JP2023554154A - サイトカインタンパク質の治療スケジュール - Google Patents

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Abstract

本開示は、特に癌を治療するための、治療用ＲＮＡの分野に関する。対象において、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡに対する望ましくない応答もしくは反応、またはその両方を低減するための組成物、使用および方法が本明細書で開示される。

Description

本開示は、特に癌を治療するための、治療用ＲＮＡの分野に関する。対象において、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡに対する望ましくない応答もしくは反応、またはその両方を低減するための組成物、使用および方法が本明細書で開示される。
免疫系は、癌を予防し、癌と闘ううえで重要な役割を果たす（Ｍｉｔｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４））。有効な抗腫瘍免疫は、異なる免疫細胞サブセットの協調作用を必要とする。Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、抗腫瘍免疫応答の重要なメディエータである。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、腫瘍細胞を直接溶解することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍への免疫サブセットの流入を促進し、樹状細胞（ＤＣ）を抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のプライミングに使用し、腫瘍細胞増殖のＩＦＮγ媒介阻害を誘導する。炎症中に誘導されるＩＦＮγおよびＩ型インターフェロンは、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して腫瘍抗原の提示を増加させ、それによってＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞認識を促進する。
進行性固形腫瘍を有する患者では治癒が不十分なままであり、より効果的で毒性の低いレジメンに対する緊急の満たされていない医学的必要性が存在する。免疫賦活サイトカインは有効な抗腫瘍免疫応答に不可欠であり、サイトカインベースの治療は有望な治療手段である。
インターロイキン２（ＩＬ２）は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む免疫系の多様な細胞に作用する強力な免疫賦活サイトカインである。ＩＬ２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の分化、増殖、生存およびエフェクタ機能を支援することが公知である（Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，５４０－７（２００３））。このサイトカインは、活性化時に主にＴ細胞によって産生される（Ｓｐｏｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８））。
ＩＬ２は、ＣＤ２５（ＩＬ２Ｒα）、ＣＤ１２２（ＩＬ２Ｒβ）およびＣＤ１３２（ＩＬ２Ｒγ）からなる高親和性ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）を発現する細胞を選択的に刺激する。高親和性ＩＬ２Ｒαβγ複合体は、免疫抑制制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に構成的に発現され、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上に一時的に存在する。これは、ＩＬ２が抗腫瘍エフェクタＴ細胞およびＮＫ細胞の機能を増強するだけでなく、Ｔｒｅｇ細胞の増殖および免疫阻害機能も刺激するので、抗腫瘍免疫応答におけるこのサイトカインの二重の役割を強調している（Ｓｐｏｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８））。
組換えヒトＩＬ２（ｒｈＩＬ２）、アルデスロイキンは、最初に承認された癌免疫療法である。アルデスロイキンは、末期の悪性黒色腫および腎細胞癌の治療において長い間使用されてきた（Ｋａｍｍｕｌａ ｅｔ ａｌ．１９９８）。ｒｈＩＬ２療法後に完全奏効を示したほとんどの患者は、初期治療後２５年を超えて無再発のままであるが、全奏効率は低い（Ｋｌａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．２００８，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．１９９８）。
ＩＬ２の臨床的有効性を制限するいくつかの要因がある。第１に、その短い血漿半減期のために、ｒｈＩＬ２は高用量で頻繁に投与されなければならない（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６））。ナイーブＴ細胞およびメモリＴ細胞ならびにＮＫ細胞の大部分は、中間親和性受容体ＩＬ２Ｒβγのみを発現するので（Ｓｔａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００６）；Ｗａｌｓｈ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（２０１２））、これらの細胞を刺激し、それによって最適な抗腫瘍免疫を達成するためには、高用量のＩＬ２が必要である。
高用量のｒｈＩＬ２治療は、癌患者のサブセットにおける全生存率を有意に増加させ得る（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００５））。残念なことに、そのようなレジメンは、しばしば血管漏出症候群（ＶＬＳ）などの重篤な有害作用を引き起こし、最大４％の治療関連死亡率をもたらす（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００５）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，８８９－９７（１９８７））。ＶＬＳの正確な原因は部分的にしか理解されていない。ＩＬ２活性化ＮＫ細胞由来の炎症誘発性サイトカイン（ＩＦＮγなど）が必須の役割を果たすと考えられている（Ａｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＩＬ２媒介毒性作用に対するＮＫ細胞の全体的な寄与は、十分に文書化されている（Ｇａｔｅｌｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）、Ｐｅａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８９））。
ｒｈＩＬ２の別の固有の難点は、癌患者においてＴｒｅｇ細胞を刺激および増殖させるその能力である。Ｔｒｅｇ細胞は、抗腫瘍エフェクタＴ細胞およびＮＫ細胞の機能を抑制することができ（Ｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１４）；Ｔｏｄｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．（２０１６））、これは全生存率の低下に関連しており、ｒｈＩＬ２に基づく癌免疫療法の開発にとって大きな障害である（Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ＆Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｂｌｏｏｄ（２００６））。
ｒｈＩＬ２は、癌において堅固な臨床的有効性を示していないので（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６））、代替アプローチが必要である。本発明者らは、組換えサイトカインの制限に対処するリボサイトカインプラットフォーム技術（国際公開第２０１９１５４９８５Ａ１号）を開発している。患者の肝細胞によるコードされたサイトカインへのリボサイトカインＲＮＡ翻訳は、活性薬物の循環中への安定した放出を確実にし、サイトカインのヒト血清アルブミン（ｈＡｌｂ）への融合は、二次リンパ器官および腫瘍における血清半減期の延長および濃縮を媒介する。リボサイトカインのこの好ましい薬物動態プロファイルは、それらの組換え対応物の薬物動態プロファイルとは対照的であり、血液中の高いサイトカイン濃度に関連する重篤な毒性の確率を低下させ、頻繁な投与を回避するのに役立つ。
組換えｒｈＩＬ２の薬力学の欠点に特異的に対処するために、本発明者らは、ヒト血清アルブミンに融合したヒトＩＬ２変異体、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８をコードする薬理学的に最適化されたＲＮＡを以前に構築した。このＩＬ２変異体は、ＩＬ２Ｒαに対するその親和性を低下させ、ＩＬ２Ｒβへのその結合を増加させる変異を有する。
マウスにおいて、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８をコードする脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤化ｍＲＮＡの注射は、腫瘍増殖阻害および生存率の改善をもたらす。ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８による処置は、Ｔｒｅｇ細胞の刺激および拡大を回避しながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍応答を強化する。
ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８のこれらの独特の治療的および薬理学的特性は、最適にバランスのとれた安全性および有効性を有する治療プロトコルを開発することを必要とする。本開示は、ＲＮＡにコードされたＩＬ２変異体、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８の忍容性を高め、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方の拡大を可能にする臨床的に適切な治療レジメンを記載する。ＩＬ２およびＩＬ２変異体に加えて、これらの所見は、ＮＫ細胞の拡大をもたらす任意の種類の免疫療法に関連する（例えば、ＩＬ－１５およびその変異体、ならびにＩ型インターフェロン誘導物質）。
国際公開第２０１９１５４９８５Ａ１号パンフレット
Ｍｉｔｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４） Ｂｌａｔｔｍａｎ，Ｊ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，５４０－７（２００３） Ｓｐｏｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１８） Ｋａｍｍｕｌａ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｋｌａｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６） Ｓｔａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２００６） Ｗａｌｓｈ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（２０１２） ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００５） Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，８８９－９７（１９８７） Ａｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｇａｔｅｌｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８） Ｐｅａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８９） Ｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２０１４） Ｔｏｄｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．（２０１６） Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ＆Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｂｌｏｏｄ（２００６）
本発明は、一般に、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ、すなわち、サイトカイン、その機能的変異体、またはサイトカインもしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ（免疫賦活ＲＮＡ）の投与を含む、対象の免疫療法治療を包含する。サイトカイン、その機能的変異体、またはサイトカインもしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列は、本明細書では「サイトカイン免疫賦活剤」または単に「免疫賦活剤」とも呼ばれる。一実施形態では、ＲＮＡは、疾患関連抗原、例えば腫瘍によって発現される抗原に特異的なＴ細胞を維持するおよび／または刺激するために投与される。
一実施形態では、本発明は、例えば、抗原エピトープに特異的なＴ細胞を刺激するための１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡ（ワクチンＲＮＡ）を使用して、対象にワクチンを投与することをさらに含み得る。
対象において発現されたサイトカイン、機能的変異体または機能的断片によって引き起こされる望ましくない応答もしくは反応、またはその両方を低減する、すなわち低下させるまたは緩和するために、本発明は、スケジュールでの免疫賦活ＲＮＡの投与を提供し、このスケジュールでは、前記ＲＮＡの第１の用量および前記ＲＮＡの第２の用量が投与され、前記第１の用量および第２の用量の投与量および投与の期間は、前記対象において望ましくない応答または反応のレベルが低下するように選択される。一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡおよびコードされた免疫賦活剤はそれぞれ、特に本明細書に記載されるスケジュールに従って投与されない場合、例えば免疫賦活ＲＮＡが、より低いプライミング用量（例えば本明細書に記載の第１の用量）を投与せずに、最初の用量（例えば本明細書に記載の第２の用量）より高い用量、例えば、治療有効用量または標的用量で投与された場合、望ましくない応答または反応を引き起こすようなものである。一実施形態では、望ましくない応答または反応はＮＫ細胞を含み、ＮＫ細胞数の増加、発熱、倦怠感、体重の減少、肝酵素の活性の上昇、毛細血管漏出症候群、低血圧および浮腫からなる群より選択される１つ以上を含み得る。一実施形態では、肝酵素は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群より選択される１つ以上を含む。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、ＩＬ２、その機能的変異体、またはＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ、例えばヒトＩＬ２（ｈＩＬ２）、その機能的変異体、またはｈＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含むかまたはそれからなる。免疫賦活ＲＮＡは、Ｔ細胞刺激分子をコードするさらなるＲＮＡを含み得、したがって、例えばＩＬ７、その機能的変異体、またはＩＬ７もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡをさらに含み得る。一実施形態では、免疫賦活剤、例えばＩＬタンパク質、その機能的変異体、またはＩＬタンパク質もしくはその機能的変異体の機能的断片は、直接またはリンカーを介して薬物動態修飾基に融合される。例えば、ｈＩＬ、その機能的変異体、またはｈＩＬもしくはその機能的変異体の機能的断片は、直接またはリンカーを介して、ヒトアルブミン（ｈＡｌｂ）、その機能的変異体、またはｈＡｌｂもしくはその機能的変異体の機能的断片に融合され得る。
一実施形態では、１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡは、例えば標的抗原もしくはポリエピトープポリペプチドをコードするＲＮＡ分子、または異なる分子種のＲＮＡ分子、例えば２、３、４、５またはさらにそれ以上の異なる分子種のＲＮＡ分子の１つの分子種を含む。一実施形態では、そのようなＲＮＡ分子は、１つの抗原エピトープまたは２つ以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはさらにそれ以上の抗原エピトープ、例えば異なる抗原エピトープをコードし得る。１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡは、本明細書では「ワクチンＲＮＡ」とも称される。そのようなワクチンＲＮＡは、１つ以上の抗原エピトープを含むアミノ酸配列、すなわちワクチン配列、すなわち抗原配列をコードする。１つ以上の抗原エピトープは、１つ以上の標的抗原に由来してもよく、したがって、対象において１つ以上の標的抗原または１つ以上の標的抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導するのに適し得る。ワクチンＲＮＡは、（適切な標的細胞によるポリヌクレオチドの発現後に）標的抗原またはそのプロセシング産物を標的とし得る免疫応答、特に免疫エフェクタ細胞の誘導、すなわち刺激、プライミングおよび／または拡大のためのエピトープを提供するために投与される。一実施形態では、本開示に従って誘導される免疫応答は、Ｔ細胞媒介免疫応答である。一実施形態では、免疫応答は、腫瘍または癌細胞、特に腫瘍抗原を発現する腫瘍または癌細胞に対する免疫応答である。
本明細書に記載の組成物および方法は、レシピエントの細胞に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳され得る一本鎖ＲＮＡを活性成分として含む。野生型またはコドン最適化コード配列に加えて、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性のために最適化された１つ以上の構造要素（５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール）を含み得る。５’－ＵＴＲ配列として、翻訳効率を高めるために最適化された「コザック配列」を有していてもよい、ヒトα－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列を使用し得る。３’－ＵＴＲ配列として、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続性を確実にするために、コード配列とポリ（Ａ）テールとの間に配置された「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素（ＦＩ要素）の組合せを使用し得る。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０６０３１４号参照）。さらに、３０個のアデノシン残基のストレッチ、それに続く（ランダムヌクレオチドの）１０個のヌクレオチドリンカー配列および別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）テールを使用し得る。このポリ（Ａ）テール配列は、ＲＮＡ安定性および翻訳効率を高めるように設計された。
さらに、ワクチンＲＮＡにおいて、ｓｅｃ（分泌シグナルペプチド）および／またはＭＩＴＤ（ＭＨＣクラスＩ輸送ドメイン）は、それぞれの要素がそれぞれＮ末端タグまたはＣ末端タグとして翻訳されるようにエピトープコード領域に融合され得る。ヒトＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）をコードする配列に由来する融合タンパク質タグは、抗原プロセシングおよび提示を改善することが示されている。ｓｅｃは、新生ポリペプチド鎖の小胞体への移行を誘導する分泌シグナルペプチドをコードする７８ｂｐ断片に対応し得る。ＭＩＴＤは、ＭＨＣクラスＩ輸送ドメインとも呼ばれる、ＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通および細胞質ドメインに対応し得る。融合タンパク質に一般的に使用されるような、主にアミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる短いリンカーペプチドをコードする配列は、ＧＳ／リンカーとして使用され得る。
抗原エピトープは、免疫寛容を破壊するためにヘルパーエピトープと組み合わせて投与され得る。ヘルパーエピトープは、破傷風トキソイド由来、例えば破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の破傷風トキソイド（ＴＴ）由来のＰ２Ｐ１６アミノ酸配列であり得る。これらの配列は、プライミング中に腫瘍非特異的Ｔ細胞支援を提供することによって寛容機構を克服するのを支持し得る。破傷風トキソイド重鎖は、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に無差別に結合し、破傷風ワクチン接種を受けたほぼ全ての個体においてＣＤ４＋メモリＴ細胞を誘導することができるエピトープを含む。さらに、ＴＴヘルパーエピトープと腫瘍関連抗原との組合せは、プライミング中にＣＤ４＋媒介Ｔ細胞支援を提供することによって、腫瘍関連抗原単独の適用と比較して免疫刺激を改善することが公知である。ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するリスクを低減するために、無差別に結合するヘルパーエピトープを含むことが公知の２つのペプチド配列を使用して、可能な限り多くのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子、例えばＰ２およびＰ１６への結合を確実にし得る。
一実施形態では、ワクチン配列は、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープを含む。免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、直接またはリンカーによって分離されて、抗原配列のＣ末端に融合され得る。任意で、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、抗原配列とＭＩＴＤとを連結し得る。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡを、ヘルパーエピトープをコードするＲＮＡと共に適用して、得られる免疫応答を増強する。ヘルパーエピトープをコードするこのＲＮＡは、上述した安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性のために最適化された構造要素（５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール）を含み得る。
ＲＮＡ、すなわち免疫賦活ＲＮＡおよびワクチンＲＮＡは、静脈内（ｉ．ｖ．）投与のための血清安定性製剤を生成するために脂質粒子に製剤化され得る。免疫賦活ＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に存在し得る。ＲＮＡナノ粒子は、コードされたタンパク質の効率的な発現をもたらす肝臓を標的とし得る。一実施形態では、本明細書に記載の免疫賦活ＲＮＡは、静脈内投与用の脂質ナノ粒子として製剤化されるＮ１－メチルプソイドウリジン修飾ｄｓＲＮＡ精製ＲＮＡである。ワクチンＲＮＡは、ＲＮＡ－リポプレックス（ＬＰＸ）中に存在し得る。ＲＮＡ－リポプレックスは、免疫系の効率的な刺激をもたらすリンパ器官の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とし得る。異なるＲＮＡを別々に脂質と複合体化して、粒子製剤を生成し得る。一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列をコードするＲＮＡと共に粒子として共製剤化される。
一態様では、対象において、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡに対する望ましくない応答もしくは反応、またはその両方を低減する方法であって、
前記ＲＮＡの第１の用量；
前記ＲＮＡの第２の用量；
を対象に投与する工程を含み、ならびに
前記第１および第２の用量の投与量および投与期間が、前記対象において望ましくない応答または反応のレベルが低下するように選択される、
方法が本明細書で提供される。
一実施形態では、前記第１の用量で投与される前記ＲＮＡの量は、前記第２の用量で投与される前記ＲＮＡの量の８０％、７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％以下である。
一実施形態では、前記第１の用量で投与される前記ＲＮＡの量は、体重１ｋｇ当たり２００μｇ、１５０μｇ、１００μｇ、９０μｇ、８０μｇ、７０μｇ、６０μｇ、５０μｇ、４０μｇ、３０μｇ、２０μｇ、１０μｇ、５μｇ、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、０．５μｇ、０．４μｇ、０．３μｇ、０．２μｇ、または０．１μｇ以下であり、第２の用量は前記第１の用量よりも多い。
一実施形態では、前記第２の用量で投与される前記ＲＮＡの量は、体重１ｋｇ当たり２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、または４００μｇよりも多く、第２の用量は前記第１の用量よりも多い。
一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、１４、または２１日を超える日数により、第１の用量の投与の完了と第２の用量の投与の開始とが分けられる。
一実施形態では、５６、４９、４２、３５、または２８日以内の日数により、第１の用量の投与の完了と第２の用量の投与の開始とが分けられる。
一実施形態では、本方法は、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡの１つ以上のさらなる用量を対象に投与する工程をさらに含む。
一実施形態では、前記第１および第２の用量は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、皮内または筋肉内注射または注入によって投与される。
一実施形態では、前記第１および第２の用量は静脈内投与される。
一実施形態では、望ましくない応答または反応はＮＫ細胞を含む。
一実施形態では、望ましくない応答または反応は、ＮＫ細胞数の増加、発熱、倦怠感、体重の減少、肝酵素の活性の上昇、毛細血管漏出症候群、低血圧および浮腫からなる群より選択される１つ以上を含む。
一実施形態では、肝酵素は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群より選択される１つ以上を含む。
一実施形態では、望ましくない応答または反応は、第１の用量を投与せずに第２の用量を投与した後に起こる。
一実施形態では、本方法は、第１の用量、第２の用量、またはその両方の投与後に、対象を望ましくない応答または反応の存在について評価する工程をさらに含む。
一実施形態では、前記方法は、検出可能な望ましくない応答または反応を引き起こさない。
一実施形態では、前記方法は、望ましくない応答または反応の減少をもたらす。
一実施形態では、本方法は、ワクチンを対象に投与する工程をさらに含む。
一実施形態では、ワクチンを対象に投与する工程は、１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡを対象に投与する工程を含む。
一実施形態では、エピトープはＴ細胞エピトープである。
一実施形態では、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列は、延長薬物動態（ＰＫ）ポリペプチドを含む。
一実施形態では、延長ＰＫポリペプチドは融合タンパク質を含む。
一実施形態では、融合タンパク質は、薬物動態修飾基に融合したサイトカインタンパク質を含む。
一実施形態では、薬物動態修飾基は、アルブミン、その機能的変異体、またはアルブミンもしくはその機能的変異体の機能的断片を含む。
一実施形態では、薬物動態修飾基は、ヒトアルブミン、その機能的変異体、またはヒトアルブミンもしくはその機能的変異体の機能的断片を含む。
一実施形態では、薬物動態修飾基は、サイトカインタンパク質のＮ末端に融合される。
一実施形態では、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｎ－薬物動態修飾基－ＧＳリンカー－サイトカインタンパク質－Ｃを含む。
一実施形態では、サイトカインタンパク質はＩＬ２変異体を含む。
一実施形態では、ＩＬ２変異体はヒトＩＬ２変異体である。
一実施形態では、ヒトＩＬ２変異体は、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体の置換変異体を含む。
一実施形態では、１つ以上の置換は、βγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒβγ）に対する親和性を増強する。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた少なくとも８０位（ロイシン）、８１位（アルギニン）、８５位（ロイシン）および９２位（イソロイシン）で置換されている。
一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた８０位（ロイシン）がフェニルアラニンで置換され、８１位（アルギニン）がグルタミン酸で置換され、８５位（ロイシン）がバリンで置換され、９２位（イソロイシン）がフェニルアラニンで置換されている。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた７４位（グルタミン）でさらに置換されている。
一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた７４位（グルタミン）は、ヒスチジンで置換されている。
一実施形態では、１つ以上の置換は、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のαサブユニットに対する親和性を低下させる。
一実施形態では、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のαサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上の置換は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性をＩＬ２Ｒβγに対する親和性よりも大きく低下させる。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた少なくとも４３位（リジン）および６１位（グルタミン酸）で置換されている。
一実施形態では、４３位（リジン）はグルタミン酸で置換され、６１位（グルタミン酸）はリジンで置換されている。
一実施形態では、ＩＬ２変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して制御性Ｔ細胞を刺激する能力が低下している。
一実施形態では、ＩＬ２変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較してエフェクタＴ細胞を刺激する能力が増加している。
一実施形態では、サイトカインタンパク質は、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含み、前記ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた少なくとも４３位（リジン）でグルタミン酸によって、６１位（グルタミン酸）でリジンによって、７４位（グルタミン）でヒスチジンによって、８０位（ロイシン）でフェニルアラニンによって、８１位（アルギニン）でグルタミン酸によって、８５位（ロイシン）でバリンによって、および９２位（イソロイシン）でフェニルアラニンによって置換されている。
一実施形態では、ヒトＩＬ２は、配列番号１に従うアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列は、配列番号６に従うアミノ酸配列（ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８）を含む。
一実施形態では、対象はヒトである。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡ、すなわちサイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ、例えばＩＬ２、その機能的変異体、またはＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、ヒトＩＬ２（ｈＩＬ２）、その機能的変異体、またはヒトＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含む。一実施形態では、ヒトＩＬ２、その機能的変異体、またはヒトＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列は、ヒトアルブミン（ｈＡｌｂ）、その機能的変異体、またはｈＡｌｂもしくはその機能的変異体の機能的断片を含む。一実施形態では、ｈＡｌｂ、その機能的変異体、またはｈＡｌｂもしくはその機能的変異体の機能的断片は、ヒトＩＬ２、その機能的変異体、またはヒトＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片と融合される。一実施形態では、ｈＡｌｂ、その機能的変異体、またはｈＡｌｂもしくはその機能的変異体の機能的断片は、ヒトＩＬ２、その機能的変異体、またはヒトＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片のＮ末端に融合される。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列、または配列番号５もしくは６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、配列番号６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
一実施形態では、免疫賦活剤は、コドン最適化されたコード配列および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、ここで、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧを含む。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、修飾ＲＮＡ、特に安定化ｍＲＮＡである。一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列、または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド配列、または配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡはポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号１５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、免疫賦活剤は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｎ－ｈＡｌｂ－ＧＳリンカー－ｈＩＬ２／ｈＩＬ２変異体－Ｃを含む。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、液体として製剤化されるか、固体として製剤化されるか、またはそれらの組合せである。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは注射用に製剤化され、および／または注射によって投与される。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、静脈内投与用に製剤化され、および／または静脈内注射によって投与される。
一実施形態では、免疫賦活ＲＮＡは、脂質粒子として製剤化されるか、または製剤化されることになる。一実施形態では、ＲＮＡ脂質粒子は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。一実施形態では、ＬＮＰ粒子は、３Ｄ－Ｐ－ＤＭＡ、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、およびコレステロールを含む。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、癌を治療または予防するための方法である。一実施形態では、１つ以上の抗原エピトープは、腫瘍抗原に由来するエピトープである。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡ、すなわち抗原エピトープに特異的なＴ細胞を刺激するための１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡは、１つ以上の腫瘍抗原に由来するエピトープをコードする。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列、すなわちワクチン配列は、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通および細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、分泌シグナルペプチドをコードするアミノ酸配列をさらに含む。
一実施形態では、分泌シグナルペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列、または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ワクチン配列は、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含み、および／またはワクチンＲＮＡは、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列をコードするＲＮＡと同時投与される。一実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープを含む。一実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ワクチン配列は、コドン最適化されたコード配列および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされ、ここで、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされたアミノ酸配列の配列を変化させない。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、修飾ＲＮＡ、特に安定化ｍＲＮＡである。一実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。一実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）、および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、５’キャップｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐｓｐ（５’）Ｇを含む。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列、または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド配列、または配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡはポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号１５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
一実施形態では、ワクチン配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｎ－抗原配列－免疫寛容を破壊するアミノ酸配列－抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列－Ｃを含む。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、液体として製剤化されるか、固体として製剤化されるか、またはそれらの組合せである。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは注射用に製剤化され、および／または注射によって投与される。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、静脈内投与用に製剤化され、および／または静脈内投与によって投与される。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、リポプレックス粒子として製剤化されるか、または製剤化されることになっている。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、ＲＮＡをリポソームと混合することによって得られる。
一態様では、本明細書に記載のＲＮＡ、すなわち、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードする第１の用量のＲＮＡおよびサイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードする第２の用量のＲＮＡを含むキットであって、前記第１および第２の用量の投与量が、前記第１および第２の用量を対象に投与すると、前記対象において望ましくない応答または反応のレベルが低下するように選択される、キットが本明細書で提供される。キットは、いくつかの用量、例えば２、３、４、５またはさらにそれ以上の第１の用量および／または第２の用量を含み得る。キットは、抗原エピトープに特異的なＴ細胞を刺激するための１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡをさらに含み得る。これらのＲＮＡの実施形態は、本明細書に記載される通り、例えば本明細書に記載される方法について記載される通りである。一実施形態では、異なるＲＮＡおよび／または異なる用量のＲＮＡは、別々のバイアル中に存在する。一実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法においてＲＮＡを使用するための説明書を含む。一実施形態では、キットは、癌を治療または予防するためのＲＮＡの使用説明書を含む。一実施形態では、１つ以上の抗原エピトープは腫瘍抗原に由来する。一態様では、医薬用途のための本明細書に記載のキットが本明細書で提供される。一実施形態では、医薬用途は、疾患または障害の治療的または予防的処置を含む。一実施形態では、疾患または障害の治療的または予防的処置は、癌を治療または予防することを含む。
一態様では、本明細書に記載の方法において使用するための、本明細書に記載のＲＮＡ、すなわちサイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードする第１の用量のＲＮＡおよびサイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードする第２の用量のＲＮＡであって、前記第１および第２の用量の投与量が、前記第１および第２の用量を対象に投与すると、前記対象において望ましくない応答または反応のレベルが低下するように選択されるＲＮＡ、ならびに任意で、抗原エピトープに特異的なＴ細胞を刺激するための１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡが本明細書で提供される。
（図１）ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８の投与はマウスにおいて毒性をもたらすが、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２の投与は毒性をもたらさない。 ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）を、５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸ（５つの前立腺腫瘍抗原をコードする）、３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８および３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂ；３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８および３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂ；５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸおよび３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８；または５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸおよび３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２の三重の組合せのいずれかで静脈内（ｉ．ｖ．）処置した。全てのリボサイトカインを、本開示に記載される全ての実験を通してＬＮＰ製剤として投与した（実施例１を参照）。ＮａＣｌで処置したマウスを陰性対照とした。（図１Ａ）注射日（０日目）と比較したマウス体重の変化。点線は変化なしを示す。 統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定を使用して決定した。 処置の３日後の肝臓および組織の損傷の代用としてのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性についてのマウス血清の分析。点線、対照群の平均。統計的有意性は、ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した。全ての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して実施した。ｎｓ、有意差なし：Ｐ＞０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。平均±ＳＥＭ（Ａ）および平均（Ｂ）。 （図２）ｈＡｌｂ－ＩＬ２＿Ａ４ｓ８はＮＫ細胞の拡大を誘発し、続いて収縮および不応答性を誘発する。（図２Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１１／群）に５×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を皮下（ｓ．ｃ．）接種し、１０、１７、２４および３１日目に腫瘍抗原ｇｐ７０をコードする２０μｇのＲＮＡ－ＬＰＸワクチンで毎週ｉ．ｖ．処置した。リボサイトカインｈＡｌｂ－ｈＩＬ２、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８またはｈＩＬ７－ｈＡｌｂ（それぞれ３μｇ）をＲＮＡワクチンと同時にｉ．ｖ．投与した。対照群には、ＲＮＡ－ＬＰＸワクチンおよびｈＡｌｂのみをコードする６μｇのＬＮＰ製剤化ＲＮＡを投与した。血液中のＣＤ４９ｂ＋ＣＤ１９－ＣＤ４－ＣＤ８－ＮＫ細胞の数を、各処置の７日後（１７、２４および３１日目）にフローサイトメトリによって決定した。点線は処置日を示し、点線の数字はＲＮＡ－ＬＰＸ＋リボサイトカインの投与された回数を示す。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダネットの多重比較検定を使用して決定した。 ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１１／群）に５×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞をｓ．ｃ．接種し、１０、１７、２４および３１日目に、２０μｇのｇｐ７０ ＲＮＡ－ＬＰＸおよびｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８をコードする３μｇのＲＮＡを個別にまたは組み合わせて毎週ｉ．ｖ．処置した。対照群には、抗原をコードしないＬＰＸ製剤化ＲＮＡおよび３μｇのＬＮＰ製剤化ｈＡｌｂコードＲＮＡを投与した。血液中のＣＤ４９ｂ＋ＣＤ１９－ＣＤ４－ＣＤ８－ＮＫ細胞の数を、最初の処置の７日後（１７日目）にフローサイトメトリによって決定した。点線、対照群の平均。統計的有意性は、ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した。全ての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して実施した。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。平均±ＳＥＭ（Ａ）および平均（Ｂ）。 （図３）ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８に関連する毒性はＮＫ細胞に依存する。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）を、リボサイトカイン＋ＲＮＡ－ＬＰＸ処置の１日前に、ポリクローナルＮＫ細胞枯渇抗体（腹腔内注射によって投与された２０μＬの抗アシアロＧＭ１抗体）による事前のＮＫ細胞枯渇を伴ってまたは伴わずに、０、７、１４および２１日目に３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８、３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂおよび５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸでｉ．ｖ．処置した。ＮａＣｌで処置したマウスを陰性対照とした。（図３Ａ）０日目と比較したマウス体重の変化。点線は変化なしを示す。 統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定を使用して決定した。 処置の３日後の肝臓および組織の損傷の代用としてのＡＬＡＴ、ＡＳＡＴおよびＬＤＨ活性についてのマウス血清の分析。点線、ＮａＣｌ群の平均。統計的有意性は、ダネットの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して決定した。全ての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して実施した。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。平均±ＳＥＭ（Ａ）および平均（Ｂ）。 （図４）低用量ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８の前処置は、その後の処置の忍容性を促進する。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目にＮａＣｌ（対照；ｎ＝７）；０日目に３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８、３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂおよび５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸ（３μｇ；ｎ＝７）；０、７、１４および２１日目に０．５μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８、０．５μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂ、５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸ（０．５μｇ；ｎ＝１１）；または０日目に０．５μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８、０．５μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂおよび５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸ、続いて７、１４および２１日目に３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８、３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂおよび５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸ（０．５μｇ／３μｇ；ｎ＝７）のいずれかでｉ．ｖ．処置した。 （図４Ａ）０日目と比較したマウス体重の変化。水平の点線は変化がないことを示す。垂直の点線は治療日を示し、点線の数字はＲＮＡ－ＬＰＸ＋リボサイトカインの投与された回数を示す。 ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴおよびＬＤＨ活性についてのマウス血清の分析（３日目、ｎ＝７／群；２４日目、ｎ＝４）。点線、対照群の平均。統計的有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定を使用して決定した。全ての分析は両側であり、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して実施した。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１。平均±ＳＥＭ（Ａ）および平均（Ｂ）。 （図５）ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｈＡｌｂ－ＩＬ２＿Ａ４ｓ８処置を繰り返すと拡大するが、ＮＫ細胞は抵抗性になるＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）を、３週間空けて３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２Ａ４ｓ８で２回（０日目および２１日目；３週間ごと）；１．５μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８で１回（０日目）および３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８で１回（２１日目；３週間ごと＿用量漸増）；３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８で１回（２１日目；３週間のみ）；または３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２Ａ４ｓ８で３回（０、７、１４日目；毎週）のいずれかでｉ．ｖ．処置した。ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、０、７、１４、２１、２８および３５日目にフローサイトメトリによって血液中で測定した。（図５Ａ）ＣＤ４５＋細胞におけるＮＫ細胞の頻度。 ＣＤ４５＋細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度。点線は処置日を示し、点線の数字はリボサイトカインの投与された回数を示す。平均±ＳＥＭ。 （図６）低用量の前処置は、３週間の投与レジメンでさえも、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８の忍容性を高める。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）を、３週間空けて３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２Ａ４ｓ８で２回（０日目および２１日目；３週間ごと）；１．５μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８で１回（０日目）および３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８で１回（２１日目；３週間ごと＿用量漸増）；３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８で１回（２１日目；３週間のみ）；または３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２Ａ４ｓ８で３回（０、７、１４日目；毎週）のいずれかでｉ．ｖ．処置した。（図６Ａ）０日目と比較したマウス体重の変化（０～３日目を示す）。 ７日目と比較したマウス体重の変化（７～１０日目を示す）。 １４日目と比較したマウス体重の変化（１４～１７日目を示す）。 ２１日目と比較したマウス体重の変化（２１～２４日目を示す）。 ０日目と比較したマウス体重の変化（０～２８日目を示す）。点線は処置日を示し、点線の数字は処置の回数を示す。平均±ＳＥＭ。
配列の説明
以下の表は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。
Figure 2023554154000001
Figure 2023554154000002
Figure 2023554154000003
Figure 2023554154000004
Figure 2023554154000005
Figure 2023554154000006
Figure 2023554154000007
本開示を以下で詳細に説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）」，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当分野の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
以下において、本開示の要素を説明する。これらの要素を特定の実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および実施形態は、本開示を明示的に記載される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明示的に記載される実施形態を任意の数の開示される要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、記載される全ての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されていると見なされるべきである。
「約」という用語は、およそ、またはほぼ、を意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈において、一実施形態では、列挙または特許請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％、または±３％を意味する。
本開示を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「１つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別個の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個々の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に不可欠な特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかしながら、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本開示の特定の実施形態として企図され、すなわち、この実施形態の目的のためには、「含む」は、「からなる」または「から本質的になる」の意味を有すると理解されるべきである。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される各資料（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書などを含む）は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有しなかったことの承認と解釈されるべきではない。
定義
以下において、本開示の全ての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。定義されていない任意の用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。
本明細書で使用される「低減する」、「減少させる」、「阻害する」または「損なう」などの用語は、好ましくは少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％またはさらにそれ以上のレベルの全体的な低下または全体的な低下を生じさせる能力に関する。これらの用語は、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減を含む。
「増加させる」、「増強する」または「超える」などの用語は、好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、またはさらにそれ以上の増加または増強に関する。
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって互いに連結された約２個以上、約３個以上、約４個以上、約６個以上、約８個以上、約１０個以上、約１３個以上、約１６個以上、約２０個以上、および最大約５０個、約１００個または約１５０個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５０個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
「治療用タンパク質」は、治療有効量で対象に提供された場合、対象の状態または病態に対してプラスのまたは有利な効果を及ぼす。一実施形態では、治療用タンパク質は治癒特性または緩和特性を有し、疾患または障害の１つ以上の症状を改善する、緩和する、軽減する、逆転させる、発症を遅延させる、または重症度を軽減するために投与され得る。治療用タンパク質は予防特性を有し得、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患もしくは病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。「治療用タンパク質」という用語は、タンパク質またはペプチド全体を含み、それらの治療的に活性な断片も指すことができる。それはまた、タンパク質の治療的に活性な変異体を含み得る。治療活性タンパク質の例としては、免疫賦活剤およびワクチン接種のためのエピトープが挙げられるが、これらに限定されない。
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、好ましくは、アミノ酸配列からの少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。
本明細書における「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって親アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は、天然もしくは野生型（ＷＴ）アミノ酸配列であり得るか、または野生型アミノ酸配列の改変形態であり得る。好ましくは、変異体アミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して１～約２０個のアミノ酸修飾、好ましくは１～約１０個または１～約５個のアミノ酸修飾を有する。
本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界で見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列を有する。
本発明によれば、アミノ酸配列に関する「修飾」という用語は、野生型ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列などの親配列と比較して、親配列の変異体をもたらすアミノ酸配列の配列変化に関する。
本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。「変異体」という用語は、全ての突然変異体、スプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体配座変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体、および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。「変異体」という用語は、特にアミノ酸配列の断片を含む。
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、得られた産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含む。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列内の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の特性を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。一実施形態では、保存的アミノ酸置換は、以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のアミノ酸、いくつかの実施形態では連続するアミノ酸について与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良の配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を用いて行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。
「％同一」、「同一性％」という用語または同様の用語は、特に、比較される配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すことが意図されている。前記パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたってランダムに分布していてもよいが、必ずしもそうではない。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して配列を比較することによって行われる。比較のための最適なアラインメントは、手動で、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、もしくは前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。いくつかの実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ａｌｉｇｎ２ｓｅｑ）で入手可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）２８に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）１、－２に設定された一致／不一致スコア；（ｖ）線形に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）使用されている低複雑度領域のフィルタ。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）３に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されたマトリックス；（ｖ）存在：１１、拡張：１に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）条件付き組成スコアマトリックス調整。
同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数（例えば、参照配列中の位置の数）で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。
いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域について与えられる。例えば、参照核酸配列が２００個のヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のヌクレオチド、いくつかの実施形態では連続するヌクレオチドについて与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長について与えられる。
相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８または少なくとも９９％の同一性を示す。
本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、例えば組換えＤＮＡ操作により、当業者によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載のペプチドおよびアミノ酸変異体は、例えば固相合成および類似の方法などによる公知のペプチド合成技術を用いて容易に調製され得る。
一実施形態では、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の断片または変異体は、好ましくは「機能的断片」または「機能的変異体」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の１つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価である任意の断片または変異体に関する。免疫賦活剤に関して、１つの特定の機能は、断片または変異体が由来するアミノ酸配列によって示される１つ以上の免疫刺激活性である。抗原または抗原配列に関して、１つの特定の機能は、断片または変異体が由来するアミノ酸配列によって示される１つ以上の免疫原性活性（例えば免疫反応の特異性）である。本明細書で使用される「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、特に、親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸によって変化しており、それでも親分子または配列の機能の１つ以上を果たすことができる、例えば標的分子に対する免疫応答を刺激または誘導することができるアミノ酸配列を含む変異体分子または配列を指す。一実施形態では、親分子または配列のアミノ酸配列の改変は、分子または配列の特徴に有意に影響を及ぼさないかまたは変化させない。異なる実施形態では、機能的断片または機能的変異体の機能は、低下し得るが、依然として有意に存在し得、例えば、機能的変異体の免疫刺激活性または免疫原性は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施形態では、機能的断片または機能的変異体の機能は、親分子または配列と比較して増強され得る。
指定されたアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列の変異体またはその断片であり得る。例えば、本明細書での使用に適したアミノ酸配列は、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在する配列または天然配列とは配列が異なるように改変され得ることが当業者に理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「説明資料」または「説明書」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図、または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の組成物を含む容器に貼付されてもよく、または組成物を含む容器と共に出荷されてもよい。あるいは、説明資料と組成物が受領者によって協働して使用されることを意図して、説明資料は容器とは別に出荷されてもよい。
「単離された」は、天然状態から改変されたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え核酸などの「組換え物」は、天然には存在しない。
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。
本明細書で使用される「生理学的ｐＨ」は、約７．５のｐＨを指す。
「遺伝子改変」または単に「改変」という用語は、核酸による細胞のトランスフェクションを含む。「トランスフェクション」という用語は、細胞への核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本発明の目的のために、「トランスフェクション」という用語はまた、細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みを含み、細胞は、対象、例えば患者に存在し得る。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができ、例えば、細胞は患者の器官、組織および／または生物の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの用途では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されれば十分である。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。トランスフェクションプロセスで導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないので、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。そのような安定なトランスフェクションは、トランスフェクションのためにウイルスベースのシステムまたはトランスポゾンベースのシステムを使用することによって達成することができる。一般に、免疫賦活剤または抗原をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。
本明細書で使用される場合、「３Ｄ－Ｐ－ＤＭＡ」という用語は、好ましくは（６Ｚ，１６Ｚ）－１２－（（Ｚ）－デカ－４－エン－１－イル）ドコサ－６，１６－ジエン－１１－イル５－（ジメチルアミノ）ペンタノエートを指す。
本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡ」という用語は、好ましくは３－Ｎ－［（ω－メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシ－プロピルアミン（ＭＰＥＧ－（２ｋＤａ）－Ｃ－ＤＭＡまたはメトキシ－ポリエチレングリコール－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロピルカルバメート（２０００））を指す。
本明細書で使用される場合、「ＤＳＰＣ」という用語は、好ましくは１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１，２－ジオクタデカノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンまたはＰＣ（１８：０／１８：０））を指す。
本明細書で使用される場合、「コレステロール」という用語は、コレスタ－５－エン－３β－オール（３β－ヒドロキシ－５－コレステン５－コレステン－３β－オール）を指す。
免疫賦活剤
本発明は、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ（免疫賦活ＲＮＡ）の使用を含む。サイトカインタンパク質は、天然に存在するサイトカインまたはその機能的変異体またはサイトカインもしくは機能的変異体の機能的断片であり得る。一実施形態では、サイトカインタンパク質は、望ましくない応答または反応を誘導し、望ましくない応答または反応はＮＫ細胞を含み得、ＮＫ細胞数の増加、発熱、倦怠感、体重の減少、肝酵素の活性の上昇、毛細血管漏出症候群、低血圧および浮腫からなる群より選択される１つ以上を含み得る。一実施形態では、肝酵素は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群より選択される１つ以上を含む。一実施形態では、サイトカインタンパク質はＮＫ細胞の拡大を誘導する。一実施形態では、サイトカインタンパク質は、ＩＬ２、ＩＬ１５およびＩＬ１８、その機能的変異体、またはその機能的断片からなる群より選択される。
一実施形態では、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列は、ＩＬ２、その機能的変異体、またはＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ２、その機能的変異体、またはヒトＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡの使用を含む。
本明細書で投与される免疫賦活ＲＮＡは、ＩＬ７、その機能的変異体、またはＩＬ７もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡをさらに含み得る。一実施形態では、本明細書で投与される免疫賦活ＲＮＡは、ヒトＩＬ７、その機能的変異体、またはヒトＩＬ７もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡをさらに含み得る。
本明細書に記載される方法および薬剤は、免疫賦活部分（例えば、ＩＬ２またはＩＬ７）が薬物動態修飾基（以下では「延長薬物動態（ＰＫ）」免疫賦活剤と呼ばれる）に結合している場合に特に有効である。一実施形態では、前記ＲＮＡは、全身アベイラビリティのために肝臓を標的とする。肝細胞は効率的にトランスフェクトすることができ、大量のタンパク質を産生することができる。
「免疫賦活剤」は、免疫系の成分のいずれか、特に免疫エフェクタ細胞の活性化を誘導するかまたは活性を増加させることによって免疫系を刺激する任意の物質である。
サイトカインは、細胞シグナル伝達に重要である小さなタンパク質（約５～２０ｋＤａ）のカテゴリである。サイトカインの放出は、それらの周囲の細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインは、免疫調節剤として自己分泌シグナル伝達、パラ分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が含まれるが、一般にホルモンまたは成長因子は含まれない（用語が一部重複しているにもかかわらず）。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および肥満細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞および様々な間質細胞を含む幅広い細胞によって産生される。所与のサイトカインは、複数の種類の細胞によって産生され得る。サイトカインは受容体を介して作用し、免疫系において特に重要である；サイトカインは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答との間のバランスを調整し、特定の細胞集団の成熟、成長、および応答性を調節する。一部のサイトカインは、他のサイトカインの作用を複雑な方法で増強または阻害する。
インターロイキン（ＩＬ）は、顕著な構造特徴に基づいて４つの主要な群に分けることができるサイトカイン（分泌タンパク質およびシグナル分子）の群である。しかしながら、それらのアミノ酸配列類似性はかなり弱い（典型的には１５～２５％の同一性）。ヒトゲノムは、５０を超えるインターロイキンおよび関連タンパク質をコードする。
インターロイキン２（ＩＬ２）は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激するサイトカインである。ＩＬ２の生物学的活性は、細胞膜にまたがる３つのポリペプチドサブユニット：ｐ５５（ＩＬ２Ｒα、αサブユニット、ヒトではＣＤ２５としても知られる）、ｐ７５（ＩＬ２Ｒβ、βサブユニット、ヒトではＣＤ１２２としても知られる）およびｐ６４（ＩＬ２Ｒγ、γサブユニット、ヒトではＣＤ１３２としても知られる）のマルチサブユニットＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒ）を介して媒介される。ＩＬ２に対するＴ細胞応答は、（１）ＩＬ２の濃度；（２）細胞表面上のＩＬ２Ｒ分子の数；および（３）ＩＬ２が占有するＩＬ２Ｒの数（すなわち、ＩＬ２とＩＬ２Ｒとの間の結合相互作用の親和性）を含む様々な因子に依存する（Ｓｍｉｔｈ，「Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｑｕａｎｔａｌ」Ｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ７６６：２６３－２７１，１９９５））。ＩＬ２：ＩＬ２Ｒ複合体はリガンド結合時に内在化され、異なる成分は異なる選別を受ける。静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして投与された場合、ＩＬ２は急速な全身クリアランスを有する（半減期が１２．９分の初期クリアランス期、続いて半減期が８５分のより遅いクリアランス期）（Ｋｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：２００９－２０１７，１９９０）。
癌患者におけるＩＬ２の全身投与の結果は理想からほど遠い。患者の１５～２０％は高用量のＩＬ２に客観的に応答するが、大多数は応答せず、多くが吐き気、錯乱、低血圧、および敗血症性ショックを含む重篤な生命を脅かす副作用を経験する。用量を減らし、投与レジメンを調整することによって血清濃度を低下させる試みがなされており、毒性は低くなるが、そのような治療は有効性も低かった。
本開示によれば、ＩＬ２は、ヒトＩＬ２（ｈＩＬ２）などの天然に存在するＩＬ２であり得る。
一実施形態では、ヒトＩＬ２は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。
一実施形態では、ＩＬ２またはＩＬ２の断片もしくは変異体は、ＩＬ２受容体に結合する。
本開示によれば、特定の実施形態では、ＩＬ２、その機能的変異体、またはＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片は、薬物動態修飾基に結合している。以下では「延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ２」と呼ばれる得られた分子は、遊離ＩＬ２、その機能的変異体、またはＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片と比較して、延長された循環半減期を有する。延長ＰＫ ＩＬ２の延長された循環半減期は、インビボの血清ＩＬ２濃度が治療範囲内に維持されることを可能にし、潜在的に、Ｔ細胞を含む多くの種類の免疫細胞の活性化の増強をもたらす。その好ましい薬物動態プロファイルのために、非修飾ＩＬ２と比較した場合、延長ＰＫ ＩＬ２はより少ない頻度でより長期間にわたって投与され得る。特定の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ２の薬物動態修飾基は、特にＩＬ２がヒトＩＬ２である場合、ヒトアルブミン（ｈＡｌｂ）である。
一実施形態では、ｈＡｌｂは、配列番号３もしくは４のアミノ酸配列、配列番号３もしくは４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号３もしくは４のアミノ酸配列もしくは配列番号３もしくは４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。
ＩＬ７は、骨髄および胸腺の間質細胞によって分泌される造血成長因子である。これは、ケラチノサイト、樹状細胞、肝細胞、ニューロン、および上皮細胞によっても産生されるが、正常なリンパ球によっては産生されない。ＩＬ７は、Ｂ細胞およびＴ細胞の発生に重要なサイトカインである。ＩＬ７サイトカインと肝細胞増殖因子は、プレプロＢ細胞増殖刺激因子として機能するヘテロ二量体を形成する。マウスにおけるノックアウト試験は、ＩＬ７がリンパ系細胞の生存に必須の役割を果たすことを示唆した。
ＩＬ７は、ＩＬ７受容体αおよび共通γ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ７受容体に結合する。結合は、胸腺内でのＴ細胞発生および末梢内での生存に重要なシグナルのカスケードをもたらす。ＩＬ７受容体が遺伝的に欠損しているノックアウトマウスは、胸腺萎縮、Ｔ細胞発生の二重陽性段階での停止、および重度のリンパ球減少を示す。マウスへのＩＬ７の投与は、胸腺移出Ｔ細胞の増加、Ｂ細胞およびＴ細胞の増加、ならびにシクロホスファミド投与後または骨髄移植後のＴ細胞の回復の増加をもたらす。
本開示によれば、ＩＬ７は、ヒトＩＬ７（ｈＩＬ７）などの天然に存在するＩＬ７であり得る。
一実施形態では、ヒトＩＬ７は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。
一実施形態では、ＩＬ７またはＩＬ７断片もしくは変異体は、ＩＬ７受容体に結合する。
本開示によれば、特定の実施形態では、ＩＬ７、その機能的変異体、またはＩＬ７もしくはその機能的変異体の機能的断片は、薬物動態修飾基に結合している。以下では「延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ７」と呼ばれる得られた分子は、遊離ＩＬ７、その機能的変異体、またはＩＬ７もしくはその機能的変異体の機能的断片と比較して、延長された循環半減期を有する。延長ＰＫ ＩＬ７の延長された循環半減期は、インビボの血清ＩＬ７濃度が治療範囲内に維持されることを可能にし、潜在的に、Ｔ細胞を含む多くの種類の免疫細胞の活性化の増強をもたらす。その好ましい薬物動態プロファイルのために、非修飾ＩＬ７と比較した場合、延長ＰＫ ＩＬ７はより少ない頻度でより長期間にわたって投与され得る。特定の実施形態では、延長ＰＫ ＩＬ７の薬物動態修飾基は、特にＩＬ７がヒトＩＬ７である場合、ヒトアルブミン（ｈＡｌｂ）である。
一実施形態では、ｈＡｌｂは、配列番号３もしくは４のアミノ酸配列、配列番号３もしくは４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号３もしくは４のアミノ酸配列もしくは配列番号３もしくは４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。
本明細書に記載の免疫賦活ＲＮＡ、すなわちサイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ、例えば、ＩＬ２、その機能的変異体、またはＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡは、免疫賦活部分、例えばサイトカインもしくは機能的変異体、またはその機能的断片を含むポリペプチドをコードする。免疫賦活部分は、ＩＬ２由来の免疫賦活部分もしくはＩＬ２免疫賦活部分、またはＩＬ７由来の免疫賦活部分またはＩＬ７免疫賦活部分であり得る。ＩＬ２免疫賦活部分は、ＩＬ２、その機能的変異体、またはＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片であり得る。ＩＬ７免疫賦活部分は、ＩＬ７、その機能的変異体、またはＩＬ７もしくはその機能的変異体の機能的断片であり得る。
したがって、免疫賦活部分を含むポリペプチドは、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチド（本明細書では「ＩＬ２、その機能的変異体、またはＩＬ２もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列」とも称される）またはＩＬ７免疫賦活ポリペプチド（本明細書では「ＩＬ７、その機能的変異体、またはＩＬ７もしくはその機能的変異体の機能的断片を含むアミノ酸配列」とも称される）であり得る。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、ヒトＩＬ２などの天然に存在するＩＬ２の変異体を含む。特に、天然に存在するＩＬ２の変異体は、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含む。一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、βγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒβγ）に対する親和性が増強されるように置換されている。一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）に対する親和性が低下するようにさらに置換されている。一実施形態では、ＩＬ２の変異体は、制御性Ｔ細胞よりもエフェクタＴ細胞を活性化する。具体的には、ＩＬ２の変異体は、ＩＬ２Ｒβγ結合、特にＣＤ１２２結合を増強する変異（「ｍｕｔβγ」）を含み、および任意で、ＩＬ２Ｒαβγ結合、特にＣＤ２５結合に影響を及ぼす変異（「ｍｕｔα」）をさらに含み得る。特に、ＩＬ２の変異体は、Ｔｒｅｇ細胞の拡大の減少ならびにエフェクタＴ細胞およびＮＫ細胞の刺激、好ましくはＩＬ２Ｒβγ＋エフェクタＴ細胞およびＮＫ細胞の刺激の増加を示し得る。本明細書に記載のＩＬ２変異体ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８は、野生型ＩＬ２と比較して、より低い濃度で既に、Ｔｒｅｇ細胞を活性化する能力が著しく低下し、エフェクタ免疫細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のようなＩＬ２Ｒβγ＋エフェクタ免疫細胞を刺激する能力が増加していることを示す。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含み、ここで、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、少なくとも８０位（ロイシン）、８１位（アルギニン）、８５位（ロイシン）および９２位（イソロイシン）で置換されており、その置換は、βγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒβγ）に対する親和性を高める。一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた８６位（イソロイシン）で置換されていない。
一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた８０位（ロイシン）がフェニルアラニンで置換され、８１位（アルギニン）がグルタミン酸で置換され、８５位（ロイシン）がバリンで置換され、９２位（イソロイシン）がフェニルアラニンで置換されている。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた７４位（グルタミン）でさらに置換されている。一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた７４位（グルタミン）は、ヒスチジンで置換されている。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含み、ここで、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、少なくとも８０位（ロイシン）でフェニルアラニンによって、８１位（アルギニン）でグルタミン酸によって、８５位（ロイシン）でバリンによって、および９２位（イソロイシン）でフェニルアラニンによって置換されている。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた７４位（グルタミン）でヒスチジンによってさらに置換されている。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含み、ここで、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、少なくとも７４位（グルタミン）でヒスチジンによって、８０位（ロイシン）でフェニルアラニンによって、８１位（アルギニン）でグルタミン酸によって、８５位（ロイシン）でバリンによって、および９２位（イソロイシン）でフェニルアラニンによって置換されている。
一実施形態では、置換は、ＩＬ２Ｒβγに対する親和性を増強する。
一実施形態では、上記の置換されたＩＬ２またはその機能的変異体（ＩＬ２ムテイン）は、他の非置換残基では野生型ＩＬ２と同一のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、上記のＩＬ２ムテインは、野生型ヒトＩＬ２の１つ以上の部位または他の残基においてアミノ酸置換などのアミノ酸修飾を有する。一実施形態では、そのようなアミノ酸置換は、野生型ＩＬ２と比較した場合、ＩＬ２Ｒαβγに対する相対的に低下した親和性をもたらす（本明細書では「ｍｕｔα」変異とも呼ばれる）。一実施形態では、そのようなアミノ酸置換は、ＩＬ２Ｒαと接触するアミノ酸残基に存在する。
したがって、一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のαサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのαサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性をＩＬ２Ｒβγに対する親和性よりも大きく低下させる。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのαサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、３５位（リジン）、４３位（リジン）、６１位（グルタミン酸）および６２位（グルタミン酸）の少なくとも１つにヒトＩＬ２またはその機能的変異体の置換を含む。一実施形態では、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２中の酸性アミノ酸残基である場合、置換は塩基性アミノ酸残基によるものであり、アミノ酸残基が野生型ヒトＩＬ２中の塩基性アミノ酸残基である場合、置換は酸性アミノ酸残基によるものである。
異なる実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのαサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、少なくとも以下の位置にヒトＩＬ２またはその機能的変異体の置換を含む：
－３５位、
－４３位、
－６１位、
－６２位、
－３５位および４３位、
－３５位および６１位、
－３５位および６２位、
－４３位および６１位、
－４３位および６２位、
－６１位および６２位、
－３５位、４３位および６１位、
－３５位、４３位および６２位、
－３５位、６１位および６２位、
－４３位、６１位および６２位、または
－３５位、４３位、６１位および６２位。
一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換されている。一実施形態では、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、３５位が置換されている。一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換されている。
一実施形態では、４３位が置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換されている。
一実施形態では、６１位が置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、６２位が置換されている。一実施形態では、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、４３位および６１位が置換されている。一実施形態では、４３位がグルタミン酸で置換され、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、３５位、４３位および６１位が置換されている。一実施形態では、３５位がグルタミン酸で置換され、４３位がグルタミン酸で置換され、６１位がリジンで置換されている。
一実施形態では、６１位および６２位が置換されている。一実施形態では、６１位がリジンで置換され、６２位がリジンで置換されている。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγのαサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上のアミノ酸置換は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた４３位（リジン）および６１位（グルタミン酸）にヒトＩＬ２またはその機能的変異体の置換を含む。一実施形態では、４３位（リジン）はグルタミン酸で置換され、６１位（グルタミン酸）はリジンで置換されている。
一実施形態では、本開示は、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡの投与を提供し、ここで、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、少なくとも４３位（リジン）でグルタミン酸によって、６１位（グルタミン酸）でリジンによって、７４位（グルタミン）でヒスチジンによって、８０位（ロイシン）でフェニルアラニンによって、８１位（アルギニン）でグルタミン酸によって、８５位（ロイシン）でバリンによって、および９２位（イソロイシン）でフェニルアラニンによって置換されている。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた８６位（イソロイシン）で置換されていない。
一実施形態では、野生型ヒトＩＬ２は、配列番号１に従うアミノ酸配列を有する。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体のムテインは、野生型ヒトＩＬ２と比較して、制御性Ｔ細胞を刺激する能力が低下している。
一実施形態では、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体のムテインは、野生型ヒトＩＬ２と比較して、エフェクタＴ細胞を刺激する能力が増加している。
本明細書に記載のＩＬ２ムテインは、薬物動態修飾基に結合することができ、したがって、「延長薬物動態（ＰＫ）ＩＬ２」であり得る。
一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、延長薬物動態（ＰＫ）ポリペプチドである。一実施形態では、延長ＰＫポリペプチドは融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体のムテインの部分と、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体に対して異種である部分とを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＩＬ２またはその機能的変異体のムテインの部分と、血清アルブミン、免疫グロブリン断片、トランスフェリン、Ｆｎ３、およびそれらの変異体からなる群より選択される部分とを含む。一実施形態では、血清アルブミンは、マウス血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、免疫グロブリン断片は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。
本明細書で使用される場合、「ＩＬ２ムテイン」は、ＩＬ２の変異体（その機能的変異体を含む）、特にＩＬ２タンパク質に対する特定の置換が行われているポリペプチドを意味する。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒβγ結合、特にＣＤ１２２結合を増強するヒトＩＬ２タンパク質への置換（「ｍｕｔβγ」）が行われている。例えば、ＩＬ２ムテインは、天然のＩＬ２ポリペプチド鎖のアミノ酸置換によって特徴付けられ得、そのようなアミノ酸置換は、例えば、野生型ＩＬ２と比較した場合、ＩＬ２Ｒβγに対する相対的に増加した親和性をもたらし、その結果、ＩＬ２媒介刺激はもはやＩＬ２Ｒαの係合を必要としない。そのような変異体は、強力なＩＬ２シグナル伝達アゴニストである。特に好ましい実施形態は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、８０位のロイシン（Ｌｅｕ）残基、８１位のアルギニン（Ａｒｇ）残基、８５位のロイシン（Ｌｅｕ）残基、および９２位のイソロイシン（Ｉｌｅ）残基を含む。
一実施形態では、ＩＬ２Ｒαβγ結合、特にＣＤ２５結合に影響を及ぼすヒトＩＬ２タンパク質へのさらなる置換（「ｍｕｔα」）が行われている。例えば、ＩＬ２ムテインはまた、天然のＩＬ２ポリペプチド鎖のアミノ酸置換によって特徴付けられ得、そのようなアミノ酸置換は、例えば、野生型ＩＬ２と比較した場合、ＩＬ２Ｒαβγ、特にそのαサブユニットに対する相対的に低下した親和性をもたらす（すなわち、ＩＬ２ムテインは、「ｍｕｔβγ」変異に加えて「ｍｕｔα」変異も含む）。これらの変異は、ＩＬ２Ｒαと接触するアミノ酸残基に存在し得る。特に好ましい実施形態は、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた、３５位のリジン（Ｌｙｓ）残基、４３位のリジン（Ｌｙｓ）残基、６１位のグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基および６２位のグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基、またはそれらの任意の組合せを含む。
ＩＬ２ムテインは、他の非置換残基では野生型ＩＬ２と同一のアミノ酸配列を有し得る（すなわち、ＩＬ２ムテインは、「ｍｕｔβγ」および任意で「ｍｕｔα」変異を含む）。しかしながら、ＩＬ２ムテインは、天然のＩＬ２ポリペプチド鎖中の１つ以上の部位または他の残基におけるアミノ酸の挿入、欠失、置換および修飾によっても特徴付けられ得る。本発明に従って、任意のそのような挿入、欠失、置換および修飾は、任意でＩＬ２Ｒαβγに対する親和性を低下させる一方で、ＩＬ２Ｒβγに対する増強された親和性を有するＩＬ２ムテインをもたらし得る。
１つ以上の置換アミノ酸残基は、保存的置換であり得るが、必ずしもそうではない。
「野生型ＩＬ２に従って番号付けされた」とは、選択されたアミノ酸を、そのアミノ酸が野生型ＩＬ２の成熟配列において通常存在する位置を参照して同定することを意味する。ＩＬ２ムテインに挿入または欠失が行われる場合、当業者は、特定の位置に通常存在するアミノ酸がムテイン中の位置でシフトされ得ることを理解するであろう。しかしながら、シフトされたアミノ酸の位置は、隣接するアミノ酸と野生型ＩＬ２中のアミノ酸に隣接するアミノ酸との精査および相関によって容易に決定することができる。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸６２０～７５２のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸６２０～７５２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸６２０～７５２のアミノ酸配列もしくは配列番号６のアミノ酸６２０～７５２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸６２０～７５２のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸１～１７７のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸１～１７７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸１～１７７のアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸１～１７７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸１～１７７のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ヒトアルブミン（ｈＡｌｂ）などのアルブミンは、直接またはリンカーを介して免疫賦活部分に融合される。
一実施形態では、ｈＡｌｂは、配列番号３もしくは４のアミノ酸配列、配列番号３もしくは４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号３もしくは４のアミノ酸配列もしくは配列番号３もしくは４のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、ｈＡｌｂは、配列番号３または４のアミノ酸配列を含む。
ｈＡｌｂは、好ましくは、免疫賦活部分の循環半減期の延長を促進するために用いられる。したがって、特に好ましい実施形態では、本明細書に記載される免疫賦活ＲＮＡは、免疫賦活部分をコードする少なくとも１つのコード領域とｈＡｌｂをコードするコード領域とを含み、前記ｈＡｌｂは、好ましくは免疫賦活部分に、例えば免疫賦活部分のＮ末端および／またはＣ末端に融合されている。一実施形態では、ｈＡｌｂおよび免疫賦活化部分は、ＧＳリンカー、例えば配列番号１１のアミノ酸配列を有するＧＳリンカーなどのリンカーによって分離されている。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、配列番号５もしくは６のアミノ酸２５～７５２のアミノ酸配列、配列番号５もしくは６のアミノ酸２５～７５２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号５もしくは６のアミノ酸２５～７５２のアミノ酸配列もしくは配列番号５もしくは６のアミノ酸２５～７５２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、配列番号５または６のアミノ酸２５～７５２のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸２６～７７２のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸２６～７７２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸２６～７７２のアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸２６～７７２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸２６～７７２のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態によれば、シグナルペプチドは、直接またはリンカーを介して、任意で延長ＰＫ基、例えばアルブミン、特にｈＡｌｂに融合された免疫賦活部分に融合される。
そのようなシグナルペプチドは、典型的には約１５～３０アミノ酸の長さを示し、好ましくは融合されるポリペプチドのＮ末端に位置する配列であるが、これに限定されない。本明細書で定義されるシグナルペプチドは、好ましくは、融合されたペプチドまたはタンパク質を定義された細胞区画、好ましくは細胞表面、小胞体（ＥＲ）またはエンドソーム－リソソーム区画に輸送することを可能にする。
一実施形態では、本明細書で定義されるシグナルペプチド配列は、インターロイキンのシグナルペプチド配列を含むが、これに限定されない。一実施形態では、本明細書で定義されるシグナルペプチド配列は、特に免疫賦活部分が免疫賦活ポリペプチドのＮ末端部分である場合、免疫賦活部分が由来するインターロイキンのシグナルペプチド配列を含むが、これに限定されない。したがって、免疫賦活部分は、非成熟ＩＬ、すなわち、その内因性シグナルペプチドを含有するＩＬであり得る。
一実施形態では、本明細書で定義されるシグナルペプチド配列は、延長ＰＫ基、例えばアルブミンのシグナルペプチド配列を含むが、これに限定されない。一実施形態では、本明細書で定義されるシグナルペプチド配列は、特に延長ＰＫ基、例えばアルブミンが免疫賦活ポリペプチドのＮ末端部分である場合、延長ＰＫ基、例えばアルブミンが由来する延長ＰＫ基、例えばアルブミンのシグナルペプチド配列を含むが、これに限定されない。したがって、延長ＰＫ基、例えばアルブミンは、非成熟延長ＰＫ基、例えばアルブミン、すなわちその内因性シグナルペプチドを含有する延長ＰＫ基、例えばアルブミンであり得る。
一実施形態では、シグナル配列は、配列番号７のアミノ酸１～２５のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸１～２５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸１～２５のアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸１～２５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号７のアミノ酸１～２５のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、シグナル配列は、配列番号３のアミノ酸１～１８のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸１～１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸１～１８のアミノ酸配列もしくは配列番号３のアミノ酸１～１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号３のアミノ酸１～１８のアミノ酸配列を含む。
そのようなシグナルペプチドは、好ましくは、それらが融合されるコードされたポリペプチドの分泌を促進するために使用される。
したがって、特に好ましい実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、任意でｈＡｌｂに融合された免疫賦活タンパク質およびシグナルペプチドをコードする少なくとも１つのコード領域を含み、前記シグナルペプチドは、好ましくは任意でｈＡｌｂに融合された免疫賦活タンパク質に、より好ましくは任意でｈＡｌｂに融合された免疫賦活タンパク質のＮ末端に融合されている。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列、配列番号５もしくは６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号５もしくは６のアミノ酸配列もしくは配列番号５もしくは６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドは、配列番号５または６のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列、配列番号１８のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号１８のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列もしくは配列番号１８のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片を含み、および／または（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列を含み、および／または（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド配列、配列番号１８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号１８のヌクレオチド配列もしくは配列番号１８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片を含み、および／または（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１８のヌクレオチド配列を含み、および／または（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１９のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列、配列番号１９のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号１９のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列もしくは配列番号１９のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片を含み、および／または（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列もしくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１９のヌクレオチド５３～２３０８のヌクレオチド配列を含み、および／または（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列、配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号１９のヌクレオチド配列もしくは配列番号１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片を含み、および／または（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列もしくは配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＩＬ２免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列を含み、および／または（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２０のヌクレオチド５３～２３６８のヌクレオチド配列、配列番号２０のヌクレオチド５３～２３６８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド５３～２３６８のヌクレオチド配列もしくは配列番号２０のヌクレオチド５３～２３６８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片を含み、および／または（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２０のヌクレオチド５３～２３６８のヌクレオチド配列を含み、および／または（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列、配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列、または配列番号２０のヌクレオチド配列もしくは配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片を含み、および／または（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配列もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含むアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＩＬ７免疫賦活ポリペプチドをコードするＲＮＡは、（ｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列を含み、および／または（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
以下において、免疫賦活ＲＮＡの実施形態を説明し、その要素を説明するときに使用される特定の用語は以下の意味を有する：
ｈＡｇ－コザック：翻訳効率を高めるための最適化された「コザック配列」を有するヒトα－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列。
ＳＰ：シグナルペプチド。
ｈＡｌｂ：ヒトアルブミンをコードする配列。
ＩＬ２／ＩＬ７：それぞれのヒトＩＬまたは変異体または断片をコードする配列。
リンカー（ＧＳ）：融合タンパク質に一般的に使用される、主にアミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなるリンカーペプチドをコードする配列。
ＦＩ要素：３’－ＵＴＲは、「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアにコードされた１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素の組合せである。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された。
Ａ３０Ｌ７０：３０個のアデノシン残基のストレッチ、それに続く１０個のヌクレオチドのリンカー配列、およびＲＮＡの安定性と翻訳効率を高めるように設計された別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）テール。
一実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ２免疫賦活ＲＮＡは、構造：
ｈＡｇコザック－ＳＰ－ｈＡｌｂ－リンカー－成熟ＩＬ２－ＦＩ要素－ライゲーション３－Ａ３０ＬＡ７０
を含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ２免疫賦活剤は、構造：
ＳＰ－ｈＡｌｂ－リンカー－成熟ＩＬ２
を含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ７免疫賦活ＲＮＡは、構造：
ＳＰ－リンカー－成熟ｈＡｌｂ－ＦＩ要素－ライゲーション３－Ａ３０ＬＡ７０を伴うｈＡｇコザック－ＩＬ７
を含む。
一実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ７免疫賦活剤は、構造：
ＳＰ－リンカー－成熟ｈＡｌｂを伴うＩＬ７
を含む。
一実施形態では、ｈＡｇ－コザックは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ＩＬ２は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＩＬ２は、配列番号６のアミノ酸６２０～７５２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＩＬ７は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ｈＡｌｂは、配列番号３または４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＦＩは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、Ａ３０Ｌ７０は、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、本明細書に記載される免疫賦活ＲＮＡは、ウリジンの代わりに１－メチル－プソイドウリジンを含む。好ましい５’キャップ構造は、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧである。
上記で論じたように、ＩＬ２免疫賦活剤またはＩＬ７免疫賦活剤などの本明細書に記載される免疫賦活剤は、一般に、延長ＰＫ基との融合タンパク質として存在する。
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、２つ以上のサブユニットを含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。好ましくは、融合タンパク質は、２つ以上のサブユニット間の翻訳融合である。翻訳融合は、読み枠内の１つのサブユニットのコードヌクレオチド配列をさらなるサブユニットのコードヌクレオチド配列と遺伝子操作することによって生成され得る。サブユニットは、リンカーによって散在され得る。
本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の要素または成分またはドメインの結合を指す。
本明細書に記載される免疫賦活ポリペプチドは、免疫賦活部分および異種ポリペプチド（すなわち、免疫賦活剤ではないポリペプチド）を含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製され得る。免疫賦活剤は、循環半減期を増加させる延長ＰＫ基に融合され得る。延長ＰＫ基の非限定的な例を以下で説明する。サイトカインまたはその変異体などの免疫賦活剤の循環半減期を増加させる他のＰＫ基もまた、本開示に適用可能であることが理解されるべきである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミンドメイン（例えば、マウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン）である。
本明細書で使用される場合、「ＰＫ」という用語は、「薬物動態」の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝、および排泄を含む化合物の特性を包含する。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ基」は、生物学的に活性な分子に融合されるかまたは生物学的に活性な分子と一緒に投与された場合、生物学的に活性な分子の循環半減期を増加させるタンパク質、ペプチド、または部分を指す。延長ＰＫ基の例としては、血清アルブミン（例えばＨＳＡ）、免疫グロブリンＦｃまたはＦｃ断片およびその変異体、トランスフェリンおよびその変異体、ならびにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合剤（米国特許出願公開第２００５／０２８７１５３号および同第２００７／０００３５４９号に開示されている）が挙げられる。他の例示的な延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１６ Ｊｕｌ；１６（７）：９０３－１５に開示されている。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ」免疫賦活剤は、延長ＰＫ基と組み合わせた免疫賦活部分を指す。一実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤は、免疫賦活部分が延長ＰＫ基に連結または融合された融合タンパク質である。
特定の実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤の血清半減期は、免疫賦活剤単独（すなわち、延長ＰＫ基に融合されていない免疫賦活剤）と比較して増加している。特定の実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤の血清半減期は、免疫賦活剤単独の血清半減期と比較して少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、または１０００％長い。特定の実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤の血清半減期は、免疫賦活剤単独の血清半減期の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍である。特定の実施形態では、延長ＰＫ免疫賦活剤の血清半減期は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。
本明細書で使用される場合、「半減期」は、ペプチドまたはタンパク質などの化合物の血清または血漿濃度が、例えば分解および／またはクリアランスもしくは天然の機構による隔離に起因して、インビボで５０％減少するのに要する時間を指す。本明細書での使用に適した延長ＰＫ免疫賦活剤は、インビボで安定化されており、その半減期は、例えば、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する血清アルブミン（例えばＨＳＡまたはＭＳＡ）への融合によって増加している。半減期は、薬物動態分析などによる、それ自体公知の任意の方法で決定することができる。適切な技術は当業者には明らかであり、例えば一般に、適切な用量のアミノ酸配列または化合物を対象に適切に投与する工程；前記対象から血液試料または他の試料を一定の間隔で収集する工程；前記血液試料中のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのようにして得られたデータ（のプロット）から、アミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投与時の初期レベルと比較して５０％低下するまでの時間を計算する工程を含み得る。さらなる詳細は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓなどの標準的なハンドブックおよびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）に提供されている。Ｇｉｂａｌｄｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，２ｎｄ Ｒｅｖ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９８２）も参照されたい。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミンもしくはその断片、または血清アルブミンもしくはその断片の変異体（本開示の目的のために、それらの全てが「アルブミン」という用語に含まれる）を含む。本明細書に記載されるポリペプチドは、アルブミン（またはその断片もしくは変異体）に融合されてアルブミン融合タンパク質を形成し得る。そのようなアルブミン融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００７００４８２８２号に記載されている。
本明細書で使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１分子のアルブミン（またはその断片もしくは変異体）と、少なくとも１分子の治療用タンパク質などのタンパク質、特に免疫賦活剤との融合によって形成されるタンパク質を指す。アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドがアルブミンをコードするポリヌクレオチドとインフレームで連結されている核酸の翻訳によって生成され得る。治療用タンパク質およびアルブミンは、アルブミン融合タンパク質の一部になると、それぞれ、アルブミン融合タンパク質の「一部」、「領域」または「部分」（例えば「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）と呼ばれ得る。非常に好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、少なくとも１分子の治療用タンパク質（治療用タンパク質の成熟形態を含むがこれに限定されない）と、少なくとも１分子のアルブミン（アルブミンの成熟形態を含むがこれに限定されない）とを含む。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、投与されたＲＮＡの標的器官の細胞、例えば肝細胞などの宿主細胞によってプロセシングされ、循環中に分泌される。ＲＮＡの発現に使用される宿主細胞の分泌経路で起こる新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングには、シグナルペプチド切断；ジスルフィド結合の形成；適切な折り畳み；炭水化物の付加およびプロセシング（例えばＮ－結合型およびＯ－結合型グリコシル化など）；特異的タンパク質分解切断；ならびに／または多量体タンパク質へのアセンブリが含まれ得るが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、特にそのＮ末端にシグナルペプチドを有するプロセシングされていない形態でＲＮＡによってコードされ、細胞による分泌後、好ましくは、特にシグナルペプチドが切断された、プロセシングされた形態で存在する。最も好ましい実施形態では、「アルブミン融合タンパク質のプロセシングされた形態」は、本明細書では「成熟アルブミン融合タンパク質」とも呼ばれる、Ｎ末端シグナルペプチド切断を受けたアルブミン融合タンパク質産物を指す。
好ましい実施形態では、治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合の同じ治療用タンパク質の血漿安定性と比較して、より高い血漿安定性を有する。血漿安定性は、典型的には、治療用タンパク質がインビボで投与され、血流中に運ばれたときから、治療用タンパク質が分解され、血流から腎臓または肝臓などの臓器へと除去され、最終的に治療用タンパク質が体内から除去されるときまでの期間を指す。血漿安定性は、血流中の治療用タンパク質の半減期に関して計算される。血流中の治療用タンパク質の半減期は、当技術分野で公知の一般的なアッセイによって容易に決定することができる。
本明細書で使用される場合、「アルブミン」は、アルブミンの１つ以上の機能活性（例えば生物学的活性）を有する、アルブミンタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変異体を集合的に指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはその断片もしくは変異体、特にヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子の変異体を指す。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンとしては、雌鶏およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物に由来し得る。
特定の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその断片もしくは変異体、例えば米国特許第５，８７６，９６９号、国際公開第２０１１／１２４７１８号、国際公開第２０１３／０７５０６６号、および国際公開第２０１１／０５１４７８９号に開示されているものである。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書では互換的に使用される。「アルブミンおよび「血清アルブミン」という用語はより広範であり、ヒト血清アルブミン（ならびにその断片および変異体）ならびに他の種由来のアルブミン（ならびにその断片および変異体）を包含する。
本明細書で使用される場合、治療用タンパク質の治療活性または血漿安定性を延長するのに十分なアルブミンの断片は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の血漿安定性が非融合状態での血漿安定性と比較して延長または拡大されるように、タンパク質の治療活性または血漿安定性を安定化または延長するのに十分な長さまたは構造のアルブミン断片を指す。
アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、アルブミン配列の全長を含み得るか、または治療活性もしくは血漿安定性を安定化もしくは延長することができるその１つ以上の断片を含み得る。そのような断片は、１０個以上のアミノ酸の長さであり得るか、またはアルブミン配列からの約１５、２０、２５、３０、５０個、もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を含み得るか、またはアルブミンの特定のドメインの一部もしくは全部を含み得る。例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインにまたがるＨＳＡの１つ以上の断片を使用し得る。好ましい実施形態では、ＨＳＡ断片はＨＳＡの成熟形態である。
一般的に言えば、アルブミン断片または変異体は、少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。
本開示によれば、アルブミンは、天然に存在するアルブミンまたはその断片もしくは変異体であり得る。アルブミンはヒトアルブミンであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。
好ましくは、アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてアルブミンを含み、Ｃ末端部分として治療用タンパク質を含む。あるいは、Ｃ末端部分としてアルブミンを含み、Ｎ末端部分として治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質も使用し得る。
一実施形態では、１つ以上の治療用タンパク質は、１つ以上のペプチドリンカーを介してアルブミンに連結される。融合部分の間のリンカーペプチドは、部分間のより大きな物理的分離を提供し、したがって、例えばその同族受容体に結合するための治療用タンパク質部分のアクセス可能性を最大化し得る。リンカーペプチドは、それが柔軟であるかまたはより剛性であるようにアミノ酸で構成され得る。リンカー配列は、プロテアーゼによってまたは化学的に切断可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、天然免疫グロブリンの２本の重鎖のそれぞれのＦｃドメイン（またはＦｃ部分）によって形成される天然免疫グロブリンの部分を指す。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、ＦｃドメインがＦｖドメインを含まない単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の一部または断片を指す。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる。したがって、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば上部、中間および／もしくは下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそれらの変異体、部分もしくは断片の少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したヒンジドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えばＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠く。本明細書におけるＦｃドメインは、一般に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これには、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメイン全体を含むポリペプチド、ならびに、例えばヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのみを含むそのようなペプチドの断片が含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体を含むがこれらに限定されない、任意の種および／または任意のサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。Ｆｃドメインは、天然のＦｃおよびＦｃ変異体分子を包含する。本明細書に記載されるように、任意のＦｃドメインを、アミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインとは異なるように修飾し得ることは、当業者に理解されるであろう。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクタ機能（例えば、ＦｃγＲ結合）が低下している。
本明細書に記載されるポリペプチドのＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、ならびにＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ３分子に由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、Ｆｃドメインもしくはその断片、またはＦｃドメインもしくはその断片の変異体（本開示の目的のために、その全てが「Ｆｃドメイン」という用語に含まれる）を含む。Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含まない。本開示での使用に適したＦｃドメインは、いくつかの異なる供給源から得られ得る。特定の実施形態では、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１定常領域に由来する。しかしながら、Ｆｃドメインは、例えばげっ歯動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）種または非ヒト霊長動物（例えばチンパンジー、マカク）種を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることが理解される。
さらに、Ｆｃドメイン（またはその断片もしくは変異体）は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。
様々なＦｃドメイン遺伝子配列（例えばマウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）が、公的にアクセス可能な寄託物の形態で入手可能である。特定のエフェクタ機能を欠く、および／または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するＦｃドメイン配列を含む定常領域ドメインを選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、適切なＦｃドメイン配列（例えばヒンジ、ＣＨ２、および／もしくはＣＨ３配列、またはその断片もしくは変異体）は、当技術分野で広く認められている技術を使用してこれらの配列から導くことができる。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００５／０２８７１５３号、米国特許出願第２００７／０００３５４９号、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号、米国特許出願第２００７／０２６９４２２号、米国特許出願第２０１０／０１１３３３９号、国際公開第２００９／０８３８０４号、および国際公開第２００９／１３３２０８号に記載されているものなどの血清アルブミン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１７６，２７８号および米国特許第８，１５８，５７９号に開示されているように、トランスフェリンである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号、米国特許出願第２０１４／０２２００１７号、および米国特許出願第２０１７／０１４５０６２号に開示されているものなどの血清免疫グロブリン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されているものなどの、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン（Ｆｎ）ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質を作製する方法もまた、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されている。Ｆｎ３ベースの延長ＰＫ基の非限定的な例は、Ｆｎ３（ＨＳＡ）、すなわち、ヒト血清アルブミンに結合するＦｎ３タンパク質である。
特定の態様では、本開示による使用に適した延長ＰＫ免疫賦活剤は、１つ以上のペプチドリンカーを使用することができる。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列中の２つ以上のドメイン（例えば、延長ＰＫ部分および免疫賦活部分）を接続するペプチドまたはポリペプチド配列を指す。例えば、ペプチドリンカーを使用して、免疫賦活部分をＨＳＡドメインに接続し得る。
例えば免疫賦活剤に延長ＰＫ基を融合するのに適したリンカーは、当技術分野で周知である。例示的なリンカーとしては、グリシン－セリンポリペプチドリンカー、グリシン－プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン－アラニンポリペプチドリンカーが挙げられる。特定の実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンポリペプチドリンカー、すなわちグリシンおよびセリン残基からなるペプチドである。
抗原エピトープ
本発明は、ワクチン接種のためのＲＮＡの使用、すなわち１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡの使用を含み得る。
一実施形態では、１つ以上の抗原エピトープは、１つ以上の腫瘍抗原に由来する。一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、１つ以上の抗原エピトープをコードする単分子種のＲＮＡ、または各ＲＮＡが少なくとも１つの抗原エピトープをコードする異なる分子種のＲＮＡを含む。したがって、各ＲＮＡは、１つ以上のエピトープを含むアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、モノエピトープポリペプチドまたはポリエピトープポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドが２つ以上の抗原エピトープを含む場合、前記エピトープは同一および／または異なり得る。ワクチンＲＮＡは、コードされたアミノ酸配列を産生するために、対象の細胞、特に抗原提示細胞において翻訳され得る。一実施形態では、細胞によるアミノ酸配列の適切なプロセシング後、エピトープはＭＨＣによって提示され、適切なＴ細胞の刺激のために対象の免疫系に提示される。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、患者に投与されると、ＭＨＣ提示エピトープなどのエピトープの集合体、例えば２個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、および好ましくは最大６０個まで、５５個まで、５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、または３０個までのエピトープを提供し、これらのエピトープは腫瘍抗原に由来し得る。対象の細胞、特に抗原提示細胞によるこれらのエピトープの提示は、ＭＨＣに結合した場合にエピトープを標的化するＴ細胞をもたらし得、ＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現し、腫瘍細胞の表面に同じエピトープを提示する場合に、対象の腫瘍、好ましくは原発腫瘍ならびに腫瘍転移を標的化することをもたらし得る。
ワクチンＲＮＡを提供するために、本発明は、１つ以上の腫瘍抗原に由来し得る十分な数のエピトープを（コード配列として）ワクチンＲＮＡに任意に含めることを含み得る。エピトープはそのまま含まれてもよく、または天然に存在するタンパク質中の前記エピトープにも隣接するアミノ酸配列に隣接していてもよい。一実施形態では、エピトープは、それらが由来する完全な抗原によって（コード配列として）表される。そのような隣接配列は、それぞれ３個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、好ましくは最大５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、または３０個までのアミノ酸を含んでもよく、Ｎ末端および／またはＣ末端でエピトープ配列に隣接していてもよい。
ワクチンＲＮＡは、ポリエピトープポリペプチドまたはマルチエピトープポリペプチドの形態のエピトープをコードし得る。本開示の特定の実施形態では、ポリペプチドは、同じおよび／または異なる腫瘍関連抗原に由来する少なくとも２個のエピトープ、少なくとも３個のエピトープ、少なくとも４個のエピトープ、少なくとも５個のエピトープ、少なくとも６個のエピトープ、少なくとも７個のエピトープ、少なくとも８個のエピトープ、少なくとも９個のエピトープ、または少なくとも１０個のエピトープを含む。エピトープは、ワクチン配列の形態でポリペプチド中に存在してもよく、すなわちそれらの天然の配列状況で、例えば天然に存在するタンパク質中のエピトープにも隣接するアミノ酸配列に隣接して存在してもよい。そのような隣接配列は、それぞれ３個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、好ましくは最大５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、または３０個までのアミノ酸を含んでもよく、Ｎ末端および／またはＣ末端でエピトープ配列に隣接していてもよい。したがって、ワクチン配列は、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、好ましくは最大５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、または３０個までのアミノ酸を含み得る。一実施形態では、エピトープおよび／またはワクチン配列は、ポリペプチドの頭部から尾部へと整列している。
一実施形態では、エピトープおよび／またはワクチン配列は、リンカー、特に中性リンカーによって間隔を空けられている。本発明による「リンカー」という用語は、エピトープまたはワクチン配列などの２つのペプチドドメインの間に付加されて前記ペプチドドメインを接続するペプチドに関する。リンカー配列に関して特に制限はない。しかしながら、リンカー配列は、２つのペプチドドメインの間の立体障害を低減し、良好に翻訳され、エピトープのプロセシングを支援するまたは可能にすることが好ましい。さらに、リンカーは、免疫原性の配列要素を全く有さないかまたはごくわずかしか有さないべきである。リンカーは、好ましくは、望ましくない免疫反応を生じ得る、隣接するエピトープ間の接合部縫合から生じるもののような非内因性エピトープを生成すべきではない。したがって、ポリエピトープワクチンは、好ましくは、望ましくないＭＨＣ結合接合エピトープの数を減少させることができるリンカー配列を含むべきである。Ｈｏｙｔ ｅｔ ａｌ．（ＥＭＢＯ Ｊ．２５（８），１７２０－９，２００６）およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（１０），８６３５－４１，２００４）は、グリシンリッチ配列がプロテアソームプロセシングを損ない、したがってグリシンリッチリンカー配列の使用が、プロテアソームによってプロセシングされ得るリンカー含有ペプチドの数を最小限に抑えるように作用することを示した。さらに、グリシンはＭＨＣ結合溝の位置で強い結合を阻害することが観察された（Ａｂａｓｔａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（７），３５６９－７５，１９９３）。Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，６１（１），１１５－２６，２００５）は、アミノ酸配列に含まれるアミノ酸グリシンおよびセリンが、プロテアソームによってより効率的に翻訳およびプロセシングされるより柔軟なタンパク質をもたらし、コードされているエピトープへのより良好なアクセスを可能にすることを見出した。リンカーはそれぞれ、３個以上、６個以上、９個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、および好ましくは最大５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、または３０個までのアミノ酸を含み得る。好ましくは、リンカーはグリシンおよび／またはセリンアミノ酸が濃縮されている。好ましくは、リンカーのアミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％はグリシンおよび／またはセリンである。好ましい一実施形態では、リンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから実質的に構成される。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡによって提供される１つ以上の抗原エピトープは、異なるポリペプチド上に前記エピトープを含むポリペプチドの集合体をコードする異なるＲＮＡ分子によってコードされ、前記ポリペプチドはそれぞれ１つ以上のエピトープを含み、これもまた重複し得る。２つ以上のポリエピトープおよび／またはマルチエピトープポリペプチドをコードする異なるＲＮＡ分子を含むワクチンＲＮＡの場合、異なるポリペプチドによって提供されるエピトープは異なっていてもよく、または部分的に重複していてもよい。
抗原提示細胞などの対象の細胞中に存在すると、本発明によるポリペプチドは、抗原エピトープを産生するようにプロセシングされる。ワクチンＲＮＡの投与は、ＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞応答を誘発することができる、ＭＨＣクラスＩＩ提示エピトープを提供し得る。あるいはまたはさらに、ワクチンＲＮＡの投与は、ＭＨＣ提示エピトープが由来する抗原を発現する細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することができる、ＭＨＣクラスＩ提示エピトープを提供し得る。好ましくは、ワクチンＲＮＡは、細胞傷害性および／またはヘルパーＴ細胞応答のポリエピトープ刺激に有用である。
ワクチン接種のために使用される本明細書に記載の１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡは、好ましくは、ＲＮＡが投与されている対象においてＴ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。前記刺激された、プライミングされたおよび／または拡大されたＴ細胞は、好ましくは標的抗原、特に癌細胞、組織および／または器官によって発現される標的抗原、すなわち腫瘍抗原に向けられる。
本開示によれば、１つ以上の抗原エピトープを含むポリペプチドは、腫瘍抗原もしくはその断片（例えば、エピトープまたはワクチン配列）を含み得るか、または腫瘍抗原もしくはその断片の変異体を含み得る。一実施形態では、そのような変異体は、腫瘍抗原または断片と免疫学的に等価である。本開示の文脈において、「腫瘍抗原またはその断片の変異体」という用語は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす配列を意味し、刺激された、プライミングされた、および／または拡大されたＴ細胞は、特に疾患細胞、組織および／または器官によって提示された場合に、腫瘍抗原を標的とする。したがって、１つ以上の抗原エピトープを含むポリペプチドは、腫瘍抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る、腫瘍抗原の断片に対応し得るかもしくはそれを含み得る、または腫瘍抗原もしくはその断片に相同なアミノ酸配列に対応し得るかもしくはそれを含み得る。１つ以上のエピトープを含むポリペプチドが、腫瘍抗原の断片または腫瘍抗原の断片に相同なアミノ酸配列を含む場合、前記断片またはアミノ酸配列は、腫瘍抗原のＴ細胞エピトープなどのエピトープまたは腫瘍抗原のＴ細胞エピトープなどのエピトープに相同な配列を含み得る。したがって、本開示によれば、１つ以上のエピトープを含むポリペプチドは、腫瘍抗原の免疫原性断片または腫瘍抗原の免疫原性断片に相同なアミノ酸配列を含み得る。本開示による「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞を刺激、プライミングおよび／または拡大することができる抗原の断片に関する。Ｔ細胞による結合のための関連エピトープを提供するために、１つ以上のエピトープ（腫瘍抗原に類似）を含むポリペプチドが抗原提示細胞などの細胞によって提示され得ることが好ましい。
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じもしくは本質的に同じ免疫学的特性を示し、および／または、例えば免疫学的効果の種類に関して、同じもしくは本質的に同じ免疫学的効果を及ぼすことを意味する。本開示の文脈において、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは、免疫化に使用される抗原または抗原変異体の免疫学的効果または特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列に結合するＴ細胞または参照アミノ酸配列を発現する細胞などの対象の免疫系に曝露されたときに、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。したがって、抗原と免疫学的に等価である分子は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大に関して、Ｔ細胞が標的とする抗原と同じもしくは本質的に同じ特性を示し、および／または同じもしくは本質的に同じ効果を及ぼす。
一実施形態では、本明細書に記載のワクチンＲＮＡは、１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡを含む。一実施形態では、本明細書に記載のワクチンＲＮＡは、２つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡを含む。異なる実施形態では、２つ以上は、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、または１０以上を含む。２つ以上のＲＮＡは、混合物中に存在してもよく、または互いに別々に存在してもよく、その結果、例えば異なる時点でおよび／または異なる経路によって互いに別々に対象に投与されてもよい。
本明細書に記載の抗原エピトープは、１つ以上の腫瘍抗原に由来し得る。一実施形態では、本明細書に記載のワクチンＲＮＡは、１つ以上の腫瘍抗原またはその変異体もしくは断片をコードする。一実施形態では、腫瘍抗原は、癌組織と健常組織との間でそのアミノ酸配列が異ならない。あるいはまたはさらに、腫瘍抗原は、個体の腫瘍に特異的なネオ抗原であり得る。そのような実施形態では、１つ以上の抗原エピトープはネオエピトープを含み得る。ネオ抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化をもたらす癌細胞のゲノムにおける１つ以上の癌特異的変異から生じ得る。
本発明によれば、「ネオ抗原」という用語は、親ペプチドまたはタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸修飾を含むペプチドまたはタンパク質に関する。例えば、ネオ抗原は腫瘍関連ネオ抗原であり得、「腫瘍関連ネオ抗原」という用語は、腫瘍特異的変異、すなわち癌細胞の核酸における変異によるアミノ酸修飾を含むペプチドまたはタンパク質を含む。そのような変異は、公知の配列決定技術によって同定され得る。
本発明によれば、「腫瘍特異的変異」または「癌特異的変異」という用語は、腫瘍または癌細胞の核酸に存在するが、対応する正常な、すなわち非腫瘍または非癌細胞の核酸には存在しない体細胞変異に関する。「腫瘍特異的変異」および「腫瘍変異」という用語、ならびに「癌特異的変異」および「癌変異」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
一実施形態では、癌特異的アミノ酸修飾は、癌特異的体細胞変異を同定することによって、例えば癌組織または１つ以上の癌細胞のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡを配列決定することによって同定される。
一実施形態では、変異は、腫瘍標本のゲノム、エクソームおよび／またはトランスクリプトームと、非腫瘍形成性標本のゲノム、エクソームおよび／またはトランスクリプトームとの間の配列相違を同定することによって決定され得る、癌患者の腫瘍標本における癌特異的体細胞変異である。
本発明によれば、腫瘍標本は、腫瘍または癌細胞を含むかまたは含むと予想される、患者に由来する身体試料などの任意の試料に関する。身体試料は、血液などの任意の組織試料、原発性腫瘍もしくは腫瘍転移から得られた組織試料、または腫瘍もしくは癌細胞を含む任意の他の試料であり得る。
非腫瘍形成性標本は、患者、または好ましくは患者と同じ種の別の個体、好ましくは腫瘍もしくは癌細胞を含まないもしくは含まないと予想される健常個体に由来する身体試料などの任意の試料に関する。身体試料は、血液などの任意の組織試料または非腫瘍形成性組織からの試料であり得る。
癌特異的変異の決定は、患者の癌変異シグネチャの決定を含み得る。「癌変異シグネチャ」という用語は、患者の１つ以上の癌細胞に存在する全ての癌変異を指し得るか、または患者の１つ以上の癌細胞に存在する癌変異の一部分のみを指し得る。したがって、癌特異的変異の決定は、患者の１つ以上の癌細胞に存在する全ての癌特異的変異の同定を含み得るか、または患者の１つ以上の癌細胞に存在する癌特異的変異の一部分のみの同定を含み得る。
好ましくは、同定される変異は、非同義変異、好ましくは腫瘍または癌細胞で発現されるタンパク質の非同義変異である。
一実施形態では、癌特異的体細胞変異を同定するまたは配列相違を同定する工程は、１つ以上、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはさらにそれ以上の癌細胞の単一細胞配列決定を含む。したがって、本発明は、前記１つ以上の癌細胞の癌変異シグネチャを同定することを含み得る。一実施形態では、癌細胞は循環腫瘍細胞である。循環腫瘍細胞などの癌細胞は、単一細胞配列決定の前に単離し得る。
一実施形態では、癌特異的体細胞変異を同定するまたは配列相違を同定する工程は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用することを含む。
一実施形態では、癌特異的体細胞変異を同定するまたは配列相違を同定する工程は、腫瘍標本のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡを配列決定することを含む。
癌特異的体細胞変異または配列相違を明らかにするために、腫瘍標本から得られた配列情報を、好ましくは、患者または異なる個体のいずれかから得られ得る生殖系列細胞などの正常な非癌性細胞のＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸を配列決定することから得られた配列情報などの参照と比較する。一実施形態では、正常なゲノム生殖系列ＤＮＡは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られる。
「ゲノム」という用語は、生物または細胞の染色体中の遺伝情報の総量に関する。
「エクソーム」という用語は、発現される遺伝子のコード部分であるエクソンによって形成される生物のゲノムの一部を指す。エクソームは、タンパク質および他の機能的遺伝子産物の合成において使用される遺伝的青写真を提供する。これはゲノムの最も機能的に関連する部分であり、したがって、生物の表現型に寄与する可能性が最も高い。ヒトゲノムのエクソームは、全ゲノムの１．５％を構成すると推定されている（Ｎｇ，ＰＣ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎ．，４（８）：１－１５，２００８）。
「トランスクリプトーム」という用語は、１つの細胞または細胞の集団で産生されるｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、および他の非コードＲＮＡを含む全てのＲＮＡ分子のセットに関する。本発明に関連して、トランスクリプトームは、特定の時点で１つの細胞、細胞の集団、好ましくは癌細胞の集団、または所与の個体の全ての細胞で産生される全てのＲＮＡ分子のセットを意味する。
「変異」という用語は、参照と比較した核酸配列の変化または相違（ヌクレオチド置換、付加または欠失）を指す。「体細胞変異」は、生殖細胞（精子および卵子）を除く身体のいずれの細胞でも起こる可能性があり、したがって子供には受け継がれない。これらの変化は、（常にではないが）癌または他の疾患を引き起こし得る。好ましくは、変異は非同義変異である。「非同義変異」という用語は、翻訳産物におけるアミノ酸置換などのアミノ酸変化をもたらす変異、好ましくはヌクレオチド置換を指す。
本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、対象への接種時に免疫応答を誘導する組成物を指す。いくつかの実施形態では、誘導された免疫応答は、治療的および／または防御的免疫を提供する。
一実施形態では、ワクチンＲＮＡは、対象の細胞で発現されて、任意で発現されたアミノ酸配列のプロセシング後に、抗原エピトープを提供する。一実施形態では、抗原エピトープはＭＨＣに関連して提示される。一実施形態では、抗原エピトープをコードするＲＮＡは、対象の細胞において一過性に発現される。一実施形態では、抗原エピトープをコードするＲＮＡの投与後、抗原エピトープをコードするＲＮＡの発現が脾臓で起こる。一実施形態では、抗原エピトープをコードするＲＮＡの投与後、抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞における抗原エピトープをコードするＲＮＡの発現が起こる。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞からなる群より選択される。一実施形態では、抗原エピトープをコードするＲＮＡの投与後、肺および／または肝臓では抗原エピトープをコードするＲＮＡの発現は起こらないか、または本質的に起こらない。一実施形態では、抗原エピトープをコードするＲＮＡの投与後、脾臓における抗原エピトープをコードするＲＮＡの発現は、肺における発現量の少なくとも５倍である。
本明細書に記載の抗原エピトープは、標的抗原、すなわち免疫応答が誘発される抗原に由来し得る。例えば、抗原エピトープは、標的抗原の断片であり得る。標的抗原は腫瘍抗原であり得る。
抗原エピトープまたは抗原エピトープを含むアミノ酸配列をコードするワクチンＲＮＡを投与することによって本発明に従って対象に提供され得る抗原エピトープは、抗原エピトープが提供されている対象において、好ましくは免疫応答、例えば細胞性免疫応答の誘導をもたらし、好ましくはＴ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。前記免疫応答は、好ましくは、疾患細胞、組織および／または器官によって発現される場合、標的抗原、すなわち疾患関連抗原、特に腫瘍抗原に向けられる。
本明細書で使用される「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞の状態を指す。活性化はまた、シグナル伝達経路の開始、サイトカイン産生の誘導、および検出可能なエフェクタ機能に関連し得る。「活性化免疫エフェクタ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けている免疫エフェクタ細胞を指す。
「プライミング」という用語は、Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞がその特異的抗原と最初に接触し、エフェクタＴ細胞などのエフェクタ細胞への分化を引き起こすプロセスを指す。
「クローン拡大」または「拡大」という用語は、特定の実体が増加するプロセスを指す。本開示の文脈において、この用語は、好ましくは、免疫エフェクタ細胞が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特異的免疫エフェクタ細胞が増幅される免疫学的応答に関連して使用される。好ましくは、クローン拡大は免疫エフェクタ細胞の分化をもたらす。
「抗原」という用語は、免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む作用物質に関する。「抗原」という用語は、特にタンパク質およびペプチドを含む。一実施形態では、抗原は、免疫系の細胞、例えば樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞によって提示される。抗原またはＴ細胞エピトープなどのそのプロセシング産物は、一実施形態では、Ｔ細胞受容体もしくはＢ細胞受容体によって、または抗体などの免疫グロブリン分子によって結合される。したがって、抗原またはそのプロセシング産物は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応し得る。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原などの疾患関連抗原であり、エピトープはそのような抗原に由来する。
「疾患関連抗原」という用語は、その最も広い意味で使用されて、疾患に関連する任意の抗原を指す。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含む分子である。したがって、疾患関連抗原またはそのエピトープは、治療目的に使用され得る。疾患関連抗原は、癌、典型的には腫瘍に関連し得る。
抗原標的は、疾患、例えば癌の間に上方制御され得る。疾患組織では、抗原は健常組織とは異なり得、早期検出、特異的診断および治療、特に標的療法のための独自の可能性を提供することができる。
いくつかの実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。
本発明の文脈において、「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」という用語は、１つ以上の腫瘍または癌組織で発現または異常発現され、好ましくは正常条件下では限られた数の組織および／もしくは器官で、または特定の発生段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば、腫瘍抗原は、正常条件下では胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官、例えば精巣、栄養膜組織、例えば胎盤、または生殖系列細胞で特異的に発現され得る。これに関連して、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明の文脈における腫瘍抗原としては、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常条件下では特定の分化段階で特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常条件下では精巣および時には胎盤において特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖系列特異的抗原が挙げられる。本発明の文脈において、腫瘍抗原は、好ましくは癌細胞の細胞表面に関連し、好ましくは正常組織では発現されないか、またはまれにしか発現されない。好ましくは、腫瘍抗原または腫瘍抗原の異常発現は、癌細胞を同定する。本発明の文脈において、対象、例えば癌疾患に罹患している患者において癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、好ましくは前記対象における自己タンパク質である。好ましい実施形態では、本発明の文脈における腫瘍抗原は、正常条件下では非必須である組織もしくは器官、すなわち免疫系によって損傷された場合に対象の死をもたらさない組織もしくは器官において、または免疫系がアクセスできないかもしくはほとんどアクセスできない身体の器官もしくは構造において特異的に発現される。好ましくは、腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍抗原と癌組織で発現される腫瘍抗原とで同一である。
腫瘍抗原の例としては、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、β－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えばクローディン６、クローディン１８．２およびクローディン１２、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴが挙げられる。特に好ましい腫瘍抗原としては、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）およびクローディン６（ＣＬＤＮ６）が挙げられる。
「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原などの分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体によって認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約５～約１００、例えば約５～約５０、より好ましくは約８～約３０、最も好ましくは約８～約２５アミノ酸の長さであり得、例えば、エピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の長さであり得る。一実施形態では、エピトープは、約１０～約２５アミノ酸の長さである。「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞エピトープを含み、好ましくはＴ細胞エピトープに関する。
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子は、ペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）および非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方をＴ細胞に表示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約８～約１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドが有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約１０～約２５アミノ酸長であり、特に約１３～約１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドが有効であり得る。
本明細書で使用される場合、「ネオエピトープ」という用語は、正常な非癌性細胞または生殖系列細胞などの参照中には存在しないが、癌細胞に見出されるエピトープを指す。これには、特に、正常な非癌性細胞または生殖系列細胞中に対応するエピトープが見出されるが、癌細胞における１つ以上の変異に起因して、エピトープの配列が変化してネオエピトープを生じさせる状況が含まれる。
特定の実施形態によれば、シグナルペプチドは、本明細書に記載のワクチンＲＮＡ（上記のマルチエピトープポリペプチドを含む）によってコードされる抗原配列に、直接またはリンカー、例えば配列番号１１に従うアミノ酸配列を有するリンカーを介して融合される。
そのようなシグナルペプチドは、典型的には約１５～３０アミノ酸の長さを示し、好ましくは抗原配列のＮ末端に位置する配列であるが、これに限定されない。本明細書で定義されるシグナルペプチドは、好ましくは、ＲＮＡによってコードされる抗原配列を定義された細胞区画、好ましくは細胞表面、小胞体（ＥＲ）またはエンドソーム－リソソーム区画に輸送することを可能にする。一実施形態では、本明細書で定義されるシグナルペプチド配列は、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）をコードする配列に由来するシグナルペプチド配列を含むが、これに限定されず、好ましくは、新生ポリペプチド鎖の小胞体への移行を誘導する分泌シグナルペプチドをコードする７８ｂｐ断片に対応し、特に配列番号８のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む配列を含む。
一実施形態では、シグナル配列は、配列番号８のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号８のアミノ酸配列もしくは配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
そのようなシグナルペプチドは、好ましくは、コードされた抗原配列の分泌を促進するために使用される。より好ましくは、本明細書で定義されるシグナルペプチドは、本明細書で定義されるコードされた抗原配列に融合される。
したがって、特に好ましい実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、抗原配列およびシグナルペプチドをコードする少なくとも１つのコード領域を含み、前記シグナルペプチドは、好ましくは抗原配列、より好ましくは本明細書に記載の抗原配列のＮ末端に融合されている。
特定の実施形態によれば、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、直接またはリンカーを介して抗原配列に融合される。
抗原プロセシングおよび／または提示を増強するそのようなアミノ酸配列は、好ましくは抗原配列のＣ末端に（および任意で免疫寛容を破壊するアミノ酸配列のＣ末端に）位置するが、これに限定されない。本明細書で定義される抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、好ましくは抗原プロセシングおよび提示を改善する。一実施形態では、本明細書で定義される抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）に由来する配列、特に配列番号９のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む配列を含むが、これに限定されない。
一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号９のアミノ酸配列もしくは配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
抗原プロセシングおよび／または提示を増強するそのようなアミノ酸配列は、好ましくは、コードされた抗原配列の抗原プロセシングおよび／または提示を促進するために使用される。より好ましくは、本明細書で定義される抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、本明細書で定義されるコードされた抗原配列に融合される。
したがって、特に好ましい実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、抗原配列ならびに抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのコード領域を含み、抗原プロセシングおよび／または提示を増強する前記アミノ酸配列は、好ましくは抗原配列、より好ましくは本明細書に記載の抗原配列のＣ末端に融合されている。
破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の破傷風トキソイドに由来するアミノ酸配列は、プライミング中にＴ細胞支援を提供することによって自己抗原に対する免疫応答を効率的に開始するために、自己寛容機構を克服するために使用され得る。
破傷風トキソイド重鎖は、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に無差別に結合し、破傷風ワクチン接種を受けたほぼ全ての個体においてＣＤ４＋メモリＴ細胞を誘導することができるエピトープを含むことが公知である。さらに、破傷風トキソイド（ＴＴ）ヘルパーエピトープと腫瘍関連抗原との組合せは、プライミング中にＣＤ４＋媒介Ｔ細胞支援を提供することによって、腫瘍関連抗原単独の適用と比較して免疫刺激を改善することが公知である。腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答の意図された誘導と競合し得る破傷風配列でＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するリスクを低下させるために、破傷風トキソイドの断片Ｃ全体ではＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含有することが公知であるので、断片Ｃ全体は使用しない。可能な限り多くのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子への結合を確実にするために、無差別に結合するヘルパーエピトープを含有する２つのペプチド配列を代替的に選択した。エクスビボ試験のデータに基づいて、周知のエピトープｐ２（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ；ＴＴ８３０－８４４）およびｐ１６（ＭＴＮＳＶＤＤＡＬＩＮＳＴＫＩＹＳＹＦＰＳＶＩＳＫＶＮＱＧＡＱＧ；ＴＴ５７８－６０９）を選択した。ｐ２エピトープは、抗黒色腫活性を高めるために臨床試験におけるペプチドワクチン接種に既に使用されていた。
現在の非臨床データ（未公開）は、腫瘍抗原および無差別に結合する破傷風トキソイド配列の両方をコードするＲＮＡワクチンが、腫瘍抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増強および寛容の破壊の改善をもたらすことを示した。腫瘍抗原特異的配列とインフレームで融合した配列を含むワクチンを接種した患者からの免疫モニタリングデータは、選択された破傷風配列がほぼ全ての患者において破傷風特異的Ｔ細胞応答を誘導することができることを明らかにする。
特定の実施形態によれば、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、直接またはリンカー、例えば配列番号１１に従うアミノ酸配列を有するリンカーを介して、抗原配列に融合される。
免疫寛容を破壊するそのようなアミノ酸配列は、好ましくは抗原配列のＣ末端に（ならびに任意で抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列のＮ末端に、ここで、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列と抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列とは、直接またはリンカー、例えば配列番号１２に従うアミノ酸配列を有するリンカーを介して融合されていてもよい）位置するが、これに限定されない。本明細書で定義される免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、好ましくはＴ細胞応答を改善する。一実施形態では、本明細書で定義される免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、破傷風トキソイド由来のヘルパー配列ｐ２およびｐ１６に由来する配列（Ｐ２Ｐ１６）、特に配列番号１０のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む配列を含むが、これに限定されない。
一実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号１０のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１０のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
破傷風トキソイドヘルパーエピトープと融合した抗原ＲＮＡを使用する代わりに、抗原コードＲＮＡを、ワクチン接種中にＴＴヘルパーエピトープをコードする別個のＲＮＡと同時投与し得る。ここで、ＴＴヘルパーエピトープコードＲＮＡは、調製前に各抗原コードＲＮＡに付加することができる。このようにして、両方の化合物を所与のＡＰＣに送達するために、抗原およびヘルパーエピトープコードＲＮＡの両方を含む混合リポプレックスナノ粒子を形成し得る。
したがって、本発明は、
（ｉ）ワクチン抗原をコードするＲＮＡ、および
（ｉｉ）免疫寛容を破壊するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ
を含むリポプレックス粒子などの粒子の使用を提供し得る。
一実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープを含む。
一実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、約４：１～約１６：１、約６：１～約１４：１、約８：１～約１２：１、または約１０：１の比で免疫寛容を破壊するアミノ酸配列をコードするＲＮＡと共に、リポプレックス粒子などの粒子として共製剤化される。
以下において、ワクチンＲＮＡの実施形態を説明し、その要素を説明するときに使用される特定の用語は以下の意味を有する：
ｈＡｇ－コザック：翻訳効率を高めるための最適化された「コザック配列」を有するヒトα－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列。
ｓｅｃ／ＭＩＴＤ：抗原プロセシングおよび提示を改善することが示されている、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）をコードする配列に由来する融合タンパク質タグ。ｓｅｃは、新生ポリペプチド鎖の小胞体への移行を誘導する、分泌シグナルペプチドをコードする７８ｂｐ断片に対応する。ＭＩＴＤは、ＭＨＣクラスＩ輸送ドメインとも呼ばれる、ＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通および細胞質ドメインに対応する。
抗原：それぞれの抗原配列をコードする配列。
グリシン－セリンリンカー（ＧＳ）：融合タンパク質に一般的に使用される、主にアミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる短いリンカーペプチドをコードする配列。
Ｐ２Ｐ１６：免疫寛容を破壊するための破傷風トキソイド由来ヘルパーエピトープをコードする配列。
ＦＩ要素：３’－ＵＴＲは、「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアにコードされた１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素の組合せである。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された。
Ａ３０Ｌ７０：３０個のアデノシン残基のストレッチ、それに続く１０個のヌクレオチドのリンカー配列、およびＲＮＡの安定性と翻訳効率を高めるように設計された別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）テール。
一実施形態では、本明細書に記載のワクチンＲＮＡは、構造：
ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ（１）－抗原－ＧＳ（２）－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ（３）－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
を有する。
一実施形態では、本明細書に記載のワクチン抗原は、構造：
ｓｅｃ－ＧＳ（１）－抗原－ＧＳ（２）－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ（３）－ＭＩＴＤ
を有する。
一実施形態では、ｈＡｇ－コザックは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｓｅｃは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｐ２Ｐ１６は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＭＩＴＤは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＳ（１）は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＳ（２）は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＳ（３）は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＦＩは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、Ａ３０Ｌ７０は、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。好ましい５’キャップ構造は、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）である。
免疫賦活ＲＮＡの投与スケジュール
本発明は、２つの異なる用量、すなわち第１の用量および第２の用量のサイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ（免疫賦活ＲＮＡ）の使用を含む。免疫賦活ＲＮＡの第１の用量（プレ用量）を、免疫賦活ＲＮＡの第２の用量（例えば標的用量）よりも少ない量で投与することにより、対象における望ましくない応答または反応のレベルが低減されるまたは防止されることが見出された。第１の用量は、慣れ／馴化効果を生じさせるのに適していてもよく、免疫賦活ＲＮＡの治療有効用量よりも低くてもよい。第２の用量は、免疫賦活ＲＮＡの治療有効量であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫賦活ＲＮＡを投与するためのスケジュールは、許容できないレベルの望ましくない応答または反応を引き起こさない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫賦活ＲＮＡを投与するためのスケジュールは、例えば、本明細書に記載の第１の用量の投与を伴わない本明細書に記載の第２の用量のみの投与と比較した場合、より低いレベルの望ましくない応答または反応を引き起こす。実施形態では、より低いレベルの望ましくない応答または反応は、例えば、１つ以上アッセイまたは症状によって測定される場合、望ましくない応答または反応の減少、例えば、１％、５％、１０％、２５％、３０％、３５％または４０％未満の減少を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫賦活ＲＮＡを投与するためのスケジュールは、検出可能なレベルの望ましくない応答または反応を引き起こさない。
一実施形態では、前記第１の用量で投与される前記ＲＮＡの量は、前記第２の用量で投与される前記ＲＮＡの量の８０％、７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％以下である。
一実施形態では、前記第１の用量で投与される免疫賦活ＲＮＡの量は、体重１ｋｇ当たり２００μｇ、１９０μｇ、１８０μｇ、１７０μｇ、１６０μｇ、１５０μｇ、１４０μｇ、１３０μｇ、１２０μｇ、１１０μｇ、１００μｇ、９０μｇ、８０μｇ、７０μｇ、６０μｇ、５０μｇ、４０μｇ、３０μｇ、２０μｇ、１０μｇ、５μｇ、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、０．５μｇ、０．４μｇ、０．３μｇ、０．２μｇ、または０．１μｇ以下であり、第２の用量は前記第１の用量よりも多い。
一実施形態では、前記第２の用量で投与される免疫賦活ＲＮＡの量は、体重１ｋｇ当たり２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、または４００μｇよりも多く、第２の用量は前記第１の用量よりも多い。
前記第１の用量の量および／または前記第２の用量の量の免疫賦活ＲＮＡは、複数回、例えば２倍、３倍、４倍、５倍またはさらにそれ以上投与され得る。一実施形態では、第２の用量または複数の第２の用量の１つは、第１の用量または複数の第１の用量の投与の完了前には投与されない。一実施形態では、第２の用量／複数の第２の用量のうちの最初の用量は、第１の用量／複数の第１の用量のうちの最後の用量の投与後に投与される。
一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、１４、または２１日間を超える日数により、第１の用量の投与／１つ以上の第１の用量の投与の完了と、第２の用量の投与／１つ以上の第２の用量の投与の開始とが分けられる。
一実施形態では、５６、４９、４２、３５、または２８日以下の日数により、第１の用量の投与／１つ以上の第１の用量の投与の完了と、第２の用量の投与／１つ以上の第２の用量の投与の開始とが分けられる。
望ましくない応答または反応は、ＮＫ細胞を含み得、ＮＫ細胞数の増加、発熱、倦怠感、体重の減少、肝酵素の活性の上昇、毛細血管漏出症候群、低血圧および浮腫からなる群より選択される１つ以上を含み得る。一実施形態では、肝酵素は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群より選択される１つ以上を含む。一実施形態では、望ましくない応答または反応は、ＮＫ細胞拡大の誘導を含む。
本開示によれば、ワクチン接種、例えばワクチンＲＮＡの投与は、抗原エピトープによるＴ細胞の刺激をもたらし得る。本開示はさらに、免疫賦活ＲＮＡを投与することによるＴ細胞の維持および／またはさらなる刺激を提供する。一実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍発現抗原／腫瘍提示抗原エピトープによって抗原刺激される。この実施形態では、ワクチン接種、すなわちワクチンの投与は行われなくてもよい。一実施形態では、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤および／または放射線療法も投与される。
核酸
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子などのＤＮＡおよびＲＮＡを含むことが意図されている。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡを含む。
本明細書に記載の核酸は、組換えおよび／または単離された分子であり得る。
核酸は、ベクターに含まれ得る。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、λファージなどのファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを含む、当業者に公知の任意のベクターを含む。前記ベクターは、発現ベクターおよびクローニングベクターを含む。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列および特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物）またはインビトロ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般に、特定の所望のＤＮＡ断片を操作および増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠いていてもよい。
本開示では、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基の全部または大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されないが、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドへの、またはＲＮＡの末端（一方もしくは両方）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書ではまた、ＲＮＡ中のヌクレオチドが、化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることが企図される。本開示では、これらの改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と考えられる。
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関連するメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは、一般に、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写によって生成され、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸を指す。
一実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、「レプリコンＲＮＡ」または単に「レプリコン」、特に「自己複製ＲＮＡ」または「自己増幅ＲＮＡ」である。特に好ましい一実施形態では、レプリコンまたは自己複製ＲＮＡは、ｓｓＲＮＡウイルス、特にアルファウイルスなどのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスに由来するか、またはそれに由来する要素を含む。アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６参照）。多くのアルファウイルスの全ゲノム長は、典型的には１１，０００～１２，０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的には５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）テールを有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与する）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。典型的には、ゲノム中に２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～ｎｓＰ４）は、典型的には、ゲノムの５’末端付近から始まる第１のＯＲＦによって一緒にコードされ、一方アルファウイルスの構造タンパク質は、第１のＯＲＦの下流に見出され、ゲノムの３’末端付近に延びる第２のＯＲＦによって一緒にコードされる。典型的には、第１のＯＲＦは第２のＯＲＦよりも大きく、比率はおよそ２：１である。アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質をコードする核酸配列のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物のメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４）に類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルス生活環の初期段階に、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャＲＮＡのように直接作用する。アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報を標的細胞または標的生物に送達するために提案されている。単純なアプローチでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームによって置き換える。アルファウイルスに基づくトランス複製系は、２つの別個の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし、他方の核酸分子はトランスで前記レプリカーゼによって複製されることができる（したがってトランス複製系という名称）。トランス複製は、所与の宿主細胞中にこれらの核酸分子の両方が存在することを必要とする。トランスでレプリカーゼによって複製され得る核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能にするために特定のアルファウイルス配列要素を含まなければならない。
一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは修飾ヌクレオシドを有し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つの（例えば全ての）ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書で使用される「ウラシル」という用語は、ＲＮＡの核酸中に存在し得る核酸塩基の１つを表す。ウラシルの構造は：
Figure 2023554154000008
 である。
本明細書で使用される「ウリジン」という用語は、ＲＮＡ中に存在し得るヌクレオシドの１つを表す。ウリジンの構造は：
Figure 2023554154000009
 である。
ＵＴＰ（ウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：
Figure 2023554154000010
 を有する。
プソイドＵＴＰ（プソイドウリジン５’－三リン酸）は、以下の構造：
Figure 2023554154000011
 を有する。
「プソイドウリジン」は、ウリジンの異性体である修飾ヌクレオシドの一例であり、ウラシルは、窒素－炭素グリコシド結合の代わりに炭素－炭素結合を介してペントース環に結合している。
別の例示的な修飾ヌクレオシドはＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）であり、これは、構造：
Figure 2023554154000012
 を有する。
Ｎ１－メチルプソイドＵＴＰは、以下の構造：
Figure 2023554154000013
 を有する。
別の例示的な修飾ヌクレオシドは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）であり、これは、構造：
Figure 2023554154000014
 を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ中の１つ以上のウリジンは、修飾ヌクレオシドで置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、各ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはプソイドウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドはＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２種類以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよく、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から独立して選択される。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）およびＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ中の１つ以上、例えば全てのウリジンを置換する修飾ヌクレオシドは、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザウリジン、６－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオプソイドウリジン、２－チオプソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリルウリジン、５－ハロウリジン（例えば５－ヨードウリジンもしくは５－ブロモウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチルウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチルプソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルプソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチルプソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオプソイドウリジン）、５－メチル－２－チオウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオプソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチルプソイドウリジン、３－メチルプソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチルプソイドウリジン、１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシプソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオプソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、または当技術分野で公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか１つ以上であり得る。
一実施形態では、ＲＮＡは、他の修飾ヌクレオシドを含むか、またはさらなる修飾ヌクレオシド、例えば修飾シチジンを含む。例えば、一実施形態では、ＲＮＡにおいて、シチジンを５－メチルシチジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。一実施形態では、ＲＮＡは、５－メチルシチジンと、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）および５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）から選択される１つ以上とを含む。一実施形態では、ＲＮＡは、５－メチルシチジンおよびＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、各シチジンの代わりに５－メチルシチジンを含み、各ウリジンの代わりにＮ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは５’キャップを含む。一実施形態では、本開示のＲＮＡは、キャップされていない５’－三リン酸を有さない。一実施形態では、ＲＮＡは５’キャップ類似体によって修飾され得る。「５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出される構造を指し、一般に、５’－５’三リン酸結合によってｍＲＮＡに接続されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。ＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップ類似体を提供することは、５’キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写によって達成され得るか、またはキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡのためのビルディングブロックキャップは、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧ（時にｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’－ＯＡｐＧとも呼ばれる）であり、これは、以下の構造：
Figure 2023554154000015
 を有する。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’－ＯＡｐＧを含む例示的なキャップ１ ＲＮＡである：
Figure 2023554154000016
以下は、別の例示的なキャップ１ ＲＮＡ（キャップ類似体なし）である：
Figure 2023554154000017
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、一実施形態では、構造：
Figure 2023554154000018
 を有するキャップ類似体アンチリバースキャップ（ＡＲＣＡキャップ（ｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ））を使用して、「キャップ０」構造で修飾される。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３’ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである：
Figure 2023554154000019
いくつかの実施形態では、「キャップ０」構造は、構造：
Figure 2023554154000020
 を有するキャップ類似体β－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）を使用して生成される。
以下は、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２’ＯＧ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ）およびＲＮＡを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである：
Figure 2023554154000021
β－Ｓ－ＡＲＣＡの「Ｄ１」ジアステレオマーまたは「β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、β－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較してＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すβ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１１／０１５３４７号参照）。
特に好ましいキャップは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐＳｐＧ）またはｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧである。一実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡの場合、好ましいキャップは、ｍ２ ７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２’－Ｏ）ＡｐＧである。一実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡの場合、好ましいキャップは、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ２ ７，２’－ＯＧｐｐＳｐＧ）である。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５’側（上流）（５’－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３’側（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在し得る。５’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは５’キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５’キャップに直接隣接している。３’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の３’末端に位置するが、「３’－ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）配列を含まない。したがって、３’－ＵＴＲはポリ（Ａ）配列（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）配列に直接隣接している。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列、または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号１４のヌクレオチド配列、または配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。
特に好ましい５’－ＵＴＲは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい３’－ＵＴＲは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、３’－ポリ（Ａ）配列を含む。
本発明で使用される場合、「ポリ（Ａ）配列」または「ポリＡテール」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。ポリ（Ａ）配列は当業者に公知であり、本明細書に記載のＲＮＡの３’ＵＴＲに後続し得る。連続的なポリ（Ａ）配列は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリ（Ａ）配列が典型的である。本明細書に開示されるＲＮＡは、転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３’末端に結合されたポリ（Ａ）配列、またはＤＮＡによってコードされ、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたポリ（Ａ）配列を有し得る。
約１２０個のＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列は、トランスフェクトされた真核細胞におけるＲＮＡのレベル、およびポリ（Ａ）配列の上流（５’側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。
ポリ（Ａ）配列は任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。この文脈において、「から本質的になる」は、ポリ（Ａ）配列中のほとんどのヌクレオチド、典型的にはポリ（Ａ）配列中のヌクレオチドの数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、またはＣヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容することを意味する。この文脈において、「からなる」は、ポリ（Ａ）配列中の全てのヌクレオチド、すなわちポリ（Ａ）配列中のヌクレオチドの数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中、例えばインビトロ転写ＲＮＡの調製中に結合される。ポリ（Ａ）配列をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと呼ばれる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。そのようなカセットは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５３２４ Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダムな配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドＤＮＡの持続的な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性と翻訳効率を支持することに関して有益な特性と依然として関連している。結果として、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に含まれるポリ（Ａ）配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、その３’末端でポリ（Ａ）配列に隣接していない、すなわち、ポリ（Ａ）配列は、Ａ以外のヌクレオチドによってその３’末端でマスクされていないか、または後続されていない。
いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドから本質的になり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は約１５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は約１２０個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号１５のヌクレオチド配列、または配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリ（Ａ）配列を含む。
特に好ましいポリ（Ａ）配列は、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。
本開示によれば、ＲＮＡは、好ましくは、ＲＮＡを投与されている対象の細胞に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳される一本鎖５’キャップｍＲＮＡとして投与される。好ましくは、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関するＲＮＡの最大の有効性のために最適化された構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列）を含む。
一実施形態では、例えばＲＮＡ脂質粒子として製剤化された、本明細書に記載のＲＮＡの投与後、ＲＮＡの少なくとも一部が治療される対象の細胞に送達される。一実施形態では、ＲＮＡの少なくとも一部が細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、ＲＮＡは、細胞によって翻訳されて、それがコードするペプチドまたはタンパク質を産生する。本発明の全ての態様の一実施形態では、ＲＮＡは対象の細胞で一過性に発現される。本発明の全ての態様の一実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。本発明の全ての態様の一実施形態では、免疫賦活剤をコードするＲＮＡの場合、細胞は肝細胞である。一実施形態では、免疫賦活剤の発現は細胞外空間にある、すなわち、免疫賦活剤は分泌される。本発明の全ての態様の一実施形態では、ワクチンＲＮＡの場合、細胞は脾細胞である。本発明の全ての態様の一実施形態では、ワクチンＲＮＡの場合、細胞は、脾臓中のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。一実施形態では、細胞は、樹状細胞またはマクロファージである。一実施形態では、ワクチン配列は、ＭＨＣに関連して発現および提示される。本明細書に記載のＲＮＡ脂質粒子などのＲＮＡ粒子は、そのような細胞にＲＮＡを送達するために使用され得る。例えば、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、免疫賦活剤をコードするＲＮＡを肝臓に送達するために使用され得る。例えば、本明細書に記載のリポプレックス粒子（ＬＰＸ）は、ワクチンＲＮＡを脾臓に送達するために使用され得る。
本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてインビトロで合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニングベクターが転写物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、本発明で使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明によるインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモータによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
本明細書で使用される「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖がペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指令する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると呼ばれ得る。
一実施形態では、本発明に従って投与されるＲＮＡは非免疫原性である。
本明細書で使用される「非免疫原性ＲＮＡ」という用語は、例えば哺乳動物に投与したとき免疫系による応答を誘導しないか、または非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にする修飾および処理に供されていないという点においてのみ異なる同じＲＮＡによって誘導されるよりも弱い応答を誘導する、すなわち標準ＲＮＡ（ｓｔｄＲＮＡ）によって誘導されるよりも弱い応答を誘導するＲＮＡを指す。好ましい一実施形態では、本明細書において修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）とも呼ばれる非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオシドをＲＮＡに組み込み、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を除去することによって非免疫原性にされる。
修飾ヌクレオシドの組み込みによって非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にするために、ＲＮＡの免疫原性を低下させるまたは抑制する限り、任意の修飾ヌクレオシドを使用し得る。自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオシドが特に好ましい。一実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。一実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチル－プソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。特に好ましい一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）または５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、特にＮ１－メチルプソイドウリジンである。
一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換は、ウリジンの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の置換を含む。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの合成中、酵素の通常とは異なる活性のために二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む有意な量の異常な産物が産生される。ｄｓＲＮＡは、炎症性サイトカインを誘導し、エフェクタ酵素を活性化してタンパク質合成の阻害をもたらす。ｄｓＲＮＡは、例えば、非多孔質または多孔質Ｃ－１８ポリスチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）マトリックスを使用するイオン対逆相ＨＰＬＣによって、ＩＶＴ ＲＮＡなどのＲＮＡから除去することができる。あるいは、ｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡを特異的に加水分解し、それによってＩＶＴ ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ夾雑物を除去する大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩを用いた酵素ベースの方法を使用することができる。さらに、セルロース材料を使用することによってｄｓＲＮＡをｓｓＲＮＡから分離することができる。一実施形態では、ＲＮＡ調製物をセルロース材料と接触させ、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を許容しない条件下で、ｓｓＲＮＡをセルロース材料から分離する。
「除去する」または「除去」は、この用語が本明細書で使用される場合、ｄｓＲＮＡなどの第２の物質の集団の近傍から分離されている、非免疫原性ＲＮＡなどの第１の物質の集団の特徴を指し、第１の物質の集団は必ずしも第２の物質を欠くわけではなく、第２の物質の集団は必ずしも第１の物質を欠くわけではない。しかしながら、第２の物質の集団の除去を特徴とする第１の物質の集団は、第１の物質と第２の物質との分離されていない混合物と比較して、第２の物質の含有量が測定可能に低い。
一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡからのｄｓＲＮＡの除去は、非免疫原性ＲＮＡ組成物中のＲＮＡの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、または０．１％未満がｄｓＲＮＡであるようなｄｓＲＮＡの除去を含む。一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、ｄｓＲＮＡを含まないか、または本質的に含まない。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製調製物は、他の全ての核酸分子（ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％の一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。
一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも効率的に細胞内で翻訳される。一実施形態では、翻訳は、その非修飾対応物と比較して２倍増強される。一実施形態では、翻訳は３倍増強される。一実施形態では、翻訳は４倍増強される。一実施形態では、翻訳は５倍増強される。一実施形態では、翻訳は６倍増強される。一実施形態では、翻訳は７倍増強される。一実施形態では、翻訳は８倍増強される。一実施形態では、翻訳は９倍増強される。一実施形態では、翻訳は１０倍増強される。一実施形態では、翻訳は１５倍増強される。一実施形態では、翻訳は２０倍増強される。一実施形態では、翻訳は５０倍増強される。一実施形態では、翻訳は１００倍増強される。一実施形態では、翻訳は２００倍増強される。一実施形態では、翻訳は５００倍増強される。一実施形態では、翻訳は１０００倍増強される。一実施形態では、翻訳は２０００倍増強される。一実施形態では、倍数は１０～１０００倍である。一実施形態では、倍数は１０～１００倍である。一実施形態では、倍数は１０～２００倍である。一実施形態では、倍数は１０～３００倍である。一実施形態では、倍数は１０～５００倍である。一実施形態では、倍数は２０～１０００倍である。一実施形態では、倍数は３０～１０００倍である。一実施形態では、倍数は５０～１０００倍である。一実施形態では、倍数は１００～１０００倍である。一実施形態では、倍数は２００～１０００倍である。一実施形態では、翻訳は、任意の他の有意な量または量の範囲だけ増強される。
一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも有意に低い自然免疫原性を示す。一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、その非修飾対応物よりも２倍低い自然免疫応答を示す。一実施形態では、自然免疫原性は３倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は４倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は５倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は６倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は７倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は８倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は９倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は１０倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は１５倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は２０倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は５０倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は１００倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は２００倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は５００倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は１０００倍低下する。一実施形態では、自然免疫原性は２０００倍低下する。
「有意に低い自然免疫原性を示す」という用語は、自然免疫原性の検出可能な低下を指す。一実施形態では、この用語は、検出可能な自然免疫応答を誘発することなく有効量の非免疫原性ＲＮＡを投与することができるような低下を指す。一実施形態では、この用語は、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を検出可能に減少させるのに十分な自然免疫応答を誘発することなく非免疫原性ＲＮＡを繰り返し投与することができるような低下を指す。一実施形態では、低下は、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の検出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を誘発することなく非免疫原性ＲＮＡを繰り返し投与することができるようなものである。
「免疫原性」は、ＲＮＡなどの異物がヒトまたは他の動物の体内で免疫応答を引き起こす能力である。自然免疫系は、比較的非特異的で即時的な免疫系の成分である。これは、適応免疫系と共に、脊椎動物免疫系の２つの主要成分のうちの１つである。
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織または系からの、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織または系から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
コドン最適化／Ｇ／Ｃ含有量の増加
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸配列は、コドン最適化されたコード配列および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされる。これはまた、コード配列の１つ以上の配列領域がコドン最適化されており、および／または野生型コード配列の対応する配列領域と比較してＧ／Ｃ含有量が増加している実施形態を含む。一実施形態では、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変化させない。
「コドン最適化された」という用語は、好ましくは核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するための核酸分子のコード領域中のコドンの改変を指す。本発明の文脈内で、コード領域は、好ましくは、本明細書に記載のＲＮＡ分子を使用して治療される対象における最適な発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、翻訳効率が、細胞におけるｔＲＮＡの出現の異なる頻度によっても決定されるという所見に基づく。したがって、ＲＮＡの配列は、頻繁に生じるｔＲＮＡが利用可能であるコドンが「希少コドン」の代わりに挿入されるように改変され得る。
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡのコード領域のグアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量は、野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含有量と比較して増加しており、ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは野生型ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して改変されていない。ＲＮＡ配列のこの改変は、翻訳される任意のＲＮＡ領域の配列がそのｍＲＮＡの効率的な翻訳のために重要であるという事実に基づく。Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量が増加した配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量が増加した配列よりも安定である。いくつかのコドンが全く同じアミノ酸をコードする（いわゆる遺伝暗号の縮重）という事実に関して、安定性のために最も好ましいコドンを決定することができる（いわゆる代替コドン使用頻度）。ＲＮＡによってコードされるアミノ酸に応じて、ＲＮＡ配列の修飾には、その野生型配列と比較して様々な可能性がある。特に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、これらのコドンを、同じアミノ酸をコードするがＡおよび／もしくはＵを含まないかまたはより低い含有量のＡおよび／もしくはＵヌクレオチドを含む他のコドンで置換することによって改変することができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、またはさらにそれ以上増加している。
核酸含有粒子
本明細書に記載のＲＮＡなどの核酸は、粒子として製剤化されて投与され得る。
本開示の文脈において、「粒子」という用語は、分子または分子複合体によって形成される構造化された実体に関する。一実施形態では、「粒子」という用語は、媒体中に分散したマイクロサイズまたはナノサイズの緻密な構造体などのマイクロサイズまたはナノサイズの構造体に関する。一実施形態では、粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物を含む粒子などの核酸含有粒子である。
ポリマーおよび脂質などの正に帯電した分子と負に帯電した核酸との間の静電相互作用は、粒子形成に関与する。これは、核酸粒子の複合体化および自発的形成をもたらす。一実施形態では、核酸粒子はナノ粒子である。
本開示で使用される場合、「ナノ粒子」は、非経口投与に適した平均直径を有する粒子を指す。
「核酸粒子」を使用して、目的の標的部位（例えば細胞、組織、器官など）に核酸を送達することができる。核酸粒子は、少なくとも１つのカチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質、プロタミンなどの少なくとも１つのカチオン性ポリマー、またはそれらの混合物および核酸から形成され得る。核酸粒子には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベースおよびリポプレックス（ＬＰＸ）ベースの製剤が含まれる。
いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、カチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質および／またはカチオン性ポリマーは、核酸と一緒になって凝集体を形成し、この凝集はコロイド的に安定な粒子をもたらすと考えられる。
一実施形態では、本明細書に記載の粒子は、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の少なくとも１つの脂質または脂質様物質、カチオン性ポリマー以外の少なくとも１つのポリマー、またはそれらの混合物をさらに含む。
いくつかの実施形態では、核酸粒子は２種類以上の核酸分子を含み、核酸分子の分子パラメータは、モル質量または基本的な構造要素、例えば分子構造、キャッピング、コード領域もしくは他の特徴に関するように、互いに類似し得るかまたは異なり得る。
本明細書に記載の核酸粒子は、一実施形態では、約３０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約７０ｎｍ～約６００ｎｍ、約９０ｎｍ～約４００ｎｍ、または約１００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
本明細書に記載の核酸粒子は、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、または約０．２以下の多分散指数を示し得る。例として、核酸粒子は、約０．１～約０．３または約０．２～約０．３の範囲の多分散指数を示し得る。
ＲＮＡ脂質粒子に関して、Ｎ／Ｐ比は、脂質中の窒素基対ＲＮＡ中のリン酸基の数の比を与える。窒素原子（ｐＨに依存する）は通常正に帯電し、リン酸基は負に帯電するので、これは電荷比と相関する。電荷平衡が存在する場合、Ｎ／Ｐ比はｐＨに依存する。正に帯電したナノ粒子はトランスフェクションに有利であると考えられているので、脂質製剤は、４より大きく１２までのＮ／Ｐ比で形成されることが多い。その場合、ＲＮＡはナノ粒子に完全に結合していると見なされる。
本明細書に記載の核酸粒子は、少なくとも１つのカチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質および／または少なくとも１つのカチオン性ポリマーからコロイドを得る工程、ならびにコロイドを核酸と混合して核酸粒子を得る工程を含み得る広範囲の方法を使用して調製することができる。
本明細書で使用される「コロイド」という用語は、分散した粒子が沈降しない均一な混合物の一種に関する。混合物中の不溶性粒子は微視的であり、粒径は１～１０００ナノメートルである。混合物は、コロイドまたはコロイド懸濁液と呼ばれ得る。「コロイド」という用語は、混合物中の粒子のみを指し、懸濁液全体を指すのではない場合がある。
少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質および／または少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含むコロイドの調製のために、リポソーム小胞を調製するために従来使用され、適切に適合された方法が本明細書で適用可能である。リポソーム小胞を調製するために最も一般的に使用される方法は、以下の基本的段階を共有する：（ｉ）有機溶媒中での脂質溶解、（ｉｉ）得られた溶液の乾燥、および（ｉｉｉ）乾燥した脂質の水和（様々な水性媒体を使用して）。
膜水和法では、脂質を最初に適切な有機溶媒に溶解し、乾燥させてフラスコの底部に薄膜を得る。得られた脂質膜を、適切な水性媒体を用いて水和して、リポソーム分散液を得る。さらに、さらなる小型化工程が含まれてもよい。
逆相蒸発は、水相と脂質を含有する有機相との間の油中水型エマルジョンの形成を含む、リポソーム小胞を調製するための膜水和の代替方法である。この混合物の短時間の超音波処理は、系の均質化のために必要である。減圧下での有機相の除去により、その後リポソーム懸濁液に変わる乳白色のゲルが得られる。
「エタノール注入技術」という用語は、脂質を含むエタノール溶液が針を通して水溶液に迅速に注入されるプロセスを指す。この作用は、溶液全体に脂質を分散させ、脂質構造体形成、例えばリポソーム形成などの脂質小胞形成を促進する。一般に、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、コロイド状リポソーム分散液にＲＮＡを添加することによって得られる。エタノール注入技術を使用して、そのようなコロイド状リポソーム分散液は、一実施形態では、以下のように形成される：カチオン性脂質およびさらなる脂質などの脂質を含むエタノール溶液を、撹拌しながら水溶液に注入する。一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、押出工程なしで得られる。
「押し出す」または「押出」という用語は、固定された断面プロファイルを有する粒子の作製を指す。特に、この用語は粒子の小型化を指し、それによって粒子は規定された細孔を有するフィルタを通過することを強いられる。
有機溶媒を含まない特性を有する他の方法もまた、コロイドを調製するために本開示に従って使用され得る。
ＬＮＰは、典型的には４つの成分：イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイド、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含む。各成分はペイロード保護を担い、有効な細胞内送達を可能にする。ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を水性緩衝液中で核酸と迅速に混合することによって調製され得る。
「平均直径」という用語は、長さの次元を有するいわゆるＺ平均、および無次元である多分散指数（ＰＩ）を結果として提供する、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用したデータ分析を伴う動的レーザー光散乱（ＤＬＳ）によって測定される粒子の平均流体力学的直径を指す（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，１９７２，ｐｐ ４８１４－４８２０，ＩＳＯ １３３２１）。ここで、粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ平均の値と同義で使用される。
「多分散指数」は、「平均直径」の定義で言及されているように、好ましくは、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて計算される。特定の前提条件下では、これは、ナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度と見なすことができる。
様々な種類の核酸含有粒子が微粒子形態の核酸の送達に適することが以前に記載されている（例えばＫａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，６０）。非ウイルス核酸送達ビヒクルの場合、核酸のナノ粒子封入は、核酸を分解から物理的に保護し、特定の化学的性質に応じて、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を助けることができる。
本開示は、核酸、少なくとも１つのカチオン性もしくはカチオンにイオン化可能な脂質もしくは脂質様物質、および／または核酸と会合して核酸粒子を形成する少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含む粒子、ならびにそのような粒子を含む組成物を記載する。核酸粒子は、非共有結合相互作用によって様々な形態で粒子に複合体化される核酸を含み得る。本明細書に記載の粒子は、ウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、それらは細胞にウイルス感染することができない。
適切なカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質およびカチオン性ポリマーは、核酸粒子を形成するものであり、「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語に含まれる。「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語は、核酸と会合して核酸粒子を形成する任意の成分に関する。そのような成分は、核酸粒子の一部であり得る任意の成分を含む。
粒子製剤では、各ＲＮＡ種（例えば、ＩＬ２免疫賦活剤をコードするＲＮＡおよびＩＬ７免疫賦活剤をコードするＲＮＡ）を個々の粒子製剤として別々に製剤化することが可能である。その場合、個々の粒子製剤はそれぞれ１つのＲＮＡ種を含む。個々の粒子製剤は、別個の実体として、例えば別個の容器中に存在し得る。そのような製剤は、粒子形成剤と一緒に各ＲＮＡ種を別々に（典型的にはそれぞれＲＮＡ含有溶液の形態で）提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得られる。それぞれの粒子は、粒子が形成されるときに提供される特定のＲＮＡ種のみを含む（個々の粒子製剤）。一実施形態では、医薬組成物などの組成物は、複数の個々の粒子製剤を含む。それぞれの医薬組成物は、混合粒子製剤と呼ばれる。本発明による混合粒子製剤は、上記のように、個々の粒子製剤を別々に形成し、続いて個々の粒子製剤を混合する工程によって得られる。混合する工程により、ＲＮＡ含有粒子の混合集団を含む製剤が得られる（例示のために、例えば、粒子の第１の集団は、ＩＬ２免疫賦活剤をコードするＲＮＡを含み得、粒子の第２の製剤は、ＩＬ７免疫賦活剤をコードするＲＮＡを含み得る）。個々の粒子集団は、個々の粒子製剤の混合集団を含む１つの容器に一緒に存在し得る。あるいは、医薬組成物の全てのＲＮＡ種（例えば、ＩＬ２免疫賦活剤をコードするＲＮＡおよびＩＬ７免疫賦活剤をコードするＲＮＡ）を組み合わせた粒子製剤として一緒に製剤化することが可能である。そのような製剤は、粒子形成剤と共に全てのＲＮＡ種の組合せ製剤（典型的には組合せ溶液）を提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得られる。混合粒子製剤とは対照的に、組合せ粒子製剤は、典型的には複数のＲＮＡ種を含有する粒子を含む。組合せ粒子組成物では、異なるＲＮＡ種が、典型的には単一の粒子中に一緒に存在する。
カチオン性ポリマー
ポリマーは、それらの高度な化学的柔軟性を考慮して、ナノ粒子ベースの送達のために一般的に使用される材料である。典型的には、カチオン性ポリマーは、負に帯電した核酸をナノ粒子に静電的に凝縮するために使用される。これらの正に帯電した基は、多くの場合、５．５～７．５のｐＨ範囲でプロトン化の状態を変化させるアミンからなり、エンドソーム破裂をもたらすイオンの不均衡につながると考えられる。ポリ－Ｌ－リジン、ポリアミドアミン、プロタミンおよびポリエチレンイミンなどのポリマー、ならびにキトサンなどの天然に存在するポリマーは全て核酸送達に適用されており、本明細書におけるカチオン性ポリマーとして適している。さらに、一部の研究者は、特に核酸送達のためのポリマーを合成した。ポリ（β－アミノエステル）は、特に、その合成の容易さと生分解性のために核酸送達において広く使用されている。そのような合成ポリマーは、本明細書におけるカチオン性ポリマーとしても適している。
本明細書で使用される「ポリマー」は、その通常の意味、すなわち、共有結合によって連結された１つ以上の繰り返し単位（モノマー）を含む分子構造体という意味を与えられる。繰り返し単位は、全て同一であってもよく、または場合によっては、ポリマー内に複数の種類の繰り返し単位が存在してもよい。場合によっては、ポリマーは生物学的に誘導される、すなわちタンパク質などの生体高分子である。場合によっては、さらなる部分、例えば本明細書に記載されるような標的化部分もポリマー中に存在し得る。
複数の種類の繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、そのポリマーは「コポリマー」であると言われる。本明細書で使用されるポリマーはコポリマーであり得ることが理解されるべきである。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の方法で配置され得る。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、または「ブロック」コポリマーとして、すなわちそれぞれが第１の繰り返し単位（例えば第１のブロック）を含む１つ以上の領域、およびそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば第２のブロック）を含む１つ以上の領域、等を含むように配置され得る。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ以上の数の別個のブロックを有することができる。
特定の実施形態では、ポリマーは生体適合性である。生体適合性ポリマーは、典型的には中程度の濃度で有意な細胞死をもたらさないポリマーである。特定の実施形態では、生体適合性ポリマーは生分解性であり、すなわち、ポリマーは、体内などの生理学的環境内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。
特定の実施形態では、ポリマーは、プロタミンまたはポリアルキレンイミン、特にプロタミンであり得る。
「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、（魚のような）様々な動物の精子細胞中で体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、加水分解時に主にアルギニンを生成する、魚の精子に見出されるタンパク質を指す。精製形態では、それらは、インスリンの長時間作用型製剤において、ヘパリンの抗凝固作用を中和するために使用される。
本開示によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列およびその断片、および前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態、ならびに人工の、特定の目的のために特別に設計された、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを含むことが意図されている。
一実施形態では、ポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンおよび／またはポリプロピレンイミン、好ましくはポリエチレンイミンを含む。好ましいポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩの平均分子量は、好ましくは０．７５×１０２～１０７Ｄａ、好ましくは１０００～１０５Ｄａ、より好ましくは１００００～４００００Ｄａ、より好ましくは１５０００～３００００Ｄａ、さらにより好ましくは２００００～２５０００Ｄａである。
本開示によれば、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの直鎖状ポリアルキレンイミンが好ましい。
本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマー（ポリカチオン性ポリマーを含む）には、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性ポリマーが含まれる。一実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマーは、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、核酸が会合することができる任意のカチオン性ポリマーを含む。
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性ポリマー以外のポリマー、すなわち非カチオン性ポリマーおよび／またはアニオン性ポリマーを含み得る。集合的に、アニオン性および中性ポリマーは、本明細書では非カチオン性ポリマーと呼ばれる。
脂質および脂質様物質
「脂質」および「脂質様物質」という用語は、本明細書では、１つ以上の疎水性部分または基、および任意で１つ以上の親水性部分または基も含む分子として広く定義される。疎水性部分および親水性部分を含む分子はまた、しばしば両親媒性物質として示される。脂質は通常、水に難溶性である。水性環境では、両親媒性の性質は、分子が組織化された構造体と様々な相とに自己集合することを可能にする。それらの相の１つは、それらが水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜中に存在する場合、脂質二重層からなる。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基で置換されたそのような基を含むがこれらに限定されない無極性基を含むことによって付与され得る。親水性基は、極性基および／または荷電基を含み得、炭水化物、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、および他の同様の基を含む。
本明細書で使用される場合、「両親媒性」という用語は、極性部分と非極性部分の両方を有する分子を指す。多くの場合、両親媒性化合物は、長い疎水性尾部に結合した極性頭部を有する。いくつかの実施形態では、極性部分は水に可溶性であるが、非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は、形式正電荷または形式負電荷のいずれかを有し得る。あるいは、極性部分は、形式正電荷と形式負電荷の両方を有してもよく、双性イオンまたは内部塩であってもよい。本開示の目的のために、両親媒性化合物は、１つ以上の天然または非天然脂質および脂質様化合物であり得るが、これらに限定されない。
「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」という用語は、構造的および／または機能的に脂質に関連するが、厳密な意味で脂質とは見なされ得ない物質に関する。例えば、この用語は、水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜中に存在する場合に両親媒性層を形成することができる化合物を含み、界面活性剤、または親水性部分と疎水性部分の両方を有する合成化合物を含む。一般的に言えば、この用語は、脂質の構造と類似していても類似していなくてもよい、異なる構造組織を有する親水性部分と疎水性部分とを含む分子を指す。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、脂質および脂質様物質の両方を包含すると解釈されるべきである。
両親媒性層に含まれ得る両親媒性化合物の具体的な例としては、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、両親媒性化合物は脂質である。「脂質」という用語は、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。一般に、脂質は、８つのカテゴリ：脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、ポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合に由来する）、ステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合に由来する）に分けられ得る。「脂質」という用語は時に脂肪の同義語として使用されるが、脂肪はトリグリセリドと呼ばれる脂質のサブグループである。脂質はまた、脂肪酸およびその誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質を含む）などの分子、ならびにコレステロールなどのステロール含有代謝物を包含する。
脂肪酸、または脂肪酸残基は、末端がカルボン酸基である炭化水素鎖からなる多様な分子の群である；この配置は、分子に、極性の親水性末端と水に不溶性の非極性の疎水性末端とを付与する。典型的には４～２４炭素長である炭素鎖は、飽和であっても不飽和であってもよく、酸素、ハロゲン、窒素、および硫黄を含む官能基に結合していてもよい。脂肪酸が二重結合を含む場合、シスまたはトランス幾何異性のいずれかの可能性があり、これは分子の立体配置に有意に影響を及ぼす。シス二重結合は脂肪酸鎖を屈曲させ、これは、鎖中のより多くの二重結合と組み合わされる影響である。脂肪酸カテゴリにおける他の主要な脂質クラスは、脂肪酸エステルおよび脂肪酸アミドである。
グリセロ脂質は、一置換、二置換、および三置換グリセロールから構成され、最もよく知られているのは、トリグリセリドと呼ばれるグリセロールの脂肪酸トリエステルである。「トリアシルグリセロール」という語は、「トリグリセリド」と同義に使用されることがある。これらの化合物では、グリセロールの３つのヒドロキシル基はそれぞれ、典型的には異なる脂肪酸によってエステル化されている。グリセロ脂質のさらなるサブクラスは、グリコシド結合を介してグリセロールに結合した１つ以上の糖残基の存在を特徴とする、グリコシルグリセロールによって代表される。
グリセロリン脂質は、エステル結合によって２つの脂肪酸由来の「尾部」に、およびリン酸エステル結合によって１つの「頭部」基に結合したグリセロールコアを含む両親媒性分子（疎水性領域と親水性領域の両方を含む）である。通常リン脂質と呼ばれる（スフィンゴミエリンもリン脂質として分類されるが）グリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチンとしても公知）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥまたはＧＰＥｔｎ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳまたはＧＰＳｅｒ）である。
スフィンゴ脂質は、スフィンゴイド塩基骨格という共通の構造的特徴を共有する化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物における主要なスフィンゴイド塩基は、一般にスフィンゴシンと呼ばれる。セラミド（Ｎ－アシル－スフィンゴイド塩基）は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。脂肪酸は、典型的には、１６～２６個の炭素原子の鎖長を有する飽和または一不飽和である。哺乳動物の主要なスフィンゴリン脂質はスフィンゴミエリン（セラミドホスホコリン）であるが、昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを含有し、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールおよびマンノース含有頭部基を有する。スフィンゴ糖脂質は、グリコシド結合を介してスフィンゴイド塩基に結合した１つ以上の糖残基から構成される分子の多様なファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純なおよび複雑なスフィンゴ糖脂質である。
コレステロールおよびその誘導体、またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に膜脂質の重要な成分である。
サッカロ脂質は、脂肪酸が糖骨格に直接連結され、膜二重層と適合性である構造を形成する化合物を表す。サッカロ脂質では、単糖が、グリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール骨格と置き換わる。最もよく知られているサッカロ脂質は、グラム陰性菌のリポ多糖のリピドＡ成分のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的なリピドＡ分子は、７本もの脂肪アシル鎖で誘導体化されている、グルコサミンの二糖である。大腸菌での増殖に必要な最小限のリポ多糖は、２つの３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（Ｋｄｏ）残基でグリコシル化されたグルコサミンのヘキサアシル化二糖である、Ｋｄｏ２－リピドＡである。
ポリケチドは、古典的な酵素、ならびに脂肪酸シンターゼと機構的特徴を共有する反復およびマルチモジュラー酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合によって合成される。それらは、動物、植物、細菌、真菌および海洋源からの多数の二次代謝物および天然産物を含み、大きな構造的多様性を有する。多くのポリケチドは、その骨格がグリコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化、または他のプロセスによってさらに修飾されることが多い環状分子である。
本開示によれば、脂質および脂質様物質は、カチオン性、アニオン性または中性であり得る。中性脂質または脂質様物質は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在する。
カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質
本明細書に記載の核酸粒子は、粒子形成剤として少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含み得る。本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む。一実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、核酸と会合することができる。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」または「カチオン性脂質様物質」は、正味の正電荷を有する脂質または脂質様物質を指す。カチオン性脂質または脂質様物質は、静電相互作用によって負に帯電した核酸に結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシル鎖またはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。
特定の実施形態では、カチオン性脂質または脂質様物質は、特定のｐＨ、特に酸性ｐＨでのみ正味の正電荷を有するが、生理学的ｐＨなどの異なる、好ましくはより高いｐＨでは、好ましくは正味の正電荷を有さず、好ましくは電荷を有さず、すなわち中性である。このイオン化可能な挙動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助け、毒性を低減することによって有効性を高めると考えられる。
本開示の目的のために、そのような「カチオンにイオン化可能な」脂質または脂質様物質は、状況と矛盾しない限り、「カチオン性脂質または脂質様物質」という用語に含まれる。
一実施形態では、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、正に帯電しているかまたはプロトン化され得る少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む頭部基を含む。
カチオン性脂質の例としては、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、ｌ，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス、シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス、シス－９’，１２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（シス－９－テトラデセニルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（βＡＥ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（ＤＯＢＡＱ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＤＡＰ）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、２，３－ビス（ドデシルオキシ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アモニウムブロミド（ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミニウムブロミド（ＤＭＯＲＩＥ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）８，８’－（（（（２（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ジオクタノエート（ＡＴＸ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＬＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＭＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）－９－（（４－（ジメチルアミノブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、Ｎ－ドデシル－３－（（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－｛２－［（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－２－｛（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－［２－（２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ）エチル］－アミノ｝－エチルアミノ）プロピオンアミド（リピドイド９８Ｎ１２－５）、１－［２－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル－［２－［４－［２－［ビス（２ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル］ピペラジン－１－イル］エチル］アミノ］ドデカン－２－オール（リピドイドＣ１２－２００）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約１００モル％、約２０モル％～約１００モル％、約３０モル％～約１００モル％、約４０モル％～約１００モル％、または約５０モル％～約１００モル％を構成し得る。
さらなる脂質または脂質様物質
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の脂質または脂質様物質、すなわち非カチオン性脂質または脂質様物質（非カチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む）を含み得る。集合的に、アニオン性および中性脂質または脂質様物質は、本明細書では非カチオン性脂質または脂質様物質と呼ばれる。イオン化可能／カチオン性脂質または脂質様物質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分を添加することによって核酸粒子の製剤を最適化することにより、粒子の安定性および核酸送達の有効性を高め得る。
核酸粒子の全体的な電荷に影響を及ぼしても及ぼさなくてもよいさらなる脂質または脂質様物質を組み込み得る。特定の実施形態では、さらなる脂質または脂質様物質は、非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば、１つ以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」は、選択されたｐＨで負に帯電している任意の脂質を指す。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在するいくつかの脂質種のいずれかを指す。好ましい実施形態では、さらなる脂質は、以下の中性脂質成分の１つを含む：（１）リン脂質；（２）コレステロールもしくはその誘導体；または（３）リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
使用することができる特定のリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリン脂質としては、特に、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、およびさらに様々な疎水性鎖を有するホスファチジルエタノールアミン脂質が挙げられる。
特定の好ましい実施形態では、さらなる脂質は、ＤＳＰＣ、またはＤＳＰＣとコレステロールである。
特定の実施形態では、核酸粒子は、カチオン性脂質とさらなる脂質の両方を含む。
一実施形態では、本明細書に記載の粒子は、ペグ化脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含む。「ペグ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を指す。ペグ化脂質は当技術分野で公知である。
理論に拘束されることを望むものではないが、少なくとも１つのさらなる脂質の量と比較した少なくとも１つのカチオン性脂質の量は、電荷、粒径、安定性、組織選択性、および核酸の生物活性などの重要な核酸粒子特性に影響を及ぼし得る。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質とのモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２または約３：１～約１：１である。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質、特に中性脂質（例えば１つ以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約０モル％～約９０モル％、約０モル％～約８０モル％、約０モル％～約７０モル％、約０モル％～約６０モル％、または約０モル％～約５０モル％を構成し得る。
リポプレックス粒子
本開示の特定の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、ＲＮＡリポプレックス粒子中に存在し得る。
本開示の文脈において、「ＲＮＡリポプレックス粒子」という用語は、脂質、特にカチオン性脂質、およびＲＮＡを含有する粒子に関する。正に帯電したリポソームと負に帯電したＲＮＡとの間の静電相互作用は、ＲＮＡリポプレックス粒子の複合体化および自発的形成をもたらす。正に帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質、およびＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。
特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約２：１である。
本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、一実施形態では、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。
本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子およびＲＮＡリポプレックス粒子を含む組成物は、非経口投与後、特に静脈内投与後の標的組織へのＲＮＡの送達に有用である。ＲＮＡリポプレックス粒子は、脂質のエタノール溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得るリポソームを使用して調製され得る。一実施形態では、水相は酸性ｐＨを有する。一実施形態では、水相は、例えば約５ｍＭの量の酢酸を含む。リポソームは、リポソームをＲＮＡと混合することによってＲＮＡリポプレックス粒子を調製するために使用され得る。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、少なくとも１つのカチオン性脂質および少なくとも１つのさらなる脂質を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および／または１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）および／または１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）を含み、少なくとも１つのさらなる脂質は、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。一実施形態では、リポソームおよびＲＮＡリポプレックス粒子は、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）および１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む。
脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、全く起こらないかまたは本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓ではプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
一実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡなどの核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態で投与される。ＬＮＰは、１つ以上の核酸分子が結合している、または１つ以上の核酸分子が封入されている粒子を形成することができる任意の脂質を含み得る。
一実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質および１つ以上の安定化脂質を含む。安定化脂質は、中性脂質およびペグ化脂質を含む。
一実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、および脂質ナノ粒子内に封入されるかまたは脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。
一実施形態では、ＬＮＰは、４０～６０モル％または５０～６０モル％のカチオン性脂質を含む。
一実施形態では、中性脂質は、５～１５モル％、７～１３モル％、または９～１２モル％の範囲の濃度で存在する。
一実施形態では、ステロイドは、３０～５０モル％、または３０～４０モル％の範囲の濃度で存在する。
一実施形態では、ＬＮＰは、１～１０モル％、１～５モル％、または１～２．５モル％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。
一実施形態では、ＬＮＰは、４０～６０モル％のカチオン性脂質；５～１５モル％の中性脂質；３０～５０モル％のステロイド；１～１０モル％のポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に封入されるかまたは脂質ナノ粒子と会合したＲＮＡを含む。
一実施形態では、モルパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在する脂質の総モルに基づいて決定される。
一実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥ、およびＳＭからなる群より選択される。一実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群より選択される。一実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。
一実施形態では、ステロイドはコレステロールである。
一実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。一実施形態では、ペグ化脂質は、以下の構造：
Figure 2023554154000022
 式中、ｎは、約５０などの３０～６０の範囲の平均値を有する、
を有する。一実施形態では、ペグ化脂質はＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡである。
一実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、以下の構造：
Figure 2023554154000023
 を有する。
一実施形態では、カチオン性脂質は３Ｄ－Ｐ－ＤＭＡである。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、３Ｄ－Ｐ－ＤＭＡ、ＲＮＡ、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質はＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡである。
いくつかの実施形態では、３Ｄ－Ｐ－ＤＭＡは、ＬＮＰ中に約４０～約６０モル％の量で存在する。一実施形態では、中性脂質は、ＬＮＰ中に約５～約１５モル％の量で存在する。一実施形態では、ステロイドは、ＬＮＰ中に約３０～約５０モル％の量で存在する。一実施形態では、ＰＥＧ２０００－Ｃ－ＤＭＡなどのペグ化脂質は、ＬＮＰ中に約１～約１０モル％の量で存在する。
ＲＮＡ標的化
本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示されるＲＮＡ（例えば、ワクチンＲＮＡまたは免疫賦活ＲＮＡ）の標的化送達を含む。
一実施形態では、本開示は、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることを含む。投与されるＲＮＡがワクチンＲＮＡである場合、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることが特に好ましい。
一実施形態では、標的細胞は脾細胞である。一実施形態では、標的細胞は、脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。一実施形態では、標的細胞は脾臓中の樹状細胞である。
「リンパ系」は、循環系の一部であり、リンパを運ぶリンパ管のネットワークを含む免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ器官、リンパ管の伝導ネットワーク、および循環リンパからなる。一次または中枢リンパ器官は、未成熟な前駆細胞からリンパ球を生成する。胸腺および骨髄は、一次リンパ器官を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ器官は、成熟したナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。
ＲＮＡは、ＲＮＡがカチオン性脂質および任意でさらなる脂質またはヘルパー脂質を含むリポソームに結合して、注射可能なナノ粒子製剤を形成する、いわゆるリポプレックス製剤によって脾臓に送達され得る。リポソームは、脂質のエタノール溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得る。ＲＮＡリポプレックス粒子は、リポソームをＲＮＡと混合することによって調製され得る。脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、全く起こらないかまたは本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓ではプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
本開示のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する電荷とＲＮＡに存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷との比である。少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する正電荷とＲＮＡに存在する負電荷との電荷比は、以下の式によって計算される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（モル））＊（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（モル））＊（ＲＮＡ中の負電荷の総数）］。
生理学的ｐＨでの本明細書に記載の脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、好ましくは、約１．９：２～約１：２、または約１．６：２～約１：２、または約１．６：２～約１．１：２の正電荷対負電荷の電荷比などの正味の負電荷を有する。特定の実施形態では、生理学的ｐＨでのＲＮＡリポプレックス粒子中の正電荷対負電荷の電荷比は、約１．９：２．０、約１．８：２．０、約１．７：２．０、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。
ＩＬ２および／またはＩＬ７などの免疫賦活剤は、肝臓または肝臓組織へのＲＮＡの選択的送達のための製剤中の免疫賦活剤をコードするＲＮＡを対象に投与する工程によって対象に提供され得る。そのような標的器官または組織へのＲＮＡの送達は、特に、大量の免疫賦活剤を発現することが望ましい場合、および／または免疫賦活剤の全身的な存在、特に有意な量での存在が望ましいもしくは必要とされる場合に好ましい。
ＲＮＡ送達システムは、肝臓への固有の選択性を有する。これは、脂質ベースの粒子、カチオン性および中性ナノ粒子、特にリポソーム、ナノミセルおよびバイオコンジュゲート中の親油性リガンドなどの脂質ナノ粒子に関連する。肝臓蓄積は、肝血管系の不連続な性質または脂質代謝（リポソームおよび脂質もしくはコレステロールコンジュゲート）によって引き起こされる。
肝臓へのＲＮＡのインビボ送達のために、薬物送達システムを使用して、その分解を防止することによってＲＮＡを肝臓に輸送し得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）被覆表面およびｍＲＮＡ含有コアからなるポリプレックスナノミセルは、ナノミセルが生理学的条件下でＲＮＡの優れたインビボ安定性を提供するので、有用な系である。さらに、高密度ＰＥＧパリセードで構成されるポリプレックスナノミセル表面によって提供されるステルス特性は、宿主の免疫防御を有効に回避する。さらに、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して、ＲＮＡを肝臓に輸送し得る。
免疫チェックポイント阻害剤
本明細書に記載されるように、一実施形態では、ワクチンＲＮＡおよび／または免疫賦活ＲＮＡなどの本明細書に記載のＲＮＡは、チェックポイント阻害剤と一緒に対象、例えば患者に投与される、すなわち同時投与される。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤およびＲＮＡは、単一組成物として対象に投与される。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤およびＲＮＡは、対象に同時に（別々の組成物として同時に）投与される。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤およびＲＮＡは、対象に別々に投与される。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＲＮＡの前に対象に投与される。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＲＮＡの後に対象に投与される。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤およびＲＮＡは、同じ日に対象に投与される。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤およびＲＮＡは、異なる日に対象に投与される。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」は、免疫系の調節因子、特に、抗原のＴ細胞受容体認識の大きさおよび質を調節する共刺激シグナルおよび阻害シグナルを指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイントは阻害シグナルである。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＣＤ２８結合を置き換えるためのＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＴＩＭ－３とガレクチン９、ＰｔｄＳｅｒ、ＨＭＧＢ１およびＣＥＡＣＡＭ１などのそのリガンドの１つ以上との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、１つまたはいくつかのＫＩＲとそれらのリガンドとの間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＰＶＲ、ＰＶＲＬ２およびＰＶＲＬ３の１つ以上との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡとＨＬＡ－Ｅとの間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＶＩＳＴＡとその１つ以上の結合パートナーとの間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、１つ以上のＳｉｇｌｅｃとそれらのリガンドとの間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＧＡＲＰとそのリガンドの１つ以上との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＣＳＦ１ＲとＣＳＦ１との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＢＴＬＡとＨＶＥＭとの間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＣＤ３９およびＣＤ７３によって産生される、アデノシン作動性経路の一部、例えばＡ２ＡＲおよび／またはＡ２ＢＲとアデノシンとの間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、Ｂ７－Ｈ３とその受容体および／またはＢ７－Ｈ４とその受容体との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＩＤＯ、ＣＤ２０、ＮＯＸまたはＴＤＯによって媒介される。
「プログラム死１（ＰＤ－１）」受容体は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫抑制受容体を指す。ＰＤ－１は、インビボで以前に活性化されたＴ細胞上に主に発現され、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１またはＣＤ２７４としても公知）およびＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣまたはＣＤ２７３としても公知）に結合する。本明細書で使用される「ＰＤ－１」という用語は、ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）、ｈＰＤ－１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。「プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）」は、ＰＤ－１に結合するとＴ細胞の活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、ＰＤ－１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドの１つ（他はＰＤ－Ｌ２）である。本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）、ｈＰＤ－Ｌ１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－Ｌ１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ２」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ２（ｈＰＤ－Ｌ２）、ｈＰＤ－Ｌ２の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－Ｌ２と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＰＤ－１のリガンド（ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）は、樹状細胞またはマクロファージなどの抗原提示細胞、および他の免疫細胞の表面に発現される。ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２への結合は、Ｔ細胞活性化の下方制御をもたらす。ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２を発現する癌細胞は、抗癌免疫応答の抑制をもたらすＰＤ－１を発現するＴ細胞をスイッチオフにすることができる。ＰＤ－１とそのリガンドとの間の相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介増殖の減少、および癌性細胞による免疫回避をもたらす。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって逆転させることができ、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用も同様に遮断される場合、その効果は相加的である。
「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）」（ＣＤ１５２としても公知）は、Ｔ細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＣＤ８０（Ｂ７－１）およびＣＤ８６（Ｂ７－２）に結合することによって免疫系を下方制御する。本明細書で使用される「ＣＴＬＡ－４」という用語は、ヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４）、ｈＣＴＬＡ－４の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＣＴＬＡ－４と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対してはるかに高い結合親和性を有する刺激性チェックポイントタンパク質ＣＤ２８のホモログである。ＣＴＬＡ４は活性化Ｔ細胞の表面に発現され、そのリガンドはプロフェッショナル抗原提示細胞の表面に発現される。ＣＴＬＡ－４のそのリガンドへの結合は、ＣＤ２８の共刺激シグナルを妨げ、阻害シグナルを生成する。したがって、ＣＴＬＡ－４はＴ細胞活性化を下方制御する。
「ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体」（ＴＩＧＩＴ、ＷＵＣＡＭまたはＶｓｔｍ３としても公知）は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上の免疫受容体であり、ＤＣ、マクロファージなどのＰＶＲ（ＣＤ１５５）ならびにＰＶＲＬ２（ＣＤ１１２；ネクチン－２）およびＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３；ネクチン－３）に結合し、Ｔ細胞媒介免疫を調節する。本明細書で使用される「ＴＩＧＩＴ」という用語は、ヒトＴＩＧＩＴ（ｈＴＩＧＩＴ）、ｈＴＩＧＩＴの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＴＩＧＩＴと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＰＶＲ」という用語は、ヒトＰＶＲ（ｈＰＶＲ）、ｈＰＶＲの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＶＲと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＰＶＲＬ２」という用語は、ヒトＰＶＲＬ２（ｈＰＶＲＬ２）、ｈＰＶＲＬ２の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＶＲＬ２と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＰＶＲＬ３」という用語は、ヒトＰＶＲＬ３（ｈＰＶＲＬ３）、ｈＰＶＲＬ３の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＶＲＬ３と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「Ｂ７ファミリー」は、受容体が未定義の阻害性リガンドを指す。Ｂ７ファミリーはＢ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４を包含し、どちらも腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞で上方制御される。本明細書で使用される「Ｂ７－Ｈ３」および「Ｂ７－Ｈ４」という用語は、ヒトＢ７－Ｈ３（ｈＢ７－Ｈ３）およびヒトＢ７－Ｈ４（ｈＢ７－Ｈ４）、その変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにそれぞれＢ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ」（ＢＴＬＡ、ＣＤ２７２としても公知）は、Ｔｈ１細胞で発現されるがＴｈ２細胞では発現されないＴＮＦＲファミリーメンバーである。ＢＴＬＡ発現は、Ｔ細胞の活性化中に誘導され、特にＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に発現される。本明細書で使用される「ＢＴＬＡ」という用語は、ヒトＢＴＬＡ（ｈＢＴＬＡ）、ｈＢＴＬＡの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＢＴＬＡと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＢＴＬＡ発現は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクタ細胞表現型への分化中に徐々に下方制御される。腫瘍特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は高レベルのＢＴＬＡを発現する。ＢＴＬＡは「ヘルペスウイルス侵入メディエータ」（ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０としても公知）に結合し、Ｔ細胞阻害に関与する。本明細書で使用される「ＨＶＥＭ」という用語は、ヒトＨＶＥＭ（ｈＨＶＥＭ）、ｈＨＶＥＭの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＨＶＥＭと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＢＴＬＡ－ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答を負に調節する。
「キラー細胞免疫グロブリン様受容体」（ＫＩＲ）は、健康な細胞と疾患細胞の区別に関与するＮＫ Ｔ細胞およびＮＫ細胞上のＭＨＣクラスＩ分子の受容体である。ＫＩＲは、正常な免疫細胞活性化を抑制するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ、ＢおよびＣに結合する。本明細書で使用される「ＫＩＲ」という用語は、ヒトＫＩＲ（ｈＫＩＲ）、ｈＫＩＲの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＫＩＲと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＨＬＡ」という用語は、ＨＬＡの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにＨＬＡと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用されるＫＩＲは、特に、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、および／またはＫＩＲ２ＤＬ３を指す。
「リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）」は（ＣＤ２２３としても公知）、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することによるリンパ球活性の阻害に関連する阻害性受容体である。この受容体は、Ｔｒｅｇ細胞の機能を増強し、ＣＤ８＋エフェクタＴ細胞の機能を阻害し、免疫応答抑制をもたらす。ＬＡＧ－３は、活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞およびＤＣ上に発現される。本明細書で使用される「ＬＡＧ－３」という用語は、ヒトＬＡＧ－３（ｈＬＡＧ－３）、ｈＬＡＧ－３の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ－３）」（ＨＡＶｃｒ－２としても公知）は、Ｔｈ１細胞応答の阻害によるリンパ球活性の阻害に関与する阻害性受容体である。そのリガンドは、様々な種類の癌において上方制御されるガレクチン９（ＧＡＬ９）である。他のＴＩＭ－３リガンドとしては、ホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）、高移動度群タンパク質１（ＨＭＧＢ１）および癌胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）が挙げられる。本明細書で使用される「ＴＩＭ－３」という用語は、ヒトＴＩＭ３（ｈＴＩＭ－３）、ｈＴＩＭ－３の変異体、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＧＡＬ９」という用語は、ヒトＧＡＬ９（ｈＧＡＬ９）、ｈＧＡＬ９の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＰｄｔＳｅｒ」という用語は、少なくとも１つの共通エピトープを有する変異体および類似体を含む。本明細書で使用される「ＨＭＧＢ１」という用語は、ヒトＨＭＧＢ１（ｈＨＭＧＢ１）、ｈＨＭＧＢ１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＣＥＡＣＡＭ１」という用語は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１（ｈＣＥＡＣＡＭ１）、ｈＣＥＡＣＡＭ１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ」は、ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の表面上に主に発現される阻害性受容体である。本明細書で使用される「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ」という用語は、ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ（ｈＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ）、ｈＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体は、ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａを含むヘテロ二量体である。これは、おそらくＨＬＡ－Ｅなどのリガンドに結合することによって、ＮＫ細胞活性化およびＣＤ８＋Ｔ細胞機能を抑制する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫ－Ｔ細胞）およびＴ細胞（α／βおよびγ／δ）のサイトカイン放出および細胞傷害性応答を制限する。ＮＫＧ２Ａは腫瘍浸潤細胞で頻繁に発現され、ＨＬＡ－Ｅはいくつかの癌で過剰発現される。
「インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ」（ＩＤＯ）は、免疫阻害特性を有するトリプトファン異化酵素である。本明細書で使用される「ＩＤＯ」という用語は、ヒトＩＤＯ（ｈＩＤＯ）、ｈＩＤＯの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＩＤＯは、キヌレニンへの変換を触媒するトリプトファン分解における律速酵素である。したがって、ＩＤＯは必須アミノ酸の枯渇に関与している。ＴおよびＮＫ細胞の抑制、Ｔｒｅｇおよび骨髄由来サプレッサ細胞の生成および活性化、ならびに腫瘍血管新生の促進に関与することが公知である。ＩＤＯは多くの癌において過剰発現され、局所炎症によって誘導された場合、腫瘍細胞の免疫系回避を促進し、慢性腫瘍進行を促進することが示された。
本明細書で使用される「アデノシン作動性経路」または「アデノシンシグナル伝達経路」では、ＡＴＰがエクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３によってアデノシンに変換され、阻害性アデノシン受容体である「アデノシンＡ２Ａ受容体」（Ａ２ＡＲ、ＡＤＯＲＡ２Ａとしても公知）および「アデノシンＡ２Ｂ受容体」（Ａ２ＢＲ、ＡＤＯＲＡ２Ｂとしても公知）の１つ以上によるアデノシン結合を介した阻害シグナル伝達をもたらす。アデノシンは、免疫抑制特性を有するヌクレオシドであり、腫瘍微小環境に高濃度で存在し、免疫細胞浸潤、細胞傷害性およびサイトカイン産生を制限する。したがって、アデノシンシグナル伝達は、宿主免疫系クリアランスを回避するための癌細胞の戦略である。Ａ２ＡＲおよびＡ２ＢＲを介したアデノシンシグナル伝達は、腫瘍微小環境に典型的に存在する高アデノシン濃度によって活性化される、癌治療における重要なチェックポイントである。ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ａ２ＡＲおよびＡ２ＢＲは、Ｔ細胞、インバリアントナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、血小板、肥満細胞および好酸球を含むほとんどの免疫細胞によって発現される。Ａ２ＡＲおよびＡ２ＢＲを介したアデノシンシグナル伝達は、Ｔ細胞受容体が媒介する免疫細胞の活性化を妨げ、Ｔｒｅｇの数の増加ならびにＤＣおよびエフェクタＴ細胞の活性化の減少をもたらす。本明細書で使用される「ＣＤ３９」という用語は、ヒトＣＤ３９（ｈＣＤ３９）、ｈＣＤ３９の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＣＤ７３」という用語は、ヒトＣＤ７３（ｈＣＤ７３）、ｈＣＤ７３の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「Ａ２ＡＲ」という用語は、ヒトＡ２ＡＲ（ｈＡ２ＡＲ）、ｈＡ２ＡＲの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「Ａ２ＢＲ」という用語は、ヒトＡ２ＢＲ（ｈＡ２ＢＲ）、ｈＡ２ＢＲの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子」（ＶＩＳＴＡ、Ｃ１０ｏｒｆ５４としても公知）は、ＰＤ－Ｌ１と相同性を有するが、造血区画に限定された固有の発現パターンを示す。本明細書で使用される「ＶＩＳＴＡ」という用語は、ヒトＶＩＳＴＡ（ｈＶＩＳＴＡ）、ｈＶＩＳＴＡの変異体、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞抑制を誘導し、腫瘍内の白血球によって発現される。
「シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン」（Ｓｉｇｌｅｃ）ファミリーメンバーは、シアル酸を認識し、「自己」と「非自己」の区別に関与する。本明細書で使用される「Ｓｉｇｌｅｃ」という用語は、ヒトＳｉｇｌｅｃ（ｈＳｉｇｌｅｃ）、ｈＳｉｇｌｅｃの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに１つ以上のｈＳｉｇｌｅｃと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ヒトゲノムは１４個のＳｉｇｌｅｃを含み、限定されないが、Ｓｉｇｌｅｃ－２、Ｓｉｇｌｅｃ－３、Ｓｉｇｌｅｃ－７およびＳｉｇｌｅｃ－９を含むそのうちのいくつかは、免疫抑制に関与している。Ｓｉｇｌｅｃ受容体は、シアル酸を含むグリカンに結合するが、シアル酸残基の結合位置化学および空間分布の認識が異なる。このファミリーのメンバーはまた、異なる発現パターンを有する。広範囲の悪性腫瘍は、１つ以上のＳｉｇｌｅｃを過剰発現する。
「ＣＤ２０」は、Ｂ細胞およびＴ細胞の表面上に発現される抗原である。ＣＤ２０の高発現は、Ｂ細胞リンパ腫、毛様細胞白血病、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、および黒色腫癌幹細胞などの癌において見出され得る。本明細書で使用される「ＣＤ２０」という用語は、ヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）、ｈＣＤ２０の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「糖タンパク質Ａ反復優勢」（ＧＡＲＰ）は、免疫寛容および腫瘍が患者の免疫系から逃れる能力において役割を果たす。本明細書で使用される「ＧＡＲＰ」という用語は、ヒトＧＡＲＰ（ｈＧＡＲＰ）、ｈＧＡＲＰの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＧＡＲＰは、末梢血中のＴｒｅｇ細胞および腫瘍部位の腫瘍浸潤Ｔ細胞を含むリンパ球上に発現される。これは、おそらく、潜在性「トランスフォーミング増殖因子β」（ＴＧＦ－β）に結合する。ＴｒｅｇにおけるＧＡＲＰシグナル伝達の破壊は、寛容の減少をもたらし、Ｔｒｅｇの腸への移動および細胞傷害性Ｔ細胞の増殖の増加を阻害する。
「ＣＤ４７」は、リガンド「シグナル調節タンパク質アルファ」（ＳＩＲＰα）に結合する膜貫通タンパク質である。本明細書で使用される「ＣＤ４７」という用語は、ヒトＣＤ４７（ｈＣＤ４７）、ｈＣＤ４７の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＣＤ４７と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＳＩＲＰα」という用語は、ヒトＳＩＲＰα（ｈＳＩＲＰα）、ｈＳＩＲＰαの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＳＩＲＰαと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＣＤ４７シグナル伝達は、アポトーシス、増殖、接着および遊走を含む様々な細胞プロセスに関与する。ＣＤ４７は、多くの癌において過剰発現され、マクロファージに対する「ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルとして機能する。阻害性抗ＣＤ４７または抗ＳＩＲＰα抗体を介したＣＤ４７シグナル伝達の遮断は、癌細胞のマクロファージ食作用を可能にし、癌特異的Ｔリンパ球の活性化を促進する。
「ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有」（ＰＶＲＩＧ、ＣＤ１１２Ｒとしても公知）は、「ポリオウイルス受容体関連２」（ＰＶＲＬ２）に結合する。ＰＶＲＩＧおよびＰＶＲＬ２は、いくつかの癌において過剰発現される。ＰＶＲＩＧ発現はまた、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ－１発現を誘導し、ＰＶＲＬ２およびＰＶＲ（ＴＩＧＩＴリガンド）は、いくつかの癌において同時過剰発現される。ＰＶＲＩＧシグナル伝達経路の遮断は、Ｔ細胞機能およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加、したがって免疫抑制の減少およびインターフェロン応答の上昇をもたらす。本明細書で使用される「ＰＶＲＩＧ」という用語は、ヒトＰＶＲＩＧ（ｈＰＶＲＩＧ）、ｈＰＶＲＩＧの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＶＲＩＧと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＰＶＲＬ２」は、上記で定義されたｈＰＶＲＬ２を含む。
「コロニー刺激因子１」経路は、本開示に従って標的とすることができる別のチェックポイントである。ＣＳＦ１Ｒは、ＣＳＦ１に結合する骨髄増殖因子受容体である。ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達の遮断は、マクロファージ応答を機能的に再プログラムし、それによって抗原提示および抗腫瘍Ｔ細胞応答を増強することができる。本明細書で使用される「ＣＳＦ１Ｒ」という用語は、ヒトＣＳＦ１Ｒ（ｈＣＳＦ１Ｒ）、ｈＣＳＦ１Ｒの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＣＳＦ１Ｒと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。本明細書で使用される「ＣＳＦ１」という用語は、ヒトＣＳＦ１（ｈＣＳＦ１）、ｈＣＳＦ１の変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＣＳＦ１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。
「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸ＮＡＤＰＨオキシダーゼ」は、免疫抑制活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する骨髄細胞の酵素のＮＯＸファミリーの酵素を指す。５つのＮＯＸ酵素（ＮＯＸ１～ＮＯＸ５）が癌の発症および免疫抑制に関与することが見出されている。ＲＯＳレベルの上昇は、ほとんど全ての癌で検出されており、腫瘍の発生および進行の多くの局面を促進する。ＮＯＸ産生ＲＯＳは、ＮＫおよびＴ細胞の機能を弱め、骨髄細胞におけるＮＯＸの阻害は、隣接するＮＫ細胞およびＴ細胞の抗腫瘍機能を改善する。本明細書で使用される「ＮＯＸ」という用語は、ヒトＮＯＸ（ｈＮＯＸ）、ｈＮＯＸの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＮＯＸと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。
本開示に従って標的とすることができる別の免疫チェックポイントは、「トリプトファン－２，３－ジオキシゲナーゼ」（ＴＤＯ）によって媒介されるシグナルである。ＴＤＯは、トリプトファン分解におけるＩＤＯの代替経路であり、免疫抑制に関与する。腫瘍細胞はＩＤＯの代わりにＴＤＯを介してトリプトファンを異化し得るので、ＴＤＯはチェックポイント遮断のためのさらなる標的であり得る。実際に、いくつかの癌細胞株は、ＴＤＯを上方制御することが見出されており、ＴＤＯはＩＤＯ阻害を補完し得る。本明細書で使用される「ＴＤＯ」という用語は、ヒトＴＤＯ（ｈＴＤＯ）、ｈＴＤＯの変異体、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＴＤＯと少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。
免疫チェックポイントの多くは、上記のような特異的受容体とリガンドの対の間の相互作用によって調節される。したがって、免疫チェックポイントタンパク質は免疫チェックポイントシグナル伝達を媒介する。例えば、チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖および／またはＴ細胞機能を直接的または間接的に調節する。癌細胞は、免疫系による攻撃から自身を保護するために、しばしばこれらのチェックポイント経路を利用する。したがって、本開示に従って調節されるチェックポイントタンパク質の機能は、典型的には、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖および／またはＴ細胞機能の調節である。したがって、免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容ならびに生理学的免疫応答の持続時間および大きさを調節し、維持する。免疫チェックポイントタンパク質の多くは、Ｂ７：ＣＤ２８ファミリーまたは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属し、特異的リガンドに結合することによって、細胞質ドメインに動員されるシグナル伝達分子を活性化する（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊａｐ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ，４６：１９１－２０３）。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント調節剤」または「チェックポイントモジュレータ」という用語は、１つ以上のチェックポイントタンパク質の機能を調節する分子または化合物を指す。免疫チェックポイント調節剤は、典型的には、自己寛容ならびに／または免疫応答の大きさおよび／もしくは持続時間を調節することができる。好ましくは、本開示に従って使用される免疫チェックポイント調節剤は、１つ以上のヒトチェックポイントタンパク質の機能を調節し、したがって「ヒトチェックポイント調節剤」である。好ましい実施形態では、本明細書で使用されるヒトチェックポイント調節剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」または「チェックポイント阻害剤」は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を全体的にもしくは部分的に低減するか、阻害するか、妨げるかもしくは負に調節するか、または１つ以上のチェックポイントタンパク質の発現を全体的にもしくは部分的に低減するか、阻害するか、妨げるかもしくは負に調節する分子を指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、１つ以上のチェックポイントタンパク質に結合する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイントタンパク質を調節する１つ以上の分子に結合する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡレベルで、１つ以上のチェックポイントタンパク質の前駆体に結合する。本開示によるチェックポイント阻害剤として機能する任意の薬剤を使用することができる。
本明細書で使用される「部分的に」という用語は、レベル、例えばチェックポイントタンパク質の阻害レベルの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を意味する。
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用するのに適した免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナルのアンタゴニスト、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、またはＴＩＭ－３を標的とする抗体である。これらのリガンドおよび受容体は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ．１２：２５２－２６４，２０１２に総説されている。本開示に従って標的化され得るさらなる免疫チェックポイントタンパク質が本明細書に記載される。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナル伝達を妨害する抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナル伝達を妨害する小分子である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナル伝達を妨害するペプチドベースの阻害剤である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナル伝達を妨害する阻害性核酸分子である。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイント遮断タンパク質間の相互作用を防止する抗体、その断片、または抗体模倣物、例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を防止する抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用を防止する抗体、その断片、または抗体模倣物である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ－３とそのリガンド、またはＴＩＭ－３とそのリガンドとの間の相互作用を防止する抗体、その断片、または抗体模倣物である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＤ３９および／もしくはＣＤ７３を介した阻害シグナル伝達ならびに／またはＡ２ＡＲおよび／もしくはＡ２ＢＲとアデノシンとの相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、Ｂ７－Ｈ３とその受容体との相互作用および／またはＢ７－Ｈ４とその受容体との相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＢＴＬＡとそのリガンドＨＶＥＭとの相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、１つ以上のＫＩＲとそれらのそれぞれのリガンドとの相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ－３とそのリガンドの１つ以上との相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ－３とそのリガンドであるガレクチン－９、ＰｔｄＳｅｒ、ＨＭＧＢ１およびＣＥＡＣＡＭ１の１つ以上との相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＴＩＧＩＴとそのリガンドであるＰＶＲ、ＰＶＲＬ２およびＰＶＲＬ３の１つ以上との相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡとＨＬＡ－Ｅとの相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＶＩＳＴＡとその結合パートナーの１つ以上との相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、１つ以上のＳｉｇｌｅｃとそれらのそれぞれのリガンドとの相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＤ２０シグナル伝達を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＧＡＲＰとそのリガンドの１つ以上との相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２との相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＳＦ１ＲとＣＳＦ１との相互作用を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＮＯＸシグナル伝達を防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＩＤＯおよび／またはＴＤＯシグナル伝達を防止する。
本明細書に記載の阻害性免疫チェックポイントシグナル伝達の阻害または遮断は、癌細胞に対する免疫抑制およびＴ細胞免疫の確立または増強の防止または逆転をもたらす。一実施形態では、本明細書に記載の免疫チェックポイントシグナル伝達の阻害は、免疫系の機能不全を低減または阻害する。一実施形態では、本明細書に記載の免疫チェックポイントシグナル伝達の阻害は、機能不全の免疫細胞の機能不全の程度をより少なくする。一実施形態では、本明細書に記載の免疫チェックポイントシグナル伝達の阻害は、機能不全のＴ細胞の機能不全の程度をより少なくする。
本明細書で使用される「機能不全」という用語は、抗原刺激に対する免疫応答性が低下した状態を指す。この用語は、抗原認識が起こり得る枯渇および／またはアネルギーの両方の共通要素を含むが、続いて起こる免疫応答は、感染または腫瘍成長を制御するのには無効である。機能不全には、機能不全の免疫細胞のために抗原認識が遅延している状態も含まれる。
本明細書で使用される「機能不全」という用語は、抗原刺激に対する免疫応答性が低下した状態にある免疫細胞を指す。機能不全には、抗原認識に対する不応答性、および抗原認識を下流のＴ細胞エフェクタ機能、例えば増殖、サイトカイン産生（例えばＩＬ－２）および／または標的細胞死滅に変換する能力の障害が含まれる。
本明細書で使用される「アネルギー」という用語は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して送達される不完全または不十分なシグナルから生じる、抗原刺激に対する不応答性の状態を指す。Ｔ細胞アネルギーはまた、共刺激の非存在下での抗原による刺激時にも生じることがあり、その結果細胞は、共刺激の状況でさえも、抗原によるその後の活性化に対して抵抗性になる。不応答性状態は、ＩＬ－２の存在によってしばしば解除され得る。アネルギーＴ細胞は、クローン拡大を受けず、および／またはエフェクタ機能を獲得しない。
本明細書で使用される「枯渇」という用語は、免疫細胞枯渇、例えば多くの慢性感染症および癌の間に起こる持続的なＴＣＲシグナル伝達から生じるＴ細胞機能不全の状態としてのＴ細胞枯渇を指す。これは、不完全または不十分なシグナル伝達によってではなく、持続的なシグナル伝達によって生じるという点でアネルギーとは区別される。枯渇は、不十分なエフェクタ機能、阻害性受容体の持続的発現、および機能性エフェクタまたはメモリＴ細胞とは異なる転写状態によって定義される。枯渇は、疾患（例えば感染症および腫瘍）の最適な制御を妨げる。枯渇は、外因性負調節経路（例えば免疫調節性サイトカイン）ならびに細胞内因性負調節経路（本明細書に記載されるような阻害性免疫チェックポイント経路）の両方に起因し得る。
「Ｔ細胞機能を増強する」とは、Ｔ細胞が持続的もしくは増幅された生物学的機能を有するように、または枯渇したもしくは不活性なＴ細胞を再生もしくは再活性化するように、Ｔ細胞を誘導する、導くもしくは刺激することを意味する。Ｔ細胞機能を増強する例としては、介入前のレベルと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのγ－インターフェロンの分泌増加、増殖増加、抗原応答性の増加（例えば腫瘍クリアランス）が挙げられる。一実施形態では、増強のレベルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％またはそれ以上である。この増強を測定する方法は当業者に公知である。
免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性核酸分子であり得る。本明細書で使用される「阻害性核酸」または「阻害性核酸分子」という用語は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を全体的にまたは部分的に低減する、阻害する、妨げるまたは負に調節する核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。阻害性核酸分子には、限定されないが、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子、およびアプタマー（例えば、ＤＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマー）が含まれる。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、タンパク質発現、特に本明細書に記載のチェックポイントタンパク質などのチェックポイントタンパク質の発現を減少させることができる核酸分子を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には２～５０ヌクレオチドを含む短いＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。チェックポイント阻害剤オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、所与の配列、特にチェックポイントタンパク質の核酸配列（またはその断片）の配列に相補的な一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。アンチセンスＲＮＡは、典型的には、ｍＲＮＡ、例えばチェックポイントタンパク質をコードするｍＲＮＡに結合することによって、前記ｍＲＮＡのタンパク質翻訳を防止するために使用される。アンチセンスＤＮＡは、典型的には、特定の相補的（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的とするために使用される。結合が起こる場合、そのようなＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは酵素ＲＮａｓｅ Ｈによって分解され得る。さらに、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドは、脊椎動物における遺伝子ノックダウンに使用され得る。例えば、Ｋｒｙｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００６（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０３：８７１－８１）は、マクロファージにおけるＢ７－Ｈ４発現を特異的にブロックするＢ７－Ｈ４特異的モルホリノを設計し、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的Ｔ細胞を有するマウスにおいてＴ細胞増殖の増加および腫瘍体積の減少をもたらした。
「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ」または「低分子阻害性ＲＮＡ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子、例えばチェックポイントタンパク質をコードする遺伝子の発現を妨げる、典型的な長さが２０～２５塩基対の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。一実施形態では、ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡを妨げ、したがって翻訳、例えば免疫チェックポイントタンパク質の翻訳を遮断する。外因性ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、遺伝子ノックダウンのために使用され得るが、その効果は、特に急速に分裂する細胞では、一過性にすぎない場合がある。安定なトランスフェクションは、例えばＲＮＡ修飾によって、または発現ベクターを使用することによって達成され得る。ｓｉＲＮＡによる細胞の安定なトランスフェクション有用な修飾およびベクターは、当技術分野で公知である。ｓｉＲＮＡ配列はまた、２本の鎖の間に短いループを導入して「低分子ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」をもたらすように修飾され得る。ｓｈＲＮＡは、ダイサーによって機能的ｓｉＲＮＡにプロセシングされ得る。ｓｈＲＮＡは、比較的低い分解速度および代謝回転速度を有する。したがって、免疫チェックポイント阻害剤はｓｈＲＮＡであり得る。
本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、ポリペプチドなどの標的分子に結合することができる、典型的には２５～７０ヌクレオチドの長さのＤＮＡまたはＲＮＡなどの一本鎖核酸分子を指す。一実施形態では、アプタマーは、本明細書に記載の免疫チェックポイントタンパク質などの免疫チェックポイントタンパク質に結合する。例えば、本開示によるアプタマーは、免疫チェックポイントタンパク質もしくはポリペプチド、または免疫チェックポイントタンパク質もしくはポリペプチドの発現を調節するシグナル伝達経路中の分子に特異的に結合することができる。アプタマーの生成および治療的使用は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，４７５，０９６号参照）。
「低分子阻害剤」または「低分子」という用語は、本明細書では互換的に使用され、上記のように１つ以上のチェックポイントタンパク質を全体的にまたは部分的に低減する、阻害する、妨げる、または負に調節する、通常は最大１０００ダルトンの低分子量有機化合物を指す。そのような低分子阻害剤は、通常、有機化学によって合成されるが、植物、真菌、および微生物などの天然源からも単離され得る。低分子量は、低分子阻害剤が細胞膜を横切って急速に拡散することを可能にする。例えば、当技術分野で公知の様々なＡ２ＡＲアンタゴニストは、５００ダルトン未満の分子量を有する有機化合物である。
免疫チェックポイント阻害剤は、必要な特異性の抗原結合断片を有する抗体部分を含む抗体、その抗原結合断片、抗体模倣物または融合タンパク質であり得る。抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載される通りである。免疫チェックポイント阻害剤である抗体またはその抗原結合断片には、特に、免疫チェックポイントタンパク質、例えば免疫チェックポイント受容体または免疫チェックポイント受容体リガンドに結合する抗体またはその抗原結合断片が含まれる。抗体または抗原結合断片はまた、本明細書に記載されるように、さらなる部分にコンジュゲートされ得る。特に、抗体またはその抗原結合断片は、キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤抗体またはその抗原結合断片は、免疫チェックポイント受容体または免疫チェックポイント受容体リガンドのアンタゴニストである。
好ましい実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤である抗体は、単離された抗体である。
本開示による免疫チェックポイント阻害剤またはその抗原結合断片である抗体はまた、任意の公知の免疫チェックポイント阻害剤抗体と抗原結合について交差競合する抗体であり得る。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤抗体は、本明細書に記載の免疫チェックポイント阻害剤抗体の１つ以上と交差競合する。抗原への結合について交差競合する抗体の能力は、これらの抗体が、抗原の同じエピトープ領域に結合し得るか、または別のエピトープに結合する場合、その特定のエピトープ領域への公知の免疫チェックポイント阻害剤抗体の結合を立体的に妨げ得ることを示す。これらの交差競合抗体は、同じエピトープに結合することによって、またはリガンドの結合を立体的に妨げることによって、そのリガンドへの免疫チェックポイントの結合を遮断すると予想されるので、それらが交差競合しているものと非常に類似した機能的特性を有し得る。交差競合抗体は、表面プラズモン共鳴分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリなどの標準的な結合アッセイにおいて公知の抗体の１つ以上と交差競合するそれらの能力に基づいて容易に同定することができる（例えば、国際公開第２０１３／１７３２２３号参照）。
特定の実施形態では、所与の抗原への結合について１つ以上の公知の抗体と交差競合するか、または所与の抗原の同じエピトープ領域に結合する抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。ヒト患者への投与のために、これらの交差競合抗体は、キメラ抗体、またはヒト化もしくはヒト抗体であり得る。そのようなキメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体は、当技術分野で周知の方法によって調製および単離することができる。
チェックポイント阻害剤はまた、分子（またはその変異体）自体の可溶性形態、例えば可溶性ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１融合物の形態であり得る。
本開示の文脈では、複数のチェックポイント阻害剤を使用することができ、複数のチェックポイント阻害剤は、異なるチェックポイント経路または同じチェックポイント経路を標的とする。好ましくは、複数のチェックポイント阻害剤は、異なるチェックポイント阻害剤である。好ましくは、複数の異なるチェックポイント阻害剤が使用される場合、特に少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なるチェックポイント阻害剤が使用され、好ましくは２、３、４または５個の異なるチェックポイント阻害剤が使用され、より好ましくは２、３または４個の異なるチェックポイント阻害剤が使用され、さらにより好ましくは２または３個の異なるチェックポイント阻害剤が使用され、最も好ましくは２個の異なるチェックポイント阻害剤が使用される。異なるチェックポイント阻害剤の組合せの好ましい例には、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＣＴＬＡ－４シグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＴＩＧＩＴシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＢ７－Ｈ３および／またはＢ７－Ｈ４シグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＢＴＬＡシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＫＩＲシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＬＡＧ－３シグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＴＩＭ－３シグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＩＤＯシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とアデノシンシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＶＩＳＴＡシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＳｉｇｌｅｃシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＣＤ２０シグナル伝達阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＧＡＲＰシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤およびＣＤ４７シグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＰＶＲＩＧシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＣＳＦ１Ｒシグナル伝達の阻害剤、ＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＮＯＸシグナル伝達の阻害剤、およびＰＤ－１シグナル伝達の阻害剤とＴＤＯシグナル伝達の阻害剤の組合せが含まれる。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子（免疫チェックポイント遮断薬）は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＰＤ－１シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＰＤ－１シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤である。特定の実施形態では、ＰＤ－１シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤またはＰＤ－Ｌ２阻害剤などのＰＤ－１リガンド阻害剤である。好ましい実施形態では、ＰＤ－１シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１受容体とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の１つ以上との間の相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分である。ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１とそのリガンドの１つ以上との間の相互作用を妨害する抗体は、当技術分野で公知である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－１に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それによって免疫活性を増加させる。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ２に特異的に結合し、ＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それによって免疫活性を増加させる。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤である。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４リガンド阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＴＩＧＩＴシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＴＩＧＩＴシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＴＩＧＩＴ阻害剤である。特定の実施形態では、ＴＩＧＩＴシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＴＩＧＩＴリガンド阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、Ｂ７ファミリーシグナル伝達経路の成分である。特定の実施形態では、Ｂ７ファミリーメンバーは、Ｂ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４である。本開示の特定の実施形態は、Ｂ７－Ｈ３および／またはＢ７－４のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。したがって、本開示の特定の実施形態は、Ｂ７－Ｈ３またはＢ７－Ｈ４を標的とする抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。Ｂ７ファミリーは定義された受容体を有さないが、これらのリガンドは、腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞上で上方制御される。前臨床マウスモデルは、これらのリガンドの遮断が抗腫瘍免疫を増強し得ることを示している。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＢＴＬＡシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＢＴＬＡシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＢＴＬＡシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＢＴＬＡ阻害剤である。特定の実施形態では、ＢＴＬＡシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＨＶＥＭ阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、１つ以上のＫＩＲシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、１つ以上のＫＩＲシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、１つ以上のＫＩＲシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＫＩＲ阻害剤である。特定の実施形態では、１つ以上のＫＩＲシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＫＩＲリガンド阻害剤である。例えば、本開示によるＫＩＲ阻害剤は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、および／またはＫＩＲ２ＤＬ３に結合する抗ＫＩＲ抗体であり得る。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＬＡＧ－３シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＬＡＧ－３シグナル伝達のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＬＡＧ－３シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ－３阻害剤である。特定の実施形態では、ＬＡＧ－３シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ－３リガンド阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＴＩＭ－３シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＴＩＭ－３シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＴＩＭ－３シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ－３阻害剤である。特定の実施形態では、ＴＩＭ－３シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＴＩＭ－３リガンド阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害剤である。特定の実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａリガンド阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＩＤＯシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＩＤＯシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤、例えばＩＤＯ阻害剤を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、アデノシンシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、アデノシンシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、アデノシンシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＤ３９阻害剤である。特定の実施形態では、アデノシンシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＤ７３阻害剤である。特定の実施形態では、アデノシンシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、Ａ２ＡＲ阻害剤である。特定の実施形態では、アデノシンシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、Ａ２ＢＲ阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＶＩＳＴＡシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＶＩＳＴＡシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＶＩＳＴＡ阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、１つ以上のＳｉｇｌｅｃシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、１つ以上のＳｉｇｌｅｃシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、１つ以上のＳｉｇｌｅｃシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、Ｓｉｇｌｅｃ阻害剤である。特定の実施形態では、１つ以上のＳｉｇｌｅｃシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、Ｓｉｇｌｅｃリガンド阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＣＤ２０シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＣＤ２０シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＣＤ２０シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＤ２０阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＧＡＲＰシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＧＡＲＰシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＧＡＲＰシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＧＡＲＰ阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＣＤ４７シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＣＤ４７シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＣＤ４７シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＤ４７阻害剤である。特定の実施形態では、ＣＤ４７シグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＳＩＲＰα阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＰＶＲＩＧシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＰＶＲＩＧシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＰＶＲＩＧシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＰＶＲＩＧ阻害剤である。特定の実施形態では、ＰＶＲＩＧシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＰＶＲＩＧリガンド阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤を対象に投与することを提供する。特定の実施形態では、ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤である。特定の実施形態では、ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤は、ＣＳＦ１阻害剤である。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＮＯＸシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＮＯＸシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤、例えばＮＯＸ阻害剤を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、阻害性免疫調節因子は、ＴＤＯシグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＴＤＯシグナル伝達経路のチェックポイント阻害剤、例えばＴＤＯ阻害剤を対象に投与することを提供する。
例示的なＰＤ－１阻害剤としては、限定されないが、抗ＰＤ－１抗体、例えばＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ；米国特許第８，７３５，５５３号、国際公開第２０１５／３５６０６号および米国特許出願公開第２０１５／００７９１０９号参照）、セミプリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ；国際公開第２０１５／１１２８００号参照）およびラムブロリズマブ（例えば、国際公開第２００８／１５６７１２号にｈＰＤ１０９Ａならびにそのヒト化誘導体ｈ４０９Ａ１、ｈ４０９Ａ１６およびｈ４０９Ａ１７として開示されている）、ＡＢ１３７１３２（Ａｂｃａｍ）、ＥＨ１２．２Ｈ７およびＲＭＰ１－１４（＃ＢＥ０１４６；Ｂｉｏｘｃｅｌｌ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｖｔ．ＬＴＤ．）、ＭＩＨ４（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ，ＢＭＳ－９３６５５８；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；国際公開第２００６／１２１１６８号参照）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ；ＭＫ－３４７５；Ｍｅｒｃｋ；国際公開第２００８／１５６７１２号参照）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ；Ｈａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４（２２）：５７９３－６および国際公開第２００９／１０１６１１号参照）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；国際公開第２０１５／１１２９００号参照）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；国際公開第２０１２／１４５４９３号参照）、ＴＳＲ－０４２（国際公開第２０１４／１７９６６４号参照）、ＲＥＧＮ－２８１０（Ｈ４Ｈ７７９８Ｎ；米国特許出願公開第２０１５／０２０３５７９号参照）、ＪＳ００１（ＴＡＩＺＨＯＵ ＪＵＮＳＨＩ ＰＨＡＲＭＡ；Ｓｉ－Ｙａｎｇ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．７０：１３６）、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ－２６６１３８０；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，１７（７）：１１５１および国際公開第２０１０／０２７８２７号および国際公開第２０１１／０６６３４２号参照）、ＰＦ－０６８０１５９１（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ；国際公開第２０１５／３５６０６号および米国特許出願公開第２０１５／００７９１０９号参照）、ＢＩ ７５４０９１、ＳＨＲ－１２１０（国際公開第２０１５／０８５８４７号参照）、ならびに国際公開第２００６／１２１１６８号に記載されている抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４；ＩＮＣＳＨＲ１２１０（Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈｅｎｇｒｕｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；ＳＨＲ－１２１０としても公知；国際公開第２０１５／０８５８４７号参照），ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ；ＡＮＢ０１１としても公知；国際公開第２０１４／１７９６６４号参照），ＧＬＳ－０１０（Ｗｕｘｉ／Ｈａｒｂｉｎ Ｇｌｏｒｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ＷＢＰ３０５５としても公知；Ｓｉ－Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．７０：１３６参照）、ＳＴＩ－１１１０（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；国際公開第２０１４／１９４３０２号参照）、ＡＧＥＮ２０３４（Ａｇｅｎｕｓ；国際公開第２０１７／０４０７９０号参照）、ＭＧＡ０１２（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ；国際公開第２０１７／１９８４６号参照）、ＩＢＩ３０８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ；国際公開第２０１７／０２４４６５号、国際公開第２０１７／０２５０１６号、国際公開第２０１７／１３２８２５号および国際公開第２０１７／１３３５４０号参照）、例えば米国特許第７，４８８，８０２号、米国特許第８，００８，４４９号、米国特許第８，１６８，７５７号、国際公開第０３／０４２４０２号、国際公開第２０１０／０８９４１１号（抗ＰＤ－Ｌ１抗体をさらに開示する）、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１１／１５９８７７号（ＴＩＭ－３に対する抗体をさらに開示する）、国際公開第２０１１／０８２４００号、国際公開第２０１１／１６１６９９号、国際公開第２００９／０１４７０８号、国際公開第０３／０９９１９６号、国際公開第２００９／１１４３３５号、国際公開第２０１２／１４５４９３号（ＰＤ－Ｌ１に対する抗体をさらに開示する）、国際公開第２０１５／０３５６０６号、国際公開第２０１４／０５５６４８号（抗ＫＩＲ抗体をさらに開示する）、米国特許出願公開第２０１８／０１８５４８２号（抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ＴＩＧＩＴ抗体をさらに開示する）、米国特許第８，００８，４４９号、米国特許第８，７７９，１０５号、米国特許第６，８０８，７１０号、米国特許第８，１６８，７５７号、米国特許出願公開第２０１６／０２７２７０８号および米国特許第８，３５４，５０９号に記載されている抗ＰＤ－１抗体、例えばＳｈａａｂａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ．，２８（９）：６６５－６７８およびＳａｓｉｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ，２０１８，ＢｉｏＤｒｕｇｓ，３２（５）：４８１－４９７に開示されているＰＤ－１シグナル伝達経路に対する低分子アンタゴニスト、例えば国際公開第２０１９／０００１４６号および国際公開第２０１８／１０３５０１号に開示されているＰＤ－１に対するｓｉＲＮＡ、国際公開第２０１８／２２２７１１号に開示されている可溶性ＰＤ－１タンパク質、ならびに例えば国際公開第２０１８／０２２８３１号に記載されている可溶性形態のＰＤ－１を含む腫瘍溶解性ウイルスが挙げられる。
特定の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ；ＢＭＳ－９３６５５８）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ；ＭＫ－３４７５）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＰＤＲ００１、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＴＳＲ－０４２、ＲＥＧＮ２８１０、ＪＳ００１、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ－２６６１３８０）、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＢＩ ７５４０９１、またはＳＨＲ－１２１０である。
例示的なＰＤ－１リガンド阻害剤はＰＤ－Ｌ１阻害剤およびＰＤ－Ｌ２阻害剤であり、限定されないが、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；国際公開第２０１１／０６６３８９号参照）、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ（米国特許出願公開第２０１４／０３４１９１７号参照）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（国際公開第２０１０／０７７６３４号の配列番号２０および米国特許第８，２１７，１４９号参照）、ＭＩＨ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；欧州特許第３ ２３０ ３１９号参照）、ＭＤＸ－１１０５（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；国際公開第２０１３０１９９０６号および米国特許第８，２１７，１４９号参照）、ＳＴＩ－１０１４（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ；国際公開第２０１３／１８１６３４号参照）、ＣＫ－３０１（チェックポイント治療薬）、ＫＮ０３５（３Ｄ Ｍｅｄ／Ａｌｐｈａｍａｂ；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖ．３：１７００４参照）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ；ＲＧ７４４６；ＭＰＤＬ３２８０Ａ；Ｒ０５５４１２６７；米国特許第９，７２４，４１３号参照）、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；米国特許第７，９４３，７４３号、国際公開第２０１３／１７３２２３号参照）、アベルマブ（バベンチオ；米国特許出願公開第２０１４／０３４１９１７号参照）、ＬＹ３３０００５４（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ Ｃｏ．）、ＣＸ－０７２（Ｐｒｏｃｌａｉｍ－ＣＸ－０７２；ＣｙｔｏｍＸとも呼ばれる；国際公開第２０１６／１４９２０１号参照）、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５（国際公開第２０１７０２０８０１号および国際公開第２０１７０２０８０２号参照）、ＭＤＸ－１１０５（米国特許出願公開第２０１５／０３２０８５９号参照）などの抗ＰＤ－Ｌ１抗体、３Ｇ１０、１２Ａ４（ＢＭＳ－９３６５５９とも呼ばれる）、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４を含む米国特許第７，９４３，７４３号に開示されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体、国際公開第２０１０／０７７６３４号、米国特許第８，２１７，１４９号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０７７６３４号、国際公開第２０１１／０６６３４２号、米国特許第８，２１７，１４９号、米国特許第７，９４３，７４３号、国際公開第２０１０／０８９４１１号、米国特許第 ７，６３５，７５７号、米国特許第 ８，２１７，１４９号、米国特許第２００９／０３１７３６８号、国際公開第２０１１／０６６３８９号、国際公開第２０１７／０３４９１６号、国際公開第２０１７／０２０２９１号、国際公開第２０１７／０２０８５８号、国際公開第２０１７／０２０８０１号、国際公開第２０１６／１１１６４５号、国際公開第２０１６／１９７３６７号、国際公開第２０１６／０６１１４２号、国際公開第２０１６／１４９２０１号、国際公開第２０１６／０００６１９号、国際公開第２０１６／１６０７９２号、国際公開第２０１６／０２２６３０号、国際公開第２０１６／００７２３５号、国際公開第２０１５／１７９６５４号、国際公開第２０１５／１７３２６７号、国際公開第２０１５／１８１３４２号、国際公開第２０１５／１０９１２４号、国際公開第２０１８／２２２７１１号、国際公開第２０１５／１１２８０５号、国際公開第２０１５／０６１６６８号、国際公開第２０１４／１５９５６２号、国際公開第２０１４／１６５０８２号、国際公開第２０１４／１０００７９号に記載されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体が含まれる。
例示的なＣＴＬＡ－４阻害剤としては、限定されないが、モノクローナル抗体であるイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ；Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）およびトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ）、トレビリズマブ、ＡＧＥＮ－１８８４（Ａｇｅｎｕｓ）およびＡＴＯＲ－１０１５、国際公開第２００１／０１４４２４号、米国特許第２００５／０２０１９９４号、欧州特許第１２１２４２２号、米国特許第５，８１１，０９７号、米国特許第５，８５５，８８７号、米国特許第６，０５１，２２７号、米国特許第６，６８２，７３６号、米国特許第６，９８４，７２０号、国際公開第０１／１４４２４号、国際公開第００／３７５０４号、米国特許第２００２／００３９５８１号、米国特許第２００２／０８６０１４号、国際公開第９８／４２７５２号、米国特許第６，２０７，１５６号、米国特許第５，９７７，３１８号、米国特許第７，１０９，００３号および米国特許第７，１３２，２８１号に開示されている抗ＣＴＬＡ４抗体、ＣＴＬＡ－４ ＥＣＤに融合したＩｇＧ１のＦｅ領域を含むドミナントネガティブタンパク質アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ；欧州特許第２８５５５３３号参照）、ならびにアバタセプトと比較してＣＴＬＡ－４ ＥＣＤ内に２つのアミノ酸置換を有する第２世代のより高親和性のＣＴＬＡ－４－Ｉｇ変異体であるベラタセプト（Ｎｕｌｏｊｉｘ；国際公開第２０１４／２０７７４８号参照）、可溶性ＣＴＬＡ－４ポリペプチド、例えばＲＧ２０７７およびＣＴＬＡ４－ＩｇＧ４ｍ（米国特許第６，７５０，３３４号参照）、抗ＣＴＬＡ－４アプタマー、ならびに例えば米国特許出願公開第２０１５／２０３８４８号に開示されているＣＴＬＡ－４に対するｓｉＲＮＡが挙げられる。例示的なＣＴＬＡ－４リガンド阻害剤は、Ｐｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍ．Ｐａｒｎｈａｍ（ｅｄ．），ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－３－０３４８－０６２０－６＿２０）に記載されている。
ＴＩＧＩＴシグナル伝達経路の例示的なチェックポイント阻害剤としては、限定されないが、ＢＭＳ－９８６２０７、ＣＯＭ９０２（ＣＧＥＮ－１５１３７；Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）、ＡＢ１５４（Ａｒｃｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはエチギリマブ（ＯＭＰ－３１３Ｍ３２；ＯｎｃｏＭｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）などの抗ＴＩＧＩＴ抗体、または国際公開第２０１７／０５９０９５号に開示されている抗体、特に「ＭＡＢ１０」、米国特許出願公開第２０１８／０１８５４８２号、国際公開第２０１５／００９８５６号および米国特許出願公開第２０１９／００７７８６４号に開示されている抗体が挙げられる。
Ｂ７－Ｈ３の例示的なチェックポイント阻害剤としては、限定されないが、Ｆｃ最適化モノクローナル抗体エノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１；Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ；米国特許出願公開第２０１２／０２９４７９６号参照）ならびに抗Ｂ７－Ｈ３抗体ＭＧＤ００９（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）およびピジリズマブ（米国特許第７，３３２，５８２号参照）が挙げられる。
例示的なＢ７－Ｈ４阻害剤としては、限定されないが、Ｄａｎｇａｊ ｅｔ ａｌ．，２０１３（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３：４８２０－９）およびＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４（Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ，１３４：１８１－１８９）、国際公開第２０１３／０２５７７９号（例えば配列番号３および４によってコードされる２Ｄ１、配列番号３７および３９によってコードされる２Ｈ９、ならびに配列番号４１および４３によってコードされる２Ｅ１１）および国際公開第２０１３／０６７４９２号（例えば配列番号１～８から選択されるアミノ酸配列を有する抗体）に記載されている抗体、例えばＫｒｙｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００６（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０３：８７１－８１）に記載されているモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、または米国特許出願公開第２０１２／０１７７６４５号に開示されているようなＢ７－Ｈ４の可溶性組換え形態が挙げられる。
例示的なＢＴＬＡ阻害剤としては、限定されないが、Ｃｒａｗｆｏｒｄ ａｎｄ Ｗｈｅｒｒｙ，２００９（Ｊ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ ８６：５－８）、国際公開第２０１１／０１４４３８号（例えば４Ｃ７、または配列番号８および１５ならびに／もしくは配列番号１１および１８に従う重鎖および軽鎖を含む抗体）、国際公開第２０１４／１８３８８５号（例えばＣＮＣＭ Ｉ－４７５２の番号で寄託された抗体）および米国特許出願公開第２０１８／１５５４２８号に記載されている抗ＢＴＬＡ抗体が挙げられる。
ＫＩＲシグナル伝達のチェックポイント阻害剤としては、限定されないが、モノクローナル抗体リリルマブ（１－７Ｆ９；ＩＰＨ２１０２；米国特許第８，７０９，４１１号参照）、ＩＰＨ４１０２（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ；Ｍａｒｉｅ－Ｃａｒｄｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃａｎｃｅｒ ７４（２１）：６０６０－７０参照）、例えば、米国特許出願公開第２０１８／２０８６５２号、米国特許出願公開第２０１８／１１７１４７号、米国特許出願公開第２０１５／３４４５７６号、国際公開第２００５／００３１６８号、国際公開第２００５／００９４６５号、国際公開第２００６／０７２６２５号、国際公開第２００６／０７２６２６号、国際公開第２００７／０４２５７３号、国際公開第２００８／０８４１０６号（例えば、配列番号２および３に従う重鎖および軽鎖を含む抗体）、国際公開第２０１０／０６５９３９号、国際公開第２０１２／０７１４１１号、国際公開第２０１２／１６０４４８号および国際公開第２０１４／０５５６４８号に開示されている抗ＫＩＲ抗体が挙げられる。
ＬＡＧ－３阻害剤としては、限定されないが、抗ＬＡＧ－３抗体ＢＭＳ－９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；国際公開第２０１４／００８２１８号および国際公開第２０１５／１１６５３９号参照）、２５Ｆ７（米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２参照）、ＩＭＰ７３１（国際公開第２００８／１３２６０１号参照）、Ｈ５Ｌ７ＢＷ（国際公開第２０１４１４０１８０号参照）、ＭＫ－４２８０（２８Ｇ－１０；Ｍｅｒｃｋ；国際公開第２０１６／０２８６７２号参照）、ＲＥＧＮ３７６７（Ｒｅｇｎｅｒｏｎ／Ｓａｎｏｆｉ）、ＢＡＰ０５０（国際公開第２０１７／０１９８９４号参照）、ＩＭＰ－７０１（ＬＡＧ－５２５；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｓｙｍ０２２（Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ）、ＴＳＲ－０３３（Ｔｅｓａｒｏ）、ＭＧＤ０１３（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓによって開発されたＬＡＧ－３およびＰＤ－１を標的とする二重特異性ＤＡＲＴ抗体）、ＢＩ７５４１１１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＦＳ１１８（Ｆ－ｓｔａｒによって開発されたＬＡＧ－３およびＰＤ－１を標的とする二重特異性抗体）、ＧＳＫ２８３１７８１（ＧＳＫ）、ならびに国際公開第２００９／０４４２７３号、国際公開第２００８／１３２６０１号、国際公開第２０１５／０４２２４６号、欧州特許第２ ３２０ ９４０号、米国特許出願公開第２０１９／１６９２９４号、米国特許出願公開第２０１９／１６９２９２号、国際公開第２０１６／０２８６７２号、国際公開第２０１６／１２６８５８号、国際公開第２０１６／２００７８２号、国際公開第２０１５／２００１１９号、国際公開第２０１７／２２０５６９号、国際公開第２０１７／０８７５８９号、国際公開第２０１７／２１９９９５号、国際公開第２０１７／０１９８４６号、国際公開第２０１７／１０６１２９号、国際公開第２０１７／０６２８８８号、国際公開第２０１８／０７１５００号、国際公開第２０１７／０８７９０１号、米国特許出願公開第２０１７／０２６０２７１号、国際公開第２０１７／１９８７４１号、国際公開第２０１７／２２０５５５号、国際公開第２０１７／０１５５６０号、国際公開第２０１７／０２５４９８号、国際公開第２０１７／１４９１４３号、国際公開第２０１８／０６９５００号、国際公開第２０１８／０８３０８７号、国際公開第２０１８／０３４２２７号、国際公開第２０１４／１４０１８０号に開示されている抗体、ＬＡＧ－３アンタゴニストタンパク質ＡＶＡ－０１７（Ａｖａｃｔａ）、可溶性ＬＡＧ－３融合タンパク質ＩＭＰ３２１（エフチラギモドアルファ；Ｉｍｍｕｔｅｐ；欧州特許第２ ２０５ ２５７号およびＢｒｉｇｎｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７９：４２０２－４２１１）、ならびに国際公開第２０１８／２２２７１１号に開示されている可溶性ＬＡＧ－３タンパク質が挙げられる。
ＴＩＭ－３阻害剤としては、限定されないが、Ｆ３８－２Ｅ２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、コボリマブ（ＴＳＲ－０２２；Ｔｅｓａｒｏ）、ＬＹ３３２１３６７（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＭＢＧ４５３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などのＴＩＭ－３を標的とする抗体、ならびに例えば、国際公開第２０１３／００６４９０号、国際公開第２０１８／０８５４６９号（例えば、配列番号３および４に従う核酸配列によってコードされる重鎖および軽鎖配列を含む抗体）、国際公開第２０１８／１０６５８８号、国際公開第２０１８／１０６５２９号（例えば、配列番号８～１１に従う重鎖および軽鎖配列を含む抗体）に開示されている抗体が挙げられる。
ＴＩＭ－３リガンド阻害剤としては、限定されないが、抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体ＣＭ１０（ｃＣＡＭ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；国際公開第２０１３／０５４３３１号参照）などのＣＥＡＣＡＭ１阻害剤、国際公開第２０１５／０７５７２５号（例えば、ＣＭ－２４、２６Ｈ７、５Ｆ４、ＴＥＣ－１１、１２－１４０－４、４／３／１７、ＣＯＬ－４、Ｆ３６－５４、３４Ｂ１、ＹＧ－Ｃ２８Ｆ２、Ｄ１４ＨＤ１１、Ｍ８．７．７、Ｄ１１－ＡＤ１１、ＨＥＡ８１、Ｂ ｌ．ｌ、ＣＬＢ－ｇｒａｎ－１０、Ｆ３４－１８７、Ｔ８４．１、Ｂ６．２、Ｂ １．１３、ＹＧ－Ｃ９４Ｇ７、１２－１４０－５、ｓｃＦｖ ＤＩＡＴＨＩＳ１、ＴＥＴ－２；ｃＣＡＭ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）に開示されている抗体、Ｗａｔｔ ｅｔ ａｌ．，２００１（Ｂｌｏｏｄ，９８：１４６９－１４７９）および国際公開第２０１０／１２５５７号に記載されている抗体、ならびにバビツキシマブ（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）などのＰｔｄＳｅｒ阻害剤が挙げられる。
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ阻害剤には、限定されないが、モナリズマブ（ＩＰＨ２２０１；Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）、ならびに米国特許第９，４２２，３６８号（例えばヒト化Ｚ１９９；欧州特許第２ ６２８ ７５３号参照）、欧州特許第３ １９３ ９２９号および国際公開第２０１６／０３２３３４号（例えばヒト化Ｚ２７０；欧州特許第２ ６２８ ７５３号参照）に開示されている抗体およびそれらの生成のための方法が含まれる。
ＩＤＯ阻害剤としては、限定されないが、エキシグアミンＡ、エパカドスタット（ＩＮＣＢ０２４３６０；ＩｎＣｙｔｅ；米国特許第９，６２４，１８５号参照）、インドキシモド（Ｎｅｗｌｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；ＣＡＳ番号：１１０１１７－８３－４）、ＮＬＧ９１９（Ｎｅｗｌｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ＣＡＳ番号：１４０２８３６－５８－１）、ＧＤＣ－０９１９（Ｎｅｗｌｉｎｋ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ＣＡＳ番号：１４０２８３６－５８－１）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＢＭＳ；ＣＡＳ番号：２２２１０３４－２９－１）、ＫＨＫ２４５５（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ．２８（４）：３１７－３３０）、ＰＦ－０６８４０００３（国際公開第２０１６／１８１３４８号参照）、ナボキシモド（ＲＧ６０７８、ＧＤＣ－０９１９、ＮＬＧ９１９；ＣＡＳ番号：１４０２８３７－７８－８）、リンロドスタット（ＢＭＳ－９８６２０５；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｕｉｂｂ；ＣＡＳ番号：１９２３８３３－６０－６）、小分子、例えば１－メチル－トリプトファン、ピロリジン－２，５－ジオン誘導体（国際公開第２０１５／１７３７６４号参照）およびＳｈｅｒｉｄａｎ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３３：３２１－３２２によって開示されているＩＤＯ阻害剤が挙げられる。
ＣＤ３９阻害剤としては、限定されないが、Ａ００１４８５（Ａｒｃｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＳＢ ０６９（ＣＡＳ番号：７８５１０－３１－３）および抗ＣＤ３９モノクローナル抗体ＩＰＨ５２０１（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ；Ｐｅｒｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２４１１－２４２５．Ｅ９参照）が挙げられる。
ＣＤ７３阻害剤としては、限定されないが、ＣＰＩ－００６（Ｃｏｒｖｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＥＤＩ９４４７（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ；国際公開第２０１６０７５０９９号参照）、ＩＰＨ５３０１（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ；Ｐｅｒｒｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８：２４１１－２４２５．Ｅ９参照）などの抗ＣＤ７３抗体、国際公開第２０１８／１１０５５５号に記載されている抗ＣＤ７３抗体、低分子阻害剤ＰＢＳ １２３７９（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ＣＡＳ番号：１８０２２２６－７８－３）、Ａ０００８３０、Ａ００１１９０およびＡ００１４２１（Ａｒｃｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７８（１３ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：３６９１－３６９１，ｄｏｉ：１０．１１５８／１５３８－７４４５．ＡＭ２０１８－３６９１参照）、ＣＢ－７０８（Ｃａｌｉｔｈｅｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＡｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１８（Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２７６（１）：１２１－１４４）に記載されているプリン細胞傷害性ヌクレオシド類似体に基づくジホスホネートが挙げられる。
Ａ２ＡＲ阻害剤としては、限定されないが、イストラデフィリン（ＫＷ－６００２；ＣＡＳ番号：１５５２７０－９９－８）、ＰＢＦ－５０９（Ｐａｌｏｂｉｏｐｈａｒｍａ）、シフォラデナント（ＣＰＩ－４４４：Ｃｏｒｖｕｓ Ｐｈａｒｍａ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ＣＡＳ番号：１２０２４０２－４０－１）、ＳＴ１５３５（［２ブチル－９－メチル－８－（２Ｈ－１，２，３－トリアゾール２－イル）－９Ｈ－プリン－６－キシラミン］；ＣＡＳ番号：４９６９５５－４２－１）、ＳＴ４２０６（Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｅｕｒｏｐ Ｊ Ｐｈａｒｍ ７６１：３５３－３６１；ＣＡＳ番号：１２４６０１８－３６－９）、トザデナント（ＳＹＮ１１５；ＣＡＳ番号：８７００７０－５５－６）、Ｖ８１４４４（国際公開第２００２／０５５０８２号参照）、プレラデナント（ＳＣＨ４２０８１４；Ｍｅｒｃｋ；ＣＡＳ番号：３７７７２７－８７－２）、ビパデナント（ＢＩＩＢ０１４；ＣＡＳ番号：４４２９０８－１０－３）、ＳＴ１５３５（ＣＡＳ番号：４９６９５５－４２－１）、ＳＣＨ４１２３４８（ＣＡＳ番号：３７７７２７－２６－９）、ＳＣＨ４４２４１６（Ａｘｏｎ ２２８３；Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ；ＣＡＳ番号：３１６１７３－５７－６）、ＺＭ２４１３８５（４－（２－（７－アミノ－２－（２－フリル）－（１，２，４）トリアゾロ（２，３－ａ）－（１，３，５）トリアジン－５－イル－アミノ）エチル）フェノール；ＣＡＳ番号：１３９１８０－３０－６）、ＡＺＤ４６３５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＢ９２８（二重Ａ２ＡＲ／Ａ２ＢＲ低分子阻害剤；Ａｒｃｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳＣＨ５８２６１（Ｐｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍ ２２：５２２－５２９参照；ＣＡＳ番号：１６００９８－９６－４）などの低分子阻害剤が挙げられる。
Ａ２ＢＲ阻害剤としては、限定されないが、ＡＢ９２８（二重Ａ２ＡＲ／Ａ２ＢＲ低分子阻害剤；Ａｒｃｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＭＲＳ １７０６（ＣＡＳ番号：２６４６２２－５３－９）、ＧＳ６２０１（ＣＡＳ番号：７５２２２２－８３－６）およびＰＢＳ１１１５（ＣＡＳ番号：１５２５２９－７９－８）が挙げられる。
ＶＩＳＴＡ阻害剤としては、限定されないが、ＪＮＪ－６１６１０５８８（オンバチリマブ；Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの抗ＶＩＳＴＡ抗体ならびに低分子阻害剤ＣＡ－１７０（抗ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２および抗ＶＩＳＴＡ低分子；ＣＡＳ番号：１６７３５３４－７６－３）が挙げられる。
Ｓｉｇｌｅｃ阻害剤としては、限定されないが、米国特許出願公開第２０１９／０２３７８６号および国際公開第２０１８／０２７２０３号に開示されている抗Ｓｉｇｌｅ－７抗体、（例えば、配列番号１に従う可変重鎖領域および配列番号１５に従う可変軽鎖領域を含む抗体）、抗Ｓｉｇｌｅｃ－２抗体イノツズマブオゾガマイシン（Ｂｅｓｐｏｎｓａ；米国特許第８，１５３，７６８号および米国特許第９，６４２，９１８号参照）、抗Ｓｉｇｌｅｃ－３抗体ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ；米国特許第９，３５９，４４２号参照）、または米国特許出願公開第２０１９／０６２４２７号、米国特許出願公開第２０１９／０２３７８６号、国際公開第２０１９／０１１８５５号、国際公開第２０１９／０１１８５２号（例えば、配列番号１７１～１７６、もしくは３および４、もしくは５および６、もしくは７および８、もしくは９および１０、もしくは１１および１２、もしくは１３および１４、もしくは１５および１６、もしくは１７および１８、もしくは１９および２０、もしくは２１および２２、もしくは２３および２４、もしくは２５および２６に従うＣＤＲを含む抗体）、米国特許出願公開第２０１７／３０６０１４号および欧州特許第３ １４６ ９７９号に開示されている抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体が挙げられる。
ＣＤ２０阻害剤としては、限定されないが、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ；ＩＤＥＣ－１０２；ＩＤＥＣ－Ｃ２Ｂ８；米国特許第５，８４３，４３９号参照）、ＡＢＰ ７９８（リツキシマブバイオシミラー）、オファツムマブ（２Ｆ２；国際公開第２００４／０３５６０７号参照）、オビヌツズマブ、オクレリズマブ（２ｈ７；国際公開第２００４／０５６３１２号参照）、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ）、トシツモマブ、ウブリツキシマブ（ＬＦＢ－Ｒ６０３；ＬＦＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの抗ＣＤ２０抗体、および米国特許出願公開第２０１８／００３６３０６号に開示されている抗体（例えば、配列番号１～３および４～６、または７および８、または９および１０に従う軽鎖および重鎖を含む抗体）が挙げられる。
ＧＡＲＰ阻害剤には、限定されないが、ＡＲＧＸ－１１５（ａｒＧＥＮ－Ｘ）などの抗ＧＡＲＰ抗体、ならびに米国特許出願公開第２０１９／１２７４８３号、米国特許出願公開第２０１９／０１６８１１号、米国特許出願公開第２０１８／３２７５１１号、米国特許出願公開第２０１６／２５１４３８号、欧州特許第３ ２５３ ７９６号に開示されている抗体およびそれら生成のための方法が含まれる。
ＣＤ４７阻害剤としては、限定されないが、例えばＨｕＦ９－Ｇ４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｆｏｒｔｙ Ｓｅｖｅｎ）、ＣＣ－９０００２／ＩＮＢＲＸ－１０３（Ｃｅｌｇｅｎｅ／Ｉｎｈｉｂｒｘ）、ＳＲＦ２３１（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＩＢＩ１８８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）などの抗ＣＤ４７抗体、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１；ＣＤ４７およびＣＤ１９を標的とする二重特異性モノクローナル抗体；Ｎｏｖｉｍｍｕｎｅ／ＴＧ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）およびＮＩ－１８０１（ＣＤ４７およびメソテリンを標的とする二重特異性モノクローナル抗体；Ｎｏｖｉｍｍｕｎｅ）を含むＣＤ４７を標的とする二重特異性抗体、ならびにＡＬＸ１４８（ＡＬＸ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；Ｋａｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２０１８３２）などのＣＤ４７融合タンパク質が挙げられる。
ＳＩＲＰα阻害剤としては、限定されないが、ＯＳＥ－１７２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ／ＯＳＥ）、ＦＳＩ－１８９（Ｆｏｒｔｙ Ｓｅｖｅｎ）などの抗ＳＩＲＰα抗体、ＴＴＩ－６２１およびＴＴＩ－６６２（Ｔｒｉｌｌｉｕｍ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；国際公開第２０１４／０９４１２２号参照）などの抗ＳＩＲＰα融合タンパク質が挙げられる。
ＰＶＲＩＧ阻害剤としては、限定されないが、ＣＯＭ７０１（ＣＧＥＮ－１５０２９）などの抗ＰＶＲＩＧ抗体、ならびに例えば国際公開第２０１８／０３３７９８号に開示されている抗体およびそれらの製造方法（例えば、ＣＨＡ．７．５１８．１Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．７．５３８．１．２．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＰＡ．９．０８６Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＰＡ．９．０８３Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．７．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ならびに配列番号５に従う可変重鎖ドメインと国際公開第２０１８／０３３７９８号の配列番号１０に従う可変軽鎖ドメインとを含む抗体、または配列番号９に従う重鎖と配列番号１４に従う軽鎖とを含む抗体；国際公開第２０１８／０３３７９８号は、抗ＴＩＧＩＴ抗体ならびに抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＰＶＲＩＧ抗体との併用療法をさらに開示する）、国際公開第２０１６１３４３３３号、国際公開第２０１８０１７８６４号（例えば、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列番号５～７に従う重鎖および／もしくは配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列番号８～１０に従う軽鎖を含む抗体、または配列番号１３および／もしくは１４もしくは配列番号２４および／もしくは２９によってコードされる抗体、または国際公開第２０１８／０１７８６４号に開示されている別の抗体）に開示されている抗体およびそれらの製造方法、ならびに国際公開第２０１６／１３４３３５号に開示されている抗ＰＶＲＩＧ抗体および融合ペプチドが挙げられる。
ＣＳＦ１Ｒ阻害剤としては、限定されないが、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体カビラリズマブ（ＦＰＡ００８；ＦｉｖｅＰｒｉｍｅ；国際公開第２０１１／１４０２４９号、国際公開第２０１３／１６９２６４号および国際公開第２０１４／０３６３５７号参照）、ＩＭＣ－ＣＳ４（ＥｉｉＬｉｌｌｙ）、エマクツズマブ（Ｒ０５５０９５５４；Ｒｏｃｈｅ）、ＲＧ７１５５（国際公開第２０１１／７００２４号、国際公開第２０１１／１０７５５３号、国際公開第２０１１／１３１４０７号、国際公開第２０１３／８７６９９号、国際公開第２０１３／１１９７１６号、国際公開第２０１３／１３２０４４号）、ならびに低分子阻害剤ＢＬＺ９４５（ＣＡＳ番号：９５３７６９－４６－５）およびペキシダルチニブ（ＰＬＸ３３９７；Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ；ＣＡＳ番号：１０２９０４４－１６－３）が挙げられる。
ＣＳＦ１阻害剤としては、限定されないが、欧州特許第１ ２２３ ９８０号およびＷｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６（Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ １１：１４７４－１４８１）、国際公開第２０１４／１３２０７２号に開示されている抗ＣＳＦ１抗体、ならびに国際公開第２００１／０３０３８１号に開示されているアンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。
例示的なＮＯＸ阻害剤としては、限定されないが、低分子ＭＬ１７１（Ｇｉａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５（１０）：９８１－９３、ＮＯＳ３１（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．４１（３）：４１９－４２６）などのＮＯＸ１阻害剤、低分子セプレン（ヒスタミン二塩酸塩；ＣＡＳ番号：５６－９２－８）、ＢＪ－１３０１（Ｇａｕｔａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １６（１０）：２１４４－２１５６；ＣＡＳ番号：１２８７２３４－４８－３）およびＬｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １４３：２５－３８によって記載されている阻害剤などのＮＯＸ２阻害剤、低分子阻害剤ＶＡＳ２８７０（Ａｌｔｅｎｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６９（１４）：２３２７－２３４３）、ジフェニレンヨードニウム（ＣＡＳ番号：２４４－５４－２）およびＧＫＴ１３７８３１（ＣＡＳ番号：１２１８９４２－３７－０；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８，１９（１０）：５７８－５８５参照）などのＮＯＸ４阻害剤が挙げられる。
ＴＤＯ阻害剤としては、限定されないが、４－（インドール－３－イル）－ピラゾール誘導体（米国特許第９，１２６，９８４号および米国特許出願公開第２０１６／０２６３０８７号参照）、３－インドール置換誘導体（国際公開第２０１５／１４０７１７号、国際公開第２０１７／０２５８６８号、国際公開第２０１６／１４７１４４号参照）、３－（インドール－３－イル）－ピリジン誘導体（米国特許出願公開第２０１５／０２２５３６７号および国際公開第２０１５／１２１８１２号参照）、国際公開第２０１５／１５００９７号、国際公開第２０１５／０８２４９９号、国際公開第２０１６／０２６７７２号、国際公開第２０１６／０７１２８３号、国際公開第２０１６／０７１２９３号、国際公開第２０１７／００７７００号に開示されている低分子二重ＩＤＯ／ＴＤＯ阻害剤などの二重ＩＤＯ／ＴＤＯアンタゴニスト、ならびに低分子阻害剤ＣＢ５４８（Ｋｉｍ，Ｃ，ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌ ２９（ｓｕｐｐｌ＿８）：ｖｉｉｉ４００－ｖｉｉｉ４４１）が挙げられる。
本開示によれば、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害性チェックポイントタンパク質の阻害剤であるが、好ましくは刺激性チェックポイントタンパク質の阻害剤ではない。本明細書に記載されるように、多数のＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＩＤＯ、Ａ２ＡＲ、Ａ２ＢＲ、ＶＩＳＴＡ、Ｓｉｇｌｅｃ、ＣＤ２０、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＧＡＲＰ、ＣＤ４７、ＰＶＲＩＧ、ＣＳＦ１Ｒ、ＮＯＸおよびＴＤＯの阻害剤ならびにそれぞれのリガンドの阻害剤が公知であり、それらのいくつかは既に臨床試験中であるか、さらには承認されている。これらの公知の免疫チェックポイント阻害剤に基づいて、代替免疫チェックポイント阻害剤が開発され得る。特に、好ましい免疫チェックポイントタンパク質の公知の阻害剤をそのまま使用してもよく、またはその類似体を使用してもよく、特にキメラ化、ヒト化またはヒト形態の抗体および本明細書に記載される抗体のいずれかと交差競合する抗体を使用してもよい。
標的化が、Ｔ細胞増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増強、および／またはサイトカイン産生の増加（例えばＩＦＮ－γ、ＩＬ２）に反映されるような抗腫瘍免疫応答などの免疫応答の刺激をもたらす限り、他の免疫チェックポイント標的もまた、アンタゴニストまたは抗体によって標的化され得ることが当業者に理解されるであろう。
チェックポイント阻害剤は、当技術分野で公知の任意の方法および任意の経路によって投与され得る。投与の方法および経路は、使用されるチェックポイント阻害剤の種類に依存する。
チェックポイント阻害剤は、本明細書に記載の任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。
チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば阻害性核酸分子または抗体もしくはその断片をコードする核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子の形態で投与され得る。例えば、抗体は、本明細書に記載されるように、発現ベクターにコードされて送達され得る。核酸分子は、それ自体で、例えばプラスミドもしくはｍＲＮＡ分子の形態で送達され得るか、または送達ビヒクル、例えばリポソーム、リポプレックスもしくは核酸脂質粒子と複合体化され得る。チェックポイント阻害剤はまた、チェックポイント阻害剤をコードする発現カセットを含む腫瘍溶解性ウイルスを介して投与され得る。チェックポイント阻害剤はまた、例えば細胞ベースの治療法の形態で、チェックポイント阻害剤を発現することができる内因性または同種異系細胞の投与によって投与され得る。
「細胞ベースの治療法」という用語は、疾患または障害（例えば癌疾患）を治療する目的で、免疫チェックポイント阻害剤を発現する細胞（例えばＴリンパ球、樹状細胞、または幹細胞）を対象に移植することを指す。一実施形態では、細胞ベースの治療法は、遺伝子操作された細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細胞は、本明細書に記載されるような免疫チェックポイント阻害剤を発現する。一実施形態では、遺伝子操作された細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、アプタマー、抗体もしくはその断片、または可溶性免疫チェックポイントタンパク質もしくは融合物などの阻害性核酸分子である免疫チェックポイント阻害剤を発現する。遺伝子操作された細胞はまた、Ｔ細胞機能を増強するさらなる作用物質を発現し得る。そのような作用物質は当技術分野で公知である。免疫チェックポイントシグナル伝達の阻害において使用するための細胞ベースの治療法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／２２２７１１号に開示されている。
本明細書で使用される「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、インビトロまたはインビボのいずれかで、正常細胞には全く影響を及ぼさないかまたは最小限の影響しか及ぼさずに、癌性または過剰増殖性細胞において選択的に複製し、その成長を遅らせるかまたはその死を誘導することができるウイルスを指す。免疫チェックポイント阻害剤の送達のための腫瘍溶解性ウイルスは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡ、アプタマー、抗体もしくはその断片、または可溶性免疫チェックポイントタンパク質もしくは融合物などの阻害性核酸分子である免疫チェックポイント阻害剤をコードし得る発現カセットを含む。腫瘍溶解性ウイルスは、好ましくは複製能を有し、発現カセットはウイルスプロモータ、例えば合成初期／後期ポックスウイルスプロモータの制御下にある。例示的な腫瘍溶解性ウイルスとしては、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ラブドウイルス（例えばセネカバレーウイルス；ＳＶＶ－００１などのピコルナウイルス）、コクサッキーウイルス、パルボウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；ＯｎｃｏＶＥＸ ＧＭＣＳＦ）、レトロウイルス（例えばインフルエンザウイルス）、麻疹ウイルス、レオウイルス、シンドビスウイルス、国際公開第２０１７／２０９０５３号に例示的に記載されているワクシニアウイルス（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｗｙｅｔｈ株を含む）、およびアデノウイルス（例えばＤｅｌｔａ－２４、Ｄｅｌｔａ－２４－ＲＧＤ、ＩＣＯＶＩＲ－５、ＩＣＯＶＩＲ－７、Ｏｎｙｘ－０１５、ＣｏｌｏＡｄ１、Ｈ１０１、ＡＤ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦ）が挙げられる。可溶性形態の免疫チェックポイント阻害剤を含む組換え腫瘍溶解性ウイルスの作製およびそれらの使用方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０２２８３１号に開示されている。腫瘍溶解性ウイルスは、弱毒化ウイルスとして使用することができる。
放射線療法
放射線療法（ＲＴ）は、使用される２番目に一般的な治療レジメンであり、癌患者の約５０％に行われる。放射線を悪性組織に局所的に送達するために、高エネルギー光子（Ｘ線およびγ線）、粒子照射（例えば陽子、炭素イオン）または放射性核種（セシウム１３７、イリジウム１９２、ヨウ素１２５）を使用する、様々な種類のＲＴ治療が存在する。局所ＲＴ（ＬＲＴ）は、１２０年以上にわたる技術的改善および放射線量の精緻化の歴史に向き合っている。
電離放射線とは、物質をイオン化するのに十分なエネルギーを有し、電磁放射線（Ｘ線およびγ線）と粒子放射線（αおよびβ粒子、陽子、重イオン）とに分けることができる放射線を指す。電離放射線の天然源は、放射性崩壊時に、α（Ｈｅ２＋）、β（ｅ－またはｅ＋）およびγ線（高エネルギー光子）の固有のスペクトルを放出する放射性同位体である。イオン化事象の数および組織浸透深さは、一次運動エネルギー、および帯電している場合はクーロンエネルギーの関数である。放射線量は、物質の単位質量当たりの吸収放射線量（１Ｊ放射線／ｋｇ物質）についての国際単位系（ＳＩ）単位としてグレイ（Ｇｙ）で測定される。
電離放射線が生体物質を横断するとき、電離放射線は、細胞、組織および全体としての生物に対する直接的かつ深刻な影響を伴って、化学結合を破壊し、分子をイオン化することができる。全ての細胞構造は、直接的または間接的に（放射線誘発活性酸素種（ＲＯＳ）による間接イオン化）放射線によって害され得るが、ＤＮＡ損傷は、最終的かつ最も深刻な結果と見なされる。電離放射線は、塩基損傷、一本鎖切断（ＳＳＢ）および二本鎖切断（ＤＳＢ）などの様々な種類のＤＮＡ損傷を引き起こし得る。ＤＮＡ損傷の種類および密度は、放射線の種類（例えば電磁気または微粒子）および線量の関数である。しかしながら、正確な細胞運命は、開始されたＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）の関数としての細胞型、細胞周期相、修復能力および細胞死能力などの細胞固有因子に依存する。第１に、細胞が修復能力を有し、損傷が最小限である場合、細胞はその損傷を修復し得る。塩基損傷およびＳＳＢは、塩基除去修復（ＢＥＲ）またはヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）を介して修復されるが、より重度のＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ、全細胞周期相）または相同組換え（ＨＲ、ＳおよびＧ２期のみ）を介して修復される。第２に、細胞はＤＮＡ損傷を修復しようとし得るが、成功せず、その損傷形態で再生する。未修復のＤＳＢは、有糸分裂崩壊による細胞死をもたらし得るが、誤って修復されたＤＳＢは、染色体転座およびゲノム不安定性を生じさせ、二次癌を引き起こし得る。第３に、細胞は損傷を認識し、プログラム細胞死（アポトーシス）を受ける。
ほとんどの癌細胞は、異常なＤＮＡ修復経路および損なわれた細胞周期制御を示すので、それらは、それらの健康な対応物とは異なって電離放射線に応答し得る。
細胞死滅の線形二次（ＬＱ）モデルは、放射線生物学および物理学における重要な数学的ツールの１つであり、送達される線量と細胞生存率との間の単純な関係を提供する。異なる放射線量をインビトロで適用し、クローン原性生存アッセイで測定される前駆細胞の生存コロニーを産生する能力によって細胞の生存率を決定する。クローン原性生存アッセイは、放射線に応答した細胞生存率を測定するための認められているゴールドスタンダードであり、
Figure 2023554154000024
 によって定義され、Ｓは生存細胞率であり、Ｄは総線量であり、αおよびβは細胞の放射線感受性の尺度である。生存率は、放射線量に対して対数スケールでプロットされる。生存曲線は、低線量では線形勾配（α）および高線量では曲線勾配（β）に従う。この曲線の初期および後期の屈曲は細胞固有の特性であり、α／β比として表される。α／β比が高い細胞は、異なる線量にわたって比較的一定の細胞死速度を経験するが、α／β比が低い細胞は顕著な曲率を示し、高線量放射線に応答して細胞死が増加する。ほとんどの健康な細胞などのゆっくり増殖する細胞または組織は、一般に非常に良好に修復し、低いα／β比を有する（後期応答組織）。腫瘍細胞などの急速に増殖する細胞または組織は、一般に修復不良であり、高いα／β比を有する（急性応答組織）。特に低線量（＜２～２．５Ｇｙ）では、正常細胞は、より遅い増殖および無傷のＤＮＡ修復のために腫瘍細胞よりも生存上の利点を有する。低線量での腫瘍細胞のより高い放射線感受性は、今日の標準的な臨床診療で依然として使用されている分割放射線療法の基礎を形成する。
しかしながら、電離放射線効果を予測するためのＬＱモデルには重大な制限がある：（ｉ）これは、インビボ放射線効果を予測するために使用されるインビトロモデルであり、（ｉｉ）クローン原性生存率を測定するが、誘導される細胞死の種類、例えば有糸分裂崩壊、アポトーシス、壊死、ネクロトーシス、オートファジーまたは複製老化についての情報は提供されておらず、（ｉｉｉ）免疫系の反応を説明しておらず、および（ｉｖ）分割当たりのより高い線量（＞１０Ｇｙ）では正確ではない。
腫瘍の放射線治療処置には、２種類の放射線装置、すなわち電磁装置および粒子装置が利用される。種類（電磁または粒子）および一次エネルギーに依存して、放射線ビームは組織への異なる線量沈着プロファイルを有する。
光子は組織に深く浸透することができず、一次エネルギーに応じて、最初の５～１０ｃｍの水中にエネルギーを沈着するが、陽子ビームのような粒子ビームは、組織により深く浸透することができる。Ｘ線は比較的安価であり、微粒子照射ほど有害ではなく、したがってより安全であると考えられるため、従来の放射線療法で最も一般的に使用されている。
Ｘ線の治療的使用は、技術開発の長い歴史に向き合っており、今日でも初期の放射線装置の多くが依然として使用されている。１９３０年代の常用電圧Ｘ線管（２００～５００キロボルト（ｋＶ））の開発により、初めてＸ線ビームによる腫瘍の外部治療が可能になった。自然のＸ線またはγ線放出放射性核種とは対照的に、Ｘ線管は、電気入力からＸ線を生成する真空管である。電子はカソードから放出され、真空を通ってアノードに向かって加速される。管電圧（５０ｋＶ～５００ｋＶ）に応じて、電子は異なる速度に加速され、異なるエネルギーのＸ線が生成される。電子がアノード材料に衝突すると、電子ビームに垂直にＸ範囲の制動放射が生成される。自然放出放射性核種とは対照的に、放射線は、Ｘ線管がオンになっている限り生成されるのみである。得られるＸ線エネルギーは、管電圧およびアノード材料の関数である。組織浸透深さが低いため、常用電圧Ｘ線は臨床診療では断念されているが、前臨床研究では依然として頻繁に適用されている。
今日、治療目的で高エネルギーＸ線を生成するために医療用線形加速器（ＬＩＮＡＣ）を利用した大容量Ｘ線（１～２５ＭｅＶ）が使用されている。ビームのサイズ、形状および角度は、健康な組織を避けながら腫瘍を覆うように制御される。従来の３ＤコンフォーマルＲＴ（３Ｄ－ＣＲＴ）および強度変調ＲＴ（ＩＭＲＴ）は、外部ビームＲＴ（ＥＢＲＴ）の異なる形態である。従来のＲＴでは、放射線量は、複数の重なり合うビームにおいて異なる角度から送達される。最高線量は腫瘍内のビーム交差部で送達され、線量は交点からの距離と共に減少する。３Ｄ－ＣＲＴでは、腫瘍３Ｄ画像（コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ））を使用して、腫瘍の形状により適合し、リスクのある臓器の輪郭をより正確に描画する放射線ビームを設計する。ＩＭＲＴは、ビームが異なる強度の数百のビームレットに分割され、高コンフォーマル線量分布および高精度の腫瘍標的化を可能にする、先進的な形態の３Ｄ－ＣＲＴである。
電磁照射とは対照的に、陽子または炭素ビームを使用して、１９７０年代に治療的使用のために粒子照射が導入された。粒子照射は、その良好な浸透可能性およびその範囲の末端における高いエネルギー沈着（ブラッグピーク）を特徴とする。これは、軌道に沿った線量沈着が制限された極めて急峻な線量勾配を可能にする。しかしながら、放射線装置は非常にコストがかかり、高線量沈着は二次癌の高いリスクを伴う。
放射線送達および放射線装置が基本的であったときに、基礎となる生物学の認識のためではなく、技術的な制限およびオフターゲット効果を低減するという要求のために、総放射線量は複数のより小さい放射線量に分割された。今日、臨床ＬＲＴプロトコルは依然として分割ＬＲＴに基づいており、６～８週間にわたって毎日１．８～２Ｇｙ（月曜日から金曜日まで）を適用し、６０～８０Ｇｙの総線量を累積する。
放射線送達の技術的進歩により、放射線量を高い精度、減少したマージンおよび高い線量コンフォメーションで送達することができる。これは、リスクの低い単回照射でより高い放射線量を送達することを可能にし、体幹部定位ＲＴ（ＳＢＲＴ）と呼ばれる。さらに、特に分割当たりの高線量を適用した場合に、ＬＲＴの免疫調節効果が知られるようになった。好ましい免疫学的効果のために、変化が進行中であり、高線量ＬＲＴを単独でまたは他の免疫調節剤と組み合わせて適用することが増えつつある。
医薬組成物
本明細書に記載の薬剤は、医薬組成物または医薬品で投与され得るか、任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含んでいてもよく、任意で１つ以上のアジュバント、安定剤などを含んでいてもよい。一実施形態では、医薬組成物は、治療的または予防的処置のため、例えば疾患を治療または予防するのに使用するためのものである。
「医薬組成物」という用語は、治療上有効な薬剤を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と一緒に含む製剤に関する。上記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患または障害を治療する、予防する、またはその重症度を低下させるのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても公知である。
本開示の医薬組成物は、１つ以上のアジュバントを含んでいてもよく、または１つ以上のアジュバントと共に投与されてもよい。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、または免疫賦活複合体などの不均一な化合物の群を含む。アジュバントの例としては、限定されることなく、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、成長因子、およびサイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインが挙げられる。サイトカインは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－ａであり得る。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１などの油である。本開示で使用するための他の好適なアジュバントとしては、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドが挙げられる。
本開示による医薬組成物は、一般に、「薬学的有効量」および「薬学的に許容される調製物」で適用される。
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
「薬学的有効量」または「治療有効量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与される用量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍／病変を縮小させるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の成長速度を低下させる（例えば、腫瘍の成長を抑制する）のに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の発生を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の再発を予防するまたは遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の成長および／またはサイズおよび／または転移が減少、遅延、改善および／または予防されるように、腫瘍に対する対象の免疫応答を増加させるのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、（例えば、ｍＲＮＡを含む組成物の）有効量の投与は、（ｉ）癌細胞の数を減少させ得る；（ｉｉ）腫瘍サイズを縮小させ得る；（ｉｉｉ）末梢器官への癌細胞浸潤を阻害し、遅延させ、ある程度減速させ、停止させ得る；（ｉｖ）転移を阻害し得る（例えば、ある程度減速させ得るおよび／またはブロックもしくは防止し得る）；（ｖ）腫瘍成長を阻害し得る；（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を予防または遅延させ得る；ならびに／または（ｖｉｉ）癌に関連する症状の１つ以上をある程度軽減し得る。
本開示の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤および任意で他の治療薬を含有し得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。
本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤としては、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが挙げられる。
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例としては、限定されないが、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤または着色剤が挙げられる。
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする薬剤に関する。さらに、「希釈剤」という用語は、流体、液体または固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上を含む。適切な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロールおよび水が挙げられる。
「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体としては、限定されないが、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが挙げられる。一実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。
治療的使用のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与は、消化管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与を含み得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、消化管を介する以外の任意の方法での投与を指す。別の実施形態では、医薬組成物は、全身投与用、例えば静脈内投与用に製剤化される。
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、異なる化合物または組成物（例えば、抗原エピトープをコードするＲＮＡおよび免疫賦活剤をコードするＲＮＡ）を同じ患者に投与するプロセスを意味する。異なる化合物または組成物は、同時に、本質的に同時に、または連続的に投与され得る。
治療
本発明は、対象において免疫応答を誘導するための、特に標的抗原または標的抗原を発現する細胞、例えば標的抗原を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するための方法および薬剤であって、免疫賦活剤をコードするＲＮＡおよび任意で抗原エピトープをコードするＲＮＡの有効量を投与する工程を含む方法および薬剤を提供する。
一実施形態では、本明細書に記載の方法および薬剤は、標的抗原に関連する疾患または障害に対する対象における免疫を提供する。したがって、本発明は、標的抗原に関連する疾患または障害を治療または予防するための方法および薬剤を提供する。
一実施形態では、本明細書に記載の方法および薬剤は、標的抗原に関連する疾患または障害を有する対象に投与される。一実施形態では、本明細書に記載の方法および薬剤は、標的抗原に関連する疾患または障害を発症するリスクがある対象に投与される。
本発明の治療化合物または治療組成物は、疾患もしくは障害に罹患しているか、または疾患もしくは障害を発症するリスクがある（もしくは発症しやすい）対象に、予防的に（すなわち疾患または障害を予防するために）または治療的に（すなわち疾患または障害を治療するために）投与され得る。そのような対象は、標準的な臨床方法を用いて同定され得る。本発明の文脈において、予防的投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行が遅延されるように、疾患の明白な臨床症状の発現の前に行われる。医学の分野の文脈において、「予防する」という用語は、疾患による死亡または罹患の負担を軽減する任意の活性を包含する。予防は、一次、二次および三次予防レベルで行うことができる。一次予防は疾患の発症を回避するが、二次および三次レベルの予防は、機能を回復させ、疾患関連合併症を減少させることによって、疾患の進行および症状の出現を予防すること、ならびに既に確立された疾患の悪影響を減少させることを目的とした活動を包含する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物の投与は、単回投与によって実施され得るか、または複数回投与によってブーストされ得る。
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部源に由来する因子によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能不全によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能不全、窮迫、社会的問題、もしくは死亡を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、ならびに構造および機能の非定型の変化を含む場合があるが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリと見なされ得る。多くの疾患を患い、それらと共に生活することは、人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。
「倦怠感」という用語は、しばしば感染症または他の疾患の最初の徴候である、一般的な不快感、不安、または痛みに関する。
本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療的介入」という用語は、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことが意図されており、ここで、予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。
「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長する（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体における疾患を排除し得る、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ得る、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ得る、個体における症状の頻度もしくは重症度を低下させ得る、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。
「予防的処置」または「予防処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的処置」または「予防処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していても有していなくてもよいヒトまたは別の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、小児、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。
「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に疾患個体または対象を意味する。
本開示の一実施形態では、目的は、癌細胞に対する免疫応答を提供すること、および癌疾患を治療することである。一実施形態では、癌は抗原陽性癌である。
本明細書に記載の医薬組成物は、免疫応答を誘導または増強するために適用可能である。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防的および／または治療的処置に有用である。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を指す。免疫系は、より原始的な自然免疫系と、それぞれが体液性成分および細胞性成分を含む脊椎動物の獲得免疫系または適応免疫系とに分けられる。
「細胞媒介性免疫」、「細胞性免疫」、「細胞性免疫応答」、または同様の用語は、抗原の発現を特徴とする、特にクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に向けられる細胞応答を含むことが意図されている。細胞応答は、免疫エフェクタ細胞、特に「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働くＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも呼ばれる）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも呼ばれる）は、癌細胞などの疾患細胞を死滅させ、さらなる疾患細胞の産生を防止する。
本発明の文脈における「エフェクタ機能」という用語は、例えば癌細胞などの疾患細胞の死滅をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含む。一実施形態では、本発明の文脈におけるエフェクタ機能は、Ｔ細胞媒介エフェクタ機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）の場合、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み、ＣＴＬの場合、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、細胞、すなわち抗原の発現を特徴とする細胞の排除、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含む。
本発明の文脈における「免疫エフェクタ細胞」または「免疫反応性細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクタ機能を発揮する細胞に関する。一実施形態における「免疫エフェクタ細胞」は、細胞上のＭＨＣに関連して提示されるか、または細胞の表面上に発現される抗原などの抗原に結合し、免疫応答を媒介することができる。例えば、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞を含む。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫エフェクタ細