CN117715655A - 用于活化和靶向免疫效应细胞的物质和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于活化免疫效应细胞并将经活化的免疫效应细胞靶向递送至靶细胞的物质和方法。在一个实施方案中，本发明涉及向对象提供经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞。在一个实施方案中，本发明涉及施用编码包含针对CAR的结合部分的肽或多肽(活化化合物)的RNA，以及施用编码包含与靶细胞结合的结合部分(初级靶向部分)和另外的针对CAR的结合部分(次级靶标)的肽或多肽(对接化合物)的RNA。

Description

用于活化和靶向免疫效应细胞的物质和方法
技术领域
本发明涉及用于活化免疫效应细胞并将所活化的免疫效应细胞靶向递送至靶细胞的物质和方法。在一个实施方案中，本发明涉及向对象提供经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(chimeric antigen recptor，CAR)的免疫效应细胞。在一个实施方案中，本发明涉及施用编码包含针对CAR的结合部分的肽或多肽(活化化合物)的RNA，以及施用编码包含与靶细胞结合的结合部分(初级靶向部分)和另一个针对CAR的结合部分(次级靶标)的肽或多肽(对接化合物(docketing compound))的RNA。在一个实施方案中，编码活化化合物的RNA由抗原呈递细胞在其细胞表面上表达。活化化合物表达之后，针对CAR的结合部分可用于免疫效应细胞的结合，其中所述结合可导致免疫效应细胞的扩增。在一个实施方案中，编码对接化合物的RNA由对象的细胞例如肝细胞表达和分泌。在对接化合物表达之后，初级靶向部分可与靶抗原(例如癌细胞上的癌抗原)结合，并随后免疫效应细胞可靶向次级靶标，从而将免疫效应细胞精确递送至靶细胞，例如癌细胞。包含在活化化合物中的针对CAR的结合部分和包含在对接化合物中的针对CAR的结合部分可以是肽标签和/或者可以是相同或不同的。
在医学治疗和诊断的许多领域中，期望选择性地将例如治疗剂(药物)或诊断(例如成像)剂的药剂递送至对象(例如患者)体内的特定部位或限制的区域。
对器官或组织的主动靶向可通过将所期望的活性部分(例如细胞毒性化合物)与靶向构建体直接或间接缀合来实现，所述靶向构建体在目的靶位点与细胞表面结合。靶向部分用于靶向的这样的物质通常是对细胞表面靶标(例如膜蛋白)具有亲和力的构建体，并包含抗体或抗体片段。
本发明涉及这样的方法，其中使用RNA编码的对接化合物例如通过与初级靶标(例如细胞表面抗原)结合来标记靶细胞。对接化合物包含次级靶标，其最终将被配备有靶向次级靶标的抗原受体的免疫效应细胞靶向。因此，根据本发明，施用编码对接化合物的RNA。RNA表达之后，对接化合物可例如通过与初级靶标结合来与靶细胞结合。免疫效应细胞通过其抗原受体与对接化合物上的次级靶标结合。此外，根据本发明，施用编码活化化合物的RNA。RNA已被表达之后，活化化合物可存在于抗原呈递细胞的细胞表面，并且可在细胞表面上呈递可被免疫效应细胞结合的部分。免疫效应细胞通过其抗原受体与结合部分结合，所述结合导致免疫效应细胞的扩增。本文中描述的概念允许使用单一类型的免疫效应细胞来靶向广泛范围的靶细胞，即，通过使用单一类型的免疫效应细胞和任选地单一类型的活化化合物与不同对接化合物组合，所述对接化合物靶向不同初级靶标并包含相同次级靶标。
发明内容
在一个方面中，本发明涉及用于治疗患有以表达靶抗原的细胞为特征的疾病、障碍或病症的对象的方法，其包括：
(i)向所述对象提供经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞；
(ii)向所述对象施用编码第一肽或多肽的第一RNA，其中所述第一肽或多肽包含针对所述CAR的结合部分；
(iii)允许所述对象中的抗原呈递细胞表达所述第一肽或多肽，使得所述针对CAR的结合部分可用于所述免疫效应细胞的结合，所述结合导致所述免疫效应细胞的扩增；
(iv)向所述对象施用编码第二肽或多肽的第二RNA，其中所述第二肽或多肽包含结合靶抗原的结合部分和所述针对CAR的结合部分；以及
(v)允许所述对象中的细胞表达所述第二肽或多肽，使得所述第二肽或多肽与表达所述靶抗原的细胞缔合，并且所述针对CAR的结合部分可用于所述免疫效应细胞的结合。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞用所述第一RNA转染。
在一些实施方案中，所述第一RNA作为颗粒制剂施用，例如被配制为脂质复合物颗粒。
在一些实施方案中，所述表达第二肽或多肽的细胞用所述第二RNA转染。
在一些实施方案中，所述第二RNA作为颗粒制剂施用，例如被配制为脂质纳米粒。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞表达所述第一肽或多肽以使所述第一肽或多肽保持与所述抗原呈递细胞缔合。
在一些实施方案中，所述第一肽或多肽是膜肽或多肽。
在一些实施方案中，所述第一肽或多肽是所述针对CAR的结合部分与膜肽或多肽的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞与缔合至表达所述靶抗原的细胞的第二肽或多肽只见的结合导致表达所述靶抗原的细胞被杀伤。
在一些实施方案中，所述表达第二肽或多肽的细胞分泌所述第二肽或多肽。
在一些实施方案中，所述表达第二肽或多肽的细胞表达所述第二肽或多肽以使其被释放到血流中。
在一些实施方案中，所述靶抗原是细胞表面抗原。
在一些实施方案中，所述第二肽或多肽是所述与靶抗原结合的结合部分与所述针对CAR的结合部分的融合肽或多肽。
在一些实施方案中，所述与靶抗原结合的结合部分包含抗体或抗体衍生物。
在一些实施方案中，所述针对CAR的结合部分包含肽标签。
在一些实施方案中，所述CAR包含抗体或抗体衍生物。
在一些实施方案中，所述抗体衍生物是抗体片段。
在一些实施方案中，所述方法包括向所述对象施用所述经遗传修饰以表达CAR的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述对象中产生所述经遗传修饰以表达CAR的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是癌症。
在一些实施方案中，表达所述靶抗原的细胞是患病细胞。
在一些实施方案中，表达所述靶抗原的细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。
在另一个方面中，本发明涉及用于治疗患有以表达靶抗原的细胞为特征的疾病、障碍或病症的对象的方法，其包括：
(i)向所述对象提供经遗传修饰以表达与肽标签结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞；
(ii)向所述对象施用编码第一肽或多肽的第一RNA，以使得所述第一肽或多肽在所述对象的抗原呈递细胞中表达，其中所述第一肽或多肽是膜蛋白，所述膜蛋白在胞外结构域中包含该CAR所结合的肽标签；以及
(iii)向所述对象施用编码第二肽或多肽的第二RNA，以使得所述第二肽或多肽在所述对象的细胞中表达并被其分泌，其中所述第二肽或多肽包含结合靶抗原的结合部分和该CAR所结合的肽标签。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞与所述第一肽或多肽的结合导致所述免疫效应细胞扩增。
在一些实施方案中，所述免疫效应细胞与结合至靶抗原的第二肽或多肽之间的结合导致表达所述靶抗原的细胞被杀伤。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞用所述第一RNA转染。
在一些实施方案中，所述第一RNA作为颗粒制剂施用，例如被配制为脂质复合物颗粒。
在一些实施方案中，所述表达第二肽或多肽的细胞用所述第二RNA转染。
在一些实施方案中，所述第二RNA作为颗粒制剂施用，例如被配制为脂质纳米粒。
在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞表达所述第一肽或多肽以使所述第一肽或多肽保持与所述抗原呈递细胞缔合。
在一些实施方案中，所述第一肽或多肽是该CAR所结合的肽标签与膜肽或多肽的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述第二肽或多肽被分泌到血流中。
在一些实施方案中，所述靶抗原是细胞表面抗原。
在一些实施方案中，所述第二肽或多肽是所述与靶抗原结合的结合部分与该CAR所结合的肽标签的融合肽或多肽。
在一些实施方案中，所述与靶抗原结合的结合部分包含抗体或抗体衍生物。
在一些实施方案中，所述CAR包含抗体或抗体衍生物。
在一些实施方案中，所述抗体衍生物是抗体片段。
在一些实施方案中，所述方法包括向所述对象施用所述经遗传修饰以表达CAR的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述对象中产生所述经遗传修饰以表达CAR的免疫效应细胞。
在一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是癌症。
在一些实施方案中，表达所述靶抗原的细胞是患病细胞。
在一些实施方案中，表达所述靶抗原的细胞是癌细胞。
在一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。
在另一个方面中，本发明涉及药盒，其包含：
(i)用于对免疫效应细胞进行遗传修饰以表达与肽标签结合的嵌合抗原受体(CAR)的核酸，或经遗传修饰以表达与肽标签结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞；
(ii)编码第一肽或多肽的第一RNA或者用于获得所述第一RNA的核酸，所述第一肽或多肽是膜蛋白，所述膜蛋白在胞外结构域中包含该CAR所结合的肽标签；并且任选地
(iii)编码第二肽或多肽的第二RNA或者用于获得所述第二RNA的核酸，所述第二肽或多肽包含与靶抗原结合的结合部分和该CAR所结合的肽标签。
用于对免疫效应细胞进行遗传修饰以表达与肽标签结合的嵌合抗原受体(CAR)的核酸、经遗传修饰以表达与肽标签结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞、第一RNA、第一肽或多肽、第二RNA和/或第二肽或多肽的实施方案在本文中描述，例如，在本发明方法的背景下描述。
在一个方面中，本发明涉及本文中所述的物质或组合物(例如，用于对免疫效应细胞进行遗传修饰的核酸、经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞、第一RNA、第二RNA和/或药盒)，其用于本文中所述方法。
附图说明
图1：模块化CAR-T细胞方法
该图包含了通用CAR-T方法的示意图，该方法基于ALFA标签/NbALFA实例上的模块化相互作用对。本文中产生了通用的和现成的可产生的CART细胞，(1)其表面上带有标签结合部分(例如NbALFA VHH)。这些CAR-T细胞向患者施用，并可通过编码与膜锚蛋白结构域(例如截短的CLDN6)融合的标签的RNA脂质复合体在体内特异性扩增(2)。由与肿瘤抗原特异性配体(例如scFv、VHH或Fab片段)融合的ALFA标签组成的第二结合部分，即所谓的靶向配体(targeting ligand，TL)，其作为脂质纳米粒配制的RNA向患者施用(3)。所述RNA在体内被翻译成双特异性蛋白质，该蛋白质被释放到血流中。在靶向配体基于其与特定肿瘤抗原的特异性结合而在肿瘤中积聚之后，其将被NbALFA-CAR T细胞结合，后者将被活化，从而导致肿瘤细胞的特异性裂解(4)。通过使用不同的靶向配体，可使用患者的相同CART细胞产物来顺序或平行处理不同的肿瘤抗原。
图2：与CAR+效应细胞结合的衔接子(adaptor)
用编码模块化CAR的mRNA转染Jurkat T细胞。表达模块化CAR的细胞武装有可溶性衔接子，并用衔接子特异性抗体染色。图中示出了表达模块化CAR的细胞表面衔接子检测的频率和强度。
图3：原代人T细胞可表达模块化CAR
原代人T细胞被活化，并随后使用mRNA改造以表达模块化CAR。将CAR分子染色，并使用流式细胞术方法检测表达。
图4：表达模块化CAR的原代人T细胞可武装有可溶性衔接子
模块化CART细胞武装有由核酸转染细胞产生的可溶性衔接子(100nM)。将衔接子用特异性抗体染色，并使用流式细胞术方法检测表达。该图示出了在表达模块化CAR的T细胞的表面的衔接子检测的频率和强度。
图5：模块化CAR-T平台介导肿瘤细胞裂解
将衔接子武装的模块化CAR T细胞与抗原阳性(Ag+)肿瘤细胞共培养。使用基于阻抗的细胞毒性方法评估CAR-T细胞应答。细胞毒性相对于用非mRNA转染的T细胞培养的肿瘤细胞归一化。
图6：由通用抗原转染到iDC中而刺激的模块化CAR介导的增殖
用编码膜锚定结合部分的mRNA转染人未成熟树突细胞。同时，用编码模块化CAR的mRNA转染T细胞，并用增殖染料染色。将模块化CAR-T细胞和表达CARVac的iDC共培养。在图6A和B中，膜锚定结合部分包含ALFA肽，而CAR包含VHH(aALFA)。图6A描述了配备有衔接子的经改造的CAR-T细胞的增殖，该细胞遇到其在iDC上的靶标时响应。类似地，关于图6A，测量了表达模块化CAR的人T细胞的增殖。此处，模块化CAR使用VHH(aALFA)SEQ ID NO:30，其与图6A中使用的VHH(aALFA)PE CAR相比，具有对iDC表面表达的其靶抗原的更高的亲和力。在图6C和D中，膜锚定结合部分包含VHH(aALFA)，而CAR包含ALFA肽。
图7：负载有CD19特异性衔接子的模块化ALFACAR-T介导针对CD19转染的iDC或原代人B细胞的增殖
人原代T细胞用编码模块化CAR的mRNA转染，并用增殖染料染色。将模块化CAR T细胞与B细胞(CD19+)或CD19 mRNA转染的iDC共培养。通过流式细胞仪评估增殖。
序列描述
下表提供了本文中引用的某些序列的列表。
具体实施方式
尽管以下详细描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些具体实施方案的目的，并且不旨在限制本公开内容的范围，本公开内容的范围将仅受所附权利要求书限制。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.编辑,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中所述进行定义。
除非另外指出，否则本公开内容的实施将采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见例如MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中，将描述本公开内容的要素。这些要素与一些具体实施方案一起列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的一些实例和实施方案不应被解释为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则所有描述要素的任何排列和组合应被认为被本说明书所公开。
术语“约”意指大约或接近，并且在一个实施方案中在本文中所列的数值或范围的情况下意指所列举或要求保护的数值或范围的±20％、±10％、±5％、或±3％。
除非本文中另外指出或者与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为涵盖一个/种和/或更多个/种。本文中数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另外指出，否则每个单独值均被并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。除非本文中另外指出或者另外与上下文明显矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本公开内容，而不对权利要求书的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指示实施本公开内容所必需的任何未要求保护的要素。
除非另有明确说明，否则在本文件中的上下文中使用术语“包含/包括”以指示除由“包含/包括”引入的列表的成员之外还可任选地存在其他成员。然而，考虑了作为本公开内容的具体实施方案，术语“包含/包括”涵盖不存在其他成员的可能性，即，出于该目的，实施方案“包含/包括”应理解为具有“由……组成”或“基本上由……组成”的含义。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本公开内容无权早于这样的公开内容。
定义
下面将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。
本文中使用的例如“减少”、“降低”、“抑制”或“减弱”等的术语涉及水平的总体减少或导致总体减少的能力，优选减少至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少75％或更多。这些术语包括完全或基本上完全的抑制，即减少至零或基本上减少至零。
例如“提高”、“增强”或“超过”等的术语优选涉及提高或增强至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少100％、至少200％、至少500％或甚至更多。
根据本公开内容，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且多至约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”或“多肽”是指大肽，特别是具有至少约150个氨基酸的肽，但是术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中通常作为同义词使用。
关于氨基酸序列(肽或蛋白质)的“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即表示在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3'端的截短的开放阅读框来获得。在N端缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5'端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别地至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
本文中的“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(wild type，WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的经修饰形式。优选地，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10或1至约5个氨基酸修饰。
本文中的“野生型”或“WT”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型氨基酸序列、肽或蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列。
出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体、异构体、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。术语“变体”特别地包括氨基酸序列片段。
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基被插入氨基酸序列中的特定位点中，尽管随机插入并合适筛选所得产物也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合体。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。在蛋白质的N端和/或C端末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于去除序列中的至少一个残基，并在其位置中插入另一个残基。优先考虑的是在同源蛋白质或肽之间非保守的氨基酸序列中的位置中的修饰和/或用具有相似特性的另一些氨基酸来替换氨基酸。优选地，肽和蛋白质变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守的氨基酸变化涉及其侧链相关联的氨基酸的家族之一的替换。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸替换包括以下组内的替换：
甘氨酸、丙氨酸；
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；
天冬氨酸、谷氨酸；
天冬酰胺、谷氨酰胺；
丝氨酸、苏氨酸；
赖氨酸、精氨酸；以及
苯丙氨酸、酪氨酸。
优选地，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性(优选同一性)程度将为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或同一性的程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则针对至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸(在一些实施方案中的连续氨基酸)给出相似性或同一性程度。在一些优选实施方案中，针对参考氨基酸序列的全长给出相似性或同一性程度。用于确定序列相似性(优选序列同一性)的比对可用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如，使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS：：needle，矩阵：Blosum62，空位开放(Gap Open)10.0，空位延伸(Gap Extend)0.5来完成。
“序列相似性”表明相同氨基酸的百分比或表示保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两种氨基酸序列之间的“序列同一性”表明序列之间相同氨基酸的百分比。两种核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同核苷酸的百分比。
术语“％同一”、“同一性”或类似术语旨在是指，特别是，待比较序列之间在最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比单纯地是统计学的，并且两种序列之间的差异可以但不一定随机分布在待比较的序列的整个长度上。两种序列的比较通常在最佳比对之后针对一个区段或“比较窗口”通过比较序列来进行，以确定相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可人工进行，或者借助于Smith and Waterman，1981，AdsApp.Math.2，482的局部同源性算法、借助于Neddleman and Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法、借助于Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 88，2444的相似性检索算法或借助于使用所述算法的计算机程序(Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)来进行。在一些实施方案中，使用可在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq)上获得的BLASTN或BLASTP算法来确定两种序列的百分比同一性。在一些实施方案中，在NCBI网站上用于BLASTN算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设为28；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)匹配/不匹配评分设置为1、-2；(v)空位成本(GapCost)设置为线性；以及(vi)针对正在使用的低复杂性区域的过滤程序(filter)。在一些实施方案中，在NCBI网站上用于BLASTP算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设为3；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为BLOSUM62(v)空位成本设置为存在11：延伸：1；以及(vi)条件组成评分矩阵调整。
百分比同一性通过确定在待比较序列所对应的相同位置的数目，将该数目除以比较的位置数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将该结果乘以100来获得。
在一些实施方案中，针对为参考序列全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出相似性或同一性程度。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸(在一些实施方案中，连续核苷酸)给出同一性程度。在一些实施方案中，针对参考序列全长给出相似性或同一性程度。
根据本公开内容，同源氨基酸序列表现出氨基酸残基的至少40％，特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％并且优选至少95％、至少98％或至少99％同一性。
本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组DNA操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或蛋白质的DNA序列的操作在例如Sambrooket al.(1989)中详细描述。此外，本文中所述的肽和氨基酸变体可借助于已知的肽合成技术例如如通过固相合成和类似方法来容易地制备。
在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白质)的片段或变体优选是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的功能特性相同或相似的一个或更多个功能特性(即，其是功能等同的)的任何片段或变体。关于结合剂(例如抗体)的序列，一种特定功能是由该片段或变体所来源的氨基酸序列所表现出的一种或更多种结合活性。本文中使用的术语“功能性片段”或“功能性变体”特别是指包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比一个或更多个氨基酸改变并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或更多种功能(例如，与靶分子结合)的氨基酸序列的变体分子或序列。在一个实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变该分子或序列的特性。在不同的实施方案中，功能性片段或功能性变体的功能可降低但仍显著存在，例如，功能性变体的结合可为亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在另一些实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能性片段或功能性变体的结合可以是增强的。
“来源于”指定氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)的氨基酸序列(肽、蛋白质或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文中的序列可被改变，使得它们在序列上与它们所来源的天然存在或天然的序列不同，同时保留天然序列的期望活性。
本文中使用的“说明材料”或“说明”包括出版物、记录、图表或可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的任何其他表达媒介。例如，本发明的药盒的说明材料可标附到包含本发明组合物的容器上，或者与包含所述组合物的容器一起运输。或者，说明材料可与容器分开运输，旨在让接受者合作使用说明材料和组合物。
“分离的”意指从天然状态改变或去除。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全从其天然状态的共存物质中分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以充分纯化的形式存在，或者可存在于非天然环境，例如宿主细胞中。
在本发明的上下文中，术语“重组”意指“通过遗传工程制备”。优选地，在本发明的上下文中，“重组物质”例如重组核酸是非天然存在的。
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中存在的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从天然来源中分离且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
