JP2023541931A - 細胞への標的化送達のための薬剤および方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、細胞へのペイロードの標的化送達のための薬剤および方法に関する。薬剤および方法は、治療薬または診断薬を標的細胞に送達するのに有用である。一実施形態では、本発明は、標的細胞に結合する結合部分（一次標的化部分）およびペイロード（エフェクタプローブ）を含む薬剤に結合するさらなる結合部分（二次標的）を含むペプチドまたはポリペプチド（ドケッティング化合物）をコードするＲＮＡを投与する工程を含む。ＲＮＡの発現後、一次標的化部分は、癌細胞上の癌抗原などの標的抗原に結合してよく、次いで、エフェクタプローブに含まれる二次標的化部分は、二次標的を標的化して、それにより「ペイロード」を癌細胞などの標的細胞に正確に送達し得る。

Description

本発明は、細胞へのペイロードの標的化送達のための薬剤および方法に関する。薬剤および方法は、治療薬または診断薬を標的細胞に送達するのに有用である。一実施形態では、本発明は、標的細胞に結合する結合部分（一次標的化部分）およびペイロード（エフェクタプローブ）を含む薬剤に結合するさらなる結合部分（二次標的）を含むペプチドまたはポリペプチド（ドケッティング化合物）をコードするＲＮＡを投与する工程を含む。ＲＮＡの発現後、一次標的化部分は、癌細胞上の癌抗原などの標的抗原に結合してよく、次いで、エフェクタプローブに含まれる二次標的化部分は、二次標的を標的化して、それにより「ペイロード」を癌細胞などの標的細胞に正確に送達し得る。
薬物療法および診断の多くの領域では、治療薬（薬物）または診断（例えばイメージング）薬などの薬剤を、患者などの対象の体内の特定の部位または限定された領域に選択的に送達することが望ましい。
器官または組織の能動的標的化は、所望の活性部分（例えば細胞傷害性化合物）を、目的の標的部位で細胞表面に結合する標的化構築物に直接的または間接的にコンジュゲートすることによって達成され得る。そのような薬剤を標的化するために使用される標的化部分は、典型的には、細胞表面標的、例えば膜タンパク質に対する親和性を有する構築物であり、抗体または抗体断片を含む。
本発明は、例えば一次標的（例えば細胞表面抗原）に結合することによって標的細胞を標識する、ＲＮＡにコードされたドケッティング化合物を使用するアプローチに関する。ドケッティング化合物は、二次標的を含み、これは最終的に、二次標的を標的とする部分を備えたさらなる化合物、すなわちエフェクタプローブによって標的化される。エフェクタプローブは、エフェクタ部分、例えば治療化合物および／もしくは診断化合物、または治療化合物および／もしくは診断化合物の標的部分、例えばエフェクタ細胞を含む。したがって、本発明によれば、ドケッティング化合物をコードするＲＮＡが投与される。ＲＮＡが発現された後、ドケッティング化合物は、例えば一次標的に結合することによって、標的細胞に結合し得る。ドケッティング化合物の二次標的化部分を介してドケッティング化合物上の二次標的に結合するエフェクタプローブを添加する。二次標的／二次標的化部分の対の一般的な例は、抗体／抗原系である。本明細書に記載の概念は、広範囲の標的細胞を標的とするために単一のエフェクタ化合物を使用することを可能にする、すなわち、単一のエフェクタ化合物を、異なる一次標的を標的とし、かつ同一の二次標的を含む異なるドケッティング化合物と組み合わせて使用することによって、可能にする。単一のドケッティング化合物を使用する一次標的化は、同じ二次標的を標的とし、かつ異なるエフェクタ部分を含む異なるエフェクタプローブと組み合わせて実施することができるので、本明細書に記載の概念はさらに有利である。したがって、本明細書に記載の概念は、ドケッティング化合物によって標識された標的細胞への異なるエフェクタ部分の連続的な標的化を可能にする。
一態様では、本発明は、標的細胞へのペイロードの標的化送達のための方法であって、
（ｉ）第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡで１つ以上の細胞をトランスフェクトする工程；
（ｉｉ）ペプチドまたはポリペプチドが標的細胞と会合し、第１の結合部分が標的細胞の表面に提示されるように、１つ以上の細胞にペプチドまたはポリペプチドを発現させる工程；および
（ｉｉｉ）第２の結合部分を含むかまたは第２の結合部分に連結されたペイロードを付加する工程
を含み、第１の結合部分と第２の結合部分とが互いに結合する、方法に関する。
一実施形態では、１つ以上の細胞を、ＲＮＡを含む粒子と接触させることによって、１つ以上の細胞にＲＮＡをトランスフェクトする。
一実施形態では、粒子は、１つ以上の細胞を標的化するための標的化分子を含む。
一実施形態では、１つ以上の細胞は、標的細胞を含むか、または標的細胞からなる。
一実施形態では、１つ以上の細胞は、第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドを、それが１つ以上の細胞と会合したままであるように発現する。
一実施形態では、１つ以上の細胞は標的細胞とは異なる。
一実施形態では、１つ以上の細胞は、第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドを、それが１つ以上の細胞によって分泌されるように発現する。
一実施形態では、１つ以上の細胞は、第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドを、それが血流中に放出されるように発現する。
一実施形態では、第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドは、標的細胞上の標的に結合する第３の結合部分を含む。
一実施形態では、標的は細胞表面抗原である。
一実施形態では、第１の結合部分と第３の結合部分は互いに連結されている。一実施形態では、第１の結合部分と第３の結合部分は、互いに共有結合的に連結されている。
一実施形態では、第１の結合部分は、抗体または抗体誘導体である。一実施形態では、第２の結合部分はペプチドタグである。
一実施形態では、第１の結合部分はペプチドタグである。一実施形態では、第２の結合部分は、抗体または抗体誘導体である。
一実施形態では、第３の結合部分は、抗体または抗体誘導体である。
一実施形態では、抗体誘導体は抗体断片である。
一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは二重特異性抗体である。一実施形態では、二重特異性抗体は二重特異性一本鎖抗体である。
一実施形態では、第２の結合部分とペイロードは、互いに共有結合的または非共有結合的に連結されている。一実施形態では、ペイロードは薬学的に活性な薬剤を含む。一実施形態では、ペイロードは診断化合物を含む。一実施形態では、ペイロードは治療化合物を含む。一実施形態では、ペイロードは担体を含む。一実施形態では、担体は微粒子担体である。一実施形態では、微粒子担体は、脂質ベースの粒子、ポリマーベースの粒子、またはそれらの混合物を含む。一実施形態では、担体は診断化合物を組み込んでいる。一実施形態では、担体は治療化合物を組み込んでいる。一実施形態では、ペイロードは第４の結合部分を含む。一実施形態では、第４の結合部分は細胞表面抗原に結合する。一実施形態では、第４の結合部分が結合する細胞表面抗原は、免疫細胞上に存在する。
一実施形態では、標的細胞は対象に存在する。
一実施形態では、本明細書に記載の方法はインビボで実施される。
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象に、
（ｉ）第１の結合部分を含むペプチドもしくはポリペプチドをコードするＲＮＡまたは前記ＲＮＡを含む粒子；および
（ｉｉ）第２の結合部分を含むかもしくは第２の結合部分に連結されたペイロードまたはそれをコードするＲＮＡ
を投与する工程を含む。
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、疾患を診断および／または治療するためのものであり、標的細胞は、疾患に関連する抗原を発現するかまたは発現し得る。
一実施形態では、標的細胞は疾患細胞である。
一実施形態では、標的は腫瘍抗原である。一実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞または癌細胞である。
一実施形態では、標的細胞は免疫エフェクタ細胞である。一実施形態では、標的細胞はＴ細胞である。一実施形態では、標的は、前記免疫エフェクタ細胞に特徴的な抗原である。
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、抗原受容体をコードする核酸を免疫エフェクタ細胞に送達するためのものである。
一態様では、本発明は、対象における標的細胞へのペイロードの標的化送達のための方法であって、
（ｉ）第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡ；および
（ｉｉ）第２の結合部分を含むかもしくは第２の結合部分に連結されたペイロードまたはそれをコードするＲＮＡ
を対象に投与する工程を含み、
第１の結合部分と第２の結合部分とが互いに結合し、第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドが、標的細胞上の標的に結合する第３の結合部分をさらに含む、
方法に関する。
一実施形態では、ＲＮＡは、投与されたとき、粒子中に存在する。
一実施形態では、ＲＮＡの投与後、第１の結合部分および第３の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドは、対象の１つ以上の細胞によって発現される。一実施形態では、１つ以上の細胞は、第１の結合部分および第３の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドを分泌する。一実施形態では、１つ以上の細胞は、第１の結合部分および第３の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドを、それが血流中に放出されるように発現する。
一態様では、本発明は、標的細胞へのペイロードの標的化送達のためのキットであって、
（ｉ）第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡ；および
（ｉｉ）第２の結合部分を含むかもしくは第２の結合部分に連結されたペイロードまたはそれをコードするＲＮＡ
を含み、
第１の結合部分と第２の結合部分が互いに結合する、キットに関する。
一実施形態では、第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドは、標的細胞上の標的に結合する第３の結合部分を含む。
一実施形態では、標的は細胞表面抗原である。
一実施形態では、第１の結合部分と第３の結合部分は互いに連結されている。一実施形態では、第１の結合部分と第３の結合部分は、互いに共有結合的に連結されている。
一実施形態では、第１の結合部分は、抗体または抗体誘導体である。一実施形態では、第２の結合部分はペプチドタグである。
一実施形態では、第１の結合部分はペプチドタグである。一実施形態では、第２の結合部分は、抗体または抗体誘導体である。
一実施形態では、第３の結合部分は、抗体または抗体誘導体である。
一実施形態では、抗体誘導体は抗体断片である。
一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは二重特異性抗体である。一実施形態では、二重特異性抗体は二重特異性一本鎖抗体である。
一実施形態では、第２の結合部分とペイロードは、互いに共有結合的または非共有結合的に連結されている。一実施形態では、ペイロードは薬学的に活性な薬剤を含む。一実施形態では、ペイロードは診断化合物を含む。一実施形態では、ペイロードは治療化合物を含む。一実施形態では、ペイロードは担体を含む。一実施形態では、担体は微粒子担体である。一実施形態では、微粒子担体は、脂質ベースの粒子、ポリマーベースの粒子、またはそれらの混合物を含む。一実施形態では、担体は診断化合物を組み込んでいる。一実施形態では、担体は治療化合物を組み込んでいる。一実施形態では、ペイロードは第４の結合部分を含む。一実施形態では、第４の結合部分は細胞表面抗原に結合する。一実施形態では、第４の結合部分が結合する細胞表面抗原は、免疫細胞上に存在する。
一実施形態では、ＲＮＡは粒子中に存在する。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法において使用するための本明細書に記載の薬剤または組成物に関する。
抗ＡＬＦＡおよび抗ＣＬＤＮ６二重特異性構築物の配列 図は、４つの抗ＡＬＦＡおよび抗ＣＬＤＮ６二重特異性構築物に関連する５つの配列を示す。図１Ａは、上から下に、ａ）ＧＳリンカーを介してＣ末端Ｈｉｓタグを有する抗ＡＬＦＡ－ＶＨＨにＣ末端で連結された抗クローディン６抗体の重鎖の可変断片、ｂ）ＧＳリンカーを介してＣ末端Ｈｉｓタグを有する抗クローディン６抗体の重鎖の可変断片にＣ末端で連結された抗ＡＬＦＡ－ＶＨＨ、およびｃ）ＧＳリンカーを介してＣ末端Ｈｉｓタグを有する抗ＡＬＦＡ－ＶＨＨにＣ末端で連結された抗クローディン６抗体の完全重鎖を示す。すべての配列は、Ｎ末端分泌シグナルまたはリーダシグナルを含む。それぞれの配列要素は、図において強調されている。 抗ＡＬＦＡおよび抗ＣＬＤＮ６二重特異性構築物の配列 図は、４つの抗ＡＬＦＡおよび抗ＣＬＤＮ６二重特異性構築物に関連する５つの配列を示す。図１Ｂは、ｄ）ＧＳリンカーを介してＣ末端Ｈｉｓタグを有する抗クローディン６抗体の完全重鎖にＣ末端で連結された抗ＡＬＦＡ－ＶＨＨ、およびｅ）抗クローディン６抗体の可変断片の軽鎖を示す。すべての配列は、Ｎ末端分泌シグナルまたはリーダシグナルを含む。それぞれの配列要素は、図において強調されている。 抗ＡＬＦＡおよび抗ＣＤ３二重特異性構築物の配列 図は、４つの抗ＡＬＦＡおよび抗ＣＤ３二重特異性構築物に関連する４つの配列を示す。図２は、上から下に、ａ）ＧＳリンカーを介してＣ末端Ｈｉｓタグを有する抗ＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）にＣ末端で連結された抗ＡＬＦＡ－ＶＨＨ、ｂ）ＧＳリンカーを介してＣ末端Ｈｉｓタグを有する抗ＡＬＦＡ－ＶＨＨにＣ末端で連結された抗ＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）、ｃ）ＧＳリンカーを介してＣ末端Ｈｉｓタグを有する抗ＣＤ３抗体（ＴＲ６６）の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）にＣ末端で連結された抗ＡＬＦＡ－ＶＨＨ、およびｄ）ＧＳリンカーを介してＣ末端Ｈｉｓタグを有する抗ＡＬＦＡ－ＶＨＨにＣ末端で連結された抗ＣＤ３抗体（ＴＲ６６）の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を示す。すべての配列はＮ末端分泌シグナルを含む。それぞれの配列要素は、図において強調されている。 合成ＡＬＦＡ色素ペプチドの概要 合成ＡＬＦＡ色素ペプチドの概要：合成ＡＬＦＡペプチドをフルオロフォアＣｙ５またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（ＡＦ６８０）とコンジュゲートするために、３つの異なるコンジュゲーション反応を試験した。（ｉ）銅フリークリックケミストリ、（ｉｉ）システインマレイミドコンジュゲーション、および（ｉｉｉ）低分子ＰＥＧ３スペーサを介したコンジュゲーション。クリックケミストリによるＣｙ５結合ＡＬＦＡペプチド（ｉ）の３つの異なる構築物を確立した：Ｃｙ５－ＤＢＣＯ－アジド－ＡＬＦＡ－ＮＨ２、Ｃｙ５－アジド－ＦＣＯ－ＡＬＦＡ－ＯＨ、Ｃｙ５－アジド－ＦＣＯ－ＡＬＦＡ－ＮＨ２。 二重特異性抗ＣＬＤＮ６および抗ＡＬＦＡ構築物の結合分析 図４Ａは、ＡＬＦＡタグおよびＣＬＤＮ６を標的とする二重特異性構築物の概略図を示す。 二重特異性抗ＣＬＤＮ６および抗ＡＬＦＡ構築物の結合分析 図４Ｂでは、ＣＬＤＮ６過剰発現細胞および標的陰性細胞を、ＡＬＦＡ二重特異性標的化ＣＬＤＮ６構築物（ＩＭＡＢ０２７ ＦａｂまたはＩｇＧ構築物に基づく）の非存在下（ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒなし）または存在下でＣｙ５－ＡＬＦＡまたはＡＬＦＡ－ＡＦ６８０ペプチドと共にインキュベートし、ＦＡＣＳによって分析した。 二重特異性抗ＣＤ３および抗ＡＬＦＡ構築物の結合分析 二重特異性抗ＣＤ３および抗ＡＬＦＡ構築物の結合分析。ＣＤ３過剰発現細胞および標的陰性細胞を、ＡＬＦＡ二重特異性標的化ＣＤ３構築物（ＴＲ６６ ｓｃＦｖまたはＣＤ３に対するＶＨＨに基づく）の非存在下（ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒなし）または存在下でＣｙ５－ＤＢＣＯ－ＡＬＦＡ－ＮＨ２ペプチド（異なる濃度で）と共にインキュベートし、ＦＡＣＳによって分析した。 二重特異性抗ＣＤ３（ＲＮＡとして投与）および抗ＡＬＦＡ構築物の結合分析 ＨＥＫ－２９３Ｔ－１７細胞のエレクトロポレーションによって、ＣＤ３およびＡＬＦＡペプチドに対するＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒを作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ－１７細胞のエレクトロポレーションのために、ａＡＬＦＡ－ＶＨＨ×ａＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）またはａＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）×ａＡＬＦＡ－ＶＨＨをコードする異なる濃度（２．５μｇ、２５μｇ）のＲＮＡを使用した。規定の時点の後、上清を回収し、ＦＡＣＳによる結合分析に使用した。したがって、標的過剰発現細胞および標的陰性細胞を１００μＬの上清と共にインキュベートし、続いてＣｙ５－ＤＢＣＯ－ＡＬＦＡ－ＮＨ２ペプチドと共にインキュベートした。陰性対照として、Ｃｙ５－ＤＢＣＯ－ＡＬＦＡ－ＮＨ２ペプチドを、ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒの非存在下であるが抗ＡＬＦＡ ＶＨＨの存在下で細胞と共にインキュベートした。陽性対照として、ａＡＬＦＡ－ＶＨＨ Ｘ ａＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）またはａＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）×ａＡＬＦＡ－ＶＨＨの２つの異なる濃度（１００ｎＭおよび５００ｎＭ）の精製タンパク質を使用した。 癌治療のためのモジュラー二重特異性抗体 図は、モジュラー二重特異性抗体を用いた癌の治療アプローチの概略図を含む。ここで、タグに特異的な第１の結合部分および腫瘍関連抗原に対する第２の結合部分を担持する第１の構築物は、コードＲＮＡの形態で提供される。ＲＮＡは、脂質ナノ粒子として製剤化されて患者に投与される。ＲＮＡは、インビボで二重特異性タンパク質に翻訳され、血流中に放出される。タグおよび第３の結合部分を含む第２の構築物は、前記患者に投与され（例えばコードＲＮＡの形態で、脂質ナノ粒子として製剤化されて）、血流中に放出され、第１の構築物に結合する。第３の結合部分の特異性に依存して、複合体は、ここで、腫瘍に係合する免疫細胞などの他のエフェクタを動員する。 モジュラーＣＡＲ－Ｔ細胞アプローチ 図は、ＡＬＦＡタグ／ＮｂＡＬＦＡの例におけるモジュール相互作用対に基づくユニバーサルＣＡＲ－Ｔアプローチの概略図を含む。ここで、その表面にタグ結合部分（例えばＮｂＡＬＦＡ ＶＨＨ）を担持する、一般的で容易に生成可能なＣＡＲＴ細胞を作製する（１）。腫瘍抗原特異的リガンド（例えばｓｃＦｖ、ＶＨＨまたはＦａｂ断片）に融合したＡＬＦＡタグからなる第２の結合部分、いわゆる標的化リガンド（ＴＬ）を、脂質ナノ粒子に製剤化されたＲＮＡとして患者に投与する（２）。ＲＮＡは、インビボで、血流中に放出される二重特異性タンパク質に翻訳される。標的化リガンドが特定の腫瘍抗原へのその特異的結合に基づいて腫瘍中に蓄積された後、ＮｂＡＬＦＡ－ＣＡＲ Ｔ細胞によって結合され、結果として活性化されて腫瘍細胞の特異的溶解をもたらす（３）。異なる標的化リガンドを使用することによって、異なる腫瘍抗原が、患者の同じＣＡＲＴ細胞産物を使用して連続的にまたは並行して対処され得る。 ＡＬＦＡペプチド提示ナノ粒子を標的化するためのＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒ ＨＥＫ２９３Ｔ－１７細胞のエレクトロポレーションによって、ＣＤ３およびＡＬＦＡペプチドに対するＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒを作製した。ａＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）×ａＡＬＦＡ－ＶＨＨをコードする２５μｇのＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ－１７細胞のエレクトロポレーションに使用した。４８時間後、ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒを含む１５μＬの上清を回収し、レポータ遺伝子（ルシフェラーゼおよびＴｈｙ１．１についての）を封入する１５μＬのＡＬＦＡペプチド提示ナノ粒子（ＰＬＸ＝異なるＮ／Ｐ比を有するポリプレックス）と共にインキュベートした。陰性対照として、ＡＬＦＡペプチドを含まないナノ粒子を使用した。インキュベーション後、５×１０５個のＣＤ３発現細胞を６μＬのＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒ－ナノ粒子混合物と共にインキュベートした。陽性対照として、１．２５μｇ／ｍＬのａＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）×ａＡＬＦＡ－ＶＨＨの精製タンパク質を使用した。４００μＬの増殖培地を添加し、１００μＬの混合物をルシフェラーゼアッセイのための白色平板に播種し、２５０μＬをＦＡＣＳ分析に使用してＴｈｙ１．１シグナルを検出した。 Ｎ／Ｐ比：正に帯電可能なポリマーアミン（Ｎ＝窒素）基対負に帯電した核酸リン酸（Ｐ）基の比
配列の説明
以下の表は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。
Figure 2023541931000001
Figure 2023541931000002
Figure 2023541931000003
Figure 2023541931000004
Figure 2023541931000005
本開示を以下で詳細に説明するが、この開示は本明細書に記載の特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、“Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）”，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
以下において、本開示の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせ得ることが理解されるべきである。様々に説明される実施例および実施形態は、本開示を明示的に記載される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明示的に記載される実施形態を任意の数の開示される要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、記載されるすべての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されていると見なされるべきである。
「約」という用語は、およそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈において、一実施形態では、列挙または特許請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％、または±３％を意味する。
本開示を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「１つの」（”a” and “an”）および「その」（”the”）という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、個々の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に不可欠な特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかしながら、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本開示の特定の実施形態として企図され、すなわち、この実施形態の目的のためには、「含む」は、「からなる」または「から本質的になる」の意味を有すると理解されるべきである。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される各資料（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書などを含む）は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有しなかったことの承認と解釈されるべきではない。
定義
以下において、本開示のすべての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。定義されていない用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。
本明細書で使用される「低減する」、「減少させる」、「阻害する」または「損なう」などの用語は、好ましくは少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％またはさらにそれ以上のレベルの全体的な低下または全体的な低下を生じさせる能力に関する。これらの用語には、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減が含まれる。
「増加させる」、「増強する」または「超える」などの用語は、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、またはさらにそれ以上の増加または増強に関する。
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって互いに連結された約２個以上、約３個以上、約４個以上、約６個以上、約８個以上、約１０個以上、約１３個以上、約１６個以上、約２０個以上、および最大約５０個、約１００個または約１５０個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５０個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、好ましくは、アミノ酸配列からの少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。
本明細書における「変異体」（”variant”）とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は、天然もしくは野生型（ＷＴ）アミノ酸配列であり得るか、または野生型アミノ酸配列の改変形態であり得る。好ましくは、変異体アミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して１～約２０個のアミノ酸修飾、好ましくは１～約１０個または１～約５個のアミノ酸修飾を有する。
本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界で見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列を有する。
本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）の「変異体」（”variants”）は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。「変異体」という用語は、すべての突然変異体、スプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体配座変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体、および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。「変異体」という用語は、特にアミノ酸配列の断片を含む。
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、得られた産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含む。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列内の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。一実施形態では、保存的アミノ酸置換は、以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のアミノ酸、いくつかの実施形態では連続するアミノ酸について与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良の配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を用いて行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドの割合を示す。
「％同一」、「同一性％」という用語または同様の用語は、特に、比較される配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すことが意図されている。前記パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたってランダムに分布していてもよいが、必ずしもそうではない。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して配列を比較することによって行われる。比較のための最適なアラインメントは、手操作によって、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、もしくは前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。いくつかの実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ａｌｉｇｎ２ｓｅｑ）で利用可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）２８に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）１、－２に設定された一致／不一致スコア；（ｖ）線形に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）使用されている低複雑度領域のフィルタ。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）３に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されたマトリックス；（ｖ）存在：１１、拡張：１に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）条件付き組成スコアマトリックス調整。
同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数（例えば、参照配列中の位置の数）で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。
いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域について与えられる。例えば、参照核酸配列が２００個のヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のヌクレオチド、いくつかの実施形態では連続するヌクレオチドについて与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長について与えられる。
相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８または少なくとも９９％の同一性を示す。
本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、例えば組換えＤＮＡ操作により、当業者によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載のペプチドおよびアミノ酸変異体は、例えば固相合成および類似の方法などによる公知のペプチド合成技術を用いて容易に調製され得る。
一実施形態では、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の断片または変異体は、好ましくは「機能的断片」または「機能的変異体」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の１つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価である任意の断片または変異体に関する。抗体などの結合剤の配列に関して、１つの特定の機能は、断片または変異体が由来するアミノ酸配列によって示される１つ以上の結合活性である。本明細書で使用される「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、特に、親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸によって変化しており、親分子または配列の機能の１つ以上を依然として果たす、例えば標的分子に結合することができるアミノ酸配列を含む変異体分子または配列を指す。一実施形態では、親分子または配列のアミノ酸配列の改変は、分子または配列の特徴に有意に影響を及ぼさないかまたは変化させない。異なる実施形態では、機能的断片または機能的変異体の機能は、低減され得るが、依然として有意に存在し得、例えば、機能的変異体の結合は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施形態では、機能的断片または機能的変異体の結合は、親分子または配列と比較して増強され得る。
指定されたアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列の変異体またはその断片であり得る。例えば、本明細書での使用に適した配列は、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在する配列または天然配列とは配列が異なるように改変され得ることが当業者に理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「説明資料」または「説明書」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図、または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の組成物を含む容器に貼付されてもよく、または組成物を含む容器と共に出荷されてもよい。あるいは、説明資料と組成物が受領者によって協働して使用されることを意図して、説明資料は容器とは別に出荷されてもよい。
「単離された」は、天然状態から改変されたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え核酸などの「組換え物」は、天然には存在しない。
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。
本明細書で使用される「生理学的ｐＨ」は、約７．５のｐＨを指す。
「遺伝子改変」または単に「改変」という用語は、核酸による細胞のトランスフェクションを含む。「トランスフェクション」という用語は、細胞への核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本発明の目的のために、「トランスフェクション」という用語はまた、細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みを含み、細胞は、対象、例えば患者に存在し得る。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができ、例えば、細胞は患者の器官、組織および／または生物の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの用途では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されれば十分である。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。トランスフェクションの過程で導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないので、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。そのような安定なトランスフェクションは、トランスフェクションのためにウイルスベースのシステムまたはトランスポゾンベースのシステムを使用することによって達成することができる。一般に、ドケッティング化合物をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。
一次標的
本発明で使用される「一次標的」は、例えば治療、診断および／またはイメージング方法において、検出、調節、結合、または他の方法で対処される標的に関する。
一次標的は、ヒトまたは動物の体内の任意の適切な標的から選択することができ、細胞、病原体もしくは寄生生物であり得るか、または細胞、病原体もしくは寄生生物上に存在し得る。
特定の実施形態によれば、一次標的は、標的細胞の表面に存在するタンパク質、例えば細胞表面抗原または細胞表面受容体などの構造体である。一次標的は、疾患、例えば感染または癌の間に上方制御され得る。疾患組織では、上記のマーカは健常組織とは異なり得、早期検出、特異的診断および治療、特に標的療法のための独特の可能性を提供することができる。
いくつかの実施形態では、一次標的または単に「標的」は、腫瘍抗原である。本発明の文脈において、「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」という用語は、正常条件下では限られた数の組織および／もしくは器官で、または特定の発生段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば腫瘍抗原は、正常条件下では胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官、例えば精巣、栄養膜組織、例えば胎盤、または生殖系列細胞で特異的に発現され得、１つ以上の腫瘍または癌組織で発現されるかまたは異常発現される。これに関連して、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明の文脈における腫瘍抗原としては、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常条件下では特定の分化段階で特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常条件下では精巣および時には胎盤において特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖系列特異的抗原が挙げられる。本発明の文脈において、腫瘍抗原は、好ましくは癌細胞の細胞表面に関連し、好ましくは正常組織では発現されないか、またはまれにしか発現されない。好ましくは、腫瘍抗原または腫瘍抗原の異常発現は、癌細胞を同定する。本発明の文脈において、対象、例えば癌疾患に罹患している患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、好ましくは前記対象における自己タンパク質である。好ましい実施形態では、本発明の文脈における腫瘍抗原は、正常条件下では非必須である組織もしくは器官、すなわち免疫系によって損傷された場合に対象の死をもたらさない組織もしくは器官において、または免疫系がアクセスできないかもしくはほとんどアクセスできない身体の器官もしくは構造において特異的に発現される。好ましくは、腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍抗原と癌組織で発現される腫瘍抗原とで同一である。
腫瘍抗原の例としては、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、β－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン６、クローディン１８．２およびクローディン１２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴが挙げられる。特に好ましい腫瘍抗原としては、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）およびクローディン６（ＣＬＤＮ６）が挙げられる。
本発明によれば、ペイロードは、ドケッティング化合物をコードするＲＮＡを標的細胞に特異的に送達することによって、および／または標的、例えば標的細胞上の抗原に結合する部分をドケッティング化合物に提供することによって、標的細胞などの標的に特異的に送達され得る。
ドケッティング化合物をコードするＲＮＡの標的細胞への特異的送達は、ＲＮＡと、標的、例えば標的細胞上の抗原に結合する標的化分子とを含む粒子を使用することによって達成され得る。
ドケッティング化合物
本発明によれば、ＲＮＡにコードされた「ドケッティング化合物」は、一次標的、例えば標的細胞または標的細胞上の抗原とドケッティング化合物との間に非共有結合などの結合を形成するために使用される。ドケッティング化合物は、エフェクタプローブへの非共有結合または共有結合などの結合を形成し得る。ＲＮＡにコードされたドケッティング化合物は、本明細書では「ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒ」とも呼ばれる。
一実施形態では、ドケッティング化合物は、「標的に結合する結合部分」、特に目的の一次標的に結合することができる「標的細胞上の標的に結合する結合部分」とも称される「一次標的化部分」を含む。本発明で使用される「一次標的化部分」は、一次標的に結合するドケッティング化合物の部分に関する。そのような標的化部分は、典型的には、細胞表面標的（例えば膜受容体）または構造タンパク質（例えばアミロイド斑）に対する親和性を有する部分である。これらの部分は、一次標的に結合する任意のペプチドまたはタンパク質（例えば抗体または抗体断片）であり得る。本明細書で使用するための適切な一次標的化部分の特定の実施形態は、細胞表面抗原結合ペプチドおよび抗体を含む。一次標的化部分の他の例は、受容体に結合するペプチドまたはタンパク質である。
一次標的化部分は、好ましくは高い特異性および／または高い親和性で結合し、一次標的との結合は、好ましくは体内で安定である。
上に列挙した一次標的の特異的標的化を可能にするために、ドケッティング化合物の一次標的化部分は、抗体、抗体断片、例えばＦａｂ２、Ｆａｂ、ｓｃＦＶ、ＶＨＨドメイン、および他のタンパク質またはペプチドを含むがこれらに限定されない化合物を含むことができる。
本発明の特定の実施形態によれば、一次標的は受容体であり、適切な一次標的化部分は、受容体に依然として結合するそのような受容体のリガンドまたはその一部、例えば受容体結合タンパク質リガンドの場合は受容体結合ペプチドを含むが、これらに限定されない。
タンパク質性の一次標的化部分の他の例としては、インターフェロン、例えばアルファ、ベータおよびガンマインターフェロン、インターロイキン、ならびにトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などのタンパク質成長因子が挙げられる。
本発明のさらなる特定の実施形態によれば、一次標的および一次標的化部分は、癌、炎症、感染、心血管疾患、例えば血栓、アテローム硬化性病変、低酸素部位、例えば脳卒中、腫瘍、心血管障害、脳障害、アポトーシス、血管新生、器官、およびレポータ遺伝子／酵素などの組織または疾患の特異的または増加した標的化をもたらすように選択される。これは、組織、細胞または疾患特異的発現を有する一次標的を選択することによって達成され得る。例えば、腫瘍抗原は、様々な腫瘍細胞型で過剰発現され得るが、正常細胞では発現されないかまたはより少ない量で発現される。
ドケッティング化合物は、「二次標的」、すなわちペイロードを含むエフェクタプローブの結合パートナーを提供するドケッティング化合物の一部として働く基をさらに含む。エフェクタプローブに結合するドケッティング化合物に含まれる結合部分（「二次標的」）と、ドケッティング化合物に結合するエフェクタプローブに含まれる結合部分（「二次標的化部分」）は、互いに結合する。
一実施形態によれば、ドケッティング化合物は二重特異性抗体を含む。一実施形態では、ドケッティング化合物は、一次標的に結合する結合ドメインおよびエフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合する結合ドメインを含む。一実施形態では、ドケッティング化合物は、一次標的に結合する抗体断片およびエフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合する抗体断片を含む。一実施形態では、少なくとも１つの結合ドメインは、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一実施形態では、少なくとも１つの結合ドメインは、ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体を含む。一実施形態では、一方の結合ドメインは、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、他方の結合ドメインは、ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体を含む。一実施形態では、一次標的に結合する結合ドメインは、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一実施形態では、エフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合する結合ドメインは、ＶＨＨなどの単一ドメイン抗体を含む。
一実施形態では、ドケッティング化合物は、一次標的に結合する抗体のＦａｂ断片を含む。一実施形態では、重鎖に由来するＦａｂ鎖は、ＧＳ－リンカーを介してエフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合するＶＨＨにＣ末端で連結されている。一実施形態では、エフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合するＶＨＨは、ＧＳリンカーを介して重鎖に由来するＦａｂ鎖にＣ末端で連結されている。
一実施形態では、ドケッティング化合物は、一次標的に結合する完全長抗体を含む。一実施形態では、完全長抗体の重鎖は、ＧＳリンカーを介してエフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合するＶＨＨにＣ末端で連結されている。一実施形態では、エフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合するＶＨＨは、ＧＳリンカーを介して完全長抗体の重鎖にＣ末端で連結されている。
一実施形態では、ドケッティング化合物は、一次標的に結合する結合ドメインと、エフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合する結合ドメインとを含む融合タンパク質を含む。
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、２つ以上のサブユニットを含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。好ましくは、融合タンパク質は、２つ以上のサブユニット間の翻訳融合である。翻訳融合は、読み枠内の１つのサブユニットのコードヌクレオチド配列をさらなるサブユニットのコードヌクレオチド配列と遺伝子操作することによって生成され得る。サブユニットは、リンカーによって散在され得る。
一実施形態では、ドケッティング化合物は、単一のペプチド鎖を含む。一実施形態では、単一ペプチド鎖は、一次標的に結合する抗体断片およびエフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合する抗体断片を含む。一実施形態では、抗体断片は、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、またはそれらの混合物である。異なる実施形態では、ドケッティング化合物は、以下の構造（Ｎ末端からＣ末端へ）の１つを含む：
ＶＨＨ（エフェクタプローブ上のα二次標的化部分）－任意のリンカー－ＶＨＨ（α一次標的）
ＶＨＨ（α一次標的）－任意のリンカー－ＶＨＨ（エフェクタプローブ上のα二次標的化部分）
ＶＨＨ（エフェクタプローブ上のα二次標的化部分）－任意のリンカー－ｓｃＦｖ（α一次標的）
ｓｃＦｖ（α一次標的）－任意のリンカー－ＶＨＨ（エフェクタプローブ上のα二次標的化部分）
ＶＨＨ（α一次標的）－任意のリンカー－ｓｃＦｖ（エフェクタプローブ上のα二次標的化部分）
ｓｃＦｖ（エフェクタプローブ上のα二次標的化部分）－任意のリンカー－ＶＨＨ（α一次標的）
ｓｃＦｖ（エフェクタプローブ上のα二次標的化部分）－任意のリンカー－ｓｃＦｖ（α一次標的）
ｓｃＦｖ（α一次標的）－任意のリンカー－ｓｃＦｖ（エフェクタプローブ上のα二次標的化部分）
一実施形態では、ドケッティング化合物は、ＲＮＡを発現する細胞からのドケッティング化合物の分泌を可能にするシグナルペプチド、例えばＮ末端シグナルペプチドを含む。
エフェクタプローブ
エフェクタプローブは、二次標的化部分を含む。二次標的化部分は、ドケッティング化合物に含まれる利用可能な二次標的の結合パートナーを形成するエフェクタプローブの部分に関する。エフェクタプローブは、所望の診断、イメージング、および／または治療効果を誘引する、提供するまたはもたらすことができる、本明細書で「エフェクタ部分」または「ペイロード」と呼ばれる部分をさらに含む。二次標的化部分およびエフェクタ部分は、共有結合的または非共有結合的に連結され得る。例えば、二次標的化部分が抗原受容体であり、エフェクタ部分が細胞である場合、抗原受容体は細胞の表面に発現され得、細胞に非共有結合的に連結され得る。
二次標的化部分がペプチドまたはタンパク質（例えば抗体断片またはペプチドタグ）を含み、エフェクタ部分がペプチドまたはタンパク質を含む一実施形態では、エフェクタプローブは単一のペプチド鎖を含み得る。一実施形態では、エフェクタプローブは、二次標的化部分およびエフェクタ部分を含む融合タンパク質を含む。この実施形態では、エフェクタプローブは、そのままで、またはエフェクタプローブをコードするＲＮＡとして投与され得る（ドケッティング化合物をコードするＲＮＡの投与と同様に）。
二次標的化部分がペプチドまたはタンパク質（例えば抗体断片またはペプチドタグ）を含み、エフェクタ部分がペプチドまたはタンパク質ではない化合物を含む一実施形態では、二次標的化部分は、例えばリンカーを介してエフェクタ部分に化学的に連結され得る。
一実施形態では、ドケッティング化合物に含まれる二次標的およびエフェクタプローブに含まれる二次標的化部分は、生理学的条件下で互いに結合する。
一実施形態では、ドケッティング化合物に含まれる二次標的は、ペプチドまたはタンパク質、例えばペプチドタグを含み、エフェクタプローブに含まれる二次標的化部分は、ペプチドまたはタンパク質に結合する結合剤、例えば抗体断片を含む。
一実施形態では、エフェクタプローブに含まれる二次標的化部分は、ペプチドまたはタンパク質、例えばペプチドタグを含み、ドケッティング化合物に含まれる二次標的は、ペプチドまたはタンパク質に結合する結合剤、例えば抗体断片を含む。
一実施形態では、本明細書で使用される二次標的／二次標的化部分システムは、エピトープタグ／結合剤システムを含む。
一実施形態では、エピトープタグ／結合剤システムは、配列ＳＲＬＥＥＥＬＲＲＲＬＴＥを含むエピトープタグを含み、結合剤は、ＣＤＲ１配列ＧＶＴＩＳＡＬＮＡＭＡＭＧ、ＣＤＲ２配列ＡＶＳＥＲＧＮＡＭ、およびＣＤＲ３配列ＬＥＤＲＶＤＳＦＨＤＹを含むラクダ科ＶＨＨドメインを含む。一実施形態では、エピトープタグ／結合剤システムは、配列ＳＲＬＥＥＥＬＲＲＲＬＴＥを含むエピトープタグを含み、結合剤は、アミノ酸配列ＥＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＶＴＩＳＡＬＮＡＭＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＥＲＲＶＭＶＡＡＶＳＥＲＧＮＡＭＹＲＥＳＶＱＧＲＦＴＶＴＲＤＦＴＮＫＭＶＳＬＱＭＤＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＨＶＬＥＤＲＶＤＳＦＨＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ、前記アミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列もしくは前記アミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の断片を含むラクダ科ＶＨＨドメインを含む。
本明細書で使用される場合、「エピトープタグ」は、抗体様機能を有する抗体またはタンパク質性分子が結合することができるアミノ酸のストレッチを指す。
一実施形態では、エフェクタプローブへのドケッティング化合物の結合後、共有結合連結が形成される。この実施形態では、本明細書で使用される二次標的／二次標的化部分システムは、共有結合を形成するタグ／キャッチャシステム、例えばイソペプチド結合を形成するＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒを含む。
ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムは、組換えタンパク質の不可逆的コンジュゲーションのための技術である。ペプチドＳｐｙＴａｇは、タンパク質ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと自発的に反応して、対の間に分子間イソペプチド結合を形成する。タグ／キャッチャ対を使用して、２つの組換えタンパク質間でバイオコンジュゲーションを達成することができる。
一実施形態では、エフェクタプローブに含まれるエフェクタ部分は、治療部分または診断部分を含む。一実施形態では、エフェクタプローブに含まれるエフェクタ部分は、治療部分または診断部分の標的、例えば免疫細胞などのエフェクタ細胞を含む。
エフェクタ部分は、例えば検出可能な標識であり得る。本明細書で使用される「検出可能な標識」は、例えば細胞、組織または生物内に存在する場合、プローブの検出を可能にするエフェクタプローブの部分に関する。本発明の文脈内で想定される検出可能な標識の１つのタイプは、造影提供剤である。様々なタイプの検出可能な標識が本発明の文脈内で想定され、以下に記載される。
したがって、本発明の特定の実施形態によれば、本発明の薬剤および方法は、イメージング、特に医用イメージングにおいて使用される。一次標的を同定するために、エフェクタプローブとして、１つ以上の検出可能な標識を含むイメージングプローブが使用される。イメージングプローブの検出可能な標識の特定の例は、ＭＲＩ画像化可能な構築物、スピン標識、光学標識、超音波応答性構築物、Ｘ線応答部分、放射性核種、（バイオ）発光およびＦＲＥＴ型色素などの従来のイメージングシステムで使用される造影提供部分である。本発明の文脈内で想定される例示的な検出可能な標識としては、蛍光分子、例えば自己蛍光分子、試薬と接触すると蛍光を発する分子など、放射性標識；例えばアビジンによるビオチンの結合を介して検出される、ビオチン；蛍光タグ、常磁性金属を含むＭＲＩ用イメージング構築物、イメージング試薬などが挙げられるが、これらに限定されない。イメージングに使用される放射性核種は、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２Ｍｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１４Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３Ｐｔ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ、および２０３Ｐｂからなる群より選択される同位体であり得る。治療に使用されるような他の元素および同位体もまた、特定の用途におけるイメージングに適用され得る。
ＭＲＩ画像化可能部分は、常磁性イオンまたは超常磁性粒子であり得る。常磁性イオンは、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｔｉ、Ｐａ、Ｌａ、Ｓｃ、Ｖ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｃｅ、Ｄｙ、Ｔｌからなる群より選択される元素であり得る。
Ｘ線応答部分には、ヨウ素、バリウム、および硫酸バリウムが含まれるが、これらに限定されない。
さらに、本発明の文脈内で想定される検出可能な標識には、抗体結合によって、例えば検出可能な標識抗体の結合によって検出することができるペプチドまたはポリペプチドも含まれる。一実施形態では、検出可能な標識は、１８Ｆ、１１Ｃまたは１２３Ｉなどの小型有機ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ標識である。
エフェクタ部分はまた、薬学的に活性な薬剤などの治療薬であってもよい。薬学的に活性な薬剤の例は当業者に公知であり、本明細書で提供される。治療プローブは、任意で検出可能な標識も含むことができる。
したがって、別の実施形態によれば、本発明の薬剤および方法は標的療法のために使用される。これは、二次標的化部分および１つ以上の薬学的に活性な薬剤（例えば、放射線療法のための薬物または放射性同位体）を含むエフェクタプローブを使用することによって達成される。
エフェクタ部分はまた、小胞、リポソーム、ポリマーカプセル、または診断もしくは治療部分が充填もしくは負荷された任意の他の担体を含み得る。
「薬学的に活性な薬剤」という用語は、個体に投与した場合に治療上有効な化合物または細胞などの任意の薬剤に関する。「薬学的に活性な薬剤」という用語はさらに、薬剤の投与を含む治療的介入において所与の疾患およびその合併症の臨床症状を変化させる、好ましくは治癒させる、緩和するまたは部分的に停止させる任意の薬剤に関する。
一実施形態では、薬学的活性な薬剤は、薬学的に活性なＲＮＡまたは薬学的に活性なペプチドもしくはタンパク質を含む。
「薬学的に活性なＲＮＡ」は、薬学的に活性なペプチドもしくはタンパク質をコードするか、またはそれ自体で薬学的に活性である、例えば、薬学的に活性なタンパク質について記載されているような１つ以上の薬学的活性を有するＲＮＡである。例えば、ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の１つ以上の鎖であり得る。そのような薬剤としては、標的転写物、例えば対象の内因性疾患に関連する転写物である転写物を標的とする、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはｓｉＲＮＡもしくはマイクロＲＮＡ様ＲＮＡの前駆体が挙げられる。
「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、治療有効量で対象に投与された場合、対象の状態または疾患状態にプラスのまたは有利な効果を有する。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、治癒特性または緩和特性を有し、疾患または障害の１つ以上の症状を改善する、軽減する、緩和する、逆転させる、発症を遅延させるまたは重症度を軽減するために投与され得る。薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、予防特性を有し得、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患もしくは病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、タンパク質またはポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性な断片も指すことができる。この用語はまた、ペプチドまたはタンパク質の薬学的に活性な類似体を含み得る。「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」という用語は、抗原であるペプチドおよびタンパク質を含み、すなわち、対象へのペプチドまたはタンパク質の投与は、治療的または部分的もしくは完全に保護的であり得る免疫応答を対象において誘発する。
薬学的に活性なタンパク質の例としては、サイトカインおよび免疫系タンパク質、例えば免疫学的に活性な化合物（例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレチン、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、可溶性主要組織適合遺伝子複合体抗原、免疫学的に活性な抗原、例えば細菌抗原、寄生虫抗原またはウイルス抗原、アレルゲン、自己抗原、抗体）、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、栄養ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチンなど）、成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、成長因子（例えば上皮成長因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子など）、成長因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成または分解性酵素、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、シトクロム、アデニル酸もしくはグアニル酸シクラーゼ、ノイラミニダーゼなど）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモンまたは成長因子結合タンパク質など）、転写および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質（例えば血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン、ミオシンなど）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、フォン・ヴィレブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）または修飾第ＶＩＩＩ因子、抗凝固因子などが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、薬学的に活性なタンパク質は、リンパ系ホメオスタシスの調節に関与するサイトカイン、好ましくは、Ｔ細胞の発生、プライミング、拡大、分化および／または生存に関与し、好ましくはそれらを誘導または増強するサイトカインである。一実施形態では、サイトカインはインターロイキンである。一実施形態では、本発明による薬学的に活性なタンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１からなる群より選択されるインターロイキンである。
一実施形態では、エフェクタプローブは、放射線療法および／または化学療法に有用な化合物であるエフェクタ部分を含む。一実施形態では、エフェクタプローブは、化学療法化合物であるエフェクタ部分を含む。
化学療法は、通常、標準化された化学療法レジメンの一部として、１つ以上の抗癌剤（化学療法剤）を使用する癌治療の一種である。化学療法という用語は、有糸分裂を阻害するための細胞内毒の非特異的使用を含意するようになった。この含意は、細胞外シグナル（シグナル伝達）を遮断する、より選択的な薬剤を除外する。古典的な内分泌ホルモン（主に、乳癌のためのエストロゲンおよび前立腺癌のためのアンドロゲン）からの成長促進シグナルを阻害する特定の分子または遺伝子標的を用いた治療法の開発は、現在ホルモン療法と呼ばれている。対照的に、受容体チロシンキナーゼに関連するもののような成長シグナルの他の阻害は、標的療法と称される。
伝統的な化学療法剤は、細胞分裂（有糸分裂）を妨げることによって細胞傷害性であるが、癌細胞はこれらの薬剤に対する感受性が大きく異なる。大部分において、化学療法は、細胞を損傷するまたは細胞にストレスを加える方法と考えることができ、アポトーシスが開始された場合、細胞死をもたらし得る。
化学療法剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および細胞傷害性抗生物質が挙げられる。
アルキル化剤は、タンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む多くの分子をアルキル化する能力を有する。アルキル化剤のサブタイプは、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、シスプラチンおよび誘導体、ならびに非古典的アルキル化剤である。ナイトロジェンマスタードには、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドおよびブスルファンが含まれる。ニトロソ尿素としては、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）およびセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチンおよびストレプトゾトシンが挙げられる。テトラジンとしては、ダカルバジン、ミトゾロミドおよびテモゾロミドが挙げられる。アジリジンとしては、チオテパ、マイトマイシンおよびジアジコン（ＡＺＱ）が挙げられる。シスプラチンおよび誘導体には、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンが含まれる。これらは、生物学的に重要な分子中のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基およびリン酸基と共有結合を形成することによって細胞機能を損なう。非古典的なアルキル化剤としては、プロカルバジンおよびヘキサメチルメラミンが挙げられる。特に好ましい一実施形態では、アルキル化剤はシクロホスファミドである。
