CN114901304A - 涉及经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞的治疗 - Google Patents
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Abstract
本公开内容涉及用于增强涉及经工程化以表达抗原受体如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞如T细胞的疗法的效率的方法。本文证明,如果另外将抗原受体所针对的靶抗原提供给对象,此类抗原受体工程化的免疫效应细胞,即使当以亚治疗量提供给对象时,也非常有效地治疗癌症疾病,甚至是已知难以用抗原受体工程化的免疫效应细胞治疗的那些癌症疾病(如实体瘤或癌症)。可以离体或体外工程化免疫效应细胞,并随后可以将免疫效应细胞施用至需要治疗的对象,或者可以在需要治疗的对象体内工程化免疫效应细胞。
Description
技术领域
本公开内容涉及用于增强涉及经工程化以表达抗原受体如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞如T细胞的疗法的效率的方法。在一个实施方案中,免疫效应细胞经遗传修饰以表达抗原受体。此类遗传修饰可以在离体或体外进行,并且随后可以将免疫效应细胞施用至需要治疗的对象,或者可以在需要治疗的对象体内进行。这些方法尤其可用于治疗以患病细胞表达抗原受体所针对的抗原为特征的实体癌症。本文证明,如果另外将抗原受体所针对的靶抗原提供给对象,此类抗原受体工程化的免疫效应细胞,即使当以亚治疗量提供给对象时,也非常有效地治疗癌症疾病,甚至是已知难以用抗原受体工程化的免疫效应细胞治疗的那些癌症疾病(如实体瘤或癌症)。在一个实施方案中,免疫效应细胞通过抗原受体如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)结合抗原或其加工产物(当存在于次级淋巴样器官的细胞如抗原呈递细胞,特别是树突细胞上或在MHC的背景下由次级淋巴样器官的细胞如抗原呈递细胞,特别是树突细胞呈递)。可以通过在对象中施用抗原受体工程化的免疫效应细胞或通过在对象中生成抗原受体工程化的免疫效应细胞而向对象提供抗原受体工程化的免疫效应细胞。在一个实施方案中,抗原受体工程化的免疫效应细胞在经治疗的对象中生成。此类体内生成通常只会在对象中提供少量的抗原受体工程化的免疫效应细胞。然而,由于通过提供抗原受体所针对的靶抗原而实现的强刺激作用,预计这些少量的抗原受体工程化的免疫效应细胞将在治疗上有效。抗原受体所针对的靶抗原可以通过向对对象施用抗原受体所靶向的抗原、编码抗原的多核苷酸或表达抗原的细胞来提供给对象。抗原受体所靶向的抗原可以包括天然存在的抗原或其变体,或者天然存在的抗原或其变体的片段。在一个特别优选的实施方案中,编码抗原的多核苷酸是RNA。本文所述的方法和药剂尤其可用于治疗以患病细胞表达抗原受体或抗原受体工程化的免疫效应细胞所针对的抗原为特征的疾病。
背景
免疫系统在癌症、自身免疫、过敏以及病原体相关疾病中起着重要作用。T细胞和NK细胞是抗肿瘤免疫应答的重要介质。CD8+T细胞和NK细胞可直接裂解肿瘤细胞。另一方面,CD4+T细胞可以介导包括CD8+T细胞和NK细胞在内的不同免疫亚群流入肿瘤。CD4+T细胞能够允许树突细胞(DC)引发抗肿瘤CD8+T细胞应答,并且可以经由IFNγ介导的MHC上调和生长抑制直接作用于肿瘤细胞。CD8+以及CD4+肿瘤特异性T细胞应答可经由疫苗接种或通过T细胞的过继转移来诱导。
基于过继细胞转移(ACT)的免疫疗法可以广义地定义为一种使用先前致敏的T细胞进行的被动免疫形式,所述T细胞在从低前体频率离体扩增到临床相关的细胞数后转移到非免疫接受者或自体宿主。已经用于ACT实验的细胞类型是淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞(Mule,J.J.等人(1984)Science 225,1487-1489;Rosenberg,S.A.等人(1985)N.Engl.J.Med.313,1485-1492)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)(Rosenberg,S.A.等人(1994)J.Natl.Cancer Inst.86,1159-1166)、造血干细胞移植(HSCT)后供体淋巴细胞以及肿瘤特异性T细胞系或克隆(Dudley,M.E.等人(2001)J.Immunother.24,363-373;Yee,C.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99,16168-16173)。可替代的方法是在短时间离体培养期间过继转移经重编程以表达限定特异性的肿瘤反应性免疫受体的自体T细胞,然后再输注到患者体内(Kershaw M.H.等人(2013)Nature Reviews Cancer 13(8):525-41)。即使患者体内不存在肿瘤反应性T细胞,这种策略也使ACT适用于各种常见的恶性肿瘤。例如,嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR T细胞)的过继转移在全球范围内在大量的临床试验中进行了研究。嵌合抗原受体(CAR)是由与胞外抗原结合部分(最常见的是来自单克隆抗体的单链可变片段(scFv))融合的胞内T细胞信号传导结构域组成的一类抗原靶向受体。CAR不依赖MHC介导的呈递而直接识别细胞表面抗原,从而允许在所有患者中使用对任何给定抗原具有特异性的单一受体构建体。通常,CAR将抗原识别结构域与T细胞受体(TCR)复合物的CD3ζ激活链融合,并包含与CD3ζ串联的次级共刺激信号,包括来自CD28的胞内结构域或各种TNF受体家族分子,如4-1BB(CD137)和OX40(CD134)。CAR显著提高了抗肿瘤功效,显示出显著的临床功效,尤其在患有血液系统恶性肿瘤的患者中(Hartmann,J.等人EMBO Mol.Med.9,1183-1197(2017))。最近,两种CAR T细胞疗法已获得FDA和EMA批准用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫性大B细胞淋巴瘤(Zheng,P.等人Drug.Discov.Today 6,1175-1182(2018))。然而,对于T细胞的实体瘤过继转移迄今为止显示出有限的功效,并需要改进(Newick,K.等人Annu.Rev.Med.68,139–152(2017))。
抗原受体工程化的免疫细胞在实体癌症中的应用面临的主要挑战特别是转移细胞的非持久性。此外,生成大量用于过继细胞转移的细胞仍然是一个挑战,并且可以施用至患者用于过继细胞转移的细胞数量通常是有限的。此外,将大量工程化的T细胞转移到宿主体内的方法存在严重不良事件的风险。因此,需要向患者提供有限量的经工程化的免疫效应细胞,如T细胞,在它们被证明是安全的之后,可以在患者体内扩增。
在这里,我们引入了一个新概念来克服体内低效的CAR T细胞刺激,这通常是实体癌症患者中的情况。我们证明了设计用于将CAR抗原全身递送到淋巴样隔室中的纳米颗粒RNA疫苗刺激过继转移的CAR T细胞。在常驻树突细胞上呈递天然折叠的靶标促进CAR T细胞的稳健同源和选择性扩增。因此,在难以治疗的小鼠模型中,CAR T细胞的植入改善和大肿瘤的消退是在亚治疗的CAR T细胞剂量下实现的。关于涉及体内生成抗原受体工程化的免疫效应细胞的疗法,预期本文所述的疫苗方法特别适合,预期其仅产生少量细胞。
本文提供的方法允许仅例如通过体内生成抗原受体工程化的免疫效应细胞向患者提供少量的抗原受体工程化的免疫效应细胞如T细胞,然后在体内扩增细胞以产生治疗量。本文证明本文所述的方法甚至在治疗实体瘤或癌症中是有效的。
概述
本发明通常包括通过靶向细胞如表达诸如肿瘤抗原的抗原的患病细胞来治疗疾病。细胞可以在细胞表面表达抗原以供嵌合抗原受体(CAR)识别,或者在MHC的背景下表达抗原以供T细胞受体(TCR)识别。该方法提供选择性地根除此类表达抗原的细胞,从而使对不表达抗原的正常细胞的不利影响最小化。将经遗传修饰以表达通过结合至抗原(或其加工产物)而靶向细胞的嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的免疫效应细胞提供给对象,如通过向对象施用经遗传修饰的免疫效应细胞或在对象中生成经遗传修饰的免疫效应细胞。施用疫苗抗原(其可以是疾病相关抗原或其变体(如包含疾病相关抗原的表位的肽或蛋白)、编码其的核酸或表达抗原的细胞以提供(任选地在由适当的靶细胞表达核酸之后)用于免疫效应细胞刺激、引发和/或扩增的抗原。在患者体内被刺激、引发和/或扩增的免疫效应细胞能够识别和根除表达抗原的患病细胞。在一个实施方案中,免疫效应细胞是T细胞。在一个实施方案中,免疫效应细胞针对肿瘤或癌症。在一个实施方案中,靶细胞群体或靶组织是肿瘤细胞或肿瘤组织,特别是实体瘤的。在一个实施方案中,靶抗原是肿瘤抗原。
本文所述的方法和药剂特别可用于治疗以患病细胞表达免疫效应细胞所针对的抗原为特征的疾病。在一个实施方案中,免疫效应细胞通过嵌合抗原受体(CAR)对疫苗抗原和疾病相关抗原(当分别存在于抗原呈递细胞和患病细胞上)具有结合特异性。在一个实施方案中,免疫效应细胞通过T细胞受体(TCR)对疫苗抗原和疾病相关抗原的加工产物(当分别在抗原呈递细胞和患病细胞上呈递时)具有结合特异性。CAR是结合了对所需抗原(如,肿瘤抗原)的特异性(其优选是基于抗体的)与T细胞受体激活胞内结构域以生成表现出特异性细胞免疫活性(如,特异性抗肿瘤细胞免疫活性)的嵌合蛋白的分子。优选地,细胞可以经遗传修饰以稳定表达其表面上的抗原受体,从而赋予可以是MHC非依赖性的新抗原特异性。在一个实施方案中,将来自待治疗的对象或来自不同对象的免疫效应细胞施用至待治疗的对象。经施用的免疫效应细胞可在施用之前离体遗传修饰或在施用之后在对象中在体内遗传修饰以表达本文所述的抗原受体。在一个实施方案中,免疫效应细胞在待治疗的对象中是内源性的(因此,不施用至待治疗的对象),并在对象体内经遗传修饰以表达本文所述的抗原受体。因此,免疫效应细胞可经离体或体内遗传修饰以表达抗原受体。因此,用抗原受体进行的此类遗传修饰可以在体外进行并随后将免疫效应细胞施用至需要治疗的对象,或可在需要治疗的对象的体内进行。因此,在一方面,本发明通常包括通过靶向表达抗原的细胞如患病细胞,特别是表达肿瘤抗原的癌细胞来治疗疾病。靶细胞可以在细胞表面上表达抗原或者可以呈递抗原的加工产物。在一个实施方案中,抗原是肿瘤相关的抗原并且疾病是癌症。此类处理提供了选择性根除表达抗原的细胞,从而使对不表达抗原的正常细胞的不利影响最小化。在一个实施方案中,施用疫苗抗原、编码其的多核苷酸或表达疫苗抗原的细胞以提供(任选地在由适当的靶细胞表达多核苷酸之后)抗原用于刺激、引发和/或扩增经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,其中将免疫效应细胞靶向抗原或其加工产物并且免疫应答是对表达抗原的靶细胞群体或靶组织的免疫应答。在一个实施方案中,编码疫苗抗原的多核苷酸是RNA。在患者中刺激、引发和/或扩增的免疫效应细胞如T细胞能够识别表达抗原的细胞,导致根除患病细胞。在一个实施方案中,将疫苗抗原编码RNA靶向次级淋巴样器官。
本发明在一方面涉及用于治疗对象的方法,其包括:
(i)向对象提供亚治疗量的经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,以及
(ii)向对象施用由抗原受体靶向的抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞。
在一个实施方案中,该方法是在所述对象中诱导免疫应答的方法。在一个实施方案中,免疫应答是T细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中,免疫应答是对表达抗原的靶细胞群体或靶组织的免疫应答。在一个实施方案中,靶细胞群体或靶组织是癌细胞或癌组织。在一个实施方案中,癌细胞或癌组织是实体癌症。
本发明在另一方面涉及用于治疗患有与抗原的表达或升高的表达相关的疾病、病症或病况的对象的方法,其包括:
(i)向对象提供亚治疗量的经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,所述抗原受体靶向与疾病、病症或病况相关的抗原,或者表达与疾病、病症或病况相关的抗原的细胞,以及
(ii)向对象施用由抗原受体靶向的抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞。
在一个实施方案中,疾病、病症或病况是癌症并且与疾病、病症或病况相关的抗原是肿瘤抗原。在一个实施方案中,疾病、病症或病况是实体癌症。
本发明在另一方面涉及用于治疗患有与肿瘤抗原的表达或升高的表达相关的实体癌症的对象的方法,其包括:
(i)向对象提供经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,所述抗原受体靶向肿瘤抗原或表达肿瘤抗原的细胞,以及
(ii)向对象施用由抗原受体靶向的抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞。
在一个实施方案中,经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞以亚治疗量提供给对象。
在本文公开的所有方面的一个实施方案中,通过在对象中施用经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞或者通过在对象中生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞而向对象提供经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞。
本发明在另一方面涉及用于治疗对象的方法,其包括:
(i)在对象中生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,以及
(ii)向对象施用由抗原受体靶向的抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞。
在一个实施方案中,该方法是在所述对象中诱导免疫应答的方法。在一个实施方案中,免疫应答是T细胞介导的免疫应答。在一个实施方案中,免疫应答是对表达抗原的靶细胞群体或靶组织的免疫应答。在一个实施方案中,靶细胞群体或靶组织是癌细胞或癌组织。在一个实施方案中,癌细胞或癌组织是实体癌症。
本发明在另一方面涉及用于治疗患有与抗原的表达或升高的表达相关的疾病、病症或病况的对象的方法,其包括:
(i)在对象中生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,所述抗原受体靶向与疾病、病症或病况相关的抗原,或者表达与疾病、病症或病况相关的抗原的细胞,以及
(ii)向对象施用由抗原受体靶向的抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞。
在一个实施方案中,疾病、病症或病况是癌症并且与疾病、病症或病况相关的抗原是肿瘤抗原。在一个实施方案中,疾病、病症或病况是实体癌症。
本发明在另一方面涉及用于治疗患有与肿瘤抗原的表达或升高的表达相关的实体癌症的对象的方法,其包括:
(i)在对象中生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,所述抗原受体靶向肿瘤抗原或表达肿瘤抗原的细胞,以及
(ii)向对象施用由抗原受体靶向的抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞。
在本文公开的所有方面的一个实施方案中,经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞以亚治疗量在对象中生成。
在本文公开的所有方面的一个实施方案中,该方法是用于治疗或预防对象中的癌症的方法。在一个实施方案中,癌症是实体癌症。在一个实施方案中,癌症与由抗原受体靶向的肿瘤抗原的表达或升高的表达相关。
在本文公开的所有方面的一个实施方案中,抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
在本文公开的所有方面的一个实施方案中,编码抗原的多核苷酸是RNA。
在本文公开的所有方面的一个实施方案中,编码抗原的多核苷酸以还包含递送媒介物的颗粒、特别是脂质复合物颗粒的形式存在。
在本文公开的所有方面的一个实施方案中,经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞包含编码抗原的多核苷酸。
在本文公开的所有方面的一个实施方案中,经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞包含编码抗原受体的多核苷酸。
在本文公开的所有方面的一个实施方案中,免疫效应细胞是T细胞。
本发明在另一方面涉及试剂盒,其包含:
(i)经遗传修饰以表达抗原受体或编码抗原受体的多核苷酸的免疫效应细胞,以及
(ii)由抗原受体靶向的抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞。
在一个实施方案中,编码抗原受体的多核苷酸可用于免疫效应细胞的体内遗传修饰以表达抗原受体。
在一个实施方案中,试剂盒还包含用于在本文所述的方法中的任一种中使用试剂盒的指导材料。
在另一方面,本发明涉及本文所述的药剂和组合物,如经遗传修饰以表达抗原受体和/或抗原的免疫效应细胞,编码抗原的多核苷酸,或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞,用于治疗用途,特别是用于本文所述的方法中。
本发明的其他特征和优点将从以下详述和权利要求中显而易见。
附图简述
图1.癌胚抗原CLDN6是CAR T-细胞疗法的理想靶标。(A,B)CLDN6转录物和蛋白在人类组织的表达,如通过(A)qRT-PCR和(B)IHC分析的。(a)肾上腺,(b)输卵管,(c)肾脏,(d)肝脏,(e)甲状腺,(f)前列腺,(g)食道,(h)胃,(i)结肠,(j)大脑,(k)小脑,(l)脊髓,(m)胸腺,(n)脾脏,(o)骨髓,(p)胰腺,(q)皮肤,(r)膀胱,(s)胎盘,(t)心肌,(u)横纹肌,(v)睾丸,(w)卵巢,(x)肺,(CA1)睾丸癌,(CA2)卵巢癌和(CA3)肺癌;(C)CLDN6-CAR的设计。(D)由人CLDN6-CAR T细胞进行的裂解(E:T=20:1,技术一式三份的平均值+/-SD,右)对CLDN6表面表达水平的依赖性。用增加量的CLDN6-RNA电穿孔Colo-699-N细胞(无内源性密封蛋白表达),如通过流式细胞术分析的(左)。(E)通过流式细胞术评估的高度同源的密封蛋白在用CLDN-RNA电穿孔的Colo-699-N细胞上的表面表达(对照(ctrl):同种型抗体,左)以及通过共培养的CLDN6-CAR T细胞进行的交叉识别和裂解的分析(E:T=7:1,技术一式三份的平均值+/-SD,右)。(F)通过CLDN6和CLDN9表面表达的流式细胞术分析的人类肿瘤细胞系(上图面)与CLDN6-CAR或未转导的T细胞(E:T=10:1)共培养。共培养后,IFNγ分泌(中间的;技术一式两份的平均值+SD)以及CD4+T细胞上的激活标志物OX40和CD8+T细胞上的激活标志物4-1BB的表达(下图面),如通过流式细胞术评估的。(G)与CLDN6-CAR或未转导的T细胞共培养的CLDN6pos和CLDN6-/-PA-1肿瘤球状体(E:T=10:1)的连续杀伤,如通过GFP实时成像测量的(技术一式三份的平均值)。(H)携带皮下CLDN6pos OV90异种移植物的NSG小鼠用转导有CLDN6-CAR或GFP的人T细胞处理。分析了单个小鼠中的肿瘤和T细胞特征(左)和肿瘤生长动力学(右)。ACT:过继细胞转移。
图2.通过RNA-LPX介导的展示CAR靶标于树突细胞上来激活CAR T细胞具有严格的抗原特异性和剂量依赖性。(A)通过流式细胞术评估的CLDN6(上图面)和CLDN18.2(下图面)在用编码相应CLDN的RNA-LPX脉冲的DC上的表面表达。(B)表达密封蛋白的DC与CFSE标记的CLDN6-CAR(上图面)或CLDN18.2-CAR T细胞(下图面)的24小时共培养后通过多重测定分析的CAR T细胞的细胞因子分泌。在5天后通过流式细胞术分析CD4+和CD8+CAR T细胞的增殖(右)。指示了技术一式三份的平均值+SD;nd=未检测。(C)单次静脉内注射25μg编码CLDN6或无关对照的RNA-LPX后24小时通过流式细胞术分析的CLDN6在BALB/c小鼠的脾免疫细胞群体上的表面表达(生物学一式两份的平均值+SEM)。(D)静脉内施用RNA-LPX后48小时切除的次级淋巴样组织中的CAR T-细胞增殖(CLDN18.2作为对照)。生物学重复的平均值+/-SEM(n=5/组)。LN,淋巴结。P值通过未配对的学生t检验测定。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图3.RNA-LPX疫苗接种介导了CAR T细胞的有效体内扩增、优异的功能和记忆形成。(A-B)静脉内(i.v.)施用的编码靶标-抗原的RNA-LPX的剂量水平对CAR T细胞在体内扩增的影响。将表达荧光素酶(Luc)的Thy1.1+CLDN6-CAR T细胞(106个/动物)转移到淋巴系统耗竭的(lymphodepleted)Thy1.2+C57BL/6-白化小鼠(n=5只/组)中,并且8天后向小鼠静脉内注射总共40μg RNA-LPX,但滴定了指定量的CLDN6。(A,左)通过生物发光成像(BLI)确定的CAR T-细胞扩增的动力学和(A,右)CAR T细胞的扩增指数,以及(B)通过流式细胞术确定的ACT后第11天的外周血中表达KLRG1-和CD62L-的内源性(Thy1.2+)和转移的(Thy1.1+)CD8+T细胞的频率(平均值±SEM)。(C)反复静脉内给药编码靶标-抗原的RNA-LPX对CAR T细胞在体内扩增的影响。转移到淋巴系统耗竭的Thy1.2+C57BL/6-白化小鼠中的不同剂量水平的表达Luc的Thy1.1+CLDN6-CAR T细胞的BLI动力学。用20μg CLDN6 RNA-LPX两次接种最低CAR T-细胞剂量组(103)中的小鼠(n=6),而所有其他组接受了盐水(n=4只/组)。处理组的代表性成像(左)和平均值+/-SEM(中间的)。通过流式细胞术测定的单独小鼠的外周血中的Thy1.1+群体(右)。(D)在第二次疫苗接种(n=5只/处理组/时间点)后三天(时间点a)和七天(时间点b),与从对照-接种疫苗的小鼠分选的高剂量CAR T细胞(7.5x106CAR-T+CLDN18.2-LPX)相比,来自CLDN6-LPX接种疫苗接种的小鼠的低剂量CAR T细胞(1.5x106CAR-T+CLDN6-LPX)的离体细胞毒性活性。分选但汇集的CAR T细胞/处理组与存在的人CLDN6-转导的B16小鼠黑色素瘤细胞或WT对照以指定的E:T比共培养20小时(技术一式三份的平均值±SD)。(E)将表达Luc/GFP的Thy1.1+CLDN6-CAR T细胞转移到淋巴系统耗竭的Thy1.2+C57BL/6-白化小鼠(n=2-3只/组)中,然后用RNA-LPX重复疫苗接种(OvaI作为对照)。通过BLI获得的CAR T细胞动力学(左,处理组的平均值±SEM)。处理前样品(时间点a,ACT后第7天)和第3次RNA-LPX处理后(时间点b,ACT后第26天)(中间的)内的外周血中的GFP+CAR T-细胞群体频率。第4次处理后31天,CD8+T细胞群体中记忆CAR T细胞的频率(右;时间点c;ACT后第80天)。由配对(C)和未配对的双尾学生t检验(D,E)确定的P-值。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图4.通过RNA-LPX疫苗接种,使亚治疗的CAR T-细胞剂量对大肿瘤具有抗肿瘤有效性。(A,B)具有大的确定肿瘤的小鼠是淋巴系统耗竭的,用同系未转导的(non-transd.)或CLDN-CAR重定向的小鼠T细胞处理,然后单次静脉内施用CLDN或对照RNA-LPX。测定了肿瘤生长(平均值±SEM,左)和存活(右)。(A)在用人CLDN6转导的荷瘤LL/2-LLc1肿瘤的C57BL/6小鼠中测试CLDN6-CAR(n=9-10只/组;处理起始时肿瘤尺寸为209mm3),以及(B)荷载小鼠CLDN18.2-转导的CT26的BALB/c小鼠中的CLDN18.2-CAR(n=9只/组;处理起始时肿瘤尺寸为77mm3)。(C)用CLDN-LPX接种两次的初始NSG小鼠中的人Luc-表达CLDN特异性CART细胞。通过测量脾脏的BLI信号来分析CAR T-细胞扩增(2-3只小鼠/组的平均值+或–SEM)。(D)具有OV90异种移植肿瘤(处理起始时肿瘤尺寸是60mm3)的NSG小鼠用亚治疗剂量的人CLDN6-CAR(105个/动物)或未转导的T细胞处理,然后每周3次重复编码CLDN6或对照的RNA-LPX。肿瘤生长曲线(9-10只小鼠/组的平均值±SEM,左)和如通过流式细胞术评估的外周血中的第3次RNA-LPX处理后的代表性CAR T-细胞频率(右)。(E)通过CARVac在治疗窗口内维持循环CAR T细胞的频率。P值通过双向ANOVA与图基多重比较检验(Tukey’s multiple-comparisons test)测定(A左,B左,D左)。在计算中考虑了从ACT直到至少对照组结束的时间点。存活益处通过对数秩检验确定(A右,B右)。ns=不显著,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图5:抗原-RNA-LPX的重复处理导致OT1-TCR修饰的T细胞的体内扩增
2.5Gy辐照的(XRAD320)C57BL/6BrdCrHsd-Tyrc小鼠(n=2-3只/组)静脉内植入了5x106个OT1-TCR-Luc-GFP转导的C57Bl/6-Thy1.1+T细胞。ACT后8天,小鼠接受了编码OvaI或hCLDN6(ctrl RNA)的mRNA脂质复合物疫苗接种(RNA-LPX;20μg,静脉内)和随后的IL-2/7支持物(1μg/细胞因子mRNA/小鼠,腹膜内(i.p.))。在ACT后第15天和第22天重复处理。在ACT后第7天(基线)直至第25天,进行连续的生物发光成像和外周血分析以监测转移的T细胞的扩增和富集。A)显示了在存在指定的核苷-修饰的-配制的细胞因子RNA的情况下,使用OvaI-RNA-LPX或对照RNA-LPX在扩增轮期间和之后的体内生物发光的定量(平均值+或-s.e.m.)。垂直虚线指示RNA-LPX/细胞因子处理的时间点。B)在ACT之后第7天(基线)、第11天(第1次疫苗接种后3天)、第18天(第2次疫苗接种后3天)和第25天(第3次疫苗接种后3天),在一个示例性小鼠/处理组的外周血中进行转移的Thy1.1+T细胞的流式细胞术分析。直方图中的数字指示表达GFP的Thy1.1+T细胞的平均荧光强度(MFI)。GFP已被用作OT1-TCR转导的T细胞的替代标志物。LPX:脂质复合物;Luc:有效的萤火虫荧光素酶。
详述
尽管下文详细描述了本公开内容,但应理解,本公开内容不限于本文所述的特定方法、方案和试剂,因为这些可以改变。还应理解,本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的,并不旨在限制本公开内容的范围,其将仅由所附权利要求限制。除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
优选地,本文使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.编辑,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中所述定义。
除非另有说明,否则本公开内容的实践将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法,其在本领域的文献中进行了解释(参见,如MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,J.Sambrook等人编辑,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中,将描述本公开内容的要素。这些要素与特定实施方案一起列出,然而,应当理解,它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。各种描述的实施例和实施方案不应被解释为将本公开内容仅限于明确描述的实施方案。该描述应当被理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的公开要素组合的实施方案。此外,除非上下文另有说明,否则所有描述的要素的任何排列和组合都应被视为由本描述公开。
