JP2024514364A - 緩衝物質を含むｒｎａ組成物ならびにその製造、保存および使用のための方法 - Google Patents

緩衝物質を含むｒｎａ組成物ならびにその製造、保存および使用のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、一般に緩衝物質を含むＲＮＡ組成物、そのような組成物の製造および保存のための方法ならびに治療におけるそのような組成物の使用の分野に関する。

Description

技術分野
本発明は、一般に緩衝物質を含むＲＮＡ組成物、そのような組成物の製造および保存のための方法ならびに治療におけるそのような組成物の使用の分野に関する。
背景
外来遺伝情報を標的細胞に送達するための組み換え核酸(例えばＤＮＡまたはＲＮＡ)の使用は周知である。ＲＮＡ使用の利点は、一過性発現および非形質転換特徴を含む。ＲＮＡは発現されるために核に入る必要はなく、さらに宿主ゲノムに統合され得ず、それにより発癌などの多様なリスクを排除する。
組み換え核酸は、それを必要とする対象に裸の形態で投与し得る；しかしながら、通常組み換え核酸は組成物を使用して投与される。例えば、ＲＮＡは、ＲＮＡと一体となってナノ粒子を形成するカチオン性ポリマーまたは脂質に大部分基づく、種々の送達媒体を使用して対象に送達され得る。ナノ粒子は、ＲＮＡを分解から保護し、ＲＮＡの標的部位への送達を可能とし、標的細胞による細胞取り込みおよびプロセシングを促進することが意図される。ＲＮＡ送達の効率は、一部、ナノ粒子の分子組成に依存し、粒子径、製剤および電荷またはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)もしくは他のリガンドなどの分子部分とのグラフティングを含む、多数のパラメータにより影響を受け得る。このようなナノ粒子製剤の運命は、多様な鍵となる因子(例えば、ナノ粒子のサイズおよびサイズ分布など)により制御される。これらの因子は、例えば、ＦＤＡの"Liposome Drug Products Guidance"において、２０１８年から分析および特定すべき特異的属性として言及されている。現在のナノ粒子製剤の臨床適用の制限は、均質、純粋かつ特徴がはっきりしたナノ粒子製剤がないことに関係し得る。
イオン化可能脂質を含むナノ粒子は、他のＲＮＡナノ粒子生成物と比較してターゲティングおよび有効性の点で利点を示し得る。しかしながら、通常の医薬用途で必要な十分な保存可能期間を得ることは困難である。安定化のために、イオン化可能脂質を含むナノ粒子は、コールドチェーンに相当な負荷を課す－８０℃などのはるかに低温で凍結する必要があるかまたは限られた安定性しか得ることができない凍結温度より高い温度、例えば５℃でしか保存できないと言われる。
溶液またはナノ粒子のＲＮＡは、断片化が遅いことは知られる。さらに、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)存在下、ＲＮＡは、翻訳のためのアクセスがほとんどできない極めて安定な折り畳まれた形態を採用する傾向にある。両方の機構、すなわち、断片化およびこの安定なＲＮＡ折り畳みの形成(「光移動性種(ＬＭＳ)」とも称される)は温度依存的であり、インタクトおよびアクセス可能なＲＮＡの結果であり、それにより液体生成物の安定性を制限する；しかしながら、本質的に凍結状態では存在しない。
発明は解決しようとする課題
故に、(ｉ)イオン化可能脂質およびＲＮＡを含み、薬務における通常の技術に適合した温度範囲、特に約－２５℃の温度または＋２～＋２０℃の温度で液体形態で安定かつ保存できる組成物；(ii)使用準備済である組成物；(iii)好ましくは、繰り返し凍結および解凍できる組成物；および(iv)そのような組成物の製造および保存のための方法に対する要求が本分野で存在する。本発明はこれらおよび他の要求に対処する。
本発明者らは、驚くべきことにここに記載する組成物および方法は上記要求を満たすことを発見した。特異的緩衝物質、特にトリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態の使用により、安定かつ液体形態で保存できる組成物を製造することが可能である。
概要
第一の態様において、本発明は、(ｉ)ＲＮＡ；(ii)カチオン的にイオン化可能な脂質；および(iii)式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)(式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＨ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であるか；またはＲ１、Ｒ２およびＲ３の２個は、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成し；各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚは独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６は独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され；そして各Ｒ５は独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択される。)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含む緩衝系を含む水相を含む、組成物を提供する。
本出願において示されるとおり、ＲＮＡ組成物におけるＰＢＳの代わりに上に特定した特定の緩衝物質、特にＴＥＡおよびそのプロトン化形態に基づく緩衝系の使用は、ＲＮＡの極めて安定な折り畳まれた形態(ここでは「光移動性種(ＬＭＳ)」とも称する)の形成を阻止する。さらに、本出願は、驚くべきことに、この緩衝系の使用により、液体形態で約３カ月保存後ＲＮＡ完全性が改善したＲＮＡ組成物を得ることができることを示す。故に、請求する組成物は改善された安定性を提供し、薬務における通常の技術に適合した温度範囲で保存でき、使用準備済組成物を提供する。
第二の態様において、本発明は、(ｉ)ＲＮＡ；および(ii)式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)(式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＨ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であるか；またはＲ１、Ｒ２およびＲ３の２個は、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成し；各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚは独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６は独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され；そして各Ｒ５は独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択される。)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含む緩衝系を含む水相を含む、組成物を提供する。
第一および第二の態様のある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々はＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である。例えば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択されてよく、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である。ある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－６アルキルおよびＣ１－６アルキレン－Ｒ４から選択され、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－４アルキルおよびＣ１－４アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－３アルキルおよびＣ１－３アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－２アルキルおよびＣ１－２アルキレン－Ｒ４から選択される。
第一および第二の態様のある実施態様において、各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚは独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６は独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、好ましくは各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚは独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６は独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、より好ましくは各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚは独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６は独立してＨおよびＣ１－２アルキルから選択される。例えば、各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され得て、好ましくは各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される。ある実施態様において、各Ｒ４は独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される。
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れか(または各々)はＣ１－６アルキレン－Ｒ４であり、Ｒ４はＯＨである第一および第二の態様のある実施態様において、アルキレン基は２～４個などの２～６個の炭素原子、例えば、２個、３個または４個の炭素原子を有するのが好ましい。故に、これらの実施態様において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れか(または各々)は好ましくはＣ２－６アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－４アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－３アルキレン－ＯＨ、例えばＣ２アルキレン－ＯＨである。
第一および第二の態様のある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される。
第一および第二の態様のある実施態様において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全て同じである。例えば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全てメチル、エチルまたは２－ヒドロキシエチルであり得る。
第一および第二の態様のある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は同一であり、Ｒ３はＲ１およびＲ２と異なる。例えば、Ｒ１およびＲ２の各々は２－ヒドロキシエチルまたはメチルであり得る；および／またはＲ３はメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される。
第一および第二の態様のある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成する。ある実施態様において、Ｒ３はＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ３はＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３はＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３はＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３はメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される。ある実施態様において、Ｎ－ヘテロ環式環は少なくとも１個の窒素環原子および所望によりＯおよびＳから選択される１個のさらなる環ヘテロ原子を含む単環式環である。例えば、Ｎ－ヘテロ環式環は、(ｉ)１個の窒素環原子；(ii)２個の窒素環原子；(iii)１個の窒素環原子および１個の酸素環原子；(iv)１個の窒素環原子および１個の硫黄環原子；または(ｖ)３個の窒素環原子を含む単環式環であり得る。ある実施態様において、Ｎ－ヘテロ環式環は単環式６員Ｎ－ヘテロ環式環などの単環式５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環である。Ｎ－ヘテロ環式環の好ましい例は、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、１,３,５－、モルホリニルおよびチオモルホリニルを含む。好ましくは、Ｎ－ヘテロ環式環はピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、モルホリニルおよびチオモルホリニルから選択される。ある実施態様において、Ｎ－ヘテロ環式環１個の窒素環原子のみ含む；これらの実施態様において、この窒素環原子はＲ３で置換されており、Ｒ３はＨ以外であるのが好ましい。ある実施態様において、Ｎ－ヘテロ環式環は１個を超える窒素環原子を含む；これらの実施態様において、１個の窒素環原子はＲ３で置換されており、Ｒ３はＨ以外であり、他の窒素環原子の少なくとも１個、好ましくは他の窒素環原子の各々はＲ５で置換されているのが好ましい。ある実施態様において、各Ｒ５は独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ５はＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５はＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５はＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５はメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される。ある実施態様において、Ｎ－ヘテロ環式環はピペリジニルであり、環Ｎ原子はＲ３で置換されており、Ｒ３はＨ以外である。ある実施態様において、Ｎ－ヘテロ環式環はピペラジニルであり、２個の環Ｎ原子の１個はＲ３で置換されており、Ｒ３はＨ以外であり、他の環Ｎ原子は所望によりＲ５で置換されており、好ましくは他の環Ｎ原子はＲ５で置換されている。ある実施態様において、Ｎ－ヘテロ環式環はピペラジニルであり、両環Ｎ原子は置換されており、ここで、個の環Ｎ原子の１個はＲ３で置換されており、Ｒ３はＨ以外であり、他の環Ｎ原子はＲ５で置換されており、ここで、好ましくはＲ５はＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５はＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５はＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５はＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５はメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される。上記実施態様の一部において、Ｒ１およびＲ２は窒素原子と一体となって５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するとき、各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される。上記実施態様の一部において、Ｒ１およびＲ２は窒素原子と一体となって５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するとき、各Ｒ４は独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される。上記実施態様の一部において、Ｒ１およびＲ２は窒素原子と一体となって５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成し、Ｒ３およびＲ５の何れか(または各々)はＣ１－６アルキレン－Ｒ４であり、Ｒ４はＯＨであるとき、アルキレン基は２～４個などの２～６個の炭素原子、例えば、２個、３個または４個の炭素原子を有するのが好ましい。故に、これらの実施態様において、Ｒ３およびＲ５の何れか(または各々)は好ましくはＣ２－６アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－４アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－３アルキレン－ＯＨ、例えばＣ２アルキレン－ＯＨである。上記実施態様の一部において、Ｒ１およびＲ２は窒素原子と一体となって５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するとき、Ｒ３およびＲ５は同じである。上記実施態様の一部において、Ｒ１およびＲ２は窒素原子と一体となって５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するとき、Ｒ３およびＲ５の両方はメチル、エチル、２－ヒドロキシエチルまたは２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルであり、好ましくは、Ｒ３およびＲ５の両方は２－ヒドロキシエチルである。上記実施態様の一部において、Ｒ１およびＲ２は窒素原子と一体となって５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するとき、Ｒ３およびＲ５は互いに異なる。
第一および第二の態様のある実施態様において、Ｒ１はＨである。ある実施態様において、Ｒ２およびＲ３の各々はＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である。例えば、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択されてよく、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である。ある実施態様において、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－６アルキルおよびＣ１－６アルキレン－Ｒ４から選択され、好ましくはＲ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－４アルキルおよびＣ１－４アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－３アルキルおよびＣ１－３アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々は独立してＣ１－２アルキルおよびＣ１－２アルキレン－Ｒ４から選択される。
ある実施態様において、Ｒ１はＨであるとき、各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される。例えば、各Ｒ４は独立して(?{1,})から選択され得る。
第一および第二の態様のある実施態様において、Ｒ１はＨであるとき、Ｒ２およびＲ３の何れか(または各々)はＣ１－６アルキレン－Ｒ４であり、Ｒ４はＯＨであり、アルキレン基は２～４個などの２～６個の炭素原子、例えば、２個、３個または４個の炭素原子を有するのが好ましい。故に、これらの実施態様において、Ｒ２およびＲ３の何れか(または各々)は好ましくはＣ２－６アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－４アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－３アルキレン－ＯＨ、例えばＣ２アルキレン－ＯＨである。
ある実施態様において、Ｒ１はＨであるとき、Ｒ２およびＲ３の各々は独立して２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択され、好ましくは、Ｒ２およびＲ３の両方は２－ヒドロキシエチルまたは２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルである。
第一および第二の態様のある実施態様において、緩衝物質はここに定義する３級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れもＨではないＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。故に、ある実施態様において、上にと規定したとおり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々はＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３である。ある実施態様において、３級アミンはモノアミンである。ある実施態様において、３級アミンはビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)、エチルジエタノールアミン、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オール、トリエチルアミンおよび２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールからなる群から選択される。ある実施態様において、３級アミンはトリエタノールアミン(ＴＥＡ)を含むかまたはそれである。
第一および第二の態様のある実施態様において、緩衝物質はここに定義する環状アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２個は窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。故に、ある実施態様において、上に特定したとおり、Ｒ１およびＲ２は、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成する。ある実施態様において、環状アミンは１以上のＣ１－６アルキレン－Ｒ４(例えば２－ヒドロキシエチル)部分で置換されているＮ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびモルホリンからなる群から選択される。
第一および第二の態様のある実施態様において、緩衝物質はここに定義する２級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１個はＨであるＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。故に、ある実施態様において、上に特定したとおり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２およびＲ３の各々はＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３である。
第一および第二の態様のある実施態様において、緩衝物質はＮ－オキシドを含むかまたはそれである。ある実施態様において、Ｎ－オキシドはトリメチルアミンＮ－オキシドである。
第一および第二の態様のある実施態様において、緩衝物質は少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４部分を含む。これらの実施態様のこのような場合において、Ｒ４はＯＨであるとき、アルキレン基は２～４個などの２～６個の炭素原子、例えば、２個、３個または４個の炭素原子を有するのが好ましい。故に、緩衝物質は少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４部分を含み、Ｒ４はＯＨであるこれらの実施態様において、少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４部分は好ましくはＣ２－６アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－４アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－３アルキレン－ＯＨ、例えばＣ２アルキレン－ＯＨまたは２－ヒドロキシエチルである。
第一および第二の態様のある実施態様において、緩衝物質はビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)およびそのプロトン化形態、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される。ある実施態様において、緩衝物質はビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)およびそのプロトン化形態、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態およびＮ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態から選択される。ある実施態様において、緩衝物質はトリエタノールアミン(ＴＥＡ)またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物中の緩衝物質の濃度は約１０mM～約２００mM、例えば約２０mM～約１８０mM、約３０mM～約１７０mM、約４０mM～約１６０mM、約５０mM～約５０mM、約６０mM～約１４０mM、約７０mM～約１３０mM、約８０mM～約１２０mM、約９０mM～約１１０mMである。ある実施態様において、組成物中の緩衝物質の濃度は約１５mM～約１００mM、好ましくは約２０mM～約８０mM、より好ましくは約４０mM～約６０mM、例えば約５０mMである。
第一および第二の態様のある実施態様において、緩衝系はさらにアニオンを含む。ある実施態様において、このアニオンはさらなる緩衝物質として作用できる。ある実施態様において、アニオンは無機および／または有機酸のアニオンから選択される(特に、組成物の所望のｐＨが緩衝物質式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態のｐＫａより少なくとも２.５ｐＨ単位低いとき)。ある実施態様において、アニオンはクロライド、酢酸、グリコール酸、乳酸およびクエン酸、コハク酸、マロン酸、グルタル酸またはアジピン酸のアニオンなどのジまたはトリカルボン酸のアニオンからなる群から選択される。ある実施態様において、緩衝系がアニオンを含むとき、組成物中のアニオンの濃度は組成物中の緩衝物質の濃度と少なくとも等しい。例えば、組成物中のアニオンの濃度は組成物中の緩衝物質の濃度より高くて良い。故に、第一および第二の態様のこれらの実施態様において、組成物中の緩衝物質の濃度は約１０mM～約２００mMの範囲内であるｘであるとき、組成物中のアニオンの濃度は少なくともｘに等しい、例えばｘより高い。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物のｐＨは約４.０～約８.０である。例えば、組成物のｐＨは約４.５～約８.０、例えば約５.０～約８.０、約５.５～約８.０、約６.０～約８.０、約６.５～約８.０、約６.８～約７.９、約７.０～約７.８または約７.５であり得る。
第一および第二の態様のある実施態様において、水は組成物の主成分であるおよび／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は約１.０％(ｖ／ｖ)未満、例えば約０.５％(ｖ／ｖ)未満である。例えば、組成物に含まれる水の量は少なくとも５０％(ｗ／ｗ)、例えば少なくとも５５％(ｗ／ｗ)、少なくとも６０％(ｗ／ｗ)、少なくとも６５％(ｗ／ｗ)、少なくとも７０％(ｗ／ｗ)、少なくとも７５％(ｗ／ｗ)、少なくとも８０％(ｗ／ｗ)、少なくとも８５％(ｗ／ｗ)、少なくとも９０％(ｗ／ｗ)または少なくとも９５％(ｗ／ｗ)であり得る。特に、組成物が抗凍結剤を含むならば、組成物に含まれる水の量は少なくとも５０％(ｗ／ｗ)、例えば少なくとも５５％(ｗ／ｗ)、少なくとも６０％(ｗ／ｗ)、少なくとも６５％(ｗ／ｗ)、少なくとも７０％(ｗ／ｗ)、少なくとも７５％(ｗ／ｗ)、少なくとも８０％(ｗ／ｗ)、少なくとも８５％(ｗ／ｗ)または少なくとも９０％(ｗ／ｗ)であり得る。組成物が抗凍結剤を実質的に含まないならば、組成物に含まれる水の量は少なくとも９５％(ｗ／ｗ)であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は約１.０％(ｖ／ｖ)未満、例えば約０.９％(ｖ／ｖ)未満、約０.８％(ｖ／ｖ)未満、約０.７％(ｖ／ｖ)未満、約０.６％(ｖ／ｖ)未満、約０.５％(ｖ／ｖ)未満、約０.４％(ｖ／ｖ)未満、約０.３％(ｖ／ｖ)未満、約０.２％(ｖ／ｖ)未満、約０.１％(ｖ／ｖ)未満、約０.０５％(ｖ／ｖ)未満または約０.０１％(ｖ／ｖ)未満であり得る。これに関して、標準条件下で液体である抗凍結剤は、水以外の溶媒ではなく、抗凍結剤とみなすべきである。換言すると、組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は約１.０％(ｖ／ｖ)未満、例えば約０.５％(ｖ／ｖ)未満であり得る上記最適限界は標準条件下で液体である抗凍結剤には適用されない。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物の浸透圧は最大約１０００×１０－３osmol／kg、例えば約１００×１０－３osmol／kg～約７５０×１０－３osmol／kgである。ある実施態様において、組成物の浸透圧は最大約５００×１０－３osmol／kg、例えば最大約４９０×１０－３osmol／kg、最大約４８０×１０－３osmol／kg、最大約４７０×１０－３osmol／kg、最大約４６０×１０－３osmol／kg、最大約４５０×１０－３osmol／kg、最大約４４０×１０－３osmol／kg、最大約４３０×１０－３osmol／kg、最大約４２０×１０－３osmol／kg、最大約４１０×１０－３osmol／kg、最大約４００×１０－３osmol／kg、最大約３９０×１０－３osmol／kg、最大約３８０×１０－３osmol／kg、最大約３７０×１０－３osmol／kg、最大約３６０×１０－３osmol／kg、最大約３５０×１０－３osmol／kg、最大約３４０×１０－３osmol／kg、最大約３３０×１０－３osmol／kg、最大約３２０×１０－３osmol／kg、最大約３１０×１０－３osmol／kgまたは最大約３００×１０－３osmol／kgである。組成物が抗凍結剤を含まないならば、組成物の浸透圧は３００×１０－３osmol／kg未満、例えば最大約２５０×１０－３osmol／kg、最大約２００×１０－３osmol／kg、最大約１５０×１０－３osmol／kg、最大約１００×１０－３osmol／kg、最大約５０×１０－３osmol／kg、最大約４０×１０－３osmol／kgまたは最大約３０×１０－３osmol／kgであり得る。組成物が抗凍結剤を含むならば、組成物の浸透圧の大部分は抗凍結剤によりもたらされるのが好ましい。例えば、抗凍結剤は組成物の浸透圧の少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％をもたらし得る。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物中のＲＮＡ濃度は約５mg／ｌ～約５００mg／ｌ、例えば約１０mg／ｌ～約４００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約３００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約２００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約１５０mg／ｌまたは約１０mg／ｌ～約１００mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、より好ましくは約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである。ある実施態様において、組成物中のＲＮＡ濃度は約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌ、例えば約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、約２５mg／ｌ～約１２５mg／ｌ、約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌ、約３５mg／ｌ～約１１５mg／ｌ、約４０mg／ｌ～約１１０mg／ｌ、約４５mg／ｌ～約１０５mg／ｌまたは約５０mg／ｌ～約１００mg／ｌである。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物は、好ましくは少なくとも約１％ｗ／ｖの濃度で抗凍結剤を含み、ここで、抗凍結剤は好ましくは炭水化物およびアルコール(例えば糖アルコールまたは低級アルコール)からなる群から選択され、より好ましくは抗凍結剤はスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から(例えばスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群からまたはスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から)選択され、より好ましくは抗凍結剤はスクロースおよび／またはグリセロールを含む。ある実施態様において、組成物中の抗凍結剤の濃度は少なくとも１％ｗ／ｖ、例えば少なくとも２％ｗ／ｖ、少なくとも３％ｗ／ｖ、少なくとも４％ｗ／ｖ、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも６％ｗ／ｖ、少なくとも７％ｗ／ｖ、少なくとも８％ｗ／ｖまたは少なくとも９％ｗ／ｖである。ある実施態様において、組成物中の抗凍結剤の濃度は最大２５％ｗ／ｖ、例えば最大２０％ｗ／ｖ、最大１９％ｗ／ｖ、最大１８％ｗ／ｖ、最大１７％ｗ／ｖ、最大１６％ｗ／ｖ、最大１５％ｗ／ｖ、最大１４％ｗ／ｖ、最大１３％ｗ／ｖ、最大１２％ｗ／ｖまたは最大１１％ｗ／ｖである。ある実施態様において、組成物中の抗凍結剤の濃度は１％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、例えば２％ｗ／ｖ～１９％ｗ／ｖ、３％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、４％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１６％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖ、９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖまたは約１０％ｗ／ｖである。ある実施態様において、組成物は、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、例えば６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖまたは９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖの濃度または約１０％ｗ／ｖの濃度で抗凍結剤(例えばスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオールまたは１,３－プロパンジオール、特に、スクロースおよび／またはグリセロール)を含む。
組成物は抗凍結剤を含む第一および第二の態様のある実施態様において、抗凍結剤は、組成物の総重量に基づき、約５０×１０－３osmol／kg～約１０００×１０－３osmol／kg(例えば約５０×１０－３osmol／kg～約５００×１０－３osmol／kg、約５０×１０－３osmol／kg～約４８０×１０－３osmol／kg、約６０×１０－３osmol／kg～約４６０×１０－３osmol／kg、約７０×１０－３osmol／kg～約４４０×１０－３osmol／kg、約８０×１０－３osmol／kg～約４２０×１０－３osmol／kg、約９０×１０－３osmol／kg～約４００×１０－３osmol／kg、約１００×１０－３osmol／kg～約３８０×１０－３osmol／kg、約１２０×１０－３osmol／kg～約３６０×１０－３osmol／kg、約１４０×１０－３osmol／kg～約３４０×１０－３osmol／kg、約１６０×１０－３osmol／kg～約３１０×１０－３osmol／kg、約１８０×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kgまたは約２００×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kg)の範囲の組成物の浸透圧をもたらす濃度で存在する。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物は抗凍結剤を実質的に含まない。
第一および第二の態様のある実施態様において、緩衝物質はここに定義する３級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れもＨではないＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含み、組成物のｐＨは約４.０～約８.０であり、組成物中のＲＮＡ濃度は約５mg／ｌ～約５００mg／ｌである。この実施態様において、組成物のｐＨは約４.５～約８.０であり、組成物中のＲＮＡ濃度は約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、例えば約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであるのが好ましい。特に好ましい実施態様において、緩衝物質はここに定義する３級アミンまたはそのプロトン化形態を含み；組成物のｐＨは約５.０～約８.０であり；組成物中のＲＮＡ濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；そして組成物は抗凍結剤を含む。別の特に好ましい実施態様において、緩衝物質はここに定義する３級アミンまたはそのプロトン化形態を含み；組成物のｐＨは約５.０～約８.０であり；組成物中のＲＮＡ濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；そして組成物は抗凍結剤を実質的に含まない。ある実施態様において、３級アミンはモノアミンである。ある実施態様において、３級アミンはビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)、エチルジエタノールアミン、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オール、トリエチルアミンおよび２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールからなる群から選択される。ある実施態様において、３級アミンはトリエタノールアミン(ＴＥＡ)を含むかまたはそれである。
第一および第二の態様のある実施態様において、緩衝物質はここに定義する環状アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２個は窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含み、組成物のｐＨは約４.０～約８.０であり、組成物中のＲＮＡ濃度は約５mg／ｌ～約５００mg／ｌである。この実施態様において、組成物のｐＨは約４.５～約８.０であり、組成物中のＲＮＡ濃度は約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、例えば約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであるのが好ましい。特に好ましい実施態様において、緩衝物質はここに定義する環状アミンまたはそのプロトン化形態を含み；組成物のｐＨは約５.０～約８.０であり；組成物中のＲＮＡ濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；そして組成物は抗凍結剤を含む。別の特に好ましい実施態様において、緩衝物質はここに定義する環状アミンまたはそのプロトン化形態を含み；組成物のｐＨは約５.０～約８.０であり；組成物中のＲＮＡ濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；そして組成物は抗凍結剤を実質的に含まない。ある実施態様において、環状アミンは１以上のＣ１－６アルキレン－Ｒ４(例えば２－ヒドロキシエチル)部分で置換されているＮ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびモルホリンからなる群から選択される。
第一の態様のある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む。
第一の態様のある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、式(Ｘ)
の構造を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、ここで、Ｌ１０、Ｌ２０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｒ３５、Ｒ３６およびＲ３７はここに定義するとおりである。ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は次のものから選択される：構造Ｘ－１～Ｘ－３６(ここに示す)；構造Ａ～Ｇ(ここに示す)；またはＮ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシプロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＯＤＡＰ)、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ)および４－((ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イル)アミノ)オキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－４－オキソブタン－１－アミン(ＤＰＬ－１４)。ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、構造Ｘ－３を有する脂質である。
第一の態様のある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は式(XI)：
の構造を有し、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｇ１、Ｇ２およびｍはここに定義するとおりである。ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は構造(XIV－１)、(XIV－２)および(XIV－３)(ここに示す)から選択される。
第一の態様のある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、組成物に存在する総脂質の約２０mol％～約８０mol％、好ましくは約２５mol％～約６５mol％、より好ましくは約３０mol％～約５０mol％、例えば約４０mol％～約５０mol％を構成する。
第一の態様のある実施態様において、組成物は１以上の付加的脂質をさらに含む。ある実施態様において、１以上の付加的脂質はポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、組成物は、カチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ペグ化脂質；またはポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)、中性脂質(例えば、ＤＳＰＣなどのリン脂質)およびステロイド(例えば、コレステロール)を含む。
組成物は１以上の付加的脂質の一つとしてポリマーコンジュゲート脂質をさらに含む第一の態様のある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質を含む。ある実施態様において、ペグ化脂質はＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＯＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＥ－ＰＥＧおよびＤＭＰＥ－ＰＥＧからなる群から選択される。ある実施態様において、ペグ化脂質は次の構造：
を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体であり、ここで、Ｒ１２、Ｒ１３およびｗはここに定義するとおりである。
組成物は１以上の付加的脂質の一つとしてポリマーコンジュゲート脂質をさらに含む第一の態様のある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートを含む。ある実施態様において、ポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートはポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである。
組成物は１以上の付加的脂質の一つとしてポリマーコンジュゲート脂質をさらに含む第一の態様のある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質は、組成物に存在する総脂質の約０.５mol％～約５mol％、好ましくは約１mol％～約５mol％、より好ましくは約１mol％～約４.５mol％を構成する。
組成物は１以上の付加的脂質の一つとして中性脂質を含む第一の態様のある実施態様において、中性脂質はリン脂質である。ある実施態様において、リン脂質はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される。ある実施態様において、リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルフタチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)からなる群から選択される。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。
組成物が１以上の付加的脂質の一つとして中性脂質を含む第一の態様のある実施態様において、中性脂質は組成物に存在する総脂質の約５mol％～約４０mol％、好ましくは約５mol％～約２０mol％、より好ましくは約５mol％～約１５mol％を構成する。
組成物が１以上の付加的脂質としてステロイドをさらに含む第一の態様のある実施態様において、ステロイドはコレステロールなどのステロールである。
組成物が１以上の付加的脂質としてステロイドをさらに含む第一の態様のある実施態様において、ステロイドは組成物に存在する総脂質の約１０mol％～約６５mol％、好ましくは約２０mol％～約６０mol％、より好ましくは約３０mol％～約５０mol％を構成する。
第一の態様のある実施態様において、組成物はカチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質(例えば、リン脂質)およびステロイドを含み、ここで、カチオン的にイオン化可能な脂質は組成物に存在する総脂質の約３０mol％～約５０mol％、例えば約４０mol％～約５０mol％を構成し；ポリマーコンジュゲート脂質は組成物に存在する総脂質の約１mol％～約４.５mol％を構成し；中性脂質(例えば、リン脂質)は組成物に存在する総脂質の約５mol％～約１５mol％を構成し；そしてステロイドは組成物に存在する総脂質の約３０mol％～約５０mol％を構成する。
第一および第二の態様のある実施態様において、ＲＮＡの少なくとも一部、および、存在するならば、１以上の脂質は、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)、リポソームおよび／またはリポフレックス(ＬＰＸ)などの粒子中に存在する。第一および第二の態様のある実施態様において、ＲＮＡは粒子内に封入されるかまたは粒子と結合している。ある実施態様において、粒子は組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％を構成する。ある実施態様において、粒子は組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７６％、例えば少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％を構成する。ある実施態様において、粒子は約３０nm～約５００nmのサイズを有する。
第一および第二の態様のある実施態様において、ＲＮＡはｍＲＮＡまたは阻害性ＲＮＡである。
第一および第二の態様のある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は(ｉ)ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む；(ii)コドン最適化されているコード配列を有する；および／または(iii)野生型コード配列と比較してＧ／Ｃ含量は増加しているコード配列を有する。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される。
第一および第二の態様のある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は次の少なくとも１以上を含む：５’キャップ；５’ ＵＴＲ；３’ ＵＴＲ；およびポリＡ配列。ある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は次の全てを含む：５’キャップ；５’ ＵＴＲ；３’ ＵＴＲ；およびポリＡ配列。ある実施態様において、ポリＡ配列は少なくとも１００個のＡヌクレオチドを含み、ここで、ポリＡ配列は好ましくはＡヌクレオチドの中断配列である。ある実施態様において、５’キャップはキャップ１またはキャップ２構造である。
第一および第二の態様のある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は１以上のポリペプチドをコードする。ある実施態様において、１以上のポリペプチドは対象における抗原に対する免疫応答を誘導するための薬学的活性ポリペプチドであるおよび／またはエピトープを含む。
第一および第二の態様のある実施態様において、薬学的活性ポリペプチドおよび／または抗原またはエピトープは病原体のタンパク質、タンパク質の免疫原性バリアントまたはタンパク質の免疫原性フラグメントもしくはその免疫原性バリアントに由来するかまたはそれである。ある実施態様において、病原体は感染性疾患を引き起こす病原体である。
第一および第二の態様のある実施態様において、薬学的活性ポリペプチドおよび／または抗原またはエピトープはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク(Ｓ)タンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに由来するかまたはそれである。ある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の９８６位および９８７位に置換されたプロリン残基を有する。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一性を有する。ある実施態様において、フラグメントはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。ある実施態様において、(ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の免疫原性バリアントのフラグメントは配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一性を有する。
第一の態様のある実施態様において、ＲＮＡは阻害性ＲＮＡ(例えばｓｉＲＮＡ)であり、標的ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズするおよび／または特異的である。ある実施態様において、標的ｍＲＮＡは、発現(特に、例えば、健常対象における発現と比較して増加した発現)が疾患と関連する薬学的活性ペプチドまたはポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。ある実施態様において、標的ｍＲＮＡは、発現(特に、例えば、健常対象における発現と比較して増加した発現)が癌と関連する薬学的活性ペプチドまたはポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物は、好ましくは約２℃～約１０℃の温度で液体である。
第一および第二の態様のある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、所望の効果をもたらす、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％である。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも９０％である。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも４週間(例えば、少なくとも３カ月)保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％である。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも４週間(例えば、少なくとも３カ月)保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも９０％である。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物の最初のＲＮＡ完全性(すなわち、製造後であるが、保存前)は少なくとも５０％であり、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月または少なくとも３カ月)保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、最初のＲＮＡ完全性の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％である。第一および第二の態様のある実施態様において、組成物の最初のＲＮＡ完全性(すなわち、製造後であるが、保存前)は少なくとも５０％であり、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、最初のＲＮＡ完全性の少なくとも９０％である。
これに加えてまたはこれとは別に、第一および第二の態様のある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)後の液体組成物のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ))は、所望の効果をもたらす、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)保存後の液体組成物のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ))は、最初の組成物、すなわち保存前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)保存後のＲＮＡ粒子のＰＤＩは０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)の液体組成物の保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は、保存前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)の液体組成物の保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、例えば、０℃以上で、少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)の液体組成物の保存後のＲＮＡ粒子のＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物は凍結形態(例えば、－２０℃で)である。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物が凍結形態であるとき、組成物は(ａ)抗凍結剤を含む；(ｂ)ｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有する；または(ｃ)抗凍結剤を含みかつｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有するのが好ましい。ある実施態様において、抗凍結剤は、(ｉ)ここに開示する抗凍結剤から選択される；および／または(ii)ここに開示する濃度で存在する。例えば、抗凍結剤はスクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群など、スクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオールおよび１,３－プロパンジオールからなる群から選択され得る；および／または約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在し得る。ある実施態様において、抗凍結剤は、所望により約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在するグリセロールである。
ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性は、組成物凍結前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または実質的に１００％である。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性は、組成物凍結前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または実質的に１００％である。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子(特にＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ)は、組成物凍結前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい。
第一および第二の態様のある実施態様において、組成物の最初のＲＮＡ完全性(すなわち、製造後であるが、凍結前)は少なくとも５０％であり、凍結組成物解凍後の組成物のＲＮＡ完全性は、最初のＲＮＡ完全性の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは実質的に１００％である。
これに加えてまたはこれとは別に、第一および第二の態様のある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ))は、組成物凍結前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のＰＤＩは０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は凍結前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
第一および第二の態様のある実施態様において、１凍結／解凍サイクル後、好ましくは２凍結／解凍サイクル後、より好ましくは３凍結／解凍サイクル後、より好ましくは４凍結／解凍サイクル後、より好ましくは５以上の凍結／解凍サイクル後のＲＮＡ粒子のサイズおよび組成物のＲＮＡ完全性は、最初の組成物のＲＮＡ粒子のサイズおよびＲＮＡ完全性(すなわち、組成物は最初に凍結される前)と実質的に同じである(すなわち、本質的に等しい)。
第三の態様において、本発明は、最終水相に分散したＬＮＰを含む組成物を製造する方法である方法を提供し、ここで、ＬＮＰはカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含み；最終水相は、式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する最終緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は第一の態様において定義したとおりであり；ここで、方法は：
(Ｉ)最終水相に分散した、カチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含むＬＮＰを含む製剤を製造し；そして
(II)所望により製剤を約－１０℃以下まで凍結し、
それにより組成物を得ることを含み、
ここで、工程(Ｉ)は：
(ａ)水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を製造し；
(ｂ)カチオン的にイオン化可能な脂質および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を製造し；
(ｃ)(ａ)の下に製造したＲＮＡ溶液と(ｂ)の下に製造したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む(第一)中間水相に分散したＬＮＰを含む(第一)中間製剤を製造し；そして
(ｄ)最終緩衝系を含む最終水性緩衝液を使用して(ｃ)の下に製造した第一中間製剤を濾過し、
それにより最終水相に分散したＬＮＰを含む製剤を製造することを含む。
本出願において示されるとおり、ＬＮＰを含む組成物においてＰＢＳの代わりに上に特定した緩衝物質、特にＴＥＡおよびそのプロトン化形態に基づく特定の緩衝系の使用は、ＲＮＡの極めて安定な折り畳まれた形態(ここでは「光移動性種(ＬＭＳ)」とも称する)の形成を阻止する。さらに、本出願は、驚くべきことに、この緩衝系の使用により、液体形態で約３カ月保存後でＲＮＡ完全性は改善されたＬＮＰ ＲＮＡ組成物を得ることは可能であることを示す。故に、請求する方法で製造された組成物は安定性は改善され、薬務における通常の技術に適合した温度範囲で保存でき、使用準備済製剤を提供する。
第三の態様のある実施態様において、最終緩衝物質は３級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れもＨではない)またはそのプロトン化形態である。故に、ある実施態様において、上にと規定したとおり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々はＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３である。ある実施態様において、３級アミンはモノアミンである。ある実施態様において、３級アミンはビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)、エチルジエタノールアミン、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オール、トリエチルアミンおよび２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールからなる群から選択される。ある実施態様において、３級アミンはトリエタノールアミン(ＴＥＡ)を含むかまたはそれである。
第三の態様のある実施態様において、最終緩衝物質は環状アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２個は窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態である。故に、ある実施態様において、上に特定したとおり、Ｒ１およびＲ２は、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成する。ある実施態様において、環状アミンは１以上のＣ１－６アルキレン－Ｒ４(例えば２－ヒドロキシエチル)部分で置換されているＮ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびモルホリンからなる群から選択される。
第三の態様のある実施態様において、最終緩衝物質は２級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１個はＨである)またはそのプロトン化形態である。故に、ある実施態様において、上に特定したとおり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２およびＲ３の各々はＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方はＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３である。
第三の態様のある実施態様において、最終緩衝物質は少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４部分を含む。これらの実施態様のこのような場合において、Ｒ４はＯＨであるとき、アルキレン基は２～４個などの２～６個の炭素原子、例えば、２個、３個または４個の炭素原子を有するのが好ましい。故に、最終緩衝物質は少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４部分を含み、Ｒ４はＯＨであるこれらの実施態様において、少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４部分は好ましくはＣ２－６アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－４アルキレン－ＯＨ、より好ましくはＣ２－３アルキレン－ＯＨ、例えばＣ２アルキレン－ＯＨまたは２－ヒドロキシエチルである。
第三の態様のある実施態様において、最終緩衝物質はビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)およびそのプロトン化形態、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される。ある実施態様において、最終緩衝物質はビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)およびそのプロトン化形態、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態およびＮ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態から選択される。ある実施態様において、最終緩衝物質はトリエタノールアミン(ＴＥＡ)またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
第三の態様のある実施態様において、特に凍結形態の組成物を製造することが望まれるならば、第三の態様の方法は、(II)製剤の約－１０℃以下までの凍結を含む。故に、これらの実施態様において、第三の態様の方法の実施は、凍結形態の組成物をもたらす。
第三の態様のある実施態様において、特に組成物が凍結形態であるとき、組成物は、(ａ)抗凍結剤を含む；(ｂ)ｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有する；または(ｃ)抗凍結剤を含みかつｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有するのが好ましい。ある実施態様において、抗凍結剤は、(ｉ)ここに開示する抗凍結剤から選択される；および／または(ii)ここに開示する濃度で存在する。例えば、抗凍結剤はスクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群など、スクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオールおよび１,３－プロパンジオールからなる群から選択され得る；および／または約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在し得る。ある実施態様において、抗凍結剤は、所望により約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在するグリセロールである。
ある別の実施態様において、特に液体形態の組成物の製造が望まれるとき、第三の態様の方法は工程(II)を含まない。故に、これらの実施態様において、第三の態様の方法の実施は液体形態の組成物をもたらす。
第三の態様のある実施態様において、工程(Ｉ)は、工程(ｃ)後に、タンジェンシャルフロー濾過および透析濾過などの希釈および濾過から選択される１以上の工程をさらに含む。例えば、希釈工程は中間製剤への希釈溶液の添加を含み得る。このような希釈溶液は１以上の付加的化合物および所望により最終緩衝系を含み得て、ここで、１以上の付加的化合物は抗凍結剤を含み得る。１以上の濾過工程(工程(ｄ)、(ｆ’)、(ｇ’)および(ｈ’)を含む)を使用して、中間製剤から望まない化合物(例えば、エタノールおよび／または１以上の二および／または多塩基有機酸)を除去するおよび／または中間製剤のＲＮＡ濃度を増加するおよび／または中間製剤のｐＨおよび／または緩衝系を変えることができる。この目的で、望まない化合物を含まない(望まない化合物は中間製剤から水性緩衝液に洗い流されるように)および／または水性緩衝液と比較して高張である(水は中間製剤から水性緩衝液に流れるように)および／または中間製剤のｐＨおよび／または緩衝系と異なるｐＨおよび／または緩衝系である水性緩衝液を使用できる。
第三の態様のある実施態様において、工程(Ｉ)は：
(ａ’)水性ＲＮＡ溶液を準備し；
(ｂ’)第一緩衝系を含む第一水性緩衝液を準備し；
(ｃ’)(ａ’)の下に準備した水性ＲＮＡ溶液と(ｂ’)の下に準備した第一水性緩衝液を混合し、それにより水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を製造し；
(ｄ’)カチオン的にイオン化可能な脂質および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を製造し；
(ｅ’)(ｃ’)の下に製造したＲＮＡ溶液と(ｄ’)の下に製造したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む第一水相に分散されたＬＮＰを含む第一中間製剤を製造し；
(ｆ’)所望によりさらなる緩衝系を含むさらなる水性緩衝液を使用して、(ｅ’)の下に製造した第一中間製剤を濾過し、それによりさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散したＬＮＰを含むさらなる中間製剤を製造し、ここで、さらなる水性緩衝液は第一水性緩衝液と同一でも異なってもよく；
(ｇ’)所望により工程(ｆ’)を１回、２回またはそれ以上繰り返し、ここで、１サイクルの工程(ｆ’)の後に得たさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散したＬＮＰを含むさらなる中間製剤を次サイクルの第一中間製剤として使用し、ここで、各サイクルにおいて、さらなる水性緩衝液は第一水性緩衝液と同一でも異なってもよく；
(ｈ’)工程(ｆ’)がないならば工程(ｅ’)で得た第一中間製剤または工程(ｆ’)は存在し、工程(ｇ’)が存在しないならば工程(ｆ’)で得たさらなる中間製剤または工程(ｆ’)および(ｇ’)が存在するならば工程(ｇ’)後に得たさらなる中間製剤を、最終緩衝系を含む最終水性緩衝液を使用して濾過し；そして
(ｉ’)所望により工程(ｈ’)で得た製剤を希釈溶液で希釈し；
それにより最終水相に分散したＬＮＰを含む製剤を製造することを含む。
第三の態様のある実施態様において、組成物における最終緩衝物質の濃度、特に最終緩衝物質およびそのプロトン化形態の総濃度は約１０mM～約２００mM、例えば約２０mM～約１８０mM、約３０mM～約１７０mM、約４０mM～約１６０mM、約５０mM～約５０mM、約６０mM～約１４０mM、約７０mM～約１３０mM、約８０mM～約１２０mM、約９０mM～約１１０mMである。ある実施態様において、組成物における最終緩衝物質の濃度、特に最終緩衝物質およびそのプロトン化形態の総濃度は約１５mM～約１００mM、好ましくは約２０mM～約８０mM、より好ましくは約４０mM～約６０mM、例えば約５０mMである。
第三の態様のある実施態様において、最終緩衝系はさらに好ましくはクロライド、酢酸、グリコール酸、乳酸およびクエン酸、コハク酸、マロン酸、グルタル酸またはアジピン酸のアニオンなどのジまたはトリカルボン酸のアニオンからなる群から選択されるアニオンを含む。ある実施態様において、最終緩衝系はアニオンを含むとき、組成物中のアニオンの濃度は少なくとも組成物における最終緩衝物質の濃度と等しい。例えば、組成物中のアニオンの濃度は組成物における最終緩衝物質の濃度より高くてよい。故に、第三の態様におけるこのような実施態様において、組成物における最終緩衝物質の濃度が約１０mM～約２００mMの範囲内であるｘであるとき、組成物中のアニオンの濃度は少なくともｘに等しい、例えばｘより高い。
工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は抗凍結剤を含む第三の態様のある実施態様において、該抗凍結剤は、炭水化物およびアルコール(例えば糖アルコールまたは低級アルコール)からなる群から選択される１以上の化合物を含む。例えば、抗凍結剤はスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から(例えばスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群からまたはスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から)選択され得る。ある実施態様において、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は抗凍結剤としてスクロースおよび／またはグリセロールを含む。
工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物が抗凍結剤を含む第三の態様のある実施態様において、製剤および／または組成物中の抗凍結剤の濃度は少なくとも１％ｗ／ｖ、例えば少なくとも２％ｗ／ｖ、少なくとも３％ｗ／ｖ、少なくとも４％ｗ／ｖ、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも６％ｗ／ｖ、少なくとも７％ｗ／ｖ、少なくとも８％ｗ／ｖまたは少なくとも９％ｗ／ｖである。ある実施態様において、製剤および／または組成物中の抗凍結剤の濃度は最大２５％ｗ／ｖ、例えば最大２０％ｗ／ｖ、最大１９％ｗ／ｖ、最大１８％ｗ／ｖ、最大１７％ｗ／ｖ、最大１６％ｗ／ｖ、最大１５％ｗ／ｖ、最大１４％ｗ／ｖ、最大１３％ｗ／ｖ、最大１２％ｗ／ｖまたは最大１１％ｗ／ｖである。ある実施態様において、製剤および／または組成物中の抗凍結剤の濃度は１％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、例えば２％ｗ／ｖ～１９％ｗ／ｖ、３％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、４％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１６％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖ、９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖまたは約１０％ｗ／ｖである。ある実施態様において、製剤および／または組成物は、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、例えば６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖまたは９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖまたはの濃度または約１０％ｗ／ｖの濃度で、抗凍結剤(例えばスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールまたはそれらの組み合わせ、特に、スクロースおよび／またはグリセロール)を含む。例えば、第三の態様の方法は希釈溶液を使用する希釈工程を含み得て、ここで、希釈溶液は、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物における抗凍結剤の上記濃度を達成するために十分量の抗凍結剤を含む。
工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物が抗凍結剤を含む第三の態様のある実施態様において、抗凍結剤は、製剤／組成物の総重量に基づき、約５０×１０－３osmol／kg～約１０００×１０－３osmol／kg(例えば約５０×１０－３osmol／kg～約５００×１０－３osmol／kg、約５０×１０－３osmol／kg～約４８０×１０－３osmol／kg、約６０×１０－３osmol／kg～約４６０×１０－３osmol／kg、約７０×１０－３osmol／kg～約４４０×１０－３osmol／kg、約８０×１０－３osmol／kg～約４２０×１０－３osmol／kg、約９０×１０－３osmol／kg～約４００×１０－３osmol／kg、約１００×１０－３osmol／kg～約３８０×１０－３osmol／kg、約１２０×１０－３osmol／kg～約３６０×１０－３osmol／kg、約１４０×１０－３osmol／kg～約３４０×１０－３osmol／kg、約１６０×１０－３osmol／kg～約３１０×１０－３osmol／kg、約１８０×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kgまたは約２００×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kg)の範囲の組成物の浸透圧をもたらす濃度で存在する。例えば、第三の態様の方法は希釈溶液を使用する希釈工程を含み得て、ここで、希釈溶液は、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物における上記浸透圧値を達成するために十分量の抗凍結剤を含む。
第三の態様のある実施態様において、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は抗凍結剤を実質的に含まない。
第三の態様のある実施態様において、最終緩衝系のｐＨ(および組成物のｐＨ)は約４.０～約８.０である。例えば、最終緩衝系のｐＨ(および組成物のｐＨ)は約４.５～約８.０、例えば約５.０～約８.０、約５.５～約８.０、約６.０～約８.０、約６.５～約８.０、約６.８～約７.９、約７.０～約７.８または約７.５であり得る。
第三の態様のある実施態様において、第一緩衝系(および工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液のｐＨ)は、６.０未満、好ましくは最大約５.５、例えば最大約５.０、最大約４.９、最大約４.８、最大約４.７、最大約４.６または最大約４.５のｐＨを有する。例えば、第一緩衝系のｐＨ(および工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液のｐＨ)は約３.５～約５.９、例えば約４.０～約５.５または約４.５～約５.０であり得る。この目的で、工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液はさらに１以上の二および／または多塩基有機酸(例えば、クエン酸アニオンおよび／またはＥＤＴＡのアニオン)を含み得る。ある実施態様において、工程(ｄ)を、１以上の望まない物質(例えば、エタノールおよび／または１以上の二および／または多塩基有機酸)を除去する条件下に実施し、そのような１以上の望まない物質を実質的に含まない最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤をもたらすのが好ましい。例えば、このような条件工程(ｃ)で得た中間水相に分散されたＬＮＰを含む中間製剤を、最終緩衝系(すなわち、最終緩衝物質)を含む最終緩衝液を使用する、少なくとも１工程の濾過、例えばタンジェンシャルフロー濾過または透析濾に付すことはでき、ここで、最終緩衝液は１以上の望まない物質を含まない。あるいは、このような条件は、(ｉ)工程(ｃ)で得た中間水相に分散されたＬＮＰを含む中間製剤(すなわち、第一中間製剤)を、さらなる緩衝系を含むさらなる水性緩衝液を使用する、少なくとも１工程の濾過、例えばタンジェンシャルフロー濾過または透析濾過に付し、それによりさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散したＬＮＰを含むさらなる中間製剤を製造し(ここで、さらなる水性緩衝液のさらなる緩衝系は工程(ａ)で使用した緩衝系と同一でも異なってもよい)；(ii)所望により工程(ｉ)を１回または２回以上繰り返し(ここで、１サイクルの工程(ｉ)で得たさらなる水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤を次サイクルの第一中間製剤として使用し、ここで、各サイクルにおいて、さらなる水性緩衝液のさらなる緩衝系は工程(ａ)で使用した第一緩衝系と同一でも異なってもよい)；そして(iii)中間工程(ｉ)で得た製剤(工程(ii)が存在しないならば)または工程(ii)(工程(ii)が存在するならば)で得た中間製剤を、最終水性緩衝液を使用する少なくとも１工程の濾過、例えばタンジェンシャルフロー濾過または透析濾過に付す(ここで、中間および最終水性緩衝液の少なくとも１個(好ましくは全中間および最終水性緩衝液)は１以上の望まない物質を含まない)ことを含み得る。
同様に、第三の態様のある実施態様において、工程(Ｉ)が工程(ａ’)～(ｅ’)および(ｈ’)(および所望により工程(ｆ’)、(ｇ’)および(ｉ’)の１以上)を含むとき、第一水性緩衝液(および工程(ｃ’)の下に得たＲＮＡ溶液のｐＨ)は、６.０未満、好ましくは最大約５.５、例えば最大約５.０、最大約４.９、最大約４.８、最大約４.７、最大約４.６または最大約４.５のｐＨを有する。例えば、第一水性緩衝液のｐＨ(および工程(ｃ’)の下に得たＲＮＡ溶液のｐＨ)は約３.５～約５.９、例えば約４.０～約５.５または約４.５～約５.０であり得る。この目的で、(ｂ’)の下に提供された第一水性緩衝液(および第一水相)はさらに１以上の二および／または多塩基有機酸(例えば、クエン酸アニオンおよび／またはＥＤＴＡのアニオン)を含み得る。これらの実施態様において、工程(ｆ’)～(ｈ’)の少なくとも１個を、１以上の望まない物質(例えば、エタノールおよび／または１以上の二および／または多塩基有機酸)を第一中間製剤および／またはさらなる中間製剤から除去する条件下に実施し、さらなる水相または最終水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤をもたらすのが好ましく、さらなるおよび／または最終水相は１以上の望まない物質を実質的に含まない。例えば、このような条件はさらなる水性緩衝液および／または最終緩衝液の使用を含み得て、ここで、さらなる水性緩衝液および最終緩衝液の少なくとも１個(好ましくはさらなる水性緩衝液および最終緩衝液の全て)は１以上の望まない物質を含まない。ある実施態様において、濾過工程はタンジェンシャルフロー濾過または透析濾過、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過であり得る。
第三の態様のある実施態様において、工程(ａ)で使用する第一緩衝系は工程(ｄ)で使用する最終緩衝物質を含み、好ましくは工程(ａ)で使用する第一緩衝系の緩衝系およびｐＨは工程(ｄ)で使用する最終水性緩衝液の緩衝系およびｐＨと同一である。例えば、第三の態様のこの実施態様において１個のみの水性緩衝液を使用する。
同様に、第三のある実施態様において、工程(Ｉ)は工程(ａ’)～(ｅ’)および(ｈ’)(および所望により工程(ｆ’)、(ｇ’)および(ｉ’)の１以上)を含むとき、第一緩衝系および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全てのさらなる緩衝系の各々は工程(ｈ’)で使用する最終緩衝物質を含み、好ましくは第一水性緩衝液および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全てのさらなる水性緩衝液の緩衝系およびｐＨは、最終水性緩衝液の緩衝系およびｐＨと同一である。例えば、第三の態様のこの実施態様の工程(ｂ’)、存在するならば(ｆ’)、存在するならば(ｇ’)および(ｈ’)で使用する水性緩衝液は同一である。
第三の態様のある実施態様において、製剤および／または組成物は主成分として水を含むおよび／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は約１.０％(ｖ／ｖ)未満、例えば約０.５％(ｖ／ｖ)未満である。例えば、製剤および／または組成物に含まれる水の量は少なくとも５０％(ｗ／ｗ)、例えば少なくとも５５％(ｗ／ｗ)、少なくとも６０％(ｗ／ｗ)、少なくとも６５％(ｗ／ｗ)、少なくとも７０％(ｗ／ｗ)、少なくとも７５％(ｗ／ｗ)、少なくとも８０％(ｗ／ｗ)、少なくとも８５％(ｗ／ｗ)、少なくとも９０％(ｗ／ｗ)または少なくとも９５％(ｗ／ｗ)であり得る。特に、製剤および／または組成物は抗凍結剤を含むとき、製剤および／または組成物に含まれる水の量は少なくとも５０％(ｗ／ｗ)、例えば少なくとも５５％(ｗ／ｗ)、少なくとも６０％(ｗ／ｗ)、少なくとも６５％(ｗ／ｗ)、少なくとも７０％(ｗ／ｗ)、少なくとも７５％(ｗ／ｗ)、少なくとも８０％(ｗ／ｗ)、少なくとも８５％(ｗ／ｗ)または少なくとも９０％(ｗ／ｗ)であり得る。製剤および／または組成物は抗凍結剤を実質的に含まないとき、製剤および／または組成物に含まれる水の量は少なくとも９５％(ｗ／ｗ)であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は約１.０％(ｖ／ｖ)未満、例えば約０.９％(ｖ／ｖ)未満、約０.８％(ｖ／ｖ)未満、約０.７％(ｖ／ｖ)未満、約０.６％(ｖ／ｖ)未満、約０.５％(ｖ／ｖ)未満、約０.４％(ｖ／ｖ)未満、約０.３％(ｖ／ｖ)未満、約０.２％(ｖ／ｖ)未満、約０.１％(ｖ／ｖ)未満、約０.０５％(ｖ／ｖ)未満または約０.０１％(ｖ／ｖ)未満であり得る。これに関して、標準条件下で液体である抗凍結剤は、水以外の溶媒ではなく、抗凍結剤とみなすべきである。換言すると、組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は約１.０％(ｖ／ｖ)未満、例えば約０.５％(ｖ／ｖ)未満であり得る上記最適限界は標準条件下で液体である抗凍結剤には適用されない。
第三の態様のある実施態様において、組成物の浸透圧は最大約１０００×１０－３osmol／kg、例えば約１００×１０－３osmol／kg～約７５０×１０－３osmol／kgである。ある実施態様において、組成物の浸透圧は最大約５００×１０－３osmol／kg、例えば最大約４９０×１０－３osmol／kg、最大約４８０×１０－３osmol／kg、最大約４７０×１０－３osmol／kg、最大約４６０×１０－３osmol／kg、最大約４５０×１０－３osmol／kg、最大約４４０×１０－３osmol／kg、最大約４３０×１０－３osmol／kg、最大約４２０×１０－３osmol／kg、最大約４１０×１０－３osmol／kg、最大約４００×１０－３osmol／kg、最大約３９０×１０－３osmol／kg、最大約３８０×１０－３osmol／kg、最大約３７０×１０－３osmol／kg、最大約３６０×１０－３osmol／kg、最大約３５０×１０－３osmol／kg、最大約３４０×１０－３osmol／kg、最大約３３０×１０－３osmol／kg、最大約３２０×１０－３osmol／kg、最大約３１０×１０－３osmol／kgまたは最大約３００×１０－３osmol／kgである。組成物が抗凍結剤を含まないならば、組成物の浸透圧は３００×１０－３osmol／kg未満、例えば最大約２５０×１０－３osmol／kg、最大約２００×１０－３osmol／kg、最大約１５０×１０－３osmol／kg、最大約１００×１０－３osmol／kg、最大約５０×１０－３osmol／kg、最大約４０×１０－３osmol／kgまたは最大約３０×１０－３osmol／kgであり得る。組成物が抗凍結剤を含むならば、組成物の浸透圧の大部分は抗凍結剤によりもたらされるのが好ましい。例えば、抗凍結剤は組成物の浸透圧の少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％をもたらし得る。
第三の態様のある実施態様において、組成物中のＲＮＡ濃度は約５mg／ｌ～約５００mg／ｌ、例えば約１０mg／ｌ～約４００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約３００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約２００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約１５０mg／ｌまたは約１０mg／ｌ～約１００mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、より好ましくは約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである。ある実施態様において、組成物中のＲＮＡ濃度は約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌである。例えば、組成物中のＲＮＡ濃度は約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、例えば約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、約２５mg／ｌ～約１２５mg／ｌ、約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌ、約３５mg／ｌ～約１１５mg／ｌ、約４０mg／ｌ～約１１０mg／ｌ、約４５mg／ｌ～約１０５mg／ｌまたは約５０mg／ｌ～約１００mg／ｌであり得る。
第三の態様のある実施態様において、最終緩衝物質はここに定義する３級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れもＨではない)またはそのプロトン化形態を含み、組成物のｐＨは約４.０～約８.０であり、組成物中のＲＮＡ濃度は約５mg／ｌ～約５００mg／ｌである。この実施態様において、組成物のｐＨは約４.５～約８.０であり、組成物中のＲＮＡ濃度は約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、例えば約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであるのが好ましい。特に好ましい実施態様において、最終緩衝物質はここに定義する３級アミンまたはそのプロトン化形態を含み；組成物のｐＨは約５.０～約８.０であり；組成物中のＲＮＡ濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；そして組成物は抗凍結剤を含む。別の特に好ましい実施態様において、最終緩衝物質はここに定義する３級アミンまたはそのプロトン化形態を含み；組成物のｐＨは約５.０～約８.０であり；組成物中のＲＮＡ濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；そして組成物は抗凍結剤を実質的に含まない。ある実施態様において、３級アミンはモノアミンである。ある実施態様において、３級アミンはビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)、エチルジエタノールアミン、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オール、トリエチルアミンおよび２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールからなる群から選択される。ある実施態様において、３級アミンはトリエタノールアミン(ＴＥＡ)を含むかまたはそれである。
第三の態様のある実施態様において、最終緩衝物質はここに定義する環状アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２個は窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含み、組成物のｐＨは約４.０～約８.０であり、組成物中のＲＮＡ濃度は約５mg／ｌ～約５００mg／ｌである。この実施態様において、組成物のｐＨは約４.５～約８.０であり、組成物中のＲＮＡ濃度は約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、例えば約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであるのが好ましい。特に好ましい実施態様において、最終緩衝物質はここに定義する環状アミンまたはそのプロトン化形態を含み；組成物のｐＨは約５.０～約８.０であり；組成物中のＲＮＡ濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；そして組成物は抗凍結剤を含む。別の特に好ましい実施態様において、最終緩衝物質はここに定義する環状アミンまたはそのプロトン化形態を含み；組成物のｐＨは約５.０～約８.０であり；組成物中のＲＮＡ濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；そして組成物は抗凍結剤を実質的に含まない。ある実施態様において、環状アミンは１以上のＣ１－６アルキレン－Ｒ４(例えば２－ヒドロキシエチル)部分で置換されているＮ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびモルホリンからなる群から選択される。
第三の態様のある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む。
第三の態様のある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、式(Ｘ)：
の構造を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、ここで、Ｌ１０、Ｌ２０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｒ３５、Ｒ３６およびＲ３７はここに定義するとおりである。ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は次のものから選択される：構造Ｘ－１～Ｘ－３６(ここに示す)；および／または構造Ａ～Ｆ(ここに示す)；および／またはＮ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシプロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＯＤＡＰ)、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ)および４－((ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イル)アミノ)オキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－４－オキソブタン－１－アミン(ＤＰＬ－１４)。ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、構造Ｘ－３を有する脂質である。
第三の態様のある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は式(XI)：
の構造を有し、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｇ１、Ｇ２およびｍはここに定義するとおりである。ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は構造(XIV－１)、(XIV－２)および(XIV－３)(ここに示す)から選択される。
第三の態様のある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、組成物に存在する総脂質の約２０mol％～約８０mol％、好ましくは約２５mol％～約６５mol％、より好ましくは約３０mol％～約５０mol％、例えば約４０mol％～約５０mol％を構成する。
第三の態様のある実施態様において、工程(ｂ)または(ｄ’)で製造したエタノール性溶液はさらに１以上の付加的脂質を含み、ＬＮＰはさらに１以上の付加的脂質を含む。好ましくは、１以上の付加的脂質はポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。第三の態様のある実施態様において、１以上の付加的脂質は、ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ペグ化脂質；またはポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)、中性脂質(例えば、ＤＳＰＣなどのリン脂質)およびステロイド(例えば、コレステロール)を含み、その結果、ＬＮＰはここに記載するカチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ペグ化脂質；またはポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)、中性脂質(例えば、ＤＳＰＣなどのリン脂質)およびステロイド(例えば、コレステロール)を含む。
１以上の付加的脂質がポリマーコンジュゲート脂質を含む第三の態様のある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。例えば、ペグ化脂質はＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＯＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＥ－ＰＥＧおよびＤＭＰＥ－ＰＥＧからなる群から選択される。ある実施態様において、ペグ化脂質は次の構造：
を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体であってよく、ここで、Ｒ１２、Ｒ１３およびｗはここに定義するとおりである。
１以上の付加的脂質がポリマーコンジュゲート脂質を含む第三の態様のある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートである。例えば、ポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートはポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーであり得る。
１以上の付加的脂質がポリマーコンジュゲート脂質を含む第三の態様のある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質は、組成物に存在する総脂質の約０.５mol％～約５mol％、好ましくは約１mol％～約５mol％、より好ましくは約１mol％～約４.５mol％を構成する。
１以上の付加的脂質が中性脂質を含む第三の態様のある実施態様において、中性脂質はリン脂質である。このようなリン脂質は好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される。リン脂質の具体例はジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルフタチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)を含む。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。
１以上の付加的脂質が中性脂質を含む第三の態様のある実施態様において(例えばリン脂質)、中性脂質は組成物に存在する総脂質の約５mol％～約４０mol％、好ましくは約５mol％～約２０mol％、より好ましくは約５mol％～約１５mol％を構成する。
１以上の付加的脂質がステロイドを含む第三の態様のある実施態様において、ステロイドはコレステロールなどのステロールである。
１以上の付加的脂質がステロイドを含む第三の態様のある実施態様において、ステロイドは組成物に存在する総脂質の約１０mol％～約６５mol％、好ましくは約２０mol％～約６０mol％、より好ましくは約３０mol％～約５０mol％を構成する。
第三の態様のある実施態様において、エタノール性溶液は、エタノール性溶液中の脂質の総モル量に基づき、２０％～６０％のカチオン的にイオン化可能な脂質、０.５％～１５％のポリマーコンジュゲート脂質、５％～２５％の中性脂質および２５％～５５％のステロイドのモル比でカチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質(例えば、リン脂質)およびステロイドを含む。例えば、モル比は、エタノール性溶液中の脂質の総モル量に基づき、４０％～５５％のカチオン的にイオン化可能な脂質、１.０％～１０％のポリマーコンジュゲート脂質、５％～１５％の中性脂質および３０％～５０％のステロイド、例えば４５％～５５％のカチオン的にイオン化可能な脂質、１.０％～５％のポリマーコンジュゲート脂質、８％～１２％の中性脂質および３５％～４５％のステロイドであり得る。
第三の態様のある実施態様において、ＬＮＰは組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％を構成する。例えば、ＬＮＰは組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７６％、例えば少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％を構成し得る。
第三の態様のある実施態様において、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
第三の態様のある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)はＬＮＰ内に封入されるかまたはＬＮＰと結合している。
第三の態様のある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)(ｉ)ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む；(ii)コドン最適化されているコード配列を有する；および／または(iii)野生型コード配列と比較してＧ／Ｃ含量は増加しているコード配列を有する。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される。
第三の態様のある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、次の(ａ)キャップ１またはキャップ２構造などの５’キャップ；(ｂ)５’ ＵＴＲ；(ｃ)３’ ＵＴＲ；および(ｄ)ポリＡ配列の１以上を含む。ある実施態様において、ポリＡ配列は少なくとも１００個のＡヌクレオチドを含み、ここで、ポリＡ配列は好ましくはＡヌクレオチドの中断配列である。
第三の態様のある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は１以上のポリペプチドをコードする。ある実施態様において、１以上のポリペプチドは対象における抗原に対する免疫応答を誘導するための薬学的活性ポリペプチドであるおよび／またはエピトープを含む。