代謝拮抗剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成を妨げる分子の群である。それらの多くは、ＤＮＡおよびＲＮＡのビルディングブロックと類似の構造を有する。代謝拮抗剤は、核酸塩基またはヌクレオシドのいずれかに類似するが、変化した化学基を有する。これらの薬物は、ＤＮＡ合成に必要な酵素を遮断するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡに組み込まれることによって効果を発揮する。代謝拮抗剤のサブタイプは、葉酸拮抗剤、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体およびチオプリンである。葉酸拮抗剤としては、メトトレキサートおよびペメトレキセドが挙げられる。フルオロピリミジンには、フルオロウラシルおよびカペシタビンが含まれる。デオキシヌクレオシド類似体としては、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、アザシチジン、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、およびペントスタチンが挙げられる。チオプリンとしては、チオグアニンおよびメルカプトプリンが挙げられる。
抗微小管剤は、微小管機能を妨げることによって細胞分裂を阻止する。ビンカアルカロイドは微小管の形成を妨げ、一方タキサンは微小管の分解を妨げる。ビンカアルカロイドとしては、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンフルニンが挙げられる。タキサンには、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）およびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）が含まれる。
トポイソメラーゼ阻害剤は、２つの酵素：トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩの活性に影響を及ぼす薬物であり、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシンが含まれる。
細胞傷害性抗生物質は、様々な作用機序を有する薬物の多様な群である。それらが化学療法の指標において共有する共通の主題は、細胞分裂を中断することである。最も重要なサブグループは、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンピラルビシン、およびアクラルビシン）ならびにブレオマイシンである；他の顕著な例としては、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、およびアクチノマイシンが挙げられる。
一実施形態では、エフェクタプローブは、エフェクタ細胞であるエフェクタ部分を含む。この実施形態では、エフェクタ細胞は、二次標的化部分を含むペプチドまたはタンパク質、例えば抗原受容体をその表面に発現し得る。一実施形態では、エフェクタ部分は、エフェクタ細胞に対する標的を含む。この実施形態では、エフェクタ細胞は、エフェクタプローブ上のエフェクタ部分を標的とするペプチドまたはタンパク質、例えば抗原受容体をその表面に発現し得る。
本発明に関連して使用され、抗原受容体をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が導入され得る細胞は、特に、溶解能を有する細胞、特にリンパ系細胞などの免疫エフェクタ細胞を含み、好ましくはＴ細胞、特に、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される細胞傷害性リンパ球である。活性化されると、これらの細胞傷害性リンパ球はそれぞれ、標的細胞の破壊を引き起こす。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、以下の手段のいずれかまたは両方によって標的細胞の破壊を引き起こす。まず、活性化されると、Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンなどの細胞毒を放出する。パーフォリンおよびグラニュライシンは標的細胞に細孔を作り、グランザイムは細胞に進入し、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する細胞質のカスパーゼカスケードを引き起こす。第２に、アポトーシスは、Ｔ細胞と標的細胞との間のＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を介して誘導され得る。本発明に関連して使用される細胞は、好ましくは自己細胞であるが、異種細胞または同種異系細胞を使用することができる。
本発明の文脈における「エフェクタ機能」という用語は、例えば、腫瘍細胞などの疾患細胞の死滅、または腫瘍の播種および転移の抑制を含む腫瘍増殖の阻害および／もしくは腫瘍発生の阻害をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明の文脈におけるエフェクタ機能は、Ｔ細胞媒介エフェクタ機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）の場合、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み、ＣＴＬの場合、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、細胞、すなわち抗原の発現を特徴とする細胞の排除、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含む。
本発明の文脈における「免疫エフェクタ細胞」または「免疫反応性細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクタ機能を発揮する細胞に関する。一実施形態における「免疫エフェクタ細胞」は、二次標的としてのドケッティング化合物によって提示されるか、またはエフェクタ部分としてのエフェクタプローブによって提示される抗原などの抗原に結合することができる。例えば、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞を含む。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫エフェクタ細胞」は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。本発明によれば、「免疫エフェクタ細胞」という用語はまた、適切な刺激で免疫細胞（Ｔ細胞、特にＴヘルパー細胞、または細胞溶解性Ｔ細胞など）に成熟することができる細胞を含む。免疫エフェクタ細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未成熟および成熟Ｔ細胞ならびに未成熟および成熟Ｂ細胞を含む。Ｔ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、抗原に曝露された場合、免疫系のクローン選択に類似する。
一実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、ＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞である。
本発明に従って使用される免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞受容体もしくはＢ細胞受容体などの内因性抗原受容体を発現してもよく、または内因性抗原受容体の発現を欠いていてもよい。
「リンパ系細胞」は、任意で適切な修飾後、例えばＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原受容体の移入後に、細胞性免疫応答などの免疫応答を生成することができる細胞、またはそのような細胞の前駆細胞であり、リンパ球、好ましくはＴリンパ球、リンパ芽球、および形質細胞を含む。リンパ系細胞は、本明細書に記載されるような免疫エフェクタ細胞であり得る。好ましいリンパ系細胞は、細胞表面に抗原受容体を発現するように改変することができるＴ細胞である。一実施形態では、リンパ系細胞は、Ｔ細胞受容体の内因性発現を欠く。
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。
Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるこれらの細胞表面上の特別な受容体の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球型と区別することができる。胸腺は、Ｔ細胞の成熟に関与する主要な器官である。Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されており、それぞれが異なる機能を有する。
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも特に、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示された場合に活性化される。ひとたび活性化されると、これらは速やかに分裂し、能動免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、身体のほぼあらゆる細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。
「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を予防するＴ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは免疫抑制性であり、一般にエフェクタＴ細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御する。Ｔｒｅｇは、バイオマーカＣＤ４、ＦｏｘＰ３、およびＣＤ２５を発現する。
本明細書で使用される場合、「ナイーブＴ細胞」という用語は、活性化Ｔ細胞またはメモリＴ細胞とは異なり、末梢内でそれらの同族抗原に遭遇したことがない成熟Ｔ細胞を指す。ナイーブＴ細胞は、一般に、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現、活性化マーカＣＤ２５、ＣＤ４４またはＣＤ６９の非存在、およびメモリＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「メモリＴ細胞」という用語は、以前にそれらの同族抗原に遭遇し、それに応答したＴ細胞のサブグループまたは亜集団を指す。抗原との２回目の遭遇時に、メモリＴ細胞は、免疫系が抗原に応答した最初の時間よりも速くかつより強い免疫応答を開始するように再生することができる。メモリＴ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得、通常、ＣＤ４５ＲＯを発現する。
本発明によれば、「Ｔ細胞」という用語はまた、適切な刺激でＴ細胞に成熟することができる細胞を含む。
Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から産生され、α－ＴＣＲ鎖およびβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの別個のペプチド鎖から構成される。γδ Ｔ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットである。しかし、γδ Ｔ細胞では、ＴＣＲは一本のγ鎖と一本のδ鎖で構成される。このＴ細胞の群は、αβ Ｔ細胞よりもはるかにまれである（全Ｔ細胞の２％）。
すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞に由来する造血前駆細胞は胸腺に存在し、細胞分裂によって拡大して未成熟な胸腺細胞の大きな集団を生成する。最初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現せず、したがって二重陰性（ＣＤ４－ＣＤ８－）細胞として分類される。発達が進むにつれて、それらは二重陽性胸腺細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）になり、最終的に単一陽性（ＣＤ４＋ＣＤ８－またはＣＤ４－ＣＤ８＋）胸腺細胞に成熟し、その後胸腺から末梢組織に放出される。
Ｔ細胞は、一般に、標準的な手順を用いてインビトロまたはエクスビボで調製し得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システムを使用して、患者などの哺乳動物の骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分から単離し得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連するまたは関連のないヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物に由来し得る。Ｔ細胞を含む試料は、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。
本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で提供されるように、ＮＫ細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化させることもできる。
免疫エフェクタ細胞などの本明細書に記載の細胞は、抗原に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を発現するように、治療されている対象においてエクスビボ／インビトロまたはインビボで遺伝子改変され得る。一実施形態では、抗原受容体を発現するための改変は、エクスビボ／インビトロで行われる。その後、改変された細胞を患者に投与し得る。
キメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ操作されたＴ細胞を用いた養子細胞移入療法は、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞が実質的に任意の腫瘍抗原を標的とするように操作され得るので、有望な抗癌治療法である。例えば、患者のＴ細胞を、患者の腫瘍細胞上の抗原に特異的に向けられるＣＡＲを発現するように遺伝子操作（遺伝子改変）し、その後患者に注入して戻し得る。
本発明によれば、「ＣＡＲ」（または「キメラ抗原受容体」）という用語は、「キメラＴ細胞受容体」および「人工Ｔ細胞受容体」という用語と同義であり、標的構造（例えば抗原）を認識し、すなわち標的構造に結合し（例えば抗原結合ドメインの抗原への結合によって）、細胞表面に前記ＣＡＲを発現するＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞に特異性を付与し得る単一の分子または分子の複合体を含む人工受容体に関する。そのような細胞は、標的細胞の認識のために抗原のプロセシングおよび提示を必ずしも必要とせず、むしろ、任意の抗原を、好ましくは特異的に認識し得る。好ましくは、ＣＡＲによる標的構造の認識は、前記ＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞の活性化をもたらす。ＣＡＲは、本明細書に記載の１つ以上のドメインを含む１つ以上のタンパク質ユニットを含み得る。「ＣＡＲ」という用語は、Ｔ細胞受容体を含まない。
ＣＡＲは、一般にＣＡＲの細胞外ドメインの一部である抗原結合部分または抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合要素を含む。具体的には、本発明のＣＡＲは、ドケッティング化合物またはエフェクタプローブ上の抗原を標的とする。
本発明の一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原に対する特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）および抗原に対する特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一実施形態では、免疫グロブリンは抗体である。一実施形態では、前記重鎖可変領域（ＶＨ）および対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ペプチドリンカーによって接続されている。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合部分の一部はｓｃＦｖである。
ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計される。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然には会合していない。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に会合している。一実施形態では、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって改変される。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともその１つ以上の膜貫通領域を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。
場合によっては、本発明のＣＡＲは、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間に結合を形成するヒンジドメインを含む。
ＣＡＲの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクタ機能の少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクタ機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクタ機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達し、特殊な機能を果たすように細胞に指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される範囲内で、そのようなトランケートされた部分は、それがエフェクタ機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意のトランケートされた部分を含むことを意味する。
ＴＣＲのみを介して生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要であることが公知である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζに由来する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。さらに、ＣＡＲの細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域と組み合わされたＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み得る。
共刺激ドメインの同一性は、ＣＡＲによる標的部分の結合時に細胞増殖および生存を増強する能力を有するという点のみに限定される。適切な共刺激ドメインには、ＣＤ２８、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲスーパーファミリーの受容体のメンバーであるＣＤ１３４（ＯＸ４０）、および活性化Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８スーパーファミリー共刺激分子であるＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）が含まれる。当業者は、これらの記載された共刺激ドメインの配列変異体が、それらがモデルとするドメインと同じまたは類似の活性を有する場合、本発明に悪影響を及ぼすことなく使用できることを理解する。そのような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有する。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＡＲ構築物は２つの共刺激ドメインを含む。特定の組合せには４つの記載されたドメインのすべての可能な変形が含まれるが、具体的な例としてはＣＤ２８＋ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）およびＣＤ２８＋ＣＤ１３４（ＯＸ４０）が挙げられる。
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結され得る。任意で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが結合を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、ＣＡＲは、新生タンパク質を小胞体内に誘導するシグナルペプチドを含む。一実施形態では、シグナルペプチドは抗原結合ドメインに先行する。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンに由来する。
ＣＡＲは、融合タンパク質の形態で一緒に上記ドメインを含み得る。そのような融合タンパク質は、一般に、Ｎ末端からＣ末端の方向に連結された抗原結合ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、およびシグナル伝達配列を含む。しかし、本発明のＣＡＲはこの配置に限定されず、他の配置も許容され、結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および１つ以上の共刺激ドメインを含む。結合ドメインは抗原に自由に結合できなければならないため、融合タンパク質中の結合ドメインの配置は、一般に、細胞の外側で領域の表示が達成される配置であることが理解される。同様に、共刺激およびシグナル伝達ドメインは細胞傷害性リンパ球の活性および増殖を誘導する働きをするので、融合タンパク質は、一般に、細胞の内部でこれら２つのドメインを表示する。
一実施形態では、ＣＡＲ分子は、
ｉ）標的抗原（例えばエピトープタグ）結合ドメイン；
ｉｉ）膜貫通ドメイン；ならびに
ｉｉｉ）４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン
を含む。
一実施形態では、抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭｌ（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬｌ、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、およびＮＫＧ２Ｃ、またはそれらの機能的変異体からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒンジドメインによって膜貫通ドメインに接続されている。一実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ８αヒンジドメインである。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ分子は、
ｉ）標的抗原結合ドメイン；
ｉｉ）ＣＤ８αヒンジドメイン；
ｉｉｉ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；ならびに
ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン
を含む。
様々な方法を使用して、ＣＡＲ構築物などの抗原受容体をＴ細胞などの細胞に導入して、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を産生し得る。そのような方法には、非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクション、非ウイルスベースのＲＮＡトランスフェクション、例えばｍＲＮＡトランスフェクション、トランスポゾンベースのシステム、およびウイルスベースのシステムが含まれる。非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクションは、挿入突然変異誘発のリスクが低い。トランスポゾンベースのシステムは、組み込み要素を含まないプラスミドよりも効率的に導入遺伝子を組み込むことができる。ウイルスベースのシステムには、γ－レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの使用が含まれる。γ－レトロウイルスは、Ｔ細胞を産生し、効率的かつ永続的に形質導入することが比較的容易であり、初代ヒトＴ細胞における組み込みの観点から安全であることが予備的に証明されている。レンチウイルスベクターも、Ｔ細胞を効率的かつ永続的に形質導入するが、製造コストがより高い。それらはまた、潜在的にレトロウイルスベースのシステムよりも安全である。
一実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体を、抗原受容体をコードする核酸でエクスビボまたはインビボのいずれかでトランスフェクトする。一実施形態では、エクスビボトランスフェクションとインビボトランスフェクションの組合せを使用し得る。一実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、治療される対象に由来する。本発明のすべての態様の一実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、治療される対象とは異なる対象に由来する。
ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞を標的とするナノ粒子を使用して、インビボで、したがってほぼ瞬時に産生され得る。例えば、ポリ（β－アミノエステル）ベースのナノ粒子を、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合するために抗ＣＤ３ｅ Ｆ（ａｂ）断片にカップリングし得る。Ｔ細胞に結合すると、これらのナノ粒子はエンドサイトーシスされる。それらの内容物、例えば抗腫瘍抗原ＣＡＲをコードするプラスミドＤＮＡは、微小管関連配列（ＭＴＡＳ）および核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有するペプチドを含むため、Ｔ細胞核に誘導され得る。ＣＡＲ遺伝子発現カセットに隣接するトランスポゾンおよび高活性トランスポザーゼをコードする別個のプラスミドを含めることにより、染色体へのＣＡＲベクターの効率的な組み込みが可能になり得る。ナノ粒子注入後のＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ産生を可能にするそのようなシステムは、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：８１３－８２０に記載されている。
さらに、ヒトＣＤ８＋細胞を特異的に標的とするレンチウイルスベクターＣＤ８－ＬＶを使用して、ＣＤ１９－ＣＡＲ Ｔ細胞をインビボで直接作製することができる（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ Ａ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｎｏｖ；１０（１１），２０１８，９１５８）。
別の可能性は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用して、ＣＡＲコード配列を特定の遺伝子座に意図的に配置することである。例えば、ＣＡＲをノックインし、それを、さもなければＴＣＲ発現を抑える内因性プロモータの動的調節制御下に置く一方で、既存のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をノックアウトし得る；例えば、Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７参照。
一実施形態では、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞は、抗原受容体をコードする核酸で安定にまたは一過性にトランスフェクトされる。したがって、抗原受容体をコードする核酸は、細胞のゲノムに組み込まれるか、または組み込まれない。
一実施形態では、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞は、内因性Ｔ細胞受容体および／または内因性ＨＬＡの発現に関して不活性化される。
一実施形態では、本明細書に記載の細胞は、治療される対象に対して自家、同種異系または同系であり得る。一実施形態では、本開示は、患者からの細胞の取り出しおよびその後の患者への細胞の再送達を想定する。一実施形態では、本開示は、患者からの細胞の取り出しを想定しない。後者の場合、細胞の遺伝子改変のすべての工程はインビボで実施される。
「自家」という用語は、同じ対象に由来するものを表すために使用される。例えば、「自家移植」は、同じ対象に由来する組織または器官の移植を指す。そのような手順は、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するので有利である。
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。
「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体または組織、すなわち、一卵性双生児もしくは同じ近交系の動物、またはそれらの組織に由来するものを表すために使用される。
「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の骨髄を異なる個体に移入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
結合部分および薬剤
本開示は、抗体または抗体誘導体などの結合部分または結合剤を記載する。さらに、本開示は、第１および第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体などの二重特異性または多重特異性結合剤を記載し、第１の結合ドメインは一次標的に結合することができ、第２の結合ドメインはエフェクタプローブ上の二次標的化部分に結合することができる。
「エピトープ」という用語は、結合剤によって認識される分子または抗原の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、抗体または任意の他の結合タンパク質によって認識され得る。エピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約５～約１００、例えば約５～約５０、より好ましくは約８～約３０、最も好ましくは約８～約２５アミノ酸長であり得、例えば、エピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。一実施形態では、エピトープは、約１０～約２５アミノ酸長である。「エピトープ」という用語は、構造エピトープを含む。
「免疫グロブリン」という用語は、２対のポリペプチド鎖、１対の軽（Ｌ）低分子量鎖および１対の重（Ｈ）鎖からなり、４つすべてがジスルフィド結合によって相互接続されている、構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指す。免疫グロブリンの構造は十分に特徴付けられている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））参照。簡潔には、各重鎖は、典型的には重鎖可変領域（本明細書ではＶＨまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域（本明細書ではＣＨまたはＣＨと略す）から構成される。重鎖定常領域は、典型的にはＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインから構成される。ヒンジ領域は、重鎖のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域であり、非常に柔軟である。ヒンジ領域内のジスルフィド結合は、ＩｇＧ分子内の２つの重鎖間の相互作用の一部である。各軽鎖は、典型的には軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬまたはＶＬと略す）および軽鎖定常領域（本明細書ではＣＬまたはＣＬと略す）から構成される。軽鎖定常領域は、典型的には１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる超可変性の領域（または配列および／もしくは構造的に定義されたループの形態が超可変であり得る超可変領域）にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１－９１７（１９８７）も参照のこと）。特に明記されない限り、または文脈と矛盾しない限り、本発明における定常領域のアミノ酸位置への言及は、ＥＵナンバリングに従う（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９６９ Ｍａｙ；６３（１）：７８－８５；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．１９９１ ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）。一般に、本明細書に記載のＣＤＲはＫａｂａｔによって定義される。