术语“约”意指大约或几乎,并且在一个实施方案中,在本文所示的数值或范围的上下文中,意指所列举或要求保护的数值或范围的±20%、±10%、±5%或±3%。
除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾,否则在描述本公开内容的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”和“该”以及类似的参考将被解释为涵盖单数和复数。本文中数值范围的叙述仅旨在用作单独引用落入该范围内的每个单独值的速记方法。除非在本文中另有说明,否则每个单独的值都并入说明书中,就好像它在本文中被单独叙述一样。除非本文另有说明或另外与上下文明显矛盾,否则本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行。本文所提供的任何和所有实例或示例性语言(如,“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本公开内容并且不对权利要求的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本公开内容的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
除非另有明确规定,否则术语“包括/包含(comprising)”在本文件的上下文中用于指示除了“包括/包含”引入的列表的成员之外,还可以任选地存在其他成员。然而,作为本公开内容的具体实施方案考虑,术语“包括/包含”涵盖不存在其他成员的可能性,即,为了该实施方案的目的,“包括/包含”应理解为具有“由...组成”的含义。
在本说明书的整个文本中引用了几个文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等),无论是在上文还是在下文,在此通过引用以其整体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本公开内容无权先于此类公开内容。
在下文中,将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另有说明,否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语都具有其领域公认的含义。
定义
如本文所用的术语如“减少”、“降低”、“抑制”或“损害”涉及水平、如结合水平的总体降低或导致总体降低的能力,优选为5%或更大、10%或更大、20%或更大,更优选50%或更大,并且最优选75%或更大。
术语如“增加”、“增强”或“超过”优选涉及增加或增强约至少10%、优选至少20%、优选至少30%、更优选至少40%、更优选至少50%,甚至更优选至少80%,并且最优选至少100%、至少200%、至少500%,或甚至更多。
根据本公开内容,术语“肽”包括寡肽和多肽,并且是指包含约2个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个、并且至多约50、约100或约150个经由肽键彼此连接的连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”或“多肽”是指大肽,特别是具有至少约151个氨基酸的肽,但术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中通常用作同义词。
“治疗性蛋白”当以治疗有效量提供给对象时,对对象的病况或疾病状态具有积极或有利的作用。在一个实施方案中,治疗性蛋白具有治愈性或姑息性特性并且可以被施用以改善、缓解、缓和、逆转疾病或病症的一种或多种症状、延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或者减轻疾病或病症的一种或多种症状的严重程度。治疗性蛋白可以具有预防特性并且可用于延迟疾病的发作或者减轻此类疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白”包括完整的蛋白质或肽,并且也可以指其治疗活性片段。它还可以包括蛋白质的治疗活性变体。治疗活性蛋白质的实例包括但不限于用于疫苗接种的抗原和细胞因子。
关于氨基酸序列(肽或蛋白质)的“片段”涉及氨基酸序列的一部分,即代表在N-末端和/或C-末端缩短的氨基酸序列的序列。例如通过翻译缺少开放阅读框3’-端的截短的开放阅读框,可以获得在C-末端缩短的片段(N-末端片段)。例如通过翻译缺少开放阅读框5’端的截短的开放阅读框,可以获得在N-末端缩短的片段(C-末端片段),只要截短的开放阅读框包含用于启动翻译的起始密码子。氨基酸序列的片段包括如来自氨基酸序列的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
本文的“变体”或“变体蛋白”或“变体多肽”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于野生型蛋白的蛋白。亲本多肽可以是天然存在的或野生型(WT)多肽,或者可以是野生型多肽的经修饰的形式。优选地,变体多肽与亲本多肽相比具有至少一个氨基酸修饰,如与亲本相比,1至约20个氨基酸修饰并且优选1个至约10个或1个至约5个氨基酸修饰。
如本文所用的“亲本多肽”、“亲本蛋白”、“前体多肽”或“前体蛋白”意指未修饰的多肽,其随后经修饰以生成变体。亲本多肽可以是野生型多肽、或者野生型多肽的变体或工程化形式。
本文的“野生型”或“WT”或“初始(native)”意指天然存在的氨基酸序列,包括等位变异。野生型蛋白质或多肽具有未被有意修饰的氨基酸序列。
为了本公开内容的目的,氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”包括所有剪接变体、翻译后修饰的变体、构象、同种型和物种同源物,特别是由细胞天然表达的那些。术语“变体”特别包括氨基酸序列的片段。
氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下,将一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列中的特定位点,尽管也可以适当筛选所得产物的随机插入。氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸(如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸)的氨基-和/或羧基末端融合物。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或多个氨基酸,如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白质的任何位置处。包含蛋白质N-末端和/或C-末端处缺失的氨基酸缺失变体也称为N-末端和/或C-末端截短变体。氨基酸取代变体的特征在于序列中的至少一个残基被去除,而另一个残基被插入其位置。优先考虑位于同源蛋白或肽之间不保守的氨基酸序列位置的修饰和/或用具有相似特性的其他氨基酸替换氨基酸。优选地,肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化,即类似带电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守的氨基酸改变涉及取代在其侧链中相关的氨基酸家族中的一个。天然存在的氨基酸一般分为四个家族:酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸),碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸),非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香族氨基酸。在一个实施方案中,保守氨基酸取代包括以下组内的取代:
甘氨酸、丙氨酸;
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸;
天冬氨酸、谷氨酸;
天冬酰胺、谷氨酰胺;
丝氨酸、苏氨酸;
赖氨酸、精氨酸;和
苯丙氨酸、酪氨酸。
优选地,给定氨基酸序列和作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性,优选同一性的程度将是至少约60%、65%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。相似性或同一性程度优选地针对氨基酸区域给出,其为参考氨基酸序列的全长的至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。例如,如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成,则相似性或同一性程度优选地针对至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸、优选连续氨基酸给出。在优选的实施方案中,相似性或同一性程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性,优选序列同一性的比对可以用本领域已知的工具完成,优选使用最佳序列比对,例如,使用Align,使用标准设置,优选EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、GapExtend 0.5。
“序列相似性”表示相同的或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两条氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同氨基酸的百分比。
术语“同一性百分比”旨在表示在最佳比对后获得的待比较的两条序列之间相同的氨基酸残基的百分比,该百分比是纯统计的并且两条序列之间的差异随机分布并且在它们的整个长度上。两条氨基酸序列之间的序列比较通常通过在对这些序列进行最佳比对后对其进行比较来进行,所述比较通过区段或通过“比较窗口”进行以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。除了手动之外,还可以通过Smith和Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法的方式、通过Neddleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法的方式、通过Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 85,2444的相似性搜索方法的方式或通过使用这些算法的计算机程序(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA于Wisconsin Genetics Software Package中,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.)的方式产生用于比较的序列的最佳比对。
通过确定被比较的两条序列之间相同位置的数量,将该数量除以比较的位置的数量并将获得的结果乘以100来计算同一性百分比,从而获得这两条序列之间的同一性百分比。
根据本公开内容,同源氨基酸序列表现出至少40%,特别是至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%并且优选至少95%、至少98或至少99%的氨基酸残基同一性。
本文所述的氨基酸序列变体可以由技术人员容易地制备,例如通过重组DNA操作。例如Sambrook等人(1989)中详细描述了用于制备具有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操作。此外,本文所述的肽和氨基酸变体可借助已知的肽合成技术,诸如例如通过固相合成和类似方法容易地制备。
在一个实施方案中,氨基酸序列(肽或蛋白)的片段或变体优选是“功能片段”或“功能变体”。术语氨基酸序列的“功能片段”或“功能变体”涉及表现出与其源自的氨基酸序列的那些功能特性相同或类似的一种或多种功能特性的任何片段或变体,即,它在功能上是等价的。关于抗原,一种特定功能是由片段或变体源自的氨基酸序列展示的一种或多种免疫刺激活性和/或结合片段或变体源自的氨基酸序列结合的受体。如本文所用的术语“功能片段”或“功能变体”特别是指变体分子或序列,其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或多个氨基酸的氨基酸序列并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或多种功能,如结合靶分子。在一个实施方案中,亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不会显著影响或改变分子或序列的结合特性。在不同的实施方案中,功能片段或功能变体的结合可以降低但仍然显著存在,如,功能变体的结合可以是亲本分子或序列的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。然而,在其他实施方案中,与亲本分子或序列相比,可以增强功能片段或功能变体的结合。
“源自”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一条氨基酸序列的来源。优选地,源自特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。源自特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如,本领域普通技术人员将理解,可以改变适用于本文的抗原,使得它们在序列上不同于其源自的天然存在的或初始的序列,同时保留初始序列的所需活性。
如本文所用,“指导材料”或“说明书”包括出版物、记录、图表或可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的任何其他表达媒介。例如,本发明的试剂盒的指导材料可以贴在容纳本发明组合物的容器上或与容纳组合物的容器一起运输。可替代地,指导材料可以与容器分开运输,目的是让接收者合作使用指导材料和组合物。
“分离的”意指从天然状态改变或去除。例如,天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”,但与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在,或可以存在于非天然环境中,诸如例如宿主细胞。
在本发明的上下文中,术语”重组”意指“通过遗传工程制备”。优选地,“重组对象”,如在本发明上下文中的重组细胞不是天然存在的。
如本文所用的术语“天然存在的”是指可以在自然界中存在物体的事实。例如,存在于有机体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离出来并且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
如本文所用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的,它能够感染非分裂细胞;它们可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中,因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV是慢病毒的所有实例。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
如本文所用,术语“特异性结合”意指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中或对象中的其他分子的分子如抗体或CAR。例如,特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个其他物种的抗原。但是,此类跨物种反应性本身并不会改变作为特异性的抗体的分类。在另一个实例中,特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而,此类交叉反应性本身并不会改变作为特异性的抗体的分类。在一些情况下,术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用,以意指该相互作用取决于化学物质上特定结构(如,抗原决定簇或表位)的存在;例如,抗体识别并结合特定的蛋白质结构,而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性,则在含有标记“A”和抗体的反应中,含有表位A(或游离、未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
术语“遗传修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸,特别是RNA引入到细胞中。出于本发明的目的,术语“转染”还包括将核酸引入细胞或由此类细胞摄取核酸,其中该细胞可以存在于对象如患者中。因此,根据本发明,用于转染本文所述核酸的细胞可以存在于体外或体内,如该细胞可以形成患者的器官、组织和/或有机体的一部分。根据本发明,转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的某些应用,如果转染的遗传物质只是瞬时表达就足够了。RNA可以转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。由于转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中,因此外源核酸会通过有丝分裂被稀释或降解。允许核酸游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果希望转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中,则必须发生稳定的转染。此类稳定的转染可以通过使用基于病毒的系统或基于转座子的系统进行转染来实现。通常,经遗传修饰以表达抗原受体的细胞用编码抗原受体的核酸稳定转染,而编码抗原的核酸通常瞬时转染到细胞中。
免疫效应细胞
与本发明结合使用并且其中可以引入编码抗原受体的核酸(DNA或RNA)的细胞特别包括免疫效应细胞,如具有溶解潜能的细胞,特别是淋巴样细胞,并且优选是T细胞,特别是细胞毒性淋巴细胞,优选选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。激活后,这些细胞毒性淋巴细胞中的每一种都会触发靶细胞的破坏。例如,细胞毒性T细胞通过以下手段中的任一种或两种触发靶细胞的破坏。首先,激活后,T细胞释放细胞毒素,如穿孔素、颗粒酶和粒溶素。穿孔素和粒溶素在靶细胞中形成孔,颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发半胱天冬酶级联反应,其诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次,可以经由T细胞和靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用来诱导凋亡。与本发明结合使用的细胞优选为自体细胞,尽管可以使用异源细胞或同种异体细胞。
本发明的上下文中的术语“效应子功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能,其导致例如杀伤诸如肿瘤细胞的患病细胞,或抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展,包括抑制肿瘤播散和转移。优选地,本发明上下文中的效应子功能是T细胞介导的效应子功能。此类功能包括在辅助T细胞(CD4+T细胞)的情况下释放细胞因子和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞,并且在CTL的情况下消除细胞,即以抗原表达为特征的细胞,例如经由凋亡或穿孔素介导的细胞裂解,产生诸如IFN-γ和TNF-α的细胞因子,以及表达抗原的靶细胞的特异性溶细胞杀伤。
在本发明的上下文中的术语“免疫效应细胞”或“免疫反应性细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应子功能的细胞。在一个实施方案中,“免疫效应细胞”能够结合抗原,如在细胞上在MHC背景下呈递的抗原或者在细胞表面上表达的抗原,并且介导免疫应答。例如,免疫效应细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、天然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地,在本发明的上下文中,“免疫效应细胞”是T细胞,优选CD4+和/或CD8+T细胞。根据本发明,术语“免疫效应细胞”还包括在适合刺激下可以成熟为免疫细胞(如T细胞,特别是T辅助细胞或溶细胞性T细胞)的细胞。免疫效应细胞包括CD34+造血干细胞、未成熟和成熟的T细胞及未成熟和成熟的B细胞。当暴露于抗原时,T细胞前体向溶细胞性T细胞的分化类似于免疫系统的克隆选择。
优选地,“免疫效应细胞”以某种程度的特异性识别抗原,特别是如果在MHC的背景下呈递或存在于患病细胞如癌细胞的表面上。优选地,所述识别使识别抗原的细胞能够应答或反应。如果细胞是辅助T细胞(CD4+T细胞),则此种响应性或反应性可能涉及细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的激活。如果细胞是CTL,则此类响应性或反应性可能涉及细胞(即以抗原表达为特征的细胞)的消除,例如,经由凋亡或穿孔素介导的细胞裂解。根据本发明,CTL响应性可以包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生、激活标志物如CD44和CD69的上调以及表达抗原的靶细胞的特异性溶细胞杀伤。也可以使用准确指示CTL响应性的人工报告子来确定CTL响应性。此类识别抗原并且具有响应性或反应性的CTL在本文中也称为“抗原响应性CTL”。
在一个实施方案中,免疫效应细胞是表达CAR的免疫效应细胞。在一个实施方案中,免疫效应细胞是表达TCR的免疫效应细胞。
根据本发明要使用的免疫效应细胞可表达内源性抗原受体如T细胞受体或B细胞受体,或者可缺乏内源性抗原受体的表达。
“淋巴样细胞”是任选地在合适的修饰后,如在抗原受体如TCR或CAR转移后,能够产生诸如细胞免疫应答的免疫应答的细胞,或此类细胞的前体细胞,并且包括淋巴细胞,优选T淋巴细胞、淋巴母细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是本文所述的免疫效应细胞。优选的淋巴样细胞是可经修饰以在细胞表面上表达抗原受体的T细胞。在一个实施方案中,淋巴样细胞缺乏T细胞受体的内源性表达。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中互换使用并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL,CD8+T细胞),其包括溶细胞性T细胞。术语“抗原特异性T细胞”或类似的术语涉及识别T细胞所靶向的抗原并优选发挥T细胞的效应子功能的T细胞。如果细胞杀伤表达抗原的靶细胞,则认为T细胞对抗原具有特异性。T细胞特异性可以使用多种标准技术中的任一种来评价,例如在铬释放测定或增殖测定中。可替代地,可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成。
T细胞属于被称为淋巴细胞的一组白细胞,并且在细胞介导的免疫中起核心作用。它们可以通过在其细胞表面存在一种称为T细胞受体(TCR)的特殊受体来与其他淋巴细胞类型(如B细胞和自然杀伤细胞)区分开来。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了几个不同的T细胞亚群,每个亚群具有不同的功能。
T辅助细胞在免疫过程中协助其他白细胞,包括B细胞成熟为浆细胞以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞,以及其他功能。这些细胞也被称为CD4+T细胞,因为它们在其表面上表达CD4糖蛋白。当在抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子向辅助T细胞呈递肽抗原时,所述辅助T细胞被激活。一旦被激活,它们会迅速分裂并分泌称为细胞因子的小蛋白,所述小蛋白调控或协助主动免疫应答。
细胞毒性T细胞会破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞,并且还与移植排斥有关。这些细胞也被称为CD8+T细胞,因为它们在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与几乎存在于身体的每个细胞的表面上的MHC I类相缔合的抗原来识别它们的靶标。
“调节性T细胞”或“Treg”是调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性和预防自身免疫疾病的T细胞亚群。Treg是免疫抑制性的,并且通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。Treg表达生物标志物CD4、FoxP3和CD25。
如本文所用,术语“初始T细胞”是指成熟T细胞,其与激活的或记忆T细胞不同,在外周没有遇到它们的同源抗原。初始T细胞的特征通常是L-选择素(CD62L)的表面表达、不存在激活标志物CD25、CD44或CD69以及不存在记忆CD45RO同种型。
如本文所用,术语“记忆T细胞”是指先前已经遇到其同源抗原并对其响应的T细胞的亚组或亚群。在第二次遇到抗原时,记忆T细胞可以繁殖以产生比免疫系统第一次对抗原作出响应的更快和更强的免疫应答。记忆T细胞可以是CD4+或CD8+并且通常表达CD45RO。
根据本发明,术语“T细胞”还包括可通过合适的刺激而成熟为T细胞的细胞。
大多数T细胞具有以几种蛋白质的复合物存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条单独的肽链组成,所述肽链由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生并被称为α-和β-TCR链。γδT细胞(伽马(gamma)德尔塔(delta)T细胞)代表T细胞的小亚组,其表面具有独特的T细胞受体(TCR)。然而,在γδT细胞中,TCR由一条γ链和一条δ链组成。该组的T细胞比αβT细胞不常见得多(总T细胞的2%)。
所有T细胞源自骨髓中的造血干细胞。来源于造血干细胞的造血祖细胞出现于胸腺并通过细胞分裂扩增以产生大的未成熟胸腺细胞群体。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8,因此被归类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们在其发育过程中的进展,它们变成双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+),并且最后成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞,然后其从胸腺释放到外周组织。
通常可以使用标准程序在体外或离体制备T细胞。例如,可以使用可商购获得的细胞分离系统从哺乳动物如患者的骨髓、外周血或者骨髓或外周血的一部分中分离T细胞。可替代地,T细胞可以来源于相关或不相关的人类、非人类动物、细胞系或培养物。例如,包含T细胞的样品可以是外周血单个核细胞(PBMC)。
如本文所用,术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指由CD56或CD16的表达和不存在T细胞受体定义的外周血淋巴细胞亚组。如本文所提供的,NK细胞也可以从干细胞或祖细胞分化而来。
核酸
如本文所用,术语“多核苷酸”或“核酸”旨在包括DNA和RNA,如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生并且化学合成的分子。核酸可以是单链的或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVT RNA)或合成RNA。根据本发明,多核苷酸优选是分离的。