第三の態様のある実施態様において、薬学的活性ポリペプチドおよび／または抗原またはエピトープは病原体のタンパク質、タンパク質の免疫原性バリアントまたはタンパク質の免疫原性フラグメントもしくはその免疫原性バリアントに由来するかまたはそれである。ある実施態様において、病原体は感染性疾患を引き起こす病原体である。
第三の態様のある実施態様において、薬学的活性ポリペプチドおよび／または抗原またはエピトープはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク(Ｓ)タンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに由来するかまたはそれである。ある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む。第三の態様のある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の９８６位および９８７位に置換されたプロリン残基を有する。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一性を有する。ある実施態様において、フラグメントはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。ある実施態様において、(ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の免疫原性バリアントのフラグメントは配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一性を有する。
第四の態様において、本発明は、水性ＲＮＡ組成物を製造する方法を提供し、ここで、方法は、(Ｉ)ＲＮＡおよび水相を含む製剤を製造し、ここで、水相は緩衝物質、式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は第一の態様において定義したとおりであり；そして(II)所望により製剤を約－１０℃以下まで凍結し、それにより組成物を得ることを含む。
第四の態様のある実施態様において、方法は工程(II)(すなわち、製剤の約－１０℃以下への凍結)を含む。
第四の態様のある実施態様において、特に方法が工程(II)を含むとき、組成物は、(ａ)抗凍結剤を含む；(ｂ)ｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有する；または(ｃ)抗凍結剤を含みかつｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有するのが好ましい。ある実施態様において、抗凍結剤は、(ｉ)ここに開示する抗凍結剤から選択される；および／または(ii)ここに開示する濃度で存在する。例えば、抗凍結剤は、スクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群などのスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され得て；および／または約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在し得る。ある実施態様において、抗凍結剤は、所望により約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在するグリセロールである。
第四の態様のある実施態様において、緩衝物質はＢＴＭおよびそのプロトン化形態、ＴＥＡおよびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される。ある実施態様において、緩衝物質はトリエタノールアミン(ＴＥＡ)またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
第一、第二または第三の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第四の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第五の態様において、本発明は、第三の態様の方法に従い組成物を製造し、組成物を約－９０℃～約－１０℃、例えば約－９０℃～約－４０℃または約－４０℃～約－２５℃または約－２５℃～約－１０℃の範囲の温度または約－２０℃の温度で保存することを含む、組成物を保存する方法を提供する。第五の態様のある実施態様において、凍結組成物の保存は少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月、好ましくは少なくとも４週間である。第五の態様のある実施態様において、凍結組成物の保存は、－２０℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月である。第五の態様のある実施態様において、組成物は－７０℃で保存できる。
第五の態様のある実施態様において、組成物は、(ａ)抗凍結剤を含む；(ｂ)ｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有する；または(ｃ)抗凍結剤を含みかつｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有するのが好ましい。ある実施態様において、抗凍結剤は(ｉ)ここに開示する抗凍結剤から選択される；および／または(ii)ここに開示する濃度で存在する。例えば、抗凍結剤は、スクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群などのスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され得て；および／または約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在し得る。ある実施態様において、抗凍結剤は、所望により約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在するグリセロールである。
第五の態様のある実施態様において、緩衝物質はＢＴＭおよびそのプロトン化形態、ＴＥＡおよびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される。ある実施態様において、緩衝物質はトリエタノールアミン(ＴＥＡ)またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
第五の態様のある実施態様において、組成物を保存する方法は、工程(II)(すなわち、製剤を約－１０℃以下まで凍結)を含む第三の態様の方法に従い組成物を製造し；凍結組成物を約－９０℃～約－１０℃の範囲の温度で一定期間(例えば、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月)保存し；そして凍結組成物を約０℃～約２０℃の範囲の温度で一定期間(例えば、少なくとも４週間、例えば少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存することを含む。
第一、第二または第三の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第五の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第六の態様において、本発明は、液体組成物を第三の態様の方法に従い製造し、液体組成物を約０℃～約２０℃、例えば約１℃～約１５℃、約２℃～約１０℃または約２℃～約８℃の範囲の温度または約５℃の温度で保存することを含む、組成物を保存する方法を提供する。第六の態様のある実施態様において、液体組成物の保存は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月または少なくとも２４カ月、好ましくは少なくとも４週間である。第六の態様のある実施態様において、液体組成物の保存は、５℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月である。
第六の態様のある実施態様において、組成物を保存する方法は、工程(II)(すなわち、製剤を約－１０℃以下まで凍結)を含む第三の態様の方法に従い組成物を製造し；そして凍結組成物を約０℃～約２０℃の範囲の温度で一定期間(例えば、少なくとも４週間)保存することを含む。
第六の態様のある実施態様において、緩衝物質はＢＴＭおよびそのプロトン化形態、ＴＥＡおよびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される。ある実施態様において、緩衝物質はトリエタノールアミン(ＴＥＡ)またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
第一、第二または第三の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第六の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第七の態様において、本発明は、第三、第四、第五または第六の態様の方法により製造可能な組成物を提供する。第七の態様のある実施態様において、組成物は凍結形態であってよく、これは、好ましくは、約－９０℃以上、例えば約－９０℃～約－１０℃の温度で保存され得る。例えば、第七の態様の凍結組成物は、約－９０℃～約－４０℃または約－４０℃～約－２５℃または約－２５℃～約－１０℃の範囲の温度または約－２０°の温度で保存さｒふぇ売る。第七の態様のある実施態様において、組成物は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月、好ましくは少なくとも４週間保存され得る。例えば、凍結組成物は、－２０℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月保存され得る。
第七の態様のある実施態様において、組成物が凍結形態であるとき、組成物は、(ａ)抗凍結剤を含む；(ｂ)ｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有する；または(ｃ)抗凍結剤を含みかつｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有するのが好ましい。ある実施態様において、抗凍結剤は(ｉ)ここに開示する抗凍結剤から選択される；および／または(ii)ここに開示する濃度で存在する。例えば、抗凍結剤は、スクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群などのスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され得て；および／または約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在し得る。ある実施態様において、抗凍結剤は、所望により約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在するグリセロールである。
第七の態様のある実施態様において、緩衝物質はＢＴＭおよびそのプロトン化形態、ＴＥＡおよびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される。ある実施態様において、緩衝物質はトリエタノールアミン(ＴＥＡ)またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
第七の態様のある実施態様において、組成物が凍結形態であるとき、凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性は、組成物は凍結される前の組成物のＲＮＡ完全性と比較して、例えば、－２０℃で保存された凍結組成物の解凍後、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または実質的に１００％である。
ある実施態様において、組成物の最初のＲＮＡ完全性(すなわち、製造後であるが、凍結前)は少なくとも５０％であり、凍結組成物解凍後の組成物のＲＮＡ完全性は、最初のＲＮＡ完全性の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは実質的に１００％である。
これに加えてまたはこれとは別に、第七の態様のある実施態様において、組成物が凍結形態であるとき、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ))は、組成物凍結前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のＰＤＩは０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は凍結前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
ある実施態様において、１凍結／解凍サイクル後、好ましくは２凍結／解凍サイクル後、より好ましくは３凍結／解凍サイクル後、より好ましくは４凍結／解凍サイクル後、より好ましくは５以上の凍結／解凍サイクル後のＲＮＡ粒子のサイズおよび組成物のＲＮＡ完全性は、最初の組成物のＲＮＡ粒子のサイズおよびＲＮＡ完全性(すなわち、組成物は最初に凍結される前)と実質的に同じである(すなわち、本質的に等しい)。
第七の態様の別の実施態様において、組成物は液体形態である。
第七の態様のある実施態様において、組成物が液体形態であるとき、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存したときの、液体組成物のＲＮＡ完全性は、所望の効果をもたらす、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存したときの、液体組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％であり得る。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存したときの、液体組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％であり得る。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも４週間保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％である。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも４週間保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％である。
ある実施態様において、液体組成物の最初のＲＮＡ完全性(すなわち、製造後であるが、保存前)は少なくとも５０％であり、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月または少なくとも３カ月)保存後の液体組成物のＲＮＡ完全性は、最初のＲＮＡ完全性の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％である。ある実施態様において、液体組成物の最初のＲＮＡ完全性(すなわち、製造後であるが、保存前)は少なくとも５０％であり、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月または少なくとも３カ月)保存後の液体組成物のＲＮＡ完全性は、最初のＲＮＡ完全性の少なくとも９０％である。
これに加えてまたはこれとは別に、第七の態様のある実施態様において、組成物が液体形態であるとき、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存下ときの液体組成物のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ))は、所望の効果をもたらす、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存下ときの液体組成物のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ))は、最初の組成物、すなわち保存前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)、液体組成物の保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)、液体組成物の保存後のＲＮＡ粒子のＰＤＩは０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)、液体組成物の保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)、液体組成物の保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は、保存前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)、液体組成物の保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)、液体組成物の保存後のＲＮＡ粒子のＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
第一、第二、第三、第四、第五または第六の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第七の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第八の態様において、本発明は、第三、第四または第五の態様の方法により製造した凍結組成物を準備し、凍結組成物を解凍して、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を製造する方法、方法を提供する。
第一、第二、第三、第四、第五、第六または第七の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第八の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第九の態様において、本発明は、第三、第四または第六の態様の方法により製造した液体組成物を準備し、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を製造する方法を提供する。
第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七または第八の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第九の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第十の態様において、本発明は、第八または第九の態様の方法により製造され得る使用準備済医薬組成物を提供する。
第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八または第九の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第十の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第十一の態様において、本発明は、治療に使用するための、第一、第七および第十の態様の何れかの組成物を提供する。
第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第十一の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第十二の態様において、本発明は、免疫応答の誘導に使用するための第一、第七および第十の態様の何れかの組成物を提供する。
第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十または第十一の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第十二の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第十三の態様において、本発明は、第一、第二、第七または第十の態様の何れかの組成物を細胞に添加し；そして組成物と細胞の混合物を十分な時間インキュベートすることを含む、細胞をトランスフェクトする方法を提供する。ある実施態様において、特にＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)が薬学的活性タンパク質をコードするとき、組成物と細胞の混合物を、薬学的活性タンパク質の発現を可能にするのに十分な時間インキュベートする。ある実施態様において、特にＲＮＡが標的ｍＲＮＡに対する阻害性ＲＮＡ(例えばｓｉＲＮＡ)であるとき、組成物と細胞の混合物を、標的ｍＲＮＡの転写および／または翻訳の阻害を可能にするのに十分な時間インキュベートする。ある実施態様において、十分な時間は少なくとも１時間(例えば少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１２時間)および／または最大約４８時間(例えば最大約３６時間または最大約２４時間)である。第十三の態様のある実施態様において、方法をインビボで実施する(すなわち、細胞は対象の臓器、組織および／または生物の一部を形成する)。第十三の態様のある実施態様において、方法をインビトロで実施する(すなわち、細胞は対象の臓器、組織および／または生物の一部を形成しない、例えば、細胞はエクスビボ細胞培養である)。
第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一または第十二の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第十三の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
第十四の態様において、本発明は、細胞をトランスフェクトするための、第一、第二、第七または第十の態様の何れかの組成物の使用を提供する。第十四の態様のある実施態様において、使用はインビボ使用である(すなわち、細胞は対象の臓器、組織および／または生物の一部を形成する)。第十四の態様のある実施態様において、使用はインビトロ使用である(すなわち、細胞は対象の臓器、組織および／または生物の一部を形成しない、例えば、細胞はエクスビボ細胞培養である)。
第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二または第十三の態様においてここに記載する何れの実施態様も、第十四の態様のあらゆる実施態様に適用され得ることは理解される。
さらなる態様において、本発明は、第一、第二、第七、第十、第十一または第十二の態様の何れかの組成物またはここに記載する医薬組成物を含む、キットを提供する。ある実施態様において、キットは、免疫応答の誘導のためなどの治療に使用するためである。ある実施態様において、キットは、感染性疾患の処置または予防のためなどの、病原体に対する免疫応答の誘導に使用するためである。
さらなる項目別実施態様は次のとおりである：
１. (ｉ)ＲＮＡ；(ii)カチオン的にイオン化可能な脂質；および(iii)式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含む緩衝系を含む水相を含む組成物であって、ここで：
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＨ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であるか；またはＲ１、Ｒ２およびＲ３の２個は、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成し；
各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚは独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６は独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され；そして
各Ｒ５は独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択されるものである、組成物。
２. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、項１の組成物。
３. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、項１または２の組成物。
４. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキルおよびＣ１－６アルキレン－Ｒ４から選択され、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキルおよびＣ１－４アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキルおよびＣ１－３アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキルおよびＣ１－２アルキレン－Ｒ４から選択される、項１～３の何れかの組成物。
５. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－２アルキルから選択される、項１～４の何れかの組成物。
６. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、項１～５の何れかの組成物。
７. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、項１～６の何れかの組成物。
８. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される、項１～７の何れかの組成物。
９. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全て同じである、項１～８の何れかの組成物。
１０. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全てがメチル、エチルまたは２－ヒドロキシエチルである、項９の組成物。
１１. Ｒ１およびＲ２が同一であり、Ｒ３がＲ１およびＲ２と異なる、項１～８の何れかの組成物。
１２. Ｒ１およびＲ２の各々が２－ヒドロキシエチル、エチルまたはメチルである、項１１の組成物。
１３. Ｒ３がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される、項１１または１２の組成物。
１４. Ｒ１およびＲ２が、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成する、項１の組成物。
１５. Ｒ３がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ３がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、項１４の組成物。
１６. Ｎ－ヘテロ環式環が少なくとも１個の窒素環原子および所望によりＯおよびＳから選択される１個のさらなる環ヘテロ原子を含む単環式環である、項１４または１５の組成物。
１７. Ｎ－ヘテロ環式環が(ｉ)１個の窒素環原子；(ii)２個の窒素環原子；(iii)１個の窒素環原子および１個の酸素環原子；(iv)１個の窒素環原子および１個の硫黄環原子；または(ｖ)３個の窒素環原子を含む単環式環である、項１４～１６の何れかの組成物。
１８. Ｎ－ヘテロ環式環が単環式６員Ｎ－ヘテロ環式環などの単環式５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環である、項１４～１７の何れかの組成物。
１９. Ｎ－ヘテロ環式環がピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、１,３,５－トリアジナニル、モルホリニルおよびチオモルホリニルから選択され、好ましくはピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、モルホリニルおよびチオモルホリニルから選択される、項１４～１８の何れかの組成物。
２０. Ｎ－ヘテロ環式環が１個の窒素環原子のみ含むならば、この窒素環原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外である、またはＮ－ヘテロ環式環が１個を超える窒素環原子を含むならば、１個の窒素環原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外であり、他の窒素環原子の少なくとも１個、好ましくは他の窒素環原子の各々、がＲ５で置換されている、項１４～１９の何れかの組成物。
２１. 各Ｒ５が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ５がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、項１４～２０の何れかの組成物。
２２. Ｎ－ヘテロ環式環がピペリジニルであり、環Ｎ原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外である、項１４～２１の何れかの組成物。
２３. Ｎ－ヘテロ環式環がピペラジニルであり、２個の環Ｎ原子の１個がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外であり、他の環Ｎ原子が所望によりＲ５で置換されており、好ましくは他の環Ｎ原子がＲ５で置換されている、項１４～２１の何れかの組成物。
２４. 両環Ｎ原子が置換されており、Ｒ５がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ５がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、項２３の組成物。
２５. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、項１４～２４の何れかの組成物。
２６. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、項１４～２５の何れかの組成物。
２７. Ｒ３およびＲ５が同じである、項１４～２６の何れかの組成物。
２８. Ｒ３およびＲ５の両方がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチルまたは２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルであり、好ましくは、Ｒ３およびＲ５の両方が２－ヒドロキシエチルである、項２７の組成物。
２９. Ｒ３およびＲ５が互いに異なる、項１４～２６の何れかの組成物。
３０. Ｒ１がＨである、項１の組成物。
３１. Ｒ２およびＲ３の各々がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、項３０の組成物。
３２. Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、項３０または３１の組成物。
３３. Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキルおよびＣ１－６アルキレン－Ｒ４から選択され、好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキルおよびＣ１－４アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキルおよびＣ１－３アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキルおよびＣ１－２アルキレン－Ｒ４から選択される、項３０～３２の何れかの組成物。
３４. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、項３０～３３の何れかの組成物。
３５. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、項３０～３４の何れかの組成物。
３６. Ｒ２およびＲ３の各々が独立してメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択され、好ましくは、Ｒ２およびＲ３の両方が２－ヒドロキシエチルまたは２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルである、項３０～３５の何れかの組成物。
３６ａ. 緩衝物質がＮ－オキシドである、項１～３６の何れかの組成物。
３７. 緩衝物質がビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)およびそのプロトン化形態、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される、項１～３６ａの何れかの組成物。
３８. 緩衝物質が少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４(例えば２－ヒドロキシエチル)部分を含む、項１～３７の何れかの組成物。
３９. (ｉ)ＲＮＡ；および(ii)式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含む緩衝系を含む水相を含む組成物であって、ここで：
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＨ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であるか；またはＲ１、Ｒ２およびＲ３の２個が、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成し；
各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され；そして
各Ｒ５が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択されるものである、組成物。
４０. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、項３９の組成物。
４１. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、項３９または４０の組成物。
４２. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキルおよびＣ１－６アルキレン－Ｒ４から選択され、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキルおよびＣ１－４アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキルおよびＣ１－３アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキルおよびＣ１－２アルキレン－Ｒ４から選択される、項３９～４１の何れかの組成物。
４３. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－２アルキルから選択される、項３９～４２の何れかの組成物。
４４. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、項３９～４３の何れかの組成物。
４５. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、項３９～４４の何れかの組成物。
４６. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される、項３９～４５の何れかの組成物。
４７. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全て同じである、項３９～４６の何れかの組成物。
４８. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全てがメチル、エチルまたは２－ヒドロキシエチルである、項４７の組成物。
４９. Ｒ１およびＲ２が同一であり、Ｒ３がＲ１およびＲ２と異なる、項３９～４６の何れかの組成物。
５０. Ｒ１およびＲ２の各々が２－ヒドロキシエチル、エチルまたはメチルである、項４９の組成物。
５１. Ｒ３がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される、項４９または５０の組成物。
５２. Ｒ１およびＲ２が、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成する、項３９の組成物。
５３. Ｒ３がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ３がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、項５２の組成物。
５３ａ. Ｎ－ヘテロ環式環が少なくとも１個の窒素環原子および所望によりＯおよびＳから選択される１個のさらなる環ヘテロ原子を含む単環式環である、項５２または５３の組成物。
５３ｂ. Ｎ－ヘテロ環式環が(ｉ)１個の窒素環原子；(ii)２個の窒素環原子；(iii)１個の窒素環原子および１個の酸素環原子；(iv)１個の窒素環原子および１個の硫黄環原子；または(ｖ)３個の窒素環原子を含む単環式環である、項５２～５３ａの何れかの組成物。
５３ｃ. Ｎ－ヘテロ環式環が単環式６員Ｎ－ヘテロ環式環などの単環式５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環である、項５２～５３ｂの何れかの組成物。
５３ｄ. Ｎ－ヘテロ環式環がピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、１,３,５－トリアジナニル、モルホリニルおよびチオモルホリニルから選択され、好ましくはピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、モルホリニルおよびチオモルホリニルから選択される、項５２～５３ｃの何れかの組成物。
５４. Ｎ－ヘテロ環式環が１個の窒素環原子のみ含むならば、この窒素環原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外である、またはＮ－ヘテロ環式環が１個を超える窒素環原子を含むならば、１個の窒素環原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外であり、他の窒素環原子の少なくとも１個、好ましくは他の窒素環原子の各々、がＲ５で置換されている、項５２～５３ｄの何れかの組成物。
５５. 各Ｒ５が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ５がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、項５２～５４の何れかの組成物。
５６. Ｎ－ヘテロ環式環がピペリジニルであり、環Ｎ原子がＲ３で置換されており、ここで、Ｒ３がＨ以外である、項５２～５５の何れかの組成物。
５７. Ｎ－ヘテロ環式環がピペラジニルであり、２個の環Ｎ原子の１個がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外であり、他の環Ｎ原子が所望によりＲ５で置換されており、好ましくは他の環Ｎ原子がＲ５で置換されている、項５２～５５の何れかの組成物。
５８. 両環Ｎ原子が置換されており、Ｒ５がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ５がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、項５７の組成物。
５９. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、項５２～５８の何れかの組成物。
６０. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、項５２～５９の何れかの組成物。
６１. Ｒ３およびＲ５が同じである、項５２～６０の何れかの組成物。
６２. Ｒ３およびＲ５の両方がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチルまたは２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルであり、好ましくは、Ｒ３およびＲ５の両方が２－ヒドロキシエチルである、項６１の組成物。
６３. Ｒ３およびＲ５が互いに異なる、項５２～６０の何れかの組成物。
６３ａ. Ｒ１がＨである、項３９の組成物。
６３ｂ. Ｒ２およびＲ３の各々がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、項６３ａの組成物。
６３ｃ. Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、項６３ａまたは６３ｂの組成物。
６３ｄ. Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキルおよびＣ１－６アルキレン－Ｒ４から選択され、好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキルおよびＣ１－４アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキルおよびＣ１－３アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキルおよびＣ１－２アルキレン－Ｒ４から選択される、項６３ａ～６３ｃの何れかの組成物。
６３ｅ. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、項６３ａ～６３ｄの何れかの組成物。
６３ｆ. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、項６３ａ～６３ｅの何れかの組成物。
６３ｇ. Ｒ２およびＲ３の各々が独立して２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択され、好ましくは、Ｒ２およびＲ３の両方が２－ヒドロキシエチルまたは２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルである、項６３ａ～６３ｆの何れかの組成物。
６３ｈ. 緩衝物質がＮ－オキシドである、項３９～６３ｇの何れかの組成物。
６４. 緩衝物質がビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)およびそのプロトン化形態、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される、項３９～６３ｈの何れかの組成物。
６５. 緩衝物質が少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４(例えば２－ヒドロキシエチル)部分を含む、項３９～６４の何れかの組成物。
６６. 緩衝系がさらにクロライド、酢酸、グリコール酸、乳酸およびクエン酸、コハク酸、マロン酸、グルタル酸またはアジピン酸のアニオンなどのジまたはトリカルボン酸のアニオンからなる群から選択されるアニオンを含む、項１～６５の何れかの組成物。
６７. 組成物中の緩衝物質の濃度が約１０mM～約２００mM、好ましくは約１５mM～約１００mM、より好ましくは約２０mM～約８０mM、より好ましくは約４０mM～約６０mM、例えば約５０mMである、項１～６６の何れかの組成物。
６８. 組成物のｐＨが約４.０～約８.０、好ましくは約４.５～約８.０、例えば約５.０～約８.０、約５.５～約８.０、約６.０～約８.０、約６.５～約８.０、約６.８～約７.９または約７.０～約７.８である、項１～６７の何れかの組成物。
６９. 水が組成物の主成分であるおよび／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約０.５％(ｖ／ｖ)未満である、項１～６８の何れかの組成物。
７０. 組成物の浸透圧が最大約１０００×１０－３osmol／kg、好ましくは約１００×１０－３osmol／kg～約７５０×１０－３osmol／kg、例えば約１００×１０－３osmol／kg～約５００×１０－３osmol／kg、より好ましくは約３００×１０－３osmol／kgである、項１～６９の何れかの組成物。
７１. 組成物中のＲＮＡ濃度が約５mg／ｌ～約５００mg／ｌ、例えば約１０mg／ｌ～約４００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約３００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約２００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約１５０mg／ｌまたは約１０mg／ｌ～約１００mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、より好ましくは約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである、項１～７０の何れかの組成物。
７２. 組成物が、好ましくは少なくとも約１％ｗ／ｖの濃度で抗凍結剤を含み、ここで、抗凍結剤が好ましくは炭水化物およびアルコール(例えば糖アルコールまたは低級アルコール)からなる群から選択され、より好ましくは抗凍結剤がスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から(例えばスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群からまたはスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から)選択される、より好ましくは抗凍結剤がスクロースおよび／またはグリセロールを含む、項１～７１の何れかの組成物。
７２ａ. 組成物が抗凍結剤を実質的に含まない、項１～７１の何れかの組成物。
７３. カチオン的にイオン化可能な脂質が、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む、項１～３８および６６～７２の何れかの組成物。
７４. カチオン的にイオン化可能な脂質が式(Ｘ)
の構造を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、ここで：
Ｌ１０およびＬ２０の一方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－であり、Ｌ１０およびＬ２０の他方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ１およびＧ２が各々独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－１２アルケニレンであり；
Ｇ３がＣ１－２４アルキレン、Ｃ２－２４アルケニレン、Ｃ３－８シクロアルキレンまたはＣ３－８シクロアルケニレンであり；
ＲａがＨまたはＣ１－１２アルキルであり；
Ｒ３５およびＲ３６が各々独立してＣ６－２４アルキルまたはＣ６－２４アルケニルであり；
Ｒ３７がＨ、ＯＲ５０、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４０、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４０または－ＮＲ５０Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４０であり；
Ｒ４０がＣ１－１２アルキルであり；
Ｒ５０がＨまたはＣ１－６アルキルであり；そして
ｘが０、１または２である、
項１～３８および６６～７３の何れかの組成物。
７４ａ.
(α)カチオン的にイオン化可能な脂質が次の構造Ｘ－１～Ｘ－３６から選択される：
(β)カチオン的にイオン化可能な脂質が次の構造Ａ～Ｇから選択される：
または
(γ)カチオン的にイオン化可能な脂質が、構造Ｘ－３を有する脂質である、
項１～３８および６６～７４の何れかの組成物。
７５. カチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質が式(XI)：
の構造を有し、ここで、
Ｒ１およびＲ２の各々が独立してＲ５または－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であり、ここで、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１個が－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であり；
Ｒ３およびＲ４の各々が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、アリールおよびＣ３－１０シクロアルキルからなる群から選択され；
Ｒ５およびＲ６の各々が独立して少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状ヒドロカルビル基であり；
Ｇ１およびＧ２の各々が独立して非置換Ｃ１－１２アルキレンまたはＣ２－１２アルケニレンであり；
Ｌ１およびＬ２の各々が独立して－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－および－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－からなる群から選択され；
ＲａがＨまたはＣ１－１２アルキルであり；
ｍが０、１、２、３または４であり；そして
ｘが０、１または２である、
項１～３８および６６～７３の何れかの組成物。
７５ａ. カチオン的にイオン化可能な脂質が構造(XIV－１)、(XIV－２)および(XIV－３)
から選択される、項１～３８、６６～７３および７５の何れかの組成物。
７６. カチオン的にイオン化可能な脂質が、組成物に存在する総脂質の約２０mol％～約８０mol％、好ましくは約２５mol％～約６５mol％、より好ましくは約３０mol％～約５０mol％、例えば約４０mol％～約５０mol％を構成する、項１～３８および６６～７５ａの何れかの組成物。
７７. さらに、好ましくはポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の付加的脂質を含み、より好ましくは組成物がカチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質(例えば、リン脂質)およびステロイドを含む、項１～７６の何れかの組成物。
７８. ポリマーコンジュゲート脂質がペグ化脂質を含み、ここで、ペグ化脂質が好ましくは(ｉ)ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＯＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＥ－ＰＥＧおよびＤＭＰＥ－ＰＥＧからなる群から選択される；または(ii)次の構造：
を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体であり、ここで：
Ｒ１２およびＲ１３が各々独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和アルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖が所望により１以上のエステル結合により中断されており；そしてｗが３０～６０の範囲の平均値を有する、項７７の組成物。
７９. ポリマーコンジュゲート脂質がポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートを含み、ここで、ポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートが好ましくはポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、項７７の組成物。
８０. ポリマーコンジュゲート脂質が、組成物に存在する総脂質の約０.５mol％～約５mol％、好ましくは約１mol％～約５mol％、より好ましくは約１mol％～約４.５mol％を構成する、項７７～７９の何れかの組成物。
８１. 中性脂質が、好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルフタチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)からなる群から選択されるリン脂質である、項７７～８０の何れかの組成物。
８２. 中性脂質が組成物に存在する総脂質の約５mol％～約４０mol％、好ましくは約５mol％～約２０mol％、より好ましくは約５mol％～約１５mol％を構成する、項７７～８１の何れかの組成物。
８３. ステロイドがコレステロールなどのステロールを含む、項７７～８２の何れかの組成物。
８４. ステロイドが組成物に存在する総脂質の約１０mol％～約６５mol％、好ましくは約２０mol％～約６０mol％、より好ましくは約３０mol％～約５０mol％を構成する、項７７～８３の何れかの組成物。
８５. カチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質(例えば、リン脂質)およびステロイドを含み、ここで、カチオン的にイオン化可能な脂質が組成物に存在する総脂質の約３０mol％～約５０mol％、例えば約４０mol％～約５０mol％を構成し；ポリマーコンジュゲート脂質が組成物に存在する総脂質の約１mol％～約４.５mol％を構成し；中性脂質(例えば、リン脂質)が組成物に存在する総脂質の約５mol％～約１５mol％を構成し；そしてステロイドが組成物に存在する総脂質の約３０mol％～約５０mol％を構成する、項７７～８４の何れかの組成物。
８６. ＲＮＡの少なくとも一部、および、存在するならば、１以上の脂質が、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)、リポソームおよび／またはリポフレックス(ＬＰＸ)などの粒子中に存在する、項１～８５の何れかの組成物。
８６ａ. 粒子が組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％を構成する、項８６の組成物。
８６ｂ. ＲＮＡが粒子内に封入されるかまたは粒子と結合している、項８６または８６ａの組成物。
８７. 粒子が約３０nm～約５００nmのサイズを有する、項８６～８６ｂの何れかの組成物。
８８. ＲＮＡがｍＲＮＡまたは阻害性ＲＮＡである、項１～８７の何れかの組成物。
８９. ＲＮＡが(ｉ)ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、ここで修飾ヌクレオシドが好ましくはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される；(ii)コドン最適化されているコード配列を有する；および／または(iii)野生型コード配列と比較してＧ／Ｃ含量が増加しているコード配列を有する、項１～８８の何れかの組成物。
９０. ＲＮＡが次の５’キャップ；５’ ＵＴＲ；３’ ＵＴＲ；およびポリＡ配列の少なくとも１個、好ましくは全てを含む、項１～８９の何れかの組成物。
９１. ポリＡ配列が少なくとも１００個のＡヌクレオチドを含み、ここで、ポリＡ配列が好ましくはＡヌクレオチドの中断配列である、項９０の組成物。
９２. ５’キャップがキャップ１またはキャップ２構造である、項９０または９１の組成物。
９３. ＲＮＡが１以上のポリペプチドをコードし、ここで、好ましくは１以上のポリペプチドが対象における抗原に対する免疫応答を誘導するための薬学的活性ポリペプチドであるおよび／またはエピトープを含む、項１～９２の何れかの組成物。
９４. 薬学的活性ポリペプチドおよび／または抗原またはエピトープが病原体のタンパク質、タンパク質の免疫原性バリアントまたはタンパク質の免疫原性フラグメントもしくはその免疫原性バリアントに由来するかまたはそれである、項９３の組成物。
９５. 薬学的活性ポリペプチドおよび／または抗原またはエピトープがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク(Ｓ)タンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに由来するかまたはそれである、項９３または９４の組成物。
９５ａ. ＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む、項９４または９５の組成物。
９５ｂ. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントが、配列番号１の９８６位および９８７位に置換されたプロリン残基を有する、項９５または９５ａの組成物。
９５ｃ. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントが、配列番号７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一性を有する、項９５～９５ｂの何れかの組成物。
９５ｄ. フラグメントがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む、項９５～９５ｃの何れかの組成物。
９５ｅ. (ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の免疫原性バリアントのフラグメントが配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一性を有する、項９５ｄの組成物。
９６. 組成物が、好ましくは約２℃～約１０℃の温度で液体である、項１～９５ｅの何れかの組成物。
９７. 組成物の少なくとも１週間、好ましくは約２℃～約８℃の温度で保存後のＲＮＡ完全性が、保存前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、項１～９６の何れかの組成物。
９８. 組成物の保存後のＲＮＡ粒子(特にＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ)が保存前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい、項８７～９７の何れかの組成物。
９９. 組成物が凍結形態である、項１～９５ｅの何れかの組成物。
９９ａ. 組成物のｐＨが４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５である、項９９の組成物。
９９ｂ. 抗凍結剤をさらに含む、項９９または９９ａの組成物。
９９ｃ. 抗凍結剤がスクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群などスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、例えば抗凍結剤がグリセロールである、項９９ｂの組成物。
９９ｄ. 抗凍結剤が約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在する、項９９ｂまたは９９ｃの組成物。
１００. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性が組成物凍結前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、項９９～９９ｄの何れかの組成物。
１０１. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子(特にＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ)が、組成物凍結前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい、項９９または１００の組成物。
１０２. 最終水相に分散したＬＮＰを含む組成物を製造する方法であって、ここで、ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含み；最終水相が最終緩衝物質、最終式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が項１～３８の何れかに定義するとおりであり；
(Ｉ)最終水相に分散した、カチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含むＬＮＰを含む製剤を製造し；そして
(II)所望により製剤を約－１０℃以下まで凍結し、
それにより組成物を得ることを含み、
ここで、工程(Ｉ)が：
(ａ)水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を製造し；
(ｂ)カチオン的にイオン化可能な脂質および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を製造し；
(ｃ)(ａ)の下に製造したＲＮＡ溶液と(ｂ)の下に製造したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む第一水相に分散したＬＮＰを含む第一中間製剤を製造し；そして
(ｄ)最終緩衝系を含む最終水性緩衝液を使用して(ｃ)の下に製造した第一中間製剤を濾過し、
それにより最終水相に分散したＬＮＰを含む製剤を製造する
ことを含む、方法。
１０３. 工程(Ｉ)が希釈および濾過から選択される１以上の工程をさらに含む、項１０２の方法。
１０４. 工程(Ｉ)が：
(ａ’)水性ＲＮＡ溶液を準備し；
(ｂ’)第一緩衝系を含む第一水性緩衝液を準備し；
(ｃ’)(ａ’)の下に準備した水性ＲＮＡ溶液と(ｂ’)の下に準備した第一水性緩衝液を混合し、それにより水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を製造し；
(ｄ’)カチオン的にイオン化可能な脂質および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を製造し；
(ｅ’)(ｃ’)の下に製造したＲＮＡ溶液と(ｄ’)の下に製造したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む第一水相に分散されたＬＮＰを含む第一中間製剤を製造し；
(ｆ’)所望によりさらなる緩衝系を含むさらなる水性緩衝液を使用して、(ｅ’)の下に製造した第一中間製剤を濾過し、それによりさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散したＬＮＰを含むさらなる中間製剤を製造し、ここで、さらなる水性緩衝液が第一水性緩衝液と同一でも異なってもよく；
(ｇ’)所望により工程(ｆ’)を１回、２回またはそれ以上繰り返し、ここで、１サイクルの工程(ｆ’)の後に得たさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散したＬＮＰを含むさらなる中間製剤を次サイクルの第一中間製剤として使用し、ここで、各サイクルにおいて、さらなる水性緩衝液が第一水性緩衝液と同一でも異なってもよく；
(ｈ’)工程(ｆ’)がないならば工程(ｅ’)で得た第一中間製剤または工程(ｆ’)が存在し、工程(ｇ’)が存在しないならば工程(ｆ’)で得たさらなる中間製剤または工程(ｆ’)および(ｇ’)が存在するならば工程(ｇ’)後に得たさらなる中間製剤を、最終緩衝系を含む最終水性緩衝液を使用して濾過し；そして
(ｉ’)所望により工程(ｈ’)で得た製剤を希釈溶液で希釈し；
それにより最終水相に分散したＬＮＰを含む製剤を製造する
ことを含む、項１０２または１０３の方法。
１０５. 濾過がタンジェンシャルフロー濾過または透析濾過、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過である、項１０２～１０４の何れかの方法。
１０６. (II)製剤の約－１０℃以下までの凍結を含む、項１０２～１０５の何れかの方法。
１０６ａ. 組成物のｐＨが４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５である、項１０６の方法。
１０７. 抗凍結剤(好ましくは工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物が抗凍結剤を含む)をさらに含む、項１０６または１０６ａの方法。
１０７ａ. 抗凍結剤がスクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群などスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、例えば抗凍結剤がグリセロールである、項１０７の方法。
１０７ｂ. 抗凍結剤が約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在する、項１０７または１０７ａの方法。
１０８. 最終緩衝物質がＢＴＭおよびそのプロトン化形態、ＴＥＡおよびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される、項１０２～１０７ｂの何れかの方法。
１０８ａ. 最終緩衝系がさらに好ましくはクロライド、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸(ＭＥＳ)のアニオン、３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)、２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)のアニオンおよびクエン酸のアニオン、コハク酸、マロン酸、グルタル酸またはアジピン酸のアニオンなどのジまたはトリカルボン酸のアニオンから選択されるアニオンを含む、項１０２～１０８の何れかの方法。
１０９. 組成物における最終緩衝物質の濃度が約１０mM～約２００mM、好ましくは約１５mM～約１００mM、より好ましくは約２０mM～約８０mM、より好ましくは約４０mM～約６０mM、例えば約５０mMである、項１０２～１０８ａの何れかの方法。
１１０. (ｉ)工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液が６.０未満、好ましくは最大約５.０、より好ましくは最大約４.５のｐＨを有する；または(ii)第一水性緩衝液が６.０未満、好ましくは最大約５.０、より好ましくは最大約４.５のｐＨを有する、項１０２～１０９の何れかの方法。
１１１. (ｉ)工程(ａ)で使用する第一緩衝系が工程(ｄ)で使用する最終緩衝物質を含み、好ましくは工程(ａ)で使用する第一緩衝系の緩衝系およびｐＨが工程(ｄ)で使用する最終水性緩衝液の緩衝系およびｐＨと同一である；または(ii)第一緩衝系および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全てのさらなる緩衝系の各々が工程(ｈ’)で使用する最終緩衝物質を含み、好ましくは第一水性緩衝液および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全てのさらなる水性緩衝液の緩衝系およびｐＨが、最終水性緩衝液の緩衝系およびｐＨと同一である、項１０２～１１０の何れかの方法。
１１２. 組成物のｐＨが約４.０～約８.０、好ましくは約４.５～約８.０、例えば約５.０～約８.０、約５.５～約８.０、約６.０～約８.０、約６.５～約８.０、約６.８～約７.９または約７.０～約７である、項１０２～１１１の何れかの方法。
１１３. 水が製剤の主成分であるおよび／または組成物および／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約０.５％(ｖ／ｖ)未満である、項１０２～１１２の何れかの方法。
１１４. 組成物の浸透圧が最大約１０００×１０－３osmol／kg、好ましくは約１００×１０－３osmol／kg～約７５０×１０－３osmol／kg、例えば約１００×１０－３osmol／kg～約５００×１０－３osmol／kg、より好ましくは約３００×１０－３osmol／kgである、項１０２～１１３の何れかの方法。
１１５. 組成物中のＲＮＡ濃度が約５mg／ｌ～約５００mg／ｌ、例えば約１０mg／ｌ～約４００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約３００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約２００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約１５０mg／ｌまたは約１０mg／ｌ～約１００mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、より好ましくは約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである、項１０２～１１４の何れかの方法。
１１５ａ. (ｉ)工程(Ｉ)が(ｄ)の下に製造した製剤の希釈溶液での希釈をさらに含むまたは工程(ｉ’)が存在し、ここで、希釈溶液が抗凍結剤を含む；および／または(ii)工程(Ｉ)で得た製剤および組成物が少なくとも約１％ｗ／ｖの濃度で抗凍結剤を含み、ここで、抗凍結剤が好ましくは炭水化物およびアルコール(例えば糖アルコールまたは低級アルコール)からなる群から選択される１以上を含む、より好ましくは抗凍結剤がスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から(例えばスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群からまたはスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から)選択される、より好ましくは抗凍結剤がスクロースおよび／またはグリセロールを含む、項１０２～１１５の何れかの方法。
１１５ｂ. 工程(Ｉ)で得た製剤および組成物が抗凍結剤を実質的に含まない、項１０２～１０６ａおよび１０８～１１５の何れかの方法。
１１６. カチオン的にイオン化可能な脂質が、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む、項１０２～１１５ｂの何れかの方法。
１１６ａ. カチオン的にイオン化可能な脂質が項７３～７５ａの何れかで定義したとおりである、項１０２～１１６の何れかの方法。
１１７. 工程(ｂ)または(ｄ’)で製造したエタノール性溶液がさらに１以上の付加的脂質を含み、ＬＮＰが１以上の付加的脂質をさらに含み、ここで、１以上の付加的脂質が好ましくはポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは１以上の付加的脂質がポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質(例えば、リン脂質)およびステロイドを含む、項１０２～１１６ａの何れかの方法。
１１７ａ. ポリマーコンジュゲート脂質が項７８～８０の何れかで定義したとおりである、項１１７の方法。
１１７ｂ. 中性脂質が、好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルフタチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)からなる群から選択されるリン脂質である、１１７または１１７ａの方法。
１１７ｃ. ステロイドがコレステロールなどのステロールを含む、項１１７～１１７ｂの何れかの方法。
１１８. カチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質およびステロイドがエタノール性溶液に２０％～６０％のカチオン的にイオン化可能な脂質、０.５％～１５％のポリマーコンジュゲート脂質、５％～２５％の中性脂質(例えば、リン脂質)および２５％～５５％のステロイドのモル比、好ましくは４５％～５５％のカチオン的にイオン化可能な脂質、１.０％～５％のポリマーコンジュゲート脂質、８％～１２％の中性脂質および３５％～４５％のステロイドのモル比で存在する、項１０２～１１７ｃの何れかの方法。
１１８ａ. ＬＮＰが組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％を構成する、項１０２～１１８の何れかの方法。
１１９. ＲＮＡが項８８および８９～９５ｅの何れかで定義したとおりである、項１０２～１１８ａの何れかの方法。
１２０. 工程(II)を含まない、項１０２～１０５および１０７～１１９の何れかの方法。
１２１. 水性ＲＮＡ組成物を製造する方法であって：
(Ｉ)ＲＮＡおよび水相を含む製剤を製造し、ここで、水相が緩衝物質、式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が項１～３８の何れかに定義するとおりであり；そして
(II)所望により製剤を約－１０℃以下まで凍結し、
それにより組成物を得る
ことを含む、方法。
１２２. (II)製剤の約－１０℃以下までの凍結を含む、項１２１の方法。
１２２ａ. 組成物のｐＨが４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５である、項１２２の方法。
１２３. 組成物が抗凍結剤を含む、項１２２または１２２ａの方法。
１２３ａ. 抗凍結剤がスクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群などスクロース、グリセロール、グルコース、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、例えば抗凍結剤がグリセロールである、項１２３の方法。
１２３ｂ. 抗凍結剤が約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在する、項１２３または１２３ａの方法。
１２４. 工程(II)を含まない、項１２１の方法。
１２５. 緩衝物質がＢＴＭおよびそのプロトン化形態、ＴＥＡおよびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される、項１２１～１２４の何れかの方法。
１２６. 項１０２～１１９、１２１、１２２および１２５の何れかの方法に従い組成物を製造し、組成物を約－９０℃～約－１０℃の範囲の温度で、例えば約－９０℃～約－４０℃または約－２５℃～約－１０℃で保存することを含む、成物を保存する方法。
１２６ａ. 組成物のｐＨが４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５である、項１２６の方法。
１２７. 組成物が抗凍結剤を含む、項１２６または１２６ａの方法。
１２７ａ. 抗凍結剤がスクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群などスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、例えば抗凍結剤がグリセロールである、項１２７の方法。
１２７ｂ. 抗凍結剤が約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在する、項１２７または１２７ａの方法。
１２８. 組成物の保存が少なくとも１カ月、例えば少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月である、項１２６～１２７ｂの何れかの方法。
１２９. 項１０２～１２８の何れかの方法に従い組成物を製造し、組成物を約０℃～約２０℃、例えば約１℃～約１５℃、約２℃～約１０℃または約２℃～約８℃の範囲の温度または約５℃の温度で保存することを含む、成物を保存する方法。
１３０. 組成物の保存が少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月または少なくとも２４カ月である、項１２９の方法。
１３１. 項１０２～１３０の何れかの方法により製造可能な組成物。
１３２. 凍結形態である、項１３１の組成物。
１３２ａ. 組成物のｐＨが４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５である、項１３２の組成物。
１３３. 抗凍結剤をさらに含む、項１３２または１３２ａの組成物。
１３３ａ. 抗凍結剤がスクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群などスクロース、グルコース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、例えば抗凍結剤がグリセロールである、項１３３の組成物。
１３３ｂ. 抗凍結剤が約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在する、項１３３または１３３ａの組成物。
１３４. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性が組成物を凍結する前の組成物のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、項１３２～１３３ｂの何れかの組成物。
１３５. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ)が、組成物凍結前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい、項１３２～１３４の何れかの組成物。
１３６. 液体形態である、項１３１の組成物。
１３７. 少なくとも１週間組成物保存後のＲＮＡ完全性が保存前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、項１３６の組成物。
１３８. 組成物を少なくとも１週間保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ)が保存前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい、項１３６または１３７の組成物。
１３９. 項１０２～１１９、１２１～１２３ｂおよび１２５～１２８の何れかに従い凍結組成物を準備し、凍結組成物を解凍して、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を製造する方法。
１４０. 項１０２～１０５、１０７～１２１、１２４、１２５、１２９および１３０の何れかに従い液体組成物を製造し、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を製造する方法。
１４１. 項１３９または１４０の方法により製造可能な、使用準備済医薬組成物。
１４２. 治療に使用するための、項１～１０１、１３１～１３８および１４１の何れかの組成物。
１４３. 対象における免疫応答の誘導に使用するための、項１～１０１、１３１～１３８および１４１の何れかの組成物。
１４３ａ. 項１～１０１、１３１～１３８および１４１の何れかの組成物を細胞に添加し；そして組成物と細胞の混合物を十分な時間インキュベートすることを含む、細胞をトランスフェクトする方法。
１４３ｂ. 細胞をトランスフェクトするための、項１～１０１、１３１～１３８および１４１の何れかの組成物の使用。
１４３ｃ. 項１～１０１、１３１～１３８および１４１～１４３の何れかの組成物またはここに記載する医薬組成物を含む、キット。
１４３ｄ. 免疫応答の誘導のためなどの治療に使用するためである、項１４３ｃのキット。
１４３ｅ. 感染性疾患の処置または予防のためなどの、病原体に対する免疫応答の誘導に使用するためである、項１４３ｃまたは１４３ｄのキット。
本発明のさらなる態様をここに開示する。
緩衝物質のタイプと相関させたＲＮＡの分解。ＲＮＡ ＬＮＰを１２週間、室温で種々の緩衝系(１００mM、ｐＨ７.４)でインキュベートした。
アニオン性部分の存在と相関させたＬＭＳの産生。ＲＮＡ ＬＮＰを、１２週間、室温で種々の緩衝系(１００mM、ｐＨ７.４)でインキュベートした。
ＲＮＡ完全性対緩衝液化学。
少なくとも１サイクルの凍結／解凍に付したＬＮＰ ＲＮＡ組成物における種々の抗凍結剤のＬＮＰのサイズに対する影響。
配列の記載
次の表は、ここで参照するある配列の一覧を提供する。
発明の詳細な記載
本発明を以下にさらに詳細に記載するが、本発明は方法、プロトコールおよび試薬は変わり得るために、ここに記載する特定のものに限定されないことは理解される。またここで使用する用語は、特定の実施態様の記載のみを目的とし、添付する特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことも理解される。他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。
以下で、本発明の要素をより詳細に記載する。これらの要素は具体的実施態様と共に挙げられているが、しかしながら、それらは任意の方法かつ任意の数で組み合わせて、さらなる実施態様を作ることはできることは理解されるべきである。多種多様に記載される例および好ましい実施態様は、明示的に記載された実施態様にのみ本発明を限定すると解釈されてはならない。この記載は、明示的に記載された実施態様と任意の数の開示されたおよび／または好ましい要素を組み合わせる、実施態様を支持しかつ包含すると理解されるできである。さらに、本明細書における全ての記載された要素のあらゆる置換および組み合わせは、文脈から反することは示されない限り、本出願の記載により開示されるとみなされるべきである。
好ましくは、ここで使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載のとおり定義する。
本発明の実施は、特に断らない限り、本分野の文献で説明されている慣用の化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組み換えＤＮＡ技術を用いる(例えば、Organikum, Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin 1990; Streitwieser/Heathcook, "Organische Chemie", VCH, 1990; Beyer/Walter, "Lehrbuch der Organischen Chemie", S. Hirzel Verlag Stuttgart, 1988; Carey/Sundberg, "Organische Chemie", VCH, 1995; March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley & Sons, 1985; Roempp Chemie Lexikon, Falbe/Regitz (Hrsg.), Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1989; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照)。
本明細書および以下の特許請求の範囲をとおして、文脈から反する解釈が必要ではない限り、用語「含む」および「含み」および「含んで」などのその変形は、記載するメンバー、整数または工程またはメンバー、整数または工程の群の包含を含意するが、あらゆる他のメンバー、整数または工程またはメンバー、整数または工程の群の除外は含意しないと理解されるべきである。用語「から本質的になる」は、何らかの本質的な意義の他のメンバー、整数または工程の除外を意味する。用語「含む」は用語「から本質的になる」を含み、これは、次に用語「からなる」を含む。故に、本明細書における各場合、用語「含む」は、用語「から本質的になる」または「からなる」に置き換えられ得る。同様に、本明細書における各場合、用語「から本質的になる」は用語「からなる」に置き換えられ得る。
本発明を説明する文脈(特に特許請求の範囲における文脈)で使用される単数ここで使用する表現および類似表現は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、単数および複数両方を包含すると解釈すべきである。
ここに記載する全ての方法は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、任意の適当な順番で実施できる。
ここに提供する任意かつ全ての例または例示的用語(例えば、「など」)の使用は、単に本発明を説明する意図であり、その他請求される本発明の範囲に限定を課さない。本明細書にいおいて、本発明の実施に必須の何らかの請求されていない要素を示すと解釈すべき用語はない。
ここで使用するとき、「および／または」は、他方を伴うまたは伴わない２個の特定した特性または成分の各々の具体的開示として解釈される。例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、各々は個々にここで示されるかのように、(ｉ)Ｘ、(ii)Ｙおよび(iii)ＸおよびＹの各々の具体的開示として解釈される。
本発明の状況において、用語「約」は、当業者は問題の特性の技術的効果をなお確信すると理解される、精度の間隔を意味する。本用語は、典型的に示す数値からの±１０％、例えば±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０.９％、±０.８％、±０.７％、±０.６％、±０.５％、±０.４％、±０.３％、±０.２％、±０.１％、±０.０５％および例えば±０.０１％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±１０％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±５％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±４％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±３％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±２％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±１％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.９％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.８％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.７％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.６％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.５％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.４％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.３％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.２％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.１％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.０５％の逸脱を示す。ある実施態様において、「約」は示す数値からの±０.０１％の逸脱を示す。当業者には認識されるとおり、ある技術的効果についての数値からの具体的なこのような逸脱は、技術的効果の性質による。例えば、天然または生物学的技術的効果は、一般に人為的または工学的技術的効果よりこのような逸脱は大きい。
ここでの値の範囲の参照は、単に範囲内に入る各別個の数値を個々に参照する省略的方法として提供することが意図される。ここで特に断らない限り、各個々の値を、個々にここに言及されているかのように本明細書に包含させる。
本明細書をとおしていくつかの文献は引用されている。ここで引用する文献の各々(全特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の明細、指示などを含む)は、上記であろうが、下記であろうが、全体として引用により本明細書に包含させる。ここでの全ては、先行発明によって本発明はかかる開示に先行する権利はないことを認めるものとして解釈されるものではない。
定義
下に、本発明の全態様に適用される定義を提供する。次の用語は、特に断らない限り、次の意味を有する。あらゆる定義されていない用語は、当分野で認識されている意味を有する。
ここで使用する「減少」または「阻害」などの用語は、例えば、レベルの約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上または約７５％以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。用語「阻害」または類似の用語は、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわち０または本質的に０への減少を含む。
ここで使用する「増強」および「増加」などの用語は、例えば、レベルの少なくとも約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約７５％以上または約１００％以上の全体的増加または増強を引き起こす能力を意味する。ある実施態様において、これらの用語は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％または少なくとも約１００％の増加または増強に関連する。
ここで使用する「生理学的ｐＨ」は、約７.５または約７.４のｐＨをいう。ある実施態様において、生理学的ｐＨは７.３～７.５である。ある実施態様において、生理学的ｐＨは７.３５～７.４５である。ある実施態様において、生理学的ｐＨは７.３、７.３５、７.４、７.４５または７.５である。
ここで使用する「生理学的条件」は、生存対象、特にヒトにおける条件(特にｐＨおよび温度)をいう。好ましくは、生理学的条件は、生理学的ｐＨおよび／または約３７℃の温度をいう。
本明細書で使用する「％(ｗ／ｖ)」(または「％ｗ／ｖ」)は、ミリリットル(ml)での溶液総体積のパーセントとして表す、グラム(ｇ)で溶質の量を測定する濃度単位である重量／体積パーセントをいう。
本明細書で使用する「重量％」または「％(ｗ／ｗ)」(または「％ｗ／ｗ」)は、グラム(ｇ)での総組成物の総重量のパーセントとして表す、グラム(ｇ)で物質の量を測定する濃度の単位である、重量パーセントをいう。
本明細書で使用する「mol％」は、１００倍したある成分のモル数対全成分の総モル数の比として定義される。
本明細書で使用する「総脂質のmol％」は、１００倍したあるある脂質成分のモル数対全脂質の総モル数の比として定義される。この状況で、ある実施態様において、用語「総脂質」は脂質および脂質様物質を含む。
用語「イオン強度」は、特定の溶液中の種々のイオン種の数とその各電荷の数学的関係をいう。故に、イオン強度Ｉは式
〔式中、ｃは特定のイオン種のモル濃度であり、ｚはその電荷の絶対値である。〕
により数学的に表される。総和Σは、溶液の全種類のイオン(ｉ)に及ぶ。
本開示によると、ある実施態様において、用語「イオン強度」は単価イオンの存在に関する。
二価無機イオン、特に二価無機カチオンの存在に関して、キレート剤の存在によるその濃度または有効濃度(遊離イオンの存在)は、ある実施態様において、ＲＮＡの分解を防止するために十分に低い。ある実施態様において、二価無機イオンの濃度または有効濃度は、ＲＮＡヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解の触媒レベル以下である。ある実施態様において、遊離二価無機イオンの濃度は２０μM以下である。ある実施態様において、遊離二価無機イオンは存在しないかまたは本質的に存在しない。
「浸透圧」は、溶媒のキログラムあたりの溶質のモル数として表される、特定の溶質の濃度をいう。
用語「凍結乾燥する」または「凍結乾燥」は、物質を、凍結し、次いで周りの圧を低下させ(例えば、１５Pa未満、例えば１０Pa未満、５Pa未満または１Pa未満またｈそれ以下)、物質中の凍結媒体を直接固体相からガス相に昇華させることによる、物質のフリーズドライをいう。故に、用語「凍結乾燥」および「フリーズドライ」はここでは相互交換可能に使用する。
用語「噴霧乾燥」は、容器(噴霧乾燥器)内で(加熱)ガスと霧状(噴霧)である流体の混合により物質を噴霧乾燥させ、該容器で、形成された液滴からの溶媒は蒸発し、乾燥粉末となることをいう。
用語「再構成」は、水などの溶媒を乾燥生成物に添加し、元の液体状態などの液体状態に戻すことをいう。
用語「凍結」は、通常、熱の除去を伴う、液体の固化に関する。
粒子、特にＬＮＰ、リポソームおよび／またはリポフレックスを含む組成物／製剤に関連してここで使用する用語「水相」は、移動または液体相、すなわち、(形式上)粒子以外の溶解された全成分を含む、連続的水相を意味する。故に、ＬＮＰなどの粒子は水相に分散し、水相が化合物Ｘを実質的に含まないとき、水相は、実質的におよび現実的に実行可能であるような方法でＸを含まず、例えば、水性組成物における化合物Ｘの濃度は１重量％未満である。しかしながら、同時に、水相に分散する粒子は化合物Ｘを１重量％を超える量で含み得ることも可能である。
塩基(例えば、式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質またはそのＮ－オキシド)と関連してここで使用する表現「プロトン化形態」は、塩基の共役酸を意味し、ここで、共役酸はプロトンを含み、それは脱プロトン化により除去可能であり、塩基となる。例えば、プロトン化形態のＴＥＡは式[ＨＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ)３]＋を有する。ここで使用する「緩衝物質」は、塩基とそのプロトン化形態の混合物(例えば、ＴＥＡと[ＨＮ(ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ)３]＋の混合物)をいう。結果として、組成物に含まれる緩衝物質の量は、組成物における塩基および共役酸両方の量の総和である。
本発明の状況における用語「組み換え」は、「遺伝子操作を介して製造すること」を意味する。ある実施態様において、本発明の状況における「組み換え物体」は、天然に存在しない。
ここで使用する用語「天然に存在する」は、物体が自然に見られ得るとの事実をいう。例えば、生物(ウイルスを含む)に存在し、天然源から単離でき、実験室で人により意図的に修飾されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。用語「天然に見られる」は「天然に存在する」ことを意味し、既知物体ならびにまだ天然から発見されていないおよび／または単離されていないが、将来的に天然源から発見されるおよび／または単離される可能性のある物体を含む。
ここで使用する用語「室温」および「環境温度」は、ここでは相互交換可能に使用され、少なくとも約１５℃、好ましくは約１５℃～約３５℃、約１５℃～約３０℃、約１５℃～約２５℃または約１７℃～約２２℃の温度をいう。このような温度は、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃および２２℃を含む。
用語「アルキル」は、飽和直鎖または分岐鎖炭化水素のモノラジカルをいう。好ましくは、アルキル基は、１～１２(例えば１～１０)個の炭素原子、すなわち、Ｃ１－１２アルキルと略す１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の炭素原子、(例えばＣ１－１０アルキルと略す１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子)、より好ましくは１～８個の炭素原子、例えば１～６個または１～４個の炭素原子を含む。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル(別名２－プロピルまたは１－メチルエチル)、ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソ－ペンチル、ｓｅｃ－ペンチル、ネオペンチル、１,２－ジメチル－プロピル、イソ－アミル、ｎ－ヘキシル、イソ－ヘキシル、ｓｅｃ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、イソ－ヘプチル、ｎ－オクチル、２－エチル－ヘキシル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシルなどを含む。「置換アルキル」は、アルキレン基の水素原子の１以上(例えば１からアルキル基に結合した水素原子の最大数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０、例えば１～５、１～４または１～３または１または２)が、水素以外の置換基に置き換えられていることを意味する(１を超える水素原子が置き換えられるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基は、ここに特定する第一レベル置換基である。置換アルキルの例は、クロロメチル、ジクロロメチル、フルオロメチルおよびジフルオロメチルを含む。
用語「アルキレン」は、飽和直鎖または分岐鎖炭化水素のジラジカルをいう。好ましくは、アルキレンは、１～１２(例えば１～１０)個の炭素原子、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の炭素原子(例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子)、より好ましくは１～８個の炭素原子、例えば１～６個または１～４個の炭素原子を含む。アルキレン基の例は、メチレン、エチレン(すなわち、１,１－エチレン、１,２－エチレン)、プロピレン(すなわち、１,１－プロピレン、１,２－プロピレン(－ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２－)、２,２－プロピレン(－Ｃ(ＣＨ３)２－)および１,３－プロピレン)、ブチレン異性体(例えば、１,１－ブチレン、１,２－ブチレン、２,２－ブチレン、１,３－ブチレン、２,３－ブチレン(ｃｉｓまたはｔｒａｎｓまたはそれらの混合物)、１,４－ブチレン、１,１－イソ－ブチレン、１,２－イソ－ブチレンおよび１,３－イソ－ブチレン)、ペンチレン異性体(例えば、１,１－ペンチレン、１,２－ペンチレン、１,３－ペンチレン、１,４－ペンチレン、１,５－ペンチレン、１,１－イソ－ペンチレン、１,１－ｓｅｃ－ペンチル、１,１－ネオペンチル)、ヘキシレン異性体(例えば、１,１－ヘキシレン、１,２－ヘキシレン、１,３－ヘキシレン、１,４－ヘキシレン、１,５－ヘキシレン、１,６－ヘキシレンおよび１,１－イソヘキシレン)、ヘプチレン異性体(例えば、１,１－ヘプチレン、１,２－ヘプチレン、１,３－ヘプチレン、１,４－ヘプチレン、１,５－ヘプチレン、１,６－ヘプチレン、１,７－ヘプチレンおよび１,１－イソヘプチレン)、オクチレン異性体(例えば、１,１－オクチレン、１,２－オクチレン、１,３－オクチレン、１,４－オクチレン、１,５－オクチレン、１,６－オクチレン、１,７－オクチレン、１,８－オクチレンおよび１,１－イソオクチレン)などを含む。少なくとも３個の炭素原子および各末端に遊離原子価を有する直鎖アルキレン部分はまた複数のメチレンとしても称され得る(例えば、１,４－ブチレンはテトラメチレンとも称され得る)。一般に、アルキレン部分について上記のように末尾「イレン」を使用する代わりに、末尾「ジイル」も使用してよい(例えば、１,２－ブチレンはブタン－１,２－ジイルとも称され得る)。「置換アルキレン」は、アルキレン基の水素原子の１以上(例えば１からアルキレン基に結合した水素原子の最大数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０、例えば１～５、１～４または１～３または１または２)が、水素以外の置換基に置き換えられていることを意味する(１を超える水素原子が置き換えられるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基は、ここに特定する第一レベル置換基である。
用語「アルケニル」は、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を有する不飽和直鎖または分岐鎖炭化水素のモノラジカルをいう。一般に、アルケニル基における炭素－炭素二重結合の最大数は２における炭素原子数を２で割ることにより計算された整数に等しく、アルケニル基の炭素原子数が奇数であるならば、分数の結果を、次の整数に切り捨てる。例えば、９個の炭素原子を有するアルケニル基について、炭素－炭素二重結合の最大数は４である。好ましくは、アルケニル基は１～６(例えば１～４)個、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素－炭素二重結合を有する。好ましくは、アルケニル基は、２～１２(例えば２～１０)個の炭素原子、すなわち、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の炭素原子(例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子)、より好ましくは２～８個の炭素原子、例えば２～６個の炭素原子または２～４個の炭素原子を含む。故に、好ましい実施態様において、アルケニル基はＣ２－１２アルケニルと略す２～１２個、(例えば、２～１０)個の炭素原子および１、２、３、４、５または６(例えば、１、２、３、４または５)個の炭素－炭素二重結合を含み、より好ましくは２～８個の炭素原子および１個、２個、３個または４個の炭素－炭素二重結合、例えば２～６個の炭素原子および１個、２個または３個の炭素－炭素二重結合または２～４個の炭素原子および１個または２個の炭素－炭素二重結合を含む。炭素－炭素二重結合はｃｉｓ(Ｚ)またはｔｒａｎｓ(Ｅ)配置であり得る。アルケニル基の例は、ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル(すなわち、アリル)、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、５－ヘキセニル、１－ヘプテニル、２－ヘプテニル、３－ヘプテニル、４－ヘプテニル、５－ヘプテニル、６－ヘプテニル、１－オクテニル、２－オクテニル、３－オクテニル、４－オクテニル、５－オクテニル、６－オクテニル、７－オクテニル、１－ノネニル、２－ノネニル、３－ノネニル、４－ノネニル、５－ノネニル、６－ノネニル、７－ノネニル、８－ノネニル、１－デセニル、２－デセニル、３－デセニル、４－デセニル、５－デセニル、６－デセニル、７－デセニル、８－デセニル、９－デセニル、１－ウンデセニル、２－ウンデセニル、３－ウンデセニル、４－ウンデセニル、５－ウンデセニル、６－ウンデセニル、７－ウンデセニル、８－ウンデセニル、９－ウンデセニル、１０－ウンデセニル、１－ドデセニル、２－ドデセニル、３－ドデセニル、４－ドデセニル、５－ドデセニル、６－ドデセニル、７－ドデセニル、８－ドデセニル、９－ドデセニル、１０－ドデセニル、１１－ドデセニルなどを含む。アルケニル基が窒素原子に結合しているならば、二重結合は窒素原子に対してアルファではあり得ない。「置換アルケニル」は、アルケニル基の水素原子の１以上(例えば１からアルケニル基に結合した水素原子の最大数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０、例えば１～５、１～４または１～３または１または２)が、水素以外の置換基に置き換えられていることを意味する(１を超える水素原子が置き換えられるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基はここに特定する第一レベル置換基である。
用語「アルキニル」は、総炭素原子は６～３０、典型的に６～２０、しばしば６～１８であり得る、少なくとも１個の炭素－炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖単価炭化水素部分をいう。アルキニル基は、所望により１以上の炭素炭素二重結合を有し得る。一般に、アルキニル基における炭素－炭素三重結合の最大数は２における炭素原子数を２で割ることにより計算された整数に等しく、アルキニル基の炭素原子数が奇数であるならば、分数の結果を、次の整数に切り捨てる。例えば、９個の炭素原子を有するアルキニル基について、炭素－炭素三重結合の最大数は４である。好ましくは、アルキニル基は、１～６(例えば１～４)、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個または６個、より好ましくは１個または２個の炭素－炭素三重結合を有する。