术语“结合”或其变化形式涉及与靶标的非共价相互作用。在一个实施例中，术语“结合”或其变化形式涉及特定结合。本文中使用的术语“特异性结合”或其变化形式意指分子例如抗体或抗原受体识别特定的靶分子，但基本上不识别或不结合样品中或对象中的其他分子。例如，与来自一种物种的抗原特异性结合的抗体也可与来自一种或更多种其他物种的抗原结合。但是，这样的跨物种反应性本身不改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，与抗原特异性结合的抗体也可与抗原的不同等位基因形式结合。然而，这样的交叉反应性本身不改变抗体分类的特异性分类。
在一些情况下，术语“特异性结合”或其变化形式可用于是指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意指相互作用依赖于化学物质上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别特定的蛋白质结构并与其结合，而不是与蛋白质一般地结合。如果抗体对表位“A”具有特异性，则包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子的存在在包含标记的“A”和抗体的反应中将减少与该抗体结合的标记的A的量。
本文中使用的“生理pH”是指约7.5的pH。
术语“遗传修饰”或简称为“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是RNA引入细胞中。出于本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞中或由这样的细胞对核酸的摄入，其中细胞可存在于对象例如患者中。因此，根据本发明，用于转染本文中所述核酸的细胞可存在于体外或体内，例如，细胞可形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果仅瞬时表达所转染的遗传物质就已足够。可将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂而被稀释或者降解。允许核酸进行游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望所转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。这样的稳定的转染可通过使用用于转染的基于病毒的体系或基于转座子的体系来实现。通常来说，经遗传修饰以表达抗原受体的细胞是用编码抗原受体的核酸稳定转染的。通常来说，编码活化化合物的核酸和/或编码对接化合物的核酸被瞬时转染到细胞中。可将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。
初级靶标
本发明中使用的“初级靶标”涉及例如在治疗方法中待结合或以其他方式处理的靶标。
初级靶标可选自人或动物体内的任何合适的靶标，并且可以是细胞、病原体或寄生虫，或者可存在于细胞、病原体或寄生虫上。
根据一个特定的实施方案，初级靶标是存在于靶细胞表面上的结构，例如蛋白质，例如细胞表面抗原或细胞表面受体。初级靶标可在疾病(例如感染或癌症)期间上调。在患病组织中，标志物可不同于健康组织，并为治疗(特别是靶向治疗)提供独特的可能性。
在一些实施方案中，初级靶标或简称“靶标”是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原可能与微生物感染(通常是微生物抗原)相关，或者与癌症(通常是肿瘤)相关。
在一些实施方案中，初级靶标或简单来说“靶标”是肿瘤抗原。在本发明的上下文中，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”涉及在正常条件下在有限数目的组织和/或器官中或在特定发育阶段中特异性表达的蛋白质，例如，肿瘤抗原在正常条件下可在胃组织中(优选在胃黏膜中)、在生殖器官中(例如，在睾丸中)、在滋养层组织中(例如，在胎盘中)或在种系细胞中特异性表达，并且在一种或更多种肿瘤或癌症组织中表达或异常表达。在该上下文中，“有限数目”优选地意指不超过3，更优选地不超过2。本发明上下文中的肿瘤抗原包括，例如，分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即在正常条件下在特定分化阶段在特定细胞类型中特异性表达的蛋白质，癌症/睾丸抗原，即在正常条件下在睾丸中特异性表达并且有时在胎盘中特异性表达的蛋白质，以及种系特异性抗原。在本发明的上下文中，肿瘤抗原优选地与癌细胞的细胞表面缔合，并且优选地在正常组织中不表达或仅很少表达。优选地，肿瘤抗原或异常表达的肿瘤抗原确定癌细胞。在本发明的上下文中，由对象(例如，患有癌症疾病的患者)中的癌细胞表达的肿瘤抗原优选地是所述对象中的自身蛋白质。在一些优选实施方案中，本发明上下文中的肿瘤抗原在正常条件下特异性地在非必需的组织或器官(即，当被免疫系统损伤时不导致对象死亡的组织或器官)中或者在不可被或仅几乎不可被免疫系统接近的身体器官或结构中表达。优选地，肿瘤抗原的氨基酸序列在正常组织中表达的肿瘤抗原和在癌组织中表达的肿瘤抗原之间是相同的。
肿瘤抗原的实例包括p53、ART-4、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、密蛋白(claudin)家族的细胞表面蛋白(例如密蛋白-6、密蛋白-18.2和密蛋白-12)、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A(优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12)、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190小BCR-abL、Pm1/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE和WT。特别优选的肿瘤抗原包括密蛋白-18.2(CLDN18.2)和密蛋白-6(CLDN6)。
根据本发明，通过向对接化合物提供与靶标结合的部分，例如靶细胞上的抗原，可将免疫效应细胞特异性递送至靶标，例如靶细胞。对接化合物还包含针对免疫效应细胞的结合部分，用于将靶标和免疫效应细胞集合在一起。
对接化合物
根据本发明，RNA编码的“对接化合物”用于在初级靶标(例如，靶细胞或靶细胞上的抗原)和对接化合物之间形成连接，例如非共价连接。对接化合物可与免疫效应细胞形成连接，例如非共价连接。RNA编码的对接化合物在本文中也被称为“Ribo对接物”。
在一个实施方案中，对接化合物包含“初级靶向部分”，也称为“与靶标结合的结合部分”，特别是“与靶细胞上的靶标结合的结合部分”，或者“与靶抗原结合的结合部分”，其能够与目的初级靶标结合。本发明中使用的“初级靶向部分”涉及与初级靶标结合的对接化合物部分。这样的靶向部分通常是对细胞表面靶标(例如，膜受体)或结构蛋白(例如，淀粉样斑块)具有亲和力的部分。这些部分可以是与初级靶标结合的任何肽或蛋白质(例如，抗体或抗体片段)。用于本文中的合适的初级靶向部分的一些具体实施方案包括细胞表面抗原结合肽和抗体。初级靶向部分的另一些实例是与受体结合的肽或蛋白质。
初级靶向部分优选以高特异性和/或高亲和力结合，并且与初级靶标的键优选地在体内是稳定的。
为了允许对上述列出的初级靶标的特异性靶向，对接化合物的初级靶向部分可包含化合物，包括但不限于抗体、抗体片段(例如Fab2、Fab、scFV、VHH结构域)和其他蛋白质或肽。
根据本发明的一个具体实施方案，初级靶标是受体，并且合适的初级靶向部分包括但不限于这样的受体的配体或其仍与受体结合的部分，例如在受体结合蛋白配体的情况下的受体结合肽。
具有蛋白质性质的初级靶向部分的另一些实例包括干扰素(例如α、β和γ干扰素)、白介素和蛋白质生长因子(例如转化生长因子(transforming growth factor，TGF)或血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF))。
根据本发明的另一个具体实施方案，选择初级靶标和初级靶向部分，使得导致对组织或疾病(例如癌症或感染)的特异性靶向或提高的靶向。这可通过选择具有组织特异性表达、细胞特异性表达或疾病特异性表达的初级靶标来实现。例如，肿瘤抗原可在多种肿瘤细胞类型中过表达，而在正常细胞中不表达或以较低量表达。
对接化合物还包含充当“次级靶标”的基团，即充当为免疫效应细胞提供结合配偶体的对接化合物的部分。包含在与免疫效应细胞结合的对接化合物中的结合部分(“次级靶标”)和包含在与对接化合物结合的免疫效应细胞中的结合部分(即抗原受体)(“次级靶向部分”)彼此结合。
在一个实施方案中，对接化合物包含融合蛋白，所述融合蛋白包含与初级靶标结合的结合结构域和与免疫效应细胞上的次级靶向部分结合的结合结构域。
本文中使用的术语“融合蛋白”是指包含两个或更多个亚基的多肽或蛋白质。优选地，融合蛋白是两个或更多个亚基之间的翻译融合体。翻译融合体可将阅读框中一个亚基的编码核苷酸序列通过用另一个亚基的编码核苷酸序列进行遗传改造来产生。亚基可散布有接头。
在一个实施方案中，对接化合物包含单条肽链。在一个实施方案中，单条肽链包含与初级靶标结合的抗体片段和与免疫效应细胞上的次级靶向部分(即抗原受体)结合的肽部分。在一个实施方案中，抗体片段是VHH、scFv、或其混合物。
在一个实施方案中，包含在对接化合物中的次级靶标包含肽或蛋白质(例如，肽标签)，并且包含在免疫效应细胞中的次级靶向部分(即抗原受体)包含与肽或蛋白质结合的结合物(例如抗体片段)。
在一个实施方案中，本文中使用的次级靶标/次级靶向部分系统包含表位标签/结合物系统。
在一个实施方案中，表位标签/结合物系统包含含有序列SRLEEELRRRLTE的表位标签以及包含含有以下的骆驼科VHH结构域的结合物：CDR1序列GVTISALNAMAMG、CDR2序列AVSERGNAM和CDR3序列LEDRVDSFHDY。在一个实施方案中，表位标签/结合物系统包含含有序列SRLEEELRRRLTE的表位标签以及包含含有以下的骆驼科VHH结构域的结合物：氨基酸序列EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS、与所述氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列、或者所述氨基酸序列的片段或与所述氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的片段。
本文中使用的“表位标签”是指抗体或具有抗体样功能的蛋白质性分子可与之结合的氨基酸区段。
在一个实施方案中，对接化合物包含信号肽，例如N端信号肽，其允许对接化合物从表达所述RNA的细胞中分泌。
活化化合物
本公开内容还涉及用于增强免疫效应细胞(例如T细胞)的效率的活化化合物。
如本文中所述，可通过在对象中施用抗原受体改造的免疫效应细胞或通过产生抗原受体改造的免疫效应细胞来向对象提供抗原受体改造的免疫效应细胞。在一个实施方案中，抗原受体改造的免疫效应细胞在被治疗的对象中产生。这样的体内产生通常将仅在对象中提供少量的抗原受体改造的免疫效应细胞。然而，预期这些少量的抗原受体改造的免疫效应细胞将是治疗有效的，这是由于通过提供抗原受体的活化化合物实现了强烈的刺激作用。通常，抗原受体改造的免疫效应细胞可以以亚治疗量提供给对象，因为本文中所述的方法进一步提供了施用包含本文中所述的免疫效应细胞结合的部分的活化化合物，其中所述结合导致免疫效应细胞活化和/或扩增。在一个实施方案中，当活化化合物存在于次级淋巴器官的细胞例如抗原呈递细胞特别是树突细胞上时，免疫效应细胞通过抗原受体与活化化合物结合。
在本发明所有方面的一个实施方案中，编码活化化合物的RNA在对象的细胞中表达，以提供与免疫效应细胞所表达的抗原受体结合的部分，所述结合导致免疫效应细胞的刺激、致敏(priming)和/或扩增。
活化化合物包含免疫效应细胞可结合的部分。在某些实施方案中，活化化合物包含对应于对接化合物或者其片段或变体的次级靶标的部分，免疫效应细胞能够与该部分例如本文中所述的肽标签结合。
活化化合物可进一步包含这样的部分，其将所述免疫效应细胞可结合的部分呈现在细胞表面上，例如抗原呈递细胞的细胞表面上。这样的部分可包含膜蛋白，例如跨膜蛋白或受体。因此，活化化合物可包含融合蛋白，该融合蛋白包含免疫效应细胞可结合的部分(例如，肽标签)和将所述免疫效应细胞可结合的部分呈现在细胞表面上的部分(例如，膜蛋白)。所述免疫效应细胞可结合的部分通常存在于细胞表面上，即细胞外部。
在一个实施方案中，施用编码活化化合物的RNA以(在合适的靶细胞表达RNA之后)提供用于刺激、致敏和/或扩增免疫效应细胞的活化化合物。患者体内被刺激、致敏和/或扩增的免疫效应细胞(例如T细胞)能够通过对接化合物识别表达抗原的靶细胞群体或靶组织，导致患病细胞的根除。在一个实施方案中，编码活化化合物的RNA靶向次级淋巴器官。
本文中使用的“活化”或“刺激”是指免疫效应细胞(例如T细胞)被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的状态。活化也可与信号传导途径的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的免疫效应细胞”尤其是指正在经历细胞分裂的免疫效应细胞。
术语“致敏”是指这样的过程，其中免疫效应细胞(例如T细胞)与其特异性抗原首次接触，并引起分化成效应细胞如效应T细胞。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指特定实体倍增的过程。在本公开内容的上下文中，该术语优选地在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中淋巴细胞被抗原刺激，增殖，并且识别所述抗原的特异性淋巴细胞被扩增。优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化。
一般而言，活化化合物在细胞表面上表达，使得其抗原受体结合部分可用于与免疫效应细胞所表达的抗原受体结合。
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面缔合”意指分子例如受体或抗原与细胞质膜缔合并位于细胞质膜上，其中该分子的至少一部分朝向所述细胞的胞外空间并且可例如通过位于细胞外的抗原受体从所述细胞的外部接近。在该情况下，部分为优选至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。缔合可以是直接的或间接的。例如，缔合可以是通过一个或更多个跨膜结构域、一个或更多个脂质锚，或者是通过与可在细胞质膜外小叶上存在的任何其他蛋白质、脂质、糖类或其他结构的相互作用。例如，与细胞表面缔合的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与另一种是跨膜蛋白的蛋白质相互作用而与细胞表面缔合的蛋白质。
“细胞表面”或“细胞的表面”根据其在本领域中的通常含义使用，并因此包括易于被蛋白质和其他分子结合的细胞外部。如果抗原位于细胞的表面并且易于被例如添加至所述细胞的抗原特异性抗体结合，则所述抗原在所述细胞的表面上表达。在一个实施方案中，在细胞表面上表达的抗原是具有被抗原受体识别的胞外部分的完整膜蛋白。
在本公开内容的上下文中，术语“胞外部分”或“胞外结构域”是指朝向细胞的胞外空间并且优选地从所述细胞的外部(例如通过位于细胞外部的结合分子，例如抗体)可及的分子(例如，蛋白质)的一部分。
免疫效应细胞
本文中使用的免疫效应细胞包含次级靶向部分。该次级靶向部分在本文中也称为嵌合抗原受体(CAR)或简称为抗原受体。次级靶向部分与免疫效应细胞的一部分相关，该部分形成针对包含在活化化合物中的针对免疫效应细胞的结合部分的结合配偶体和/或针对包含在对接化合物中的次级靶标的结合部分的结合配偶体。免疫效应细胞优选能够提供或产生期望的作用，例如治疗作用。
结合本发明使用的并且可引入编码抗原受体的核酸(DNA或RNA)的免疫效应细胞特别地包括，免疫效应细胞，例如具有裂解潜力的细胞，特别是淋巴细胞，并且优选T细胞，特别是细胞毒性淋巴细胞，优选选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。一旦活化，这些细胞毒性淋巴细胞中的每一种都触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过以下方式中的任一种或两种触发靶细胞的破坏。首先，一旦活化，T细胞释放细胞毒素，例如穿孔素、颗粒酶(granzyme)和颗粒溶素(granulysin)。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，而颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶级联，其诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，凋亡可通过T细胞和靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导。尽管可使用异源细胞或同种异体细胞，但结合本发明使用的细胞优选是自体细胞。
本发明上下文中的术语“效应子功能”包括由免疫系统组分介导的任何功能，这些功能导致例如杀伤患病细胞如肿瘤细胞，或抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤散播和转移。优选地，本发明上下文中的效应子功能是T细胞介导的效应子功能。在辅助T细胞(CD4+T细胞)的情况下，这样的功能包括释放细胞因子和/或活化CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞，并且在CTL的情况下包括例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除细胞(即以表达抗原为特征的细胞)，产生细胞因子例如IFN-g和TNF-α，以及抗原表达靶细胞的特异性细胞裂解杀伤。
在本发明上下文中，术语“免疫效应细胞”或“免疫反应性细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应子功能的细胞。在一个实施方案中，“免疫效应细胞”能够结合抗原(例如，肽抗原)，例如通过活化化合物和对接化合物如次级靶标呈递的抗原。例如，免疫效应细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫效应细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+ T细胞，最优选CD8+ T细胞。根据本发明，术语“免疫效应细胞”还包括可在适当的刺激下成熟为免疫细胞(例如T细胞，特别是T辅助细胞或细胞裂解T细胞)的细胞。免疫效应细胞包括CD34+造血干细胞，未成熟和成熟T细胞以及未成熟和成熟B细胞。当暴露于抗原时，T细胞前体分化为细胞裂解T细胞，类似于免疫系统的克隆选择。
根据本发明使用的免疫效应细胞可表达内源性抗原受体，例如T细胞受体或B细胞受体，或者可缺乏内源性抗原受体的表达。
“淋巴样细胞”是任选地在适当修饰后，例如在转移抗原受体例如TCR或CAR后，能够产生免疫应答(例如细胞免疫应答)的细胞，或者这样的细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞(优选T淋巴细胞)、成淋巴细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是如本文中所述的免疫效应细胞。优选的淋巴样细胞是可被修饰以在细胞表面上表达抗原受体的T细胞。在一个实施方案中，淋巴样细胞缺少T细胞受体的内源性表达。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括包含溶细胞性T细胞的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)(CD8+ T细胞)和T辅助细胞(CD4+ T细胞)。
T细胞属于被称为淋巴细胞的一组白细胞，并且在细胞介导的免疫中起着核心作用。它们可通过其细胞表面上被称为T细胞受体(T cell receptor，TCR)的特殊受体的存在与其他淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)区分开来。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已经发现了数种不同的T细胞亚群，每种具有独特的功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化等功能。这些细胞也被称为CD4+T细胞，因为它们在其表面上表达CD4糖蛋白。当辅助T细胞通过在抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)表面上表达的II类MHC分子呈递肽抗原时，辅助T细胞被活化。一旦活化，其迅速分裂并分泌被称为细胞因子的小蛋白，这些小蛋白调节或协助主动免疫应答。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，也参与移植排斥。这些细胞也被称为CD8+ T细胞，因为它们在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与存在于几乎身体的每个细胞的表面上的I类MHC缔合的抗原来识别它们的靶标。
“调节性T细胞”或“Treg”是调节免疫系统、维持对自身抗原的耐受性以及预防自身免疫病的T细胞亚群。Treg是免疫抑制的，并且通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。Treg表达生物标志物CD4、FoxP3和CD25。
本文中使用的术语“初始T细胞”是指不同于活化T细胞或记忆T细胞，在外周内未接触其同源抗原的成熟T细胞。初始T细胞的特征通常在于L-选择素(CD62L)的表面表达，不存在活化标志物CD25、CD44或CD69，以及不存在记忆CD45RO同种型。
本文中使用的术语“记忆T细胞”是指先前已接触并响应于其同源抗原的T细胞亚组或亚群。在与抗原第二次接触时，记忆T细胞可复制以产生比第一次免疫系统响应于抗原更快且更强的免疫应答。记忆T细胞可以是CD4+或CD8+并且通常表达CD45RO。
根据本发明，术语“T细胞”还包括在适当刺激的情况下可成熟为T细胞的细胞。
大多数T细胞都具有作为几种蛋白质的复合体存在的T细胞受体(TCR)。实际的T细胞受体由两条独立的肽链构成，它们由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并被称为α-TCR链和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T细胞)代表一小部分在其表面上具有独特T细胞受体(TCR)的T细胞。然而，在γδT细胞中，TCR由一条γ链和一条δ链构成。这类T细胞相比于αβT细胞不常见得多(占T细胞总数的2％)。
所有T细胞都来源于骨髓中的造血干细胞。源自造血干细胞的造血祖细胞存在于胸腺中并通过细胞分裂扩增以产生大量未成熟胸腺细胞。最早的胸腺细胞既不表达CD4也不表达CD8，因此分类为双阴性(CD4-CD8-)细胞。随着它们在发育过程中的进展，它们变成双阳性胸腺细胞(CD4+CD8+)，并且最终成熟为单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)胸腺细胞，然后从胸腺释放到外周组织。
通常可使用标准操作在体外或离体制备T细胞。例如，可使用市售的细胞分离系统从哺乳动物如患者的骨髓、外周血或者骨髓或外周血的级分中分离T细胞。或者，T细胞可来源于相关或不相关的人、非人动物、细胞系或培养物。包含T细胞的样品可例如是外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。
本文中使用的术语“NK细胞”或“自然杀伤细胞”是指由CD56或CD16的表达和T细胞受体的缺失定义的外周血淋巴细胞亚群。如本文中提供的，NK细胞也可由干细胞或祖细胞分化。
抗原受体
本文中所述的免疫效应细胞可在被治疗的对象中离体/体外或体内进行遗传修饰以分别表达在活化化合物和对接化合物上的抗原受体，例如结合抗原的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)。在一个实施方案中，针对表达抗原受体的修饰是在离体/体外进行的。随后，可将经修饰细胞向患者施用。
由于CAR修饰的T细胞可被改造以靶向(优选地以MHC依赖性方式靶向)几乎任何肿瘤抗原，因此用表达嵌合抗原受体的CAR改造T细胞进行过继性细胞转移治疗是有前景的抗癌治疗。例如，可将患者的T细胞遗传改造(遗传修饰)成表达特异性针对患者肿瘤细胞上的抗原的CAR，然后输注回患者中。
本文中描述的本公开内容不限于使用自体免疫效应细胞。
根据本公开内容，免疫效应细胞可以被遗传修饰以表达抗原受体。免疫效应细胞可离体或在体内进行遗传修饰以表达抗原受体。这样的遗传修饰可离体或在体外实现，并随后可将免疫效应细胞施用于需要治疗的对象，或者可在需要治疗的对象体内进行。
在多种实施方案中，将来自待治疗对象或来自不同对象的免疫效应细胞施用于待治疗对象。施用的免疫效应细胞可在施用之前进行离体遗传修饰，或在施用之后在对象体内进行遗传修饰，以表达本文中所述的抗原受体。在一个实施方案中，免疫效应细胞在待治疗的对象中是内源性的(因此，不施用于待治疗的对象)，并且在对象体内被遗传修饰以表达本文中所述的抗原受体。
根据本发明，术语“CAR”(或“嵌合抗原受体”)与术语“嵌合T细胞受体”和“人工T细胞受体”同义，并且涉及包含单一分子或分子复合体的人工受体，其识别靶结构(例如抗原)(即与其结合)(例如通过抗原结合结构域与抗原结合)并且可赋予免疫效应细胞例如在细胞表面上表达所述CAR的T细胞以特异性。这样的细胞不一定需要处理和呈递抗原来识别，而是可优选地以特异性识别任何抗原。优选地，靶结构被CAR识别使得表达所述CAR的免疫效应细胞被活化。CAR可包含一个或更多个蛋白质单元，所述蛋白质单元包含如本文中所述的一个或更多个结构域。术语“CAR”不包括T细胞受体。
CAR包含靶标特异性结合元件或者称为抗原结合部分或抗原结合结构域，通常是CAR胞外结构域的一部分。具体地，本发明的CAR靶向活化化合物和对接化合物上的抗原。
在本发明的一个实施方案中，抗原结合结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白重链可变区(VH)和对抗原具有特异性的免疫球蛋白轻链可变区(VL)。在一个实施方案中，免疫球蛋白是抗体。在一个实施方案中，所述重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)通过肽接头连接。优选地，CAR中的抗原结合部分是scFv。在本发明的一个实施方案中，抗原结合结构域包含VHH结构域。
CAR被设计为包含与CAR胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，跨膜结构域不与CAR中的结构域之一天然缔合。在一个实施方案中，跨膜结构域与CAR中的结构域之一天然缔合。在一个实施方案中，通过氨基酸替换来修饰跨膜结构域以避免这样的结构域与具有相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合体的其他成员的相互作用最小化。跨膜结构域可源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中具有特定用途的跨膜区可来源于以下(即至少包含以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成跨膜结构域的每个末端。
在一些实例中，本发明的CAR包含形成跨膜结构域和胞外结构域之间的连接的铰链结构域。
CAR的胞质结构域或另外的胞内信号传导结构域负责活化其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能的蛋白质的部分。虽然通常可使用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下不需要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，这样的截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。术语胞内信号传导结构域因此意味着包括胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
已知通过单独TCR产生的信号不足以完全活化T细胞并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，T细胞活化可被认为由两种不同种类的胞质信号传导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原独立性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
在一个实施方案中，CAR包含来源于CD3ζ的初级胞质信号传导序列。此外，CAR的胞质结构域可包含与共刺激信号传导区结合的CD3ζ信号传导结构域。
共刺激结构域的特性仅限于其具有在CAR与靶向部分结合之后增强细胞增殖和存活的能力。合适的共刺激结构域包括CD28、CD137(4-1BB)(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员)、CD134(OX40)(TNFR受体超家族成员)和CD278(ICOS)(在活化的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子)。技术人员将理解，可使用这些提及的共刺激结构域的序列变体而对本发明无不利影响，其中所述变体与其模拟的结构域具有相同或类似的活性。这样的变体与其来源于的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，CAR构建体包含两个共刺激结构域。虽然一些具体组合包括四种提及的结构域的所有可能变化方案，但是一些具体实例包括CD28+CD137(4-1BB)和CD28+CD134(OX40)。
CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或特定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选长度为2至10个氨基酸)可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一个实施方案中，CAR包含将新生蛋白质导入内质网的信号肽。在一个实施方案中，信号肽在抗原结合结构域之前。在一个实施方案中，信号肽源自例如IgG的免疫球蛋白。
CAR可以包含上述结构域(共同以融合蛋白的形式)。这样的融合蛋白将通常包含以N端至C端方向连接的抗原结合结构域、一个或更多个共刺激结构域和信号传导序列。然而，本发明的CAR不限于这种排列，并且其他排列也是可接受的并且包括结合结构域、信号传导结构域和一个或更多个共刺激结构域。应理解，由于结合结构域必须自由结合抗原，因此结合结构域在融合蛋白中的布置将通常使得实现该区域在细胞外部的展示。以同样的方式，由于共刺激和信号传导结构域用于诱导细胞毒性淋巴细胞的活性和增殖，因此融合蛋白将通常会在细胞内部展示这两个结构域。
在一个实施方案中，CAR分子包含：
i)靶抗原(例如，表位标签)结合结构域；
ii)跨膜结构域；和
iii)胞内结构域，其包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含scFv。在一个实施方案中，跨膜结构域包含选自以下的蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，
CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD154，KIRDS2，OX40，CD2，CD27，LFA-1(CD11a，CD18)，ICOS(CD278)，4-1BB(CD137)，GITR，CD40，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Ra，ITGA1，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f,ITGAD，CDIId，ITGAE，CD103，ITGAL，CDIIa，LFA-1，ITGAM，CDIIb，ITGAX，CDIIc，ITGBI，CD29，ITGB2，CD18，LFA1，ITGB7，TNFR2，DNAMI(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRT AM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGLI，CDIOO(SEMA4D)，SLAMF6(NTB-A，Lyl08)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，NKG2D，和NKG2C，或其功能性变体。在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域通过铰链结构域与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，铰链结构域是CD8α铰链结构域。
在一个实施方案中，本发明的CAR分子包含：
i)靶抗原结合结构域；
ii)CD8α铰链结构域；
iii)CD8α跨膜结构域；和
iv)胞内结构域，其包含4-1BB共刺激结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
多种方法可用于将抗原受体(例如CAR构建体)引入到细胞(例如T细胞)中，以产生经遗传修饰以表达抗原受体的细胞。这样的方法包括：基于非病毒的DNA转染、基于非病毒的RNA转染，例如mRNA转染、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的DNA转染具有低插入诱变风险。与不包含整合元件的质粒相比，基于转座子的系统可更高效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易产生，高效且永久地转导T细胞，并且从原代人T细胞的整合观点来看已被初步证明是安全的。慢病毒载体也高效且永久地转导T细胞，但是制造更加昂贵。它们相比于基于逆转录病毒的系统还可能更加安全。
本文中使用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞的逆转录病毒中是独特的；它们可以将显著量的遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。来源于慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的方式。
在一个实施方案中，用编码抗原受体的核酸离体或体内转染T细胞或T细胞祖细胞。在一个实施方案中，可使用离体和体内转染的组合。在一个实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞来自待治疗的对象。在本发明所有方面的一个实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞来自与待治疗的对象不同的对象。
使用靶向T细胞的纳米粒，CAR T细胞可在体内产生，并且因此几乎瞬时地产生。例如，基于聚(β-氨基酯)的纳米粒可与抗CD3e F(ab)片段偶联以用于与T细胞上的CD3结合。与T细胞结合之后，这些纳米粒被内吞。它们的内容物，例如编码抗肿瘤抗原CAR的质粒DNA，可由于包含含有微管相关序列(microtubule-associated sequence，MTAS)和核定位信号(nuclear localization signal，NLS)的肽而被导向至T细胞细胞核。包含在CAR基因表达盒侧翼的转座子和编码过度活跃转座酶的单独质粒，可允许CAR载体有效整合到染色体中。Smith et al.(2017)Nat.Nanotechnol.12:813-820中描述了这样的系统，该系统在输注纳米粒之后允许体内产生CAR T细胞。
此外，使用特异性靶向人CD8+细胞的慢病毒载体CD8-LV可在体内直接产生CD19-CAR T细胞(Pfeiffer A.et al.,EMBO Mol.Med.Nov；10(11),2018,9158)。
另一种可能性是使用CRISPR/Cas9方法有意将CAR编码序列置于特定基因座处。例如，现有的T细胞受体(TCR)可被敲除，同时敲入CAR并将其置于内源性启动子的动态调节控制下，否则其会弱化TCR的表达；参见例如Eyquem et al.(2017)Nature 543:113-117。
在一个实施方案中，经遗传修饰以表达抗原受体的细胞用编码抗原受体的核酸稳定或瞬时转染。因此，编码抗原受体的核酸被整合或未被整合到细胞的基因组中。
在一个实施方案中，使经遗传修饰以表达抗原受体的细胞失活以表达内源性T细胞受体和/或内源性HLA。
在一个实施方案中，本文中所述的细胞相对于待治疗的对象可以是自体的、同种异体的或同基因的。在一个实施方案中，本公开内容设想了从患者中去除细胞并随后将所述细胞重新递送至该患者。在一个实施方案中，本发明没有设想从患者中去除细胞。在后一种情况下，细胞遗传修饰的所有步骤都在体内进行。
术语“自体”用于描述来源于同一对象的任何事物。例如，“自体移植”是指来源于同一对象的组织或器官的移植。这样的操作是有利的，因为它们克服了免疫屏障，否则会导致排斥。
术语“同种异体的”用于描述来源于相同物种的不同个体的任何事物。当一个或更多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被认为彼此是同种异体的。
术语“同基因的”用于描述来源于具有相同基因型的个体或组织(即同卵双胞胎或相同近交品系的动物，或其组织)的任何事物。
术语“异源的”用于描述由多个不同要素组成的事物。作为一个实例，将一个个体的骨髓转移到不同个体中构成异源移植。异源基因是来源于除对象之外的来源的基因。
结合部分和物质
本公开内容描述了结合部分或物质(例如抗体或抗体衍生物)。
术语“表位”是指被结合剂识别的分子或抗原的一部分或片段。例如，表位可以被抗体或任何其他结合蛋白质识别。表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约8至约25个氨基酸，例如，表位的长度可优选9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10个氨基酸至约25个氨基酸之间。术语“表位”包括结构表位。
术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链(一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链)组成，所有四条链通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已被良好地表征。参见例如Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(本文中缩写为VH或VH)和重链恒定区(本文中缩写为CH或CH)构成。重链恒定区通常由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。铰链区是重链的CH1和CH2结构域之间的区域，并且具有高度柔性。铰链区中的二硫键是IgG分子中两条重链之间相互作用的部分。每条轻链通常由轻链可变区(本文中缩写为VL或VL)和轻链恒定区(本文中缩写为CL或CL)构成。轻链恒定区通常由一个结构域CL构成。VH和VL区可进一步细分为高变的区(或高变区，其可以是序列高变的和/或形成结构上限定的环)，也称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，散布有更保守的区，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还参见Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196,901-917(1987))。除非另有说明或与上下文相矛盾，否则本发明中对恒定区中氨基酸位置的引用是根据EU编号进行的(Edelman et al.,Proc Natl Acad Sci U SA.1969May；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition.1991NIH Publication No.91-3242)。通常来说，本文中所述的CDR是Kabat定义的。
本文中使用的术语“对应于……的位置的氨基酸”是指人IgG1重链中的氨基酸位置编号。通过与人IgG1比对，可发现其他免疫球蛋白中相应的氨基酸位置。因此，一个序列中“对应于”另一序列中的氨基酸或区段的氨基酸或区段是使用标准序列比对程序(例如通常默认设置的ALIGN、ClustalW或类似程序)与另一氨基酸或片段比对，并且与人IgG1重链具有至少50％、至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸或区段。如何比对序列或序列中的片段并由此确定序列中对应于根据本发明的氨基酸位置的位置与在本领域中被认为是公知的。
本发明上下文中的术语“抗体(antibody，Ab)”是指具有结合、优选与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者的衍生物。在一个实施方案中，结合发生在典型的生理条件下，其具有相当长时间段的半衰期，例如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约一小时、至少约两小时、至少约四小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或更多、约48小时或更多、约3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相关的功能限定的时间段(例如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体与抗原结合相关的生理应答的时间)。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合区。本文中使用的术语“抗原结合区”、“结合区”或“结合结构域”是指与抗原相互作用的区域或结构域并且通常包含VH区和VL区。当用于本文中时，术语抗体不仅包括单特异性抗体，还包括多特异性抗体，其包含多个，例如两个或更多个，例如三个或更多个不同的抗原结合区。抗体(Ab)的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和补体系统的成分，例如C1q，其是补体活化经典途径中的第一组分。如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，本文中使用的术语抗体包括作为抗原结合片段(即保留抗原特异性结合的能力)的抗体片段和抗体衍生物，即，来源于抗体的构建体。已表明，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来进行。涵盖在术语“抗体”内的抗原结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如WO2007059782(Genmab)中所述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))，其基本上由VH结构域组成并且也称为结构域抗体(Holt et al；TrendsBiotechnol.2003Nov；21(11):484-90)；(vi)骆驼科或纳米抗体分子(Revets et al；Expert Opin Biol Ther.2005Jan；5(1):111-24)和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接起来，使得它们能够成为单蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(single chain Fv，scFv)，参见例如Bird et al.,Science 242,423-426(1988)and Huston et al.,PNAS USA85,5879-5883(1988))。除非另有说明或上下文明确指出，否则这样的单链抗体涵盖在术语抗体之内。尽管这样的片段通常被包括在抗体的含义之内，但是它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。在本发明情况下的这些和其他可用的抗体片段以及这样的片段的双特异性形式在本文中进一步讨论。还应理解，除非另有指明，否则术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及通过任意已知技术(例如酶切割、肽合成和重组技术)提供的保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段(抗原结合片段)。
短语“单链Fv”或“scFv”是指这样的抗体，其中传统双链抗体的重链和轻链的可变结构域(VH和VL)已经连接形成一条链。任选地，在两条链之间插入接头(通常是肽)，以允许适当折叠和产生活性结合位点。
单结构域抗体，也称为纳米抗体，是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。在一个实施方案中，单结构域抗体是重链抗体的可变结构域(VH)。这些被称为VHH片段。与整个抗体一样，单结构域抗体能够选择性地与特定抗原结合。第一个单结构域抗体是由骆驼科中发现的重链抗体改造而成的。软骨鱼类也具有重链抗体(IgNAR，“免疫球蛋白新抗原受体”)，可从中获得称为VNAR片段的单结构域抗体。替代方法是将来自人或小鼠的常见免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的二聚体可变结构域拆分为单体。尽管目前大多数对单结构域抗体的研究都是基于重链可变结构域，但来源于轻链的纳米抗体也已被证明与靶表位特异性结合。
抗体可具有任意同种型。本文中使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。当本文中提及特定同种型例如IgG1时，该术语不限于特定同种型序列例如特定IgG1序列，而是用于指示抗体在序列上更接近该同种型例如IgG1而不是其他同种型。因此，例如本发明的IgG1抗体可以是天然存在的IgG1抗体的序列变体，包括恒定区中的变体。
在多种实施方案中，抗体是IgG1抗体，更特别是IgG1，κ或IgG1，λ同种型(即IgG1，κ、λ)、IgG2a抗体(例如IgG2a，κ、λ)、IgG2b抗体(例如IgG2b，κ、λ)、IgG3抗体(例如IgG3，κ、λ)或IgG4抗体(例如IgG4，κ、λ)。
本文中使用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与永生化细胞融合的从转基因或转染色体非人动物例如转基因小鼠获得的B细胞，其基因组包含人重链转基因和轻链转基因。
本文中使用的术语“嵌合抗体”是指其中可变区来源于非人物种(例如，来源于啮齿动物)并且恒定区来源于不同物种例如人的抗体。开发用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低抗体的免疫原性。在嵌合抗体的情况下使用的术语“可变区”或“可变结构域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链二者的CDR和框架区的区域。嵌合抗体可通过使用Sambrook etal.,1989,Molecular Cloning:Alaboratory Manual,New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,Ch.15所述的标准DNA技术产生。嵌合抗体可以是经遗传改造或经酶改造的重组抗体。产生嵌合抗体在技术人员的知识范围内，并因此，根据本发明的嵌合抗体的产生可通过除本文中所述之外的其他方法来进行。
本文中使用的术语“人源化抗体”是指遗传改造的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和被修饰以与人可变结构域具有高水平序列同源性的非人可变结构域。这可通过将一起形成抗原结合位点的六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人接纳体框架区(FR)上来实现(参见WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可需要将来自亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可帮助鉴定框架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列、任选地包含针对非人氨基酸序列的一个或更多个氨基酸回复突变的主要人框架区，以及完全人恒定区。任选地，可应用不一定是回复突变的另外的氨基酸修饰以获得具有优选特征例如亲和力和生物化学特性的人源化抗体。
本文中使用的术语“人抗体”是指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文中使用的术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠或大鼠)种系的CDR序列已接枝到人框架序列上的抗体。人单克隆抗体可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体法，例如，Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管原则上优选体细胞杂交方案，但是也可采用其他用于产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化或使用人抗体基因的文库的噬菌体展示技术。用于制备分泌人单克隆抗体的杂交瘤的合适动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是已经非常成熟的方案。分离用于融合的经免疫接种脾细胞的免疫接种方案和技术是本领域中已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合方案也是已知的。因此，人单克隆抗体可例如使用携带部分人免疫系统而不是小鼠或大鼠系统的转基因或转染色体小鼠或大鼠产生。因此，在一个实施方案中，人抗体从携带人种系免疫球蛋白序列而不是动物免疫球蛋白序列的转基因动物例如小鼠或大鼠中获得。在这样的实施方案中，抗体源自引入动物中的人种系免疫球蛋白序列，但最终抗体序列是所述人种系免疫球蛋白序列通过内源性动物抗体机制的体细胞超突变和亲和力成熟进一步修饰的结果，参见例如Mendez et al.1997Nat Genet.15(2):146-56。
当在本文中使用时，除非与上下文相矛盾，否则术语“Fab-臂”、“结合臂”或“臂”包括一个重链-轻链对，并且在本文中可与“半分子”互换使用。
当在抗体的上下文中使用时，术语“全长”表示抗体不是片段，而是包含特定同种型的通常在自然界中发现的该同种型的所有结构域，例如IgG1抗体的VH、CH1、CH2、CH3、铰链、VL和CL结构域。
当在本文中使用时，除非与上下文相矛盾，否则术语“Fc区”是指由免疫球蛋白重链的两个Fc序列组成的抗体区，其中所述Fc序列包含至少铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
本文中使用的在抗体与预定抗原或表位结合的上下文中的术语“结合”或“能够结合”通常是当使用生物层干涉术(Bio-Layer Interferometry，BLI)确定时，或者例如当使用表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术在BIAcore 3000仪器中使用抗原作为配体并且抗体作为分析物确定时，以对应于约10-7M或更小(例如约10-8M或更小，例如约10-9M或更小，约10-10M或更小，或约10-11M或甚至更小)的KD的亲和力的结合。抗体以对应于这样的KD的亲和力与预定抗原结合，所述KD比其与除预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力低至少十倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。亲和力低的量取决于抗体的KD，所以当抗体的KD非常低(即抗体高度特异)时，对抗原的亲和力低于对非特异性抗原的亲和力的程度可以是至少10,000倍。
本文中使用的术语“kd”(秒-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为koff值。
本文中使用的术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
本发明还设想了包含本文中所述抗体的VL区、VH区或者一个或更多个CDR的功能变体的抗体。在抗体的上下文中使用的VL、VH或CDR的功能变体仍然允许抗体保留至少相当大比例(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的“参考”或“亲本”抗体的亲和力和/或特异性/选择性，并且在一些情况下，这样的抗体可与比亲本抗体更高的亲和力、选择性和/或特异性相关。
这样的功能变体通常保留与亲本抗体的显著序列同一性。
示例性变体包括主要通过保守替换而与亲本抗体序列的VH和/或VL和/或CDR区不同的变体；例如，变体中至多10个，例如9、8、7、6、5、4、3、2或1个替换是保守的氨基酸残基替代。
本文中所述抗体序列(例如VL区或VH区)或与本文中所述抗体序列(例如VL区或VH区)具有一定程度同源性或同一性的抗体序列的功能变体优选在非CDR序列中包含修饰或变异，而CDR序列优选保持不变。
除非与上下文相矛盾，否则本文中使用的术语“特异性”旨在具有以下含义。如果两种抗体与相同的抗原和相同的表位结合，则它们具有“相同的特异性”。
术语“竞争”可指在第一抗体和第二抗体之间针对相同抗原的竞争。或者，“竞争”也可以是指抗体与内源性配体之间竞争与内源性配体的相应受体的结合。如果抗体阻止内源性配体与其受体结合，则称这样的抗体阻断配体与其受体的内源性相互作用，并因此与内源性配体竞争。如何测试抗体与靶抗原的结合的竞争的本领域技术人员公知的。这样的方法的一个实例是所谓的交叉竞争测定，其可例如作为ELISA或通过流式细胞术进行。或者，可使用生物层干涉术来确定竞争。
竞争与靶抗原结合的抗体可结合抗原上的不同表位，其中表位彼此如此接近以至于与一个表位结合的第一抗体阻止了第二抗体与另一个表位的结合。然而，在另一些情况下，两种不同的抗体可结合抗原上的相同表位，并且会在竞争结合测定中竞争结合。这样的结合相同表位的抗体在本文中被认为具有相同的特异性。因此，在一个实施方案中，认为与相同表位结合的抗体与靶分子上的相同氨基酸结合。抗体与靶抗原上的相同表位结合可通过本领域技术人员已知的标准丙氨酸扫描实验或抗体-抗原结晶实验来确定。优选地，与不同表位结合的抗体或结合结构域不相互竞争与其各自表位的结合。
如上所述，本领域已经描述了多种形式的抗体。本发明的结合剂原则上可包含任何同种型的抗体。同种型的选择通常通过期望的Fc介导的效应功能来指导，例如ADCC诱导，或对缺乏Fc介导的效应功能的抗体(“惰性”抗体)的要求。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可使用人轻链恒定区，κ或λ中任一者。本发明的抗体的效应功能可通过同种型转换为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体而改变以用于多种治疗用途。在一个实施方案中，本发明抗体的两条重链都是IgG1同种型，例如IgG1，κ。任选地，重链可在铰链区和/或CH3区进行修饰，如本文中别处所述。
优选地，每个抗原结合区或结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中所述可变区各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3，以及四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4。此外，优选地，抗体包含两个重链恒定区(CH)和两个轻链恒定区(CL)。
在一个实施方案中，结合剂包含全长抗体，例如全长IgG1抗体。
在另一个实施方案中，结合剂包含抗体片段，例如Fab'或Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，如WO2007059782(Genmab)中所述的单价抗体，F(ab')2片段，Fd片段，Fv片段，dAb片段，骆驼科或纳米抗体，或者分离的互补决定区(CDR)。
本发明上下文中的术语“结合剂”是指能够与期望抗原结合的任何物质。在本发明的某些实施方案中，结合剂是以下或包含以下：抗体、抗体片段或任何其他结合蛋白或者其任何组合。
本发明上下文中的术语“结合部分”是指能够与期望抗原结合的任何部分、基团或结构域。在本发明的某些实施方案中，结合部分是以下或包含以下：抗体、抗体片段或任何其他结合蛋白或者其任何组合。
核酸
本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸”旨在包含DNA和RNA，例如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包含体外转录的RNA(in vitro transcribed RNA，IVT RNA)或合成的RNA。根据本发明，多核苷酸优选地是分离的。
核酸可包含在载体中。本文中使用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，其包括质粒载体、黏粒载体、噬菌体载体(例如λ噬菌体)、病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒或杆状病毒载体)，或人工染色体载体(例如细菌人工染色体(bacterial artificialchromosome，BAC)、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)或P1人工染色体(P1 artificial chromosome，PAC))。所述载体包含表达载体以及克隆载体。表达载体包含质粒以及病毒载体并且一般包含期望编码序列和用于在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)中或在体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的合适的DNA序列。克隆载体一般用于改造和扩增特定的期望DNA片段，并可缺乏表达所期望DNA片段所需要的功能性序列。
在本发明所有方面的一个实施方案中，本文中所述的编码活化化合物的RNA在经处理以提供活化化合物的对象细胞中表达。如果活化化合物包含多于一条多肽链，则不同的多肽链可以由相同或不同的RNA分子编码。
在本发明所有方面的一个实施方案中，本文中所述的编码对接化合物的RNA在经处理对象的细胞中表达以提供对接化合物。如果对接化合物包含多于一条多肽链，则不同的多肽链可由相同或不同的RNA分子编码。
本文中所述的核酸可以是重组和/或分离的分子。