核酸可包含在载体中。如本文所用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体,包括质粒载体,粘粒载体,噬菌体载体如λ噬菌体,病毒载体如逆转录病毒、腺病毒或杆状病毒载体,或人工染色体载体如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包括质粒以及病毒载体,并且通常含有所需的编码序列和适当的DNA序列,该序列对于在特定宿主有机体(如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在体外表达系统中表达可操作连接的编码序列是必需的。克隆载体通常用于工程化和扩增某些所需的DNA片段,并且可能缺乏表达所需DNA片段所需的功能序列。
在本发明的所有方面的一个实施方案中,核酸如编码抗原受体的核酸或编码疫苗抗原的核酸在经治疗的对象的细胞中表达以提供抗原受体或疫苗抗原。在本发明的所有方面的一个实施方案中,核酸在对象的细胞中瞬时表达。因此,在一个实施方案中,核酸不整合至细胞的基因组中。在本发明的所有方面的一个实施方案中,核酸是RNA,优选体外转录的RNA。在本发明的所有方面的一个实施方案中,抗原受体的表达在细胞表面处。在本发明的所有方面的一个实施方案中,疫苗抗原的表达在细胞表面处。在本发明的所有方面的一个实施方案中,疫苗抗原在MHC的背景下表达并呈递。
在本发明的所有方面的一个实施方案中,编码疫苗抗原的核酸在待治疗的对象的细胞如抗原呈递细胞中表达以提供疫苗抗原以用于由经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞结合,所述结合导致经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。
本文所述的核酸可以是重组的和/或分离的分子。
在本公开内容中,术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中,RNA含有所有或大部分的核糖核苷酸残基。如本文所用,“核糖核苷酸”是指在β-D-核糖呋喃糖基的2’-位具有羟基基团的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA,以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的经修饰的RNA。此类改变可以是指将非核苷酸材料添加到内部RNA核苷酸或RNA的末端。本文还考虑了RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸,如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容,这些改变的RNA被认为是天然存在的RNA的类似物。
在本公开内容的某些实施方案中,RNA是信使RNA(mRNA),其涉及编码肽或蛋白质的RNA转录物。如本领域所确立的,mRNA通常含有5’非翻译区(5’-UTR)、肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。在一些实施方案中,RNA通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中,mRNA是使用DNA模板通过体外转录产生的,其中DNA是指含有脱氧核糖核苷酸的核酸。
在一个实施方案中,RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)并且可以通过适当的DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸,特别是cDNA并将其引入适当的用于体外转录的载体来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。
在一个实施方案中,RNA可以具有经修饰的核糖核苷酸。经修饰的核糖核苷酸的实例包括但不限于5-甲基胞苷、假尿苷和/或1-甲基-假尿苷。
在一些实施方案中,根据本公开内容的RNA包含5’-帽。在一个实施方案中,本公开内容的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。在一个实施方案中,RNA可通过5’-帽类似物修饰。术语“5’-帽”是指在mRNA分子的5’-末端处存在的结构,并且通常由经由5’至5’三磷酸键与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中,该鸟苷在7-位置处甲基化。提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA可以通过体外转录实现,其中5’-帽共转录表达到RNA链中,或者可以使用加帽酶在转录后连接至RNA。
在一些实施方案中,RNA的结构单元帽(building block cap)是m2 7,3’-OGppp(m1 2 ’-O)ApG(有时也称为m2 7,3’OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG),其具有以下结构:
以下是示例性Cap1 RNA,其包含RNA和m2 7,3’OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG:
以下是另一种示例性Cap1 RNA(无帽类似物):
在一些实施方案中,使用“Cap0”结构修饰RNA,在一个实施方案中,帽类似物抗反向帽(ARCA帽(m2 7,3’OG(5’)ppp(5’)G))具有以下结构:
以下是示例性Cap0 RNA,其包含RNA和m2 7,3’OG(5’)ppp(5’)G:
在一些实施方案中,使用具有以下结构的帽类似物β-S-ARCA(m2 7,2’OG(5’)ppSp(5’)G)生成“Cap0”结构:
以下是示例性Cap0 RNA,其包含β-S-ARCA(m2 7,2’OG(5’)ppSp(5’)G)和RNA:
一个特别优选的帽包括5’-帽m2 7,2’OG(5’)ppSp(5’)G。
在一些实施方案中,根据本公开内容的RNA包含5’-UTR和/或3’-UTR。术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中被转录但不翻译成氨基酸序列的区域,或RNA分子如mRNA分子中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框的5’(上游)(5’-UTR)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’-UTR)。5’-UTR(如果存在)位于蛋白编码区的起始密码子的上游的5’末端。5’-UTR位于5’-帽(如果存在)的下游,如与5’-帽直接相邻。3’-UTR(如果存在)位于蛋白质编码区的终止密码子下游的3’末端,但术语“3’-UTR”优选不包括poly(A)尾。因此,3’-UTR位于poly(A)序列(如果存在)的上游,如与poly(A)序列直接相邻。
在一些实施方案中,根据本公开内容的RNA包含3’-poly(A)序列。
如本文所用,术语“poly-A尾”或“poly-A序列”是指通常位于RNA分子3’-末端的腺苷酸残基的不间断或间断序列。poly-A尾或poly-A序列是本领域技术人员已知的,并且可以在本文所述的RNA中的3’-UTR之后。不间断的poly-A尾以连续的腺苷酸残基为特征。实际上,不间断的poly-A尾是典型的。本文公开的RNA可以具有在转录后通过模板非依赖性RNA聚合酶连接至RNA的游离3’-末端的poly-A尾或由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的poly-A尾。
已经证明,约120个A核苷酸的poly-A尾对转染的真核细胞中的RNA水平以及从poly-A尾的上游(5’)存在的开放阅读框翻译的蛋白质的水平具有有益影响(Holtkamp等人,2006,Blood,第108卷,第4009-4017页)。
poly-A尾可以具有任何长度。在一些实施方案中,poly-A尾包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200或至多150个A核苷酸,并且特别是约120个A核苷酸。在本申请的上下文中,“基本上由……组成”意指poly-A尾中的大多数核苷酸,通常poly-A尾中至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的按数量计的核苷酸是A核苷酸,但允许剩余的核苷酸是除A核苷酸之外的核苷酸,如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在本申请的上下文中,“由……组成”意指poly-A尾中的所有核苷酸,即poly-A尾中的100%按数量计的核苷酸,是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。
在一些实施方案中,基于在与编码链互补的链中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板,在RNA转录期间,如在制备体外转录的RNA期间,连接poly-A尾。编码poly-A尾的DNA序列(编码链)被称为poly(A)盒。
在一些实施方案中,存在于DNA编码链中的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成,但被四个核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。此类随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。此类盒公开于在此通过引用并入的WO 2016/005324 A1中。WO 2016/005324 A1中公开的任何poly(A)盒均可用于本发明中。基本上由dA核苷酸组成但被具有四个核苷酸(dA、dC、dG、dT)的均等分布并且具有如5至50个核苷酸长度的随机序列中断的poly(A)盒显示,在DNA水平上,质粒DNA在大肠杆菌中的持续增殖,并且在RNA水平上仍然与关于支持涵盖的RNA稳定性和翻译效率有益特性相关。因此,在一些实施方案中,本文所述的RNA分子中含有的poly-A尾基本上由A核苷酸组成,但被四个核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。此类随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。
在一些实施方案中,除了A核苷酸之外,没有核苷酸在其3’-末端侧接poly-A尾,即poly-A尾在其3’-末端没有被A以外的核苷酸掩盖或跟随。
在一些实施方案中,poly-A尾可包含至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200或至多150个核苷酸。在一些实施方案中,poly-A尾可基本上由至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200或至多150个核苷酸组成。在一些实施方案中,poly-A尾可由至少20、至少30、至少40、至少80、或至少100且至多500、至多400、至多300、至多200或至多150个核苷酸组成。在一些实施方案中,poly-A尾包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中,poly-A尾包含约150个核苷酸。在一些实施方案中,poly-A尾包含约120个核苷酸。
根据本公开内容,疫苗抗原优选以单链、5’-加帽的mRNA施用,其在进入抗原呈递细胞(APC)后被翻译成相应的蛋白质。优选地,RNA含有针对RNA在稳定性和翻译效率方面的最大功效而优化的结构元件(5’-帽、5’-UTR、3’-UTR、poly(A)-尾)。
在一个实施方案中,β-S-ARCA(D1)用作RNA的5’-末端的特定加帽结构。在一个实施方案中,5’-UTR序列源自人α-球蛋白mRNA。在一个实施方案中,将源自人β-球蛋白mRNA的两个重复的3’-UTR置于编码序列与poly(A)-尾之间,以确保更高的最大蛋白质水平和延长的mRNA持久性。在一个实施方案中,使用长度测量为110个核苷酸的poly(A)-尾,其由一段30个腺苷残基,随后是10个核苷酸接头序列和另外70个腺苷残基组成。这种poly(A)-尾序列经设计以增强树突细胞中的RNA稳定性和翻译效率。
RNA优选作为脂质复合物颗粒施用,所述脂质复合物颗粒优选包含DOTMA和DOPE,如下文进一步描述的。此类颗粒优选通过全身施用,特别是通过静脉内施用来施用。
在本公开内容的上下文中,术语“转录”涉及一种过程,其中DNA序列中的遗传密码被转录成RNA。随后,RNA可以被翻译成肽或蛋白质。
关于RNA,术语“表达”或“翻译”涉及细胞核糖体中的过程,mRNA链通过该过程指导氨基酸序列的组装以制备肽或蛋白质。
“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列(如基因、cDNA或mRNA)用作在生物过程中合成具有确定的核苷酸序列的其他聚合物和大分子(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的模板的固有特性,以及由此产生的生物学特性。因此,如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质,则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码此基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
根据本公开内容,术语“RNA编码”意指RNA,如果存在于适当的环境中,如在靶组织的细胞内,可以指导氨基酸的组装以在翻译过程期间产生其编码的肽或蛋白质。在一个实施方案中,RNA能够与允许翻译肽或蛋白质的细胞翻译机器相互作用。细胞可以在细胞内(如在细胞质和/或细胞核中)产生编码的肽或蛋白质,可以分泌编码的肽或蛋白质,或者可以在表面上产生它。
如本文所用,“内源性”是指来自有机体、细胞、组织或系统或者在有机体、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。
如本文所用,术语“外源性”是指从有机体、细胞、组织或系统引入或者在有机体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。
如本文所用的术语“表达”被定义为特定的核苷酸序列的转录和/或翻译。表达可以是瞬时的或稳定的。根据本发明,术语“表达”还包括“异常表达”或“反常表达”。
如本文所用,术语“连接”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个要素或组件或结构域连接在一起。
细胞因子
本文所述的方法可以包括向对象提供一种或多种细胞因子,如通过向对象施用一种或多种细胞因子、编码一种或多种细胞因子的多核苷酸或表达一种或多种细胞因子的宿主细胞。
如本文所用的术语“细胞因子”包括天然存在的细胞因子及其功能变体(包括天然存在的细胞因子的片段及其变体)。一种特别优选的细胞因子是IL2。
细胞因子是一类在细胞信号传导中很重要的小蛋白(~5–20kDa)。它们的释放会影响它们周围细胞的行为。细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子,但通常不包括激素或生长因子(尽管术语中有一些重叠)。细胞因子由多种细胞产生,包括免疫细胞,如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞,以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。给定的细胞因子可以由多于一种类型的细胞产生。细胞因子通过受体发挥作用,并且在免疫系统中尤为重要;细胞因子调节体液免疫应答和基于细胞的免疫应答之间的平衡,并且它们调控特定细胞群体的成熟、生长和响应性。一些细胞因子以复杂的方式增强或抑制其他细胞因子的作用。
IL2
白介素-2(IL2)是一种诱导抗原激活的T细胞增殖并刺激自然杀伤(NK)细胞的细胞因子。IL2的生物活性是通过跨细胞膜的以下三个多肽亚基的多亚基IL2受体复合物(IL2R)介导的:p55(IL2Rα,α亚基,在人类中也称为CD25)、p75(IL2Rβ,β亚基,在人类中也称为CD122)和p64(IL2Rγ,γ亚基,在人类中也称为CD132)。T细胞对IL2的响应取决于多种因素,包括:(1)IL2的浓度;(2)细胞表面IL2R分子的数量;和(3)由IL2占据的IL2R的数量(即IL2和IL2R之间的结合相互作用的亲和力(Smith,"Cell Growth Signal Transduction isQuantal"In Receptor Activation by Antigens,Cytokines,Hormones,and GrowthFactors 766:263-271,1995))。IL2:IL2R复合物在配体结合后被内化,并且不同的组分进行差异分类。当作为静脉内(i.v.)团注施用时,IL2具有快速的全身清除率(初始清除期的半衰期为12.9分钟,随后是较慢的清除期,半衰期为85分钟)(Konrad等人,Cancer Res.50:2009-2017,1990)。
在真核细胞中,人IL2被合成为153个氨基酸的前体多肽,从中去除20个氨基酸以生成成熟的分泌型IL2。重组人IL2已在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物COS细胞中产生。
根据本公开内容,IL2(任选地作为延长的-PK IL2的一部分)可以是天然存在的IL2或其片段或变体。IL2可以是人IL2并且可以来源于任何脊椎动物,尤其是任何哺乳动物。
延长的-PK基团(Extended-PK group)
本文所述的细胞因子多肽可以制备为融合物或嵌合多肽,其包括细胞因子部分和异源多肽(即,不是细胞因子或其变体的多肽)。所得分子,下文称为“延长的药代动力学(PK)细胞因子”,相对于游离细胞因子具有拖长的循环半衰期。延长的-PK细胞因子的经拖长的循环半衰期允许体内血清细胞因子浓度维持在治疗范围内,从而可能导致包括T细胞在内的多种类型的免疫细胞的激活增强。由于其有利的药代动力学特征,与未修饰的细胞因子相比,延长的-PK细胞因子以更低频率给药并且持续时间更长。
如本文所用,“半衰期”是指化合物如肽或蛋白质的血清或血浆浓度在体内降低50%(例如由于由自然机制导致的降解和/或清除或隔离)所用的时间。适用于本文的延长的-PK细胞因子如延长的-PK白介素(IL)在体内稳定,并且其半衰期通过例如与抗降解和/或清除或隔离的血清白蛋白(如HSA或MSA)融合而增加。半衰期可以以任何本身已知的方式,如通过药代动力学分析来确定。合适的技术对本领域技术人员来说是清楚的,并且可以例如通常包括以下步骤:将合适剂量的氨基酸序列或化合物适当地施用至对象;定期从所述对象采集血液样品或其他样品;确定所述血液样品中氨基酸序列或化合物的水平或浓度;以及从如此获得的数据(图)计算直到氨基酸序列或化合物的水平或浓度与给药后的初始水平相比已经减少50%的时间。另外的细节提供于如标准手册中,如Kenneth,A.等人,Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists和Peters等人,Pharmacokinetic Analysis:A Practical Approach(1996)。还参考Gibaldi,M.等人,Pharmacokinetics,第2修订版,Marcel Dekker(1982)。
细胞因子可融合至延长的-PK基团,从而增加循环半衰期。延长的-PK基团的非限制性实例在下文中描述。应当理解,增加细胞因子或其变体的循环半衰期的其他PK基团也适用于本公开内容。在某些实施方案中,延长的-PK基团是血清白蛋白结构域(如,小鼠血清白蛋白、人血清白蛋白)。
如本文所用,术语“PK”是“药代动力学”的首字母缩写词,并且包括化合物的特性,例如包括由对象进行的吸收、分布、代谢和消除。如本文所用,“延长的-PK基团”是指当与生物活性分子融合或与生物活性分子一起施用时增加生物活性分子的循环半衰期的蛋白质、肽或部分。延长的-PK基团的实例包括血清白蛋白(如HSA)、免疫球蛋白Fc或Fc片段及其变体、转铁蛋白及其变体以及人血清白蛋白(HSA)结合剂(如美国公开号2005/0287153和2007/0003549所公开)。其他示例性的延长的-PK基团公开于Kontermann,Expert OpinBiol Ther,2016年7月;16(7):903-15中,将其通过引用以其整体并入本文。如本文所用,“延长的-PK细胞因子”是指与延长的-PK基团组合的细胞因子部分。在一个实施方案中,延长的-PK细胞因子是融合蛋白,其中细胞因子部分连接或融合至延长的-PK基团。如本文所用,“延长的-PK IL”是指与延长的-PK基团组合的白介素(IL)部分(包括IL变体部分)。在一个实施方案中,延长的-PK IL是其中IL部分连接或融合至延长的-PK基团的融合蛋白。示例性融合蛋白是其中IL2部分与HSA融合的HSA/IL2融合物。
在某些实施方案中,相对于单独的细胞因子(即未与延长的-PK基团融合的细胞因子),延长的-PK细胞因子的血清半衰期增加。在某些实施方案中,相对单独的细胞因子的血清半衰期,延长的-PK细胞因子的血清半衰期长至少20、40、60、80、100、120、150、180、200、400、600、800或1000%。在某些实施方案中,延长的-PK细胞因子的血清半衰期是单独的细胞因子的血清半衰期的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍、或50倍。在某些实施方案中,延长的-PK细胞因子的血清半衰期为至少10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时、或200小时。
在某些实施方案中,延长的-PK基团包括血清白蛋白、或其片段、或血清白蛋白或其片段的变体(为了本公开内容的目的,所有这些都包括在术语“白蛋白”中)。本文所述的多肽可以与白蛋白(或其片段或变体)融合以形成白蛋白融合蛋白。此类白蛋白融合蛋白描述于美国公开号20070048282中。
如本文所用,“白蛋白融合蛋白”是指通过将至少一个分子的白蛋白(或其片段或变体)与至少一个分子的蛋白质(如治疗性蛋白,特别是IL2(或其变体))融合而形成的蛋白。白蛋白融合蛋白可以通过核酸翻译产生,其中编码治疗性蛋白的多核苷酸与编码白蛋白的多核苷酸框内连接。治疗性蛋白和白蛋白,曾经是白蛋白融合蛋白的一部分,可以各自称为白蛋白融合蛋白的“部分(portion)”、“区域”或“部分(moiety)”(如,“治疗性蛋白部分”或“白蛋白蛋白部分”)。在一个高度优选的实施方案中,白蛋白融合蛋白包含至少一个分子的治疗性蛋白(包括但不限于成熟形式的治疗性蛋白)和至少一个分子的白蛋白(包括但不限于成熟形式的白蛋白)。在一个实施方案中,白蛋白融合蛋白由宿主细胞加工,如用于经施用的RNA的靶器官的细胞,如肝细胞,并分泌到循环系统中。在用于表达RNA的宿主细胞的分泌途径中发生的新生白蛋白融合蛋白的加工可以包括但不限于信号肽裂解;二硫键的形成;正确折叠;碳水化合物的添加和加工(诸如例如,N-和O-连接的糖基化);特异性蛋白水解裂解;和/或组装成多聚体蛋白质。白蛋白融合蛋白优选地由未加工形式的RNA编码,其特别是在其N-末端具有信号肽并且在细胞分泌后优选以加工形式存在,其中特别地信号肽已被裂解掉。在一个最优选的实施方案中,“白蛋白融合蛋白的加工形式”是指经历N-端信号肽裂解的白蛋白融合蛋白产物,在本文中也称为“成熟白蛋白融合蛋白”。
在优选的实施方案中,包含治疗性蛋白的白蛋白融合蛋白与未与白蛋白融合时相同治疗性蛋白的血浆稳定性相比具有更高的血浆稳定性。血浆稳定性通常是指治疗性蛋白在体内施用并被带入血流中与治疗性蛋白被降解并从血流中清除到最终从体内清除治疗性蛋白的器官(如肾脏或肝脏)中之间的时间段。血浆稳定性是根据血流中治疗性蛋白的半衰期计算的。血流中治疗性蛋白的半衰期可以通过本领域已知的常用测定法容易地确定。
如本文所用,“白蛋白”统指白蛋白蛋白或氨基酸序列,或具有白蛋白的一种或多种功能活性(如,生物活性)的白蛋白片段或变体。特别地,“白蛋白”是指人白蛋白或其片段或变体,尤其是人白蛋白的成熟形式,或来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段,或这些分子的变体。白蛋白可以源自任何脊椎动物,尤其是任何哺乳动物,例如人、小鼠、牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于母鸡和鲑鱼。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以来自与治疗性蛋白部分不同的动物。
在某些实施方案中,白蛋白是人血清白蛋白(HSA)、或其片段或变体,如US 5,876,969、WO 2011/124718、WO 2013/075066和WO 2011/0514789中公开的那些。
术语“人血清白蛋白(HSA)”和“人白蛋白(HA)”在本文中可互换使用。术语“白蛋白和“血清白蛋白”更广泛,包括人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。
如本文所用,足以拖长治疗性蛋白的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段是指在长度或结构上足以稳定或拖长蛋白质的治疗活性或血浆稳定性以使白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的血浆稳定性与非融合状态下的血浆稳定性相比拖长或延长的白蛋白片段。
白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含全长的白蛋白序列,或者可以包括其能够稳定或拖长治疗活性或血浆稳定性的一个或多个片段。此类片段的长度可以是10个或更多个氨基酸,或者可以包括来自白蛋白序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸,或者可以包括白蛋白的特定结构域的一部分或全部。例如,可以使用跨越前两个免疫球蛋白样结构域的HAS的一个或多个片段。在一个优选的实施方案中,HSA片段是HSA的成熟形式。
通常,白蛋白片段或变体的长度为至少100个氨基酸,优选至少150个氨基酸。
根据本公开内容,白蛋白可以是天然存在的白蛋白或其片段或变体。白蛋白可以是人白蛋白并且可以来源于任何脊椎动物,尤其是任何哺乳动物。
优选地,白蛋白融合蛋白包含作为N-末端部分的白蛋白和作为C-末端部分的治疗性蛋白。可替代地,也可以使用包含白蛋白作为C-末端部分和治疗性蛋白作为N-末端部分的白蛋白融合蛋白。
在一个实施方案中,治疗性蛋白通过肽接头与白蛋白连接。融合部分之间的接头肽可以在部分之间提供更大的物理分离,从而使治疗性蛋白部分的例如用于结合其同源受体的可及性最大化。接头肽可以由氨基酸组成,从而使其具有柔性或更刚性。接头序列可以被蛋白酶或通过化学方式裂解。
如本文所用,术语“Fc区”是指由其两条重链的各自Fc结构域(或Fc部分)形成的天然免疫球蛋白的部分。如本文所用,术语“Fc结构域”是指单个免疫球蛋白(Ig)重链的一部分或片段,其中Fc结构域不包含Fv结构域。在某些实施方案中,Fc结构域开始于正好在木瓜蛋白酶裂解位点上游的铰链区并结束于抗体的C-末端。因此,完整的Fc结构域至少包含铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中,Fc结构域包含以下中的至少一种:铰链(如,上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或其变体、部分或片段。在某些实施方案中,Fc结构域包含完整Fc结构域(即,铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在某些实施方案中,Fc结构域包含融合至CH3结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)。在某些实施方案中,Fc结构域包含融合至CH3结构域(或其部分)的CH2结构域(或其部分)。在某些实施方案中,Fc结构域由CH3结构域或其部分组成。在某些实施方案中,Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中,Fc结构域由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在某些实施方案中,Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中,Fc结构域缺乏至少一部分的CH2结构域(如,所有或部分的CH2结构域)。本文中的Fc结构域通常是指包含免疫球蛋白重链的全部或部分Fc结构域的多肽。这包括但不限于包含完整CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽以及仅包含如铰链、CH2和CH3结构域的此类肽的片段。Fc结构域可以来源于任何物种和/或任何亚类的免疫球蛋白,包括但不限于人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fc结构域涵盖天然Fc和Fc变体分子。如本文所说明,本领域普通技术人员将理解可以修饰任何Fc结构域,使得其在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc结构域。在某些实施方案中,Fe结构域具有降低的效应子功能(如,FcγR结合)。