用語「アルケニレン」は、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を有する、不飽和直鎖または分岐鎖炭化水素のジラジカルをいう。一般に、アルケニレン基における炭素－炭素二重結合の最大数は２における炭素原子数を２で割ることにより計算された整数に等しく、アルケニレン基の炭素原子数が奇数であるならば、分数の結果を、次の整数に切り捨てる。例えば、９個の炭素原子を有するアルケニレン基について、炭素－炭素二重結合の最大数は４である。好ましくは、アルケニレン基は、１～６(例えば１～４)個、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素－炭素二重結合を有する。好ましくは、アルケニレン基は、２～１２(例えば２～１０)個の炭素原子、すなわち、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の炭素原子(例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子)、より好ましくは２～８個の炭素原子、例えば２～６個の炭素原子または２～４個の炭素原子を含む。故に、好ましい実施態様において、アルケニレン基は２～１２(例えば２～１０個の炭素)原子および１、２、３、４、５または６(例えば１、２、３、４または５)個の炭素－炭素二重結合を含み、より好ましくは２～８個の炭素原子および１個、２個、３個または４個の炭素－炭素二重結合、例えば２～６個の炭素原子および１個、２個または３個の炭素－炭素二重結合または２～４個の炭素原子および１個または２個の炭素－炭素二重結合を含む。炭素－炭素二重結合はｃｉｓ(Ｚ)またはｔｒａｎｓ(Ｅ)配置であり得る。アルケニレン基の例は、エテン－１,２－ジイル、ビニリデン(別名エテニリデン)、１－プロペン－１,２－ジイル、１－プロペン－１,３－ジイル、１－プロペン－２,３－ジイル、アリリデン、１－ブテン－１,２－ジイル、１－ブテン－１,３－ジイル、１－ブテン－１,４－ジイル、１－ブテン－２,３－ジイル、１－ブテン－２,４－ジイル、１－ブテン－３,４－ジイル、２－ブテン－１,２－ジイル、２－ブテン－１,３－ジイル、２－ブテン－１,４－ジイル、２－ブテン－２,３－ジイル、２－ブテン－２,４－ジイル、２－ブテン－３,４－ジイルなどを含む。アルケニレン基が窒素原子に結合しているならば、二重結合は窒素原子に対してアルファではあり得ない。「置換アルケニレン」アルケニレン基の水素原子の１以上(例えば１からアルケニレン基に結合した水素原子の最大数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０、例えば１～５、１～４または１～３または１または２)が、水素以外の置換基に置き換えられていることを意味する(１を超える水素原子が置き換えられるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基はここに特定する第一レベル置換基である。
用語「シクロアルキル」は、「アルキル」および「アルケニル」の環状非芳香族バージョンをいい、好ましくは３～１４個の炭素原子、例えば３～１２個または３～１０個の炭素原子、すなわち、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個または１４個の炭素原子(例えば３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子)、より好ましくは３～７個の炭素原子。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロプロペニル、シクロブチル、シクロブテニル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、シクロノニル、シクロノネニル、シクロデシル、シクロデセニルおよびアダマンチルを含む。シクロアルキル基は、一環(単環式)、二環(二環式)または二を超える環(多環式)からなり得る。
用語「シクロアルキレン」は「アルキレン」の環状非芳香族バージョンをいい、ジェミナル、ビシナルまたは孤立ジラジカルである。ある実施態様において、シクロアルキレンは(ｉ)単環式または多環式(例えば二または三環式)および／または(ii)３～１４員(すなわち、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員または１４員、例えば３～１２員または３～１０員)である。ある実施態様において、シクロアルキレンは単環、二環または三環式３～１４員(すなわち、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員または１４員、例えば３～１２員または３～１０員)シクロアルキレンである。一般に、シクロアルキレン部分について、上記のように末尾「イレン」を使用する代わりに、末尾「ジイル」も使用してよい(例えば、１,２－シクロプロピレンはシクロプロパン－１,２－ジイルとも称し得る)。シクロアルキレン基の例は、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロオクチレン、ビシクロ[３.２.１]オクチレン、ビシクロ[３.２.２]ノニレンおよびアダマンタニレン(例えば、トリシクロ[３.３.１.１３,７]デカン－２,２－ジイル)を含む。「置換シクロアルキレン」は、アルキレン基の水素原子の１以上(例えば１からシクロアルキレン基に結合した水素原子の最大数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０、例えば１～５、１～４または１～３または１または２)が、水素以外の置換基に置き換えられていることを意味する(１を超える水素原子が置き換えられるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基はここに特定する第一レベル置換基である。
用語「シクロアルケニレン」は「アルケニレン」の環状非芳香族バージョンをいい、ジェミナル、ビシナルまたは孤立ジラジカルである。一般に、シクロアルケニレン基における炭素－炭素二重結合の最大数は２における炭素原子数を２で割ることにより計算された整数に等しく、シクロアルケニレン基の炭素原子数が奇数であるならば、分数の結果を、次の整数に切り捨てる。例えば、９個の炭素原子を有するシクロアルケニレン基について、炭素－炭素二重結合の最大数は４である。好ましくは、シクロアルケニレン基は１～６(例えば１～４)個、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素－炭素二重結合を有する。ある実施態様において、シクロアルケニレンは(ｉ)単環式または多環式(例えば二または三環式)および／または(ii)３～１４員(すなわち、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員または１４員、例えば３～１２員または３～１０員)である。ある実施態様において、シクロアルケニレンは単環、二環または三環式３～１４員(すなわち、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員または１４員、例えば３～１２員または３～１０員)シクロアルケニレンである。シクロアルケニレン基の例は、シクロヘキセニレン、シクロヘプテニレン、シクロプロペニレン、シクロブテニレン、シクロペンテニレンおよびシクロオクテニレンを含む。「置換シクロアルケニレン」は、シクロアルケニレン基の水素原子の１以上(例えば１からシクロアルケニレン基に結合した水素原子の最大数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０、例えば１～５、１～４または１～３または１または２)が、水素以外の置換基に置き換えられていることを意味する(１を超える水素原子が置き換えられるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基はここに特定する第一レベル置換基である。
用語「アリール」は、芳香族環状炭化水素のモノラジカルをいう。好ましくは、アリール基は、一環(例えば、フェニル)または２以上の縮合環(例えば、ナフチル)で配置され得る３～１４(例えば、５、６、７、８、９または１０、例えば５、６または１０)個の炭素原子を含む。アリール基の例は、シクロプロペニリウム、シクロペンタジエニル、フェニル、インデニル、ナフチル、アズレニル、フルオレニル、アントリルおよびフェナントリルを含む。好ましくは、「アリール」は、６個の炭素原子を含む単環式環または１０個の炭素原子を含む芳香族二環式環系をいう。好ましい例はフェニルおよびナフチルである。アリールはフラーレンを含まない。
用語「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環式環」は、シクロアルキル基における１、２、３または４環炭素原子は好ましくは酸素、窒素、ケイ素、セレン、リンおよび硫黄からなる群から、より好ましくはＯ、ＳおよびＮからなる群から選択されるヘテロ原子で置き換えられている、上に定義した非芳香族シクロアルキル基をいう。ヘテロシクリル基は、
好ましくは１または２環は、３～１０個、例えば３個、４個、５個、６または７個の環原子を含む。好ましくは、ヘテロシクリル基の各環において、Ｏ原子の最大数は１であり、Ｓ原子の最大数は１であり、ＯおよびＳ原子の最大総数は２である。ヘテロシクリル基の例は、モルホリニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル(別名ピペリジル)、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、１,３,５－トリアジナニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジ－およびテトラヒドロフラニル、ジ－およびテトラヒドロチエニル、ジ－およびテトラヒドロピラニル、ウロトロピニル、ラクトン、ラクタム、環状イミドおよび環状無水物を含む。「置換ヘテロシクリル」は、ヘテロシクリル基の水素原子の１以上(例えば１からヘテロシクリル基に結合した水素原子の最大数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０、例えば１～５、１～４または１～３または１または２)が、水素以外の置換基に置き換えられていることを意味する(１を超える水素原子が置き換えられるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基はここに特定する第一レベル置換基である。
用語「Ｎ－ヘテロ環式環」は、ヘテロ環式環は少なくとも１個のＮ環原子を含み、１以上のさらなる環ヘテロ原子(好ましくは酸素、窒素、ケイ素、セレン、リンおよび硫黄からなる群から、より好ましくはＯ、ＳおよびＮからなる群から選択される)を含んでよい、上に定義したヘテロ環式環をいう。Ｎ－ヘテロ環式環の例は、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、１,３,５－トリアジナニル、モルホリニルおよびチオモルホリニル、好ましくはピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、モルホリニルおよびチオモルホリニルを含む。「置換Ｎ－ヘテロ環式環」は、Ｎ－ヘテロ環式環の水素原子の１以上(例えば１からＮ－ヘテロ環式環に結合した水素原子の最大数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０、例えば１～５、１～４または１～３または１または２)が、水素以外の置換基に置き換えられていることを意味する(１を超える水素原子が置き換えられるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基はここに特定する第一レベル置換基である。
炭化水素に関連してする用語「芳香族」は、分子全体が芳香族でなければならないことを意味する。例えば、単環式アリールが水素化されているならば(部分的にまたは完全に)、得られた水素化環状構造は、本発明の目的で、シクロアルキルとして分類される。同様に、二または多環式アリール(例えばナフチル)が水素化されているならば、得られた水素化二または多環式構造(例えば１,２－ジヒドロナフチル)は、本発明の目的でシクロアルキルとして分類される(１,２－ジヒドロナフチルにおけるように、一環はなお芳香族であっても)。本出願の範囲内で、ヘテロアリール(すなわち、アリール基における１以上の炭素原子はヘテロ原子に置き換えられているアリール基)とヘテロシクリルは区別される。例えば、インドリニル、すなわち、インドリルのジヒドロバリアントは、二環式構造の１環のみが芳香族であり、環原子の１個がヘテロ原子であるため、本発明の目的でヘテロシクリルとして分類される。
典型的第一レベル置換基は、好ましくはＣ１－３アルキル、フェニル、ハロゲン、－ＣＦ３、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＳＣＨ３、－ＮＨ２－ｚ(ＣＨ３)ｚ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＨおよび－Ｃ(＝Ｏ)ＯＣＨ３からなる群から選択され、ここで、ｚは０、１または２であり、Ｃ１－３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルである。特に好ましい第一レベル置換基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ハロゲン(例えばＦ、ＣｌまたはＢｒ)および－ＣＦ３、例えばハロゲン(例えば、Ｆ、ＣｌまたはＢｒ)および－ＣＦ３からなる群から選択される。
式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)に関して、表現「Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＨ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３である」は、Ｈ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３の各々は同時に１個のみＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)のＮ原子に結合できることを意味する。例えば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１個がＨであるならば、他の２個はＨであってはならない(すなわち、他の２個はＨ以外でなければならない)。同様に、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１個がＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２であるならば、他の２個はＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２であってはならない(すなわち、他の２個はＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２以外でなければならない)。また、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１個がＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であるならば、他の２個はＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であってはならない(すなわち、他の２個はＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３以外でなければならない)。好ましくは、この表現は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１個のみがＨ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であってよく、他の２個はＨ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２、Ｃ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であってはならないことを意味する(例えば、他の２個は独立してＣ１－６アルキルであるかまたは窒素原子と一体となって、所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成する)。
凍結組成物に関連してここで使用する表現「凍結組成物解凍後」は、凍結組成物が、特徴(例えば組成物に含まれる粒子(例えばＬＮＰ)のＲＮＡ完全性および／またはサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)が測定され得る前に解凍されなければならないことを意味する。
「単価」化合物は、目的の官能基１個のみを有する化合物に関する。例えば、単価アニオンは、好ましくは生理学的条件下、負荷電基１個のみを有する化合物に関する。
「二価」または「二塩基性」化合物は、２個の目的の官能基を有する化合物に関する。例えば、二塩基性有機酸は、２個の酸基を有する。
「多価」または「多塩基性」化合物は、３個以上の目的の官能基を有する化合物に関する。例えば、多塩基性有機酸は、３個以上の酸基を有する。
ここで使用する表現「Ｘを実質的に含まない」は、混合物(例えばここに記載する組成物または製剤の水相)は、実質的におよび現実的に実行可能である方法で、Ｘを含まないことを意味する。例えば、混合物がＸを実質的に含まないならば、混合物中のＸの量は、混合物の総重量に基づき、１重量％未満(例えば、０.５未満重量％、０.４未満重量％、０.３未満重量％、０.２未満重量％、０.１未満重量％、０.０９未満重量％、０.０８未満重量％、０.０７未満重量％、０.０６未満重量％、０.０５未満重量％、０.０４未満重量％、０.０３未満重量％、０.０２未満重量％、０.０１未満重量％、０.００５未満重量％、０.００１未満重量％)であり得る。
表現「クエン酸アニオン」は、クエン酸アニオンを含み、水性媒体に溶解したとき、クエン酸アニオンを遊離するあらゆる化合物を意味する。クエン酸アニオンを含み、水性媒体に溶解したときクエン酸アニオンを遊離する化合物の例は、クエン酸およびクエン酸の塩を含む。
ここで使用する表現「ＥＤＴＡのアニオン」は、ＥＤＴＡのアニオンを含み、水性媒体に溶解したとき、ＥＤＴＡのアニオンを遊離するあらゆる化合物を意味する。ＥＤＴＡのアニオンを含み、水性媒体に溶解したときアニオンを遊離する化合物の例は、、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)およびＥＤＴＡの塩を含む。
ここで使用する表現「二塩基性有機酸アニオン」は、遊離形態(すなわち、プロトン化)、無水物形態または塩形態である、２個の酸基を含むあらゆる有機化合物を意味する。これに関して、用語「酸基」は、カルボン酸または硫酸基をいう。好ましくは、表現「二塩基性有機酸」は、カルボン酸または硫酸基と１以上の有機アルコールのエステルをｈ鵜熊内。二塩基性有機酸の例は、シュウ酸、リンゴ酸および酒石酸を含む。
ここで使用する表現「多塩基性有機酸アニオン」は、遊離形態(すなわち、プロトン化)、無水物形態または塩形態である、３個以上の基を含むあらゆる有機化合物を意味する。これに関して、用語「酸基」は、カルボン酸または硫酸基をいう。好ましくは、表現「多塩基性有機酸」は、カルボン酸または硫酸基と１以上の有機アルコールのエステルを含まない。多塩基性有機酸の一例は、クエン酸を含む。
表現「ＲＮＡ完全性」は、サンプルに含まれるＲＮＡの総量(すなわち、非断片化＋断片化ＲＮＡ)に対する完全長(すなわち、非断片化)ＲＮＡのパーセンテージを意味する。ＲＮＡ完全性は、ＲＮＡをクロマトグラフィーにより分離し(例えば、使用キャピラリー電気泳動)、主ＲＮＡピークのピーク面積(すなわち、完全長(すなわち、非断片化)ＲＮＡのピーク面積)を決定し、総ＲＮＡのピーク面積を決定し、主ＲＮＡピークのピーク面積を総ＲＮＡのピーク面積で除すことにより決定され得る。
用語「抗凍結剤」は、凍結段階中の調製物の活性成分を保護するために、調製物(例えば、製剤または組成物)に添加する物質に関する。
用語「凍結乾燥保護剤」は、乾燥段階中の活性成分を保護するために、製剤に添加する物質に関する。
本発明によると、用語「ペプチド」はオリゴおよびポリペプチドを含み、互いにペプチド結合により連結した約２以上、約３以上、約４以上、約６以上、約８以上、約１０以上、約１３以上、約１６以上、約２０以上および最大約５０、約１００または約１５０の連続アミノ酸を含む物質をいう。用語「ポリペプチド」は、大型ペプチド、特に少なくとも約１５１アミノ酸を有するペプチドをいう。「ペプチド」および「ポリペプチド」はいずれもタンパク質分子であるが、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」はここでは通常同義語として使用する。
「治療タンパク質」は、治療有効量で対象に提供したとき、対象の状態または疾患状態に良いまたは有利な効果をもたらす。ある実施態様において、治療タンパク質は、治癒的または緩和的性質を有し、疾患または障害の１以上の症状の改善、緩和、軽減、逆転、発症遅延または重症度低減のために投与し得る。治療タンパク質は予防的性質を有し得て、疾患発症遅延またはそのような疾患または病態の重症度低減のために使用され得る。用語「治療タンパク質」はタンパク質またはペプチド全体を含み、その治療活性フラグメントをいい得る。タンパク質の治療活性バリアントも含み得る。治療活性タンパク質の例は、ワクチン接種用抗原およびサイトカインなどの免疫刺激剤を含むが、これらに限定されない。
本発明の種々の実施態様によると、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)などの核酸は細胞に取り込まれまたは導入され、すなわちトランスフェクトまたは形質導入され、その細胞はインビトロまたは対象中に存在し得て、該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現をもたらす。細胞は、コード化ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を細胞内に(例えば細胞質および／または核に)発現でき、コード化ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を分泌できおよび／または表面に発現できる。
本発明によると、「発現する核酸」および「コードする核酸」などの用語または類似の用語はここでは相互交換可能に使用され、特定のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関して、核酸は、好ましくは細胞内の、適切な環境に存在するならば、該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を産生するよう発現され得ることを意味する。
用語「部分」はフラグメントをいう。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造に関して、その「部分」なる用語は、該構造の連続的または不連続的フラグメントをいい得る。
用語「一部」および「フラグメント」は、ここでは相互交換可能に使用され、連続的要素をいう。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質などの構造の一部は、該構造の連続的要素をいう。組成物の状況で使用するとき、用語「一部」は、組成物の部分を意味する。例えば、組成物の一部は、該組成物の０.１％～９９.９％(例えば０.１％、０.５％、１％、５％、１０％、５０％、９０％または９９％)のあらゆる部分であり得る。
アミノ酸配列(ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質)に関する「フラグメント」は、アミノ酸配列の一部に関し、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮されたフラグメント(Ｎ末端フラグメント)は、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠く短縮オープンリーディングフレームの翻訳により得られ得る。Ｎ末端で短縮されたフラグメント(Ｃ末端フラグメント)は、例えば、短縮オープンリーディングフレームは翻訳開始を司る開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠く短縮オープンリーディングフレームの翻訳により得られ得る。アミノ酸配列のフラグメントは、例えば、アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列のフラグメントは、好ましくはアミノ酸配列からの少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０または少なくとも１００連続アミノ酸を含む。アミノ酸配列のフラグメントは、例えば、アミノ酸配列の最大８、特に最大１０、最大１２、最大１５、最大２０、最大３０または最大５５連続アミノ酸の配列を含む。
本発明によると、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の一部またはフラグメントは、好ましくはそれが由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも１個の機能的性質を有する。このような機能的性質は、薬理学的活性、他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との相互作用、酵素活性、抗体との相互作用および核酸の選択的結合を含む。例えば、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の薬理学的活性フラグメントは、フラグメントは由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の薬理学的活性の少なくとも１個を有する。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の一部またはフラグメントは、好ましくはペプチドまたはタンパク質の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０連続アミノ酸の配列を含む。ペプチドまたはタンパク質の一部またはフラグメントは、好ましくはペプチドまたはタンパク質の最大８、特に最大１０、最大１２、最大１５、最大２０、最大３０または最大５５連続アミノ酸の配列を含む。
ここで使用し、アミノ酸配列(ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質)に関する「バリアント」は、少なくとも１個のアミノ酸により親アミノ酸配列と異なる(例えば、異なるアミノ酸または同じアミノ酸の修飾)アミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は天然に存在するかまたは野生型(ＷＴ)アミノ酸配列であってよく、または野生型アミノ酸配列の修飾バージョンであってよい。ある実施態様において、バリアントアミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１個のアミノ酸差異、例えば、１～約２０アミノ酸差異および好ましくは親と比較して１～約１０または１～約５アミノ酸差異を有する。
ここでの「野生型」または「ＷＴ」または「天然」は、アレル変異を含み、天然に見られるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列を有する。
本発明の目的で、アミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび／またはアミノ酸置換バリアントを含む。用語「バリアント」は、全変異体、スプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体構造、アイソフォーム、アレル変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。用語「バリアント」は、特に、アミノ酸配列のフラグメントを含む。
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列への１または２以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１以上のアミノ酸残基はアミノ酸配列における特定の部位に挿入されるが、ランダム挿入と得られた生成物の適切なスクリーニングも可能である。アミノ酸付加バリアントは、１以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上アミノ酸のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失バリアントは、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上アミノ酸の除去などの、配列からの１以上のアミノ酸の除去により特徴づけられる。欠失は、タンパク質のどの位置でもよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端および／またはＣ末端短縮化バリアントとも称される。アミノ酸置換バリアントは、配列における少なくとも１個の残基は除去され、その場所に他の残基は挿入されることにより特徴づけられる。相同タンパク質またはペプチドで保存されていないアミノ酸配列の位置の修飾および／またはアミノ酸の類似の性質を有する他の者への置換が好ましい。ある実施態様において、ペプチドおよびタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電または非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖は関連するアミノ酸のファミリーの一つの置換である。天然に存在するアミノ酸は、一般に４ファミリーに分けられる：酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リシン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)および非荷電極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、まとめて芳香族アミノ酸に分類されることもある。ある実施態様において、保存的アミノ酸置換は、次の群内の置換を含む：
－ グリシン、アラニン；
－ バリン、イソロイシン、ロイシン；
－ アスパラギン酸、グルタミン酸；
－ アスパラギン、グルタミン；
－ セリン、スレオニン；
－ リシン、アルギニン；および
－ フェニルアラニン、チロシン。
ある実施態様において、あるアミノ酸配列と該あるアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列の間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域に対して示される。例えば、参照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなるならば、類似性または同一性の程度は、好ましくは、ある実施態様において、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００アミノ酸連続的アミノ酸に対して示される。ある実施態様において、類似性または同一性の程度は参照アミノ酸配列の全長に対して示される。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当分野で知られるツールを使用し、好ましくは最良配列アラインメントを使用し、例えば、Alignを使用し、標準設定、好ましくはEMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5を使用して実施できる。
「配列類似性」は、同一または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２アミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。
用語「％同一」および「％同一性」または類似の用語は、特に、比較する配列間で最適アラインメントで同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージをいう。該パーセンテージは純粋に統計であり、２配列間の差異は、必ずしもではないが、比較する配列の全長にわたり無作為に分布していてよい。２配列の比較は、通常対応する配列の局所領域を同定するために、最適アラインメント後、セグメントまたは「比較の窓」に関して配列を比較することにより、実施する。比較のための最適アラインメントは手動でまたはSmith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482による局所相同性アルゴリズムの助けを借りて、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443による局所相同性アルゴリズムの助けを借りて、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444による類似性検索アルゴリズムの助けをかりてまたは該アルゴリズムを使用するコンピュータプログラム(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ)の助けを借りて、実施し得る。ある実施態様において、２配列のパーセント同一性は、United States National Center for Biotechnology Information (NCBI)ウェブサイト(例えば、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seqで利用可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して、実施できる。ある実施態様において、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムで使用するアルゴリズムパラメータは、(ｉ)期待閾値設定１０；(ii)文字サイズ設定２８；(iii)クエリー範囲の最大マッチ設定０；(iv)マッチ／ミスマッチスコア設定１、－２；(ｖ)ギャップコスト設定直線；および(vi)低複雑度領域のフィルター使用を含む。ある実施態様において、ＮＣＢＩウェブサイトでＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで使用するアルゴリズムパラメータは、(ｉ)期待閾値設定１０；(ii)文字サイズ設定３；(iii)クエリー範囲の最大マッチ設定０；(iv)マトリックス設定ＢＬＯＳＵＭ６２；(ｖ)ギャップコスト設定存在：１１拡張：１；および(vi)条件的組成スコアマトリクス調整を使用する。
パーセンテージ同一性は、比較配列は対応する同一位置の数を決定し、該数値を比較する位置の数(例えば、参照配列における位置の数)で除し、この結果を１００倍することにより得る。
ある実施態様において、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域に対して示す。例えば、参照核酸配列は２００ヌクレオチドからなるとき、同一性の程度は、ある実施態様において、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００ヌクレオチド連続的ヌクレオチドに対して示される。ある実施態様において、類似性または同一性の程度は参照配列の全長に対して示される。
相同アミノ酸配列は、本開示によると、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８または少なくとも９９％同一性を示す。
ここに記載するアミノ酸配列バリアントは、当業者により、例えば、組み換えＤＮＡ操作により容易に製造され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を製造するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Sambrook et al. (1989)に詳述される。さらに、ここに記載するペプチドおよびアミノ酸バリアントは、例えば、固相合成および類似の方法によるなどの、既知ペプチド合成技術の助けを借りて、容易に製造できる。
ある実施態様において、アミノ酸配列(ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質)のフラグメントまたはバリアントは、好ましくは「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」である。アミノ酸配列の「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」なる用語は、由来するアミノ酸配列と同一または類似の１以上の機能的性質を示すあらゆるフラグメントまたはバリアントをいい、すなわち、機能的に等価である。抗原または抗原性配列について、ある特定の機能は、フラグメントまたはバリアントは由来するアミノ酸配列により示される１以上の免疫原性活性である。ここで使用する用語「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」は、特に親分子または配列のアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸は改変されたアミノ酸配列を含みかつ親分子または配列の機能の１以上、例えば、免疫応答の誘導を果たすことができる、バリアント分子または配列をいう。ある実施態様において、親分子または配列のアミノ酸配列における修飾は、分子または配列の特徴に顕著に影響しないまたは改変しない。異なる実施態様において、機能的フラグメントまたは機能的バリアントの機能は減少されていてよいが、なお顕著に存在し、例えば、機能的バリアントの免疫原性は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施態様において、機能的フラグメントまたは機能的バリアントの免疫原性は、親分子または配列と比較して増強され得る。
指定アミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)に「由来する」アミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)は、第一アミノ酸配列の起源をいう。ある実施態様において、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、特定の配列またはそのフラグメントと同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはそのフラグメントのバリアントであり得る。例えば、ここでの使用に適する抗原は、由来する天然に存在するまたは天然配列から配列は異なるように改変されていてよいが、なお天然配列の望ましい活性を保持することは当業者には理解される。
ある実施態様において、「単離」は、天然状態または製造工程からの組成物などの人工組成物から改変または除去(例えば、精製)されていることを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離されている同じ核酸またはペプチドは「単離」されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在できまたは例えば、宿主細胞など非天然環境で存在できる。ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は実質的に精製された形態である。ある実施態様において、実質的に精製された形態のＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)の溶液(好ましくは水溶液)は第一緩衝系を含む。
用語「遺伝子修飾」または単に「修飾」は、核酸での細胞のトランスフェクションを含む。用語「トランスフェクション」は、細胞への核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本発明の目的で、用語「トランスフェクション」はまた細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みも含み、ここで、細胞は対象、例えば、患者内に存在し得る。故に、本発明によると、ここに記載する核酸のトランスフェクションのための細胞はインビトロまたはインビボで存在し得て、例えば細胞は患者の臓器、組織および／または生物の一部を形成し得る。本開示によると、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのある適用について、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されるならば、十分である。ＲＮＡはそのコード化タンパク質を一過性に発現するために、細胞にトランスフェクトされ得る。トランスフェクション過程で導入された核酸は通常核ゲノムに統合されないため、外来核酸は有糸分裂を通して希釈されるかまたは分解する。核酸のエピソーム増幅は可能な細胞の希釈率は大きく減少する。トランスフェクトされた核酸は実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望まれるならば、安定なトランスフェクションは起こらなければならない。このような安定なトランスフェクションは、トランスフェクションのためのウイルスベースの系またはトランスポゾンベースの系の使用により達成できる。一般に、抗原をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。ＲＮＡを、そのコード化タンパク質を一過性に発現するために細胞にトランスフェクトし得る。
本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアナログを含む。本発明によると、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアナログは、それは由来している該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾携帯であり、該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の機能的性質の少なくとも１個を有する。例えば、薬理学的活性ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアナログは、アナログは由来しているペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の薬理学的活性の少なくとも１個を有する。このような修飾はあらゆる化学修飾を含み、炭水化物、脂質および／またはタンパク質またはペプチドなどのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドと関連するあらゆる分子の単一または複数置換、欠失および／または付加を含む。ある実施態様において、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「アナログ」は、グルコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護／遮断基の導入、タンパク分解的切断または抗体もしくは他の細胞リガンドへの結合に起因する修飾形態を含む。用語「アナログ」はまた該タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの全機能的化学等価物まで拡大される。
ここで使用する「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖の誘導のために十分に刺激されている、細胞(例えば、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞)の状態をいう。活性化はまたシグナル伝達経路開始、サイトカイン産生誘導および検出可能なエフェクター機能とも関連し得る。用語「活性化免疫エフェクター細胞」は、とりわけ、細胞分裂を受けている免疫エフェクター細胞をいう。
用語「プライミング」は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞はその特異的抗原と初めて接触し、エフェクターＴ細胞などのエフェクター細胞エフェクターＴ細胞などのエフェクター細胞への分化を引き起こす過程をいう。
用語「クローン拡大」または「拡大」は、特異的エンティティは増加する過程をいう。ある実施態様において、本用語は、好ましくは免疫エフェクター細胞が抗原により刺激され、増殖し、該抗原を認識する特異的免疫エフェクター細胞が増幅する免疫学的応答の状況において使用される。ある実施態様において、拡大は免疫エフェクター細胞の分化に至る。
本発明による「抗原」は、免疫応答を誘導するあらゆる物質および／または細胞応答などの免疫応答または免疫機構は標的とするあらゆる物質を包含する。これはまた、抗原は抗原ペプチドにプロセシングされ、免疫応答または免疫機構は、特にＭＨＣ分子により提示されているならば、１以上の抗原ペプチドを標的とする状況も含む。特に、「抗原」は抗体またはＴリンパ球(Ｔ細胞)と特異的に反応するあらゆる物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質に関する。本発明によると、用語「抗原」は、Ｔ細胞エピトープなどの少なくとも１個のエピトープを含むあらゆる分子を含む。好ましくは、本発明の状況における抗原は、所望によりプロセシング後、好ましくは抗原(抗原を発現する細胞を含む)特異的である、免疫反応を誘導する分子である。ある実施態様において、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原または細菌抗原などの疾患関連抗原またはそのような抗原由来のエピトープである。
本発明によると、免疫応答のための候補であるあらゆる適当な抗原が使用され得て、ここで、免疫応答は液性または細胞免疫応答または両方であり得る。本発明のある実施態様の状況において、抗原は、ＭＨＣ分子の状況で細胞、好ましくは抗原提示細胞により提示され、これは抗原に対する免疫応答をもたらす。抗原は、天然に存在する抗原に対応するまたはそれ由来の生成物であり得る。このような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫および他の感染因子および病原体を含み得るかまたはそれに由来し得るかまたは抗原はまた腫瘍抗原であり得る。本発明によると、抗原は、天然に存在する生成物、例えば、ウイルスタンパク質またはその一部に対応し得る。
用語「疾患関連抗原」は、その最も広い意味で使用し、疾患と関連するあらゆる抗原をいう。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して、該疾患に対する細胞抗原特異的免疫応答および／または液性抗体応答を行うエピトープを含む分子である。疾患関連抗原は病原体関連抗原、すなわち、微生物による感染に関連する抗原、典型的に微生物抗原(例えば細菌またはウイルス抗原)または腫瘍抗原などの癌、典型的に腫瘍に関連する抗原を含む。
ある実施態様において、抗原は腫瘍抗原、すなわち、腫瘍細胞の一部、特に主に細胞内にまたは腫瘍細胞の表面抗原として生ずるものである。他の実施態様において、抗原は病原体関連抗原、すなわち、病原体、例えば、ウイルス、細菌、単細胞生物または寄生虫由来の抗原、例えばウイルスリボ核タンパク質またはコートタンパク質などのウイルス抗原である。特に、抗原はＭＨＣ分子により提示されるべきであり、これは、特に、Ｔ細胞受容体の活性の調節を介して、免疫系の細胞、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の調節、特に活性化をもたらす。
用語「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」は、細胞質、細胞表面または細胞核に由来し得る癌細胞の構成要素をいう。特に、細胞内でまたは腫瘍細胞の表面抗原として産生される抗原をいう。例えば、腫瘍抗原は、癌胎児性抗原、α１－フェトプロテイン、イソフェリチンおよび胎児スルホ糖タンパク質、α２－Ｈ－鉄蛋白およびγ－フェトプロテインならびに種々のウイルス腫瘍抗原を含む。本発明のある実施態様によると、腫瘍抗原はタイプおよび／または発現レベルに関して腫瘍または癌ならびに腫瘍または癌細胞に特徴的であるあらゆる抗原を含む
用語「ウイルス抗原」は、抗原性性質を有する、すなわち、個体において免疫応答を誘発できるあらゆるウイルス成分をいう。ウイルス抗原はウイルスリボ核タンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。
用語「細菌抗原」は、抗原性性質を有する、すなわち、個体において免疫応答を誘発できるあらゆる細菌成分をいう。細菌抗原は細菌の細胞壁または細胞質膜に由来し得る。
用語「エピトープ」は、抗原などの分子の抗原性決定基、すなわち、特に、ＭＨＣ分子により提示されたとき、免疫系により認識される、例えば、抗体Ｔ細胞またはＢ細胞により認識される分子の一部またはフラグメントをいう。タンパク質のエピトープは、該タンパク質の連続的または不連続的部分を含み得て、例えば、約５～約１００、約５～約５０、約８～約０、約１０～約２５アミノ酸長であってよく、例えば、エピトープは好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であり得る。ある実施態様において、本発明の状況におけるエピトープはＴ細胞エピトープである。
「エピトープ」、「抗原のフラグメント」、「免疫原性ペプチド」および「抗原ペプチド」などの用語は、ここでは相互交換可能に使用され、例えば、抗原または抗原を発現するかまたは含みかつ提示する細胞に対する、例えば、免疫応答を誘発できる、抗原の不完全な表現に関連し得る。ある実施態様において、本用語は、抗原の免疫原性部分に関する。好ましくは、特にＭＨＣ分子により提示されるとき、Ｔ細胞受容体により認識(すなわち、特異的に結合)される抗原の部分である。ある好ましい免疫原性部分はＭＨＣクラスＩまたはクラスII分子に結合する。用語「エピトープ」は、免疫系により認識される、抗原などの分子の一部またはのフラグメントをいう。例えば、エピトープはＴ細胞、Ｂ細胞または抗体により認識され得る。抗原のエピトープは抗原の連続的または不連続的部分を含み得て、約５～約１００、例えば約５～約５０、より好ましくは約８～約３０、最も好ましくは約８～約２５アミノ酸長であってよく、例えば、エピトープは好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であってよい。ある実施態様において、エピトープは約１０～約２５アミノ酸長である。用語「エピトープ」はＴ細胞エピトープを含む。
用語「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子により提示されたとき、Ｔ細胞により認識されるタンパク質の一部またはフラグメントをいう。用語「主要組織適合性複合体」および略称「ＭＨＣ」はＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスII分子を含み、全脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または罹患細胞の間のシグナル伝達に重要であり、ここで、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープと結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれを提示する。ＭＨＣによりコードされるタンパク質は細胞表面に発現され、自己抗原(細胞自体からのペプチドフラグメント)および非自己抗原(例えば、侵襲微生物のフラグメント)の両方をＴ細胞に示す。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは典型的に約８～約１０アミノ酸長であるが、より長いまたは短いペプチドは有効であり得る。クラスII ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは典型的に約１０～約２５アミノ酸長、特に約１３～約１８アミノ酸長であり、一方より長いおよび短いペプチドは有効であり得る。
ペプチドおよびタンパク質抗原は、例えば、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸または５０アミノ酸長を含み、２～１００アミノ酸であり得る。ある実施態様において、ペプチドは５０アミノ酸より大きくてよい。ある実施態様において、ペプチドは１００アミノ酸より大きくてよい。
ペプチドまたはタンパク質抗原は、免疫系は該ペプチドまたはタンパク質に対する抗体およびＴ細胞応答を進展する能力を誘導または増加できる、あらゆるペプチドまたはタンパク質をいう。
ある実施態様において、ワクチン抗原、すなわち、対象への接種は免疫応答を誘導する抗原は、免疫エフェクター細胞により認識される。ある実施態様において、ワクチン抗原は、免疫エフェクター細胞により認識されるならば、ワクチン抗原を認識する抗原受容体を担持する免疫エフェクター細胞の適切な共刺激シグナル、刺激、プライミングおよび／または拡大存在下に誘導されることができる。本発明の実施態様の状況において、ワクチン抗原は好ましくは細胞、好ましくは抗原提示細胞表面に提示されるかまたは存在する。ある実施態様において、抗原は罹患細胞(例えば腫瘍細胞または感染細胞)により提示される。ある実施態様において、抗原受容体は、ＭＨＣにより提示される抗原のエピトープに結合するＴＣＲである。ある実施態様において、ＴＣＲの結合は、抗原提示細胞などの細胞により提示される抗原に対してＴ細胞により発現されおよび／またはＴ細胞に存在するとき、該Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。ある実施態様において、ＴＣＲの結合は、罹患細胞に提示される抗原に対してＴ細胞により発現されおよび／またはＴ細胞に存在するとき、罹患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらし、ここで、該Ｔ細胞は、好ましくは細胞毒性因子、例えば、パーフォリンおよびグランザイムを遊離する。
ある実施態様において、抗原受容体は、抗原のエピトープに結合する抗体またはＢ細胞受容体である。ある実施態様において、抗体またはＢ細胞受容体は、抗原の天然エピトープに結合する。
用語「細胞表面に発現」または「細胞表面と結合」は、抗原などの分子は細胞の原形質膜と結合し、そこに位置することを意味し、ここで、分子の少なくとも一部は、該細胞の細胞外空間に面し、例えば、細胞の外に位置する抗体により、該細胞の外側からアクセス可能である。この状況で、一部は、例えば、少なくとも４、少なくとも８、少なくとも１２または少なくとも２０アミノ酸であり得る。結合は直接でも間接でもよい。例えば、結合は１以上の膜貫通ドメイン、１以上の脂質アンカーによるものであるかまたは任意の他のタンパク質、脂質、糖または細胞の原形質膜の外葉に見られ得る他の構造との相互作用によるものであり得る。例えば、細胞の表面と結合する分子は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であってよくまたは膜貫通タンパク質である他のタンパク質との相互作用により細胞の表面と結合するタンパク質であってよい。
「細胞表面」または「細胞の表面」は、当分野におけるその通常の意味に従い使用し、故に、タンパク質および他の分子による結合に対してアクセス可能である細胞の外側を含む。抗原は、該細胞の表面に位置するならば、細胞の表面に発現され、例えば、細胞に添加された抗原特異的抗体による結合に対してアクセス可能である。ある実施態様において、細胞の表面に発現される抗原は、ＣＡＲにより認識され得る細胞外部分を有する必須膜タンパク質である。
本発明の状況における用語「細胞外部分」または「エキソドメイン」は、細胞の細胞外空間に面し、好ましくは、例えば、細胞の外側に位置する抗体などの分子の結合により、該細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質などの分子の一部である。ある実施態様において、本用語は、１以上の細胞外ループまたはドメインまたはそのフラグメントをいう。
用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」は、ここでは相互交換可能に使用され、Ｔヘルパー細胞(ＣＤ４＋ Ｔ細胞)および細胞溶解Ｔ細胞を含む細胞毒性Ｔ細胞(ＣＴＬ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞)を含む。用語「抗原特異的Ｔ細胞」または類似の用語は、特に、ＭＨＣ分子により、抗原提示細胞または癌細胞などの罹患細胞の表面に提示されたとき、Ｔ細胞は標的とし、好ましくはＴ細胞のエフェクター機能を発揮する、抗原を認識するＴ細胞に関する。Ｔ細胞は、該細胞が抗原を発現する標的細胞を殺すならば、抗原に特異的と考えられる。Ｔ細胞特異性は、多様な標準技術の何れか、例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイを使用して評価し得る。あるいは、リンホカイン(例えばインターフェロン－γ)の合成を測定できる。本発明のある実施態様において、ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は少なくとも１個のエピトープをコードする。
用語「標的」は、細胞免疫応答などの免疫応答の標的である、細胞または組織などの因子を意味する。標的は、抗原または抗原エピトープ、すなわち、抗原に由来するペプチドフラグメントを提示する細胞である。ある実施態様において、標的細胞は、抗原を発現し、好ましくは該抗原をクラスＩ ＭＨＣと提示する細胞である。
「抗原プロセシング」は、抗原を、該抗原のフラグメントであるプロセシング生成物に分解し(例えば、タンパク質をペプチドに分解)、これらフラグメントの１以上とＭＨＣ分子を関連させて(例えば、結合による)、特異的Ｔ細胞に対して細胞、好ましくは抗原提示細胞により提示させることをいう。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞に区別できる。
「抗原応答性ＣＴＬ」は、抗原提示細胞の表面にクラスＩ ＭＨＣと提示される抗原または該抗原に由来するペプチドに応答性であるＣＤ８＋ Ｔ細胞を意味する。
本開示によると、ＣＴＬ応答性は、持続的カルシウム流動、細胞分裂、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方制御ならびに腫瘍抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解による死滅を含む。ＣＴＬ応答性はまたＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポーターの使用によっても決定できる。
用語「免疫応答」および「免疫反応」は、その慣用の意味でここでは相互交換可能に使用し、抗原に対する統合された身体応答をいい、細胞免疫応答、液性免疫応答または両方をいい得る。本開示によると、抗原、細胞または組織などの因子に関する「への免疫応答」または「に対する免疫応答」なる用語は、該因子に向かう細胞応答などの免疫応答に関する。免疫応答は、１以上の抗原に対する抗体の進展およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔリンパ球、例えば、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球などの抗原特異的Ｔリンパ球の拡大からなる群から選択される１以上の反応を含み得て、インビトロで種々の増殖またはサイトカイン産生試験で検出され得る。
本発明の状況における用語「免疫応答の誘導」および「免疫応答の誘発」および類似の用語は、細胞免疫応答、液性免疫応答または両方の誘導などの免疫応答の誘導をいう。免疫応答は保護／予防／防止的および／または治療的であり得る。免疫応答はあらゆる免疫原または抗原または抗原ペプチド、好ましくは腫瘍関連抗原または病原体関連抗原(例えば、ウイルス(例えばインフルエンザウイルス(Ａ、ＢまたはＣ)、ＣＭＶまたはＲＳＶ)の抗原)に対するものであり得る。この状況で「誘導」は、誘導前特定の抗原または病原体に対する免疫応答はなかったことを意味し得るだけでなく、誘導前に特定の抗原または病原体に対する一定レベルの免疫応答はあり、該免疫応答は増強されることも意味し得る。故に、この状況で「免疫応答の誘導」は「免疫応答の増強」も含む。ある実施態様において、個体における免疫応答の誘導後、該個体は感染性疾患または癌性疾患などの疾患の発症から保護されるかまたは疾患状態は免疫応答の誘導により軽減される。
用語「細胞免疫応答」、「細胞応答」、「細胞介在免疫」または類似の用語は、クラスＩまたはクラスII ＭＨＣとの抗原発現および／または抗原により特徴づけられる細胞に対する細胞応答を含むことを意味する。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」として働き得るＴ細胞またはＴリンパ球と称される細胞に関する。ヘルパーＴ細胞(ＣＤ４＋ Ｔ細胞とも称される)は、免疫応答の制御により中心的役割を有し、キラー細胞(細胞毒性Ｔ細胞、細胞溶解Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される)は、罹患細胞などの細胞を殺す。
用語「液性免疫応答」は、抗体が、最終的に中和および／または排除される、因子および生物に応答して産生される生存生物における過程をいう。抗体応答の特異性は、単一特異性の抗原に結合する膜関連受容体を介してＴおよび／またはＢ細胞により介在される。適切な抗原の結合および種々の他の活性化シグナルの受信後、Ｂリンパ球が分裂し、記憶Ｂ細胞ならびに各々抗原受容体により認識されたとおり同一抗原性エピトープを認識する抗体を産生する抗体分泌形質細胞クローンを産生する。記憶Ｂリンパ球は、特異的抗原によりその後活性化されるまで休止状態のままである。これらのリンパ球は、記憶の細胞基盤および特異的抗原に再暴露されたとき抗体応答の結果的な漸増を提供する。
ここで使用する用語「抗体」は、抗原のエピトープに特異的に結合できる免疫グロブリン分子をいう。特に、用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質をいう。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および前記の何れかの組み合わせをいう。各重鎖は重鎖可変領域(ＶＨ)および重鎖定常領域(ＣＨ)からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域(ＶＬ)および軽鎖定常領域(ＣＬ)からなる。可変領域および定常領域はここではそれぞれ可変ドメインおよび定常ドメインとも称する。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と称されるより保存された領域は散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性の領域にさらに細分化し得る。各ＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端方向で次の順番で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＶＨのＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称され、ＶＬのＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称される。重鎖および軽鎖可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は重鎖定常領域(ＣＨ)および軽鎖定常領域(ＣＬ)を含み、ここで、ＣＨは定常ドメインＣＨ１、ヒンジ領域および定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３にさらに細分化され得る(アミノ末端からカルボキシ末端方向で次の順番で配置される：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３)。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、種々の免疫系の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)を含む宿主組織または因子の結合を介在し得る。抗体は、天然源または組み換え源由来のインタクト免疫グロブリンであってよく、インタクト免疫グロブリンの免疫活性部分であってよい。抗体は、典型的に免疫グロブリン分子の四量体である。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ(ａｂ)２ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む、多様な形態で存在し得る。
用語「免疫グロブリン」は、抗体またはＢ細胞受容体(ＢＣＲ)などの抗原受容体などの、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質に関する。免疫グロブリンは、特徴的免疫グロブリン(Ｉｇ)折り畳みを有する構造ドメイン、すなわち、免疫グロブリンドメインにより特徴づけられる。本用語は、膜結合免疫グロブリンならびに可溶性免疫グロブリンを含む。膜結合免疫グロブリンは表面免疫グロブリンまたは膜免疫グロブリンとも称され、一般にＢＣＲの一部である。可溶性免疫グロブリンは、一般に抗体と称される。免疫グロブリンは、一般に数鎖、典型的にジスルフィド結合により連結された２個の同一重鎖および２個の同一軽鎖からなる。これらの鎖は、主にＶＬ(可変軽鎖)ドメイン、ＣＬ(定常軽鎖)ドメイン、ＶＨ(可変重鎖)ドメインおよびＣＨ(定常重鎖)ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４などの免疫グロブリンドメインからなる。５タイプの哺乳動物免疫グロブリン重鎖、すなわち、α、δ、ε、γおよびμからなり、抗体の異なるクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを担う。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは逆に、膜または表面免疫グロブリンの重鎖は、カルボキシ末端に膜貫通ドメインおよび短細胞質ドメインを含む。哺乳動物において、２タイプの軽鎖、すなわち、ラムダおよびカッパはある。免疫グロブリン鎖は可変領域および定常領域を含む。定常領域は本質的に免疫グロブリンの種々のアイソタイプ内で保存されており、ここで、可変部分は高度に多様性であり、抗原認識を担う。
用語「ワクチン接種」および「免疫化」は、治療または予防理由のために個体を処置する過程をいい、ここに記載するとおり、１以上の免疫原または抗原またはその誘導体を、特にそれをコードするＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)の形態で個体に投与し、該１以上の免疫原または抗原または該１以上の免疫原または抗原の提示により特徴づけられる細胞に対する免疫応答を刺激することに関する。
「抗原の提示により特徴づけられる細胞」または「抗原を提示する細胞」または「抗原提示細胞表面上に抗原を提示するＭＨＣ分子」または類似の表現は、罹患細胞、特に腫瘍細胞または感染細胞または抗原提示細胞などの細胞は、抗原または抗原ペプチドを、直接またはプロセシング後、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスII分子、最も好ましくはＭＨＣクラスＩ分子により提示することを意味する。
本発明の状況において、用語「転写」は、ＤＮＡ配列の遺伝子コードはＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)に転写される過程に関する。その後、ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)はペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
ＲＮＡに関して、用語「発現」または「翻訳」は、ｍＲＮＡの鎖はアミノ酸の配列の集合を指示し、ペプチドまたはタンパク質を製造する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
ここに記載する医薬製剤、特にキットは、指示材または指示を含み得る。ここで使用する「指示材」または「指示」は、本発明の組成物および方法の有用性の伝達に使用できる、刊行物、レコーディング、図表または表現のための何らかの他の媒体を含む。本発明のキットの指示材は、例えば、本発明の組成物を含むコンテナに添付されまたは組成物を含むコンテナと共に輸送されることができる。あるいは、指示材は、指示材および組成物はレシピエントにより協調的に使用されることを意図して、コンテナと別に輸送され得る。
ここで使用する用語「任意的」または「所望により」は、その後に記載されている事象、状況または状態が起きても起きなくてもよいことを意味し、この記載は、該事象、状況または状態が起こる場合および起こらない場合を含む。
ここに記載する特定の化合物のプロドラッグは、個体への投与により、生理学的条件下化学変換を受けて、特定の化合物をもたらす化合物をいう。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境で化学的または生化学的方法で特定の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、例えば、適当な酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバーに入れたとき、特定の化合物にゆっくり変換され得る。プロドラッグの例は、インビボで加水分解可能なエステル(特定の化合物に含まれるアルコールまたはカルボキシ基使用)またはアミド(特定の化合物に含まれるアミノまたはカルボキシ基使用)である。具体的に、特定の化合物に含まれ、少なくとも１個の水素原子を有するあらゆるアミノ基は、プロドラッグ形態に変換され得る。典型的Ｎ－プロドラッグ形態は、カルバメート、マンニッヒ塩基、エナミンおよびエナミノンを含む。
本明細書において、化合物の構造式は、該化合物のある異性体を表し得る。しかしながら、本発明は、構造的に生ずる幾何異性体、不斉炭素光に基づく学異性体、立体異性体、互変異性体などの全異性体および異性体混合物を含み、式の記載に限定されないことは理解される。さらに、本明細書において、化合物の構造式は、該化合物の特定の塩および／または溶媒和物を示し得る。しかしながら、本発明は全ての塩(例えば、薬学的に許容される塩)および溶媒和物(例えば、水和物)を含み、特定の塩および／または溶媒和物の記載に限定されないことは理解される。
「異性体」は、同じ分子式を有するが、構造(「構造異性体」)または官能基および／または原子の幾何(空間)位置(「立体異性体」)は異なる化合物である。「エナンチオマー」は、互いに重なり合わない鏡像である立体異性体の対である。「ラセミ混合物」または「ラセミ体」は、等量でエナンチオマーの対を含み、接頭辞(±)により示される。「ジアステレオマー」は、重なり合わず、互いに鏡像ではない立体異性体である。「互変異性体」は、自発的にかつ、純粋であっても、個々の原子または原子の基の移動により互いに可逆性に相互変換される、同じ化学物質の構造異性である；すなわち、互変異性体は、互いに動的化学平衡にある。互変異性体の例は、ケト－エノール－互変異性の異性体である。「立体構造異性体」は、形式上単結合に対する単なる回転により相互変換され得る立体異性体であり － 特に － シクロヘキサンのいす形、半いす形、舟形およびねじれ舟形などの異なる３次元形態の(ヘテロ)環状環に至るものである。
ここで使用する用語「溶媒和物」は、溶媒(例えば有機溶媒(例えば、脂肪族アルコール(例えばメタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール)、アセトン、アセトニトリル、エーテルなど)、水またはこれら液体の２以上の混合物)における溶解物質の付加複合体をいい、ここで、付加複合体は結晶または混合結晶の形態で存在する。付加複合体に含まれる溶媒の量は、化学量論的または非化学量論的であり得る。「水和物」は、溶媒は水である溶媒和物である。
同位体標識された化合物において、１以上の原子は同じプロトン数を有するが、中性子数は異なる対応する原子に置き換えられる。例えば、水素原子は、重水素またはトリチウム原子に置き換えられ得る。本発明で使用できる同位体の例は、重水素、トリチウム、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｆ、３２Ｐ、３２Ｓ、３５Ｓ、３６Ｃｌおよび１２５Ｉを含む。
用語「平均直径」は、動的光散乱法(ＤＬＳ)により測定した粒子の平均流体力学直径をいい、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用してデータ解析し、結果として、いわゆるＺ平均と長さの寸法および大きさのない多分散性指数(ＰＤＩ)を提供する(Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321)。ここで、粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ平均値と同義的に使用する。
ある実施態様において、「多分散性指数」は、「平均直径」の定義に記載したとおり、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱法測定値に基づき、計算される。ある必要条件下、ナノ粒子のアンサンブルのサイズ分布の測定値として解釈され得る。
回転軸に対する粒子の「回転半径」(ここではＲｇと略す)は、粒子の全質量は濃縮されていると仮定して、ある軸に対するその慣性モーメントは、その実際の質量分布と同じである、回転軸からの点の半径方向距離である。数学上、Ｒｇは重心またはある軸からの粒子の成分の二乗平均平方根距離である。例えば、重心から固定距離ｓｉに位置する、質量ｍｉ(ｉ＝１、２、３、・・・、ｎ)のｎ質量要素からなる巨大分子について、Ｒｇは、全質量要素にわたるｓｉ ２の質量平均の平方根であり、次のとおり、計算できる。
回転半径は、例えば、光散乱法の使用により実験的に決定またはケイ酸できる。特に、小散乱ベクター
について、構造関数Ｓは次のとおり定義される：
〔式中、Ｎは成分数である(ギニエ則)。〕。
粒子の定量的サイズ分布に関連して、「Ｄ１０値」は、粒子の１０％はこの値未満の直径を有する、直径である。Ｄ１０値は、粒子集団内(例えばフィールド・フロー・フラクショネーションにより得た粒子ピーク内)の最小粒子径の割合をいう手段である。
粒子の定量的サイズ分布に関連して、「Ｄ５０値」は、粒子の５０％はこの値未満の直径を有する、直径である。Ｄ５０値は、粒子集団内(例えばフィールド・フロー・フラクショネーションにより得た粒子ピーク内)の平均粒子径の集団をいう手段である。
粒子の定量的サイズ分布に関連して、「Ｄ９０値」は、粒子の９０％はこの値未満の直径を有する、直径である。「Ｄ９５」、「Ｄ９９」および「Ｄ１００」値は対応する意味を有する。Ｄ９０、Ｄ９５、Ｄ９９およびＤ１００値は、粒子集団内(例えばフィールド・フロー・フラクショネーションにより得た粒子ピーク内)の大型粒子の割合をいう手段である。
粒子の「流体力学半径」(「ストークス半径」または「ストークス・アインシュタイン半径」と称することもある)は、該粒子と同じ速度で拡散する仮定上の剛球の半径である。流体力学半径は、サイズだけでなく、溶媒効果も考慮に入れた、粒子の移動性に関する。例えば、水和は強い小さな荷電粒子は、水和は弱い大型荷電粒子より大きな流体力学半径を有し得る。これは、小さな粒子は溶液を移動する際引きずる水分子の数は多いためである。溶媒中の粒子の実際の寸法は直接測定不可能であるため、流体力学半径は、ストークス・アインシュタイン式により定義され得る：
〔式中、ｋＢはボルツマン定数であり；Ｔは温度であり；ηは溶媒の粘性であり；そしてＤは拡散係数である。〕。拡散係数は、例えば、動的光散乱法(ＤＬＳ)の使用により実験的に決定され得る。故に、粒子または粒子の集団(例えばここに開示する製剤または組成物に含まれるＬＮＰなどの粒子の流体力学半径またはそのような製剤または組成物をフィールド・フロー・フラクショネーションに付して得られる粒子ピークの流体力学半径)の流体力学半径を決定するある法オフは、該粒子または粒子の集団のＤＬＳシグナル(例えばここに開示する製剤または組成物に含まれるＬＮＰなどの粒子のＤＬＳシグナルまたはそのような製剤または組成物をフィールド・フロー・フラクショネーションに付して得られる粒子ピークのＤＬＳシグナル)の測定である。
ここで使用する用語「凝集体」は粒子の集団に関し、ここで、粒子は同一であるかまたは極めて類似し、互いに非共有結合(例えば、イオン相互作用、Ｈ架橋相互作用、双極子相互作用および／またはファン・デル・ワールス相互作用)で接着する。
ここで使用する表現「光散乱法」は、光は通過する媒体における局在化非均一性のために、光を、１以上の通路で直線軌道から逸脱させる物理的過程をいう。
用語「ＵＶ」は紫外線を意味し、１０nm～４００nmの波長、すなわち、可視光より短いは、Ｘ線より長い電磁スペクトルのバンドをいう。
ここで使用する表現「多角度光散乱法」または「ＭＡＬＳ」は、サンプルにより複数の角度に散乱された光の測定の技術に関する。「多角度」は、これに関して、散乱光は、例えば、選択した特定の角度を含む範囲にわたり移動する１個の検出器または特定の角度位置に固定された一連の検出器により、測定される異なる別々の角度で検出され得ることを意味する。ある好ましい実施態様において、ＭＡＬＳで使用する光源はレーザー源である(ＭＡＬＬＳ：多角度レーザー光散乱法)。粒子を含む組成物のＭＡＬＳシグナルに基づき、適切な定式化(例えば、Ｚｉｍｍプロット、ＢｅｒｒｙプロットまたはＤｅｂｙｅプロット)の使用により、該粒子の回転半径(Ｒｇ)、故に、サイズを決定することが可能である。好ましくは、Ｚｉｍｍプロットは、次の式を使用する図示である：
〔式中、ｃは溶媒中の粒子の質量濃度(ｇ／mL)であり；Ａ２は第二ビリアル係数(mol・mL／ｇ２)であり；Ｐ(θ)は散乱光強度の角度への依存に関連する形状因子であり；Ｒθは過剰レイリー比(cm－１)であり；そしてＫ＊は、４π２ηｏ(ｄｎ／ｄｃ)２λ０ －４ＮＡ －１に等しい光学定数であり、ここで、ηｏは入射放射(真空)波長での溶媒の屈折率であり、λ０は入射放射(真空)波長(nm)であり、ＮＡはアボガドロ数(mol－１)であり、そしてｄｎ／ｄｃは示差的屈折率増分(mL／ｇ)である。〕(例えば、Buchholz et al. (Electrophoresis 22 (2001), 4118-4128); B.H. Zimm (J. Chem. Phys. 13 (1945), 141; P. Debye (J. Appl. Phys. 15 (1944): 338;およびW. Burchard (Anal. Chem. 75 (2003), 4279-4291参照)。好ましくは、Ｂｅｒｒｙプロットは次の項またはその逆数で計算される：
〔式中、ｃ、ＲθおよびＫ＊は上に定義したとおりである。〕。好ましくは、Ｄｅｂｙｅプロットは次の項またはその逆数で計算される：
〔式中、ｃ、ＲθおよびＫ＊は上に定義したとおりである。〕。
ここで使用する表現「動的光散乱法」または「ＤＬＳ」は、特に粒子の流体力学半径に関連して、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを決定するための技術をいう。単色光源、通常レーザーを、偏光子をとおし、サンプルに照射する。その後、散乱光は第二偏光子をとおり、そこで、検出され、得られた像はスクリーンに投影される。溶液中の粒子は光で照射され、全方向に光を回折させる。粒子から回折された光は、建設的に(明領域)または破壊的に(暗領域)干渉され得る。この過程を短時間間隔で繰り返し、得られた斑点パターンのセットを、経時的に各スポットの光強度を比較するオートコリレータにより分析する。
ここで使用する表現「静的光散乱法」または「ＳＬＳ」は、特に、粒子の回転半径および／または粒子のモル質量に関する、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを決定する技術をいう。高強度単色光、通常レーザーを、粒子を含む溶液に発射する。１個または多数の検出器を使用して、１個または多数の角度での散乱強度を測定する。角度依存性は、全巨大分子のモル質量および半径のサイズ両方の正確な測定値を得るために必要である。故に、多角度光散乱法(ＭＡＬＳ)または多角度レーザー光散乱法(ＭＡＬＬＳ)として知られる、入射光の方向に対して数角度での同時測定は、一般に静的光散乱法の標準的実施としてみなされる。
核酸
用語「核酸」は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸(ＲＮＡ)、それらの組み合わせおよびそれらの修飾形態を含む。本用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組み換えにより産生したおよび化学合成した分子を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖および線形または共有結合で閉環した分子として存在し得る。核酸は単離され得る。用語「単離核酸」は、本発明によると、核酸は(ｉ)例えばＤＮＡについてはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)でインビトロで増幅されたまたはＲＮＡについてはインビトロ転写された(例えば、ＲＮＡポリメラーゼを使用)、(ii)クローニングにより組み換え産生された、(iii)例えば、ゲル電気泳動による切断および分離により精製されたまたは(iv)例えば、化学合成により合成されたものであることを意味する。
用語「ヌクレオシド」(ここでは「Ｎ」と略す)は、リン酸基を伴わないヌクレオチドと考えられ得る化合物に関する。ヌクレオシドは、糖(例えば、リボースまたはデオキシリボース)に連結した核酸塩基であるが、ヌクレオチドはヌクレオシドおよび１以上のリン酸基からなる。ヌクレオシドの例は、シチジン、ウリジン、シュードウリジン、アデノシンおよびグアノシンを含む。
通常天然に存在する核酸を構成する５種の標準ヌクレオシドは、ウリジン、アデノシン、チミジン、シチジンおよびグアノシンである。５種のヌクレオシドは、通常それぞれ１文字コードＵ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧと略される。しかしながら、チミジンは、ウリジンに見られるリボフラノース環ではなく、２’－デオキシリボフラノース部分を含むため、「ｄＴ」(「ｄ」は「デオキシ」を表す)と表記されるのはより一般的である。これは、チミジンがデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)に見られ、リボ核酸(ＲＮＡ)に見られないためである。逆に、ウリジンはＲＮＡに見られ、ＤＮＡに見られない。残りの３種のヌクレオシドはＲＮＡおよびＤＮＡ両方に見られ得る。ＲＮＡにおいて、それらはＡ、ＣおよびＧと表され、一方ＤＮＡにおいては、ｄＡ、ｄＣおよびｄＧと表される。
修飾プリン(ＡまたはＧ)またはピリミジン(Ｃ、ＴまたはＵ)塩基部分は、好ましくは１以上のアルキル基、より好ましくは１以上のＣ１－４アルキル基、さらにより好ましくは１以上のメチル基により修飾される。修飾プリンまたはピリミジン塩基部分の具体例はＮ７－アルキル－グアニン、Ｎ６－アルキル－アデニン、５－アルキル－シトシン、５－アルキル－ウラシルおよびＮ(１)－アルキル－ウラシル、例えばＮ７－Ｃ１－４アルキル－グアニン、Ｎ６－Ｃ１－４アルキル－アデニン、５－Ｃ１－４アルキル－シトシン、５－Ｃ１－４アルキル－ウラシルおよびＮ(１)－Ｃ１－４アルキル－ウラシル、好ましくはＮ７－メチル－グアニン、Ｎ６－メチル－アデニン、５－メチル－シトシン、５－メチル－ウラシルおよびＮ(１)－メチル－ウラシルを含む。
ここで、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施態様において、ＤＮＡは全てまたは大多数のデオキシリボヌクレオチド残基を含む。ここで使用する「デオキシリボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を欠くヌクレオチドをいう。ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、単離ＤＮＡ例えば、部分的に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組み換えにより産生したＤＮＡならびに天然に存在するＤＮＡと１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により異なる修飾ＤＮＡを含むが、これらに限定されない。このような改変は、内部ＤＮＡヌクレオチドまたはＤＮＡの末端への非ヌクレオチド物質の付加をいい得る。ＤＮＡにおけるヌクレオチドは、化学合成したヌクレオチドまたはリボヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることもここで意図される。本発明に関して、これらの改変ＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡのアナログと考えられる。分子は、分子におけるデオキシリボヌクレオチド残基の含量が、分子における総ヌクレオチド残基数に基づき５０％を超える(例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％)ならば、「大多数のデオキシリボヌクレオチド残基」を含む。分子におけるヌクレオチド残基の総数は、全ヌクレオチド残基の総和である(ヌクレオチド残基は標準(すなわち、天然に存在する)ヌクレオチド残基であるかまたはそのアナログであるかは無関係)。
ＤＮＡは組み換えＤＮＡであってよく、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングにより得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得ることができる。
ＲＮＡ
本発明によると、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子を意味する。好ましい実施態様において、ＲＮＡは全てまたは大多数のリボヌクレオチド残基を含む。ここで使用する「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドをいう。ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ例えば、部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えにより産生したＲＮＡならびに天然に存在するＲＮＡと１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変により異なる修飾ＲＮＡを含むが、これらに限定されない。このような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端への非ヌクレオチド物質の付加を言い得る。ＲＮＡにおけるヌクレオチドは、化学合成したヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることもここで意図される。本発明に関して、これらの改変／修飾ヌクレオチドは天然に存在するヌクレオチドのアナログと称することはでき、このような改変／修飾ヌクレオチドを含む対応するＲＮＡ(すなわち、改変／修飾ＲＮＡ)は天然に存在するＲＮＡのアナログと称することができる。分子は、分子におけるリボヌクレオチド残基の含量が、分子における総ヌクレオチド残基数に基づき、５０％を超える(例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％)ならば、「大多数のリボヌクレオチド残基」を含む。分子におけるヌクレオチド残基の総数は、全ヌクレオチド残基の総和である(ヌクレオチド残基は標準(すなわち、天然に存在する)ヌクレオチド残基であるかまたはそのアナログあるかは無関係)。
「ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)、小核ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)、自己増幅ＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)、一本鎖ＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)、ｄｓＲＮＡ、阻害性ＲＮＡ(例えばアンチセンスｓｓＲＮＡ、小干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)またはマイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ))、活性化ＲＮＡ(例えば小活性化ＲＮＡ)および免疫刺激性ＲＮＡ(ｉｓＲＮＡ)を含む。ある実施態様において、「ＲＮＡ」はｍＲＮＡをいう。
好ましい実施態様において、ＲＮＡは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む。
ここで使用する用語「インビトロ転写」または「ＩＶＴ」は、転写(すなわち、ＲＮＡの産生)が無細胞様式で実施されることを意味する。すなわち、ＩＶＴは生存／培養細胞ではなく、細胞から抽出した転写機構(例えば、ＲＮＡポリメラーゼ(好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６ポリメラーゼ)を含む細胞ライセートまたはその単離成分)を使用する。
ｍＲＮＡ
本発明の全態様のある実施態様において、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
本発明によると、用語「ｍＲＮＡ」は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用して産生され得る「複写物」を含む。一般に、ｍＲＮＡは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする。典型的に、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、ペプチド／タンパク質コード領域および３’－ＵＴＲを含む。本発明の状況において、ｍＲＮＡは、好ましくはＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写(ＩＶＴ)により産生される。上記のとおり、インビトロ転写方法は当業者に知られ、多様なインビトロ転写キットが市販されている。
ｍＲＮＡは一本鎖であるが、自己相補的配列を含み得て、ｍＲＮＡの一部は折り畳まれ、それ自体と対合して、二重螺旋を形成することができる。
本発明によると、「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを意味し、２個の部分的にまたは完全に相補的な鎖を有するＲＮＡである。
本発明の好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ複写物に関する。
ある実施態様において、好ましくはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、少なくとも４５ヌクレオチド(例えば少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１,０００、少なくとも１,５００、少なくとも２,０００、少なくとも２,５００、少なくとも３,０００、少なくとも３,５００、少なくとも４,０００、少なくとも４,５００、少なくとも５,０００、少なくとも６,０００、少なくとも７,０００、少なくとも８,０００、少なくとも９,０００ヌクレオチド)、好ましくは最大１５,０００、例えば最大１４,０００、最大１３,０００、最大１２,０００ヌクレオチド、最大１１,０００ヌクレオチドまたは最大１０,０００ヌクレオチドの長さを有する。
当分野で確立されているとおり、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、一般に５’非翻訳領域(５’－ＵＴＲ)、ペプチド／ポリペプチド／タンパク質コード領域および３’非翻訳領域(３’－ＵＴＲ)を含む。ある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)はインビトロ転写または化学合成により産生される。ある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写により産生される。インビトロ転写方法は当業者に知られる；例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照。さらに、多様なインビトロ転写キット、例えば、Thermo Fisher Scientific(例えばTranscriptAidTM T7キット、MEGAscript(登録商標)T7キット、MAXIscript(登録商標))、New England BioLabs Inc. (例えばHiScribeTM T7キット、HiScribeTM T7 ARCA mRNAキット)、Promega(例えばRiboMAXTM、HeLaScribe(登録商標)、Riboprobe(登録商標)系)、Jena Bioscience(例えばSP6またはT7転写キット)およびEpicentre(例えばAmpliScribeTM)からは市販されている。修飾ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)を提供するために、修飾されている天然に存在するヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチドおよび／または修飾されている天然に存在しないヌクレオチドなどの、対応して修飾されているヌクレオチドを、合成(好ましくはインビトロ転写)中に組み込むことができまたは修飾を転写後ｍＲＮＡに実施および／または付加し得る。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)はインビトロ転写ＲＮＡ(ＩＶＴ－ＲＮＡ)であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により得ることができる。転写制御のためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの具体例は、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、インビトロ転写はＴ７またはＳＰ６プロモーターにより制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することにより、得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得ることができる。
本発明のある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、「レプリコンＲＮＡ」(例えば「レプリコンｍＲＮＡ」)または単に「レプリコン」、特に「自己複製ＲＮＡ」(例えば「自己複製ｍＲＮＡ」)または「自己増幅ＲＮＡ」(または「自己増幅ｍＲＮＡ」)である。ある特に好ましい実施態様において、レプリコンまたは自己複製ＲＮＡ(例えば自己複製ｍＲＮＡ)は、ｓｓＲＮＡウイルス、特にプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス、例えばアルファウイルスに由来するかまたはそれに由来する要素を含む。アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的代表例である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する(アルファウイルス生活環のレビューは、Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856参照)。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は、典型的に１１,０００～１２,０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは典型的に５’キャップおよび３’ポリ(Ａ)テイルを含む。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質(ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与)および構造タンパク質(ウイルス粒子を形成)をコードする。ゲノムに典型的に２個のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)はある。４個の非構造タンパク質(ｎｓＰ１－ｎｓＰ４)は、典型的にゲノムの５’末端近辺から開始される第一ＯＲＦにより一緒にコードされ、一方アルファウイルス構造タンパク質は、第一ＯＲＦの下流に見られ、ゲノムの３’末端近辺まで伸びる第二ＯＲＦにより一緒にコードされる。典型的に、第一ＯＲＦは第二ＯＲＦより大きく、おおよそ２：１の比である。アルファウイルスにより感染された細胞において、非構造タンパク質をコードする核酸配列のみはゲノムＲＮＡから翻訳され、構造タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物メッセンジャーＲＮＡを模倣するＲＮＡ分子であるサブゲノム複写物から翻訳可能である(ｍＲＮＡ; Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124)。感染後、すなわちウイルス生活環の早期段階で、(＋)鎖ゲノムＲＮＡは、直接非構造ポリタンパク質(ｎｓＰ１２３４)をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためのメッセンジャーＲＮＡのように作用する。アルファウイルス由来ベクターは、標的細胞または標的生物への外来遺伝情報の送達のために提案されている。単純なアプローチにおいて、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置き換える。アルファウイルスベースのトランス複製系は、一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし、他方の核酸分子は該レプリカーゼによりトランスで複製され得る２個の別の核酸分子におけるアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する(故に命名トランス複製系)。トランス複製は、ある宿主細胞におけるこれら核酸分子両方の存在を必要とする。レプリカーゼによりトランスで複製され得る核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼにより認識され、ＲＮＡ合成させるために、あるアルファウイルス配列要素を含まなければならない。
本発明のある実施態様において、ここに記載する(例えば、本発明の組成物に含まれるおよび／または本発明の方法で使用される)ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、例えば、安定性増加および／または翻訳効率増加および／または免疫原性減少および／または細胞毒性減少のために、１以上の修飾を含む。例えば、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)の発現を増加させるために、コード領域、すなわち、発現ペプチドまたはタンパク質をコードする配列内を、好ましくは発現ペプチドまたはタンパク質の配列を変えることなく、修飾し得る。このような修飾は、例えば、ＷＯ２００７／０３６３６６およびＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５６５０２に記載され、次のものを含む：５’キャップ構造；天然に存在するポリ(Ａ)テイルの伸長または短縮化；５’－および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)の改変、例えば該ＲＮＡのコード領域と無関係のＵＴＲの導入；１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置き換え；およびコドン最適化(例えば、ＲＮＡのＧＣ含量を変える、好ましくは増加するため)。本発明の修飾ｍＲＮＡの状況における用語「修飾」は、好ましくは該ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)に天然に存在しない、ｍＲＮＡのあらゆる修飾に関する。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は５’キャップ構造を含む。ある実施態様において、ｍＲＮＡは、キャップのない５’－三リン酸を含まない。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、慣用の５’キャップおよび／または５’キャップアナログを含み得る。用語「慣用の５’キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見られるキャップ構造をいい、一般に三リン酸部分を介してｍＲＮＡの隣接ヌクレオチドの５’末端に結合するグアノシン５’－三リン酸(Ｇｐｐｐ)からなる(すなわち、グアノシンは、ｍＲＮＡの残りに５’→５’三リン酸結合を介して結合する)。グアノシンは、位置Ｎ７でメチル化されていてよい(キャップ構造ｍ７Ｇｐｐｐとなる)。用語「５’キャップアナログ」は、慣用の５’キャップに基づくが、逆配向での５’キャップアナログの組込みを回避するために、ｍ７グアノシン構造の２’位または３’位は修飾されている、５’キャップをいう(このような５’キャップアナログはアンチリバースキャップアナログ(ＡＲＣＡ)とも称する)。特に好ましい５’キャップアナログは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５６５０２に記載のβ－リン酸におけるホスホロチオエート修飾５’キャップアナログ(例えばｍ２ ７,２’ＯＧ(５’)ｐｐＳｐ(５’)Ｇ(ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡまたはβ－Ｓ－ＡＲＣＡと称する))などの、リン酸架橋における架橋および非架橋酸素に１以上の置換を有するものである。ここに記載するとおり、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)に５’キャップ構造を施すことは、５’キャップ構造は産生されたＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)鎖に共転写的に組み込まれる対応する５’キャップ化合物の存在下のＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により達成され得るかまたはＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)を、例えば、インビトロ転写により産生してよく、５’キャップ構造を、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後ｍＲＮＡに負荷し得る。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、ｍ２ ７,２’ＯＧ(５’)ｐｐＳｐ(５’)Ｇ(特にそのＤ１ジアステレオマー)、ｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)Ｇおよびｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧからなる群から選択される５’キャップ構造を含む。ある実施態様において、抗原またはエピトープを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡは、５’キャップ構造としてｍ２ ７,２’ＯＧ(５’)ｐｐＳｐ(５’)Ｇ(特にそのＤ１ジアステレオマー)を含む。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、キャップ０、キャップ１またはキャップ２、好ましくはキャップ１またはキャップ２を含む。本発明によると、用語「キャップ０」は構造「ｍ７ＧｐｐｐＮ」を意味し、ここで、Ｎは２’位にＯＨ部分を担持するあらゆるヌクレオシドである。本発明によると、用語「キャップ１」は構造「ｍ７ＧｐｐｐＮｍ」を意味し、ここで、Ｎｍは２’位にＯＣＨ３部分を担持するあらゆるヌクレオシドである。本発明によると、用語「キャップ２」は構造「ｍ７ＧｐｐｐＮｍＮｍ」を意味し、ここで、各Ｎｍは独立して２’位にＯＣＨ３部分を担持するあらゆるヌクレオシドである。
５’キャップアナログベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(β－Ｓ－ＡＲＣＡ)は次の構造を有する：
「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」または「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)」は、ＨＰＬＣカラムでベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー(ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ２))と比較して速く溶出し、故に保持時間は短い、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣは好ましくは分析的ＨＰＬＣである。ある実施態様において、好ましくは５μm、４.６×２５０mm形式の、Supelcosil LC-18-T RPカラムは分離に使用され、それによって流速１.３ml／分は適用され得る。ある実施態様において、酢酸アンモニウム中メタノールの勾配、例えば、１５分以内の０.０５Ｍ 酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５.９中メタノールの０～２５％線形勾配が使用される。ＵＶ検出(ＶＷＤ)を２６０nmで実施でき、蛍光検出(ＦＬＤ)を２８０nmでの励起および３３７nmでの検出で実施できる。
