-CD5 scFv与CD68跨膜结构域融合，该CD68跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合，该FcRγ胞内结构域与PI3K募集结构域融合(CD5-CD68tm-FcR-PI3K)。
图9描绘了在髓系细胞中模拟表达或表达具有胞外结构域(ECD)和抗CD5 scFv的各种构建体之后的示例性流式细胞术数据(侧向散射(SSC)对抗-CD5 CFP+)。所描绘的构建体包括含有抗CD5 scFv的ECD，该抗CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合，该FcRγ胞内结构域与PI3K募集结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-FcR-PI3K)；含有抗CD5 scFv的ECD，该抗CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-FcR)；含有抗CD5 scFv的ECD，该抗CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-无ICD)；含有抗CD5scFv的ECD，该抗CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合，该FcRγ胞内结构域与CD40胞内结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-FcR-CD40)；和含有抗CD5 scFv的ECD，该抗CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与FcRγ胞内结构域融合，该FcRγ胞内结构域与TNFR2胞内结构域融合(CD5-CD8h-CD8tm-FcR-TNFR2)。
图10A描绘了示出使用FITC标记的珠的吞噬测定的示例性实验流程图的示意图，所述珠包被在由THP-1细胞中表达的FarRed荧光团标记的CFP靶向的抗原中。
图10B描绘了使用图10A的实验设计模拟表达或表达抗CD5 CFP后的示例性流式细胞术数据(侧向散射(SSC)对CSFE-FarRed)。
图10C描绘了显示使用图10A的实验设计，用空载体(模拟物)或编码所述CFP的载体转导的人原代髓系细胞中的相对吞噬作用的示例性图，所述CFP与包被有BSA或CD5的FITC标记的珠共培养。
图10D描绘了使用图10A的实验设计模拟表达或表达所示抗CD5CFP后所示的蛋白质浓度(pg/mL)的示例性条形图。每个CFP都包含含抗CD5 scFv的ECD，该抗CD5 scFv与CD8铰链结构域融合，该CD8铰链结构域与CD8跨膜结构域融合，该CD8跨膜结构域与指定的胞内结构域融合。
图10E描绘了测量在IL-10、IL-4和TGFβ的存在下孵育24小时然后与H9 T细胞淋巴瘤细胞孵育的表达抗CD5 CFP的原代人单核细胞中的M1相关标志物(CD16和MHC I类)的表达的示例性图。表达抗CD5CFP的原代人单核细胞在M2环境中表现出强大的活性。
图10F描绘了在IL-10、IL-4和TGFβ存在下孵育表达抗CD5嵌合抗原受体的原代人单核细胞24小时然后孵育H9 T细胞淋巴瘤细胞过夜后的TNF-α的浓度(pg/mL)的示例性条形图。表达抗CD5 CFP的原代人单核细胞能够在类似肿瘤微环境(TME)的条件下发挥作用以产生炎症介质。
图10G描绘了在IL-10、IL-4和TGFβ存在下孵育表达抗CD5 CFP的原代人单核细胞24小时然后孵育H9 T细胞淋巴瘤细胞过夜后指示的化学引诱剂(CCL3、CCL4、CXCL10和CXCL12)的浓度(pg/mL)的示例性条形图。表达抗CD5 CFP的原代人单核细胞能够起作用以分泌多种趋化因子，包括类似肿瘤微环境(TME)的条件中的T细胞化学引诱剂和NK细胞化学引诱剂。
图10H描绘了在IL-10、IL-4和TGFβ存在下孵育表达抗CD5 CFP的原代人单核细胞24小时然后孵育H9 T细胞淋巴瘤细胞过夜后指示的化学引诱剂(CCL8、CXCL1、嗜酸性粒细胞趋化因子和CCL5)的浓度(pg/mL)的示例性条形图。表达抗CD5 CFP的原代人单核细胞能够起作用以分泌多种趋化因子，包括激活多形核中性粒细胞(PMN)和嗜酸性粒细胞和白细胞化学引诱剂的趋化因子。
图11A描绘了示出使用CFSE标记的靶细胞的吞噬测定的示例性实验流程图的示意图，所述靶细胞被在THP-1细胞中表达的FarRed荧光团标记的CFP靶向。
图11B描绘了使用图11A的实验设计在THP-1细胞中模拟表达或表达抗CD5 CFP后的示例性流式细胞术数据(侧向散射(SSC)对正向散射(FSC)；CSFE对FarRed；和细胞计数对CSFE)。髓系细胞系用抗CD5 CFP电穿孔并用胞内FarRed染料标记。这些细胞与用CFSE预标记的H9 T细胞癌细胞以1:3的髓系细胞：肿瘤细胞比例孵育。4小时后，通过流式细胞术测量吞噬作用。
图11C描绘了显示了使用空载体(模拟物)或编码所述CFP的载体电穿孔并使用图11A的实验设计用胞内FarRed染料标记的髓系细胞系中的相对吞噬作用的示例性图。这些细胞与用CFSE预标记的H9 T细胞癌细胞以1:3的髓系细胞：肿瘤细胞比例孵育。4小时后，通过流式细胞术测量吞噬作用。
图12A描绘了示出使用pHRodo标记的靶细胞的吞噬测定的示例性实验流程图的示意图，所述靶细胞被在原代人单核细胞中表达的FarRed荧光团标记的CFP靶向。
图12B描绘了使用图12A的实验设计在原代人单核细胞中模拟表达或表达抗CD5CFP后的示例性流式细胞术数据(pHRodo对FarRed)。原代人单核细胞用抗CD5 CFP电穿孔并用胞内FarRed染料标记。这些细胞与用pHRodo预标记的H9 T细胞癌细胞孵育。孵育后，通过流式细胞术测量吞噬作用。
图12C描绘了量化图12B的结果的示例性图表，显示使用图12A的实验设计在原代人单核细胞中模拟表达或表达所述抗CD5 CFP后的相对吞噬作用。
图12D描绘了在进行基于珠的吞噬测定后在单核细胞中模拟表达或表达所示抗CD5 CFP后的所示的蛋白质浓度(pg/mL)的示例性条形图。
图13描绘了在指定的浓度下在没有细胞或表达抗CD5 CFP的THP-1细胞与CCL2孵育之后相对荧光单位(RFU)随时间变化的示例性图表。与对照相比的倍数增加描绘了CCL2诱导的趋化性与单独用测定缓冲液处理的细胞的比。图表中的每个条形代表两个重复孔的平均值±SD。
图14描绘了在指定的浓度下在没有细胞或表达抗CD5 CFP的原代人单核细胞细胞与CCL2孵育之后相对荧光单位(RFU)随时间变化的示例性图表。与对照相比的倍数增加描绘了CCL2诱导的趋化性与单独用测定缓冲液处理的细胞的比。图表中的每个条形代表两个重复孔的平均值±SD。
图15A描绘了显示外周T细胞淋巴瘤动物模型实验的示例性实验流程图的示意图。在肿瘤接种后第11天开始用指定量的表达抗CD5 CFP的人原代单核细胞进行治疗。IVIS成像用于测量肿瘤质量。
图15B描绘了根据图15A中所示实验在人原代单核细胞中表达抗CD5 CFP之后的示例性流式细胞术数据(侧向散射(SSC)对抗CD5CFP+)。
图15C描绘了根据图15A中所示实验用表达抗CD5 CFP的媒介物或人原代单核细胞处理的小鼠异种移植模型的示例性结果。在第0天，将NSG小鼠注射表达荧光素酶的CD5+肿瘤细胞。然后小鼠或者未被处理或被注射用抗CD5 CFP电穿孔的人原代单核细胞的指定方案。
图15D描绘了来自图15C的结果的相对肿瘤大小随时间变化的图表。荧光素酶荧光的IVIS成像用于测量肿瘤质量。
图16A描绘了显示外周T细胞淋巴瘤动物模型实验的示例性实验流程图的示意图。在肿瘤接种后第11天开始用指定量的表达抗CD5 CFP的人原代单核细胞进行治疗。
图16B描绘了根据图16A中所示实验在人原代单核细胞中表达抗CD5 CFP之后的示例性流式细胞术数据(侧向散射(SSC)对抗CD5CFP+)。数据显示实现了95％的转染效率。
图16C描绘了根据图16A所示的实验，相对肿瘤大小随时间变化的图表。荧光素酶荧光的IVIS成像用于测量肿瘤质量。
图16D描绘了根据图16A所示的实验，相对肿瘤大小随时间变化的图表。卡尺测量用于测量肿瘤质量。数据表明，在免疫受损的小鼠模型中，治疗与延迟的肿瘤进展和肿瘤质量的统计学显着减少有关。使用Bonferroni-Dunn方法(α＝0.5)确定统计显著性。每一行都单独分析，没有假设一致的SD。t检验次数：8或4。
图17A描绘了显示包含胞外结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自MDA5的第二胞内信号传导结构域的示例性CFP的示意图。
图17B描绘了显示在未转染的原代单核细胞(顶部)和用体外转录的mRNA转染的原代单核细胞中的表达的示例性流式细胞术数据(侧向散射(SSC)对抗CD5 CFP+)，所述mRNA编码包含胞外CD5结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自MDA5的第二胞内信号传导结构域的CFP。
图17C描绘了在未转染的原代单核细胞和用体外转录的mRNA转染的原代单核细胞中分泌的指定细胞因子的浓度(pg/mL)的示例性条形图，所述mRNA编码包含胞外CD5结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自MDA5的第二胞内信号传导结构域的CFP。
图18A描绘了显示包含胞外结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自TNFR1或TNFR2的第二胞内信号传导结构域的示例性嵌合受体融合蛋白(CFP)的示意图。
图18B描绘了示例性流式细胞术数据(侧向散射(SSC)对抗CD5CFP+)，其显示在以下细胞中的表达：未转染的原代单核细胞(左)；用体外转录的编码CFP的mRNA转染的原代单核细胞，所述CFP包含胞外CD5结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自TNFR1的第二胞内信号传导结构域(中间)；用体外转录的编码CFP的mRNA转染的原代单核细胞，该CFP包含胞外CD5结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自TNFR2的第二胞内信号传导结构域(右)。
图18C描绘了指定的细胞因子/趋化因子的浓度(pg/mL)的示例性条形图，该细胞因子/趋化因子在以下细胞中分泌：未转染的原代单核细胞；用体外转录的编码CFP的mRNA转染的原代单核细胞，所述CFP包含胞外CD5结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自TNFR1的第二胞内信号传导结构域CFP；用体外转录的编码CFP的mRNA转染的原代单核细胞，该CFP包含胞外CD5结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自TNFR2的第二胞内信号传导结构域。
图19A描绘了显示包含胞外结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自CD40、PI3K募集结构域或TNFR2的第二胞内信号传导结构域的CFP的示意图。
图19B描绘了显示M2刺激测定的示例性实验流程图的示意图。在被添加到未包被或包被重组CD5抗原的培养板中之前，将表达不同CFP构建体的原代单核细胞在M2条件(IL4、IL10、TGFβ)下培养24小时。将细胞在板上孵育24小时，并测量分泌到培养基中的各种细胞因子的量。
图19C描绘了指定的细胞因子/趋化因子(TNFα、IL8、IL1β、IP-10、Gro-α/KC、CCL3、CCL4、CCL5和CXCL12)的浓度(pg/mL)的示例性条形图，该细胞因子/趋化因子在以下细胞中分泌：未转染的原代单核细胞；用体外转录的编码CFP的mRNA转染的原代单核细胞，所述CFP包含胞外CD5结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自TNFR1的第二胞内信号传导结构域；用体外转录的编码CFP的mRNA转染的原代单核细胞，该CFP包含胞外结合结构域、跨膜结构域、衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和衍生自TNFR2的第二胞内信号传导结构域。CD5连接诱导了几种包括的促炎细胞因子和包括的趋化因子的上调。
图20A描绘了编码CFP的示例性慢病毒构建体的示意图，该CFP包含胞外HER2结合结构域(scFv)、胞外Flag标签、衍生自CD8的胞外铰链结构域、CD8跨膜结构域和(a)衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和包含PI3K募集结构域的第二胞内信号传导结构域、(b)衍生自MEGF10的第一胞内信号传导结构域和包含PI3K募集结构域的第二胞内信号传导结构域或(c)衍生自THP-1细胞中的CD3ζ的胞内信号传导结构域。还描绘了示例性流式细胞术数据(侧向散射(SSC)对Flag-PE)，显示在未转导的原代单核细胞或用所描绘的CFP构建体转导的原代单核细胞中的表达。
图20B描绘了显示吞噬作用测定的示例性实验流程图的示意图。
图20C描绘了使用图20B中描绘的吞噬作用测定，用图20A中描绘的慢病毒构建体转导的THP-1细胞的吞噬作用百分比的示例性条形图。将用或不用佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)激活的转导的THP-1细胞与FarRed标记的SKOV3肿瘤细胞一起孵育过夜。还描绘了显示吞噬作用的细胞的示例性荧光显微图像。
图20D描绘了在进行图20B中描绘的吞噬作用测定之后显示吞噬作用的示例性流式细胞术数据(FarRed对PE)。将用或不用PMA激活的转导的THP-1细胞与FarRed标记的SKOV3肿瘤细胞一起孵育过夜。
图20E描绘了在进行图20B中描绘的吞噬作用测定之后的示例性流式细胞术数据(SSC对FSC和FarRed对PE)。将用或不用PMA激活的转导的THP-1细胞与FarRed标记的SKOV3肿瘤细胞一起孵育过夜。还描绘了示例性条形图，其显示了通过下式
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计算的靶细胞的细胞死亡百分比。
图21A描绘了示出使用从健康供体Leukopak分离并用编码CFP的慢病毒载体转导的吞噬作用测定的示例性实验流程图的示意图，所述CFP包含胞外HER2结合结构域(scFv)、胞外Flag标签、衍生自CD8的胞外铰链结构域、CD8跨膜结构域和衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和包含PI3K募集结构域的第二胞内信号传导结构域。
图21B描绘了使用图21A中描述的吞噬作用测定，从健康供体Leukopak分离并用编码CFP的慢病毒载体转导的CD14+细胞的吞噬作用百分比的示例性条形图，所述CFP包含胞外HER2结合结构域(scFv)、胞外Flag标签、衍生自CD8的胞外铰链结构域、CD8跨膜结构域、和衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和包含PI3K募集结构域的第二胞内信号传导结构域。转导的细胞与靶细胞(Jurkat(HER2-)或SKOV3(HER2+))一起孵育过夜。还描绘了显示SKOV3细胞但不是Jurkat细胞的吞噬作用的细胞的示例性荧光显微图像。
图21C描绘了在进行图21A中描绘的吞噬作用测定之后显示吞噬作用的示例性流式细胞术数据(CSFE对PE)。从健康供体Leukopak分离的转导CD14+细胞与CFSE标记的HER2+SKOV3卵巢肿瘤细胞和CFSE标记的HER2-Jurkat细胞一起孵育过夜。还描绘了显示图21A中描绘的实验中靶细胞的细胞死亡百分比的示例性条形图。
图22A描绘了显示MSTO间皮瘤动物模型实验以研究CFP表达细胞穿透肿瘤部位和评估在穿透后CFP表达细胞的激活的能力的示例性实验流程图的示意图。
图22B描绘了显示在从健康供体Leukopak分离并用编码CFP的慢病毒载体转导的CFSE标记的CD14+细胞被施用给MSTO荷瘤NSG小鼠之后24小时移除的肿瘤样本的生物成像的荧光显微图像，该CFP包含胞外HER2结合结构域(scFv)、胞外Flag标签、衍生自CD8的胞外铰链结构域、CD8跨膜结构域和衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和包含PI3K募集结构域的第二胞内信号传导结构域。观察到转导的细胞迁移到肿瘤中并在肿瘤细胞周围积累。
图22C描绘了显示在从健康供体Leukopak分离并用编码CFP的慢病毒载体转导的CFSE标记的CD14+细胞被施用给MSTO荷瘤NSG小鼠之后24小时移除的脾脏样本的生物成像的荧光显微图像，该CFP包含胞外HER2结合结构域(scFv)、胞外Flag标签、衍生自CD8的胞外铰链结构域、CD8跨膜结构域和衍生自FcRγ的第一胞内信号传导结构域和包含PI3K募集结构域的第二胞内信号传导结构域。观察到转导的细胞迁移到脾脏中。还通过流式细胞术检查了在细胞输注后24小时从脾脏中分离的CFSE标记的细胞。脾脏中CFSE标记的细胞维持HLA、CD14和CD303的表达。有趣的是，观察到CCR2表达降低，同时CD370(CLEC9A)表达增加，这可能表明细胞迁移到脾脏中并发展成为能够刺激T细胞反应的专职APC。有趣的是，观察到CD206(甘露糖)表达与CD45一样降低。甘露糖受体表达的减少可能与分化为M1表型有关。
图23描绘了显示MSTO间皮瘤动物模型实验的示例性实验流程图的示意图。在肿瘤接种后第21天开始用指定量的表达抗HER2 CFP的人原代单核细胞进行治疗。IVIS成像用于测量肿瘤质量。
图24描绘了根据图23所示的实验，肿瘤大小随时间变化的图表。与对照处理的动物相比，表达抗HER2 CFP的人原代单核细胞的输注与肿瘤进展的延迟有关。
图25描绘了表明靶细胞CD47受体SIRP-α(SIRPα)介导的信号传导对吞噬细胞受体的抑制的图。
图26A描绘了重组显性阴性CFP构建体的设计的图形表示(上小图)，以及显示在巨噬细胞中表达的重组CFP蛋白对内源SIRPα的抑制的图形表示。CFP具有能够结合靶细胞中的CD47的胞外SIRPα结构域，SIRPαTM结构域，但缺乏胞内信号传导结构域。
图26B显示了对照和显性阴性CFP转导的细胞的相对吞噬作用的示例预期结果。
图26C显示了通过对照和显性阴性CFP转导的细胞(E:T，效应物：靶标)裂解靶细胞的示例预期结果。
图26D显示了在用显性阴性CFP转导的巨噬细胞治疗后，肿瘤模型中小鼠存活的示例预期结果。
图27A描绘了包含能够结合靶细胞中的CD47的SIRPa胞外结构域、SIRPa TM结构域但缺乏胞内SIRPa信号传导结构域的重组CFP、SIRPa-PI3K(上小图)的设计的图形表示。CFP在胞内末端与具有PI3-激酶(PI3K)结合结构域的胞内信号传导结构域融合。BD：结合结构域。下小图显示了显示在巨噬细胞中表达的重组CFP蛋白对内源SIRPα的抑制的图形表示。
图27B显示了对照和SIRPα-PI3K CFP转导的细胞的相对吞噬作用的预期结果的实例。
图27C显示了对照和SIRPα-PI3K CFP转导的细胞的相对Akt磷酸化的预期结果的实例。
图27D显示了与对照(空载体转导的)巨噬细胞相比，表达CFP(整合素-CAR)的细胞对肿瘤细胞的溶解增加的预期结果。
图27E显示在用SIRPα-PI3K CFP转导的巨噬细胞治疗后或无治疗对照的肿瘤的小鼠异种移植模型中的预期存活曲线。
图28A上小图描绘了包含能够结合CD47的SIRPa胞外结构域、SIRPa TM结构域但缺乏胞内SIRPa信号传导结构域的重组CFP、SIRPa-M1(上小图)的设计的图形表示。CFP包含具有促炎结构域的胞内信号传导结构域。下小图显示了当在髓系细胞(例如，巨噬细胞)中表达时显示重组CFP蛋白对内源SIRPα的抑制的图形表示。促炎结构域可以诱导M1极化。
图28B显示流式细胞术测定的预期结果的实例，显示与载体对照相比，当用SIRPa-M1转导髓系细胞(例如，巨噬细胞)时，M1状态标志物表达的增加。
图28C显示流式细胞术测定的预期结果的实例，显示与载体对照相比，当用SIRPa-M1转导髓系细胞(例如，巨噬细胞)时，促炎标志物的增加。
图28D显示了与对照(空载体转导的)髓系细胞(例如，巨噬细胞)相比，表达SIRPa-M1的细胞对肿瘤细胞的溶解增加的预期结果。
图28E显示在用SIRPa-M1转导的髓系细胞(例如，巨噬细胞)治疗后或无治疗对照的肿瘤的小鼠异种移植模型中的预期存活曲线。
图29A上小图描绘了基于受体的CFP、SIRPαβ的说明性示意图，其包含与SIRPαβ链融合的对癌抗原特异的胞外scFv。CD47受体SIRPα的胞外部分与对癌抗原特异性的scFv融合。SIRPα的ECD与SIRPβ的跨膜结构域融合。CFP的胞内结构域包含衍生自SIRPβ的胞内结构域。通过将scFv与靶配体结合而激活CFP会激活SIRPβ胞内结构域，其通过DAP12的激活触发靶细胞的吞噬作用。下小图显示了在髓系细胞(例如，巨噬细胞)中表达的重组SIRPαβ蛋白的图形表示。
图29B描绘了与载体对照相比吞噬细胞受体融合蛋白SIRPα的图形表示。
图29C显示了与对照(空载体转导的)巨噬细胞相比，SIRPα转导的巨噬细胞对靶细胞的裂解增加的预期结果。
图29D显示了描绘在用SIRPαβ转导的巨噬细胞治疗后或无治疗对照的肿瘤的小鼠异种移植模型中的存活曲线的预期结果。
图30A描绘了核酸构建体的说明性示意图，其包含调控元件序列、编码CFP的序列、编码T2A的序列和编码唾液酸酶的序列。T2A序列允许在翻译时从CFP上切割唾液酸酶。
图30B描绘了在分泌的唾液酸酶存在下靶细胞的增强的吞噬吞没的图形表示。
图30C描绘了显示在唾液酸酶存在下表达CFP的工程化髓系细胞对靶细胞的增强裂解的预期结果。
图30D描绘了编码唾液酸酶的核酸构建体的说明性示意图，其具有用于在激活的单核细胞(例如，巨噬细胞)中表达的调控元件。
图30E描绘了由于吞噬细胞中NF-κB(NF-κB)激活，靶细胞的增强的吞噬吞没的图形表示。NF-κB的激活激活了编码唾液酸酶的核酸构建体的表达。
图30F描绘了编码唾液酸酶的核酸构建体的说明性示意图，其在3’UTR具有调控元件。ARE结构域具有可用于构建体的靶向表达以及增加或减少mRNA半衰期的持续时间的RNA结合蛋白的结合序列基序。
图30G是由于表达图6F所示的唾液酸酶构建体，靶细胞的增强的吞噬吞没的图形表示。
图31A描绘了基于FcRα的CFP的说明性示意图(上小图)，其包含与FcRα链融合的对癌抗原特异的胞外scFv。FcRα链缺乏胞内结构域。跨膜结构域与内源Fcγ受体跨膜结构域三聚化用于在巨噬细胞中表达。通过将scFv与靶抗原结合激活CFP而激活FcRα-Fcγ受体，其触发靶细胞的吞噬作用。下小图显示了在髓系细胞(例如，巨噬细胞)中表达的重组FcRα-CFP的图形表示。
图31B描绘了与载体对照相比表达CFP(FcRα-CAR)的细胞的相对吞噬活性的图形表示。
图31C显示了与对照(空载体转导的)髓系细胞(例如，巨噬细胞)相比，CFP(FcRα-CAR)转导的髓系细胞(例如，巨噬细胞)对靶细胞的裂解增加的预期结果。
图31D显示了描述在用CFP(FcRα-CAR)转导的髓系细胞(例如，巨噬细胞)治疗后或无治疗对照的肿瘤的小鼠异种移植模型中的存活曲线的预期结果。
图32A描绘了CFP(TREM-CAR)的说明性示意图(上小图)，其包含与TREM 1/2/3的ECD融合的对癌抗原特异的胞外scFv。CFP包括TREM 1/2/3的TM和ICD。TREM的跨膜结构域与内源性DAP12跨膜结构域三聚化，其促进吞噬作用并调节炎症。通过将scFv与靶抗原结合激活CFP而激活TREM介导的内源DAP12信号传导，其触发靶细胞的吞噬作用。下小图显示了在髓系细胞(例如，巨噬细胞)中表达的重组CFP(TREM-CAR)的图形表示。
图32B描绘了与载体对照相比表达CFP(TREM-CAR)的细胞的相对吞噬活性的图形表示。
图32C显示了与对照(空载体转导的)髓系细胞(例如，巨噬细胞)相比，CFP(TREM-CAR)转导的髓系细胞(例如，巨噬细胞)对靶细胞的裂解增加的预期结果。
图32D显示了描述在用CFP(TREM-CAR)转导的髓系细胞(例如，巨噬细胞)治疗后或无治疗对照的肿瘤的小鼠异种移植模型中的存活曲线的预期结果。
图33A显示了半胱天冬酶-募集的CFP(半胱天冬酶-CAR)的说明性示意图。该构建体由从N端到C端的信号肽、抗原特异性scFv、铰链区(例如，来自CD8)、TM(例如，来自CD8)区、包含吞噬信号传导结构域的ITAM(例如，FcRγ)、用于双顺反子表达的T2A序列、SH2结构域、半胱天冬酶切割序列和半胱天冬酶原(上小图)。当转导到巨噬细胞中时，该构建体将共表达CFP和SH2-半胱天冬酶原。半胱天冬酶原在静息状态下被自抑制。肿瘤表面抗原与CAR受体的结合导致ITAM酪氨酸基序的磷酸化，导致SH2融合的半胱天冬酶原的募集。半胱天冬酶原的成簇导致自切割和激活。SH2和半胱天冬酶原之间的接头也将在识别位点被切割。激活的半胱天冬酶1/4/5驱动强烈的炎症(下小图)。
图33B显示了描绘当人原代髓系细胞(例如，巨噬细胞)与靶肿瘤细胞共培养时，与空载体相比，表达半胱天冬酶-募集的CFP(半胱天冬酶-CAR)的细胞中的炎症基因表达增加的预期结果。使用ELISA的细胞因子分析显示，与载体对照相比，促炎细胞因子和趋化因子的分泌增加。
图33C显示了描绘当人原代髓系细胞(例如，巨噬细胞)与靶肿瘤细胞共培养时，与空载体相比，表达半胱天冬酶-募集的CFP(半胱天冬酶-CAR)的细胞中促炎细胞表面标志物表达增加的预期的流式细胞术结果。
图33D显示了与对照(空载体转导的)髓系细胞(例如，巨噬细胞)相比，半胱天冬酶-募集的CFP(半胱天冬酶-CAR)转导的髓系细胞(例如，巨噬细胞)对靶肿瘤细胞的裂解增加的预期结果。
图33E显示了描绘在用半胱天冬酶-募集的CFP(半胱天冬酶-CAR)转导的巨噬细胞治疗后或无治疗对照的肿瘤的小鼠异种移植模型中的存活曲线的预期结果。
图34A描绘了CFP构建体的示例性模块化设计的图形表示。
图34B描绘了CFP构建体的示例性模块化设计的图形表示。
图34C描绘了CFP构建体的示例性模块化设计的图形表示。
具体实施方式
所有术语都旨在被理解为它们将被本领域技术人员理解。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与由本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。
尽管可以在单个实施方案的上下文中描述本公开的各种特征，但是也可以单独地或以任何合适的组合来提供这些特征。相反，尽管为了清楚起见可以在单独的实施方案的上下文中在本文中描述本公开，但是本公开也可以在单个实施方案中实施。
说明书中对“一些实施方案(some embodiments)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“一个实施方案(one embodiment)”或“其他实施方案(otherembodiments)”的引用是指结合实施方案描述的特征、结构或特性包括在至少一些实施方案中，但不必包括在本公开的所有实施方案中。
如在说明书和权利要求书中所用，词语“包括(comprising)”(和任何形式的包括(comprising)，例如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)，“具有(having)”(和任何形式的具有(having)，例如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(以及任何形式的包括(including)，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“包含(containing)”(以及任何形式的包含(containing)，例如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除另外未列举的元素或方法步骤。预期本说明书中所讨论的任何实施方案可以关于本公开的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本公开的组合物可用于实现本公开的方法。
如本文所用，术语“约”或“大约”在提及诸如参数、量、时距等可测量值时，意在涵盖与指定值相差+/-30％或更少、+/-20％或更少、+/-10％或更少、+/-5％或更少、或+/-1％或更少的变化，只要这样的变化适合在本公开中执行。应当理解，修饰语“约”或“大约”所指的值本身也被具体公开。
本文提供了工程化的髓系细胞(包括但不限于，嗜中性粒细胞、单核细胞、髓系树突细胞(mDC)、肥大细胞和巨噬细胞)，其被工程化为特异性结合靶细胞。工程化的髓系细胞可以直接(例如，通过吞噬作用)和/或间接(例如，通过激活T细胞)攻击和杀死靶细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。
虽然癌症是本公开中详细描述的一个示例性实施方案，但预期本文描述的方法和技术可用于靶向体内受感染或以其他方式患病的细胞。类似地，本文描述了使用工程化细胞的治疗组合物和疫苗组合物。
本文提供了用于治疗疾病或病症，例如癌症的组合物和方法。本文提供的组合物和方法利用人髓系细胞，包括但不限于嗜中性粒细胞、单核细胞、髓系树突细胞(mDC)、肥大细胞和巨噬细胞，以靶向患病细胞，例如癌细胞。本文提供的组合物和方法可用于通过多种机制消除患病细胞，例如癌细胞和/或患病组织，包括T细胞激活和募集、效应免疫细胞激活(例如，CD8 T细胞和NK细胞激活)、抗原交叉呈递、增强的炎症反应、调节性T细胞减少和吞噬作用。例如，髓系细胞可用于维持针对癌细胞的免疫反应。
本文提供了包含编码嵌合融合蛋白(CFP)，例如吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP)、清道夫受体(SR)融合蛋白(SFP)、整合素受体(IR)融合蛋白(IFP)或半胱天冬酶募集受体(半胱天冬酶-CAR)融合蛋白的重组核酸的组合物。由重组核酸编码的CFP可包含胞外结构域(ECD)，该胞外结构域包含与靶细胞的抗原结合的抗原结合结构域。胞外结构域可以与铰链结构域或衍生自受体的胞外结构域融合，所述受体为例如CD2、CD8、CD28、CD68、吞噬细胞受体、清道夫受体或整合素受体。重组核酸编码的CFP还可包含跨膜结构域，例如衍生自CD2、CD8、CD28、CD68、吞噬细胞受体、清道夫受体或整合素受体的跨膜结构域。在一些实施方案中，由重组核酸编码的CFP还包含含胞内信号传导结构域的胞内结构域，例如衍生自吞噬细胞受体、清道夫受体或整合素受体的胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可包含一个或多个衍生自吞噬细胞受体、清道夫受体或整合素受体的胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可包含一个或多个胞内信号传导结构域，其促进吞噬活性、炎症反应、一氧化氮产生、整合素激活、增强的效应细胞迁移(例如，通过趋化因子受体表达)、抗原呈递和/或增强的交叉呈递。在一些实施方案中，CFP是吞噬细胞受体融合蛋白(PFP)。在一些实施方案中，CFP是吞噬细胞清道夫受体融合蛋白(PFP)。在一些实施方案中，CFP是整合素受体融合蛋白(IFP)。在一些实施方案中，CFP是炎症受体融合蛋白。在一些实施方案中，由重组核酸编码的CFP还包含含募集结构域的胞内结构域。例如，胞内结构域可包含一个或多个PI3K募集结构域、半胱天冬酶募集结构域或半胱天冬酶激活和募集结构域(CARD)。
本文提供了包含编码CFP的重组核酸的组合物，所述CFP包含吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基(例如，吞噬细胞受体融合蛋白(PFP))，其包含：(i)跨膜结构域，和(ii)包含吞噬细胞受体胞内信号传导结构域的胞内结构域；和对抗原特异的胞外抗原结合结构域，例如靶细胞的抗原或呈递在靶细胞上的抗原；其中跨膜结构域和胞外抗原结合结构域可操作地连接，使得抗原通过在吞噬细胞受体的胞内信号传导结构域中激活的融合受体的胞外抗原结合结构域与靶标结合。
本文提供了包含编码CFP的重组核酸序列的组合物，所述CFP包含吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基(例如，吞噬细胞受体融合蛋白(PFP))，其包含：PR亚基，PR亚基包含：跨膜结构域和包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和包含对靶细胞的抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；并且其中在CFP与靶细胞的抗原结合后，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的髓系细胞如嗜中性粒细胞、单核细胞、髓系树突细胞(mDC)、肥大细胞或巨噬细胞的杀伤或吞噬活性增加至少大于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％。
本文提供了包含编码CFP的重组核酸序列的组合物，所述CFP包含吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基(例如，吞噬细胞受体融合蛋白(PFP))，其包含：PR亚基，PR亚基包含：跨膜结构域和包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和包含对靶细胞的抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；并且其中在CFP与靶细胞的抗原结合后，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的髓系细胞如嗜中性粒细胞、单核细胞、髓系树突细胞(mDC)、肥大细胞或巨噬细胞的杀伤或吞噬活性增加至少1.1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍。
在一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：(a)包含重组多核酸的髓系细胞，例如嗜中性粒细胞、单核细胞、髓系树突细胞(mDC)、肥大细胞或巨噬细胞，其中重组多核酸包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列，CFP包括：(i)包含抗CD5结合结构域的胞外结构域，和(ii)与胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域；和(b)药学上可接受的载体；其中髓系细胞表达CFP并且与不表达CFP的髓系细胞相比，表达CD5的靶细胞的吞噬作用表现出至少1.1倍的增加。在一些实施方案中，CD5结合结构域是包含抗体的抗原结合片段、Fab片段、scFv结构域或sdAb结构域的CD5结合蛋白。在一些实施方案中，CD5结合结构域包含scFv，该scFv包含：(i)SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的可变重链(VH)序列；和(ii)SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的可变轻链(VL)序列。在一些实施方案中，CD5结合结构域包含scFv，该scFv包含SEQ ID NO:33或与SEQ ID NO:33具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，HER2结合结构域包含scFv，该scFv包含：(i)SEQ ID NO:8或与SEQID NO:8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的可变重链(VH)序列；和(ii)SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的可变轻链(VL)序列。在一些实施方案中，CD5结合结构域包含scFv，该scFv包含SEQID NO:32或与SEQ ID NO:32具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在一些实施方案中，CFP还包含胞内结构域，其中胞内结构域包含一个或多个胞内信号传导结构域，并且其中包含胞内结构域的野生型蛋白质不包含胞外结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域还包含衍生自CD8的铰链结构域，其中铰链结构域与跨膜结构域和抗CD5结合结构域可操作地连接。在一些实施方案中，胞外铰链结构域包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，CFP包含胞外结构域，该胞外结构域与SEQ ID NO:30或与SEQID NO:30具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的跨膜结构域融合。在一些实施方案中，CFP包含胞外结构域，该胞外结构域与SEQ ID NO:31或与SEQ ID NO:31具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的跨膜结构域融合。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6或29或与SEQ ID NO:6或29具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:18或与SEQ ID NO:18具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:34或与SEQ ID NO:34具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:19或与SEQ ID NO:19具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，CFP包含一个或多个包含吞噬信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，吞噬信号传导结构域包含衍生自除Megf10、MerTk、FcRα和Bai1之外的受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，吞噬信号传导结构域包含衍生自除Megf10、MerTk、FcR和Bai1之外的受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，吞噬信号传导结构域包含衍生自除CD3ζ之外的受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，吞噬信号传导结构域包含衍生自FcRγ、FcRα或FcRε的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，吞噬信号传导结构域包含衍生自CD3ζ的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CFP包含SEQ ID NO:3、20、27和28中的任一个或与SEQ ID NO:3、20、27和28中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域还包含促炎信号传导结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含PI3-激酶(PI3K)募集结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含SEQ ID NO:4或与SEQ IDNO:4具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域衍生自CD40的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CFP包含SEQ ID NO:21或与SEQ ID NO:21具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CFP包含SEQ ID NO:23或与SEQ IDNO:23具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CFP包含SEQ ID NO:14或与SEQ ID NO:14具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CFP包含SEQ ID NO:15或与SEQ ID NO:15具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CFP包含SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:16具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CFP包含SEQ ID NO:24或与SEQ ID NO:24具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CFP包含SEQ ID NO:25或与SEQ ID NO:25具有至少70％、75％、80％、85％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，CFP包括：(a)胞外结构域，该胞外结构域包括：(i)特异性结合CD5的scFv，和(ii)衍生自CD8的铰链结构域；衍生自CD28的铰链结构域或衍生自CD68的胞外结构域的至少一部分；(b)CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD2跨膜结构域或CD68跨膜结构域；和(c)包含至少两个胞内信号传导结构域的胞内结构域，其中所述至少两个胞内信号传导结构域包含：(i)衍生自FcRα、FcRγ或FcRε的第一胞内信号传导结构域，和(ii)第二胞内信号传导结构域：(A)包含PI3K募集结构域，或(B)衍生自CD40。在一些实施方案中，作为上述(c)的替代，CFP包含：包含至少两个胞内信号传导结构域的胞内结构域，其中所述至少两个胞内信号传导结构域包含：(i)衍生自吞噬细胞受体胞内结构域的第一胞内信号传导结构域，和(ii)衍生自清道夫受体吞噬细胞受体胞内结构域的第二胞内信号传导结构域，其包含：(A)包含PI3K募集结构域，或(B)衍生自CD40。可在表2中找到可从中衍生出胞内信号传导结构域的示例性清道夫受体。在一些实施方案中，CFP包含源自先天免疫受体的胞内信号传导结构域的胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，重组多核酸是mRNA。在一些实施方案中，重组多核酸是环状RNA。在一些实施方案中，重组多核酸是病毒载体。在一些实施方案中，重组多核酸通过病毒载体递送。
在一些实施方案中，髓系细胞是CD14+细胞、CD14+/CD16-细胞、CD14+/CD16+细胞、CD14-/CD16+细胞、CD14-/CD16-细胞、树突细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞，M1巨噬细胞或镶嵌髓系细胞/巨噬细胞/树突细胞。
在一个方面，本文提供了一种在有此需要的人类受试者中治疗癌症的方法，包括向人类受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含：(a)包含重组多核酸序列的髓系细胞，其中所述多核酸序列包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的序列，所述CFP包含：(i)包含抗CD5结合结构域的胞外结构域，和(ii)与胞外结构域可操作地连接的跨膜结构域；和(b)药学上可接受的载体；其中该髓系细胞表达CFP。
在一些实施方案中，在CFP与由受试者的靶癌细胞表达的CD5结合后，与不表达CFP的髓系细胞相比，该髓系细胞的杀伤或吞噬活性增加了大于20％。在一些实施方案中，人类受试者中的肿瘤生长受到抑制。
在一些实施方案中，癌症是CD5+癌症。在一些实施方案中，癌症是白血病、T细胞淋巴瘤或B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，抗CD5结合结构域是包含抗体的抗原结合片段、scFv结构域、Fab片段或sdAb结构域的CD5结合蛋白。在一些实施方案中，抗CD5结合结构域是结合CD5的蛋白质或其片段，例如CD5的配体(例如，CD5的天然配体)。
在一些实施方案中，CFP还包含胞内结构域，其中该胞内结构域包含一个或多个胞内信号传导结构域，其中一个或多个胞内信号传导结构域包含吞噬信号传导结构域并且其中包含胞内结构域的野生型蛋白质不包含胞外结构域。
在一些实施方案中，吞噬信号传导结构域包含衍生自除Megf10、MerTk、FcRα和Bai1之外的受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，吞噬信号传导结构域包含衍生自FcRγ、FcRα或FcRε的胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域还包含促炎信号传导结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含PI3-激酶(PI3K)募集结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含衍生自CD8的铰链结构域、衍生自CD28的铰链结构域或衍生自CD68的胞外结构域的至少一部分。
在一些实施方案中，CFP包括：(a)胞外结构域，该胞外结构域包括：(i)特异性结合CD5的scFv，和(ii)衍生自CD8的铰链结构域；衍生自CD28的铰链结构域或衍生自CD68的胞外结构域的至少一部分；(b)CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD2跨膜结构域或CD68跨膜结构域；和(c)包含至少两个胞内信号传导结构域的胞内结构域，其中所述至少两个胞内信号传导结构域包含：(i)衍生自FcRγ或FcRε的第一胞内信号传导结构域，和(ii)第二胞内信号传导结构域，其：(A)包含PI3K募集结构域，或(B)衍生自CD40。在一些实施方案中，重组核酸是mRNA或环状RNA。在一些实施方案中，髓系细胞是CD14+细胞、CD14+/CD16-细胞、CD14+/CD16+细胞、CD14-/CD16+细胞、CD14-/CD16-细胞、树突细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞，M1巨噬细胞或镶嵌髓系细胞/巨噬细胞/树突细胞。
在一些实施方案中，该方法还包括施用另外的治疗剂，该另外的治疗剂选自CD47激动剂、抑制Rac的试剂、抑制Cdc42的试剂、抑制GTP酶的试剂、促进F-肌动蛋白分解的试剂、促进PI3K募集到PFP的试剂、促进PI3K活性的试剂、促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的试剂、促进ARHGAP12活性的试剂、促进ARHGAP25活性的试剂、促进SH3BP1活性的试剂、促进初级和/或次级淋巴器官中淋巴细胞隔离的试剂、增加次级淋巴器官中幼稚T细胞和中枢记忆T细胞浓度的试剂以及其任意组合。
在一些实施方案中，髓系细胞还包含：(a)与CFP二聚化的内源肽或蛋白质，(b)与CFP二聚化的非内源肽或蛋白质；(c)第二重组多核酸序列，其中该第二重组多核酸序列包含编码与CFP相互作用的肽或蛋白质的序列；其中与不表达CFP的髓系细胞相比，二聚化或相互作用增强表达CFP的髓系细胞的吞噬作用。
在一些实施方案中，髓系细胞表现出(i)效应活性、交叉呈递、呼吸爆发、ROS产生、iNOS产生、炎症介质、胞外囊泡产生、磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生、表达抗原的靶细胞的胞啃作用、对CD47介导的吞噬作用抑制的抗性、对LILRB1介导的吞噬作用抑制的抗性、或其任意组合；和/或(ii)IL-1、IL3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-23、TNFα、细胞因子的TNF家族、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL-17、IP-10、RANTES、干扰素、MHC I类蛋白、MHC II类蛋白、CD40、CD48、CD58、CD80、CD86、CD112、CD155、TRAIL/TNF家族死亡受体、TGFβ、B7-DC、B7-H2、LIGHT、HVEM、TL1A、41BBL、OX40L、GITRL、CD30L、TIM1、TIM4、SLAM、PDL1、MMP(例如，MMP2、MMP7和MMP9)或其任何组合的表达的增加。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自吞噬细胞或栓系受体，或者其中胞内信号传导结构域包含吞噬激活结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcR-α或Bai1的吞噬细胞受体之外的受体。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自蛋白质，例如受体(例如，吞噬细胞受体)，选自：TNFR1、MDA5、CD40、凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fcα受体I、CR1、CD35、CD3ζ、补体受体、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4和CD169。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自含有ITAM结构域的受体。
本文提供了一种组合物，其包含编码CFP的重组核酸，例如吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)，其包含：PR亚基，该PR亚基包含：跨膜结构域，和包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和包含对靶细胞的抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；并且其中胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcRα或Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体。
在一些实施方案中，在CFP与靶细胞的抗原结合后，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞的杀伤活性增加至少大于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％。在一些实施方案中，当CFP在细胞中表达时，CFP功能性地掺入细胞的细胞膜中。在一些实施方案中，在CFP与靶细胞的抗原结合后，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞的杀伤活性增加至少1.1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自受体(例如，吞噬细胞受体)，选自：TNFR1、MDA5、CD40、凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fcα受体I、CR1、CD35、CD3ζ、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4和CD169。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。
本文提供了一种组合物，其包含编码CFP的重组核酸，例如吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)，其包含：PR亚基，该PR亚基包含：跨膜结构域，和包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和包含对靶细胞的抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；并且其中胞内信号传导结构域衍生自受体，例如吞噬细胞受体，选自TNFR1、MDA5、CD40、凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fcα受体I、CR1、CD35、CD3ζ、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4和CD169。
在一些实施方案中，在CFP与靶细胞的抗原结合后，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞的杀伤活性增加至少大于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcRα或Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含PI3K募集结构域，例如衍生自CD19的PI3K募集结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
本文提供了一种组合物，其包含编码CFP的重组核酸，例如吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)，其包含：PR亚基，该PR亚基包含：跨膜结构域，和包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和包含对靶细胞的抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；并且其中细胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
本文提供了一种工程化CFP的组合物，该工程化CFP为例如吞噬细胞受体融合蛋白，其可以在细胞(例如，髓系细胞)中表达，例如以产生可以靶向靶细胞的工程化髓系细胞，例如患病细胞。
靶细胞是例如，癌细胞。在一些实施方案中，工程化的髓系细胞在癌细胞吞没后可在其细胞表面呈递癌抗原以激活T细胞。“抗原”是能够刺激免疫反应的分子。T细胞识别的抗原，无论是辅助性T淋巴细胞(辅助性(TH)细胞)还是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，都不会被识别为完整的蛋白质，而是被识别为在细胞表面上与MHC蛋白(例如，I类或II类MHC蛋白)缔合的小肽。在自然发生的免疫反应过程期间，与抗原呈递细胞(APC)上的II类MHC分子相关联被识别的抗原从胞外获得、内化并加工成与II类MHC分子相关联的小肽。
在一些实施方案中，在CFP与靶细胞的抗原结合后，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞的杀伤活性增加至少大于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％。在一些实施方案中，当CFP在细胞中表达时，CFP功能性地掺入细胞的细胞膜中。在一些实施方案中，在CFP与靶细胞的抗原结合后，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞的杀伤活性增加至少1.1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍。
在一些实施方案中，表达抗原的靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，表达抗原的靶细胞的直径为至少0.8微米。