本文所述的多肽的Fc结构域可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如,多肽的Fc结构域可以包含来源于IgG1分子的CH2和/或CH3结构域和来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中,Fc结构域可包含部分来源于IgG1分子和部分来源于IgG3分子的嵌合铰链区。在另一个实例中,Fc结构域可包含部分来源于IgG1分子和部分来源于IgG4分子的嵌合铰链。
在某些实施方案中,延长的-PK基团包括Fc结构域或其片段、或Fc结构域或其片段的变体(为了本公开内容的目的,所有这些都包含在术语“Fc结构域”中)。Fc结构域不含有与抗原结合的可变区。适用于本公开内容的Fc结构域可以从许多不同的来源获得。在某些实施方案中,Fc结构域来源于人类免疫球蛋白。在某些实施方案中,Fc结构域来自人类IgG1恒定区。然而,应当理解,Fc结构域可以来源于另一种哺乳动物物种的免疫球蛋白,包括例如啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类动物(如黑猩猩、猕猴)物种。
此外,Fc结构域(或其片段或变体)可以来源于任何免疫球蛋白类别,包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE,以及任何免疫球蛋白同种型,包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
多种Fc结构域基因序列(如,小鼠和人类恒定区基因序列)以可公开访问的保藏物的形式获得。可以选择缺乏特定效应子功能和/或具有特定修饰以降低免疫原性的包含Fc结构域序列的恒定区结构域。抗体和编码抗体的基因的许多序列已经公开,并且合适的Fc结构域序列(如铰链、CH2和/或CH3序列,或其片段或变体)可以使用本领域公认的技术从这些序列中得到。
在某些实施方案中,延长的-PK基团是血清白蛋白结合蛋白,如US2005/0287153、US2007/0003549、US2007/0178082、US2007/0269422、US2010/0113339、WO2009/083804和WO2009/133208中所述的那些,将其通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中,延长的-PK基团是转铁蛋白,如US 7,176,278和US 8,158,579中所公开的,将其通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中,延长的-PK基团是血清免疫球蛋白结合蛋白,如在US2007/0178082、US2014/0220017和US2017/0145062中公开的那些,将其通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中,延长的-PK基团是结合血清白蛋白的基于纤连蛋白(Fn)的支架结构域蛋白,如US2012/0094909中公开的那些,将其通过引用以其整体并入本文。US2012/0094909中还公开了制备基于纤连蛋白的支架结构域蛋白的方法。基于Fn3的延长的-PK基团的非限制性实例是Fn3(HSA),即与人血清白蛋白结合的Fn3蛋白。
在某些方面,适合根据本公开内容使用的延长的-PK细胞因子可以采用一个或多个肽接头。如本文所用,术语“肽接头”是指肽或多肽序列,其连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个或更多个结构域(如,延长的-PK部分和IL部分,如IL2)。例如,肽接头可用于将细胞因子部分连接至HSA结构域。
适用于将延长的-PK基团融合到例如IL2的接头在本领域中是众所周知的。示例性接头包括甘氨酸-丝氨酸-多肽接头、甘氨酸-脯氨酸-多肽接头和脯氨酸-丙氨酸多肽接头。在某些实施方案中,接头是甘氨酸-丝氨酸-多肽接头,即由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。
除了上述异源多肽外或代替上述异源多肽,本文所述的细胞因子变体多肽可以含有编码“标志物”或“报告子”的序列。标志物或报告基因的实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、β-半乳糖苷酶和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。
抗原受体
本文所述的细胞如免疫效应细胞可表达结合抗原或其加工产物(特别是当存在于靶细胞上或由靶细胞呈递时)的抗原受体如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。细胞可以天然表达抗原受体或被修饰(如,在待治疗的对象的离体/体外或体内)以表达抗原受体。在一个实施方案中,表达抗原受体的修饰离体/在体外发生。随后,可以将经修饰的细胞施用至患者。在一个实施方案中,表达抗原受体的修饰在体内发生。细胞可以是患者的内源性细胞或可以已经施用至患者。
嵌合抗原受体
使用表达嵌合抗原受体的CAR-工程化T细胞的过继细胞转移疗法是一种很有前途的抗癌疗法,因为CAR-修饰的T细胞可以被工程化以靶向几乎任何肿瘤抗原。例如,可以对患者的T细胞进行遗传工程化(遗传修饰)以表达特异性针对患者肿瘤细胞上抗原的CAR,然后输注回患者体内。
根据本发明,术语“CAR”(或“嵌合抗原受体”)与术语“嵌合T细胞受体”和“人工T细胞受体”同义,并且涉及包含单个分子或分子复合物的人工受体,其识别即结合靶细胞如癌细胞上的靶结构(如抗原)(如通过抗原结合结构域与靶细胞表面上表达的抗原的结合),并且可以赋予特异性给免疫效应细胞,如在细胞表面上表达所述CAR的T细胞。此类细胞不一定需要加工和呈递抗原以识别靶细胞,而是可以优选地特异性识别靶细胞上存在的任何抗原。优选地,CAR对靶结构的识别导致表达所述CAR的免疫效应细胞的激活。CAR可以包含一个或多个蛋白质单元,所述蛋白质单元包含如本文所述的一个或多个结构域。术语“CAR”不包括T细胞受体。
CAR包含靶特异性结合元件,另外称为抗原结合部分或抗原结合结构域,其通常是CAR细胞外结构域的一部分。抗原结合结构域识别配体,该配体充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物。具体地,本发明的CAR靶向诸如肿瘤细胞的患病细胞上的诸如肿瘤抗原的抗原。
在一个实施方案中,CAR中的结合结构域特异性结合抗原。在一个实施方案中,CAR中的结合结构域所结合的抗原在癌细胞中表达(肿瘤抗原)。在一个实施方案中,抗原在癌细胞的表面上表达。在一个实施方案中,结合结构域结合抗原的胞外结构域或胞外结构域中的表位。在一个实施方案中,结合结构域结合活细胞表面上存在的抗原的天然表位。
在本发明的一个实施方案中,抗原结合结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白重链的可变区(VH)和对抗原具有特异性的免疫球蛋白轻链的可变区(VL)。在一个实施方案中,免疫球蛋白是抗体。在一个实施方案中,所述重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)经由肽接头连接。优选地,CAR中的抗原结合部分是scFv。
CAR经设计以包含融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方案中,跨膜结构域不与CAR中的结构域之一天然缔合。在一个实施方案中,跨膜结构域与CAR中的结构域之一天然缔合。在一个实施方案中,跨膜结构域通过氨基酸取代进行修饰以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合,从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下,结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中特别使用的跨膜区可以来源于T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的α、β或ζ链(即至少包含以上的跨膜区)。可替代地,跨膜结构域可以是合成的,在这种情况下,它将主要包含疏水残基,如亮氨酸和缬氨酸。优选地,苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将出现在合成跨膜结构域的每一端。
在一些情况下,本发明的CAR包含形成跨膜结构域和胞外结构域之间的连接的铰链结构域。
CAR的胞质结构域或其他细胞内信号传导结构域负责激活其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如,T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性,包括细胞因子的分泌。因此,术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的蛋白质部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域,但在许多情况下不需要使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言,此类截短部分可用于代替完整链,只要它转导效应子功能信号即可。因此,术语“胞内信号传导结构域”意在包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
已知仅通过TCR生成的信号不足以完全激活T细胞,并且还需要次级或共刺激信号。因此,可以说T细胞激活是由两类不同的胞质信号传导序列介导的:通过TCR(初级胞质信号传导序列)启动抗原依赖性初级激活的那些,以及以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级或共刺激信号(次级胞质信号传导序列)的那些。
在一个实施方案中,CAR包含来源于CD3-ζ的初级胞质信号传导序列。此外,CAR的胞质结构域可以包含与共刺激信号传导区组合的CD3-ζ信号传导结构域。
共刺激结构域的特性仅限于它具有在CAR结合靶向部分后增强细胞增殖和存活的能力。合适的共刺激结构域包括CD28、CD137(4-1BB)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员、CD134(OX40)、TNFR-受体超家族成员和CD278(ICOS)、CD28-超家族共刺激分子(在激活的T细胞上表达)。技术人员将理解,可以使用这些所述的共刺激结构域的序列变体而不会不利地影响本发明,其中变体具有与它们被建模的结构域相同或相似的活性。此类变体将与它们所源自的结构域的氨基酸序列具有至少约80%的序列同一性。在本发明的一些实施方案中,CAR构建体包含两个共刺激结构域。虽然特定组合包括四个所述结构域的所有可能变体,但具体实例包括CD28+CD137(4-1BB)和CD28+CD134(OX40)。
CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或指定的顺序相互连接。任选地,优选长度为2至10个氨基酸的短寡肽或多肽接头可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。
在一个实施方案中,CAR包含将新生蛋白质引导至内质网的信号肽。在一个实施方案中,信号肽在抗原结合结构域前面。在一个实施方案中,信号肽来源于免疫球蛋白如IgG。
CAR可包含一起呈融合蛋白形式的以上结构域。此类融合蛋白通常包含以N-末端至C-末端方向连接的抗原结合结构域、一个或多个共刺激结构域和信号传导序列。然而,本发明的CAR不限于这种排列,其他排列也是可接受的并且包括结合结构域、信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。应当理解,因为结合结构域必须自由结合抗原,所以结合结构域在融合蛋白中的放置通常使得实现该区域在细胞外部的展示。以同样的方式,因为共刺激和信号传导结构域用于诱导细胞毒性淋巴细胞的活性和增殖所以,融合蛋白通常会在细胞内部展示这两个结构域。
在一个实施方案中,CAR分子包含:
i)靶抗原(如,CLDN6或CLDN18.2)结合结构域;
ii)跨膜结构域;和
iii)胞内结构域,其包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
在一个实施方案中,抗原结合结构域包含scFv。在一个实施方案中,跨膜结构域包含选自以下的蛋白的跨膜结构域:T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDlla、LFA-1、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAMl(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGLl、CDIOO(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C,或其功能变体。在一个实施方案中,跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。在一个实施方案中,抗原结合结构域通过铰链结构域连接至跨膜结构域。在一个实施方案中,铰链结构域是CD8α铰链结构域。
在一个实施方案中,本发明的CAR分子包含:
i)靶抗原结合结构域;
ii)CD8α铰链结构域;
iii)CD8α跨膜结构域;和
iv)胞内结构域,其包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区,称为互补决定区(CDR),散布着更保守的区域,称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端到羧基末端以以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合,包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。抗体结合,优选特异性结合抗原。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白,并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分或片段。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在,包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab’)2,以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY;Harlow等人,1989,in:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York;Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883;Bird等人,1988,Science 242:423-426)。
由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。此类蛋白质中包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物(如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物)中的一抗。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数对象的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其他抗体响应中最有效的免疫球蛋白,并且对防御细菌和病毒很重要。IgD是这样的免疫球蛋白,其没有已知的抗体功能,但可以作为抗原受体。IgE是通过在暴露于过敏原后引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞中释放介质来介导速发性超敏反应的免疫球蛋白。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分,并且通常包含完整抗体的抗原决定可变区。
抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用,“抗体重链”是指抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中较大的一种。
如本文所用,“抗体轻链”是指抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中较小的一种,κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
根据本公开内容,当存在于T细胞上时的CAR识别诸如抗原呈递细胞或患病细胞如癌细胞的表面上的抗原时,使得T细胞被刺激和/或扩增或发挥如上所述的效应子功能。
免疫效应细胞的遗传修饰
可以使用多种方法将抗原受体如CAR构建体引入诸如T细胞的细胞以产生经遗传修饰以表达抗原受体的细胞。此类方法包括基于非病毒的DNA转染、基于非病毒的RNA转染,如mRNA转染、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的DNA转染具有较低的插入诱变风险。基于转座子的系统可以比不含整合元件的质粒更有效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易生产,有效且永久地转导T细胞,并且从整合的角度初步证明在原代人T细胞中是安全的。慢病毒载体也有效且永久地转导T细胞,但制造更贵。它们也潜在地比基于逆转录病毒的系统更安全。
在本发明的所有方面的一个实施方案中,用编码抗原受体的核酸离体或体内转染T细胞或T细胞祖细胞。在一个实施方案中,可以使用离体或体内转染的组合。在本发明的所有方面的一个实施方案中,T细胞或T细胞祖细胞来自待治疗的对象。在本发明的所有方面的一个实施方案中,T细胞或T细胞祖细胞来自不同于待治疗的对象的对象。
CAR T细胞可以使用靶向T细胞的纳米颗粒,在体内产生,并且因此几乎是瞬间产生的。例如,基于聚(β-氨基酯)的纳米颗粒可以与抗CD3e F(ab)片段偶联以结合至T细胞上的CD3。在与T细胞结合后,这些纳米颗粒被内吞。由于包含含有微管相关序列(MTAS)和核定位信号(NLS)的肽,它们的内容物,例如编码抗肿瘤抗原CAR的质粒DNA,可以被定向至T细胞核。包含侧接CAR基因表达盒的转座子和编码高活性转座酶的单独质粒可以允许CAR载体有效整合到染色体中。此类允许在纳米颗粒输注后体内产生CAR T细胞的系统描述于Smith等人(2017)Nat.Nanotechnol.12:813-820中。
此外,CD19-CAR T细胞可以使用特异性靶向人CD8+细胞的慢病毒载体CD8-LV直接在体内产生(Pfeiffer A.等人,EMBO Mol.Med.Nov;10(11),2018,9158)。
另一种可能性是使用CRISPR/Cas9方法将CAR编码序列故意放置在特定基因座处。例如,可以敲除现有的T细胞受体(TCR),同时敲入CAR并将其置于内源性启动子的动态调控控制之下,所述内源性启动子否则会调节TCR表达;参见,如,Eyquem等人,(2017)Nature543:113-117。
在本发明的所有方面的一个实施方案中,经遗传修饰以表达抗原受体的细胞用编码抗原受体的核酸稳定或瞬时转染。因此,编码抗原受体的核酸整合或不整合到细胞的基因组中。
在本发明的所有方面的一个实施方案中,使经遗传修饰以表达抗原受体的细胞失活以表达内源性T细胞受体和/或内源性HLA。
在本发明的所有方面的一个实施方案中,本文所述的细胞可以是待治疗的对象自体的、同种异体的或同系的。在一个实施方案中,本公开内容设想从患者体内移除细胞并将细胞随后重新递送至患者。在一个实施方案中,本公开内容未设想从患者体内移除细胞。在后一种情况下,细胞遗传修饰的所有步骤都是在体内进行。
术语“自体的”用于描述来源于同一对象的任何事物。例如,“自体移植”是指来源于同一对象的组织或器官的移植。此类程序是有利的,因为它们克服了否则会导致排斥的免疫屏障。
术语“同种异体的”用于描述来源于同一物种的不同个体的任何事物。当一个或多个基因座处的基因不相同时,则称两个或更多个个体彼此为同种异体的。
术语“同系的”用于描述来源于具有相同基因型的个体或组织的任何事物,即相同近交系的同卵双胞胎或动物,或其组织。
术语“异源的”用于描述由多个不同要素组成的事物。作为一个实例,将一个个体的骨髓移植到不同个体中就构成了异源移植。异源基因是来源于除对象之外的来源的基因。
抗原
本文所述的方法还包括使受治疗的对象中的免疫效应细胞,特别是表达抗原受体的免疫效应细胞,例如经遗传操作以表达抗原受体的免疫效应细胞与同源抗原分子(本文也称为“抗原受体靶向的抗原”、“疫苗抗原”或简称为“抗原”)接触的步骤,其中抗原分子或其加工产物,如其片段,结合抗原受体,如免疫效应细胞携带的TCR或CAR。在一个实施方案中,同源抗原分子包括由免疫效应细胞所靶向的靶细胞表达的抗原或其片段,或抗原或片段的变体。
因此,本文所述的方法包括向对象施用同源抗原分子、编码其的核酸或表达同源抗原分子的细胞的步骤。在一个实施方案中,编码同源抗原分子的核酸在对象的细胞中表达以提供同源抗原分子。在一个实施方案中,同源抗原分子的表达在细胞表面处。在一个实施方案中,编码同源抗原分子的核酸在对象的细胞中瞬时表达。在一个实施方案中,编码同源抗原分子的核酸是RNA。在一个实施方案中,同源抗原分子或编码其的核酸经全身施用。在一个实施方案中,在全身施用编码同源抗原分子的核酸后,编码同源抗原分子的核酸在脾脏中发生表达。在一个实施方案中,在全身施用编码同源抗原分子的核酸后,编码同源抗原分子的核酸在抗原呈递细胞,优选专职抗原呈递细胞中发生表达。在一个实施方案中,抗原呈递细胞选自树突细胞、巨噬细胞和B细胞。在一个实施方案中,在全身施用编码同源抗原分子的核酸后,编码同源抗原分子的核酸在肺和/或肝脏中不发生表达或基本上不发生表达。在一个实施方案中,在全身施用编码同源抗原分子的核酸后,编码同源抗原分子的核酸在脾脏中的表达是肺中表达量的至少5倍。
根据本发明提供给对象的肽和蛋白质抗原(通过施用肽和蛋白质抗原,编码肽和蛋白质抗原的核酸,特别是RNA,或表达肽和蛋白质抗原的细胞),即疫苗抗原,优选导致被施用肽或蛋白质抗原、核酸或细胞的对象中免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。所述刺激的、引发的和/或扩增的免疫效应细胞优选针对靶抗原,特别是由患病细胞、组织和/或器官表达的靶抗原,即疾病相关抗原。因此,疫苗抗原可以包含疾病相关抗原或其片段或变体。在一个实施方案中,此类片段或变体在免疫学上等效于疾病相关抗原。在本公开内容的上下文中,术语“抗原的片段”或“抗原的变体”意指导致免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增的药剂,所述刺激的、引发的和/或扩增的免疫效应细胞靶向抗原,即疾病相关抗原,特别是当由患病细胞、组织和/或器官呈递时。因此,疫苗抗原可对应于或可包含疾病相关抗原,可对应于或可包含疾病相关抗原的片段,或可对应于或可包含与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果疫苗抗原包含疾病相关抗原的片段或与疾病相关抗原的片段同源的氨基酸序列,则所述片段或氨基酸序列可以包含免疫效应细胞的抗原受体所靶向的疾病相关抗原的表位或与疾病相关抗原的表位同源的序列。因此,根据本公开内容,疫苗抗原可包含疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开内容的“抗原的免疫原性片段”优选涉及能够刺激、引发和/或扩增携带与抗原结合的抗原受体的免疫效应细胞或表达抗原的细胞的抗原片段。优选疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)提供相关表位,用于由免疫效应细胞中存在的抗原结合结构域结合。在一个实施方案中,疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)在细胞如抗原呈递细胞上表达,以便为免疫效应细胞的结合提供相关表位。在一个实施方案中,疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)由细胞(如MHC背景中的抗原呈递细胞)表达并呈递于其表面上,从而为免疫效应细胞的结合提供相关表位。疫苗抗原可以是重组抗原。
在本发明的所有方面的一个实施方案中,编码疫苗抗原的核酸在对象的细胞中表达以提供抗原或其加工产物用于由免疫效应细胞表达的抗原受体进行结合,所述结合导致免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。
术语“免疫学上等效的”意指免疫学上等效的分子如免疫学上等效的氨基酸序列表现出相同或基本相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效应,如关于免疫学效应的类型。在本公开内容的上下文中,术语“免疫学上等效的”优选地关于用于免疫的抗原或抗原变体的免疫学效应或特性使用。例如,如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统时,如与参考氨基酸序列结合的T细胞或表达参考氨基酸序列的细胞诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应,则所述氨基酸序列在免疫学上与参考氨基酸序列是等效的。因此,在免疫学上与抗原等效的分子就T细胞的刺激、引发和/或表达而言表现出与T细胞所靶向的抗原相同或基本相同的特性和/或发挥与其相同或基本相同的作用。
如本文所用,“激活”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫效应细胞如T细胞的状态。激活也可与信号传导通路的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能有关。术语“激活的免疫效应细胞”尤其是指正在经历细胞分裂的免疫效应细胞。
术语“引发”是指这样的过程,其中免疫效应细胞如T细胞首先与其特异性抗原接触并导致分化成效应细胞如效应T细胞。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在本公开内容的上下文中,该术语优选地用于免疫应答的上下文中,其中淋巴细胞被抗原刺激、增殖,并且识别所述抗原的特异性淋巴细胞被扩增。优选地,克隆扩增导致淋巴细胞分化。