キャップ１の構成要素である５’キャップアナログｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ(別名ｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)ｍ２’－ＯＡｐＧ)は次の構造を有する：
β－Ｓ－ＡＲＣＡおよびｍＲＮＡを含むキャップ０ ｍＲＮＡの例は、次の構造を有する：
ｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)ＧおよびｍＲＮＡを含むキャップ０ ｍＲＮＡの例は、次の構造を有する：
ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧおよびｍＲＮＡを含むキャップ１ ｍＲＮＡの例は、次の構造を有する：
ここで使用する用語「ポリＡテイル」または「ポリＡ配列」は、典型的にＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)分子の３’末端に位置するアデニル酸残基の中断されていないまたは中断配列をいう。ポリＡテイルまたはポリＡ配列は当業者に知られ、ここに記載するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)における３’－ＵＴＲに続き得る。中断されていないポリＡテイルは、連続アデニル酸残基により特徴づけられる。本来、中断されていないポリＡテイルは典型的だえる。ここに開示するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、転写後鋳型非依存的ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡの遊離３’末端に結合されたポリＡテイルまたはＤＮＡによりコードされ、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写されたポリＡテイルを有し得る。
約１２０個のＡヌクレオチドのポリＡテイルが、トランスフェクト真核生物細胞におけるｍＲＮＡレベルおよびポリＡテイルの上流(５’)に存在するタンパク質レベルに有益な影響を有することが示されている(Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017)。
ポリＡテイルはどんな長さでもよい。ある実施態様において、ポリＡテイルは、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０または少なくとも１００および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００または最大１５０個のＡヌクレオチド、特に、約１２０個のＡヌクレオチドを含む、それから本質的になるまたはそれからなる。この状況で、「本質的にからなる」は、ポリＡテイルにおけるヌクレオチドの大部分、典型的にポリＡテイルにおけるヌクレオチド数で少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％はＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドはＡヌクレオチド以外のヌクレオチド、例えばＵヌクレオチド(ウリジル酸)、Ｇヌクレオチド(グアニル酸)またはＣヌクレオチド(シチジル酸)であってよいことを意味する。この状況で、「からなる」は、ポリＡテイルにおける全ヌクレオチド、すなわち、ポリＡテイルにおけるヌクレオチド数で１００％はＡヌクレオチドであることを意味する。用語「Ａヌクレオチド」または「Ａ」はアデニル酸を意味する。
ある実施態様において、ポリＡテイルはＲＮＡ転写中、例えば、インビトロ転写ＲＮＡの製造中、コード鎖に相補的な鎖に反復ｄＴヌクレオチド(デオキシチミジル酸)を含むＤＮＡ鋳型に基づき、結合される。ポリＡテイルをコードするＤＮＡ配列(コード鎖)はポリ(Ａ)カセットと称される。
ある実施態様において、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ(Ａ)カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド(ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ)のランダム配列により中断されているこのようなランダム配列は５～５０、１０～３０または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。このようなカセットは、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示される。ＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示されるあらゆるポリ(Ａ)カセットは本発明で使用され得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド(ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ)は均等に分布したランダム配列により中断され、例えば、５～５０ヌクレオチド長を有し、ＤＮＡレベルで、大腸菌におけるプラスミドＤＮＡの一定増殖を示し、ＲＮＡレベルで、なおＲＮＡ安定性および翻訳効率の支持に関する有益な性質となお関連するポリ(Ａ)カセットは包含される。結果として、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)分子に含まれるポリＡテイルは、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド(Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ)のランダム配列により中断される。このようなランダム配列は５～５０、１０～３０または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。
ある実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは３’末端でポリＡテイルに隣接しておらず、すなわち、ポリＡテイルはマスクされていないまたはその３’末端でＡ以外のヌクレオチドは続いていない。
ある実施態様において、ポリＡテイルは少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および最大５００、最大４００、最大３００、最大２００または最大１５０ヌクレオチドを含み得る。ある実施態様において、ポリＡテイルは本質的に少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および最大５００、最大４００、最大３００、最大２００または最大１５０ヌクレオチドからなり得る。ある実施態様において、ポリＡテイルは少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および最大５００、最大４００、最大３００、最大２００または最大１５０ヌクレオチドからなり得る。ある実施態様において、ポリＡテイルは少なくとも１００ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリＡテイルは約１５０ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリＡテイルは約１２０ヌクレオチドを含むM。ある実施態様において、ポリＡテイルは配列番号１４のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。ある実施態様において、ポリＡ配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列。を有する
ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。用語「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」は、転写されるが、アミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子における領域またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子における対応する領域に関する。非翻訳領域(ＵＴＲ)は、オープンリーディングフレームの５’(上流)(５’－ＵＴＲ)および／またはオープンリーディングフレームの３’(下流)(３’－ＵＴＲ)に存在し得る。５’－ＵＴＲは、存在するならば、５’末端、タンパク質コード化領域の開始コドンの上流に位置する。５’－ＵＴＲは、５’キャップ(存在するならば)の下流である、例えば、５’キャップに直接隣接する。３’－ＵＴＲは、存在するならば、３’末端、タンパク質コード化領域の停止コドンの下流に位置するが、用語「３’－ＵＴＲ」は好ましくはポリＡ配列を含まない。故に、３’－ＵＴＲは、ポリＡ配列(存在するならば)の上流、例えば、ポリＡ配列に直接隣接する。ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)分子の３’非翻訳領域への３’－ＵＴＲの組み込みは、翻訳効率の増強をもたらし得る。２以上のこのような３’－ＵＴＲの組み込みにより、相乗的効果は達成され得る(好ましくは頭－尾配向；例えば、Holtkamp et al., Blood 108, 4009-4017 (2006)参照)。３’－ＵＴＲは、導入されるＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)に対して自己でも異種でもよい。ある特定の実施態様において、３’－ＵＴＲはグロビン遺伝子またはｍＲＮＡ、例えばアルファ２－グロビン、アルファ１－グロビンまたはベータ－グロビン、好ましくはベータ－グロビン、より好ましくはヒトベータ－グロビンの遺伝子またはｍＲＮＡ由来である。例えば、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、既存の３’－ＵＴＲの、アルファ２－グロビン、アルファ１－グロビン、ベータ－グロビン、好ましくはベータ－グロビン、より好ましくはヒトベータ－グロビンなどのグロビン遺伝子由来の３’－ＵＴＲの１以上、好ましくは２コピーでの置き換えまたは挿入により修飾され得る。
ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。
ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)は、配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。
ここに記載するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)安定性増加および／または免疫原性減少および／または細胞毒性減少のために、修飾リボヌクレオチドを有し得る。例えば、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)におけるウリジンは、修飾ヌクレオシドにより(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に)置き換えられているある実施態様において、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。
ある実施態様において、ウリジンを置き換える修飾ウリジンは、シュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)、５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)いおけるウリジンを(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に)置き換える修飾ヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン(ｍ３Ｕ)、５－メトキシ－ウリジン(ｍｏ５Ｕ)、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン(ｓ２Ｕ)、４－チオ－ウリジン(ｓ４Ｕ)、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン(ｈｏ５Ｕ)、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン(例えば、５－ヨード－ウリジノル５－ブロモ－ウリジン)、ウリジン５－オキシ酢酸(ｃｍｏ５Ｕ)、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル(ｍｃｍｏ５Ｕ)、５－カルボキシメチル－ウリジン(ｃｍ５Ｕ)、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン(ｃｈｍ５Ｕ)、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル(ｍｃｈｍ５Ｕ)、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン(ｍｃｍ５Ｕ)、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン(ｍｃｍ５ｓ２Ｕ)、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－メチルアミノメチル－ウリジン(ｍｎｍ５Ｕ)、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン(ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ)、５－カルバモイルメチル－ウリジン(ｎｃｍ５Ｕ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン(τｍ５Ｕ)、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン(τｍ５ｓ２Ｕ)、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン)、５－メチル－２－チオ－ウリジン(ｍ５ｓ２Ｕ)、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン(ｍ１ｓ４ψ)、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン(ｍ３ψ)、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン(Ｄ)、ジヒドロシュードウリジン、５,６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン(ｍ５Ｄ)、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－(３－アミノ－３－カルボキシプロピル)ウリジン(ａｃｐ３Ｕ)、１－メチル－３－(３－アミノ－３－カルボキシプロピル)シュードウリジン(ａｃｐ３ψ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(ｉｎｍ５Ｕ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)－２－チオ－ウリジン(ｉｎｍ５ｓ２Ｕ)、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン(Ｕｍ)、５,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン(ｍ５Ｕｍ)、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン(ψｍ)、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｓ２Ｕｍ)、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｍｃｍ５Ｕｍ)、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｎｃｍ５Ｕｍ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕｍ)、３,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン(ｍ３Ｕｍ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｉｎｍ５Ｕｍ)、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－ａｒａ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－ａｒａ－ウリジン、５－(２－カルボメトキシビニル)ウリジン、５－[３－(１－Ｅ－プロペニルアミノ)ウリジンまたは当分野で知られる任意の他の修飾ウリジンの何れか１以上であり得る。
(ウリジンを部分的にまたは完全に、好ましくは完全に置き換える)シュードウリジンにより修飾されているＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)はここでは「Ψ修飾」と称し、一方用語「ｍ１Ψ修飾」は、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)はＮ(１)－メチルシュードウリジン(ウリジンを部分的にまたは完全に、好ましくは完全に置き換える)を含むことを意味する。さらに、用語「ｍ５Ｕ修飾」は、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は５－メチルウリジン(ウリジンを部分的にまたは完全に、好ましくは完全に置き換える)を含むことを意味する。このようなΨまたはｍ１Ψまたはｍ５Ｕ修飾ＲＮＡは、通常非修飾形態と比較して免疫原性の減少を示し、故に、免疫応答の誘導は回避または最小化されるべき適用において好ましい。ある実施態様において、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、ウリジンを完全に置き換えるＮ(１)－メチルシュードウリジンを含む。
本明細書に記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)のコドンは、例えば、ＲＮＡのＧＣ含量を増加するためおよび／または目的のペプチドまたはタンパク質を発現する細胞(または対象)において稀なコドンを、該細胞(または対象)において同義高頻度コドンであるコドンに置き換えるためにさらに最適化してよい。ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列は、コドン最適化されたおよび／または野生型コード配列と比較してＧ／Ｃ含量は増加したコード配列によりコードされる。これはまた、コード配列の１以上の配列領域はコドン最適化および／または野生型コード配列の対応する配列領域と比較してＧ／Ｃ含量は増加した実施態様も含む。ある実施態様において、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含量増加は、好ましくはコードするアミノ酸配列の配列を変化させない。
用語「コドン最適化」は、核酸分子のコード領域におけるコドンを、好ましくは核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を改変することなく、宿主生物の典型的コドン利用を反映するよう改変することをいう。本発明の状況内において、コード領域は、好ましくはここに記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)を使用して処置する対象における最適発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、細胞におけるｔＲＮＡの出現における異なる頻度によっても翻訳効率が決定されるとの知見に基づく。故に、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)の配列は、ｔＲＮＡで高頻度に出現するコドンが「稀なコドン」の代わりに挿入され、利用可能であるように修飾され得る。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)のコード領域のグアノシン／シトシン(Ｇ／Ｃ)含量は、野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含量と比較して増加し、ここで、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)によりコードされるアミノ酸配列は、好ましくは野生型ＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列と比較して修飾されていない。このＲＮＡ配列の修飾は、翻訳されるあらゆるＲＮＡ領域の配列は、そのＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)の効率的翻訳に重要であるとの事実に基づく。Ｇ(グアノシン)／Ｃ(シトシン)含量は増加した配列は、Ａ(アデノシン)／Ｕ(ウラシル)含量は増加した配列より安定である。数個のコドンは全く同一のアミノ酸をコードする(いわゆる遺伝子コードの縮重)事実に関し、安定性のための最も好ましいコドンは決定され得る(いわゆる代替コドン利用)。ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)によりコードされるアミノ酸により、野生型配列と比較して、ＲＮＡ配列のする種々の可能性はある。特に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンを、これらのコドンを、同じアミノ酸をコードするが、Ａおよび／またはＵを含まないまたはＡおよび／またはＵヌクレオチド含量は低い他のコドンに置換することにより、修飾し得る。
種々の実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)のコード領域のＧ／Ｃ含量は、野生型ＲＮＡのード領域のＧ／Ｃ含量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％またはそれ以上増加される。
上記修飾の組み合わせ、すなわち、５’キャップ構造の組み込み、ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列のアンマスキング、５’－および／または３’－ＵＴＲの改変(例えば１以上の３’－ＵＴＲの組み込み)、１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置き換え(例えば、シチジンについて５－メチルシチジンおよび／またはウリジンについてシュードウリジン(Ψ)またはＮ(１)－メチルシュードウリジン(ｍ１Ψ)または５－メチルウリジン(ｍ５Ｕ))およびコドン最適化は、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)の安定性に相乗効果を有し、翻訳効率を増加する。故に、ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)、特にここに開示する免疫応答の誘導のための抗原またはエピトープをコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、は、上記修飾、すなわち、(ｉ)５’キャップ構造の組み込み；(ii)ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列のアンマスキング；(iii)５’－および／または３’－ＵＴＲの改変(例えば１以上の３’－ＵＴＲの組み込み)；(iv)１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置き換え(例えば、シチジンについて５－メチルシチジンおよび／またはウリジンについてシュードウリジン(Ψ)またはＮ(１)－メチルシュードウリジン(ｍ１Ψ)または５－メチルウリジン(ｍ５Ｕ))；および(ｖ)コドン最適化の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または全個々の組み合わせを含む。ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)はキャップ１またはキャップ２、好ましくはキャップ１構造を含む。ある実施態様において、ポリＡ配列は、少なくとも１００ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリＡ配列は配列番号１４のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。ある実施態様において、５’－ＵＴＲは配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、３’－ＵＴＲは配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本発明の一部態様は、ここに開示するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)のある細胞または組織への標的化送達に関する。ある実施態様において、本発明は、リンパ系、特に二次性リンパ系臓器、より具体的に脾臓のターゲティングに関する。リンパ系、特に二次性リンパ系臓器、より具体的に脾臓のターゲティングは、投与されるＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)が免疫応答の誘導のための抗原またはエピトープをコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)であるならば、特に好ましい。ある実施態様において、標的細胞は脾臓細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓における樹状細胞である。「リンパ系」は、リンパ液を運ぶリンパ管のネットワークを含む、循環系の一部であり、免疫系の重要な一部である。リンパ系はリンパ性臓器、リンパ管の伝導ネットワークおよび循環リンパ液からなる。一次または中枢リンパ系臓器は、未成熟前駆細胞からリンパ球を産生する。胸腺および骨髄は一次リンパ系臓器を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次性または末梢リンパ系臓器は、成熟ナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。
脂質ベースのＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)送達系は、肝臓に生来の優先性を有する。肝臓蓄積は、肝臓脈管構造の不連続性または脂質代謝(リポソームと脂質またはコレステロールコンジュゲート)により引き起こされる。ある実施態様において、標的臓器は肝臓であり、標的組織は肝臓組織である。このような標的組織への送達は、特に、この臓器または組織へのコード化ペプチドまたはタンパク質の存在が望ましいならばおよび／または大量のコード化ペプチドまたはタンパク質の発現が望まれるならばおよび／または特に相当量のコード化ペプチドまたはタンパク質が全身に存在することが望まれるかまたは必要であるならば、好ましい。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)組成物の投与後、ＲＮＡの少なくとも一部は標的細胞または標的臓器に送達される。ある実施態様において、ＲＮＡの少なくとも一部は標的細胞のサイトゾルに送達される。ある実施態様において、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)であり、ＲＮＡは標的細胞により翻訳されて、該ペプチドまたはタンパク質を産生する。ある実施態様において、標的細胞は肝臓における細胞である。ある実施態様において、標的細胞は筋肉細胞である。ある実施態様において、標的細胞は内皮細胞である。ある実施態様において、標的細胞は腫瘍細胞または腫瘍微小環境の細胞である。ある実施態様において、標的細胞は血液細胞である。ある実施態様において、標的細胞はリンパ節の細胞である。ある実施態様において、標的細胞は肺の細胞である。ある実施態様において、標的細胞は皮膚の細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓における樹状細胞である。ある実施態様において、標的細胞はＴ細胞である。ある実施態様において、標的細胞はＢ細胞である。ある実施態様において、標的細胞はＮＫ細胞である。ある実施態様において、標的細胞は単球である。故に、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物を、このような標的細胞にＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)を送達するために使用し得る。従って、本発明はまたここに記載するＲＮＡ組成物を対象に投与することを含む、対象における標的細胞にＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)を送達する方法に関する。ある実施態様において、ＲＮＡは標的細胞のサイトゾルに送達される。ある実施態様において、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)であり、ＲＮＡは標的細胞により翻訳されて、該ペプチドまたはタンパク質を産生する。
阻害性ＲＮＡ
本発明の全態様のある実施態様において、ＲＮＡは阻害性ＲＮＡである。
ここで使用する用語「阻害性ＲＮＡ」は、標的ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズするおよび／または特異的であり、それによりその転写および／または翻訳を阻害(例えば、減少)する、ＲＮＡを意味する。阻害性ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに対してアンチセンス配向で配列を有するＲＮＡ分子を含む。適当な阻害性オリゴヌクレオチドは、典型的に５～数百ヌクレオチド、より典型的に約２０～７０ヌクレオチド長またはそれより短い、さらにより典型的に約１０～３０ヌクレオチド長まで種々の長さである。阻害性ＲＮＡの例は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む。本発明の全態様のある実施態様において、阻害性ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。
ここで使用する用語「アンチセンスＲＮＡ」は、生理学的条件下、特定の遺伝子を含むＤＮＡまたは該遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし、それにより、該遺伝子の転写および／または該ｍＲＮＡの翻訳を阻害するＲＮＡをいう。アンチセンスＲＮＡまたはその一部は、天然に存在するｍＲＮＡと二重鎖を形成し、故にｍＲＮＡの蓄積または翻訳を阻止する。他の可能性は、核酸不活性化のためのリボザイムの使用である。アンチセンスＲＮＡは、Ｎ末端または５’上流部位、例えば翻訳開始部位、転写開始部位またはプロモーター部位とハイブリダイズし得る。ある実施態様において、アンチセンスＲＮＡは、３’非翻訳領域またはｍＲＮＡスプライシング部位とハイブリダイズし得る。
アンチセンスＲＮＡのサイズは、１５ヌクレオチド～１５,０００、好ましくは２０～１２,０００、特に１００～１０,０００、１５０～８,０００、２００～７,０００、２５０～６,０００、３００～５,０００ヌクレオチド、例えば１５～２,０００、２０～１,０００、２５～８００、３０～６００、３５～５００、４０～４００、４５～３００、５０～２５０、５５～２００、６０～１５０または６５～１００ヌクレオチドまで変わり得る。ある実施態様において、アンチセンスＲＮＡは、少なくとも２,７００ヌクレオチド(例えば少なくとも２,８００、少なくとも２,９００、少なくとも３,０００、少なくとも３,１００、少なくとも３,２００、少なくとも３,３００、少なくとも３,４００、少なくとも３,５００、少なくとも３,６００、少なくとも３,７００、少なくとも３,８００、少なくとも３,９００、少なくとも４,０００、少なくとも４,１００、少なくとも４,２００、少なくとも４,３００、少なくとも４,４００、少なくとも４,５００、少なくとも４,６００、少なくとも４,７００、少なくとも４,８００、少なくとも４,９００、少なくとも５,０００ヌクレオチド)の長さを有する。
アンチセンスＲＮＡの安定性は必要に応じて修飾され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡは、安定化効果を有する１以上の修飾により安定化され得る。このような修飾は、修飾ホスホジエステル結合(例えば天然に存在するホスホジエステル結合の代わりにメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミデート結合)および２’－置換(例えば、２’－フルオロ、２’－Ｏ－アルキル(例えば２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－プロピルまたは２’－Ｏ－ペンチル)および２’－Ｏ－アリル)を含む。例えば、アンチセンスＲＮＡのある実施態様において、ホスホロチオエート結合は部分的にホスホジエステル結合に置換されている。あるいはまたはさらに、アンチセンスＲＮＡのある実施態様において、リボース部分は部分的に２’位をＯ－アルキル(例えば２’－Ｏ－メチル)で置換されている。
アンチセンスＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列(「標的配列」)の何れかにおける約１９～２５連続ヌクレオチドのあらゆるストレッチに対して標的化され得る。一般に、標的ｍＲＮＡの標的配列は、開始コドンから好ましくは５０～１００nt下流(すなわち、３’方向)から開始する、標的ｍＲＮＡに対応するあるｃＤＮＡ配列から選択され得る。しかしながら、標的配列は、５’または３’非翻訳領域または開始コドンに近接する領域に位置し得る。
アンチセンスＲＮＡは、当分野で知られるいくつかの技術を使用して、得ることができる。例えば、アンチセンスＲＮＡは、当分野で知られる方法を使用して、化学合成または組み換えにより産生し得る。好ましくは、アンチセンスＲＮＡは、任意の適当なプロモーターを使用して、組み換え環状または線形ＤＮＡプラスミドから転写される。
アンチセンスＲＮＡの発現に適するプラスミドの選択、アンチセンスＲＮＡを発現するための核酸配列をプラスミドに挿入する方法および該アンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＩＶＴ方法は当分野における技術の範囲内である。
ここで使用する「小干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、標的ｍＲＮＡの一部に特異的に結合できる、好ましくは１０を超えるヌクレオチド長、より好ましくは１５を超えるヌクレオチド長、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長の、ＲＮＡ分子を意味する。この結合ｈは、標的ｍＲＮＡの該部分は切断または分解され、それにより該標的ｍＲＮＡの遺伝子発現は阻害される過程を含む。１９～２５ヌクレオチドの範囲は、ｓｉＲＮＡの最も好ましいサイズである。しかし、原則として、ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、２個の相補的、一本鎖ＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡを含み得て、本発明によると、２個の相補的部分は塩基対合し、一本鎖「ヘアピン」領域により共有結合で結合している単一分子を含む。すなわち、センス領域およびアンチセンス領域は、リンカー分子を介して共有結合で結合され得る。リンカー分子はポリヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーであり得るが、好ましくはポリヌクレオチドリンカーである。何らかの理論に拘束されることを願わないが、ｓｉＲＮＡ分子のヘアピン領域は細胞内で「ダイサー」タンパク質(またはその等価物)により開裂され、２個の個々の塩基対合したＲＮＡ分子のｓｉＲＮＡを形成すると考えられる。
ｓｉＲＮＡはまた３’オーバーハングを含んでよい。ここで使用する「３’オーバーハング」は、ＲＮＡ鎖の３’末端から伸びる少なくとも１個の不対ヌクレオチドをいう。故に、ある実施態様において、ｓｉＲＮＡは、１～約６ヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドを含む)長、好ましくは１～約５ヌクレオチド長、より好ましくは１～約４ヌクレオチド長および特に好ましくは約２～約４ヌクレオチド長の少なくとも１個の３’オーバーハングを含む。ｓｉＲＮＡ分子の両鎖(すなわち、ｓｉＲＮＡ分子は細胞内で「ダイサー」タンパク質により開裂された後)は３’オーバーハングを含む実施態様において、オーバーハングの長さは各鎖で同一でも異なってもよい。ある好ましい実施態様において、３’オーバーハングはｓｉＲＮＡの両鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖はジデオキシチミジル酸(「ＴＴ」)またはジウリジル酸(「ｕｕ」)の３’オーバーハングを含み得る。
ｓｉＲＮＡの安定性を増強するために、３’オーバーハングを分解に対して安定化もし得る。ある実施態様において、オーバーハングは、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドの包含により安定化される。あるいは、ピリミジンヌクレオチドの修飾アナログによる置換、例えば、３’オーバーハングのウリジンヌクレオチドの２’－デオキシチミジンでの置換は許容され、ＲＮＡｉ分解効率に影響しない。特に、２’－デオキシチミジンに２’－ヒドロキシルが存在しないことは、組織培養培地における３’オーバーハングのヌクレアーゼ抵抗性を顕著に増強する。
ここで使用する「標的ｍＲＮＡ」は、下方制御の標的であるＲＮＡ分子をいう。ある実施態様において、標的ｍＲＮＡは、ここに特定する薬学的活性ペプチドまたはポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。ある実施態様において、薬学的活性ペプチドまたはポリペプチドは、発現(特に、例えば、健常対象における発現と比較して増加した発現)は疾患と関連するものである。ある実施態様において、標的ｍＲＮＡは、発現(特に、例えば、健常対象における発現と比較して増加した発現)は癌と関連する薬学的活性ペプチドまたはポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
本発明によると、ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列(「標的配列」)の何れかにおける約１９～２５連続ヌクレオチドのあらゆるストレッチに対して標的化され得る。ｓｉＲＮＡの標的配列を選択する技術は、例えば、引用により本明細書に包含させる２００２年１０月１１日改定のTuschl T. et al., "The siRNA User Guide"に示される。「The siRNA User Guide」は、Dr. Thomas Tuschl, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, New York, USAにより維持されるウェブサイトでワールドワイドウェブ上で利用可能であり、Rockefeller Universityのウェブサイトにアクセスし、キーワード「ｓｉＲＮＡ」で検索することにより、アクセスすることにより見ることができる。標的配列の選択および／またはｓｉＲＮＡの設計に関するさらなるガイダンスは、キーワード「ｓｉＲＮＡ」を使用して、Protocol Online(www.protocol-online.com)のウェブページに見ることができる。故に、ある実施態様において、本発明で使用するｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡにおける約１９～約２５ヌクレオチドの任意の連続ストレッチと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
一般に、標的ｍＲＮＡの標的配列は、好ましくは、開始コドンから５０～１００nt下流(すなわち、３’方向)から開始する、標的ｍＲＮＡに対応するあるｃＤＮＡ配列から選択される。しかしながら、標的配列は５’または３’非翻訳領域または開始コドンに近接する領域に位置し得る。
ｓｉＲＮＡは、当分野で知られるいくつかの技術を使用して、得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、開示全体を引用により本明細書に包含させるTuschl et al.の米国出願２００２／００８６３５６に記載のショウジョウバエインビトロ系などの、当分野で知られる方法を使用して、化学合成または組み換えにより産生し得る。ｓｉＲＮＡは、ｐｏｌ IIIプロモーターからのＲＮＡ発現は最初に転写されたヌクレオチドはプリンであるときのみ効率的であると考えられるため、ターゲティング部位を変化させることなくｐｏｌ III発現ベクターから発現できる。
好ましくは、ｓｉＲＮＡは、任意の適当なプロモーターを使用して、組み換え環状または線形ＤＮＡプラスミドから転写される。プラスミドから本発明で使用するｓｉＲＮＡを転写するための適当なプロモーターは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡｐｏｌ IIIプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターを含む。他の適当なプロモーターの選択は当分野の技術の範囲内である。
ｓｉＲＮＡを転写するための適当なプラスミドの選択、ｓｉＲＮＡを発現するための核酸配列をプラスミドに挿入する方法および該ｓｉＲＮＡのインビトロ転写のＩＶＴ方法は当分野における技術の範囲内である。
ここで使用する用語「ｍｉＲＮＡ」(マイクロＲＮＡ)は、２１～２５(例えば２１～２３、好ましくは２２)ヌクレオチドの長さを有し、標的ｍＲＮＡの分解および／または翻訳阻止を誘導する、非コードＲＮＡに関する。ｍｉＲＮＡは、典型的に植物、動物および一部ウイルスで見られ、それぞれ植物および動物では真核生物核ＤＮＡおよびウイルスＤＮＡ(ゲノムはＤＮＡに基づくウイルスにおいて)によりコードされる。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ複写物(ｍＲＮＡ)の相補的配列に結合し、通常翻訳抑制または標的分解および遺伝子サイレンシングをもたらす転写後制御因子である。
ｍｉＲＮＡは、当分野で知られるいくつかの技術を使用して、得ることができる。例えば、ｍｉＲＮＡは、当分野で知られる方法を使用して、化学合成または組み換えにより産生し得る(例えば、Applied Biological Materials Inc.販売のｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成キットなどの市販キットの使用により)。好ましくは、ｍｉＲＮＡは、任意の適当なプロモーターを使用して、組み換え環状または線形ＤＮＡプラスミドから転写される。
薬学的活性ペプチドまたはポリペプチド
「コード」は、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)などのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列は、生物学的過程におけるヌクレオチドの規定配列(すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)またはアミノ酸の規定配列およびそれに起因する生物学的性質を有する他のポリマーおよび巨大分子の合成の鋳型として役立つ固有の性質をいう。故に、遺伝子は、その遺伝子に対応するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)の転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される、ヌクレオチド配列はＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供される両コード鎖および非コード鎖は、タンパク質またはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称され得る。
ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、１以上のポリペプチド、例えば、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは薬学的活性ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列(例えば、ＯＲＦ)を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは薬学的活性ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列(例えば、ＯＲＦ)を含み、特に細胞または対象に導入されたならば、該ペプチドまたはタンパク質の発現ができる。故に、ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、ペプチドまたはタンパク質をコードする、好ましくは薬学的活性ペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域(ＯＲＦ)を含む。これに関して、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、開始コドンから始まり、停止コドンで終わるコドンの連続的ストレッチである。このような薬学的活性ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、ここでは「薬学的活性ＲＮＡ」(または「薬学的活性ｍＲＮＡ」)とも称する。ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、１を超えるペプチドまたはポリペプチド、例えば、２個、３個、４個またはそれ以上のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
本発明によると、用語「薬学的活性ペプチドまたはタンパク質」は、ペプチドまたはタンパク質の発現が、例えば、疾患または障害の症状の軽減に利益がある、個体の処置に使用できるペプチドまたはタンパク質を意味する。好ましくは、薬学的活性ペプチドまたはタンパク質は、治癒的または緩和的性質を有し、疾患または障害の１以上の症状の改善、緩和、軽減、逆転、発症遅延または重症度低減のために投与し得る。ある実施態様において、薬学的活性ペプチドまたはタンパク質は、治療有効量で個体に投与したとき、個体の状態または疾患状態に良いまたは有利な効果を有する。薬学的活性ペプチドまたはタンパク質は予防的性質を有し得て、疾患または障害の発症遅延またはそのような疾患または障害の重症度低減に使用し得る。用語「薬学的活性ペプチドまたはタンパク質」はタンパク質またはポリペプチド全体を含み、その薬学的活性フラグメントもいい得る。またペプチドまたはタンパク質の薬学的活性アナログも含み得る。
薬学的活性ペプチドおよびタンパク質の具体例は、免疫刺激剤、例えば、サイトカイン、ホルモン、接着分子、免疫グロブリン、免疫学活性化合物、増殖因子、プロテアーゼ阻害剤、酵素、受容体、アポトーシス制御因子、転写因子、腫瘍サプレッサータンパク質、構造タンパク質、再プログラム化因子、ゲノム工学タンパク質および血液タンパク質を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、薬学的活性ペプチドおよびポリペプチドは補充タンパク質を含む。
「免疫刺激剤」は、免疫系の成分の何れか、特に免疫エフェクター細胞の活性化誘導または活性増加により、免疫系を刺激する、あらゆる物質である。免疫刺激剤は、炎症促進性(例えば、感染または癌を処置するとき)または抗炎症性(例えば、自己免疫性疾患を処置するとき)であり得る。
ある実施態様において、免疫刺激剤はサイトカインまたはそのバリアントである。サイトカインの例は、インターフェロン、例えばインターフェロン－アルファ(ＩＦＮ－α)またはインターフェロン－ガンマ(ＩＦＮ－γ)、インターロイキン、例えばＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５およびＩＬ２３、コロニー刺激因子、例えばＭ－ＣＳＦおよびＧＭ－ＣＳＦおよび腫瘍壊死因子を含む。他の態様によると、免疫刺激剤は、ＡＰＣトール様受容体アゴニストまたは共刺激／細胞接着膜タンパク質などのアジュバント型免疫刺激剤を含む。トール様受容体アゴニストの例は、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＩＣＡＭ－１などの共刺激／接着タンパク質を含む。
用語「サイトカイン」は、約５～６０kDa(例えば約５～２０kDa)の分子量を有し、細胞シグナル伝達(例えば、傍分泌、内分泌および／または自己分泌シグナル伝達)に参加するタンパク質に関する。特に、放出されたとき、サイトカインは、放出部位周囲の細胞の行動に効果を発揮する。サイトカインの例は、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子(ＴＮＦｓ)を含む。本発明によると、サイトカインはホルモンまたは増殖因子を含まない。サイトカインは、ホルモンと、(ｉ)通常ホルモンよりはるかに可変性の濃度で活性であり、(ii)一般に広範囲の細胞により産生される(ほぼ全ての有核細胞はサイトカインを産生できる)点で、異なる。インターフェロンは、通常抗ウイルス、抗増殖性および免疫調節活性により特徴づけられる。インターフェロンは、制御細胞表面のインターフェロン受容体への結合により、細胞内の遺伝子の転写を改変および制御し、それにより細胞内のウイルス複製を阻止するタンパク質である。インターフェロンは２タイプに分類され得る。ＩＦＮ－ガンマは唯一II型インターフェロンである；残りのその他はＩ型インターフェロンである。サイトカインの具体例はエリスロポエチン(ＥＰＯ)、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ－ＣＳＦ)、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ－ＣＳＦ)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、インターフェロンアルファ(ＩＦＮα)、インターフェロンベータ(ＩＦＮβ)、インターフェロンガンマ(ＩＮＦγ)、インターロイキン２(ＩＬ－２)、インターロイキン４(ＩＬ－４)、インターロイキン１０(ＩＬ－１０)、インターロイキン１１(ＩＬ－１１)、インターロイキン１２(ＩＬ－１２)およびインターロイキン２１(ＩＬ－２１)を含む。
本開示によると、サイトカインは天然に存在するサイトカインまたはその機能的フラグメントもしくはバリアントであり得る。サイトカインはヒトサイトカインであってよく、あらゆる脊椎動物、特にあらゆる哺乳動物に由来し得る。ある特に好ましいサイトカインはインターフェロン－αである。
免疫刺激剤は、肝臓または肝臓組織へのＲＮＡの優先的送達のための製剤の免疫刺激剤をコードするＲＮＡを対象に投与することにより、対象に提供され得る。そのような標的臓器または組織へのＲＮＡの送達は、特に、大量の免疫刺激剤の発現が望ましいならばおよび／または特に相当量での免疫刺激剤は全身に存在することが望ましいかまたは必要であるならば、好ましい。ＲＮＡ送達系は、肝臓に生来の優先性を有する。これは脂質ベースの粒子、カチオン性および中性ナノ粒子、特に脂質ナノ粒子に関する。
肝臓をターゲティングするための適当な免疫刺激剤の例は、Ｔ細胞増殖および／または維持に関与するサイトカインである。適当なサイトカインの例は、ＩＬ２またはＩＬ７、そのフラグメントおよびバリアントおよびこれらサイトカイン、フラグメントおよびバリアントの融合タンパク質、例えば拡張ＰＫサイトカインを含む。
他の実施態様において、免疫刺激剤をコードするＲＮＡを、リンパ系、特に二次性リンパ系臓器、より具体的に脾臓へのＲＮＡの優先的送達のための製剤で投与し得る。そのような標的組織への免疫刺激剤の送達は、特に、免疫刺激剤のこの臓器または組織における存在が望ましいならば、好ましいは(例えば、免疫応答の誘導のために、特にサイトカインなどの免疫刺激剤はＴ細胞プライミング中または常在免疫細胞の活性化に必要であるとき)、免疫刺激剤は、特に、相当量で全身に存在することは望まれない(例えば、免疫刺激剤は全身毒性を有するため)。
適当な免疫刺激剤の例は、Ｔ細胞プライミングに関与するサイトカインである。適当なサイトカインの例は、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－β、そのフラグメントおよびバリアントおよびこれらサイトカイン、フラグメントおよびバリアントの融合タンパク質、例えば拡張ＰＫサイトカインを含む。
インターフェロン(ＩＦＮ)は、ウイルス、細菌、寄生虫などのいくつかの病原体およびまた腫瘍細胞の存在に応答して、宿主細胞により産生および放出される一群のシグナル伝達タンパク質である。典型的シナリオにおいて、ウイルス感染細胞は、近隣細胞の抗ウイルス防御増大を引き起こすインターフェロンを放出する。
シグナル伝達する受容体のタイプに基づき、インターフェロンは典型的にＩ型インターフェロン、II型インターフェロンおよびIII型インターフェロンの３群に分けられる。
Ｉ型インターフェロンは全てＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ－α／β受容体(ＩＦＮＡＲ)として知られる特異的細胞表面受容体複合体に結合する。
ヒトに存在するＩ型インターフェロンは、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮε、ＩＦＮκおよびＩＦＮωである。一般に、Ｉ型インターフェロンは、体は侵入してきたウイルスを認識したとき産生される。それらは線維芽細胞および単球により産生される。放出されたら、Ｉ型インターフェロンは標的細胞の特異的受容体に結合し、ウイルスはＲＮＡおよびＤＮＡを産生し、複製することを阻止するタンパク質の発現に至る。
ＩＦＮαタンパク質は、主に形質細胞様樹状細胞(ｐＤＣ)により産生される。主に、ウイルス感染に対する自然免疫に関与する。合成を担う遺伝子は、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１と称される１３サブタイプある。これらの遺伝子は、染色体９に一体となってクラスターで見られる。
ＩＦＮβタンパク質は、線維芽細胞により大量に賛成される。主に自然免疫応答に関与する抗ウイルス活性を有する。ＩＦＮβ１およびＩＦＮβ３の２タイプのＩＦＮβは記載されている。ＩＦＮβ１の天然および組み換え形態は、抗ウイルス、抗細菌および抗癌性質を有する。
II型インターフェロン(ヒトにおけるＩＦＮγ)は免疫インターフェロンとしても知られ、ＩＬ１２により活性化される。さらに、II型インターフェロンは細胞毒性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞により放出される。
III型インターフェロンは、ＩＬ１０Ｒ２(別名ＣＲＦ２－４)およびＩＦＮＬＲ１(別名ＣＲＦ２－１２)からなる受容体複合体を介してシグナル伝達する。Ｉ型およびII型ＩＦＮより発見は新しいは、最近の情報は、III型ＩＦＮのあるタイプのウイルスまたは真菌感染における重要性を示す。
一般に、Ｉ型およびII型インターフェロンは免疫応答の制御および活性化を担う。
本開示によると、Ｉ型インターフェロンは好ましくはＩＦＮαまたはＩＦＮβ、より好ましくはＩＦＮαである。
本開示によると、インターフェロンは天然に存在するインターフェロンまたはその機能的フラグメントもしくはバリアントであり得る。インターフェロンはヒトインターフェロンであってよく、あらゆる脊椎動物、特にあらゆる哺乳動物に由来し得る。
インターロイキン(ＩＬ)は、特徴的構造特性に基づき４個の主要な群に分割され得る一群のサイトカイン(分泌型タンパク質およびシグナル分子)である。しかしながら、アミノ酸配列類似性はむしろ弱い(典型的に１５～２５％同一性)。ヒトゲノムは、５０を超えるインターロイキンおよび関連タンパク質をコードする。
本開示によると、インターロイキンは天然に存在するインターロイキンまたはその機能的フラグメントもしくはバリアントであり得る。インターロイキンはヒトインターロイキンであってよく、あらゆる脊椎動物、特にあらゆる哺乳動物に由来し得る。
ここに記載する免疫刺激剤ポリペプチドは、免疫刺激剤部分および異種ポリペプチド(すなわち、免疫刺激剤ではないポリペプチド)を含む融合またはキメラポリペプチドとして製造できる。免疫刺激剤は、循環半減期を延長する拡張ＰＫ基に融合し得る。拡張ＰＫ基の非限定的例は下に記載する。サイトカインなどの免疫刺激剤またはそのバリアントの循環半減期を延長する他のＰＫ基も本発明において適用可能であることは理解されるべきである。ある実施態様において、拡張ＰＫ基は血清アルブミンドメイン(例えば、マウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン)である。
ここで使用する用語「ＰＫ」は「薬物動態(pharmacokinetic)」の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝および排除を含む、化合物の性質を包含する。ここで使用する「拡張ＰＫ基」は、生物学的活性分子に融合したときまたは一緒に投与されたとき、生物学的活性分子の循環半減期を延長するタンパク質、ペプチドまたは部分をいう。拡張ＰＫ基の例は、血清アルブミン(例えば、ＨＳＡ)、免疫グロブリンＦｃまたはそのＦｃフラグメントおよびバリアント、トランスフェリンおよびそのバリアントおよびヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)結合剤(米国公開２００５／０２８７１５３および２００７／０００３５４９に開示)を含む。拡張ＰＫ基の他の例は、引用により全体として本明細書に包含させるKontermann, Expert Opin Biol Ther, 2016 Jul;16(7):903-15に開示される。ここで使用する「拡張ＰＫ」免疫刺激剤は、拡張ＰＫ基と組み合わせた免疫刺激剤部分をいう。ある実施態様において、拡張ＰＫ免疫刺激剤は、免疫刺激剤部分は拡張ＰＫ基に結合または融合した融合タンパク質である。
ある実施態様において、拡張ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は、免疫刺激剤単独(すなわち、拡張ＰＫ基に融合していない免疫刺激剤)と比較して延長する。ある実施態様において、拡張ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は、免疫刺激剤単独の血清半減期に対して少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも１２０％、少なくとも１５０％、少なくとも１８０％、少なくとも２００％、少なくとも４００％、少なくとも６００％、少なくとも８００％または少なくとも１０００％長い。ある実施態様において、拡張ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は、免疫刺激剤単独の血清半減期より少なくとも１.５倍、２倍、２.５倍、３倍、３.５倍、４倍、４.５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍または５０倍長い。ある実施態様において、拡張ＰＫ免疫刺激剤の血清半減期は少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間または２００時間である。
ここで使用する「半減期」は、ペプチドまたはポリペプチドなどの化合物の血清または血漿濃度が、例えば、天然機構による分解および／またはクリアランスまたは隔離により、インビボで５０％減少する時間である。ここで使用するのに適する拡張ＰＫ免疫刺激剤は、例えば、分解および／またはクリアランスまたは隔離に耐える血清アルブミン(例えば、ＨＳＡまたはＭＳＡ)への融合により、インビボで安定化され、半減期は延長する。半減期は、薬物動態分析などのそれ自体既知の任意の方法で決定され得る。適当な技術は当業者には明らかであり、例えば一般に適当な用量のアミノ酸配列または化合物を対象に適切に投与し；一定間隔で該対象から血液サンプルまたは他のサンプルを採取し；該血液サンプル中のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定し；そして、そうして得たデータ(のプロット)から、アミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度は投与時の初期レベルと比較して５０％減少するまでの時間を計算する工程を含む。さらなる詳細は、例えば、Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996)などの標準ハンドブックに提供される。Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)もまた参照のこと。
ある実施態様において、拡張ＰＫ基は、血清アルブミンまたはそのフラグメントまたは血清アルブミンもしくはそのフラグメントのバリアントを含む(その全て、本発明の目的で用語「アルブミン」に含まれる)。ここに記載するポリペプチドをアルブミン(またはそのフラグメントもしくはバリアント)に融合して、アルブミン融合タンパク質を形成し得る。そのようなアルブミン融合タンパク質は米国公開２００７００４８２８２に記載されている。
ここで使用する「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１分子のアルブミン(またはそのフラグメントもしくはバリアント)と少なくとも１分子の治療タンパク質、特に免疫刺激剤などのタンパク質の融合により形成されたタンパク質をいう。アルブミン融合タンパク質は、治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドがインフレームでアルブミンをコードするポリヌクレオチドと結合する核酸の翻訳により産生され得る。治療タンパク質およびアルブミンは、アルブミン融合タンパク質の一部となったら、各々アルブミン融合タンパク質の「部」、「領域」または「部分」(例えば、「治療タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」)と称され得る。高度に好ましい実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、少なくとも１分子の治療タンパク質(治療タンパク質の成熟形態を含むが、これに限定されない)および少なくとも１分子のアルブミン(アルブミンの成熟形態を含むが、これに限定されない)を含む。ある実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、投与ＲＮＡの標的臓器の細胞、例えば肝臓細胞などの宿主細胞によりプロセシングされ、循環に分泌される。ＲＮＡ発現に使用する宿主細胞の分泌経路で起こる発生期アルブミン融合タンパク質のプロセシングは、シグナルペプチド切断；ジスルフィド結合形成；適切な折り畳み；炭水化物(例えば、Ｎ－およびＯ結合グルコシル化など)付加およびプロセシング；特異的タンパク分解的切断；および／または多量体タンパク質への集合を含み得るが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは特にＮ末端にシグナルペプチドを有するプロセシングされていない形態のＲＮＡによりコードされ、細胞による分泌後、好ましくは特にシグナルペプチドは開裂されたプロセシングされた形態で存在する。最も好ましい実施態様において、「プロセシングされた形態のアルブミン融合タンパク質」は、Ｎ末端シグナルペプチド切断を受けているアルブミン融合タンパク質生成物をいい、ここでは「成熟アルブミン融合タンパク質」とも称する。
好ましい実施態様において、治療タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合していないときの同じ治療タンパク質の血漿安定性と比較して、血漿安定性が高い。血漿安定性は、典型的に治療タンパク質はインビボで投与され、血流に運搬されるときと、治療タンパク質は分解され、血流から最終的に治療タンパク質を体から除去する腎臓または肝臓などの臓器に入るときの間の時間をいう。血漿安定性は、血流中の治療タンパク質の半減期の点で計算される。血流中の治療タンパク質の半減期は、当分野で知られる一般的アッセイにより容易に決定され得る。
ここで使用する「アルブミン」は、まとめて、アルブミンの１以上の機能的活性(例えば、生物学的活性)を有するアルブミンタンパク質またはアミノ酸配列またはアルブミンフラグメントまたはバリアントをいう。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアント、特にヒトアルブミンまたは他の脊椎動物からのアルブミンの成熟形態またはそのフラグメントまたはこれらの分子のバリアントをいう。アルブミンは、あらゆる脊椎動物、特にあらゆる哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジまたはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンは、雌鶏およびサケを含むが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療タンパク質部分と異なる動物からであってよい。
ある実施態様において、アルブミンはヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)またはそのフラグメントもしくはバリアント、例えばＵＳ５,８７６,９６９、ＷＯ２０１１／１２４７１８、ＷＯ２０１３／０７５０６６およびＷＯ２０１１／０５１４７８９に開示のものである。
用語ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)およびヒトアルブミン(ＨＡ)はここでは相互交換可能に使用する。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」はより広く、ヒト血清アルブミン(およびそのフラグメントおよびバリアント)ならびに他の種からのアルブミン(およびそのフラグメントおよびバリアント)を包含する。
ここで使用する治療タンパク質の治療活性または血漿安定性の延長に十分なアルブミンのフラグメントは、アルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分の血漿安定性は、非融合状態の血漿安定性と比較して、延長または拡大するようにタンパク質の治療活性または血漿安定性を安定化または延長するのに十分な長さまたは構造のアルブミンのフラグメントをいう。
アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は完全長のアルブミン配列を含んでよくまたは治療活性または血漿安定性を安定化または延長できる１以上のそのフラグメントを含んでよい。このようなフラグメントは１０以上のアミノ酸長であってよくまたはアルブミン配列からの約１５、２０、２５、３０、５０以上連続アミノ酸を含んでよくまたはアルブミンの特異的ドメインの一部または全てを含んでよい。例えば、最初の２個の免疫グロブリン様ドメインにわたるＨＳＡの１以上のフラグメントを使用し得る。好ましい実施態様において、ＨＳＡフラグメントはＨＳＡの成熟形態である。
一般的に言って、アルブミンフラグメントまたはバリアントは少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。
本開示によると、アルブミンは天然に存在するアルブミンまたはそのフラグメントもしくはバリアントであってよい。アルブミンはヒトアルブミンであってよく、あらゆる脊椎動物、特にあらゆる哺乳動物に由来し得る。
ある実施態様において、アルブミン融合タンパク質はＮ末端部分としてアルブミンおよびＣ末端部分として治療タンパク質を含む。あるいは、Ｃ末端部分としてアルブミンおよびＮ末端部分として治療タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質も使用し得る。他の実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端およびＣ末端両方に融合した治療タンパク質を有する。好ましい実施態様において、Ｎ末端およびＣ末端に融合した治療タンパク質は同じ治療タンパク質である。他の好ましい実施態様において、Ｎ末端およびＣ末端に融合した治療タンパク質は異なる治療タンパク質である。ある実施態様において、異なる治療タンパク質は両方サイトカインである。
ある実施態様において、治療タンパク質は、ペプチドリンカーを介してアルブミンに結合する。融合部分の間のペプチドリンカーは部分間の物理的分離を大きくし、故に、例えば、その同族受容体への結合について治療タンパク質部分の接近可能性を最大化し得る。ペプチドリンカーは、柔軟またはより剛性であるようなアミノ酸からなり得る。リンカー配列はプロテアーゼまたは化学的に開裂し得る。
ここで使用する用語「Ｆｃ領域」は、天然免疫グロブリンの、その２個の重鎖の各Ｆｃドメイン(またはＦｃ部分)から形成される部分をいう。ここで使用する用語「Ｆｃドメイン」は、単一免疫グロブリン(Ｉｇ)重鎖の部分またはフラグメントであり、ここで、ＦｃドメインはＦｖドメインを含まない。ある実施態様において、Ｆｃドメインはパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域から始まり、抗体のＣ末端で終わる。従って、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジ(例えば、上部、中央および／または下部ヒンジ領域)ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインまたはそのバリアント、部分もしくはフラグメントの少なくとも１個を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン(すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン)を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合したヒンジドメイン(またはその一部)を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合したＣＨ２ドメイン(またはその一部)を含む。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン(またはその一部)およびＣＨ３ドメイン(またはその一部)からなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン(またはその一部)およびＣＨ３ドメインからなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン(またはその一部)およびＣＨ２ドメイン(またはその一部)からなる。ある実施態様において、Ｆｃドメインは、少なくともＣＨ２ドメインの一部(例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部)を欠く。ここでのＦｃドメインは、一般に免疫グロブリン重鎖鎖のＦｃドメインの全てまたは一部を含むポリペプチドをいう。これは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン全体を含むポリペプチドならびに、例えば、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含むそのようなペプチドのフラグメントを含むが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、どんな種の免疫グロブリンおよび／または、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体を含むが、これらに限定されないどんなサブタイプに由来してもよい。Ｆｃドメインは天然ＦｃおよびＦｃバリアント分子を含む。ここに示すとおり、あらゆるＦｃドメインを、天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインとアミノ酸配列は変わるように修飾し得ることは当業者により認識される。ある実施態様において、Ｆｃドメインのエフェクター機能(例えば、ＦｃγＲ結合)は低減している。
ここに記載するポリペプチドのＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子由来のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインおよびＩｇＧ３分子由来のヒンジ領域を含み得る。他の例で、Ｆｃドメインは、一部ＩｇＧ１分子および一部ＩｇＧ３分子由来のキメラヒンジ領域を含み得る。他の例で、Ｆｃドメインは一部ＩｇＧ１分子および一部ＩｇＧ４分子由来のキメラヒンジ領域を含み得る。
ある実施態様において、拡張ＰＫ基は、ＦｃドメインまたはそのフラグメントまたはＦｃドメインもしくはそのフラグメントのバリアント(その全て、本発明の目的で用語「Ｆｃドメイン」に含まれる)を含む。Ｆｃドメインは抗原に結合する可変領域を含まない。本発明での使用に適するＦｃドメインは、いくつかの異なる源から得ることができる。ある実施態様において、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリン由来である。ある実施態様において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１定常領域からである。しかしながら、Ｆｃドメインは、例えば、齧歯類(例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット)または非ヒト霊長類(例えばチンパンジー、マカク)種を含む他の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることは理解される。
さらに、Ｆｃドメイン(またはそのフラグメントもしくはバリアント)は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含むあらゆる免疫グロブリンクラスならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むあらゆる免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。
多様なＦｃドメイン遺伝子配列(例えば、マウスおよびヒト定常領域遺伝子配列)は、公的にアクセス可能なデポジットの形で利用可能である。特定のエフェクター機能を欠くおよび／または免疫原性を低減するために特定の修飾をされた、Ｆｃドメイン配列を含む定常領域ドメインは選択できる。抗体および抗体コード化遺伝子の多くの配列は公開されており、適当なＦｃドメイン配列(例えばヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３配列またはそのフラグメントもしくはバリアント)を、当分野で認識される技術を使用して、これら配列から導き得る。
ある実施態様において、拡張ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させるＵＳ２００５／０２８７１５３、ＵＳ２００７／０００３５４９、ＵＳ２００７／０１７８０８２、ＵＳ２００７／０２６９４２２、ＵＳ２０１０／０１１３３３９、ＷＯ２００９／０８３８０４およびＷＯ２００９／１３３２０８に記載されるものなどの血清アルブミン結合タンパク質である。ある実施態様において、拡張ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させるＵＳ７,１７６,２７８およびＵＳ８,１５８,５７９に開示のトランスフェリンである。ある実施態様において、拡張ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させるＵＳ２００７／０１７８０８２、ＵＳ２０１４／０２２００１７およびＵＳ２０１７／０１４５０６２のものなどの血清免疫グロブリン結合タンパク質である。ある実施態様において、拡張ＰＫ基は、引用により全体として本明細書に包含させるＵＳ２０１２／００９４９０９に開示のものなどの、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン(Ｆｎ)ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質を製造する方法も、ＵＳ２０１２／００９４９０９に開示される。Ｆｎ３ベースの拡張ＰＫ基の非限定的例はＦｎ３(ＨＳＡ)、すなわち、ヒト血清アルブミンに結合するＦｎ３タンパク質である。
ある実施態様において、本発明での使用に適する拡張ＰＫ免疫刺激剤は、１以上のペプチドリンカーを用い得る。ここで使用する用語「ペプチドリンカー」は、線形アミノ酸配列のポリペプチド鎖における２以上のドメイン(例えば、拡張ＰＫ部分および免疫刺激剤部分)を結合するペプチドまたはポリペプチド配列をいう。例えば、ペプチドリンカーを使用して、免疫刺激剤部分をＨＳＡドメインに結合し得る。
拡張ＰＫ基を、例えば、免疫刺激剤に融合するのに適するリンカーは当分野で周知である。リンカーの例は、グリシン－セリン－ポリペプチドリンカー、グリシン－プロリン－ポリペプチドリンカーおよびプロリン－アラニンポリペプチドリンカーを含む。ある実施態様において、リンカーはグリシン－セリン－ポリペプチドリンカー、すなわち、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドである。
ある実施態様において、薬学的活性ペプチドまたはタンパク質は補充タンパク質を含む。これらの実施態様において、本発明は、対象に補充タンパク質をコードするここに記載するＲＮＡを投与することを含む、タンパク質補充を必要とする障害(例えば、タンパク質欠損障害)を有する対象を処置する方法である。用語「タンパク質補充」は、タンパク質(その機能的バリアントを含む)の、そのようなタンパク質は欠損する対象への導入をいう。本用語はまた他の点でタンパク質の提供は必要なまたは利益はある、例えば、タンパク質不足を有する対象へのタンパク質の導入をいう。用語「タンパク質欠乏により特徴づけられる障害」は、タンパク質はないまたは量は不十分であることにより引き起こされる病理を呈する、あらゆる障害をいう。この用語は、生物学的に不活性なタンパク質生成物をもたらすタンパク質折り畳み障害、すなわち、立体配座障害を含む。タンパク質不足は感染症、免疫抑制、臓器不全、腺問題、放射線障害、栄養欠乏、中毒または他の環境的または外的損傷に関与し得る。
用語「ホルモン」は、腺により産生されるシグナル伝達分子のクラスに関し、ここで、シグナル伝達は、通常次の工程を含む：(ｉ)特定の組織におけるホルモンの合成；(ii)保存および分泌；(iii)標的へのホルモンの輸送；(iv)受容体によるホルモンの結合；(ｖ)シグナルの中継および増幅；および(vi)ホルモンの分解。ホルモンは、サイトカインと、(１)ホルモンは通常活性濃度の変動は少ないおよび(２)一般に特定の種の細胞により産生される点で異なる。ある実施態様において、「ホルモン」は、インスリン、バソプレッシン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)、甲状腺ホルモン、成長ホルモン(例えばヒト成長ホルモンまたはウシソマトトロピン)、オキシトシン、心房ナトリウム利尿ペプチド(ＡＮＰ)、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリンおよびレプチンなどのペプチドまたはタンパク質ホルモンである。
用語「接着分子」は、細胞の表面に位置し、該細胞と他の細胞または細胞外マトリクス(ＥＣＭ)の結合に関与するタンパク質に関する。接着分子は典型的に膜貫通受容体であり、カルシウム非依存性(例えば、インテグリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、リンパ球ホーミング受容体)およびカルシウム依存性(カドヘリンおよびセレクチン)に分類できる。接着分子の具体例は、インテグリン、リンパ球ホーミング受容体、セレクチン(例えば、Ｐ－セレクチン)およびアドレッシンである。
インテグリンはまたシグナル伝達に関与する。特に、リガンド結合により、インテグリンは細胞シグナル伝達経路、例えば、受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)などの膜貫通タンパク質キナーゼの経路を調節する。このような制御は細胞増殖、分裂、生存もしくは分化またはアポトーシスに至る。ｆインテグリンの具体例は、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、αＬβ２、αＭβ２、αIIｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８およびα６β４を含む。
用語「免疫グロブリン」または「免疫グロブリンスーパーファミリー」は、細胞の認識、結合および／または接着過程に関与する分子をいう。このスーパーファミリーに属する分子は、免疫グロブリンドメインまたは折り畳みとして領域との特性を共有する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、抗体(例えば、ＩｇＧ)、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)、主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)分子、共受容体(例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９)、抗原受容体アクセサリー分子(例えば、ＣＤ－３γ、ＣＤ３－δ、ＣＤ－３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ)、共刺激または阻害性分子(例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６)およびその他を含む。
用語「免疫学活性化合物」は、好ましくは免疫細胞の成熟誘導および／または抑制、サイトカイン生合成誘導および／または抑制により免疫応答を変えるおよび／またはＢ細胞による抗体産生刺激により液性免疫を改変する、あらゆる化合物に関する。免疫学活性化合物は、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を含むが、これらに限定されない強力な免疫刺激活性を有し、また免疫応答の他の態様を下方制御する、例えば免疫応答をＴＨ２免疫応答から離すことはでき、広範なＴＨ２介在疾患に有用である。免疫学活性化合物はワクチンアジュバントとして有用であり得る。免疫学活性化合物の具体例は、インターロイキン、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ－ＣＳＦ)、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ－ＣＳＦ)、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、インターフェロン、インテグリン、アドレッシン、セレクチン、ホーミング受容体および抗原、特に腫瘍関連抗原、病原体関連抗原(例えば細菌、寄生虫またはウイルス抗原)、アレルゲンおよび自己抗原を含む。好ましい免疫学活性化合物はワクチン抗原、すなわち、対象への接種は免疫応答を誘導する抗原である。
ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)は、対象における抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含む。「対象における抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含むペプチドまたはポリペプチド」はまたここでは「ワクチン抗原」、「ペプチドおよびタンパク質抗原」または単に「抗原」とも称する。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)は、ＲＮＡを投与された対象の細胞、例えば、抗原提示細胞(ＡＰＣ)への侵入により、各タンパク質に翻訳される一本鎖、５’キャップ化ｍＲＮＡである。好ましくは、ＲＮＡは、(ｉ)安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性のために最適化された構造要素を含む(５’キャップ、５’ ＵＴＲ、３’ ＵＴＲ、ポリ(Ａ)配列)；(ii)ＲＮＡの有効性の最適化のために修飾されている(例えば、翻訳有効性増加、免疫原性減少および／または細胞毒性減少)(例えば、天然に存在するヌクレオシド(特にシチジン)を、合成ヌクレオシド(例えば、シュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジンからなる群から選択される修飾ヌクレオシド)で(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に)置き換えることにより)または(iii)(ｉ)および(ii)両方である。
ある実施態様において、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)は、ＲＮＡの５’末端の特異的キャッピング構造として利用される。ある実施態様において、５’－ＵＴＲは配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、３’－ＵＴＲは、配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列は１１０ヌクレオチド長であり、３０アデノシン残基のストレッチ、続いて１０ヌクレオチドリンカー配列および他の７０アデノシン残基からなる。このポリ(Ａ)配列は、樹状細胞におけるＲＮＡ安定性および翻訳効率の増強のために設計された。ある実施態様において、ポリ(Ａ)配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列または配列番号１４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ＲＮＡは、ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、ウリジンを(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に)置き換える修飾ヌクレオシドは、シュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジンからなる群から選択される。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ａ)コドン最適化されている、(ｂ)野生型コード配列と比較してＧ／Ｃ含量は増加しているまたは(ｃ)(ａ)および(ｂ)両方であるコード配列を有する。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ワクチン抗原を提供するために対象の細胞で発現される。ある実施態様において、ワクチン抗原の発現は細胞表面である。ある実施態様において、ワクチン抗原は、ＭＨＣにより提示される。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、対象の細胞で一過性に発現される。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは全身投与される。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの全身投与後、脾臓でワクチン抗原をコードするＲＮＡは発現される。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの全身投与後、抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞でワクチン抗原をコードするＲＮＡは発現される。ある実施態様において、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞からなる群から選択される。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの全身投与後、肺および／または肝臓でワクチン抗原をコードするＲＮＡの発現はされないまたは本質的にされない。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの全身投与後、脾臓におけるワクチン抗原をコードするＲＮＡの発現は、肺における発現量の少なくとも５倍である。
ワクチン抗原は、対象における抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含む。従って、ワクチン抗原は、対象における抗原に対する免疫応答を誘導するための抗原性配列を含む。このような抗原性配列は、標的抗原または疾患関連抗原、例えば、感染因子のタンパク質(例えば、ウイルスまたは細菌抗原)または腫瘍抗原に対応し得るかまたはその免疫原性バリアントまたは標的抗原または疾患関連抗原またはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに対応し得る。故に、抗原性配列は、標的抗原または疾患関連抗原またはその免疫原性バリアントの少なくとも１エピトープを含み得る。
本発明での使用に適する抗原性配列、例えば、エピトープは、典型的に標的抗原、すなわち免疫応答の誘発対象となる抗原に由来し得る。例えば、ワクチン抗原内に含まれる抗原性配列は、標的抗原または標的抗原のフラグメントもしくはバリアントであり得る。
抗原性配列またはその処理産物、例えば、そのフラグメントは、免疫エフェクター細胞により担持されるＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原受容体に結合し得る。ある実施態様において、抗原性配列は、免疫エフェクター細胞は向かう標的細胞により発現される抗原またはそのフラグメントまたは抗原性配列もしくはフラグメントのバリアントからなる群から選択される。
ワクチン抗原をコードするＲＮＡの投与により、本発明により対象に提供され得るワクチン抗原は、ワクチン抗原は提供される対象において、好ましくは免疫応答の誘導、例えば、免疫エフェクター細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。該免疫応答、例えば、刺激された、プライミングされたおよび／または拡大された免疫エフェクター細胞は、好ましくは標的抗原、特に罹患細胞、組織および／または臓器により発現される標的抗原、すなわち、疾患関連抗原に向かう。故に、ワクチン抗原は、疾患関連抗原またはそのフラグメントもしくはバリアントを含み得る。ある実施態様において、そのようなフラグメントまたはバリアントは、疾患関連抗原と免疫学的に等価である。
本発明の状況において、用語「抗原のフラグメント」または「抗原のバリアント」は、免疫応答の誘導、例えば、免疫エフェクター細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらし、その免疫応答、例えば、刺激された、プライミングされたおよび／または拡大された免疫エフェクター細胞は、特に、罹患細胞、組織および／または臓器により提示されたとき、抗原、すなわち疾患関連抗原を標的とする、薬剤を意味する。故に、ワクチン抗原は疾患関連抗原に対応し得るまたは含み得る、疾患関連抗原のフラグメントに対応し得るまたは含み得るまたは疾患関連抗原またはそのフラグメントと相同である抗原に対応し得るまたは含み得る。ワクチン抗原が疾患関連抗原のフラグメントと相同である疾患関連抗原のフラグメントまたはアミノ酸配列を含むならば、該フラグメントまたはアミノ酸配列は、免疫エフェクター細胞の抗原受容体は標的とする疾患関連抗原のエピトープまたは疾患関連抗原のエピトープと相同である配列を含み得る。故に、本開示によると、ワクチン抗原は、疾患関連抗原の免疫原性フラグメントまたは疾患関連抗原の免疫原性フラグメントと相同であるアミノ酸配列を含み得る。「免疫原性抗原のフラグメント」は、本開示によると、好ましくは、抗原または抗原を発現する細胞に対する免疫応答の誘導、例えば、それに結合する抗原受容体を担持する免疫エフェクター細胞の、刺激、プライミングおよび／または拡大はできる抗原のフラグメントに関する。ワクチン抗原(疾患関連抗原に類似)は、免疫エフェクター細胞に提示される抗原受容体により結合される関連するエピトープを提供するのが好ましい。ある実施態様において、ワクチン抗原またはそのフラグメント(疾患関連抗原に類似)は、免疫エフェクター細胞は結合する関連するエピトープを提供するために、抗原提示細胞などの細胞の表面に発現される(所望によりＭＨＣにより)。ワクチン抗原は組み換え抗原であり得る。
本発明の全態様のある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは対象の細胞で発現され、免疫エフェクター細胞により発現される抗原受容体は結合するための抗原またはその処理産物を提供し、該結合は免疫エフェクター細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。本発明による「抗原」は、免疫応答を誘導するあらゆる物質および／または細胞応答および／または液性応答などの免疫応答または免疫機構は向かうあらゆる物質を含む。これはまた、抗原は抗原ペプチドにプロセシングされ、免疫応答または免疫機構は、特に存在するならばＭＨＣ分子との関連で、１以上の抗原ペプチドに向かう状況も含む。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球(Ｔ細胞)と特異的に反応するペプチドまたはポリペプチドなどのあらゆる物質に関する。用語「抗原」は、Ｔ細胞エピトープなどの少なくとも１個のエピトープを含む分子を含み得る。ある実施態様において、抗原は、所望によりプロセシング後、抗原(抗原を発現する細胞を含む)特異的であり得る免疫反応を誘導する分子である。ある実施態様において、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原または細菌抗原などの疾患関連抗原またはそのような抗原由来のエピトープであり得る。
ある実施態様において、抗原は、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞などの免疫系の細胞の表面に提示されるかまたは存在する。抗原またはＴ細胞エピトープなどのその処理産物は、ある実施態様において、抗原受容体により結合される。従って、抗原またはその処理産物は、Ｔリンパ球(Ｔ細胞)などの免疫エフェクター細胞と特異的に反応し得る。
用語「オート抗原」または「自己抗原」は、対象体内に端を発し(すなわち、自己抗原は「自己由来抗原」とも称され得る)、この正常な体の一部に対し異常に活発な免疫応答を生ずる抗原をいう。自己抗原に対するこのような活発な免疫反応は「自己免疫性疾患」の原因であり得る。
ある実施態様において、抗原は罹患細胞(例えば腫瘍細胞または感染細胞)表面に発現される。ある実施態様において、抗原受容体は、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインのエピトープに結合するＣＡＲである。ある実施態様において、ＣＡＲは、生存細胞表面に提示される抗原の天然エピトープに結合する。ある実施態様において、抗原提示細胞などの細胞に存在する抗原に対してＴ細胞により発現されたときおよび／またはＴ細胞に存在するとき、ＣＡＲの結合は、該Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。ある実施態様において、罹患細胞に存在する抗原に対してＴ細胞により発現されたときおよび／またはＴ細胞に存在するとき、ＣＡＲの結合は、罹患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらし、ここで、該Ｔ細胞は、好ましくは細胞毒性因子、例えば、パーフォリンおよびグランザイムを放出する。
ある実施態様によると、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、抗原性ペプチドまたはポリペプチド(抗原性配列)に直接またはリンカーを介して融合される。従って、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡは、抗原性ペプチドまたはポリペプチドおよび抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列をコードする少なくとも１個のコード領域を含む。
ある実施態様において、抗原をそれをコードするＲＮＡの形態で投与し得るワクチン接種は、天然に存在する抗原またはそのエピトープなどのフラグメントを含む。
そのような抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、好ましくは抗原性ペプチドまたはポリペプチドのＣ末端(および所望により免疫寛容を解除するアミノ酸配列のＣ末端)に位置するが、これに限定されない。ここに定義する抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、好ましくは抗原プロセシングおよび提示を改善する。ある実施態様において、ここに定義する抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体(ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３)由来の配列、特に配列番号３６のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、分泌配列、例えば、配列番号３５のアミノ酸配列を含む配列は、抗原性ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端に融合し得る。
ある実施態様において、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号３６のアミノ酸配列、配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３６のアミノ酸配列または配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
従って、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡは抗原性ペプチドまたはポリペプチドおよび抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列をコードする少なくとも１個のコード領域を含み、ここに記載するとおり該抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、好ましくは抗原性ペプチドまたはポリペプチドに、より好ましくは抗原性ペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に融合されている。
さらに、分泌配列、例えば、配列番号３５のアミノ酸配列を含む配列は、抗原性ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端に融合し得る。
クロストリジウム・テタニの破傷風トキソイド由来のアミノ酸配列を、プライミング中、Ｔ細胞の助けにより、自己抗原に対する免疫応答を効率的に搭載するために、自己耐容性機構に打ち勝つために用い得る。
破傷風トキソイド重鎖は、破傷風ワクチン接種個体ほぼ全てで乱雑にＭＨＣクラスIIアレルに結合し、ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞を誘導できるエピトープを含むことは知られる。さらに、破傷風トキソイド(ＴＴ)ヘルパーエピトープと腫瘍関連抗原の組み合わせは、プライミング中のＣＤ４＋介在Ｔ細胞の助けにより、腫瘍関連抗原単独の適用と比較して免疫刺激を改善することが知られる。意図する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答を打ち負かし得る破傷風配列でのＣＤ８＋ Ｔ細胞刺激のリスクを低減するために、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープを含むことは知られている破傷風トキソイドのフラグメントＣ全体を使用しない。あるいはできるだけ多くのＭＨＣクラスIIアレルとの結合を確実にするために、乱雑に結合するヘルパーエピトープを含む２個のペプチド配列を選択する。エクスビボ試験のデータに基づき、周知エピトープｐ２(QYIKANSKFIGITEL; TT830-844；配列番号４０)およびｐ１６(MTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQG; TT578-609；配列番号４１)を選択した。ｐ２エピトープは、抗黒色腫活性のブーストのために臨床治験におけるペプチドワクチン接種で既に使用された。
非臨床データは、腫瘍抗原＋乱雑に結合破傷風トキソイド配列の両方をコードするＲＮＡワクチンが、腫瘍抗原に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の増強および寛容の解除の改善をもたらすことを示した。腫瘍抗原特異的配列と共にインフレームで融合したこれら配列を含むワクチンをワクチン接種した患者からの免疫モニタリングデータは、選択した破傷風配列はほぼ全患者で破傷風特異的Ｔ細胞応答を誘導できることを確認した。
ある実施態様によると、免疫寛容を解除するアミノ酸配列は、抗原性ペプチドまたはポリペプチドに、直接またはリンカー、例えば、配列番号３８のアミノ酸配列を有するリンカーを介して融合する。
このような免疫寛容を解除するアミノ酸配列は、好ましくは抗原性ペプチドまたはポリペプチドのＣ末端(および所望により抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列のＮ末端、ここで、免疫寛容を解除するアミノ酸配列および抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、直接またはリンカー、例えば、配列番号３９のアミノ酸配列を有するリンカーを介して結合し得る)に位置するが、これに限定されない。ここで定義する免疫寛容を解除するアミノ酸配列は、好ましくはＴ細胞応答を改善する。ある実施態様において、ここで定義する免疫寛容を解除するアミノ酸配列は、破傷風トキソイド由来ヘルパー配列ｐ２およびｐ１６(Ｐ２Ｐ１６)由来配列、特に配列番号３７のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、免疫寛容を解除するアミノ酸配列は、配列番号３７のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３７のアミノ酸配列または配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、免疫寛容を解除するアミノ酸配列は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
次に、ワクチンＲＮＡの実施態様を記載し、ここで、その要素を記載するときに使用するある用語は、次の意味を有する：
キャップ：ｍ２ ７,２’ＯＧ(５’)ｐｐＳｐ(５’)Ｇ(特にそのＤ１ジアステレオマー)、ｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)Ｇおよびｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧからなる群から選択される５’キャップ構造。
ｈＡｇ－コザック：翻訳効率を上げるための最適化‘コザック配列’を伴うヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列。
ｓｅｃ／ＭＩＴＤ：抗原プロセシングおよび提示を改善することは示されている、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体(ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３)をコードする配列由来の融合タンパク質タグ。Ｓｅｃは、発生期ポリペプチド鎖の小胞体への転座をガイドする、分泌シグナルペプチドをコードする７８bpフラグメントに対応する。ＭＩＴＤはＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通および細胞質ドメイン、別名ＭＨＣクラスＩ輸送ドメインに対応する。
抗原：各ワクチン抗原／エピトープをコードする配列。
グリシン－セリンリンカー(ＧＳ)：融合タンパク質で一般に使用されている、主にアミノ酸グリシン(Ｇ)およびセリン(Ｓ)からなる短ペプチドリンカーをコードする配列。
Ｐ２Ｐ１６：免疫寛容を解除するための破傷風トキソイド由来ヘルパーエピトープをコードする配列。