在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出表达抗原的靶细胞的吞噬作用增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出表达抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少1.1倍。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出表达抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍或50倍。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出细胞因子产生的增加。在一些实施方案中，细胞因子选自IL-1、IL3、IL-6、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素及其组合。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出效应活性的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出交叉呈递的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出MHC II类蛋白的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出CD80的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出CD86的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出MHC I类蛋白的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出TRAIL/TNF家族死亡受体的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出B7-H2的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出LIGHT的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出HVEM的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出CD40的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出TL1A的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出41BBL的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出OX40L的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出GITRL死亡受体的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出CD30L的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出TIM4的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出TIM1配体的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出SLAM的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出CD48的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出CD58的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出CD155的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出CD112的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出PDL1的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出B7-DC的表达的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出呼吸爆发的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出ROS产生的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出iNOS产生的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出iNOS产生的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出胞外囊泡产生的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出表达抗原的靶细胞的胞啃作用增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出对CD47介导的吞噬作用抑制的抗性的增加。在一些实施方案中，与不表达CFP的细胞相比，表达CFP的细胞表现出对LILRB1介导的吞噬作用抑制的抗性的增加。在一些实施方案中，表达CFP的细胞表现出磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的增加。
在一些实施方案中，CFP的胞外结构域包含Ig结合结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、FcRγI、FcRγIIA、FcRγIIB、FcRγIIC、FcRγIIIA、FcRγIIIB、FcRn、TRIM21、FcRL5结合结构域。在一些实施方案中，CFP的胞外结构域包含FcR胞外结构域。在一些实施方案中，CFP的胞外结构域包含FcRα、FcRβ、FcRε或FcRγ胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含FcRα(FCAR)胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含FcRβ胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含FCER1A胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含FDGR1A、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A或FCGR3B胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含整合素结构域或整合素受体结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含一种或多种整合素α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7或β8结构域。
在一些实施方案中，CFP还包含与跨膜结构域和胞外抗原结合结构域可操作地连接的胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域还包含受体、铰链、间隔区和/或接头的胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含吞噬细胞受体的胞外部分。在一些实施方案中，CFP的胞外部分衍生自与从中衍生胞内信号传导结构域的受体相同的受体。在一些实施方案中，胞外结构域包含清道夫受体的胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白结构域包含免疫球蛋白的胞外结构域或免疫球蛋白铰链区。在一些实施方案中，胞外结构域包含吞噬吞没结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含能够进行多聚体组装的结构。在一些实施方案中，胞外结构域包含用于多聚化的支架。在一些实施方案中，胞外结构域的长度为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。在一些实施方案中，胞外结构域的长度为至多500、400、300、200或100个氨基酸。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域与靶细胞的抗原特异性结合。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含抗体结构域。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含受体结构域、抗体结构域，其中该抗体结构域包含功能性抗体片段、单链可变片段(scFv)、Fab、单域抗体(sdAb)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、VNAR结构域、VHH结构域、双特异性抗体、双抗体或其功能片段或组合。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含配体、受体的胞外结构域或衔接子。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含对单一抗原特异的单一胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含至少两个胞外抗原结合结构域，其中至少两个胞外抗原结合结构域中的每一个对不同抗原具有特异性。
在一些实施方案中，抗原是癌症相关抗原、谱系相关抗原、病原抗原或自身免疫抗原。在一些实施方案中，抗原包括病毒抗原。在一些实施方案中，抗原是T淋巴细胞抗原。在一些实施方案中，抗原是胞外抗原。在一些实施方案中，抗原是胞内抗原。在一些实施方案中，抗原选自来自胸苷激酶(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、粘蛋白-1、粘蛋白-16(MUC16)、MUC1、表皮生长因子受体vIII(EGFRvIII)、间皮素、人表皮生长因子受体2(HER2)、EBNA-1、LEMD1、磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原(CEA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、卵泡刺激素受体、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、促红细胞生成素生成性肝细胞癌A2(EphA2)、EphB2、自然杀伤基团2D(NKG2D)配体、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD45、CD56CD79b、CD97、CD117、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD213A2、CD248、CD276、PSCA、CS-1、CLECL1、GD3、PSMA、FLT3、TAG72、EPCAM、IL-1、整合素受体、PRSS21、VEGFR2、PDGFRβ、SSEA-4、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、GM3、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、Dsg1、Dsg3、IGLL1及其组合的抗原。在一些实施方案中，抗原是选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CCR4、CD8、CD30、CD45和CD56的蛋白质的抗原。在一些实施方案中，抗原是卵巢癌抗原或T淋巴瘤抗原。在一些实施方案中，抗原是整合素受体的抗原。在一些实施方案中，抗原是整合素受体或选自α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8的整合素的抗原。在一些实施方案中，抗原是整合素受体配体的抗原。在一些实施方案中，抗原是纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白的抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域可以结合两种或更多种不同的抗原。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含自身抗原或其片段，例如Dsg1或Dsg3。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含受体结构域或抗体结构域，其中该抗体结构域结合自身抗原，例如Dsg1或Dsg3。
在一些实施方案中，跨膜结构域和胞外抗原结合结构域通过接头可操作地连接。在一些实施方案中，跨膜结构域和胞外抗原结合结构域通过诸如CD8α、IgG1或IgG4的铰链区的接头可操作地连接。
在一些实施方案中，胞外结构域包含多聚化支架。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD68跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD2跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcR跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcRγ跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcRα跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcRβ跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcRε跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包括来自突触融合蛋白，例如突触融合蛋白3或突触融合蛋白4或突触融合蛋白5的跨膜结构域。在一些实施方案中，当CFP在细胞中表达时，跨膜结构域与内源性受体的跨膜结构域寡聚化。在一些实施方案中，当CFP在细胞中表达时，跨膜结构域与外源性受体的跨膜结构域寡聚化。在一些实施方案中，当CFP在细胞中表达时，跨膜结构域与内源性受体的跨膜结构域二聚化。在一些实施方案中，当CFP在细胞中表达时，跨膜结构域与外源性受体的跨膜结构域二聚化。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自与从其衍生出胞内信号传导结构域的蛋白质不同的蛋白质。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自与从其衍生出胞外结构域的蛋白质不同的蛋白质。在一些实施方案中，跨膜结构域包括吞噬细胞受体的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域和胞外结构域衍生自相同的蛋白质。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自与胞内信号传导结构域相同的蛋白质。在一些实施方案中，重组核酸编码DAP12募集结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与DAP12寡聚化的跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域的长度为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，跨膜结构域的长度为至多12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含衍生自吞噬细胞受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括衍生自除选自Megf10、MerTk、FcRα或Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括衍生自选自：TNFR1、MDA5、CD40、凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fc-α受体I、CR1、CD35、CD3ζ、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4和CD169的吞噬细胞受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含PI3K募集结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含衍生自清道夫受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包括CD47抑制结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含Rac抑制结构域、Cdc42抑制结构域或GTP酶抑制结构域。在一些实施方案中，Rac抑制结构域、Cdc42抑制结构域或GTP酶抑制结构域在表达PFP的细胞的吞噬杯处抑制Rac、Cdc42或GTP酶。在一些实施方案中，胞内结构域包含F-肌动蛋白分解激活结构域、ARHGAP12激活结构域、ARHGAP25激活结构域或SH3BP1激活结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包括磷酸酶抑制结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包括ARP2/3抑制结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包括至少一个ITAM结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个ITAM结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含至少一个ITAM结构域，该ITAM结构域选自CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b 1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列的ITAM结构域。在一些实施方案中，至少一个ITAM结构域包含Src家族激酶磷酸化位点。在一些实施方案中，至少一个ITAM结构域包括Syk募集结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含F-肌动蛋白解聚激活结构域。在一些实施方案中，胞内结构域缺乏酶活性。
在一些实施方案中，胞内结构域不包含衍生自CD3ζ胞内结构域的结构域。在一些实施方案中，胞内结构域不包含衍生自MerTK胞内结构域的结构域。在一些实施方案中，胞内结构域不包含衍生自TLR4胞内结构域的结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包括CD47抑制结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含激活整合素的结构域，例如PSGL-1的胞内区。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含激活Rap1 GTP酶的结构域，例如来自EPAC和C3G的结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自桩蛋白。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域激活粘着斑激酶。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自单个吞噬细胞受体。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自单个清道夫受体。在一些实施方案中，胞内结构域包含吞噬作用增强结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包含促炎信号传导结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含激酶激活结构域或激酶结合结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含IL-1信号传导级联激活结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含衍生自TLR3、TLR4、TLR7、TLR 9、TRIF、RIG-1、MYD88、MAL、IRAK1、MDA-5、IFN-受体、STING、NLRP家族成员、NLRP1-14、NOD1、NOD2、脓素、AIM2、NLRC4、FCGR3A、FCERIG、CD40、Tank1结合激酶(TBK)、半胱天冬酶结构域、半胱天冬酶原结合结构域或其任意组合的胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包含衍生自连接蛋白(Cx)蛋白的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可包含衍生自Cx43、Cx46、Cx37、Cx40、Cx33、Cx50、Cx59、Cx62、Cx32、Cx26、Cx31、Cx30.3、Cx31.1、Cx30、Cx25、Cx45、Cx47、Cx31.3、Cx36、Cx31.9、Cx39、Cx40.1或Cx23的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可以包含衍生自Cx43的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包含衍生自SIGLEC蛋白的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可以包括衍生自Siglec-1(唾液酸粘附素)、Siglec-2(CD22)、Siglec-3(CD33)、Siglec-4(MAG)、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-13、Siglec-14、Siglec-15、Siglec-16或Siglec-17的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包含衍生自C型凝集素蛋白的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可包含衍生自甘露糖受体蛋白的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可包含衍生自脱唾液酸糖蛋白受体蛋白的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可以包括衍生自巨噬细胞半乳糖型凝集素(MGL)、DC-SIGN(CLEC4L)、胰岛蛋白(CLEC4K)、髓系DAP12相关凝集素(MDL)-1(CLEC5A)，DC相关C型凝集素1(Dectin1)亚家族蛋白、dectin 1/CLEC7A、DNGR1/CLEC9A、髓系C型凝集素样受体(MICL)(CLEC12A)、CLEC2(CLEC1B)、CLEC12B、DC免疫受体(DCIR)亚家族蛋白、DCIR/CLEC4A、Dectin 2/CLEC6A、血液DC抗原2(BDCA2)(CLEC4C)、Mincle(巨噬细胞诱导C型凝集素)(CLEC4E)、NOD样受体蛋白、NOD样受体MHC II类反式激活因子(CIITA)、IPAF、BIRC1、RIG-I样受体(RLR)蛋白、RIG-I、MDA5、LGP2、NAIP5/Birc1e、NLRP蛋白、NLRP1、NLRP2、NLRP3、NLRP4、NLRP5、NLRP6、NLRP7、NLRP89、NLRP9、NLRP10、NLRP11、NLRP12、NLRP13、NLRP14、NLR蛋白、NOD1或NOD2，或其任意组合的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包含衍生自细胞粘附分子的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可包括衍生自IgCAM、钙粘蛋白、整合素、C型凝集素样结构域蛋白(CTLD)和/或蛋白聚糖分子的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可包含衍生自E-钙粘蛋白、P-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、R-钙粘蛋白、B-钙粘蛋白、T-钙粘蛋白或M-钙粘蛋白的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。例如，胞内结构域可包含衍生自选择素例如E-选择素、L-选择素或P-选择素的信号传导结构域，例如胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CFP不包含全长胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内结构域的长度为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。在一些实施方案中，胞内结构域的长度为至多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。
在一些实施方案中，重组核酸编码FcRα链胞外结构域、FcRα链跨膜结构域和/或FcRα链胞内结构域。在一些实施方案中，重组核酸编码FcRβ链胞外结构域、FcRβ链跨膜结构域和/或FcRβ链胞内结构域。在一些实施方案中，当在细胞中表达时，FcRα链或FcRβ链与FcRγ形成复合物。在一些实施方案中，当在细胞中表达时，FcRα链或FcRβ链与内源性FcRγ形成复合物。在一些实施方案中，FcRα链或FcRβ链不掺入不表达FcRγ的细胞的细胞膜中。在一些实施方案中，CFP不包含FcRα链胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CFP不包含FcRβ链胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，重组核酸编码TREM胞外结构域、TREM跨膜结构域和/或TREM胞内结构域。在一些实施方案中，TREM是TREM1、TREM 2或TREM 3。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码促炎多肽的序列。在一些实施方案中，组合物还包含促炎核苷酸或重组核酸中的核苷酸，例如ATP、ADP、UTP、UDP和/或UDP-葡萄糖。
在一些实施方案中，组合物还包含促炎多肽。在一些实施方案中，促炎多肽是趋化因子、细胞因子。在一些实施方案中，趋化因子选自IL-1、IL3、IL5、IL-6、il8、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES和干扰素。在一些实施方案中，细胞因子选自IL-1、IL3、IL5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES和干扰素。
在一些实施方案中，为递送将髓系细胞特异性靶向。使用特殊的可生物降解聚合物，如PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸)和/或聚乙烯醇(PVA))可以靶向髓系细胞。在一些实施方案中，一种或多种化合物可选择性地掺入此类聚合物结构中以影响髓系细胞功能。在一些实施方案中，靶向结构是多层的，例如由一层或多层PLGA和一层或多层PVA层构成。在一些实施方案中，靶向结构按照分层活性的顺序组装。在一些实施方案中，靶向聚合物结构被组织成特定形状的组分，例如可粘附到髓系细胞表面并递送一种或多种组分如生长因子和细胞因子的不稳定结构，例如以将髓系细胞维持在赋予特定的极化的微环境中。在一些实施方案中，聚合物结构使得它们不被髓系细胞吞噬，但它们可以保持粘附在表面上。在一些实施方案中，一种或多种生长因子可以是M1极化因子，例如细胞因子。在一些实施方案中，一种或多种生长因子可以是M2极化因子，例如细胞因子。在一些实施方案中，一种或多种生长因子可以是巨噬细胞激活细胞因子，例如IFNγ。在一些实施方案中，聚合物结构能够在体内环境如实体瘤中持续释放一种或多种生长因子。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码炎症稳态调节剂的序列。在一些实施方案中，炎症的稳态调节剂是mRNA的非翻译区(UTR)中的序列。在一些实施方案中，UTR中的序列是与RNA结合蛋白结合的序列。在一些实施方案中，当RNA结合蛋白与非翻译区(UTR)中的序列结合时，翻译被抑制或阻止。在一些实施方案中，UTR中的序列包含WWWU(AUUUA)UUUW的共有序列，其中W是A或U。在一些实施方案中，重组核酸在双顺反子载体上表达。
在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，靶细胞是人细胞。在一些实施方案中，靶细胞包括被病原体感染的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，即淋巴细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，即卵巢癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，即乳腺癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，即胰腺细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，即胶质母细胞瘤细胞。
在一些实施方案中，重组核酸是DNA。在一些实施方案中，重组核酸是RNA。在一些实施方案中，重组核酸是mRNA。在一些实施方案中，重组核酸是未修饰的mRNA。在一些实施方案中，重组核酸是修饰的mRNA。在一些实施方案中，重组核酸是环状RNA。在一些实施方案中，重组核酸是tRNA。在一些实施方案中，重组核酸是微小RNA。
本文还提供了包含编码本文所述CFP的重组核酸序列的载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，载体还包含与至少一种编码一种或多种多肽的核酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，载体是多顺反子的。在一些实施方案中，至少一个核酸序列中的每一个与单独的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，载体还包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，载体还包含位于编码一种或多种多肽的至少一种核酸序列侧翼的5'UTR和/或3'UTR。在一些实施方案中，载体还包含一个或多个调控区。
本文还提供了由本文所述组合物的重组核酸编码的多肽。
本文还提供了包含本文所述的组合物、本文所述的载体或本文所述的多肽的细胞。在一些实施方案中，细胞是噬菌细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞衍生细胞、髓系细胞、巨噬细胞、树突细胞、淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、小胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施方案中，细胞是自体细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，细胞是M1细胞。在一些实施方案中，细胞是M2细胞。在一些实施方案中，细胞是M1巨噬细胞。在一些实施方案中，细胞是M2巨噬细胞。在一些实施方案中，细胞是M1髓系细胞。在一些实施方案中，细胞是M2髓系细胞。
本文还提供了一种药物组合物，其包含本文所述的组合物，例如本文所述的重组核酸、本文所述的载体、本文所述的多肽或本文所述的细胞；和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，药物组合物还包含另外的治疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂选自CD47激动剂、抑制Rac的试剂、抑制Cdc42的试剂、抑制GTP酶的试剂、促进F-肌动蛋白分解的试剂、促进PI3K募集到PFP的试剂、促进PI3K活性的试剂、促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的试剂、促进ARHGAP12活性的试剂、促进ARHGAP25活性的试剂、促进SH3BP1活性的试剂及其任意组合。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂包括无血清培养基、脂质或纳米颗粒。
本文还提供了一种在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，包括向受试者施用本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是实体癌。在一些实施方案中，实体癌选自卵巢癌，合适的癌症包括卵巢癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌。在一些实施方案中，癌症是液体癌。在一些实施方案中，液体癌是白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，液体癌是T细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，疾病是T细胞恶性肿瘤。
在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂选自CD47激动剂、抑制Rac的试剂、抑制Cdc42的试剂、抑制GTP酶的试剂、促进F-肌动蛋白分解的试剂、促进PI3K募集到PFP的试剂、促进PI3K活性的试剂、促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的试剂、促进ARHGAP12活性的试剂、促进ARHGAP25活性的试剂、促进SH3BP1活性的试剂及其任意组合。
在一些实施方案中，施用包括输注或注射。在一些实施方案中，施用包括直接对实体癌施用。在一些实施方案中，施用包括基于环状RNA的递送程序、基于非颗粒封装的mRNA的递送程序、基于mRNA的递送程序、基于病毒的递送程序、基于颗粒的递送程序、基于脂质体的递送程序或基于外来体的递送程序。在一些实施方案中，在受试者中引发CD4+T细胞反应或CD8+T细胞反应。
本文还提供了一种制备细胞的方法，该方法包括使细胞与本文所述的组合物、本文所述的载体或本文所述的多肽接触。在一些实施方案中，接触包括转导。在一些实施方案中，接触包括化学转染、电穿孔、核转染或病毒感染或转导。
本文还提供了一种制备药物组合物的方法，包括将脂质与本文所述的组合物或本文所述的载体接触。在一些实施方案中，接触包括形成脂质纳米颗粒。
本文还提供了一种制备药物组合物的方法，包括使抗体与本文所述的组合物或本文所述的载体接触。在一些实施方案中，接触包括形成脂质纳米颗粒。
定义
“试剂”可以指任何细胞、小分子化合物、抗体或其片段、核酸分子或多肽。
“改变”或“变化”可以指增加或减少。例如，改变可以是增加或减少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％或40％、50％、60％，或甚至高达70％、75％、80％、90％或100％。例如，改变可以是增加或减少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍或40倍、50倍、60倍、甚至高达70倍、75倍、80倍、90倍或100倍。
如本文所用，“抗原呈递细胞”或“APC”包括专职抗原呈递细胞(例如，B淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞)，以及其他抗原呈递细胞(例如，角化细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞(脑)、胰腺β细胞和血管内皮细胞)。APC可以表达主要组织相容性复合体(MHC)分子，并可在其表面展示与MHC复合的抗原，其可以被T细胞识别并触发T细胞激活和免疫反应。专职抗原呈递细胞，尤其是树突细胞，在刺激幼稚T细胞方面发挥着关键作用。非专职抗原呈递细胞，如成纤维细胞，也可能有助于这一过程。APC还可以通过加工外源性抗原并将加工后的抗原呈递到I类MHC分子上来交叉呈递肽抗原。产生与I类MHC分子相关联而被识别的蛋白质的抗原通常是在细胞内产生的蛋白质，并且这些抗原被加工并与I类MHC分子相关联。
“生物样品”可以指衍生自生物体的任何组织、细胞、流体或其他材料。
术语“表位”可以指能够结合抗体或其结合片段、T细胞受体和/或抗体样分子的任何蛋白质决定簇，例如序列或结构或氨基酸残基。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。“T细胞表位”可以指被T细胞受体识别的肽或肽-MHC复合物。
工程化细胞，例如工程化髓系细胞，可以指在细胞中具有至少一种外源核酸序列的细胞，即使是瞬时表达的。表达外源核酸可以通过别处描述的各种方法进行，并且包括本领域已知的方法。本公开涉及制备和使用工程化细胞，例如工程化髓系细胞，例如工程化吞噬细胞。本公开尤其涉及包含编码例如，嵌合融合蛋白(CFP)的外源核酸的工程化细胞。
术语“免疫反应”包括但不限于T细胞介导的、NK细胞介导的和/或B细胞介导的免疫反应。这些反应可能受到T细胞共刺激和NK细胞共刺激的调节的影响。示例性免疫反应包括T细胞反应，例如细胞因子产生和细胞的细胞毒性。此外，免疫反应包括受NK细胞激活、B细胞激活和/或T细胞激活间接影响的免疫反应，例如抗体产生(体液反应)和细胞因子反应性细胞(例如，巨噬细胞)的激活。免疫反应包括适应性免疫反应。适应性免疫系统可以对外来分子结构做出反应，例如入侵生物的抗原。与先天免疫系统不同，适应性免疫系统对病原体具有高度特异性。适应性免疫还可以提供持久性保护。适应性免疫反应包括体液免疫反应和细胞介导的免疫反应。在体液免疫反应中，B细胞分泌到体液中的抗体与病原体来源的抗原结合，从而通过多种机制例如补体介导的裂解消除病原体。在细胞介导的免疫反应中，能够破坏其他细胞的T细胞被激活。例如，如果与疾病相关的蛋白质存在于细胞中，它们可以在细胞内通过蛋白水解被片段化成肽。然后特定的细胞蛋白可以将自身附着在抗原或以这种方式形成的肽上，并将它们运输到细胞表面，在那里它们可以被呈递给分子防御机制，例如T细胞。细胞毒T细胞可以识别这些抗原并杀死携带这些抗原的细胞。
“配体”可以指能够与另一分子例如受体结合或形成复合物的分子。配体可包括但不限于，蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂蛋白、激素、脂肪酸、磷脂或与受体结合的任何组分。在一些实施方案中，受体具有特定配体。在一些实施方案中，受体可以与配体混杂结合，在这种情况下，它可以与在结构构型、电荷分布或任何其他物理化学特征上至少具有相似性的几种配体结合。配体可以是生物分子。配体可以是非生物材料。例如，配体可以是作为清道夫受体MARCO的配体的带负电颗粒。例如，配体可以是TiO2，它是清道夫受体SRA1的配体。
术语“主要组织相容性复合体(MHC)”、“MHC分子”或“MHC蛋白”是指能够结合抗原肽并将抗原肽呈递给T淋巴细胞的蛋白质。这种抗原肽可以代表T细胞表位。人MHC也称为HLA复合体。因此，术语“人白细胞抗原(HLA)”、“HLA分子”或“HLA蛋白”与术语“主要组织相容性复合体(MHC)”、“MHC分子”和“MHC蛋白”可互换使用。HLA蛋白可分为HLA I类或HLA II类。两个HLA类别的蛋白质结构非常相似；然而，它们具有非常不同的功能。I类HLA蛋白存在于身体几乎所有细胞的表面上，包括大多数肿瘤细胞。I类HLA蛋白负载有抗原，这些抗原通常来源于内源性蛋白或存在于细胞内的病原体，然后呈递给幼稚或细胞毒T淋巴细胞(CTL)。HLA II类蛋白存在于抗原呈递细胞(APC)上，包括但不限于树突细胞、B细胞和巨噬细胞。它们主要将从外部抗原来源(例如细胞外部)加工的肽呈递给辅助性T细胞。
在HLA II类系统中，诸如巨噬细胞和未成熟的树突细胞的吞噬细胞可以通过吞噬作用将实体吸收到吞噬体中，尽管B细胞表现出更普遍的内吞作用进入核内体，核内体与溶酶体融合，溶酶体的酸性酶将吸收的蛋白质切割成许多不同的肽。自噬是HLA II类肽的另一个来源。研究最多的亚类II HLA基因是：HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、和HLA-DRB1。
HLA II类分子将肽呈递给CD4+辅助性T细胞可导致对外来抗原的免疫反应。一旦被激活，CD4+T细胞可以促进B细胞分化和抗体产生，以及CD8+T细胞(CTL)反应。CD4+T细胞还可以分泌激活和诱导其他免疫细胞的分化的细胞因子和趋化因子。HLA II类分子通常是α链和β链的异二聚体，它们相互作用以形成比I类肽结合沟更开放的肽结合沟。
HLA等位基因通常以共显性方式表达。例如，每个人携带3个I类基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)中各自的2个等位基因，因此可以表达6种不同类型的II类HLA。在II类HLA基因座中，每个人都遗传了一对HLA-DP基因(DPA1和DPB1，其编码α和β链)、HLA-DQ(DQA1和DQB1，用于α和β链)，一个基因HLA-DRα(DRA1)，以及一个或多个基因HLA-DRβ(DRB1和DRB3，-4或-5)。例如，HLA-DRB1具有多于近400个已知的等位基因。这意味着一个杂合个体可以遗传六个或八个功能正常的II类HLA等位基因：来自每个父母的三个或多个。因此，HLA基因是高度多态的；许多不同的等位基因存在于种群内的不同个体中。编码HLA蛋白的基因有许多可能的变异，使每个人的免疫系统能对各种外来侵入物做出反应。一些HLA基因具有数百个已识别的版本(等位基因)，每个版本给定特定的编号。在一些实施方案中，I类HLA等位基因为HLA-A*02:01、HLA-B*14:02、HLA-A*23:01、HLA-E*01:01(非经典)。在一些实施方案中，II类HLA等位基因为HLA-DRB*01:01、HLA-DRB*01:02、HLA-DRB*11:01、HLA-DRB*15:01和HLA-DRB*07:01。
“髓系细胞”可以泛指造血细胞系统的髓系谱系的细胞，并且可以排除例如淋巴细胞谱系。髓系细胞包括例如，粒细胞谱系和单核细胞谱系的细胞。髓系细胞是从骨髓中造血干细胞衍生的共同祖细胞分化而来的。对髓系细胞谱系的定型可能受不同转录因子激活控制，因此髓系细胞可以表征为具有一定程度适应性的细胞，这可以描述为基于细胞外和细胞内刺激进一步分化为终末细胞类型的能力。髓系细胞可以通过其表面上的各种趋化因子受体迅速募集到局部组织中。髓系细胞对各种细胞因子和趋化因子有反应。
例如，髓系细胞可以是在一种或多种细胞因子和趋化因子(例如G-CSF、GM-CSF、Flt3L、CCL2、VEGF和S100A8/9)的影响下在骨髓中源自造血干细胞的细胞。在一些实施方案中，髓系细胞是前体细胞。在一些实施方案中，髓系细胞可以是具有共同髓系祖细胞或粒细胞祖细胞、成髓细胞或单核细胞-树突细胞祖细胞或其组合的特征的细胞。髓系细胞可包括粒细胞或单核细胞或其前体细胞。髓系细胞可以包括未成熟的粒细胞、未成熟的单核细胞、未成熟的巨噬细胞、未成熟的嗜中性粒细胞和未成熟的树突细胞。髓系细胞可包括单核细胞或前单核细胞或单核细胞前体。在一些情况下，如本文所用，髓系细胞可以指具有M0表型、M1表型或M2表型的单核细胞。髓系细胞可包括树突细胞(DC)、成熟的DC、单核细胞衍生的DC、浆细胞样DC、前树突细胞或DC的前体。髓系细胞可以包括嗜中性粒细胞，它可以是成熟的嗜中性粒细胞、嗜中性粒细胞前体或多形核细胞(PMN)。髓系细胞可包括巨噬细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞、组织巨噬细胞、M0、M1或M2表型的巨噬细胞。髓系细胞可以包括肿瘤浸润性单核细胞(TIM)。髓系细胞可以包括肿瘤相关单核细胞(TAM)。髓系细胞可包括髓系衍生的抑制细胞(MDSC)。髓系细胞可包括组织驻留巨噬细胞。髓系细胞可包括肿瘤相关DC(TADC)。因此，髓系细胞可以表达一种或多种细胞表面标志物，例如CD11b、CD14、CD15、CD16、CD38、CCR5、CD66、Lox-1、CD11c、CD64、CD68、CD163、CCR2、CCR5、HLA-DR、CD1c、CD83、CD141、CD209、MHC-II、CD123、CD303、CD304、SIGLEC家族蛋白和CLEC家族蛋白。在一些情况下，髓系细胞的特征可能在于一种或多种细胞表面标志物的高或低表达，所述标志物为例如CD11b、CD14、CD15、CD16、CD66、Lox-1、CD11c、CD64、CD68、CD163、CCR2、CCR5、HLA-DR、CD1c、CD83、CD141、CD209、MHC-II、CD123、CD303、CD304或其组合。
“吞噬作用”与“吞没”可互换使用，并且可以指细胞吞没颗粒(例如，癌细胞或受感染细胞)的过程。这个过程可产生包含颗粒的内部隔室(吞噬体)。该过程可用于从体内摄取和/或去除颗粒，例如癌细胞或受感染细胞。吞噬细胞受体可能参与吞噬作用的过程。吞噬作用的过程可以与免疫反应和抗原呈递密切相关。外源性抗原的加工通过某种类型的内吞事件被吸收到专职抗原呈递细胞后进行。吞噬作用还可以促进抗原呈递。例如，来自吞噬细胞或病原体的抗原，包括癌抗原，可以被加工并呈递到APC的细胞表面。
“多肽”可以指含有通过肽键连接在一起的氨基酸的分子，例如糖蛋白、脂蛋白、细胞蛋白或膜蛋白。多肽可包含蛋白质的一个或多个亚基。多肽可由重组核酸编码。在一些实施方案中，多肽可在单个氨基酸链中包含多于一个肽序列，其可被间隔区、接头或肽切割序列隔开。多肽可以是融合多肽。多肽可包含一个或多个结构域、模块或部分。
“受体”可以指由转导信号的多肽(例如将胞外信号转导至细胞的多肽)组成的化学结构。受体可用于在细胞、晶胞生成或生物体中传递信息。受体包含至少一个受体单元并且可以包含两个或更多个受体单元，其中每个受体单元包含蛋白质分子，例如糖蛋白分子。受体可以包含与配体结合并可以与配体形成复合物的结构。信号传导信息可以通过受体与细胞表面上的配体结合后的构象变化来传递。
术语“抗体”是指通常称为免疫球蛋白的一类蛋白质，包括但不限于IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgM和IgY。术语“抗体”包括但不限于全长抗体、单链抗体、单域抗体(sdAb)及其抗原结合片段。抗原结合抗体片段包括但不限于，Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd(由VH和CH1组成)、单链可变片段(scFv)、单链抗体、二硫键-连接的可变片段(dsFv)和包含VL和/或VH结构域的片段。抗体可以来自任何动物来源。抗原结合抗体片段，包括单链抗体，可包含单独或与铰链区、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域中的一个或多个组合的一个或多个可变区。还包括一个或多个可变区和铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。抗体可以是单克隆、多克隆、嵌合、人源化和人单克隆和多克隆抗体，其例如特异性结合HLA相关多肽或HLA-肽复合物。
术语“重组核酸”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的核酸。重组核酸可包含非天然存在的核苷酸序列。可以在实验室合成重组核酸。重组核酸可以利用重组DNA技术制备，例如DNA的酶促修饰，如酶切、连接和DNA克隆。重组核酸可以是DNA、RNA、其类似物或其组合。重组DNA可以被离体或体外转录，例如以产生信使RNA(mRNA)。重组mRNA可以被分离、纯化并用于转染细胞。重组核酸可以编码蛋白质或多肽。
将核酸引入或掺入细胞的过程可以通过转化、转染或转导进行。转化是细菌细胞摄取外源核酸的过程。该过程适用于质粒DNA的繁殖、蛋白质生产和其他应用。转化将重组质粒DNA引入感受态细菌细胞，感受态细菌细胞从环境中吸收胞外DNA。某些细菌种类在某些环境条件下具有天然感受态，但感受态是在实验室环境中人工诱导的。转染是将诸如DNA、RNA或抗体的小分子引入真核细胞中。转染也可以指将噬菌体引入细菌细胞中。“转导”多用于描述将重组病毒载体颗粒导入靶细胞中，而“感染”是指野生型病毒对人类或动物的自然感染。
术语“载体”可以指能够在宿主细胞中自主复制并且允许核酸分子的克隆的核酸分子。如本领域技术人员所知，载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒载体、噬菌体载体、酵母载体、哺乳动物载体等。例如，用于外源基因转化的载体可以是质粒。在某些实施方案中，载体包含含有复制起点和在宿主细胞中复制和/或维持核酸序列所必需的其他元件的核酸序列。在一些实施方案中，本文提供的载体或质粒是表达载体。表达载体能够指导与它们可操作地连接的基因和/或核酸序列的表达。在一些实施方案中，表达载体或质粒呈环状双链DNA分子的形式。载体或质粒可以整合或可以不整合到宿主细胞的基因组中。在一些实施方案中，质粒的核酸序列在引入后不整合到宿主细胞的基因组或染色体中。例如，质粒可以包含用于核酸序列的瞬时表达或稳定表达的元件，例如宿主细胞中质粒携带的基因或开放阅读框。在一些实施方案中，载体是瞬时表达载体。在一些实施方案中，载体是在宿主细胞中自主复制的稳定表达的载体。在一些实施方案中，质粒的核酸序列在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组或染色体中。可用于本文公开的方法中的表达载体包括但不限于质粒、附加体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体。载体可以是DNA或RNA载体。在一些实施方案中，本文提供的载体是在引入宿主细胞中后能够整合到宿主细胞基因组中的RNA载体(例如，通过逆转录)，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体。也可以使用本领域技术人员已知的发挥等效功能的其他形式的表达载体，例如，自复制的染色体外载体或能够整合到宿主基因组中的载体。示例性载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些。
在提及融合蛋白时使用的术语“间隔区”或“接头”是指连接融合蛋白的两个其他肽序列的肽序列。在一些实施方案中，接头或间隔区除了连接或保持蛋白质或RNA序列之间的一些最小距离或其他空间关系之外没有特定的生物活性。在一些实施方案中，可以选择间隔区的组成氨基酸以影响分子的一些特性，例如分子的折叠、柔性、净电荷或疏水性。用于在本公开的实施方案中使用的合适的接头是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。在一些实施方案中，接头用于分开两个或多个多肽，例如，两个抗原肽分开的距离足以确保每个抗原肽正确折叠。示例性肽接头序列采用柔性的延伸构象并且不表现出形成有序二级结构的倾向。柔性接头蛋白区域中的氨基酸可以包括Gly、Asn和Ser，或含有Gly、Asn和Ser的氨基酸序列的任何排列。其他接近中性的氨基酸，例如Thr和Ala，也可用于接头序列中。
术语“治疗(“treat)”、“治疗的(treated)”、“治疗(“treating)”、“治疗(treatment)”等意指减少、预防或改善疾病和/或与其相关的症状(例如，瘤形成或肿瘤或传染源或自身免疫性疾病)。“治疗(Treating)”可以指在疾病(例如，癌症或传染源感染或自身免疫病)发作或疑似发作后向受试者施用治疗。“治疗(Treating)”包括“减轻”的概念，其可以指减少与疾病和/或与治疗相关的副作用的任何症状或其他不良反应的发生或复发的频率或严重性。术语“治疗(Treating)”还包括“管理”的概念，其是指降低患者疾病或病症的严重性，例如延长患有该疾病的患者的生命或延长其生存能力，或延迟其复发，例如，延长患有该疾病的患者的缓解期。应理解，尽管不排除，治疗病症或病况并不要求完全消除病症、病况或与其相关的症状。如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”和它们的语法等价物可以指避免或延迟受试者中与疾病或病况相关的症状的发作，所述受试者在开始施用试剂或化合物时尚未出现此类症状。在某些实施方案中，如本文所述治疗受试者或患者包括施用治疗组合物，例如药物、代谢物、预防组分、编码或以其他方式形成药物、代谢物或预防组分的核酸、肽或蛋白质。在一些实施方案中，治疗包括向有此需要的受试者施用细胞或细胞群。在一些实施方案中，治疗包括向受试者施用一种或多种本文所述的工程化细胞，例如一种或多种工程化髓系细胞，例如吞噬细胞。治疗包括治疗疾病或病况或综合征，其可以是病理性疾病、病况或综合征，或隐匿型疾病、病况或综合征。在一些情况下，如本文所用，治疗可包括施用治疗性疫苗。在一些实施方案中，将工程化吞噬细胞施用于患者或受试者。在一些实施方案中，施用给人类受试者的细胞导致降低的免疫原性。例如，工程化的吞噬细胞可能不会导致或减少移植物抗宿主病(GVHD)或自相残杀效应。在一些实施方案中，施用给人类受试者的工程化细胞与受试者免疫相容(即，具有在受试者中自然表达的匹配HLA亚型)。受试者的受试者特异性HLA等位基因或HLA基因型可以通过本领域已知的任何方法确定。在示例性实施方案中，该方法包括确定多态性基因类型，其可以包括生成从测序数据集提取的读数与包含多态性基因的等位基因变体的基因参考集的比对、确定比对中的每个等位基因变体的第一后验概率或后验概率得出的分数、将具有最大第一后验概率或后验概率得出的分数的等位基因变体鉴定为第一等位基因变体、鉴定与第一等位基因变体和一个或多个其他等位基因变体比对的一个或多个重叠读数、使用加权因子确定一个或多个其他等位基因变体的第二后验概率或后验概率得出的分数、通过选择具有最大第二后验概率或后验概率得出的分数的等位基因变体、定义多态性基因的基因类型的第一和第二等位基因变体来鉴定第二等位基因变体，和提供第一和第二等位基因变体的输出。
“片段”可以指蛋白质或核酸的一部分。在一些实施方案中，片段保留参考蛋白质或核酸的至少50％、75％或80％，或90％、95％或甚至99％的生物活性。
术语“分离的”、“纯化的”、“生物纯的”及其语法等价物是指在不同程度上不含在其天然状态下通常伴随的组分的材料。“隔离”表示与原始来源或周围环境的分离程度。“纯化”表示高于隔离度的分离程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分不含其他材料，使得任何杂质不会实质性地影响蛋白质的生物学特性或引起其他不利后果。即，如果本公开的核酸或肽在通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品，则该核酸或肽被纯化。纯度和均匀性通常使用分析化学技术来确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。对于可以进行修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离蛋白质，这些蛋白质可以单独纯化。
术语“瘤形成”或“癌症”是指由不适当的高水平细胞分裂、不适当的低水平细胞凋亡或两者引起或导致的任何疾病。胶质母细胞瘤是瘤形成或癌症的一个非限制性实例。术语“癌症”或“肿瘤”或“过度增殖性疾病”是指存在具有致癌细胞典型特征的细胞，例如不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长和增殖速度，以及某些特征性形态特征。癌细胞通常以肿瘤的形式存在，但这种细胞可以单独存在于动物体内，或者也可以是非致瘤性癌细胞，例如白血病细胞。
术语“疫苗”应理解为意指用于产生免疫以预防和/或治疗疾病(例如，瘤形成/肿瘤/传染源/自身免疫疾病)的组合物。因此，如本文所用，疫苗是包含重组核酸或包含并表达重组核酸的细胞的药物，并且旨在用于人类或动物中以通过疫苗接种产生特异性防御和保护物质。“疫苗组合物”可以包括药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。本公开的方面涉及该技术在制备基于吞噬细胞的疫苗中的用途。
术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准或可批准或列入美国药典或其他公认的药典，可用于动物，包括人类。“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与试剂一起施用于受试者的赋形剂、载体或稀释剂，其不破坏其药理活性并且当以足以递送治疗量的试剂的剂量施用时是无毒的。