术语“抗原”涉及包含可以针对其产生免疫应答的表位的因子。术语“抗原”尤其包括蛋白质和肽。在一个实施方案中,抗原呈递或存在于免疫系统的细胞的表面,如抗原呈递细胞,如树突细胞或巨噬细胞。在一个实施方案中,抗原或其加工产物如T细胞表位由抗原受体结合。因此,抗原或其加工产物可以与免疫效应细胞如T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。在一个实施方案中,抗原是疾病相关抗原,如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原,并且表位来源于此类抗原。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的意义使用,以指代与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是一种含有表位的分子,该表位将刺激宿主的免疫系统以产生针对疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答。因此,疾病相关抗原或其表位可用于治疗目的。疾病相关抗原可与微生物感染有关,通常是微生物抗原,或与癌症,通常是肿瘤有关。
术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”是指癌细胞的成分,其可以来源于细胞质、细胞表面和细胞核。特别地,其是指在细胞内产生或作为肿瘤细胞上的表面抗原的那些抗原。肿瘤抗原通常优先由癌细胞表达(如,它在癌细胞中的表达水平高于在非癌细胞中的表达),并且在一些情况下,它仅由癌细胞表达。肿瘤抗原的实例包括但不限于p53、ART-4、BAGE、β-连环蛋白/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、密封蛋白家族的细胞表面蛋白(如密封蛋白-6、密封蛋白-18.2和密封蛋白-12)、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap 100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A(优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A 10、MAGE-A 11或MAGE-A12)、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、pl90次要BCR-abL、Pml/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE、WT和WT-1。特别地,优选的肿瘤抗原是密封蛋白家族的蛋白质,如密封蛋白-6或密封蛋白-18.2。
术语“病毒抗原”是指具有抗原特性,即能够在个体中引发免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。
术语“细菌抗原”是指具有抗原特性,即能够在个体中引发免疫应答的任何细菌组分。细菌抗原可以来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面缔合”意指分子如受体或抗原与细胞的质膜缔合并位于细胞的质膜处,其中至少一部分分子面向所述细胞的胞外空隙并且可从所述细胞的外部接近,例如通过位于细胞外的抗体。在本申请的上下文中,部分优选为至少4个,优选为至少8个,优选为至少12个,更优选为至少20个氨基酸。缔合可以是直接的或间接的。例如,缔合可以通过一个或多个跨膜结构域、一个或多个脂质锚,或通过与任何其他蛋白质、脂质、糖或可以在细胞质膜的外叶上存在的其他结构相互作用进行。例如,与细胞表面缔合的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白,或者可以是通过与作为跨膜蛋白的另一种蛋白质相互作用而与细胞表面缔合的蛋白质。
“细胞表面”或“细胞的表面”按照其在本领域中的正常含义使用,因此包括易于被蛋白质和其他分子结合的细胞的外部。如果抗原位于所述细胞的表面并且易于被如添加至细胞的抗原特异性抗体结合,则抗原在细胞表面上表达。在一个实施方案中,在细胞表面上表达的抗原是具有被CAR识别的胞外部分的整合膜蛋白。
在本发明的上下文中,术语“胞外部分”或“外结构域(exodomain)”是指诸如蛋白质的分子的一部分,其面向细胞的胞外间隙并且优选地可从所述细胞的外部如由位于细胞外的诸如抗体的结合分子接近。优选地,术语是指一个或多个胞外环或结构域或其片段。
术语“表位”是指分子,如被免疫系统识别的抗原的一部分或片段。例如,表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可以包括抗原的连续或不连续部分并且长度可以是约5至约100,如约5至约50,更优选约8至约30,最优选约10至约25个氨基酸,例如,表位的长度可以优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中,表位的长度是约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指蛋白质的一部分或片段,当其在MHC分子的背景下呈递时被T细胞识别。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白质或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导很重要,其中MHC蛋白质或分子结合肽表位并将它们呈递以供T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达,并向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(如入侵微生物的片段)。在I类MHC/肽复合物的情况下,结合肽的长度通常为约8至约10个氨基酸,尽管更长或更短的肽可能是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下,结合肽的长度通常为约10至约25个氨基酸,并且特别是约13至约18个氨基酸,而更长和更短的肽可能是有效的。
在一个实施方案中,靶抗原是肿瘤抗原并且疫苗抗原或其片段(如表位)来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是通常已知在各种癌症中表达的“标准”抗原。肿瘤抗原也可以是“新抗原”,它对个体的肿瘤具有特异性,并且以前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可以由癌细胞基因组中的一个或多个癌症特异性突变从而导致氨基酸改变而产生。如果肿瘤抗原是新抗原,则疫苗抗原优选包含含有一个或多个氨基酸变化的所述新抗原的表位或片段。
癌症突变随着每个个体而不同。因此,编码新型表位(新表位)的癌症突变代表了开发疫苗组合物和免疫疗法的有吸引力的靶标。肿瘤免疫疗法的功效依赖于选择能够在宿主内诱导有效免疫应答的癌症特异性抗原和表位。RNA可用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。位于脾脏中的树突细胞(DC)代表对免疫原性表位或抗原(如肿瘤表位)的RNA表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已显示使用多个表位可促进肿瘤疫苗组合物的治疗功效。肿瘤突变组的快速测序可为个体化疫苗提供多个表位,其可由本文所述的RNA编码,如为单个多肽,其中表位任选地由接头分开。在本公开内容的某些实施方案中,RNA编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位、或至少十个表位。示例性实施方案包括编码至少五个表位(称为“五表位”)的RNA和编码至少十个表位(称为“十表位”)的RNA。
根据本发明的各个方面,目标优选是提供针对表达肿瘤抗原如CLDN6或CLDN18.2的癌细胞的免疫应答并且治疗涉及表达肿瘤抗原如CLDN6或CLDN18.2的细胞的癌症疾病。优选地,本发明涉及施用抗原受体工程化的免疫效应细胞,如靶向表达肿瘤抗原如CLDN6或CLDN18.2的癌细胞的T细胞。
肽和蛋白质抗原的长度可以是2-100个氨基酸,包括例如5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸、或50个氨基酸。在一些实施方案中,肽可以是大于50个氨基酸。在一些实施方案中,肽可以是大于100个氨基酸。
根据本发明,疫苗抗原应可被免疫效应细胞识别。优选地,抗原如果被免疫效应细胞识别,则能够在适当的共刺激信号存在下诱导携带识别抗原的抗原受体的免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。在本发明的实施方案的上下文中,抗原优选存在于细胞,优选抗原呈递细胞的表面上。识别患病细胞表面上的抗原可能会导致针对该抗原(或表达抗原的细胞)的免疫反应。
在本发明的所有方面的一个实施方案中,抗原在患病细胞如疾病细胞中表达。在一个实施方案中,抗原在患病细胞如癌细胞的表面上表达。在一个实施方案中,抗原受体是CAR,其结合抗原的胞外结构域或抗原的胞外结构域中的表位。在一个实施方案中,CAR结合存在于活细胞表面上的抗原的天然表位。在一个实施方案中,当由T细胞表达和/或存在于T细胞上的CAR结合存在于细胞如抗原呈递细胞上的抗原导致所述T细胞的刺激、引发和/或扩增。在一个实施方案中,当由T细胞表达和/或存在于T细胞上的CAR结合存在于患病细胞如癌细胞上的抗原导致患病细胞的细胞溶解和/或凋亡,其中所述T细胞优选释放细胞毒性因子,如穿孔素和颗粒酶。
化疗
在某些实施方案中,可以将另外的治疗与本文所述的治疗组合施用至患者。此类另外的治疗包括经典的癌症疗法,如放射疗法、手术、温热疗法和/或化疗。
化疗是一种类型的癌症治疗,其使用一种或多种抗癌药物(化疗剂),通常作为标准化化疗方案的一部分。术语“化疗”已经开始意味着非特异性使用胞内毒物来抑制有丝分裂。该含义不包括阻断胞外信号(信号转导)的更具选择性的药剂。开发具有特定分子或遗传靶标的疗法,其抑制来自经典内分泌激素(主要是用于乳腺癌的雌激素和用于前列腺癌的雄激素)的促生长信号,现在称为激素疗法。相比之下,生长信号的其他抑制,如与受体酪氨酸激酶相关的那些,被称为靶向疗法。
重要的是,药物的使用(无论是化疗、激素疗法还是靶向疗法)构成了癌症的全身疗法,因为它们被引入血流中,因此原则上能够治疗身体的任何解剖部位处的癌症。全身疗法通常与构成癌症局部疗法的其他方式(即功效限于应用它们的解剖区域的治疗),如放射疗法、手术或温热疗法结合使用。
传统的化疗剂通过干扰细胞分裂(有丝分裂)而具有细胞毒性,但癌细胞对这些药剂的敏感性差异很大。在很大程度上,化疗可以被认为是一种损伤或应激细胞的方式,如果启动凋亡,则这可能会导致细胞死亡。
化疗剂包括烷化剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂和细胞毒性抗生素。
烷化剂具有使许多分子烷基化的能力,所述分子包括蛋白质、RNA和DNA。烷化剂的亚型是氮芥、亚硝基脲、四嗪、氮丙啶、顺铂及衍生物,以及非经典烷化剂。氮芥包括二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和白消安。亚硝基脲包括N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(MeCCNU)、福莫司汀和链脲佐菌素。四嗪包括达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺。氮丙啶包括噻替哌、丝裂霉素和地吖醌(AZQ)。顺铂和衍生物包括顺铂、卡铂和奥沙利铂。它们通过与生物学重要分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基团形成共价键来损害细胞功能。非经典烷化剂包括丙卡巴肼和六甲基三聚氰胺。在一个特别优选的实施方案中,烷化剂是环磷酰胺。
抗代谢物是一组阻碍DNA和RNA合成的分子。它们中的许多具有与DNA和RNA的结构单元相似的结构。抗代谢物类似于核碱基或核苷,但具有改变的化学基团。这些药物通过阻断DNA合成所需的酶或掺入DNA或RNA中而发挥其作用。抗代谢物的亚型是抗叶酸剂、氟嘧啶、脱氧核苷类似物和硫嘌呤。抗叶酸剂包括甲氨蝶呤和培美曲塞。氟嘧啶包括氟尿嘧啶和卡培他滨。脱氧核苷类似物包括阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、阿扎胞苷、氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨和喷司他丁。硫嘌呤包括硫鸟嘌呤和巯基嘌呤。
抗微管剂通过阻止微管功能来阻断细胞分裂。长春花生物碱阻止微管的形成,而紫杉烷阻止微管分解。长春花生物碱包括长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁。紫杉烷包括多西他赛(泰索帝)和紫杉醇(紫杉醇)。
拓扑异构酶抑制剂是影响以下两种酶活性的药物:拓扑异构酶I和拓扑异构酶II,并且包括伊立替康、拓扑替康、喜树碱、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、美巴龙和阿柔比星。
细胞毒性抗生素是具有不同作用机制的各种药物组。他们在其化疗适应症中的共同主题是它们中断细胞分裂。最重要的亚组是蒽环类药物(如多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星和阿柔比星)和博来霉素;其他突出的实例包括丝裂霉素C、米托蒽醌和放线菌素。
在一个实施方案中,在施用免疫效应细胞之前,可以应用淋巴系统耗竭处理,如通过施用环磷酰胺和氟达拉滨。此类处理可以增加细胞持久性以及临床响应的发生率和持续时间。
免疫检查点抑制剂
在某些实施方案中,免疫检查点抑制剂与本文所述的其他治疗剂组合使用。
如本文所用,“免疫检查点”是指调控T细胞受体识别抗原的幅度和质量的共刺激和抑制信号。在某些实施方案中,免疫检查点是抑制性信号。在某些实施方案中,抑制性信号是PD-1和PD-L1之间的相互作用。在某些实施方案中,抑制性信号是CTLA-4与CD80或CD86之间的相互作用以替代CD28结合。在某些实施方案中,抑制性信号是LAG3和MHC II类分子之间的相互作用。在某些实施方案中,抑制性信号是TIM3和半乳糖凝集素9之间的相互作用。
如本文所用,“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。在某些实施方案中,免疫检查点抑制剂防止与免疫检查点相关的抑制性信号。在某些实施方案中,免疫检查点抑制剂是破坏与免疫检查点相关的抑制性信号传导的抗体或其片段。在某些实施方案中,免疫检查点抑制剂是破坏抑制性信号传导的小分子。在某些实施方案中,免疫检查点抑制剂是防止检查点阻断蛋白之间相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物,如防止PD-1和PD-L1之间相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中,免疫检查点抑制剂是防止CTLA-4与CD80或CD86之间相互作用的抗体或其片段。在某些实施方案中,免疫检查点抑制剂是防止LAG3与其配体或TIM-3与其配体之间的相互作用的抗体或其片段。检查点抑制剂也可以是分子(或其变体)本身的可溶形式,如可溶性PD-L1或PD-L1融合物。
“程序性死亡-1(PD-1)”受体是指属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1主要在体内先前激活的T细胞上表达,并与两种配体PD-L1和PD-L2结合。如本文所用的术语“PD-1”包括人PD-1(hPD-1),hPD-1的变体、同种型和物种同源物,以及具有至少一个与hPD-1共同的表位的类似物。
“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2),它在与PD-1结合后下调T细胞激活和细胞因子分泌。如本文所用的术语“PD-L1”包括人PD-L1(hPD-L1),hPD-L1的变体、同种型和物种同源物,以及具有至少一个与hPD-L1共同的表位的类似物。
“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)”是一种T细胞表面分子,并且是免疫球蛋白超家族的成员。这种蛋白质通过与CD80和CD86结合来下调免疫系统。如本文所用的术语“CTLA-4”包括人CTLA-4(hCTLA-4),hCTLA-4的变体、同种型和物种同源物,以及具有至少一个与hCTLA-4共同的表位的类似物。
“淋巴细胞激活基因-3(LAG3)”是一种与通过与MHC II类分子结合来抑制淋巴细胞活性相关的抑制性受体。该受体增强了Treg细胞的功能并抑制CD8+效应T细胞功能。如本文所用的术语“LAG3”包括人LAG3(hLAG3),hLAG3的变体、同种型和物种同源物,以及具有至少一个共同表位的类似物。
“T细胞膜蛋白-3(TIM3)”是一种通过抑制TH1细胞应答而参与抑制淋巴细胞活性的抑制性受体。它的配体是半乳糖凝集素9,其在各种类型的癌症中上调。如本文所用的术语“TIM3”包括人TIM3(hTIM3),hTIM3的变体、同种型和物种同源物,以及具有至少一个共同表位的类似物。
“B7家族”是指具有不确定受体的抑制性配体。B7家族包括B7-H3和B7-H4,两者都在肿瘤细胞和肿瘤浸润细胞上上调。
在某些实施方案中,适用于本文公开的方法中的免疫检查点抑制剂是抑制性信号的拮抗剂,如靶向例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、B7-H3、B7-H4或TIM3的抗体。这些配体和受体综述于Pardoll,D.,Nature.12:252-264,2012中。
在某些实施方案中,免疫检查点抑制剂是破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导的抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中,免疫检查点抑制剂是一种小分子,其破坏或抑制来自抑制性免疫调节剂的信号传导。
在某些实施方案中,抑制性免疫调节剂是PD-1/PD-L1信号传导通路的组分。因此,本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用破坏PD-1受体与其配体PD-L1之间的相互作用的抗体或其抗原结合部分。与PD-1结合并破坏PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用的抗体是本领域已知的。在某些实施方案中,抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-1。在某些实施方案中,抗体或其抗原结合部分特异性结合PD-L1并抑制其与PD-1的相互作用,从而增加免疫活性。
在某些实施方案中,抑制性免疫调节剂是CTLA4信号传导通路的组分。因此,本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向CTLA4并破坏其与CD80和CD86相互作用的抗体或其抗原结合部分。
在某些实施方案中,抑制性免疫调节剂是LAG3(淋巴细胞激活基因3)信号传导通路的组分。因此,本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向LAG3并破坏其与MHCII类分子相互作用的抗体或其抗原结合部分。
在某些实施方案中,抑制性免疫调节剂是B7家族信号传导通路的组分。在某些实施方案中,B7家族成员是B7-H3和B7-H4。因此,本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向B7-H3或H4的抗体或其抗原结合部分。B7家族没有任何明确的受体,但这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润性细胞上被上调。临床前小鼠模型已经显示,阻断这些配体可以增强抗肿瘤免疫力。
在某些实施方案中,抑制性免疫调节剂是TIM3(T细胞膜蛋白3)信号传导通路的组分。因此,本公开内容的某些实施方案提供了向对象施用靶向TIM3并破坏其与乳糖凝集素9的相互作用的抗体或其抗原结合部分。
本领域普通技术人员将理解,其他免疫检查点靶标也可以被拮抗剂或抗体靶向,只要该靶向导致刺激免疫应答,如抗肿瘤免疫应答,如例如T细胞增殖增加、T细胞激活增强和/或细胞因子(如IFN-γ、IL2)产生增加所反映的。
RNA靶向
根据本发明,特别优选本文所述的肽、蛋白质或多肽,特别是疫苗抗原,以编码本文所述的肽、蛋白质或多肽的RNA的形式施用。在一个实施方案中,本文所述的不同肽、蛋白质或多肽由不同的RNA分子编码。
在一个实施方案中,RNA被配制在递送媒介物中。在一个实施方案中,递送媒介物包含颗粒。在一个实施方案中,递送媒介物包含至少一种脂质。在一个实施方案中,至少一种脂质包括至少一种阳离子脂质。在一个实施方案中,脂质与RNA形成复合物和/或封装RNA。在一个实施方案中,脂质包含在封装RNA的囊泡中。在一个实施方案中,RNA被配制在脂质体中。
根据本公开内容,在施用本文所述的RNA后,将至少一部分RNA递送至靶细胞。在一个实施方案中,将至少一部分RNA递送至靶细胞的胞质。在一个实施方案中,RNA被靶细胞翻译以产生编码的肽或蛋白质。
本公开内容的一些方面涉及本文公开的RNA(如,编码疫苗抗原的RNA)的靶向递送。
在一个实施方案中,本公开内容涉及靶向淋巴系统,特别是次级淋巴样器官,更具体是脾脏。如果施用的RNA是编码疫苗抗原的RNA,则特别优选靶向淋巴系统,特别是次级淋巴样器官,更具体是脾脏。
在一个实施方案中,靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中,靶细胞是抗原呈递细胞如脾脏中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中,靶细胞是脾脏中的树突细胞。
“淋巴系统”是循环系统的一部分,并且是免疫系统的重要组成部分,包括携带淋巴液的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的输导网络和循环淋巴液组成。原代或中央淋巴样器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成原代淋巴样器官。次级或外周淋巴样器官,包括淋巴结和脾脏,维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
RNA可以通过所谓的脂质复合物制剂递送至脾脏,其中RNA与包含阳离子脂质和任选的另外或辅助脂质的脂质体结合以形成可注射的纳米颗粒制剂。脂质体可以通过将脂质在乙醇中的溶液注射到水或适合的水相中来获得。RNA脂质复合物颗粒可以通过将脂质体与RNA混合来制备。靶向脾脏的RNA脂质复合物颗粒描述于通过引用并入本文的WO 2013/143683中。已经发现具有净负电荷的RNA脂质复合物颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞,如抗原呈递细胞,特别是树突细胞。因此,在施用RNA脂质复合物颗粒后,脾脏中会发生RNA累积和/或RNA表达。因此,本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于在脾脏中表达RNA。在一个实施方案中,在施用RNA脂质复合物颗粒后,肺和/或肝脏中不发生或基本上不发生RNA累积和/或RNA表达。在一个实施方案中,在施用RNA脂质复合物颗粒后,在抗原呈递细胞,如脾脏中的专职抗原呈递细胞中发生RNA累积和/或RNA表达。因此,本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于在此类抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方案中,抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
在本公开内容的上下文中,术语“RNA脂质复合物颗粒”涉及含有脂质,特别是阳离子脂质和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质复合物颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可以使用阳离子脂质如DOTMA和另外的脂质如DOPE来合成。在一个实施方案中,RNA脂质复合物颗粒是纳米颗粒。
如本文所用,“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过静电相互作用将带负电荷的RNA与脂质基质结合。通常,阳离子脂质具有亲脂部分,如甾醇、酰基或二酰基链,并且脂质的头基通常带有正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双十八烷基铵(DDAB);1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP);1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP);1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷;1,2-二烷基氧基-3-二甲基铵丙烷;双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基铵(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、l,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)和2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙铵(DOSPA)。优选DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在特定的实施方案中,阳离子脂质是DOTMA和/或DOTAP。
可以掺入另外的脂质以调节RNA脂质复合物颗粒的总正负电荷比和物理稳定性。在某些实施方案中,另外的脂质是中性脂质。如本文所用,“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的实例包括但不限于1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在特定的实施方案中,另外的脂质是DOPE、胆固醇和/或DOPC。
在某些实施方案中,RNA脂质复合物颗粒包括阳离子脂质和另外的脂质两者。在一个示例性实施方案中,阳离子脂质是DOTMA并且另外的脂质是DOPE。
在一些实施方案中,至少一种阳离子脂质与至少一种另外脂质的摩尔比是约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、或约3:1至约1:1。在特定的实施方案中,摩尔比可以是约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1、或约1:1。在一个示例性实施方案中,至少一种阳离子脂质与至少一种另外脂质的摩尔比是约2:1。
本文所述的RNA脂质复合物颗粒的平均直径在一个实施方案中的范围为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在特定的实施方案中,RNA脂质复合物颗粒的平均直径是约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm或约1000nm。在一个实施方案中,RNA脂质复合物颗粒的平均直径范围为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中,RNA脂质复合物颗粒的平均直径范围为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中,RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约400nm。
本公开内容的RNA脂质复合物颗粒的电荷是存在于至少一种阳离子脂质中的电荷与存在于RNA中的电荷的总和。电荷比是存在于至少一种阳离子脂质中的正电荷与存在于RNA中的负电荷的比率。存在于至少一种阳离子脂质中正电荷与存在于RNA中的负电荷的电荷比通过以下等式计算:电荷比=[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中的正电荷总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中的负电荷总数)]。
本文所述的靶向脾脏的RNA脂质复合物颗粒在生理pH下优选具有净负电荷,如正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2至约1:2。在特定的实施方案中,在生理pH下的RNA脂质复合物颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2.0、约1.8:2.0、约1.7:2.0、约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0、或约1:2.0。