在本公开内容中，术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。本文中使用的“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'-位具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的RNA之经修饰RNA。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或RNA的末端。本文中还考虑了RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的RNA被认为是天然存在RNA的类似物。
在本公开内容的某些实施方案中，RNA是信使RNA(messenger RNA，mRNA)，其涉及编码肽或蛋白质的RNA转录物。如本领域中认可的，mRNA通常包含5'非翻译区(5'untranslated region，5'-UTR)、肽编码区和3'非翻译区(3'untranslated region，3'-UTR)。在一些实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mRNA通过使用DNA模板进行体外转录产生，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
在一个实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是cDNA并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的反转录获得。
在本公开内容的某些实施方案中，RNA是“复制子RNA”或简称为“复制子”，特别是“自复制RNA”或“自扩增RNA”。在一个特别优选的实施方案中，复制子或自复制RNA来源于或包含这样的元件，该元件来源于ssRNA病毒，特别是正链ssRNA病毒(例如甲病毒)。甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒在受感染细胞的胞质中复制(对于甲病毒生命周期的综述，参见Joséet al.,Future Microbiol.,2009,第4卷,第837至856页)。许多甲病毒的总基因组长度通常为11,000至12,000个核苷酸，并且基因组RNA通常具有5'帽和3'poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白质修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(open reading frame，ORF)。四种非结构蛋白(nsP1至nsP4)通常由在基因组5'端附近开始的第一ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由存在于第一ORF下游并延伸到基因组3'端附近的第二ORF一起编码。通常来说，第一ORF大于第二ORF，比例为约2:1。在被甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，所述亚基因组转录物是类似于真核信使RNA(mRNA)的RNA分子(Gould et al.,2010,Antiviral Res.,第87卷第111至124页)。在感染之后，即在病毒生命周期的早期，(+)链基因组RNA直接充当信使RNA用于翻译编码非结构多蛋白(nsP1234)的开放阅读框。已提出了将甲病毒来源的载体用于将外来遗传信息递送到靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，将编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框替换为编码目的蛋白质的开放阅读框。基于甲病毒的反式复制系统依赖于以下两个分开的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，并且另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此称为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许通过甲病毒复制酶进行识别和RNA合成。
在一个实施方案中，本文中所述的RNA可具有经修饰核苷。在一些实施方案中，RNA包含代替至少一个(例如，每个)尿苷的经修饰核苷。
本文中使用的术语“尿嘧啶”描述了可存在于RNA的核酸中的核碱基之一。尿嘧啶的结构是：
本文中使用的术语“尿苷”描述了可存在于RNA中的核苷之一。尿苷的结构是：
UTP(5'-三磷酸尿苷)具有以下结构：
假-UTP(5’-三磷酸假尿苷)具有以下结构：
“假尿苷”是经修饰核苷的一个实例，其是尿苷的异构体，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键与戊糖环连接。
另一示例性的经修饰核苷是N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)，其具有以下结构：
N1-甲基-假-UTP具有以下结构：
另一示例性的经修饰核苷为5-甲基-尿苷(m5U)，其具有以下结构：
在一些实施方案中，本文中所述的RNA中的一个或更多个尿苷被经修饰核苷替代。在一些实施方案中，经修饰核苷是经修饰尿苷。
在一些实施方案中，RNA包含代替至少一个尿苷的经修饰核苷。在一些实施方案中，RNA包含代替每个尿苷的经修饰核苷。
在一些实施方案中，经修饰核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(Ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，RNA可包含多于一种类型的经修饰核苷，并且经修饰核苷独立地选自假尿苷(Ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(Ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，经修饰核苷包含假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，替代RNA中的一个或更多个(例如，所有)尿苷的经修饰核苷可以是以下中的任意一种或更多种：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷或本领域中已知的任何其他经修饰尿苷。
在一个实施方案中，RNA包含另一些经修饰核苷或包含其他经修饰核苷，例如经修饰胞苷。例如，在一个实施方案中，在RNA中，5-甲基胞苷被胞苷部分或完全地，优选完全地取代。在一个实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷和选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲基尿苷(m5U)中的一个或更多个。在一个实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷和N1-甲基假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，RNA包含取代每个胞苷的5-甲基胞苷和取代每个尿苷的N1-甲基假尿苷(m1ψ)。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-帽。在一个实施方案中，本公开内容的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。在一个实施方案中，RNA可被5’-帽类似物修饰。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’-端的结构，并且通常由通过5’至5’三磷酸键联与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位处被甲基化。提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA可通过体外转录来实现，其中5’-帽共转录表达到RNA链中，或者可使用加帽酶与RNA进行转录后连接。
在一些实施方案中，RNA的构件单元帽为m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG(有时也称为m2 7,3` OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG)，其具有以下结构：
以下是示例性的帽1RNA，其包含RNA和m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG：
以下是另一示例性Cap1 RNA(无帽类似物)：
在一些实施方案中，使用“帽0”结构修饰RNA，所述“帽0”结构在一个实施方案中使用了具有以下结构的帽类似物反逆转帽(analog anti-reverse cap，ARCA帽(m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G))：
以下是包含RNA和m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G的一个示例性帽0RNA：
在一些实施方案中，使用具有以下结构的帽类似物β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)产生“帽0”结构：
以下是包含β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)和RNA的一个示例性帽0RNA：
β-S-ARCA或“β-S-ARCA(D1)”的“D1”非对映体是β-S-ARCA的非对映体，其与β-S-ARCA的D2非对映体(β-S-ARCA(D2)相比，首先在HPLC柱上洗脱，并且因此表现出更短的保留时间(参见WO 2011/015347，通过引用并入本文)。
一个特别优选的帽是β-S-ARCA(D1)(m2 7,2’-OGppSpG)或m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-UTR和/或3’-UTR。术语“非翻译区”或”UTR”涉及DNA分子中被转录但不被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’-UTR)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’-UTR)。5’-UTR(如果存在的话)位于5’端，在蛋白质编码区的起始密码子的上游。5’-UTR位于5’-帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽相邻。3’-UTR(如果存在的话)位于3’端，在蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3’-UTR”优选不包含poly(A)序列。因此，3’-UTR位于poly(A)序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly(A)序列相邻。
在一些实施方案中，RNA包含5’-UTR，该5’-UTR包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNA包含3’-UTR，该3’-UTR包含SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列或者与SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
一个特别优选的5’-UTR包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。一个特别优选的3’-UTR包含SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含3’-poly(A)序列。
本文中使用的术语“poly(A)序列”或“poly-A尾”是指通常位于RNA分子的3’端的腺苷酸残基的不间断或间断的序列。poly(A)序列是本领域技术人员已知的，并且可在本文中所述RNA中的3’-UTR之后。不间断的poly(A)序列的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly(A)序列是典型的。本文中公开的RNA可具有在转录之后通过模板非依赖性RNA聚合酶与RNA的游离3’端连接的poly(A)序列或由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的poly(A)序列。
已经表明，约120个A核苷酸的poly(A)序列对转染的真核细胞中的RNA水平以及从存在于poly(A)序列的上游(5’)的开放阅读框翻译的蛋白质水平具有有益影响(Holtkampet al.,2006,Blood,第108卷,第4009页至4017页)。
poly(A)序列可以是任何长度的。在一些实施方案中，poly(A)序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个或多至150个A核苷酸，并且特别是约120个A核苷酸。在本上下文中，“基本上由……组成”意指poly(A)序列中的大多数核苷酸，通常按poly(A)序列中核苷酸的数目计至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是A核苷酸，但允许其余核苷酸是除A核苷酸之外的核苷酸，例如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在本上下文中，“由……组成”意指poly(A)序列中的所有核苷酸，即按poly(A)序列中核苷酸的数目计100％是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。
在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录期间，例如在制备体外转录的RNA期间，连接poly(A)序列。编码poly(A)序列的DNA序列(编码链)被称为poly(A)盒。
在一些实施方案中，存在于DNA编码链中的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但被四种核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。这样的盒公开于WO 2016/005324 A1中，其在此通过引用并入。WO2016/005324 A1中公开的任何poly(A)盒均可用于本发明。涵盖以下：基本上由dA核苷酸组成但被具有均等分布的四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)并且长度为例如5至50个核苷酸的随机序列中断的poly(A)盒显示，在DNA水平上质粒DNA在大肠杆菌(E.coli)中的恒定增殖，而在RNA水平上仍与对于支持RNA稳定性和翻译效率的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文中所述的RNA分子中包含的poly(A)序列基本上由A核苷酸组成，但是被四种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可为5至50、10至30或10至20个核苷酸。
在一些实施方案中，除A核苷酸之外无核苷酸在其3’端侧接有poly-A尾，即，poly(A)序列在其3’端未被除A之外的核苷酸掩蔽或跟随。
在一些实施方案中，poly(A)序列可包含至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列可基本上由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列可由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约120个核苷酸。
在一些实施方案中，RNA包含poly(A)序列，所述poly(A)序列包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列或者与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
一个特别优选的poly(A)序列包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列
根据本公开内容，将活化化合物优选作为单链5’加帽mRNA施用，该mRNA在进入被施用所述RNA的对象的细胞时被翻译成相应的蛋白质。优选地，RNA包含针对RNA在稳定性和翻译效率方面的最大效力而优化的结构元件(5’-帽、5’-UTR、3’-UTR、poly(A)序列)。
根据本公开内容，将对接化合物优选作为单链5’-加帽mRNA施用，该mRNA在进入被施用所述RNA的对象的细胞时被翻译成相应的蛋白质。优选地，RNA包含针对RNA在稳定性和翻译效率方面的最大效力而优化的结构元件(5’-帽、5’-UTR、3’-UTR、poly(A)序列)。
在一个实施方案中，β-S-ARCA(D1)被用作RNA 5’端的特定加帽结构。在一个实施方案中，m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG被用作RNA 5’端的特定加帽结构。在一个实施方案中，5’-UTR序列来源于人α-珠蛋白mRNA并且任选地具有针对提高翻译效率而优化的“Kozak序列”。在一个实施方案中，将来源于“分裂的氨基端增强子”(amino terminal enhancer ofsplit，AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两个序列元件(FI元件)的组合置于编码序列和poly(A)序列之间，以确保更高的最大蛋白质水平和mRNA的延长的持久性。这些是通过对赋予RNA稳定性和增强总蛋白表达的序列进行离体选择过程来确定的(参见WO 2017/060314，通过引用并入本文)。在一个实施方案中，将来源于人β-珠蛋白mRNA的两个重复的3’-UTR置于编码序列和poly(A)序列之间，以确保更高的最大蛋白质水平和mRNA的延长的持久性。在一个实施方案中，使用测量长度为110个核苷酸的poly(A)序列，其由以下组成：30个腺苷残基的区段，随后是10核苷酸接头序列和另外70个腺苷残基。这种poly(A)序列被设计用于增强RNA稳定性和翻译效率。
在本发明所有方面的一个实施方案中，编码活化化合物的RNA在经处理以提供活化化合物的对象的细胞中表达。在本发明所有方面的一个实施方案中，RNA在对象的细胞中瞬时表达。在本发明所有方面的一个实施方案中，RNA是体外转录的RNA。在本发明所有方面的一个实施方案中，活化化合物的表达是在细胞表面，即，活化化合物保持与细胞缔合。
在本发明所有方面的一个实施方案中，编码对接化合物的RNA在经处理对象的细胞中表达以提供对接化合物。在本发明所有方面的一个实施方案中，RNA在对象的细胞中瞬时表达。在本发明所有方面的一个实施方案中，RNA是体外转录的RNA。在本发明所有方面的一个实施方案中，对接化合物的表达进入胞外空间，即，对接化合物是经分泌的。
在本公开内容的背景下，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码被转录成RNA的过程。随后，RNA可翻译成肽或蛋白质。
根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中RNA特别是mRNA在无细胞系统中体外合成的过程，该过程优选地使用适当的细胞提取物。优选地，将克隆载体应用于转录物的产生。这些克隆载体通常被称为转录载体，并且根据本发明被术语“载体”涵盖。根据本发明，本发明中使用的RNA优选为体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可通过体外转录合适的DNA模板获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6RNA聚合酶。优选地，根据本发明的体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入到合适的载体中以用于体外转录来获得。cDNA可通过对RNA进行逆转录来获得。
关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及在细胞的核糖体中的这样的过程，通过该过程mRNA的链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白质。
在一个实施方案中，在施用本文中所述的RNA(例如，配制为RNA脂质颗粒)之后，至少一部分RNA被递送至细胞以用于表达。在一个实施方案中，至少一部分RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA被靶细胞翻译以产生其编码的肽或蛋白质。
“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的用作合成生物过程中的其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和由其产生的生物学特性。因此，如果与该基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA转录模板的非编码链二者均可称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
在一个实施方案中，根据本发明待施用的编码活化化合物的RNA是非免疫原性的。
在一个实施方案中，待施用的编码对接化合物的RNA根据本发明是非免疫原性的。
本文中使用的术语“非免疫原性RNA”是指在向例如哺乳动物施用时不诱导通过免疫系统的应答的RNA，或比由相同RNA(不同之处仅在于其没有经受使非免疫原性RNA无免疫原性的修饰和处理)诱导，即比由标准RNA(standard RNA，stdRNA)诱导的应答更弱的应答的RNA。在一个优选的实施方案中，通过将抑制RNA介导的先天免疫受体激活的经修饰核苷并入到RNA中并除去双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)使非免疫原性RNA(本文中也称为经修饰RNA(modified RNA，modRNA))无免疫原性。
为了通过并入经修饰核苷使非免疫原性RNA无免疫原性，可使用任何经修饰核苷，只要其降低或抑制RNA的免疫原性即可。特别优选的是抑制RNA介导的先天免疫受体激活的经修饰核苷。在一个实施方案中，经修饰核苷包含用包含经修饰核碱基的核苷对一个或更多个尿苷的替代。在一个实施方案中，经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。在一个实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。在一个特别优选的实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)，特别是N1-甲基-假尿苷。
在一个实施方案中，用包含经修饰核碱基的核苷对一个或更多个尿苷的替代包括替代至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。
在使用T7 RNA聚合酶通过体外转录(in vitro transcription，IVT)合成mRNA期间，由于该酶的非常规活性，产生了显著量的异常产物，包括双链RNA(dsRNA)。dsRNA诱导炎性细胞因子并活化效应酶，导致蛋白质合成抑制。可例如通过使用无孔或多孔C-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(polystyrene-divinylbenzene，PS-DVB)基质的离子对反相HPLC从RNA例如IVT RNA中除去dsRNA。或者，可使用使用特异性水解dsRNA而不是ssRNA的大肠杆菌核糖核酸酶III的基于酶促的方法，从而从IVT RNA制剂中消除dsRNA污染物。此外，可通过使用纤维素材料将dsRNA与ssRNA分离。在一个实施方案中，使RNA制剂与纤维素材料接触，并且在允许dsRNA与纤维素材料结合而不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件下将ssRNA与纤维素材料分离。
本文中使用的术语“去除”或“除去”是指第一物质群(例如非免疫原性RNA)与紧邻的第二物质群(例如dsRNA)分离的特征，其中第一物质群不一定不含第二物质，并且第二物质群不一定不含第一物质。然而，与第一和第二物质的未分离混合物相比，以除去第二物质群为特征的第一物质群具有可测量的更低含量的第二物质。
在一个实施方案中，从非免疫原性RNA中去除dsRNA包括去除dsRNA，使得非免疫原性RNA组合物中小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.3％或小于0.1％的RNA是dsRNA。在一个实施方案中，非免疫原性RNA不含或基本上不含dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA组合物包含单链核苷经修饰RNA的经纯化制剂。例如，在一些实施方案中，单链核苷经修饰RNA的经纯化制剂基本上不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，相对于所有其他核酸分子(DNA、dsRNA等)，经纯化制剂是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％单链核苷经修饰RNA。
在一个实施方案中，非免疫原性RNA比具有相同序列的标准RNA在细胞中更有效地翻译。在一个实施方案中，翻译相对于其未经修饰对应物增强了2倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了3倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了4倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了5倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了6倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了7倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了8倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了9倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了10倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了15倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了20倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了50倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了100倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了200倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了500倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了1000倍因数。在一个实施方案中，翻译增强了2000倍因数。在一个实施方案中，因数是10至1000倍。在一个实施方案中，因子是10至100倍。在一个实施方案中，因数是10至200倍。在一个实施方案中，因数是10至300倍。在一个实施方案中，因数是10至500倍。在一个实施方案中，因数是20至1000倍。在一个实施方案中，因数是30至1000倍。在一个实施方案中，因数是50至1000倍。在一个实施方案中，因数是100至1000倍。在一个实施方案中，因数是200至1000倍。在一个实施方案中，翻译增强了任何其他显著量或量的范围。
在一个实施方案中，非免疫原性RNA表现出比具有相同序列的标准RNA显著更低的先天免疫原性。在一个实施方案中，非免疫原性RNA表现出比其未经修饰对应物低2倍的先天免疫应答。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了3倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了4倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了5倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了6倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了7倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了8倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了9倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了10倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了15倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了20倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了50倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了100倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了200倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了500倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了1000倍因数。在一个实施方案中，先天免疫原性降低了2000倍因数。