可用于本公开的方法的核酸分子包括但不限于具有活性或编码多肽的任何核酸分子。与内源序列具有基本同一性的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下，核酸分子配对时以在互补多核苷酸序列或其部分之间形成双链分子。(参见，例如，Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。例如，严格盐浓度通常可以低于约750mM的NaCl和75mM的柠檬酸三钠、低于约500mM的NaCl和50mM的柠檬酸三钠、或低于约250mM的NaCl和25mM的柠檬酸三钠。低严格度杂交可在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格度杂交可在至少约35％甲酰胺或至少约50％甲酰胺的存在下获得。严格的温度条件通常可包括至少约30℃、至少约37℃或至少约42℃的温度。不同的附加参数，例如杂交时间、去污剂(例如十二烷基硫酸钠(SDS))的浓度以及载体DNA的包含或排除，是本领域技术人员众所周知的。通过根据需要组合这些不同的条件来实现不同程度的严格度。在示例性实施方案中，杂交可在30℃下在750mM的NaCl、75mM的柠檬酸三钠和1％的SDS中发生。在另一个示例性实施方案中，杂交可在37℃下在500mM的NaCl、50mM的柠檬酸三钠、1％的SDS、35％的甲酰胺和100μg/ml的变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中发生。在另一个示例性实施方案中，杂交可在42℃下在250mM的NaCl、25mM的柠檬酸三钠、1％的SDS、50％的甲酰胺和200μg/ml的ssDNA中发生。这些条件的有用变化对本领域技术人员来说是显而易见的。对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也可能在严格度方面有所不同。洗涤严格条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上所述，可以通过降低盐浓度或提高温度来增加洗涤严格度。例如，洗涤步骤的严格盐浓度可以小于约30mM的NaCl和3mM的柠檬酸三钠，或小于约15mM的NaCl和1.5mM的柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件可包括至少约25℃、至少约42℃或至少约68℃的温度。在示例性实施方案中，洗涤步骤可在25℃下在30mM的NaCl、3mM的柠檬酸三钠和0.1％的SDS中进行。在其他示例性实施方案中，洗涤步骤可以在42℃下在15mM的NaCl、1.5mM的柠檬酸三钠和0.1％的SDS中进行。在另一个示例性实施方案中，洗涤步骤可以在68℃下在15mM的NaCl、1.5mM的柠檬酸三钠和0.1％的SDS中进行。这些条件的另外变化对本领域技术人员来说是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如Benton和Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology,WileyInterscience,New York,2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular CloningTechniques,1987,Academic Press,New York)；和Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中。
“基本相同”是指多肽或核酸分子与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任一氨基酸序列)表现出至少50％的同一性。这样的序列在氨基酸水平或核酸下可以与用于比较的序列有至少60％、80％或85％、90％、95％、96％、97％、98％或甚至99％或更高的同一性。序列同一性通常使用序列分析软件(例如，Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705,BLAST,BESTFIT,GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量。此类软件通过为各种替换、缺失和/或其他修饰指定同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守替换通常包括以下组内的替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-m°之间的概率分数表示密切相关的序列。“参考”是比较的标准。应当理解，各个序列中特定位置或残基的编号取决于所使用的特定蛋白质和编号方案。编号可能例如在成熟蛋白质的前体和成熟蛋白质本身上不同，物种之间的序列差异可能会影响编号。本领域技术人员将能够通过本领域众所周知的方法，例如通过与参考序列的序列比对和同源残基的确定，鉴定任何同源蛋白质和相应编码核酸中的相应残基。
术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的生物体，例如动物(例如，人类)。仅作为示例，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，例如非人类灵长类动物、鼠、牛、马、犬、绵羊或猫。
术语“治疗效果”是指一种或多种疾病症状(例如，瘤形成、肿瘤或传染源感染或自身免疫性疾病)或其相关病理的某种程度的缓解。如本文所用，“治疗有效量”是指在向细胞或受试者单剂量或多剂量施用后，超出在没有这种治疗的情况下预期的，有效延长患有此类疾病的患者的生存力、减少病症的一种或多种迹象或症状、预防或延迟等的试剂的量。“治疗有效量”旨在限定达到治疗效果所需的量。具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的“治疗有效量”(例如，ED50)。
工程化髓系细胞“靶向”攻击患病细胞
本公开涉及用于制备靶向杀伤髓系细胞的组合物和方法；通过利用免疫防御中的先天功能作用，包括与检测异物、颗粒、患病细胞、细胞碎片、炎症信号、化学引诱剂相关的特性；激活内源性DAMP和PAMP信号传导通路；触发骨髓细胞生产，外渗；趋化性；吞噬细胞；胞饮作用；募集；吞没；清除；激活病原体的细胞内氧化爆发和裂解或杀死，检测、吞没和杀死患病或受损的细胞；在体内去除不需要的细胞、组织或非细胞碎片；抗原呈递和激活先天免疫的作用；激活和调节免疫反应级联；激活T细胞库；自噬；炎性和非炎性细胞凋亡；细胞焦亡、免疫编辑以对组织稳态的应激和恢复做出反应。在一个方面，本文提供了用于增强用于治疗应用的髓系细胞的一种或多种功能的方法和组合物，该一种或多种功能可以是以下各项中的一种或多种：检测异物、颗粒、患病细胞、细胞碎片、炎症信号、化学引诱剂相关的特性；激活内源性DAMP和PAMP信号传导通路；触发骨髓形成，外渗；趋化性；吞噬作用；胞饮作用；募集；胞啃；吞没；清除；激活病原体的细胞内氧化爆发和胞内裂解或杀死，检测、吞没和杀死患病或受损的细胞；在体内去除不需要的细胞、组织或无细胞碎片；抗原呈递和激活先天免疫的作用；激活和调节免疫反应级联；激活T细胞库；自噬；炎性和非炎性细胞凋亡；细胞焦亡、免疫编辑以对组织稳态的应激和恢复做出反应。在一个实施方案中，组合物和方法还涉及通过对这些细胞进行基因修饰来增强某些髓系细胞的靶向和杀伤功能。本文所述的组合物和方法涉及产生工程化髓系细胞，其中工程化髓系细胞包含至少一种基因修饰，并且可以涉及识别和诱导针对病原体、患病细胞(例如，肿瘤或癌细胞)的效应子功能，使得工程化的髓系细胞能够识别、靶向、吞噬、杀死和/或消除病原体或患病细胞或癌细胞，此外，可以在吞噬、杀死和/或消除病原体或患病细胞之后激活特异性免疫反应级联。
髓系细胞似乎是肿瘤中最丰富的细胞(图1B)。髓系细胞还能够识别身体的健康正常细胞上的肿瘤细胞，并对身体的肿瘤细胞产生免疫反应。作为先天免疫反应的哨兵，髓系细胞能够感知非自身或异常细胞类型，并通过称为吞噬作用的过程清除它们。这可以涉及在驱动髓系细胞介导的肿瘤细胞的吞噬作用和裂解方面的治疗优势。然而，这些天然存在的肿瘤浸润性髓系细胞(TIM)可能受到肿瘤微环境(TME)的影响。TIM构成了异质的细胞群。许多TIM起源于循环单核细胞和粒细胞，其又起源于骨髓衍生的造血干细胞。然而，在肿瘤衍生因子持续刺激的情况下，单核细胞和粒细胞祖细胞会从其终末分化为成熟巨噬细胞、DC或粒细胞的内在通路转移，并可能成为促进肿瘤的髓系细胞类型。分化为病理性的、选择性激活的未成熟髓系细胞是有利的。这些未成熟的髓系细胞包括肿瘤相关DC(TADC)、肿瘤相关嗜中性粒细胞(TAN)、髓系来源抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。作为这种紧急骨髓形成的替代，TAM也可能起源于组织驻留巨噬细胞，其又可以是胚胎或单核细胞起源。这些组织驻留巨噬细胞在致癌过程中会发生表型和功能的变化，且增殖可能有助于维持衍生自组织驻留巨噬细胞的TAM。肿瘤微环境可驱动肿瘤浸润的髓系细胞成为髓系来源抑制细胞并获得抑制T细胞的能力。因此，需要创新方法来创造治疗有效的TIM，这些TIM可以浸润肿瘤，并可以靶向肿瘤细胞进行吞噬细胞摄取和杀伤。
在一个方面，本文提供了能够靶向特定靶细胞例如肿瘤细胞或病原细胞的工程化髓系细胞。在一些实施方案中，本文提供的工程化髓系细胞在浸润、靶向和杀死肿瘤细胞方面是有效的。本文所述的工程化髓系/吞噬细胞被设计为包含重组核酸，其编码一种或多种蛋白质，这些蛋白质有助于将吞噬细胞靶向靶细胞，例如肿瘤细胞或癌细胞。在一个实施方案中，工程化的髓系细胞能够容易地浸润肿瘤。在一个实施方案中，工程化的髓系细胞对靶细胞具有高度特异性，在循环中与受试者的非肿瘤、非患病细胞没有交叉反应性或具有可忽略不计的交叉反应性。在一个实施方案中，本文所述的工程化髓系/吞噬细胞被设计为包含重组核酸，这将帮助细胞克服/绕过TME影响并产生有效的抗肿瘤反应。在一个实施方案中，本文所述的工程化髓系/吞噬细胞被设计为包含重组核酸，其增强靶细胞的吞噬作用。在另一个实施方案中，本文所述的工程化髓系/吞噬细胞被设计为包含重组核酸，其增强减少或消除胞啃作用和/或增强靶细胞的吞噬裂解。
因此，在一些实施方案中，本文公开的组合物包含髓系细胞，其包含编码嵌合受体融合蛋白(CFP)，例如吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸。重组核酸可包含编码PR亚基的序列，该序列包含：(i)跨膜结构域，和(ii)包含PR胞内信号传导结构域的胞内结构域；和对靶细胞的抗原特异的胞外抗原结合结构域；其中跨膜结构域和胞外抗原结合结构域可操作地连接；其中PR胞内信号传导结构域衍生自具有信号转导结构域的受体。重组核酸进一步编码一种或多种多肽，这些多肽构成一种或多种质膜受体，帮助接合吞噬细胞与靶细胞并增强其吞噬活性。
在一些实施方案中，本文所述的髓系细胞包含一种或多种包含嵌合受体的重组蛋白，其中嵌合受体能够响应针对靶细胞的第一吞噬信号，所述靶细胞可以是患病细胞、肿瘤细胞或病原体；和第二信号，第二信号是炎症信号，其增强对第一信号所启动的靶标的吞噬和杀伤反应。
吞噬细胞
本文提供了用于免疫治疗的方法和组合物，包括“改进”或“修饰”或“工程化”吞噬细胞并将其靶向特定靶标，所述靶标可以是患者或受试者中的特定细胞类型或细胞类别。在一些实施方案中，受试者是患有疾病的患者。在本节中，术语受试者和患者经常可以互换使用。在一些实施方案中，吞噬细胞衍生自患有疾病的受试者，其中所述疾病是例如，癌症。来自受试者的自体细胞可以在体外被修饰并被施用到细胞中，其中修饰的吞噬细胞被重新设计以特异性攻击和杀死受试者中的癌细胞。
在一些实施方案中，受试者患有非癌症的疾病。
在一些实施方案中，受试者患有为感染的疾病。在一些实施方案中，本文提供的用于免疫治疗的方法和组合物用于“改进”或“修饰”或“工程化”吞噬细胞并将其靶向感染，例如受试者体内的感染细胞。
在一些实施方案中，受试者患有病毒、细菌、真菌或原生动物感染的疾病。在一些实施方案中，本文提供的用于免疫治疗的方法和组合物用于“改进”或“修饰”或“工程化”吞噬细胞并将其靶向受感染的受试者体内的病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、真菌感染的细胞或原生动物感染的细胞。在一些实施方案中，本文提供的用于免疫治疗的方法和组合物用于“改进”或“修饰”或“工程化”吞噬细胞并将其靶向受试者体内的病毒、细菌、真菌或任何病原体，使得受试者体内的病毒、细菌、真菌或病原体被吞噬和/或杀死。在一些实施方案中，本文提供的用于免疫治疗的方法和组合物用于“改进”或“修饰”或“工程化”吞噬细胞并将其靶向受试者体内的病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或病原体的抗原，使得受试者体内存在至少一种对受试者体内的病毒、细菌、真菌或病原体的改进的免疫反应。
在一些实施方案中，髓系细胞，例如吞噬细胞，是同种异体的。在一些实施方案中，本文提供的用于免疫治疗的方法和组合物包括获得衍生自同种异体来源的髓系细胞，例如吞噬细胞。髓系细胞，例如吞噬细胞，随后可以被修饰或工程化并引入患病受试者中，使得来自同种异体来源的修饰或工程化的细胞能够攻击受试者的患病细胞、吞噬患病细胞和/或直接或间接杀死患病细胞，或改善受试者对疾病的至少一种免疫反应。在一些实施方案中，同种异体来源是人。在一些实施方案中，同种异体来源是健康人。
吞噬细胞是免疫系统的天然哨兵，并且形成人体的第一道防线。它们吞没病原体、病原体感染的细胞、异物或癌细胞并将其从体内清除。大多数潜在病原体在它们引起例如明显感染之前被该系统迅速中和。这可能涉及通过被膜小窝系统的受体介导的摄取、胞饮作用，特别是由于膜皱褶和吞噬作用引起的巨胞饮作用。因此，吞噬细胞可以被各种非自身(和自身)元件激活，并在识别它们的“靶标”时表现出一定程度的适应性。
单核吞噬细胞系统(MPS)由单核细胞、巨噬细胞和树突细胞组成，对于组织稳态和通过其在抗原呈递中的作用确定免疫反应的平衡至关重要。MPS是源自骨髓祖细胞并产生血液单核细胞、组织巨噬细胞和树突细胞的细胞谱系。因此，从MPS产生巨噬细胞的过程开始于BM中的前单核细胞，该前单核细胞经历分化过程，成为准备进入体循环的单核细胞。在循环中短时间(<48h)后，这些新形成的单核细胞迅速渗入外周组织，在外周组织中它们中的大部分分化为巨噬细胞或树突细胞(DC)。抗微生物吞噬作用可清除和降解致病微生物，通过细胞因子和趋化因子分泌诱导促炎信号传导，并募集免疫细胞以产生有效的炎症反应。这种类型的吞噬作用通常被称为“炎性吞噬作用”(或“免疫原性吞噬作用”)。然而，在一些情况下，例如某些持续感染，抗炎反应可能会跟随微生物的摄取。抗微生物吞噬作用通常由髓系的专职吞噬细胞，如未成熟的树突细胞(DC)和巨噬细胞以及组织驻留免疫细胞进行。受损的细胞、凋亡细胞或细胞的吞噬作用通常是非炎症(也称为“非免疫原性”)过程。转化或恶性细胞(自身细胞)和细胞被吞噬，且凋亡细胞在不会对周围组织造成损伤或诱导促炎免疫反应的情况下被迅速清除。这种类型的凋亡细胞清除是非炎症的，并且包括从凋亡细胞释放“找到我”信号以将吞噬细胞募集到凋亡细胞的位置；伴随着暴露在凋亡细胞表面的“吃掉我”信号，被吞噬细胞通过特异性受体结合；细胞骨架重排以吞没凋亡细胞；然后消化摄取的凋亡细胞并引发特定的吞噬反应(例如，抗炎细胞因子的分泌)。
吞噬作用，颗粒(例如质膜包膜内>0.5μm的颗粒)的细胞摄取，与通过液相巨胞饮和受体通路对可溶性配体的内吞作用密切相关并部分重叠。与凋亡细胞摄取相关的变体，也称为胞葬作用，以及由感染和炎症引起的坏死细胞(坏死性凋亡和细胞焦亡)。外源性颗粒(异体吞噬)的摄取与自体吞噬具有共同的特征，自体吞噬是隔离和溶酶体处理受损细胞内的细胞器的一种内源性过程。根据颗粒大小、受体-配体相互作用的多样性和细胞骨架参与，存在一系列摄取机制。一旦被内化，吞噬体液泡可以选择性地与初级溶酶体或内质网(ER)和高尔基氏复合体的产物融合，以形成次级吞噬溶酶体(Russell,D.G.(2011).Immunol.Rev.240,252–268)。该通路是动态的，因为它与内吞和分泌囊泡巨噬细胞、DC、破骨细胞和嗜酸性粒细胞发生融合和裂变。抗微生物吞噬作用可清除和降解致病微生物，通过细胞因子和趋化因子分泌诱导促炎信号传导，并募集免疫细胞以产生有效的炎症反应。这种类型的吞噬作用通常被称为“炎性吞噬作用”(或“免疫原性吞噬作用”)。然而，在一些情况下，例如某些持续感染，抗炎反应可能会伴随微生物的摄取。抗微生物吞噬作用通常由髓系的专职吞噬细胞，如未成熟的树突细胞(DC)和巨噬细胞以及组织驻留免疫细胞进行。相比之下，受损的自体衍生的凋亡细胞或细胞碎片的吞噬作用(例如，胞葬作用)通常是非炎症(也称为“非免疫原性”)过程。每天有数十亿个受损、垂死和不需要的细胞发生细胞凋亡。不需要的细胞包括，例如，在发育过程中产生的过量细胞、衰老细胞、感染细胞(细胞内细菌或病毒)、转化或恶性细胞，以及被细胞毒剂不可逆破坏的细胞。
骨髓是循环嗜中性粒细胞和单核细胞的来源，它们将取代选定的组织驻留巨噬细胞，并在炎症和感染期间扩增组织髓细胞群。在吞噬作用后，新募集的单核细胞和组织巨噬细胞通过从质膜中预先存在的磷脂和花生四烯酸盐中生成它们并释放通过激活呼吸爆发或诱导诱导型一氧化氮合成产生的自由基来分泌它们的产物；除了通过合成上述产生的低分子量产物(花生四烯酸代谢物、超氧阴离子和一氧化氮)来实现外，巨噬细胞中的吞噬作用诱导的分泌主要通过新的RNA合成和pH的变化来实现，导致渐进酸化。
在一些实施方案中，本文提供的吞噬细胞是单核细胞或单核细胞谱系的细胞。
在一些实施方案中，髓系细胞是吞噬性巨噬细胞是MARCO+SignR1+并且在外边缘区中发现快速清除胶囊包裹的细菌。类似的CD169+F4/80_巨噬细胞排列在淋巴结的被膜下淋巴窦，并与病毒感染有关。注意到内皮巨噬细胞，包括肝脏中的库普弗细胞，清除血液和淋巴结中的微生物和抗原配体，以提供与粘膜免疫相当但又不同的正弦免疫功能。并非所有组织巨噬细胞都是组成性吞噬细胞，即使它们仍然表达典型的巨噬细胞标志物。在啮齿动物脾脏的边缘区，缺乏F4/80的嗜金属巨噬细胞强烈表达CD169、唾液酸结合免疫球蛋白(Ig)样凝集素1(SIGLEC1[唾液酸粘附素])，但吞噬作用差。非专职吞噬细胞包括上皮细胞和成纤维细胞。成纤维细胞是“工作类吞噬细胞”，其通过粘附分子ICAM和玻连蛋白受体通过使用CD11b-CD18以外的整合素清除凋亡碎片。据报道，星形胶质细胞也会吞没凋亡的尸体，即使不能有效降解。与吞噬作用相关的质膜受体可以是调理素的，FcRs(激活或抑制)主要针对IgG抗体的保守结构域，以及补体受体，例如通过经典(IgM或IgG)或补体激活的替代凝集素通路沉积的iC3b的CR3。CR3还可以在没有调理素的情况下介导识别，可能是通过沉积巨噬细胞衍生的补体。抗微生物吞噬作用通常由髓系的专职吞噬细胞，如未成熟的树突细胞(DC)和巨噬细胞以及组织驻留免疫细胞进行。
在一些实施方案中，为了本文公开的即时细胞工程化程序的目的，用于用于免疫治疗而工程化的细胞是强吞噬性的。
在一些实施方案中，为了本文公开的即时细胞工程化程序的目的，用于免疫治疗而工程化的细胞获自全血、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织。
在一些实施方案中，用于免疫治疗而工程化的细胞获自外周血。
在肝脏MPS中，就产生用于癌症免疫治疗的细胞的目的而言，已经表征了多种结构和功能区别，包括刺激性和抑制性两者。
表1-肝单核细胞、巨噬细胞和DC的示例性表型特征
Figure BDA0003447683340000691
在一些实施方案中，被工程化用于本申请中的免疫治疗的髓系细胞包括选自巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞的髓系细胞。
在一些实施方案中，被工程化用于免疫治疗的髓系细胞是吞噬细胞。在一些实施方案中，吞噬细胞是单核细胞。
在一些实施方案中，被工程化用于本申请中的免疫治疗的髓系细胞是单核细胞、单核细胞衍生的巨噬细胞和/或树突细胞。
在一些实施方案中，被工程化用于本申请中的免疫治疗的髓系细胞是单核细胞或巨噬细胞。
在一些实施方案中，髓系细胞从外周血中获得。
在一些实施方案中，髓系细胞通过选择标志物CD14+CD16低来选择。在一些实施方案中，髓系细胞通过淘析选择。
在一些实施方案中，髓系细胞从受试者的白细胞单采术柱中分离。在一些实施方案中，受试者与施用包含工程化细胞的药物组合物的受试者是同一受试者。
在一些实施方案中，受试者与施用包含工程化细胞的药物组合物的受试者不是同一受试者。
在一些实施方案中，每周一次对同一受试者进行白细胞单采术以收集更多的髓系细胞。在一些实施方案中，在8-10天的跨度内对同一受试者进行多于一次的白细胞单采术以收集更多的髓系细胞。在一些实施方案中，在一个月的跨度内对同一受试者进行多于两次的白细胞单采术以收集更多的髓系细胞。
在一些实施方案中，髓系细胞从白细胞单采术样品或外周血样品中分离。在一些实施方案中，髓系细胞是祖细胞。在一些实施方案中，髓系细胞是单核细胞前体细胞。在一些实施方案中，本文所述的髓系细胞未分化为终末细胞且未表现出终末细胞表型，例如组织巨噬细胞。在一些实施方案中，髓系细胞包括CD14+细胞。在一些实施方案中，髓系细胞不表达CD16。在一些实施方案中，髓系细胞表达少量的CD16。在一些实施方案中，为了从生物样品(例如，外周血或单采血样)通过选择CD14+细胞进行工程化的目的，预选髓系细胞。在一些实施方案中，在不与待选择的髓系细胞接触或接合的情况下进行选择。在一些实施方案中，髓系细胞在工程化之前从生物样品中通过分选进行选择，例如基于流式细胞术的细胞分选器(FACS)。在一些实施方案中，表达CD16的髓系细胞被抗体捕获并且剩余的髓系细胞被收集并用于工程化。在一些实施方案中，除CD16外，一种或多种其他细胞表面分子被靶向用于在负选择过程中捕获，以获得髓系细胞，例如CD3、CD8、CD11c、CD40或CD206。
在一个方面，本文提供了包含至少一种编码融合蛋白的外源重组核酸的髓系细胞。融合蛋白可以是至少包含跨膜结构域和胞外结构域的嵌合蛋白，胞外结构域包含可结合靶细胞的区域。例如，嵌合蛋白可以结合靶标，例如靶抗原、抗原肽或靶细胞上的配体。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶标是癌抗原。在一些实施方案中，嵌合蛋白在髓系细胞中表达并激活髓系细胞以克服TME诱导的抑制信号并充当激活的促炎性髓系细胞。在一个实施方案中，在髓系细胞中表达的嵌合蛋白能够对除靶标外的第二信号(第一信号)作出反应，其中第二信号是促炎信号和激活信号。在一些实施方案中，在髓系细胞中表达的嵌合蛋白能够响应除靶标或第一信号之外的多种信号。除了靶标或第一信号之外，嵌合蛋白可能够响应一个、两个、三个、四个、五个或更多个信号。
在另一个实施方案中，在髓系细胞中表达的嵌合蛋白对结合靶标具有特异性。在一些实施方案中，靶标是癌细胞。嵌合蛋白的表达赋予髓系细胞靶标特异性。
在一个实施方案中，在髓系细胞中表达的嵌合蛋白能够多重化，例如，具有用于激活和处理多于一种信号或信号类型的多个结构域。在一些实施方案中，多个结构域的激活同时导致对髓系细胞的增强的效应反应。髓系细胞的效应反应包括例如，增强的吞噬作用、促炎性激活和靶细胞的杀伤。在一些实施方案中，在髓系细胞中表达的能够多重化的嵌合蛋白能够结合多于一种配体，例如靶抗原和辅助分子。在一些实施方案中，嵌合蛋白能够结合癌细胞上的多个靶抗原。在一些实施方案中，嵌合蛋白能够多重化并能够结合多个细胞上的多个靶抗原。在一些实施方案中，嵌合蛋白可结合癌细胞上的巨噬细胞-单核细胞抑制靶标，并在接触时使用融合到细胞内末端的促炎结构域产生刺激信号，该过程称为“信号转换”。例如，嵌合蛋白的胞外结构域可包含CD47结合结构域，而嵌合融合蛋白缺乏天然CD47受体的跨膜和/或胞内结构域，但在胞内区包含PI3K募集结构域，从而将巨噬细胞-单核细胞抑制信号从与肿瘤细胞的接触转化为促炎吞噬作用增强信号。
在一些实施方案中，嵌合蛋白能够与表达的嵌合蛋白的多个单元结合，例如多聚化。多聚化包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体或十聚体形成。在一些实施方案中，多聚化可通过跨膜区、胞外区或胞内区或其组合的缔合而发生。例如，包含吞噬细胞受体MARCO的胶原结构域区域的嵌合蛋白可形成三聚体以实现其有效功能。在一些实施方案中，嵌合蛋白能够与其他分子例如另一种受体缔合。例如，嵌合蛋白包含与FcγTM结构域二聚化的Fc-α跨膜结构域，其中Fcγ可以是内源性受体。
在一些实施方案中，能够多重化的嵌合蛋白包含多个胞内结构域，这些胞内结构域可以被多于一种信号激活并且可以依次激活多个胞内信号传导分子。例如，嵌合蛋白可包含吞噬作用受体结构域和促炎结构域。例如，嵌合蛋白包含FcR信号传导结构域和募集半胱天冬酶原的另外的磷酸化结构域。
PFP融合蛋白的吞噬细胞受体(PR)亚基
本发明提供了编码CFP的重组核酸，该CFP是吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP)。PFP可以包含PR亚基，其包含：跨膜(TM)结构域和包含PR胞内信号传导结构域的胞内结构域(ICD)。在一些实施方案中，编码PFP的重组核酸当在细胞中表达时，PFP功能性地掺入细胞的细胞膜中。在一些实施方案中，重组核酸编码跨膜结构域，该跨膜结构域特异性地掺入髓系细胞(例如，吞噬细胞，例如巨噬细胞)的膜中。
在一些实施方案中，在筛选跨膜蛋白文库之后选择合适的PR。PR亚基在胞外结构域与癌细胞结合抗体融合。在一些实施方案中，PR可以在细胞内末端与一个或多个附加结构域融合。
CFP融合蛋白的胞内结构域
在一些实施方案中，CFP亚基包含吞噬细胞受体的TM结构域。
在一些实施方案中，CFP亚基包含吞噬细胞受体的ICD结构域。
在一些实施方案中，吞噬细胞受体是清道夫受体。虽然许多清道夫受体在物质的检测和摄取中协作，但并非所有参与吞噬作用过程的受体都会单独触发吞没。某些吞噬作用和清道夫受体的参与可能对下游免疫反应产生巨大影响。例如，用500nm带负电荷的纳米颗粒触发A型清道夫受体MARCO与抗炎耐受性免疫反应有关。而带有正电荷的颗粒被吞噬作用受体的子集吞没，这些吞噬作用受体激活促炎通路，如NLRP3和/或纤维化反应。此外，某些清道夫受体通路，例如内皮细胞表达的清道夫受体(SREC-I)，已被证明在抗原交叉呈递中发挥作用。因此，识别和理解可用于增强巨噬细胞活性和临床疗效的潜在受体是CFP开发平台的重要步骤。
由专职吞噬细胞自然可变地表达的非调理素受体包括凝集素样识别分子，例如CD169、CD33和唾液酸化残基的相关受体。此外，吞噬细胞还表达Dectin-1(具有明确信号传导能力的真菌β-葡聚糖的受体)、相关的C型凝集素(例如，MICL、Dectin-2、Mincle和DNGR-1)和一组清道夫受体。SR-A、MARCO和CD36的结构域结构各不相同，并且对凋亡和微生物配体具有不同但重叠的识别。CD36相关家族成员揭示了脱辅基蛋白配体与受体螺旋束结合，而它们的外表面结构域形成了一个通道，通过该通道，诸如胆固醇的脂质被易位到膜双层。
表2-人体内的清道夫受体
Figure BDA0003447683340000731
Figure BDA0003447683340000741
Figure BDA0003447683340000751
表3-SR家族成员的选定配体
Figure BDA0003447683340000752
Figure BDA0003447683340000761
(ND，未定义的)
在一些实施方案中，重组核酸编码用于吞噬作用的嵌合抗原受体(CAR-P)。在一些实施方案中，重组核酸编码吞噬细胞受体(PR)融合蛋白。
在一些实施方案中，由重组核酸编码的CFP的ICD包含来自选自以下各项的蛋白质的结构域：TNFR1、CD40、MDA5、凝集素、dectin1、甘露糖受体(CD206)、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)和CD169受体。
在一些实施方案中，ICD包含衍生自以下各项的任何一种或多种的信号传导结构域：凝集素、dectin 1、甘露糖受体(CD206)、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO(具有胶原结构的巨噬细胞受体，别名：SRA6、SCARA2)、CD36(血小板反应蛋白受体，别名：清道夫受体B类，成员3)、CD163(清道夫受体，富含半胱氨酸-1型)、MSR1、SCARA3、COLEC12(别名：具有C型凝集素、SCARA4或胶原凝集素12的清道夫受体)、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68(SCARD、微唾液酸转运蛋白)、OLR1(氧化低密度脂蛋白受体1、LOX1或C型凝集素结构域家族8成员A)、SCARF1、SCARF2、SRRCB4D、SSC5D和CD169(别名，唾液酸粘附素受体，SIGLEC1)。
在一些实施方案中，重组核酸编码例如，人MARCO的胞内结构域。PR亚基可以包含具有人MARCO的44个氨基酸的胞内结构域ICD，其具有氨基酸序列：MRNKKILKEDELLSETQQAAFHQIAMEPFEINVPKPKRRNGVNF。在一些实施方案中，PR亚基包含与MARCO的胞内结构域至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的变体。在一些实施方案中，PR包含人MARCO的跨膜区。
在一些实施方案中，重组核酸编码人SRA1的胞内结构域。CFP包含具有人SRA1的50个氨基酸的胞内结构域ICD，其具有氨基酸序列：MEQWDHFHNQQEDTDSCSESVKFDARSMTALLPPNPKNSPSLQEKLKSFK。在一些实施方案中，PR亚基包含与人SRA1的胞内结构域至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的变体。SRA的胞内区具有磷酸化位点。
在一些实施方案中，CFP包含人SRA1的跨膜区。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码CD36的胞内结构域的序列。在一些实施方案中，重组核酸包含编码CD36的TM结构域的序列。天然存在的全长CD36具有两个TM结构域和两个短的胞内结构域，且CD36的胞外结构域与氧化的LDL结合。两个胞内结构域都含有脂肪酸酰化的半胱氨酸对。它缺乏已知的信号传导结构域(例如，激酶、磷酸酶、g-蛋白结合或支架结构域)。N端胞质结构域极短(5-7个氨基酸残基)，并且与质膜内部小叶紧密相连。羧基末端结构域包含13个氨基酸，包含与CD4和CD8的胞内结构域中已知与信号传导分子相互作用的区域同源的CXCX5K基序。CD36的胞内结构域能够组装信号传导复合物，其激活lyn激酶、MAP激酶和粘着斑激酶(FAK)，并使含有src同源性2的磷酸酪氨酸磷酸酶(SHP-2)失活。鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的成员已被确定为潜在的关键信号传导中间体。
在一些实施方案中，重组核酸编码例如，人SCARA3的胞内结构域。CFP可以包含具有人SCARA3的56个氨基酸的胞内结构域ICD，其具有氨基酸序列：MKVRSAGGDGDALCVTEEDLAGDDEDMPTFPCTQKGRPGPRCSRCQKNLS LHTSVR。在一些实施方案中，CFP包含与人SCARA3的胞内结构域至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性的变体。在一些实施方案中，CFP包含SCARA3的TM结构域。
在一些实施方案中，PR的TM结构域长约20-30个氨基酸。在一些实施方案中，TM结构域包含多个跨膜跨度。在一些实施方案中，TM结构域的长度包含约20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150或更多个氨基酸。在一些实施方案中，SR的TM结构域长约20-30个氨基酸。
清道夫受体可以以同二聚体或异二聚体形式出现。例如，MARCO以同三聚体形式出现。在一些实施方案中，清道夫受体是单体。在一些实施方案中，清道夫受体是同二聚体。在一些实施方案中，清道夫受体是异二聚体。在一些实施方案中，清道夫受体是同三聚体。在一些实施方案中，清道夫受体是异三聚体。在一些实施方案中，清道夫受体是同四聚体。在一些实施方案中，清道夫受体是异四聚体。在一些实施方案中，清道夫受体是包含相同或不同的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、十个或更多个亚基的多聚体。
在一些实施方案中，PSP的TM结构域或ICD结构域不是衍生自FcR、Megf10、Bai1或MerTK。在一些实施方案中，PR的ICD不包含CD3ζ胞内结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域和跨膜结构域衍生自FcRβ。
在一个方面，重组核酸编码增强的吞噬作用的嵌合抗原受体(CAR-P)，其是吞噬清道夫受体(PSR)融合蛋白(PFP)，包括：(a)胞外结构域，包含对靶细胞的抗原特异的胞外抗原结合结构域，(b)跨膜结构域，和(c)重组PSR胞内信号传导结构域，其中重组PSR胞内信号传导结构域包含衍生自吞噬细胞受体的第一部分和衍生自非吞噬细胞受体的第二部分。
在一些实施方案中，第二部分不是PI3K募集结构域。
衍生自非吞噬细胞受体的第二部分可包含胞内信号传导结构域，其增强表达重组核酸的工程化髓系细胞(例如吞噬细胞)的吞噬作用和/或炎症潜能。在一些实施方案中，衍生自非吞噬细胞受体的第二部分包含多于一个胞内结构域(ICD)。在一些实施方案中，衍生自非吞噬细胞受体的第二部分包含第二ICD。在一些实施方案中，衍生自非吞噬细胞受体的第二部分包含第二和第三ICD。在一些实施方案中，衍生自非吞噬细胞受体的第二部分包含第二、第三和第四ICD，其中第二部分由重组核酸编码。在一些实施方案中，细胞内部分包含两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个ICD。包含衍生自非吞噬细胞受体的第二、或第三或第四ICD的相应第二部分描述如下。
用于增强胞内信号传导和炎症激活的嵌合抗原受体
在一个方面，重组核酸编码除吞噬性ICD之外的第二胞内结构域，其赋予有效促炎免疫激活的能力，例如当髓系细胞如巨噬细胞参与对抗感染时。第二胞内结构域(第二ICD)融合到第一吞噬性ICD的胞质末端。第二胞内结构域提供了触发炎性体和促炎信号所必需的第二信号。Nod样受体(NLR)是先天免疫反应中激活的受体亚群，其寡聚化以形成多蛋白复合物，多蛋白复合物充当募集促炎半胱天冬酶并诱导其切割和激活的平台。这导致ROS的直接激活，并经常导致称为细胞焦亡的剧烈细胞死亡。有四种炎性体复合物，NLRP1m、NLRP3、IPAF和AIM2。
肿瘤微环境(TME)构成了免疫抑制环境。Il-10、糖皮质激素、凋亡细胞和免疫复合物的影响可干扰先天免疫细胞功能。包括吞噬细胞在内的免疫细胞形成耐受性表型。在诸如巨噬细胞的髓系细胞中，这种表型，通常称为M2表型，与M1表型不同，M1表型中的细胞是有效的并且能够杀死病原体。例如，暴露于LPS或IFNγ的髓系细胞，例如巨噬细胞，可极化为M1表型，而暴露于IL-4或IL-13的髓系细胞，如巨噬细胞，可极化为M2表型。LPS或IFNγ可与诸如巨噬细胞的髓系细胞表面上的Toll样受体4(TLR4)相互作用，诱导Trif和MyD88通路，诱导转录因子IRF3、AP-1和NFKB的激活，从而激活TNF基因、干扰素基因、CXCL10、NOS2、IL-12等，用于促炎性M1髓系细胞反应。类似地，IL-4和IL-13与IL-4R结合，激活Jak/Stat6通路，其调节CCL17、ARG1、IRF4、IL-10、SOCS3等的表达，这些基因是与抗炎症反应(M2反应)相关的基因。CD14、CD80、D206的表达和CD163的低表达是髓系细胞(如巨噬细胞)向M1表型极化的指标。
在一些实施方案中，重组核酸编码一个或多个另外的胞内结构域，包括用于炎症反应的胞质结构域。在一些实施方案中，编码包含用于工程化髓系细胞(例如巨噬细胞)中的炎症反应的胞质结构域的吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸的表达赋予类似于M1表型的强促炎症反应。
在一些实施方案中，用于炎症反应的细胞质结构域包含TLR3、TLR4、TLR9、MYD88、TRIF、RIG-1、MDA5、CD40、IFN受体、NLRP-1、NLRP-2、NLRP-3、NLRP-4、NLRP-5、NLRP-6、NLRP-7、NLRP-8、NLRP-9、NLRP-10、NLRP-11、NLRP-12、NLRP-13、NLRP-14、NOD1、NOD2、脓素、AIM2、NLRC4和/或CD40的胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，吞噬清道夫受体(PR)融合蛋白(PFP)包含用于激活IL-1信号传导级联的促炎胞质结构域。
在一些实施方案中，嵌合受体(例如，吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP))的胞质部分包含来自toll样受体的胞质结构域，例如toll样受体3(TLR3)、toll样受体4(TLR4)、toll样受体7(TLR7)、toll样受体8(TLR8)、toll样受体9(TLR9)的胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，嵌合受体的胞质部分包含来自白介素-1受体相关激酶1(IRAK1)的合适区域。
在一些实施方案中，嵌合受体的胞质部分包含来自分化初级反应蛋白(MYD88)的合适区域。
在一些实施方案中，嵌合受体的胞质部分包含来自髓磷脂和淋巴细胞蛋白(MAL)的合适区域。
在一些实施方案中，嵌合受体的胞质部分包含来自视黄酸诱导基因(RIG-1)的合适区域。
在一些实施方案中，CFP的胞质部分包含MYD88、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、MAL或IRAK1中任一个的胞质结构域。
在一些实施方案中，重组CFP胞内信号传导结构域包含衍生自吞噬细胞的第一部分和衍生自非吞噬细胞受体的第二部分，其中衍生自非吞噬细胞受体的第二部分包含磷酸化位点。在一些实施方案中，磷酸化位点包含适用于自磷酸化位点的氨基酸序列。在一些实施方案中，磷酸化位点包含适合被Src家族激酶磷酸化的氨基酸序列。在一些实施方案中，磷酸化位点包含氨基酸序列，其在磷酸化时能够结合激酶中的SH2结构域。在一些实施方案中，除了第一胞质部分之外，受体酪氨酸激酶结构域在PFP的胞质末端融合。
在一些实施方案中，磷酸化是酪氨酸磷酸化。
在一些实施方案中，第二胞内结构域是免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。ITAM基序存在于哺乳动物α和β免疫球蛋白、TCRγ受体、FCRγ受体亚基、CD3链受体和NFAT激活分子中。
在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含一个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含多于一个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含两个或更多个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含三个或更多个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含四个或更多个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含五个或更多个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含六个或更多个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含七个或更多个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含八个或更多个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含九个或更多个ITAM基序。在一些实施方案中，PFP胞内结构域包含十个或更多个ITAM基序。
在一些实施方案中，第一吞噬ICD中的一个或多个结构域包含突变。
在一些实施方案中，第二ICD中的一个或多个结构域包含突变以增强激酶结合结构域、产生磷酸化位点、产生SH2对接位点或其组合。
炎症基因的共表达
在一个方面，重组核酸包含促炎基因的编码序列，其在工程化细胞中与PFP共表达。在一些实施方案中，促炎基因是细胞因子。实例包括但不限于TNF-α、IL-1α、IL-1、IL-6、CSF、GMCSF或IL-12或干扰素。
编码促炎基因的重组核酸可以是单顺反子的，其中(a)PSP和(b)促炎基因的两个编码序列被转录后或翻译后切割以独立表达。
在一些实施方案中，两个编码序列包含例如编码P2A序列的自切割结构域。
在一些实施方案中，两个编码区被IRES位点分开。
在一些实施方案中，两个编码序列由双顺反子遗传元件编码。(a)PSP和(b)促炎基因的编码区可以是单向的，其中每个都处于单独的调控控制之下。在一些实施方案中，两者的编码区是双向的并且以相反方向驱动。每个编码序列都处于单独的调控控制之下。
促炎基因的共表达旨在赋予髓系细胞(如巨噬细胞)强烈的炎症刺激，并激活周围组织的炎症。
整合素激活结构域
细胞-细胞和细胞-基质粘附是由整合素胞外结构域与多种蛋白质配体的结合介导的；然而，这些粘附相互作用的细胞控制及其转化为动态细胞反应，如细胞扩散或迁移，需要整合素胞质尾区。这些短尾与胞内配体结合，胞内配体将受体连接到信号传导通路和细胞骨架网络(Calderwood DA,2004,Integrin Activation,Journal of CellScience117,657-666，其全文并入本文)。整合素是由α和β亚基非共价结合形成的异二聚体粘附受体。每个亚基都是I型跨膜糖蛋白，具有相对较大的胞外结构域，并且除了β4亚基外，还有短的胞质尾区。个体整合素家族成员具有识别多个配体的能力。整合素可以与大量的胞外基质蛋白(骨基质蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、玻连蛋白和血管性血友病因子)结合，反映了整合素在细胞与胞外基质粘附中的主要功能。许多“反受体”是配体，反映了整合素在介导细胞间相互作用中的作用。整合素经历构象变化以增加配体亲和力。
整合素β2亚家族由四种不同的整合素受体组成：αMβ2(CD11b/CD18,Mac-1、CR3,Mo-1)、αLβ2(CD11a/CD18、LFA-1)、αXβ2(CD11c/CD18)和αDβ2(CD11d/CD18)。这些白细胞整合素几乎参与白细胞功能的每个方面，包括免疫反应、内皮细胞的粘附和通过内皮细胞的转运、病原体的吞噬作用和白细胞激活。
所有β2整合素的α亚基包含约200个氨基酸的插入区域，称为I或A结构域。在其他几种整合素α亚基和其他蛋白质(例如，某些凝血和补体蛋白)中发现了高度保守的I结构域。I结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用，并且在整合素中，它们完整地参与蛋白质配体的结合。尽管I结构域在其整合素的配体结合功能中占主导地位，但α亚基的其他区域确实影响配体识别。例如，在αMβ2中，识别I结构域外但在αM亚基中的表位的mAb(OKM1)抑制配体结合；αLβ2和α2β1中的EF-手掌区，在其α亚基中具有I结构域的整合素，有助于配体识别。αM亚基，也许还有其他α亚基，包含凝集素样结构域，它参与非蛋白质配体的结合，并且占据可能调节I结构域的功能。
由于整合素缺乏酶活性，信号传导是由质膜细胞质面上的信号传导复合物的组装诱导的。这些复合物的形成以两种方式实现：首先，通过受体群集，增加了分子相互作用的亲合力，从而增加了效应分子的结合率，其次，通过诱导受体的构象变化，产生或暴露效应结合位点。在ECM中，整合素能够结合纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、腱生蛋白、玻连蛋白和血小板反应蛋白。整合素/ECM相互作用的簇形成粘着斑，将细胞骨架组分和信号传导分子集中在细胞内。整合素的胞质尾区充当α-辅肌动蛋白和踝蛋白的结合位点，然后募集粘着斑蛋白——参与将F-肌动蛋白锚定到膜上的蛋白质。踝蛋白被激酶激活，例如蛋白激酶C(PKCα)。
整合素由选择素激活。白细胞表达L-选择素，激活的血小板表达P-选择素，且激活的内皮细胞表达E-选择素和P-选择素。P-选择素介导的粘附能实现β2整合素的趋化因子或血小板激活因子触发的激活，其稳定粘附。它还有助于从粘附的白细胞中释放趋化因子。P-选择素糖蛋白配体1的胞质结构域与Nef相关因子1形成组成型复合物。在结合P-选择素后，Src激酶磷酸化Nef相关因子1，其募集磷酸肌醇-3-OH激酶p85-p110δ异二聚体并导致白细胞整合素的激活。E-选择素配体转导也影响β2整合素功能的信号。选择素触发Src家族激酶的激活。通过选择素参与而激活的SFK磷酸化DAP12和FcRγ胞质结构域中基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。在一些方面，CD44足以转导来自E-选择素的信号。CD44触发整合素的由内而外的信号传导。整合素激活的最后一个常见步骤是将踝蛋白结合到β亚基的胞质尾区。Kindlin是另一组胞质接头，与整合素β尾区的不同区域结合。Kindlin增加了踝蛋白激活的整合素的群集。Kindlin对选择素信号传导有反应，然而，kindlin主要存在于造血细胞中，例如嗜中性粒细胞。选择素信号传导以及趋化因子组分激活整合素后的信号传导具有共同的组分，包括SFK、Syk和SLP-76。
在一些实施方案中，重组CFP的胞内结构域包含整合素激活结构域。整合素激活结构域包含选择素的胞内结构域，例如P-选择素、L-选择素或E-选择素。
在一些实施方案中，重组CFP的胞内结构域包含层粘连蛋白的整合素激活结构域。
在一些实施方案中，重组CFP的胞内结构域包含用于踝蛋白激活的整合素激活结构域。
在一些实施方案中，重组CFP的胞内结构域包含与吞噬细胞受体ICD结构域的胞质末端融合的整合素激活结构域。
用于增强抗原交叉呈递的嵌合受体
在一些实施方案中，重组核酸编码能够使抗原交叉呈递的结构域。通常，MHC I类分子呈递在细胞内合成的自身或病原体衍生的抗原，而通过内吞摄取衍生的外源性抗原被加载到MHC II类分子上以呈递给CD4+T细胞。内源性抗原的MHC I限制性呈递，其中肽由蛋白酶体产生。然而，在某些情况下，DC可以将外源性抗原加工成MHC-I通路以呈递给CD8+T细胞。这被称为抗原的交叉呈递。可溶性或外源性抗原组分可能被液泡中的溶酶体蛋白酶降解并被DC交叉呈递，而不是遵循内吞通路。在某些情况下，分子伴侣，例如热激蛋白质90(Hsp90)已显示有助于某些APC交叉呈递抗原。已知与游离多肽相比，HSP-肽复合物被一组不同的受体内化。这些受体来自清道夫受体家族，且包括LOX-1、SREC-I/SCARF-I和FEEL1/Stabilin-1。SREC-1和LOX-1均已显示介导分子伴侣结合的抗原的交叉呈递并导致CD8+T淋巴细胞的激活。
SREC-1(通过内皮细胞表达的清道夫受体)与其他类型的清道夫受体没有明显的同源性，但具有独特的结构域结构。它在胞外结构域中包含10个富含EGF样半胱氨酸基序的重复。最近，SREC-I的结构被证明与具有由秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)基因ced-I编码的16个EGF样重复序列的跨膜蛋白的结构相似，其充当识别凋亡细胞的细胞表面吞噬细胞受体。
通过I类MHC通路交叉呈递癌抗原导致增强的CD8+T细胞反应，这与细胞毒性有关，因此有利于肿瘤消退。在一些实施方案中，PFP的胞内结构域包含SREC1胞内结构域。在一些实施方案中，PFP的胞内结构域包含SRECII胞内结构域。
在一些实施方案中，CFP包括：包含来自SREC1或SRECII的PSR胞内信号传导结构域的胞内结构域。
在一些实施方案中，CFP包括：(i)跨膜结构域，和(ii)包含来自SREC1或SRECII的CFP胞内信号传导结构域的胞内结构域。
在一些实施方案中，CFP包括：(i)跨膜结构域，(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域，和(iii)来自SREC1或SRECII的胞外结构域。
PFP融合蛋白的跨膜结构域
在一些实施方案中，由重组核酸编码的TM包含编码清道夫受体(SR)结构域的序列。在一些实施方案中，TM可以是以下各项中的任何一种或多种的TM结构域或衍生自以下各项中的任何一种或多种的TM结构域：凝集素、dectin 1、甘露糖受体(CD206)、SRA1、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、SRCRB4D、SSC5D和CD169。
在一些实施方案中，TM结构域长约20-30个氨基酸。SR的TM结构域长约20-30个氨基酸。
在一些实施方案中，CFP的TM结构域或ICD结构域并非衍生自Megf10、Bai1或MerTK。在一些实施方案中，CFP的ICD不包含CD3ζ胞内结构域。
在一些实施方案中，TM衍生自与ICD相同的吞噬细胞受体。
在一些实施方案中，TM区衍生自质膜蛋白。TM可以选自Fc受体(FcR)。在一些实施方案中，编码来自特定FcR的结构域的核酸序列用于重组构建体的细胞特异性表达。包含TM结构域的FCR-α区可用于髓系细胞，例如巨噬细胞，构建体的特异性表达。FcRα重组蛋白可以在肥大细胞中表达。
在一些实施方案中，PFP包含FcRβ的TM。
在一些实施方案中，PFP包含FcRβ和ICD结构域两者。在一些实施方案中，PFP包含FcRα和ICD结构域两者。
在一些实施方案中，TM结构域衍生自CD8。
在一些实施方案中，TM衍生自CD2。
在一些实施方案中，TM衍生自FcRα。
PFP融合蛋白的胞外结构域
在一些实施方案中，本文提供的PFP融合蛋白的胞外结构域包含结合一种或多种靶标的抗原结合结构域。结合靶标可以是抗原或配体。例如，结合靶标可以是靶细胞上的抗原。在一些实施方案中，靶标结合结构域对靶标是特异性的。在一些实施方案中，胞外结构域可包括选自胞内抗体、肽抗体、纳米抗体、单域抗体的抗体或抗原结合结构域。SMIP和多特异性抗体。
在一些实施方案中，抗体片段包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。在本发明的另一方面，根据上述任一实施方案的抗HIV抗体是单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。抗体片段包括但不限于，Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、双抗体、线性抗体、由抗体片段抗体和scFv片段以及下文描述的其他片段形成的多特异性抗体。在另一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整的IgGl抗体或本文所述的其他抗体类别或同种型。(参见，例如，Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；Pluckthiin,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷，第269-315页(1994)；Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Wo93/01161；和美国专利号5,571,894、5,869,046、6,248,516和5,587,458)。全长抗体、完整抗体或整个抗体是具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有包含如本文定义的Fc区的重链的抗体。抗体片段可以通过各种技术制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述。
Fv是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段包含紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区的二聚体。从这两个结构域的折叠中产生六个高变环(来自H链和L链各三个环)，这些高变环为抗原结合提供氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变区(或仅包含三个对抗原特异的CDR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。
单链Fv(sFv或scFv)是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。sFv多肽可以在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得sFv能够形成期望的抗原结合结构。(参见例如，Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)；Borrebaeck1995,下文。sFv可用于嵌合抗原受体(CAR)。
双抗体是通过在VH和VL结构域之间构建具有短接头(约5-10个残基)的sFv片段来制备的小抗体片段，从而实现V结构域的链间而非链内配对，产生二价片段。双特异性双抗体是两个交叉sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。(参见例如，EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))。
结构域抗体(dAb)可以完全人的形式产生，是抗体的最小已知抗原结合片段，范围从约11kDa至约15kDa。DAb是免疫球蛋白重链和轻链的强大可变区(分别为VH和VL)。它们在微生物细胞培养物中高度表达，显示出良好的生物物理特性，包括例如但不限于溶解度和温度稳定性，并且非常适合通过体外选择系统(例如，噬菌体展示)进行选择和亲和力成熟。Dab作为单体具有生物活性，由于它们的小尺寸和固有的稳定性，可以格式化为大的分子，以制造具有延长的血清半衰期或其他药理活性的药物。(参见例如，W09425591和US20030130496)。
Fv和sFv是唯一具有没有恒定区的完整结合位点的物种。因此，它们适用于在体内使用期间减少非特异性结合。可以构建sFv融合蛋白以在sFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合。抗体片段也可以是“线性抗体。(参见例如，美国专利号5,641,870)。这种线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
在一些实施方案中，胞外结构域包括Fab结合结构域。在其他这样的实施方案中，胞外结构域包括scFv。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含衍生自以下各项组成的组的胞外抗原结合结构域：抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、单域抗体(sdAb)、VNAR结构域和VHH结构域、双特异性抗体、双抗体或其任何的功能片段。在一些实施方案中，抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、单域抗体(sdAb)、VNAR结构域和VHH结构域、双特异性抗体、双抗体或其任何的功能片段特异性结合一种或多种抗原。
在一些实施方案中，抗原是癌抗原，并且靶细胞是靶癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞的抗原选自CD3、CD4、CD5、CD7、CD19、CCR2、CCR4、CD30、CD37、TCRB1/2、TCRαβ、TCRαδ。CD22、HER2(ERBB2/neu)、间皮素、PSCA、CD123、CD30、CD171、CD138、CS-1、CLECL1、CD33、CD79b、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、PSMA、ROR1、FLT3、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3(CD276)、KIT(CD 117)、CD213A2、IL-1IRa、PRSS21、VEGFR2、CD24、MUC-16、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、MUC1、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、FAP、EphA2、GM3、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CD97、CD179a、ALK和IGLL1。
在一些实施方案中，靶抗原是自身免疫抗原。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是产生自身抗体的B细胞。在一些实施方案中，靶抗原是Dsg1或Dsg3。
多种癌抗原靶标可选自本领域技术人员已知的癌抗原。根据癌症和涉及的细胞类型，癌抗原是突变的天然蛋白质。筛选针对突变/癌抗原而非天然抗原具有特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌抗原可以是突变/癌抗原中的一种或多种：MUC16、CCAT2、CTAG1A、CTAG1B、MAGE A1、MAGEA2、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA6、PRAME、PCA3、MAGEC1、MAGEC2、MAGED2、AFP、MAGEA8、MAGE9、MAGEA11、MAGEA12、IL13RA2、PLAC1、SDCCAG8、LSP1、CT45A1、CT45A2、CT45A3、CT45A5、CT45A6、CT45A8、CT45A10、CT47A1、CT47A2、CT47A3、CT47A4、CT47A5、CT47A6、CT47A8、CT47A9、CT47A10、CT47A11、CT47A12、CT47B1、SAGE1和CT55。
在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌抗原可以是突变/癌抗原中的一种或多种：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD30、CXCR4、CD45、CD56，其中癌症是T细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌抗原可以是突变/癌抗原中的一种或多种：IDH1、ATRX、PRL3或ETBR，其中癌症是胶质母细胞瘤。
在一些实施方案中，例如，靶癌细胞的癌抗原可以是突变/癌抗原中的一种或多种：CA125、β-hCG、尿促性腺激素片段、AFP、CEA、SCC、抑制素或外二醇，其中癌症是卵巢癌。
在一些实施方案中，靶癌细胞的癌抗原可以是CD5。
在一些实施方案中，靶癌细胞的癌抗原可以是HER2。
在一些实施方案中，靶癌细胞的癌抗原可以是EGFR变体III。
在一些实施方案中，靶癌细胞的癌抗原可以是CD19。
在一些实施方案中，SR亚基区包含清道夫受体的胞外结构域(ECD)。在一些实施方案中，清道夫受体的ECD包含含ICD和TM结构域的SR的ECD结构域。在一些实施方案中，靶抗原是癌细胞上的SR-配体，例如来自表2或表3的任何一种配体组分。在一些实施方案中，SR-ECD有助于吞噬细胞与靶细胞的结合，进而被激活，并激活靶细胞的吞噬作用。
在一些实施方案中，CFP包括清道夫受体的ECD或其部分。在一些实施方案中，CFP包括清道夫受体的ICD或其部分。在一些实施方案中，CFP包含清道夫受体的TM结构域。在一些实施方案中，由重组核酸编码的ECD包含选自：凝集素、dectin 1、甘露糖受体(CD206)、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)和CD169的结构域。大多数清道夫受体的胞外结构域包含具有广泛结合特异性的清道夫受体，其可用于在外来物质的非特异性抗体非依赖性识别中区分自身和非自身。I型和II型A类清道夫受体(SR-AI1和SR-AII)是三聚体膜糖蛋白，具有小的NH2末端胞内结构域，且胞外部分含有短间隔区结构域、a-螺旋卷曲螺旋结构域和三螺旋胶原结构域。I型受体还包含富含半胱氨酸的COOH末端(SRCR)结构域。这些受体存在于全身不同组织的髓系细胞(如巨噬细胞)中，并表现出异常广泛的配体结合特异性。它们结合多种聚阴离子，包括化学修饰的蛋白质，例如修饰的LDL，并且它们与动脉粥样硬化形成过程中的胆固醇沉积有关。它们还可能在巨噬细胞相关宿主防御和炎症条件下的细胞粘附过程中发挥作用。
在一些实施方案中，SR ECD被设计为与促凋亡细胞结合。在一些实施方案中，清道夫受体ECD包含针对癌细胞或受感染细胞的细胞表面分子的结合结构域。
在一些实施方案中，PR亚基的胞外结构域通过接头连接至靶细胞结合结构域，例如对癌抗原特异的抗体或其部分。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含一个抗原结合结构域。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含多于一个结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域是scFv。图2显示了一个实施方案的图形表示，其中PFP靶向癌细胞上的单个靶标(左)或多个靶标(右)。一种或多于一种scFv在胞外结构域与重组PR融合。在一些实施方案中，scFv级分和PR的胞外结构域通过接头连接。
在一些实施方案中，ECD抗原结合结构域可以结合胞内抗原。在一些实施方案中，胞内抗原是癌抗原。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以小于1000nM的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以小于500nM的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以小于450nM的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以小于400nM的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以小于350nM的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以小于250nM的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以小于200nM的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以小于100nM的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以范围在200nM至1000nM之间的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域以范围在300nM至1.5mM之间的亲和力结合靶配体。在一些实施方案中，抗原结合结构域以>200nM、>300nM或>500nM的亲和力结合靶配体。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域结合靶配体，其中靶配体是T细胞，结合特征使得靶T细胞不被触发以激活工程化细胞的T细胞介导的裂解。在一些实施方案中，TCR与工程化细胞上的配体的结合被避免、绕过或抑制。
接头
接头可用于连接本公开的任何多肽或肽结构域。本文所述的PFP融合蛋白可包含一个或多个接头。例如，PFP融合蛋白的一个或多个结构域和亚基可以直接与另一个结构域或亚基融合，或者可以通过接头连接到另一个结构域或亚基。在一些实施方案中，包含对靶细胞上的抗原具有特异性的抗体、可与靶细胞上的抗原特异性结合的抗体部分或对靶细胞上的抗原具有特异性的scFv的胞外抗原结合结构域通过接头连接至TM结构域或其他胞外结构域。在一些实施方案中，在胞外抗原结合结构域处有多于一个scFv的情况下，多于一个scFv通过接头彼此连接。
在一些实施方案中，接头是短肽序列。
接头可以像共价键一样简单，或者它可以是多个原子长度的聚合物接头。在某些实施方案中，接头是多肽或基于氨基酸。在其他实施方案中，接头不是肽样的。在某些实施方案中，接头是共价键(例如，碳-碳键、二硫键、碳-杂原子键等)。
在一些实施方案中，接头是一个氨基酸或多个氨基酸(例如，肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是键(例如，共价键)、有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一些实施方案中，接头的长度为约3至约104(例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100)个氨基酸。在一些实施方案中，接头是甘氨酸的段和一个或多个丝氨酸残基。对于短肽接头优选的其他氨基酸包括但不限于，苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)和丙氨酸(Ala)精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)。其中Pro、Thr和Gln是用于天然接头常用的氨基酸。Pro是一种具有环状侧链的独特氨基酸，其导致非常受限制的构象。富含Pro的序列用作域间接头，包括丙酮酸脱氢酶中的硫辛酰基和E3结合结构域之间的接头(GA2PA3PAKQEA3PAPA2KAEAPA3PA2KA)。出于本公开的目的，经验接头可以是柔性接头、刚性接头和可切割接头。序列例如(G4S)x(其中x是该部分的多个拷贝，指定为1、2、3、4等)包含柔性接头序列。本文使用的其他柔性序列包括甘氨酸的几个重复序列，例如(Gly)6或(Gly)8。另一方面，可以使用刚性接头，例如接头(EAAAK)x，其中x是整数，1、2、3、4等产生刚性接头。可以使用本文提供的融合蛋白的结构域或亚基之间的各种接头长度和柔性，例如，范围从非常柔性的形式(GGGS)n、(GGGGS)n和(G)n的接头到更刚性的形式(EAAAK)n、(SGGS)n、SGSETPGTSESATPES的接头(参见例如，Guilinger JP,ThompsonDB,Liu DR.Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves thespecificity of genome modification.Nat.Biotechnol.2014；32(6):577-82；全部内容通过引用并入本文)和(XP)n)以实现最佳长度。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，接头包含(GGS)n基序，其中n是1、3或7。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列SGGGGSG。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列GSGS。
在一些实施方案中，接头是柔性的。在一些实施方案中，接头包含铰链区。如果包括，这样的间隔区或接头结构域可以将结合结构域定位在远离宿主细胞表面的位置，以进一步实现适当的细胞/细胞接触、结合和激活。可以改变胞外间隔区的长度以基于所选靶分子、所选结合表位、结合结构域大小和亲和力优化靶分子结合。在某些实施方案中，胞外间隔区结构域是免疫球蛋白铰链区(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD)。免疫球蛋白铰链区可以是野生型免疫球蛋白铰链区或改变的野生型免疫球蛋白铰链区。在一些实施方案中，本文使用的接头或间隔区包含具有以下序列的IgG4铰链区：ESKYGPPCPPCP。在一些实施方案中，铰链区包含铰链或间隔区，其包含存在于1型膜蛋白(例如CD8a、CD4、CD28和CD7)的胞外区中的序列，其可以是野生型或其变体。在一些实施方案中，胞外间隔区结构域包含选自以下各项的免疫球蛋白Fc结构域的全部或部分：CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域或其组合。在一些实施方案中，间隔区或接头可以通过翻译后修饰例如糖基化进一步修饰。
在一些实施方案中，胞外间隔区结构域可包含II型C-凝集素的茎区(位于C型凝集素结构域和跨膜结构域之间的胞外结构域)。II型C-凝集素包括CD23、CD69、CD72、CD94、NKG2A和NKG2D。在更进一步的实施方案中，胞外间隔区结构域可以衍生自清道夫受体MERTK。
在一些实施方案中，接头包含至少2个或至少3个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含4个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含5个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含6个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含7个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含8个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含9个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含8个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含10个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含大于10个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在一些实施方案中，接头中有12个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头中有14个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头中有15个或更多个氨基酸。
用于增强吞噬作用的其他融合蛋白
在本公开的一个方面，制备了编码一种或多种嵌合受体的重组核酸，所述嵌合受体主要通过阻断抑制信号来增强髓系细胞如巨噬细胞的吞噬作用。髓系细胞，例如巨噬细胞，尤其是在肿瘤环境中遇到吞噬阻制或抑制信号，例如对靶细胞(例如癌细胞)上的CD47介导的抗吞噬活性。产生嵌合受体，当其在吞噬细胞中表达时会阻断CD47信号传导。
在一些实施方案中，可设计其他CAR融合蛋白以在可增强吞噬作用的吞噬细胞中表达。在一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白(CFP)的重组核酸，包含：(a)亚基，该亚基包括：(i)胞外结构域；(ii)跨膜结构域；(b)对靶细胞的CD47具有特异性的胞外抗原结合结构域；其中：亚基的胞外结构域和胞外抗原结合结构域可操作地连接；并且该亚基不包含结合CD47的内源性受体的功能性胞内结构域，或不包含激活磷酸酶的胞内结构域。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域衍生自信号调控蛋白α(SIRPα)。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域衍生自信号调控蛋白β(SIRPβ)。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自SIRPα。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自SIRPβ。
在一些实施方案中，另外的CAR融合蛋白(CFP)可以与上述重组PFP共转染。在一些实施方案中，清道夫受体胞内结构域包含第二胞内结构域，该第二胞内结构域包含激活吞噬作用的信号传导结构域；或在胞质末端的促炎结构域，它们可操作地连接。激活吞噬作用的信号传导结构域来自一种受体，该受体选自表2中列出的受体。
在一些实施方案中，具有吞噬作用信号传导结构域的胞内结构域包括具有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(Immunoreceptor Tyrosine-based ActivationMotif，ITAM)基序的结构域。ITAM是存在于免疫系统的几种受体(例如，T细胞受体、免疫球蛋白(Ig)和FcR)的胞质尾区的保守序列。它们具有保守的氨基酸序列基序，由定义的间隔(YXXL/I-X6-8-YXXL/I)隔开的成对的YXXL/I基序(Y＝酪氨酸，L＝赖氨酸和I＝异亮氨酸)组成。此外，大多数ITAM在相对于第一ITAM酪氨酸的+2位置包含带负电荷的氨基酸(D/E)。ITAM内的残基的磷酸化招募几种激活吞噬作用的信号传导分子。ITAM基序也存在于胞内衔接子蛋白中，即12kDa的DNAX激活蛋白(DAP12)。
在一些实施方案中，胞内区域中的吞噬信号传导结构域包含PI3激酶(PI3K)募集结构域(也称为PI3K结合结构域)。本文使用的PI3K结合结构域可以是CD19、CD28、CSFR或PDGFR的相应PI3K结合结构域。PI3激酶募集到结合结构域导致Akt介导的信号级联反应和吞噬作用的激活。PI3K-Akt信号传导通路在吞噬作用、炎症反应的调节和其他活动中很重要，所述活动包括囊泡运输和细胞骨架重组。PI3激酶募集结构域是质膜蛋白中的细胞内结构域，其具有可被磷酸化的酪氨酸残基，其进而可被PI3Kp85的Src同源结构域(SH2)结构域识别。p85的SH2结构域识别受体胞质结构域上的磷酸化酪氨酸。这会导致p110的变构激活和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)的产生，其被酶Akt和组成型活性3'-磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK1)通过它们的plekstrin同源结构域识别。Akt与PIP3的相互作用导致Akt构象的变化以及PDK1和rictor-mTOR复合物分别对残基Thr308和Ser473的磷酸化。这两个残基的磷酸化导致Akt的激活，Akt进而磷酸化糖原合酶激酶3(GSK-3)等底物。GSK-3有两种同种型，GSK-3α和GSK-3β，它们都具有组成型活性。同种型在结构上相关但在功能上是非冗余的。当GSK-3α中的Ser21残基或GSK-3β中的Ser9残基(位于其调控N端结构域中)被Akt和其他激酶磷酸化时，观察到GSK-3的失活。通过磷酸化抑制GSK-3对于调节炎症和吞噬过程很重要。
在一些实施方案中，重组PFP包含(a)胞外CD47结合结构域SIRPα，(b)SIRPβ跨膜结构域，和(c)SIRPβ的胞内结构域。SIRPβ信号传导可以通过参与DAP12激活来激活促吞噬信号传导。
该家族的各种成员在与膜蛋白上的唾液酸化聚糖接触时会转导检查点信号。在一些成员中，Siglec蛋白的胞内结构域包含多个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。ITIM在其胞质尾区共享共有氨基酸序列，即(I/V/L/S)-X-Y-X-X-(L/V)，其中X表示任何氨基酸，I＝异亮氨酸，V＝缬氨酸，L＝赖氨酸，S＝丝氨酸，Y＝酪氨酸。ITIM基序上酪氨酸残基的磷酸化会募集两个含SH2结构域的负调节因子中的任一个：肌醇磷酸酶SHIP(含Src同源性2的肌醇多磷酸5-磷酸酶)或酪氨酸磷酸酶SHP-1(含Src同源性2的蛋白质酪氨酸磷酸酶-1)。(Y+2)位置的亮氨酸有利于与SHIP结合，而(Y-2)位置的异亮氨酸有利于SHP-1结合。ITIM也可以与另一种酪氨酸磷酸酶SHP-2结合，但SHP-2在ITIM介导的抑制中发挥功能作用的证据不如其他介质清楚。因此，通过与唾液酸残基(例如在唾液酸化膜聚糖蛋白中)结合在胞外配体结合结构域激活Siglec膜蛋白，ITIM接收胞内信号，该信号被磷酸化，并启动SHP介导的免疫调节的信号传导，包括吞噬潜力的降低。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含编码嵌合Siglec受体(SgR)融合蛋白(SgFP)的重组核酸构建体，其包含：(a)SgR亚基，该SgR亚基包含：(i)跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；(a)胞外结构域，其包含对靶细胞的细胞表面蛋白的唾液酸化聚糖具有特异性的抗原结合结构域；(b)其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；并且其中：(i)SgFP不包含结合唾液酸化聚糖的内源性受体的功能性胞内结构域，或(ii)SgFP包含激活吞噬作用或炎症通路的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合受体在胞内结构域中存在缺陷，因此充当Siglec诱导的免疫调节胞内信号传导的阻断剂。这通过删除编码胞内结构域的核酸区域并克隆Siglec受体编码序列的其余部分来实现。该构建体可被指定为siglec胞内结构域缺失构建体[Siglec ICD]。在一些实施方案中，重组核酸构建体编码包含与siglec受体的胞外结构域(ECD)融合的癌抗原特异性scFv的重组嵌合抗原受体。这允许构建体对癌细胞的靶向性。嵌合受体包含siglec受体的TM和ICD，所述ICD可以是内源性ICD，或与另外的吞噬作用促进结构域融合的ICD，例如一个或多个PI3K结合结构域。在一些实施方案中，包含胞外siglec结构域的嵌合受体与唾液酸酶共表达。可以将编码唾液酸酶的核酸掺入表达具有分泌信号序列的嵌合结构域的表达载体中。由于唾液酸酶由表达CAR-siglec受体的同一细胞表达，唾液酸酶的表达剥夺了siglec的ECD与其天然配体的结合，但被与其受体结合的scFv激活，从而确保了嵌合受体对癌抗原表达细胞的作用的特异性。
在一些实施方案中，嵌合受体包含来自TREM蛋白的一个或多个结构域，在胞外区与可特异性结合癌抗原的抗原结合结构域融合，例如癌抗原特异性抗体或其部分或片段。在一些实施方案中，编码TREM嵌合抗原受体的重组核酸编码融合蛋白，该融合蛋白包含：(a)至少一个TREM跨膜结构域(TM)和一个TREM胞内结构域(ICD)；(b)胞外结构域(ECD)，其包含可特异性结合癌抗原的抗原结合结构域。融合蛋白被设计成靶向癌细胞并通过包含抗原结合结构域的ECD与靶癌细胞结合，并且该结合经由通过TREM TM和/或胞内结构域的信号传导触发和增强吞噬作用。TREM的跨膜结构域与DAP12跨膜结构域三聚化并触发细胞内促吞噬信号传导级联。在一些实施方案中，TREM结构域由TREM1、或由TREM2、或由TREM3成员贡献。胞外抗原结合结构域通过短间隔区或接头与TREM结构域的胞外末端融合。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含对癌抗原特异的抗体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含与癌细胞表面上的抗原特异性结合的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域是对癌抗原特异的抗体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域是抗体的一部分，其中该片段可以与癌细胞上的癌抗原特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含对癌抗原结合结构域特异的单链可变部分(scFv)。
在一些实施方案中，嵌合融合蛋白(CFP)包含靶向结合CD5(CD5结合结构域)的胞外结构域(ECD)，例如，包含具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些实施方案中，嵌合CFP包含CD5结合重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，靶向结合CD5的胞外结构域(ECD)(CD5结合结构域)包含具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的轻链可变结构域(VL)。在一些实施方案中，嵌合CFP包含CD5结合轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CFP包含靶向结合HER2的胞外结构域(HER2结合结构域)，其具有例如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链可变结构域和如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，CFP包含HER2结合重链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CFP包含HER2结合轻链可变结构域，其包含与SEQ ID NO:9具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CFP包括将ECD连接到跨膜(TM)的铰链。在一些实施方案中，铰链包含CD8受体的铰链区的氨基酸序列。在一些实施方案中，CFP可以包含具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的铰链(CD8α链铰链结构域)。在一些实施方案中，PFP铰链区包含与SEQID NO:7具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CFP包含CD8跨膜区，例如具有在SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CFP TM区包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CFP包含具有FcR结构域的胞内结构域。在一些实施方案中，CFP包含FcR结构域，胞内结构域包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列，或至少与SEQ IDNO:3具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，CFP包含具有PI3K募集结构域的胞内结构域。在一些实施方案中，PI3K募集结构域包含SEQ ID No:4所示的氨基序列。在一些实施方案中，PI3K募集结构域包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CFP包含具有CD40胞内结构域的胞内结构域。在一些实施方案中，CD40 ICD包含SEQ ID NO:5中所示的氨基序列。在一些实施方案中，CD40 ICD包含与SEQID NO:5具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。
表4-嵌合PFP及其结构域的序列
Figure BDA0003447683340001001
Figure BDA0003447683340001011
Figure BDA0003447683340001021
Figure BDA0003447683340001031
Figure BDA0003447683340001041
Figure BDA0003447683340001051
Figure BDA0003447683340001061
表5-接头序列
SEQ ID 序列
10 SSGGGGSGGGGSGGGGS
11 SGGGGSG
12 SGGG
13 GSGS
PFP的特点：
PFP在结构上结合到在其中表达它的细胞的细胞膜中。核酸构建体中的特定前导序列，例如信号肽，指导所编码蛋白质的质膜表达。由构建体编码的跨膜结构域将表达的蛋白质结合到细胞的质膜中。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcR-α受体的TM结构域，其与髓系细胞如巨噬细胞中的内源性FcRγ受体二聚化，确保髓系细胞特异性表达。
在一些实施方案中，PFP使表达它的细胞具有强吞噬性。当编码PFP的重组核酸在细胞中表达时，与不表达重组核酸的细胞相比，该细胞表现出对具有靶细胞抗原的靶细胞的增加的吞噬作用。当重组核酸在细胞中表达时，与不表达重组核酸的细胞相比，该细胞表现出对具有靶细胞抗原的靶细胞的增加的吞噬作用。在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，与不表达重组核酸的细胞相比，该细胞表现出对具有靶细胞抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少2倍。在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，与不表达重组核酸的细胞相比，该细胞表现出对具有靶细胞抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍或至少5倍。在一些实施方案中，组合物包含编码吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸，其包含：(a)PR亚基，该亚基包括：(i)跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；并且其中当PFP与靶细胞的抗原结合时，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的杀伤或吞噬活性增加至少大于10％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于10％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于11％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于12％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于13％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于14％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于15％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于16％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于17％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于18％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于19％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于20％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于30％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于40％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于50％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于60％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于70％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于80％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于90％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于100％。
在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于2倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于4倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于6倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于8倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于10倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于20倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加至少大于50倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬活性增加约50倍。
在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于10％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于20％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于30％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于40％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于50％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于60％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于70％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于80％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于90％。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于100％。
在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于2倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于4倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于6倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于8倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于10倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于20倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于30倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于40倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于50倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于100倍。在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加约100倍。
在一些实施方案中，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的吞噬相关杀伤活性增加至少大于2倍。
在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，细胞表现出增加的细胞因子产生。细胞因子可以包括以下各项中的任一种：IL-1、IL-6、IL-12、IL-23、TNF、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27和干扰素。
在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，细胞表现出增加的细胞迁移。可以通过标准运动性测定法在细胞培养物中检测到增强的细胞迁移。在一些实施方案中，可以使用鬼笔环肽染色和荧光显微术检测和监测肌动蛋白丝重排。在某些情况下，延时显微镜用于此目的。
在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，细胞表现出增加的免疫活性。在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，细胞表现出增加的MHC II表达。在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，细胞表现出增加的CD80表达。在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，细胞表现出增加的CD86表达。在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，细胞表现出增加的iNOS产生。
在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，与不表达重组核酸的细胞相比，该细胞表现出对表达靶细胞抗原的靶细胞的增加的胞啃作用。在一些实施方案中，当重组核酸在细胞中表达时，与表达重组核酸的细胞的吞噬作用相比，该细胞对表达靶细胞抗原的靶细胞表现出较少的胞啃作用。
在实施方案中，嵌合受体可以被糖基化、聚乙二醇化和/或以其他方式翻译后修饰。在进一步的实施方案中，糖基化、聚乙二醇化和/或其他翻译后修饰可以在体内或体外发生和/或可以使用化学技术进行。在另外的实施方案中，任何糖基化、聚乙二醇化和/或其他翻译后修饰可以是N-连接的或O-连接的。在实施方案中，任何一种嵌合受体可以是酶促或功能活性的，使得当胞外结构域被配体结合时，信号被转导以极化髓系细胞，例如巨噬细胞。
制备CFP和工程化髓系细胞的方法
CAR-P的制备方法包括以下步骤：(1)筛选PSR亚基框架；(2)筛选抗原结合特异性；(3)CAR-P重组核酸构建体；(4)工程化细胞和验证。
筛选PSR亚基框架：如上所述，受体的设计包括至少一个吞噬细胞受体结构域，其能够增强吞噬作用的信号传导。本质上，可以针对新的吞噬功能或增强结构域筛选大量质膜蛋白。筛选吞噬细胞受体亚基的方法是本领域技术人员已知的。其他信息可以在实施例部分中找到。一般而言，通常采用功能基因组学和逆向工程来获得编码功能相关蛋白质多肽或其部分的基因序列。在一些实施方案中，构建引物和探针用于鉴定和/或分离蛋白质、多肽或其片段或编码它们的核酸片段。在一些实施方案中，引物或探针可被标记用于实验鉴定。在一些实施方案中，蛋白质或肽的标记可用于胞内或胞外定位。
筛选潜在的抗体以选择高亲和力的特异性抗原结合结构域。筛选抗体或抗体结构域的方法是本领域技术人员已知的。具体实施例提供了更多信息。抗体及其片段的实例包括但不限于IgAs、IgDs、IgEs、IgGs、IgMs、Fab片段、F(ab')2片段、单价抗体、scFv片段、scRv-Fc片段、IgNAR、hcIgG、VHH抗体、纳米抗体和α抗体。
可商购的抗体可用于产生嵌合受体的胞外结构域。可商购抗体的实例包括但不限于：抗-HGPRT、克隆13H11.1(EMD Millipore)、抗-ROR1(ab135669)(Abcam)、抗-MUC1[EP1024Y](ab45167)(Abcam)、抗-MUC16[X75](ab1107)(Abcam)、抗-EGFRvIII[L8A4](绝对抗体)、抗-间皮素[EPR2685(2)](ab134109)(Abcam)、HER2[3B5](ab16901)(Abcam)、抗-CEA(LS-C84299-1000)(LifeSpan BioSciences)、抗-BCMA(ab5972)(Abcam)、抗-磷脂酰肌醇聚糖3[9C2](ab129381)(Abcam)、抗-FAP(ab53066)(Abcam)、抗-EphA2[RM-0051-8F21](ab73254)(Abcam)、抗-GD2(LS-0546315)(LifeSpan BioSciences)、抗-CD19[2E2B6B10](ab31947)(Abcam)、抗-CD20[EP459Y](ab78237)(Abcam)、抗-CD30[EPR4102](ab134080)(Abcam)、抗-CD33[SP266](ab199432)(Abcam)、抗-CD123(ab53698)(Abcam)、抗-CD133(BioLegend)、抗-CD123(1A3H4)ab181789(Abcam)和抗-CD171(L1.1)(Invitrogenantibodies)。从已知抗体产生抗体片段(例如scFv)的技术在本领域是常规的。
重组核酸可以按照本领域技术人员已知的分子生物学技术产生。这些方法包括但不限于设计引物、产生PCR扩增产物、限制性酶切、连接、克隆、克隆产物的凝胶纯化、克隆DNA的细菌繁殖、克隆质粒或载体的分离和纯化。一般指南可在以下各项中找到：MolecularCloning of PCR Products:by Michael Finney,Paul E.Nisson,Ayoub Rashtchian inCurrent Protocols in Molecular Biology,第56卷,第1期(首次发表：2001年11月1日)；Recombinational Cloning by Jaehong Park,Joshua LaBaer in Current Protocols inMolecular Biology第74卷,第1期(首次发表：2006年5月15日)等。在一些实施方案中，可以使用特定的扩增技术，例如Kwoh等人，1989年描述的TAS技术(基于转录的扩增系统)；3SR技术，其通过引入结合在此。(Self-Sustained Sequence Replication)，由Guatelli等人在1990年描述；Kievitis等人在1991年描述的NASBA技术(基于核酸序列的扩增)；SDA技术(链置换扩增)(Walker等人，1992)；TMA技术(转录介导的扩增)。
在一些实施方案中，重组核酸序列被优化用于在人类中表达。
DNA、mRNA和环状RNA：在一些实施方案中，裸DNA或信使RNA(mRNA)可用于将核酸引入细胞内。在一些实施方案中，通过脂质纳米颗粒(LNP)封装将编码PFP的DNA或mRNA引入吞噬细胞中。mRNA是单链的，并且可以被密码子优化。在一些实施方案中，mRNA可以包含一种或多种修饰的或非天然的碱基，例如5'-甲基胞嘧啶或假尿苷。mRNA的长度可能为50-10,000个碱基。在一个方面，转基因作为mRNA递送。mRNA可包含大于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000个碱基。在一些实施方案中，mRNA的长度可以大于10,000个碱基。在一些实施方案中，mRNA的长度可为约11,000个碱基。在一些实施方案中，mRNA的长度可为约12,000个碱基。在一些实施方案中，mRNA包含编码融合蛋白的转基因序列。LNP封装的DNA或RNA可用于转染髓系细胞，例如巨噬细胞，或可施用于受试者。
在一些实施方案中，使用编码PFP的环状RNA(环状RNA)。在环状RNA(环状RNA)中，3'和5'末端共价连接，构成一类RNA。可以使用LNP将环状RNA递送到细胞或受试者内部。
进一步增强髓系细胞表达嵌合抗原受体蛋白的功能的机制
髓系细胞，例如巨噬细胞，尤其是在肿瘤微环境中遇到吞噬阻制或抑制信号，例如靶细胞(例如癌细胞)的CD47介导的抗吞噬活性，如在图25中图形表示的。分化簇47(CD47)是属于免疫球蛋白超家族的受体。它可以与整合素和血小板反应蛋白1(TSP-1)结合，并在人类细胞中普遍表达。包括肿瘤细胞在内的靶细胞表达CD47作为“不要吃我”的信号，以逃避吞噬作用介导的杀伤和清除。吞噬细胞可以表达与CD47结合的信号调控蛋白α受体(SIRP)。SIRP家族成员是受体型跨膜糖蛋白，参与受体酪氨酸激酶偶联信号传导过程的负调节。SIRP-α可以被酪氨酸激酶磷酸化。该PTP的磷酸酪氨酸残基已被证明可以募集含有酪氨酸磷酸酶(PTP)的SH2结构域，并作为PTP的底物。SIRP-□是SIRP家族的另一个成员，发现它与TYROBP/DAP12相互作用，TYROBP/DAP12是一种带有基于免疫受体酪氨酸激活基序的蛋白质。当与TYROBD缔合时，它可以触发髓系细胞的激活。据报道，该蛋白质还参与了酪氨酸激酶SYK的募集。
在一个方面，本文提供了当在吞噬细胞中表达时产生的嵌合受体以功能性阻断CD47信号传导。
在另一方面，本文提供了用于通过阻断CD47信号来增强工程化髓系细胞例如巨噬细胞的吞噬作用的组合物和方法。在一些实施方案中，将编码本文所述的CFP受体的重组核酸单独或与其他重组吞噬细胞受体组合转染或转导入髓系细胞，例如吞噬细胞中，以产生用于免疫治疗的工程化巨噬细胞。在一些其他实施方案中，重组吞噬细胞受体包含清道夫受体的胞内结构域。
在一些实施方案中，本文提供了包含编码CFP的重组核酸的组合物，其包含：(a)亚基，该亚基包括：(i)可以与靶细胞上的CD47特异性结合的胞外结构域；(ii)跨膜结构域；其中亚基的胞外结构域和胞外抗原结合结构域可操作地连接；并且该亚基不包含结合CD47的内源性受体的功能性胞内结构域，或不包含激活磷酸酶的胞内结构域。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域衍生自信号调控蛋白α(SIRPα)。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域衍生自信号调控蛋白β(SIRPβ)。SIRPβ不与CD47结合。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自SIRPα。在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自SIRPβ。此类重组核酸缺乏任何胞内结构域，因此是非信号受体和CD47信号传导的阻断剂。该构建体称为SIRP-ΔICD。通过该嵌合受体的SIRPα或SIRPβECD的胞外配体结合结构域，该受体与靶细胞上的CD47结合，但由于没有功能性SIRPα胞内结构域而使其信号传递惰性，从而减少CD47信号传导和抑制表达CFP的髓系细胞(如巨噬细胞)对CD47+细胞的吞噬作用。这种构建体的过度表达可以在很大程度上降低癌细胞对CD47介导的髓系细胞(如巨噬细胞)的抗吞噬活性。
在一些实施方案中，除了SIRP-ΔICD的过表达之外，内源性SIRPα还可被抑制。siRNA可以被设计为特异性靶向编码SIRPα的ICD的mRNA的部分，使得siRNA不会降低或影响SIRP-ΔICD的表达。
在一些实施方案中，SIRP-□ICD和/或内源性SIRPα的抑制剂可以在表达融合蛋白的细胞中表达，该融合蛋白包含吞噬细胞受体和对癌抗原特异的胞外抗原结合结构域。
用于阻断抗吞噬信号和激活吞噬作用的嵌合抗原受体
A.CD47结合信号转导的改变
在一个方面，产生了重组核酸，该重组核酸包括编码嵌合抗原受体(CAR)融合蛋白(CFP)的重组核酸，该融合蛋白(CFP)包含：(a)跨膜结构域；(b)对靶细胞的CD47具有特异性的胞外抗原结合结构域；其中：对CD47具有特异性的跨膜结构域和胞外抗原结合结构域可操作地连接；并且CFP不包含结合CD47的内源性受体的功能性胞内结构域，或不包含激活磷酸酶的胞内结构域，以及(b)来自吞噬细胞受体的胞内结构域，其能够激活胞内信号传导以增强吞噬作用。在一些实施方案中，重组核酸构建体包含编码清道夫受体的胞内信号传导结构域的核酸序列。这类受体在本文中称为“转换受体”，因为它们被设计为将吞噬抑制信号转化(或转换)为吞噬促进信号。在一些实施方案中，嵌合受体的胞内结构域可包含清道夫受体的胞内结构域，选自凝集素、dectin 1、甘露糖受体(CD206)、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)和CD169受体，其在细胞外末端与包含SIRPαCD47结合结构域的胞外结构域融合。
在一些实施方案中，具有吞噬作用信号传导结构域的胞内结构域包括具有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)基序的结构域。ITAM是存在于免疫系统的几种受体(例如，T细胞受体、免疫球蛋白(Ig)和FcR)的胞质尾区的保守序列。它们具有保守的氨基酸序列基序，由定义的间隔(YXXL/I-X6-8-YXXL/I)隔开的成对的YXXL/I基序(Y＝酪氨酸，L＝赖氨酸和I＝异亮氨酸)组成。此外，大多数ITAM在相对于第一ITAM酪氨酸的+2位置包含带负电荷的氨基酸(D/E)。ITAM内的残基的磷酸化招募几种激活吞噬作用的信号传导分子。ITAM基序也存在于胞内衔接子蛋白中，即12kDa的DNAX激活蛋白(DAP12)。
在一些实施方案中，胞内区域中的吞噬信号传导结构域可包含PI3激酶(PI3K)募集结构域(也称为PI3K结合结构域)。本文使用的PI3K结合结构域可以是CD19、CD28、CSFR或PDGFR的相应PI3K结合结构域。PI3激酶募集到结合结构域导致Akt介导的信号级联反应和吞噬作用的激活。PI3K-Akt信号传导通路在吞噬作用、炎症反应的调节和其他活动中很重要，所述活动包括囊泡运输和细胞骨架重组。PI3激酶募集结构域是质膜蛋白中的细胞内结构域，其具有可被磷酸化的酪氨酸残基，其进而可被PI3Kp85的Src同源结构域(SH2)结构域识别。p85的SH2结构域识别受体胞质结构域上的磷酸化酪氨酸。这会导致p110的变构激活和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)的产生，其被酶Akt和组成型活性3'-磷酸肌醇依赖性激酶1(PDK1)通过它们的plekstrin同源结构域识别。Akt与PIP3的相互作用导致Akt构象的变化以及PDK1和rictor-mTOR复合物分别对残基Thr308和Ser473的磷酸化。这两个残基的磷酸化导致Akt的激活，Akt进而磷酸化糖原合酶激酶3(GSK-3)等底物。GSK-3有两种同种型，GSK-3α和GSK-3β，它们都具有组成型活性。同种型在结构上相关但在功能上是非冗余的。当GSK-3α中的Ser21残基或GSK-3β中的Ser9残基(位于其调控N端结构域中)被Akt和其他激酶磷酸化时，观察到GSK-3的失活。通过磷酸化抑制GSK-3对于调节炎症和吞噬过程很重要。
在一些实施方案中，重组PFP包含(a)胞外CD47结合结构域SIRPα，(b)SIRPβ跨膜结构域，和(c)SIRPβ的胞内结构域。SIRPβ信号传导可以通过参与DAP12激活来激活促吞噬信号传导。
B.唾液酸结合信号转导的改变
在一个方面，本文公开了通过在免疫细胞上表达的膜蛋白Siglec家族成员来转换吞噬调节信号转导的组合物和方法。该家族的各种成员在与膜蛋白上的唾液酸化聚糖接触时会转导检查点信号。在一些成员中，Siglec蛋白的胞内结构域包含多个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。ITIM在其胞质尾区共享共有氨基酸序列，即(I/V/L/S)-X-Y-X-X-(L/V)，其中X表示任何氨基酸，I＝异亮氨酸，V＝缬氨酸，L＝赖氨酸，S＝丝氨酸，Y＝酪氨酸。ITIM基序上酪氨酸残基的磷酸化会募集两个含SH2结构域的负调节因子中的任一个：肌醇磷酸酶SHIP(含Src同源性2的肌醇多磷酸5-磷酸酶)或酪氨酸磷酸酶SHP-1(含Src同源性2的蛋白质酪氨酸磷酸酶-1)。(Y+2)位置的亮氨酸有利于与SHIP结合，而(Y-2)位置的异亮氨酸有利于SHP-1结合。ITIM也可以与另一种酪氨酸磷酸酶SHP-2结合，但SHP-2在ITIM介导的抑制中发挥功能作用的证据不如其他介质清楚。因此，通过与唾液酸残基(例如在唾液酸化膜聚糖蛋白中)结合在胞外配体结合结构域激活Siglec膜蛋白，ITIM接收胞内信号，该信号被磷酸化，并启动SHP介导的免疫调节的信号传导，包括吞噬潜力的降低。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含编码嵌合Siglec受体(SgR)融合蛋白(SgFP)的重组核酸构建体，其包含：(a)SgR亚基，该SgR亚基包含：(i)跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；(a)胞外结构域，其包含对靶细胞的细胞表面蛋白的唾液酸化聚糖具有特异性的抗原结合结构域；(b)其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；并且其中：(i)SgFP不包含结合唾液酸化聚糖的内源性受体的功能性胞内结构域，或(ii)SgFP包含激活吞噬作用或炎症通路的胞内信号传导结构域。
Siglec家族受体包括膜蛋白、siglec 1(CD169)、siglec 2(CD22)、siglec 3(CD33)、siglec 4(MAG)、siglec 5、siglec 6、siglec 7、siglec 8、siglec 9、siglec 10、siglec 11、siglec 12、siglec 13、siglec 14、siglec 15、siglec 16。
在一些实施方案中，重组核酸构建体编码包含Siglec受体的胞外结构域(ECD)的重组嵌合抗原受体，其可结合靶细胞的膜蛋白上的唾液酸化残基，所述靶细胞包含siglec家族成员中的任一个。在一些实施方案中，重组核酸构建体编码包含Siglec受体的跨膜蛋白(TM)结构域的重组嵌合抗原受体。在一些实施方案中，嵌合受体缺乏胞内结构域，因此充当Siglec诱导的免疫调节胞内信号传导的阻断剂。这通过删除编码胞内结构域的核酸区域并克隆Siglec受体编码序列的其余部分来实现。该构建体可以指定为siglec胞内结构域缺失构建体[SiglecΔICD]。
在一些实施方案中，重组核酸构建体编码包含Siglec受体的胞外结构域(ECD)的重组嵌合抗原受体，其可结合靶细胞的膜蛋白上的唾液酸化残基。在一些实施方案中，重组核酸构建体编码包含Siglec受体的跨膜蛋白(TM)结构域的重组嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，嵌合受体包含无关膜蛋白的TM结构域，例如CD8 TM或CD2 TM结构域。在一些实施方案中，包含Siglec ECD和/或Siglec TM的嵌合抗原受体缺乏内源性Siglec胞内结构域(ICD)(例如，通过胞内结构域[Siglec ICD]的缺失实现)，并且其中无关蛋白质的胞内结构域融合到构建体的胞质末端。
值得注意的是，Siglec 2、3、5、6、7、8、9、10、11和12个家族成员包含2个或更多个胞内ITIM基序。在一些实施方案中，包含ITIM基序的siglec蛋白的胞内结构域被删除以产生Siglec ICD，并与吞噬促进蛋白的ICD融合，从而将由siglec与其配体(唾液酸化聚糖)在癌细胞上的结合产生的抑制信号改变为促炎和吞噬促进信号。
无关蛋白可包含可产生吞噬激活信号或促炎信号的胞内结构域，例如以下蛋白质的胞内结构域：MRC1、ItgB5、MERTK、ELMO、BAIL Tyro3、Axl、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、PI3K、FcyR1、FcyR2A、FcyR2B2、FcyR2C、FcyR3A、FcER1、FcaRl、BAFF-R、DAP12、NFAM1和CD79b胞内结构域。
在一些实施方案中，嵌合受体的胞内结构域可包含清道夫受体的胞内结构域，选自凝集素、dectin 1、甘露糖受体(CD206)、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)和CD169受体，其在细胞外末端与包含Siglec唾液酸化聚糖结合结构域的胞外结构域融合。
在一些实施方案中，胞内区域中的吞噬信号传导结构域可包含PI3激酶(PI3K)募集结构域(也称为PI3K结合结构域)。本文使用的PI3K结合结构域可以是CD19、CD28、CSFR或PDGFR的相应PI3K结合结构域。
在一些实施方案中，具有吞噬作用信号传导结构域的胞内结构域包括具有一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)基序的结构域。
C.嵌合Siglec构建体和唾液酸酶共表达
在一些实施方案中，重组核酸构建体编码包含与siglec受体的胞外结构域(ECD)融合的癌抗原特异性scFv的重组嵌合抗原受体。这允许构建体对癌细胞的靶向性。嵌合受体包含siglec受体的TM和ICD，所述ICD可以是内源性ICD，或与另外的吞噬作用促进结构域融合的ICD，例如一个或多个PI3K结合结构域。Siglec ECD区的激活被同时表达的唾液酸酶阻止。唾液酸酶可由单顺反子设计中的构建体编码，其中整个构建体表达为单个多肽并且它们很容易被内源性T2A切割而切割；或者可以是双顺反子，其中唾液酸酶的编码序列被转录为单独的mRNA。
siglec受体与膜蛋白上普遍存在的唾液酸化残基结合，并可以激活下游信号。在一些实施方案中，本文所述的嵌合构建体编码siglec蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，但在胞外末端与靶向scFv的癌症融合，并在胞内末端编码唾液酸酶。
在一些实施方案中，无论重组构建体是单顺反子还是多顺反子，唾液酸酶编码序列与N端信号肽的编码序列融合，所述N端信号肽在翻译时对蛋白唾液酸酶的分泌发出信号。在唾液酸酶表达并释放到细胞外环境中后，该酶从表达构建体的细胞膜附近的环境中的细胞外膜蛋白中去除消化的唾液酸残基。由于唾液酸酶由表达CAR-siglec受体的同一细胞表达，唾液酸酶的表达剥夺了siglec的ECD与其天然配体的结合，但被与其受体结合的scFv激活，从而确保了嵌合受体对癌抗原表达细胞的作用的特异性。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体通过激活ITIM而激活siglec受体的内源性ICD结构域而起到抗炎和吞噬调节信号传导蛋白的作用。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含具有促炎信号传导部分的内源性ICD结构域，和/或包含ICD的内源性siglec ITIM的耗尽，其中每一个在前一节中描述，并且可以模块化方式与包含本文描述的CAR的scFv组合。