RNA递送系统对肝脏具有固有的偏好。这涉及基于脂质的颗粒、阳离子和中性纳米颗粒,特别是脂质纳米颗粒,如生物缀合物中的脂质体、纳米胶束和亲脂性配体。肝脏累积是由肝脏脉管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。
在细胞因子如IL2的靶向递送的一个实施方案中,靶器官是肝脏并且靶组织是肝脏组织。优选递送至此类靶组织,特别是如果期望在该器官或组织中存在细胞因子和/或如果期望表达大量细胞因子和/或如果期望或需要细胞因子特别是以大量全身存在。
在一个实施方案中,编码细胞因子的RNA在用于靶向肝脏的制剂中施用。此类制剂在上文描述。
对于将RNA体内递送至肝脏,药物递送系统可用于通过防止其降解将RNA转运至肝脏中。例如,由聚(乙二醇)(PEG)-包被的表面和含mRNA的核心组成的多聚复合物(polyplex)纳米胶束是一种有用的系统,因为纳米胶束在生理条件下提供了RNA的优异的体内稳定性。此外,由密集的PEG栅栏组成的多聚复合物纳米胶束表面提供的隐身特性,有效地逃避了宿主免疫防御。
药物组合物
本文所述的肽、蛋白质、多肽、RNA、RNA颗粒、免疫效应细胞和其他药剂,如免疫检查点抑制剂,可以在药物组合物或药物中施用用于治疗性或预防性治疗,并且可以以可包含药学上可接受的载体并且可以任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等的任何适合的药物组合物的形式施用。在一个实施方案中,药物组合物用于治疗性或预防性治疗,如用于治疗或预防涉及抗原的疾病,如癌症疾病,如本文所述的那些。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效药剂,优选与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂一起的制剂。通过将所述药物组合物施用至对象,所述药物组合物可用于治疗、预防疾病或病症或者减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。在本公开内容的上下文中,药物组合物包含如本文所述的肽、蛋白质、多肽、RNA、RNA颗粒、免疫效应细胞和/或其他药剂。
本公开内容的药物组合物可以包含一种或多种佐剂或者可以与一种或多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括一组异质的化合物,如油乳剂(如弗氏佐剂(Freund's adjuvant))、矿物质化合物(如明矾)、细菌产物(如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素)或免疫刺激复合物。佐剂的实例包括但不限于LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子,如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。细胞因子可以是IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-a。此外已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油如ISA51。用于本公开内容的其他合适的佐剂包括脂肽,如Pam3Cys。
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学有效量”和“药学上可接受的制剂”施加。
术语“药学上可接受的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的材料的无毒性。
术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指单独或与其他剂量一起实现所需反应或所需效应的量。在治疗特定疾病的情况下,所需反应优选涉及抑制疾病进程。这包括减缓疾病的进展,并且特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的所需反应也可以是延迟所述疾病或所述病况的发作或预防所述疾病或所述病况的发作。本文所述的组合物的有效量将取决于待治疗的病况、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、体型和体重)、治疗的持续时间、伴随疗法的类型(如果存在)、具体的施用途径和类似因素。因此,本文所述组合物的施用剂量可取决于各种此类参数。在初始剂量对患者的反应不足的情况下,可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现的有效的更高剂量)。
术语“亚治疗量”通常是指低于药剂的标准治疗量,意味着达到所需效果所需的量低于单独使用药剂时的量。如本文所用,术语“亚治疗量”意指特定药剂的剂量或量在不存在其他化合物、药物或药剂的情况下,如在不存在疫苗抗原的情况下,不足以实现所需的药理作用。此类所需的药理作用可以包括完全或基本上完全排斥实体瘤。亚治疗量和剂量通常不小于治疗剂量或量的约5%,通常不小于约10%,并且通常不大于约75%,更通常不大于约60%。通常,用于人类CAR T细胞疗法的经施用的免疫效应细胞的数量(包括在对象体内产生的)约为每剂109个(相当于1,33x107个/kg)或更高(相当于1.3x107个/kg)。此外,一些治疗方法包括在短时间段(如小于4周)内重复施用CAR T细胞,以通过剂量递增来提高安全性和/或维持患者体内有效T细胞的数量。这导致在这样的时间段内甚至更高的“累积剂量”。因此,经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞的“亚治疗量”是在至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天或甚至更久的时间段内每个初始剂量和/或累积剂量的此类细胞的108或更少、107或更少、106或更少、105或更少、104或更少、103或更少或甚至更低的量。在一个实施方案中,经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞的“亚治疗量”涉及108或更少、107或更少、106或更少、105或更少、104或更少、103或更少或甚至更低的量的此类细胞的单剂量。术语“单剂量”意指长期施用一剂的治疗性物质。术语“拖长的时间”包括至少14天、至少21天、至少28天、至少3个月、至少6个月或甚至更久的时间段。
本公开内容的药物组合物可以含有盐、缓冲剂、防腐剂和任选的其他治疗剂。在一个实施方案中,本公开内容的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开内容的药物组合物中的合适防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
如本文所用,术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载体、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂或着色剂。
术语“稀释剂(diluent)”涉及稀释剂(diluting agent)和/或降黏剂。此外,术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分,其中结合了活性组分以促进、增强或实现药物组合物的施用。如本文所用的载体可以是一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质,它们适合于施用至对象。合适的载体包括但不限于无菌水、林格(Ringer)、乳酸林格(Ringer lactate)、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘并且特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧-丙烯共聚物。在一个实施方案中,本公开内容的药物组合物包含等渗盐水。
用于治疗用途的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂是药学领域中公知的,并且例如描述于Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.RGennaro编辑,1985)中。
药学载体、赋形剂或稀释剂可以根据预期的施用途径和标准药学实践选择。
在一个实施方案中,本文所述的药物组合物可以静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用。在某些实施方案中,药物组合物被配制成局部施用或全身施用。全身施用可以包括涉及通过胃肠道吸收的经肠施用,或肠胃外施用。如本文所用,“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道以外的任何方式施用,如通过静脉内注射。在一个优选的实施方案中,药物组合物经配制用于全身施用。在另一个优选的实施方案中,全身施用通过静脉内施用进行。在本发明的所有方面的一个实施方案中,全身施用编码抗原的RNA。
如本文所用的术语“共施用”意指不同化合物或组合物(如,免疫效应细胞(其可以通过在对象体内产生来“施用”)、和抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞)被施用至同一患者的过程。不同的化合物或组合物可以同时、基本上同时或依次施用。在一个实施方案中,抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞在施用或生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞后,如在施用或生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞之后至少一天,如1至10天或1至5天施用。抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞可以在恒定的时间或不同的时间间隔,如在施用或生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞后,如在10至40天的时间间隔内施用几次,其中抗原、编码抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达抗原的宿主细胞的第一次施用可以是施用或生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞后至少一天,如1至10天或1至5天。
治疗
本文所述的药剂、组合物和方法可用于治疗患有疾病的对象,如以存在表达抗原的患病细胞为特征的疾病。特别优选的疾病是癌症疾病。例如,如果抗原来源于病毒,则药剂、组合物和方法可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。如果抗原是肿瘤抗原,则药剂、组合物和方法可用于治疗其中癌细胞表达所述肿瘤抗原的癌症疾病。
本文所述的药剂、组合物和方法可用于各种疾病的治疗性或预防性治疗,其中提供如本文所述的免疫效应细胞和/或免疫效应细胞的活性对患者有益,如癌症和感染性疾病。在一个实施方案中,本文所述的药剂、组合物和方法可用于预防性和/或治疗性治疗涉及抗原的疾病。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学状况。疾病可能是由初始来自外部来源的因素引起的,如感染性疾病,或其可能是由内部功能障碍引起的,如自身免疫疾病。在人类中,“疾病”通常被更广泛地用于指代会导致受折磨的个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡,或与个体接触的那些人出现类似问题的任何病况。在这个更广泛的意义上,它有时包括伤害、残疾、病症、综合征、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化,而在其他情况下和出于其他目的,这些可以被认为是可区分的类别。疾病通常不仅会在身体方面影响个体,还会在情绪方面影响个体,因为感染和患有许多疾病会改变一个人对生活的看法和一个人的个性。
在本申请的上下文中,术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗性干预”涉及为了对抗诸如疾病或病症的病况的目的而对对象进行管理和护理。该术语旨在包括针对对象所患有的给定病况的全谱治疗,如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症,以延缓疾病、病症或病况的进展,以减轻或缓解症状和并发症、和/或治愈或消除疾病、病症或病况以及预防病况,其中预防被理解为为了对抗疾病、激活或病症的目的而对个体进行管理和护理,并且包括施用活性化合物以防止症状或并发症的发作。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或拖长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体中的疾病,阻止或减缓个体中疾病的发展,抑制或减缓个体中的疾病发展,降低个体中症状的频率或严重程度,和/或降低当前患有或以前患有疾病的个体的复发。
术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可以患有或易患疾病或病症(如癌症)但可能患有或可能没有患有疾病或病症的人类或另外的哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在许多实施方案中,个体是人。除非另有说明,否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄,并且因此包括成人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的实施方案中,“个体”或“对象”是“患者”。
术语“患者”意指用于治疗的个体或对象,特别是患病个体或对象。
在本公开内容的一个实施方案中,目的是提供针对表达抗原的患病细胞(如表达肿瘤抗原的癌细胞)的免疫应答,以及治疗疾病,如涉及表达诸如肿瘤抗原的抗原的细胞的癌症疾病。
可以引发针对抗原的免疫应答,其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。本文所述的药物组合物适用于诱导或增强免疫应答。因此,本文所述的药物组合物可用于涉及抗原的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
如本文所用,“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的综合身体响应,并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。
“细胞介导的免疫”、“细胞免疫”、“细胞免疫应答”或类似术语意在包括针对以抗原表达为特征,特别是以用I类或II类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答涉及称为T细胞或T淋巴细胞的细胞,它们充当“辅助者”或“杀手”。辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调控免疫应答发挥核心作用,并且杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、溶细胞T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤诸如癌细胞的患病细胞,从而防止产生更多的患病细胞。
本公开内容考虑了可以是保护性、防止性、预防性和/或治疗性的免疫应答。如本文所用,“诱导了[或诱导]免疫应答”可以表明在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答,或者它可以表明在诱导之前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答,这在诱导后增强。因此,“诱导了[或诱导]免疫应答”包括“增强了[或增强]免疫应答”。
术语“免疫疗法”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或病况。术语“免疫疗法”包括抗原免疫或抗原疫苗接种。
术语“免疫”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的,例如出于治疗性或预防性原因向个体施用抗原的过程。
术语“巨噬细胞”是指由单核细胞分化产生的吞噬细胞亚群。由炎症、免疫细胞因子或微生物产物激活的巨噬细胞通过水解和氧化攻击非特异性地吞噬并杀死巨噬细胞内的外来病原体,导致病原体降解。来自降解蛋白质的肽展示在巨噬细胞表面上,在那它们可以被T细胞识别并且它们可以直接与B细胞表面的抗体相互作用,导致T和B细胞激活并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞类别。在一个实施方案中,巨噬细胞是脾巨噬细胞。
术语“树突细胞”(DC)是指属于抗原呈递细胞类别的吞噬细胞的另一亚型。在一个实施方案中,树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征是高吞噬活性和低T细胞激活潜力。未成熟的树突细胞不断地从周围环境中采集诸如病毒和细菌的病原体。一旦它们与可呈递的抗原接触,它们就会被激活成成熟的树突细胞并开始迁移到脾脏或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解成小块,并在成熟后使用MHC分子将那些片段呈递在其细胞表面。同时,它们上调在T细胞激活中充当共受体的细胞表面受体,如CD80、CD86和CD40,从而极大地增强了它们激活T细胞的能力。它们还上调了CCR7,这是一种趋化受体,可诱导树突细胞通过血流到达脾脏或通过淋巴系统到达淋巴结。在这里,它们充当抗原呈递细胞,并激活辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞(通过向它们呈递抗原以及非抗原特异性共刺激信号)。因此,树突细胞可以主动诱导T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一个实施方案中,树突细胞是脾树突细胞。
术语“抗原呈递细胞”(APC)是能够在其细胞表面上(或细胞表面处)展示、获得和/或呈递至少一种抗原或抗原片段的多种细胞中的一种细胞。抗原呈递细胞可以区分为专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。
术语“专职抗原呈递细胞”涉及组成性表达与初始T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合物II类(MHC II类)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞的细胞膜上的MHC II类分子复合物相互作用,则抗原呈递细胞产生诱导T细胞激活的共刺激分子。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
术语“非专职抗原呈递细胞”涉及抗原呈递细胞,其不组成性地表达MHC II类分子,而是在某些细胞因子如干扰素-γ的刺激后才表达MHC II类分子。示例性的非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
“抗原加工”是指抗原降解成作为所述抗原的片段的加工产物(如,蛋白质降解成肽)以及这些片段中的一个或多个与MHC分子缔合(如,经由结合)以供诸如抗原呈递细胞的细胞呈递给特定T细胞。
术语“涉及抗原的疾病”、“涉及表达抗原的细胞的疾病”或类似术语是指涉及抗原的任何疾病,如以抗原存在为特征的疾病。涉及抗原的疾病可以是感染性疾病或癌症疾病或简单的癌症。如上所提及的,抗原可以是疾病相关抗原,如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原。在一个实施方案中,涉及抗原的疾病是涉及优选在细胞表面上表达抗原的细胞的疾病。
术语“感染性疾病”是指可以从个体传播到个体或从有机体传播到有机体并且是由微生物因子(microbial agent)(如普通感冒)引起的任何疾病。感染性疾病是本领域已知的并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生虫病,所述疾病分别由病毒、细菌和寄生虫引起。在这方面,感染性疾病可以是例如肝炎、性传播疾病(如衣原体或淋病)、肺结核、HIV/获得性免疫缺陷综合症(AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合症(SARS)、禽流感和流感。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述通常以不受调控的细胞生长为特征的个体的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体地,此类癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经外胚层癌、脊柱轴肿瘤、胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。
如本文所用的术语“实体瘤”或“实体癌症”是指癌性肿块的表现,如本领域中众所周知的,例如在Harrison's Principles of Internal Medicine,第14版中。优选地,该术语是指除血液之外,优选地除血液、骨髓和淋巴样系统之外的身体组织的癌症或癌。例如但不限于,实体瘤包括前列腺癌、肺癌、结直肠组织癌、膀胱癌、口咽/喉组织癌、肾癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胰腺癌、脑癌和中枢神经系统癌。
由于产生的协同效应,癌症治疗中的组合策略可能是期望的,这可能比单一治疗方法的影响要强得多。在一个实施方案中,药物组合物与免疫治疗剂一起施用。如本文所用,“免疫治疗剂”涉及可能参与激活特定免疫应答和/或免疫效应功能的任何药剂。本公开内容考虑使用抗体作为免疫治疗剂。不希望受理论束缚,抗体能够通过各种机制实现针对癌细胞的治疗效果,所述机制包括诱导凋亡、阻断信号转导通路的组分或抑制肿瘤细胞的增殖。在某些实施方案中,抗体是单克隆抗体。单克隆抗体可以经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)诱导细胞死亡,或结合补体蛋白,导致直接的细胞毒性,称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。可与本公开内容结合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(括号内)的非限制性实例包括:阿巴伏单抗(CA-125)、阿昔单抗(CD41)、阿德木单抗(EpCAM)、阿托珠单抗(CD20)、培阿赛珠单抗(VEGFR2)、喷替酸阿妥莫单抗(CEA)、阿麦妥单抗(MORAb-009)、马安那莫单抗(TAG-72)、阿波珠单抗(HLA-DR)、阿西莫单抗(CEA)、阿替利珠单抗(PD-L1)、巴维昔单抗(磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(CD22)、贝利尤单抗(BAFF)、贝伐珠单抗(VEGF-A)、美坦新比瓦妥单抗(CD44v6)、博纳吐单抗(CD 19)、维布妥昔单抗(CD30 TNFRSF8)、美坦新坎妥珠单抗(粘蛋白CanAg)、瑞伐坦坎妥单抗(MUC1)、卡罗单抗喷地肽(前列腺癌细胞)、卡芦单抗(CNT0888)、卡妥昔单抗(EpCAM、CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、泊西他珠单抗(EpCAM)、西妥木单抗(IGF-1受体)、克劳西单抗(密封蛋白)、泰坦-克利妥珠单抗(MUC1)、可那木单抗(TRAIL-R2)、达西组单抗(CD40)、达洛珠单抗(胰岛素样生长因子I型受体)、地舒单抗(RANKL)、地莫单抗(B-淋巴瘤细胞)、曲齐妥单抗(DR5)、依罗美昔单抗(GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(EpCAM)、埃罗妥珠单抗(SLAMF7)、依那妥单抗(PDL192)、恩妥昔单抗(NPC-1C)、依帕珠单抗(CD22)、厄妥昔单抗(HER2/neu、CD3)、依拉西珠单抗(整合素ανβ3)、法拉妥单抗(叶酸受体1)、FBTA05(CD20)、非卡妥珠单抗(SCH 900105)、芬妥木单抗(IGF-1受体)、法兰妥单抗(糖蛋白75)、非苏木单抗(TGF-β)、加利昔单抗(CD80)、加尼妥单抗(IGF-I)、奥加米星吉妥单抗(CD33)、吉伏珠单抗(ILΙβ)、吉伦妥昔单抗(碳酸酐酶9(CA-IX))、维格伦巴单抗(GPNMB)、替伊莫单抗(CD20)、艾芦库单抗(VEGFR-1)、伊戈伏单抗(Igovoma)(CA-125)、拉坦素英达妥昔单抗(SDC1)、英妥木单抗(CD51)、奥加米星伊妥珠单抗(CD22)、伊匹单抗(CD152)、伊妥木单抗(CD30)、拉贝珠单抗(CEA)、来沙木单抗(TRAIL-R2)、利韦单抗(乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(CD33)、美坦新洛伐单抗(CD56)、卢卡单抗(CD40)、鲁昔单抗(CD23)、马他妥单抗(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(EGFR)、美泊利单抗(IL5)、米拉妥珠单抗(CD74)、米妥莫单抗(GD3神经节苷脂)、莫格利珠单抗(CCR4)、莫妥昔单抗假单抗(CD22)、他那可洛单抗(C242抗原)、埃托-那普妥莫单抗(5T4)、纳那妥单抗(RON)、耐昔妥珠单抗(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、纳武单抗(IgG4)、奥法妥木单抗(CD20)、奥拉单抗(PDGF-R a)、奥那妥组单抗(人分散因子受体激酶)、莫奥珠单抗(EpCAM)、奥曲果单抗(CA-125)、奥塞芦单抗(OX-40)、帕尼单抗(EGFR)、帕曲妥单抗(HER3)、培马单抗(MUC1)、Pertuzuma(HER2/neu)、平妥莫单抗(腺癌抗原)、普妥木单抗(波形蛋白)、雷妥莫单抗(N-羟乙酰基神经氨酸)、雷曲妥单抗(纤连蛋白外结构域-B)、雷韦单抗(狂犬病病毒糖蛋白)、雷莫卢单抗(VEGFR2)、利妥木单抗(HGF)、利妥昔单抗(CD20)、罗妥木单抗(IGF-1受体)、萨马珠单抗(CD200)、西罗妥珠单抗(FAP)、司妥昔单抗(IL6)、他贝芦单抗(BAFF)、替西塞坦他卡妥珠单抗(甲种胎儿蛋白)、帕他普莫单抗(CD19)、替妥莫单抗(腱生蛋白C)、替妥木单抗(CD221)、替西木单抗(CTLA-4)、替加妥珠单抗(TRAIL-R2)、TNX-650(IL13)、托西莫单抗(CD20)、曲妥珠单抗(HER2/neu)、TRBS07(GD2)、曲美木单抗(CTLA-4)、西莫白介素图库斯珠单抗(EpCAM)、乌布妥昔单抗(MS4A1)、乌瑞芦单抗(4-1BB)、伏洛昔单抗(整合素α5β1)、伏妥莫单抗(肿瘤抗原CTAA 16.88)、扎妥木单抗(EGFR)和扎诺莫单抗(CD4)。
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呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用各种实施方案。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文描述的实例的各种修改对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的,并且本文定义的一般原理可以应用于其他实例和应用而不背离各种实施方案的精神和范围。因此,各种实施方案不旨在限于本文描述和示出的实例,而是要符合与权利要求一致的范围。
实施例
实施例1:材料和方法
嵌合抗原受体(CAR)的构建.