本明細書で使用される「位置．．．に対応するアミノ酸」という用語は、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるアミノ酸位置番号を指す。他の免疫グロブリン中の対応するアミノ酸位置は、ヒトＩｇＧ１とのアラインメントによって見出され得る。したがって、別の配列中のアミノ酸またはセグメント「に対応する」１つの配列中のアミノ酸またはセグメントは、典型的にはデフォルト設定で、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷまたは同様の標準的な配列アラインメントプログラムを使用して他のアミノ酸またはセグメントと整列するものであり、ヒトＩｇＧ１重鎖と少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する。配列または配列中のセグメントを整列させ、それによって本発明によるアミノ酸位置に対応する配列中の位置を決定する方法は、当技術分野で周知であると考えられる。
本発明の文脈における「抗体」（Ａｂ）という用語は、抗原に結合する、好ましくは特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそれらのいずれかの誘導体を指す。一実施形態では、結合は、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、約２４時間以上、約４８時間以上、約３、４、５、６、７日間以上など、または任意の他の関連する機能的に定義された期間（例えば、抗原への抗体結合に関連する生理学的応答を誘導、促進、増強および／もしくは調節するのに十分な時間）などの、有意な期間の半減期を有する典型的な生理学的条件下で起こる。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。本明細書で使用される「抗原結合領域」、「結合領域」または「結合ドメイン」という用語は、抗原と相互作用し、典型的にはＶＨ領域とＶＬ領域の両方を含む領域またはドメインを指す。本明細書で使用される場合の抗体という用語は、単一特異性抗体だけでなく、複数、例えば２つ以上、例えば３つ以上の異なる抗原結合領域を含む多重特異性抗体も含む。抗体（Ａｂ）の定常領域は、免疫系の様々な細胞（エフェクタ細胞など）および補体活性化の古典的経路における第１成分であるＣ１ｑなどの補体系の成分を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。上記のように、本明細書で使用される抗体という用語は、特に明記されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、抗原結合断片である、すなわち抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の断片、および抗体誘導体、すなわち抗体に由来する構築物を含む。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実施され得ることが示されている。「抗体」という用語に包含される抗原結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ’もしくはＦａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、または国際公開第２００７０５９７８２号（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されている一価抗体；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから本質的になるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインから本質的になるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれる（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｎｏｖ；２１（１１）：４８４－９０）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４－５４６（１９８９））；（ｖｉ）ラクダ科動物またはナノボディ分子（Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ；５（１）：１１１－２４）ならびに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３－４２６（１９８８）およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５８７９－５８８３（１９８８）参照）としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって連結され得る。そのような一本鎖抗体は、特に明記されない限り、または文脈によって明確に指示されない限り、抗体という用語に包含される。そのような断片は一般に抗体の意味の範囲内に含まれるが、それらは、集合的におよびそれぞれ独立して本発明の固有の特徴であり、異なる生物学的特性および有用性を示す。本発明の文脈におけるこれらおよび他の有用な抗体断片、ならびにそのような断片の二重特異性形式を本明細書でさらに論じる。抗体という用語は、特に明記されない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体様ポリペプチド、ならびに酵素的切断、ペプチド合成、および組換え技術などの任意の公知の技術によって提供される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片（抗原結合断片）も含むことも理解されるべきである。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という語句は、従来の二本鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）が結合して一本鎖を形成している抗体を指す。任意で、適切な折り畳みおよび活性結合部位の創出を可能にするために、リンカー（通常はペプチド）が２本の鎖の間に挿入される。
ナノボディとしても公知の単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨ）である。これらはＶＨＨ断片と呼ばれる。全抗体と同様に、単一ドメイン抗体は、特定の抗原に選択的に結合することができる。第１の単一ドメイン抗体を、ラクダ科動物に見出される重鎖抗体から操作した。軟骨魚類も重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）を有し、そこからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替アプローチは、ヒトまたはマウス由来の一般的な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）からの二量体可変ドメインを単量体に分割することである。単一ドメイン抗体に関するほとんどの研究は、現在、重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖に由来するナノボディも、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。
抗体は、任意のアイソタイプを有することができる。本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる免疫グロブリンクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）を指す。特定のアイソタイプ、例えばＩｇＧ１が本明細書で言及される場合、この用語は、特定のアイソタイプ配列、例えば特定のＩｇＧ１配列に限定されないが、抗体が他のアイソタイプよりもそのアイソタイプ、例えばＩｇＧ１に配列が近いことを示すために使用される。したがって、例えば本発明のＩｇＧ１抗体は、定常領域の変異を含む、天然に存在するＩｇＧ１抗体の配列変異体であり得る。
様々な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体、より具体的にはＩｇＧ１カッパもしくはＩｇＧ１ラムダアイソタイプ（すなわちＩｇＧ１κ、ＩｇＧ１λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えばＩｇＧ２ａκ、ＩｇＧ２ａλ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えばＩｇＧ２ｂκ、ＩｇＧ２ｂλ）、ＩｇＧ３抗体（例えばＩｇＧ３κ、ＩｇＧ３λ）またはＩｇＧ４抗体（例えばＩｇＧ４κ、ＩｇＧ４λ）である。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニックまたはトランスクロモソーマル非ヒト動物から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、可変領域が非ヒト種に由来し（例えばげっ歯動物に由来）、定常領域がヒトなどの異なる種に由来する抗体を指す。治療用途のためのキメラモノクローナル抗体は、抗体免疫原性を低下させるために開発されている。キメラ抗体の文脈で使用される「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲおよびフレームワーク領域を含む領域を指す。キメラ抗体は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈ．１５に記載されている標準的なＤＮＡ技術を使用して作製され得る。キメラ抗体は、遺伝子操作された、または酵素的に操作された組換え抗体であり得る。キメラ抗体を作製することは当業者の知識の範囲内であり、したがって、本発明によるキメラ抗体の作製は、本明細書に記載される以外の方法によって行われ得る。
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体定常ドメインおよびヒト可変ドメインに対して高レベルの配列相同性を含むように改変された非ヒト可変ドメインを含む、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。これは、一緒になって抗原結合部位を形成する６つの非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を相同なヒトアクセプタフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することによって達成され得る（国際公開第９２／２２６５３号および欧州特許第０６２９２４０号参照）。親抗体の結合親和性および特異性を完全に再構成するために、親抗体（すなわち非ヒト抗体）からヒトフレームワーク領域へのフレームワーク残基の置換（復帰突然変異）が必要とされ得る。構造相同性モデリングは、抗体の結合特性に重要なフレームワーク領域内のアミノ酸残基を同定するのに役立ち得る。したがって、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列、主に、任意で非ヒトアミノ酸配列への１つ以上のアミノ酸復帰突然変異を含むヒトフレームワーク領域、および完全ヒト定常領域を含み得る。任意で、必ずしも復帰突然変異ではないさらなるアミノ酸修飾を適用して、親和性および生化学的特性などの好ましい特徴を有するヒト化抗体を得ることができる。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスまたはラットなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。ヒトモノクローナル抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が原則として好ましいが、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えば、Ｂリンパ球のウイルスもしくは発癌性形質転換、またはヒト抗体遺伝子のライブラリを用いるファージディスプレイ技術を使用することができる。ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための適切な動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は十分に確立された手順である。融合のために免疫化された脾細胞を単離するための免疫化プロトコルおよび技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。したがって、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、マウス系またはラット系ではなくヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルマウスまたはラットを用いて作製することができる。したがって、一実施形態では、ヒト抗体は、動物免疫グロブリン配列の代わりにヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を担持する、マウスまたはラットなどのトランスジェニック動物から得られる。そのような実施形態では、抗体は、動物に導入されたヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来するが、最終的な抗体配列は、前記ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列が内因性動物抗体機構による体細胞超変異および親和性成熟によってさらに修飾された結果であり、例えばＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５（２）：１４６－５６参照。
本明細書で使用される場合、文脈と矛盾しない限り、「Ｆａｂアーム」、「結合アーム」または「アーム」という用語は、１つの重鎖－軽鎖対を含み、本明細書では「半分子」と互換的に使用される。
抗体に関連して使用される場合の「完全長」という用語は、抗体が断片ではないが、自然界でそのアイソタイプについて通常見出される特定のアイソタイプのドメイン、例えばＩｇＧ１抗体のＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ、ＶＬおよびＣＬドメインのすべてを含むことを示す。
本明細書で使用される場合、文脈と矛盾しない限り、「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリンの重鎖の２つのＦｃ配列からなる抗体領域を指し、前記Ｆｃ配列は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。
本明細書で使用される場合、所定の抗原またはエピトープへの抗体の結合に関連して「結合する」または「結合することができる」という用語は、典型的には、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して決定される場合、または、例えば抗原をリガンドとし、抗体を分析物として使用するＢＩＡｃｏｒｅ ３０００装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて決定される場合、約１０－７Ｍ以下、例えば約１０－８Ｍ以下、例えば約１０－９Ｍ以下、約１０－１０Ｍ以下、または約１０－１１Ｍもしくはさらにそれ以下のＫＤに対応する親和性での結合である。抗体は、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低い、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性で所定の抗原に結合する。親和性がより低い程度量は抗体のＫＤに依存するので、抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が高度に特異的である）場合、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性よりも低い程度は、少なくとも１０，０００倍であり得る。
本明細書で使用される「ｋｄ」（ｓｅｃ－１）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも称される。
本明細書で使用される「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。
本発明はまた、本明細書に記載の抗体のＶＬ領域、ＶＨ領域、または１つ以上のＣＤＲの機能的変異体を含む抗体を想定する。抗体に関連して使用されるＶＬ、ＶＨ、またはＣＤＲの機能的変異体は、抗体が「参照」または「親」抗体の親和性および／または特異性／選択性の少なくとも実質的な割合（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上）を保持することを依然として可能にし、場合によっては、そのような抗体は、親抗体よりも高い親和性、選択性および／または特異性に関連し得る。
そのような機能的変異体は、典型的には、親抗体との有意な配列同一性を保持する。
例示的な変異体には、主に保存的置換によって親抗体配列のＶＨ領域および／またはＶＬ領域および／またはＣＤＲ領域とは異なるものが含まれる；例えば、変異体における置換の最大１０個、例えば９、８、７、６、５、４、３、２または１個は保存的アミノ酸残基置換である。
ＶＬ領域もしくはＶＨ領域などの本明細書に記載の抗体配列の機能的変異体、またはＶＬ領域もしくはＶＨ領域などの本明細書に記載の抗体配列とある程度の相同性もしくは同一性を有する抗体配列は、好ましくは非ＣＤＲ配列の改変または変異を含むが、ＣＤＲ配列は、好ましくは不変のままである。
本明細書で使用される「特異性」という用語は、文脈と矛盾しない限り、以下の意味を有することが意図されている。２つの抗体は、同じ抗原および同じエピトープに結合する場合、「同じ特異性」を有する。
「競合する」および「競合」という用語は、同じ抗原に対する第１の抗体と第２の抗体との間の競合を指し得る。あるいは、「競合する」および「競合」は、内因性リガンドの対応する受容体への結合についての抗体と内因性リガンドとの間の競合も指し得る。抗体が内因性リガンドのその受容体への結合を妨げる場合、そのような抗体は、リガンドとその受容体との内因性相互作用を遮断すると言われ、したがって内因性リガンドと競合している。標的抗原への結合についての抗体の競合を試験する方法は、当業者に周知である。そのような方法の一例は、例えばＥＬＩＳＡとしてまたはフローサイトメトリによって実施され得る、いわゆる交差競合アッセイである。あるいは、バイオレイヤー干渉法を用いて競合を決定してもよい。
標的抗原への結合について競合する抗体は、抗原上の異なるエピトープに結合することができ、エピトープは互いに非常に近接しているので、一方のエピトープに結合する第１の抗体が他方のエピトープへの第２の抗体の結合を妨げる。しかしながら、他の状況では、２つの異なる抗体が抗原上の同じエピトープに結合することができ、競合結合アッセイにおいて結合について競合する。同じエピトープに結合するそのような抗体は、本明細書では同じ特異性を有すると見なされる。したがって、一実施形態では、同じエピトープに結合する抗体は、標的分子上の同じアミノ酸に結合すると見なされる。抗体が標的抗原上の同じエピトープに結合することは、当業者に公知の標準的なアラニンスキャニング実験または抗体－抗原結晶化実験によって決定され得る。好ましくは、異なるエピトープに結合する抗体または結合ドメインは、それらのそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合していない。
上記のように、様々な形式の抗体が当技術分野で記載されている。本発明の結合剤は、原則として、任意のアイソタイプの抗体を含むことができる。アイソタイプの選択は、典型的には、所望のＦｃ媒介エフェクタ機能、例えばＡＤＣＣ誘導、またはＦｃ媒介エフェクタ機能を欠く抗体（「不活性」抗体）の必要性によって導かれる。例示的なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域カッパまたはラムダのいずれかが使用され得る。本発明の抗体のエフェクタ機能は、様々な治療的使用のために、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチングによって変化し得る。一実施形態では、本発明の抗体の両方の重鎖は、ＩｇＧ１アイソタイプ、例えばＩｇＧ１κである。任意で、重鎖は、本明細書の他の箇所に記載されるように、ヒンジおよび／またはＣＨ３領域で修飾されていてもよい。
好ましくは、抗原結合領域またはドメインの各々は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記可変領域は各々、３つのＣＤＲ配列、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに４つのフレームワーク配列、それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含む。さらに、好ましくは、抗体は２つの重鎖定常領域（ＣＨ）および２つの軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。
一実施形態では、結合剤は、完全長ＩｇＧ１抗体などの完全長抗体を含む。
他の実施形態では、結合剤は、Ｆａｂ’もしくはＦａｂ断片などの抗体断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、国際公開第２００７０５９７８２号（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されている一価抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ラクダ科動物もしくはナノボディ、または単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
本発明の文脈における「結合剤」という用語は、所望の抗原に結合することができる任意の薬剤を指す。本発明の特定の実施形態では、結合剤は、抗体、抗体断片、もしくは任意の他の結合タンパク質、またはそれらの任意の組合せであるか、またはそれらを含む。
本発明の文脈における「結合部分」という用語は、所望の抗原に結合することができる任意の部分、基またはドメインを指す。本発明の特定の実施形態では、結合部分は、抗体、抗体断片、もしくは任意の他の結合タンパク質、またはそれらの任意の組合せであるか、またはそれらを含む。
天然に存在する抗体は、一般に単一特異性であり、すなわちそれらは単一の抗原に結合する。本発明は、例えば一次標的および二次標的化部分上の異なるエピトープに結合する結合剤、例えばドケッティング化合物を記載する。そのような結合剤は、少なくとも二重特異性または多重特異性、例えば三重特異性、四重特異性などである。したがって、結合剤は、本明細書に記載されるような２つ以上の抗体またはそれらの断片を含み得る。特に、本明細書に記載の結合剤は、２つの異なる抗体、抗体および異なる抗体の断片、ならびに２つの異なる抗体の断片（２つの結合ドメインを形成する２つの異なる抗体の前記断片）から構成される人工タンパク質であり得る。
本発明によれば、二重特異性結合剤、特に二重特異性抗体などの二重特異性タンパク質は、２つの異なる結合特異性を有し、したがって２つのエピトープに結合し得る分子である。特に、本明細書で使用される「二重特異性抗体」という用語は、２つの抗原結合部位、すなわち、第１のエピトープに親和性を有する第１の結合部位と、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープに結合親和性を有する第２の結合部位とを含む抗体を指す。
本発明の文脈における「二重特異性」という用語は、異なるエピトープに結合する２つの異なる抗原結合領域を有する薬剤を指す。
「多重特異性結合剤」は、３つ以上の異なる結合特異性を有する分子である。
二重特異性抗体の多くの異なる形式および使用が当技術分野で公知であり、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２０１５ Ｊｕｌ；２０（７）：８３８－４７および；ＭＡｂｓ，２０１２ Ｍａｒ－Ａｐｒ；４（２）：１８２－９７によって総説された。
本発明による二重特異性抗体は、特定の二重特異性形式またはその作製方法に限定されない。
本発明において使用され得る二重特異性抗体分子の例としては、（ｉ）異なる抗原結合領域を含む２つのアームを有する単一の抗体；（ｉｉ）例えば、余分なペプチドリンカーによってタンデムに連結された２つのｓｃＦｖを介して、２つの異なるエピトープに特異性を有する一本鎖抗体；（ｉｉｉ）各軽鎖および重鎖が短いペプチド結合を介してタンデムに２つの可変ドメインを含む二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－Ｉｇ（商標））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））；（ｉｖ）化学的に連結された二重特異性（Ｆａｂ’）２断片；（ｖ）標的抗原の各々に対して２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合物であるＴａｎｄａｂ；（ｖｉ）多価分子をもたらすｓｃＦｖとダイアボディとの組合せであるフレキシボディ；（ｖｉｉ）Ｆａｂに適用されると、異なるＦａｂ断片に連結された２つの同一のＦａｂ断片からなる三価二重特異性結合タンパク質を生じ得る、プロテインキナーゼＡの「二量体化およびドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドックアンドロック」分子；（ｖｉｉｉ）例えば、ヒトＦａｂアームの両末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるＳｃｏｒｐｉｏｎ分子；ならびに（ｉｘ）ダイアボディが挙げられる。
「二重特異性抗体」という用語は、ダイアボディを含む。ダイアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作り出す二価二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３参照）。二重特異性抗体には、二重特異性一本鎖抗体も含まれる。「二重特異性一本鎖抗体」という用語は、２つの結合ドメインを含む単一のポリペプチド鎖を表す。特に、本発明による「二重特異性一本鎖抗体」もしくは「一本鎖二重特異性抗体」という用語または関連する用語は、好ましくは、完全な免疫グロブリン中に存在する定常部分および／またはＦｃ部分を欠く単一のポリペプチド鎖中の少なくとも２つの抗体可変領域を連結することから生じる抗体構築物を意味する。例えば、二重特異性一本鎖抗体は、各々が別個のエピトープに特異的に結合することができ、スペーサを挟んだ２つの抗体可変領域が単一の連続したポリペプチド鎖として存在するように短いポリペプチドスペーサを介して互いに接続された合計２つの抗体可変領域、例えば２つのＶＨ領域を有する構築物であり得る。二重特異性一本鎖抗体の別の例は、３つの抗体可変領域を有する単一のポリペプチド鎖であり得る。ここで、２つの抗体可変領域、例えば１つのＶＨと１つのＶＬはｓｃＦｖを構成することができ、２つの抗体可変領域は合成ポリペプチドリンカーを介して互いに接続されており、後者は、タンパク質分解に最大限耐性のままでありながら免疫原性が最小限になるように遺伝子操作されていることが多い。このｓｃＦｖは、特定のエピトープに特異的に結合することができ、ｓｃＦｖによって結合されるエピトープとは異なるエピトープに結合することができるさらなる抗体可変領域、例えばＶＨ領域に接続される。二重特異性一本鎖抗体のさらに別の例は、４つの抗体可変領域を有する単一のポリペプチド鎖であり得る。ここで、最初の２つの抗体可変領域、例えばＶＨ領域およびＶＬ領域は、１つのエピトープに結合することができる１つのｓｃＦｖを形成し得るが、第２のＶＨ領域およびＶＬ領域は、別のエピトープに結合することができる第２のｓｃＦｖを形成し得る。単一の連続したポリペプチド鎖内で、１つの特異性の個々の抗体可変領域は、合成ポリペプチドリンカーによって好都合に分離され得るが、それぞれのｓｃＦｖは、上記のように短いポリペプチドスペーサによって好都合に分離され得る。一実施形態によれば、二重特異性抗体の第１の結合ドメインは、１つの抗体可変ドメイン、好ましくはＶＨＨドメインを含む。本発明の一実施形態によれば、二重特異性抗体の第１の結合ドメインは、２つの抗体可変ドメイン、好ましくはｓｃＦｖ、すなわちＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨを含む。本発明の一実施形態によれば、二重特異性抗体の第２の結合ドメインは、１つの抗体可変ドメイン、好ましくはＶＨＨドメインを含む。本発明の一実施形態によれば、二重特異性抗体の第２の結合ドメインは、２つの抗体可変ドメイン、好ましくはｓｃＦｖ、すなわちＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨを含む。したがって、その最小形態では、本発明による二重特異性抗体における抗体可変領域の総数はわずか２つである。例えば、そのような抗体は、２つのＶＨドメインまたは２つのＶＨＨドメインを含み得る。一実施形態によれば、二重特異性抗体の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインはそれぞれ、１つの抗体可変ドメイン、好ましくはＶＨＨドメインを含む。一実施形態によれば、二重特異性抗体の第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインはそれぞれ、２つの抗体可変ドメイン、好ましくはｓｃＦｖ、すなわちＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨを含む。この実施形態では、結合剤は、好ましくは、（ｉ）第１の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、（ｉｉ）第１の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、（ｉｉｉ）第２の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および（ｉｖ）第２の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
一実施形態では、本発明による二重特異性分子は、各々が異なるエピトープに対する２つのＦａｂ領域を含む。一実施形態では、本発明の分子は、抗原結合断片（Ｆａｂ）２複合体である。Ｆａｂ２複合体は、２つのＦａｂ断片から構成され、一方のＦａｂ断片は、１つのエピトープに特異的なＦｖドメイン、すなわちＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、他方のＦａｂ断片は、別のエピトープに特異的なＦｖドメインを含む。Ｆａｂ断片の各々は、ＶＬ－ＣＬモジュールおよびＶＨ－ＣＨモジュールの２つの一本鎖で構成され得る。あるいは、個々のＦａｂ断片の各々は、一本鎖、好ましくはＶＬ－ＣＬ－ＣＨ－ＶＨに配置されてもよく、個々の可変ドメインおよび定常ドメインはペプチドリンカーで接続されてもよい。
一実施形態では、本発明による結合剤は、様々なタイプの二価および三価一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、２つの抗体の可変ドメインを模倣する融合タンパク質を含む。二価の一本鎖可変断片（ジ－ｓｃＦｖ、バイ－ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって操作することができる。これは、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を生成し、タンデムｓｃＦｖを得ることによって行うことができる。本発明はまた、３つ以上のｓｃＦｖ結合ドメインを含む多重特異性分子を含む。
別の可能性は、２つの可変領域が一緒に折り畳まれるには短すぎるリンカーペプチド（約５アミノ酸）を有するｓｃＦｖの作製であり、ｓｃＦｖを強制的に二量体化させる。このタイプはダイアボディとして公知である。さらに短いリンカー（１または２アミノ酸）は、三量体、いわゆるトリアボディまたはトリボディの形成をもたらす。テトラボディも作製されている。それらは、それらの標的に対してダイアボディよりもさらに高い親和性を示す。
二重特異性抗体断片の特に好ましい例はダイアボディであり（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７７（１９９８），７６３－７７２）、これは小さな二価二重特異性抗体断片である。ダイアボディは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるペプチドリンカーによって接続された同じポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）上の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。これは、別の鎖の相補的ドメインとの対合を強制し、２つの機能的抗原結合部位を有する二量体分子のアセンブリを促進する。
一実施形態では、本発明による二重特異性または多重特異性分子は、免疫グロブリンの可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）および定常ドメイン（Ｃ）を含む。一実施形態では、二重特異性分子は、ミニボディ、好ましくは、各鎖の定常ドメイン（Ｃ）を介して互いに接続された２つの単一のＶＨ－ＶＬ－Ｃ鎖を含むミニボディである。この態様によれば、対応する可変重鎖領域（ＶＨ）、対応する可変軽鎖領域（ＶＬ）および定常ドメイン（Ｃ）は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ（エピトープ１）－ＶＬ（エピトープ１）－（Ｃ）およびＶＨ（エピトープ２）－ＶＬ（エピトープ２）－Ｃの順序で配置され、式中、Ｃは好ましくはＣＨ３ドメインであり、エピトープ１は第１のエピトープを指し、エピトープ２は第２のエピトープを指す。定常ドメインの対合は、ミニボディの形成をもたらす。
別の態様によれば、本発明の二重特異性結合剤は、二重特異性一本鎖抗体構築物の形式であり、前記構築物は、少なくとも２つの結合ドメインを含むか、または少なくとも２つの結合ドメインからなる。一実施形態では、各結合ドメインは、抗体重鎖由来の１つの可変領域（「ＶＨ領域」）を含み、第１の結合ドメインのＶＨ領域はエピトープ１に特異的に結合し、第２の結合ドメインのＶＨ領域はエピトープ２に特異的に結合する。２つの結合ドメインは、任意で短いポリペプチドスペーサによって互いに連結されている。各結合ドメインは、抗体軽鎖由来の１つの可変領域（「ＶＬ領域」）をさらに含み得、第１および第２の結合ドメインのそれぞれの中のＶＨ領域およびＶＬ領域は、第１の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域ならびに第２の結合ドメインのＶＨ領域およびＶＬ領域が互いに対合することを可能にするのに十分な長さのポリペプチドリンカーを介して互いに連結されている。
一実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、第１の結合ドメインを含む抗体、例えば完全長抗体を含む。一実施形態では、本明細書に記載の結合剤は、第１の結合ドメインを含む抗体に共有結合的に連結された第２の結合ドメインを含むｓｃＦｖまたはＶＨＨなどの抗体断片を含む。一実施形態では、結合剤は、抗体の軽鎖または重鎖のＮ末端またはＣ末端に共有結合的に連結されたｓｃＦｖまたはＶＨＨなどの抗体断片を含む。
核酸
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子などのＤＮＡおよびＲＮＡを含むことが意図されている。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡを含む。本発明によれば、ポリヌクレオチドは、好ましくは単離されている。
核酸は、ベクターに含まれ得る。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、λファージなどのファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを含む、当業者に公知の任意のベクターを含む。前記ベクターは、発現ベクターおよびクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列および特定の宿主生物（例えば細菌、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物）またはインビトロ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般に、特定の所望のＤＮＡ断片を操作および増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠いていてもよい。
本発明のすべての態様の一実施形態では、本明細書に記載されるドケッティング化合物をコードするＲＮＡは、治療される対象の細胞で発現されてドケッティング化合物を提供する。ドケッティング化合物が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、異なるポリペプチド鎖は、同じまたは異なるＲＮＡ分子によってコードされ得る。
本明細書に記載の核酸は、組換えおよび／または単離された分子であり得る。
本開示では、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基の全部または大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されることなく、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端（一方もしくは両方）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書では、ＲＮＡ中のヌクレオチドは、化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることも企図される。本開示では、これらの改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と見なされる。
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関するメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは一般に、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用したインビトロ転写によって生成され、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸を指す。
一実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、「レプリコンＲＮＡ」または単に「レプリコン」、特に「自己複製ＲＮＡ」または「自己増幅ＲＮＡ」である。特に好ましい一実施形態では、レプリコンまたは自己複製ＲＮＡは、ｓｓＲＮＡウイルス、特にアルファウイルスなどのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスに由来するか、またはそれに由来する要素を含む。アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６参照）。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は、典型的には１１，０００～１２，０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的には５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）尾部を有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与する）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。典型的には、ゲノム内に２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～ｎｓＰ４）は、典型的には、ゲノムの５’末端付近から始まる第１のＯＲＦによって一緒にコードされ、一方アルファウイルスの構造タンパク質は、第１のＯＲＦの下流に見出され、ゲノムの３’末端付近に延びる第２のＯＲＦによって一緒にコードされる。典型的には、第１のＯＲＦは第２のＯＲＦよりも大きく、その比率はおよそ２：１である。アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質をコードする核酸配列のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物のメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４）に類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルス生活環の初期段階に、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャＲＮＡのように直接作用する。アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報を標的細胞または標的生物に送達するために提案されている。単純なアプローチでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置き換える。アルファウイルスに基づくトランス複製系は、２つの別個の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし、他方の核酸分子はトランスで前記レプリカーゼによって複製されることができる（したがってトランス複製系という名称）。トランス複製は、所与の宿主細胞内にこれらの両方の核酸分子が存在することを必要とする。トランスでレプリカーゼによって複製され得る核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能にするために特定のアルファウイルス配列要素を含まなければならない。
一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは修飾ヌクレオシドを有し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つの（例えばすべての）ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書で使用される「ウラシル」という用語は、ＲＮＡの核酸中に存在し得る核酸塩基の１つを表す。ウラシルの構造は：
Figure 2023541931000006
である。
本明細書で使用される「ウリジン」という用語は、ＲＮＡ中に存在し得るヌクレオシドの１つを表す。ウリジンの構造は：
Figure 2023541931000007
である。
ＵＴＰ（ウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：
Figure 2023541931000008
を有する。
プソイドＵＴＰ（プソイドウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：
Figure 2023541931000009
を有する。
「プソイドウリジン」は、ウリジンの異性体である修飾ヌクレオシドの一例であり、ウラシルは、窒素－炭素グリコシド結合の代わりに炭素－炭素結合を介してペントース環に結合している。
別の例示的な修飾ヌクレオシドはＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）であり、これは、構造：
Figure 2023541931000010
を有する。
Ｎ１－メチルプソイドＵＴＰは、以下の構造：
Figure 2023541931000011
を有する。
別の例示的な修飾ヌクレオシドは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）であり、これは、構造：
Figure 2023541931000012
を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ中の１つ以上のウリジンは、修飾ヌクレオシドで置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはプソイドウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２種類以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよく、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）およびＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ中の１つ以上、例えばすべてのウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザウリジン、６－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオプソイドウリジン、２－チオプソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリルウリジン、５－ハロウリジン（例えば５－ヨードウリジンもしくは５－ブロモウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチルウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチルプソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルプソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチルプソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオプソイドウリジン）、５－メチル－２－チオウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオプソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチルプソイドウリジン、３－メチルプソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチルプソイドウリジン、１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシプソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオプソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、または当技術分野で公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか１つ以上であり得る。
一実施形態では、ＲＮＡは、他の修飾ヌクレオシドを含むか、またはさらなる修飾ヌクレオシド、例えば修飾シチジンを含む。例えば、一実施形態では、ＲＮＡにおいて、シチジンを５－メチルシチジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。一実施形態では、ＲＮＡは、５－メチルシチジンと、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から選択される１つ以上とを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、５－メチルシチジンおよびＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、各シチジンの代わりに５－メチルシチジンを含み、各ウリジンの代わりにＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは５’キャップを含む。一実施形態では、本開示のＲＮＡは、キャップされていない５’－三リン酸を有さない。一実施形態では、ＲＮＡは５’キャップ類似体によって修飾され得る。「５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出される構造を指し、一般に、５’－５’三リン酸結合によってｍＲＮＡに接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。ＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップ類似体を提供することは、５’キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写によって達成され得るか、またはキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡのためのビルディングブロックキャップは、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧ（時にｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’－ＯＡｐＧとも称される）であり、これは、以下の構造：
Figure 2023541931000013
を有する。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’－ＯＡｐＧを含む例示的なキャップ１ ＲＮＡである。
Figure 2023541931000014
以下は、別の例示的なキャップ１ ＲＮＡ（キャップ類似体なし）である。
Figure 2023541931000015
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、一実施形態では、以下の構造：
Figure 2023541931000016
を有するキャップ類似体アンチリバースキャップ（ＡＲＣＡキャップ（ｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ））を使用して、「キャップ０」構造で修飾される。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである。
Figure 2023541931000017
いくつかの実施形態では、「キャップ０」構造は、構造：
Figure 2023541931000018
を有するキャップ類似体β－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）を使用して生成される。
以下は、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）およびＲＮＡを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである。
Figure 2023541931000019
β－Ｓ－ＡＲＣＡの「Ｄ１」ジアステレオマーまたは「β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較してＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すβ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１／０１５３４７号参照）。
特に好ましいキャップは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐＳｐＧ）またはｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧである。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５’側（上流）（５’－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３’側（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在し得る。５’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは５’キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５’キャップに直接隣接している。３’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の３’末端に位置するが、「３’－ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）配列を含まない。したがって、３’－ＵＴＲはポリ（Ａ）配列（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）配列に直接隣接している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号２もしくは３のヌクレオチド配列、または配列番号２もしくは３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。
特に好ましい５’－ＵＴＲは、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい３’－ＵＴＲは、配列番号２または３のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、３’－ポリ（Ａ）配列を含む。
本発明で使用される場合、「ポリ（Ａ）配列」または「ポリＡ尾部」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。ポリ（Ａ）配列は当業者に公知であり、本明細書に記載のＲＮＡの３’ＵＴＲに後続し得る。連続的なポリ（Ａ）配列は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリ（Ａ）配列が典型的である。本明細書に開示されるＲＮＡは、転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３’末端に結合されたポリ（Ａ）配列、またはＤＮＡによってコードされ、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたポリ（Ａ）配列を有し得る。
約１２０個のＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列は、トランスフェクトされた真核細胞におけるＲＮＡのレベル、およびポリ（Ａ）配列の上流（５’側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。
ポリ（Ａ）配列は任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。この文脈において、「から本質的になる」は、ポリ（Ａ）配列中のほとんどのヌクレオチド、典型的にはポリ（Ａ）配列中のヌクレオチド数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、またはＣヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容することを意味する。この文脈において、「からなる」は、ポリ（Ａ）配列中のすべてのヌクレオチド、すなわちポリ（Ａ）配列中のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中、例えばインビトロ転写ＲＮＡの調製中に結合される。ポリ（Ａ）配列をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと称される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。そのようなカセットは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／００５３２４Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５３２４Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダムな配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドＤＮＡの持続的な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性と翻訳効率の支持に関する有益な特性と依然として関連していることを示す。結果として、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に含まれるポリ（Ａ）配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、その３’末端でポリ（Ａ）配列に隣接していない、すなわち、ポリ（Ａ）配列は、Ａ以外のヌクレオチドによってその３’末端でマスクされていないか、または後続されていない。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドから本質的になり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は約１５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は約１２０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号４のヌクレオチド配列、または配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリ（Ａ）配列を含む。
特に好ましいポリ（Ａ）配列は、配列番号４のヌクレオチド配列を含む。
本開示によれば、ドケッティング化合物は、好ましくは、ＲＮＡを投与されている対象の細胞に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳される一本鎖５’キャップｍＲＮＡとして投与される。好ましくは、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関するＲＮＡの最大の有効性のために最適化された構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列）を含む。
一実施形態では、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）をＲＮＡの５’末端の特異的キャッピング構造として利用する。一実施形態では、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧをＲＮＡの５’末端の特異的キャッピング構造として利用する。一実施形態では、５’－ＵＴＲ配列はヒトα－グロビンｍＲＮＡに由来し、任意で翻訳効率を高めるために最適化された「コザック配列」を有する。一実施形態では、「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素（ＦＩ要素）の組合せをコード配列とポリ（Ａ）配列との間に配置して、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続性を確実にする。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０６０３１４号参照）。一実施形態では、ヒトβグロビンｍＲＮＡに由来する２つの再反復３’－ＵＴＲをコード配列とポリ（Ａ）配列との間に配置して、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続性を確実にする。一実施形態では、３０個のアデノシン残基のストレッチと、それに続く１０個のヌクレオチドリンカー配列および別の７０個のアデノシン残基とからなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）配列が使用される。このポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの安定性および翻訳効率を高めるように設計された。
本発明のすべての態様の一実施形態では、ドケッティング化合物をコードするＲＮＡは、治療される対象の細胞で発現されてドケッティング化合物を提供する。本発明のすべての態様の一実施形態では、ＲＮＡは、対象の細胞において一過性に発現される。本発明のすべての態様の一実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。本発明のすべての態様の一実施形態では、ドケッティング化合物の発現は細胞外空間内にあり、すなわち、ドケッティング化合物は分泌される。
本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてインビトロで合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターが転写物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、本発明で使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明によるインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモータによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指示する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。
一実施形態では、例えばＲＮＡ脂質粒子として製剤化された本明細書に記載のＲＮＡの投与後、ＲＮＡの少なくとも一部が発現のために標的細胞に送達される。一実施形態では、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されて、それがコードするペプチドまたはタンパク質を産生する。
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称され得る。
一実施形態では、本発明に従って投与されるドケッティング化合物をコードするＲＮＡは、非免疫原性である。
本明細書で使用される「非免疫原性ＲＮＡ」という用語は、例えば哺乳動物に投与したとき免疫系による応答を誘導しないか、または非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にする修飾および処理に供されていないという点においてのみ異なる同じＲＮＡによって誘導されるよりも弱い応答を誘導する、すなわち標準ＲＮＡ（ｓｔｄＲＮＡ）によって誘導されるよりも弱い応答を誘導するＲＮＡを指す。好ましい一実施形態では、本明細書において修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）とも呼ばれる非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオシドをＲＮＡに組み込み、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を除去することによって非免疫原性にされる。
修飾ヌクレオシドの組み込みによって非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にするために、ＲＮＡの免疫原性を低下させるまたは抑制する限り、任意の修飾ヌクレオシドを使用し得る。自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオシドが特に好ましい。一実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。一実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチル－プソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。特に好ましい一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）、特にＮ１－メチル－プソイドウリジンである。
一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換は、ウリジンの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の置換を含む。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの合成中、酵素の通常とは異なる活性のために二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む有意な量の異常な産物が産生される。ｄｓＲＮＡは、炎症性サイトカインを誘導し、エフェクタ酵素を活性化してタンパク質合成の阻害をもたらす。ｄｓＲＮＡは、例えば、非多孔性または多孔性のＣ－１８ポリスチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）マトリックスを使用するイオン対逆相ＨＰＬＣによって、ＩＶＴ ＲＮＡなどのＲＮＡから除去することができる。あるいは、ｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡを特異的に加水分解し、それによってＩＶＴ ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ夾雑物を除去する大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩを用いた酵素ベースの方法を使用することができる。さらに、セルロース材料を使用することによってｄｓＲＮＡをｓｓＲＮＡから分離することができる。一実施形態では、ＲＮＡ調製物をセルロース材料と接触させ、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を許容しない条件下で、ｓｓＲＮＡをセルロース材料から分離する。
本明細書で使用される場合、「除去する」または「除去」という用語は、ｄｓＲＮＡなどの第２の物質の集団の近傍から分離されている、非免疫原性ＲＮＡなどの第１の物質の集団の特徴を指し、第１の物質の集団は必ずしも第２の物質を欠くわけではなく、第２の物質の集団は必ずしも第１の物質を欠くわけではない。しかしながら、第２の物質の集団の除去を特徴とする第１の物質の集団は、第１の物質と第２の物質との分離されていない混合物と比較して、第２の物質の含有量が測定可能に低い。
一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡからのｄｓＲＮＡの除去は、非免疫原性ＲＮＡ組成物中のＲＮＡの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、または０．１％未満がｄｓＲＮＡであるようなｄｓＲＮＡの除去を含む。一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを含まないか、または本質的に含まない。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製調製物は、他のすべての核酸分子（ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％の一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。
一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも効率的に細胞内で翻訳される。一実施形態では、翻訳は、その非修飾対応物と比較して２倍増強される。一実施形態では、翻訳は３倍増強される。一実施形態では、翻訳は４倍増強される。一実施形態では、翻訳は５倍増強される。一実施形態では、翻訳は６倍増強される。一実施形態では、翻訳は７倍増強される。一実施形態では、翻訳は８倍増強される。一実施形態では、翻訳は９倍増強される。一実施形態では、翻訳は１０倍増強される。一実施形態では、翻訳は１５倍増強される。一実施形態では、翻訳は２０倍増強される。一実施形態では、翻訳は５０倍増強される。一実施形態では、翻訳は１００倍増強される。一実施形態では、翻訳は２００倍増強される。一実施形態では、翻訳は５００倍増強される。一実施形態では、翻訳は１０００倍増強される。一実施形態では、翻訳は２０００倍増強される。一実施形態では、倍数は１０～１０００倍である。一実施形態では、倍数は１０～１００倍である。一実施形態では、倍数は１０～２００倍である。一実施形態では、倍数は１０～３００倍である。一実施形態では、倍数は１０～５００倍である。一実施形態では、倍数は２０～１０００倍である。一実施形態では、倍数は３０～１０００倍である。一実施形態では、倍数は５０～１０００倍である。一実施形態では、倍数は１００～１０００倍である。一実施形態では、倍数は２００～１０００倍である。一実施形態では、翻訳は、任意の他の有意な量または量の範囲だけ増強される。
一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも有意に低い自然免疫原性を示す。一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、その非修飾対応物よりも２倍低い自然免疫応答を示す。一実施形態では、自然免疫原性は３倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は４倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は５倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は６倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は７倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は８倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は９倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は１０倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は１５倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は２０倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は５０倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は１００倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は２００倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は５００倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は１０００倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は２０００倍低下する。
「有意に低い自然免疫原性を示す」という用語は、自然免疫原性の検出可能な低下を指す。一実施形態では、この用語は、検出可能な自然免疫応答を誘発することなく有効量の非免疫原性ＲＮＡを投与することができるような低下を指す。一実施形態では、この用語は、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を検出可能に減少させるのに十分な自然免疫応答を誘発することなく非免疫原性ＲＮＡを繰り返し投与することができるような低下を指す。一実施形態では、低下は、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の検出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を誘発することなく非免疫原性ＲＮＡを繰り返し投与することができるようなものである。
「免疫原性」は、ＲＮＡなどの異物がヒトまたは他の動物の体内で免疫応答を引き起こす能力である。自然免疫系は、比較的非特異的で即時的な免疫系の成分である。これは、適応免疫系と共に、脊椎動物免疫系の２つの主要成分のうちの１つである。
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織または系からの、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織または系から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の要素または成分またはドメインの結合を指す。
コドン最適化／Ｇ／Ｃ含量の増加
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のドケッティング化合物のアミノ酸配列は、コドン最適化されたコード配列および／またはそのＧ／Ｃ含量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされる。これはまた、コード配列の１つ以上の配列領域がコドン最適化されており、および／または野生型コード配列の対応する配列領域と比較してＧ／Ｃ含量が増加している実施形態を含む。一実施形態では、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含量の増加は、好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変化させない。
「コドン最適化された」という用語は、好ましくは核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するための核酸分子のコード領域中のコドンの改変を指す。本発明の文脈内で、コード領域は、好ましくは、本明細書に記載のＲＮＡ分子を使用して治療される対象における最適な発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、翻訳効率が、細胞におけるｔＲＮＡの出現の異なる頻度によっても決定されるという所見に基づく。したがって、ＲＮＡの配列は、頻繁に生じるｔＲＮＡが利用可能であるコドンが「まれなコドン」の代わりに挿入されるように改変され得る。
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡのコード領域のグアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量は、野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含量と比較して増加しており、ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは野生型ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して改変されていない。ＲＮＡ配列のこの改変は、翻訳される任意のＲＮＡ領域の配列がそのｍＲＮＡの効率的な翻訳のために重要であるという事実に基づく。Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量が増加した配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含量が増加した配列よりも安定である。いくつかのコドンが全く同じアミノ酸をコードする（いわゆる遺伝暗号の縮重）という事実に関して、安定性のために最も好ましいコドンを決定することができる（いわゆる代替コドン使用頻度）。ＲＮＡによってコードされるアミノ酸に依存して、その野生型配列と比較して、ＲＮＡ配列の改変には様々な可能性がある。特に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、これらのコドンを、同じアミノ酸をコードするがＡおよび／もしくはＵを含まないかまたはより低い含量のＡおよび／もしくはＵヌクレオチドを含む他のコドンで置換することによって改変することができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、またはさらにそれ以上増加している。
核酸含有粒子
ドケッティング化合物をコードするＲＮＡなどの本明細書に記載の核酸は、粒子として製剤化されて投与され得る。
本開示の文脈において、「粒子」という用語は、分子または分子複合体によって形成される構造化された実体に関する。一実施形態では、「粒子」という用語は、媒体中に分散したマイクロサイズまたはナノサイズの緻密な構造体などのマイクロサイズまたはナノサイズの構造体に関する。一実施形態では、粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物を含む粒子などの核酸含有粒子である。
ポリマーおよび脂質などの正に帯電した分子と負に帯電した核酸との間の静電相互作用は、粒子形成に関与する。これは、複合体化と核酸粒子の自発的形成をもたらす。一実施形態では、核酸粒子はナノ粒子である。
本開示で使用される場合、「ナノ粒子」は、非経口投与に適した平均直径を有する粒子を指す。
「核酸粒子」を使用して、目的の標的部位（例えば細胞、組織、器官など）に核酸を送達することができる。核酸粒子は、少なくとも１つのカチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質、プロタミンなどの少なくとも１つのカチオン性ポリマー、またはそれらの混合物および核酸から形成され得る。核酸粒子には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベースおよびリポプレックス（ＬＰＸ）ベースの製剤が含まれる。
いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、カチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質および／またはカチオン性ポリマーは、核酸と一緒になって凝集体を形成し、この凝集はコロイド的に安定な粒子をもたらすと考えられる。
一実施形態では、本明細書に記載の粒子は、カチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質以外の少なくとも１つの脂質もしくは脂質様物質、カチオン性ポリマー以外の少なくとも１つのポリマー、またはそれらの混合物をさらに含む。
いくつかの実施形態では、核酸粒子は複数の種類の核酸分子を含み、核酸分子の分子パラメータは、モル質量、または分子構造、キャッピング、コード領域もしくは他の特徴などの基本的な構造要素に関するように、互いに類似し得るかまたは異なり得る。
本明細書に記載の核酸粒子は、一実施形態では、約３０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約７０ｎｍ～約６００ｎｍ、約９０ｎｍ～約４００ｎｍ、または約１００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
本明細書に記載の核酸粒子は、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、または約０．２以下の多分散指数を示し得る。例として、核酸粒子は、約０．１～約０．３または約０．２～約０．３の範囲の多分散性指数を示し得る。
ＲＮＡ脂質粒子に関して、Ｎ／Ｐ比は、脂質中の窒素基対ＲＮＡ中のリン酸基の数の比率を与える。窒素原子（ｐＨに依存する）は通常正に帯電し、リン酸基は負に帯電するので、これは電荷比と相関する。電荷平衡が存在する場合、Ｎ／Ｐ比はｐＨに依存する。正に帯電したナノ粒子はトランスフェクションに有利であると考えられているので、脂質製剤は、４より大きく１２までのＮ／Ｐ比で形成されることが多い。その場合、ＲＮＡはナノ粒子に完全に結合していると見なされる。
本明細書に記載の核酸粒子は、少なくとも１つのカチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質および／または少なくとも１つのカチオン性ポリマーからコロイドを得る工程、ならびにコロイドを核酸と混合して核酸粒子を得る工程を含み得る広範囲の方法を使用して調製することができる。
本明細書で使用される「コロイド」という用語は、分散した粒子が沈降しない均一な混合物の一種に関する。混合物中の不溶性粒子は微視的であり、粒径は１～１０００ナノメートルである。混合物は、コロイドまたはコロイド懸濁液と呼ばれ得る。「コロイド」という用語は、混合物中の粒子のみを指し、懸濁液全体を指すのではない場合がある。
少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質および／または少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含むコロイドの調製のために、リポソーム小胞を調製するために従来使用され、適切に適合された方法が本明細書で適用可能である。リポソーム小胞を調製するために最も一般的に使用される方法は、以下の基本的段階を共有する：（ｉ）有機溶媒中での脂質溶解、（ｉｉ）得られた溶液の乾燥、および（ｉｉｉ）乾燥した脂質の水和（様々な水性媒体を使用して）。
膜水和法では、脂質を最初に適切な有機溶媒に溶解し、乾燥させてフラスコの底部に薄膜を得る。得られた脂質膜を、適切な水性媒体を用いて水和して、リポソーム分散液を得る。さらに、さらなる小型化工程が含まれてもよい。
逆相蒸発は、水相と脂質を含有する有機相との間の油中水型エマルジョンの形成を含む、リポソーム小胞を調製するための膜水和の代替方法である。この混合物の短時間の超音波処理は、系の均質化のために必要である。減圧下での有機相の除去により、その後リポソーム懸濁液に変わる乳白色のゲルが得られる。
「エタノール注入技術」という用語は、脂質を含むエタノール溶液が針を通して水溶液に迅速に注入されるプロセスを指す。この作用は、溶液全体に脂質を分散させ、脂質構造形成、例えばリポソーム形成などの脂質小胞形成を促進する。一般に、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、コロイド状リポソーム分散液にＲＮＡを添加することによって得られる。エタノール注入技術を使用して、そのようなコロイド状リポソーム分散液は、一実施形態では、以下のように形成される：カチオン性脂質およびさらなる脂質などの脂質を含むエタノール溶液を、撹拌しながら水溶液に注入する。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、押出工程なしで得られる。
「押し出す」または「押出」という用語は、固定された断面プロファイルを有する粒子の作製を指す。特に、これは粒子の小型化を指し、それによって粒子は規定された細孔を有するフィルタを通過する。
有機溶媒を含まない特性を有する他の方法もまた、コロイドを調製するために本開示に従って使用し得る。
ＬＮＰは、典型的には４つの成分：イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイド、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含む。各成分はペイロード保護を担い、有効な細胞内送達を可能にする。ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を水性緩衝液中で核酸と迅速に混合することによって調製し得る。
「平均直径」という用語は、長さの次元を有するいわゆるＺ平均、および無次元である多分散指数（ＰＩ）を結果として提供する、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用したデータ分析を伴う動的レーザー光散乱（ＤＬＳ）によって測定される粒子の平均流体力学的直径を指す（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，１９７２，ｐｐ ４８１４－４８２０，ＩＳＯ１３３２１）。ここで、粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ平均の値と同義で使用される。
「多分散指数」は、好ましくは、「平均直径」の定義で言及されているように、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて計算される。特定の前提条件下では、これは、ナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度と見なすことができる。
様々な種類の核酸含有粒子が微粒子形態の核酸の送達に適することが以前に記載されている（例えばＫａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，６０）。非ウイルス核酸送達ビヒクルの場合、核酸のナノ粒子封入は、核酸を分解から物理的に保護し、特定の化学的性質に応じて、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を助けることができる。
本開示は、核酸、少なくとも１つのカチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質、および／または核酸と会合して核酸粒子を形成する少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含む粒子、ならびにそのような粒子を含む組成物を記載する。核酸粒子は、非共有結合相互作用によって様々な形態で粒子に複合体化される核酸を含み得る。本明細書に記載の粒子は、ウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、それらは細胞にウイルス感染することができない。
適切なカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質およびカチオン性ポリマーは、核酸粒子を形成するものであり、「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語に含まれる。「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語は、核酸と会合して核酸粒子を形成する任意の成分に関する。そのような成分には、核酸粒子の一部であり得る任意の成分が含まれる。
カチオン性ポリマー
ポリマーは、それらの高度な化学的柔軟性を考慮して、ナノ粒子ベースの送達のために一般的に使用される材料である。典型的には、カチオン性ポリマーは、負に帯電した核酸をナノ粒子に静電的に凝縮するために使用される。これらの正に帯電した基は、多くの場合、５．５～７．５のｐＨ範囲でプロトン化の状態を変化させるアミンからなり、エンドソーム破裂をもたらすイオンの不均衡につながると考えられている。ポリ－Ｌ－リジン、ポリアミドアミン、プロタミンおよびポリエチレンイミンなどのポリマー、ならびにキトサンなどの天然に存在するポリマーはすべて核酸送達に適用されており、本明細書におけるカチオン性ポリマーとして適している。さらに、一部の研究者は、特に核酸送達のためのポリマーを合成した。ポリ（β－アミノエステル）は、特に、その合成の容易さと生分解性のために核酸送達において広く使用されている。そのような合成ポリマーは、本明細書におけるカチオン性ポリマーとしても適している。
本明細書で使用される「ポリマー」は、その通常の意味、すなわち、共有結合によって連結された１つ以上の繰り返し単位（モノマー）を含む分子構造体という意味を与えられる。繰り返し単位は、すべて同一であり得るか、または場合によっては、ポリマー内に複数の種類の繰り返し単位が存在し得る。場合によっては、ポリマーは生物学的に誘導される、すなわちタンパク質などの生体高分子である。場合によっては、さらなる部分、例えば本明細書に記載されるような標的化部分もポリマー中に存在し得る。
複数の種類の繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、そのポリマーは「コポリマー」であると言われる。本明細書で使用されるポリマーはコポリマーであり得ることが理解されるべきである。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の方法で配置され得る。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、または「ブロック」コポリマーとして、すなわち、それぞれが第１の繰り返し単位（例えば第１のブロック）を含む１つ以上の領域、およびそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば第２のブロック）を含む１つ以上の領域などを含むように配置することができる。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ以上の数の別個のブロックを有することができる。
特定の実施形態では、ポリマーは生体適合性である。生体適合性ポリマーは、典型的には、中程度の濃度では有意な細胞死を引き起こさないポリマーである。特定の実施形態では、生体適合性ポリマーは生分解性であり、すなわち、ポリマーは、体内などの生理学的環境内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。
特定の実施形態では、ポリマーは、プロタミンまたはポリアルキレンイミン、特にプロタミンであり得る。
「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、（魚のような）様々な動物の精子細胞中で体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、加水分解時に主にアルギニンを生成する、魚の精子に見出されるタンパク質を指す。精製形態では、それらは、インスリンの長時間作用型製剤において、ヘパリンの抗凝固作用を中和するために使用される。
本開示によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列およびその断片、および前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態、ならびに人工の、特定の目的のために特別に設計された、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを含むことが意図されている。
一実施形態では、ポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンおよび／またはポリプロピレンイミン、好ましくはポリエチレンイミンを含む。好ましいポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩの平均分子量は、好ましくは０．７５×１０２～１０７Ｄａ、好ましくは１０００～１０５Ｄａ、より好ましくは１００００～４００００Ｄａ、より好ましくは１５０００～３００００Ｄａ、さらにより好ましくは２００００～２５０００Ｄａである。
本開示によれば、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの直鎖状ポリアルキレンイミンが好ましい。
本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマー（ポリカチオン性ポリマーを含む）には、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性ポリマーが含まれる。一実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマーは、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、核酸が会合することができる任意のカチオン性ポリマーを含む。
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性ポリマー以外のポリマー、すなわち非カチオン性ポリマーおよび／またはアニオン性ポリマーを含み得る。集合的に、アニオン性および中性ポリマーは、本明細書では非カチオン性ポリマーと称される。
脂質および脂質様物質
「脂質」および「脂質様物質」という用語は、本明細書では、１つ以上の疎水性部分または基、および任意で１つ以上の親水性部分または基も含む分子として広く定義される。疎水性部分と親水性部分を含む分子はまた、しばしば両親媒性物質として示される。脂質は通常、水に難溶性である。水性環境では、両親媒性の性質は、分子が組織化された構造体と様々な相に自己集合することを可能にする。それらの相の１つは、それらが水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜中に存在する場合、脂質二重層からなる。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基で置換されたそのような基を含むがこれらに限定されない無極性基を含むことによって付与され得る。親水性基は、極性基および／または荷電基を含み得、炭水化物、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、および他の同様の基を含む。
本明細書で使用される場合、「両親媒性」という用語は、極性部分と非極性部分の両方を有する分子を指す。多くの場合、両親媒性化合物は、長い疎水性尾部に結合した極性頭部を有する。いくつかの実施形態では、極性部分は水に可溶性であるが、非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は、形式正電荷または形式負電荷のいずれかを有し得る。あるいは、極性部分は、形式正電荷と形式負電荷の両方を有してもよく、双性イオンまたは内部塩であってもよい。本開示の目的のために、両親媒性化合物は、１つ以上の天然または非天然脂質および脂質様化合物であり得るが、これらに限定されない。
「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」という用語は、構造的および／または機能的に脂質に関連するが、厳密な意味で脂質とは見なされ得ない物質に関する。例えば、この用語には、水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜中に存在する場合に両親媒性層を形成することができる化合物が含まれ、界面活性剤、または親水性部分と疎水性部分の両方を有する合成化合物が含まれる。一般的に言えば、この用語は、脂質の構造と類似していても類似していなくてもよい、異なる構造組織を有する親水性部分と疎水性部分とを含む分子を指す。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、脂質および脂質様物質の両方を包含すると解釈されるべきである。
両親媒性層に含まれ得る両親媒性化合物の具体的な例としては、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、両親媒性化合物は脂質である。「脂質」という用語は、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。一般に、脂質は、８つのカテゴリ：脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合に由来する）、ステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合に由来する）に分けられ得る。「脂質」という用語は時に脂肪の同義語として使用されるが、脂肪はトリグリセリドと呼ばれる脂質のサブグループである。脂質はまた、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質を含む）などの分子、ならびにコレステロールなどのステロール含有代謝物を包含する。
脂肪酸、または脂肪酸残基は、末端がカルボン酸基である炭化水素鎖からなる多様な分子の群である；この配置は分子に、極性の親水性末端と水に不溶性の非極性の疎水性末端とを付与する。典型的には４～２４炭素長である炭素鎖は、飽和でも不飽和でもよく、酸素、ハロゲン、窒素、および硫黄を含む官能基に結合していてもよい。脂肪酸が二重結合を含む場合、シスまたはトランス幾何異性のいずれかの可能性があり、これは分子の立体配置に有意に影響を及ぼす。シス二重結合は脂肪酸鎖の屈曲を生じさせ、これは、鎖内のより多くの二重結合と組み合わされる影響である。脂肪酸カテゴリにおける他の主要な脂質クラスは、脂肪酸エステルおよび脂肪酸アミドである。
グリセロ脂質は、一置換、二置換、および三置換グリセロールから構成され、最もよく知られているのは、トリグリセリドと呼ばれるグリセロールの脂肪酸トリエステルである。「トリアシルグリセロール」という語は、「トリグリセリド」と同義に使用されることがある。これらの化合物では、グリセロールの３つのヒドロキシル基はそれぞれ、典型的には異なる脂肪酸によってエステル化されている。グリセロ脂質のさらなるサブクラスは、グリコシド結合を介してグリセロールに結合した１つ以上の糖残基の存在を特徴とする、グリコシルグリセロールによって代表される。
グリセロリン脂質は、エステル結合によって２つの脂肪酸由来の「尾部」に、およびリン酸エステル結合によって１つの「頭部」基に結合したグリセロールコアを含む両親媒性分子（疎水性領域と親水性領域の両方を含む）である。通常リン脂質と称される（スフィンゴミエリンもリン脂質として分類されるが）グリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチンとしても公知）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥまたはＧＰＥｔｎ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳまたはＧＰＳｅｒ）である。
スフィンゴ脂質は、スフィンゴイド塩基骨格という共通の構造的特徴を共有する化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物における主要なスフィンゴイド塩基は、一般にスフィンゴシンと称される。セラミド（Ｎ－アシル－スフィンゴイド塩基）は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。脂肪酸は、典型的には、１６～２６炭素原子の鎖長を有する飽和または一不飽和である。哺乳動物の主要なスフィンゴリン脂質はスフィンゴミエリン（セラミドホスホコリン）であるが、昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを含有し、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールおよびマンノース含有頭部基を有する。スフィンゴ糖脂質は、グリコシド結合を介してスフィンゴイド塩基に結合した１つ以上の糖残基から構成される分子の多様なファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純なおよび複雑なスフィンゴ糖脂質である。
コレステロールおよびその誘導体、またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に膜脂質の重要な成分である。
サッカロ脂質は、脂肪酸が糖骨格に直接連結され、膜二重層と適合性である構造を形成する化合物を表す。サッカロ脂質では、単糖がグリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール骨格と置き換わる。最もよく知られているサッカロ脂質は、グラム陰性菌のリポ多糖のリピドＡ成分のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的なリピドＡ分子は、７本もの脂肪アシル鎖で誘導体化されている、グルコサミンの二糖である。大腸菌での増殖に必要な最小限のリポ多糖は、２つの３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（Ｋｄｏ）残基でグリコシル化されたグルコサミンのヘキサアシル化二糖である、Ｋｄｏ２－リピドＡである。
ポリケチドは、古典的な酵素、ならびに脂肪酸シンターゼと機構的特徴を共有する反復およびマルチモジュラー酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合によって合成される。それらは、動物、植物、細菌、真菌および海洋源からの多数の二次代謝物および天然産物を含み、大きな構造的多様性を有する。多くのポリケチドは、その骨格がしばしばグリコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化、または他のプロセスによってさらに修飾される環状分子である。
本開示によれば、脂質および脂質様物質は、カチオン性、アニオン性または中性であり得る。中性脂質または脂質様物質は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在する。
カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質
本明細書に記載の核酸粒子は、粒子形成剤として少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含み得る。本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む。一実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、核酸と会合することができる。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」または「カチオン性脂質様物質」は、正味の正電荷を有する脂質または脂質様物質を指す。カチオン性脂質または脂質様物質は、静電相互作用によって負に帯電した核酸に結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシル鎖またはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。
特定の実施形態では、カチオン性脂質または脂質様物質は、特定のｐＨ、特に酸性ｐＨでのみ正味の正電荷を有するが、生理学的ｐＨなどの異なる、好ましくはより高いｐＨでは、好ましくは正味の正電荷を有さず、好ましくは電荷を有さず、すなわち中性である。このイオン化可能な挙動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助け、毒性を低減することによって有効性を高めると考えられる。
本開示の目的のために、そのような「カチオンにイオン化可能な」脂質または脂質様物質は、状況と矛盾しない限り、「カチオン性脂質または脂質様物質」という用語に含まれる。
一実施形態では、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、正に帯電しているかまたはプロトン化され得る少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む頭部基を含む。
カチオン性脂質の例としては、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、ｌ，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス、シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス、シス－９’，１２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（シス－９－テトラデセニルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（βＡＥ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（ＤＯＢＡＱ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＤＡＰ）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、２，３－ビス（ドデシルオキシ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アモニウムブロミド（ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミニウムブロミド（ＤＭＯＲＩＥ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）８，８’－（（（（２（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ジオクタノエート（ＡＴＸ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＬＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＭＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）－９－（（４－（ジメチルアミノブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、Ｎ－ドデシル－３－（（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－｛２－［（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－２－｛（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－［２－（２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ）エチル］－アミノ｝－エチルアミノ）プロピオンアミド（リピドイド９８Ｎ１２－５）、１－［２－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル－［２－［４－［２－［ビス（２ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル］ピペラジン－１－イル］エチル］アミノ］ドデカン－２－オール（リピドイドＣ１２－２００）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約１００モル％、約２０モル％～約１００モル％、約３０モル％～約１００モル％、約４０モル％～約１００モル％、または約５０モル％～約１００モル％を構成し得る。
さらなる脂質または脂質様物質
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の脂質または脂質様物質、すなわち非カチオン性脂質または脂質様物質（非カチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む）を含み得る。集合的に、アニオン性および中性脂質または脂質様物質は、本明細書では非カチオン性脂質または脂質様物質と称される。イオン化可能／カチオン性脂質または脂質様物質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分を添加することによって核酸粒子の製剤を最適化することにより、粒子の安定性および核酸送達の有効性を高め得る。
核酸粒子の全体的な電荷に影響を及ぼしても及ぼさなくてもよいさらなる脂質または脂質様物質を組み込み得る。特定の実施形態では、さらなる脂質または脂質様物質は、非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば１つ以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」は、選択されたｐＨで負に帯電している任意の脂質を指す。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在するいくつかの脂質種のいずれかを指す。好ましい実施形態では、さらなる脂質は、以下の中性脂質成分の１つを含む：（１）リン脂質；（２）コレステロールもしくはその誘導体；または（３）リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
使用することができる特定のリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリン脂質としては、特に、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、および様々な疎水性鎖を有するさらなるホスファチジルエタノールアミン脂質が挙げられる。
特定の好ましい実施形態では、さらなる脂質は、ＤＳＰＣ、またはＤＳＰＣとコレステロールである。
特定の実施形態では、核酸粒子は、カチオン性脂質とさらなる脂質の両方を含む。
一実施形態では、本明細書に記載の粒子は、ペグ化脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含む。「ペグ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を指す。ペグ化脂質は当技術分野で公知である。
理論に拘束されることを望むものではないが、少なくとも１つのさらなる脂質の量と比較した少なくとも１つのカチオン性脂質の量は、電荷、粒径、安定性、組織選択性、および核酸の生物活性などの重要な核酸粒子特性に影響を及ぼし得る。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質、特に中性脂質（例えば１つ以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約０モル％～約９０モル％、約０モル％～約８０モル％、約０モル％～約７０モル％、約０モル％～約６０モル％、または約０モル％～約５０モル％を構成し得る。
リポプレックス粒子
本開示の特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、ＲＮＡリポプレックス粒子中に存在し得る。
本開示の文脈において、「ＲＮＡリポプレックス粒子」という用語は、脂質、特にカチオン性脂質、およびＲＮＡを含有する粒子に関する。正に帯電したリポソームと負に帯電したＲＮＡとの間の静電相互作用は、ＲＮＡリポプレックス粒子の複合体化と自発的形成をもたらす。正に帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質、およびＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。
特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質とさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約２：１である。
本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、一実施形態では、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０～約７００ｎｍ、約４００～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。
本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、非経口投与後、特に静脈内投与後の標的組織へのＲＮＡの送達に有用である。ＲＮＡリポプレックス粒子は、脂質のエタノール溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得るリポソームを使用して調製され得る。一実施形態では、水相は酸性ｐＨを有する。一実施形態では、水相は、例えば約５ｍＭの量の酢酸を含む。リポソームは、リポソームをＲＮＡと混合することによってＲＮＡリポプレックス粒子を調製するために使用され得る。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質および少なくとも１つのさらなる脂質を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および／または１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）および／または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡなどの核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態で投与される。ＬＮＰは、１つ以上の核酸分子が結合している、または１つ以上の核酸分子が封入されている粒子を形成することができる任意の脂質を含み得る。
一実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質および１つ以上の安定化脂質を含む。安定化脂質には、中性脂質およびペグ化脂質が含まれる。
一実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、および脂質ナノ粒子内に封入された、または脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。
一実施形態では、ＬＮＰは、４０～５５モル％、４０～５０モル％、４１～４９モル％、４１～４８モル％、４２～４８モル％、４３～４８モル％、４４～４８モル％、４５～４８モル％、４６～４８モル％、４７～４８モル％、または４７．２～４７．８モル％のカチオン性脂質を含む。一実施形態では、ＬＮＰは、約４７．０、４７．１、４７．２、４７．３、４７．４、４７．５、４７．６、４７．７、４７．８、４７．９または４８．０モル％のカチオン性脂質を含む。
一実施形態では、中性脂質は、５～１５モル％、７～１３モル％、または９～１１モル％の範囲の濃度で存在する。一実施形態では、中性脂質は、約９．５、１０または１０．５モル％の濃度で存在する。
一実施形態では、ステロイドは、３０～５０モル％、３５～４５モル％または３８～４３モル％の範囲の濃度で存在する。一実施形態では、ステロイドは、約４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６モル％の濃度で存在する。
一実施形態では、ＬＮＰは、１～１０モル％、１～５モル％、または１～２．５モル％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。
一実施形態では、ＬＮＰは、４０～５０モル％のカチオン性脂質；５～１５モル％の中性脂質；３５～４５モル％のステロイド；１～１０モル％のポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に封入された、または脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。
一実施形態では、モル％は、脂質ナノ粒子中に存在する脂質の総モルに基づいて決定される。
一実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥ、およびＳＭからなる群より選択される。一実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群より選択される。一実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。
一実施形態では、ステロイドはコレステロールである。
一実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。一実施形態では、ペグ化脂質は、以下の構造：
Figure 2023541931000020
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を有し、式中、
Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐の飽和または不飽和アルキル鎖であり、アルキル鎖は、１つ以上のエステル結合によって中断されていてもよく、ｗは、３０～６０の範囲の平均値を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖である。一実施形態では、ｗは、４０～５５の範囲の平均値を有する。一実施形態では、平均ｗは約４５である。一実施形態では、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立して、約１４個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖であり、ｗは約４５の平均値を有する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式（ＩＩＩ）：
Figure 2023541931000021
の構造、またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有し、式中、
Ｌ１またはＬ２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ１またはＧ２は、それぞれ独立して、置換されていないＣ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３は、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
Ｒａは、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３は、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；
Ｒ４はＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５は、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；ならびに
ｘは、０、１または２である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）：
Figure 2023541931000022
の１つを有し、式中、
Ａは、３～８員のシクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり；
Ｒ６は、各存在において、独立してＨ、ＯＨまたはＣ１－Ｃ２４アルキルであり；
ｎは、１～１５の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。
式（ＩＩＩ）の他の実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）：
Figure 2023541931000023
の１つを有し、式中、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、１～１２の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ１またはＬ２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＬ２の各々は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前述のいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＬ２の各々は、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。
式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）：
Figure 2023541931000024
の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）または（ＩＩＩＪ）：
Figure 2023541931000025
のうちの１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、ｎは、２～１２、例えば２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは３である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは５である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のうちのいくつかの他の実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、４～９または４～６の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ６はＨである。前述の実施形態の他の実施形態では、Ｒ６はＣ１－Ｃ２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ６はＯＨである。
式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ３は非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は置換されている。様々な異なる実施形態では、Ｇ３は、直鎖Ｃ１－Ｃ２４アルキレンまたは直鎖Ｃ１－Ｃ２４アルケニレンである。
式（ＩＩＩ）のいくつかの他の前述の実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、またはその両方がＣ６－Ｃ２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、以下の構造：
Figure 2023541931000026
を有し、式中、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、各存在において、独立してＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；ならびに
ａは２～１２の整数であり、
式中、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびａはそれぞれ、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ７ａの少なくとも１つの存在はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ７ａは、各存在においてＨである。前述の実施形態の他の異なる実施形態では、Ｒ７ｂの少なくとも１つの存在はＣ１－Ｃ８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１－Ｃ８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
式（ＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ１もしくはＲ２、またはその両方が、以下の構造：
Figure 2023541931000027
の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ３は、ＯＨ、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ４である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、メチルまたはエチルである。
様々な異なる実施形態では、式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質は、以下の表に示される構造の１つを有する。
式（ＩＩＩ）の代表的な化合物。
Figure 2023541931000028
Figure 2023541931000029
Figure 2023541931000030
Figure 2023541931000031
Figure 2023541931000032
Figure 2023541931000033
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の脂質は化合物ＩＩＩ－３である。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質はＡＬＣ－０１５９である。
ＡＬＣ－０１５９：
Figure 2023541931000034
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に約４０～約５０モル％の量で存在する。一実施形態では、中性脂質は、ＬＮＰ中に約５～約１５モル％の量で存在する。一実施形態では、ステロイドは、ＬＮＰ中に約３５～約４５モル％の量で存在する。一実施形態では、ペグ化脂質は、ＬＮＰ中に約１～約１０モル％の量で存在する。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物ＩＩＩ－３を約４０～約５０モル％の量で含み、ＤＳＰＣを約５～約１５モル％の量で含み、コレステロールを約３５～約４５モル％の量で含み、ＡＬＣ－０１５９を約１～約１０モル％の量で含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４７．５モル％の量の化合物ＩＩＩ－３、約１０モル％の量のＤＳＰＣ、約４０．７モル％の量のコレステロール、および約１．８モル％の量のＡＬＣ－０１５９を含む。
Ｎ／Ｐ値は、好ましくは少なくとも約４である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ値は、４～２０、４～１２、４～１０、４～８、または５～７の範囲である。一実施形態では、Ｎ／Ｐ値は約６である。
医薬組成物
ドケッティング化合物またはエフェクタプローブをコードするＲＮＡなどの本明細書に記載の薬剤は、医薬組成物または医薬品中で投与されてもよく、任意の適切な医薬組成物の形態で投与されてもよい。
本発明のすべての態様の一実施形態では、ドケッティング化合物またはエフェクタプローブをコードするＲＮＡなどの本明細書に記載の成分は、薬学的に許容される担体を含み得、任意で１つ以上のアジュバント、安定剤などを含み得る医薬組成物中で投与され得る。一実施形態では、医薬組成物は、治療的または予防的処置のため、例えば疾患を治療または予防するのに使用するためのものである。
「医薬組成物」という用語は、治療上有効な薬剤を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に含む製剤に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患または障害を治療する、予防する、またはその重症度を低下させるのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても公知である。
本開示による医薬組成物は、一般に、「薬学的有効量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
「薬学的有効量」または「治療有効量」という用語は、単独でまたはさらなる用量および／もしくは薬剤と共に所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与される用量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
本開示の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、および任意で他の治療薬を含有し得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。
本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤としては、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが挙げられる。
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例としては、限定されないが、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤が挙げられる。
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする薬剤に関する。さらに、「希釈剤」という用語は、流体、液体または固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上を含む。適切な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロールおよび水が挙げられる。
「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強する、または可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体としては、限定されないが、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが挙げられる。一実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。
治療的使用のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与には、消化管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、消化管を介する以外の任意の方法での投与を指す。好ましい実施形態では、医薬組成物は筋肉内投与用に製剤化される。別の実施形態では、医薬組成物は、全身投与用、例えば静脈内投与用に製剤化される。
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、ドケッティング化合物をコードするＲＮＡおよびエフェクタプローブなどの異なる化合物または組成物を同じ患者に投与するプロセスを意味する。異なる化合物または組成物は、同時に、本質的に同時に、または連続的に投与され得る。
治療
本明細書に記載の薬剤、組成物および方法は、疾患、例えば抗原を発現する疾患細胞（一次標的としての役割を果たし得る）の存在を特徴とする疾患を有する対象を治療するために使用することができる。特に好ましい疾患は癌疾患である。例えば、抗原がウイルスに由来する場合、薬剤、組成物および方法は、前記ウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患の治療に有用であり得る。抗原が腫瘍抗原である場合、薬剤、組成物および方法は、癌細胞が前記腫瘍抗原を発現する癌疾患の治療に有用であり得る。
本明細書に記載の薬剤、組成物および方法は、様々な疾患の治療的または予防的処置において使用され得る。一実施形態では、本明細書に記載の薬剤、組成物および方法は、抗原が関与する疾患の予防的および／または治療的処置に有用である。
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部源に由来する因子によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能不全によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能不全、窮迫、社会的問題、もしくは死亡を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす任意の状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、ならびに構造および機能の非定型の変化を含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリと見なされ得る。多くの疾患を患い、それらと共に生活することは、人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個人に影響を及ぼす。
本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療的介入」という用語は、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことを意図しており、予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。
「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長する（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体における疾患を排除し得る、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ得る、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ得る、個体における症状の頻度もしくは重症度を低下させ得る、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。
「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害（例えば癌）に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していても有していなくてもよいヒトまたは別の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、小児、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。
「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に罹患した個体または対象を意味する。
本開示の一実施形態では、目的は、腫瘍抗原を発現する癌細胞などの抗原を発現する疾患細胞に薬学的に活性な薬剤（化合物および細胞を含む）を送達し、腫瘍抗原などの抗原を発現する細胞が関与する癌疾患などの疾患を治療することである。
「抗原が関与する疾患」、「抗原を発現する細胞が関与する疾患」という用語または同様の用語は、抗原に関係する任意の疾患、例えば抗原の存在を特徴とする疾患を指す。抗原が関与する疾患は、感染症、または癌疾患もしくは単に癌であり得る。上記のように、抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり得る。一実施形態では、抗原が関与する疾患は、好ましくは細胞表面に抗原を発現する細胞が関与する疾患である。
「感染症」という用語は、個体から個体へ、または生物から生物へと伝播する可能性があり、微生物因子によって引き起こされる任意の疾患（例えば普通の風邪）を指す。感染症は当技術分野で公知であり、例えば、それぞれウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる、ウイルス性疾患、細菌性疾患、または寄生虫性疾患が含まれる。これに関して、感染症は、例えば、肝炎、性感染症（例えばクラミジアまたは淋病）、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、鳥インフルエンザ、およびインフルエンザであり得る。
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする個体における生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例としては、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が挙げられる。本開示による「癌」という用語は、癌転移も含む。
本明細書で使用される「固形腫瘍」または「固形癌」という用語は、例えばＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおいて当技術分野で周知のように、癌性腫瘤の発現を指す。好ましくは、この用語は、血液以外の、好ましくは血液、骨髄およびリンパ系以外の体組織の癌または癌腫を指す。例えば、限定するものではないが、固形腫瘍には、前立腺の癌、肺癌、結腸直腸組織、膀胱、中咽頭／喉頭組織、腎臓、乳房、子宮内膜、卵巣、子宮頸部、胃、膵臓、脳および中枢神経系の癌が含まれる。
本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認を意図するものではない。これらの文書の内容に関するすべての記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。具体的な装置、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な変更は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書に記載され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。
材料および方法
細胞および細胞培養
ヒトＣＬＤＮ６（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＬＤＮ６）、ＣＨＯ－Ｋ１－モック、ＦｌｐＩｎ－ＣＨＯ－ＧＦＰおよびヒトＣＤ３発現細胞（ＦｌｐＩｎ－ＣＨＯ－ｈｕＣＤ３）を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（ＦｌｐＩｎ－ＣＨＯ－ｈｕＣＤ３およびＦｌｐＩｎ－ＣＨＯ－ＧＦＰの場合）および１ｍｇ／ｍＬジェネティシン（ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＬＤＮ６の場合）を添加したダルベッコ改変栄養混合物Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２）培地中で増殖させた。細胞を５％ＣＯ２加湿空気雰囲気中３７℃で維持し、４８～７２時間ごとに継代した。ＨＥＫ２９７Ｔ－１７細胞を、１０％ＦＢＳを含むダルベッコ改変栄養混合物（ＤＭＥＭ）培地添加物中で増殖させ、７．５％ＣＯ２加湿空気雰囲気中３７℃で維持し、４８～７２時間ごとに継代した。二重特異性タンパク質の大規模生産のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞株を使用した。細胞を、標準的な加湿条件下（３７℃および８％ＣＯ２）に、１２０～１３５ｒｐｍ（Ｍｉｎｉｔｒｏｎ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒシェーカ、Ｉｎｆｏｒｓ－ＨＴ）で公称容量の１５～２５％を使用して、ベントキャップ（１２５ｍＬ）を備えたポリカーボネート製の使い捨て滅菌エルレンマイヤーフラスコで培養した。１×ＨＴ添加物および４ｍＭグルタミンを添加したＣＨＯ細胞用の無タンパク質既知組成培地（ＣＤＣＨＯ培地、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、密度が約１～１．５×１０６生存細胞／ｍＬに達したときに、典型的には４８～７２時間ごとに細胞を継代培養した。
翻訳効率を分析するために、ＲＮＡをＨＥＫ－２９３－Ｔ－１７細胞にエレクトロポレーションし、ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒタンパク質を含む細胞培養上清をＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって分析した。
二重特異性タンパク質の構築および親和性精製
ヒトコドン最適化Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧまたはＶＨＨ配列を遺伝子合成（ＴＷＩＳＴ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって作製した。抗ＣＬＤＮ６（ＩＭＡＢ０２７）ＩｇＧ（ＶＨ－ＣＨ１－３）、Ｆａｂ断片（ＶＨ－ＣＨ１）、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＴＲ６６）または抗ＣＤ３ ＶＨＨ（Ｆ０４）構築物を、（Ｇ４Ｓ１）１ペプチドリンカーコード配列を使用して抗ＡＬＦＡ ＶＨＨ（ＮａｎｏＴａｇ）に融合し、分泌シグナル配列および６ｘＨｉｓタグ配列を含めた（表１および２ならびに図１および２の配列参照）。二重特異性構築物の組換え発現のために、製造者のプロトコルを使用してＭａｘＣｙｔｅフローエレクトロポレーション条件でＣＨＯ－Ｓ細胞をエレクトロポレーションした。培養上清をＣＨＯ－Ｓ産生細胞株から回収し、組換えタンパク質をＣａｐｔｕｒｅｍ Ｈｉｓ－ｔａｇｇｅｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）によって精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクマシーブリリアントブルー染色、ならびにペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗６ｘＨｉｓタグ抗体を使用して実施したウエスタンブロット分析によって品質を試験した。
ＨＥＫ２９３＿Ｔ１７細胞のエレクトロポレーション
ＨＥＫ－２９３＿Ｔ１７細胞を、Ｘ－Ｖｉｖｏ培地（Ｂｉｏｚｙｍ）において８×１０６／ｍＬの密度に調整した。２５０μＬの細胞を０．４ｃｍキュベット（ＶＷＲ）に移し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（０．１ｍｇ／ｍＬもしくは０．０１ｍｇ／ｍＬの最終ＲＮＡ濃度）に希釈した２５μＬのＲＮＡ、または模擬対照としてＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液のみを用いてエレクトロポレーションした。ＥＣＭ８３０装置（ＢＴＸ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐａｒａｔｕｓ）を使用したエレクトロポレーション条件は、２５０ボルト、２パルス、５ミリ秒であった。その後、細胞に７５０μＬのＥｘｐｉ２９３（商標）培地（Ｇｉｂｃｏ）を、２×１０６個の細胞を含む合計１ｍＬまで添加した。これらを１２ウェル細胞培養プレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）のウェルに播種した。細胞培養物の上清を４８時間後に回収し、遠心分離し（３００ｘｇ、１０分）、フローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）による分析まで２～８℃で保存した。
ＡＬＦＡ色素ペプチドの合成
ＡＬＦＡペプチドを化学的に合成し、Ｃｙ５またはＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－６８０（ＡＦ６８０）色素のいずれかにコンジュゲートした。Ｃｙ５を、異なる戦略を使用して銅フリークリックケミストリによって結合した：第１の構築物（Ｃｙ５－ＤＢＣＯ－アジド－ＡＬＦＡ－ＮＨ２）では、Ｃｙ５－ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチレン）を、Ｎ末端にアジド部分を有するＣ末端アミド化ＡＬＦＡペプチドにコンジュゲートした。他の構築物（Ｃｙ５－アジド－ＦＣＯ－ＡＬＦＡ－ＯＨ、Ｃｙ５－アジド－ＦＣＯ－ＡＬＦＡ－ＮＨ２）については、Ｃｙ５－アジドを、Ａｌｆａペプチドを含有するＦＣＯ（フルオロシクロオクチン）とのクリック反応に使用した。ＡＦ６８０結合ペプチドは、ＰｅｐｓｃａｎおよびＪＰＴから調製した。これらの場合、フルオロフォアは、短いＰＥＧ３スペーサ（Ｐｅｐｓｃａｎ）を介して、またはスルフヒドリル基へのマレイミドベースのコンジュゲーションを可能にする導入されたＮ末端システイン残基を使用して結合した。異なるＡＬＦＡペプチドフルオロフォアコンジュゲートを図３に示す。
ＦＡＣＳ分析
細胞を９６ウェルマイクロタイタプレート（丸いボタン）に最終密度が２×１０５になるように播種し、示されているＡＬＦＡ二重特異性抗体の存在下に４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋５ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ＋１０ｍＬのＦＢＳ）で洗浄し、ＡＬＦＡ－Ｃｙ５またはＡＬＦＡ－ＡＦ６８０ペプチドと共に氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液でのさらなる洗浄工程の後、細胞をＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。励起レーザーライン６３３ｎＭを使用して、Ｃｙ５およびＡＦ６８０シグナルを検出した。
（実施例１）二重特異性構築物のインビトロ機能分析
図１および２に示す二重特異性構築物配列を、上記のように遺伝子合成によって作製した。ＡＬＦＡペプチドを化学的に合成し、上記のようにＣｙ５またはＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－６８０のいずれかにコンジュゲートした。
図４～６は、標的（ＣＬＤＮ６またはＣＤ３）過剰発現細胞および標的陰性細胞（ＦｌｐＩｎ－ＣＨＯ－モック）のＦＡＣＳ分析を示す。図４では、精製された組換え抗ＣＬＤＮ６抗ＡＬＦＡ抗体および蛍光標識ＡＬＦＡペプチドの存在下で細胞を分析する。以下の量／濃度を適用した：
１．ＶＬ－ＣＬ（ＩＭＡＢ０２７）を含む１００ｎＭ ａＡＬＦＡ×ａＣＬＤＮ６ ＶＨ（ＩＭＡＢ０２７）－ＣＨ１－Ｈ６（ａＡＬＦＡ×ａＣＬＤＮ６ ＶＨ（ＩＭＡＢ０２７）－ＣＨ１－Ｈ６：ＶＬ－ＣＬ（ＩＭＡＢ０２７）の比＝１：１．５）
２．ＶＬ－ＣＬ（ＩＭＡＢ０２７）を含む１００ｎＭ ａＣＬＤＮ６ ＶＨ（ＩＭＡＢ０２７）－ＣＨ１×ａＡＬＦＡ－Ｈ６（ａＣＬＤＮ６ ＶＨ（ＩＭＡＢ０２７）－ＣＨ１×ａＡＬＦＡ－Ｈ６：ＶＬ－ＣＬ（ＩＭＡＢ０２７）の比＝１：１．５）
３．ＶＬ－ＣＬ（ＩＭＡＢ０２７）を含む１００ｎＭ ａＡＬＦＡ×ａＣＬＤＮ６ ＶＨ（ＩＭＡＢ０２７）ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｈ６（ａＡＬＦＡ×ａＣＬＤＮ６ ＶＨ（ＩＭＡＢ０２７）ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｈ６：ＶＬ－ＣＬ（ＩＭＡＢ０２７）の比＝１：２．５）
４．ＶＬ－ＣＬ（ＩＭＡＢ０２７）を含む１００ｎＭ ａＣＬＤＮ６ ＶＨ（ＩＭＡＢ０２７）ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３×ａＡＬＦＡ－Ｈ６（ａＣＬＤＮ６ ＶＨ（ＩＭＡＢ０２７）ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３×ａＡＬＦＡ－Ｈ６：ＶＬ－ＣＬ（ＩＭＡＢ０２７）の比＝１：２．５）
１．～４．＋ＶＬ－ＣＬ（ＩＭＡＢ０２７）
ａ）１μｇ／ｍＬ Ｃｙ５－ＤＢＣＯ－アジド－ＡＬＦＡ－ＮＨ２
ｂ）１μｇ／ｍＬ Ｃｙ５－アジド－ＦＣＯ－ＡＬＦＡ－ＯＨ
ｃ）１μｇ／ｍＬ Ｃｙ５－アジド－ＦＣＯ－ＡＬＦＡ－ＮＨ２
ｄ）または１μｇ／ｍＬ ＡＬＦＡ－ＡＦ６８０
図５では、精製された組換え抗ＣＤ３－抗ＡＬＦＡ抗体ならびに示されている量（１、０．２、０．０４、０．００８、０．００１６および０．０００３２μｇ／ｍＬ）のＣｙ５－ＤＢＣＯ－アジド－ＡＬＦＡ－ＮＨ２蛍光標識ＡＬＦＡペプチドの存在下で細胞を分析する。以下の構築物および量／濃度を使用した：
１．２４０ｎＭ ａＡＬＦＡ×ａＣＤ３ ＶＬ－ＶＨ（ＴＲ６６）－Ｈ６
２．１５６ｎＭ ａＣＤ３ ＶＬ－ＶＨ（ＴＲ６６）×ａＡＬＦＡ－Ｈ６
３．２９４ｎＭ ａＣＤ３ ＶＨＨ（Ｆ０４）×ａＡＬＦＡ－Ｈ６
４．４１６ｎＭ ａＡＬＦＡ×ａＣＤ３ ＶＨＨ（Ｆ０４）－Ｈ６
図４および５のＦＡＣＳ測定は、それぞれの細胞表面標的の提示における複合体化（ａＡＬＦＡ－ＡＬＦＡペプチド連結）構築物の特異的蛍光強度の増加を示す。
図６では、精製された組換え二重特異性抗体で処理した細胞を、同じ構築物を発現するＲＮＡトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ－１７細胞の上清と共にインキュベートした細胞と比較して分析する。ここで、実験は、精製された組換えタンパク質およびＲＮＡエレクトロポレーション後の細胞上清中のタンパク質について同様の結果を示す。
（実施例２）癌のためのモジュラー二重特異性抗体。
図７に例示するこの実施例では、抗ＡＬＦＡ ＶＨＨ配列に融合した腫瘍特異的リガンドである抗ＣＬＤＮ６ ｓｃＦｖおよびＡＬＦＡタグに融合した抗Ｔ細胞特異的リガンドである抗ＣＤ３ ＶＨＨが、脂質ナノ粒子に封入された２つの分離したコードＲＮＡの形態で患者に投与される。脂質ナノ粒子は肝細胞によって取り込まれ、次いで、肝細胞は両方の二重特異性融合タンパク質を発現し、それらを血流中に放出する。抗ＣＬＤＮ６ｘ抗ＡＬＦＡ標的化リガンドは腫瘍部位に蓄積し、抗ＣＤ３－ＡＬＦＡタグはＴ細胞部位に蓄積する。ＡＬＦＡタグに対する抗ＡＬＦＡ ＶＨＨの高い特異性により、両方の細胞集団（腫瘍細胞およびＴ細胞）が互いに接続される。これはＣＤ３媒介Ｔ細胞活性化を引き起こし、腫瘍細胞の溶解をもたらす。記載された手順は、理論上、異なる腫瘍抗原および免疫細胞抗原に対して普遍的に適用可能である。
（実施例３）ユニバーサルＣＡＲＴアプローチ。
図８に例示するこの実施例では、タグを標的とする結合部分が認識ドメインとしてキメラ抗原受容体のヒンジ、膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインに融合されているＣＡＲ－Ｔ細胞を作製する。コストを削減し、迅速な患者供給を可能にするために、同種異系ＣＡＲＴ細胞がこの目的のために好ましく、これは、αβ Ｔ細胞枯渇の遺伝子操作のような確立された方法によって作製することができる。一般的なＣＡＲＴ細胞を患者に投与する。第２の成分として、腫瘍特異的標的化リガンド、例えば抗ＣＬＤＮ６ ｓｃＦｖをタグ配列に融合し、脂質ナノ粒子に封入されたＲＮＡとして患者に投与する。脂質ナノ粒子は肝細胞によって取り込まれ、次いで、肝細胞は二重特異性融合タンパク質を発現し、それを血流中に放出する。標的化リガンドは腫瘍部位に蓄積し、そこで最終的に一般的なＣＡＲ－Ｔ細胞が結合して腫瘍細胞死滅を媒介することができる。記載された手順は、理論上、異なる腫瘍抗原に普遍的に適用可能であり、原則として有効性を高め、異なる標的化リガンドをコードするＲＮＡの混合物を提供することによっていくつかの抗原の同時標的化も可能にする。このアプローチの別の主要な利点は、標的化リガンドの非存在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞の安全な持続性である。これにより、すべての腫瘍細胞が排除され、並行して、腫瘍再発の場合に同じまたは別の標的化リガンドを使用して治療を継続する選択肢が提供される場合、ＣＡＲ－Ｔ細胞を枯渇させることなく治療を一時停止することが可能になる。
（実施例４）ＡＬＦＡペプチド提示ナノ粒子を標的化するためのＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒ
ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒの生成および品質管理
ＣＤ３およびＡＬＦＡペプチドに対するＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒを、ａＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）×ａＡＬＦＡ－ＶＨＨをコードする２５μｇのＲＮＡ（２５μＬの１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中）を用いた２×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ－１７細胞（２５０μＬのＸ－Ｖｉｖｏ１５培地中）のエレクトロポレーションによって生成した。陰性対照（モック）として、ＲＮＡを含まない緩衝液を細胞にエレクトロポレーションした。４８時間後、細胞上清を回収し、濾過した。分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットはＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒの生成の成功を確認し、ＣＤ３発現細胞株に対するフローサイトメトリ分析はその機能性を証明した。
ナノ粒子－ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒ実験
ナノ粒子－ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒ実験のために、１５μＬのＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒ含有上清を、１５μＬのＡＬＦＡペプチド被覆ポリプレックス（ＰＬＸ）と共に室温で５分間インキュベートした。ＰＬＸは、１５または７．５のＮ／Ｐ比を有し、レポータ遺伝子ルシフェラーゼおよびＴｈｙ１．１をコードするポリ核酸を負荷されていた。陰性対照として、ＡＬＦＡペプチドを含まないナノ粒子を使用した。
５×１０５個のＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（１００μＬ）を、９６ディープウェルプレート中の６μＬのＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒ－ＰＬＸ混合物と共に３７℃で５分間インキュベートした。陰性対照として模擬上清および陽性対照として１．２５μｇ／ｍＬの精製ａＣＤ３－ＶＨＨ（Ｆ０４）×ａＡＬＦＡ－ＶＨＨタンパク質を使用した。ウェルあたり４００μＬの増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）を添加した。一晩培養のために、１００μＬの混合物をルシフェラーゼアッセイ用の９６ウェル白色フラットプレートに播種し、２５０μＬをＦＡＣＳ分析（Ｔｈｙ１．１検出）用の９６ウェル丸底プレートに播種した。一晩のインキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２で行った。
分析
ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒ生成の成功、ＡＬＦＡ被覆ＰＬＸへのそのａＡＬＦＡ－ＶＨＨ媒介結合、その後の粒子の内在化およびレポータ遺伝子発現を評価するために、ルシフェラーゼ活性を、発光およびＴｈｙ１．１発現を介してフローサイトメトリ分析によって測定した。
ルシフェラーゼアッセイのために、９６ウェル白色フラットプレートのウェルあたり５０μＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏアッセイ基質（１００μＬ細胞懸濁液）を添加し、暗所において室温で３分間インキュベートした。Ｔｅｃａｎ Ｒｅａｄｅｒで発光を測定した。
Ｔｈｙ１．１陽性細胞を、フローサイトメトリのためにａ－Ｔｈｙ１．１－ＡＦ６４７（クローンＯＸ－７）で染色した。死細胞（ｅＦｌｏｕｒ４５０＋）を分析から除外した。ＦＡＣＳデータを、Ｔｈｙ１．１＋細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）とＴｈｙ１．１＋細胞の割合との乗算によって比較した。
図９は、ＲｉｂｏＤｏｃｋｅｒが標的細胞へのＡＬＦＡ被覆ナノ粒子の特異的取り込みおよびそれらの核酸カーゴからの発現を促進することを示す。

Claims (74)

  1. 標的細胞へのペイロードの標的化送達のための方法であって、
    （ｉ）第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡで１つ以上の細胞をトランスフェクトする工程；
    （ｉｉ）前記ペプチドまたはポリペプチドが標的細胞と会合し、前記第１の結合部分が前記標的細胞の表面に提示されるように、前記１つ以上の細胞に前記ペプチドまたはポリペプチドを発現させる工程；および
    （ｉｉｉ）第２の結合部分を含むかまたは第２の結合部分に連結されたペイロードを付加する工程
    を含み、前記第１の結合部分と前記第２の結合部分とが互いに結合する、方法。
  2. 前記１つ以上の細胞を、前記ＲＮＡを含む粒子と接触させることによって、前記１つ以上の細胞に前記ＲＮＡをトランスフェクトする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記粒子が、前記１つ以上の細胞を標的化するための標的化分子を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記１つ以上の細胞が標的細胞を含むかまたは標的細胞からなる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記１つ以上の細胞が、第１の結合部分を含む前記ペプチドまたはポリペプチドを、それが前記１つ以上の細胞と会合したままであるように発現する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記１つ以上の細胞が前記標的細胞とは異なる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記１つ以上の細胞が、第１の結合部分を含む前記ペプチドまたはポリペプチドを、それが前記１つ以上の細胞によって分泌されるように発現する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記１つ以上の細胞が、第１の結合部分を含む前記ペプチドまたはポリペプチドを、それが血流中に放出されるように発現する、請求項１～３、６および７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 第１の結合部分を含む前記ペプチドまたはポリペプチドが、標的細胞上の標的に結合する第３の結合部分を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記標的が細胞表面抗原である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記第１の結合部分と前記第３の結合部分とが互いに連結されている、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記第１の結合部分と前記第３の結合部分とが互いに共有結合的に連結されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記第１の結合部分が抗体または抗体誘導体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記第２の結合部分がペプチドタグである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第１の結合部分がペプチドタグである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記第２の結合部分が抗体または抗体誘導体である、請求項１～１２および１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第３の結合部分が抗体または抗体誘導体である、請求項９～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記抗体誘導体が抗体断片である、請求項１３、１４、１６および１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ペプチドまたはポリペプチドが二重特異性抗体である、請求項１～１４、１７および１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記二重特異性抗体が二重特異性一本鎖抗体である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記第２の結合部分と前記ペイロードとが、互いに共有結合的または非共有結合的に連結されている、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ペイロードが薬学的に活性な薬剤を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記ペイロードが診断化合物を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ペイロードが治療化合物を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ペイロードが担体を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記担体が微粒子担体である、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記微粒子担体が、脂質ベースの粒子、ポリマーベースの粒子、またはそれらの混合物を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記担体が診断化合物を組み込んでいる、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記担体が治療化合物を組み込んでいる、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ペイロードが第４の結合部分を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記第４の結合部分が細胞表面抗原に結合する、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記第４の結合部分が結合する前記細胞表面抗原が免疫細胞上に存在する、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記標的細胞が対象に存在する、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. インビボで実施される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 対象に、
    （ｉ）第１の結合部分を含むペプチドもしくはポリペプチドをコードする前記ＲＮＡまたは前記ＲＮＡを含む前記粒子；および
    （ｉｉ）第２の結合部分を含むかもしくは第２の結合部分に連結された前記ペイロードまたはそれをコードするＲＮＡ
    を投与する工程を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 疾患を診断および／または治療するためのものであり、前記標的細胞が前記疾患に関連する抗原を発現するかまたは発現し得る、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記標的細胞が疾患細胞である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記標的が腫瘍抗原である、請求項９～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記標的細胞が腫瘍細胞または癌細胞である、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記標的細胞が免疫エフェクタ細胞である、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記標的細胞がＴ細胞である、請求項１～３５および４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記標的が、前記免疫エフェクタ細胞に特徴的な抗原である、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 抗原受容体をコードする核酸を前記免疫エフェクタ細胞に送達するためのものである、請求項１～３５および４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 対象における標的細胞へのペイロードの標的化送達のための方法であって、
    （ｉ）第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡ；および
    （ｉｉ）第２の結合部分を含むかもしくは第２の結合部分に連結されたペイロードまたはそれをコードするＲＮＡ
    を前記対象に投与する工程を含み、
    前記第１の結合部分と前記第２の結合部分とが互いに結合し、第１の結合部分を含む前記ペプチドまたはポリペプチドが、標的細胞上の標的に結合する第３の結合部分をさらに含む、
    方法。
  45. 前記ＲＮＡが、投与されたとき、粒子中に存在する、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ＲＮＡの投与後、第１の結合部分および第３の結合部分を含む前記ペプチドまたはポリペプチドが、前記対象の１つ以上の細胞によって発現される、請求項４４または４５に記載の方法。
  47. 前記１つ以上の細胞が、第１の結合部分および第３の結合部分を含む前記ペプチドまたはポリペプチドを分泌する、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記１つ以上の細胞が、第１の結合部分および第３の結合部分を含む前記ペプチドまたはポリペプチドを、それが血流中に放出されるように発現する、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 標的細胞へのペイロードの標的化送達のためのキットであって、
    （ｉ）第１の結合部分を含むペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡ；および
    （ｉｉ）第２の結合部分を含むかもしくは第２の結合部分に連結されたペイロードまたはそれをコードするＲＮＡ
    を含み、
    前記第１の結合部分と前記第２の結合部分とが互いに結合する、キット。
  50. 第１の結合部分を含む前記ペプチドまたはポリペプチドが、標的細胞上の標的に結合する第３の結合部分を含む、請求項４９に記載のキット。
  51. 前記標的が細胞表面抗原である、請求項５０に記載のキット。
  52. 前記第１の結合部分と前記第３の結合部分とが互いに連結されている、請求項５０または５１に記載のキット。
  53. 前記第１の結合部分と前記第３の結合部分とが互いに共有結合的に連結されている、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のキット。
  54. 前記第１の結合部分が抗体または抗体誘導体である、請求項４９～５３のいずれか一項に記載のキット。
  55. 前記第２の結合部分がペプチドタグである、請求項４９～５４のいずれか一項に記載のキット。
  56. 前記第１の結合部分がペプチドタグである、請求項４９～５３のいずれか一項に記載のキット。
  57. 前記第２の結合部分が抗体または抗体誘導体である、請求項４９～５３および５６のいずれか一項に記載のキット。
  58. 前記第３の結合部分が抗体または抗体誘導体である、請求項５０～５７のいずれか一項に記載のキット。
  59. 前記抗体誘導体が抗体断片である、請求項５４、５５、５７および５８のいずれか一項に記載のキット。
  60. 前記ペプチドまたはポリペプチドが二重特異性抗体である、請求項４９～５５、５８および５９のいずれか一項に記載のキット。
  61. 前記二重特異性抗体が二重特異性一本鎖抗体である、請求項６０に記載のキット。
  62. 前記第２の結合部分と前記ペイロードとが互いに共有結合的または非共有結合的に連結されている、請求項４９～６１のいずれか一項に記載のキット。
  63. 前記ペイロードが薬学的に活性な薬剤を含む、請求項４９～６２のいずれか一項に記載のキット。
  64. 前記ペイロードが診断化合物を含む、請求項４９～６３のいずれか一項に記載のキット。
  65. 前記ペイロードが治療化合物を含む、請求項４９～６４のいずれか一項に記載のキット。
  66. 前記ペイロードが担体を含む、請求項４９～６５のいずれか一項に記載のキット。
  67. 前記担体が微粒子担体である、請求項６６に記載のキット。
  68. 前記微粒子担体が、脂質ベースの粒子、ポリマーベースの粒子、またはそれらの混合物を含む、請求項６７に記載のキット。
  69. 前記担体が診断化合物を組み込んでいる、請求項６６～６８のいずれか一項に記載のキット。
  70. 前記担体が治療化合物を組み込んでいる、請求項６６～６９のいずれか一項に記載のキット。
  71. 前記ペイロードが第４の結合部分を含む、請求項４９～７０のいずれか一項に記載のキット。
  72. 前記第４の結合部分が細胞表面抗原に結合する、請求項７１に記載のキット。
  73. 前記第４の結合部分が結合する前記細胞表面抗原が免疫細胞上に存在する、請求項７２に記載のキット。
  74. 前記ＲＮＡが粒子中に存在する、請求項４９～７３のいずれか一項に記載のキット。
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