用于增强吞噬作用的嵌合抗原受体结构域
TREM结构域
在一个方面，本文提供了编码嵌合受体的重组核酸，其具有来自髓系细胞上表达的触发受体(TREM)受体、TREM嵌合受体的一个或多个结构域。TREM受体是免疫反应的重要调节剂，因为它们能够放大或减少PRR诱导的信号。该蛋白质家族包括以下成员：TREM 1、2、3。TREM共享共同的结构特性，包括存在单个V型细胞外免疫球蛋白样结构域、跨膜结构域和短的胞质尾区。特别地，TREM跨膜结构域(TM)具有带负电荷的残基，其可与12kDa的DNAX激活蛋白(DAP12)的带正电荷的残基相互作用，这是一种包含基于免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的跨膜衔接子。
在一些实施方案中，编码嵌合抗原受体的重组核酸包含编码至少TREM TM结构域的序列，使得嵌合受体与DAP12相互作用并通过DAP12中的ITAM内的残基的磷酸化增强吞噬作用，其募集激活吞噬作用的几种信号传导分子。
在一些实施方案中，嵌合受体包含来自TREM蛋白的一个或多个结构域，在胞外区与可特异性结合癌抗原的抗原结合结构域融合，例如癌抗原特异性抗体或其部分或片段。
在一些实施方案中，编码TREM嵌合抗原受体的重组核酸编码融合蛋白，该融合蛋白包含：(a)至少一个TREM跨膜结构域(TM)和一个TREM胞内结构域(ICD)；(b)胞外结构域(ECD)，其包含可特异性结合癌抗原的抗原结合结构域。融合蛋白被设计成靶向癌细胞并通过包含抗原结合结构域的ECD与靶癌细胞结合，并且该结合经由通过TREM TM和/或胞内结构域的信号传导触发和增强吞噬作用。TREM的跨膜结构域与DAP12跨膜结构域三聚化并触发细胞内促吞噬信号传导级联。在一些实施方案中，TREM结构域由TREM1、或由TREM2、或由TREM3成员贡献。胞外抗原结合结构域通过短间隔区或接头与TREM结构域的胞外末端融合。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含对癌抗原特异的抗体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含与癌细胞表面上的抗原特异性结合的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域是对癌抗原特异的抗体。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域是抗体的一部分，其中该片段可以与癌细胞上的癌抗原特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含对癌抗原结合结构域特异的单链可变部分(scFv)。
FcR结构域
在一些方面，本文描述了编码包含FcR结构域的嵌合抗原受体的重组核酸。在一些实施方案中，本文所述的嵌合受体可包含FcRα(FcRα1)结构域。FcRα1跨膜结构域与髓系细胞(如巨噬细胞)和其他吞噬细胞(如肥大细胞)中的FcRγ跨膜结构域异源化，并且异源二聚化是蛋白质在细胞表面上表达所必需的。在一些实施方案中，包含FcRα1TM结构域的重组蛋白的表达限于在天然表达FcγR的细胞中表达。在这方面，具有FcRα1TM结构域的重组嵌合蛋白被排除在表达FcRγ的吞噬细胞之外的任何细胞中表达。类似地，FcRβ表达仅限于肥大细胞。在一些实施方案中，嵌合受体被设计为具有包含FcRα1TM结构域的一个或多个结构域用于嵌合蛋白的髓系细胞特异性表达。在一些实施方案中，嵌合受体被设计为具有包含FcRβTM结构域的一个或多个结构域用于嵌合蛋白的肥大细胞特异性表达。
半胱天冬酶原结构域
在一些方面，本文描述了编码嵌合抗原受体和融合蛋白的重组核酸，所述融合蛋白包含：在C末端与半胱天冬酶切割序列和编码半胱天冬酶原(Sh2-ccs-半胱天冬酶原)的序列连接的Src同源性2结构域(SH2)l。在一些实施方案中，重组核酸编码嵌合抗原受体，其包含第一多肽(a)，所述第一多肽包含：可特异性结合癌抗原的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含可触发或增强吞噬作用的ITAM基序的胞内信号传导结构域，以及第二多肽(b)胞内多肽，所述胞内多肽包含在C末端与半胱天冬酶切割序列和编码半胱天冬酶原(SH2-ccs-半胱天冬酶原)的序列连接的Src同源性2结构域(SH2)1。重组核酸可以是单顺反子的或多顺反子的。在一些实施方案中，重组核酸是单顺反子的，并且编码(a)的序列和编码(b)的序列被T2A序列隔开，T2A序列在翻译后内源性地切割两个多肽。半胱天冬酶原可以是半胱天冬酶原1、半胱天冬酶原2或半胱天冬酶原3。在(a)和(b)表达和切割后，SH2-ccs-半胱天冬酶原的SH2结构域将半胱天冬酶原引导至(a)的ITAM基序的磷酸化胞内结构域，并被激活。与磷酸化ITAM残基接触的SH2结构域的激活激活半胱天冬酶原的蛋白水解切割，以生成消化吞噬细胞所需的激活的半胱天冬酶。
泛素化激活结构域
在一些实施方案中，可将胞内信号传导结构域添加至嵌合受体以增强吞噬信号传导。泛素信号传导参与吞噬作用的触发。内吞受体的单泛素化可以靶向它们进行溶酶体降解。IL-4信号介导的清道夫受体MSR1在胞内结构域的多泛素化可导致受体激活，并触发其与参与诱导炎症基因激活的MAP激酶通路蛋白的相互作用。例如，MSR1蛋白的K63多泛素化导致其与吞噬体中的TAK1/MKK7/JNK相互作用。MSR1的K27残基的泛素化也与MSR信号传导和促炎基因激活有关，例如促炎细胞因子的表达。泛素E3连接酶可以促进泛素与MSR1胞内信号传导结构域上的特定赖氨酸残基连接，其在IL4激活时被激活，进而可通过TAK1、MKK7和JNK的结合激活胞内信号传导，并触发促炎基因如TNF-α和IL-1的表达。
在一些实施方案中，本文所述的重组嵌合抗原受体可包含胞内结构域，其包含可被泛素化和激活以产生促炎信号的残基。
在一些实施方案中，本文描述的嵌合抗原受体的胞内结构域包含MSR1的胞内结构域，其包含可经历E3连接酶介导的泛素化的残基。
在一些实施方案中，本文描述的嵌合抗原受体的胞内结构域包含可被泛素化并且在泛素化后可以与TAK1结合的胞内结构域。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗原受体的胞内结构域包含可被泛素化且在泛素化后可与MAP激酶蛋白例如MKK7结合的胞内结构域。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗原受体的胞内结构域包含可被泛素化的胞内结构域，并且其在泛素化后可结合激酶或包含MAP激酶蛋白例如MKK7的蛋白质复合物。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗原受体的胞内结构域包含可被泛素化的胞内结构域，并且其在泛素化后可与包含JNK的激酶或蛋白质复合物结合。在一些实施方案中，本文所述的嵌合抗原受体的胞内结构域包含可被泛素化的胞内结构域，并且其在泛素化后可结合可激活促炎基因转录的激酶或蛋白质复合物。
如本文所考虑的，合适的泛素化结构域可以连接在本公开中描述的任何一种CARP受体的细胞内部分处。
与其他嵌合受体共表达进行吞噬作用
在一些实施方案中，本文所述的一种或多种CFP可以与重组吞噬细胞受体融合蛋白(PFP)共表达，所述重组吞噬细胞受体融合蛋白具有包含可特异性结合癌细胞表面上的癌抗原的抗原结合结构域的胞外结构域。融合蛋白进一步包含跨膜结构域和细胞内吞噬作用受体结构域，可以包含和另外的吞噬信号传导增强结构域，例如激酶结合结构域。PFP专门设计用于靶向癌细胞并在与靶标结合后激活吞噬作用。CFP的共表达增强了被PFP增强的吞噬作用。例如，将PFP与SIRP-CFP共表达的细胞增强了细胞的吞噬能力，其中PFP还提供了针对细胞的特异性癌症靶向。例如，将PFP与SH2-ccs-半胱天冬酶原共表达的细胞与PFP具有特异性靶向癌细胞，而吞噬活性被PFP胞内结构域增强，并且癌细胞杀伤活性由于SH2-ccs-半胱天冬酶原经由半胱天冬酶原激活到半胱天冬酶的凋亡细胞的清除而被增强。
在一些实施方案中，清道夫受体胞内结构域包含第二胞内结构域，该第二胞内结构域包含激活吞噬作用的信号传导结构域；或在胞质末端的促炎结构域，它们可操作地连接。由于CD47结合结构域与吞噬细胞受体的一个或多个胞内信号传导结构域可操作地连接，源自细胞外末端的CD47配体接合的信号传导事件在通过胞内结构域时改变为在重组受体的细胞内末端处的吞噬作用增强信号而不是天然CD47结合SIRPα受体的吞噬作用抑制信号。表达重组受体的细胞的吞噬潜能高度增强，或超过表达SIRP-□ICD的细胞。
在一些实施方案中，细胞内吞噬信号传导结构域可包含选自MRC1、ItgB5、MERTK、ELMO、BAIL Tyro3、Axl、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、PI3K、FcyR1、FcyR2A、FcyR2B2、FcyR2C、FcyR3A、FcER1、FcaRl、BAFF-R、DAP12、NFAM1和CD79b胞内结构域的结构域。
在一个方面，嵌合受体的功能可以通过在髓系细胞中与CFP表达同时或独立表达另外的重组蛋白而得到进一步增强。在一些实施方案中，另外的重组蛋白与上述CFP共表达，其中CFP可以结合在靶细胞中表达的抗原，并且CFP增强表达CFP的髓系细胞对靶细胞的吞噬和杀伤。在一些实施方案中，另外的重组蛋白被设计为进一步增强表达CFP的细胞的功能。
在一些实施方案中，另外的重组蛋白是第二嵌合蛋白，例如嵌合融合蛋白，例如第二嵌合蛋白。在一些实施方案中，第二嵌合蛋白在表达靶向CFP的癌抗原的髓系细胞群中表达。在一些实施方案中，另外的重组蛋白是第二嵌合融合蛋白或吞噬作用受体融合蛋白(PFP)。在一些实施方案中，第二嵌合蛋白是截短蛋白。
用于增强髓系细胞的吞噬作用和杀伤作用的示例性另外的重组构建体：
在一个方面，本文提供了包含编码嵌合CD47受体(CR)融合蛋白的重组核酸的组合物，所述融合蛋白包含：(a)CR亚基，该CR亚基包括：(i)跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；(b)胞外结构域，其包含对靶细胞的CD47具有特异性的抗原结合结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；并且其中：(i)CR不包含结合CD47的内源性受体的功能性胞内结构域，(ii)CR包含磷酸酶失活结构域或不包含激活磷酸酶的胞内结构域，或(iii)CR包含衍生自吞噬细胞受体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CR不包含结合CD47的内源性受体的功能性胞内结构域。
在一些实施方案中，CR包含磷酸酶失活结构域或不包含激活磷酸酶的胞内结构域。在一些实施方案中，CR包含衍生自吞噬细胞或栓系受体的细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，对CD47具有特异性的抗原结合结构域包括对CD47具有特异性的抗体结构域。
在一些实施方案中，对CD47具有特异性的抗原结合结构域包含衍生自SIRPα或SIRPβ的胞外结构域。
在一些实施方案中，CR包含含胞内信号传导结构域的胞内结构域。
在一个方面，本文提供了一种组合物，该组合物包含编码吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸，该融合蛋白包含：(a)PR亚基，该亚基包括：(i)跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；其中细胞内信号传导结构域衍生自吞噬细胞受体；并且其中重组核酸编码：(A)编码促炎多肽，(B)包含分子的结合基序，使得在分子与结合基序结合后重组核酸的翻译被抑制(C)半胱天冬酶原结构域，或(D)半胱天冬酶原结合结构域，或(E)唾液酸酶。
在一个方面，本文提供了一种组合物，该组合物包含编码吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸，该融合蛋白包含：(a)PR亚基，该PR亚基包括：跨膜结构域，和包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；其中当在细胞中表达时，PFP与FcRγ形成功能性复合物。
在一个方面，本文提供了一种组合物，该组合物包含编码吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸，该融合蛋白包含：(a)PR亚基，该PR亚基包括：跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中跨膜结构域和胞外结构域可操作地连接；其中当在细胞中表达时，PFP与DAP12形成功能性复合物。
在一些实施方案中，重组核酸编码：(A)编码促炎多肽，(B)包含分子的结合基序，使得在分子与结合基序结合后重组核酸的翻译被抑制(C)半胱天冬酶原结构域，或(D)半胱天冬酶原结合结构域。
在一些实施方案中，当在细胞中表达时，PFP与FcRγ形成功能性复合物。
在一些实施方案中，当在细胞中表达时，PFP与DAP12形成功能性复合物。
在一些实施方案中，PFP包含结合CD47配体的抗原结合结构域，但不包含结合CD47的内源性受体的功能性胞内结构域，(i)PFP包含磷酸酶失活结构域或不包含激活磷酸酶的胞内结构域，或(ii)PFP包含衍生自吞噬细胞受体的胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CFP或PFP与FcR形成功能复合物。
在一些实施方案中，CFP或PFP与FcRγ形成功能复合物。
在一些实施方案中，CFP或PFP包含FcR-α或FcRβ的跨膜结构域。
在一些实施方案中，CFP或PFP与TREM形成功能复合物。
在一些实施方案中，CFP或PFP包含含ITAM的胞内结构域。
在一些实施方案中，CFP或PFP包含含ITIM的胞内结构域。
在一些实施方案中，表达CFP或PFP的细胞表现出抑制CD47介导的抗吞噬活性。
在一些实施方案中，截短的SIRPα结合CD47并抑制。
在一些实施方案中，结合基序在重组核酸的UTR区中。在一些实施方案中，结合基序是ARE序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域结合DAP12的跨膜结构域。
在一些实施方案中，与DAP12的跨膜结构域结合的跨膜结构域衍生自TREM。
在一些实施方案中，CFP或PFP包含衍生自DAP12单体的胞内结构域。
在一些实施方案中，重组多核苷酸进一步包含编码第一修饰信号调控蛋白α(SIRPα)的序列。
在一些实施方案中，第一修饰的SIRPα缺乏野生型SIRPα的胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，第一修饰的SIRPα缺乏野生型SIRPβ的胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，CFP或PFP不传输阻断吞噬作用的信号。
在一些实施方案中，组合物进一步包含编码第二修饰信号调控蛋白α(SIRPα)的多核苷酸，其中第二修饰SIRPα包含PI3K结合结构域。
在一些实施方案中，PI3K结合结构域衍生自CD19、CD28、CSFR或PDGFR。
在一些实施方案中，组合物进一步包含编码第三修饰信号调控蛋白α(SIRPα)的多核苷酸，其中第三修饰SIRPα包含促炎结构域。
在一些实施方案中，组合物进一步包含编码重组SIRP的多核苷酸，其中重组SIRP包含衍生自SIRPα的胞外结构域、衍生自SIRPβ的跨膜结构域和衍生自SIRPβ的胞内结构域。
在一些实施方案中，组合物进一步包含当重组SIRP结合抗原CD47时，第三修饰的SIRPα不传递阻断吞噬作用的信号。
在一些实施方案中，抗CD47结合结构域衍生自信号调控蛋白α(SIRPα)或信号调控蛋白β(SIRPβ)。
在一些实施方案中，在PFP与靶细胞的抗原结合后，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的杀伤活性增加至少大于20％。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自吞噬细胞或栓系受体。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自除吞噬细胞受体之外的受体，所述吞噬细胞受体选自表2中所列的受体中的任一种。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自选自凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)和CD169的受体。
在一些实施方案中，其中胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcR-α或Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体。
在一些实施方案中，在PFP与靶细胞的抗原结合后，与不表达PFP的细胞相比，表达PFP的细胞的杀伤活性增加至少大于20％。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自选自表1中所列蛋白质中的任一种的吞噬细胞受体。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含PI3K募集结构域。
在一些实施方案中，当CFP或PFP在细胞中表达时，CFP或PFP功能性地掺入细胞的细胞膜中。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出表达抗原的靶细胞的吞噬作用增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出表达抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少1.1倍。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出表达抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍或50倍。
在一些实施方案中，表达抗原的靶细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，表达抗原的靶细胞的直径为至少0.8微米。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自清道夫受体。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出细胞因子产生的增加。
在一些实施方案中，细胞因子选自IL-1、IL3、IL-6、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素及其组合。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出效应物活性的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出交叉呈递的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出MHC II类蛋白的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出CD80的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出CD86的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出MHC I类蛋白的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出TRAIL/TNF家族死亡受体的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出B7-H2的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出LIGHT的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出HVEM的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出CD40的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出TL1A的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出41BBL的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出OX40L的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出GITRL死亡受体的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出CD30L的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出TIM4的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出TIM1配体的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出SLAM的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出CD48的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出CD58的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出CD155的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出CD112的表达的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出PDL1的表达的增加。
在一些实施方案中，本文提供了与不表达CFP或PFP的细胞相比的任何B7-DC的组合物。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出呼吸爆发的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出ROS产生的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出iNOS产生的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出iNOS产生的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出胞外囊泡产生的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出表达抗原的靶细胞的胞啃作用的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出对CD47介导的吞噬作用抑制的抗性的增加。
在一些实施方案中，与不表达CFP或PFP的细胞相比，表达CFP或PFP的细胞表现出对LILRB1介导的吞噬作用抑制的抗性的增加。
在一些实施方案中，胞内结构域包含Rac抑制结构域、Cdc42抑制结构域或GTP酶抑制结构域。
在一些实施方案中，Rac抑制结构域、Cdc42抑制结构域或GTP酶抑制结构域在表达CFP或PFP的细胞的吞噬杯处抑制Rac、Cdc42或GTP酶。
在一些实施方案中，胞内结构域包含F-肌动蛋白分解激活结构域、ARHGAP12激活结构域、ARHGAP25激活结构域或SH3BP1激活结构域。
在一些实施方案中，表达CFP或PFP的细胞表现出磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的增加。
在一些实施方案中，胞外结构域包含Ig结合结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域包含IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcγRIIIB、FcRn、TRIM21、FcRL5结合结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域包含FcR胞外结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域包含FcRα、FcRβ、FcRε或FcRγ胞外结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域包含FcRα(FCAR)胞外结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域包含FcRβ胞外结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域包含FcRε(FCER1A)胞外结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域包含FcRγ(FDGR1A、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B)胞外结构域。前述权利要求中任一项所述的组合物，其中胞外结构域包含整合素结构域。
在一些实施方案中，胞外结构域包含一个或多个整合素α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αIIb、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7、β8结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包括CD47抑制结构域。
在一些实施方案中，PSR亚基进一步包含与跨膜结构域和胞外抗原结合结构域可操作地连接的胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域还包含受体、铰链、间隔区或接头的胞外结构域。在一些实施方案中，胞外结构域包含PSR的胞外部分。在一些实施方案中，PSR的胞外部分衍生自与PSR胞内信号传导结构域相同的PSR。在一些实施方案中，胞外结构域包括清道夫受体的胞外结构域或免疫球蛋白结构域。
在一些实施方案中，免疫球蛋白结构域包含免疫球蛋白的胞外结构域或免疫球蛋白铰链区。在一些实施方案中，胞外结构域包含吞噬吞没标志物。
在一些实施方案中，胞外结构域包含能够进行多聚体组装的结构。在一些实施方案中，胞外结构域包含用于多聚化的支架。
在一些实施方案中，胞外结构域的长度为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。在一些实施方案中，胞外结构域的长度为至多500、400、300、200或100个氨基酸。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域与靶细胞的抗原特异性结合。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含抗体结构域。在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含受体结构域、抗体结构域，其中抗体结构域包含功能性抗体片段、单链可变片段(scFv)、Fab、单域抗体(sdAb)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、VNAR结构域、VHH结构域、双特异性抗体、双抗体或其功能片段或组合。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含配体、受体的胞外结构域或衔接子。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含对单一抗原特异的单一胞外抗原结合结构域。
在一些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含至少两个胞外抗原结合结构域，其中至少两个胞外抗原结合结构域中的每一个对不同抗原具有特异性。在一些实施方案中，抗原是癌抗原或病原体抗原或自身免疫抗原。在一些实施方案中，抗原包括病毒抗原。在一些实施方案中，抗原是T淋巴细胞抗原。在一些实施方案中，抗原是胞外抗原。在一些实施方案中，抗原是胞内抗原。
在一些实施方案中，抗原选自胸苷激酶(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、粘蛋白-1、粘蛋白-16(MUC16)、MUC1、表皮生长因子受体vIII(EGFRvIII)、间皮素、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、EBNA-1、LEMD1、磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原(CEA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、卵泡刺激素受体、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、促红细胞生成素生成性肝细胞癌A2(EphA2)、EphB2、自然杀伤基团2D(NKG2D)配体、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD45、CD56CD79b、CD97、CD117、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD213A2、CD248、CD276、PSCA、CS-1、CLECL1、GD3、PSMA、FLT3、TAG72、EPCAM、IL-1、整合素受体、PRSS21、VEGFR2、PDGFRβ、SSEA-4、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、GM3、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、IGLL1及其组合。在一些实施方案中，抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CCR4、CD8、CD30、CD45、CD56。
在一些实施方案中，抗原是卵巢癌抗原或T淋巴瘤抗原。在一些实施方案中，抗原是整合素受体。在一些实施方案中，抗原是选自α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8的整合素受体。
在一些实施方案中，跨膜结构域和胞外抗原结合结构域通过接头可操作地连接。在一些实施方案中，跨膜结构域和胞外抗原结合结构域通过诸如CD8α、IgG1或IgG4的铰链区的接头可操作地连接。
在一些实施方案中，胞外结构域包含多聚化支架。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcR跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcR-α、FcRβ或FcRγ跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcαR(FCAR)跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcRε(FCER1A)跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含FcRγ(FDGR1A、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A和FCGR3B)跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含T细胞受体亚基、CD3ε、CD3γ和CD3δ、CD45、CD2 CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD19、CD22、CD33、CD28、CD30、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD 154，或其功能片段，或具有至少1、2或3个修饰但不超过20、10或5个修饰跨膜结构域的氨基酸序列。
在一些实施方案中，跨膜结构域包括来自突触融合蛋白，例如突触融合蛋白3或突触融合蛋白4或突触融合蛋白5的跨膜结构域。
在一些实施方案中，当CR或PFP在细胞中表达时，跨膜结构域与内源性受体的跨膜结构域寡聚化。
在一些实施方案中，当CR或PFP在细胞中表达时，跨膜结构域与外源性受体的跨膜结构域寡聚化。
在一些实施方案中，当CFP或PFP在细胞中表达时，跨膜结构域与内源性受体的跨膜结构域二聚化。
在一些实施方案中，当CFP或PFP在细胞中表达时，跨膜结构域与外源性受体的跨膜结构域二聚化。
在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自与从其衍生出胞内信号传导结构域的蛋白质不同的蛋白质。
在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自与从其衍生出胞外结构域的蛋白质不同的蛋白质。
在一些实施方案中，跨膜结构域包括吞噬细胞受体的跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域和胞外结构域衍生自相同的蛋白质。
在一些实施方案中，跨膜结构域衍生自与胞内信号传导结构域相同的蛋白质。
在一些实施方案中，重组核酸编码DAP12募集结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含与DAP12寡聚化的跨膜结构域。
在一些实施方案中，跨膜结构域的长度为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域的长度为至多12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸。
在一些实施方案中，胞内结构域包括磷酸酶抑制结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包括ARP2/3抑制结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包括至少一个ITAM结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个ITAM结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域进一步包括至少一个ITAM结构域。在一些实施方案中，胞内结构域还包含至少一个选自CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b 1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列的ITAM结构域。
在一些实施方案中，至少一个ITAM结构域包含Src家族激酶磷酸化位点。在一些实施方案中，至少一个ITAM结构域包括Syk募集结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含F-肌动蛋白解聚激活结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包含可以泛素化的残基。在一些实施方案中，胞内结构域可以结合E3泛素连接酶。
在一些实施方案中，胞内结构域可以结合TAK1激酶。
在一些实施方案中，胞内结构域可以结合MAP激酶或MAP激酶家族成员。
在一些实施方案中，胞内结构域可以在泛素化时被激活并且可以激活导致促炎基因转录的胞内信号传导。
在一些实施方案中，胞内结构域缺乏酶活性。
在一些实施方案中，胞内结构域不包含衍生自CD3ζ胞内结构域的结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域包含CD47抑制结构域。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含激活整合素的结构域，例如PSGL-1的胞内区。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含激活Rap1 GTP酶的结构域，例如来自EPAC和C3G的结构域。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域来自桩蛋白。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域激活粘着斑激酶。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自单个吞噬细胞受体。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域衍生自单个清道夫受体。在一些实施方案中，胞内结构域还包含吞噬作用增强结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包含促炎信号传导结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含激酶激活结构域或激酶结合结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含IL-1信号传导级联激活结构域。在一些实施方案中，促炎信号传导结构域包含衍生自TLR3、TLR4、TLR7、TLR 9、TRIF、RIG-1、MYD88、MAL、IRAK1、MDA-5、IFN-受体、NLRP家族成员、NLRP1-14、NOD1、NOD2、脓素、AIM2、NLRC4、FCGR3A、FCERIG、CD40或其任意组合。在一些实施方案中，CFP或PFP不包含全长胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，胞内结构域的长度为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。
在一些实施方案中，胞内结构域的长度为至多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。
在一些实施方案中，重组核酸编码FcRα链胞外结构域、FcRα链跨膜结构域和/或FcRα链胞内结构域。在一些实施方案中，重组核酸编码FcRβ链胞外结构域、FcRβ链跨膜结构域和/或FcRβ链胞内结构域。在一些实施方案中，当在细胞中表达时，FcRα链或FcRβ链与FcRγ形成复合物。在一些实施方案中，当在细胞中表达时，FcRα链或FcRβ链与内源性FcRγ形成复合物。在一些实施方案中，FcRα链或FcRβ链不掺入不表达FcRγ的细胞的细胞膜中。在一些实施方案中，CFP或PFP不包含FcRα链胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CFP或PFP不包含FcRβ链胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，重组核酸编码TREM胞外结构域、TREM跨膜结构域和/或TREM胞内结构域。在一些实施方案中，TREM是TREM1、TREM 2或TREM 3。
在一些实施方案中，重组核酸包含编码促炎多肽的序列。在一些实施方案中，组合物还包含促炎多肽。
在一些实施方案中，促炎多肽是趋化因子、细胞因子和核苷酸。在一些实施方案中，在一些实施方案中，趋化因子选自CCL2、CXCL1、CXCL12、CXCL9、CXCL10、CXCL11。
在一些实施方案中，细胞因子选自IL-1、IL3、IL5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素。
在一些实施方案中，重组核酸包含炎症的稳态调节剂。
在一些实施方案中，炎症的稳态调节剂是mRNA的非翻译区(UTR)中的序列。在一些实施方案中，UTR中的序列是与RNA结合蛋白结合的序列。在一些实施方案中，当RNA结合蛋白与非翻译区(UTR)中的序列结合时，翻译被抑制或阻止。在一些实施方案中，UTR中的序列包含WWWU(AUUUA)UUUW的共有序列，其中W是A或U。
在一些实施方案中，重组核酸在双顺反子载体上表达。
在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，靶细胞是人细胞。在一些实施方案中，靶细胞包括被病原体感染的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，即淋巴细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，即卵巢癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，即卵巢胰腺细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞，即胶质母细胞瘤细胞。
在一些实施方案中，重组核酸是DNA。在一些实施方案中，重组核酸是RNA。在一些实施方案中，重组核酸是mRNA。在一些实施方案中，重组核酸是环状RNA。在一些实施方案中，重组核酸是tRNA。在一些实施方案中，重组核酸是微小RNA。
本文提供了包含上述组合物的载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方案中，载体还包含与至少一种编码一种或多种多肽的核酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，载体是多顺反子的。在一些实施方案中，至少一个核酸序列中的每一个与单独的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，载体还包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。在一些实施方案中，载体还包含位于编码一种或多种多肽的至少一种核酸序列侧翼的5'UTR和/或3'UTR。在一些实施方案中，载体还包含一个或多个调控区。
本文提供了由上述组合物的重组核酸编码的多肽。
在一个方面，本文提供了包含上述载体或上述多肽的细胞。在一些实施方案中，细胞是噬菌细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞衍生细胞、髓系细胞、巨噬细胞、树突细胞、淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、小胶质细胞或星形胶质细胞。在一些实施方案中，细胞是自体细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体细胞。在一些实施方案中，细胞是M1髓系细胞，例如巨噬细胞。在一些实施方案中，细胞是M2髓系细胞，例如巨噬细胞。在一些实施方案中，细胞是髓系谱系的前体细胞。在一些实施方案中，髓系细胞是CD14+细胞。在一些实施方案中，髓系细胞是CD16-细胞。在一些实施方案中，髓系细胞是CD14+和CD16-细胞。
本文提供了一种药物组合物，其包含(a)如上所述的核酸组合物或载体或多肽或细胞；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含另外的治疗剂。在一些实施方案中，药物组合物包含另外的治疗剂，该另外的治疗剂选自CD47激动剂、抑制Rac的试剂、抑制Cdc42的试剂、抑制GTP酶的试剂、促进F-肌动蛋白分解的试剂、促进PI3K募集到CFP或PFP的试剂、促进PI3K活性的试剂、促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的试剂、促进ARHGAP12活性的试剂、促进ARHGAP25活性的试剂、促进SH3BP1活性的试剂及其任意组合。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂包括无血清培养基、脂质或纳米颗粒。
本文提供了一种在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，包括向受试者施用本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是实体癌。在一些实施方案中，实体癌选自卵巢癌，合适的癌症包括卵巢癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌。在一些实施方案中，癌症是液体癌。在一些实施方案中，液体癌是白血病或淋巴瘤。在一些实施方案中，液体癌是T细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，疾病是T细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂选自CD47激动剂、抑制Rac的试剂、抑制Cdc42的试剂、抑制GTP酶的试剂、促进F-肌动蛋白分解的试剂、促进PI3K募集到CFP或PFP的试剂、促进PI3K活性的试剂、促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的试剂、促进ARHGAP12活性的试剂、促进ARHGAP25活性的试剂、促进SH3BP1活性的试剂及其任意组合。
在一些实施方案中，施用包括输注或注射。在一些实施方案中，施用包括直接对实体癌施用。
在一些实施方案中，施用包括基于环状RNA、mRNA、病毒、颗粒、脂质体或外来体的递送程序。
在一些实施方案中，在受试者中引发CD4+T细胞反应或CD8+T细胞反应。
在一些实施方案中，方法包括使细胞与上述组合物、载体或上述多肽接触。在一些实施方案中，接触包括转导。在一些实施方案中，转导包括化学转染、电穿孔、核转染或病毒感染。
在一些实施方案中，本文提供了一种制备药物组合物的方法，包括将脂质与本文所述的组合物或本文所述的载体接触。
在一些实施方案中，接触包括形成脂质纳米颗粒。
还提供了一种制备药物组合物的方法，包括使抗体与本文所述的组合物或本文所述的载体接触。在一些实施方案中，接触包括形成脂质纳米颗粒。
重组核酸构建体中的转录调控元件
在一些实施方案中，重组核酸在非编码区内包含一种或多种调控元件，其可被操纵用于所编码蛋白质的期望表达谱。在一些实施方案中，非编码区可包含合适的增强子。在一些实施方案中，增强子包含调控蛋白的结合区，或可以将肽添加到细胞或包含细胞的系统中，以在增强子的影响下开始表达编码的蛋白质。相反，调控元件可包含保持与同源蛋白结合并继续抑制重组蛋白的转录和/或翻译的蛋白结合结构域，直到提供细胞外信号使蛋白从结合位置解偶联以允许开始蛋白质合成。实例包括但不限于本领域技术人员已知的四环素诱导型(Tet-诱导型或Tet-开启)和四环素抑制型(Tet-关闭)系统。
包含代谢开关的构建体：
在一些实施方案中，可以操纵位于构建体编码区侧翼的5'和3'非翻译区以调节由上述核酸构建体编码的重组蛋白的表达。例如，3'UTR可以包含一个或多个被插入用于稳定mRNA的元件。在一些实施方案中，富含AU的元件(ARE)序列插入3'UTR中，导致RNA结合蛋白的结合，该RNA结合蛋白使mRNA稳定或不稳定，从而能够控制mRNA半衰期。
在一些实施方案中，3'UTR可包含用于与阻止翻译的成熟mRNA链结合的RNA结合蛋白(例如，GAPDH)的保守区域。在一些实施方案中，糖酵解导致RNA结合蛋白(例如，GAPDH)解偶联，允许mRNA链翻译。代谢开关的原理是当细胞进入某种代谢状态时触发靶基因的表达。例如，在静息细胞中，GAPDH是RNA结合蛋白(RBP)。它与3'UTR中的ARE序列结合，阻止mRNA的翻译。当细胞进入糖酵解时，需要GAPDH将葡萄糖转化为ATP，从mRNA上脱离以允许进行蛋白质的翻译。在一些实施方案中，其中存在包含重组核酸的细胞的环境提供基因表达的代谢开关。例如，缺氧条件可以触发代谢开关，诱导GAPDH从mRNA中脱离。因此，当髓系细胞(例如巨噬细胞)离开循环并进入缺氧的肿瘤环境时，可以诱导mRNA的表达。这允许全身施用核酸或包含核酸的细胞，但确保局部表达，特别是靶向肿瘤环境。
在一些实施方案中，核酸构建体可以是分裂构建体，例如，允许构建体的一部分在组成型表达系统的控制下表达，而核酸的另一部分在代谢开关的控制下表达，如上所述。在一些实施方案中，核酸可以处于双顺反子控制之下。在一些实施方案中，双顺反子载体包含在第一调控控制下的第一编码序列，包括可能在组成型控制下的靶识别部分的编码序列；和可能在代谢开关下的编码炎症基因表达的第二编码序列。在一些实施方案中，双顺反子载体可以是单向的。在一些实施方案中，双顺反子载体可以是双向的。
在一些实施方案中，ARE序列包含用于结合与ADK、ALDH18A1、ALDH6A1、ALDOA、ASS1、CCBL2、CS、DUT、ENO1、FASN、FDPS、GOT2,HADHB、HK2、HSD17B10、MDH2、NME1、NQ01、PKM2、PPP1CC、SUCLG1、TP11、GAPDH或LDH结合的ARE序列的蛋白结合基序。
核酸递送到细胞中：
可以通过不同的递送方法将编码如本文所述的CFP或PFP的核酸引入细胞，例如髓系细胞。可在体外、离体或体内将如本文所述的重组核酸引入细胞。在一些实施方案中，核酸以质粒或载体的形式被引入髓系细胞。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是表达载体，例如，包含一个或多个启动子和其他调控元件的载体，包括增强子结合序列、起始和终止密码子、5'UTR、包含转录物稳定化元件的3'UTR、可选的保守调控蛋白结合序列等。在一些实施方案中，载体是噬菌体、粘粒或人工染色体。
在一些实施方案中，通过已知的转染方法，例如使用脂质体，或磷酸钙，或通过物理方法例如电穿孔或核转染，将载体引入或掺入细胞中。在一些实施方案中，通过感染将载体引入或掺入细胞，该过程通常称为病毒转导。
在一些实施方案中，用于表达CFP的载体是病毒来源的。在一些实施方案中，重组核酸由能够在非分裂细胞中复制的病毒载体编码。在一些实施方案中，编码重组核酸的核酸由慢病毒载体例如基于HIV和FIV的载体编码。在一些实施方案中，慢病毒载体是内部制备的并为此目的大规模制造。在一些实施方案中，如本领域技术人员已知的，使用可商购的慢病毒载体。在一些实施方案中，重组核酸由单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体编码。
在一些实施方案中，可通过使用转座酶和转座元件，特别是mRNA编码的转座酶，实现转基因稳定整合到髓系细胞，例如巨噬细胞和其他吞噬细胞中。在一个实施方案中，长散布元件-1(L1)RNA可以被考虑用于转基因的逆转录转座和稳定整合到髓系细胞中，例如巨噬细胞或吞噬细胞。逆转录转座子可用于稳定整合编码吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸。
在一些实施方案中，可通过将转基因掺入瞬时表达载体中表达转基因来修饰髓系细胞。在一些实施方案中，转基因的表达可以由来自细胞外的调节剂暂时调节。实例包括Tet-开启Tet-关闭系统，其中转基因的表达通过四环素的存在或不存在来调节。
在一些实施方案中，本文所述的重组核酸是环状RNA(环状RNA)。环状RNA包含RNA分子，其中RNA分子的5'端和3'端连接在一起。不希望受任何理论的束缚，环状RNA没有游离末端，与某些其他形式的RNA或核酸相比，可能具有更长的半衰期，并且可能对RNase R外切核酸酶的消化具有抗性，并且在体内比其对应物线性RNA更慢地转换。在一些实施方案中，环状RNA的半衰期大于20小时。在一些实施方案中，环状RNA的半衰期大于30小时。在一些实施方案中，环状RNA的半衰期大于40小时。在一些实施方案中，环状RNA的半衰期大于48小时。在某些实施方案中，环状RNA包含接合真核核糖体的内部核糖体进入位点(IRES)元件和编码多肽的RNA序列元件，该多肽与IRES可操作地连接以插入细胞，以产生感兴趣的多肽。
环状RNA可以通过本领域技术人员已知的方法制备。例如，环状RNA可以是化学合成的，或者可以是酶促合成的。在一些实施方案中，线性初级构建体或线性mRNA可以被环化或串联以产生环状RNA。环化或串联的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促或核酶催化方法的方法发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。在一些实施方案中，线性初级构建体或线性mRNA可以使用化学方法环化或串联以形成环状RNA。在化学方法中，核酸(例如，线性初级构建体或线性mRNA)的5'端和3'端含有化学反应基团，当靠近在一起时，在分子的5'端和3'端之间形成新的共价键。5'端可以含有NHS-酯反应基团并且3'端可以含有3'-氨基末端核苷酸，使得在有机溶剂中线性RNA分子的3'端上的3'-氨基末端核苷酸在5'-NHS-酯部分上进行亲核攻击，形成新的5'-/3'-酰胺键。在一些实施方案中，DNA或RNA连接酶，例如T4连接酶可用于将5'-磷酸化核酸分子(例如，线性初级构建体或线性mRNA)酶促连接至核酸的3'-羟基，形成新的磷酸二酯键。在一些实施方案中，线性初级构建体或线性mRNA可以通过使用至少一个非核酸部分来环化或串联。例如，至少一个非核酸部分可以与线性初级构建体或线性mRNA的5'端附近和/或3'端附近的区域或特征反应，以环化或串联线性初级构建体或线性mRNA。在一些实施方案中，线性初级构建体或线性mRNA可由于非核酸部分而被环化或串联，该非核酸部分导致在线性初级构建体或线性mRNA的5'和3'端处、附近或与之连接的原子、分子表面之间的吸引力。例如，线性初级构建体或线性mRNA可以被分子间力或分子内力环化或串联。分子间力的非限制性实例。在一些实施方案中，线性初级构建体或线性mRNA可以包含靠近5'端和靠近3'端的核酶RNA序列。在一些实施方案中，可以通过将DNA片段插入含有具有自发切割和自环化能力的序列的质粒中来合成环状RNA。在一些实施方案中，通过制备编码RNA环化酶核酶的DNA构建体，将DNA构建体表达为RNA，然后使RNA自剪接来产生环状RNA，这在体外产生不含内含子的环状RNA。在一些实施方案中，通过合成线性多核苷酸、在杂交条件下将线性核苷酸与互补连接寡核苷酸组合并连接线性多核苷酸来产生环状RNA。
环状RNA可以被修饰或未修饰。在一些实施方案中，环状RNA被化学修饰。例如，环状RNA的A、G、U或C核糖核苷酸可包含化学修饰。在一些实施方案中，环状RNA的任何区域，例如CFP或PFP的编码区、侧翼区和/或末端区可含有一个、两个或更多个(任选不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些实施方案中，与未修饰的环状RNA相比，引入细胞的修饰的环状RNA在细胞中可表现出降低的降解。还包括对诸如糖、核碱基或核苷间键(例如连接磷酸/磷酸二酯键/磷酸二酯骨架)的修饰。在一些实施方案中，核碱基的一个或多个原子，例如嘧啶核碱基可以被任选取代的氨基、任选取代的硫氢基、任选取代的烷基(例如，甲基或乙基)或卤素(例如，氯或氟)替换或取代。在某些实施方案中，修饰(例如，一个或多个修饰)存在于每一个糖和核苷间键中。US20170204422中描述了对环状RNA的另外修饰，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，环状RNA与其他多核苷酸、染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、得克萨卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标志物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶、蛋白质例如糖蛋白或肽，例如对共配体具有特异性亲和力的分子或抗体，例如与特定细胞类型(例如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)、激素和激素受体、非肽物质(例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素或辅因子)结合的抗体缀合。
在一些实施方案中，将环状RNA直接施用于受试者的组织。美国专利号5,766,903、5,580,859、5,773,244、6,210,931、PCT公开号WO1992001813，Hsu等人，Nature(1979)280:339-340、Harland&Misher、Development(1988)102:837-852、Memczak等人，Nature(2013)495:333-338、Jeck等人和RNA(2013)19:141-157中对环状RNA进行了另外描述，它们各自的全部内容通过引用并入本文.
在一些实施方案中，将核酸与纳米颗粒(NP)一起引入髓系细胞。纳米颗粒可以具有各种形状或尺寸并且可以包含编码CFP或PFP的核酸。在一些实施方案中，NP是脂质纳米颗粒(LNP)。在一些实施方案中，NP包含聚(氨基酸)、多糖和聚(α-羟基酸)、金、银、碳、铁、二氧化硅或其任意组合。在一些实施方案中，NP包括聚丙交酯-共-乙交酯(PGLA)颗粒。在一些实施方案中，例如通过水/油乳液或水-油-水乳液将核酸包封在NP中。在一些实施方案中，核酸与NP缀合。
NP可以在体外、离体或体内递送至细胞。在一些实施方案中，NP被离体递送至吞噬细胞。在一些实施方案中，NP被体内递送至吞噬细胞。在一些实施方案中，NP的直径小于100nm。在一些实施方案中，NP的直径大于100nm。在一些实施方案中，NP是杆状NP。在一些实施方案中，NP是球形NP。在特定实施方案中，NP是用于递送至吞噬细胞的球形NP。在另外的实施方案中，NP的直径为至少100nm并且当递送至细胞时不会触发降低的毒性或会触发降低的毒性。
在一些实施方案中，NP带正电。在一些实施方案中，NP带负电。在一些实施方案中，NP是由髓系细胞离体或体内递送和吸收的阳离子NP。
刚度可能会影响NP的生物学影响。由刚性材料制成的NP可能与增加栓塞的可能性有关，而更容易变形的柔性聚合物基NP可能会在与炎症相关的复杂血管变化期间更好地进入组织。NP的流动性也会影响载有抗原的NP刺激免疫反应的能力。因此，肌内、固相、含抗原的脂质体免疫接种可能比类似施用的液相脂质体引起更强烈的Th1/Th17反应。不希望受任何理论的束缚，固相颗粒可能是由固定化抗原颗粒贮库的形成产生的，并且可能导致APC的抗原供应延长，也与正共刺激分子如CD80的上调有关，这支持有效的T细胞引发。
在一些实施方案中，蛋白冠可在NP周围形成。蛋白冠可以在两步过程中形成。在第一步中，高亲和力蛋白质与NP迅速结合以形成初级冠。在第二步中，亲和力较低的蛋白质与NP直接结合，或者与初级冠中的蛋白质结合，形成次级冠。因此，蛋白冠的成分可能受到血清蛋白质含量的影响，并因此受到调节其的稳态或免疫反应的影响。在一些实施方案中，具有高丰度的蛋白质，例如白蛋白，包含显著比例的初级冠。在一些实施方案中，具有不同电荷的NP在特定环境中(例如在含有某种抗原或抗体的血浆中)结合大量较少丰度的蛋白质。蛋白冠的体内形成可能改变NP电荷或掩蔽对NP靶向某些受体很重要的官能团和/或增强吞噬细胞对NP的清除。在一些实施方案中，NP被工程化为减少NP电荷的变化或官能团的掩蔽，和/或增加NP的血清半衰期。在一些实施方案中，NP表面涂层被设计为调节调理作用事件。例如，NP的表面可能涂覆有聚合乙二醇(PEG)或其低分子量衍生物聚环氧乙烷(PEO)。不希望受任何理论束缚，PEG增加表面亲水性，由于降低的血清蛋白结合而导致改善的循环NP半衰期。在一些实施方案中，涂覆有PEG或PEO的NP被工程化为导致NP的毒性降低或生物相容性增加。髓系细胞的其他NP设计和NP靶向在Getts等人，Trends Immunol.36(7):419-427(2015)中描述，其全部内容通过引用并入本文。
本文所述的NP可用于在体外/离体细胞培养中或在体内施用将重组核酸引入细胞中。在一些实施方案中，NP被修饰用于体内施用。例如，在被肝或脾吞噬细胞摄取之前，NP可以包括结合部分的表面修饰或附着以结合特定毒素、蛋白质、配体或其任意组合。在最近的啮齿动物概念验证研究中，注入的高度带负电的“免疫修饰NP”(IMP)可以吸收某些血液蛋白，包括S100家族和热激蛋白质，然后最终被单核吞噬细胞系统的细胞去除和破坏。此外，这种机制还可用于捕获和浓缩某些循环蛋白质。已显示IMP结合膜联蛋白1。膜联蛋白1的积累及其向特定白细胞亚群的呈递可能具有广泛的免疫结果。例如，载有膜联蛋白1的NP可以通过诱导细胞凋亡和/或促进T细胞激活来减少嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，NP被设计成靶向细胞表面受体，例如清道夫受体。在一些实施方案中，NP是具有高度负表面电荷的颗粒。
在一些实施方案中，NP包封核酸，其中核酸是裸DNA分子。在一些实施方案中，NP包封核酸，其中所述核酸是mRNA分子。在一些实施方案中，NP包封核酸，其中所述核酸是环状RNA(环状RNA)分子。在一些实施方案中，NP包封核酸，其中所述核酸是载体、质粒或其部分或片段。
在一些实施方案中，NP是脂质纳米颗粒(LNP)。LNP可包含极性和或非极性脂质。在一些实施方案中，胆固醇存在于LNP中用于有效递送。LNP的直径为100-300nm，为mRNA递送到各种细胞类型，包括髓系细胞如巨噬细胞提供有效手段。在一些实施方案中，LNP可用于在体外细胞培养中将重组核酸引入细胞中。在一些实施方案中，LNP包封核酸，其中核酸是裸DNA分子。在一些实施方案中，LNP包封核酸，其中所述核酸是mRNA分子。在一些实施方案中，LNP包封核酸，其中核酸插入载体，例如质粒载体中。在一些实施方案中，LNP包封核酸，其中所述核酸是环状RNA分子。
在一些实施方案中，LNP用于将核酸递送到受试者体内。LNP可用于在受试者体内系统地递送核酸。它可以通过注射递送。在一些实施方案中，包含核酸的LNP通过静脉内途径注射。在一些实施方案中，LNP被皮下注射。
药物组合物
本文提供了一种药物组合物，其包含工程化的髓系细胞，例如巨噬细胞，包含编码CFP的重组核酸和药学上可接受的赋形剂。
本文还提供了一种药物组合物，其包含编码CFP的重组核酸和药学上可接受的赋形剂。药物组合物可包含DNA、mRNA或环状RNA或这些中任一种的脂质体组合物。脂质体是LNP。
本文还提供了包含载体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述载体包含编码CFP的重组核酸。药物组合物可包含插入质粒载体或病毒载体中的DNA、mRNA或环状RNA。
在一些实施方案中，工程化的髓系细胞，例如巨噬细胞，在足以达到治疗施用剂量的细胞培养物中生长，洗涤，并重悬到药物组合物中。
在一些实施方案中，赋形剂包含在中性pH下的无菌缓冲液(例如，HEPES或PBS)。在一些实施方案中，药物组合物的pH为7.5。在一些实施方案中，pH可以在可接受的范围内变化。在一些实施方案中，工程化的细胞可包含在无菌富集细胞悬浮培养基中，该培养基包含补体去活血清或合成血清。在一些实施方案中，药物组合物进一步包含用于细胞保存和功能的细胞因子、趋化因子或生长因子。
在一些实施方案中，药物组合物可包含与工程化细胞共同施用的另外治疗剂。
治疗方法
本文提供了使用药物组合物治疗受试者癌症的方法，所述药物组合物包含工程化髓系细胞，例如吞噬细胞(例如，巨噬细胞)、表达编码CFP的重组核酸，例如吞噬细胞受体(PR)融合蛋白(PFP)以直接或间接靶向、攻击和杀死癌细胞。工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，在本文的描述中也被称为CAR-P细胞。
癌症包括但不限于，T细胞淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、B细胞癌(例如，多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症)、重链疾病(诸如例如，α链疾病、γ链疾病和mu链疾病)、良性单克隆丙种球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌(例如，转移性、激素难治性前列腺癌)、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、周围神经系统癌症、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠癌或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌等。适用于本公开所涵盖的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人类肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形瘤肿瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)；真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症和重链病。在一些实施方案中，癌症是上皮癌，例如但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在其他实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以在其他方面有不同的特点，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞或未分化性。在一些实施方案中，本公开用于淋巴瘤或其亚型的治疗、诊断和/或预后，包括但不限于套细胞淋巴瘤。淋巴增生性疾病也被认为是增生性疾病。
通常，细胞免疫疗法包括向患者提供包含活细胞的药物。在一些方面，患有癌症的患者或受试者用自体细胞治疗，该方法包括分离PBMC衍生的髓系细胞(例如巨噬细胞)、离体修饰细胞以通过将编码CFP的重组核酸引入细胞中产生能够肿瘤裂解的吞噬性髓系细胞以及将修饰的髓系细胞施用于受试者。
在一些方面，向受试者施用一剂或多剂药物组合物，所述药物组合物包含治疗性髓系细胞，例如吞噬细胞，其中所述细胞是同种异体的。可以匹配HLA用于与受试者的相容性，使得细胞不会导致移植物抗宿主病(GVHD)。到达诊所的受试者进行HLA分型以确定受试者表达的HLA抗原。
HLA分型通常通过使用抗体的血清学方法或通过基于PCR的方法例如序列特异性寡核苷酸探针杂交(Sequence Specific Oligonucleotide Probe Hybridization，SSOP)或基于序列的分型(Sequence Based Typing，SBT)来进行。
序列信息可以通过测序方法或使用质谱法例如液相色谱-质谱法(LC-MS或LC-MS/MS，或者替代地HPLC-MS或HPLC-MS/MS)的方法鉴定。这些测序方法对于技术人员来说可能是众所周知的，并且在Medzihradszky KF和Chalkley RJ.Mass Spectrom Rev.2015年1-2月；34(1):43-63中进行了综述。
在一些方面，吞噬细胞衍生自受试者，在体外用重组核酸转染或转导，在体外细胞培养中扩增以达到适合施用的数量，然后施用于受试者。在一些实施方案中，在体外用重组核酸转染或转导、在体外细胞培养中扩增以达到适合施用的数量的步骤需要2天、或3天、或4天、或5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天。
在一些实施方案中，包含重组核酸的足量转染或转导的髓系细胞，例如巨噬细胞被无菌保存，在HLA分型并将产品与受体HLA亚型匹配后，将其作为“现成”产品施用于受试者。在一些实施方案中，工程化的吞噬细胞被冷冻保存。在一些实施方案中，将工程化的吞噬细胞冷冻保存在合适的培养基中以经受解冻而不显著降低细胞活力。
在一些实施方案中，向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含载体中的DNA或mRNA或环状RNA，或上文所述的药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，现成的细胞产品的施用可以是瞬时的，或者在施用前可能需要1天、2天、或3天、或4天、或5天、或6天、或7天或更长时间。可将包含细胞或核酸的药物组合物从制备开始保存一段时间直到在冷冻条件下使用。在一些实施方案中，药物组合物可以被解冻一次。在一些实施方案中，药物组合物可以被解冻多于一次。在一些实施方案中，药物组合物在施用于受试者之前在冻融循环之后稳定。在一些实施方案中，在解冻前施用后测试药物组合物的最终质量控制。
在一些实施方案中，每个施用剂量施用包含10^6个工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，每个施用剂量施用包含10^7个工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，每个施用剂量施用包含5X 10^7个工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，每个施用剂量施用包含10^8个工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，每个施用剂量施用包含2x10^8个工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，每个施用剂量施用包含5x10^8个工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，每个施用剂量施用包含10^9个工程化细胞的组合物。在一些实施方案中，每个施用剂量施用包含10^10个工程化细胞的组合物。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，被施用一次。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，被施用多于一次。
在一些实施方案中，工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，在一段时间跨度内(包括几个月、一年或更长时间)对受试者施用两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、或十次或更多次。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，每周施用两次。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，每周施用一次。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，每两周施用一次。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，每三周施用一次。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，每月施用一次。
在一些实施方案中，将工程化的吞噬细胞每2个月施用一次、每3个月施用一次、每4个月施用一次、每5个月施用一次或每6个月施用一次。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，通过注射施用。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，通过输注施用。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，通过静脉输注施用。
在一些实施方案中，将工程化的髓系细胞，例如吞噬细胞，通过皮下输注施用。
包含重组核酸或工程化细胞的药物组合物可以通过导致治疗有效结果的任何途径施用。这些包括但不限于，肠内(进入肠道)、胃肠道、硬膜外(进入硬脑膜)、口服(通过口腔)、经皮、硬膜外、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮(应用到皮肤上)、皮内(进入皮肤本身)、皮下(皮肤下)、鼻腔给药(通过鼻子)、静脉内(进入静脉)、静脉推注、静脉滴注、动脉内(进入动脉)、肌肉内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内、(输注或注射到腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内、(通过眼睛)、海绵窦内注射(进入病理腔)、腔内(进入阴茎根部)、阴道内给药、子宫内、羊膜腔外给药、透皮(通过完整皮肤扩散用于全身分布)、经粘膜(通过粘膜扩散)、经阴道、吹入法(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼液(在结膜上)、滴耳液、耳穴(在耳朵内或通过耳朵)、颊(针对脸颊)、结膜、皮肤、牙科(对一颗或多颗牙齿)、电渗、子宫颈内、鼻窦内、气管内、体外、血液透析、浸润、间质、腹内、羊膜内、关节内、胆管内、支气管内、囊内、软骨内(软骨内)、尾内(马尾内)、脑池内(小脑延髓池小脑结节内)、角膜内(角膜内)、牙科冠齿内、冠状动脉内(冠状动脉内)、海绵体体腔内(阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(盘窝内)，管内(腺管内)、十二指肠内(十二指肠内)、硬膜内(硬膜内或下方)、表皮内(至表皮)、食道内(至食道)、胃内(胃内)、齿龈内(齿龈内)、回肠内(小肠远端部分内)、病灶内(在局部病灶内或直接引入局部病灶)、腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴管内)、髓内(在骨的骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、眼内(在眼睛内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或其支气管内)、鼻内(在鼻内或眶周鼻窦内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(关节的滑膜腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴任何水平的脑脊液内)、胸廓内(在胸内)、管内(在器官的小管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在中耳内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子电渗疗法(通过电流，其中可溶性盐的离子迁移到身体组织中)、冲洗(沐浴或冲洗开放的伤口或体腔)、喉部(直接在喉部)、鼻胃(通过鼻子并进入胃内)、闭塞敷料技术(局部途径给药，然后用封闭该区域的敷料覆盖)、眼科(到外眼)、口咽部(直接到口腔和咽部)、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠、呼吸道(通过口腔或鼻吸入局部或全身作用在呼吸道内)、球后(脑桥后面或者眼球后面)、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(通过气管壁)、经鼓室(穿过或通过鼓室)、输尿管(到输尿管)、尿道(到尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断、神经阻滞、胆道灌注、心脏灌注、光分离术或脊髓。在具体实施方案中，组合物可以允许它们穿过血脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式施用。
在一些实施方案中，向受试者施用包含编码本文所述的CFP或PFP的核酸的药物组合物。在一些实施方案中，向受试者施用包含DNA、mRNA或环状RNA的药物组合物。在一些实施方案中，向受试者施用含有核酸例如DNA、mRNA或环状RNA的载体。在一些实施方案中，核酸被施用或在上述药学上可接受的赋形剂中。
在一些实施方案中，受试者被施用与核酸(例如编码如本文所述的CFP或PFP的DNA、mRNA或环状RNA)相关的纳米颗粒(NP)。在一些实施方案中，核酸被封装在纳米颗粒中。在一些实施方案中，核酸与纳米颗粒缀合。在一些实施方案中，NP是聚丙交酯-共-乙交酯(PGLA)颗粒。在一些实施方案中，将NP皮下施用。在一些实施方案中，将NP静脉内施用。在一些实施方案中，NP被工程化为与施用途径相关。例如，NP的大小、形状或电荷可以根据施用途径工程化。在一些实施方案中，皮下施用的NP的尺寸小于200nm。在一些实施方案中，皮下施用的NP的尺寸大于200nm。在一些实施方案中，皮下施用的NP的大小为至少30nm。在一些实施方案中，将NP静脉内输注。在一些实施方案中，静脉内输注的NP的直径为至少5nm。在一些实施方案中，静脉内输注的NP的直径为至少30nm。在一些实施方案中，静脉内输注的NP的直径为至少100nm。在某些实施方案中，施用的NP，例如静脉施用的NP，通过循环单核细胞被吞没。其他NP设计和施用方法描述于Getts等人，Trends Immunol.36(7):419-427(2015)中描述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，向受试者施用包含编码本文所述的CFP或PFP的环状RNA的药物组合物。可以以本文所述的任何途径施用环状RNA。在一些实施方案中，可以直接输注环状RNA。在一些实施方案中，环状RNA可以在包含氯化钠、氯化钙、磷酸盐和/或EDTA中的一种或多种的制剂或溶液中。在一些实施方案中，环状RNA溶液可包括盐水、含2mM的钙的盐水、5％蔗糖、含2mM的钙的5％蔗糖、5％甘露醇、含2mM钙的5％甘露醇、林格氏乳酸盐、氯化钠、含2mM的钙和甘露糖的氯化钠中的一种或多种。在一些实施方案中，环状RNA溶液是冻干的。可以改变每种组分的量以实现一致的、可再现的更高浓度的盐水或简单的缓冲剂制剂。还可以改变组分以增加缓冲溶液中的环状RNA在一段时间内和/或在各种条件下的稳定性。在一些实施方案中，环状RNA被配制在冻干凝胶相脂质体组合物中。在一些实施方案中，环状RNA制剂包含填充剂，例如蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、甘氨酸、乳糖和/或棉子糖，以赋予制剂期望的一致性和/或制剂组分的稳定性。美国公开号US2012060293和US20170204422中描述的环状RNA的另外的配制和施用方法的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，向受试者施用包含编码本文所述的CFP或PFP的mRNA的药物组合物。在一些实施方案中，将mRNA共同配制为纳米颗粒(NP)，例如脂质纳米颗粒(LNP)。例如，LNP可以包括阳离子脂质或可离子化的脂质。在一些实施方案中，将mRNA配制成聚合物颗粒，例如聚乙烯亚胺颗粒、聚(糖酰胺胺)、ly(β-氨基)酯(PBAE)、PEG颗粒、神经酰胺-PEG、聚酰胺胺颗粒或聚乳酸-共-乙醇酸颗粒(PLGA)。在一些实施方案中，通过直接注射施用mRNA。在一些实施方案中，mRNA与转染剂复合，例如脂质体转染2000、jetPEI、RNAiMAX或Invivofectamine。
mRNA可以是裸mRNA。mRNA可以被修饰或未修饰。例如，mRNA可以被化学修饰。在一些实施方案中，mRNA的核碱基和/或序列被修饰以增加mRNA的稳定性和半衰期。在一些实施方案中，mRNA被糖基化。其他mRNA修饰和递送方法，如Flynn等人，BioRxiv787614(2019)和Kowalski等人，Mol.Ther.27(4):710-728(2019)所述，其各自的全部内容通过引用并入本文。
实施方案
1.一种包含编码吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸的组合物，所述吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)包含：(a)PR亚基，所述PR亚基包括：(i)跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；并且其中当所述PFP与所述靶细胞的抗原结合时，与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞的杀伤或吞噬活性增加至少大于20％。
2.根据实施方案1所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自吞噬细胞或栓系受体，或者其中胞内信号传导结构域包含吞噬激活结构域。
3.根据实施方案1或2所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcR-α或Bai1的吞噬细胞受体之外的受体。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自一种受体，所述受体选自表2中列出的受体。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。
6.根据实施方案5所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
7.一种包含编码吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸的组合物，所述吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)包含：(a)PR亚基，所述PR亚基包括：(i)跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；并且其中所述胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcR-α或Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体。
8.根据实施方案7所述的组合物，其中在所述PFP与所述靶细胞的抗原结合后，与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞的杀伤活性增加至少大于20％。
9.根据实施方案7或8所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自选自凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fc-α受体I、CR1、CD35、CD3ζ、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4和CD169的吞噬细胞受体。
10.根据实施方案7-9中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。
11.一种包含编码吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸的组合物，所述吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)包含：(a)PR亚基，所述PR亚基包括：(i)跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和(b)包含对靶细胞的抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；并且其中所述胞内信号传导结构域衍生自吞噬细胞受体，所述吞噬细胞受体选自凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fc-α受体I、CR1、CD35、CD3ζ、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4和CD169。
12.根据实施方案11所述的组合物，其中在所述PFP与所述靶细胞的抗原结合后，与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞的杀伤活性增加至少大于55％。
13.根据实施方案11或12所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcR-α或Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体。
14.根据实施方案11-13中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。
15.根据实施方案14所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
16.一种包含编码吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)的重组核酸的组合物，所述吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(PFP)包含：(a)PR亚基，所述PR亚基包括：(i)跨膜结构域，和(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；并且其中所述胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
17.根据实施方案16所述的组合物，其中在所述PFP与所述靶细胞的抗原结合后，与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞的杀伤活性增加至少大于20％。
18.根据实施方案16或17所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自吞噬细胞受体。
19.根据实施方案16-18中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcR-α或Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体。
20.根据实施方案16-19中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自选自凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fc-α受体I、CR1、CD35、CD3ζ、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4和CD169的吞噬细胞受体。
21.根据实施方案1-15中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含PI3K募集结构域。
22.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中当所述PFP在所述细胞中表达时，所述PFP功能性地掺入细胞的细胞膜中。
23.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出表达所述抗原的靶细胞的吞噬作用增加。
24.根据实施方案23所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出表达所述抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少1.1倍。
25.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出表达所述抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍或50倍。
26.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中表达所述抗原的靶细胞是癌细胞。
27.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中表达所述抗原的所述靶细胞的直径为至少0.8微米。
28.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自清道夫受体。
29.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出细胞因子产生的增加。
30.根据实施方案29所述的组合物，其中所述细胞因子选自IL-1、IL3、IL-6、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素及其组合。
31.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出效应物活性的增加。
32.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出交叉呈递的增加。
33.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出MHC II类蛋白的表达的增加。
34.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出CD80的表达的增加。
35.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出CD86的表达的增加。
36.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出MHC I类蛋白的表达的增加。
37.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出TRAIL/TNF家族死亡受体的表达的增加。
38.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出B7-H2的表达的增加。
39.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出LIGHT的表达的增加。
40.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出HVEM的表达的增加。
41.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出CD40的表达的增加。
42.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出TL1A的表达的增加。
43.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出41BBL的表达的增加。
44.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出OX40L的表达的增加。
45.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出GITRL死亡受体的表达的增加。
46.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出CD30L的表达的增加。
47.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出TIM4的表达的增加。
48.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出TIM1配体的表达的增加。
49.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出SLAM的表达的增加。
50.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出CD48的表达的增加。
51.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出CD58的表达的增加。
52.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出CD155的表达的增加。
53.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出CD112的表达的增加。
54.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出PDL1的表达的增加。
55.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出B7-DC的表达的增加。
56.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出呼吸爆发的增加。
57.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出ROS产生的增加。
58.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出iNOS产生的增加。
59.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出iNOS产生的增加。
60.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出细胞外囊泡产生的增加。
61.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出表达所述抗原的靶细胞的胞啃作用的增加。
62.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出对CD47介导的吞噬作用抑制的抗性的增加。
63.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中与不表达所述PFP的细胞相比，表达所述PFP的细胞表现出对LILRB1介导的吞噬作用抑制的抗性的增加。
64.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含Rac抑制结构域、Cdc42抑制结构域或GTP酶抑制结构域。
65.根据实施方案64所述的组合物，其中所述Rac抑制结构域、所述Cdc42抑制结构域或所述GTP酶抑制结构域在表达所述PFP的细胞的吞噬杯处抑制Rac、Cdc42或GTP酶。
66.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含F-肌动蛋白分解激活结构域、ARHGAP12激活结构域、ARHGAP25激活结构域或SH3BP1激活结构域。
67.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中表达所述PFP的细胞表现出磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的增加。
68.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含Ig结合结构域。
69.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、FcRγI、FcRγIIA、FcRγIIB、FcRγIIC、FcRγIIIA、FcRγIIIB、FcRn、TRIM21、FcRL5结合结构域。
70.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcR胞外结构域。
71.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcRα、FcRβ、FcRε或FcRγ胞外结构域。
72.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcRα(FCAR)胞外结构域。
73.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcRβ胞外结构域。
74.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcRε(FCER1A)胞外结构域。
75.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcRγ(FDGR1A、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B)胞外结构域。
76.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含整合素结构域。
77.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含一种或多种整合素α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7或β8结构域。
78.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含CD47抑制结构域。
79.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述PSR亚基进一步包含与跨膜结构域和胞外抗原结合结构域可操作地连接的胞外结构域。
80.根据实施方案79所述的组合物，其中所述胞外结构域还包含受体、铰链、间隔区或接头的胞外结构域。
81.根据实施方案80所述的组合物，其中所述胞外结构域包含PSR的胞外部分。
82.根据实施方案81所述的组合物，其中所述PSR的胞外部分衍生自与PSR胞内信号传导结构域相同的PSR。
83.根据实施方案79-82中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含清道夫受体的胞外结构域或免疫球蛋白结构域。
84.根据实施方案83所述的组合物，其中所述免疫球蛋白结构域包含免疫球蛋白的胞外结构域或免疫球蛋白铰链区。
85.根据实施方案79-84中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含吞噬吞没标志物。
86.根据实施方案79-85中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含能够进行多聚体组装的结构。
87.根据实施方案79-86中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含用于多聚化的支架。
88.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域的长度为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。
89.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域的长度为至多500、400、300、200或100个氨基酸。
90.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域与所述靶细胞的抗原特异性结合。
91.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含抗体结构域。
92.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含受体结构域、抗体结构域，其中所述抗体结构域包含功能性抗体片段、单链可变片段(scFv)、Fab、单域抗体(sdAb)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、VNAR结构域、VHH结构域、双特异性抗体、双抗体或其功能片段或组合。
93.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含配体、受体的胞外结构域或衔接子。
94.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含对单一抗原特异的单一胞外抗原结合结构域。
95.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含至少两个胞外抗原结合结构域，其中至少两个胞外抗原结合结构域中的每一个对不同抗原具有特异性。
96.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原是癌抗原或病原体抗原或自身免疫抗原。
97.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括病毒抗原。
98.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原是T淋巴细胞抗原。
99.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原是胞外抗原。
100.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原是胞内抗原。
101.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原选自胸苷激酶(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、粘蛋白-1、粘蛋白-16(MUC16)、MUC1、表皮生长因子受体vIII(EGFRvIII)、间皮素、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、EBNA-1、LEMD1、磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原(CEA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、卵泡刺激素受体、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、促红细胞生成素生成性肝细胞癌A2(EphA2)、EphB2、自然杀伤基团2D(NKG2D)配体、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD45、CD56CD79b、CD97、CD117、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD213A2、CD248、CD276、PSCA、CS-1、CLECL1、GD3、PSMA、FLT3、TAG72、EPCAM、IL-1、整合素受体、PRSS21、VEGFR2、PDGFRβ、SSEA-4、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、GM3、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、IGLL1及其组合。
102.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CCR4、CD8、CD30、CD45、CD56。
103.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原是卵巢癌抗原或T淋巴瘤抗原。
104.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原是整合素受体。
105.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原是选自α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8的整合素受体。
106.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括2种或更多种抗原。
107.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域和所述胞外抗原结合结构域通过接头可操作地连接。
108.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域和所述胞外抗原结合结构域通过接头如CD8α、IgG1或IgG4的铰链区可操作地连接。
109.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含多聚化支架。
110.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含FcR跨膜结构域。
111.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含具有不超过20、10或5个修饰跨膜结构域的FcR-ε。
112.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包括来自突触融合蛋白，例如突触融合蛋白3或突触融合蛋白4或突触融合蛋白5的跨膜结构域。
113.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中当所述PFP在细胞中表达时，所述跨膜结构域与内源性受体的跨膜结构域寡聚化。
114.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中当所述PFP在细胞中表达时，所述跨膜结构域与外源性受体的跨膜结构域寡聚化。
115.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中当所述PFP在细胞中表达时，所述跨膜结构域与内源性受体的跨膜结构域二聚化。
116.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中当所述PFP在细胞中表达时，所述跨膜结构域与外源性受体的跨膜结构域二聚化。
117.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域衍生自与从其衍生出所述胞内信号传导结构域的蛋白质不同的蛋白质。
118.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域衍生自与从其衍生出所述胞外结构域的蛋白质不同的蛋白质。
119.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含吞噬细胞受体的跨膜结构域。
120.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域衍生自相同的蛋白质。
121.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域衍生自与所述胞内信号传导结构域相同的蛋白质。
122.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码DAP12募集结构域。
123.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含与DAP12寡聚化的跨膜结构域。
124.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域的长度为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸。
125.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域的长度为至多12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸。
126.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含磷酸酶抑制结构域。
127.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含ARP2/3抑制结构域。
128.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含至少一个ITAM结构域。
129.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个ITAM结构域。
130.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域还包含至少一个ITAM结构域。
131.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域还包含至少一个选自CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b 1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列的ITAM结构域。
132.根据实施方案129所述的组合物，其中所述至少一个ITAM结构域包含Src家族激酶磷酸化位点。
133.根据实施方案129所述的组合物，其中所述至少一个ITAM结构域包含Syk募集结构域。
134.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含F-肌动蛋白解聚激活结构域。
135.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域缺乏酶活性。
136.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域不包含衍生自CD3ζ胞内结构域的结构域。
137.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含CD47抑制结构域。
138.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含激活整合素的结构域，例如PSGL-1的胞内区。
139.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含激活Rap1 GTP酶的结构域，例如来自EPAC和C3G的结构域。
140.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域来自桩蛋白。
141.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域激活粘着斑激酶。
142.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自单个吞噬细胞受体。
143.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自单个清道夫受体。
144.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域进一步包含吞噬作用增强结构域。
145.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含促炎信号传导结构域。
146.根据实施方案中145所述的组合物，其中所述促炎信号传导结构域包含激酶激活结构域或激酶结合结构域。
147.根据实施方案145或146所述的组合物，其中所述促炎信号传导结构域包含IL-1信号传导级联激活结构域。
148.根据实施方案145-147中任一项所述的组合物，所述促炎信号传导结构域包含衍生自TLR3、TLR4、TLR7、TLR 9、TRIF、RIG-1、MYD88、MAL、IRAK1、MDA-5、IFN-受体、NLRP家族成员、NLRP1-14、NOD1、NOD2、脓素、AIM2、NLRC4、FCGR3A、FCERIG、CD40、半胱天冬酶结构域或半胱天冬酶原结合结构域或其任意组合的胞内信号传导结构域。
149.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述PFP不包含全长胞内信号传导结构域。
150.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域的长度为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。
151.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域的长度为至多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。
152.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码FcRα链胞外结构域、FcRα链跨膜结构域和/或FcRα链胞内结构域。
153.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码FcRβ链胞外结构域、FcRβ链跨膜结构域和/或FcRβ链胞内结构域。
154.根据实施方案152或153所述的组合物，其中当在细胞中表达时，FcRα链或FcRβ链与FcRγ形成复合物。
155.根据实施方案154所述的组合物，其中当在细胞中表达时，所述FcRα链或FcRβ链与内源性FcRγ形成复合物。
156.根据实施方案152-155中任一项所述的组合物，其中所述FcRα链或所述FcRβ链不掺入不表达FcRγ的细胞的细胞膜中。
157.根据实施方案152-156中任一项所述的组合物，其中所述PFP不包含FcRα链胞内信号传导结构域。
158.根据实施方案152-157中任一项所述的组合物，其中所述PFP不包含FcRβ链胞内信号传导结构域。
159.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码TREM胞外结构域、TREM跨膜结构域和/或TREM胞内结构域。
160.根据实施方案159所述的组合物，其中所述TREM是TREM1、TREM 2或TREM 3。
161.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸包含编码促炎多肽的序列。
162.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含促炎多肽。
163.根据实施方案162所述的组合物，其中所述促炎多肽是趋化因子、细胞因子和核苷酸。
164.根据实施方案163所述的组合物，其中所述趋化因子选自IL-1、IL3、IL5、IL-6、il8、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素。
165.根据实施方案163所述的组合物，其中所述细胞因子选自IL-1、IL3、IL5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素。
166.根据实施方案163所述的组合物，其中所述核苷酸选自ATP、ADP、UTP、UDP和/或UDP-葡萄糖。
167.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸包含编码炎症稳态调节剂的序列。
168.根据实施方案167所述的组合物，其中所述炎症的稳态调节剂是mRNA的非翻译区(UTR)中的序列。
169.根据实施方案168所述的组合物，其中所述UTR中的序列是与RNA结合蛋白结合的序列。
170.根据实施方案168或169所述的组合物，其中在所述RNA结合蛋白与非翻译区(UTR)中的序列结合时，翻译被抑制或阻止。
171.根据实施方案169或170所述的组合物，其中所述UTR中的序列包含WWWU(AUUUA)UUUW的共有序列，其中W是A或U。
172.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸在双顺反子载体上表达。
173.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。
174.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞是人类细胞。
175.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞包括被病原体感染的细胞。
176.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞是癌细胞。
177.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞是癌细胞，即淋巴细胞。
178.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞为癌细胞，即卵巢癌细胞。
179.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞为癌细胞，即卵巢胰腺细胞。
180.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞为癌细胞，即胶质母细胞瘤细胞。
181.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为DNA。
182.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为RNA。