术语“表现出显著较低的先天免疫原性”是指可检出的先天免疫原性降低。在一个实施方案中，该术语是指这样的降低，使得可施用有效量的非免疫原性RNA而不引发可检出的先天免疫应答。在一个实施方案中，该术语是指这样的降低，使得可重复施用非免疫原性RNA而不引发足以可检出地降低蛋白质(由非免疫原性RNA编码)的产生的先天免疫应答。在一个实施方案中，降低使得可重复施用非免疫原性RNA而不引发足以消除可检出的蛋白质(由非免疫原性RNA编码)的产生的先天免疫应答。
“免疫原性”是外来物质(例如RNA)在人或其他动物体内引发免疫应答的能力。先天免疫系统是免疫系统中相对非特异性和即时性的组分。它是脊椎动物免疫系统以及适应性免疫系统的两个主要组分之一。
本文中使用的“内源性”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。
本文中使用的术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
本文中使用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
本文中使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合/融合体”可互换使用。这些术语是指将两个或更多个要素或组分或结构域连接在一起。
密码子优化/G/C含量提高
在一些实施方案中，本文中所述的活化化合物的氨基酸序列和/或本文中所述的对接化合物的氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或G/C含量提高的编码序列编码。这还包括这样的实施方案，其中与野生型编码序列的相应序列区相比，编码序列的一个或更多个序列区是密码子优化和/或G/C含量提高的。在一个实施方案中，密码子优化和/或G/C含量提高优选不改变编码的氨基酸序列的序列。
术语“密码子优化的”是指改变核酸分子的编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子选用而不优选改变由核酸分子编码的氨基酸序列。在本发明的上下文中，编码区优选是密码子优化的以用于在使用本文中所述的RNA分子待处理的对象中的最佳表达。密码子优化基于这样的发现，即翻译效率也由细胞中tRNA出现的不同频率决定。因此，可修饰RNA的序列，使得对频繁出现的tRNA可用的密码子代替“稀有密码子”被插入。
在本发明的一些实施方案中，与野生型RNA的相应编码序列的G/C含量相比，本文中所述RNA的编码区的鸟苷/胞嘧啶(guanosine/cytosine，G/C)含量提高，其中由所述RNA编码的氨基酸序列与由野生型RNA编码的氨基酸序列相比优选地不是经修饰的。RNA序列的这种修饰基于以下事实：待翻译的任何RNA区域的序列对于该mRNA的有效翻译是重要的。具有提高的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有提高的A(adenosine)(腺苷)/U(uracil)(尿嘧啶)含量的序列更稳定。关于数个密码子编码一个且是同一个氨基酸(所谓的遗传密码简并)的事实，可确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子选用)。取决于待由RNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比，存在修饰RNA序列的多种可能性。特别地，包含A和/或U核苷酸的密码子可通过用其他密码子替换这些密码子来修饰，所述其他密码子编码相同的氨基酸但不含A和/或U核苷酸或者包含较低含量的A和/或U核苷酸。
在多个实施方案中，本文中所述RNA的编码区的G/C含量与野生型RNA的编码区的G/C含量相比提高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。
包含核酸的颗粒
可将本文中所述的核酸例如编码活化化合物的RNA和/或编码对接化合物的RNA配制为颗粒施用。
在本公开内容的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如分散在介质中的微米或纳米尺寸的密实结构。在一个实施方案中，颗粒是包含核酸的颗粒，例如包含DNA、RNA或其混合物的颗粒。
带正电荷的分子(例如聚合物和脂质)与带负电荷的核酸之间的静电相互作用参与颗粒形成。这导致核酸颗粒的复合和自发形成。在一个实施方案中，核酸颗粒是纳米粒。
本公开内容中使用的“纳米粒”是指具有适合于肠胃外施用的平均直径的颗粒。
“核酸颗粒”可用于将核酸递送至目的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。核酸颗粒可由至少一种阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质、至少一种阳离子聚合物例如鱼精蛋白或其混合物以及核酸形成。核酸颗粒包括基于脂质纳米粒(lipidnanoparticle，LNP)的制剂和基于脂质复合物(lipoplex，LPX)的制剂。
不旨在受任何理论的束缚，认为阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质和/或阳离子聚合物与核酸结合在一起形成聚集体，并且这种聚集产生胶体稳定的颗粒。
在一个实施方案中，本文中所述的颗粒还包含至少一种除阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质之外的脂质或类脂质物质、至少一种除阳离子聚合物之外的聚合物，或其混合物。
在一些实施方案中，核酸颗粒包含多于一种类型的核酸分子，其中核酸分子的分子参数可彼此类似或不同，如关于摩尔质量或基本结构要素，例如分子结构、加帽、编码区或其他特征。
本文中所述的核酸颗粒可具有在一个实施方案中为约30nm至约1000nm、约50nm至约800nm、约70nm至约600nm、约90nm至约400nm、或约100nm至约300nm的平均直径。
本文中所述的核酸颗粒可显示出小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、或约0.2或更小的多分散指数。举例来说，核酸颗粒可表现出约0.1至约0.3或约0.2至约0.3的多分散指数。
关于RNA脂质颗粒，N/P比给出脂质中氮基团与RNA中磷酸基团数目的比率。它与电荷比相关，因为氮原子(取决于pH)通常带正电荷并且磷酸基团带负电荷。在存在电荷平衡的情况下，N/P比取决于pH。脂质制剂通常以大于4至12的N/P比形成，因为带正电荷的纳米粒被认为有利于转染。在那种情况下，RNA被认为与纳米粒完全结合。
本文中所述的核酸颗粒可使用广泛多种方法制备，所述方法可包括从至少一种阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质和/或者至少一种阳离子聚合物获得胶体，并将该胶体与核酸混合以获得核酸颗粒。
本文中使用的术语“胶体”涉及一种类型的均匀混合物，其中分散的颗粒不沉降。混合物中的不溶性颗粒是微观的，粒径为1至1000纳米。该混合物可称为胶体或胶体混悬液。有时，术语“胶体”仅指混合物中的颗粒，而不是整个混悬液。
对于包含至少一种阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质和/或者至少一种阳离子聚合物的胶体的制备，在本文中可应用的方法是通常用于制备脂质体囊泡并适当地进行调整的方法。用于制备脂质体囊泡的最常用的方法具有以下基本阶段：(i)在有机溶剂中脂质的溶解，(ii)所得溶液的干燥，和(iii)经干燥脂质的水合(使用多种水性介质)。
在膜水合法中，首先将脂质溶解在合适的有机溶剂中，然后完全干燥(dry down)以在烧瓶底部产生薄膜。使用适当的水性介质将获得的脂质膜水合以产生脂质体分散体。此外，可包括另外的缩减(downsizing)步骤。
反相蒸发是用于制备脂质体囊泡的膜水合的替代方法，其涉及在水相和包含脂质的有机相之间形成油包水乳液。体系均质化需要对该混合物进行简短的声处理。在减压下除去有机相产生乳状凝胶，其随后变成脂质体混悬液。
术语“乙醇注射技术”是指这样的方法，其中将包含脂质的乙醇溶液通过针快速注射到水溶液中。该反应将脂质散布在整个溶液中并促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成，例如脂质体形成。一般地，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒可通过将RNA添加至胶体脂质体分散体而获得。在一个实施方案中，使用乙醇注射技术，这样的胶体脂质体分散体如下形成：在搅拌下将包含脂质例如阳离子脂质和另外的脂质的乙醇溶液注射到水溶液中。在一个实施方案中，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒可在没有挤出步骤的情况下获得。
术语“挤出”或其变化形式是指产生具有固定的横截面轮廓的颗粒。特别地，它是指将颗粒的尺寸减小，由此迫使颗粒通过具有限定孔的过滤器。
根据本公开内容，也可使用具有无有机溶剂特征的其他方法来制备胶体。
LNP通常包含四种组分：可电离的阳离子脂质、中性脂质(例如磷脂)、类固醇(例如胆固醇)和聚合物缀合的脂质(例如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)-脂质)。每种组分都负责载荷保护，并实现有效的胞内递送。可通过将溶解在乙醇中的脂质与核酸在水性缓冲液中迅速混合来制备LNP。
术语“平均直径”是指如通过动态激光光散射(DLS)以及使用所谓的累积量算法(cumulant algorithm)进行数据分析而测量的颗粒的平均流体动力学直径，所述累积量算法的结果是提供具有长度维度的所谓的Z平均值和无量纲的多分散性指数(PI)(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,pp4814-4820,ISO 13321)。在此，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与Z平均值的该值同义使用。
“多分散性指数”优选基于动态光散射测量值通过如在“平均直径”的定义中提及的所谓的累积量分析来计算。在某些先决条件下，可将其作为对纳米粒系综(ensemble)的尺寸分布的量度(measure)。
先前已描述了不同类型的包含核酸的颗粒适合于以颗粒形式递送核酸(例如，Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒核酸递送载剂，核酸的纳米粒包封物理地保护核酸免于降解并且，根据特定的化学性质，可协助细胞摄取和内体逃逸。
本公开内容描述了包含核酸和与核酸缔合以形成核酸颗粒的至少一种阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质和/或者至少一种阳离子聚合物以及包含这样的颗粒的组合物。核酸颗粒可包含通过非共价相互作用以不同形式与颗粒复合的核酸。本文中所述的颗粒不是病毒颗粒，特别不是感染性病毒颗粒，即它们不能病毒性地感染细胞。
合适的阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质和阳离子聚合物是形成核酸颗粒的那些，并且包括在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”中。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与核酸缔合以形成核酸颗粒的任何组分。这样的组分包括可以是核酸颗粒的一部分的任何组分。
阳离子聚合物
鉴于聚合物的高度化学柔性，其是用于基于纳米粒的递送的常用物质。通常来说，阳离子聚合物用于将带负电荷的核酸静电凝聚成纳米粒。这些带正电荷的基团通常由胺组成，所述胺在5.5至7.5的pH范围内改变其质子化状态，被认为导致离子失衡从而导致内体破裂。聚合物例如聚-L-赖氨酸、聚酰胺-胺、鱼精蛋白和聚乙烯亚胺以及天然存在的聚合物例如壳聚糖均已应用于核酸递送并且适合作为本文中的阳离子聚合物。另外，一些调查人员已合成了专门用于核酸递送的聚合物。特别地，聚(β-氨基酯)由于其易于合成和生物可降解性而在核酸递送中获得了广泛的应用。这样的合成聚合物也适合作为本文中的阳离子聚合物。
本文中使用的“聚合物”具有其通常的含义，即包含通过共价键连接的一个或更多个重复单元(单体)的分子结构。重复单元可全部相同，或者在一些情况下，聚合物内可存在多于一种类型的重复单元。在一些情况下，聚合物是生物来源的，即生物聚合物(例如蛋白质)。在一些情况下，聚合物中也可存在另外的部分，例如靶向部分，例如本文中所述的那些。
如果聚合物内存在多于一种类型的重复单元，则该聚合物被称为“共聚物”。应理解，本文中所使用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以以任何方式排列。例如，重复单元可以以随机顺序、以交替顺序排列或者作为“嵌段”共聚物，即包含每个均包含第一重复单元的一个或更多个区域(例如，第一嵌段)，和每个均包含第二重复单元的一个或更多个区域(例如，第二嵌段)，等。嵌段共聚物可具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数目的不同嵌段。
在某些实施方案中，聚合物是生物相容性的。生物相容性聚合物是在中等浓度下通常不导致显著细胞死亡的聚合物。在某些实施方案中，生物相容性聚合物是生物可降解的，即该聚合物能够在生理环境内(例如体内)化学和/或生物地降解。
在某些实施方案中，聚合物可以是鱼精蛋白或聚亚烷基亚胺，特别是鱼精蛋白。
术语“鱼精蛋白”是指多种相对低分子量的强碱性蛋白质中的任一种，其富含精氨酸并且被发现特别是与DNA缔合以代替不同动物(例如鱼)的精细胞中的体细胞组蛋白。特别地，术语“鱼精蛋白”是指存在于鱼精液中的蛋白质，其是强碱性的，可溶于水，不被热凝结并且在水解之后主要产生精氨酸。以纯化的形式，其用于胰岛素的长效制剂并且用于中和肝素的抗凝作用。
根据本公开内容，本文中使用的术语“鱼精蛋白”意指包含获自或来源于天然或生物学来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列包括其片段和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式以及(合成的)多肽，所述多肽是人工的并且是为特定目的而专门设计的，并且不能从天然或生物学来源中分离。
在一个实施方案中，聚亚烷基亚胺包括聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)。PEI的平均分子量优选为0.75·102至107Da，优选1000至105Da，更优选10000至40000Da，更优选15000至30000Da，甚至更优选20000至25000Da。
根据本公开内容优选的是线性聚亚烷基亚胺，例如线性聚乙烯亚胺(PEI)。
考虑在本文中使用的阳离子聚合物(包括聚阳离子聚合物)包括能够静电结合核酸的任何阳离子聚合物。在一个实施方案中，考虑在本文中使用的阳离子聚合物包括可与核酸缔合(例如通过与核酸形成复合物或者形成其中围住(enclose)或包封核酸的囊泡)的任何阳离子聚合物。
本文中所述的颗粒还可包含除阳离子聚合物之外的聚合物，即非阳离子聚合物和/或阴离子聚合物。阴离子聚合物和中性聚合物在本文中统称为非阳离子聚合物。
脂质和类脂质物质
术语“脂质”和“类脂质物质”在本文中被广泛定义为包含一个或更多个疏水部分或基团以及任选地还包含一个或更多个亲水部分或基团的分子。包含疏水部分和亲水部分的分子也经常被称为两亲体。脂质通常难溶于水。在水性环境中，两亲性质允许分子自组装成有组织的结构和不同的相。那些相之一由脂质双层组成，因为它们存在于囊泡、多层/单层脂质体或水性环境中的膜中。可通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基团以及被一个或更多个芳族、脂环族或杂环基团取代的这样的基团。亲水基团可包含极性和/或带电荷基团，并且包括碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他相似基团。
本文中使用的术语“两亲的”是指具有极性部分和非极性部分二者的分子。两亲化合物通常具有与长疏水尾连接的极性头。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。另外，极性部分可具有形式正电荷或形式负电荷。或者，极性部分可具有形式正电荷和负电荷二者，并且可以是两性离子或内盐。出于本公开内容的目的，两亲化合物可以是但不限于一种或更多种天然或非天然的脂质和类脂质化合物。
术语“类脂质物质”、“类脂质化合物”或“类脂质分子”涉及与脂质在结构上和/或功能上相关但在严格意义上不能视为脂质的物质。例如，该术语包括当其存在于囊泡、多层/单层脂质体或水性环境中的膜时能够形成两亲层的化合物，并且包括表面活性剂或具有亲水和疏水部分二者的合成化合物。一般而言，该术语是指这样的分子，其包含亲水和疏水部分，其具有可与或可不与脂质类似的不同结构组织。除非本文中另外指出或明显与上下文相矛盾，否则本文中使用的术语“脂质”应被解释为包括脂质和类脂质物质二者。
可包含在两亲层中的两亲化合物的一些具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。
在某些实施方案中，两亲化合物是脂质。术语“脂质”是指特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂的一组有机化合物。通常来说，脂质可分为八种类别：脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(来源于酮酯酰亚基的缩合)、固醇脂质和孕烯醇酮脂类(来源于异戊二烯亚基的缩合)。尽管有时将术语“脂质”用作脂肪的同义词，但脂肪是称为甘油三酯的脂质亚组。脂质还包括分子，例如脂肪酸类及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂)，以及包含固醇的代谢物，例如胆固醇。
脂肪酸或脂肪酸残基是一类不同的分子，其由以羧酸基团终止的烃链构成；这种排列赋予该分子以极性的亲水端和不溶于水的非极性疏水端。通常长为4至24个碳的碳链可以是饱和的或不饱和的，并且可与包含氧、卤素、氮和硫的官能团连接。如果脂肪酸包含双键，则可能出现顺式或反式几何异构，这显著影响分子构型。顺式双键导致脂肪酸链弯曲，这是与链中的更多双键复合的作用。脂肪酸类别中的其他主要脂质种类是脂肪酯和脂肪酰胺。
甘油脂质由单取代甘油、双取代甘油和三取代甘油构成，最著名的是甘油脂肪酸三酯，称为甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基通常各自被不同的脂肪酸酯化。另外的甘油脂质亚类以糖基甘油为代表，其特征在于存在通过糖苷键联与甘油连接的一个或更多个糖残基。
甘油磷脂是两亲分子(包含疏水区和亲水区二者)，其包含通过酯键联与两个脂肪酸来源的“尾”连接并且通过磷酸酯键联与一个“头”基连接的甘油核心。甘油磷脂(通常称为磷脂(尽管鞘磷脂也被归类为磷脂))的一些实例是磷脂酰胆碱(也称为PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。
鞘脂是享有共同的结构特征-鞘氨醇碱(sphingoid base)骨架的复杂的化合物家族。哺乳动物中主要的鞘氨醇碱通常被称为鞘氨醇。神经酰胺(N-酰基-鞘氨醇碱)是鞘氨醇碱衍生物的具有酰胺连接脂肪酸的一个主要亚类。脂肪酸通常是饱和的或单不饱和的，链长度为16至26个碳原子。哺乳动物的主要鞘磷酸脂(phosphosphingolipid)是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要包含神经酰胺磷酸乙醇胺并且真菌具有植物神经酰胺磷酸肌醇和含甘露糖的头基。鞘糖脂是由通过糖苷键与鞘氨醇碱连接的一个或更多个糖残基构成的不同分子家族。这些中的一些实例是简单和复杂的鞘糖脂，例如脑苷脂和神经节苷脂。
固醇脂质(例如胆固醇及其衍生物或者生育酚及其衍生物)与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。
糖脂描述的是其中脂肪酸与糖骨架直接连接从而形成与膜双层相容的结构的化合物。在糖脂中，单糖替代了存在于甘油脂质和甘油磷脂中的甘油骨架。最熟悉的糖脂是革兰氏阴性菌中脂多糖的脂质A组分的酰化葡糖胺前体。典型的脂质A分子是葡糖胺的二糖，其被多至七个脂肪酰基链衍生化。大肠杆菌中生长所需的最小脂多糖是Kdo2-脂质A，其为被两个3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖酸(Kdo)残基糖基化的葡糖胺六酰化二糖。
聚酮是通过经典酶以及与脂肪酸合酶共享机械特征的迭代和多模块酶通过乙酰基和丙酰基亚基的聚合而合成的。它们包含来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的大量次级代谢产物和天然产物，并且具有大的结构多样性。许多聚酮是其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或其他过程进一步修饰的环状分子。
根据本公开内容，脂质和类脂质物质可以是阳离子的、阴离子的或中性的。中性脂质或类脂质物质在选定的pH下以不带电荷或中性两性离子的形式存在。
阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质
本文中所述的核酸颗粒可包含至少一种阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质作为颗粒形成剂。考虑在本文中使用的阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质包括能够静电结合核酸的任何阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质。在一个实施方案中，考虑在本文中使用的阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质可与核酸缔合，例如通过与核酸形成复合物或者通过形成其中围住或包封核酸的囊泡。
本文中使用的“阳离子脂质”或“阳离子类脂质物质”是指具有净正电荷的脂质或类脂质物质。阳离子脂质或类脂质物质通过静电相互作用与带负电荷的核酸结合。通常来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如固醇、酰基链、二酰基链或更多个酰基的链，并且脂质的头基通常带有正电荷。
在某些实施方案中，阳离子脂质或类脂质物质仅在特定pH，特别是酸性pH下具有净正电荷，而在不同的优选更高的pH例如生理pH下，其优选地不具有净正电荷，优选地不具有电荷，即它是中性的。与在生理pH下保持阳离子的颗粒相比，认为这种可电离的行为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。
除非与情况相矛盾，否则出于本公开内容的目的，这样的“阳离子可电离的”脂质或类脂质物质包含在术语“阳离子脂质或类脂质物质”中。
在一个实施方案中，阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质包含头基，所述头基包含至少一个带正电荷或能够被质子化的氮原子(N)。
阳离子脂质的一些实例包括但不限于：1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)；N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(DODMA)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基氮(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)和2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9’,12’-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙胺(2,3-Dilinoleoyloxy-N,N-dimethylpropylamine，DLinDAP)、1,2-N,N’-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙胺/>(DMRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四烯基氧基)-1-溴化丙胺/>(GAP-DMORIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)-1-溴化丙胺/>(GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙胺/>(GAP-DMRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙胺/>(βAE-DMRIE)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙烷-1-胺/>(DOBAQ)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DMDAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、2,3-双(十二烷氧基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基丙烷-1-溴化铵(DLRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙烷-1-溴化铵/>(DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8’-((((2(二甲基氨基)乙基)硫基)羰基)氮烷二基)二辛酸酯(di((Z)-non-2-en-1-yl)8,8’-((((2(dimethylamino)ethyl)thio)carbonyl)azanediyl)dioctanoate，ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)丙烷-1-胺(DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙烷-1-胺(DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(lipidoid 98N12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(lipidoid C12-200)。
在一些实施方案中，阳离子脂质可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约100mol％、约20mol％至约100mol％、约30mol％至约100mol％、约40mol％至约100mol％、或约50mol％至约100mol％。
另外的脂质或类脂质物质
本文中所述的颗粒还可包含除阳离子的或阳离子可电离的脂质或类脂质物质之外的脂质或类脂质物质，即非阳离子脂质或类脂质物质(包括非阳离子可电离的脂质或类脂质物质)。阴离子的以及中性的脂质或类脂质物质在本文中统称为非阳离子脂质或类脂质物质。除可电离/阳离子脂质或类脂质物质之外，通过添加其他疏水部分(例如胆固醇和脂质)对核酸颗粒制剂进行优化可增强颗粒稳定性和核酸递送的效力。
可并入另外的脂质或类脂质物质，这可影响或可不影响核酸颗粒的总电荷。在某些实施方案中，另外的脂质或类脂质物质是非阳离子脂质或类脂质物质。非阳离子脂质可包含例如一种或更多种阴离子脂质和/或中性脂质。本文中使用的“阴离子脂质”是指在选定的pH下带负电荷的任何脂质。本文中使用的“中性脂质”是指在选定pH下以不带电荷或中性两性离子形式存在的多种脂质物质中的任一种。在一些优选实施方案中，所述另外的脂质包含以下中性脂质组分之一：(1)磷脂；(2)胆固醇或其衍生物；或者(3)磷脂与胆固醇或其衍生物的混合物。胆固醇衍生物的一些实例包括但不限于胆甾烷醇(cholestanol)、胆甾烷酮(cholestanone)、胆甾烯酮(cholestenone)、粪甾烷醇(coprostanol)、胆甾醇基-2’-羟乙基醚、胆甾醇基-4’-羟丁基醚、生育酚及其衍生物，及其混合物。
可使用的特定磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这样的磷脂特别是包括二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholine)，例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱(dipentadecanoylphosphatidylcholine)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dilauroylphosphatidylcholine)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine，DTPC)、二十四酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine，DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine，POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)和磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine，DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine，DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine，DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dilauroyl-phosphatidylethanolamine，DLPE)、二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(diphytanoyl-phosphatidylethanolamine，DPyPE)，以及具有不同疏水链的另外的磷脂酰乙醇胺脂质。
在某些优选实施方案中，另外的脂质是DSPC或DSPC和胆固醇。
在某些实施方案中，核酸颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。
在一个实施方案中，本文中所述的颗粒包含聚合物缀合的脂质，例如聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分二者的分子。聚乙二醇化脂质在本领域中是已知的。
不希望受到理论的束缚，与所述至少一种另外的脂质的量相比，所述至少一种阳离子脂质的量可影响重要的核酸颗粒特征，例如电荷、颗粒尺寸、稳定性、组织选择性和核酸的生物活性。因此，在一些实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、或约3:1至约1:1。
在一些实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质(例如，一种或更多种磷脂和/或胆固醇)可占颗粒中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约0mol％至约80mol％、约0mol％至约70mol％、约0mol％至约60mol％、或约0mol％至约50mol％。
脂质复合物颗粒
在本公开内容的某些实施方案中，本文中所述的RNA可存在于RNA脂质复合物颗粒中。
在本公开内容的上下文中，术语“RNA脂质复合物颗粒”涉及包含脂质(特别是阳离子脂质)和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质复合体颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可使用阳离子脂质(例如DOTMA)和另外的脂质(例如DOPE)合成。在一个实施方案中，RNA脂质复合体颗粒是纳米粒。
在某些实施方案中，RNA脂质复合体颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，并且另外的脂质是DOPE。
在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、或约3:1至约1:1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以为约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1、或约1:1。在一个示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约2:1。
在一个实施方案中，本文中所述的RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在一些具体实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm、或约1000nm。在一个实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中，RNA脂质复合体颗粒的平均直径为约400nm。
在肠胃外施用之后，特别是在静脉内施用之后，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒和包含RNA脂质复合物颗粒的组合物可用于将RNA递送至靶组织。可使用脂质体来制备RNA脂质复合物颗粒，所述脂质体可通过将脂质在乙醇中的溶液注射到水或合适的水相中而获得。在一个实施方案中，水相具有酸性pH。在一个实施方案中，水相以例如约5mM的量包含乙酸。脂质体可用于通过将脂质体与RNA混合来制备RNA脂质复合物颗粒。在一个实施方案中，脂质体和RNA脂质复合物颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)。在一个实施方案中，所述至少一种另外的脂质包含1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(cholesterol，Chol)和/或1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)并且所述至少一种另外的脂质包含1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一个实施方案中，脂质体和RNA脂质复合物颗粒包含1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
脂质纳米粒(LNP)
在一个实施方案中，本文中所述的核酸(例如RNA)以脂质纳米粒(LNP)的形式施用。LNP可包含能够形成与一个或更多个核酸分子连接或者其中包封一个或更多个核酸分子的颗粒的任何脂质。
在一个实施方案中，LNP包含一种或更多种阳离子脂质和一种或更多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。
在一个实施方案中，LNP包含阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质；和RNA，其包封在脂质纳米粒内或与脂质纳米粒缔合。
在一个实施方案中，LNP包含40mol％至55mol％、40mol％至50mol％、41mol％至49mol％、41mol％至48mol％、42mol％至48mol％、43mol％至48mol％、44mol％至48mol％、45mol％至48mol％、46mol％至48mol％、47mol％至48mol％或47.2mol％至47.8mol％的阳离子脂质。在一个实施方案中，LNP包含约47.0mol％、47.1mol％、47.2mol％、47.3mol％、47.4mol％、47.5mol％、47.6mol％、47.7mol％、47.8mol％、47.9或48.0mol％的阳离子脂质。
在一个实施方案中，中性脂质以5mol％至15mol％、7mol％至13mol％或9mol％至11mol％的浓度存在。在一个实施方案中，中性脂质以约9.5mol％、10mol％或10.5mol％的浓度存在。
在一个实施方案中，类固醇以30mol％至50mol％、35mol％至45mol％或38mol％至43mol％的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以约40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％或46mol％的浓度存在。
在一个实施方案中，LNP包含1mol％至10mol％、1mol％至5mol％或1mol％至2.5mol％的聚合物缀合的脂质。
在一个实施方案中，LNP包含40mol％至50mol％的阳离子脂质；5mol％至15mol％的中性脂质；35mol％至45mol％的类固醇；1mol％至10mol％的聚合物缀合的脂质；和RNA，其包封在脂质纳米粒内或与脂质纳米粒缔合。
在一个实施方案中，mol％基于脂质纳米粒中存在的脂质的总摩尔来确定。
在一个实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一个实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一个实施方案中，中性脂质是DSPC。
在一个实施方案中，类固醇是胆固醇。
在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化的脂质。在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构或者为其可药用盐、互变异构体或立体异构体：
其中：
R12和R13各自独立地是包含10至30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链，其中所述烷基链任选地被一个或更多个酯键中断；并且w具有范围为30至60的平均值。在一个实施方案中，R12和R13各自独立地是包含12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在一个实施方案中，w具有范围为40至55的平均值。在一个实施方案中，平均w为约45。在一个实施方案中，R12和R13各自独立地是包含约14个碳原子的直链饱和烷基链，并且w具有约45的平均值。
在一些实施方案中，LNP的阳离子脂质组分具有式(III)的结构或者为其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体：
其中：
L1或L2中的一者是-O(C＝O)-，-(C＝O)O-，-C(＝O)-，-O-，-S(O)x-，-S-S-，-C(＝O)S-，SC(＝O)-，-NRaC(＝O)-，-C(＝O)NRa-，NRaC(＝O)NRa-，-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-；并且L1或L2中的另一者是-O(C＝O)-，-(C＝O)O-，-C(＝O)-，-O-，-S(O)x-，-S-S-，-C(＝O)S-，SC(＝O)-，-NRaC(＝O)-，-C(＝O)NRa-，NRaC(＝O)NRa-，-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接的键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8环亚烷基、C3-C8环亚烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H，OR5，CN，-C(＝O)OR4，-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；并且
x是0、1或2。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：
其中：
A是3至8元环烷基或亚环烷基环；
R6在每次出现时独立地是H、OH或C1-C24烷基；
n是范围为1至15的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有结构(IIIA)，而在另一些实施方案中，脂质具有结构(IIIB)。
在式(III)的另一些实施方案中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：
其中y和z各自独立地是范围为1至12的整数。
在式(III)的任一前述实施方案中，L1或L2中的一者是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2中的每一者都是-O(C＝O)-。在任一前述的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地是-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2中的每一者都是-(C＝O)O-。
在式(III)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(III)或(IIIJ)之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，n是2至12的整数，例如2至8或2至4。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。
在式(III)一些其他的前述实施方案中，y和z各自独立地是2至10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是范围为4至9或4至6的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R6是H。在另一些前述实施方案中，R6是C1-C24烷基。在另一些实施方案中，R6是OH。
在式(III)的一些实施方案中，G3是未经取代的。在另一些实施方案中，G3是经取代的。在多个不同的实施方案中，G3是直链C1-C24亚烷基或直链C1-C24亚烯基。
在式(III)的一些其他前述实施方案中，R1或R2或其两者都是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；并且
a是2至12的整数，
其中R7a、R7b和a各自被选择使得R1和R2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是范围为5至9或8至12的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，R7a在每次出现时都是H。在前述的另一些不同实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同实施方案中，R1或R2或其两者具有以下结构之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NHC(＝O)R4。在一些实施方案中，R4是甲基或乙基。
在多个不同的实施方案中，式(III)的阳离子脂质具有下表中列出的结构之一。
式(III)的代表性化合物。
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在一些实施方案中，LNP包含式(III)的脂质、RNA、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质是ALC-0159。
ALC-0159：
在一些实施方案中，阳离子脂质以约40mol％至约50mol％的量存在于LNP中。在一个实施方案中，中性脂质以约5mol％至约15mol％的量存在于LNP中。在一个实施方案中，类固醇以约35mol％至约45mol％的量存在于LNP中。在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质以约1mol％至约10mol％的量存在于LNP中。
在一些实施方案中，LNP以约40mol％至约50mol％的量包含化合物III-3、以约5mol％至约15mol％的量包含DSPC、以约35mol％至约45mol％的量包含胆固醇和以约1mol％至约10mol％的量包含ALC-0159。
在一些实施方案中，LNP以约47.5摩尔％的量包含化合物III-3、以约10摩尔％的量包含DSPC、以约40.7摩尔％的量包含胆固醇和以约1.8摩尔％的量包含ALC-0159。
N/P值优选为至少约4。在一些实施方案中，N/P值的范围为4至20、4至12、4至10、4至8或5至7。在一个实施方案中，N/P值为约6。
本文中所述的LNP可具有在一个实施方案中约30nm至约200nm，或约60nm至约120nm的平均直径。
RNA靶向
本公开内容的一些方面涉及本文中公开的RNA(例如，编码活化化合物的RNA和/或编码对接化合物的RNA)的靶向递送。
在一个实施方案中，本公开内容涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。如果施用的RNA是编码活化化合物的RNA，则特别优选靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。
在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。
“淋巴系统”是循环系统的一部分并且是免疫系统的一个重要部分，其包含携有淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。初级或中枢淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成初级淋巴器官。次级或外周淋巴器官(包括淋巴结和脾)维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
RNA可通过所谓的脂质复合物制剂递送至脾，其中RNA与包含阳离子脂质和任选地另外的或辅助脂质的脂质体结合以形成可注射的纳米粒制剂。脂质体可通过将脂质在乙醇中的溶液注射到水或合适的水相中而获得。RNA脂质复合物颗粒可通过将脂质体与RNA混合来制备。靶向脾的RNA脂质复合物颗粒在WO 2013/143683中描述，其通过引用并入本文。已经发现，具有净负电荷的RNA脂质复合物颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，施用RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中发生RNA积聚和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于在脾中表达RNA。在一个实施方案中，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在肺和/或肝中没有发生或基本上没有发生RNA积聚和/或RNA表达。在一个实施方案中，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中在抗原呈递细胞例如专职抗原呈递细胞中发生RNA积聚和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于在这样的抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
本公开内容的RNA脂质复合物颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷与RNA中存在的电荷的总和。电荷比是所述至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的电荷比通过以下等式来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中的正电荷总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中的负电荷总数)]。
本文中所述的靶向脾的RNA脂质复合物颗粒在生理pH下优选地具有净负电荷，例如正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2至约1:2、或约1.6:2至约1:2、或约1.6:2至约1.1:2.。在一些具体实施方案中，在生理pH下RNA脂质复合物颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.9:2.0、约1.8:2.0、约1.7:2.0、约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0或约1:2.0。
可通过向对象施用在用于将RNA优先递送至肝或肝组织的制剂中的编码对接化合物的RNA来向对象提供对接化合物。特别是，如果期望表达大量经编码的肽/多肽，和/或者如果期望或需要编码的肽/多肽全身性存在，特别是以显著量全身性存在，则优选将RNA递送至这样的靶器官或组织。
RNA递送系统对肝具有固有的偏好。这涉及基于脂质的颗粒、阳离子纳米粒和中性纳米粒，特别是脂质纳米粒，例如脂质体、纳米胶束和亲脂性配体(在生物缀合物中)。肝积聚是由肝脉管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。
为了在体内将RNA递送至肝，可使用药物递送系统通过阻止其降解将RNA运送到肝中。例如，由聚(乙二醇)(PEG)包被的表面和包含mRNA的核心组成的复合物(polyplex)纳米胶束是可用的系统，因为纳米胶束在生理条件下提供了优异的体内RNA稳定性。此外，由致密的PEG栅栏(RNA palisade)构成的复合物纳米胶束表面所提供的隐匿(stealth)特性有效地规避了宿主免疫防御。
用于靶向肝的合适免疫刺激剂的实例是参与T细胞增殖和/或维持的细胞因子。合适的细胞因子的实例包括IL2或IL7、其片段和变体，以及这些细胞因子、片段和变体的融合蛋白。
在另一个实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA可在制剂中施用，用于将RNA优先递送至淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。特别是，如果期望免疫刺激剂存在于该器官或组织中(例如，用于诱导免疫反应，特别是在T细胞致敏期间或用于活化常驻免疫细胞而需要免疫刺激剂例如细胞因子的情况下)，而不期望免疫刺激剂全身性存在，特别是以显著量全身性存在(例如，因为免疫刺激剂具有全身毒性)，优选将免疫刺激剂递送至这样的靶组织。
合适的免疫刺激剂的实例是参与T细胞致敏的细胞因子。合适的细胞因子的实例包括IL12、IL15、IFN-α或IFN-β、其片段及变体，以及这些细胞因子、片段和变体的融合蛋白。
药物组合物
本文中所述的物质例如编码活化化合物的RNA、编码对接化合物的RNA和/或免疫效应细胞可以以药物组合物或药物的形式施用，并且可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
在本发明所有方面的一个实施方案中，本文中所述的组分可在药物组合物中施用，所述药物组合物可包含可药用载体并且可任选地包含一种或更多种佐剂、稳定剂等。在一个实施方案中，所述药物组合物用于治疗性或预防性治疗，例如用于治疗或预防疾病。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的制剂。通过将所述药物组合物向对象施用，所述药物组合物可用于治疗、预防或者减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学有效量”和在“可药用制剂”中施加。
术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指单独或与另外的剂量和/或药剂一起实现期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展，并且特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是延迟所述疾病或所述病症的发生或预防其发生。本文中所述的组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、身高和体重，治疗持续时间，伴随治疗(如果存在的话)的类型，具体施用途径以及类似因素。因此，本文中所述的组合物的施用剂量可以取决于多种这样的参数。在采用初始剂量患者中的反应不足的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径实现有效更高的剂量)。
术语“亚治疗量”通常是指药剂的低于标准治疗量，意味着所期望作用所需的量低于单独使用药剂时的量。本文中使用的术语“亚治疗量”意指在不存在其他化合物、药物或药剂的情况下，例如在不存在活化化合物的情况下，特定药剂的剂量或量不足以实现所期望的药理作用。这样的期望的药理作用可包括完全或基本上完全排斥实体瘤。亚治疗量和剂量通常不低于治疗剂量或量的约5％，通常不低于约10％，并且通常不高于约75％，更通常不高于约60％。通常，用于人CAR T细胞治疗的施用的免疫效应细胞的数目(包括对象中体内产生的)为约109个/剂(等同于1.33×107个/kg)或更高(等同于1.3×107个/kg)。此外，一些治疗方法包括在短时间(例如少于4周)内重复施用CAR T细胞，以在患者中维持有效T细胞的数目和/或通过剂量递增来提高安全性。这导致在这样的时间段内甚至更高的“累积剂量”。因此，免疫效应细胞的“亚治疗量”是每初始剂量和/或在至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少14天、至少21天、至少28天或甚至更长的时间段内累积剂量的108或更少、107或更少、106或更少、105或更少、104或更少、103或更少、或者甚至更少的这样的细胞的量。在一个实施方案中，经遗传修饰以表达抗原受体的免疫效应细胞的“亚治疗量”涉及以108或更少、107或更少、106或更少、105或更少、104或更少、103或更少、或者甚至更少的量的这样的细胞的单剂量。术语“单剂量”意指施用一剂治疗物质持续延长的时间。术语“延长的时间”包括至少14天、至少21天、至少28天、至少3个月、至少6个月或甚至更长的时间。
本公开内容的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或冲淡剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任何一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。如本文中所用，载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。
用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCo.(A.R Gennaroedit.1985)中。
可根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
在一个实施方案中，本文中所述的药物组合物可静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌内施用。在某些实施方案中，将药物组合物配制为用于局部施用或全身性施用。全身性施用可以包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。如本文中所用，“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式的施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，将药物组合物配制为用于肌内施用。在另一个实施方案中，将药物组合物配制为用于全身性施用，例如，用于静脉内施用。
本文中使用的术语“共施用”意指将不同的化合物或组合物例如编码活化化合物的RNA、编码对接化合物的RNA和任选地免疫效应细胞向同一患者施用的方法。不同的化合物或组合物可同时、基本上同时或顺序施用。
治疗
本文中所述的药剂、组合物和方法可用于治疗患有疾病的对象，该疾病是例如以存在表达抗原的患病细胞(可作为初级靶标)为特征的疾病。特别优选的疾病是癌症疾病。例如，如果抗原来源于病毒，则药剂、组合物和方法可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。如果抗原是肿瘤抗原，则药剂、组合物和方法可用于治疗其中癌细胞表达所述肿瘤抗原的癌症疾病。
本文中所述的药剂、组合物和方法可用于多种疾病的治疗性或预防性治疗。在一个实施方案中，本文中所述的药剂、组合物和方法可用于涉及抗原的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
本文中所述的方法和药剂特别可用于治疗以表达对接化合物所针对的抗原(例如肿瘤抗原)的患病细胞为特征的疾病。细胞可在细胞表面上表达抗原，用于被对接化合物识别。所述方法可提供表达抗原的这样的细胞的选择性根除，从而使对不表达抗原的正常细胞的不良作用最小化。例如通过向对象施用经遗传修饰的免疫效应细胞或在对象中产生经遗传修饰的免疫效应细胞来向对象提供经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞，所述嵌合抗原受体通过与对接化合物结合来靶向细胞。
在一个实施方案中，本文中所述的免疫效应细胞是T细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞针对肿瘤或癌症。在一个实施方案中，靶细胞群或靶组织是肿瘤细胞或肿瘤组织，特别是实体瘤。在一个实施方案中，靶抗原(初级靶标)是肿瘤抗原。