通过将免疫球蛋白重链可变区的信号肽序列(基因库编号AAC18316.1)与来源于IMAB206-C46S抗体的人CLDN6-特异性单链可变片段(scFv)(WO20121560018)连接而构建CLDN6-CAR。scFv片段与人CD8α铰链和跨膜区(基因库编号NP_001759.3,aa 138-206)融合,然后是人4-1BB(基因库编号NP_001552.2,aa 214-255)和人CD3ζ(基因库编号NP_000725,aa 52-163,Q65K)信号传导部分。CLDN18.2-CAR基于相同的第二代CAR支架,其具有来源于IMAB362抗体的取代的scFv(WO2013174404A1)。将密码子优化和合成的序列(EurofinsGenomics)克隆到γ-逆转录病毒自灭活(SIN)载体pES.12-6中,以在人类和鼠T细胞中在短的无内含子形式的人延伸因子1-α启动子(EFS)的控制下稳定过表达。对于体内成像,CAR基因经由2A-剪接元件连接至萤火虫荧光素酶(Luc)和eGFP报告基因(Szymczak A.L.等人,Nature Biotechnology 22,589-594(2004))。
动物
雌性C57BL/6BrdCrHsd-Tyrc小鼠、C57BL/6小鼠、BALB/c购自Envigo和Janvier(8-12周龄)。在整个同系小鼠实验中使用性别匹配的动物。NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠的繁殖对购自Jackson实验室(Bar Harbour,ME,USA)。这些以及同类系C57BL/6-Thy1.1和BALB/c-Thy1.1供体小鼠(Jackson Lab)在德国BioNTech SE的动物设施中饲养。用年龄和性别混合的动物进行NSG小鼠的研究。所有实验均在无特定病原体(SPF)条件下并根据德国动物实验规定进行。
细胞系、培养条件、病毒上清液的生成
将人细胞系,包括卵巢癌OV-90-SC12、SK-OV-3和NIH-OVCAR-3、乳腺癌MDA-MB-231和MCF7、肺癌LCLC-103H、CPC-N和COLO-699-N、SK-MEL-37黑色素瘤、胃癌23132-87、HEK-293胚胎肾细胞、滋养细胞癌JAR和NEC8胚胎睾丸癌细胞在标准条件下培养。PA-1-SC12_A02_gfp(称为PA-1)和PA-1-SC12_A02_gfp_CLDN18.2_CLDN6-/-(在CLDN6-CAR实验中称为PA-1-CLDN6-/-或在CLDN18.2-CAR实验中称为PA-1-CDLN18.2)是经慢病毒转导以过表达HLA-A*0201和GFP的人内源性CLDN6表达畸胎瘤细胞系PA-1-SC12的两种衍生物。该细胞系的进一步修饰是慢病毒转导以使用以下引导RNA靶向序列(5’-3’)过表达CLDN18.2和CRISPR/Cas9介导的CLDN6基因敲除:AA AGC GGT CAC CTT CCA CAT(Eurofins Genomics)。NCI-N87-CLDN18.2胃癌细胞系被逆转录病毒转导以过表达CLDN18.2。通过慢病毒转导生成小鼠肿瘤细胞系LL/2-LLc1-hCLDN6(Lewis肺癌)、CT26-mCLDN18.2(结直肠癌)和B16-hCLDN6(黑色素瘤)。对于所有具有异源密封蛋白表达的细胞系(病毒转导的和RNA转染的两者),除了CT26-mCLDN18.2细胞系外,都使用了人类直系同源物。
收到后立即生成主细胞库和工作细胞库。第三代和第四代用于体内肿瘤实验。每三个月对细胞进行一次支原体测试。收到后未对细胞进行重新验证。
293Vec-Galv和Platinum-E细胞用于生成GALV和MLV-E假型病毒颗粒。根据制造商的说明书,用TransIT-LT1(Mirus)转染细胞。转染后48小时和72小时收集逆转录病毒上清液,并使用Jurkat-mCAT细胞评价滴度(Koste L.等人,Gene therapy 21,533–538(2014))。对于一些实验,稳定的生产者克隆已用于生产逆转录病毒上清液(BioNTech IMFS)。
RNA构建体和体外转录
用于编码抗原的RNA的体外转录的质粒模板基于pST1-T7-GG-hAg-MCS-2hBg-A30LA70载体及其变体。这些载体的特征是针对稳定性和蛋白质翻译在药理学上优化的5’和3’UTR及poly(A)尾,具体是5’人α-球蛋白,两个连续的3’人β-球蛋白UTR和一个poly(A)尾,所述poly(A)尾的长度测量为110个核苷酸,由一段30个腺苷残基,然后是10个核苷酸的接头序列和另外的70个腺苷组成。克隆至这些载体中的编码序列分别是人密封蛋白-6(NP_067018.2)、密封蛋白-3(NP_001297.1)、密封蛋白-4(NP_001296.1)、密封蛋白-9(NP_066192.1)、密封蛋白-18.2(NP_001002026.1)、人CD19(NP_001171569.1)或萤火虫萤光素酶的全长ORF。在一个实验中,使用了RNA编码的卵白蛋白-表位SIINFEKL(OvaI),其3’侧接有分泌信号并且5’侧接有MHC I跨膜和胞内结构域,用于在转染细胞的MHC I类和II类上的优化呈递(Kreiter S.等人,J.Immunol.180,309–318(2008))。
如前所述进行体外转录和用β-S-抗反向帽类似物(ARCA)加帽(Holtkamp S.等人,Blood 108,4009–4017(2006))。
人外周血单个核细胞(PBMC)和树突细胞(DC)
通过-Hypaque(Amersham Biosciences)密度梯度离心从来自获自德国美因茨输血中心大学医院(transfusion center university hospital Mainz,Germany)的健康供体的血沉棕黄层中分离PBMC。将单核细胞用抗CD14微珠(Miltenyi Biotec)富集。未成熟的DC(iDC)通过补充有1,000IU/mL重组人(rh)GM-CSF和1,000IU/mL rh IL-4(均来自Miltenyi Biotec)的由RPMI 1640GlutaMAXTM、50IU/mL青霉素、50μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸和5%(v/v)热灭活人AB血清(均来自Invitrogen,Karlsruhe,Germany)组成的培养基进行分化5天。
人类T细胞的逆转录病毒工程化
利用3:1的珠粒-与-CD3+T-细胞的比率,使用Human T-ExpanderCD3/CD28 CTS(Life Technologies)通过CD3+/CD28high T细胞的磁性分离从DC耗竭的PBMC中富集T细胞,并在450IU/mL rh IL-7和50IU/mL rh IL-15(均来自Miltenyi Biotec)的存在下在补充有5%(v/v)人血清的X-VIVO 15培养基(Lonza)中培养。三天后,去除CD3/CD28珠粒并将预激活的T细胞在25μg/mL(Immundiagnostik AG)和GALV假型逆转录病毒上清液的存在下转导一次。将细胞在450IU/mL rh IL-7和50IU/mL rh IL-15的存在下再扩增4天,并直接用于评估CAR表面表达、T细胞表型和体外/体内-效应子功能或者冷冻保存。
小鼠T细胞的逆转录病毒工程化
将初始C57BL/6-Thy1.1+或BALB/c-Thy1.1+小鼠的脾细胞用DynabeadsTM小鼠T-激活剂CD3/CD28(gibco)以1:1的珠粒-与-CD3+T-细胞比在450IU/mL rh IL-7和50IU/mL rhIL-15的存在下在补充有10%FBS,1x NEAA、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES、50μM b-巯基乙醇、50IU/mL青霉素和50μg/mL链霉素的RPMI1640-GlutaMAX中预激活。珠粒激活后24小时,将细胞轻轻旋转(1h,37℃,300xg)并在MLVE-假型γ-逆转录病毒载体预包被的RetroNectin板上孵育。在另外的过夜培养后,在新鲜病毒颗粒包被的板上重复旋转转导。初始预激活后72小时,从培养物中去除DynabeadsTM小鼠T激活剂CD3/CD28,并在提供有450IU/mL rh IL-7和50IU/mL rh IL-15的以上提及的培养基中将细胞扩增另外72小时。在一些实验中用作对照的非转导T细胞经历了相同的珠粒激活和扩增程序。经由流式细胞术评估转导的鼠T细胞上的转基因表达。
肿瘤细胞的植入
将在100μL PBS中的5x106个OV90-SC12、2-5x106个NCI-N-87_hCLDN18-2、4x105个LL/2-LLC1-hCLDN6-gfp-luc或5x105个CT26-mCDLN18.2肿瘤细胞皮下注射至小鼠的右后腹。使用Microsoft Excel的Daniels的XL工具箱插件(Daniels′s XL Toolbox Add-in forMicrosoft Excel)对之前的ACT荷瘤进行分层,以实现处理组之间的均匀肿瘤体积分布。每两到三天用卡尺测量肿瘤大小,以使用方程(a2×b)/2(a,宽度;b,长度)计算肿瘤体积。当表现出健康受损迹象时,当溃烂肿瘤的体积超过1,500mm3时,使动物安乐死。
过继细胞转移(ACT)和RNA-LPX处理
对于小鼠T细胞的ACT,将表达CAR的Thy1.1+T细胞静脉内注射至全身辐照的非荷瘤C57BL/6BrdCrHsd-Tyrc(2.5Gy),或荷瘤C57BL/6(5Gy)和BALB/c(4Gy)供体小鼠中的眼球后静脉丛内(如果没有另外说明)。除非对CAR T-细胞体内扩增另有说明,否则小鼠接受20μg RNA-LPX。用非相关抗原RNA-LPX或盐水处理的小鼠用作对照。盐水用作PBS的同义词,图3C除外,其中使用了150mM NaCl。对于CAR T细胞体内扩增研究,使用Luc-GFP共表达CAR T细胞。没有报告基因共表达的CAR T细胞用于研究抗肿瘤功效。
对于人类T细胞的ACT,将解冻或新鲜转导的人类T细胞(如图所示的CAR-或GFP-转基因阳性T细胞的数量)静脉内注射到眼球后神经丛中。T细胞在体外激活和转导后立即使用,或者在PBS中洗涤2次后冷冻保存、解冻和转移。通常,T细胞产物的活力>90%。
生物发光成像
使用Xenogen IVIS光谱成像系统(Caliper Life Sciences)通过体内生物发光成像评价Luc-RNA的生物分布、CAR-Luc-GFP转导的T细胞扩增、摄取和翻译。简而言之,腹膜内注射D-荧光素水溶液(80mg/kg体重;Perkin Elmer)。从活体动物发射的光子在5分钟后被量化,暴露时间为1分钟。目的区域(ROI)被量化为总通量(光子/秒,由彩条表示)。使用Living Image 4.0软件叠加图像。对于CAR T细胞扩增的量化,将指定时间点的总通量除以基线处的总通量。
IVT RNA的电穿孔
在预冷的4-mm间隙无菌电穿孔比色皿(Bio-Rad)中,将1μg IVT RNA添加至悬浮在X-VIVO 15中的细胞。使用ECM 830方波电穿孔系统进行电穿孔(BTX:Colo699-N细胞:300V,8ms,1个脉冲)。电穿孔后24小时经由流式细胞术评估转染效率。
脂质体抗原编码RNA(RNA-LPX)的生成和DC的体外转染
如上所述,通过从经优化以提高RNA稳定性和翻译效率的DNA质粒模板体外转录生成编码抗原的RNA。使用包括分泌信号在内的密封蛋白的全长序列,以确保在细胞中表达后在自然拓扑中的膜表达。如前所述生成脂质体复合物(Kranz L.M.等人,Nature.534,396-401(2016))。简而言之,脂质级分含有摩尔比为2:1的DOTMA/DOPE的辅助脂质DOPE,并且组装颗粒以实现1.3:2的阳离子DOTMA和RNA的电荷比。对于体外转染,将3x106个供体匹配的未成熟DC与编码CLDN6或CLDN18.2的RNA-LPX(在150mM NaCl中缓冲)一起孵育。
增殖测定
将人类CAR转导的T细胞用0.8μM羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE,Invitrogen)标记,并在圆底板中以10:1的E:T比与RNA-LPX转染的DC共培养。24小时后收集培养物上清液用于细胞因子多重分析。在共培养开始后120小时通过流式细胞术评估T细胞的增殖。
对于体内增殖分析,在ACT之前,将鼠Luc-GFP共表达的CAR T细胞用2.5μM CellProliferation Dye eFluorTM450(CPD450,Invitrogen)标记。ACT后52小时(RNA-LPX处理后48小时),将解剖的脾脏、同侧腹股沟(ing.)、腋窝(ax)、颈椎(cerv.)和对侧腹股沟淋巴结(LN)的单细胞悬液用抗Thy1.1抗体进行表面染色,通过流式细胞术分析Thy1.1+GFP+细胞的增殖。
细胞毒性测定
基于球状体的细胞毒性:3D肿瘤球状体从104个PA-1-SC12_A02_gfp和PA-1-SC12_A02_gfp_CLDN18.2_CLDN6-/-细胞系在超低附着96-孔板(Costar)中生成。在接种后48小时,将105个非转导的T细胞或CAR转导的T细胞于GibcoTMFluoroBriteTMDMEM(LifeTechnologies)中添加至球状体。在37℃、5%CO2下,在IncuCyte Zoom Live-含量成像系统(Essen Bioscience)中以4倍放大率和300ms的暴露时间对孔进行成像以检测绿色荧光。第一次共培养后168小时,将T细胞用新生成的肿瘤球状体进行第二次攻击。使用IncuCyte分析软件对数据进行分析,以检测和量化总的绿色物体综合强度(GCU×μm2/图像)。使用IncuCyte分析软件绘制每个时间点的绿色物体计数的平均值。
在图1D、1E和图3D中,使用xCELLigence系统(OMNI Life Science)评估了CAR介导的细胞毒性。根据供应商的说明书进行细胞指数(CI)阻抗测量。将2×104个人类靶细胞(除了LCLC-103H之外,在此1×104个/孔)接种于E-板96PET中的每孔内。在图3D中,将2.5×103个B16-hCLDN6或B16-F10细胞接种于E-板96(均来自ACEA Biosciences Inc.)中。24-28小时后,将人类CAR转导的T细胞或离体分选的鼠CAR表达T细胞以指定的比率以200μL的终体积添加到肿瘤细胞中,并且由xCELLigence系统每30分钟监测一次,持续长达48小时的时间段。最大CI对应于最小裂解(Lmin),并且在将靶细胞仅与未转导的效应人类T细胞或鼠靶细胞一起孵育后进行评估。12或24小时后评估人类靶细胞的特异性裂解百分比,共培养20小时后鼠靶细胞的裂解,并且如下计算:(CI Lmin–CI样品)/CI Lmin×100。
细胞因子多重分析
在根据制造商的说明书,使用Bio-Plex 2000将CAR T细胞与RNA-LPX转染的iDC进行24小时共培养之后,使用用于定量分析培养上清液中的人类IL-2、IFNγ和TNFα的ProcartaPlexTM3-Plex试剂盒免疫测定(Invitrogen,PPX-03-MXGZFMP),其由经制备的磁珠的预先配置的多分析物试剂组组成。高灵敏度5-Plex Mouse ProcartaPlexTM Panel用于测量在携带CLDN6-CAR T的C57BL/6BrdCrHsd-Tyrc小鼠中的RNA-LPX处理的不同时间点之后的血清细胞因子水平。收集血清并从储存在-20℃的样品中测定鼠IFNγ、IL-2、IL-4、IL-6和TNFα-水平。除了少数例外,未稀释的样品用作测定的输入。使用批次的检测水平如下:IFNγ:0.06-260pg/mL;IL-2:0.12-490pg/mL;IL-4:0.14-560pg/mL;IL-6:0.70-2850pg/mL;TNFα:0.34-1390pg/mL。未检测到IL-2和IL-4。将单个样品中不可检测的IFNγ/IL-6/TNFα水平设为零,并在相应的图中进行印迹。
流式细胞术
通过Alexa Fluor 647偶联的抗独特型抗体评估鼠和人T细胞上的CAR表面表达。
已经使用了用于人T细胞和PBMC的胞外染色的单克隆抗体,简而言之,CD45-PE-Cy7(BD;克隆:HI30)、CD4-APC-Cy7(BD/BioLegend;克隆:SK3或OKT4)、CD4-PerCP-Cy5.5(eBioscience;克隆:RPA-T4)、CD8a-BV421(BD;克隆:RPA-T8)、CD137-PE(BD;克隆:4B4-1)、CD134-PE(BD;克隆:L106)。
不同密封蛋白的表面表达通过以下评估:抗CLDN6-DyLight650(WO20121560018;克隆:IMAB027)、抗CLDN18.2-AlexaFluor647(WO2013174404A1;克隆:IMAB362)、未缀合的抗CLDN9(Aldevron,克隆:YD-4E9)、未缀合的大鼠IgG2b同种型对照、抗大鼠IgG2b-PE(均来自eBioscience;克隆:R2B-7C3)、未缀合的抗CLDN3(克隆:385021)、未缀合的抗CLDN4(均来自R&D Systems;克隆:382321)、未缀合的小鼠IgG2a同种型对照(BioLegend;克隆:MOPC-173)、未缀合的大鼠IgG2b同种型对照(eBioscience)和affiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(H+L)-APC(Jackson Immuno Research,多克隆)。使用7-AAD(Beckman Coulter)、Fixable Viability Dye eFluor 506或eFluor 780(均来自eBioscience)测定活力。
已经使用了用于鼠脾细胞或鼠PBMC的胞外染色的单克隆抗体,简而言之:CD3-BV605(克隆:145-2C11)、CD4-APC-Cy7(克隆GK1.5)、CD4-BV480(克隆:RM4-5)、CD8-BV421(所有来自BD)、CD8-eFluor506(eBioscience)、CD8-PE(所有克隆:53-6.7)、CD11b-FITC(克隆:M1/70)、CD11c-PE-Cy7(所有来自BD;克隆:HL3)、CD19-PerCP-Cy5.5(BioLegend;克隆:1D3)、CD40-BV786(BD;克隆:3/23)、CD45-BV605(BD;克隆:30-F11)、CD62L-APC-Fire750(BioLegend;克隆:MEL-14)、CD69-PE(BD;克隆:H1.2F3)、CD86-BV510(BioLegend;克隆:GL1)、CD90.1-PerCP(克隆:Ox-7)、CD90.2-PE(BD;克隆:53-2.1)、CD127-PE-Cy7(所有来自BD;克隆:SB/199)、F4/80-BV421(BioLegend;克隆:BM8)、KLRG1-eFluor450(eBioscience;克隆:2F1)、NK1.1-BV786(BD;克隆:PK136)、PDCA-1-PE(Miltenyi;克隆:JF05-1C2.4.1)。
为了检测循环的小鼠或人类T细胞,将50μL外周肝素化血液用抗体染色,随后使用ACK裂解缓冲液(gibco)或BD FACS裂解溶液(BD)裂解。使用FoxP3/转录因子染色缓冲液组和Ki67-eFluor450(克隆:SolA15;均来自eBioscience)在用RNA-LPX或盐水处理过继转移有CLDN6-CAR T细胞的C57BL6-白化小鼠后第2天和第7天评估脾细胞中Thy1.1+淋巴细胞的离体Ki67水平。在相同时间点,在1x蛋白质转运抑制剂(eBioscience)的存在下将3x105个脾细胞分别与1x105个B16-hCLDN6或B16-F10 WT细胞在37℃下孵育5小时之后,使用cytofix/cytoperm试剂盒(BD)和IFNγ特异性抗体(eBioscience;克隆:XMG1.2)进行胞内IFNγ染色。
对于细胞分选,在指定的时间点,分离RNA-LPX处理小鼠的脾细胞,并分别通过使用包被有CD90.2或CD19抗体的MACS磁性微珠和MACS柱(Miltenyi Biotec)同时磁性耗竭内源性T和B细胞进行预富集。每个处理组汇集每只小鼠的富集细胞,然后将CAR T细胞(Thy1.1+CD8+GFP+)在BD FACSMelody细胞分选仪上分选并用于离体细胞毒性测定。
定量实时PCR(qRT-PCR)
使用TRIzol/氯仿提取方案提取总RNA,并使用RNeasy微型试剂盒(QIAGEN)净化水相。随后,在1.0μg总RNA上进行逆转录,并使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNAEraser(Takara Bio Inc.)。qRT-PCR使用BioMarkTMHD系统和SsoFastTM Supermix with Low ROX(Bio-Rad Laboratories)进行。根据“在BioMarkTM或BioMark HD系统上使用进行快速基因表达分析”高级开发协议37制备和分析样品和测定。使用IFC Controller HX加载96.96基因表达动态阵列IFC(96.96GeneExpression Dynamic Array IFC)。用于分析中的引物:(5’-3’)CLDN6-for:ACT CGG CCTAGG AAT TTC CCT、CLDN6-rev:CAG AGG CCA TGG CGA GG、HPRT1-for:TGA CAC TGG CAAAAC AAT GCA、HPRT1-rev:GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT、TBP-for:GAG CCA AGA GTG AAGAAC AGT C、TBP-rev:GCT CCC CAC CAT ATT CTG AAT CT、HMBS-for:AGC CCA GCT GCA GAGAAA GT、HMBS-rev:GGA TGA TGG CAC TGA ACT CC、CLDN18-for:GTG ACT GCC TGT CAG GGCT、CLDN18-rev:GGA CAC AGG AGC GCC AC(退火温度:60℃)。通过对三个管家基因(Tbp、Hprt1、Hmbs)和来源于所有分析组织的培养基表达值进行归一化获得ΔΔCT值。在图S2B中,2.0μg总RNA、寡聚-dT(18x dT)引物和SuperScript II逆转录酶试剂盒(Invitrogen)用于逆转录。在Applied Biosystem 7300实时PCR系统仪器和QuantiTect SYBR Green PCRKit(QIAGEN)上进行表达分析。用于分析中的引物:(5’-3’)CLDN6-for:CTT ATC TCC TTCGCA GTG CAG、CLDN6-rev:AAG GAG GGC GAT GAC ACA GAG(退火温度:58℃)、HPRT1-for:TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA、HPRT1-rev:GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT(退火温度:62℃)。通过对参考基因Hprt1和来源于所有分析组织的培养基表达值进行归一化获得ΔΔCT值。对于这两种分析,ΔΔCT值随后从log2转换为线性标度。图1A所示的qRT-PCR数据是使用从商业供应商获得的健康组织样品和没有肿瘤相关疾病的死后手术样品生成的。
已公开的RNAseq群组的表达分析
获得TCGA肿瘤(dbGaP登录:phs000178)和GTEx正常群组(dbGaP登录:phs000424.v4.p1)的RNAseq表达数据。使用STAR RNA-seq比对器(Dobin A.等人,Bioinformatics(Oxford,England)29,15-21(2013))和随后的读取计数和归一化来确定基因表达。
免疫组织化学染色
手术标本和活检样品的福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织切片获自K.Dhaene博士(病理科(Department of Pathology),Algemeen Stedelijk Ziekenhuis,Aalst,Belgium)。组织微阵列(TMA)购自Biocat(Heidelberg,Germany)或从处死的小鼠内部收集。将3-4μm厚的组织切片脱蜡,然后通过在120℃下在补充有0.05%吐温-20(pH 6.0)的10mM柠檬酸中煮沸10分钟进行抗原修复,随后猝灭(通过0.3%H2O2;15分钟)并在室温下用10%的于PBS中的山羊血清封闭(30分钟)。将载玻片在2-8℃下与0.2μg/mL抗CLDN6(IBL,#18865)、1:1,000抗CD3(Abcam,ab16669)、1:500抗荧光素酶(Abcam,ab21176)、1:1,000抗F4/80(Thermo Scientific,MA5-16363)或1:500抗CD11c(BD Biosciences,565227)抗体在封闭缓冲液中孵育过夜。使用基于聚合物的BrightVision抗体BrightVision HRP山羊-a-兔(Immunologic,DPVR-110HRP)连同红色底物色原溶液(VectorRed;SK-4800Vector Labs,Burlingame,USA),用辣根过氧化物酶标记的二抗使抗体结合可视化。随后用梅耶苏木精(Mayer’s haematoxylin)(Carl Roth;T865.2)对切片进行复染,并进行全载玻片成像(Zeiss;AxioScan Z1)。
对于苏木精/伊红(HE)染色,使用Leica ST5020多功能染色机。脱蜡后,首先对所有载玻片进行梅耶苏木精(Carl Roth;T865.2)染色,然后进行伊红-G 0.5%(Carl Roth;X883.2),均持续4分钟,然后在自来水中显影5分钟。将载玻片固定并进行全载玻片成像(Zeiss;AxioScan Z1)。
数据的统计分析和描述
所有结果均以技术重复的平均值+/-SD或生物重复的平均值+/-SEM表示。每个实验的统计分析在相应的图例中进行了描述。未配对的双尾学生t检验用于比较两组。选择配对t检验对同一对象在两个不同时间点进行重复测量。当比较两个以上的组时,进行单向方差分析(ANOVA)。在比较时间和处理两者时进行双向ANOVA,并且当使用图基事后检验进行显著(P<0.05)的多重比较时,使用对数秩检验确定存活益处。通过皮尔逊乘积相关系数(Pearson’s product correlation coefficient)r计算转移的CAR T细胞数量与生物发光之间的相关性。所有统计分析均使用GraphPad PRISM 6.04进行。ns=不显著,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。没有使用统计方法来预先确定动物或其他实验的样品量。
实施例2:RNA疫苗驱动CAR T细胞的体内扩增和功效
采用表达CAR的经遗传工程化的T细胞的过继细胞疗法(ACT)在患有B细胞恶性肿瘤的患者中取得了临床成功(Neelapu S.S.等人,The New England journal of medicine377,2531–2544(2017);Maude S.L.等人,The New England journal of medicine 378,439–448(2018))。然而,在患有实体瘤的患者中,CAR T-细胞疗法的功效仍然令人失望(Scarfo I.等人,Journal for immunotherapy of cancer 5,28(2017))。一个关键障碍是缺乏具有高的癌症特异性表达的细胞表面靶标,以允许有效的肿瘤根除和低的脱肿瘤/命中靶标毒性的风险(Morgan R.A.等人,Mol.Ther.18,843–851(2010);Lamers C.H.等人,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 21,904–912(2013);Richman S.A.等人,Cancer immunology research 6,36–46(2018))。我们和其他人最近报道了密封蛋白(CLDN)6的癌症相关表达,所述密封蛋白(CLDN)6是一种参与紧密连接形成的跨膜四蛋白膜蛋白(Turksen K.等人,Dev.Dyn.222,292–300(2001))。为了评价CLDN6作为CAR T-细胞疗法的靶标的适用性,我们对它在一组综合组织中的表达进行了分析。在小鼠中,已经报道了CLDN6是发育调控的(Turksen K.,Journal of cell science117,2435–2447(2004))。通过免疫组织化学(IHC)染色,我们发现CLDN6在胎儿器官中广泛表达,但在产前下调,导致成年小鼠的大多数器官中缺乏表达(数据未显示)。在人类中,CLDN6转录物水平在来源于胃、胰腺、肺和肾的胎儿组织中很高,但在相应的成人组织样品中检测不到(数据未显示)。在通过定量RT-PCR分析的来自50种以上成人组织类型的160多种非癌性健康人类样品中,排除了CLDN6转录物表达(图1A)。一致地,在通过IHC染色评估的>40种测试的成人正常组织类型中的任一种中均未检测到CLDN6蛋白(图1B)。与之前的研究(Ushiku T.等人,Histopathology 61(6):1043-56(2012);Micke P.等人,Internationaljournal of cancer 135,2206–2214(2014))一致,高CLDN6转录物水平常见于各种人类实体癌症,如睾丸腺癌、卵巢腺癌、子宫腺癌和肺腺癌(图1A)。IHC染色显示了CLDN6蛋白在这些人类癌症中的膜表达,其在许多测试样本中是高的且同质的(数据未显示)。
这些发现表明CLDN6在人类中非常紧密和完全沉默,尽管在小鼠中没有,并且将CLDN6定量为具有针对CAR T-细胞靶向的理想表达谱的严格癌胚细胞表面抗原(JuneC.H.,Science(New York,N.Y.)。359,1361-1365(2018))。我们设计了含4-1BB共刺激结构域的第2代CLDN6-CAR。对于受体结构域,我们工程化了单链可变片段(scFv),其在纳摩尔范围内对CLDN6具有精细特异性和高结合亲和力(图1C)。
首先,我们在体外表征了CLDN6-CAR-工程化的人类T细胞。用递增量的CLDN6 RNA转染CLDN6neg COLO-699N肺癌细胞并评估CAR T细胞进行的杀伤(图1D)。我们观察到CLDN6-CAR对CLDN6-转染的靶细胞的高度灵敏识别和裂解,即使在最低靶表达水平下亦如此。
在类似的实验环境中,我们评价了CLDN6-CAR对CLDN3、CLDN4和CLDN9(最密切相关的密封蛋白家族成员)的交叉识别,它们与CLDN6相反在毒性相关的正常组织中表达。CAR靶向的CLDN6的第一胞外环与这些密封蛋白的相应氨基酸序列之间的同源性分别为81%、85%和98%,具有CAR的交叉反应性和脱靶毒性的风险。仅CLDN6转染的靶细胞,而不是用相关密封蛋白转染的那些,都被杀伤,证明了CLDN6-CAR T细胞的精确靶向(图1E)。
为了测量同源免疫激活,我们将CLDN6-CAR T细胞与人肿瘤细胞系共培养。我们发现在与CLDN6pos靶标而非CLDN6neg细胞共培养后,干扰素-γ(IFNγ)分泌和T细胞激活标志物的上调(图1F)。CLDN6-CAR T细胞能够有效清除CLDN6pos PA-1卵巢癌球状体,并在再次攻击后重复杀伤(图1G)。通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除缺失CLDN6(图1G顶部)完全消除了CAR T-细胞对PA-1的识别,进一步证实了CLDN6-CAR T细胞的高效力和靶特异性。
接下来,我们研究了人类CLDN6-CAR T细胞在皮下异种移植人类肿瘤细胞系的小鼠中的体内抗肿瘤活性。值得注意的是,CLDN6-CAR T细胞对鼠CLDN6的结合亲和力比对人CLDN6低15倍,而人CLDN6严格局限于胚胎阶段,鼠CLND6在一些胚胎后体细胞组织中表达。具有大OV90肿瘤(平均体积168mm3)的NSG小鼠经历了用单剂量人类CLDN6-CAR T细胞或对照细胞进行的ACT。值得注意的是,所有CLDN6-CAR T细胞处理的小鼠在2周内都经历了完全的肿瘤消退,而在对照组中肿瘤进展迅速(图1H)。在ACT后长达25天的完整观察期内,在治愈的小鼠中可检测到循环的CLDN6-CAR T细胞(数据未显示)。
已知转移的CAR T细胞的植入和持久性对其临床效应至关重要(Maude S.L.等人,The New England journal of medicine 371,1507–1517(2014);Kalos M.等人,Sciencetranslational medicine 3,95ra73(2011);Porter D.L.等人,Science translationalmedicine 7,303ra139(2015))。在血液恶性肿瘤中,CAR T细胞针对B细胞的谱系抗原,并在宿主的正常和恶性B细胞上遇到它们的靶标。这些用作提供强增殖信号的抗原呈递细胞(APC),并促进CAR T细胞的持久性(Kalos M.等人,Science translational medicine 3,95ra73(2011);Porter D.L.等人,Science translational medicine 7,303ra139(2015))。
相比之下,CAR T细胞对抗实体瘤的频率通常会迅速下降(Gargett T.等人,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 24,1135–1149(2016);Feng K.等人,Life sciences 59,468–479(2016);O'Rourke D.M.等人,Science translational medicine9(399)(2017)),这是由于当CAR T细胞在免疫抑制性肿瘤微环境中遇到它们的靶标时实体病灶内肿瘤细胞的可及性受损以及不存在增殖信号。我们假设呈其天然构象的CAR靶标在淋巴样组织中专职APC表面上的表达将使其在最佳免疫激活环境中可用于同源CAR T细胞刺激。
最近,我们引入了静脉内施用的脂质体抗原编码RNA(RNA-LPX)以刺激癌症患者自然库中的肿瘤相关T细胞(Kranz L.M.等人,Nature534,396–401(2016))。这种纳米颗粒疫苗将抗原递送至脾脏、淋巴结和骨髓中的APC,并同时启动Toll样受体依赖性I型IFN-驱动的免疫刺激程序,从而促进抗原特异性T细胞的引发和强烈扩增。
为了测试这种方法是否可以适合作为CAR T-细胞扩增RNA疫苗(简称CARVac),我们进行了一系列实验。
首先,我们测试了CLDN6是否可以在树突细胞(DC)上天然展示并且确实在体外刺激CLDN6-CAR T细胞。我们测量了用不同量的编码CLDN6的RNA-LPX(本文的CLDN6-LPX)处理的DC上CLDN6的浓度依赖性表面表达(图2A,上图面)。所得的CLDN6在DC上的表达以剂量依赖性方式诱导共培养的CLDN6-CAR T细胞的刺激、细胞因子分泌和增殖(图2B,上图面)。当BALB/c小鼠静脉内(i.v.)注射CLDN6-LPX时,在脾DC和巨噬细胞上检测到CLDN6表面表达,但在淋巴细胞上没有检测到(图2C),这证实了CAR抗原在体内仅递送至APC。APC被激活并经历成熟(数据未显示)。在注射了RNA-LPX的小鼠的脾脏和淋巴结中,检测到强烈激活的NK、B和T细胞(数据未显示)。
接下来,向初始C57BL/6小鼠植入用细胞增殖染料标记的CLDN6-CAR T细胞,并用CLDN6-或对照-LPX进行接种。从CLDN6-LPX接种的小鼠但未从对照处理的小鼠切除的所有主要身体区域的脾脏和淋巴结展示出增殖的CLDN6-CAR T细胞的比例显著增加,表明CAR抗原在淋巴样隔室内的全身功能表达(图2D)。
为了评估这种方法的更广泛适用性,我们采取了CLDN18.2,其是CLDN家族中与癌症相关的远缘成员。CLDN18.2在各种高医疗需求肿瘤如胃食管癌和胰腺癌中表达(S.等人,International journal of cancer 134,731–739(2014);Rohde C.等人,Japanese journal of clinical oncology 49,870-876(2019);Sahin U.等人,Clin.Cancer Res.14,7624-7634(2008))。在人类和小鼠两者中,它在正常组织中的表达限于胃粘膜的分化细胞的紧密连接处,在其中它被屏蔽。只有在紧密连接结构的癌症相关扰动后,CLDN18.2抗体结合表位才会暴露(Sahin U.等人,Clinical cancer research:anofficial journal of the American Association for Cancer Research 14,7624–7634(2008))。我们通过用表现出以与人类和小鼠CLDN18.2两者相似的亲和力进行特异性结合的抗CLDN18.2scFv取代CLDN6特异性scFv工程化了CLDN18.2-CAR。CLDN18.2-CAR T细胞显示出发挥了与针对CLDN6-CAR观察到的相似功能特征,包括严格的抗原特异性激活和体外肿瘤细胞杀伤(数据未显示)及在体内完全排斥晚期CLDN18.2pos肿瘤(数据未显示)。与用CLDN18.2-LPX处理的DC共培养的CLDN18.2-CAR T细胞显示出同源激活和增殖(图2A,B下图面)。
接下来,我们在一系列小鼠实验中研究了CARVac概念的体内性能。
向接受全身辐照(TBI)用于淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)的Thy1.2+C57BL/6小鼠植入共表达荧光素酶(Luc)和GFP的Thy1.1+CLDN6-CAR T细胞,随后用CLDN6-LPX进行接种。体内生物发光成像揭示了单个静脉内剂量的CLDN6-LPX诱导循环CLDN6-CAR T细胞的显著扩增(图3A)。扩增与RNA-LPX剂量水平相关,并且即使在0.625μg RNA-LPX的最低剂量下也是显著的。经处理的动物中的外周血T细胞的定量和表型分析证实了增加频率的Thy1.1+CAR T细胞表现出激活的表型(KLRG1hi、CD62Llow),而在RNA-LPX处理后任何剂量下内源性T细胞均未受影响(图3B)。
CAR T-细胞数量在RNA-LPX疫苗接种后3-4天达到峰值,随后下降,模拟了抗原特异性T细胞对刺激的生理响应的动态,具有初始扩增和随后的收缩期(图3A)。
在另一项实验中,各组小鼠接受了不同剂量水平的CLDN6-CAR T细胞,开始时低至103个细胞/小鼠,并且在ACT后不久保持未处理或接受CLDN6-LPX方案。在未接受CLDN6-LPX的小鼠中,如通过生物发光量化的原代CAR T细胞植入与过继转移的细胞数量线性相关,并且随着时间的推移保持稳定或缓慢下降(图3C左、中间的)。值得注意的是,在根据CARVac概念处理的小鼠中,无论起始剂量如何,CAR T细胞都会扩增。实际上,CLDN6-LPX介导的仅103个CAR T细胞的扩增导致外周血中可检测到的频率(图3C右)。几乎整个过继转移的CAR T细胞群体都经历了由RNA-LPX进行的激活和增殖,如大多数转移的T细胞上Ki67的瞬时上调所示(数据未显示)。RNA-LPX扩增的CLDN6-CAR T细胞是完全有功能的。与从未接种疫苗的小鼠分离的CAR T细胞相比,它们在与CLDN6pos肿瘤细胞离体共培养后产生更高水平的IFNγ(数据未显示),并发挥显著更高且严格的抗原依赖性溶细胞活性(图3D)。
如增加的扩增所示,低剂量的CAR T细胞组从重复的RNA-LPX处理中获益更多。高剂量CAR T细胞组的体内扩增在达到高水平后停滞不前,这表明饱和阈值可能是由于T细胞竞争内稳态γc-细胞因子和小生境导致的(图3C中间的)。
为了评估重复RNA-LPX疫苗接种对CAR T细胞长期持久性的影响,CLDN6-CAR T细胞植入的小鼠每周接受三剂RNA-LPX,然后以更长的无处理间隔(4周和4.5周)再进行两次RNA-LPX施用。第一次CLDN6-LPX暴露快速扩增了CAR T细胞超过两个数量级,随后每周处理将CAR T细胞维持在高水平,导致频率超过总外周血淋巴细胞的15%(图3E左,中间的)。在较长的CLDN6-LPX处理暂停中,血液CAR T细胞频率下降。在未接种疫苗的动物中,CAR T细胞数量并没有下降到植入的基线水平,而是稳定在十倍以上的频率。在每次无处理间隔后,CLDN6-CAR T细胞可以被CLDN6-LPX稳健地重新扩增,表明CAR T细胞的记忆形成。通过流式细胞术证实了具有TEM(CD127+、CD62Lneg、KLRG1neg)和TCM(CD127+、CD62L+、KLRG1neg)表型的CAR T细胞的富集(图3E,右)。
细胞因子释放综合征(CRS)作为扩增期中促炎细胞因子的过度和延长分泌的临床表现,是CAR T细胞针对B细胞标志物最突出的严重不良事件(Brudno,J.N.等人,Bloodreviews 34,45–55(2019))。为了结合CARVac概念探索CRS的风险,我们分析了在暴露于CLDN6-LPX后轻度预调理的CLDN6-CAR T细胞植入小鼠中的IFNγ、IL6和TNFα血清浓度。值得注意的是,除了早期的轻度和瞬时的IFNγ升高外,没有观察到促炎细胞因子的相关倾斜(数据未显示),并且经处理的小鼠外观正常,显示了随着时间的推移规律的体重增加(数据未显示)。
由于反复施加RNA-LPX和细胞毒性T细胞效应子的强烈扩增可能有淋巴样组织中APC耗竭的风险,我们将处理过的小鼠的脾脏作为RNA-LPX暴露量最高的器官进行了分析。暴露于单剂量或重复剂量的RNA-LPX的小鼠的脾脏在脾脏结构或者红髓和白髓外观方面未显示任何病理改变(数据未显示)。重复RNA-LPX处理后不同时间点脾脏的细胞组成的流式细胞术显示CD11c+DC和F4/80+巨噬细胞群体的轻度和瞬时减少,以及T细胞、B细胞和NK细胞群体没有数量变化(数据未显示)。从相应时间点开始,脾组织切片中APC亚群的细胞分布没有观察到变化(数据未显示)。
最后,我们研究了RNA-LPX对荷瘤小鼠中的CAR T细胞的治疗功效的影响。具有大的CLDN6pos LL/2-LLc1 Lewis肺肿瘤(平均肿瘤体积209mm3)的经淋巴系统耗竭的C57BL/6小鼠接受了用亚治疗剂量的小鼠CLDN6-CAR T细胞进行的ACT,然后单次注射CLDN6-LPX或对照。通过单独的CLDN6-CAR T细胞对肿瘤控制是不完全的,并且肿瘤生长只是延迟了。相比之下,接受补充有CLDN6-LPX施加的CAR T细胞的小鼠经历了对大肿瘤的完全排斥,中位存活期显著较高(图4A)。我们结合单次施用CLDN18.2-LPX,在患有CLDN18.2pos CT26结肠癌(平均肿瘤体积78mm3)的BALB/c小鼠中针对CLDN18.2 CAR T细胞重现了这些发现,进一步支持了用CARVac概念改善CAR T细胞的抗肿瘤效应的适用性(图4B)。
为了评价人类CAR T细胞的CARVac概念,我们在NSG小鼠中使用了CLDN6pos OV90异种移植肿瘤模型。在初步实验中,我们证实了NSG小鼠在重复RNA-LPX施用后能够脾摄入RNA(图4C)并促进人类CAR T细胞的特异性扩增(数据未显示)。携带晚期CLDN6pos OV90肿瘤的NSG小鼠接受亚治疗剂量的1x105个CLDN6-CAR+T细胞,然后接受重复CLDN6-LPX或对照处理(图4D)。晚期肿瘤在CLDN6-LPX处理的小鼠中被完全排斥,而在植入相同CAR T细胞剂量的对照组中它们迅速进展(图4D,左)。有效的肿瘤控制与外周血中高频率的CAR T细胞相关,证明它们在CLDN6-LPX疫苗接种后有效的体内扩增和改善的持久性(图4D,右)。与CLDN6-CAR T细胞一样,这些发现针对人类CLDN18.2-CAR T细胞结合CLDN18.2-LPX在NSG小鼠异种移植模型中重现(数据未显示)。
总之,我们的研究确立了两个关键发现。
对于一个,我们的数据支持CLDN6作为适合CAR T细胞靶向的癌胚细胞表面抗原。在人类中,CLDN6基因在健康成人组织中被严格沉默,但在高医疗需求的各种实体瘤中异常激活,导致高蛋白水平表达。这与工程化针对该表面分子的高灵敏度、精确特异性和强效能的CLDN6-定向的CAR的可行性一起,提出其作为实体癌症的CAR T细胞疗法的理想新靶标。没有同源CLDN6表达的肿瘤具有抗原丢失变体生长的风险。然而,CLDN6 CAR T细胞是强烈激活的IFNγ-分泌效应子,因此它们的抗肿瘤活性被认为会驱动抑制性肿瘤微环境的炎性重塑和内源性肿瘤抗原的释放,这将共同促进抗原的扩散并抵消抗原丢失变体的快速生长(Sampson J.H.等人,Clinical cancer research:an official journal of theAmerican Association for Cancer Research 20,972–984(2014))。
其次,我们提出CARVac概念作为一种提高CAR T细胞的抗肿瘤功效的方法。CAR抗原以其天然构象展示在位于淋巴样隔室中的APC表面,这是T细胞共刺激和有效扩增的理想环境。值得注意的是,相同的APC很可能同时处理和呈现MHC分子上的CLDN6,这可能导致内源性CLDN6特异性T细胞的引发和激活。最近,已经探索了不同的方法用于CAR T细胞的抗原特异性扩增(Berger C.等人,Cancer immunology research 3,206–216(2015);SlaneyC.Y.等人,Clinical cancer research:an official journal of the AmericanAssociation for Cancer Research 23,2478–2490(2017);Tanaka M.等人,Clinicalcancer research:an official journal of the American Association for CancerResearch 23,3499–3509(2017);Ma L.等人,Science(New York,N.Y.)365,162–168(2019);Wang X.等人,Clinical cancer research:an official journal of theAmerican Association for Cancer Research 21,2993–3002(2015))。这里呈现的CARVac方法结合了各种独特的特征。CARVac格式的优点之一是单链RNA作为天然TLR-配体在一个分子中结合了递送抗原和佐剂性(adjuvanticity)。重要的是,该方法不需要重新工程化CAR支架或调整T细胞转导方案,也不依赖于肽配体作为疫苗模拟表位的繁琐鉴定和表征。对于任何基于蛋白质的抗原,纳米颗粒RNA-LPX的生产速度快且成本低。临床级制造工艺已到位。在正在进行的临床试验中,RNA-LPX疫苗平台用于诱导针对一系列不同肿瘤抗原(NCT02410733、NCT02316457、NCT03815058)的CD4+和CD8+T细胞响应的目的,早期临床数据支持在人类中的淋巴样靶向和执行预期的作用模式。使用RNA,可以立即生成匹配的高亲和力疫苗,并以GMP级制造,用于基本上任何现有的CAR(包括针对构象表位的那些),从而提供了一种真正普遍适用的方法。
我们的数据确定了单次以及重复施用CARVac以实现工程化T细胞的可调扩增的可行性和安全性。RNA-LPX刺激的CAR T细胞在细胞因子响应和溶细胞活性(抗原识别后)方面优于未刺激的CAR T细胞。它们形成记忆T细胞并以更高的频率持续存在。CARVac方法不仅改善了转移的CAR T细胞的植入,而且还在较低的CAR T-细胞剂量下实现治疗性肿瘤控制(图4E)。
由RNA-LPX介导的CAR T细胞的扩增、收缩和再刺激动力学模拟了T细胞在抗原特异性引发和加强后所经历的生理过程。CAR T-细胞扩增的幅度取决于RNA-LPX剂量,允许控制循环CAR T细胞的水平,以及在最佳治疗窗口内滴定CAR T细胞频率。
除了缺乏合适的靶标和循环中CAR T细胞的快速下降之外,CAR T细胞在人类实体癌症中的功效还存在其他障碍,包括肿瘤抗原异质性、受损的T-细胞运输和外渗至肿瘤部位、耗竭和免疫抑制微环境。实现在治疗窗口内维持最佳刺激的CAR T细胞也可以为克服那些限制提供良好的基础。
实施例3:RNA-LPX介导的疫苗接种也适用于TCR-修饰的T细胞的体内扩增和富集
过继转移的肿瘤反应性T细胞疗法的临床成功也与那些细胞在体内的持久性呈正相关(Robbins等人(2004)J Immunol.173(12):7125-30,Huang等人(2005)28(3):258-67)。除了CAR T细胞扩增,我们分析了原位抗原暴露是否也可以增强过继转移的TCR-修饰的T细胞在体内的持久性。因此,将荧光素酶共表达的OT1-TCR转导的鼠T细胞过继转移到轻度刺激(2.5Gy)的小鼠中,然后重复施用编码任一或对照抗原的RNA-LPX。通过生物发光成像(图5A)和流式细胞术(图5B)依次监测OT1-TCR转导的T细胞群体的扩增和富集。
用脂质体配制的TCR抗原重复疫苗接种后,OT1-TCR-修饰的T细胞能够在体内扩增。OT1-TCR-修饰的T细胞生物发光信号在对照组中随时间推移降低,而抗原特异性再刺激的OT1 TCR T细胞生物发光信号在每次OvaI-RNA-LPX处理后富集(图5A)。根据生物发光数据,表达GFP的OT1-TCR T细胞的流式细胞术分析导致在重复刺激期间,外周血中转移的OT1-TCR T细胞(GFP用作转移的OT1-TCR表达T细胞的标志物)富集。与对照-RNA-LPX处理组相比,小鼠中表达GFP的细胞的平均荧光保持恒定(图5B)。这些数据表明,RNA-LPX技术还通过提供原位自然共刺激来支持足够的TCR-修饰的T细胞激活,这可以导致TCR-修饰的T细胞在体内的类似富集。
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Claims (34)
1.用于治疗对象的方法,其包括:
(i)向所述对象提供亚治疗量的经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,以及
(ii)向所述对象施用由所述抗原受体靶向的抗原、编码所述抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达所述抗原的宿主细胞。
2.如权利要求1所述的方法,其是在所述对象中诱导免疫应答的方法。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
4.如权利要求2或3所述的方法,其中所述免疫应答是对表达抗原的靶细胞群体或靶组织的免疫应答。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述靶细胞群体或靶组织是癌细胞或癌组织。
6.如权利要求4所述的方法,其中所述癌细胞或癌组织是实体癌症。
7.用于治疗患有与抗原的表达或升高的表达相关的疾病、病症或病况的对象的方法,其包括:
(i)向所述对象提供亚治疗量的经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,所述抗原受体靶向与所述疾病、病症或病况相关的抗原或者表达与所述疾病、病症或病况相关的抗原的细胞,以及
(ii)向所述对象施用由所述抗原受体靶向的抗原、编码所述抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达所述抗原的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述疾病、病症或病况是癌症并且所述与所述疾病、病症或病况相关的抗原是肿瘤抗原。
9.如权利要求7或8所述的方法,其中所述疾病、病症或病况是实体癌症。
10.用于治疗患有与肿瘤抗原的表达或升高的表达相关的实体癌症的对象的方法,其包括:
(i)向所述对象提供经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,所述抗原受体靶向所述肿瘤抗原或表达所述肿瘤抗原的细胞,以及
(ii)向所述对象施用由所述抗原受体靶向的抗原、编码所述抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达所述抗原的宿主细胞。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞以亚治疗量提供给所述对象。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法,其中通过在所述对象中施用所述经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞或者通过在所述对象中生成所述经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞而向所述对象提供所述经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞。
13.用于治疗对象的方法,其包括:
(i)在所述对象中生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,以及
(ii)向所述对象施用由所述抗原受体靶向的抗原、编码所述抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达所述抗原的宿主细胞。
14.如权利要求13所述的方法,其是在所述对象中诱导免疫应答的方法。
15.如权利要求14所述的方法,其中所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
16.如权利要求14或15所述的方法,其中所述免疫应答是对表达抗原的靶细胞群体或靶组织的免疫应答。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述靶细胞群体或靶组织是癌细胞或癌组织。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述癌细胞或癌组织是实体癌症。
19.用于治疗患有与抗原的表达或升高的表达相关的疾病、病症或病况的对象的方法,其包括:
(i)在所述对象中生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,所述抗原受体靶向与所述疾病、病症或病况相关的抗原或者表达与所述疾病、病症或病况相关的抗原的细胞,以及
(ii)向所述对象施用由所述抗原受体靶向的抗原、编码所述抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达所述抗原的宿主细胞。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述疾病、病症或病况是癌症并且所述与所述疾病、病症或病况相关的抗原是肿瘤抗原。
21.如权利要求19或20所述的方法,其中所述疾病、病症或病况是实体癌症。
22.用于治疗患有与肿瘤抗原的表达或升高的表达相关的实体癌症的对象的方法,其包括:
(i)在所述对象中生成经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞,所述抗原受体靶向所述肿瘤抗原或表达所述肿瘤抗原的细胞,以及
(ii)向所述对象施用由所述抗原受体靶向的抗原、编码所述抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达所述抗原的宿主细胞。
23.如权利要求13至22中任一项所述的方法,其中所述经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞在所述对象中以亚治疗量生成。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法,其是用于治疗或预防对象中的癌症的方法。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述癌症是实体癌症。
26.如权利要求24或25所述的方法,其中所述癌症与由所述抗原受体靶向的肿瘤抗原的表达或升高的表达相关。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法,其中所述抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法,其中所述编码所述抗原的多核苷酸是RNA。
29.如权利要求1至27中任一项所述的方法,其中所述经遗传修饰以表达所述抗原的宿主细胞包含编码所述抗原的多核苷酸。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞包含编码所述抗原受体的多核苷酸。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法,其中所述免疫效应细胞是T细胞。
32.试剂盒,其包含:
(i)经遗传修饰以表达抗原受体或编码抗原受体的多核苷酸的免疫效应细胞,以及
(ii)由所述抗原受体靶向的抗原、编码所述抗原的多核苷酸或经遗传修饰以表达所述抗原的宿主细胞。
33.如权利要求32所述的试剂盒,其中所述编码抗原受体的多核苷酸可用于免疫效应细胞的遗传修饰以表达抗原受体。
34.如权利要求32或33所述的试剂盒,其还包含在权利要求1至31中任一项所述的方法中使用所述试剂盒的指导材料。
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