183.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为mRNA。
184.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为环状RNA。
185.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为tRNA。
186.根据前述实施方案中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为微小RNA。
187.一种载体，其包含根据实施方案1-186中任一项所述的组合物。
188.根据实施方案187所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
189.根据实施方案188所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。
190.根据实施方案187-189中任一项所述的载体，其中所述载体还包含与至少一种编码一种或多种多肽的核酸序列可操作地连接的启动子。
191.根据实施方案187-190中任一项所述的载体，其中所述载体是多顺反子的。
192.根据实施方案190或191所述的载体，其中所述至少一个核酸序列中的每一个与单独的启动子可操作地连接。
193.根据实施方案187-192中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。
194.根据实施方案187-192中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含位于编码一种或多种多肽的至少一种核酸序列侧翼的5'UTR和/或3'UTR。
195.根据实施方案187-192中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含一个或多个调控区。
196.一种多肽，由实施方案1-186中任一项所述的组合物的所述重组核酸编码。
197.一种细胞，包含实施方案1-186中任一项所述的组合物、实施方案187-195中任一项所述的载体或实施方案196所述的多肽。
198.根据实施方案197所述的细胞，其中所述细胞是吞噬细胞。
199.根据实施方案197或198所述的细胞，其中所述细胞是干细胞衍生细胞、髓系细胞、巨噬细胞、树突细胞、淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、小胶质细胞或星形胶质细胞。
200.根据实施方案197-199中任一项所述的细胞，其中所述细胞是自体细胞。
201.根据实施方案197-199中任一项所述的细胞，其中所述细胞是同种异体细胞。
202.根据实施方案197-201中任一项所述的细胞，其中所述细胞是M1细胞。
203.根据实施方案197-201中任一项所述的细胞，其中所述细胞是M2细胞。
204.一种药物组合物，其包含(a)实施方案1-186中任一项所述的组合物、实施方案187-195中任一项所述的载体、实施方案196所述的多肽或实施方案197-203中任一项所述的细胞；和(b)药学上可接受的赋形剂。
205.根据实施方案204所述的药物组合物，进一步包含另外的治疗剂。
206.根据实施方案204或205所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂选自CD47激动剂、抑制Rac的试剂、抑制Cdc42的试剂、抑制GTP酶的试剂、促进F-肌动蛋白分解的试剂、促进PI3K募集到PFP的试剂、促进PI3K活性的试剂、促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的试剂、促进ARHGAP12活性的试剂、促进ARHGAP25活性的试剂、促进SH3BP1活性的试剂及其任意组合。
207.根据实施方案204-206中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包含无血清培养基、脂质或纳米颗粒。
208.一种治疗有此需要的受试者的疾病的方法，包括向所述受试者施用实施方案204-207中任一项所述的药物组合物。
209.根据实施方案208所述的方法，其中所述疾病是癌症。
210.根据实施方案209所述的方法，其中所述癌症是实体癌。
211.根据实施方案210所述的方法，其中所述实体癌选自卵巢癌，合适的癌症包括卵巢癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌。
212.根据实施方案209所述的方法，其中所述癌症是液体癌。
213.根据实施方案212所述的方法，其中所述液体癌是白血病或淋巴瘤。
214.根据实施方案212所述的方法，其中所述液体癌是T细胞淋巴瘤。
215.根据实施方案208所述的方法，其中所述疾病是T细胞恶性肿瘤。
216.根据实施方案208-215中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用另外的治疗剂。
217.根据实施方案216所述的方法，其中所述另外的治疗剂选自CD47激动剂、抑制Rac的试剂、抑制Cdc42的试剂、抑制GTP酶的试剂、促进F-肌动蛋白分解的试剂、促进PI3K募集到PFP的试剂、促进PI3K活性的试剂、促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的试剂、促进ARHGAP12活性的试剂、促进ARHGAP25活性的试剂、促进SH3BP1活性的试剂及其任意组合。
218.根据实施方案208-217中任一项所述的方法，其中施用包括输注或注射。
219.根据实施方案208-218中任一项所述的方法，其中施用包括直接对所述实体癌施用。
220.根据实施方案208-219中任一项所述的方法，其中施用包括基于环状RNA、mRNA、病毒、颗粒、脂质体或外来体的递送程序。
221.根据实施方案208-220中任一项所述的方法，其中在所述受试者中引发CD4+T细胞反应或CD8+T细胞反应。
222.一种制备细胞的方法，所述方法包括使细胞与实施方案1-186中任一项所述的组合物、实施方案187-195中任一项所述的载体或实施方案196所述的多肽接触。
223.根据实施方案222所述的方法，其中接触包括转导。
224.根据实施方案223所述的方法，其中转导包括化学转染、电穿孔、核转染或病毒感染。
225.一种制备药物组合物的方法，包括使脂质与实施方案1-186中任一项所述的组合物或实施方案187-195中任一项所述的载体接触。
226.根据实施方案225所述的方法，其中接触包括形成脂质纳米颗粒。
227.一种制备药物组合物的方法，包括使抗体与实施方案1-186中任一项所述的组合物或实施方案187-195中任一项所述的载体接触。
228.根据实施方案225所述的方法，其中接触包括形成脂质纳米颗粒。
实施例
实施例1.新型嵌合受体融合蛋白(CFP)构建体的产生
在本节中，描述了用于识别用于生成新型CFP的有用的CFP ECD、TM、ICD和抗原结合结构域的示例性设计。简言之，针对增强的吞噬特性及其各自吞噬作用相关的胞内信号传导，筛选了大量潜在的候选蛋白质。然后将有用的结构域用于生成新型CFP。筛选可以分为两部分：A.PR结构域的筛选；B.胞外抗原结合结构域的筛选。
PR结构域的筛选：
筛选了5,800种质膜蛋白的吞噬潜力。J774巨噬细胞用5800种血浆蛋白的文库瞬时转染。建立了高通量多重测定(从6孔板测定建立到用机器人处理的384孔板测定)，以评估质膜的各种潜在功能。示例性测定包括但不限于，吞噬作用测定、细胞因子产生测定、炎性体激活测定和iNOS激活测定。在以下段落中描述了示例性的简化方法。还使用了每种方法的变体并且是技术人员理解的。测试的示例性胞内信号传导结构域包括但不限于，CD40-FcRγ；FcRγ-CD40；NLRP3；FcRγ-SH2-半胱天冬酶原；FcRγ-Myd88；FcRγ-IFN受体；FcR-TNFR1；FcRγ-TNFR2；FcR-AIM2；FcRγ-TRIFN；FcRγ-半胱天冬酶原；TRIFC；RIG1；MDA5；TBK；CD64；CD16A；CD89；FcRε；SIRPβ；(两个连续的胞内结构域用带连字符的术语表示，例如，FcRγ-Myd88是指包含FcRγ胞内信号传导结构域作为信号传导结构域1；和Myd88胞内信号传导结构域作为信号传导结构域2的胞内结构域)。筛选的胞外接头结构域包括但不限于CD64、CD16A、CD89、SIRPα、FcRε、CD8铰链。测试的跨膜结构域包括但不限于CD8、CD64、CD16A、CD89、FcRε、SIRPα、TNFR1和CD40。还筛选了MDA5结构域。
吞噬作用测定：
使用直径为1nm、5nm或10nm的抗原连接二氧化硅或聚苯乙烯珠来筛选巨噬细胞。惰性珠包被在支持的脂双层中，并且抗原被连接到脂双层上。制备J774巨噬细胞系，每个细胞系表达克隆的重组质膜蛋白。重组质膜蛋白还可表达荧光标签。细胞系在含有热灭活血清和抗生素(青霉素/链霉素)的完全RPMI培养基中维持和繁殖。在测定当天，将细胞以每孔1x10^6个细胞/ml的密度铺板在6孔板中或以相对比例铺板在12或24孔板中，并孵育2-6小时。然后将细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤一次，并将珠加入到血清耗尽或补体耗尽的营养培养基中。在加入珠后30分钟和2小时，通过光学显微镜观察细胞。可以使用标记的抗体进行免疫荧光反应，并且荧光共聚焦显微镜用于检测吞没时细胞蛋白的相互作用和共定位。置信水平由克鲁斯卡尔-沃利斯检验和邓恩的多重比较校正确定。
在一些实施例中，将载有染料的肿瘤细胞喂给巨噬细胞系并通过显微镜评估吞噬作用。
细胞因子产生：
如上培养巨噬细胞系。在一项测定中，将表达质膜蛋白的每个J774细胞系铺板在多孔板中，并用抗原连接的珠进行攻击，并通过在4小时和24小时收集上清液来测定细胞因子产生。通过ELISA从上清液中测定细胞因子。在另一部分中，在与珠孵育后4和24小时收集细胞，并进行流式细胞术检测细胞因子。在每种情况下，以多重格式测定多种细胞因子，细胞因子可以选自：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、TNF-α、GMCSF、CXCL1、CXCL3、CXCL9、CXCL-10、MIP1-α和MIP-2。使用巨噬细胞炎性细胞因子测定试剂盒(R&D Systems)。
炎症基因和细胞因子激活的胞内信号传导通路可以通过蛋白质印迹分析确定MAP激酶的磷酸化、JNK、Akt信号传导通路、包括STAT-1的磷酸化和激活的干扰素激活通路。
炎性体激活测定：
NLRP3炎性体的激活通过ELISA检测增加的IL-1产生和通过蛋白质印迹检测半胱天冬酶-1激活来测定，检测半胱天冬酶原的切割以产生更短的半胱天冬酶。在微孔板多重设置中，半胱天冬酶-Glo(Promega Corporation)用于更快地读出半胱天冬酶1激活。
iNOS激活测定：
使用荧光测定NOS活性测定试剂盒(AbCAM)，通过iNOS激活和NO产生来测量氧化爆发电位的激活。
癌细胞杀伤测定：
Raji B细胞用作癌抗原呈递细胞。Raji细胞与癌细胞的全细胞粗提取物一起孵育，并与J774巨噬细胞系共同孵育。巨噬细胞在感染1小时后可以破坏细胞，这可以通过显微镜检测或通过细胞死亡测定进行检测。
高亲和力抗原结合结构域的筛选：
癌症配体接受抗体轻链和重链可变结构域的筛选，以生成CFP的胞外结合结构域。筛选人全长抗体或scFv文库。潜在的配体也用于免疫美洲驼，以在美洲驼中开发新的免疫球蛋白结合结构域，并制备单域抗体。
然后将从筛选中鉴定的特定有用的结构域逆转录，并将其克隆到慢病毒表达载体中以生成CFP构建体。可以使用来自筛选产生的高度吞噬细胞受体的胞外、TM和胞质区的一个或多个结构域产生编码CFP的重组核酸。简言之，鉴定显示促炎细胞因子产生和炎性体激活的高激活剂的质膜受体。进行生物信息学研究以鉴定功能结构域，包括胞外激活结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，例如特定激酶激活位点、SH2募集位点。然后将这些筛选的功能结构域克隆到模块化结构中以生成新型CFP。这些是候选CFP，并且在体外和/或体内测试这些嵌合构建体中的每一个的吞噬增强、细胞因子和趋化因子的产生和/或肿瘤细胞杀伤。使用基于微粒的吞噬作用测定来检查吞噬作用的变化。简言之，链霉亲和素偶联的荧光聚苯乙烯微粒(直径6μm)与生物素化重组表达和纯化的癌症配体缀合。表达新型CFP的髓系细胞与配体包被的微粒一起孵育1-4小时，并使用流式细胞术分析和量化吞噬的量。然后制备设计者CFP的质粒或慢病毒结构，并在巨噬细胞中测试癌细胞裂解。
以下部分描述了包含CFP的示例性功能结构域。
实施例2.具有清道夫受体ECD、TM和ICD的重组CFP(SR-CAR)的生成
为本申请目的而设计的CFP是模块化的，具有主要由scFv或Fab区或VHH结构域组成的胞外靶标结合结构域，其可结合靶标，例如CD5、短铰链、跨膜结构域和包含一个或两个或更多个信号传导结构域的胞内结构域(图2A-2C)。另外，胞外结构域可以设计为结合单个或多个靶标(图3)。吞噬清道夫受体的示例性设计示于图4A和4B中。编码CFP的重组核酸构建如下：将编码重组蛋白的膜定位信号的信号肽序列置于胞外抗原结合结构域的编码序列的上游。然后合成编码胞外抗原结合scFv结构域的核酸序列并克隆到表达载体中，位于信号肽序列的下游。CFP由编码胞外结构域的序列组成，选择的清道夫受体的TM结构域和胞内结构域连接在scFv的3'端，并且优选地在scFv的3'端和清道夫受体ECD的5'端之间具有接头肽序列。示例性接头肽是GGGS，并且任选地，接头是具有四聚体的两个或多个重复的序列。一旦表达，清道夫受体TM结构域就被掺入到细胞膜中。
制备SR-CAR的慢病毒构建体并纯化用于转导研究。
实施例3.重组CFG(SR-CAR)的表达及功能分析
为了测试CFP的功能，使用脂质体转染用pCMV-SRCAR转导人巨噬细胞。平行地，对照细胞用空载体转染。在细胞稳定48小时后，对细胞进行吞噬作用测定。图4C显示了体外吞噬作用测定中的预期结果。用对照空载体或SR-CAR转导的人原代巨噬细胞与载有染料的肿瘤细胞共培养，并使用流式细胞术量化吞噬作用。与对照细胞相比，带有SR CAR质粒的细胞显示出增加的吞噬作用。
图4D显示了体外细胞裂解测定中的预期结果。用对照载体或SR-CAR转导的人原代巨噬细胞与以不同E:T比表达荧光素酶的肿瘤细胞共培养，并使用荧光素酶测定法量化特异性裂解。
图4E显示了小鼠异种移植模型中的预期结果。在第0天，使NSG小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤细胞。小鼠或者未经治疗，或者注射用SR-CAR转导的人原代巨噬细胞，并生成存活曲线。
实施例4.具有第二胞内结构域-炎症反应结构域的重组CFP蛋白(IR-CAR)的生成
该实施例显示了具有胞外scFv结构域、具有铰链的接头、CD8跨膜结构域、胞内吞噬细胞受体结构域和另外来自促炎蛋白的另一个胞内炎症反应(IR)结构域的示例性PFP设计(图5A-5B)。编码PFP的重组核酸构建如下：将编码重组蛋白的膜定位信号的信号肽序列置于胞外抗原结合结构域的编码序列的上游。然后合成编码胞外抗原结合scFv结构域的核酸序列并克隆到表达载体中，位于信号肽序列的下游。PR亚基由编码CD8受体的胞外和跨膜结构域的序列组成。scFv和CD8区域通过铰链连接，铰链由靠近胞外结构域的CD8区域贡献。CD8 TM编码区的3'端连接到选择的吞噬细胞受体的胞内结构域。在胞内吞噬结构域的编码序列的3'端，连接促炎胞内反应结构域的5'端。
为了测试，将重组构建体插入慢病毒表达载体中，并纯化以用于细胞表达。)
实施例5.重组CFP(IR-CAR的表达及功能分析
用对照空载体或CFP(M1-CAR)转导的人原代髓系细胞与靶肿瘤细胞共培养。图5C显示了载有染料的靶肿瘤细胞的相对吞噬作用的预期结果。图5D显示了当M1-CAR髓系细胞与靶肿瘤细胞共培养时细胞因子的表达的预期结果。使用ELISA的细胞因子分析显示，与载体对照相比，促炎细胞因子和趋化因子的分泌增加。图5E显示了表面抗原(MHCII、CD80、CD86)流式细胞术的预期结果，显示与载体对照相比M1状态标志物表达的增加，并且类似地，iNOS表达(胞内)上调。图5F和5G表示预期结果。
实施例6.具有整合素激活结构域(整合素-CAR)的重组CFP的生成
该实施例显示了具有胞外scFv结构域、跨膜结构域和胞内吞噬结构域以及另外的胞内整合素激活结构域的示例性设计(图6A、6B)。编码PFP的重组核酸构建如下：将编码重组蛋白的膜定位信号的信号肽序列置于胞外抗原结合结构域的编码序列的上游。然后合成编码胞外抗原结合scFv结构域的核酸序列并克隆到表达载体中，位于信号肽序列的下游。PSR亚基由编码CD8受体的胞外和跨膜结构域的序列组成。scFv和CD8区域通过铰链连接，铰链由靠近胞外结构域的CD8区域贡献。CD8 TM编码区的3'端连接到选择的吞噬细胞受体的吞噬结构域。在胞内吞噬结构域的编码序列的3'端，连接P-选择素胞内整合素激活结构域的5'端。重组核酸的基本设计示于图5A中。示例性受体的结构布局的示意图示于图5B中。图5B显示了整合素激活的图形表示，其中整合素是内源性的，并且在激活时形成簇。当在巨噬细胞中表达时，scFv与肿瘤特异性抗原的结合导致吞噬信号传导的激活以及整合素的激活。这导致更强的吞噬作用以及改善的巨噬细胞运输。
将构建体插入慢病毒载体并纯化以进行功能研究。
实施例7.重组整合素-CAR的表达和功能分析。
用对照空载体或整合素-CAR转导的人原代巨噬细胞与靶肿瘤细胞共培养。图5C显示了与对照巨噬细胞相比，整合素-CAR转导的巨噬细胞的吞噬作用增加的预期结果。图5D显示了表达整合素-CAR的细胞增加的肿瘤细胞裂解的预期结果。图5E显示了与对照巨噬细胞相比，整合素-CAR转导的巨噬细胞迁移和肿瘤浸润增加的预期结果。图5F显示了在用整合素-CAR转导的巨噬细胞治疗后或无治疗对照的肿瘤的小鼠异种移植模型中的预期存活曲线。
实施例8.具有SREC-1交叉呈递结构域的重组CFP的生成
在该实施例中，表达CFP的载体的示例性设计具有胞外scFv结构域、跨膜结构域和胞内吞噬结构域，以及另外的信号传导结构域。图6A提供了涉及SREC和抗原交叉呈递的胞内信号传导通路的示意图。编码CFP的重组核酸构建如下：将编码重组蛋白的膜定位信号的信号肽序列置于胞外抗原结合结构域的编码序列的上游。然后合成编码胞外抗原结合scFv结构域的核酸序列并克隆到表达载体中，位于信号肽序列的下游。PR亚基由编码吞噬细胞受体的胞外和跨膜结构域的序列组成。TM编码区的3'端连接到吞噬细胞受体的吞噬结构域。在胞内吞噬结构域的编码序列的3'端，连接交叉呈递的胞内信号传导结构域的5'端。示例性受体的结构布局的示意图示于图6B中。图6C-6F示出了如前所述的预期功能特性。
实施例9.从受试者制备髓系和巨噬细胞的制造方案
从PBMC中分离髓系/巨噬细胞：
使用Histopaque 1077(Sigma)通过密度离心将外周血单核细胞与正常供体血沉棕黄层分离。洗涤后，使用CliniMACS GMP级CD14微珠和LS分离磁柱(Miltenyi Biotec)从单核细胞级分中分离CD14+单核细胞。简言之，将细胞重悬至适当浓度的PEA缓冲液(磷酸盐缓冲盐水[PBS]加2.5mmol/L的乙二胺四乙酸[EDTA]和人血清白蛋白[0.5％终体积的Alburex 20％，Octopharma])，按照制造商的说明与CliniMACS CD14珠一起孵育，然后洗涤并通过磁化的LS柱。洗涤后，纯化的单核细胞从消磁柱上洗脱，洗涤并重悬于相关培养基中进行培养。从白细胞单采术分离CD14+细胞：PBMC通过白细胞单采术从给予知情同意参与研究的肝硬化捐献者处收集。使用Optia单采系统通过无菌收集进行单核细胞(MNC)外周血的白细胞单采术。使用MNC的标准采集程序，处理2.5血容量。使用符合GMP的功能封闭系统(CliniMACS Prodigy系统，Miltenyi Biotec)进行CD14细胞的分离。简言之，对白细胞单采产品取样进行细胞计数，并取出等分试样用于预分离流式细胞术。确定单核细胞(CD14+)的百分比和绝对细胞数，如果需要，调整体积以满足要求的选择标准(≤20x109总白细胞；<400x106白细胞/mL；≤3.5x109CD14细胞，体积50–300mL)。使用CliniMACS Prodigy与CliniMACS CD14微珠(医疗器械III类)、TS510管组和LP-14程序进行CD14细胞分离和分隔。在该过程结束时，选择的CD14+阳性单核细胞在PBS/EDTA缓冲液(CliniMACS缓冲液，Miltenyi)中洗涤，该缓冲液含有医药级0.5％人白蛋白(Alburex)，然后重悬在TexMACS(或比较仪)培养基中进行培养。
细胞计数和纯度：
使用Sysmex XP-300自动分析仪(Sysmex)对总MNC和分离的单核细胞级分进行细胞计数。通过流式细胞术用TruCount管(Becton Dickinson)进行巨噬细胞数量的评估，以确定绝对细胞数量，因为Sysmex始终低估单核细胞的数量。使用流式细胞术(FACSCantoII,BD Biosciences)和一组针对人类白细胞的抗体(CD45-VioBlue、CD15-FITC、CD14-PE、CD16-APC)评估分离的纯度，并通过确定嗜中性粒细胞污染(CD45int、CD15pos)的量来评估产品质量。细胞培养——含健康供体样本的培养物的发育
研究了巨噬细胞分化的最佳培养基，并测试了用于细胞产品的三种候选。此外，还检查了单核细胞冷冻保存对获得用于治疗用途的髓系细胞和巨噬细胞的影响。进行功能测定以量化髓系细胞和巨噬细胞的吞噬能力及其进一步极化的能力，以及如本公开其他地方所述的吞噬潜力。
使用受试者样品的全面工艺验证
将从Prodigy分离的白细胞单采术中培养的单核细胞在含有GMP级TexMACS(Miltenyi)和100ng/mL的M-CSF的培养袋(MACS GMP分化袋，Miltenyi)中以2x106个单核细胞/cm2/mL培养。用100ng/mL符合GMP的重组人M-CSF(R&D Systems)培养单核细胞。细胞在37℃、5％CO2的潮湿环境中培养7天。在培养期间(第2天和第4天)进行两次50％体积的培养基补充，去除50％的培养基，然后供给补充有200ng/mL的M-CSF的新鲜培养基(以恢复100ng/mL的最终浓度)。
细胞收获：
对于正常供体来源的巨噬细胞，在第7天使用细胞解离缓冲液(Gibco,ThermoFisher)和pastette从孔中取出细胞。将细胞重悬在PEA缓冲液中并计数，然后每次测试将约1x106个细胞染色用于流式细胞术。在第7天，使用含有医药级0.5％人血清白蛋白(HAS；Alburex)的PBS/EDTA缓冲液(CliniMACS缓冲液，Miltenyi)从培养袋中取出白细胞单采术来源的巨噬细胞。收获的细胞重悬在由两种许可产品组成的赋形剂中：用于输注的0.9％盐水(Baxter)和0.5％人白蛋白(Alburex)。
流式细胞术表征：
使用FACSCanto II(BD Biosciences)或MACSQuant 10(Miltenyi)流式细胞仪分析单核细胞和巨噬细胞表面标志物表达。每个样本采集约20,000个事件。在新鲜分离的和第7天成熟的细胞中，白细胞标志物的细胞表面表达通过将细胞与特定抗体(最终稀释1:100)一起孵育来进行。将细胞与FcR阻滞剂(Miltenyi)孵育5分钟，然后在4℃下与抗体混合物孵育20分钟。在PEA中洗涤细胞，并以1:100添加死细胞排斥染料DRAQ7(BioLegend)。针对如下一系列表面标志物将细胞染色：CD45-VioBlue、CD14-PE或CD14-PerCP-Vio700、CD163-FITC、CD169-PE和CD16-APC(全部Miltenyi)、CCR2-BV421、CD206-FITC、CXCR4-PE和CD115-APC(全部BioLegend)以及25F9-APC和CD115-APC(eBioscience)。使用前向和侧向散射以及DRAQ7死细胞鉴别器(BioLegend)对单核细胞和巨噬细胞进行门控以排除碎片、双联体和死细胞，并使用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。根据最初的详细表型，开发小组作为释放标准(CD45-VB/CD206-FITC/CD14-PE/25F9 APC/DRAQ7)，其限定了从单核细胞发育为功能性巨噬细胞。对于25F9和CD206两者，巨噬细胞确定为其平均荧光强度(MFI)比第0天的单核细胞的水平高五倍。开发第二小组，其评估其他标志物作为扩展小组的一部分，由CCR2-BV421/CD163-FITC/CD169-PE/CD14-PerCP-Vio700/CD16-AP C/DRAQ7)组成，但不用作细胞产品的释放标准的一部分。
使用pHRodo珠测试来自血沉棕黄层CD14细胞的单核细胞和巨噬细胞的吞噬摄取，pHRodo珠只有在进入酸性内体时才发荧光。简言之，将单核细胞或巨噬细胞与1-2uL的pHRodo大肠杆菌(Escherichia coli)生物颗粒(LifeTechnologies,Thermo Fisher)一起培养1小时，然后取出培养基并洗涤细胞以去除未吞噬的颗粒。使用EVOS显微镜(ThermoFisher)评估吞噬作用，使用ImageJ软件(NIH免费软件)捕获图像并量化珠的细胞摄取。通过用IFNγ(50ng/mL)或IL-4(20ng/mL)处理第7天巨噬细胞48小时以诱导极化为M1或M2表型(或分别M[IFNγ]与M[IL-4])，检查向确定的分化巨噬细胞极化的能力。48小时后，通过EVOS明视野显微镜观察细胞，然后像以前一样收获和显型。对巨噬细胞产生后和响应炎症刺激的细胞因子和生长因子分泌特征进行进一步分析。巨噬细胞像以前一样由健康供体的血沉棕黄层产生，未经处理或用TNFα(50ng/mL,Peprotech)和聚肌苷酸：聚胞苷酸(poly I:C，一种结合TLR3的病毒同源物，1g/mL，Sigma)刺激以模拟发炎肝脏中存在的条件，或脂多糖(LPS,100ng/mL,Sigma)加IFNγ(50IU/mL,Peprotech)以产生最大的巨噬细胞激活。将第7天的巨噬细胞孵育过夜，收集上清液并离心以去除碎片，然后储存在-80℃下直至测试。使用在Magpix多重酶联免疫测定读板器(BioRad)上运行的27重人细胞因子试剂盒和9重基质金属蛋白酶试剂盒进行分泌蛋白质组分析。
产品稳定性：
在工艺开发过程中测试各种赋形剂，包括PBS/EDTA缓冲液；含0.5％HAS(Alburex)的PBS/EDTA缓冲液、单独的0.9％盐水或含0.5％HAS的盐水。发现含有0.5％HAS赋形剂的0.9％盐水(Baxter)保持最佳细胞活力和表型(数据未示出)。在三个过程优化运行中研究来自肝硬化供体的巨噬细胞在收获后的稳定性，并在过程验证运行中评估更有限的时间点范围(n＝3)。收获并重悬在赋形剂(用于输注的0.9％盐水，0.5％人血清白蛋白)中后，将袋子储存在环境温度(21–22℃)下，并在收获后0、2、4、6、8、12、24、30和48小时采集样本。对每个样本运行释放标准抗体组，从25F9和CD206的几何MFI测量存活率和从第0天开始的平均倍数变化。
统计分析：
结果表示为平均值±SD。在可能的情况下，使用GraphPad Prism 6使用未配对的双尾t检验评估差异的统计显著性。当P值<0.05时，结果被认为具有统计学意义。
实施例10.CD5-FcR-PI3K CFP构建体
在该实施例中，使用已知的分子生物学技术构建CD5靶向的CFP。CFP具有胞外结构域，该胞外结构域包含融合到scFv的信号肽，该scFv包含连接到轻链可变结构域的重链可变结构域，该轻链可变结构域与靶细胞上的CD5结合，通过短接头附接到CD8α链铰链和CD8α链TM结构域。TM结构域在胞质末端与FcRγ胞质部分和PI3K募集结构域融合。该构建体在具有荧光标志物和药物(氨苄青霉素)抗性的载体中制备，并通过转染细菌宿主扩增。序列提供如下：
CD5-FcR-PI3K
MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKSGGGGSGALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQGSGSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENM(SEQ ID NO:14)。
使用合适的引物通过纯化的质粒的体外逆转录产生mRNA。将纯化的mRNA转导到细胞系中进行表达分析。
实施例11.HER2-FcR-PI3K CFP构建体
在该实施例中，使用已知的分子生物学技术构建HER2靶向的CFP。CFP具有胞外结构域，该胞外结构域包含融合到scFv的信号肽，该scFv包含连接到轻链可变结构域的重链可变结构域，该轻链可变结构域与靶细胞上的HER2结合，通过短接头附接到CD8α链铰链和CD8α链TM结构域。TM结构域在胞质末端与FcRγ胞质部分和上述实施例中的PI3K募集结构域融合。序列提供如下：
HER2-FcR-PI3K
MWLQSLLLLGTVACSISDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDVWGQGTLVTVSSSGGGGSGALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQGSGSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENM(SEQ ID NO:15)。
实施例12.CD5-FcR-CD40 CFP构建体
在该实施例中，使用具有包含CD40序列的胞内结构域的已知分子生物学技术构建CD5靶向的CFP。CFP具有胞外结构域，该胞外结构域包含融合到scFv的信号肽，该scFv包含连接到轻链可变结构域的重链可变结构域，该轻链可变结构域与靶细胞上的CD5结合，通过短接头附接到CD8α链铰链和CD8α链TM结构域。TM结构域在胞质末端与FcRγ胞质部分融合，然后与CD40胞质部分融合。序列提供如下：
CD5-FcR-CD40
MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKSGGGGSGALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ(SEQ ID NO:16)。
实施例13.抗CD5和抗HER2 CFP的表达
在该实施例中，来自单核细胞系THP-1的细胞用单独的抗CD5CFP(CD5 CAR)构建体进行电穿孔，其中所述构建体没有胞内结构域(无ICD)；或具有CD40信号传导结构域或FcR信号传导结构域的胞内结构域(ICD)；或具有PI3激酶(PI3K)募集信号传导结构域；或具有来自FcRγ胞内结构域的第一CD40信号传导结构域和第二信号传导结构域，反之亦然；具有第一FcRγ信号传导结构域和第二PI3K募集信号传导结构域或反之亦然，并且CAR构建体的表达通过如图8中所示的流式细胞术测定。在每种情况下，均观察到大于95％的细胞的强烈表达。图9显示了这些构建体中的一些在原代人髓系细胞中的表达。表6描述了图中构建体的结构域。
表6-CD5-CFP构建体和HER2 CFP构建体
Figure BDA0003447683340001891
Figure BDA0003447683340001901
Figure BDA0003447683340001911
实施例14.吞噬作用和激活测定
为了对表达THP-1巨噬细胞的各种抗CD5 CFP进行功能分析，给细胞喂食6μm的FITC标记的CD5抗原包被的珠(图10A)并通过流式细胞术定量每个细胞的FITC珠的吞噬吞没(图10B)。对照珠为BSA包被的。实验性CD5包被的珠很容易被THP-1细胞吞没(图10C)。每个构建体都显示出高水平的靶标特异性吞噬作用，并且与BSA包被的珠的吸收相比，CD5包被的珠吸收率至少高10倍。图10D显示了在对照BSA包被的珠或实验性CD5包被的珠的存在下表达抗CD5 CFP的细胞的细胞因子分析。与模拟电穿孔相比，在表达抗CD5CFP的细胞中观察到更高的细胞因子反应，尽管在没有任何进一步刺激的情况下细胞因子的诱导并不是非常高。表达抗CD5 CFP的细胞表现出CD16和MHC I类分子的低表达，CD16和MHC I类分子是非经典单核细胞的标志(图10E)。然而，在激活刺激的存在下，如图10F-10H所示，在细胞因子的诱导下，表达抗CD5 CFP的细胞显示出高度激活。
THP-1细胞用编码CD5-CD8h-CD8tm-FcR-PI3K的CFP构建体电穿孔，并用胞内FarRed染料标记。这些细胞与用CFSE预标记的H9 T细胞癌细胞以1:3的髓系细胞：肿瘤细胞比例孵育。4小时后，通过流式细胞术测量吞噬作用(图11A)。癌细胞很容易被表达抗CD5CFP的细胞吞噬(图11B、图11C)。
如上所述测定用抗CD5-CAR构建体电穿孔的原代单核细胞的珠吞没、靶标特异性和细胞因子。使用pHRodo标记的靶细胞，与模拟电穿孔细胞相比，在表达任何CD5-结合剂构建体的任何单核细胞的情况下，注意到(图12A)增加的吞噬吞没(图12B和12C)。在另一个实验中，用抗CD5-CAR构建体(CD5-CD8h-CD8tm-FcR-PI3K)电穿孔原代单核细胞，并测定吞噬作用和细胞因子释放。结果示于图12D中。
两种THP-1细胞原代单核细胞都对体外CCL2施用高度敏感，并表现出增加的趋化性(分别为图13和图14)
实施例15.表达抗CD5嵌合抗原受体的单核细胞对CD5 T淋巴瘤模型的体内功效
在该实施例中，在小鼠H9 T细胞淋巴瘤模型中检查表达根据前面部分中描述的方法产生的抗CD5嵌合抗原受体的髓系细胞在减少肿瘤方面的功效。CD5在T细胞淋巴瘤表面上表达。表达抗CD5嵌合抗原受体的单核细胞能够结合表达CD5的细胞。然而，本文测试了这些抗CD5-CAR单核细胞是否能够克服TME并发挥任何抗肿瘤潜力。建立T细胞淋巴瘤肿瘤模型，其中将CD5阳性H9细胞皮下注射到NSG-SGM3小鼠体内。NSG-SGM3小鼠(JacksonLaboratory,USA)是表达人IL3、GM-CSF和SCF的三重转基因NSG-SGM3(NSGS)小鼠，并将高度免疫缺陷的NOD SCIDγ(NSG)小鼠的特征与支持髓系和调节性T细胞群的稳定植入的细胞因子结合。H9-mCherry-萤光素酶细胞系较早地衍生如下：H9细胞系衍生自Hut78 Sezary综合征T细胞系；mCherry-萤火虫荧光素酶融合蛋白通过用pGLCherry荧光素酶转染Hut78稳定表达，并选择进行稳定整合。mCherry阳性细胞通过FACS分选进一步富集，目前细胞系超过80％的mCherry阳性。
肿瘤细胞的制备和施用：
H9-mCherry-Luc细胞在含有10％FBS的RPMI1640中培养。在肿瘤细胞注射当天，将细胞以1000xg离心3分钟，去除上清液，并将细胞重悬在1:1稀释的基质胶中。每只小鼠皮下注射1x106个肿瘤细胞。
如上所述制备表达CD5-CAR的髓系细胞(CD-CAR单核细胞)。2亿个细胞被电穿孔；电穿孔(EP)后培养单核细胞1小时并冷冻保存。解冻后分析表明巨大的存活率(>95％)。注射CD5 CAR单核细胞的那天是植入肿瘤后的11天。在用测试制品治疗的当天，根据肿瘤体积将动物随机分为三组(表7)。
表7-小鼠给药方案
Figure BDA0003447683340001931
将CD5-CAR单核细胞冷冻保存在CryoStor CS10(每瓶1ml，25M细胞)中。细胞在37℃水浴中快速解冻，无需进一步处理直接注射到动物体内。在注射CD5 CAR单核细胞之前，用70％异丙醇或乙醇溶液擦拭要注射的区域。CD5 CAR单核细胞静脉内施用。CD5-CAR单核细胞过继转移的那天被认为是研究的第0天。其余的注射根据表8进行。测试方案在图15A中以图形方式描述。
表8-小鼠中CD5-CAR细胞的注射时间表
Figure BDA0003447683340001941
肿瘤测量和体重：
每天观察动物的临床症状。使用IVIS(Perkin Elmer,Boston,MA)通过成像确定肿瘤体积。以一定剂量或150mg/kg(200μl)给小鼠IP注射荧光素(Biovision，目录号#7903)，10分钟后使用IVIS成像。记录辐射值(光子/秒/平方厘米)。对所有动物进行IVIS成像和体重测量，直至死亡或安乐死。在注射第一剂后第20天去除肿瘤并称重。
在解冻后24、48和72小时进行SOP培养和CD14+单核细胞的电穿孔和粘合物检测后，CD5-CAR单核细胞用Alexa488缀合的人CD5蛋白染色。用HER2-CAR构建体电穿孔的单核细胞用作阴性对照以确定门的位置。发现转染效率在24小时时为74％(图15B)。这表明电穿孔可以有力地将mRNA转染到CD14+CD16-单核细胞中；CAR构建体的表达是短暂的，寿命为3-4天，这可能是由于mRNA和受体蛋白的快速周转所致。
与未治疗的动物相比，每3-4天接受6剂量的1.4x106的CD5-CAR细胞的动物中，通过相对发光信号测量的肿瘤生长显著更慢(图15C和图15D)。仅接受一剂1x106的CD5-CAR细胞的动物没有表现出这种肿瘤停滞效应(图15C和图15D)。在6个剂量组中，一只动物在第13天和第16天之间死亡。在第20天，几只小鼠具有可以清晰地触及的非常大的肿瘤。在第20天处死所有动物并通过解剖去除它们的肿瘤。然后在秤上称重肿瘤，并以棱柱体绘制数据。
在另一项研究中，NSG-SGM3小鼠接受了不同的给药方案，如图16A所示。在该方案中，小鼠在第11、12、13和14天接受4次输注，每天一次。CD5-CAR表达在电穿孔后得到验证，并且发现大于95％(图16B)。在该测定中，记录了肿瘤生长在统计学上的显著降低，如图16C和16D所示。
从本节举例说明的研究中，很明显，靶向CD5+H9的CD5-CAR单核细胞的多次输注可导致肿瘤生长延迟。更高的剂量可能会引起更强的抗肿瘤反应。NSG-SGM3小鼠没有功能性T细胞、B细胞和NK细胞。因此，该模型旨在检查C5-CAR单核细胞的内在抗肿瘤活性，其包括吞噬作用和细胞毒性剂如TNFα和NO/ROS的分泌。在免疫完全模型中，可以预期更高的抗肿瘤活性，其中表达CAR的单核细胞可以交叉呈递抗原以激活T细胞并分泌炎性细胞因子以促进淋巴细胞浸润。
实施例16.CD5-FcR-MDA5 CFP构建体
在该实施例中，使用已知的分子生物学技术构建了CD5靶向的CFP，具有包含MDA-5胞内结构域序列(如SEQ ID NO:23中的串联CARD ICD序列)的两个半胱天冬酶激活(CARD)结构域的胞内结构域。如图17A图形表示的，CFP具有胞外结构域，该胞外结构域包含融合到scFv的信号肽，该scFv包含连接到轻链可变结构域的重链可变结构域，该轻链可变结构域与靶细胞上的CD5结合，通过短接头附接到CD8α链铰链和CD8α链TM结构域。TM结构域在胞质末端与FcRγ胞质部分融合，然后与MDA5胞质部分融合(SEQ ID NO:23)。
MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKSGGGGSGALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQGSGSMSNGYSTDENFRYLISCFRARVKMYIQVEPVLDYLTFLPAEVKEQIQRTVATSGNMQAVELLLSTLEKGVWHLGWTREFVEALRRTGSPLAARYMNPELTDLPSPSFENAHDEYLQLLNLLQPTLVDKLLVRDVLDKCMEEELLTIEDRNRIAAAENNGNESGVRELLKRIVQKENWFSAFLNVLRQTGNNELVQELTGSDCSESNAEIEN(SEQ ID NO:24)。
使用体外转录的mRNA制备mRNA多核苷酸，其具有包括编码SEQ ID NO:24的序列的序列，并且用mRNA转录原代巨噬细胞。注意到CD5-FcR-MDA5嵌合抗原受体在原代髓系细胞中的成功表达，如图17B所示。如图17C所示，与未转染的细胞相比，表达CD5-FcR-MDA5的单核细胞显示出更高水平的IL1β、IL6、IFNγ和TNFα分泌以及趋化因子CCL5分泌，通过ELISA测定法测量的。
实施例17.CD5-FcR-TNFR1或TNFR2 CFP构建体
在该实施例中，使用具有TNFR1或TNFR2胞内结构域的已知分子生物学技术构建CD5靶向的CFP。如图18A图形表示的，CFP具有胞外结构域，该胞外结构域包含融合到scFv的信号肽，该scFv包含连接到轻链可变结构域的重链可变结构域，该轻链可变结构域与靶细胞上的CD5结合，通过短接头附接到CD8α链铰链和CD8α链TM结构域。TM结构域在胞质末端与FcRγ胞质部分融合，然后与胞内信号传导结构域(ICD)序列TNFR1(SEQ ID NO:21)或TNFR2的ICD(SEQ ID NO:22)融合。具有TNFR1胞内信号传导结构域的CFP的全长序列描述如下：
MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKSGGGGSGALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQGSGSQRWKSKLYSIVCGKSTPEKEGELEGTTTKPLAPNPSFSPTPGFTPTLGFSPVPSSTFTSSSTYTPGDCPNFAAPRREVAPPYQGADPILATALASDPIPNPLQKWEDSAHKPQSLDTDDPATLYAVVENVPPLRWKEFVRRLGLSDHEIDRLELQNGRCLREAQYSMLATWRRRTPRREATLELLGRVLRDMDLLGCLEDIEEALCGPAALPPAPSLLR(SEQ ID NO:25)。
具有TNFR2胞内信号传导结构域的CFP的全长序列描述如下：
MWLQSLLLLGTVACSISEIQLVQSGGGLVKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTHTGEPTYADSFKGRFTFSLDDSKNTAYLQINSLRAEDTAVYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRANRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKSGGGGSGALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHEKPPQGSGSPLCLQREAKVPHLPADKARGTQGPEQQHLLITAPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGVEASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDTDSSPSESPKDEQVPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS(SEQ ID NO:26)。
在转染的原代巨噬细胞中测试了编码具有TNFα受体1或2胞内结构域的CFP的体外转录的mRNA的表达。结果示于图18B中。如图18C和18D所示，具有TNFR1胞内信号传导结构域的CFP的表达显示增加的细胞因子分泌水平。相反，具有TNFR2胞内信号传导结构域的CFP显示出与未转染的对照细胞相当的细胞因子水平(图18C、18D)。不希望受理论束缚，TNFR2(p75)在免疫应答通路中发挥致耐受性和免疫抑制作用，并且主要由调节细胞例如某些DC亚型和天然Treg表达。因此，此处显示的结果清楚地表明，在CFP构建中使用的单个胞质结构域发挥着重要作用，其分别影响表达CFP的细胞的功能。在这些结果中还表明，TNFR2可用作表达CFP的细胞的促炎活性的功能测定中的阴性对照。
接下来，针对功能测定测试了几种CD5靶向的构建体。用编码相应CFP的多核苷酸构建体转染的原代单核细胞在M2条件(IL4、IL10、TGFβ)的存在下进行培养24小时，然后将这些细胞铺板在CD5包被或未包被(对照)板上并培养24小时。测量细胞分泌的趋化因子和细胞因子。图19A显示了示例性构建体的图形表示，该构建体可以结合CD5并具有不同的胞内结构域(ICD)，例如CD40 ICD、PI3K募集ICD、TNFR2 ICD。图19B显示了描述实验设计的图。当接受包含IL4、IL-10和/或TGFβ的培养基并受到CD5抗原包被板(或未包被的对照板)刺激时，单核细胞谱系细胞向M2表型的转化导致细胞因子和趋化因子分泌的增加，其然后通过ELISA测量。结果描绘在图19C、19D和19E中。与具有CD40 ICD的CFP或阴性对照CFP TNFR2-ICD表达细胞相比，表达具有PI3激酶(PI3K)募集信号传导结构域的CFP的细胞分泌高水平的趋化因子CCL3、CXCL12、CCL4、CCL5和KC(图19C)。表达具有PI3K募集结构域以及在某些情况下CD40信号传导结构域的CFP的细胞表现出细胞因子如TNF-α和IL8的高分泌。
实施例18.表达抗HER2嵌合抗原受体的单核细胞的功效
在该实施例中，分析具有本公开内容中描述的示例性设计的胞外HER2抗原结合结构域的嵌合融合蛋白(CAR)作为潜在抗癌剂的功能功效。第一代慢病毒载体用于产生用于转导髓样THP1细胞系的慢病毒。PMA处理的THP1细胞中的转导效率范围为67-90％(图20A)。表达HER2靶向构建体的THP1细胞用或不用PMA激活，与FarRed标记的SKOV3卵巢肿瘤细胞一起孵育过夜以分析吞噬作用。实验装置描绘在图20B的示意图中。显微成像和流式细胞术(图20C和图20D)用于确定吞噬作用。FarRed+FLAG+细胞被认为是吞噬事件。在该实验中，观察到FcRγ-PI3K表达构建体在未激活的THP-1细胞中比其他构建体具有增强的功效。在激活后，所有受体都与吞噬作用有关(图20D)。靶细胞死亡通过以下公式计算：[(单独的#SKOV3-带效应物的#SKOV3)/单独的#SKOV3]x100；且结果如图20E所示。
用编码FcRγ+PI3K胞内结构域的慢病毒HER2靶向的CFP构建体转导从健康供体分离的CD14+细胞，分析CSFE标记的SCOV3肿瘤细胞的吞噬作用和杀伤(图21A)。结果示于图21B和图21C中。Jurkat细胞用作靶细胞的对照，因为这些细胞不表达HER2。
为了测试这些表达HER2构建体的细胞是否能够在肿瘤环境中分化为M0、M1、M2表型，开发了具有MSTO细胞上清液的体外间皮瘤模型，如图22A中的示意图所概述。表达HER2靶向的嵌合抗原受体的CD14+细胞暴露于6种培养条件：M0(100ng/ml MCSF)；M1(5ng/mlLPS+100ng/ml IFNγ)；M2(100ng/ml MCSF+20ng/ml IL-10+20ng/ml TGFβ)；DC(100ng/mlGMCSF+20ng/ml IL-4)；肿瘤条件培养基(MSTO-条件RPMI+100ng/ml MCSF)；和对照。对于这些实验中的一部分，在嵌合HER2构建体的胞外区中，将编码FLAG肽的序列掺入scFv和跨膜结构域之间。收获细胞并测试细胞活力，发现大于80％。在24小时时通过流式细胞术检查细胞的表型。确定了在24、48和72小时时几种细胞标志物的表达。使用荧光标记的纯化HER2蛋白检测HER-2嵌合构建体的表达。在所有条件下，发现构建体被表达，尽管在M1条件下表达最低。所有其他条件都与高水平的嵌合受体表达相关。还观察到细胞差异表达HLA DP、DQ、DR(MHCII)和HLA ABC(MHC1)。CD14、CD11c、CD379、CD303、CD45、CX3CR1的表达在所有培养条件下都是一致的，而甘露糖受体(CD206)、MERTK和CCR2在M1条件下培养的那些细胞上下调，这与细胞的分化有关。综上所述，该数据表明表达HER2-CFP的细胞将在没有受体连接的情况下根据环境线索进行分化。
在该测定的另一个扩展中，在存在MSTO肿瘤细胞的不同培养条件下，表达HER2-CFP的细胞上的表面分子的表达。观察到在肿瘤细胞的存在下CCR2的下调，表明受体连接和细胞激活。HLA分子表达的维持可能表明抗原加工和呈递能力的维持。这些数据表明，无论极化如何，受体衔接都会触发与肿瘤破坏相关的激活和活性。
使用表达HER2的肿瘤的体内模型来研究表达HER2-CFP的细胞的肿瘤渗透和激活。实验设计的示意图如图22A所示。在单次输注已用胞质染料CSFE标记的CFP表达细胞后24小时测定HER2靶向的CFP表达细胞的迁移和渗透。取出肿瘤并进行组织学处理。如图22B所示，观察到表达HER2-CFP的髓系细胞迁移到肿瘤中并在肿瘤细胞周围积聚。在MSTO荷瘤NSG小鼠中施用CFSE标记的HER2靶向的CFP表达细胞后24小时，取出脾脏并进行组织学处理。如图22C所示，观察到表达HER2靶向的CFP的髓系细胞迁移到脾脏中。CFSE标记的HER2靶向CFP表达细胞在细胞输注后24小时从荷瘤小鼠的脾脏中分离出来，并通过流式细胞术检查。脾脏中的HER2靶向的CFP表达细胞维持HLA、CD14和CD303的表达。观察到CCR2表达降低，同时CD370(CLEC9A)增加，这可能表明这些细胞迁移到脾脏中并发展成为能够刺激T细胞反应的专职APC。观察到CD206(甘露糖)表达与CD45一样降低。甘露糖受体表达的减少可能与分化为M1表型有关。
在类似的体内肿瘤模型中，在三次输注HER2靶向的CFP表达细胞后分析肿瘤消退，如图23中的示意图所示。与对照处理的动物相比，表达抗HER2嵌合抗原受体的人原代单核细胞的三次输注与肿瘤进展的延迟有关(图24)。
实施例19.用于阻断抗吞噬信号和激活吞噬作用的材料和方法
达尔伯克改良伊格尔培养基、胰蛋白酶-EDTA、wortmanni(布拉德福试剂和溶葡萄球菌素)购自Sigma-Aldrich,Inc.(St.Louis,MO)。低血清Opti-MEM I培养基购自Gibco-BRL(Gaithersburg,MD)。SH-5获自Enzo Life Sciences(Plymouth,PA)，且OSU-03012(OSU)购自Cedarlane Labs(Burlington,NC)。FuGENE转染试剂和50倍不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物购自Roche Applied Science(Manheim,Germany)。细胞在24孔板中生长至60％至70％的细胞覆盖，并将培养基更换为DMEM 10％FCS。然后，为了获得类似的蛋白质表达，根据制造商的说明，在低血清Opti-MEM I培养基中，将5ng的pCMV5-Akt-CA或200ng的pCMV5-Akt-DN的1.2μl的FuGENE转染试剂(比例，4:1[FuGENE-质粒])添加到BEC。
实施例20.重组阴性SIRPα的表达和功能分析
图26A显示了显性阴性SIRPα受体(SIRPa_neg)的说明性示意图。该受体由SIRPα的ECD和TM结构域组成，没有任何胞内结构域。ECD：胞外结构域；TM：跨膜结构域。当在巨噬细胞中表达时，SIRPα_neg与CD47配体结合但不发出信号，因此它充当抑制CD47信号传导的显性阴性诱饵受体。
为了测试重组阴性SIRPα(SIRPα_neg)的功能，用表达SIRPα的重组阴性形式的慢病毒载体转导人原代巨噬细胞。平行地，对照细胞用空载体或表达GFP的相同载体转染。图26B显示了体外吞噬作用测定中的预期结果。用对照空载体或SIRPα_neg转导的人原代巨噬细胞与载有染料的肿瘤细胞共培养，并使用流式细胞术量化吞噬作用。与对照细胞相比，带有SIRPα_neg载体的细胞显示出增加的吞噬作用。
图26C显示了体外细胞裂解测定中的预期结果。用对照载体或SIRPα_neg载体转导的人原代巨噬细胞与以不同E:T比表达荧光素酶的肿瘤细胞共培养，并使用荧光素酶测定法量化特异性裂解。
图26D显示了小鼠异种移植模型中的预期结果。在第0天，将NSG小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤细胞。小鼠或者未经治疗，或者注射用SIRPα_neg转导的人原代巨噬细胞，并生成存活曲线。
实施例21.表达SIRPα-PI3K结合结构域构建体的重组嵌合蛋白的表达和功能分析
图27A显示了SIRPα-PI3K开关受体的说明性示意图。该受体由SIRPα的ECD和TM结构域组成，SIRPα在胞内末端与PI3K BD融合。ECD：胞外结构域；TM：跨膜结构域；PI3K BD：PI3K结合结构域。当在巨噬细胞中表达时，SIRPα-PI3K与CD47配体结合并激活PI3K介导的促吞噬作用、促存活信号传导。
为了测试，图27A的重组构建体被插入慢病毒表达载体，并纯化用于转染。
用SIRPα-PI3K转导的人原代巨噬细胞与靶肿瘤细胞共培养。在对照组中，用表达GFP的对照构建体转导人巨噬细胞。图27B显示了载有染料的靶肿瘤细胞的相对吞噬作用的预期结果，通过流式细胞术定量。与表达对照载体的细胞相比，表达SIRPα-PI3K的细胞表现出更强的吞噬作用。图27C显示了测量Akt激活水平的预期结果。表达SIRPα-PI3K的人原代巨噬细胞以及对照构建体(GFP)或SIRPα-PI3K并与肿瘤细胞共培养，并且PI3K激活下游的Akt磷酸化水平使用pAkt抗体通过蛋白质印迹确定并定量。图27D显示了体外细胞裂解测定中的预期结果。将表达SIRPα-PI3K的人原代巨噬细胞以及对照构建体(GFP)或SIRPα-PI3K以不同E:T比与表达荧光素酶的肿瘤细胞共培养，并使用荧光素酶测定法量化特异性裂解。图27E显示了小鼠异种移植模型中的预期结果。在第0天，将NSG小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤细胞。小鼠或者未经治疗，或者注射表达CAR-P SIRPα-PI3K的人原代巨噬细胞。
实施例22.表达SIRPα-M1的重组嵌合蛋白的设计和功能分析。
本实施例显示了构建体的示例性设计，该构建体具有SIRPα的胞外CD47结合结构域，并与激活促炎信号传导的胞内结构域(SIRPα-M1)融合。图28A显示了触发促炎症信号传导的SIRPα开关受体(SIRPα-M1)的说明性示意图。该受体由与任一以下基因的促炎结构域融合的SIRPα的ECD和TM结构域组成：TLR3、TLR4、TLR9、MYD88、TRIF、RIG-1、MDA5、CD40、IFN受体或具有此类促炎胞内信号传导结构域的其他基因。
将构建体插入慢病毒载体并纯化以进行功能研究。当在巨噬细胞中表达时，CD47SIRPα-M1的结合导致促炎信号的激活。这导致更强的吞噬作用、促炎细胞因子和表面受体的表达，以及抗原交叉呈递的增强。图28B和28C分别显示了当表达SIRPα-M1的巨噬细胞与靶肿瘤细胞共培养时细胞因子和表面抗原的诱导表达的预期结果。用对照空载体或SIRPα-M1转导的人原代巨噬细胞与肿瘤细胞共培养。使用ELISA的细胞因子分析显示，与载体对照相比，促炎细胞因子和趋化因子的分泌增加。流式细胞术显示与载体对照相比，M1状态标志物表达的增加。图28D和28E显示了体外细胞裂解测定和体内异种移植小鼠模型中的预期结果。在图28D中，将共表达CAR-P的人原代巨噬细胞以及SIRPα-M1以不同E:T比与表达荧光素酶的肿瘤细胞共培养，并使用荧光素酶测定法量化特异性裂解。在图28E中，在第0天向NSG小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤细胞。小鼠或者未经治疗，或者注射共表达CAR-P SIRPα-M1的人原代巨噬细胞。
实施例23.表达SIRPαβ-开关受体的重组嵌合蛋白的设计和功能分析
在该实施例中，描述了表达SIRPαβ开关受体的载体的示例性设计。图29A显示了SIRPαβ开关受体的说明性示意图。该受体由与SIRPβ的TM和ICD融合的SIRPα的ECD组成。ECD：胞外结构域；TM：跨膜结构域；ICD：胞内结构域。与SIRPα不同，SIRPβ不与CD47结合，而是通过其TM区域与DAP12缔合并促进吞噬作用。当在巨噬细胞中表达时，SIRPαβ与CD47配体结合并且还与DAP12缔合以促进吞噬信号传导。人巨噬细胞用SIRPαβ和对照载体转导，以用于功能分析。
图29B显示了载有染料的靶肿瘤细胞的相对吞噬作用的预期结果，通过流式细胞术定量。与表达对照载体的细胞相比，表达SIRPαβ的细胞表现出更强的吞噬作用。图29C显示了载有染料的靶肿瘤细胞的相对裂解的预期结果。表达SIRPαβ的细胞比表达对照载体的细胞表现出更高的靶细胞裂解。在第0天向NSG小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤细胞。小鼠未经治疗或用共表达CAR-P SIRPαβ的人原代巨噬细胞注射，并生成存活曲线(图29D)。
实施例24.表达Siglec开关受体的重组嵌合蛋白的设计和功能分析
在该实施例中，描述了表达Siglec开关受体的载体的示例性设计。图30A显示了单顺反子Siglec开关受体的说明性示意图。嵌合受体具有两部分：吞噬作用的嵌合受体(CARP)和唾液酸酶。CARP由用于翻译的蛋白的膜定位的信号肽、胞外结构域组成，其具有抗原结合结构域。抗原结合结构域是特异性针对靶细胞例如癌细胞上的抗原的scFv。该抗原结合结构域与ECD和Siglec蛋白的TM结构域融合。ICD结构域可以是促进吞噬作用的ICD结构域，例如来自吞噬细胞受体的信号传导结构域。该构建体编码短的T2A切割位点和唾液酸酶的下游编码序列。唾液酸酶具有用于酶唾液酸酶的胞外释放的在先信号传导序列，预期其去除表达构建体的细胞的胞外环境中的唾液酸化残基。唾液酸化聚糖是siglec蛋白的配体，因此唾液酸酶的表达耗尽了siglec蛋白的天然配体，使嵌合受体中的siglec蛋白的ECD呈惰性。ECD：胞外结构域；TM：跨膜结构域；ICD：胞内结构域。当在巨噬细胞中表达时，Siglec-唾液酸酶CARP增强吞噬作用，而不是像内源性siglec信号传导那样抑制吞噬作用。用Siglec-唾液酸酶CARP和对照载体转导人巨噬细胞，以用于功能分析。
图30C显示了载有染料的靶肿瘤细胞的相对裂解的预期结果。表达Siglec-唾液酸酶CARP的细胞比表达仅表达Siglec CARP构建体而不表达唾液酸酶的CARP对照载体的细胞具有更高的靶细胞裂解。
图30D-30G显示了唾液酸酶CARP构建体的另外的示例性设计。这些可以是图30A中描述的构建体中的掺入部分，其中附加元件是唾液酸酶的编码序列5'和3'侧翼末端的调控元件。如图30D所示，唾液酸酶构建体处于与CARP不同的单独启动子的控制之下(与图30A中的相比，这是多顺反子构建体)，其中启动子前面是NF-κB反应元件。NF-κB通路在吞噬细胞中被激活。因此，唾液酸酶在NF-κB反应元件的影响下表达，因此在主动吞噬的巨噬细胞中选择性表达(如图30E所示)。图30F显示了在唾液酸酶构建体的3'-UTR中添加特异性ARE蛋白结合序列以调节其在选择性巨噬细胞中的表达。例如，插入用于将GAPDH结合到mRNA的序列基序可以提供在GAPDH糖基化状态变化时触发的受调节的表达。示例性的GAPDH ARE结合序列是：WWWU(AUUUA)UUUW(其中W为A或U)。GAPDH是mRNA结合蛋白。当GAPDH保持与mRNA结合时，mRNA被阻止转录，因此是沉默的。糖基化的变化激活GAPDH并将其与mRNA分离。这会触发mRNA的转录。缺氧条件可以触发糖基化状态的变化。因此，该构建体可以在缺氧条件下例如在肿瘤微环境中被激活和表达。
实施例25.表达FcRα受体的重组嵌合蛋白的设计和功能分析。
在该实施例中，描述了表达具有巨噬细胞特异性表达的癌抗原靶向受体的载体的示例性设计。在该示例性构建体中，胞外抗原结合结构域是可以特异性结合癌抗原的scFv。FcRα链的胞外跨膜和胞内结构域通过接头(CAR-FcRγ)与scFv融合。FcRγ链与FcRγ的内源性跨膜结构域异二聚化，其在巨噬细胞中特异性表达。图31A显示了靶向FcRγ受体的癌症的说明性示意图。
图31B显示了载有染料的靶肿瘤细胞的相对吞噬作用的预期结果，通过流式细胞术定量。与表达对照载体的细胞相比，表达CAR-FcRγ的细胞表现出增强的吞噬作用。图31C显示了载有染料的靶肿瘤细胞的相对裂解的预期结果。表达FcRγ的细胞比表达对照载体的细胞表现出更高的靶细胞裂解。在第0天向NSG小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤细胞。小鼠未经治疗或用共表达CAR-FcRγ的人原代巨噬细胞注射，并生成存活曲线(图31D)。
实施例26.重组CFP(CAR-TREM)的设计和功能分析
在该实施例中，描述了表达具有髓系细胞特异性表达的癌抗原靶向受体的载体的示例性设计。在该示例性构建体中，胞外抗原结合结构域是可以特异性结合癌抗原的scFv。TREM链的胞外跨膜和胞内结构域通过接头(CAR-TREM)与scFv融合。TREM链与DAP12的内源性DAP12跨膜结构域异二聚化，并产生促进吞噬作用的促炎信号。图32A显示了靶向CAR-TREM的癌症的说明性示意图。
图32B显示了载有染料的靶肿瘤细胞的相对吞噬作用的预期结果，通过流式细胞术定量。与表达对照载体的细胞相比，表达CAR-TREM的细胞表现出增强的吞噬作用。图32C显示了载有染料的靶肿瘤细胞的相对裂解的预期结果。表达TREM的细胞比表达对照载体的细胞表现出更高的靶细胞裂解。在第0天向NSG小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤细胞。小鼠未经治疗或用共表达CAR-TREM的人原代巨噬细胞注射，并生成存活曲线(图32D)。
实施例27.表达胞内半胱天冬酶构建体的重组嵌合蛋白的设计和功能分析。
在该实施例中，设计了包含具有ITAM胞内结构域的CAR的编码序列和编码融合胞内蛋白的单独编码序列的单个构建体，即与通过半胱天冬酶切割位点连接的SH2结合结构域连接的半胱天冬酶原。该构建体在图33A(上小图)中以图形方式描绘。融合的半胱天冬酶原编码序列与具有T2A结构域的CAR编码序列隔开，该T2A结构域在T2A位点翻译后切割两种蛋白质。图33A显示了表达特异性结合癌抗原的胞外scFv、可以是前述实施例中描述的任何TM的跨膜结构域和包含SH2结合结构域的胞内ITAM结构域的CAR。如图33A中的图形描述所示的，通过在T2A位点切割而从剩余构建体中翻译和释放后的半胱天冬酶原部分通过SH2对接位点与胞内ITAM结构域缔合，其包含CAR的胞内ITAM结构域处的酪氨酸磷酸化残基。在通过ITAM与SH2结构域结合和磷酸化后，半胱天冬酶原被激活并在半胱天冬酶切割位点被切割，这会激活半胱天冬酶原以形成半胱天冬酶。这启动了吞噬作用的胞内信号传导通路。该构建体在人原代巨噬细胞中表达，用于功能分析。图33B-33C显示了当半胱天冬酶-CAR巨噬细胞与靶肿瘤细胞共培养时细胞因子和表面抗原的诱导表达的预期结果。用对照空载体或半胱天冬酶-CAR转导的人原代巨噬细胞与靶肿瘤细胞共培养。使用ELISA的细胞因子分析显示，与载体对照相比，促炎细胞因子和趋化因子的分泌增加。流式细胞术显示与载体对照相比，促炎细胞表面标志物的表达增加。图33D-33E分别显示了体外细胞裂解测定和体内异种移植小鼠模型中的预期结果。在图33D中，用对照载体或半胱天冬酶-CAR转导的人原代巨噬细胞与以不同E:T比表达荧光素酶的肿瘤细胞共培养，并使用荧光素酶测定法量化特异性裂解。在图33E中，在第0天向NSG小鼠注射表达荧光素酶的肿瘤细胞。小鼠或者未经治疗，或者在第0天注射用半胱天冬酶-CAR转导的人原代巨噬细胞。
实施例28.包括代谢开关原理的载体的模块化设计。
在该实施例中，描述了构建体的特异性增强。如本领域技术人员所理解的，本节中描述的设计可以适用于本公开中描述的任何构建体。如图34A(上小图)所示，该设计举例说明了CAR的通用构建体，其中在3'UTR中插入了富含AU的元件(ARE)序列，导致RNA结合蛋白(例如，GAPDH)与成熟的mRNA链结合，阻止翻译。GAPDH结合序列可以指定为WWWU(AUUUA)UUUW，其中W是A或U。糖酵解导致RNA结合蛋白(例如，GAPDH)解偶联，允许mRNA链翻译。
其他示例性的ARE序列可用于替代GAPDH结合序列。此类序列可以是ARE序列，其与ADK、ALDH18A1、ALDH6A1、ALDOA、ASS1、CCBL2、CS、DUT、ENO1、FASN、FDPS、GOT2,HADHB、HK2、HSD17B10、MDH2、NME1、NQ01、PKM2、PPP1CC、SUCLG1、TP11、GAPDH、LDH结合。修饰的ARE在CARP的表达构建体的3'端处使用，如图10A(下小图)所示。
图34B举例说明了表达促炎蛋白的通用构建体，作为单顺反子构建体或多顺反子构建体的一部分，用于CARP的表达以及本文所述的促炎蛋白的表达；或本文所述的构建体可用于与任何其他嵌合抗原构建体共表达。在图34B中未示出，所示部分的构建体的剩余部分用作编码CAR蛋白的构建体的一部分。任何蛋白质都可以表示为“感兴趣的蛋白质”，其包括但不限于白细胞介素12、2型干扰素、1型干扰素、促炎介体、可溶性因子、颗粒、裂解蛋白、一氧化氮等——触发抗肿瘤活性(抗PD1抗体等)的任何蛋白质，吸引嗜中性粒细胞的FMLP配体。编码序列的3'端包含一个或多个ARE序列，该ARE序列可与ADK、ALDH18A1、ALDH6A1、ALDOA、ASS1、CCBL2、CS、DUT、ENO1、FASN、FDPS、GOT2,HADHB、HK2、HSD17B10、MDH2、NME1、NQ01、PKM2、PPP1CC、SUCLG1、TP11、GAPDH、LDH等中的任一个结合。
图34C显示了适用于本文公开的设计的若干示例性模块化构建体。图34C描绘了示例性构建体，其中两个或更多个编码序列被构建体((i))编码的T2A或P2A切割位点分隔。内源性蛋白质在该位点切割新翻译的蛋白质，释放两个由单个构建体生成的独立的蛋白质。图34C还描绘了示例性双顺反子构建体，其包含两个编码序列，一个在启动子P1的影响下用于包含抗原特异性结合物和胞内结构域(ICD)的融合蛋白；另一个在第二个启动子P2和3'调控元件的影响下编码炎性基因。两个编码序列被设计成彼此方向相反((ii))。图34C还描绘了示例性设计，其中两个不同的基因由双顺反子载体构建体编码，并且是单向的((iii))。图34C还描绘了示例性设计，其中两个基因由载体构建体编码，其中第二个编码序列之前是IRES构建体，该IRES构建体确保独立的核糖体进入位点用于源自单个核酸构建体((iv))独立地翻译为单独的多肽。

Claims (265)

1.一种包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述嵌合融合蛋白(CFP)包含：
(a)吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基，所述亚基包括：
(i)跨膜结构域，和
(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和
(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；其中所述抗原不是CD19或CD22抗原，并且其中在所述CFP与所述靶细胞的抗原结合后，与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞的杀伤或吞噬活性增加至少20％CFP，其中杀伤或吞噬活性通过流式细胞术测量。
2.一种包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述嵌合融合蛋白(CFP)包含：
(a)吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基，所述亚基包括：
(i)跨膜结构域，和
(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和
(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；并且其中在所述CFP与所述靶细胞的抗原结合后，与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞的杀伤或吞噬活性增加至少10倍，其中杀伤或吞噬活性计算为每100个表达所述CFP的细胞的吞没。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自吞噬细胞或栓系受体，或者其中胞内信号传导结构域包含吞噬激活结构域。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcR或Bai1的吞噬细胞受体之外的受体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自一种受体，所述受体选自表2中列出的受体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
8.一种包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述嵌合融合蛋白(CFP)包含：
(a)吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基，所述亚基包括：
(i)跨膜结构域，和
(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和
(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；和
其中所述胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcRα和Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中在所述CFP与所述靶细胞的抗原结合后，与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞的杀伤活性增加至少大于20％，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞的杀伤或吞噬活性增加至少20％，其中杀伤或吞噬活性通过流式细胞术测量。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自选自凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fc-α受体I、CR1、CD35、CD3ζ、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4、TNFR1、MDA5、CD40和CD169的蛋白质。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。
12.一种包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述嵌合融合蛋白(CFP)包含：
(a)吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基，所述亚基包括：
(i)跨膜结构域，和
(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和
(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；和
其中所述胞内信号传导结构域衍生自选自凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fc-α受体I、CR1、CD35、CD3ζ、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4、TNFR1、MDA5、CD40和CD169的噬菌受体。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中在所述CFP与所述靶细胞的抗原结合后，与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞的杀伤或吞噬活性增加至少55％。
14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcRα或Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含促炎信号传导结构域。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
17.一种包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述嵌合融合蛋白(CFP)包含：
(a)吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基，所述亚基包括：
(i)跨膜结构域，和
(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和
(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；和
其中所述胞内信号传导结构域包含不是PI3K募集结构域的促炎信号传导结构域。
18.一种包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述嵌合融合蛋白(CFP)包含：
(a)吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基，所述亚基包括：
(i)跨膜结构域，和
(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和
(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；其中所述胞内信号传导结构域包含衍生自TFNR1受体的信号传导结构域。
19.一种包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述嵌合融合蛋白(CFP)包含：
(a)吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基，所述亚基包括：
(i)跨膜结构域，和
(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和
(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；其中所述胞内信号传导结构域包含衍生自CD40受体的信号传导结构域。
20.一种包含编码嵌合融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述嵌合融合蛋白(CFP)包含：
(a)吞噬细胞或栓系受体(PR)亚基，所述亚基包括：
(i)跨膜结构域，和
(ii)包含胞内信号传导结构域的胞内结构域；和
(b)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域可操作地连接；其中所述胞内信号传导结构域包含衍生自MDA5受体的信号传导结构域。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的组合物，其中在所述CFP与所述靶细胞的抗原结合后，与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞的杀伤或吞噬活性增加至少大于20％，其中杀伤或吞噬活性通过流式细胞术测量。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自吞噬细胞受体。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自除选自Megf10、MerTk、FcR或Bai1的吞噬细胞受体之外的吞噬细胞受体。
24.根据权利要求17-23中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自选自凝集素、dectin 1、CD206、清道夫受体A1(SRA1)、MARCO、CD36、CD163、MSR1、SCARA3、COLEC12、SCARA5、SCARB1、SCARB2、CD68、OLR1、SCARF1、SCARF2、CXCL16、STAB1、STAB2、SRCRB4D、SSC5D、CD205、CD207、CD209、RAGE、CD14、CD64、F4/80、CCR2、CX3CR1、CSF1R、Tie2、HuCRIg(L)、CD64、CD32a、CD16a、CD89、Fc-α受体I、CR1、CD35、CD3ζ、CR3、CR4、Tim-1、Tim-4、TNFR1、MDA5、CD40和CD169的吞噬细胞受体。
25.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含PI3K募集结构域。
26.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含FcRγ胞内结构域。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域以N到C的顺序包含FcRγ胞内结构域和CD40受体胞内信号传导结构域。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域以C到N的顺序包含FcRγ胞内结构域和CD40受体胞内信号传导结构域。
29.根据权利要求26所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域以N到C的顺序包含FcRγ胞内结构域和TNFR1受体胞内信号传导结构域。
30.根据权利要求26所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域以C到N的顺序包含FcRγ胞内结构域和TNFR1受体胞内信号传导结构域。
31.根据权利要求26所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域以N到C的顺序包含FcRγ胞内结构域和MDA5信号传导结构域。
32.根据权利要求26所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域以C到N的顺序包含FcRγ胞内结构域和MDA5信号传导结构域。
33.根据权利要求26所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域以N到C的顺序包含FcRγ胞内结构域和PI3K募集结构域。
34.根据权利要求26所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域以C到N的顺序包含FcRγ胞内结构域和PI3K募集结构域。
35.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中当所述CFP在所述细胞中表达时，所述CFP功能性地掺入细胞的细胞膜中。
36.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出表达所述抗原的靶细胞的吞噬作用增加。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出表达所述抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少1.1倍，其中吞噬作用通过流式细胞术测量。
38.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出表达所述抗原的靶细胞的吞噬作用增加至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍，其中吞噬作用通过流式细胞术测量。
39.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中表达所述抗原的靶细胞是癌细胞。
40.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中表达所述抗原的所述靶细胞的直径为至少0.8微米。
41.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自清道夫受体。
42.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出细胞因子产生的增加。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述细胞因子选自IL-1、IL3、IL-6、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素及其组合。
44.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出效应物活性的增加。
45.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出交叉呈递的增加。
46.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出MHCII类蛋白的表达增加。
47.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出CD80的表达的增加。
48.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出CD86的表达的增加。
49.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出MHCI类蛋白的表达增加。
50.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出TRAIL/TNF家族死亡受体的表达的增加。
51.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出B7-H2的表达的增加。
52.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出LIGHT的表达的增加。
53.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出HVEM的表达的增加。
54.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出CD40的表达的增加。
55.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出TL1A的表达的增加。
56.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出41BBL的表达的增加。
57.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出OX40L的表达的增加。
58.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出GITRL死亡受体的表达的增加。
59.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出CD30L的表达的增加。
60.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出TIM4的表达的增加。
61.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出TIM1配体的表达的增加。
62.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出SLAM的表达的增加。
63.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出CD48的表达的增加。
64.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出CD58的表达的增加。
65.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出CD155的表达的增加。
66.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出CD112的表达的增加。
67.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出PDL1的表达的增加。
68.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出B7-DC的表达的增加。
69.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出呼吸爆发的增加。
70.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出ROS产生的增加。
71.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出iNOS产生的增加。
72.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出iNOS产生的增加。
73.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出细胞外囊泡产生的增加。
74.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出表达所述抗原的靶细胞的胞啃作用的增加。
75.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出对CD47介导的吞噬作用抑制的抗性的增加。
76.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中与不表达所述CFP的细胞相比，表达所述CFP的细胞表现出对LILRB1介导的吞噬作用抑制的抗性的增加。
77.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含Rac抑制结构域、Cdc42抑制结构域或GTP酶抑制结构域。
78.根据权利要求64所述的组合物，其中所述Rac抑制结构域、所述Cdc42抑制结构域或所述GTP酶抑制结构域在表达所述CFP的细胞的吞噬杯处抑制Rac、Cdc42或GTP酶。
79.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含F-肌动蛋白分解激活结构域、ARHGAP12激活结构域、ARHGAP25激活结构域或SH3BP1激活结构域。
80.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中表达所述CFP的细胞表现出磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的增加。
81.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含Ig结合结构域。
82.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、FcRγI、FcRγIIA、FcRγIIB、FcRγIIC、FcRγIIIA、FcRγIIIB、FcRn、TRIM21、FcRL5结合结构域。
83.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcR胞外结构域。
84.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcR-α、FcRβ、FcRε或FcRγ胞外结构域。
85.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcRα(FCAR)胞外结构域。
86.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcRβ胞外结构域。
87.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcRε(FCER1A)胞外结构域。
88.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含FcRγ(FDGR1A、FCGR2A、FCGR2B、FCGR2C、FCGR3A、FCGR3B)胞外结构域。
89.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含整合素结构域。
90.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含一种或多种整合素α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7或β8结构域。
91.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含CD47抑制结构域。
92.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述PR亚基进一步包含与跨膜结构域和胞外抗原结合结构域可操作地连接的胞外结构域。
93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述胞外结构域还包含受体、铰链、间隔区或接头的胞外结构域。
94.根据权利要求93所述的组合物，其中所述胞外结构域包含PR的胞外部分。
95.根据权利要求94所述的组合物，其中所述PR的胞外部分衍生自与PR胞内信号传导结构域相同的PR。
96.根据权利要求92-95中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含清道夫受体的胞外结构域或免疫球蛋白结构域。
97.根据权利要求96所述的组合物，其中所述免疫球蛋白结构域包含免疫球蛋白的胞外结构域或免疫球蛋白铰链区。
98.根据权利要求92-97中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含吞噬吞没标志物。
99.根据权利要求92-98中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含能够进行多聚体组装的结构。
100.根据权利要求92-98中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含用于多聚化的支架。
101.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域的长度为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。
102.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域的长度为至多500、400、300、200或100个氨基酸。
103.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域与所述靶细胞的抗原特异性结合。
104.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含抗体结构域。
105.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含受体结构域、抗体结构域，其中所述抗体结构域包含功能性抗体片段、单链可变片段(scFv)、Fab、单域抗体(sdAb)、纳米抗体、VH结构域、VL结构域、VNAR结构域、VHH结构域、双特异性抗体、双抗体或其功能片段或组合。
106.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含配体、受体的胞外结构域或衔接子。
107.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含对单一抗原特异的单一胞外抗原结合结构域。
108.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外抗原结合结构域包含至少两个胞外抗原结合结构域，其中至少两个胞外抗原结合结构域中的每一个对不同抗原具有特异性。
109.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原是癌抗原或病原体抗原或自身免疫抗原。
110.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括病毒抗原。
111.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原是T淋巴细胞抗原。
112.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原是胞外抗原。
113.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原是胞内抗原。
114.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原选自胸苷激酶(TK1)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、粘蛋白-1、粘蛋白-16(MUC16)、MUC1、表皮生长因子受体vIII(EGFRvIII)、间皮素、人表皮生长因子受体2(HER2)、间皮素、EBNA-1、LEMD1、磷脂酰丝氨酸、癌胚抗原(CEA)、B细胞成熟抗原(BCMA)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、卵泡刺激素受体、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、促红细胞生成素生成性肝细胞癌A2(EphA2)、EphB2、自然杀伤基团2D(NKG2D)配体、双唾液酸神经节苷脂2(GD2)、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD45、CD56CD79b、CD97、CD117、CD123、CD133、CD138、CD171、CD179a、CD213A2、CD248、CD276、PSCA、CS-1、CLECL1、GD3、PSMA、FLT3、TAG72、EPCAM、IL-1、整合素受体、PRSS21、VEGFR2、PDGFRβ、SSEA-4、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、GM3、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、IGLL1、皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)及其组合。
115.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CCR4、CXCR4、CD8、CD30、CD45、CD56和皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)。
116.根据权利要求114所述的组合物，其中所述抗原是CD5抗原。
117.根据权利要求114所述的组合物，其中所述抗原是HER2抗原。
118.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原是卵巢癌抗原或T淋巴瘤抗原。
119.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原是整合素受体。
120.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原是选自α1、α2、αIIb、α3、α4、α5、α6、α7、α8、α9、α10、α11、αD、αE、αL、αM、αV、αX、β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7和β8的整合素受体。
121.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括2种或更多种抗原。
122.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域和所述胞外抗原结合结构域通过接头可操作地连接。
123.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域和所述胞外抗原结合结构域通过接头如CD8α、IgG1或IgG4的铰链区可操作地连接。
124.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞外结构域包含多聚化支架。
125.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含FcR跨膜结构域。
126.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含具有不超过20、10或5个修饰跨膜结构域的FcR-ε。
127.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包括来自突触融合蛋白，例如突触融合蛋白3或突触融合蛋白4或突触融合蛋白5的跨膜结构域。
128.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。
129.根据权利要求1-127中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域或CD2跨膜结构域。
130.根据权利要求1-127中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包括CD68跨膜结构域。
131.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中当所述CFP在细胞中表达时，所述跨膜结构域与内源性受体的跨膜结构域寡聚化。
132.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中当所述CFP在细胞中表达时，所述跨膜结构域与外源性受体的跨膜结构域寡聚化。
133.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中当所述CFP在细胞中表达时，所述跨膜结构域与内源性受体的跨膜结构域二聚化。
134.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中当所述CFP在细胞中表达时，所述跨膜结构域与外源性受体的跨膜结构域二聚化。
135.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域衍生自与从其衍生出所述胞内信号传导结构域的蛋白质不同的蛋白质。
136.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域衍生自与从其衍生出所述胞外结构域的蛋白质不同的蛋白质。
137.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含吞噬细胞受体的跨膜结构域。
138.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域衍生自相同的蛋白质。
139.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域衍生自与所述胞内信号传导结构域相同的蛋白质。
140.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码DAP12募集结构域。
141.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域包含与DAP12寡聚化的跨膜结构域。
142.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域的长度为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸。
143.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域的长度为至多12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸。
144.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含磷酸酶抑制结构域。
145.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含ARP2/3抑制结构域。
146.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含至少一个ITAM结构域。
147.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个ITAM结构域。
148.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域进一步包含至少一个ITAM结构域。
149.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域还包含至少一个选自CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b 1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d、其功能片段以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列的ITAM结构域。
150.根据权利要求149所述的组合物，其中所述至少一个ITAM结构域包含Src家族激酶磷酸化位点。
151.根据权利要求149所述的组合物，其中所述至少一个ITAM结构域包含Syk募集结构域。
152.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含F-肌动蛋白解聚激活结构域。
153.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域缺乏酶活性。
154.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域不包含衍生自CD3ζ胞内结构域的结构域。
155.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含CD47抑制结构域。
156.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含激活整合素的结构域，例如PSGL-1的胞内区。
157.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域包含激活Rap1 GTP酶的结构域，例如来自EPAC和C3G的结构域。
158.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域来自桩蛋白。
159.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域激活粘着斑激酶。
160.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自单个吞噬细胞受体。
161.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内信号传导结构域衍生自单个清道夫受体。
162.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域进一步包含吞噬作用增强结构域。
163.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域包含促炎信号传导结构域。
164.根据权利要求163所述的组合物，其中所述促炎信号传导结构域包含激酶激活结构域或激酶结合结构域。
165.根据权利要求163或164所述的组合物，其中所述促炎信号传导结构域包含IL-1信号传导级联激活结构域。
166.根据权利要求163-165中任一项所述的组合物，所述促炎信号传导结构域包含衍生自TLR3、TLR4、TLR7、TLR 9、TRIF、RIG-1、MYD88、MAL、IRAK1、MDA-5、IFN-受体、NLRP家族成员、NLRP1-14、NOD1、NOD2、脓素、AIM2、NLRC4、FCGR3A、FCERIG、CD40、Tank结合激酶(TNK)、半胱天冬酶结构域或半胱天冬酶原结合结构域或其任意组合的胞内信号传导结构域。
167.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述CFP不包含全长胞内信号传导结构域。
168.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域的长度为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。
169.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述胞内结构域的长度为至多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、300、400或500个氨基酸。
170.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码FcRα链胞外结构域、FcRα链跨膜结构域和/或FcRα链胞内结构域。
171.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码FcRβ链胞外结构域、FcRβ链跨膜结构域和/或FcRβ链胞内结构域。
172.根据权利要求170或171所述的组合物，其中当在细胞中表达时，FcRα链或FcRβ链与FcRγ形成复合物。
173.根据权利要求172所述的组合物，其中当在细胞中表达时，所述FcRα链或FcRβ链与内源性FcRγ形成复合物。
174.根据权利要求170-173中任一项所述的组合物，其中所述FcRα链或所述FcRβ链不掺入不表达FcRγ的细胞的细胞膜中。
175.根据权利要求170-174中任一项所述的组合物，其中所述CFP不包含FcRα链胞内信号传导结构域。
176.根据权利要求170-175中任一项所述的组合物，其中所述CFP不包含FcRβ链胞内信号传导结构域。
177.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸编码TREM胞外结构域、TREM跨膜结构域和/或TREM胞内结构域。
178.根据权利要求177所述的组合物，其中所述TREM是TREM1、TREM 2或TREM 3。
179.一种包含编码吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(CFP)从N-末端到C-末端包含：
(a)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；和
(b)PR亚基，所述PR亚基包括：
(i)CD8跨膜结构域，和
(ii)包含Fcγ胞内信号传导结构域和CD40胞内信号传导结构域的胞内结构域
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域通过接头可操作地连接。
180.一种包含编码吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(CFP)从N-末端到C-末端包含：
(a)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；和
(b)PR亚基，所述PR亚基包括：
(i)CD8跨膜结构域，和
(ii)包含Fcγ胞内信号传导结构域和TNFR1胞内信号传导结构域的胞内结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域通过接头可操作地连接。
181.一种包含编码吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(CFP)的重组核酸的组合物，所述吞噬细胞或栓系受体(PR)融合蛋白(CFP)从N-末端到C-末端包含：
(a)包含对靶细胞抗原特异的抗原结合结构域的胞外结构域；和
(b)PR亚基，所述PR亚基包括：
(i)CD8跨膜结构域，和
(ii)包含Fcγ胞内信号传导结构域和MDA5胞内信号传导结构域的胞内结构域；
其中所述跨膜结构域和所述胞外结构域通过接头可操作地连接。
182.根据权利要求179-181中任一项所述的组合物，其中所述抗原是CD5抗原。
183.根据权利要求179-181中任一项所述的组合物，其中所述抗原是HER2抗原。
184.根据权利要求179-183中任一项所述的组合物，其中所述CFP还包含信号肽。
185.根据权利要求184所述的组合物，其中所述信号肽是GMCSF信号肽。
186.根据权利要求184所述的组合物，其中所述CFP包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
187.根据权利要求184所述的组合物，其中所述CFP包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
188.根据权利要求184所述的组合物，其中所述CFP包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
189.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸包含促炎核苷酸或编码促炎多肽的多核苷酸序列。
190.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含促炎多肽。
191.根据权利要求189或190所述的组合物，其中所述促炎多肽是趋化因子或细胞因子。
192.根据权利要求191所述的组合物，其中所述趋化因子选自IL-1、IL3、IL5、IL-6、il8、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素。
193.根据权利要求191所述的组合物，其中所述细胞因子选自IL-1、IL3、IL5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-23、TNF、CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-18、IL-23、IL-27、CSF、MCSF、GMCSF、IL17、IP-10、RANTES、干扰素。
194.根据权利要求189所述的组合物，其中所述核苷酸选自ATP、ADP、UTP、UDP和/或UDP-葡萄糖。
195.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸包含编码炎症稳态调节剂的序列。
196.根据权利要求195所述的组合物，其中所述炎症的稳态调节剂是mRNA的非翻译区(UTR)中的序列。
197.根据权利要求196所述的组合物，其中所述UTR中的序列是与RNA结合蛋白结合的序列。
198.根据权利要求196或197所述的组合物，其中在所述RNA结合蛋白与非翻译区(UTR)中的序列结合时，翻译被抑制或阻止。
199.根据权利要求197或198所述的组合物，其中所述UTR中的序列包含WWWU(AUUUA)UUUW的共有序列，其中W是A或U。
200.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸在双顺反子载体上表达。
201.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞是哺乳动物细胞。
202.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞是人细胞。
203.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞包括被病原体感染的细胞。
204.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞是癌细胞。
205.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞是癌细胞，即淋巴细胞。
206.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞为癌细胞，即卵巢癌细胞。
207.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞为癌细胞，即卵巢胰腺细胞。
208.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶细胞为癌细胞，即胶质母细胞瘤细胞。
209.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为DNA。
210.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为RNA。
211.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为mRNA。
212.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为环状RNA。
213.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为tRNA。
214.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述重组核酸为微小RNA。
215.一种载体，包含权利要求1-214中任一项所述的组合物的所述重组核酸。
216.根据权利要求215所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
217.根据权利要求216所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。
218.根据权利要求215-217中任一项所述的载体，其中所述载体还包含与至少一种编码一种或多种多肽的核酸序列可操作地连接的启动子。
219.根据权利要求215-218中任一项所述的载体，其中所述载体是多顺反子的。
220.根据权利要求218或219所述的载体，其中所述至少一个核酸序列中的每一个与单独的启动子可操作地连接。
221.根据权利要求215-220中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。
222.根据权利要求215-221中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含位于编码一种或多种多肽的至少一种核酸序列侧翼的5'UTR和/或3'UTR。
223.根据权利要求215-222中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包含一个或多个调控区。
224.一种多肽，由权利要求1-214中任一项所述的组合物的所述重组核酸编码。
225.一种细胞，包含权利要求1-214中任一项所述的组合物、权利要求216-223中任一项所述的载体或权利要求224所述的多肽。
226.根据权利要求225所述的细胞，其中所述细胞是未成熟的髓系细胞。
227.根据权利要求225所述的细胞，其中所述细胞是未极化或未分化的髓系细胞。
228.根据权利要求225所述的细胞，其中所述细胞是CD14+/CD16低细胞。
229.根据权利要求225所述的细胞，其中所述细胞是CD14+/CD16-细胞、CD14-/CD16+细胞。
230.根据权利要求225所述的细胞，其中所述细胞是吞噬细胞。
231.根据权利要求225所述的细胞，其中所述细胞是干细胞衍生细胞、髓系细胞、巨噬细胞、树突细胞、淋巴细胞、肥大细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、髓系祖细胞、镶嵌表型细胞或星形胶质细胞。
232.根据权利要求225中任一项所述的细胞，其中所述细胞是M1巨噬细胞。
233.根据权利要求225中任一项所述的细胞，其中所述细胞是M2巨噬细胞。
234.根据权利要求225-233中任一项所述的细胞，其中所述细胞是自体细胞。
235.根据权利要求225-233中任一项所述的细胞，其中所述细胞是同种异体细胞。
236.一种修饰细胞群，其中多个所述修饰细胞群包含权利要求1-214中任一项所述的组合物、权利要求216-223中任一项所述的载体或权利要求224所述的多肽。
237.根据权利要求236所述的修饰细胞群，其中所述多个包括所述修饰细胞群的至少80％。
238.根据权利要求237所述的修饰细胞群，其中所述细胞群未被富集。
239.根据权利要求237或238所述的修饰细胞群，其中所述细胞群是CD14+/CD16-细胞、CD14-/CD16+细胞或CD14+/CD16低细胞。
240.根据权利要求237或239所述的修饰细胞群，其中所述细胞群是吞噬细胞。
241.一种药物组合物，其包含：
(a)权利要求1-214中任一项所述的组合物、权利要求216-223中任一项所述的载体或权利要求224所述的多肽、权利要求225-235中任一项所述的细胞或权利要求236-240中任一项所述的细胞群；和
(b)药学上可接受的赋形剂。
242.根据权利要求241所述的药物组合物，进一步包含另外的治疗剂。
243.根据权利要求241或242所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂选自CD47激动剂、抑制Rac的试剂、抑制Cdc42的试剂、抑制GTP酶的试剂、促进F-肌动蛋白分解的试剂、促进PI3K募集到CFP的试剂、促进PI3K活性的试剂、促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的试剂、促进ARHGAP12活性的试剂、促进ARHGAP25活性的试剂、促进SH3BP1活性的试剂及其任意组合。
244.根据权利要求241-243中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包含无血清培养基、脂质或纳米颗粒。
245.一种治疗有此需要的受试者的疾病的方法，包括向所述受试者施用权利要求241-244中任一项所述的药物组合物。
246.根据权利要求245所述的方法，其中所述疾病是癌症。
247.根据权利要求246所述的方法，其中所述癌症是实体癌。
248.根据权利要求247所述的方法，其中所述实体癌选自卵巢癌，合适的癌症包括卵巢癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌。
249.根据权利要求246所述的方法，其中所述癌症是液体癌。
250.根据权利要求249所述的方法，其中所述液体癌是白血病或淋巴瘤。
251.根据权利要求249所述的方法，其中所述液体癌是T细胞淋巴瘤。
252.根据权利要求245所述的方法，其中所述疾病是T细胞恶性肿瘤。
253.根据权利要求245-252中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者施用另外的治疗剂。
254.根据权利要求253所述的方法，其中所述另外的治疗剂选自CD47激动剂、抑制Rac的试剂、抑制Cdc42的试剂、抑制GTP酶的试剂、促进F-肌动蛋白分解的试剂、促进PI3K募集到CFP的试剂、促进PI3K活性的试剂、促进磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸产生的试剂、促进ARHGAP12活性的试剂、促进ARHGAP25活性的试剂、促进SH3BP1活性的试剂及其任意组合。
255.根据权利要求245-254中任一项所述的方法，其中所述施用包括输注或注射。
256.根据权利要求245-255中任一项所述的方法，其中所述施用包括直接对所述实体癌施用。
257.根据权利要求245-256中任一项所述的方法，其中所述施用包括施用环状RNA、mRNA、病毒载体、颗粒、纳米颗粒、脂质体-、外来体或细胞。
258.根据权利要求245-257中任一项所述的方法，其中在所述受试者中引发CD4+T细胞反应或CD8+T细胞反应。
259.一种制备细胞的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1-214中任一项所述的组合物、权利要求216-223中任一项所述的载体或权利要求224所述的多肽接触。
260.根据权利要求259所述的方法，其中接触包括转导。
261.根据权利要求260所述的方法，其中转导包括化学转染、电穿孔、核转染或病毒感染。
262.一种制备药物组合物的方法，包括使脂质与权利要求1-214中任一项所述的组合物、权利要求216-223中任一项所述的载体或权利要求224所述的多肽接触。
263.根据权利要求262所述的方法，其中接触包括形成脂质纳米颗粒。
264.一种制备药物组合物的方法，包括使抗体与权利要求1-214中任一项所述的组合物或权利要求216-223中任一项所述的载体接触。
265.根据权利要求264所述的方法，其中接触包括形成脂质纳米颗粒。
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