在一个方面中，本发明通常包括通过靶向表达抗原的细胞例如患病细胞，特别是表达肿瘤抗原的癌细胞来治疗疾病。在一个实施方案中，癌细胞或癌组织是实体癌。靶细胞可表达在细胞表面上的抗原。在一个实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原，并且疾病是癌症。这样的治疗提供了表达抗原的细胞的选择性根除，从而使对不表达抗原的正常细胞的不良作用最小化。
在一个实施方案中，向对象提供亚治疗量的经遗传修饰以表达CAR的免疫效应细胞。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可以由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可以由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于是指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡或者与该个体有关的那些的类似问题的任何病症。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些情况下和出于另一些目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上而且在情感上影响个体，因为对许多疾病的感染和经历可改变个体对生命的看法和个体的性格。
在本发明背景下，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病或障碍目的的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以防止症状或并发症的发生。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以在个体中消除疾病、在个体中阻止或减缓疾病的发生、在个体中抑制或减缓疾病的发生，在个体中降低症状的频率或严重程度，和/或在目前患有或以前曾患有疾病的个体中降低复发。
术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如，癌症)折磨或易于患有疾病或病症(例如，癌症)但是可患有或可未患有疾病或病症的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
在本公开内容的一个实施方案中，目的是将药物活性剂(包含化合物和细胞)递送至表达抗原的患病细胞(例如表达肿瘤抗原的癌细胞)以及治疗涉及表达抗原例如肿瘤抗原的细胞的疾病例如癌症疾病。
术语“涉及抗原的疾病”、“涉及表达抗原的细胞的疾病”或类似术语是指涉及抗原的任何疾病，例如以抗原的存在为特征的疾病。涉及抗原的疾病可以是感染性疾病或癌症疾病或仅是癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原。在一个实施方案中，涉及抗原的疾病是涉及表达抗原优选细胞表面上的抗原的细胞的疾病。
术语“感染性疾病”是指可在个体之间或生物体之间传播并且由微生物原(microbial agent)引起的任何疾病(例如，普通感冒)。感染性疾病是本领域中已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生物性疾病，这些疾病分别由病毒、细菌和寄生物引起。在这方面中，感染性疾病可以是，例如，肝炎、性传播疾病(例如衣原体或淋病)、结核病、HIV/获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、禽流感和流感。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于：上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin’s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，CNS)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。
本文中使用的术语“实体瘤”或“实体癌”是指癌性肿块的表现，如本领域中公知的，例如Harrison’s Principles of Internal Medicine,第14版中所述。优选地，该术语是指除血液以外优选除血液、骨髓和淋巴系统以外的身体组织的癌症或癌。例如但不通过限制的方式，实体瘤包括前列腺癌、肺癌、结直肠组织癌、膀胱癌、口咽/喉组织癌、肾癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胰腺癌、脑癌和神经中枢系统癌。
本文中所述的方法和药剂特别可用于治疗癌症，例如实体癌，其特征在于表达对接化合物所针对的抗原的患病细胞。
在本公开内容的一个实施方案中，目的是提供针对表达抗原的患病细胞(例如表达肿瘤抗原的癌细胞)的免疫应答，并治疗疾病例如涉及表达抗原(例如肿瘤抗原)的细胞的癌症疾病。
可引发针对抗原的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。本文中所述的药物组合物适用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于预防和/或治疗性治疗涉及抗原的疾病。
本文中使用的“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的整体身体应答，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。
“细胞介导的免疫”、“细胞免疫”、“细胞免疫应答”或类似术语意指包括针对以表达抗原为特征，特别是以呈递具有I类或II类MHC的抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答与被称为T细胞或T淋巴细胞的充当“辅助者”或“杀伤者”的细胞有关。辅助T细胞(也称为CD4+ T细胞)通过调节免疫应答发挥重要作用，并且杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、细胞裂解T细胞、CD8+ T细胞或CTL)杀伤患病细胞例如癌细胞，防止产生更多患病细胞。
本公开内容考虑了可以是保护性的、防止性的、预防性的和/或治疗性的免疫应答。本文中所用的“诱导(induce)[或诱导(inducing)]免疫应答”可表示在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答，或可表示在诱导之前存在针对特定抗原的基础水平的免疫应答，其在诱导之后增强。因此，“诱导(induce)[或诱导(inducing)]免疫应答”包括“增强(enhance)[或增强(enhancing)]免疫应答”。
术语“巨噬细胞”是指单核细胞分化产生的吞噬细胞亚群。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物活化的巨噬细胞通过水解和氧化攻击来非特异性地吞噬并杀伤巨噬细胞内的外来病原体，导致病原体降解。来自降解蛋白质的肽展示在巨噬细胞表面上，在那里它们可被T细胞识别，并且它们可直接与B细胞表面上的抗体相互作用，导致T和B细胞活化并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞类。在一个实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
术语“树突细胞”(DC)指属于抗原呈递细胞类的吞噬细胞的另一个亚型。在一个实施方案中，树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征是高的吞噬活性和低的T细胞活化潜力。未成熟的树突细胞不断地取样(sample)周围环境以寻找病原体，例如病毒和细菌。一旦它们与可呈递抗原接触，它们被活化成成熟的树突细胞，并开始迁移到脾脏或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解成小片段，并且在成熟之后使用MHC分子将那些片段呈现在其细胞表面。同时，它们上调在T细胞活化中作为共受体的细胞表面受体，例如CD80、CD86和CD40，大大增强了其活化T细胞的能力。它们还上调CCR7，CCR7是趋化受体，诱导树突细胞通过血流到达脾或通过淋巴系统到达淋巴结。在此，它们作为抗原呈递细胞并通过向辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞呈递抗原和非抗原特异性共刺激信号来使其活化。因此，树突细胞可主动诱导T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一个实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
术语“抗原呈递细胞”(APC)是能够在其细胞表面展示、获取和/或呈递至少一种抗原或抗原片段的多种细胞的细胞。抗原呈递细胞可分为专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。
术语“专职抗原呈递细胞”涉及组成型表达与初始T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合体II类(MHC II类)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的MHCII类分子复合物相互作用，则抗原呈递细胞产生共刺激分子，诱导了T细胞的活化。专职抗原呈递细胞包含树突细胞和巨噬细胞。
术语“非专职抗原呈递细胞”涉及不组成型表达MHC II类分子，但在某些细胞因子如干扰素-γ的刺激下表达MHC II类分子的抗原呈递细胞。示例性的非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
“抗原加工”是指将抗原降解成加工产物，其是所述抗原的片段(例如，将蛋白质降解成肽)，并且将一个或更多个这些片段与MHC分子缔合(例如，通过结合)以用于通过细胞的呈递，例如将抗原呈递细胞呈递至特异性T细胞。
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用多种实施方案。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述的实例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实例和应用。因此，多种实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
实施例
mRNA构建体
所有构建体通过基因合成产生，包含或编码下述序列元件：
序列元件
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待用于以下实施例的构建体所编码的蛋白质如下：
/>
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实施例1：通用CART方法
在本实施例中，在图1中示出，产生了CAR-T细胞，其中捕获子(catcher)作为识别结构域与嵌合抗原受体的铰链、跨膜和胞内信号传导结构域融合。为了降低成本并允许快速的患者供应，出于该目的优选同种异体CAR-T细胞，其可通过已建立的方法如αβT细胞耗竭的基因工程而产生。向患者施用通用CAR-T细胞，在患者体内，基于我们最近发表的CARVAC方法(Reinhard et al.,2020)可通过脂质体配制的编码与膜锚蛋白结构域融合的CAR特异性标签的mRNA来扩增CAR-T细胞。作为第二组分，将肿瘤特异性靶向配体(例如抗CLDN6 scFv)与标签序列融合，并作为包封在脂质纳米粒中的RNA向患者施用。脂质纳米粒被肝细胞摄取，然后肝细胞表达双特异性融合蛋白并将其释放到血流中。靶向配体在肿瘤部位积聚，在那里最终通用CAR-T细胞可结合肿瘤细胞并介导肿瘤细胞杀伤。所描述的操作理论上普遍适用于不同的肿瘤抗原，并且原则上可增强效力，以及还能够通过提供编码不同靶向配体的RNA混合物来同时靶向数种抗原。该方法的另一个主要优点是在不存在靶向配体的情况下CAR-T细胞的安全持久性。如果所有肿瘤细胞均被消除并且平行地在肿瘤复发的情况下提供使用相同或另一种靶向配体继续治疗的选项，则这能够在不耗竭CAR-T细胞的情况下暂停治疗。
实施例2：Jurkat细胞中的模块化CAR-T
用编码模块化CAR的mRNA改造Jurkat T细胞，并在24小时后通过流式细胞术进行分析。可溶性模块化CAR衔接子由经核酸转染的细胞产生。将模块化CAR Jurkat细胞用1或10nM的可溶性衔接子武装，并用衔接子特异性抗体(针对aCLDN6抗体的抗独特型抗体)复染，以检测衔接子在模块化CAR上的结合。使用流式细胞术方法检测衔接子结合的CAR。模拟Jurkat细胞(非mRNA转染的)用作对照，其中在细胞表面没有检出衔接子部分。在经修饰以表达模块化CAR(VHH(aALFA)-G4S-CAR，SEQ ID NO:30)的T细胞系表面检出衔接子。所用的剂量范围表明，模块化CAR-T细胞可在低剂量(1nM，衔接子结合细胞的％)下有效地结合衔接子，并且结合强度(MFI)可随着衔接子剂量的提高而提高。在本实验中，使用了ALFA-VH-VL衔接子形式(SEQ ID NO:34)。图2示出了CAR和衔接子的组装。
实施例3：原代细胞中的模块化CAR-T
使用CD3激动性抗体在5天内活化原代人T细胞，并随后用编码模块化CAR的mRNA(VHH(aALFA)-G4S-CAR，SEQ ID NO:30)转染。24小时之后，用标记的ALFA肽对CAR分子进行染色。使用流式细胞术方法检测表达。图3示出了CAR在原代人T细胞中良好表达(39.5％)。
平行地，将如上所述活化和转染的原代细胞用经核酸转染细胞所产生的100nM可溶性衔接子武装，并在24小时之后用衔接子特异性抗体染色。使用流式细胞术方法评估CAR结合衔接子的百分比。衔接子结合在经改造的原代人T细胞的表面表达的模块化CAR(100nM衔接子为12.4％)。在本实验中，使用了ALFA-VH-VL-His-标签衔接子形式(SEQ ID NO:34)。图4示出了模块化CAR已组装好。与图2相比，衔接子的较低检出是基于VH-VL结构域的可及性，该VH-VL结构域由在此的2个标签包围。
实施例4：模块化CAR-T细胞介导肿瘤细胞裂解
将抗原阳性肿瘤细胞接种在E-平板(ACEA)上，并在共培养之前孵育24小时。在用经核酸转染细胞产生的10nM或100nM可溶性衔接子转染之后24小时，经改造以表达模块化CAR的经活化的原代人T细胞(参见图3)被武装。将武装的模块化CAR-T细胞与肿瘤细胞以10:1的效应子与靶细胞之比共培养。未武装的模块化CAR-T细胞用作阴性对照。在xCELLigence系统上使用基于阻抗的方法经27小时评估肿瘤细胞裂解。细胞毒性相对于非mRNA转染的T细胞归一化，并根据Triton-X实现的最大裂解进行计算。
未武装的模块化CAR-T细胞不诱导表达抗原的肿瘤细胞的细胞毒性裂解。武装有衔接子的模块化CAR-T细胞促进了强的细胞裂解活性。图5示出了以衔接子剂量依赖性方式杀伤肿瘤细胞。
实施例5：由包含通用ALFA肽的mRNA转染的iDC诱导的模块化CAR-T细胞的增殖
人的未成熟树突细胞(immature dendritic cell，iDC)通过GM-CSF和IL-4从CD14阳性细胞分化而来。将iDC用编码膜锚定结合部分的mRNA(CARVac)转染。将自体T细胞用编码模块化CAR的mRNA转染，并用增殖染料亮紫(brilliant violet)染色。模块化CAR-T细胞和表达CARVac的iDC以10:1的效应子与靶标之比为共培养4天。模块化CAR-T细胞增殖通过使用流式细胞术方法通过子代增殖染料的减少来评估。模拟mRNA转染的iDC用作阴性对照(对照)。在图6A和B中，在iDC上表达的膜锚定结合部分包含ALFA肽，而CAR包含抗ALFAVHH。在图6C和D中，在iDC上表达的膜锚定结合部分包含抗ALFAVHH，而CAR包含ALFA肽。
尽管模块化的CAR-T细胞针对对照iDC不增殖，但VHH(aALFA)CAR(SEQ ID NO:30)T细胞以及类似的VHH(aALFA)PE-CAR显示出针对包含ALFA肽的CARVac构建体的明显增殖(图6A&B)。这里，使用两种用于跨膜锚定的不同支架，模块化CAR的靶标在抗原呈递细胞的表面表达。TNFL9锚(SEQ ID NO:31)或(EA3K)GPI锚(SEQ ID NO:32)。在图6C&D中，模块化CAR(SEQ ID NO:27和28)促进了针对包含VHH的iDC呈现的构建体(SEQ ID NO:33)的明显增殖。
实施例6：负载有CD19特异性衔接子的模块化ALFA CAR-T介导针对CD19转染的iDC或原代人B细胞的增殖
将人原代T细胞改造成表达ALFA CAR，并用增殖染料亮紫标记。然后将它们与用编码CD19的mRNA转染的原代人B细胞(左)或自体iDC在存在0、1或10nM衔接子(nbALFA/VHH(aALFA)-抗CD19(FMC63))的情况下共孵育4天，所述衔接子由核酸改造的生产细胞产生。在B细胞的情况下，效应子与靶标之比从10:1、1:1到1:10不等。在iDC作为靶细胞的情况下，使用的E:T之比为10:1。在流式细胞仪采集和分析之后，描绘增殖的CAR-T细胞的频率。
如图7中所观察到的，改造的ALFA-CAR T细胞的增殖需要衔接子以及表达CD19靶标的靶细胞的存在。
注意，在本实施例中，衔接子由与scFv抗原结合结构域连接的VHH(aALFA)抗原结合结构域形成。
序列表
<110> BioNTech Cell & Gene Therapies GmbH
<120> 用于活化和靶向免疫效应细胞的物质和方法
<130> 674-381 PCT3
<150> PCT/EP2021/065290
<151> 2021-06-08
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR
<400> 1
aacuaguauu cuucuggucc ccacagacuc agagagaacc cgccacc 47
<210> 2
<211> 311
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR
<400> 2
cucgagagcu cgcuuucuug cuguccaauu ucuauuaaag guuccuuugu ucccuaaguc 60
caacuacuaa acugggggau auuaugaagg gccuugagca ucuggauucu gccuaauaaa 120
aaacauuuau uuucauugcu gcgucgagag cucgcuuucu ugcuguccaa uuucuauuaa 180
agguuccuuu guucccuaag uccaacuacu aaacuggggg auauuaugaa gggccuugag 240
caucuggauu cugccuaaua aaaaacauuu auuuucauug cugcgucgag accuggucca 300
gagucgcuag c 311
<210> 3
<211> 278
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR
<400> 3
cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uccuggguac cccgagucuc 60
ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120
aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180
ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240
cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278
<210> 4
<211> 110
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A30L70
<400> 4
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcauaugacu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 110
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位标签
<400> 5
Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR1
<400> 6
Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR2
<400> 7
Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met
1 5
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR3
<400> 8
Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu
20 25 30
Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg
35 40 45
Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu
50 55 60
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG-前导序列
<400> 10
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ALFA
<400> 11
Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro
1 5 10 15
<210> 12
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8铰链
<400> 12
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
35 40 45
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
50 55 60
Ile Thr Leu Tyr Cys
65
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人41-BB结构域
<400> 13
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD3ζ结构域
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Linker
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 16
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFL9 (全长序列)
<400> 16
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人sec信号序列
<400> 17
Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser
20 25
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 18
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 19
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPI锚(人CD55)
<400> 19
Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser
1 5 10 15
Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr
20 25 30
Met Gly Leu Leu Thr
35
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG-前导序列
<400> 20
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCLDN6 VH
<400> 22
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Gly Phe Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aCLDN6 VL
<400> 23
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala
100 105 110
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 25
Gly Gly Ser
1
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签
<400> 26
His His His His His His
1 5
<210> 27
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 27
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr
20 25 30
Glu Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
35 40 45
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
50 55 60
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
65 70 75 80
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
85 90 95
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
100 105 110
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
115 120 125
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
130 135 140
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
145 150 155 160
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
165 170 175
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
180 185 190
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
195 200 205
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
210 215 220
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
225 230 235 240
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
245 250 255
Arg
<210> 28
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 28
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr
20 25 30
Glu Pro Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
35 40 45
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
50 55 60
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
65 70 75 80
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
85 90 95
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
100 105 110
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
115 120 125
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
130 135 140
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
145 150 155 160
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
165 170 175
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
180 185 190
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
195 200 205
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
210 215 220
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
245 250 255
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
260
<210> 29
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 29
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile
35 40 45
Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Glu Arg Arg Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met
65 70 75 80
Tyr Arg Glu Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr
85 90 95
Asn Lys Met Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 30
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR构建体
<400> 30
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile
35 40 45
Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Glu Arg Arg Val Met Val Ala Ala Val Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met
65 70 75 80
Tyr Arg Glu Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr
85 90 95
Asn Lys Met Val Ser Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys His Val Leu Glu Asp Arg Val Asp Ser Phe His
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
145 150 155 160
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
165 170 175
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
180 185 190
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
210 215 220
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
225 230 235 240
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
245 250 255
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln
260 265 270
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
275 280 285
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
290 295 300
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
305 310 315 320
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
325 330 335
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
340 345 350
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
355 360 365
Arg
<210> 31
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 活化化合物
<400> 31
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Pro Ser
245 250 255
Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu
260 265
<210> 32
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 活化化合物
<400> 32
Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser Ser Arg Leu Glu Glu Glu
20 25 30
Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu Pro Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
35 40 45
Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser
50 55 60
Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly
65 70 75 80
Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr
85 90
<210> 33
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 活化化合物
<400> 33
Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
35 40 45
Thr Ala Ser Gly Val Thr Ile Ser Ala Leu Asn Ala Met Ala Met Gly
50 55 60
Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Glu Arg Arg Val Met Val Ala Ala Val
65 70 75 80
Ser Glu Arg Gly Asn Ala Met Tyr Arg Glu Ser Val Gln Gly Arg Phe
85 90 95
Thr Val Thr Arg Asp Phe Thr Asn Lys Met Val Ser Leu Gln Met Asp
100 105 110
Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His Val Leu Glu
115 120 125
Asp Arg Val Asp Ser Phe His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg
165 170 175
Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr
180 185 190
Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr
195 200
<210> 34
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 对接化合物
<400> 34
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Pro Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr
20 25 30
Glu Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln
35 40 45
Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys
50 55 60
Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys
65 70 75 80
Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr
85 90 95
Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
100 105 110
Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu
115 120 125
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Phe
130 135 140
Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr
165 170 175
Gln Ser Pro Ser Ile Met Ser Val Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile
180 185 190
Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln
195 200 205
Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu
210 215 220
Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Ser
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Ala Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
245 250 255
Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Tyr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly
260 265 270
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ser Asp Pro Ala Gly Gly Ser His His
275 280 285
His His His His
290
<210> 35
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG-前导序列
<400> 35
atggactgga tctggcgaat actgtttctg gtgggagccg ccactggggc ccattct 57
<210> 36
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALFA
<400> 36
cctagcaggc tggaggagga actccgcaga cggctgaccg aaccc 45
<210> 37
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD8铰链
<400> 37
actactaccc cagcacctag accgcctaca cccgcaccca ctatcgcgtc tcagcccttg 60
agtctgcggc ccgaggcttg tcggcccgca gctggcgggg ctgtgcatac ccgaggactc 120
gactttgcat gcgacatcta catttgggcc cctctggccg gcacttgcgg cgtccttctt 180
ctgagtctgg tcataacgtt gtattgc 207
<210> 38
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人41-BB 结构域
<400> 38
aaacggggca ggaagaaact gctgtatatc ttcaagcagc ctttcatgcg cccagttcag 60
accactcagg aggaggatgg gtgttcctgt cgtttccctg aggaagaaga aggcgggtgc 120
gaattg 126
<210> 39
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD3ζ结构域
<400> 39
agggtcaagt ttagccgatc agctgacgcc cctgcttaca aacaggggca aaatcagctt 60
tacaatgagc tgaacctcgg gcgtagagag gagtacgacg tgttggacaa gcgcagaggg 120
agagatcccg agatgggcgg caaaccaaga cgcaagaatc cccaagaagg cctctacaac 180
gagctgcaga aggataaaat ggccgaagcc tatagcgaga ttggcatgaa aggagaacgg 240
aggagaggga aaggtcacga tggactctac caaggcctga gcacagctac caaagacacg 300
tatgatgcct tgcacatgca agcactgcca cccaggtag 339
<210> 40
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 40
ggaggaggcg ggagc 15
<210> 41
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFL9 (全长序列)
<400> 41
atggagtatg ctagcgatgc ctctctggac ccggaagctc catggccacc agctcctagg 60
gctcgcgctt gccgtgtgct tccttgggcc ctggtggctg gcctcctgtt gctgctgctg 120
ctggctgccg catgcgctgt gttcctcgcc tgtccatggg cggtaagtgg cgcgagagcc 180
tctcctggtt cagccgcatc accgaggctg agggaagggc cagagcttag ccccgatgac 240
cctgctgggt tgctcgacct gagacagggg atgtttgccc agttggtagc gcagaacgtg 300
ctgctgatcg acggtccctt gagctggtat tccgatcccg gtcttgccgg agtcagcctc 360
actggcggcc tgagttacaa ggaggacacc aaggaactgg tggttgccaa agccggtgtc 420
tactacgtgt tcttccagct cgaactcagg cgcgtggttg caggagaggg gtcaggctct 480
gtgagtcttg cccttcatct ccagcccctg agaagcgcag ccggagccgc tgcactggcg 540
ctgaccgtgg atctcccacc cgcctcctcc gaagcccgca atagcgcttt tggcttccaa 600
gggcgactgt tgcacctgtc tgcaggccaa cggctgggag tccatctgca cacggaggcc 660
agagcacgac acgcatggca gctgacacag ggagccactg tcctgggact gtttcgggtt 720
acacccgaga ttcctgcagg ccttccctcc cctcggtccg ag 762
<210> 42
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人sec信号序列
<400> 42
atgagagtga tggcccccag aaccctgatc ctgctgctgt ctggcgccct ggccctgaca 60
gagacatggg ccggaagc 78
<210> 43
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 43
gaggcggcag ctaaggaagc tgctgctaaa gaggctgcgg ctaag 45
<210> 44
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GPI锚(人CD55)
<400> 44
ccaaataaag gaagtggaac cacttcaggt actacccgtc ttctatctgg gcacacgtgt 60
ttcacgttga caggtttgct tgggacgcta gtaaccatgg gcttgctgac ttga 114
<210> 45
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG-前导序列
<400> 45
atggattgga cttggcgggt cttttgcctg ttagcagtgg cccccggcgc tcatagc 57
<210> 46
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 46
ggaggaggcg ggagcggcgg gggtagt 27
<210> 47
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCLDN6 VH
<400> 47
gaagttcagc tgcagcagtc agggccggaa ctggtgaaac ccggcgctag catgaagatc 60
tcctgtaagg cgagcgggta ttcctttacc ggctacacca tgaactgggt taagcaatct 120
cacggcaaga accttgagtg gataggactc attaatcctt acaatggcgg cacaatctac 180
aaccagaagt tcaaaggcaa agcaaccctt accgtggaca agagcagctc tacagcctat 240
atggagctgc tctcactgac gtccgaggat agcgcagtgt actattgtgc gcgggattac 300
gggtttgtgc tggattattg gggacagggc accacactga ccgtaagcag t 351
<210> 48
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> aCLDN6 VL
<400> 48
gacattgtcc tgacacagag tccatccatt atgagcgtga gtcctggtga aaaggttaca 60
atcacctgca gtgcaagctc atcagtgtct tacatgcatt ggtttcagca gaagccggga 120
acttctccta agctgagcat ctactctacg agcaatctcg cctctggtgt cccagcgagg 180
ttctcaggac gcgggtccgg gacttcctat tccctcacaa tttccagggt agccgctgaa 240
gatgctgcca cctattattg ccaacagcgc agcaactacc caccctggac attcggtggt 300
ggaacaaaac tggagattaa gcggtccgac ccagcc 336
<210> 49
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 49
ggaggcggtg gaagtggcgg tggagggtca ggaggtggtg gatct 45
<210> 50
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 50
ggcggctct 9
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> His-标签
<400> 51
caccaccacc accatcat 18

Claims (45)

1.用于治疗患有以表达靶抗原的细胞为特征的疾病、障碍或病症的对象的方法，其包括：
(i)向所述对象提供经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞；
(ii)向所述对象施用编码第一肽或多肽的第一RNA，其中所述第一肽或多肽包含针对所述CAR的结合部分；
(iii)允许所述对象中的抗原呈递细胞表达所述第一肽或多肽，使得所述针对所述CAR的结合部分可用于所述免疫效应细胞的结合，所述结合导致所述免疫效应细胞的扩增；
(iv)向所述对象施用编码第二肽或多肽的第二RNA，其中所述第二肽或多肽包含与所述靶抗原结合的结合部分和针对所述CAR的结合部分；以及
(v)允许所述对象中的细胞表达所述第二肽或多肽，使得所述第二肽或多肽与表达所述靶抗原的细胞缔合，并且所述针对所述CAR的结合部分可用于所述免疫效应细胞的结合。
2.权利要求1所述的方法，其中所述抗原呈递细胞用所述第一RNA转染。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一RNA作为颗粒制剂施用，例如被配制为脂质复合物颗粒。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中表达所述第二肽或多肽的细胞用所述第二RNA转染。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二RNA作为颗粒制剂施用，例如被配制为脂质纳米粒。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞表达所述第一肽或多肽，使得所述第一肽或多肽保持与所述抗原呈递细胞缔合。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一肽或多肽是膜肽或多肽。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一肽或多肽是所述针对所述CAR的结合部分与膜肽或多肽的融合蛋白。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述免疫效应细胞与缔合至表达所述靶抗原的细胞的第二肽或多肽之间的结合导致表达所述靶抗原的细胞被杀伤。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中表达所述第二肽或多肽的细胞分泌所述第二肽或多肽。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中表达所述第二肽或多肽的细胞表达所述第二肽或多肽以使其被释放到血流中。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是细胞表面抗原。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第二肽或多肽是结合靶抗原的结合部分与针对所述CAR的结合部分的融合肽或多肽。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述结合靶抗原的结合部分包含抗体或抗体衍生物。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述针对所述CAR的结合部分包含肽标签。
16.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述CAR包含抗体或抗体衍生物。
17.权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述抗体衍生物是抗体片段。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述对象施用所述经遗传修饰以表达CAR的免疫效应细胞。
19.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述方法包括在所述对象中产生所述经遗传修饰以表达CAR的免疫效应细胞。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是癌症。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述表达靶抗原的细胞是患病细胞。
22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述表达靶抗原的细胞是癌细胞。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
24.用于治疗患有以表达靶抗原的细胞为特征的疾病、障碍或病症的对象的方法，其包括：
(i)向所述对象提供经遗传修饰以表达与肽标签结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞；
(ii)向所述对象施用编码第一肽或多肽的第一RNA，以使得所述第一肽或多肽在所述对象的抗原呈递细胞中表达，其中所述第一肽或多肽是膜蛋白，其在胞外结构域中包含该CAR所结合的肽标签；以及
(iii)向所述对象施用编码第二肽或多肽的第二RNA，以使得所述第二肽或多肽在所述对象的细胞中表达并被其分泌，其中所述第二肽或多肽包含与所述靶抗原结合的结合部分和该CAR所结合的肽标签。
25.权利要求24所述的方法，其中所述免疫效应细胞与所述第一肽或多肽的结合导致所述免疫效应细胞的扩增。
26.权利要求24或25所述的方法，其中所述免疫效应细胞与结合至靶抗原的第二肽或多肽之间的结合导致表达所述靶抗原的细胞被杀伤。
27.权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞用所述第一RNA转染。
28.权利要求24至27中任一项所述的方法，其中所述第一RNA作为颗粒制剂施用，例如被配制为脂质复合物颗粒。
29.权利要求24至28中任一项所述的方法，其中表达所述第二肽或多肽的细胞用所述第二RNA转染。
30.权利要求24至29中任一项所述的方法，其中所述第二RNA作为颗粒制剂施用，例如被配制为脂质纳米粒。
31.权利要求24至30中任一项所述的方法，其中所述抗原呈递细胞表达所述第一肽或多肽，以使得所述第一肽或多肽保持与所述抗原呈递细胞缔合。
32.权利要求24至31中任一项所述的方法，其中所述第一肽或多肽是CAR所结合的肽标签与膜肽或多肽的融合蛋白。
33.权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述第二肽或多肽被分泌到血流中。
34.权利要求24至33中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是细胞表面抗原。
35.权利要求24至34中任一项所述的方法，其中所述第二肽或多肽是结合靶抗原的结合部分与CAR所结合肽标签的融合肽或多肽。
36.权利要求24至35中任一项所述的方法，其中所述结合靶抗原的结合部分包含抗体或抗体衍生物。
37.权利要求24至36中任一项所述的方法，其中所述CAR包含抗体或抗体衍生物。
38.权利要求36或37所述的方法，其中所述抗体衍生物是抗体片段。
39.权利要求24至38中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述对象施用所述经遗传修饰以表达CAR的免疫效应细胞。
40.权利要求24至38中任一项所述的方法，其中所述方法包括在所述对象中产生所述经遗传修饰以表达CAR的免疫效应细胞。
41.权利要求24至40中任一项所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是癌症。
42.权利要求24至41中任一项所述的方法，其中所述表达靶抗原的细胞是患病细胞。
43.权利要求24至42中任一项所述的方法，其中所述表达靶抗原的细胞是癌细胞。
44.权利要求24至43中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
45.药盒，其包含：
(i)用于对免疫效应细胞进行遗传修饰以表达与肽标签结合的嵌合抗原受体(CAR)的核酸，或经遗传修饰以表达与肽标签结合的嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞；
(ii)编码第一肽或多肽的第一RNA或者用于获得所述第一RNA的核酸，所述第一肽或多肽是膜蛋白，其在胞外结构域中包含该CAR所结合的肽标签；并且任选地
(iii)编码第二肽或多肽的第二RNA或者用于获得所述第二RNA的核酸，所述第二肽或多肽包含与靶抗原结合的结合部分和该CAR所结合的肽标签。
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