ＦＩ要素：３’－ＵＴＲは、「スプリットのアミノ末端エンハンサー」(ＡＥＳ)ｍＲＮＡ(Ｆと称される)およびミトコンドリアにコードされた１２ＳリボソームＲＮＡ(Ｉと称される)由来の２個の配列要素の組み合わせである。これらは、ＲＮＡ安定性に寄与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択過程により同定された。
Ａ３０Ｌ７０：樹状細胞におけるＲＮＡ安定性および翻訳効率の増強のために設定された、３０アデノシン残基、続いて１０ヌクレオチドリンカー配列および他の７０アデノシン残基のストレッチからなる１１０ヌクレオチド長あるポリ(Ａ)テイル。
ある実施態様において、ワクチンここに記載するＲＮＡは、次の構造の一つを有する。
ｃａｐ－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ(１)－抗原－ＧＳ(２)－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ(３)－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ(１)－抗原－ＧＳ(２)－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ(３)－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
ある実施態様において、ワクチン抗原は、構造：
ｓｅｃ－ＧＳ(１)－抗原－ＧＳ(２)－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ(３)－ＭＩＴＤ
を有する。
ある実施態様において、ｈＡｇ－コザックは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、ｓｅｃは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、Ｐ２Ｐ１６は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＭＩＴＤは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＧＳ(１)は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＧＳ(２)は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＧＳ(３)は、配列番号３９のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＦＩは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、Ａ３０Ｌ７０は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原／エピトープをコードする配列はウリジンを(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に)置き換える修飾ヌクレオシドを含み、ここで、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジンからなる群から選択される。
ある実施態様において、ワクチン抗原／エピトープをコードする配列はコドン最適化されている。
ある実施態様において、ワクチン抗原／エピトープをコードする配列のＧ／Ｃ含量は、野生型コード配列と比較して増加している。
用語「プロフェッショナル抗原提示細胞」は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合性複合体クラスII(ＭＨＣクラスII)分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスII分子複合体と相互作用するならば、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は樹状細胞およびマクロファージを含む。
用語「非プロフェッショナル抗原提示細胞」は、ＭＨＣクラスII分子を構成的にではないが、インターフェロン－ガンマなどのあるサイトカインによる刺激により発現する、抗原提示細胞に関する。例として、非プロフェッショナル抗原提示細胞は、線維芽細胞、胸腺上皮性細胞、甲状腺上皮性細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞を含む。
用語「樹状細胞」(ＤＣ)は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞のサブタイプをいう。ある実施態様において、樹状細胞は造血骨髄前駆細胞由来である。これらの前駆細胞は、最初に未成熟樹状細胞に形質転換する。これらの未成熟細胞は、高食作用活性および低Ｔ細胞活性化能により特徴づけられる。未成熟樹状細胞は、常にウイルスおよび細菌などの病原体について周辺環境をサンプリングする。提示可能抗原と接触したら、成熟樹状細胞へと活性化され、脾臓またはリンパ節に遊走する。未成熟樹状細胞は、病原体を貪食し、タンパク質を小片に分解し、成熟によりこれらフラグメントをＭＨＣ分子を使用して細胞表面に提示する。同時に、Ｔ細胞を活性化する能力を大きく増強するＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化における共受容体として作用する細胞表面受容体を上方制御する。また、樹状細胞の血流を通って脾臓までまたはリンパ系を通ってリンパ節までの移動を誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７も上方制御する。ここで、抗原提示細胞として働き、非抗原特異的共刺激シグナルと並行して、抗原を提示することにより、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。故に、樹状細胞はＴ細胞またはＢ細胞関連免疫応答を能動的に誘導できる。ある実施態様において、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
用語「マクロファージ」は、単球の分化により産生される食細胞のサブグループをいう。炎症、免疫サイトカインまたは微生物生成物により活性化されるマクロファージは、病原体の分解をもたらす加水分解的および酸化的攻撃によりマクロファージ内の外来病原体を非特異的に貪食し、殺す。分解タンパク質からのペプチドはマクロファージ細胞表面に提示され、そこで、Ｔ細胞により認識され得て、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用でき、ＴおよびＢ細胞活性化および免疫応答のさらなる刺激をもたらす。マクロファージは、抗原提示細胞のクラスに属する。ある実施態様において、マクロファージは脾臓マクロファージである。
用語「アレルゲン」は、対象の体外に端を発し(すなわち、アレルゲンは「異種抗原」とも称することはできる)、対象の免疫系は、そうしなければ対象に有害である認知された脅威と戦う異常に活発な免疫応答を生ずる一種の抗原をいう。「アレルギー」は、アレルゲンに対するそのような活発な免疫反応により引き起こされる疾患である。アレルゲンは、通常免疫グロブリン(ＩｇＥ)応答を介してアトピー個体のＩ型過敏症反応を刺激することはできる抗原である。アレルゲンの具体例は、ピーナツタンパク質(例えば、Ａｒａ ｈ ２.０２)、オブアルブミン、牧草花粉タンパク質(例えば、Ｐｈｌ ｐ ５)およびイエダニタンパク質(例えば、Ｄｅｒ ｐ ２)由来のアレルゲンである。
用語「増殖因子」は、細胞増殖、増殖、治癒および／または細胞分化を刺激できる分子をいう。典型的に、増殖因子は、細胞間のシグナル伝達分子として作用する。用語「増殖因子」は、標的細胞の表面の特異的受容体に結合する特定のサイトカインおよびホルモンを含む。増殖因子の例は、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、例えばＶＥＧＦＡ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、インシュリン様増殖因子、エフリン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ニューレグリン、神経栄養因子(例えば、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、神経増殖因子(ＮＧＦ))、胎盤増殖因子(ＰＧＦ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、レナラーゼ(ＲＮＬＳ)(抗アポトーシス生存因子)、Ｔ細胞増殖因子(ＴＣＧＦ)、トロンボポエチン(ＴＰＯ)、トランスフォーミング増殖因子(トランスフォーミング増殖因子アルファ(ＴＧＦ－α)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(ＴＧＦ－β))および腫瘍壊死因子－アルファ(ＴＮＦ－α)を含む。ある実施態様において、「増殖因子」はペプチドまたはタンパク質増殖因子である。
用語「プロテアーゼ阻害剤」は、プロテアーゼの機能を阻害する分子、特にペプチドまたはタンパク質をいう。プロテアーゼ阻害剤は、それは阻害するプロテアーゼにより(例えば、アスパラギンプロテアーゼ阻害剤)または作用機序により(例えば、セルピンなどの自殺阻害剤)分類され得る。プロテアーゼ阻害剤の具体例はセルピン、例えばアルファ１－アンチトリプシン、アプロチニンおよびベスタチンを含む。
用語「酵素」は、化学反応を加速する巨大分子生物学的触媒をいう。あらゆる触媒と同様、酵素は、触媒する反応により消費されず、該反応の平衡を変えない。多くの他の触媒とは異なり、酵素ははるかに特異的である。ある実施態様において、酵素は、対象の恒常性に必須であり、例えば、酵素の何らかの機能不全(特に、変異、欠失または産生減少の何れかにより引き起こされ得る活性減少)は、疾患をもたらす。酵素の例は、単純ヘルペスウイルスタイプ１チミジンキナーゼ(ＨＳＶ１－ＴＫ)、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、シュードコリンエステラーゼおよびラクターゼを含む。
用語「受容体」は、細胞の外からシグナル(特にリガンドと称される化学シグナル)を受信するタンパク質分子をいう。シグナル(例えば、リガンド)の受容体への結合は、細胞にある種の応答、例えば、キナーゼの細胞内活性化を引き起こす。受容体は、膜貫通受容体(例えばイオンチャネル結合(イオンチャネル型)受容体、Ｇタンパク質結合(代謝型)受容体および酵素結合受容体)および細胞内受容体(例えば細胞質受容体および核受容体)。受容体の具体例はステロイドホルモン受容体、増殖因子受容体およびペプチド受容体(すなわち、リガンドはペプチドである受容体)、例えばＰ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１(ＰＳＧＬ－１)を含む。用語「増殖因子受容体」は、増殖因子に結合する受容体をいう。
用語「アポトーシス制御因子」は、アポトーシスを調節する、すなわち、アポトーシスを活性化または阻害する分子、特にペプチドまたはタンパク質をいう。アポトーシス制御因子は、ミトコンドリア機能を制御するものおよびカスパーゼを制御するもの２つの広いクラスに分類され得る。第一クラスは、ミトコンドリア膜電位の喪失および／またはサイトゾルへのシトクロムＣなどのアポトーシス促進性タンパク質の放出の防止により、ミトコンドリア完全性を保持するよう作用するタンパク質(例えば、ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ｘＬ)を含む。またこの第一クラスに属するのは、シトクロムＣの放出を促進するアポトーシス促進性タンパク質(例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＭ)である。第二クラスは、アポトーシスタンパク質阻害剤(例えば、ＸＩＡＰ)またはカスパーゼの活性化を遮断するＦＬＩＰなどのタンパク質を含む。
用語「転写因子」は、特に、特異的ＤＮＡ配列への結合により、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写の速度を制御するタンパク質に関する。転写因子は、一生を通じて細胞分裂、細胞増殖および細胞死；胚発生中の細胞遊走および組織化；および／またはホルモンなどの細胞外からのシグナルに対する応答を制御し得る。転写因子は、通常、該転写因子により制御される遺伝子に隣接して、特異的ＤＮＡ配列に結合する少なくとも１個のＤＮＡ結合ドメインを含む。転写因子の具体例はＭＥＣＰ２、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴタンパク質ファミリーおよびＨＯＸタンパク質ファミリーを含む。
用語「腫瘍サプレッサータンパク質」は、細胞を癌化する過程から保護する分子、特にペプチドまたはタンパク質に関する。腫瘍サプレッサータンパク質(通常対応する腫瘍サプレッサー遺伝子によりコードされる)は、細胞周期の制御に弱化または抑制効果を発揮するおよび／またはアポトーシスを促進する。それらの機能は、次の１以上であり得る：細胞周期の継続に必須の遺伝子の抑制；細胞周期とＤＮＡ損傷のカップリング(細胞に損傷ＤＮＡは存在する限り、細胞分裂は起こらないはずである)；損傷ＤＮＡが修復され得ないならばアポトーシス開始；転移抑制(例えば、腫瘍細胞の分散阻止、接触阻害の喪失遮断および転移阻害)；およびＤＮＡ修復。腫瘍サプレッサータンパク質の具体例はｐ５３、ホスファターゼおよびテンシンホモログ(ＰＴＥＮ)、ＳＷＩ／ＳＮＦ(SWItch／スクロース非発酵性)、フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプレッサー(ｐＶＨＬ)、大腸腺腫症(ＡＰＣ)、ＣＤ９５、腫瘍形成能の抑制５(ＳＴ５)、腫瘍形成能の抑制５(ＳＴ５)、腫瘍形成能の抑制１４(ＳＴ１４)およびＹｉｐｐｅｅ様３(ＹＰＥＬ３)を含む。
用語「構造タンパク質」は、そうでなければ流体である生物学的成分に堅さおよび硬性を与えるタンパク質をいう。構造タンパク質は、大部分線維性(例えばコラーゲンおよびエラスチン)であるが、球状(例えばアクチンおよびチューブリン)でもあり得る。通常、球状タンパク質は、モノマーとして可溶性であるが、重合して、長い、繊維を形成し、例えば、細胞骨格を形成し得る。他の構造タンパク質は、機械力を産生できるモータータンパク質(例えばミオシン、キネシンおよびダイニン)およびサーファクタントプロテインである。構造タンパク質の具体例はコラーゲン、サーファクタントプロテインＡ、サーファクタントプロテインＢ、サーファクタントプロテインＣ、サーファクタントプロテインＤ、エラスチン、チューブリン、アクチンおよびミオシンを含む。
用語「再プログラム化因子」または「再プログラム化転写因子」は、体細胞に、所望により再プログラム化因子などのさらなる因子と共に発現されたとき、該体細胞の幹細胞特徴、特に多能性を有する細胞への再プログラム化または脱分化に至る分子、特にペプチドまたはタンパク質に関する。再プログラム化因子の具体例はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧを含む。
用語「ゲノム工学タンパク質」は、対象のゲノムにおけるＤＮＡの挿入、欠失または置換は可能なタンパク質に関する。ゲノム工学タンパク質の具体例はメガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)および規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列－ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９(ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９)を含む。
用語「血液タンパク質」は、対象の血漿、特に健常対象の血漿に存在するペプチドまたはタンパク質に関する。血液タンパク質は、輸送(例えば、アルブミン、トランスフェリン)、酵素活性(例えば、トロンビンまたはセルロプラスミン)、凝血(例えば、フィブリノゲン)、病原体に対する防御(例えば、補体成分および免疫グロブリン)、プロテアーゼ阻害剤(例えば、アルファ１－アンチトリプシン)などの多様な機能を有する。血液タンパク質の具体例はトロンビン、血清アルブミン、第VII因子、第VIII因子、インスリン、第IX因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、タンパク質Ｃ、フォン・ヴィレブランド因子、アンチトロンビンIII、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ－ＣＳＦ)、修飾第VIII因子および抗凝血因子を含む。
故に、ある実施態様において、薬学的活性ペプチドまたはタンパク質は、(ｉ)好ましくはエリスロポエチン(ＥＰＯ)、インターロイキン４(ＩＬ－２)およびインターロイキン１０(ＩＬ－１１)からなる群から選択される、より好ましくはＥＰＯであるサイトカイン；(ii)接着分子、特にインテグリン；(iii)免疫グロブリン、特に抗体；(iv)免疫学活性化合物、特に抗原、例えばウイルスまたは細菌抗原、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原；(ｖ)ホルモン、特にバソプレッシン、インスリンまたは成長ホルモン；(vi)増殖因子、特にＶＥＧＦＡ；(vii)プロテアーゼ阻害剤、特にアルファ１－アンチトリプシン；(viii)好ましくは単純ヘルペスウイルスタイプ１チミジンキナーゼ(ＨＳＶ１－ＴＫ)、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、シュードコリンエステラーゼ、膵臓酵素およびラクターゼからなる群から選択される酵素；(ix)受容体、特に増殖因子受容体；(ｘ)アポトーシス制御因子、特にＢＡＸ；(xi)転写因子、特にＦＯＸＰ３；(xii)腫瘍サプレッサータンパク質、特にｐ５３；(xiii)構造タンパク質、特にサーファクタントプロテインＢ；(xiv)例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧかｒなある群から選択される再プログラム化因子；(xv)ゲノム工学タンパク質、特に規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列－ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９(ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９)；および(xvi)血液タンパク質、特にフィブリノゲンである。
ある実施態様において、薬学的活性ペプチドまたはタンパク質は１以上の抗原または１以上のエピトープを含み、すなわち、対象へのペプチドまたはタンパク質の投与は、対象における１以上の抗原または１以上のエピトープに対する免疫応答を誘導し、治療または部分的にまたは完全に保護的であり得る。
ある実施態様において、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、少なくとも１個のエピトープ、例えば、少なくとも２個のエピトープ、少なくとも３個のエピトープ、少なくとも４個のエピトープ、少なくとも５個のエピトープ、少なくとも６個のエピトープ、少なくとも７個のエピトープ、少なくとも８個のエピトープ、少なくとも９個のエピトープまたは少なくとも１０個のエピトープをコードする。
ある実施態様において、標的抗原は腫瘍抗原であり、抗原性配列(例えば、エピトープ)は腫瘍抗原由来である。腫瘍抗原は、種々の癌で発現されることは一般に知られる「標準」抗原である。腫瘍抗原はまた、個体の腫瘍に特異的であり、以前は免疫系により認識されていなかった「ネオ抗原」でもよい。ネオ抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化をもたらす癌細胞のゲノムの１以上の癌特異的変異に起因し得る。腫瘍抗原がネオ抗原であるならば、ワクチン抗原は、好ましくは１以上のアミノ酸変化を含む該ネオ抗原のエピトープまたはフラグメントを含む。
腫瘍抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ベータ－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えばクローディン－６、クローディン－１８.２およびクローディン－１２、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ １００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ(またはｈＴＲＴ)、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐｌ９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴおよびＷＴ－１を含むが、これらに限定されない。
癌変異は各個体で異なる。故に、新規エピトープ(ネオエピトープ)をコードする癌変異は、ワクチン組成物および免疫療法の開発における魅力的標的を代表する。腫瘍免疫療法の有効性は、宿主内で強力な免疫応答を誘導できる、癌特異的抗原およびエピトープの選択に依存する。ＲＮＡを、患者への患者特異的腫瘍エピトープの送達に使用できる。脾臓に常在する樹状細胞(ＤＣ)は、腫瘍エピトープなどの免疫原性エピトープまたは抗原のＲＮＡ発現のために特に興味深い抗原提示細胞を表す。複数エピトープの使用は、腫瘍ワクチン組成物の治療有効性を促進することが示されている。腫瘍ミュータノームの迅速なシークエンシングは、例えば、エピトープは所望によりリンカーにより離されている、単一ポリペプチドとして、ここに記載されるＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)によりコードされ得る個別化ワクチンのための複数エピトープを提供し得る。本発明のある実施態様において、ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は、少なくとも１個のエピトープ、少なくとも２個のエピトープ、少なくとも３個のエピトープ、少なくとも４個のエピトープ、少なくとも５個のエピトープ、少なくとも６個のエピトープ、少なくとも７個のエピトープ、少なくとも８個のエピトープ、少なくとも９個のエピトープまたは少なくとも１０個のエピトープをコードする。例示的実施態様は、少なくとも５個のエピトープ(「ペンタトープ」と称する)をコードするＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)および少なくとも１０個のエピトープ(「デカトープ」と称する)をコードするＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)を含む。
ある実施態様において、エピトープは病原体関連抗原由来である。ある実施態様において、薬学的活性ポリペプチドおよび／または抗原またはエピトープは病原体のタンパク質、タンパク質の免疫原性バリアントまたはタンパク質の免疫原性フラグメントもしくはその免疫原性バリアントに由来するかまたはそれである。
ある実施態様において、病原体はウイルス、細菌、真菌、寄生虫および他の微生物から選択される。
ウイルスの例は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(ＳＡＲＳ－ＣｏＶ)、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、エプスタイン・バールウイルス(ＥＢＶ)、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)(例えば、ＣＭＶ５)、ヒトヘルペスウイルス(ＨＨＶ)(例えば、ＨＨＶ６、７または８)、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)、ウシヘルペスウイルス(ＢＨＶ)(例えば、ＢＨＶ４)、ウマヘルペスウイルス(ＥＨＶ)(例えば、ＥＨＶ２)、ヒトＴ細胞白血病ウイルス(ＨＴＬＶ)５、水痘帯状疱疹ウイルス(ＶＺＶ)、麻疹ウイルス、パポーバウイルス(ＪＣおよびＢＫ)、肝炎ウイルス(例えば、ＨＢＶまたはＨＣＶ)、粘液腫ウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、エンテロウイルス、パルボウイルス、ポリオーマウイルス、インフルエンザウイルス、パピローマウイルス(例えばヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ))、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルスおよび伝染性軟属腫ウイルス(ＭＣＶ)、リッサウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、風疹ウイルスおよびムンプスウイルスを含むが、これらに限定されない。ウイルス感染が原因の疾患の例は、ＳＡＲＳ、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス感染、性器ヘルペス、肝炎(例えばＢ型またはＣ型肝炎)、インフルエンザ(インフル、例えばヒトインフルエンザ、ブタインフルエンザ、イヌインフルエンザ、ウマインフルエンザおよびトリインフルエンザ)、ＨＰＶ感染、帯状疱疹、狂犬病、一般的な風邪、胃腸炎、風疹およびムンプスを含むが、これらに限定されない。
細菌の例は、カンピロバクター(例えばカンピロバクター・ジェジュニ)、エンテロバクター種、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・ファエカリス、大腸菌(例えば、F. coli O157:H7)、Ａ群レンサ球菌、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ヘリコバクター・ピロリ、リステリア、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、シュードモナス・エルギノーザ、肺炎球菌、サルモネラ、シゲラ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミデス、ボレリアおよびリケッチア、クラミジア科、Ｎナイセリア・ゴノレー、ボルデテラ・パータシス、クロストリジウム・テタニ、ナイセリア・メニンギティディス、ストレプトコッカス(例えばストレプトコッカス・ニューモニエまたはストレプトコッカス・ピオゲネス)および梅毒トレポネーマを含むが、これらに限定されない。細菌感染が原因の疾患の例は、炭疽、コレラ、ジフテリア、食中毒、ハンセン病、髄膜炎、消化性潰瘍疾患、肺炎、敗血症、敗血症性ショック、破傷風、結核、腸チフス、尿路感染、ライム病、ロッキー山紅斑熱、クラミジア、淋菌、百日咳、破傷風、髄膜炎、猩紅熱および梅毒を含むが、これらに限定されない。
寄生虫の例は、プラスモジウム、トリパノソーマ、リーシュマニア、トリコモナス、ディエンタメーバ、ジアルジア、赤痢アメーバ、ネグレリア、イソスポラ、トキソプラズマ、サルコシスティス、リノスポリジウム・セーベリおよびバランチジウムを含むが、これらに限定されない。寄生虫感染が原因の疾患の例は、マラリア、トリパノソーマ症、シャーガス病、リーシュマニア症、トリコモナス症、二核アメーバ症、ジアルジア症、アメーバ赤痢、コクシジウム症、トキソプラズマ症、肉胞子虫症、リノスポリジウム症およびバランチジウム症を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、病原体は、感染性病原体、特にウイルス疾患、細菌疾患または寄生虫疾患などの感染性疾患を引き起こす病原体である。ある実施態様において、病原体は、ウイルス、細菌または寄生虫である。故に、これらの実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)および／または組成物を該病原体により引き起こされる感染性疾患の予防および／または処置に使用できる。
ある実施態様において、エピトープはウイルス抗原に由来する。
ある実施態様において、抗原またはエピトープは、コロナウイルスＳタンパク質、その免疫原性バリアントまたはコロナウイルスタンパク質またはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに由来する。故に、ある実施態様において、本発明で使用するｍＲＮＡは、コロナウイルスタンパク質、その免疫原性バリアントまたはコロナウイルスタンパク質またはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、抗原またはエピトープは、コロナウイルスＳタンパク質、その免疫原性バリアントまたはコロナウイルスＳタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに由来する。故に、ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)は、コロナウイルスＳタンパク質、その免疫原性バリアントまたはコロナウイルスＳタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、コロナウイルスはＭＥＲＳ－ＣｏＶである。ある実施態様において、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶである。ある実施態様において、コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
コロナウイルスは、エンベロープのある、陽方向鎖、一本鎖ＲＮＡ((＋)ｓｓＲＮＡ)ウイルスである。既知ＲＮＡウイルスの中で最大のゲノム(２６～３２kb)を有し、系統的に４属(α、β、γおよびδ)に分けられ、ベータコロナウイルスはさらに４分化系列(Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ)に細分される。コロナウイルスは、広範なトリおよびヒトを含む哺乳動物種に感染する。一部ヒトコロナウイルスは、一般に軽度呼吸器疾患を引き起こすが、幼児、高齢者および免疫不全者では重症度は大きくなり得る。それぞれベータコロナウイルス分化系列ＣおよびＢに属する中東呼吸器症候群コロナウイルス(ＭＥＲＳ－ＣｏＶ)および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(ＳＡＲＳ－ＣｏＶ)は高度に病原性である。両ウイルスとも、最近１５年以内に動物リザーバーからヒト集団に発生し、大流行を引き起こし、高症例死亡率であった。非定型肺炎(コロナウイルス感染症２０１９；ＣＯＶＩＤ－１９)を引き起こす重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２(ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２)の大流行は、２０１９年１２月半ばから中国で猛威を振るい、国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態にまで進展している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２(ＭＮ９０８９４７.３)は、ベータコロナウイルス系統Ｂに属する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶと少なくとも７０％配列類似性を有する。
一般に、コロナウイルスは４個の構造タンパク質、すなわち、エンベロープ(Ｅ)、膜(Ｍ)、ヌクレオカプシド(Ｎ)およびスパイク(Ｓ)を有する。ＥおよびＭタンパク質はウイルス集合に重要な機能を有し、Ｎタンパク質はウイルスＲＮＡ合成に必要である。重大な糖タンパク質はウイルス結合および標的細胞への侵入を担う。Ｓタンパク質は、一本鎖不活性前駆体として合成され、産生細胞でフーリン様宿主プロテアーゼにより２個の非共有結合で結合したサブユニット、Ｓ１およびＳ２に開裂される。Ｓ１サブユニットは、宿主細胞受容体を認識する受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。Ｓ２サブユニットは、融合ペプチド、２個の７反復および膜貫通ドメインを含み、その全て、大立体配座再配列に付されることにより、ウイルスと宿主細胞膜の融合の介在に必要である。Ｓ１およびＳ２サブユニットは三量体形成して、大きな融合前スパイクを形成する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ前駆体タンパク質はタンパク質分解によりＳ１(６８５ａａ)およびＳ２(５８８ａａ)サブユニットに開裂される。Ｓ１サブユニットは、ウイルスの宿主アンギオテンシン－変換酵素２(ＡＣＥ２)受容体を介する感受性細胞の侵入を介在する受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。
ある実施態様において、抗原またはエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに由来する。故に、ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。故に、ある実施態様において、コード化アミノ酸配列は、対象におけるコロナウイルスＳタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対する免疫応答の誘導のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはその免疫原性バリアントのエピトープを含む。ある実施態様において、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、配列番号１の９８６位および９８７位のプロリン残基は置換された完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードする、ＯＲＦを含む。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号７と少なくとも８０％同一性(例えば少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、少なくとも９１％同一性、少なくとも９２％同一性、少なくとも９３％同一性、少なくとも９４％同一性、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％同一性、少なくとも９７％同一性、少なくとも９８％同一性または少なくとも９９％同一性)を有する。。
ある実施態様において、ＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)を投与して、(適切な標的細胞による発現後)標的抗原(コロナウイルスＳタンパク質、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質)またはその処理産物に向けた、免疫応答、例えば、抗体および／または免疫エフェクター細胞の誘導のための抗原を提供する。ある実施態様において、本発明により誘導される免疫応答はＢ細胞介在免疫応答、すなわち、抗体介在免疫応答である。これに加えてまたはこれとは別に、ある実施態様において、本発明により誘導される免疫応答はＴ細胞介在免疫応答である。ある実施態様において、免疫応答は抗コロナウイルス、特に抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫応答である。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の免疫原性フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。ある実施態様において、本明細書に記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ＲＮＡはポリペプチドの細胞内発現に適するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の受容体結合部分を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。ある実施態様において、このようなコード化ポリペプチドは完全なＳタンパク質を含まない。ある実施態様において、コード化ポリペプチドは、例えば、配列番号５に示す、受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。ある実施態様において、コード化ポリペプチドは、配列番号２９または３１のペプチドを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス完全長スパイク(Ｓ)タンパク質は１２７３アミノ酸からなり、配列番号１に示す次のアミノ酸配列を有する。本発明の目的で、配列番号１に示すアミノ酸配列は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質アミノ酸配列と考えられる。ここで示すＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の位置番号付けは、配列番号１のアミノ酸配列およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントの対応する位置に対する。
具体的実施態様において、配列番号１の完全長スパイク(Ｓ)タンパク質は、プロトタイプ融合前立体構造が安定化されるような方法で修飾される。融合前立体構造の安定化は、完全長スパイクタンパク質のアミノ酸残基９８６および９８７の２連続プロリン置換の導入により得られ得る。具体的に、スパイク(Ｓ)タンパク質安定化タンパク質バリアントは、９８６位のアミノ酸残基はプロリンに交換され、９８７位のアミノ酸残基もプロリンに交換される方法で得られる。ある実施態様において、プロトタイプ融合前立体構造が安定化しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む。
当業者は、種々のスパイクバリアントおよび／またはそれを記載するリソースを知っている。
ある実施態様において、ここに記載する(例えば、本発明の組成物に含まれるおよび／または本発明の方法で使用される)ＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイク(Ｓ)タンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメントを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなるアミノ酸配列をコードする。
配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列、そのバリアントまたはそのフラグメントはここでは「ＲＢＤ」または「ＲＢＤドメイン」とも称する。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、多量体複合体、特に三量体複合体を形成できる。この目的で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列の多量体複合体、特に三量体複合体形成を可能とするドメインを含み得る。ある実施態様において、多量体複合体の形成を可能とするドメインは、三量体化ドメイン、例えば、ここに記載する三量体化ドメインを含む。
ある実施態様において、三量体化ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質に、直接またはリンカー、例えば、グリシン／セリンリンカーを介して融合する。従って、ある実施態様において、三量体化ドメインは、上記コード化アミノ酸配列(これは所望により上記シグナルペプチドに融合していてよい)に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または免疫原性そのフラグメント(抗原性ペプチドまたはタンパク質)由来の上記アミノ酸配列に融合する。
このような三量体化ドメインは好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に位置するが、これに限定されない。ここに定義する三量体化ドメインは、好ましくはＲＮＡによりコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の三量体化を可能とする。ここに定義する三量体化ドメインの例は、Ｔ４フィブリチンの天然三量体化ドメインであるフォルドンを含むが、これらに限定されない。Ｔ４フィブリチン(フォルドン)のＣ末端ドメインはフィブリチン三量体構造の形成に必須であり、人工三量体化ドメインとして使用できる。ある実施態様において、ここに定義する三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、ここに定義する三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、ここに定義する三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列、配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列または配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、三量体化ドメインをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメント(例えば、ここに記載されるとおり)をコードするＲＮＡにより発現されるＲＢＤ抗原は、例えば、免疫原性を増加するため、Ｔ４－フィブリチン由来「フォルドン」三量体化ドメインの付加により修飾され得る。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、コドン最適化されたおよび／または野生型コード配列と比較してＧ／Ｃ含量は増加したコード配列によりコードされ、ここで、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含量増加は、好ましくはコードするアミノ酸配列の配列を変化させない。
ある実施態様において、
(ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは配列番号１または７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列、配列番号１または７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０４９のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０４９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０４９のヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０４９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０４９のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、コード化アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、コード化アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１７～６８３のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、コード化アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１～６８３のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～６８３のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～６８３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、コード化アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１～６８３のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、コード化アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１～６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１～６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～６８５のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～６８５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、コード化アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１～６８５のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は分泌シグナルペプチドを含む。
ある実施態様において、分泌シグナルペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに、好ましくはＮ末端で融合される。
ある実施態様において、
(ｉ)分泌シグナルペプチドをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)分泌シグナルペプチドは配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号６のヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号４のヌクレオチド配列、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号４のヌクレオチド配列または配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列もしくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６、配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列、配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列または配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１８のアミノ酸配列もしくは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様によると、膜貫通ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質に、直接またはリンカー、例えば、グリシン／セリンリンカーを介して融合する。従って、ある実施態様において、膜貫通ドメインは、上記ワクチン抗原(これは所望により上記のとおりシグナルペプチドおよび／または三量体化ドメインに融合していてよい)に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または免疫原性そのフラグメント(抗原性ペプチドまたはタンパク質)由来の上記アミノ酸配列に融合する。このような膜貫通ドメインは好ましくは抗原性ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に位置するが、これに限定されない。好ましくは、このましくは、膜貫通ドメインは、存在するならば、三量体化ドメインのＣ末端に位置するが、これに限定されない。ある実施態様において、三量体化ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメント、すなわち、抗原性ペプチドまたはタンパク質と膜貫通ドメインの間に存在する。ここに定義する膜貫通ドメインは、好ましくはＲＮＡによりコードされる抗原性ペプチドまたはタンパク質の細胞膜への固定を可能とする。
ある実施態様において、ここに定義する膜貫通ドメイン配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の膜貫通ドメイン配列、特に配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含む配列またはその機能的バリアントを含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列は、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列は、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列をコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列もしくは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号２７のヌクレオチド配列、配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２７のヌクレオチド配列または配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列もしくは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号２７のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、上記ワクチン抗原は、上記ワクチン抗原に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または免疫原性そのフラグメント(抗原性ペプチドまたはタンパク質)由来の上記アミノ酸配列からなるまたは本質的にそれからなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルススパイク(Ｓ)タンパク質の連続配列を含む。ある実施態様において、上記ワクチン抗原は、２２０アミノ酸、２１５アミノ酸、２１０アミノ酸または２０５アミノ酸を超えないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルススパイク(Ｓ)タンパク質の連続配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ここにＢＮＴ１６２ｂ１(ＲＢＰ０２０.３)、ＢＮＴ１６２ｂ２(ＲＢＰ０２０.１またはＲＢＰ０２０.２)として記載されるヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ここにＲＢＰ０２０.２として記載するヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２１のヌクレオチド配列、配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むおよび／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２１のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号１９のヌクレオチド配列または２０、配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または２０を含むおよび／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号１９または２０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２０のヌクレオチド配列、配列番号２０のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号４２のアミノ酸配列、配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号４２のアミノ酸配列もしくは配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、
(ｉ)配列番号４３のヌクレオチド配列、配列番号４３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するヌクレオチド配列を含むおよび／または
(ii)配列番号４２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)および(ｉ)配列番号４３のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号４２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、
(ｉ)配列番号４４のヌクレオチド配列、配列番号４４のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するヌクレオチド配列を含むおよび／または
(ii)配列番号４２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)および(ｉ)配列番号４４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号４２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号４５のアミノ酸配列、配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号４５のアミノ酸配列もしくは配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、
(ｉ)配列番号４６のヌクレオチド配列、配列番号４６のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するヌクレオチド配列を含むおよび／または
(ii)配列番号４５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)および(ｉ)配列番号４６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号４５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、
(ｉ)配列番号４７のヌクレオチド配列、配列番号４７のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するヌクレオチド配列を含むおよび／または
(ii)配列番号４５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％または９７％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)および(ｉ)配列番号４７のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号４５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該ＲＮＡは、上記ＲＮＡ修飾の１以上、すなわち、５’キャップ構造の組み込み、ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列のアンマスキング、５’－および／または３’－ＵＴＲの改変(例えば１以上の３’－ＵＴＲの組み込み)、１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置き換え(例えば、シチジンについて５－メチルシチジンおよび／またはウリジンについてシュードウリジン(Ψ)またはＮ(１)－メチルシュードウリジン(ｍ１Ψ)または５－メチルウリジン(ｍ５Ｕ))およびコドン最適化を含む。ある実施態様において、該ＲＮＡは、上記修飾の組み合わせ、好ましくは上記修飾の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個のまたは全５個の組み合わせ、すなわち、(ｉ)５’キャップ構造の組み込み、(ii)ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列のアンマスキング；(iii)５’－および／または３’－ＵＴＲの改変(例えば１以上の３’－ＵＴＲの組み込み)；(iv)１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置き換え(例えば、シチジンについて５－メチルシチジンおよび／またはウリジンについてシュードウリジン(Ψ)またはＮ(１)－メチルシュードウリジン(ｍ１Ψ)または５－メチルウリジン(ｍ５Ｕ))および(ｖ)コドン最適化を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該ＲＮＡは、修飾ＲＮＡ、特に安定化ｍＲＮＡである。ある実施態様において、該ＲＮＡは、少なくとも１個のウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、該ＲＮＡは、は、各ウリジンの代わりになど少なくとも１個のウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは独立してシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される。ある実施態様において、該ＲＮＡは、５’キャップ、好ましくはキャップ１またはキャップ２構造、より好ましくはキャップ１構造を含む。ある実施態様において、該ＲＮＡは、配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。ある実施態様において、該ＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列に対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。ある実施態様において、該ＲＮＡはポリＡ配列を含む。ある実施態様において、ポリＡ配列は、少なくとも１００ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリＡ配列は配列番号１４のヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、ＲＢＤに変異を含み(例えば、配列番号１と比較してＱ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９Ｐなどであるが、これらに限定されない)および／またはスパイクタンパク質に変異を含む(例えば、配列番号１と比較してＤ６１４Ｇなどであるが、これらに限定されない)。当業者は、種々のスパイクバリアントおよび／またはそれを記載するリソースを知っており(例えば、COVID-19 Viral Genome Analysis Pipelineにより維持され、https://cov.lanl.gov/components/sequence/COV/int_sites_tbls.comp(最終アクセス２０２０年８月２４日)に見られるスパイク変異部位の表)、本明細書を読むことにより、ここに記載するＲＮＡ組成および／または方法は、このようなバリアントの何れかまたは全ておよび／またはそれらの組み合わせに対して中和活性を示す、ワクチン接種対象に血清を誘導能力により特徴づけられることを知る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位に変異を含み、所望により配列番号１と比較してさらに１以上の変異を含んでよい(例えば、配列番号１としてＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失などであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、「懸念される変異株２０２０１２／０１」(ＶＯＣ－２０２０１２／０１；系統Ｂ.１.１.７としても知られる)を含む。バリアントは、以前は英国公衆衛生庁により２０２０年１２月に調査中の第一変異株(ＶＵＩ－２０２０１２／０１)と名付けられたが、懸念される変異株(ＶＯＣ－２０２０１２／０１)に再分類された。ＶＯＣ－２０２０１２／０１は、英国でＣＯＶＩＤ－１９パンデミック中の２０２０年１０月に、前の月に採取したサンプルから初めて検出され、１２月半ばまでに急速に拡散し始めたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントである。英国でのＣＯＶＩＤ－１９感染率の顕著な増加と相関する；この増加は、少なくとも一部、ヒト細胞におけるＡＣＥ２への結合に必要なスパイク糖タンパク質受容体結合ドメイン内の変化Ｎ５０１Ｙによる。ＶＯＣ－２０２０１２／０１バリアントは１３非同義変異、４欠失および６同義変異(すなわち、タンパク質を変換させる１７変異および変化させない６変異)の２３変異により定義される。ＶＯＣ ２０２０１２／０１におけるスパイクタンパク質変化は、欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈを含む。ＶＯＣ－２０２０１２／０１における最も重要な変化の一つは、Ｎ５０１Ｙ、アミノ酸５０１位のアスパラギン(Ｎ)からチロシン(Ｙ)への変化と考えられる。この変異は単独でまたはＮ末端ドメイン(ＮＴＤ)の６９／７０位の欠失と組み合わせて、ウイルスの伝達性を増強させ得る。
故に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡの具体的実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較して欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、バリアント「５０１.Ｖ２」を含む。このバリアントは、２０２０年１０月のサンプルで最初に観察され、それ以来、南アフリカで全ゲノムシークエンシング(ＷＧＳ)により５０１.Ｖ２バリアントの３００を超える症例が確認されており、２０２０年１２月には、その地域ではウイルスの優勢形態となった。予備的結果は、このバリアントの伝達性は増加している可能性が示されている。５０１.Ｖ２バリアントは、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖを含む複数スパイクタンパク質変化により定義されており、さらに最近集められたウイルスは、さらなる変化：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４を有する。
故に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡの具体的実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントはまた配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＨ６９／Ｖ７０欠失を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較してさらに１以上の変異も含み得る(例えば、配列番号１と比較してＹ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉなどであるが、これらに限定されない)。具体的実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは次の変異を含む：配列番号１と比較して欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、デンマーク国立血清研究所(ＳＳＩ)によりΔＦＶＩ－スパイクとも称されるバリアント「クラスター５」を含む。デンマークの北ユラン地域で発見され、ミンク農家を介してミンクからヒトに広がっていると考えられる。クラスター５において、ウイルスのスパイクタンパク質における数個の異なる変異は確認されている。特異的変異は、６９～７０デルタＨＶ(タンパク質の６９位および７０位のヒスチジンおよびバリン残基の欠失)、Ｙ４５３Ｆ(４５３位のチロシンからフェニルアラニンへの変化)、Ｉ６９２Ｖ(６９２位のイソロイシンからバリン)、Ｍ１２２９Ｉ(１２２９位のメチオニンからイソロイシン)および所望によりＳ１１４７Ｌ(１１４７位のセリンからロイシン)を含む。
故に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡの具体的実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較して欠失６９～７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉおよび所望によりＳ１１４７Ｌ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＤ６１４Ｇ変異などの、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の６１４位に変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。配列番号１と比較してスパイクタンパク質の６１４位に変異を含む該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較してさらに１以上の変異も含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較して欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位および６１４位に変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＮ５０１Ｙ変異およびＤ６１４Ｇ変異を含む。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してさらに１以上の変異を含む(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較して欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＥ４８４Ｋ変異などの、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の４８４位に変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してさらに１以上の変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントはまた配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、ブラジル変異株として知られるバリアント系統Ｂ.１.１.２４８を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のこのバリアントは、Ｐ.１系統と名付けられ、１７の特有のアミノ酸変化を有し、その１０個は、Ｎ５０１ＹおよびＥ４８４Ｋを含むスパイクタンパク質である。Ｂ.１.１.２４８はＢ.１.１.２８に始まる。Ｅ４８４ＫはＢ.１.１.２８およびＢ.１.１.２４８両方に存在する。Ｂ.１.１.２４８は、いくつかのＳタンパク質多形性[Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆ]を有し、南アフリカからの記載したバリアントとある重要なＲＢＤ位置(Ｋ４１７、Ｅ４８４、Ｎ５０１)が類似する。
故に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡの具体的実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＮ５０１Ｙ変異およびＥ４８４Ｋ変異などの、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位および４８４位の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してさらに１以上の変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントはまた配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＮ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異およびＤ６１４Ｇ変異などの、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位、４８４位および６１４位の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してさらに１以上の変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＬ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してさらに１以上の変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１Ｖおよび欠失２４２～２４４および所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６ＩおよびＫ４１７Ｎ。該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントはまた配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＫ４１７ＮまたはＫ４１７Ｔ変異などの、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の４１７位に変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してさらに１以上の変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２～２４４。該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントはまた配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質におけるＫ４１７ＮまたはＫ４１７Ｔ変異およびＥ４８４Ｋおよび／またはＮ５０１Ｙ変異などの、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の４１７位および４８４位および／または５０１位の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してさらに１以上の変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２～２４４。該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントはまた配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、オミクロン変異株として知られるバリアント系統Ｂ.１.１.５２９を含む。このバリアントは、Ａ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ(アミノ酸２１４後のＥＰＥの挿入)、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆを含む多数の変異を含む。
故に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ(アミノ酸２１４後のＥＰＥの挿入)、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個または少なくとも３７個を含む：配列番号１と比較してＴ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７１Ｌ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ３３９Ｄ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ８５６Ｋ、Ｎ７６４Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｄ７９６Ｙ、Ｑ９５４Ｈ、Ｔ９５Ｉ、Ａ６７Ｖ、Ｌ９８１Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｇ４９６Ｓ、Ｔ４７８Ｋ、Ｑ４９８Ｒ、Ｑ４９３Ｒ、Ｅ４８４Ａ、Ｎ５０１Ｙ、Ｓ３７５Ｆ、Ｙ５０５Ｈ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ１４２Ｄ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｌ１４１ｄｅｌ、Ｙ１４４Ｆ、Ｙ１４５Ｄ、Ｇ１４２ｄｅｌ。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個または全てを含む：配列番号１と比較してＴ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７１Ｌ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ３３９Ｄ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ８５６Ｋ、Ｎ７６４Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｄ７９６Ｙ、Ｑ９５４Ｈ、Ｔ９５Ｉ、Ａ６７Ｖ、Ｌ９８１Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｇ４９６Ｓ、Ｔ４７８Ｋ、Ｑ４９８Ｒ、Ｑ４９３Ｒ、Ｅ４８４Ａ。該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＮ５０１Ｙ、Ｓ３７５Ｆ、Ｙ５０５Ｈ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌおよび／またはは、次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＮ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ１４２Ｄ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＬ１４１ｄｅｌ、Ｙ１４４Ｆ、Ｙ１４５Ｄ、Ｇ１４２ｄｅｌ。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３を含む：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは次の変異を含む：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは次の変異を含む：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ここに記載するＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異を含んでも、含まなくてもよい。
ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、セクション「医薬組成物の使用」の下に開示する変異の１以上を有し得る。
本発明のある実施態様において、抗原(例えば腫瘍抗原またはワクチン抗原)は、好ましくはＲＮＡを投与された対象の細胞への挿入により、各タンパク質に翻訳される一本鎖、５’キャップ化ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)として投与される。好ましくは、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性のために最適化された構造要素(５’キャップ、５’ ＵＴＲ、３’ ＵＴＲ、ポリ(Ａ)配列)を含む。
ある実施態様において、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)は、ＲＮＡの５’末端の特異的キャッピング構造として利用される。ある実施態様において、ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧは、ＲＮＡの５’末端の特異的キャッピング構造として利用される。ある実施態様において、５’－ＵＴＲ配列はヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡ由来であり、所望により翻訳効率を増加するための最適化‘コザック配列’を有する。ある実施態様において、「スプリットのアミノ末端エンハンサー」(ＡＥＳ)ｍＲＮＡ(Ｆと称される)およびミトコンドリアにコードされた１２ＳリボソームＲＮＡ(Ｉと称される)由来の２個の配列要素の組み合わせがコード配列とポリ(Ａ)配列の間に配置され、高い最高タンパク質レベルおよびｍＲＮＡ持続の延長を確実にする。ある実施態様において、ヒトベータ－グロビンｍＲＮＡ由来の２個の反復３’－ＵＴＲがコード配列とポリ(Ａ)配列の間に配置され、高い最高タンパク質レベルおよびｍＲＮＡ持続の延長を確実にする。ある実施態様において、３０アデノシン残基、続いて１０ヌクレオチドリンカー配列および他の７０アデノシン残基のストレッチからなる１１０ヌクレオチド長であるポリ(Ａ)配列が使用される。このポリ(Ａ)配列は、ＲＮＡ安定性および翻訳効率の増強のために設計された。
次に、３個の異なるＲＮＡプラットフォームの実施態様を記載し、その各々、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードする。
一般に、ワクチンここに記載するＲＮＡは、５’→３’で、次の構造を含み得る：
キャップ－５’－ＵＴＲ－ワクチン抗原コード化配列－３’－ＵＴＲ－ポリ(Ａ)
または
ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－ｈＡｇ－コザック－ワクチン抗原コード化配列－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０。
一般に、ここに記載するワクチン抗原は、Ｎ末端からＣ末端で、次の構造の一つを含み得る：
シグナル配列－ＲＢＤ－三量体化ドメイン
または
シグナル配列－ＲＢＤ－三量体化ドメイン－膜貫通ドメイン。
ＲＢＤおよび三量体化ドメインは、リンカー、特にアミノ酸配列ＧＳＰＧＳＧＳＧＳ(配列番号３３)を有するリンカーなどのＧＳリンカーにより離され得る。三量体化ドメインおよび膜貫通ドメインは、リンカー、特にアミノ酸配列ＧＳＧＳＧＳ(配列番号３４)を有するリンカーなどのＧＳリンカーにより離され得る。
シグナル配列はここに記載するシグナル配列であり得る。ＲＢＤはここに記載するＲＢＤドメインであり得る。三量体化ドメインはここに記載する三量体化ドメインであり得る。膜貫通ドメインはここに記載する膜貫通ドメインであり得る。
ある実施態様において、
シグナル配列は配列番号１のアミノ酸１～１６または１～１９のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ＲＢＤは配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、
三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして
膜貫通ドメインは、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、
シグナル配列は配列番号１のアミノ酸１～１６または１～１９のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列を含み、
ＲＢＤは配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列を含み、
三量体化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列を含み；そして
膜貫通ドメインは、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含む。
上記ＲＮＡまたは上記ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、非修飾ウリジン含有ｍＲＮＡ(ｕＲＮＡ)、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)または自己増幅ＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)であり得る。ある実施態様において、上記ＲＮＡまたは上記ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。
非修飾ウリジンメッセンジャーＲＮＡ(ｕＲＮＡ)
非修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｕＲＮＡ)の活性本体は、細胞に入ると翻訳される一本鎖ｍＲＮＡである。コロナウイルスワクチン抗原をコードする配列に加えて、各ｕＲＮＡは、好ましくは安定性および翻訳効率に関して最適化された共通構造要(５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ(Ａ)テイル)を含む。好ましい５’キャップ構造はベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)(ｍ２ ７,２’－ＯＧｐｐＳｐＧ)である。好ましい５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲは、それぞれ配列番号１２のヌクレオチド配列および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。好ましいポリ(Ａ)テイルは配列番号１４の配列を含む。
このプラットフォームの異なる実施態様は次のとおりである：
ＲＢＬ０６３.１(配列番号１５；配列番号７)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－ｈＡｇ－コザック－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＲＢＬ０６３.２(配列番号１６；配列番号７)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－ｈＡｇ－コザック－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＢＮＴ１６２ａ１；ＲＢＬ０６３.３(配列番号１７；配列番号５)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－ｈＡｇ－コザック－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(Ｓ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)である部分配列)
これに関して、「ｈＡｇ－コザック」は、翻訳効率を上げるための最適化‘コザック配列’を伴うヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列を意味する；「Ｓ１Ｓ２タンパク質」／「Ｓ１Ｓ２ ＲＢＤ」は、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原をコードする配列を意味する；「ＦＩ要素」は、３’－ＵＴＲは「スプリットのアミノ末端エンハンサー」(ＡＥＳ)ｍＲＮＡ(Ｆと称される)およびミトコンドリアにコードされた１２ＳリボソームＲＮＡ(Ｉと称される)由来の２個の配列要素の組み合わせであることを意味する。これらは、ＲＮＡ安定性に寄与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択過程により同定された；「Ａ３０Ｌ７０」は、樹状細胞におけるＲＮＡ安定性および翻訳効率を増強するため設計された、３０アデノシン残基、続いて１０ヌクレオチドリンカー配列および他の７０アデノシン残基のストレッチからなる、１１０ヌクレオチド長あるポリ(Ａ)テイルを意味する；「ＧＳ」は、グリシン－セリンリンカー、すなわち、融合タンパク質で一般に使用されている、主にアミノ酸グリシン(Ｇ)およびセリン(Ｓ)からなる 短リンカーペプチドをコードする配列を意味する。
ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)
ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)薬物物質の活性本体は、同様に細胞に入ると翻訳される一本鎖ｍＲＮＡである。コロナウイルスワクチン抗原をコードする配列(すなわち、オープンリーディングフレーム)に加えて、各ｍｏｄＲＮＡは、ｕＲＮＡと同様ＲＮＡの最大有効性について最適化された共通構造要素(５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ(Ａ)テイル)を含む。ｕＲＮＡと比較して、ｍｏｄＲＮＡは、ウリジンの代わりに１－メチル－シュードウリジンを含む。好ましい５’キャップ構造はｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧである。好ましい５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲは、それぞれ配列番号１２のヌクレオチド配列および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。好ましいポリ(Ａ)テイルは配列番号１４の配列を含む。さらなる精製工程は、インビトロ転写反応中に酸性されるｄｓＲＮＡ汚染物を減少するためにｍｏｄＲＮＡに適用される。
このプラットフォームの異なる実施態様は次のとおりである：
ＢＮＴ１６２ｂ２；ＲＢＰ０２０.１(配列番号１９；配列番号７)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ)－ｈＡｇ－コザック－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＢＮＴ１６２ｂ２；ＲＢＰ０２０.２(配列番号２０；配列番号７)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ)－ｈＡｇ－コザック－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＢＮＴ１６２ｂ１；ＲＢＰ０２０.３(配列番号２１；配列番号５)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ)－ｈＡｇ－コザック－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(フィブリチンに融合したＳ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)である部分配列)
ＢＮＴ１６２ｂ３ｃ(配列番号２９；配列番号３０)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ－ｈＡｇ－コザック－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＧＳ－ＴＭ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２タンパク質の膜貫通ドメイン(ＴＭ)に融合したフィブリチンに融合したＳ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)である部分配列)；抗原配列のＮ末端に内因性Ｓ１Ｓ２タンパク質分泌シグナルペプチド(ａａ１－１９)
ＢＮＴ１６２ｂ３ｄ(配列番号３１；配列番号３２)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ－ｈＡｇ－コザック－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＧＳ－ＴＭ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２タンパク質の膜貫通ドメイン(ＴＭ)に融合したフィブリチンに融合したＳ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)である部分配列)；抗原配列のＮ末端に免疫グロブリン分泌シグナルペプチド(ａａ１－２２)
自己増幅ＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)
自己増幅ｍＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)薬物物質の活性本体は、細胞に入ると自己増幅し、その後コロナウイルスワクチン抗原は翻訳される一本鎖ＲＮＡである。好ましくは単一タンパク質をコードするｕＲＮＡおよびｍｏｄＲＮＡとは対照的に、ｓａＲＮＡのコード領域は２個のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む。５’－ＯＲＦは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥＶ)ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(レプリカーゼ)などのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。レプリカーゼＯＲＦの後ろに、３’にサブゲノムプロモーターおよび抗原をコードする第二ＯＲＦは続く。さらに、ｓａＲＮＡ ＵＴＲは、自己増幅に必要な５’および３’保存配列要素(ＣＳＥ)を含む。ｓａＲＮＡは、ｕＲＮＡと同様ＲＮＡの最大有効性について最適化された共通構造要素(５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ(Ａ)テイル)を含む。ｓａＲＮＡは、好ましくはウリジンを含む。好ましい５’キャップ構造はベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)(ｍ２ ７,２’－ＯＧｐｐＳｐＧ)である。
ｓａＲＮＡの細胞質送達は、アルファウイルス様生活環を開始させる。しかしながら、ｓａＲＮＡは、ゲノムパッケージングまたは細胞侵入に必要なアルファウイルス構造タンパク質をコードせず、それ故複製コンピテントウイルス粒子の産生は可能である可能性は極めて低い。複製は、ＤＮＡを産生する中間工程を何ら含まない。よって、ｓａＲＮＡの使用／取り込みは、標的細胞内のゲノム組込みまたは他の永久遺伝子修飾のリスクはない。さらに、ｓａＲＮＡ自体、ｄｓＲＮＡ中間体の認識を介して自然免疫応答を効率的に活性化することにより、永続性複製を防止する。
このプラットフォームの異なる実施態様は次のとおりである：
ＲＢＳ００４.１(配列番号２４；配列番号７)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－レプリカーゼ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＲＢＳ００４.２(配列番号２５；配列番号７)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－レプリカーゼ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＢＮＴ１６２ｃ１； ＲＢＳ００４.３(配列番号２６；配列番号５)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－レプリカーゼ－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(Ｓ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)である部分配列)
ＲＢＳ００４.４(配列番号２７；配列番号２８)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－レプリカーゼ－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＴＭ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コード化抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(Ｓ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)である部分配列)
さらに、分泌シグナルペプチド(ｓｅｃ)は、好ましくはｓｅｃはＮ末端タグとして翻訳されるような方法で、抗原コード化領域に融合し得る。ある実施態様において、ｓｅｃは、Ｓタンパク質の分泌シグナルペプチドに対応する。融合タンパク質で一般的に使用される主にアミノ酸グリシン(Ｇ)およびセリン(Ｓ)からなる短リンカーペプチドをコードする配列をＧＳ／リンカーとして使用し得る。
ある実施態様において、抗原(例えば腫瘍抗原またはワクチン抗原)をコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、抗原を提供するよう処置された対象の細胞で発現される。ある実施態様において、ＲＮＡは、対象の細胞で一過性に発現される。ある実施態様において、ＲＮＡは、インビトロで転写される。ある実施態様において、抗原の発現は細胞表面である。ある実施態様において、抗原は発現され、ＭＨＣにより提示される。ある実施態様において、抗原の発現は細胞外空間である、すなわち、抗原は分泌型である。
抗原分子またはその処理産物、例えば、そのフラグメントは、免疫エフェクター細胞により担持されるＢＣＲまたはＴＣＲなどの抗原受容体または抗体に結合し得る。
ペプチドおよびタンパク質抗原をコードするＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)の投与により本発明により対象に提供されるペプチドおよびタンパク質抗原(ここで、抗原はワクチン抗原である)は、好ましくはペプチドまたはタンパク質抗原を提供した対象で免疫応答、例えば、液性および／または細胞免疫応答の誘導をもたらす。該免疫応答は、好ましくは標的抗原に対する。故に、ワクチン抗原は、標的抗原、そのバリアントまたはそのフラグメントを含み得る。ある実施態様において、このようなフラグメントまたはバリアントは、標的抗原と免疫学的に等価である。本発明の状況において、用語「抗原のフラグメント」または「抗原のバリアント」は、免疫応答の誘導をもたらす薬剤を意味し、その免疫応答は抗原、すなわち標的抗原を標的とする。故に、ワクチン抗原は標的抗原に対応し得るかまたは含み得る、標的抗原のフラグメントに対応し得るかまたは含み得るまたは標的抗原またはそのフラグメントと相同の抗原に対応し得るかまたは含み得る。故に、本発明によると、ワクチン抗原は、標的抗原の免疫原性フラグメントまたは標的抗原の免疫原性フラグメントと相同であるアミノ酸配列を含み得る。本発明による「免疫原性抗原のフラグメント」は、好ましくは標的抗原に対する免疫応答の誘導はできる抗原のフラグメントに関する。ワクチン抗原は組み換え抗原であり得る。
用語「免疫学的に等価」は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子は、同じまたは本質的に同じ免疫学的性質を有するおよび／または、例えば、免疫学的効果のタイプに関して、同じまたは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明の状況において、用語「免疫学的に等価」は、好ましくは、免疫化に使用する抗原または抗原バリアントの免疫学的効果または性質に関して使用する。例えば、アミノ酸配列は、該アミノ酸配列を、対象の免疫系に暴露したとき、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導するならば、参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。故に、ある実施態様において、抗原と免疫学的に等価である分子は、同じまたは本質的に同じ性質を示すおよび／またはＴ細胞は標的とする抗原に関してＴ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大に関して同じまたは本質的に同じ効果を示す。
ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は非免疫原性である。免疫刺激剤をコードするＲＮＡを、本発明により投与して、アジュバント効果を提供し得る。免疫刺激剤をコードするＲＮＡは標準ＲＮＡまたは非免疫原性ＲＮＡであり得る。
ここで使用する用語「非免疫原性ＲＮＡ」(例えば「非免疫原性ｍＲＮＡ」)は、例えば、哺乳動物に投与したとき、免疫系による応答を誘導しないまたは非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にする修飾およびに付されていない点でのみ異なる同じＲＮＡにより誘導されるより、すなわち標準ＲＮＡ(ｓｔｄＲＮＡ)により誘導されるより弱い応答を誘導するＲＮＡをいう。ある実施態様において、ここでは修飾ＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)とも称される非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ介在活性化を抑制する修飾ヌクレオシドのＲＮＡへの組み込みおよび／または例えば、インビトロ転写中の、例えば、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の形成の制限および／または例えば、インビトロ転写後の二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の除去による二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の量の制限により、非免疫原性とされる。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ介在活性化を抑制する修飾ヌクレオシドのＲＮＡへの組み込みおよび／または例えば、インビトロ転写後の二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の除去により、非免疫原性とされる。
非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)を、修飾ヌクレオシドの組み込みにより非免疫原性とするために、ＲＮＡの免疫原性を低減または抑制する限り、あらゆる修飾ヌクレオシドは使用され得る。特に好ましいのは、自然免疫受容体のＲＮＡ介在活性化を抑制する修飾ヌクレオシドである。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは、１以上のウリジンの修飾核酸塩基を含むヌクレオシドでの置換を含む。ある実施態様において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。ある実施態様において、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは３－メチル－ウリジン(ｍ３Ｕ)、５－メトキシ－ウリジン(ｍｏ５Ｕ)、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン(ｓ２Ｕ)、４－チオ－ウリジン(ｓ４Ｕ)、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン(ｈｏ５Ｕ)、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン(例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン)、ウリジン５－オキシ酢酸(ｃｍｏ５Ｕ)、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル(ｍｃｍｏ５Ｕ)、５－カルボキシメチル－ウリジン(ｃｍ５Ｕ)、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン(ｃｈｍ５Ｕ)、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル(ｍｃｈｍ５Ｕ)、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン(ｍｃｍ５Ｕ)、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン(ｍｃｍ５ｓ２Ｕ)、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－メチルアミノメチル－ウリジン(ｍｎｍ５Ｕ)、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン(ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ)、５－カルバモイルメチル－ウリジン(ｎｃｍ５Ｕ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン(τｍ５Ｕ)、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン(τｍ５ｓ２Ｕ)、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン)、５－メチル－２－チオ－ウリジン(ｍ５ｓ２Ｕ)、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン(ｍ１ｓ４ψ)、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン(ｍ３ψ)、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン(Ｄ)、ジヒドロシュードウリジン、５,６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン(ｍ５Ｄ)、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－(３－アミノ－３－カルボキシプロピル)ウリジン(ａｃｐ３Ｕ)、１－メチル－３－(３－アミノ－３－カルボキシプロピル)シュードウリジン(ａｃｐ３ ψ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(ｉｎｍ５Ｕ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)－２－チオ－ウリジン(ｉｎｍ５ｓ２Ｕ)、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン(Ｕｍ)、５,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン(ｍ５Ｕｍ)、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン(ψｍ)、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｓ２Ｕｍ)、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｍｃｍ５Ｕｍ)、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｎｃｍ５Ｕｍ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕｍ)、３,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン(ｍ３Ｕｍ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｉｎｍ５Ｕｍ)、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－ａｒａ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－ａｒａ－ウリジン、５－(２－カルボメトキシビニル)ウリジンおよび５－[３－(１－Ｅ－プロペニルアミノ)ウリジンからなる群から選択される。ある特に好ましい実施態様において、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)または５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)、特にＮ１－メチル－シュードウリジンである。
ある実施態様において、１以上のウリジンの修飾核酸塩基を含むヌクレオシドでの置換は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のウリジンの置換を含む。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写(ＩＶＴ)によるＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)の合成中、酵素の非慣習的活性により、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を含む相当量の異常生成物は産生される。ｄｓＲＮＡは炎症性サイトカインを誘導し、エフェクター酵素を活性化し、タンパク質合成阻害に至る。ＤｓＲＮＡの形成は、例えば、合成中のウリジン三リン酸(ＵＴＰ)の量を制限することにより、インビトロ転写(ＩＶＴ)によるｍＲＮＡの合成中、制限され得る。所望により、ｍＲＮＡの合成中、ＵＴＰを１回または数回添加し得る。また、ｄｓＲＮＡは、例えば、非多孔性または多孔性Ｃ－１８ポリスチレン－ジビニルベンゼン(ＰＳ－ＤＶＢ)マトリクスを使用するイオン対逆相ＨＰＬＣにより、ＩＶＴ ＲＮＡなどのＲＮＡから除去し得る。あるいは、ｄｓＲＮＡを特異的に加水分解するが、ｓｓＲＮＡはせず、それによりＩＶＴ ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ汚染物を除去する大腸菌ＲＮａｓｅIIIを使用する酵素ベースの方法を使用できる。さらに、ｄｓＲＮＡは、セルロース物質を使用してｓｓＲＮＡから分離できる。ある実施態様において、ＲＮＡ調製物をセルロース物質と接触させ、ｓｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡはセルロース物質と結合し、ｓｓＲＮＡはセルロース物質に結合しない条件下で、セルロース物質から分離する。ｓｓＲＮＡを提供するための適当な方法は、例えば、ＷＯ２０１７／１８２５２４に開示される。
ここで使用する用語「除去する」または「除去」は、非免疫原性ＲＮＡなどの第一物質の集団は、ｄｓＲＮＡなどの第二物質の集団の近位から分離される特徴をいい、ここで、第一物質の集団は必ずしも第二物質はないものではなく、第二物質の集団は必ずしも第一物質はないものではない。しかしながら、第二物質の集団の除去により特徴づけられる第一物質の集団は、第一および第二物質の分離されていない混合物と比較して、第二物質の含量は測定可能に低い。
ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡからのｄｓＲＮＡ(特にｄｓｍＲＮＡ)の除去は、非免疫原性ＲＮＡ組成物の１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０.５未満％、０.３未満％または０.１未満％のＲＮＡはｄｓＲＮＡなｄｓＲＮＡの除去を含む。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)はｄｓＲＮＡを含まないかまたは本質的に含まない。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物を含む。例えば、ある実施態様において、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)の精製調製物は二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を実質的に含まない。ある実施態様において、精製調製物は、全ての他の核酸分子(ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど)に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％または少なくとも９９.９％一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。
種々の方法を使用して、ｄｓＲＮＡの量を決定できる。例えば、サンプルをｄｓＲＮＡ特異的抗体と接触させてよく、ＲＮＡに結合した抗体の量を、サンプル中のｄｓＲＮＡの量の指標としてとり得る。既知量のｄｓＲＮＡを含むサンプルを参照として使用し得る。
例えば、ＲＮＡを膜、例えば、ナイロンブロッティング膜にスポットし得る。膜を、例えば、５％(ｗ／ｖ)脱脂粉乳含有ＴＢＳ－Ｔ緩衝液(２０mMトリスｐＨ７.４、１３７mM ＮａＣｌ、０.１％(ｖ／ｖ)ＴＷＥＥＮ－２０)でブロックする。ｄｓＲＮＡ検出のために、膜を、ｓＲＮＡ特異的抗体、例えば、ｄｓＲＮＡ特異的マウスｍＡｂ(English & Scientific Consulting, Szirak, Hungary)とインキュベートし得る。例えば、ＴＢＳ－Ｔでの洗浄後、膜を二次抗体、例えば、ＨＲＰ－コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch, Cat #715-035-150)とインキュベートしてよく、二次抗体により産生されるシグナルを検出し得る。
ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は、同じ配列の標準ＲＮＡより効率的に細胞で翻訳される。ある実施態様において、翻訳は、その非修飾カウンターパートと比較して、２倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、３倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、４倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、５倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、６倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、７倍増強される。ある実施態様において、翻訳は８倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、９倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、１０倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、１５倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、２０倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、５０倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、１００倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、２００倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、５００倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、１０００倍増強される。ある実施態様において、翻訳は、２０００倍増強される。ある実施態様において、倍数は１０～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は１０～１００倍である。ある実施態様において、倍数は１０～２００倍である。ある実施態様において、倍数は１０～３００倍である。ある実施態様において、倍数は１０～５００倍である。ある実施態様において、倍数は２０～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は３０～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は５０～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は１００～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は２００～１０００倍である。ある実施態様において、翻訳は、任意の他の相当量または量の範囲増強される。
ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は、同じ配列の標準ＲＮＡより顕著に低い自然免疫原性を示す。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は、その非修飾カウンターパートより２倍低い自然免疫応答を示す。ある実施態様において、自然免疫原性は３倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は４倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は５倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は６倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は７倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は８倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は９倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は１０倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は１５倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は２０倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は５０倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は１００倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は２００倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は５００倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は１０００倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は２０００倍減少される。
用語「顕著に低い自然免疫原性を示す」は、自然免疫原性の検出可能な減少をいう。ある実施態様において、本用語は、検出可能な自然免疫応答の誘導なく、有効量の非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)を投与できるような現象をいう。ある実施態様において、本用語は、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は、非免疫原性ＲＮＡによりコードされたタンパク質の産生の検出可能な減少に十分な自然免疫応答を誘発することなく、繰り返し投与できるような減少をいう。ある実施態様において、減少は、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は、非免疫原性ＲＮＡによりコードされたタンパク質の検出可能な産生の排除に十分な自然免疫応答を誘発することなく、繰り返し投与できるようなものである。
「免疫原性」は、ヒトまたは他の動物の体で免疫応答を誘発する、ＲＮＡなどの外来物質の能力である。自然免疫系は、比較的非特異的および即時である、免疫系の成分である。適応免疫系と共に、脊椎動物免疫系の２つの主成分の一つである。
ここで使用する「内因性」は、生物、細胞、組織または系内からのまたはそこで産生されたあらゆる物質をいう。
ここで使用する用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系外からのまたはそこで産生されたあらゆる物質をいう。
ここで使用する用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
ここで使用する用語「結合」、「融合」または「融合体」は、相互交換可能に使用される。これらの用語は、２以上の要素または成分またはドメインの一体となった結合をいう。
粒子
ここに記載するＲＮＡ、特にｍＲＮＡなどの粒子は、(ｉ)核酸および(ii)核酸を複合体化できるポリマーまたは脂質などの少なくとも１個のカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な化合物を含む、粒子で提供され得る。
種々のタイプのＲＮＡ含有粒子は、粒子形態のＲＮＡの送達に適するとして以前に記載されている(例えば、Kaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60参照)。非ウイルスＲＮＡ送達媒体に関して、ＲＮＡのナノ粒子封入は、ＲＮＡを物理的に分解から保護し、特定の化学に依存して、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を助け得る。
ポリマーおよび脂質などの正荷電分子と負荷電核酸の間の静電気的相互作用は、粒子形成に関与する。これにより、複合体化および核酸粒子の自発的形成がもたらされる。
製造過程中、例えば、ｐＨ５の、ＲＮＡの水溶液のカチオン的にイオン化可能な脂質を含むエタノール性脂質混合物への導入により、負荷電ＲＮＡ薬物物質と正荷電カチオン的にイオン化可能な脂質の間の静電気的相互作用はもたらされる。この静電気的相互作用は、ＲＮＡ薬物物質の効率的封入と同時の粒子形成をもたらす。ＲＮＡ封入後、得られたＲＮＡ－ＬＮＰ周囲の媒体の、例えば、ｐＨ８への調節により、ＬＮＰの表面電荷は中和される。全ての他の変数を一定に維持したとき、電荷－中性粒子は、荷電粒子と比較して、長いインビボ循環寿命および良好な肝細胞への送達を示し、細網内皮系により迅速に浄化される。エンドソーム取り込みにより、エンドソームの低ｐＨはＬＮＰを融合性とし、標的細胞のサイトゾルへのＲＮＡの放出を可能とする。
本発明の状況において、用語「粒子」は、分子または分子複合体、特に粒子形成化合物により形成される、構造体に関する。ある実施態様において、粒子は、１タイプ以上の両親媒性物質(例えば、両親媒性脂質、両親媒性ポリマーおよび／または両親媒性タンパク質／ポリペプチド)から製造されるエンベロープ(例えば、１以上の層または薄膜)を含む。この状況で、表現「両親媒性物質」は、親水性および親油性両方の性質を有する物質を意味する。エンベロープは、両親媒性である必要はない付加的物質(例えば、付加的脂質および／または付加的ポリマー)を含み得る。故に、粒子は、単層膜または多重膜構造であってよく、ここで、１以上の層または薄膜を構成する物質は、所望により両親媒性である必要はない付加的物質(例えば、付加的脂質および／または付加的ポリマー)と組み合わせた１タイプ以上の両親媒性物質(特に両親媒性脂質、両親媒性ポリマーおよび／または両親媒性タンパク質／ポリペプチドからなる群から選択される)を含む。ある実施態様において、用語「粒子」は、マイクロまたはナノサイズ小型構造など、マイクロまたはナノサイズ構造に関する。これに関して、用語「マイクロサイズ」は、粒子の全３つの外部寸法はマイクロスケール、すなわち、１～５μmであることを意味する。本発明によると、用語「粒子」は、リポフレックス粒子(ＬＰＸ)、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)、ポリプレックス粒子、リポポリプレックス粒子、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)およびそれらの混合物(例えば、ＬＰＸとＶＬＰの混合物またはＬＮＰとＶＬＰの混合物などの２タイプ以上の粒子の混合物)を含む。
「核酸粒子」を使用して、核酸(例えばＲＮＡ、特にｍＲＮＡ)を目的の標的部位(例えば、細胞、組織、臓器など)に送達できる。核酸粒子は、少なくとも１個のカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質、プロタミンなどの少なくとも１個のカチオン性ポリマーまたはそれらの混合物および核酸から形成され得る。核酸粒子は、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)ベースおよびリポフレックス(ＬＰＸ)ベースの製剤を含む。
何らかの理論に拘束されることを意図しないが、カチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質および／またはカチオン性ポリマーは核酸と一体となって凝集体を形成し、この凝集はコロイド状に安定な粒子をもたらすと考えられる。ある実施態様において、粒子は、ここに記載する両親媒性脂質、特にカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な両親媒性脂質およびＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)を含む。ある実施態様において、粒子は、カチオン性／カチオン的にイオン化可能な脂質(特に、ここに開示する式(Ｘ)のカチオン的にイオン化可能な脂質；ここに開示する構造Ａ～Ｇの１個を有するカチオン的にイオン化可能な脂質；またはここに開示する式(XI)のカチオン的にイオン化可能な脂質)およびポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)脂質などのヘルパー脂質；またはポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)；中性脂質(例えばリン脂質)；ステロイド(例えばコレステロール)；およびそれらの組み合わせを含むかまたはこれからなる。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ粒子において、ＲＮＡ(特に、ｍＲＮＡ)は、ＬＮＰの場合、ＬＮＰの中心コアを占拠する、カチオン的にイオン化可能な脂質(特にここに開示する式(Ｘ)のカチオン的にイオン化可能な脂質；ここに開示する構造Ａ～Ｇの１個を有するカチオン的にイオン化可能な脂質；またはここに開示する式(XI)のカチオン的にイオン化可能な脂質)により結合される。ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ＰＥＧ脂質；またはポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)は、リン脂質と共に粒子(例えばＬＮＰ)の表面を形成する。ある実施態様において、表面は二層を含む。ある実施態様において、荷電および非荷電形態のコレステロールおよびカチオン的にイオン化可能な脂質(特にここに開示する式(Ｘ)のカチオン的にイオン化可能な脂質；ここに開示する構造Ａ～Ｇの１個を有するカチオン的にイオン化可能な脂質；またはここに開示する式(XI)のカチオン的にイオン化可能な脂質)はＬＮＰなどの粒子全体に分布できる。
一般に、リポフレックス(ＬＰＸ)は、２個の水相、すなわちＲＮＡを含む相および脂質の分散系を含む相の混合により得られる。ある実施態様において、脂質相はリポソームを含む。
ある実施態様において、リポソームは、薄膜は脂質二重層を含み、封入された内腔は水相を含む、自己封鎖単層膜または多重膜小胞粒子である。ナノ粒子形成のためにリポソームを使用する必須要件は、必要である混合物中の脂質は、適用された水性環境で薄膜(二層)相を形成できることである。
ある実施態様において、リポソームは、水性コアを封入する単層膜または多重膜リン脂質二重層(ここでは水性内腔とも称する)を含む。極性頭(親水性)基および非極性テイル(疎水性)基を有する物質から製造し得る。ある実施態様において、核酸の送達のために設計されるリポソームの製剤に用いられるカチオン性脂質は、本来両親媒性であり、グリセロールを介して炭化水素鎖またはコレステロール誘導体に結合した正荷電(カチオン性)アミン頭基からなる。
ある実施態様において、リポフレックスは、カチオン性リポソームとＲＮＡの静電気的相互作用により形成される多重膜リポソームベースの製剤である。ある実施態様において、形成されたリポフレックスは、リポソーム構造の小型ＲＮＡ－リポフレックスへの変換に起因する分子と異なる内部配置を有する。ある実施態様において、これらの製剤は、ＲＮＡの封入の悪さおよびＲＮＡの不完全な捕捉により特徴づけられる。
ある実施態様において、ＬＰＸ粒子は、ここに記載する両親媒性脂質、特にカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な両親媒性脂質およびＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)を含む。ある実施態様において、正荷電リポソーム(１以上の両親媒性脂質、特にカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な両親媒性脂質により製造)と負荷電ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)の間の静電気的相互作用は、複合体化およびＲＮＡリポフレックス粒子の自発的形成をもたらす。正荷電リポソームは、一般に式(Ｉ)のカチオン的にイオン化可能な脂質などのカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な両親媒性脂質、ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＤＭＡおよびＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなどの付加的脂質を使用して合成され得る。ある実施態様において、ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)リポフレックス粒子はナノ粒子である。
一般に、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)は、水相中のＲＮＡとエタノールなどの有機溶媒を含む相中の脂質の直接混合により得られる。この場合、脂質または脂質混合物は、水で薄膜(二層)相を形成しない、粒子形成のために使用され得る。
ある実施態様において、ここに記載する粒子は、さらにカチオン的にイオン化可能な脂質以外の少なくとも１個の脂質または脂質様物質を含む。
ある実施態様において、核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ(例えば、ｍＲＮＡ ＬＮＰなどのｍＲＮＡ粒子)などのＲＮＡ粒子)は１を超えるタイプの核酸分子を含み、ここで、モル質量または基本的構造要素、例えば、分子構造、キャッピング、コード領域または他の特性に関するなど、核酸分子の分子パラメータは、互いに類似しても異なってもよい。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ここに記載する粒子と非共有結合で結合し得る。ある実施態様において、ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は粒子の外表面に付着してよい(表面ＲＮＡ(特に表面ｍＲＮＡ))および／または粒子に含まれていてよい(封入ＲＮＡ(特に封入ｍＲＮＡ))。
本明細書で使用する「ナノ粒子」は、ここに記載する核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)および少なくとも１個のカチオン性脂質を含む粒子をいい、ここで、粒子の全３つの外部寸法はナノスケールである、すなわち、少なくとも約１nmかつ約１０００nm未満(好ましくは、１０～９９０nm、例えば１５～９００nm、２０～８００nm、３０～７００nm、４０～６００nmまたは５０～５００nm)である。好ましくは、最長および最短軸の差は有意ではない。好ましくは、粒子のサイズはその直径である。
ここに記載する核酸粒子(特にｍＲＮＡ粒子などのＲＮＡ粒子)は、約０.５未満、約０.４未満、約０.３未満、約０.２未満、約０.１未満または約０.０５未満の多分散性指数(ＰＤＩ)を示し得る。例として、核酸粒子は、約０.０１～約０.４または約０.１～約０.３の範囲の多分散性指数を示し得る。
本発明の状況において、用語「リポフレックス粒子」は、両親媒性脂質、特にカチオン性両親媒性脂質およびここに記載する核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)を含む粒子に関する。正荷電リポソーム(１以上の両親媒性脂質、特にカチオン性両親媒性脂質から製造)と負荷電核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)の間の静電気的相互作用は、複合体化および核酸リポフレックス粒子の自発的形成をもたらす。正荷電リポソームは、一般にＤＯＴＭＡなどのカチオン性両親媒性脂質およびＤＯＰＥなどの付加的脂質を使用して合成され得る。ある実施態様において、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)リポフレックス粒子はナノ粒子である。
用語「脂質ナノ粒子」は、ナノサイズ脂質含有粒子に関する。
本発明の状況において、用語「ポリプレックス粒子」は、両親媒性ポリマー、特にカチオン性両親媒性ポリマーおよびここに記載する核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)を含む粒子に関する。正荷電カチオン性両親媒性ポリマーと負荷電核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)の間の静電気的相互作用は、複合体化および核酸ポリプレックス粒子の自発的形成をもたらす。ポリプレックス粒子の製造に適する正荷電両親媒性ポリマーは、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリＬ－リシン、ポリＬ－アルギニンおよびヒストンを含む。ある実施態様において、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)ポリプレックス粒子はナノ粒子である。
用語「リポポリプレックス粒子」は、ここに記載する両親媒性脂質(特にカチオン性両親媒性脂質)、ここに記載する両親媒性ポリマー(特にカチオン性両親媒性ポリマー)およびここに記載する核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)を含む粒子に関する。ある実施態様において、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)リポポリプレックス粒子はナノ粒子である。
用語「ウイルス様粒子」(ここではＶＬＰと略す)は、ウイルスを緊密に模倣するが、該ウイルスの遺伝物質を何ら含まず、故に、非感染性である分子をいう。好ましくは、ＶＬＰはここに記載する核酸(好ましくはＲＮＡ)を含み、該核酸(好ましくはＲＮＡ)は、ＶＬＰは由来するウイルスと異種である。ＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質の個々の発現により合成でき、その後、それらはウイルス様構造に自己集合し得る。ある実施態様において、異なるウイルスからの構造カプシドタンパク質の組み合わせを使用して、組み換えＶＬＰを作り得る。ＶＬＰは、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)(小ＨＢＶ由来表面抗原(ＨＢｓＡｇ))、パルボウイルス科(例えば、アデノ随伴ウイルス)、パピローマウイルス科(例えば、ＨＰＶ)、レトロウイルス科(例えば、ＨＩＶ)、フラビウイルス科(例えば、Ｃ型肝炎ウイルス)およびバクテリオファージ(例えばＱβ、ＡＰ２０５)を含む広範な科のウイルスの成分から産生され得る。
用語「核酸含有粒子」は、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)は結合しているここに記載する粒子をいう。これに関して、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)を粒子の外表面に付着させてよい(表面核酸(特に表面ｍＲＮＡなどの表面ＲＮＡ))および／または粒子に封入してよい(封入核酸(特に封入ｍＲＮＡなどの封入ＲＮＡ))。
ある実施態様において、本発明の方法および使用で利用する粒子は、約１０～約２０００nm、例えば少なくとも約１５nm(好ましくは少なくとも約２０nm、少なくとも約２５nm、少なくとも約３０nm、少なくとも約３５nm、少なくとも約４０nm、少なくとも約４５nm、少なくとも約５０nm、少なくとも約５５nm、少なくとも約６０nm、少なくとも約６５nm、少なくとも約７０nm、少なくとも約７５nm、少なくとも約８０nm、少なくとも約８５nm、少なくとも約９０nm、少なくとも約９５nmまたは少なくとも約１００nm)および／または最大１９００nm(好ましくは最大約１９００nm、最大約１８００nm、最大約１７００nm、最大約１６００nm、最大約１５００nm、最大約１４００nm、最大約１３００nm、最大約１２００nm、最大約１１００nm、最大約１０００nm、最大約９５０nm、最大約９００nm、最大約８５０nm、最大約８００nm、最大約７５０nm、最大約７００nm、最大約６５０nm、最大約６００nm、最大約５５０nmまたは最大約５００nm)の範囲、好ましくは約２０～約１５００nm、例えば約３０～約１２００nm、約４０～約１１００nm、約５０～約１０００nm、約６０～約９００nm、約７０～８００nm、約８０～７００nm、約９０～６００nmまたは約５０～５００nmまたは約１００～５００nmの範囲、例えば１０～１０００nm、１５～５００nm、２０～４５０nm、２５～４００nm、３０～３５０nm、４０～３００nm、５０～２５０nm、６０～２００nmまたは７０～１５０nmの範囲のサイズ(好ましくは直径、すなわち、回転半径(Ｒｇ)値の２倍または流体力学半径の２倍などの半径の２倍)を有する。
ある実施態様において、ここに記載する粒子(例えば、ＬＮＰおよびＬＰＸ)は、ある実施態様において、約５０nm～約１０００nm、約５０nm～約８００nm、約５０nm～約７００nm、約５０nm～約６００nm、約５０nm～約５００nm、約５０nm～約４５０nm、約５０nm～約４００nm、約５０nm～約３５０nm、約５０nm～約３００nm、約５０nm～約２５０nm、約５０nm～約２００nm、約１００nm～約１０００nm、約１００nm～約８００nm、約１００nm～約７００nm、約１００nm～約６００nm、約１００nm～約５００nm、約１００nm～約４５０nm、約１００nm～約４００nm、約１００nm～約３５０nm、約１００nm～約３００nm、約１００nm～約２５０nm、約１００nm～約２００nm、約１５０nm～約１０００nm、約１５０nm～約８００nm、約１５０nm～約７００nm、約１５０nm～約６００nm、約１５０nm～約５００nm、約１５０nm～約４５０nm、約１５０nm～約４００nm、約１５０nm～約３５０nm、約１５０nm～約３００nm、約１５０nm～約２５０nm、約１５０nm～約２００nm、約２００nm～約１０００nm、約２００nm～約８００nm、約２００nm～約７００nm、約２００nm～約６００nm、約２００nm～約５００nm、約２００nm～約４５０nm、約２００nm～約４００nm、約２００nm～約３５０nm、約２００nm～約３００nmまたは約２００nm～約２５０nmの範囲である、平均直径を有する。
ＲＮＡ脂質粒子(特にｍＲＮＡ ＬＮＰなどのＲＮＡ ＬＮＰ)に関して、Ｎ／Ｐ比は、脂質の窒素基対ＲＮＡのリン酸基数の比をもたらす。窒素原子(ｐＨに依存)は通常正荷電であり、リン酸基は負荷電であるため、電荷比と相関する。電荷平衡は存在するとき、Ｎ／Ｐ比はｐＨに依存する。脂質製剤は、正荷電ナノ粒子はトランスフェクションに好都合であると考えられるため、しばしば４より大きく１２までのＮ／Ｐ比で形成される。この場合、ＲＮＡは、ナノ粒子に完全に結合されていると考えられる。
ここに記載する核酸粒子(特にｍＲＮＡ粒子などのＲＮＡ粒子)は、少なくとも１個のカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーからのコロイドを得て、コロイドと核酸を混合して核酸粒子を得ることを含み得る、広範な方法を使用して製造できる。
ここで使用する用語「コロイド」は、分散粒子は沈降しない均質混合物のタイプに関する。混合物中の不溶性粒子は顕微鏡的であり、粒子径１～１０００ナノメートルである。混合物はコロイドまたはコロイド状懸濁液と称し得る。用語「コロイド」は、懸濁液全体ではなく、混合物の粒子のみをいうことはある。
少なくとも１個のカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーを含むコロイドの製造について、リポソーム小胞の製造に慣用的に使用される方法はここで適用可能であり、適切に適合される。リポソーム小胞の製造で最も一般に使用される方法は、次の基本的段階が共通する：(ｉ)有機溶媒への脂質溶解、(ii)得られた溶液の乾燥および(iii)乾燥脂質の水和(種々の水性媒体を使用)。
フィルム水和方法において、脂質をまず適当な有機溶媒に溶解し、フラスコの底に薄フィルムを生ずるよう乾燥させる。得られた脂質フィルムを適切な水性媒体を使用して水和して、リポソーム分散系を得る。さらに、付加的小型化工程が含まれ得る。
水相と脂質を含む有機相の間の油中水型エマルジョン形成を含む逆相蒸発は、リポソーム小胞の製造のためのフィルム水和に代わる方法である。この混合物の短い音波処理は、系均質化のために必要である。有機相の減圧下の除去により乳状ゲルを得て、これはその後リポソーム懸濁液に変わる。
用語「エタノール注入技術」は、脂質を含むエタノール溶液を、針を通して水溶液に急速に注入する過程をいう。この行為により溶液全体に脂質が分散し、脂質構造形成、例えばリポソーム形成などの脂質小胞形成が促進される。一般に、ここに記載する核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)リポフレックス粒子は、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)をコロイド状リポソーム分散系に添加することにより得られる。エタノール注入技術を使用して、このようなコロイド状リポソーム分散系は、ある実施態様において、次のとおり形成される：カチオン的にイオン化可能な脂質(例えばここに開示する式(Ｘ)のカチオン的にイオン化可能な脂質；ここに開示する構造Ａ～Ｇの１個を有するカチオン的にイオン化可能な脂質；ここに開示する式(XI)のカチオン的にイオン化可能な脂質；ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＤＭＡ)および付加的脂質(例えばポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)脂質；またはポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)；中性脂質(例えばリン脂質)；ステロイド(例えばコレステロール)；および組み合わせ)などの脂質を含むエタノール溶液を、撹拌下に水溶液に注入する。ある実施態様において、ここに記載する核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)リポフレックス粒子を、押し出しの工程を用いることなく得ることができる。
用語「押し出す」または「押し出し」は、固定、断面プロファイルを有する粒子を作ることをいう。特に、粒子を規定細孔のフィルターを篩過させる粒子の小型化をいう。
無有機溶媒特徴を有する他の方法も、コロイドの製造のために本発明により使用され得る。
ＬＮＰは、典型的にイオン化可能カチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質の４成分含む。各成分は、ペイロード保護を担い、有効な細胞内送達を可能とする。ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質と水性緩衝液中の核酸の迅速な混合により製造され得る。ここに記載するＲＮＡ粒子は、ＰＥＧ脂質またはサルコシン化脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含み得るが、(ｉ)ＰＥＧ脂質を含まないまたは(ii)サルコシン化脂質を含まないまたは(ｉ)および(ii)のいかなる組み合わせも含まないＲＮＡ粒子もここで提供される。ある実施態様において、ＲＮＡ粒子はポリマーコンジュゲート脂質を何ら含まない(換言すると、これらのＲＮＡ粒子はポリマーコンジュゲート脂質を実質的に含まない)。
種々のタイプの核酸含有粒子は、粒子形態の核酸の送達に適するとして以前に記載されている(例えば、Kaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60参照)。非ウイルス核酸送達媒体について、核酸のナノ粒子封入は、核酸を物理的に分解から保護し、特異的化学に依存して、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を助け得る。
ある好ましい実施態様において、ここに記載するＲＮＡおよび少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含むＬＮＰは１以上の付加的脂質をさらに含む。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡおよび少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含むＬＮＰは、(ａ)水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を製造し；(ｂ)カチオン的にイオン化可能な脂質および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を製造し；(ｃ)(ａ)の下に製造したＲＮＡ溶液と(ｂ)の下に製造したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む第一水相に分散したＬＮＰを含む第一中間製剤を製造し；そして(ｄ)最終緩衝系を含む最終水性緩衝液を使用して(ｃ)の下に製造した第一中間製剤を濾過し、それにより最終緩衝系を含む最終水相にＬＮＰ分散系を含む製剤を製造することにより製造する。工程(ｃ)後、タンジェンシャルフロー濾過または透析濾過などの希釈および濾過から選択される１以上の工程が続き得る。ある実施態様において、第一緩衝系は最終緩衝系と異なる。別の実施態様において、第一緩衝系および最終緩衝系は同じである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡおよび少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含むＬＮＰは、(ａ’)水相に、カチオン的にイオン化可能な脂質および、存在するならば、１以上の付加的脂質のリポソームまたはコロイド状調製物を製造し；(ｂ’)水および緩衝系を含むＲＮＡ溶液を製造し；そして(ｃ’)(ａ’)の下に製造したリポソームまたはコロイド状調製物と(ｂ’)の下に製造したｍＲＮＡ溶液を混合することにより製造する。工程(ｃ’)後、タンジェンシャルフロー濾過などの希釈および濾過から選択される１以上の工程が続き得る。
本明細書は、ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)およびＲＮＡと結合して核酸粒子を形成する少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含む組成物を記載する。ＲＮＡ粒子は、粒子と非共有結合相互作用により種々の形態で複合体化するＲＮＡを含み得る。ここに記載する粒子はウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、細胞にウイルス性に感染できない。
適当なカチオン的にイオン化可能な脂質は、核酸粒子を含むものであり、用語「粒子形成成分」または「粒子形成剤」に含まれる。用語「粒子形成成分」または「粒子形成剤」は、核酸粒子を形成するよう核酸と結合するあらゆる成分に関する。このような成分は、核酸粒子の一部であり得るあらゆる成分を含む。
ある実施態様において、ＲＮＡ粒子(特にｍＲＮＡ粒子)は１を超えるタイプのＲＮＡ分子を含み、ここで、モル質量または基本的構造要素、例えば、分子構造、キャッピング、コード領域または他の特性に関するなど、ＲＮＡ分子の分子パラメータは、互いに類似しても異なってもよい。
粒子製剤において、各ＲＮＡ種を個別粒子製剤として別々に製剤化することが可能である。この場合、各個々の粒子製剤は１個のＲＮＡ種を含む。個々の粒子製剤は、例えば別々のコンテナに、別々の物として存在し得る。このような製剤は、各ＲＮＡ種を別々に粒子形成剤と共に準備し(典型的に各々ＲＮＡ含有溶液の形態)、それにより粒子を形成させることにより得ることができる。各粒子は、排他的に粒子形成時に提供された特異的ＲＮＡ種(個々の粒子製剤)を含む。ある実施態様において、医薬組成物などの組成物は、１を超える個々の粒子製剤を含む。各医薬組成物は、混合粒子製剤と称される。本発明による混合粒子製剤は、個々の粒子製剤を、別々に形成し、続いて個々の粒子製剤を混合する工程により得られる。混合する工程により、ＲＮＡ含有粒子の混合集団を含む製剤は得られる。個々の粒子集団は、一緒に、個々の粒子製剤の混合集団を含む１コンテナにあり得る。あるいは、医薬組成物の全ＲＮＡ種を、一緒に、組み合わせ粒子製剤として製剤することが可能である。このような製剤は、全ＲＮＡ種の組み合わせ製剤(典型的に組み合わせ溶液)を粒子形成剤と共に準備し、それにより粒子を形成させることにより得ることができる。混合粒子製剤とは逆に、組み合わせ粒子製剤は、典型的に１を超えるＲＮＡ種を含む粒子を含む。組み合わせ粒子組成物において、種々のＲＮＡ種は典型的に単一粒子に一緒に存在する。
脂質
用語「脂質」および「脂質様物質」は、１以上の疎水性部分または基を含み、所望によりまた１以上の親水性部分または基を含む分子として広く定義される。疎水性部分および親水性部分を含む分子は、しばしば両親媒性物質とも称される。脂質は、通常水に不溶性であるかまたはほとんど溶けないが、多くの有機溶媒に可溶性である。水性環境では、両親媒性性質により、分子は組織的構造および種々の相に自己集合できる。これらの相の一つは、水性環境における小胞、多重膜／単層膜リポソームまたは膜に存在するため、脂質二重層からなる。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基であるが、これに限定されない非極性基の包含により付与でき、このような基は、１以上の芳香族、シクロ脂肪族またはヘテロ環式基で置換され得る。親水性基は極性および／または荷電基を含み得て、炭水化物、リン酸、カルボン酸、硫酸、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシルおよびその他の基を含む。
ここで使用する用語「疎水性」は、水溶液に実質的に混和しないまたは不溶性であるあらゆる分子、部分または基をいう。用語疎水性基は、少なくとも６個の炭素原子を有する炭化水素を含む。炭化水素の単価ラジカルは、ここではヒドロカルビルと称する。疎水性基は、基は水溶液に実質的に混和しないまたは不溶性である条件を満たす限り、官能基(例えば、エーテル、エステル、ハライドなど)ならびに炭素および水素以外の原子を有し得る。
用語「炭化水素」は、ここで定義するアルキル、アルケニルまたはアルキニルなどの、非環状、例えば、線形(直鎖)または分岐、ヒドロカルビル基を含む。アルキル、アルケニルまたはアルキニルの水素原子の１以上は他の原子、例えば、ハロゲン、酸素または硫黄で置換され得ることは認識される。他に断らない限り、炭化水素基はまた、炭化水素の全体的極性は比較的非極性である限り、環状(アルキル、アルケニルまたはアルキニル)基またはアリール基を含む。
ここで使用する用語「両親媒性」は、極性部分および非極性部分両方を有する分子をいう。しばしば、両親媒性化合物は、長疎水性テイルに結合した極性頭を有する。ある実施態様において、極性部分は水に可溶性であり、一方非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は形式正電荷または形式負電荷を有し得る。あるいは、極性部分は形式正および負電荷両方であり、双性イオンまたは分子内塩であり得る。本発明の目的で、両親媒性化合物は、天然または非天然脂質および脂質様化合物の１個または複数であってよいは、これらに限定されない。
用語「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」は、脂質と構造的および／または機能的に関連するが、厳密な意味では脂質とみなされ得ない物質に関する。例えば、本用語は、水性環境で小胞、多重膜／単層膜リポソームまたは膜で存在するため両親媒性層を形成できる化合物を含み、親水性および疎水性両方の部分を有する界面活性剤または合成化合物を含む。一般的に言って、本用語は、脂質と類似していても類似していなくてもよい、異なる構造組織化を有する親水性および疎水性部分を含む分子をいう。細胞膜に自発的に組み込まれ得る脂質様化合物の例は、合成機能－スペーサー脂質構築物(ＦＳＬ)、合成機能－スペーサー－ステロール構築物(ＦＳＳ)ならびに人工両親媒性分子などの機能的脂質構築物を含む。２個の長アルキル鎖および極性頭基を含む脂質は、一般に円柱状である。２個のアルキル鎖により占拠される領域は、極性頭基により占拠される領域と類似する。このような脂質は、モノマーとして低溶解度であり、水不溶性である平面的二層に凝集する傾向にある。１個の線形アルキル鎖および親水性頭基のみを含む古典的界面活性剤モノマーは、一般に円錐形である。親水性頭基は線形アルキル鎖より多くの分子空間を占拠する傾向にある。ある実施態様において、界面活性剤は、水可溶性である球形または楕円形ミセルに凝集する傾向はある。脂質は、界面活性剤と同じ一般的構造 － 極性親水性頭基および非極性疎水性テイル － を有してよく、脂質は、界面活性剤とモノマーの形、溶液中形成された凝集体のタイプおよび凝集に必要な濃度範囲は異なる。ここで使用する用語「脂質」は、ここで特に断らない限りまたは文脈から明らかに反しない限り、脂質および脂質様物質両方を含むと解釈される。
両親媒性層に含まれ得る両親媒性化合物の具体例は、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、両親媒性化合物は脂質である。用語「脂質」は、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることにより特徴づけられる、有機化合物の一群である。一般に、脂質は、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド(ケトアシルサブユニットの縮合由来)、ステロール脂質およびプレノール脂質(イソプレンサブユニットの縮合由来)の８カテゴリーに分け得る。用語「脂質」は脂肪と同義語として使用されることはあるが、脂肪はトリグリセライドと称される脂質のサブグループである。脂質はまた脂肪酸およびそれらの誘導体(トリ－、ジ－、モノグリセライドおよびリン脂質を含む)ならびにステロイド、すなわち、コレステロールまたはその誘導体などのステロール含有代謝物などの分子を含む。コレステロール誘導体の例は、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびその誘導体およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
脂肪酸または脂肪酸残基は、カルボン酸基で終わる炭化水素鎖から製造される分子の多様な群である；この配置により、分子は極性、親水性末端および水に不溶性である非極性、疎水性末端を有する。典型的に４～２４個の炭素長の炭素鎖は、飽和でも不飽和でもよく、酸素、ハロゲン、窒素および硫黄を含む官能基に結合してよい。脂肪酸が二重結合を含むならば、分子の配置に顕著に影響する、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ幾何異性の可能性はある。Ｃｉｓ－二重結合により、脂肪酸鎖は、鎖中のさらなる二重結合と結合する効果である屈曲となる。脂肪酸カテゴリーにおける他の主要脂質クラスは、脂肪エステルおよび脂肪アミドである。
グリセロ脂質は、モノ－、ジ－およびトリ－置換グリセロールからなり、トリグリセライドと称されるグリセロールの脂肪酸トリエステルは最も知られる。用語「トリアシルグリセロール」は、「トリグリセライド」と同義的に使用されることはある。これらの化合物において、グリセロールの３個のヒドロキシル基は各々、典型的に異なる脂肪酸により、エステル化されている。グリセロ脂質の付加的サブクラスは、グリコシド結合によりグリセロールに結合した１以上の糖残基の存在により特徴づけられる、グリコシルグリセロールにより表される。
グリセロリン脂質は、エステル結合により２個の脂肪酸由来「テイル」におよびリン酸エステル結合により１個の「頭」基に結合しているグリセロールコアを含む両親媒性分子(疎水性および親水性両方の領域を含む)である。通常リン脂質(スフィンゴミエリンもリン脂質と分類されるが)と称される、グリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン(別名ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチン)、ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥまたはＧＰＥｔｎ)およびホスファチジルセリン(ＰＳまたはＧＰＳｅｒ)を含む。
スフィンゴ脂質は、共通構造特性、スフィンゴイド塩基主鎖を共有する化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物における主要スフィンゴイド塩基は、一般にスフィンゴシンと称される。セラミド(Ｎ－アシル－スフィンゴイド塩基)は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要サブクラスである。脂肪酸は、典型的に１６～２６個の炭素原子鎖長の飽和または一不飽和である。哺乳動物の主要ホスホスフィンゴ脂質はスフィンゴミエリン(セラミドホスホコリン)であり、一方昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを含み、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールおよびマンノース含有頭基を有する。スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴイド塩基へのグリコシド結合を介して結合した１以上の糖残基からなる多様な分子のファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純および複雑スフィンゴ糖脂質である。
コレステロールおよびその誘導体またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に、膜脂質の重要な成分である。
糖脂質は、脂肪酸は糖主鎖に直接結合し、膜二層と互換性の構造を形成する化合物をいう。糖脂質において、単糖は、グリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール主鎖を置換する。最もなじみ深い糖脂質は、グラム陰性細菌のリポ多糖のリピドＡ成分のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的脂質分子は、７個もの脂肪－アシル鎖で誘導体化されたグルコサミンの二糖である。大腸菌増殖に必要な最小リポ多糖は、２個の３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸(Ｋｄｏ)残基でグリコシル化されているグルコサミンのヘキサ－アシル化二糖であるＫｄｏ２－リピドＡである。
ポリケチドは、古典的酵素ならびに脂肪酸シンターゼと機構的特性を共有する反復的およびマルチモジュール酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合により合成される。動物、植物、細菌、真菌および海生源からの多数の二次性代謝物および天然生成物を含み、構造多様性は大きい。多くのポリケチドは、主鎖はしばしばグルコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化または他の過程によりさらに修飾されている環状分子である。
カチオン的にイオン化可能な脂質
ここに記載するＲＮＡ組成物およびここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、粒子形成剤として少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含む。ここでのし応は意図されるカチオン的にイオン化可能な脂質は、核酸と静電気的に結合できるあらゆるカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む。ある実施態様において、っこでの使用は意図されるカチオン的にイオン化可能な脂質は、核酸と、例えば核酸と複合体を形成することによりまたは核酸は封入または被覆されている小胞を形成することにより結合できる。
ここで使用する「カチオン性脂質」または「カチオン性脂質様物質」は、正味の正荷電を有する脂質または脂質様物質をいう。カチオン性脂質または脂質様物質は、負荷電核酸と静電気的相互作用により結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシルまたはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分を含み、脂質の頭基は典型的に正荷電を有する。
ある実施態様において、カチオン性脂質または脂質様物質は、あるｐＨ、特に酸性ｐＨでのみ正味の正荷電を有し、異なる、好ましくは生理学的ｐＨなどの高いｐＨで好ましくは正味の正荷電を有さず、好ましくは電荷を有しない、すなわち、中性である。このイオン化可能行動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助け、毒性を低減することにより有効性を増強すると考えられる。
ここで使用する「カチオン的にイオン化可能な脂質」は、正味の正荷電を有するまたは中性である脂質または脂質様物質をいい、すなわち、脂質は永久にカチオン性ではない。故に、カチオン的にイオン化可能な脂質は溶解される組成物のｐＨに依存して、カチオン的にイオン化可能な脂質は正荷電または中性である。本発明の目的で、このような「カチオン的にイオン化可能な」脂質は、状況に反しない限り、用語「カチオン性脂質」に含まれる。
ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、好ましくは生理学的条件下、正荷電またはプロトン化される、少なくとも１個の窒素原子(Ｎ)を含む頭基を含む。
カチオン性脂質の例は、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシプロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)、３－(Ｎ－(Ｎ’,Ｎ’－ジメチルアミノエタン)－カルバモイル)コレステロール(ＤＣ－Ｃｈｏｌ)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(ＤＤＡＢ)；１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＡＰ)；１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＯＤＡＰ)；１,２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１,２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチル塩化アンモニウム(ＤＯＤＡＣ)、１,２－ジステアリルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン(ＤＳＤＭＡ)、２,３－ジ(テトラデオキシ)プロピル－(２－ヒドロキシエチル)－ジメチルアザニウム(ＤＭＲＩＥ)、１,２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン(ＤＭＥＰＣ)、ｌ,２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＭＴＡＰ)、１,２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド(ＤＯＲＩＥ)および２,３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－[２(スペルミンカルボキサミド)エチル]－Ｎ,Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウムトリフルオロ酢酸(ＤＯＳＰＡ)、１,２－ジリノレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬ末端ＭＡ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(イヌ)、３－ジメチルアミノ－２－(コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ)－１－(ｃｉｓ,ｃｉｓ－９,１２－オクタデカジエンオキシ)プロパン(ＣＬｉｎＤＭＡ)、２－[５’－(コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ)－３’－オキサペントキシ)－３－ジメチル－１－(ｃｉｓ,ｃｉｓ－９’,１２’－オクタデカｄｉｅｎオキシ)プロパン(ＣｐＬｉｎＤＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－３,４－ジオレイルオキシベンジルアミン(ＤＭＯＢＡ)、１,２－Ｎ,Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＯｃａｒｂＤＡＰ)、２,３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルプロピルアミン(ＤＬｉｎＤＡＰ)、１,２－Ｎ,Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ)、１,２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＣＤＡＰ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－(２－ジメチルアミノエチル)－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ)、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ)、Ｎ－(２－ヒドロキシエチル)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(テトラデシルオキシ)－１－プロパンアミニウムブロマイド(ＤＭＲＩＥ)、(±)－Ｎ－(３－アミノプロピル)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(ｃｉｓ－９－テトラデセニルオキシ)－１－プロパンアミニウムブロマイド(ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ)、(±)－Ｎ－(３－アミノプロピル)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(ドデシルオキシ)－１－プロパンアミニウムブロマイド(ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ)、(±)－Ｎ－(３－アミノプロピル)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(テトラデシルオキシ)－１－プロパンアミニウムブロマイド(ＧＡＰ－ＤＭＲＩＥ)、Ｎ－(２－アミノエチル)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(テトラデシルオキシ)－１－プロパンアミニウムブロマイド(βＡＥ－ＤＭＲＩＥ)、Ｎ－(４－カルボキシベンジル)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(オレオイルオキシ)プロパン－１－アミニウム(ＤＯＢＡＱ)、２－({８－[(３β)－コレスト－５－エン－３－イルオキシ]オクチル}オキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－３－[(９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イルオキシ]プロパン－１－アミン(オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＭＤＡＰ)、１,２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＰＤＡＰ)、Ｎ１－[２－((１Ｓ)－１－[(３－アミノプロピル)アミノ]－４－[ジ(３－アミノ－プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]－３,４－ジ[オレイルオキシ]－ベンズアミド(ＭＶＬ５)、１,２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン(ＤＯＥＰＣ)、２,３－ビス(ドデシルオキシ)－Ｎ－(２－ヒドロキシエチル)－Ｎ,Ｎ－ジメチルプロパン－１－アモニウムブロマイド(ＤＬＲＩＥ)、Ｎ－(２－アミノエチル)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(テトラデシルオキシ)プロパン－１－アミニウムブロマイド(ＤＭＯＲＩＥ)、ジ((Ｚ)－ノン－２－エン－１－イル)８,８’－((((２(ジメチルアミノ)エチル)チオ)カルボニル)アザンジイル)－ジオクタノエート(ＡＴＸ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(ドデシルオキシ)プロパン－１－アミン(ＤＬＤＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(テトラデシルオキシ)プロパン－１－アミン(ＤＭＤＭＡ)、ジ((Ｚ)－ノン－２－エン－１－イル)－９－((４－(ジメチルアミノブタノイル)－オキシ)ヘプタデカンジオエート(Ｌ３１９)、Ｎ－ドデシル－３－((２－ドデシルカルバモイル－エチル)－{２－[(２－ドデシルカルバモイル－エチル)－２－{(２－ドデシルカルバモイル－エチル)－[２－(２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ)－エチル]－アミノ}－エチル－アミノ)プロピオンアミド(リピドイド９８Ｎ１２－５)、１－[２－[ビス(２－ヒドロキシドデシル)アミノ]エチル－[２－[４－[２－[ビス(２－ヒドロキシドデシル)アミノ]エチル]ピペラジン－１－イル]エチル]アミノ]ドデカン－２－オール(リピドイドＣ１２－２００)を含むが、これらに限定されない。好ましいのは、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣおよびＤＯＳＰＡである。具体的実施態様において、カチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質はＤＯＤＭＡである。
ＤＯＴＭＡは、４級アミン頭基を有するカチオン性脂質である。ＤＯＴＭＡの構造は、次のとおり表され得る：
ＤＯＤＭＡは、３級アミン頭基を有するイオン化可能カチオン性脂質である。ＤＯＤＭＡの構造は、次のとおり表され得る：
ある実施態様において、組成物はカチオン的にイオン化可能な脂質を含む。
ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、好ましくは生理学的条件下、正荷電またはプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子(Ｎ)を含む頭基を含むM。
カチオン的にイオン化可能な脂質の例は、例えば、ＷＯ２０１６／１７６３３０およびＷＯ２０１８／０７８０５３に開示される。ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は式(Ｘ)：
の構造を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、ここで：
Ｌ１０およびＬ２０の一方は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－であり、Ｌ１０およびＬ２０の他方は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ１およびＧ２は各々独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－１２アルケニレンであり；
Ｇ３はＣ１－２４アルキレン、Ｃ２－２４アルケニレン、Ｃ３－８シクロアルキレンまたはＣ３－８シクロアルケニレンであり；
ＲａはＨまたはＣ１－１２アルキルであり；
Ｒ３５およびＲ３６は各々独立してＣ６－２４アルキルまたはＣ６－２４アルケニルであり；
Ｒ３７はＨ、ＯＲ５０、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４０、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４０または－ＮＲ５０Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４０であり；
Ｒ４０はＣ１－１２アルキルであり；
Ｒ５０はＨまたはＣ１－６アルキルであり；そして
ｘは０、１または２である。
式(Ｘ)の前記実施態様のいくつかにおいて、脂質は次の構造(ＸＡ)または(ＸＢ)の一つを有する：
〔式中、
Ａは３～８員シクロアルキルまたはシクロアルキレン基であり；
Ｒ６０は、各場合独立して、Ｈ、ＯＨまたはＣ１－Ｃ２４アルキルであり；
ｎ１は１～１５の範囲の整数である。〕。
式(Ｘ)の前記実施態様のいくつかにおいて、脂質は構造(ＸＡ)を有し、他の実施態様において、Ｓ脂質は構造(ＸＢ)を有する。
式(Ｘ)の他の実施態様において、脂質は次の構造(ＸＣ)または(ＸＤ)の一つを有する：
〔式中、ｙおよびｚは各々独立して１～１２の範囲の整数である。〕。
式(Ｘ)の前記実施態様の何れにおいても、Ｌ１０およびＬ２０の一方は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－である。例えば、ある実施態様において、Ｌ１０およびＬ２０の各々は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－である。前記の何れかのいくつかの異なる実施態様において、Ｌ１０およびＬ２０は各々独立して－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－または－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－である。例えば、ある実施態様において、Ｌ１０およびＬ２０の各々は－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－である。
式(Ｘ)のいくつかの異なる実施態様において、脂質は次の構造(ＸＥ)または(ＸＦ)の一つを有する。
式(Ｘ)の前記実施態様のいくつかにおいて、脂質は次の構造(ＸＧ)、(ＸＨ)、(ＸＪ)または(ＸＫ)の一つを有する。
式(Ｘ)の前記実施態様のいくつかにおいて、ｎ１は２～１２、例えば２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、ある実施態様において、ｎ１は３、４、５または６である。ある実施態様において、ｎ１は３である。ある実施態様において、ｎ１は４である。ある実施態様において、ｎ１は５である。ある実施態様において、ｎ１は６である。
式(Ｘ)の前記実施態様の他のいくつかにおいて、ｙおよびｚは各々独立して２～１０の範囲の整数である。例えば、ある実施態様において、ｙおよびｚは各々独立して４～９または４～６の範囲の整数である。
式(Ｘ)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ６０はＨである。前記の他の実施態様において、Ｒ６０はＣ１－Ｃ２４アルキルである。他の実施態様において、Ｒ６０はＯＨである。
式(Ｘ)のある実施態様において、Ｇ３は非置換である。他の実施態様において、Ｇ３は置換されている。種々の異なる実施態様において、Ｇ３は線形Ｃ１－Ｃ２４アルキレンまたは線形Ｃ２－Ｃ２４アルケニレンである。
式(Ｘ)の前記実施態様の他のいくつかにおいて、Ｒ３５またはＲ３６または両方はＣ６－Ｃ２４アルケニルである。例えば、ある実施態様において、Ｒ３５およびＲ３６は、各々独立して、次の構造を有する：
〔式中、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、各場合、独立してＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；そして
ａは２～１２の整数であり、
ここで、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびａは、Ｒ３５およびＲ３６は各々独立して６～２０個の炭素原子を含むよう選択される。〕。例えば、ある実施態様において、ａは５～９または８～１２の範囲の整数である。
式(Ｘ)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ７ａの少なくとも１個はＨである。例えば、ある実施態様において、Ｒ７ａは各場合Ｈである。前記の他の異なる実施態様において、Ｒ７ｂの少なくとも１個はＣ１－Ｃ８アルキルである。例えば、ある実施態様において、Ｃ１－Ｃ８アルキルはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
式(Ｘ)の異なる実施態様において、Ｒ３５またはＲ３６または両方は次の構造の一つを有する。
式(Ｘ)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ３７はＯＨ、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４０、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４０または－ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｒ４０である。ある実施態様において、Ｒ４０はメチルまたはエチルである。
種々の異なる実施態様において、式(Ｘ)のカチオン性脂質は次に示す構造の一つを有する。
種々の異なる実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、下表に示す構造の一つを有する。
ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は式(XI)：
の構造を有し、ここで、
Ｒ１およびＲ２の各々は独立してＲ５または－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であり、ここで、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１個は－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であり；
Ｒ３およびＲ４の各々は独立してＣ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、アリールおよびＣ３－１０シクロアルキルからなる群から選択され；
Ｒ５およびＲ６の各々は独立して少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状ヒドロカルビル基であり；
Ｇ１およびＧ２の各々は独立して非置換Ｃ１－１２アルキレンまたはＣ２－１２アルケニレンであり；
Ｌ１およびＬ２の各々は独立して－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－および－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－からなる群から選択され；
ＲａはＨまたはＣ１－１２アルキルであり；
ｍは０、１、２、３または４であり；そして
ｘは０、１または２である。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｇ１は独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたは非置換Ｃ２－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ１－１２アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ２－１２アルケニレンである。ある実施態様において、各Ｇ１は独立して非置換Ｃ６－１２アルキレンまたは非置換Ｃ６－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ６－１２アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ６－１２アルケニレンである。ある実施態様において、各Ｇ１は独立して非置換Ｃ８－１２アルキレンまたは非置換Ｃ８－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ８－１２アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ８－１２アルケニレンである。ある実施態様において、各Ｇ１は独立して非置換Ｃ６－１０アルキレンまたは非置換Ｃ６－１０アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ６－１０アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ６－１０アルケニレンである。ある実施態様において、各Ｇ１は独立して８個、９個または１０個の炭素原子を有する非置換アルキレン、例えば、８個、９個または１０個の炭素原子を有する非置換、直鎖アルキレンである。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は両方独立して－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であるとき、Ｒ１のＧ１はＲ２のＧ１と異なってよい。これらの実施態様の何れかにおいて、例えば、Ｒ１のＧ１は非置換、直鎖Ｃ１－１２アルキレンであり、Ｒ２のＧ１は非置換、直鎖Ｃ２－１２アルケニレンである；またはＲ１のＧ１は非置換、直鎖Ｃ１－１２アルキレン基であり、Ｒ２のＧ１は異なる非置換、直鎖Ｃ１－１２アルキレン基である。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は両方独立して－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であるとき、Ｒ１のＧ１はＲ２のＧ１と同一であってよい。これらの実施態様の何れかにおいて、例えば、各Ｇ１は同じ非置換、直鎖Ｃ８－１２アルキレン、例えば非置換、直鎖Ｃ８－１０アルキレンであるかまたは各Ｇ１は同じ非置換、直鎖Ｃ６－１２アルケニレンである。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、各Ｌ１は独立して－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－および－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－からなる群から選択される。ある実施態様において、Ｌ１のＲａはＨまたはＣ１－１２アルキルである。ある実施態様において、Ｌ１のＲａはＨまたはＣ１－６アルキル、例えば、ＨまたはＣ１－３アルキルである。ある実施態様において、Ｌ１のＲａはＨ、メチルまたはエチルである。ある実施態様において、各Ｌ１は独立して－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－および－ＳＣ(＝Ｏ)－からなる群から選択される。ある実施態様において、各Ｌ１は独立して－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－または－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－である。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は両方独立して－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であるとき、Ｒ１のＬ１はＲ２のＬ１と異なってよい。これらの実施態様の何れかにおいて、例えば、Ｒ１のＬ１は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－および－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－からなる群から選択されるある部分であり(例えば、Ｒ１のＬ１は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－である)、Ｒ２のＬ１は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－および－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－から選択される異なる部分である(例えば、Ｒ２のＬ１は－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－である)。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は両方独立して－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であるとき、Ｒ１のＬ１はＲ２のＬ１と同一であってよい。これらの実施態様の何れかにおいて、例えば、各Ｌ１は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－および－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－からなる群から選択される同じ部分である、例えば、各Ｌ１は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－であるかまたは各Ｌ１は－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－である。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、各Ｒ６は独立して少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状ヒドロカルビル基、例えば、少なくとも１０個の炭素原子を有する直鎖ヒドロカルビル基である。ある実施態様において、各Ｒ６は、独立して最大３０個の炭素原子、例えば最大２８個、最大２６個、最大２４個、最大２２個または最大２０個の炭素原子を有する。ある実施態様において、各Ｒ６は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する非環状ヒドロカルビル基、例えば、１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基である。ある実施態様において、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。ある実施態様において、各Ｒ６は独立して最大３０個の炭素原子(例えば最大２８個、最大２６個、最大２４個、最大２２個または最大２０個の炭素原子)を有し、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。ある実施態様において、各Ｒ６は独立して少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状ヒドロカルビル基であり、例えば、少なくとも１０個の炭素原子を有する直鎖ヒドロカルビル基であり、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。ある実施態様において、各Ｒ６は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する非環状ヒドロカルビル基、例えば、１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基であり、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。ある実施態様において、Ｒ６のヒドロカルビル基はアルキルまたはアルケニル基、例えば、Ｃ１０－３０アルキルまたはアルケニル基である。故に、ある実施態様において、各Ｒ６は独立して少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状アルキル基または少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状アルケニル基、例えば、少なくとも１０個の炭素原子を有する直鎖アルキル基または少なくとも１０個の炭素原子を有する直鎖アルケニル基である。ある実施態様において、各Ｒ６は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子原子を有する非環状アルキル基)または１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する非環状アルケニル基、例えば、１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖アルキル基または１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖アルケニル基である。ある実施態様において、各Ｒ６は独立して１１～１９個の炭素原子(例えば１１個、１３個、１５個、１７個または１７個の炭素原子)を有する非環状アルキル基、例えば、１１～１９個の炭素原子(例えば１１個、１３個、１５個、１７個または１７個の炭素原子)を有する直鎖アルキル基である。ある実施態様において、各Ｒ６は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子原子を有する非環状アルキル基)または１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する非環状アルケニル基、例えば、１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖アルキル基または１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖アルケニル基であり、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。ある実施態様において、各Ｒ６は独立して１１～１９個の炭素原子(例えば１１個、１３個、１５個、１７個または１７個の炭素原子)を有する非環状アルキル基、例えば、１１～１９個の炭素原子(例えば１１個、１３個、１５個、１７個または１７個の炭素原子)を有する直鎖アルキル基であり、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。表現「内部炭素原子」は、Ｒ６はＬ１に結合するＲ６の炭素原子は、Ｒ６の少なくとも２個の他の炭素原子に直接結合することを意味する。例えば、次のＣ１１アルキル基について、２位、３位、４位、５位および７位の何れかの各炭素原子は、本発明により「内部炭素原子」としてみなされ、一方１位、６位、８位、９位、１０位および１１位の炭素原子は違う。
結果として、Ｒ６の内部炭素を介してＬ１に結合するＣ１１アルキル基であるＲ６は、次の基：
を含み、ここで、
はＲ６はＬ１に結合する結合を表す。さらに、直鎖アルキル基、例えば、直鎖Ｃ１１アルキル基について、直鎖アルキル基の最初と最後の炭素原子以外(すなわち、直鎖Ｃ１１アルキル基の１位および１１位の素原子以外)の各炭素原子は「内部炭素原子」としてみなさる。故に、ある実施態様において、ｐ炭素原子を有する直鎖アルキル基であり、Ｒ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合するＲ６は、Ｒ６は２位～(ｐ－１)位(それにより１位およびｐ位の末端Ｃ原子は除外される)の何れかのＲ６の炭素原子を介してＬ１に結合することを意味する。ある実施態様において、Ｒ６はｐ’炭素原子(ここで、ｐ’は偶数である)を有する直鎖アルキル基であり、Ｒ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合するとき、Ｒ６は、Ｒ６の位置(ｐ’／２－１)、(ｐ’／２)および(ｐ’／２＋１)の何れかの炭素を介してＬ１に結合する(例えば、ｐ’が１０であるならば、Ｒ６はＲ６の４位、５位および６位の何れかの炭素原子を介してＬ１に結合する)。ある実施態様において、Ｒ６はｐ”炭素原子(ここで、ｐ”は奇数である)を有する直鎖アルキル基であり、Ｒ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合するとき、Ｒ６は、Ｒ６の位置(ｐ”－１)／２および(ｐ”＋１)／２の何れかの炭素を介してＬ１に結合する(例えば、ｐ”が１１であるとき、Ｒ６はＲ６の５位および６位の何れかの炭素原子を介してＬ１に結合する)。一般に、Ｒ１およびＲ２両方は－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であり、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合するとき、Ｒ１のＲ６はＲ１のＲ６の内部炭素原子を介してＲ１のＬ１に結合し(そしてＲ２のＬ１には結合しない)、Ｒ２のＲ６はＲ２のＲ６の内部炭素原子を介してＲ２のＬ１に結合する(そしてＲ１のＬ１には結合しない)。ある実施態様において、各Ｒ６は独立して
からなる群から選択され、ここで、
は、Ｒ６はＬ１に結合する結合を表す。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は両方独立して－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であるとき、Ｒ１のＲ６はＲ２のＲ６と異なる。これらの実施態様の何れかにおいて、例えば、Ｒ１のＲ６は少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状、好ましくは直鎖、ヒドロカルビル基であってよく(例えば、Ｒ１のＲ６は
である)、そしてＲ２のＲ６は異なる少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状、好ましくは直鎖、ヒドロカルビル基であってよい(例えば、Ｒ２のＲ６は
である)。ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は両方独立して－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であるとき、Ｒ１のＲ６はＲ２のＲ６と同一である。これらの実施態様の何れかにおいて、例えば、各Ｒ６は同じ少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状、好ましくは直鎖、ヒドロカルビル基である(例えば、各Ｒ６は
である)。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ５は少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状ヒドロカルビル基、例えば、少なくとも１０個の炭素原子を有する直鎖ヒドロカルビル基である。ある実施態様において、Ｒ５は少なくとも１２個の炭素原子を有する非環状ヒドロカルビル基、例えば少なくとも１４個、少なくとも１６個または少なくとも１８個の炭素原子、例えば、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個または少なくとも１８個の炭素原子を有する直鎖ヒドロカルビル基である。ある実施態様において、Ｒ５は最大３０個の炭素原子、例えば最大２８個、最大２６個、最大２４個、最大２２個または最大２０個の炭素原子を有する。ある実施態様において、Ｒ５は非環状ヒドロカルビル基、例えば、直鎖ヒドロカルビル基であり、ここで、各ヒドロカルビル基は１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個、１０～２０個の炭素原子または１２～３０個、１２～２８個、１２～２６個、１２～２４個、１２～２２個、１２～２０個の炭素原子または１４～３０個、１４～２８個、１４～２６個、１４～２４個、１４～２２個、１４～２０個の炭素原子または１６～３０個、１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有する。ある実施態様において、Ｒ５のヒドロカルビル基はアルキルまたはアルケニル基、例えば、Ｃ１０－３０アルキルまたはアルケニル基である。故に、ある実施態様において、Ｒ５は少なくとも１０個の炭素原子(例えば少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個または少なくとも１８個の炭素原子原子を有する非環状アルキル基)または少なくとも１０個の炭素原子(例えば少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個または少なくとも１８個の炭素原子)を有する非環状アルケニル基、例えば、少なくとも１０個の炭素原子(例えば少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個または少なくとも１８個の炭素原子)を有する直鎖アルキル基または少なくとも１０個の炭素原子(例えば少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個または少なくとも１８個の炭素原子)を有する直鎖アルケニル基である。ある実施態様において、Ｒ５は非環状アルキル基または非環状アルケニル基、例えば、直鎖アルキル基または直鎖アルケニル基であり、ここで、アルキルおよびアルケニル基の各々は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個、１０～２０個の炭素原子または１２～３０個、１２～２８個、１２～２６個、１２～２４個、１２～２２個、１２～２０個の炭素原子または１４～３０個、１４～２８個、１４～２６個、１４～２４個、１４～２２個、１４～２０個の炭素原子または１６～３０個、１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有する。ある実施態様において、アルケニル基は少なくとも２個の炭素－炭素二重結合、例えば、２個または３個の炭素－炭素二重結合、例えば２個の炭素－炭素二重結合を有する。ある実施態様において、アルケニル基は少なくとも１個のｃｉｓ配置の炭素－炭素二重結合、例えば、１個、２個または３個、例えば２個の、ｃｉｓ配置の炭素－炭素二重結合を有する。故に、ある実施態様において、Ｒ５は非環状アルキル基または非環状アルケニル基、例えば、直鎖アルキル基または直鎖アルケニル基であり、ここで、アルキルおよびアルケニル基の各々は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個、１０～２０個の炭素原子または１２～３０個、１２～２８個、１２～２６個、１２～２４個、１２～２２個、１２～２０個の炭素原子または１４～３０個、１４～２８個、１４～２６個、１４～２４個、１４～２２個、１４～２０個の炭素原子または１６～３０個、１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有し、アルケニル基は少なくとも２個の炭素－炭素二重結合、例えば、２個または３個の炭素－炭素二重結合を有する。ある実施態様において、Ｒ５は非環状アルキル基または非環状アルケニル基、例えば、直鎖アルキル基または直鎖アルケニル基であり、ここで、アルキルおよびアルケニル基の各々は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個、１０～２０個の炭素原子または１２～３０個、１２～２８個、１２～２６個、１２～２４個、１２～２２個、１２～２０個の炭素原子または１４～３０個、１４～２８個、１４～２６個、１４～２４個、１４～２２個、１４～２０個の炭素原子または１６～３０個、１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有し、アルケニル基は少なくとも１個の炭素－炭素二重結合、例えば１個、２個または３個のｃｉｓ配置の炭素－炭素二重結合を有する。ある実施態様において、Ｒ５は次の構造
を有し、ここで、
は、Ｒ５は化合物の残りに結合する結合を表す。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｌ２は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－および－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－からなる群から選択される。ある実施態様において、Ｌ２は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－および－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－からなる群から選択される。ある実施態様において、Ｌ２のＲａはＨまたはＣ１－１２アルキルである。ある実施態様において、Ｌ２のＲａはＨまたはＣ１－６アルキル、例えば、ＨまたはＣ１－３アルキルである。ある実施態様において、Ｌ２のＲａはＨ、メチルまたはエチルである。ある実施態様において、Ｌ２は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－および－ＳＣ(＝Ｏ)－からなる群から選択される。ある実施態様において、Ｌ２は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－または－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－である。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｇ２は非置換Ｃ１－１２アルキレンまたは非置換Ｃ２－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ１－１２アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ２－１２アルケニレンである。ある実施態様において、Ｇ２は非置換Ｃ２－１０アルキレンまたは非置換Ｃ２－１０アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ２－１０アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ２－１０アルケニレンである。ある実施態様において、Ｇ２は非置換Ｃ２－６アルキレンまたは非置換Ｃ２－６アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ２－６アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ２－６アルケニレンである。ある実施態様において、Ｇ２は非置換Ｃ２－４アルキレンまたは非置換Ｃ２－４アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ２－４アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ２－４アルケニレンである。ある実施態様において、Ｇ２はエチレンまたはトリメチレンである。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ３およびＲ４の各々は独立してＣ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルである。ある実施態様において、Ｒ３およびＲ４の各々は独立してＣ１－４アルキルまたはＣ２－４アルケニルである。ある実施態様において、Ｒ３およびＲ４の各々は独立してＣ１－３アルキルである。ある実施態様において、Ｒ３およびＲ４の各々は独立してメチルまたはエチルである。ある実施態様において、Ｒ３およびＲ４の各々はメチルである。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、ｍは０、１、２または３である。ある実施態様において、ｍは０または２である。ある実施態様において、ｍは０である。ある実施態様において、ｍは２である。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、カチオン的にイオン化可能な脂質は式(XIIａ)または(XIIｂ)：
の構造を有し、ここで、
Ｒ３およびＲ４の各々は独立してＣ１－Ｃ６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり；
Ｒ５は少なくとも１４個の炭素原子(例えば少なくとも１６個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基であり、ここで、ヒドロカルビル基は好ましくは少なくとも２個の炭素－炭素二重結合を有し；
各Ｒ６は独立して少なくとも１０個の炭素原子を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であるおよび／または各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合し、好ましくは各Ｒ６は独立して少なくとも１０個の炭素原子を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合し；
各Ｇ１は独立して非置換、直鎖Ｃ４－１２アルキレンまたはＣ４－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ６－１２アルキレンまたはＣ６－１２アルケニレン、例えば非置換、直鎖Ｃ８－１２アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ８－１２アルケニレンであり；
Ｇ２は非置換Ｃ２－Ｃ１０アルキレンまたはＣ２－１０アルケニレン、好ましくは非置換Ｃ２－Ｃ６アルキレンまたはＣ２－６アルケニレンであり；
Ｌ１およびＬ２の各々は独立して－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－または－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－であり；そして
ｍは０、１、２または３、好ましくは０または２である。
式(XIIａ)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ５は最大３０個の炭素原子、例えば最大２８個、最大２６個、最大２４個、最大２２個または最大２０個の炭素原子を有する。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は１４～３０個の炭素原子(例えば１４～２８個、１４～２６個、１４～２４個、１４～２２個、１４～２０個の炭素原子または１６～３０個、１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基である。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は１４～３０個の炭素原子(例えば１４～２８個、１４～２６個、１４～２４個、１４～２２個、１４～２０個の炭素原子または１６～３０個、１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有する直鎖アルキルまたはアルケニル基である。式(XIIａ)のある実施態様において、アルケニル基は少なくとも２個の炭素－炭素二重結合、例えば、２個または３個の炭素－炭素二重結合、例えば２個の炭素－炭素二重結合を有する。ある実施態様において、アルケニル基は少なくとも１個のｃｉｓ配置の炭素－炭素二重結合、例えば、１個、２個または３個、例えば２個の、ｃｉｓ配置の炭素－炭素二重結合を有する。故に、式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は直鎖アルキル基または直鎖アルケニル基であり、ここで、アルキルおよびアルケニル基の各々は独立して１４～３０個の炭素原子(例えば１４～２８個、１４～２６個、１４～２４個、１４～２２個、１４～２０個の炭素原子または１６～３０個、１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有し、アルケニル基は少なくとも２個の炭素－炭素二重結合、例えば、２個または３個の炭素－炭素二重結合を有する。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は直鎖アルキル基または直鎖アルケニル基であり、ここで、アルキルおよびアルケニル基の各々は独立して１４～３０個の炭素原子(例えば１４～２８個、１４～２６個、１４～２４個、１４～２２個、１４～２０個の炭素原子または１６～３０個、１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有し、アルケニル基は少なくとも１個の炭素－炭素二重結合、例えば１個、２個または３個のｃｉｓ配置の炭素－炭素二重結合を有する。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は直鎖アルキル基または直鎖アルケニル基であり、ここで、アルキルおよびアルケニル基の各々は独立して１４～３０個の炭素原子(例えば１４～２８個、１４～２６個、１４～２４個、１４～２２個、１４～２０個の炭素原子または１６～３０個、１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有し、アルケニル基は２個または３個の炭素－炭素二重結合を有し、ここで、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合、例えば１個、２個または３個の炭素－炭素二重結合はｃｉｓ配置である。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は次の構造
を有し、ここで、
は、Ｒ５は化合物の残りに結合する結合を表す。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ６は最大３０個の炭素原子、例えば最大２８個、最大２６個、最大２４個、最大２２個または最大２０個の炭素原子を有する。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ６は１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する非環状ヒドロカルビル基(例えば、非環状アルキル基)、例えば、１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)である。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ６は少なくとも１０個の炭素原子を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ６は１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する非環状ヒドロカルビル基(例えば、非環状アルキル基)、例えば、１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｇ１は独立して非置換、直鎖Ｃ４－１２アルキレンまたはＣ４－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ６－１２アルキレンまたはＣ６－１２アルケニレンである。式(XIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は少なくとも１４個の炭素原子(例えば１４～３０個の炭素原子)および２個または３個の炭素－炭素二重結合を有する直鎖ヒドロカルビル基、例えば、直鎖アルケニル基であり；Ｒ６は少なくとも１０個の炭素原子(例えば、１０～３０個の炭素原子を有する)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合し；そしてＧ１は独立して非置換、直鎖Ｃ４－１２アルキレンまたはＣ４－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ６－１２アルキレンまたはＣ６－１２アルケニレンである。
式(XIIｂ)の前記実施態様のいくつかにおいて、各Ｒ６は、独立して最大３０個の炭素原子、例えば最大２８個、最大２６個、最大２４個、最大２２個または最大２０個の炭素原子を有する。式(XIIｂ)のある実施態様において、各Ｒ６は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子または１１～１９個の炭素原子、例えば１１個、１３個、１５個、１７個または１７個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)である。式(XIIｂ)のある実施態様において、各Ｒ６は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子または１１～１９個の炭素原子、例えば１１個、１３個、１５個、１７個または１７個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。式(XIIｂ)のある実施態様において、各Ｒ６は独立して
からなる群から選択され、ここで、
は、Ｒ６はＬ１に結合する結合を表す。式(XIIｂ)のある実施態様において、各Ｇ１は独立して非置換、直鎖Ｃ６－１２アルキレンまたはＣ６－１２アルケニレンである。式(XIIｂ)のある実施態様において、各Ｇ１は独立して非置換、直鎖Ｃ８－１２アルキレンまたはＣ８－１２アルケニレンである。式(XIIｂ)のある実施態様において、各Ｒ６は独立して少なくとも１０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子または１１～１９個の炭素原子、例えば１１個、１３個、１５個、１７個または１７個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、Ｒ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合し；そして各Ｇ１は独立して非置換、直鎖Ｃ８－１２アルキレンまたはＣ８－１２アルケニレンである。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、カチオン的にイオン化可能な脂質は式(XIIIａ)または(XIIIｂ)：
の構造を有し、ここで、
Ｒ３およびＲ４の各々は独立してＣ１－４アルキルまたはＣ２－４アルケニル、より好ましくはＣ１－３アルキル、例えばメチルまたはエチルであり；
Ｒ５は少なくとも１６個の炭素原子を有する直鎖アルキルまたはアルケニル基であり、ここで、アルケニル基は好ましくは少なくとも２個の炭素－炭素二重結合を有し；
各Ｒ６は独立して少なくとも１０個の炭素原子を有する直鎖ヒドロカルビル基であり、ここで、Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合し；
各Ｇ１は独立して非置換、直鎖Ｃ６－１２アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ６－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ８－１２アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ８－１２アルケニレン、例えば非置換、直鎖Ｃ８－１０アルキレンまたは非置換、直鎖Ｃ８－１０アルケニレン、例えば非置換、直鎖Ｃ８アルキレンであり；
Ｇ２は非置換Ｃ２－６アルキレンまたはＣ２－６アルケニレン、好ましくは非置換Ｃ２－４アルキレンまたはＣ２－４アルケニレン、例えばエチレンまたはトリメチレンであり；
Ｌ１およびＬ２の各々は独立して－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－または－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－であり；そして
ｍは０、１、２または３、好ましくは０または２である。
式(XIIIａ)の前記実施態様のいくつかにおいて、Ｒ５は最大３０個の炭素原子、例えば最大２８個、最大２６個、最大２４個、最大２２個または最大２０個の炭素原子を有する。式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は１６～３０個の炭素原子(例えば１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有する直鎖アルキルまたはアルケニル基である。式(XIIIａ)のある実施態様において、アルケニル基は少なくとも２個の炭素－炭素二重結合、例えば、２個または３個の炭素－炭素二重結合、例えば２個の炭素－炭素二重結合を有する。ある実施態様において、アルケニル基は少なくとも１個のｃｉｓ配置の炭素－炭素二重結合、例えば、１個、２個または３個、例えば２個の、ｃｉｓ配置の炭素－炭素二重結合を有する。故に、式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は直鎖アルキル基または直鎖アルケニル基であり、ここで、アルキルおよびアルケニル基の各々は独立して１６～３０個の炭素原子(例えば１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有し、アルケニル基は少なくとも２個の炭素－炭素二重結合、例えば、２個または３個の炭素－炭素二重結合を有する。式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は直鎖アルキル基または直鎖アルケニル基であり、ここで、アルキルおよびアルケニル基の各々は独立して１６～３０個の炭素原子(例えば１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有し、アルケニル基は少なくとも１個の炭素－炭素二重結合、例えば１個、２個または３個のｃｉｓ配置の炭素－炭素二重結合を有する。式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は直鎖アルキル基または直鎖アルケニル基であり、ここで、アルキルおよびアルケニル基の各々は独立して１６～３０個の炭素原子(例えば１６～２８個、１６～２６個、１６～２４個、１６～２２個、１６～２０個の炭素原子または１８～３０個、１８～２８個、１８～２６個、１８～２４個、１８～２２個または１８～２０個の炭素原子)を有し、アルケニル基は２個または３個の炭素－炭素二重結合を有し、ここで、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合、例えば１個、２個または３個の炭素－炭素二重結合はｃｉｓ配置である。式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は次の構造
を有し、ここで、
は、Ｒ５は化合物の残りに結合する結合を表す。式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｒ６は最大３０個の炭素原子、例えば最大２８個、最大２６個、最大２４個、最大２２個または最大２０個の炭素原子を有する。式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｒ６は１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｒ６は１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子)を有する直鎖アルキル基であり、Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｇ１は独立して非置換、直鎖Ｃ４－１２アルキレンまたはＣ４－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ６－１２アルキレンまたはＣ６－１２アルケニレンである。式(XIIIａ)のある実施態様において、Ｒ５は少なくとも１６個の炭素原子(例えば１６～３０個の炭素原子)および２個または３個の炭素－炭素二重結合を有する直鎖ヒドロカルビル基、例えば、直鎖アルケニル基であり；Ｒ６は少なくとも１０個の炭素原子(例えば、１０～３０個の炭素原子を有する)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合し；そしてＧ１は独立して非置換、直鎖Ｃ４－１２アルキレンまたはＣ４－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ６－１２アルキレンまたはＣ６－１２アルケニレンである。
式(XIIIｂ)の前記実施態様のいくつかにおいて、各Ｒ６は、独立して最大３０個の炭素原子、例えば最大２８個、最大２６個、最大２４個、最大２２個または最大２０個の炭素原子を有する。式(XIIIｂ)のある実施態様において、各Ｒ６は独立して１０～３０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子または１１～１９個の炭素原子、例えば１１個、１３個、１５個、１７個または１７個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合する。式(XIIIｂ)のある実施態様において、各Ｒ６はＲ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合し、
からなる群から独立して選択され、ここで、
は、Ｒ６はＬ１に結合する結合を表す。式(XIIIｂ)のある実施態様において、各Ｇ１は独立して非置換、直鎖Ｃ８－１２アルキレンまたはＣ８－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ８－１０アルキレンまたはＣ８－１０アルケニレンである。式(XIIIｂ)のある実施態様において、各Ｒ６は独立して少なくとも１０個の炭素原子(例えば１０～２８個、１０～２６個、１０～２４個、１０～２２個または１０～２０個の炭素原子または１１～１９個の炭素原子、例えば１１個、１３個、１５個、１７個または１７個の炭素原子)を有する直鎖ヒドロカルビル基(例えば、直鎖アルキル基)であり、Ｒ６の内部炭素原子を介してＬ１に結合し；そして各Ｇ１は独立して非置換、直鎖Ｃ８－１２アルキレンまたはＣ８－１２アルケニレン、例えば、非置換、直鎖Ｃ８－１０アルキレンまたはＣ８－１０アルケニレンである。
式(XI)の前記実施態様のいくつかにおいて、カチオン的にイオン化可能な脂質は次の式(XIV－１)、(XIV－２)および(XIV－３)
の一つを有する。
ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は(６Ｚ,１６Ｚ)－１２－((Ｚ)－デク－４－エン－１－イル)ドコサ－６,１６－ジエン－１１－イル５－(ジメチルアミノ)ペンタノエート(３Ｄ－Ｐ－ＤＭＡ)である。３Ｄ－Ｐ－ＤＭＡの構造は、次のとおり表され得る。
種々の異なる実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質はＮ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシプロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＯＤＡＰ)、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ)および４－((ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イル)アミノ)オキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－４－オキソブタン－１－アミン(ＤＰＬ－１４)からなる群から選択される。
カチオン的にイオン化可能な脂質のさらなる例は、３－(Ｎ－(Ｎ’,Ｎ’－ジメチルアミノエタン)－カルバモイル)コレステロール(ＤＣ－Ｃｈｏｌ)、１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＯＤＡＰ)；１,２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１,２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、１,２－ジステアリルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン(ＤＳＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬ末端ＭＡ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(イヌ)、３－ジメチルアミノ－２－(コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ)－１－(ｃｉｓ,ｃｉｓ－９,１２－オクタデカジエンオキシ)プロパン(ＣＬｉｎＤＭＡ)、２－[５’－(コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ)－３’－オキサペントキシ)－３－ジメチル－１－(ｃｉｓ,ｃｉｓ－９’,１２’－オクタデカｄｉｅｎオキシ)プロパン(ＣｐＬｉｎＤＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－３,４－ジオレイルオキシベンジルアミン(ＤＭＯＢＡ)、１,２－Ｎ,Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＯｃａｒｂＤＡＰ)、２,３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルプロピルアミン(ＤＬｉｎＤＡＰ)、１,２－Ｎ,Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ)、１,２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＣＤＡＰ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－(２－ジメチルアミノエチル)－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ)、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ)、２－({８－[(３β)－コレスト－５－エン－３－イルオキシ]オクチル}オキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－３－[(９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イルオキシ]プロパン－１－アミン(オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＭＤＡＰ)、１,２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＰＤＡＰ)、Ｎ１－[２－((１Ｓ)－１－[(３－アミノプロピル)アミノ]－４－[ジ(３－アミノ－プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]－３,４－ジ[オレイルオキシ]－ベンズアミド(ＭＶＬ５)、ジ((Ｚ)－ノン－２－エン－１－イル)８,８’－((((２(ジメチルアミノ)エチル)チオ)カルボニル)アザンジイル)ジオクタノエート(ＡＴＸ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(ドデシルオキシ)プロパン－１－アミン(ＤＬＤＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(テトラデシルオキシ)プロパン－１－アミン(ＤＭＤＭＡ)、ジ((Ｚ)－ノン－２－エン－１－イル)－９－((４－(ジメチルアミノブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(Ｌ３１９)、Ｎ－ドデシル－３－((２－ドデシルカルバモイル－エチル)－{２－[(２－ドデシルカルバモイル－エチル)－２－{(２－ドデシルカルバモイル－エチル)－[２－(２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ)－エチル]－アミノ}－エチルアミノ)プロピオンアミド(リピドイド９８Ｎ１２－５)、１－[２－[ビス(２－ヒドロキシドデシル)アミノ]エチル－[２－[４－[２－[ビス(２－ヒドロキシドデシル)アミノ]エチル]ピペラジン－１－イル]エチル]アミノ]ドデカン－２－オール(リピドイドＣ１２－２００)を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は構造Ｘ－３を有する。
ある実施態様において、ここで使用するカチオン性脂質はＤＰＬ１４であるまたはそれを含む。ここで使用する「ＤＰＬ１４」は次の一般式を含む脂質である。
ここに開示するカチオン的にイオン化可能な脂質についての記載はまたその塩(特に薬学的に許容される塩)、互変異性体、立体異性体、溶媒和物(例えば、水和物)および同位体標識された形態も含むことは理解される。
ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、組成物／粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約１００mol％、約２０mol％～約１００mol％、約３０mol％～約１００mol％、約４０mol％～約１００mol％または約５０mol％～約１００mol％を構成し得る。
ここに記載する組成物／粒子(特にＲＮＡ組成物／粒子)ここに記載する組成物／粒子(特にＲＮＡ組成物／粒子)がカチオン的にイオン化可能な脂質および１以上の付加的脂質を含むある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、組成物／粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％、約３０mol％～約５０mol％、約３５mol％～約４５mol％または約４０mol％を構成する。ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、組成物／粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約２０mol％～約８０mol％、約２５mol％～約６５mol％または約３０mol％～約５０mol％、例えば約４０mol％～約５０mol％を構成する。
ある実施態様において、ここに記載する粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)はカチオン的にイオン化可能な脂質の４０～５５molパーセント、４０～５０molパーセント、４１～４９molパーセント、４１～４８molパーセント、４２～４８molパーセント、４３～４８molパーセント、４４～４８molパーセント、４５～４８molパーセント、４６～４８molパーセント、４７～４８molパーセントまたは４７.２～４７.８molパーセントを構成する。ある実施態様において、粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)はカチオン的にイオン化可能な脂質の約４７.０、４７.１、４７.２、４７.３、４７.４、４７.５、４７.６、４７.７、４７.８、４７.９または４８.０molパーセントを構成する。
ある実施態様において、ここに記載するカチオン的にイオン化可能な脂質の少なくとも一部がＲＮＡの少なくとも一部と結合して粒子(例えば、ＬＮＰ)を形成するとき、カチオン的にイオン化可能な脂質は組成物に存在する総脂質の約１０mol％～約９５mol％、約２０mol％～約９５mol％、約２０mol％～約９０mol％、約３０mol％～約９０mol％、約４０mol％～約９０mol％または約４０mol％～約８０mol％、例えば粒子に存在する総脂質の約２０mol％～約８０mol％、約２５mol％～約７０mol％、約３０mol％～約６０mol％または約３０mol％～約５０mol％、例えば約４０mol％～約６０mol％を構成し得る。
ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は少なくとも約４である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は４～２０、４～１２、４～１０、４～８または５～７の範囲である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は約６である。
付加的脂質
ここに記載するＲＮＡ組成物はカチオン的にイオン化可能な脂質以外の脂質または脂質様物質、すなわち、非カチオン性脂質または脂質様物質(非カチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む)も含み得る。まとめて、アニオン性および中性脂質または脂質様物質はここでは非カチオン性脂質または脂質様物質と称する。カチオン的にイオン化可能な脂質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分の付加による核酸粒子の製剤の最適化は、組成物および／または粒子安定性および核酸(例えばＲＮＡ)送達の有効性を増大し得る。
核酸粒子の全体的電荷に影響してもしなくてもよい１以上の付加的脂質を取り込み得る。ある実施態様において、１以上の付加的脂質は非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば、１以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。ここで使用する「アニオン性脂質」は、選択したｐＨで負荷電であるあらゆる脂質をいう。ここで使用する「中性脂質」は、選択したｐＨで非荷電または中性双性イオン形態で存在する、あらゆるいくつかの脂質種の何れかをいう。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)はカチオン的にイオン化可能な脂質および１以上の付加的脂質を含む。
理論に拘束されることを願わないが、１以上の付加的脂質の量と比較したカチオン的にイオン化可能な脂質の量は、核酸の電荷、粒子径、安定性、組織選択性および生理活性などの重要な核酸粒子特徴に影響し得る。従って、ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質対１以上の付加的脂質のモル比は約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２または約３：１～約１：１である。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に含まれる１以上の付加的脂質は、次の中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質およびそれらの組み合わせの１以上を含む。
中性脂質
ある実施態様において、１以上の付加的脂質は、好ましくはリン脂質である中性脂質を含む。ある実施態様において、リン脂質はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される。使用できる具体的リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンを含むが、これらに限定されない。このようなリン脂質は、特にジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルフタチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)、ジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)、１,２－ジ－(９Ｚ－オクタデセノイル)－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＤＯＰＧ)、１,２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－(１’－ｒａｃ－グリセロール)(ＤＰＰＧ)、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン(ＰＯＰＥ)、Ｎ－パルミトイル－Ｄ－エリトロ－スフィンゴシルホスホリルコリン(ＳＭ)および種々の疎水性鎖を有するさらなるホスファチジルエタノールアミン脂質を含む。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥおよびＳＭからなる群から選択される。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群から選択される。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。
故に、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)はカチオン的にイオン化可能な脂質およびＤＳＰＣを含む。
ある実施態様において、中性脂質は、５～１５molパーセント、７～１３molパーセントまたは９～１１molパーセントの範囲の濃度でここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に存在する。ある実施態様において、中性脂質は、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に存在する総脂質の約９.５、１０または１０.５molパーセントの濃度で存在する。
ステロイド
ある実施態様において、ステロイドはコレステロールである。故に、ある実施態様において、ＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)はカチオン的にイオン化可能な脂質およびコレステロールを含む。
ある実施態様において、ステロイドはＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に３０～５０molパーセント、３５～４５molパーセントまたは３８～４３molパーセントの範囲の濃度で存在する。ある実施態様において、ステロイドはここに記載する組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に存在する総脂質の約４０、４１、４２、４３、４４、４５または４６molパーセントの濃度で存在する。
ある好ましい実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)は、好ましくは上に示す濃度で、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含む。
ある実施態様において、中性脂質(特に、１以上のリン脂質)とステロイド(特に、コレステロール)の組み合わせ濃度は、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)の総脂質の約０mol％～約９０mol％、約０mol％～約８０mol％、約０mol％～約７０mol％、約０mol％～約６０mol％または約０mol％～約５０mol％、例えば約２０mol％～約８０mol％、約２５mol％～約７５mol％、約３０mol％～約７０mol％、約３５mol％～約６５mol％または約４０mol％～約６０mol％を構成し得る。
(ｉ)ＲＮＡ、(ii)式(Ｉ)のカチオン的にイオン化可能な脂質および(iii)付加的脂質の少なくとも一部が粒子(例えば、ＬＮＰ)を形成するある実施態様において、付加的脂質(例えば、１以上のリン脂質および／またはコレステロール)は、粒子に存在する総脂質の約０mol％～約６０mol％、約２mol％～約５５mol％、約５mol％～約５０mol％、約５mol％～約４５mol％、約１０mol％～約４５mol％、約１５mol％～約４０mol％または約２０mol％～約４０mol％を構成し得る。
ある実施態様において、リン脂質は、粒子に存在する総脂質の約５mol％～約４０mol％、好ましくは約５mol％～約２０mol％、より好ましくは約５mol％～約１５mol％を構成し得る。
ある実施態様において、ステロイド(特に、コレステロール)は、粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約６５mol％、好ましくは約２０mol％～約６０mol％、より好ましくは約３０mol％～約５０mol％を構成する。
ポリマーコンジュゲート脂質
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物は少なくとも１個のポリマーコンジュゲート脂質を含み得る。ポリマーコンジュゲート脂質は典型的に脂質部分およびそれにコンジュゲートしたポリマー部分を含む分子である。
ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質は、ここではペグ化脂質またはＰＥＧ脂質とも称するＰＥＧコンジュゲート脂質である。用語「ペグ化脂質」は、脂質部分およびポリエチレングリコール部分両方を含む分子をいう。ペグ化脂質は当分野で知られる。
ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質は、ここではサルコシン化脂質またはｐＳａｒ脂質とも称するポリサルコシンコンジュゲート脂質である。用語「サルコシン化脂質」は、脂質部分およびポリサルコシン部分両方を含む分子をいう。
ここで使用する「ポリマー」は、その通常の意味であり、すなわち、共有結合により結合した１以上の反復単位(モノマー)を含む分子構造をいう。反復単位は全て同一でよくまたはある場合、ポリマー内に１を超えるタイプの反復単位が存在し得る。ある場合、ポリマーは生物学的に由来し、すなわち、タンパク質などのバイオポリマーである。ある場合、付加的部分、例えばターゲティング部分もポリマーに存在し得る。１を超えるタイプの反復単位がポリマー内に存在するならば、ポリマーは「コポリマー」と称される。コポリマーを形成する反復単位は、どのような形式で配置されていてもよい。例えば、反復単位は無作為の順番、交互の順番または「ブロック」コポリマー、すなわち、各々第一反復単位(例えば、第一ブロック)を含む１以上の領域および各々第二反復単位(例えば、第二ブロック)を含む１以上の領域を含むポリマーとしてなどのように配置され得る。ブロックコポリマーは、２個(ジブロックコポリマー)、３個(トリブロックコポリマー)またはそれ以上の数の異なるブロックを有し得る。
ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質は、疎水性脂質層を遮蔽する保護的親水性層の形成により、脂質粒子を立体的に安定化するよう設計される。ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質は、そのような脂質粒子がインビボに投与されたとき血清タンパク質との結合および／または結果的な細網内皮系による取り込みを減少できる。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物はペグ化脂質を含まない。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物はサルコシン化脂質を含まない。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物はペグ化脂質またはサルコシン化脂質を含まない。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物はあらゆるポリマーコンジュゲート脂質を含まない。
ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)コンジュゲート脂質
ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。用語「ペグ化脂質」は、脂質部分およびポリエチレングリコール部分両方を含む分子をいう。ペグ化脂質は当分野で知られる。ある実施態様において、ペグ化脂質は次の構造(XV)：
を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体であり、ここで、Ｒ１２およびＲ１３は独立して１０～３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐、アルキルまたはアルケニル鎖であり、ここで、アルキルまたはアルケニル鎖は所望により１以上のエステル結合により中断されており；そしてｗは３０～６０の範囲の平均値を有する。
式(XV)のある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３の各々は独立して１０～１８個の炭素原子、好ましくは１２～１６個の炭素原子を含む直鎖アルキル鎖である。
式(XV)のある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３は同一である。ある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３の各々は１２個の炭素原子を含む直鎖アルキル鎖である。ある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３の各々は１４個の炭素原子を含む直鎖アルキル鎖である。ある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３の各々は１６個の炭素原子を含む直鎖アルキル鎖である。
式(XV)のある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３は異なる。ある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３の一方は１２個の炭素原子を含む直鎖アルキル鎖であり、Ｒ１２およびＲ１３の他方は１４個の炭素原子を含む直鎖アルキル鎖である。
式(XV)のある実施態様において、ｚは４０～５０の範囲の平均値、例えば平均値４５を有する。
式(XV)のある実施態様において、ｚは、式(XV)のペグ化脂質のＰＥＧ部分が、約４００～約６０００ｇ／mol、例えば約１０００～約５０００ｇ／mol、約１５００～約４０００ｇ／molまたは約２０００～約３０００ｇ／molの平均分子量を有するような範囲内である。
種々のＰＥＧコンジュゲート脂質は当分野で知られ、ペグ化ジアシルグリセロール(ＰＥＧ－ＤＡＧ)例えば１－(モノメトキシ－ポリエチレングリコール)－２,３－ジミリストイルグリセロール(ＰＥＧ－ＤＭＧ)、ペグ化ホスファチジルエタエタノロアミン(ＰＥＧ－ＰＥ)、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール(ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ)例えば４－Ｏ－(２’,３’－ジ(テトラデカノイルオキシ)プロピル－１－Ｏ－(ω－メトキシ(ポリエトキシ)エチル)ブタンジオエート(ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ)、ペグ化セラミド(ＰＥＧ－ｃｅｒ)またはＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート、例えばω－メトキシ(ポリエトキシ)エチル－Ｎ－(２,３－ジ(テトラデカンオキシ)プロピル)カルバメートまたは２,３－ジ(テトラデカンオキシ)プロピル－Ｎ－(ωメトキシ(ポリエトキシ)エチル)カルバメートなどを含むが、これらに限定されない。
ＰＥＧコンジュゲート脂質のさらなる例は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ(１,２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－[カルボキシ(ポリエチレングリコール)メトキシ])、例えばＤＳＰＥ－ＰＥＧ(２０００)ナトリウム塩、ＤＯＰＥ－ＰＥＧ(１,２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－[(ポリエチレングリコール)メトキシ])、例えばＤＯＰＥ－ＰＥＧ(２０００)アンモニウム塩、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ(１,２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－[(ポリエチレングリコール)メトキシ)、例えばＤＰＰＥ－ＰＥＧ(２０００)アンモニウム塩およびＤＭＰＥ－ＰＥＧ(１,２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－[(ポリエチレングリコール)メトキシ])、例えばＤＭＰＥ－ＰＥＧ(２０００)ナトリウム塩を含む。
ある実施態様において、ペグ化脂質は、例えば、次の構造を有する２－[(ポリエチレングリコール)－２０００]－Ｎ,Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド／２－[２－(ω－メトキシ(ポリエチレングリコール２０００)エトキシ]－Ｎ,Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドである。
ある実施態様において、ペグ化脂質は、例えば、次の構造を有するＤＭＧ－ＰＥＧ ２０００である。
ある実施態様において、ペグ化脂質は、次の構造
を有し、ここで、ｎは３０～６０の範囲、例えば約５０の平均値を有する。
ある実施態様において、ペグ化脂質は、好ましくは３－Ｎ－[(ω－メトキシポリ(エチレングリコール)２０００)カルバモイル]－１,２－ジミリスチルオキシ－プロピルアミン(ＭＰＥＧ－(２kDa)－Ｃ－ＤＭＡ)またはメトキシ－ポリエチレングリコール－２,３－ビス(テトラデシルオキシ)プロピルカルバメート(２０００)と称するＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡである。ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡは、肝臓へのＲＮＡの送達を最適化するために選択され得る。ＰＥＧ脂質アンカーのアルキル鎖長の調節により、封入核酸の薬理学が予測可能な方法で制御できることが判明している。バイアルで、すなわち、投与前、粒子は、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡとの完全相補性を維持する。血液区画で、すなわち、投与後、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡは経時的にＲＮＡ粒子から解離し、より容易に細胞により取り込まれる融合性粒子が増えることを明らかにし、最終的にＲＮＡペイロードの放出に至る。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物は、ここに記載する目的で、各々引用により全体として本明細書に包含させるＷＯ２０１７／０７５５３１およびＷＯ２０１８／０８１４８０に記載の１以上のＰＥＧコンジュゲート脂質またはペグ化脂質を含み得る。
ある実施態様において、ペグ化脂質は、ここに記載するＲＮＡ組成物に存在する総脂質の約１mol％～約１０mol％、好ましくは約１mol％～約５mol％、より好ましくは約１mol％～約２.５mol％を構成する。
(ｉ)ＲＮＡ、(ii)、式(Ｉ)のカチオン的にイオン化可能な脂質および(iii)ペグ化脂質の少なくとも一部が粒子(例えば、ＬＮＰ)を形成するある実施態様において、ペグ化脂質は、粒子に存在する総脂質の約１mol％～約１０mol％、好ましくは約１mol％～約５mol％、より好ましくは約１mol％～約２.５mol％を構成し得る。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物はここに開示するカチオン的にイオン化可能な脂質、ペグ化脂質、リン脂質およびコレステロールを含み、ここで、カチオン的にイオン化可能な脂質は組成物に存在する総脂質の４０～５０molパーセントを構成し、ペグ化脂質は組成物に存在する総脂質の１～５molパーセントを構成し、リン脂質は組成物に存在する総脂質の５～１５molパーセントを構成し、コレステロールは組成物に存在する総脂質の３０～５０molパーセントを構成する。ある実施態様において、リン脂質はＤＯＰＥである。ある実施態様において、リン脂質はＤＳＰＣである。ある実施態様において、ペグ化脂質はＤＭＧ－ＰＥＧ ２０００である。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物に含まれる緩衝物質はここに定義する３級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れもＨではないＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物に含まれる緩衝物質はここに定義する環状アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２個は窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。ある実施態様において、緩衝物質はＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
ポリサルコシン(ｐＳａｒ)コンジュゲート脂質
ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート、すなわち、ポリサルコシン(ポリ(Ｎ－メチルグリシン))を含む脂質または脂質様物質である。故に、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物は、ここに開示するカチオン的にイオン化可能な脂質およびｐＳａｒコンジュゲート脂質を含む。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物はさらに中性脂質、例えば、リン脂質、コレステロールまたはその誘導体または中性脂質、例えば、リン脂質とコレステロールまたはその誘導体の組み合わせを含み得る。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物は、ここに記載するカチオン的にイオン化可能な脂質、ｐＳａｒコンジュゲート脂質、中性脂質、例えば、リン脂質およびコレステロールまたはその誘導体を含む。ある実施態様において、リン脂質はＤＳＰＣである。ある実施態様において、リン脂質はＤＯＰＥである。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物は、ここに記載するカチオン的にイオン化可能な脂質、ｐＳａｒコンジュゲート脂質、ＤＳＰＣおよびコレステロールまたはその誘導体を含む。
ポリサルコシンは、アセチル化(中性末端基)または他の官能化末端基を含み得る。ＲＮＡ脂質粒子の場合、ポリサルコシンは、ある実施態様において、粒子に含まれる非カチオン性脂質または脂質様物質にコンジュゲート、好ましくは共有結合で結合している。
ある実施態様において、ポリサルコシンの末端基を、正または負電荷などのある性質を付与する１以上の分子部分または粒子を特定の細胞型、細胞のコレクションまたは組織に向けるターゲティング剤で官能化し得る。
多様な適当なターゲティング剤が当分野で知られる。ターゲティング剤の非限定的例は、ペプチド、タンパク質、酵素、核酸、脂肪酸、ホルモン、抗体、炭水化物、単糖、オリゴ糖または多糖、ペプチドグリカン、グリコペプチドなどを含む。例えば、標的細胞の表面の抗原の結合するいくつかの種々の物質の何れかを使用し得る。標的細胞表面抗原に対する抗体は、一般に標的に対する必要な特異性を示す。抗体に加えて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２またはｓｃＦｖフラグメントまたは単一ドメイン抗体(例えばラクダ類ＶＨＨフラグメント)などの適当な免疫反応性フラグメントも用い得る。ターゲティング機構形成における使用に適する多くの抗体フラグメントが当分野で既に利用可能である。同様に、標的細胞の表面の何れかの受容体に対するリガンドを、ターゲティング剤として適切に用い得る。所望の標的細胞表面に見られる細胞表面受容体、タンパク質または糖タンパク質に特異的に結合する天然または合成のあらゆる小分子または生体分子を含む。
ある実施態様において、ポリサルコシンは、２～２００、２～１９０、２～１８０、２～１７０、２～１６０、２～１５０、２～１４０、２～１３０、２～１２０、２～１１０、２～１００、２～９０、２～８０、２～７０、５～２００、５～１９０、５～１８０、５～１７０、５～１６０、５～１５０、５～１４０、５～１３０、５～１２０、５～１１０、５～１００、５～９０、５～８０、５～７０、１０～２００、１０～１９０、１０～１８０、１０～１７０、１０～１６０、１０～１５０、１０～１４０、１０～１３０、１０～１２０、１０～１１０、１０～１００、１０～９０、１０～８０または１０～７０サルコシン単位を含む。
ある実施態様において、ポリサルコシンは次の一般式(XVI)：
を含み、ここで、ｘはサルコシン単位数をいう。ポリサルコシンは、結合の１個を介して、粒子形成成分または疎水性成分と結合し得る。ポリサルコシンは、他の結合を介して、Ｈ、親水性基、イオン化可能基またはターゲティング部分などの機能的部分へのリンカーに結合し得る。
ポリサルコシンは、脂質または脂質様物質などの任意の粒子形成成分に、コンジュゲート、特に共有結合で結合または連結され得る。ポリサルコシン脂質コンジュゲートは、ポリサルコシンがカチオン性脂質またはカチオン的にイオン化可能な脂質または付加的脂質などのここに記載する脂質とコンジュゲートしている分子である。あるいは、ポリサルコシンは、カチオン的にイオン化可能な脂質または１以上の付加的脂質と異なる脂質または脂質様物質にコンジュゲートする。
ある実施態様において、ポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートは次の一般式(XVIａ)：
を含み、ここで、Ｒ１１およびＲ１２の一方は疎水性基を含み、他方はＨ、親水性基、イオン化可能基または所望によりターゲティング部分を含む官能基である。ある実施態様において、疎水性基は、好ましくは、１０～５０個、１０～４０個または１２～２０個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖アルキル基またはアリール基を含む。ある実施態様において、疎水性基を含むＲ１１またはＲ１２は、１以上の直鎖または分枝鎖アルキル基に結合したヘテロ原子、特にＮなどの部分を含む。
ある実施態様において、ポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートは次の一般式(XVIｂ)：
を含み、ここで、ＲはＨ、親水性基、イオン化可能基または所望によりターゲティング部分を含む官能基である。
一般式(XVIａ)および(XVIｂ)の記号「ｘ」はサルコシン単位数をいい、ここに定義する数であり得る。
ある実施態様において、ポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートはポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである。
典型的に、ポリサルコシン部分は、２～２００、５～２００、５～１９０、５～１８０、５～１７０、５～１６０、５～１５０、５～１４０、５～１３０、５～１２０、５～１１０、５～１００、５～９０、５～８０、１０～２００、１０～１９０、１０～１８０、１０～１７０、１０～１６０、１０～１５０、１０～１４０、１０～１３０、１０～１２０、１０～１１０、１０～１００、１０～９０または１０～８０サルコシン単位を有する。
ある実施態様において、ｐＳａｒコンジュゲート脂質は次の式(VII－１)：
の構造を有し、ここで、ｎは２３である。式(VII－１)のｐＳａｒコンジュゲート脂質はまたここでは「Ｃ１４ｐＳａｒ２３」とも称する。
故に、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)は、カチオン的にイオン化可能な脂質およびポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート、例えば、上に定義するポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートを含む。
ある場合、ポリサルコシン脂質コンジュゲートは、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に存在する総脂質の約０.２mol％～約５０mol％、約０.２５mol％～約３０mol％、約０.５mol％～約２５mol％、約０.７５mol％～約２５mol％、約１mol％～約２５mol％、約１mol％～約２０mol％、約１mol％～約１５mol％、約１mol％～約１０mol％、約１mol％～約５mol％、約１.５mol％～約２５mol％、約１.５mol％～約２０mol％、約１.５mol％～約１５mol％、約１.５mol％～約１０mol％、約１.５mol％～約５mol％、約２mol％～約２５mol％、約２mol％～約２０mol％、約２mol％～約１５mol％、約２mol％～約１０mol％または約２mol％～約５mol％を構成し得る。
(ｉ)ＲＮＡ、(ii)、式(Ｉ)のカチオン的にイオン化可能な脂質および(iii)ｐＳａｒコンジュゲート脂質の少なくとも一部が粒子(例えば、ＬＮＰ)を形成するある実施態様において、ｐＳａｒコンジュゲート脂質は、粒子に存在する総脂質の約０.５mol％～約５mol％、好ましくは約１mol％～約５mol％、より好ましくは約１mol％～約４.５mol％を構成し得る。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物は、ここに記載するカチオン的にイオン化可能な脂質、ｐＳａｒコンジュゲート脂質、リン脂質およびコレステロールを含み、ここで、カチオン的にイオン化可能な脂質は組成物に存在する総脂質の４０～５０molパーセントを構成し、ｐＳａｒコンジュゲート脂質は組成物に存在する総脂質の１～４.５molパーセントを構成し、リン脂質は組成物に存在する総脂質の５～１５molパーセントを構成し、コレステロールは組成物に存在する総脂質の３０～５０molパーセントを構成する。ある実施態様において、リン脂質はＤＯＰＥである。ある実施態様において、リン脂質はＤＳＰＣである。ある実施態様において、ｐＳａｒコンジュゲート脂質はＣ１４ｐＳａｒ２３である。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物に含まれる緩衝物質はここに定義する３級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れもＨではないＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物に含まれる緩衝物質はここに定義する環状アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２個は窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。ある実施態様において、緩衝物質はＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
ＲＮＡ組成物の実施態様
ある実施態様において、１以上の付加的脂質は、好ましくは各々上に示す濃度で次の成分の１個を含む：(１)中性脂質；(２)ステロイド；(３)ポリマーコンジュゲート脂質；(４)中性脂質とステロイドの混合物；(５)中性脂質とポリマーコンジュゲート脂質の混合物；(６)ステロイドとポリマーコンジュゲート脂質の混合物；または(７)中性脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質の混合物。ある実施態様において、１以上の付加的脂質は、好ましくは各々上に示す濃度で次の成分の１個を含む：(１)リン脂質；(２)コレステロール；(３)ペグ化脂質；(４)リン脂質とコレステロールの混合物；(５)リン脂質とペグ化脂質の混合物；(６)コレステロールとペグ化脂質の混合物；または(７)リン脂質、コレステロールおよびペグ化脂質の混合物。
故に、好ましい実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)は、好ましくは各々上に示す濃度で、カチオン的にイオン化可能な脂質および次の脂質または脂質混合物を含む：(１)中性脂質；(２)ステロイド；(３)ポリマーコンジュゲート脂質；(４)中性脂質とステロイドの混合物；(５)中性脂質とポリマーコンジュゲート脂質の混合物；(６)ステロイドとポリマーコンジュゲート脂質の混合物；または(７)中性脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質の混合物。具体的実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は４０～５０molパーセントの濃度の濃度で存在し；中性脂質は５～１５molパーセントの濃度で存在し；ステロイドは３５～４５molの濃度で存在し；そしてポリマーコンジュゲート脂質は１～１０molパーセントの濃度で存在し、ここで、ＲＮＡは、ＬＮＰ内に封入されているかまたはそれと結合している。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に含まれる緩衝物質はここに定義する３級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れもＨではないＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に含まれる緩衝物質はここに定義する環状アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２個は窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。ある実施態様において、緩衝物質はＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)は、好ましくは各々上に示す濃度で、カチオン的にイオン化可能な脂質および次の脂質または脂質混合物を含む：(１)リン脂質；(２)コレステロール；(３)ペグ化脂質；(４)リン脂質とコレステロールの混合物；(５)リン脂質とペグ化脂質の混合物；(６)コレステロールとペグ化脂質の混合物；または(７)リン脂質、コレステロールおよびペグ化脂質の混合物。ある具体的実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は０～５０molパーセントの濃度で存在し；リン脂質は５～１５molパーセントの濃度で存在し；コレステロールは３５～４５molの濃度で存在し；そしてペグ化脂質は１～１０molパーセントの濃度で存在し、ここで、ＲＮＡはＬＮＰ内に封入されているかまたはそれと結合していてよい。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に含まれる緩衝物質はここに定義する３級アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の何れもＨではないＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(特にｍＲＮＡ組成物)に含まれる緩衝物質はここに定義する環状アミン(すなわち、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の２個は窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成するＮ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３))またはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。ある実施態様において、緩衝物質はＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
Ｎ／Ｐ値は好ましくは少なくとも約４である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は４～２０、４～１２、４～１０、４～８または５～７の範囲である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は約６である。
ここに記載するＬＮＰは、ある実施態様において、約３０nm～約２００nmまたは約６０nm～約１２０nmの範囲である平均直径を有し得る。
一般に、ここに記載するＲＮＡを含むＬＮＰ(または「ＲＮＡ ＬＮＰ」)は、ＲＮＡの目的の標的部位(例えば、細胞、組織、臓器など)への送達に使用できる「ＲＮＡ脂質粒子」である。ＲＮＡ脂質粒子は、典型的にカチオン的にイオン化可能な脂質(例えば構造Ｉ－３を有する脂質)および１以上の付加的脂質、例えばリン脂質(例えば、ＤＳＰＣ)、ステロイド(例えば、コレステロールまたはそのアナログ)およびポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ペグ化脂質またはポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)から形成される。
何らかの理論に拘束されることを意図しないが、カチオン的にイオン化可能な脂質および１以上の付加的脂質は、一体となってＲＮＡと組み合わさり、コロイド状に安定な粒子を形成し、ここで、核酸は脂質マトリクスに結合すると考えられる。
ある実施態様において、ＲＮＡ脂質粒子は１を超えるタイプのＲＮＡ分子を含み、ここで、ＲＮＡ分子のモル質量または分子構造、キャッピング、コード領域または他の特性などの基本的構造要素に関するなどのような、分子パラメータは、互いに類似しても異なってもよい。
ある実施態様において、ＲＮＡ脂質ＬＮＰ(例えばｍＲＮＡ脂質ＬＮＰ)は、ＲＮＡに加えて、(ｉ)粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％、約３０mol％～約５０mol％、約３５mol％～約４５mol％または約４０mol％を構成し得るカチオン的にイオン化可能な脂質、(ii)粒子に存在する総脂質の約０mol％～約９０mol％、約２０mol％～約８０mol％、約２５mol％～約７５mol％、約３０mol％～約７０mol％、約３５mol％～約６５mol％または約４０mol％～約６０mol％を構成し得る中性脂質および／またはステロイド(例えば、１以上のリン脂質および／またはコレステロール)および(iii)ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、粒子に存在する総脂質の１mol％～１０mol％、１mol％～５mol％または１mol％～２.５mol％を構成し得るペグ化脂質；または粒子に存在する総脂質の約０.２mol％～約５０mol％、約０.２５mol％～約３０mol％、約０.５mol％～約２５mol％、約０.７５mol％～約２５mol％、約１mol％～約２５mol％、約１mol％～約２０mol％、約１mol％～約１５mol％、約１mol％～約１０mol％、約１mol％～約５mol％、約１.５mol％～約２５mol％、約１.５mol％～約２０mol％、約１.５mol％～約１５mol％、約１.５mol％～約１０mol％、約１.５mol％～約５mol％、約２mol％～約２５mol％、約２mol％～約２０mol％、約２mol％～約１５mol％、約２mol％～約１０mol％または約２mol％～約５mol％を構成し得るポリサルコシン脂質コンジュゲート)を含む。
ある好ましい実施態様において、中性脂質は、粒子に存在する総脂質の約５mol％～約５０mol％、約５mol％～約４５mol％、約５mol％～約４０mol％、約５mol％～約３５mol％、約５mol％～約３０mol％、約５mol％～約２５mol％または約５mol％～約２０mol％のリン脂質を含む。
ある好ましい実施態様において、ステロイドは、粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約１０mol％～約７０mol％、約１５mol％～約６５mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％または約３０mol％～約５０mol％のコレステロールまたはその誘導体を含む。
ある好ましい実施態様において、中性脂質およびステロイドは、(ｉ)粒子に存在する総脂質の約５mol％～約５０mol％、約５mol％～約４５mol％、約５mol％～約４０mol％、約５mol％～約３５mol％、約５mol％～約３０mol％、約５mol％～約２５mol％または約５mol％～約２０mol％のＤＳＰＣなどのリン脂質；および(ii)粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約１０mol％～約７０mol％、約１５mol％～約６５mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％または約３０mol％～約５０mol％のコレステロールなどのコレステロールまたはその誘導体の混合物を含む。非限定的例として、リン脂質とコレステロールの混合物を含むｍＲＮＡ ＬＮＰは、粒子に存在する総脂質の約５mol％～約５０mol％、約５mol％～約４５mol％、約５mol％～約４０mol％、約５mol％～約３５mol％、約５mol％～約３０mol％、約５mol％～約２５mol％または約５mol％～約２０mol％のＤＳＰＣおよび粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約１０mol％～約７０mol％、約１５mol％～約６５mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％または約３０mol％～約５０mol％のコレステロールを含み得る。
ある実施態様において、ＲＮＡ脂質粒子は、ＲＮＡに加えて、(ｉ)粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％、約３０mol％～約５０mol％、約３５mol％～約４５mol％または約４０mol％を構成し得るカチオン的にイオン化可能な脂質(例えば構造Ｉ－３を有する脂質)、(ii)粒子に存在する総脂質の約５mol％～約５０mol％、約５mol％～約４５mol％、約５mol％～約４０mol％、約５mol％～約３５mol％、約５mol％～約３０mol％、約５mol％～約２５mol％または約５mol％～約２０mol％を構成し得るＤＳＰＣ、(iii)粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約１０mol％～約７０mol％、約１５mol％～約６５mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％または約３０mol％～約５０mol％を構成し得るコレステロールおよび(iv)粒子に存在する総脂質の１mol％～１０mol％、１mol％～５mol％または１mol％～２.５mol％を構成し得るペグ化脂質；または(iv’)粒子に存在する総脂質の約０.２mol％～約５０mol％、約０.２５mol％～約３０mol％、約０.５mol％～約２５mol％、約０.７５mol％～約２５mol％、約１mol％～約２５mol％、約１mol％～約２０mol％、約１mol％～約１５mol％、約１mol％～約１０mol％、約１mol％～約５mol％、約１.５mol％～約２５mol％、約１.５mol％～約２０mol％、約１.５mol％～約１５mol％、約１.５mol％～約１０mol％、約１.５mol％～約５mol％、約２mol％～約２５mol％、約２mol％～約２０mol％、約２mol％～約１５mol％、約２mol％～約１０mol％または約２mol％～約５mol％を構成し得るポリサルコシン脂質コンジュゲートを含む。
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰは、ある実施態様において、約３０nm～約１０００nm、約３０nm～約８００nm、約３０nm～約７００nm、約３０nm～約６００nm、約３０nm～約５００nm、約３０nm～約４５０nm、約３０nm～約４００nm、約３０nm～約３５０nm、約３０nm～約３００nm、約３０nm～約２５０nm、約３０nm～約２００nm、約３０nm～約１９０nm、約３０nm～約１８０nm、約３０nm～約１７０nm、約３０nm～約１６０nm、約３０nm～約１５０nm、約５０nm～約５００nm、約５０nm～約４５０nm、約５０nm～約４００nm、約５０nm～約３５０nm、約５０nm～約３００nm、約５０nm～約２５０nm、約５０nm～約２００nm、約５０nm～約１９０nm、約５０nm～約１８０nm、約５０nm～約１７０nm、約５０nm～約１６０nmまたは約５０nm～約１５０nmの範囲の平均直径を有する。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰは、約４０nm～約８００nm、約５０nm～約７００nm、約６０nm～約６００nm、約７０nm～約５００nm、約８０nm～約４００nm、約１５０nm～約８００nm、約１５０nm～約７００nm、約１５０nm～約６００nm、約２００nm～約６００nm、約２００nm～約５００nmまたは約２００nm～約４００nmの範囲の平均直径を有する。
例えば、ここに記載する方法により製造した、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰは、約０.５未満、約０.４未満、約０.３未満、約０.２未満、約０.１未満または約０.０５以下の多分散性指数を示す。例として、ＲＮＡ ＬＮＰは、約０.０５～約０.２、例えば約０.０５～約０.１の範囲の多分散性指数を示し得る。
本発明のある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰにおけるＲＮＡは、濃度約２mg／ｌ～約５ｇ／ｌ、約２mg／ｌ～約２ｇ／ｌ、約５mg／ｌ～約２ｇ／ｌ、約１０mg／ｌ～約１ｇ／ｌ、約５０mg／ｌ～約０.５ｇ／ｌまたは約１００mg／ｌ～約０.５ｇ／ｌである。具体的実施態様において、ＲＮＡは、濃度約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌ、約０.００５mg／mL～約０.０９mg／mL、約０.００５mg／mL～約０.０８mg／mL、約０.００５mg／mL～約０.０７mg／mL、約０.００５mg／mL～約０.０６mg／mLまたは約０.００５mg／mL～約０.０５mg／mLである。
ＲＮＡ粒子を含む組成物
ここに記載する組成物は、ＲＮＡ ＬＮＰ、好ましくは複数のＲＮＡ ＬＮＰを含み得る。用語「複数のＲＮＡ ＬＮＰ」または「複数のＲＮＡ脂質粒子」は、ある数の粒子の集団をいう。ある実施態様において、本用語は、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２または１０２３またはそれ以上の粒子の集団をいう。
ある実施態様において、ここに記載する組成物は、４０００／ml未満、好ましくは最大３５００／ml、例えば最大３４００／ml、最大３３００／ml、最大３２００／ml、最大３１００／mlまたは最大３０００／mlの量で少なくとも１０μmサイズの粒子を含む。
複数の粒子は、前記範囲の任意のフラクションまたはその中の任意の範囲で含まれ得ることは、当業者には明らかである。
ある実施態様において、ここに記載する組成物は液体または固体であり、固体は凍結形態をいう。
本発明者らは、ＬＮＰを含む組成物においてＰＢＳの代わりに上に特定した緩衝物質、特にＴＥＡおよびそのプロトン化形態に基づく特定の緩衝系の使用が、ＲＮＡの極めて安定な折り畳まれた形態(ここでは「光移動性種(ＬＭＳ)」と称する)の形成を阻止することを驚くべきことに発見した。
さらに、本出願は、驚くべきことに、この緩衝系の使用により、液体形態で約３カ月保存後ＲＮＡ完全性は改善したＲＮＡ組成物を得ることができることを示す。故に、請求する方法で製造された組成物は安定性が改善され、薬務における通常の技術に適合した温度範囲で保存でき、使用準備済製剤を提供する。
粒子(例えばＬＮＰ)サイズ(Ｚ平均)に関してここで使用する表現「等しい」または「本質的に等しい」は、プロセシング工程後(例えば、凍結／解凍サイクル後)の組成物に含まれる粒子のＺ平均値が、プロセシング工程前(例えば、凍結／解凍サイクル前)の粒子のＺ平均値±３０％(好ましくは、±２５％、より好ましくは±２４％、例えば±２０％、±１５％、±１０％、±５％または±１％)に対応することを意味する。例えば、凍結／解凍サイクルにまだ付されていない組成物に含まれる粒子(例えばＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)値が９０nmであり、凍結／解凍サイクルに付された組成物に含まれる粒子(例えばＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)値が１１５nmであるならば、凍結／解凍サイクル後、すなわち、凍結組成物解凍後の粒子のサイズ(Ｚ平均)は、凍結／解凍サイクル前、すなわち、組成物の凍結前の粒子のサイズ(Ｚ平均)に(本質的に)等しいと考えられる。粒子(例えばＬＮＰ)のサイズ分布またはＰＤＩに関してここで使用する表現「等しい」または「本質的に等しい」は、これに応じて解釈される。例えば、凍結／解凍サイクルにまだ付されていない組成物に含まれる粒子(例えばＬＮＰ)のＰＤＩ値が０.３０であり、凍結／解凍サイクルに付された組成物に含まれる粒子(例えばＬＮＰ)のＰＤＩ値が０.３８であるならば、凍結／解凍サイクル後、すなわち、凍結組成物解凍後の粒子のＰＤＩは、凍結／解凍サイクル前、すなわち、組成物の凍結前の粒子のＰＤＩに(本質的に)等しいと考えられる。
ここに記載する組成物はまた生成物品質の実質的な低下および、特に、保存および／または凍結中のＲＮＡ活性の実質的な低下を回避するため、例えば凝集、粒子崩壊、ＲＮＡ分解および／または他のタイプの損傷を減少または阻止するために、抗凍結剤(特に、組成物が凍結形態であるまたは少なくとも１個の凍結工程または少なくとも１サイクルの凍結／解凍に付されるならば)および／または界面活性剤を安定化剤として含み得る。
ある実施態様において、抗凍結剤は炭水化物である。ここで使用する用語「炭水化物」は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖および多糖をいい、これらを含む。
ある実施態様において、抗凍結剤は単糖である。ここで使用する用語「単糖」は、より単純な炭水化物単位に加水分解され得ない、単一炭水化物単位(例えば、単純糖)をいう。単糖抗凍結剤の例は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、リボースなどを含む。
ある実施態様において、抗凍結剤は二糖である。ここで使用する用語「二糖」は、グリコシド結合で、例えば１－４結合または１－６結合で結合される２個の単糖単位により形成された化合物または化学部分をいう。二糖は、２個の単糖に加水分解され得る。二糖抗凍結剤の例は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースなどを含む。
用語「三糖」は、一体となって結合されて１分子を形成する３個の糖をいう。三糖の例は、ラフィノースおよびメレジトースを含む。
ある実施態様において、抗凍結剤はオリゴ糖である。ここで使用する用語「オリゴ糖」は、線形、分岐または環状構造を形成するよう、グリコシド結合で、例えば１－４結合または１－６結合で、結合された３～約１５、好ましくは３～約１０単糖単位により形成される化合物または化学部分をいう。オリゴ糖抗凍結剤の例は、シクロデキストリン、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、スタキオース、アカルボースなどを含む。オリゴ糖は酸化または還元され得る。
ある実施態様において、抗凍結剤は環状オリゴ糖である。ここで使用する用語「環状オリゴ糖」は、環状構造を形成するようグリコシド結合で、例えば１－４結合または１－６結合で結合された３～約１５、好ましくは６、７、８、９または１０単糖単位により形成される化合物または化学部分をいう。環状オリゴ糖抗凍結剤の例は、αシクロデキストリン、βシクロデキストリンまたはγシクロデキストリンなどの個別の化合物である環状オリゴ糖を含む。
環状オリゴ糖抗凍結剤の他の例は、環状オリゴ糖部分を含むポリマーなどの大型分子構造にシクロデキストリン部分を含む化合物を含む。環状オリゴ糖は酸化または還元され得る、例えば、ジカルボニル形態に酸化される。ここで使用する用語「シクロデキストリン部分」は、ポリマーなどの大型分子構造に組み込まれたまたはその一部であるシクロデキストリン(例えば、α、βまたはγシクロデキストリン)ラジカルをいう。シクロデキストリン部分は、直接または任意的リンカーを介して１以上の他の部分に結合され得る。シクロデキストリン部分は酸化または還元され得る、例えば、ジカルボニル形態に酸化される。
炭水化物抗凍結剤、例えば、環状オリゴ糖抗凍結剤は誘導体化炭水化物であり得る。例えば、ある実施態様において、抗凍結剤は、誘導体化環状オリゴ糖、例えば、誘導体化シクロデキストリン、例えば、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、例えば、部分的にエーテル化されたシクロデキストリン(例えば、部分的にエーテル化されたβシクロデキストリン)である。
抗凍結剤の例は、多糖である。ここで使用する用語「多糖」は、線形、分岐または環状構造を形成するようグリコシド結合で、例えば１－４結合または１－６結合で結合された少なくとも１６単糖単位により形成される化合物または化学部分をいい、主鎖構造の一部として多糖を含むポリマーを含む。主鎖において、多糖は線形でも環状でもよい。多糖抗凍結剤の例は、グリコーゲン、アミラーゼ、セルロース、デキストラン、マルトデキストリンなどを含む。
ある実施態様において、抗凍結剤は糖アルコールである。ここで使用する用語「糖アルコール」は、少なくとも２個の炭素原子および各炭素原子に結合した１個のヒドロキシル基を含む有機化合物をいう。典型的に、糖アルコールは、糖由来であり(例えば、糖の水素化)、水可溶性固体である。ここで使用する用語「糖」は、甘味のある、可溶性炭水化物をいう。糖アルコールの例は、エチレングリコール、グリセロール、エリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトールおよびポリグリシトールを含む。ある実施態様において、糖アルコールは式ＨＯＣＨ２(ＣＨＯＨ)ｎＣＨ２ＯＨ(ここで、ｎは０～２２(例えば、０、１、２、３または４)を有する)を有するかまたは環状そのバリアント(形式上環状エーテルをもたらす糖アルコールの脱水に由来する；例えばイソソルビドは、ソルビトールの環状脱水バリアントである)である。
ある実施態様において、抗凍結剤は、最大６個の炭素原子(好ましくは少なくとも２および最大５個、４個または３個の炭素原子)を有するアルコール(特に脂肪族アルコール)などの低級アルコールである。好ましい実施態様において、低級アルコールは水と完全に混和性である。ある実施態様において、抗凍結剤はエタノール、プロパノール、１,２－プロパンジオールおよび１,３－プロパンジオールからなる群から選択される。
ある実施態様において、抗凍結剤はグリセロールおよび／またはソルビトールである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)は、抗凍結剤としてスクロースを含み得る。理論に拘束されることを願わないが、スクロースは、組成物の凍結保護の促進に機能し、それにより核酸(特にＲＮＡ)粒子の凝集を阻止し、組成物の化学および物理的安定性を維持する。ある実施態様は、本発明におけるスクロースの代替抗凍結剤を意図する。代替安定化剤は、グルコース、グリセロールおよびソルビトール、好ましくはグルコースおよびグリセロールを含むが、これらに限定されない。
好ましい抗凍結剤はスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある実施態様において、抗凍結剤はスクロース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオールおよびグルコースからなる群、例えばスクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群から選択される。好ましい実施態様において、抗凍結剤はスクロースおよび／またはグリセロールを含む。より好ましい実施態様において、抗凍結剤はスクロースである。ある他の好ましい実施態様において、抗凍結剤はグリセロールである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)は、抗凍結剤を少なくとも１％ｗ／ｖ、例えば少なくとも２％ｗ／ｖ、少なくとも３％ｗ／ｖ、少なくとも４％ｗ／ｖ、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも６％ｗ／ｖ、少なくとも７％ｗ／ｖ、少なくとも８％ｗ／ｖまたは少なくとも９％ｗ／ｖの濃度で含む。ある実施態様において、組成物中の抗凍結剤の濃度は最大２５％ｗ／ｖ、例えば最大２０％ｗ／ｖ、最大１９％ｗ／ｖ、最大１８％ｗ／ｖ、最大１７％ｗ／ｖ、最大１６％ｗ／ｖ、最大１５％ｗ／ｖ、最大１４％ｗ／ｖ、最大１３％ｗ／ｖ、最大１２％ｗ／ｖまたは最大１１％ｗ／ｖである。ある実施態様において、組成物中の抗凍結剤の濃度は１％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、例えば２％ｗ／ｖ～１９％ｗ／ｖ、３％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、４％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１６％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖ、９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖまたは約１０％ｗ／ｖである。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)は、抗凍結剤(例えばスクロース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオール、グルコースまたはそれらの組み合わせ、特に、スクロースおよび／またはグリセロール)を５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、例えば６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖまたは９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖの(総)濃度または約１０％ｗ／ｖの濃度で含む。
ある実施態様において、特に組成物が凍結形態であるとき、抗凍結剤が約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在するのが好ましい。
好ましくは、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)は、抗凍結剤を、組成物の総重量に基づき、約５０×１０－３osmol／kg～約１osmol／kg(例えば約１００×１０－３osmol／kg～約９００×１０－３osmol／kg、約１２０×１０－３osmol／kg～約８００×１０－３osmol／kg、約１４０×１０－３osmol／kg～約７００×１０－３osmol／kg、約１６０×１０－３osmol／kg～約６００×１０－３osmol／kg、約１８０×１０－３osmol／kg～約５００×１０－３osmol／kgまたは約２００×１０－３osmol／kg～約４００×１０－３osmol／kg)、例えば、約５０×１０－３osmol／kg～約４００×１０－３osmol／kg(例えば約５０×１０－３osmol／kg～約３９０×１０－３osmol／kg、約６０×１０－３osmol／kg～約３８０×１０－３osmol／kg、約７０×１０－３osmol／kg～約３７０×１０－３osmol／kg、約８０×１０－３osmol／kg～約３６０×１０－３osmol／kg、約９０×１０－３osmol／kg～約３５０×１０－３osmol／kg、約１００×１０－３osmol／kg～約３４０×１０－３osmol／kg、約１２０×１０－３osmol／kg～約３３０×１０－３osmol／kg、約１４０×１０－３osmol／kg～約３２０×１０－３osmol／kg、約１６０×１０－３osmol／kg～約３１０×１０－３osmol／kg、約１８０×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kgまたは約２００×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kg)の範囲の組成物の浸透圧をもたらす濃度で含む。
ある実施態様において、特に組成物が凍結形態であるとき、組成物がｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有するのが好ましい。
ある実施態様において、特に組成物が凍結形態であるとき、組成物が(ａ)抗凍結剤を含む；(ｂ)ｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有する；または(ｃ)抗凍結剤を含みかつｐＨ４.０～８.０、好ましくは５.０～７.０、より好ましくは５.５～６.５、最も好ましくは約５.５を有するのが好ましい。ある実施態様において、抗凍結剤は(ｉ)ここに開示する抗凍結剤から選択される；および／または(ii)ここに開示する濃度で存在する。例えば、抗凍結剤は、スクロース、グリセロールおよびグルコースからなる群など、スクロース、グリセロール、１,２－プロパンジオール、１,３－プロパンジオール、グルコースおよびそれらの組み合わせ、からなる群から選択され得るおよび／または約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在し得る。ある実施態様において、抗凍結剤は、所望により約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で存在するグリセロールである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)はスクロースを抗凍結剤として(例えば、約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で)および３級または環状アミン(ここに定義するの)を緩衝物質として、好ましくはここに定義する量／濃度で含む。ある実施態様において、３級アミンはＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)は、グリセロールを抗凍結剤として(例えば、約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で)および３級または環状アミン(ここに定義するの)を緩衝物質として、好ましくはここに定義する量／濃度で含む。ある実施態様において、３級アミンはＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)は、１,２－プロパンジオールを抗凍結剤として(例えば、約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で)および３級または環状アミン(ここに定義するの)を緩衝物質として、好ましくはここに定義する量／濃度で含む。ある実施態様において、３級アミンはＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)は、１,３－プロパンジオールを抗凍結剤として(例えば、約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で)および３級または環状アミン(ここに定義するの)を緩衝物質として、好ましくはここに定義する量／濃度で含む。ある実施態様において、３級アミンはＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)は、グルコースを抗凍結剤として(例えば、約１００mM～約６００mM、好ましくは約２００mM～約６００mMおよびより好ましくは約３００mM～約５００mMの濃度で)および３級または環状アミン(ここに定義するの)を緩衝物質として、好ましくはここに定義する量／濃度で含む。ある実施態様において、３級アミンはＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
ある別の実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)は抗凍結剤を実質的に含まず、例えば何ら抗凍結剤を含まず、３級または環状アミン(ここに定義するの)を緩衝物質として、好ましくはここに定義する量／濃度で含む。ある実施態様において、３級アミンはＴＥＡまたはそのプロトン化形態を含むかまたはそれである。
本発明のある実施態様は、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)におけるキレート剤の使用を意図する。キレート剤は、金属イオンと少なくとも２個の配位共有結合を形成でき、それにより安定な、水可溶性複合体を形成する化学化合物をいう。理論に拘束されることを願わないが、キレート剤は、遊離二価イオン濃度を低下させ、遊離二価イオンは、そうしなければ、本発明のＲＮＡ分解を加速し得る。適当なキレート剤の例は、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ＥＤＴＡの塩、デフェロキサミンＢ、デフェロキサミン、ジチオカルブナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム、ペンテト酸ナトリウム塩、サクシマー、トリエンチン、ニトリロ三酢酸、ｔｒａｎｓ－ジアミノシクロヘキサン四酢酸(ＤＣＴＡ)、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)およびビス(アミノエチル)グリコールエーテル－Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－四酢酸を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、キレート剤はＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの塩である。例示的実施態様において、キレート剤はＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。ある実施態様において、ＥＤＴＡは、濃度約０.０５mM～約５mM、約０.１mM～約２.５mMまたは約０.２５mM～約１mMである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)の水相は、キレート剤を含まない。例えば、ここに記載するＲＮＡ組成物(例えばＲＮＡ ＬＮＰ組成物)がキレート剤を含むならば、該キレート剤が、存在するならば、ＬＮＰにのみ存在するのが好ましい。
医薬組成物
ここに記載するＲＮＡ組成物は、治療または予防処置のための医薬組成物または医薬としてまたはその製造のために有用である。
ここに記載するＲＮＡ組成物は、任意の適当な医薬組成物の形態で投与され得る。
用語「医薬組成物」は、好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物と共に治療的有効剤を含む、組成物をいう。該医薬組成物は、対象への該医薬組成物の投与により、疾患または障害の処置、予防または重症度低減に有用である。本発明の状況において、医薬組成物は、ここに記載するＲＮＡを含む。
本発明の医薬組成物は１以上のアジュバントを含んでよくまたは１以上のアジュバントと共に投与してよい。用語「アジュバント」は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン(例えば、フロイントアジュバント)、無機化合物(例えばミョウバン)、細菌生成物(例えばボルデテラ・パータシス毒素)または免疫刺激複合体など、雑多な化合物群に関する。アジュバントの例は、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、増殖因子およびサイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインを含むが、これらに限定されない。ケモカインはＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＮＦａ、ＩＮＦ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－ａであり得る。さらに知られるアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバントまたは油、例えばMontanide(登録商標)ISA51であり得る。本発明で使用するための他の適当なアジュバントは、リポペプチド、例えばPam3Cysならびに親油性成分、例えばサポニン、トレハロース－６,６－ジベヘナート(ＴＤＢ)、モノホスホリル脂質－Ａ(ＭＰＬ)、モノミコロイルグリセロール(ＭＭＧ)またはグルコピラノシル脂質アジュバント(ＧＬＡ)を含む。
本発明の医薬組成物は凍結形態または「使用準備済形態」(すなわち、例えば、解凍、再構成または希釈などの処理を何ら行わず、対象にすぐに投与できる形態、特に液体形態)であり得る。故に、保存可能形態の医薬組成物の投与前、この保存可能形態は、使用準備済または投与可能形態へ処理または移行しなければならない。例えば、凍結医薬組成物は解凍しなければならない。使用準備済注射剤は、バイアル、アンプルまたはシリンジなどのコンテナで提供でき、ここで、コンテナは１以上の用量を含み得る。
ある実施態様において、医薬組成物は凍結形態であり、約－９０℃以上、例えば約－９０℃～約－１０℃の温度で保存され得る。例えば、ここに記載する凍結医薬組成物(例えば第三、第四、第五または第八の態様の方法により製造した凍結組成物または第一、第二、第七、第七、第十、第十一または第十二の態様の凍結組成物)は、約－９０℃～約－１０℃の範囲の温度で、例えば約－９０５℃～約－４０℃または約－４０℃～約－２５℃または約－２５℃～約－１０℃または約－２０℃の温度で保存できる。
凍結形態の医薬組成物のある実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月、好ましくは少なくとも４週間保存され得る。例えば、凍結医薬組成物は、－２０℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月保存され得る。
凍結形態の医薬組成物のある実施態様において、凍結医薬組成物解凍後のＲＮＡ完全性は、例えば、凍結組成物解凍後、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または実質的に１００％であり、それは、－２０℃で保存されている(例えば、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月、好ましくは少なくとも４週間)。凍結形態の医薬組成物のある実施態様において、凍結医薬組成物解凍後のＲＮＡ完全性は、例えば、凍結組成物解凍後、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または実質的に１００％であり、それは、－２０℃で保存されている(例えば、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月、好ましくは少なくとも４週間)。
ある実施態様において、医薬組成物の最初のＲＮＡ完全性(すなわち、製造後であるが、凍結前)は少なくとも５０％であり、凍結組成物解凍後の組成物のＲＮＡ完全性は、最初のＲＮＡ完全性の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは実質的に１００％である。
凍結形態の医薬組成物のある実施態様において、凍結医薬組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩは、凍結前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい。例えば、使用準備済医薬組成物がここに記載する凍結医薬組成物から製造されるとき、使用準備済医薬組成物に含まれるＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩは、凍結前の凍結医薬組成物に含まれる(例えば第二態様の方法の工程(Ｉ)で製造される製剤に含まれる)ＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しいのが好ましい。
ある実施態様において、１凍結／解凍サイクル後、好ましくは２凍結／解凍サイクル後、より好ましくは３凍結／解凍サイクル後、より好ましくは４凍結／解凍サイクル後、より好ましくは５以上の凍結／解凍サイクル後の医薬組成物のＲＮＡ粒子のサイズおよびＲＮＡ完全性は、最初の医薬組成物(すなわち、医薬組成物が最初に凍結される前)のＲＮＡ粒子のサイズおよびＲＮＡ完全性と実質的に同じである(すなわち、本質的に等しい)。
ある実施態様において、医薬組成物は液体形態であり、約０℃～約２０℃の範囲の温度で保存できる。例えば、ここに記載する液体医薬組成物(例えば第二、第四または第七の態様の方法により製造した液体組成物または第五、第八、第九または第十の態様の液体組成物)は、約１℃～約１５℃、例えば約２℃～約１０℃または約２℃～約８℃または約５℃の温度の範囲の温度で保存できる。
液体形態の医薬組成物のある実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月または少なくとも２４カ月、好ましくは少なくとも４週間保存できる。例えば、液体医薬組成物は、５℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月保存できる。
液体形態の医薬組成物のある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存したときの、液体組成物のＲＮＡ完全性は、所望の効果をもたらす、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存したときの、液体組成物のＲＮＡ完全性は、最初の組成物のＲＮＡ完全性、すなわち、組成物が保存される前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％であり得る。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存したときの、液体組成物のＲＮＡ完全性は、最初の組成物のＲＮＡ完全性、すなわち、組成物が保存される前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも９０％である。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも４週間(例えば、少なくとも３カ月)保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％である。ある実施態様において、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で、少なくとも４週間(例えば、少なくとも３カ月)保存後の組成物のＲＮＡ完全性は、保存前のＲＮＡ完全性と比較して、少なくとも９０％である。
ある実施態様において、医薬組成物の最初のＲＮＡ完全性(すなわち、製造後であるが、保存前)は少なくとも５０％であり、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月または少なくとも３カ月)保存後の医薬組成物のＲＮＡ完全性は、最初のＲＮＡ完全性の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％である。ある実施態様において、医薬組成物の最初のＲＮＡ完全性(すなわち、製造後であるが、保存前)は少なくとも５０％であり、好ましくは０℃以上、例えば約２℃～約８℃の温度で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月または少なくとも３カ月)保存後の医薬組成物のＲＮＡ完全性は、最初のＲＮＡ完全性の少なくとも９０％である。
液体形態の医薬組成物のある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存したとき、医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ))は、所望の効果をもたらす、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ))は、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも４カ月または少なくとも６カ月)保存したとき、は、最初の医薬組成物、すなわち、保存前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)保存後の医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)保存後の医薬組成物のＬＮＰのＰＤＩは０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)保存後の医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)保存後の医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は、保存前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と本質的に等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)保存後の医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間(例えば少なくとも４週間または少なくとも３カ月)保存後の医薬組成物のＬＮＰのＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
本発明の医薬組成物は、一般に「薬学的に有効量」でおよび「薬学的に許容される製剤」で適用される。
用語「薬学的に許容される」は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性性をいう。
用語「薬学的に有効量」は、単独でまたはさらなる用量で所望の反応または所望の効果を達成する量をいう。特定の疾患の処置の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻止をいう。これは、疾患進行の減速および、特に、疾患進行の中断または逆転を含む。疾患の処置における所望の反応は、該疾患もしくは該状態の発症の遅延または発症の予防でもあり得る。ここに記載する粒子または医薬組成物の有効量は、処置する状態、疾患重症度、年齢、生理学的状態、体格および体重を含む患者の個々のパラメータ、付随する治療(存在するならば)のタイプ、具体的投与経路および類似の因子に依存する。従って、ここに記載する粒子または医薬組成物を投与する用量は、種々のこのようなパラメータに依存し得る。患者における反応が、最初の用量で不十分であるならば、高用量(または異なる、より局在的な投与経路により達成される効率的に高用量)が使用され得る。
具体的実施態様において、本発明の医薬組成物(例えば、免疫原性組成物、すなわち、免疫応答の誘導に使用できる医薬組成物)は、コンテナ、例えば、バイアルに１回用量として製剤化できる。ある実施態様において、免疫原性組成物は、バイアルに多回用量製剤として製剤化できる。ある実施態様において、多回用量製剤は、バイアルあたり少なくとも２用量含む。ある実施態様において、多回用量製剤は、バイアルあたり計２～２０用量、例えば、バイアルあたり２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２用量含む。ある実施態様において、バイアルにおける各用量は体積が等しい。ある実施態様において、第一用量は、その後の用量と異なる体積である。
「安定な」多回用量製剤は、好ましくは許容されないレベルの微生物増殖を示さず、活性生物学的分子成分の破壊または分解が実質的にないまたはない。ここで使用する「安定な」免疫原性組成物は、対象に投与したとき所望の免疫学的応答を誘導できるままである製剤を含む。
本発明の医薬組成物は、緩衝液(特に、医薬組成物製造に用いたＲＮＡ組成物由来)、防腐剤および所望により他の治療剤を含む。ある実施態様において、本発明の医薬組成物、特に使用準備済医薬組成物は、１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物を含む。
本発明の医薬組成物における使用に適当な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールを含むが、これらに限定されない。
ここで使用する用語「添加物」は、本発明の医薬組成物に存在し得るが、活性成分ではない物質をいう。添加物の例は、担体、結合剤、希釈剤、滑沢剤、増粘剤、表面活性剤、防腐剤、安定化剤、乳化剤、緩衝液、風味剤または着色剤を含むが、これらに限定されない。
「薬学的に許容される塩」は、例えば、塩酸、酢酸、乳酸、２－(Ｎ－モルホリノ)エタンスルホン酸(ＭＥＳ)、３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)、２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)または安息香酸などの薬学的に許容される酸を使用して形成され得る、例えば、酸付加塩を含む。さらに、適当な薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウムまたはカリウム塩)；アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウムまたはマグネシウム塩)；アンモニウム(ＮＨ４ ＋)；および適当な有機リガンド(例えば、４級アンモニウムおよびアミンカチオン)と形成される塩を含み得る。薬学的に許容される塩の説明的例は、先行文献に見ることができる；例えば、S. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, pp. 1-19 (1977)参照。薬学的に許容されない塩を、薬学的に許容される塩の製造に使用する可能性があり、本発明に含まれる。
用語「希釈剤」は、希釈および／または薄化剤に関する。さらに、用語「希釈剤」は、任意の１以上の流体、液体または固体懸濁液および／または混合媒体を含む。適当な希釈剤の例は、エタノールおよび水を含む。
用語「担体」は、活性成分が医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために組み合わせされている、天然、合成、有機、無機であり得る成分をいう。ここで使用する担体は、対象への投与に適する、１以上の適合性固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適当な担体は、無菌水、リンゲル、乳酸リンゲル、無菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシ－プロピレンコポリマーを含むが、これらに限定されない。
治療用途のための薬学的に許容される担体、添加物または希釈剤は医薬分野で周知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)に記載される。
医薬担体、添加物または希釈剤は、意図する投与経路および標準薬務に関連して選択され得る。
医薬組成物の投与経路
ある実施態様において、ここに記載する医薬組成物または使用準備済医薬組成物などのここに記載する組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内、経皮、リンパ節内、筋肉内または腫瘍内投与され得る。ある実施態様において、(医薬)組成物は、局所投与または全身投与のために製剤化される。全身投与は、消化管を介する吸収を含む経腸投与または非経腸投与を含み得る。ここで使用する「非経腸投与」は、静脈内注射によるなど、消化管を介する以外の何らかの方法での投与をいう。好ましい実施態様において、(医薬)組成物、特に使用準備済医薬組成物は、全身投与のために製剤化される。他の好ましい実施態様において、全身投与は静脈内投与による。他の好ましい実施態様において、(医薬)組成物、特に使用準備済医薬組成物は、筋肉内投与用に製剤化される。
医薬組成物の使用
ここに記載するＲＮＡ組成物は、種々の疾患、特に対象へのペプチドまたはタンパク質の提供が治療または予防効果をもたらす疾患の治療または予防処置に使用され得る。例えば、ウイルス由来の抗原またはエピトープの提供は、該ウイルスにより引き起こされるウイルス疾患の処置または予防に有用であり得る。腫瘍抗原またはエピトープの提供は、癌細胞が該腫瘍抗原を発現する癌疾患の処置に有用であり得る。機能的タンパク質または酵素の提供は、例えば、リソソーム蓄積症(例えばムコ多糖症)または因子欠乏症における、タンパク質機能不全により特徴づけられる遺伝子障害の処置に有用であり得る。サイトカインまたはサイトカイン－融合体の提供は、腫瘍微小環境の調節に有用であり得る。
用語「疾患」(ここでは「障害」とも称する)は、個体の体に影響する異常状態をいう。疾患は、しばしば特異的症状および徴候を伴う医学的状態として解釈される。疾患は、感染性疾患などの外的源に端を発する因子により引き起こされ得るかまたは自己免疫性疾患など内部機能不全により引き起こされ得る。ヒトにおいて、「疾患」は、しばしばより広義に使用され、罹患個体の疼痛、機能不全、窮迫、社会問題または死亡を引き起こすまたは該個体と接触した者に類似の問題を引き起こすあらゆる状態をいう。広い意味で、傷害、能力障害、障害、症候群、感染、単離症状、逸脱行動および構造および機能の非定型バリエーションを含むことがあり、一方他の文脈および他の目的で、区別可能なカテゴリーと考えられ得る。疾患は、通常、多くの疾患への罹患およびそれを抱えて生きることは、人生の見方および人格を変え得るため、身体的だけでなく、感情的にも個体に影響する。
用語「感染性疾患」は、個体から個体または生物から生物に伝播され得て、微生物因子により引き起こされるあらゆる疾患をいう。感染症は当分野で知られ、例えば、それぞれウイルス、細菌および寄生虫により引き起こされる疾患であるウイルス疾患、細菌疾患または寄生虫疾患を含む。これに関して、感染性疾患は、例えば、性感染疾患(例えば、クラミジア、淋菌または梅毒)、ＳＡＲＳ、後天性免疫不全症候群(ＡＩＤＳ)、麻疹、水痘、サイトメガロウイルス感染、性器ヘルペス、肝炎(例えばＢ型肝炎またはＣ型肝炎)、インフルエンザ(ヒトインフルエンザ、ブタインフルエンザ、イヌインフルエンザ、ウマインフルエンザおよびトリインフルエンザなどのインフルエンザ)、ＨＰＶ感染、帯状疱疹、狂犬病、一般的な風邪、胃腸炎、風疹、ムンプス、炭疽、コレラ、ジフテリア、食中毒、ハンセン病、髄膜炎、消化性潰瘍疾患、肺炎、敗血症、敗血症性ショック、破傷風、結核、腸チフス、尿路感染、ライム病、ロッキー山紅斑熱、クラミジア、百日咳、破傷風、髄膜炎、猩紅熱、マラリア、トリパノソーマ症、シャーガス病、リーシュマニア症、トリコモナス症、二核アメーバ症、ジアルジア症、アメーバ赤痢、コクシジウム症、トキソプラズマ症、肉胞子虫症、リノスポリジウム症およびバランチジウム症を含む。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ組成物は、感染性疾患の治療または予防処置に使用され得る。
本文脈において、用語「処置」、「処置する」または「治療介入」は、疾患または障害などの状態と戦う目的での、対象の管理および介護に関する。本用語は、対象が罹患しているある状態の処置、例えば、症状または合併症軽減のための治療的有効化合物の投与、疾患、障害または状態の進行遅延、症状および合併症の軽減または緩和および／または疾患、障害または状態の治癒または排除ならびに状態の予防までの処置の全範囲を含み、ここで、予防は、疾患、状態または障害と戦う目的での個体の管理および介護であり、症状または合併症の発症を予防するための活性化合物の投与を含むと理解される。
用語「治療処置」は、個体の健康状態を改善するおよび／または余命を延長(増加)するあらゆる処置に関する。該処置は、個体における疾患の排除、個体における疾患進展の停止または減速、個体における疾患進展の阻止または減速、個体における症状の頻度または重症度の低減および／または現在または過去に疾患を有した個体における再発減少であり得る。
用語「予防処置」または「予防的処置」は、個体で疾患が発症するのを予防することを意図したあらゆる処置に関する。用語「予防処置」または「予防的処置」はここでは相互交換可能に使用する。
用語「個体」および「対象」はここでは相互交換可能に使用する。ヒトまたは他の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類)または鳥類(ニワトリ)、魚または疾患または障害(例えば、癌、感染症)に罹患し得るまたは疑われるが、疾患または障害を有するか有しない可能性があるまたはワクチン接種などの予防介入の必要があり得るまたはタンパク質補充によるなどの介入が必要であり得るあらゆる他の動物種を含む、あらゆる他の非哺乳動物をいう。多くの実施態様において、個体はヒトである。特に断らない限り、用語「個体」および「対象」は特定の年齢を意味せず、故に成人、高齢者、小児および新生児を含む。本発明の実施態様において、「個体」または「対象」は「患者」である。
用語「患者」は、処置のための個体または対象、特に罹患個体または対象を意味する。
本発明のある実施態様において、目的はワクチン接種による感染性疾患に対する保護の提供である。
本発明のある実施態様において、目的は対象、特にそれを必要とする対象への分泌型治療タンパク質、例えば抗体、二特異的抗体、サイトカイン、サイトカイン融合タンパク質、酵素の提供である。
本発明のある実施態様において、目的は対象、特にそれを必要とする対象へのタンパク質補充治療、例えば、エリスロポエチン、第VII因子、フォン・ヴィレブランド因子、β－ガラクトシダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの産生の提供である。
本発明のある実施態様において、目的は血液における免疫細胞の調節／再プログラムである。
本発明(特に阻害性ＲＮＡに関するもの)のある実施態様において、目的はペプチドまたはポリペプチドの発現(例えば標的ｍＲＮＡの転写および／または翻訳)の減少または阻害である。ある実施態様において、標的ｍＲＮＡは、発現(特に、例えば、健常対象における発現と比較して増加した発現)は疾患と関連する薬学的活性ペプチドまたはポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。ある実施態様において、標的ｍＲＮＡは、発現(特に、例えば、健常対象における発現と比較して増加した発現)は癌と関連する薬学的活性ペプチドまたはポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡを含むここに記載するＲＮＡ組成物(以下単に「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物」とする)は、対象への投与後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどの種々のＳタンパク質バリアントの一団を標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を対象で誘導する。ある実施態様において、種々のＳタンパク質バリアントの一団は、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個またはそれ以上のＳタンパク質バリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、ＲＢＤドメイン内にアミノ酸修飾を有するバリアントおよび／またはＲＢＤドメイン外にアミノ酸修飾を有するバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における３２１位(Ｑ)に対応するアミノ酸がＳである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における３２１位(Ｑ)に対応するアミノ酸がＬである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における３４１位(Ｖ)に対応するアミノ酸がＩである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における３４８位(Ａ)に対応するアミノ酸がＴである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における３５４位(Ｎ)に対応するアミノ酸がＤである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における３５９位(Ｓ)に対応するアミノ酸がＮである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における３６７位(Ｖ)に対応するアミノ酸がＦである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における３７８位(Ｋ)に対応するアミノ酸がＳである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における３７８位(Ｋ)に対応するアミノ酸がＲである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における４０８位(Ｒ)に対応するアミノ酸がＩである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における４０９位(Ｑ)に対応するアミノ酸がＥである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における４３５位(Ａ)に対応するアミノ酸がＳである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における４３９位(Ｎ)に対応するアミノ酸がＫである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における４５８位(Ｋ)に対応するアミノ酸がＲである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における４７２位(Ｉ)に対応するアミノ酸がＶである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における４７６位(Ｇ)に対応するアミノ酸がＳである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における４７７位(Ｓ)に対応するアミノ酸がＮである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における４８３位(Ｖ)に対応するアミノ酸がＡである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における５０８位(Ｙ)に対応するアミノ酸がＨである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における５１９位(Ｈ)に対応するアミノ酸がＰである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。ある実施態様において、このようなＳタンパク質バリアントは、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸がＧである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質または天然に存在するそのバリアントを含む。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、Ｓタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応する位置に変異を含む天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象で引き起こす。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。
配列番号１における、５０１位(Ｎ)に対応する位置に変異を含む該Ｓタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)および２４４(Ｌ)。ある実施態様において、配列番号１における６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、ＶＯＣ－２０２０１２／０１を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、５０１.Ｖ２を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ→Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１の位置６９(Ｈ)および７０(Ｖ)に対応する位置に欠失を含むＳタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、配列番号１の位置６９(Ｈ)および７０(Ｖ)に対応する位置に欠失を含むＳタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)および１２２９(Ｍ)。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１における１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、ＶＯＣ－２０２０１２／０１を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、「クラスター５」を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：欠失６９～７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉおよび所望によりＳ１１４７Ｌ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。ある実施態様において、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。
ある実施態様において、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)および１２２９(Ｍ)。ある実施態様において、配列番号１における６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１における１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、ＶＯＣ－２０２０１２／０１を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における位置５０１(Ｎ)および６１４(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸は５０１位(Ｎ)であり、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。
ある実施態様において、配列番号１における位置５０１(Ｎ)および６１４(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)および１２２９(Ｍ)。ある実施態様において、配列番号１における６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１における１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、ＶＯＣ－２０２０１２／０１を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：欠失６９～７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４ＧおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。ある実施態様において、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。
ある実施態様において、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、４１７(Ｋ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)。ある実施態様において、配列番号１における６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１における１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。ある実施態様において、配列番号１における６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、５０１.Ｖ２を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ→Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、「Ｂ.１.１.２８」を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、「Ｂ.１.１.２４８」を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における位置５０１(Ｎ)および４８４(Ｅ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸は５０１位(Ｎ)であり、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。
ある実施態様において、配列番号１における位置５０１(Ｎ)および４８４(Ｅ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、４１７(Ｋ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)。ある実施態様において、配列番号１における６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１における１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。ある実施態様において、配列番号１における６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、５０１.Ｖ２を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ→Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、「Ｂ.１.１.２４８」を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における位置５０１(Ｎ)、４８４(Ｅ)および６１４(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸は５０１位(Ｎ)であり、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸は４８４位(Ｅ)であり、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。
ある実施態様において、配列番号１における位置５０１(Ｎ)、４８４(Ｅ)および６１４(Ｄ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、４１７(Ｋ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)。ある実施態様において、配列番号１における６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１における１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。ある実施態様において、配列番号１における６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２～２４４。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１の位置２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)および２４４(Ｌ)ｉｎに対応する位置に欠失を含むＳタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、配列番号１の位置２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)および２４４(Ｌ)に対応する位置に欠失を含むＳタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、４１７(Ｋ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、４１７(Ｋ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)。ある実施態様において、配列番号１における６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１における１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。ある実施態様において、配列番号１における６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、５０１.Ｖ２を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１Ｖおよび欠失２４２～２４４および所望により：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６ＩおよびＫ４１７Ｎ。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ→Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸はＴである。
ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５０１(Ｎ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、４８４(Ｅ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)。ある実施態様において、配列番号１における６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸はＫである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１における１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、５０１.Ｖ２を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望により：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２～２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ→Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、「Ｂ.１.１.２４８」を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における位置４１７(Ｋ)および４８４(Ｅ)および／または５０１(Ｎ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸は４１７位(Ｋ)であり、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸は４８４位(Ｅ)であるおよび／または配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における４１７位(Ｋ)に対応するアミノ酸は４１７位(Ｋ)であり、配列番号１における４８４位(Ｅ)に対応するアミノ酸は４８４位(Ｅ)であるおよび／または配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。
ある実施態様において、配列番号１における位置４１７(Ｋ)および４８４(Ｅ)および／または５０１(Ｎ)に対応する位置に変異を含むＳタンパク質バリアントは、さらに１以上の変異を含み得る。このような１以上のさらなる変異は、配列番号１における次の位置に対応する変異から選択され得る：６９(Ｈ)、７０(Ｖ)、１４４(Ｙ)、５７０(Ａ)、６１４(Ｄ)、６８１(Ｐ)、７１６(Ｔ)、９８２(Ｓ)、１１１８(Ｄ)、８０(Ｄ)、２１５(Ｄ)、７０１(Ａ)、１８(Ｌ)、２４６(Ｒ)、２４２(Ｌ)、２４３(Ａ)、２４４(Ｌ)、４５３(Ｙ)、６９２(Ｉ)、１１４７(Ｓ)、１２２９(Ｍ)、２０(Ｔ)、２６(Ｐ)、１３８(Ｄ)、１９０(Ｒ)、６５５(Ｈ)、１０２７(Ｔ)および１１７６(Ｖ)。ある実施態様において、配列番号１における６９位(Ｈ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における７０位(Ｖ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における１４４位(Ｙ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における５７０位(Ａ)に対応するアミノ酸はＤである。ある実施態様において、配列番号１における６１４位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における６８１位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における７１６位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における９８２位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における１１１８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＨである。ある実施態様において、配列番号１における８０位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＡである。ある実施態様において、配列番号１における２１５位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＧである。ある実施態様において、配列番号１における７０１位(Ａ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１８位(Ｌ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における２４６位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における２４２位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４３位(Ａ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における２４４位(Ｌ)に対応するアミノ酸は欠失している。ある実施態様において、配列番号１における４５３位(Ｙ)に対応するアミノ酸はＦである。ある実施態様において、配列番号１における６９２位(Ｉ)に対応するアミノ酸はＶである。ある実施態様において、配列番号１における１１４７位(Ｓ)に対応するアミノ酸はＬである。ある実施態様において、配列番号１における１２２９位(Ｍ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における２０位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＮである。ある実施態様において、配列番号１における２６位(Ｐ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における１３８位(Ｄ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１９０位(Ｒ)に対応するアミノ酸はＳである。ある実施態様において、配列番号１における６５５位(Ｈ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、配列番号１における１０２７位(Ｔ)に対応するアミノ酸はＩである。ある実施態様において、配列番号１における１１７６位(Ｖ)に対応するアミノ酸はＦである。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、５０１.Ｖ２を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望により：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２～２４４。該Ｓタンパク質バリアントは、配列番号１の６１４位に対応する位置にＤ→Ｇ変異も含み得る。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、「Ｂ.１.１.２４８」を標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、配列番号１における次の位置に対応する位置に次の変異を有するＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、オミクロン(Ｂ.１.１.５２９)バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個または少なくとも３７個を含むＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：配列番号１と比較してＴ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７１Ｌ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ３３９Ｄ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ８５６Ｋ、Ｎ７６４Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｄ７９６Ｙ、Ｑ９５４Ｈ、Ｔ９５Ｉ、Ａ６７Ｖ、Ｌ９８１Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｇ４９６Ｓ、Ｔ４７８Ｋ、Ｑ４９８Ｒ、Ｑ４９３Ｒ、Ｅ４８４Ａ、Ｎ５０１Ｙ、Ｓ３７５Ｆ、Ｙ５０５Ｈ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ１４２Ｄ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｌ１４１ｄｅｌ、Ｙ１４４Ｆ、Ｙ１４５Ｄ、Ｇ１４２ｄｅｌ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個または全てを含むＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：配列番号１と比較してＴ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７１Ｌ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ３３９Ｄ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ８５６Ｋ、Ｎ７６４Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｄ７９６Ｙ、Ｑ９５４Ｈ、Ｔ９５Ｉ、Ａ６７Ｖ、Ｌ９８１Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｇ４９６Ｓ、Ｔ４７８Ｋ、Ｑ４９８Ｒ、Ｑ４９３Ｒ、Ｅ４８４Ａ。該Ｓタンパク質バリアントは、次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＮ５０１Ｙ、Ｓ３７５Ｆ、Ｙ５０５Ｈ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌおよび／または次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＮ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ１４２Ｄ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ。ある実施態様において、該Ｓタンパク質バリアントは、次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＬ１４１ｄｅｌ、Ｙ１４４Ｆ、Ｙ１４５Ｄ、Ｇ１４２ｄｅｌ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個または少なくとも３３個を含むＳタンパク質バリアントを標的とする、抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：配列番号１と比較して
Ａ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対照への投与後、次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対照への投与後、次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする抗体応答、特に中和抗体応答を対象において誘導する：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、オミクロン(Ｂ.１.１.５２９)バリアントを標的とする免疫応答(細胞および／または抗体応答、特に中和抗体応答)を対象において誘導する。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個または少なくとも３７個を含むＳタンパク質バリアントを標的とする免疫応答(細胞および／または抗体応答、特に中和抗体応答)を対象において誘導する：配列番号１と比較してＴ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７１Ｌ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ３３９Ｄ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ８５６Ｋ、Ｎ７６４Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｄ７９６Ｙ、Ｑ９５４Ｈ、Ｔ９５Ｉ、Ａ６７Ｖ、Ｌ９８１Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｇ４９６Ｓ、Ｔ４７８Ｋ、Ｑ４９８Ｒ、Ｑ４９３Ｒ、Ｅ４８４Ａ、Ｎ５０１Ｙ、Ｓ３７５Ｆ、Ｙ５０５Ｈ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ１４２Ｄ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｌ１４１ｄｅｌ、Ｙ１４４Ｆ、Ｙ１４５Ｄ、Ｇ１４２ｄｅｌ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個または全てを含むＳタンパク質バリアントを標的とする免疫応答(細胞および／または抗体応答、特に中和抗体応答)を対象において誘導する：配列番号１と比較してＴ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７１Ｌ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ３３９Ｄ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ８５６Ｋ、Ｎ７６４Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｄ７９６Ｙ、Ｑ９５４Ｈ、Ｔ９５Ｉ、Ａ６７Ｖ、Ｌ９８１Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｇ４９６Ｓ、Ｔ４７８Ｋ、Ｑ４９８Ｒ、Ｑ４９３Ｒ、Ｅ４８４Ａ。該Ｓタンパク質バリアントは、次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＮ５０１Ｙ、Ｓ３７５Ｆ、Ｙ５０５Ｈ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌおよび／または次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＮ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ１４２Ｄ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ。ある実施態様において、該Ｓタンパク質バリアントは、次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＬ１４１ｄｅｌ、Ｙ１４４Ｆ、Ｙ１４５Ｄ、Ｇ１４２ｄｅｌ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対象への投与後、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個または少なくとも３３個を含むＳタンパク質バリアントを標的とする免疫応答(細胞および／または抗体応答、特に中和抗体応答)を対象において誘導する：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対照への投与後、次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする免疫応答(細胞および／または抗体応答、特に中和抗体応答)を対象において誘導する：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。
ある実施態様において、ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＮＡ組成物は、対照への投与後、次の変異を含むＳタンパク質バリアントを標的とする免疫応答(細胞および／または抗体応答、特に中和抗体応答)を対象において誘導する：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。
ここで使用する用語「位置・・・に対応するアミノ酸」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、特に配列番号１に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置番号に対応するアミノ酸位置番号をいう。用語「配列番号１と比較して」は、「配列番号１における次の位置に対応する位置」と等しい。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアントなどの他のコロナウイルスＳタンパク質バリアントにおける対応するアミノ酸位置は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、特に配列番号１に示すアミノ酸配列とのアラインメントにより見つけ得る。配列または配列のセグメントをどのようにアラインし、それにより配列における本発明のアミノ酸位置と対応する位置を決定するかは、当分野で周知であると考える。典型的にデフォルト設定での、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷなどの標準配列アラインメントプログラムが使用され得る。
ある実施態様において、抗体応答が標的とする種々のＳタンパク質バリアントの一団は、上記Ｑ３２１Ｓ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｓ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９ＰおよびＤ６１４Ｇバリアントからなる群から選択される、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個またはそれ以上のＳタンパク質バリアントを含む。ある実施態様において、抗体応答が標的とする種々のＳタンパク質バリアントの一団は、上記Ｑ３２１Ｓ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｓ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９ＰおよびＤ６１４Ｇバリアントからなる群からの全Ｓタンパク質バリアントを含む。
ある実施態様において、抗体応答が標的とする種々のＳタンパク質バリアントの一団は、上記Ｑ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９ＰおよびＤ６１４Ｇバリアントからなる群から選択される、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個またはそれ以上のＳタンパク質バリアントを含む。ある実施態様において、抗体応答が標的とする種々のＳタンパク質バリアントの一団は、上記Ｑ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９ＰおよびＤ６１４Ｇバリアントからなる群からの全Ｓタンパク質バリアントを含む。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質バリアント、特に天然に存在するＳタンパク質バリアントなどのＳタンパク質バリアントについてここに記載した変異の１以上を含む。ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応する位置に変異を含む。ある実施態様において、配列番号１における５０１位(Ｎ)に対応するアミノ酸はＹである。ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、ＶＯＣ－２０２０１２／０１、５０１.Ｖ２、クラスター５およびＢ.１.１.２４８からなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の全変異などの、１以上の変異を含むある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１の８０位のアラニン置換、２１５位のグリシン置換、４８４位のリシン置換、５０１位のチロシン置換、７０１位のバリン置換、１８位のフェニルアラニン置換、２４６位のイソロイシン置換、４１７位のアスパラギン置換、６１４位のグリシン置換、２４２～２４４位の欠失および９８６位および９８７位のプロリン置換を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個、少なくとも３３個、少なくとも３４個、少なくとも３５個、少なくとも３６個または少なくとも３７個を含む：配列番号１と比較してＴ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７１Ｌ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ３３９Ｄ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ８５６Ｋ、Ｎ７６４Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｄ７９６Ｙ、Ｑ９５４Ｈ、Ｔ９５Ｉ、Ａ６７Ｖ、Ｌ９８１Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｇ４９６Ｓ、Ｔ４７８Ｋ、Ｑ４９８Ｒ、Ｑ４９３Ｒ、Ｅ４８４Ａ、Ｎ５０１Ｙ、Ｓ３７５Ｆ、Ｙ５０５Ｈ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌ、Ｎ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ１４２Ｄ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ、Ｌ１４１ｄｅｌ、Ｙ１４４Ｆ、Ｙ１４５Ｄ、Ｇ１４２ｄｅｌ。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個または全てを含む：配列番号１と比較してＴ５４７Ｋ、Ｈ６５５Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７１Ｌ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ３３９Ｄ、Ｇ４４６Ｓ、Ｎ８５６Ｋ、Ｎ７６４Ｋ、Ｋ４１７Ｎ、Ｄ７９６Ｙ、Ｑ９５４Ｈ、Ｔ９５Ｉ、Ａ６７Ｖ、Ｌ９８１Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｇ４９６Ｓ、Ｔ４７８Ｋ、Ｑ４９８Ｒ、Ｑ４９３Ｒ、Ｅ４８４Ａ。該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、バリアントまたはフラグメントは、次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＮ５０１Ｙ、Ｓ３７５Ｆ、Ｙ５０５Ｈ、Ｖ１４３ｄｅｌ、Ｈ６９ｄｅｌ、Ｖ７０ｄｅｌおよび／または次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＮ２１１ｄｅｌ、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ１４２Ｄ、Ｙ１４４ｄｅｌ、Ｙ１４５ｄｅｌ。ある実施態様において、該ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、バリアントまたはフラグメントは、次の変異の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または全てを含み得る：配列番号１と比較してＬ１４１ｄｅｌ、Ｙ１４４Ｆ、Ｙ１４５Ｄ、Ｇ１４２ｄｅｌ。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、次の変異の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３１個、少なくとも３２個または少なくとも３３個を含む：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、次の変異を含む：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。
ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、次の変異を含む：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９ＫおよびＬ９８１Ｆ。
ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号１と比較してＫ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐを含む。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、次の変異を含む：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ。
ある実施態様において、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、次の変異を含む：配列番号１と比較してＡ６７Ｖ、Δ６９～７０、Ｔ９５Ｉ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４３～１４５、Δ２１１、Ｌ２１２Ｉ、ｉｎｓ２１４ＥＰＥ、Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、Ｔ５４７Ｋ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｎ６７９Ｋ、Ｐ６８１Ｈ、Ｎ７６４Ｋ、Ｄ７９６Ｙ、Ｎ８５６Ｋ、Ｑ９５４Ｈ、Ｎ９６９Ｋ、Ｌ９８１Ｆ、Ｋ９８６ＰおよびＶ９８７Ｐ。
ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号４２のアミノ酸配列、配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号４２のアミノ酸配列もしくは配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号４２のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号４５のアミノ酸配列、配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号４５のアミノ酸配列もしくは配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも９９.５％、９９％、９８.５％、９８％、９８.５％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、該変異を含む、例えば、ここに記載するＲＮＡによりコードされる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。
免疫療法およびワクチン接種の原理は、疾患に対する免疫保護的反応が、処置する疾患と免疫学的に関連する抗原またはエピトープで免疫化した対象により産生されるとの事実に基づくことを当業者は知っている。従って、ここに記載する医薬組成物は、免疫応答の誘導または増強に適用可能である。故に、ここに記載する医薬組成物は、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防および／または治療処置に有用である。
用語「免疫化」または「ワクチン接種」は、例えば、治療または予防上の理由のため、免疫応答の誘導の目的で個体に抗原を投与する過程をいう。
ここでの文献および研究論文の引用は、これらの何れかが適切な先行文献であることを認めることを意図しない。これらの文献の内容についての記載は、出願人が入手可能な情報に基づき、これらの文献の内容の正確性について何ら承認するものではない。
記載(次の実施例を含む)は、当業者が種々の実施態様を製造および使用することを可能とするものである。具体的デバイス、技術および適用の記載は、単なる例として提供する。ここに記載する実施例への種々の修飾が当業者には容易に明らかであり、ここに定義する一般的原理を、種々の実施態様の精神および範囲から逸脱することなく他の例および適用に適用し得る。故に、種々の実施態様は、ここに記載し、示す例に限定する意図はなく、特許請求の範囲に一致すべきである。
方法
ＲＮＡ ＬＮＰの製造
製造プロトコールを、脂質Ｘ－３をカチオン的にイオン化可能な脂質の例として採用して、ここに記載する。同じプロトコールが、他のカチオン的にイオン化可能な脂質にも同様に適用される。従って、またカチオン的にイオン化可能な脂質とＲＮＡの比(Ｎ／Ｐ比)が、負電荷過剰のものを含み、例えば、高いまたは低いＮ／Ｐ比を有する他の製剤を、記載のとおり、製造し、安定化できる。さらに、他の脂質比(リン脂質、コレステロール、ポリマーコンジュゲート脂質)ならびに他のタイプのポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ポリサルコシン脂質)を使用できる。プロトコールは、何らポリマーコンジュゲート脂質を有しない生成物にも適用される。
ＲＮＡ ＬＮＰを水性－エタノール混合プロトコールにより製造した。簡潔に、ＲＮＡ(例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＢＮＴ１６２ｂ２)を、水性緩衝液条件(例えば、５０mMクエン酸、ｐＨ４.０)で、それぞれ４７.５：１０：４０.７：１.８モル比で脂質Ｘ－３、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび２－[(ポリエチレングリコール)－２０００]－Ｎ,Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドを含むエタノール性脂質混合物と、３部のＲＮＡおよび１部の脂質混合物の体積比で混合する。Ｔ混合要素を使用する標準ポンプベースの設定を使用して、混合を達成する。脂質ナノ粒子生コロイドを、２部の緩衝液(例えば、クエン酸緩衝液５０mM、ｐＨ４.０)でさらに希釈する。総流量は４００～２０００mL／分、例えば７２０ml／分である。クエン酸緩衝液(５０mM ｐＨ４.０)に対するＴＦＦ(タンジェンシャルフロー濾過)を使用してエタノール含量を減らし、ＬＮＰ生成物を濃縮した。緩衝液交換を、透析カセットを使用して実施した。２０mM 標的緩衝液ｐＨ７.４に対し４時間透析した。透析後、ＬＮＰ懸濁液のＲＮＡ濃度を決定した。１０mM 標的緩衝液ｐＨ７.４添加により、保存懸濁液を等濃度に調節した。次いで、各個々の懸濁液の４アリコートを、適切な体積の１Ｍ緩衝液ｐＨ７.４および４０％スクロースの添加により、１０mM、２０mM、５０mMまたは１００mMのその緩衝液および１０％スクロースに各個々に製剤化した。各１mLのサンプルを密封し、２０～２５℃で保存した。
ＬＮＰサイズおよび多分散性
ＲＮＡ ＬＮＰ製剤／組成物(またはそのサンプル)のＬＮＰの平均粒子径およびサイズ分布を動的光散乱法(ＤＬＳ)により評価する。本方法は、粒子径決定に１７３°での後方散乱を使用する粒径測定器を使用する。結果を、粒子のＺ平均サイズまたは流体力学直径および多分散性指数として報告する。多分散性値を使用して、測定されたＺ平均サイズ周囲の適合対数正規分布の幅をいい、粒度測定ソフトウェア内の私有の数学的計算を使用して、作成する。サイズおよび多分散性の結果を、それぞれnmおよび多分散性指数値として報告する。サンプルを緩衝液または水で適切な濃度に希釈する。ここに記載する実験について、Wyatt DynaProプレートリーダーを、１００μLの水に希釈した２０μLのサンプルを含む透明平底９６ウェルプレートと共に使用した。流体力学直径(nm)および多分散性指数をDYNAMICS 7を使用して計算した。
ＲＮＡ完全性
ＲＮＡ完全性をキャピラリー電気泳動により決定する。ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ－１００／エタノールで処理したＲＮＡ－ＬＮＰを、キャピラリーに含まれるゲルマトリクスに適用する。ＲＮＡおよびその誘導体、分解物および不純物は、サイズにより分離される。ゲルマトリクスは、ＲＮＡ成分に特異的に結合する蛍光色素を含み、ＣＣＤ検出器により検出される、青色ＬＥＤ誘導蛍光による検出が可能となる。励起波長は４７０nmである。ＲＮＡの完全性は、主ＲＮＡピークのピーク面積と検出された総ピーク面積の比較により決定し、パーセンテージとして報告する。遅く移動する種(ＬＭＳ)は、主ピークより後で検出された全シグナルにより表し、また総ピーク面積のパーセンテージとして表す。
実施例１
ＲＮＡ ＬＮＰを上記のとおり製造し、表２に挙げる緩衝液の一つに対して透析した。

緩衝液は、表２に記載する濃度を有し、全サンプルはさらに３００mMスクロースを含んだ。ＲＮＡ完全性を経時的に測定し、％インタクトＲＮＡ、遅く移動する種(ＬＭＳ)として現れる％ＲＮＡおよび断片化ＲＮＡの％(左から右方向)として報告する。全サンプルのＲＮＡの開始時完全性は７５％であった。
表３および４に示すデータは、表１に示す緩衝液イオンの構造要素に照らしてみたとき、次の結論を可能とする：
ＲＮＡの断片化はアミンのタイプと相関し、分解は３級または４級アミン＜２級アミン＜１級アミンンの順で減少する。
ＲＮＡの断片化は、ジアミンに比してモノアミンで低い。
遅く移動する種の産生は、緩衝液化合物中のアニオン性部分の存在に比例する。
３級モノアミンは、ＲＮＡを断片化およびＬＭＳ形成両方から保護する。
結論は図１～３によりさらに支持される。
アミンのタイプとＲＮＡ分解の相関は図１により明確に示され、ＲＮＡの分解が少ない緩衝液では３級モノアミンが明らかに多いことを示す。１級および一部２級アミンは、他方で、有意なまたは完全なＲＮＡの分解をもたらす(相関０.８６)。
同様に、ＬＭＳの形成は、図２に示すとおり、緩衝物質中のアニオン性部位の数と明らかな相関を示す。リン酸、スルホン酸またはカルボキシルなどのアニオン性部分はＬＭＳの形成を促進する(相関０.７８)。
図３は、最適濃度での各緩衝液のＲＮＡの分解を示す。性能が最良の緩衝液は、常に濃度２０～１００mMの３級モノアミンである。
実施例２
脂質ナノ粒子を、水性ｍＲＮＡ溶液とエタノール性脂質溶液の混合により製造した。その後、精製工程(０.２μmフィルター使用)および配合工程が続いた。詳細には、ｍＲＮＡを、４０mMクエン酸緩衝液ｐＨ４.０に最終濃度０.４mg／mLで準備した。脂質を無水ＥｔＯＨに、３５℃で最終濃度３０.１mg／mLで溶解し、０.２μm ＰＥＳフィルターを通した。脂質ナノ粒子を形成するために、ミキサーを使用して、ＲＴで、１体積の脂質溶液を３体積のｍＲＮＡ溶液と組み合わせた。この混合工程直後、２体積のクエン酸緩衝液ｐＨ４.０でのオンライン希釈工程を実施し、ＥｔＯＨ濃度を減らした。次いで、中間生成物をクエン酸緩衝液ｐＨ４.０(２体積交換)に対するタンジェンシャルフロー濾過を使用して透析濾過し、さらにＥｔＯＨ濃度を減らした。ダイアフィルトレーション後、生成物を６等分し、各アリコートを、表５に挙げる異なる緩衝液に対して透析した。

透析後、各アリコートを集め、シリンジフィルターを使用して０.２μm濾過し、ｍＲＮＡ含量を分析した。ｍＲＮＡ定量後、各サンプルを３２等分し、その各々を表６に挙げる試験する８種の異なる抗凍結剤の一つで、種々の濃度で覆った。

標的ｍＲＮＡ濃度は０.１mg／mLであった。次いで、全アリコートを深９６ウェルプレートに入れ、凍結解凍実験の出発物質として使用した。
これら実験の結果を図４Ａ～Ｄに示す。
図４Ａ～Ｄに見られるとおり、抗凍結剤としてスクロースまたはグリセロールを含む組成物の性能は最良であり、すなわち、５凍結／解凍サイクル後でさえ、良好なコロイド安定性を示す。

Claims (143)

  1. (ｉ)ＲＮＡ；(ii)カチオン的にイオン化可能な脂質；および(iii)式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含む緩衝系を含む水相を含む組成物であって、ここで：
    Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＨ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であるか；またはＲ１、Ｒ２およびＲ３の２個は、窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成し；
    各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚは独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６は独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され；そして
    各Ｒ５は独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択されるものである、組成物。
  2. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、請求項１の組成物。
  3. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３でありから選択され、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、請求項１または２の組成物。
  4. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキルおよびＣ１－６アルキレン－Ｒ４から選択され、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキルおよびＣ１－４アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキルおよびＣ１－３アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキルおよびＣ１－２アルキレン－Ｒ４から選択される、請求項１～３の何れかの組成物。
  5. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－２アルキルから選択される、請求項１～４の何れかの組成物。
  6. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、請求項１～５の何れかの組成物。
  7. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、請求項１～６の何れかの組成物。
  8. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される、請求項１～７の何れかの組成物。
  9. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全て同じである、請求項１～８の何れかの組成物。
  10. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全てがメチル、エチルまたは２－ヒドロキシエチルである、請求項９の組成物。
  11. Ｒ１およびＲ２が同一であり、Ｒ３がＲ１およびＲ２と異なる、請求項１～８の何れかの組成物。
  12. Ｒ１およびＲ２の各々が２－ヒドロキシエチル、エチルまたはメチルである、請求項１１の組成物。
  13. Ｒ３がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される、請求項１１または１２の組成物。
  14. Ｒ１およびＲ２が窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成する、請求項１の組成物。
  15. Ｒ３がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ３がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、請求項１４の組成物。
  16. Ｎ－ヘテロ環式環が少なくとも１個の窒素環原子および所望によりＯおよびＳから選択される１個のさらなる環ヘテロ原子を含む単環式環である、請求項１４または１５の組成物。
  17. Ｎ－ヘテロ環式環が(ｉ)１個の窒素環原子；(ii)２個の窒素環原子；(iii)１個の窒素環原子および１個の酸素環原子；(iv)１個の窒素環原子および１個の硫黄環原子；または(ｖ)３個の窒素環原子を含む単環式環である、請求項１４～１６の何れかの組成物。
  18. Ｎ－ヘテロ環式環が単環式６員Ｎ－ヘテロ環式環などの単環式５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環である、請求項１４～１７の何れかの組成物。
  19. Ｎ－ヘテロ環式環がピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、１,３,５－トリアジナニル、モルホリニルおよびチオモルホリニルから選択され、好ましくはピペリジニル、ピペラジニル、１,２－ジアジナニル、１,３－ジアジナニル、モルホリニルおよびチオモルホリニルから選択される、請求項１４～１８の何れかの組成物。
  20. Ｎ－ヘテロ環式環が１個の窒素環原子のみ含むならば、この窒素環原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外である、またはＮ－ヘテロ環式環が１個を超える窒素環原子を含むならば、１個の窒素環原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外であり、他の窒素環原子の少なくとも１個、好ましくは他の窒素環原子の各々、がＲ５で置換されている、請求項１４～１９の何れかの組成物。
  21. 各Ｒ５が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ５がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、請求項１４～２０の何れかの組成物。
  22. Ｎ－ヘテロ環式環がピペリジニルであり、環Ｎ原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外である、請求項１４～２１の何れかの組成物。
  23. Ｎ－ヘテロ環式環がピペラジニルであり、２個の環Ｎ原子の１個がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外であり、他の環Ｎ原子が所望によりＲ５で置換されており、好ましくは他の環Ｎ原子がＲ５で置換されている、請求項１４～２１の何れかの組成物。
  24. 両環Ｎ原子が置換されており、Ｒ５がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ５がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、請求項２３の組成物。
  25. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、請求項１４～２４の何れかの組成物。
  26. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、請求項１４～２５の何れかの組成物。
  27. Ｒ３およびＲ５が同じである、請求項１４～２６の何れかの組成物。
  28. Ｒ３およびＲ５の両方がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチルまたは２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルであり、好ましくはＲ３およびＲ５の両方が２－ヒドロキシエチルである、請求項２７の組成物。
  29. Ｒ３およびＲ５が互いに異なる、請求項１４～２６の何れかの組成物。
  30. Ｒ１がＨである、請求項１の組成物。
  31. Ｒ２およびＲ３の各々がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、請求項３０の組成物。
  32. Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、最大でＲ２およびＲ３の一方がＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、請求項３０または３１の組成物。
  33. Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキルおよびＣ１－６アルキレン－Ｒ４から選択され、好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキルおよびＣ１－４アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキルおよびＣ１－３アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキルおよびＣ１－２アルキレン－Ｒ４から選択される、請求項３０～３２の何れかの組成物。
  34. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、請求項３０～３３の何れかの組成物。
  35. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、請求項３０～３４の何れかの組成物。
  36. Ｒ２およびＲ３の各々が独立してメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択され、好ましくはＲ２およびＲ３の両方が２－ヒドロキシエチルまたは２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルである、請求項３０～３５の何れかの組成物。
  37. 緩衝物質がビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)およびそのプロトン化形態、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される、請求項１～３６の何れかの組成物。
  38. 緩衝物質が少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４(例えば２－ヒドロキシエチル)部分を含む、請求項１～３７の何れかの組成物。
  39. (ｉ)ＲＮＡ；および(ii)式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含む緩衝系を含む水相を含む組成物であって、ここで：
    Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は独立してＨ、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個はＨ、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であるか；またはＲ１、Ｒ２およびＲ３の２個は窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成し；
    各Ｒ４は独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－６アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚは独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６は独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され；そして
    各Ｒ５は独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択されるものである、組成物。
  40. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から独立して選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４、ＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣＨ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)２またはＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、請求項３９の組成物。
  41. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３であり、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３であり、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の最大１個がＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３である、請求項３９または４０の組成物。
  42. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－６アルキルおよびＣ１－６アルキレン－Ｒ４から選択され、好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－４アルキルおよびＣ１－４アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－３アルキルおよびＣ１－３アルキレン－Ｒ４から選択され、より好ましくはＲ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してＣ１－２アルキルおよびＣ１－２アルキレン－Ｒ４から選択される、請求項３９～４１の何れかの組成物。
  43. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－３アルキルから選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｒ６)ｚ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２－ｚから選択され、ここで、各ｚが独立して０および１から選択され；そして各Ｒ６が独立してＨおよびＣ１－２アルキルから選択される、請求項３９～４２の何れかの組成物。
  44. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、請求項３９～４３の何れかの組成物。
  45. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、請求項３９～４４の何れかの組成物。
  46. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々が独立してメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される、請求項３９～４５の何れかの組成物。
  47. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全て同じである、請求項３９～４６の何れかの組成物。
  48. Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の全てがメチル、エチルまたは２－ヒドロキシエチルである、請求項４７の組成物。
  49. Ｒ１およびＲ２が同一であり、Ｒ３がＲ１およびＲ２と異なる、請求項３９～４６の何れかの組成物。
  50. Ｒ１およびＲ２の各々が２－ヒドロキシエチル、エチルまたはメチルである、請求項４９の組成物。
  51. Ｒ３がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチル、２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルおよび１,５－ジヒドロキシ－３－(２－ヒドロキシエチル)ペンタン－３－イルから選択される、請求項４９または５０の組成物。
  52. Ｒ１およびＲ２が窒素原子と一体となって所望により１個または２個のＲ５で置換されている５員または６員Ｎ－ヘテロ環式環を形成する、請求項３９の組成物。
  53. Ｒ３がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ３がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ３がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、請求項５２の組成物。
  54. Ｎ－ヘテロ環式環が１個の窒素環原子のみ含むならば、この窒素環原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外である、またはＮ－ヘテロ環式環が１個を超える窒素環原子を含むならば、１個の窒素環原子がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外であり、他の窒素環原子の少なくとも１個、好ましくは他の窒素環原子の各々、がＲ５で置換されている、請求項５２～５３の何れかの組成物。
  55. 各Ｒ５が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ５がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、請求項５２～５４の何れかの組成物。
  56. Ｎ－ヘテロ環式環がピペリジニルであり、環Ｎ原子がＲ３で置換されており、ここで、Ｒ３がＨ以外である、請求項５２～５５の何れかの組成物。
  57. Ｎ－ヘテロ環式環がピペラジニルであり、２個の環Ｎ原子の１個がＲ３で置換されており、Ｒ３がＨ以外であり、他の環Ｎ原子が所望によりＲ５で置換されており、好ましくは他の環Ｎ原子がＲ５で置換されている、請求項５２～５５の何れかの組成物。
  58. 両環Ｎ原子が置換されており、Ｒ５がＣ１－６アルキル、Ｃ１－６アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－５アルキレン－Ｒ４)３から選択され、好ましくはＲ５がＣ１－４アルキル、Ｃ１－４アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－３アルキル、Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－３アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がＣ１－２アルキル、Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４およびＣ(Ｃ１－２アルキレン－Ｒ４)３から選択され、より好ましくはＲ５がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチル、２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルおよび２－[ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ]エチルから選択される、請求項５７の組成物。
  59. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－４アルキレン－ＯＨ)２から選択され、好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－３アルキレン－ＯＨ)２から選択され、より好ましくは各Ｒ４が独立して－ＯＨ、－Ｏ－(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)および－Ｎ(Ｃ１－２アルキレン－ＯＨ)２から選択される、請求項５２～５８の何れかの組成物。
  60. 各Ｒ４が独立して－ＯＨ、２－ヒドロキシエトキシおよびビス(２－ヒドロキシエチル)アミノから選択される、請求項５２～５９の何れかの組成物。
  61. Ｒ３およびＲ５が同じである、請求項５２～６０の何れかの組成物。
  62. Ｒ３およびＲ５の両方がメチル、エチル、２－ヒドロキシエチルまたは２－(２－ヒドロキシエトキシ)エチルであり、好ましくはＲ３およびＲ５の両方が２－ヒドロキシエチルである、請求項６１の組成物。
  63. Ｒ３およびＲ５が互いに異なる、請求項５２～６０の何れかの組成物。
  64. 緩衝物質がビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－トリス－メタンまたはＢＴＭ)およびそのプロトン化形態、トリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される、請求項３９～６３の何れかの組成物。
  65. 緩衝物質が少なくとも１個のＣ１－６アルキレン－Ｒ４(例えば２－ヒドロキシエチル)部分を含む、請求項３９～６４の何れかの組成物。
  66. 緩衝系がさらにクロライド、酢酸、グリコール酸、乳酸およびクエン酸、コハク酸、マロン酸、グルタル酸またはアジピン酸のアニオンなどのジまたはトリカルボン酸のアニオンからなる群から選択されるアニオンを含む、請求項１～６５の何れかの組成物。
  67. 組成物中の緩衝物質の濃度が約１０mM～約２００mM、好ましくは約１５mM～約１００mM、より好ましくは約２０mM～約８０mM、より好ましくは約４０mM～約６０mM、例えば約５０mMである、請求項１～６６の何れかの組成物。
  68. 組成物のｐＨが約４.０～約８.０、好ましくは約４.５～約８.０、例えば約５.０～約８.０、約５.５～約８.０、約６.０～約８.０、約６.５～約８.０、約６.８～約７.９または約７.０～約７である.８、請求項１～６７の何れかの組成物。
  69. 水が組成物の主成分であるおよび／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約０.５％(ｖ／ｖ)未満である、請求項１～６８の何れかの組成物。
  70. 組成物の浸透圧が最大約１０００×１０－３osmol／kg、好ましくは約１００×１０－３osmol／kg～約７５０×１０－３osmol／kg、例えば約１００×１０－３osmol／kg～約５００×１０－３osmol／kg、より好ましくは約３００×１０－３osmol／kgである、請求項１～６９の何れかの組成物。
  71. 組成物中のＲＮＡ濃度が約５mg／ｌ～約５００mg／ｌ、例えば約１０mg／ｌ～約４００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約３００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約２００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約１５０mg／ｌまたは約１０mg／ｌ～約１００mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、より好ましくは約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである、請求項１～７０の何れかの組成物。
  72. 組成物が抗凍結剤を含む、請求項１～７１の何れかの組成物。
  73. カチオン的にイオン化可能な脂質が生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む、請求項１～３８および６６～７２の何れかの組成物。
  74. カチオン的にイオン化可能な脂質が式(Ｘ)
    の構造を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体であり、ここで：
    Ｌ１０およびＬ２０の一方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－であり、Ｌ１０およびＬ２０の他方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－または直接結合であり；
    Ｇ１およびＧ２が各々独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－１２アルケニレンであり；
    Ｇ３がＣ１－２４アルキレン、Ｃ２－２４アルケニレン、Ｃ３－８シクロアルキレンまたはＣ３－８シクロアルケニレンであり；
    ＲａがＨまたはＣ１－１２アルキルであり；
    Ｒ３５およびＲ３６が各々独立してＣ６－２４アルキルまたはＣ６－２４アルケニルであり；
    Ｒ３７がＨ、ＯＲ５０、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４０、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４０または－ＮＲ５０Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４０であり；
    Ｒ４０がＣ１－１２アルキルであり；
    Ｒ５０がＨまたはＣ１－６アルキルであり；そして
    ｘが０、１または２である、
    請求項１～３８および６６～７３の何れかの組成物。
  75. カチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質が式(XI)：
    の構造を有し、ここで、
    Ｒ１およびＲ２の各々が独立してＲ５または－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であり、ここで、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１個が－Ｇ１－Ｌ１－Ｒ６であり；
    Ｒ３およびＲ４の各々が独立してＣ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、アリールおよびＣ３－１０シクロアルキルからなる群から選択され；
    Ｒ５およびＲ６の各々が独立して少なくとも１０個の炭素原子を有する非環状ヒドロカルビル基であり；
    Ｇ１およびＧ２の各々が独立して非置換Ｃ１－１２アルキレンまたはＣ２－１２アルケニレンであり；
    Ｌ１およびＬ２の各々が独立して－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－および－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－からなる群から選択され；
    ＲａがＨまたはＣ１－１２アルキルであり；
    ｍが０、１、２、３または４であり；そして
    ｘが０、１または２である、
    請求項１～３８および６６～７３の何れかの組成物。
  76. カチオン的にイオン化可能な脂質が組成物に存在する総脂質の約２０mol％～約８０mol％、好ましくは約２５mol％～約６５mol％、より好ましくは約３０mol％～約５０mol％、例えば約４０mol％～約５０mol％を構成する、請求項１～３８および６６～７５の何れかの組成物。
  77. さらに、好ましくはポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の付加的脂質を含み、より好ましくは組成物がカチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質(例えば、リン脂質)およびステロイドを含む、請求項１～７６の何れかの組成物。
  78. ポリマーコンジュゲート脂質がペグ化脂質を含み、ここで、ペグ化脂質が好ましくは(ｉ)ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＯＰＥ－ＰＥＧ、ＤＰＰＥ－ＰＥＧおよびＤＭＰＥ－ＰＥＧからなる群から選択される；または(ii)次の構造：
    を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体であり、ここで：
    Ｒ１２およびＲ１３が各々独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和アルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖が所望により１以上のエステル結合により中断されており；そしてｗが３０～６０の範囲の平均値を有する、請求項７７の組成物。
  79. ポリマーコンジュゲート脂質がポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートを含み、ここで、ポリサルコシン脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートが好ましくはポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、請求項７７の組成物。
  80. ポリマーコンジュゲート脂質が組成物に存在する総脂質の約０.５mol％～約５mol％、好ましくは約１mol％～約５mol％、より好ましくは約１mol％～約４.５mol％を構成する、請求項７７～７９の何れかの組成物。
  81. 中性脂質が好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルフタチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)からなる群から選択されるリン脂質である、請求項７７～８０の何れかの組成物。
  82. 中性脂質が組成物に存在する総脂質の約５mol％～約４０mol％、好ましくは約５mol％～約２０mol％、より好ましくは約５mol％～約１５mol％を構成する、請求項７７～８１の何れかの組成物。
  83. ステロイドがコレステロールなどのステロールを含む、請求項７７～８２の何れかの組成物。
  84. ステロイドが組成物に存在する総脂質の約１０mol％～約６５mol％、好ましくは約２０mol％～約６０mol％、より好ましくは約３０mol％～約５０mol％を構成する、請求項７７～８３の何れかの組成物。
  85. カチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質(例えば、リン脂質)およびステロイドを含み、ここで、カチオン的にイオン化可能な脂質が組成物に存在する総脂質の約３０mol％～約５０mol％、例えば約４０mol％～約５０mol％を構成し；ポリマーコンジュゲート脂質が組成物に存在する総脂質の約１mol％～約４.５mol％を構成し；中性脂質(例えば、リン脂質)が組成物に存在する総脂質の約５mol％～約１５mol％を構成し；そしてステロイドが組成物に存在する総脂質の約３０mol％～約５０mol％を構成する、請求項７７～８４の何れかの組成物。
  86. ＲＮＡの少なくとも一部、および、存在するならば、１以上の脂質が脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)、リポソームおよび／またはリポフレックス(ＬＰＸ)などの粒子中に存在する、請求項１～８５の何れかの組成物。
  87. 粒子が約３０nm～約５００nmのサイズを有する、請求項８６の組成物。
  88. ＲＮＡがｍＲＮＡまたは阻害性ＲＮＡである、請求項１～８７の何れかの組成物。
  89. ＲＮＡが(ｉ)ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、ここで修飾ヌクレオシドが好ましくはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される；(ii)コドン最適化されているコード配列を有する；および／または(iii)野生型コード配列と比較してＧ／Ｃ含量が増加しているコード配列を有する、請求項１～８８の何れかの組成物。
  90. ＲＮＡが次の５’キャップ；５’ ＵＴＲ；３’ ＵＴＲ；およびポリＡ配列の少なくとも１個、好ましくは全てを含む、請求項１～８９の何れかの組成物。
  91. ポリＡ配列が少なくとも１００個のＡヌクレオチドを含み、ここで、ポリＡ配列が好ましくはＡヌクレオチドの中断配列である、請求項９０の組成物。
  92. ５’キャップがキャップ１またはキャップ２構造である、請求項９０または９１の組成物。
  93. ＲＮＡが１以上のポリペプチドをコードし、ここで、好ましくは１以上のポリペプチドが対象における抗原に対する免疫応答を誘導するための薬学的活性ポリペプチドであるおよび／またはエピトープを含む、請求項１～９２の何れかの組成物。
  94. 薬学的活性ポリペプチドおよび／または抗原またはエピトープが病原体のタンパク質、タンパク質の免疫原性バリアントまたはタンパク質の免疫原性フラグメントもしくはその免疫原性バリアントに由来するかまたはそれである、請求項９３の組成物。
  95. 薬学的活性ポリペプチドおよび／または抗原またはエピトープがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク(Ｓ)タンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに由来するかまたはそれである、請求項９３または９４の組成物。
  96. 組成物が好ましくは約２℃～約１０℃の温度で液体である、請求項１～９５の何れかの組成物。
  97. 組成物の少なくとも１週間、好ましくは約２℃～約８℃の温度で保存後のＲＮＡ完全性が保存前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、請求項１～９６の何れかの組成物。
  98. 組成物の保存後のＲＮＡ粒子(特にＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ)が保存前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい、請求項８７～９７の何れかの組成物。
  99. 組成物が凍結形態である、請求項１～９５の何れかの組成物。
  100. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性が組成物凍結前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、請求項９９の組成物。
  101. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子(特にＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ)が組成物凍結前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい、請求項９９または１００の組成物。
  102. 最終水相に分散したＬＮＰを含む組成物を製造する方法であって、ここで、ＬＮＰはカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含み；最終水相は最終緩衝物質、最終式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は請求項１～３８の何れかに定義するとおりであり；
    (Ｉ)最終水相に分散した、カチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含むＬＮＰを含む製剤を製造し；そして
    (II)所望により製剤を約－１０℃以下まで凍結し、
    それにより組成物を得ることを含み、
    ここで、工程(Ｉ)は：
    (ａ)水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を製造し；
    (ｂ)カチオン的にイオン化可能な脂質および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を製造し；
    (ｃ)(ａ)の下に製造したＲＮＡ溶液と(ｂ)の下に製造したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む第一水相に分散したＬＮＰを含む第一中間製剤を製造し；そして
    (ｄ)最終緩衝系を含む最終水性緩衝液を使用して(ｃ)の下に製造した第一中間製剤を濾過し、
    それにより最終水相に分散したＬＮＰを含む製剤を製造する
    ことを含む、方法。
  103. 工程(Ｉ)が希釈および濾過から選択される１以上の工程をさらに含む、請求項１０２の方法。
  104. 工程(Ｉ)が：
    (ａ’)水性ＲＮＡ溶液を準備し；
    (ｂ’)第一緩衝系を含む第一水性緩衝液を準備し；
    (ｃ’)(ａ’)の下に準備した水性ＲＮＡ溶液と(ｂ’)の下に準備した第一水性緩衝液を混合し、それにより水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を製造し；
    (ｄ’)カチオン的にイオン化可能な脂質および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を製造し；
    (ｅ’)(ｃ’)の下に製造したＲＮＡ溶液と(ｄ’)の下に製造したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む第一水相に分散されたＬＮＰを含む第一中間製剤を製造し；
    (ｆ’)所望によりさらなる緩衝系を含むさらなる水性緩衝液を使用して、(ｅ’)の下に製造した第一中間製剤を濾過し、それによりさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散したＬＮＰを含むさらなる中間製剤を製造し、ここで、さらなる水性緩衝液が第一水性緩衝液と同一でも異なってもよく；
    (ｇ’)所望により工程(ｆ’)を１回、２回またはそれ以上繰り返し、ここで、１サイクルの工程(ｆ’)の後に得たさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散したＬＮＰを含むさらなる中間製剤を次サイクルの第一中間製剤として使用し、ここで、各サイクルにおいて、さらなる水性緩衝液が第一水性緩衝液と同一でも異なってもよく；
    (ｈ’)工程(ｆ’)がないならば工程(ｅ’)で得た第一中間製剤または工程(ｆ’)が存在し、工程(ｇ’)が存在しないならば工程(ｆ’)で得たさらなる中間製剤または工程(ｆ’)および(ｇ’)が存在するならば工程(ｇ’)後に得たさらなる中間製剤を、最終緩衝系を含む最終水性緩衝液を使用して濾過し；そして
    (ｉ’)所望により工程(ｈ’)で得た製剤を希釈溶液で希釈し；
    それにより最終水相に分散したＬＮＰを含む製剤を製造する
    ことを含む、請求項１０２または１０３の方法。
  105. 濾過がタンジェンシャルフロー濾過または透析濾過、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過である、請求項１０２～１０４の何れかの方法。
  106. (II)製剤の約－１０℃以下までの凍結を含む、請求項１０２～１０５の何れかの方法。
  107. 工程(Ｉ)で得た製剤および組成物が抗凍結剤を含む、請求項１０６の方法。
  108. 最終緩衝物質がＢＴＭおよびそのプロトン化形態、ＴＥＡおよびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される、請求項１０２～１０７の何れかの方法。
  109. 組成物における最終緩衝物質の濃度が約１０mM～約２００mM、好ましくは約１５mM～約１００mM、より好ましくは約２０mM～約８０mM、より好ましくは約４０mM～約６０mM、例えば約５０mMである、請求項１０２～１０８の何れかの方法。
  110. (ｉ)工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液が６.０未満、好ましくは最大約５.０、より好ましくは最大約４.５のｐＨを有する；または(ii)第一水性緩衝液が６.０未満、好ましくは最大約５.０、より好ましくは最大約４.５のｐＨを有する、請求項１０２～１０９の何れかの方法。
  111. (ｉ)工程(ａ)で使用する第一緩衝系が工程(ｄ)で使用する最終緩衝物質を含み、好ましくは工程(ａ)で使用する第一緩衝系の緩衝系およびｐＨが工程(ｄ)で使用する最終水性緩衝液の緩衝系およびｐＨと同一である；または(ii)第一緩衝系および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全てのさらなる緩衝系の各々が工程(ｈ’)で使用する最終緩衝物質を含み、好ましくは第一水性緩衝液および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全てのさらなる水性緩衝液の緩衝系およびｐＨが最終水性緩衝液の緩衝系およびｐＨと同一である、請求項１０２～１１０の何れかの方法。
  112. 組成物のｐＨが約４.０～約８.０、好ましくは約４.５～約８.０、例えば約５.０～約８.０、約５.５～約８.０、約６.０～約８.０、約６.５～約８.０、約６.８～約７.９または約７.０～約７である.８、請求項１０２～１１１の何れかの方法。
  113. 水が製剤の主成分であるおよび／または組成物および／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約０.５％(ｖ／ｖ)未満である、請求項１０２～１１２の何れかの方法。
  114. 組成物の浸透圧が最大約１０００×１０－３osmol／kg、好ましくは約１００×１０－３osmol／kg～約７５０×１０－３osmol／kg、例えば約１００×１０－３osmol／kg～約５００×１０－３osmol／kg、より好ましくは約３００×１０－３osmol／kgである、請求項１０２～１１３の何れかの方法。
  115. 組成物中のＲＮＡ濃度が約５mg／ｌ～約５００mg／ｌ、例えば約１０mg／ｌ～約４００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約３００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約２００mg／ｌ、約１０mg／ｌ～約１５０mg／ｌまたは約１０mg／ｌ～約１００mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、より好ましくは約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである、請求項１０２～１１４の何れかの方法。
  116. カチオン的にイオン化可能な脂質が生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む、請求項１０２～１１５の何れかの方法。
  117. 工程(ｂ)または(ｄ’)で製造したエタノール性溶液がさらに１以上の付加的脂質を含み、ＬＮＰが１以上の付加的脂質をさらに含み、ここで、１以上の付加的脂質が好ましくはポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは１以上の付加的脂質がポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質(例えば、リン脂質)およびステロイドを含む、請求項１０２～１１６の何れかの方法。
  118. カチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質およびステロイドがエタノール性溶液に２０％～６０％のカチオン的にイオン化可能な脂質、０.５％～１５％のポリマーコンジュゲート脂質、５％～２５％の中性脂質(例えば、リン脂質)および２５％～５５％のステロイドのモル比、好ましくは４５％～５５％のカチオン的にイオン化可能な脂質、１.０％～５％のポリマーコンジュゲート脂質、８％～１２％の中性脂質および３５％～４５％のステロイドのモル比で存在する、請求項１０２～１１７の何れかの方法。
  119. ＲＮＡが請求項８８および８９～９５の何れかで定義したとおりである、請求項１０２～１１８の何れかの方法。
  120. 工程(II)を含まない、請求項１０２～１０５および１０７～１１９の何れかの方法。
  121. 水性ＲＮＡ組成物を製造する方法であって、
    (Ｉ)ＲＮＡおよび水相を含む製剤を製造し、ここで、水相は緩衝物質、式Ｎ(Ｒ１)(Ｒ２)(Ｒ３)を有する緩衝物質、そのＮ－オキシドまたはそのプロトン化形態を含み、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は請求項１～３８の何れかに定義するとおりであり；そして
    (II)所望により製剤を約－１０℃以下まで凍結し、
    それにより組成物を得る
    ことを含む、方法。
  122. (II)製剤の約－１０℃以下までの凍結を含む、請求項１２１の方法。
  123. 組成物が抗凍結剤を含む、請求項１２２の方法。
  124. 工程(II)を含まない、請求項１２１の方法。
  125. 緩衝物質がＢＴＭおよびそのプロトン化形態、ＴＥＡおよびそのプロトン化形態、エチルジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、２－(ジエチルアミノ)エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、トリエチルアミンおよびそのプロトン化形態、２－[２－(ジエチルアミノ)エトキシ]エタン－１－オールおよびそのプロトン化形態、ジエタノールアミンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ’－ビス(２－ヒドロキシエチル)ピペラジンおよびそのプロトン化形態、Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－テトラキス(２－ヒドロキシエチル)エチレンジアミンおよびそのプロトン化形態およびトリメチルアミンＮ－オキシドおよびそのプロトン化形態から選択される、請求項１２１～１２４の何れかの方法。
  126. 請求項１０２～１１９、１２１、１２２および１２５の何れかの方法に従い組成物を製造し、組成物を約－９０℃～約－１０℃の範囲の温度で、例えば約－９０℃～約－４０℃または約－２５℃～約－１０℃で保存することを含む、成物を保存する方法。
  127. 組成物が抗凍結剤を含む、１２６の方法。
  128. 組成物の保存が少なくとも１カ月、例えば少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月である、請求項１２７の方法。
  129. 請求項１０２～１２８の何れかの方法に従い組成物を製造し、組成物を約０℃～約２０℃、例えば約１℃～約１５℃、約２℃～約１０℃または約２℃～約８℃の範囲の温度または約５℃の温度で保存することを含む、成物を保存する方法。
  130. 組成物の保存が少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月または少なくとも２４カ月である、請求項１２９の方法。
  131. 請求項１０２～１３０の何れかの方法により製造可能な組成物。
  132. 凍結形態である、請求項１３１の組成物。
  133. 抗凍結剤をさらに含む、請求項１３２の組成物。
  134. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性が組成物を凍結する前の組成物のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、請求項１３２または１３３の組成物。
  135. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ)が組成物凍結前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい、請求項１３２～１３４の何れかの組成物。
  136. 液体形態である、請求項１３１の組成物。
  137. 少なくとも１週間組成物保存後のＲＮＡ完全性が保存前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、請求項１３６の組成物。
  138. 組成物を少なくとも１週間保存後のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散性指数(ＰＤＩ)が保存前のＲＮＡ粒子のサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと本質的に等しい、請求項１３６または１３７の組成物。
  139. 請求項１０２～１１９、１２１、１２２、１２３および１２５～１２８の何れかに従い凍結組成物を準備し、凍結組成物を解凍して、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を製造する方法。
  140. 請求項１０２～１０５、１０７～１２１、１２４、１２５、１２９および１３０の何れかに従い液体組成物を製造し、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を製造する方法。
  141. 請求項１３９または１４０の方法により製造可能な、使用準備済医薬組成物。
  142. 治療に使用するための、請求項１～１０１、１３１～１３８および１４１の何れかの組成物。
  143. 対象における免疫応答の誘導に使用するための、請求項１～１０１、１３１～１３８および１４１の何れかの組成物。
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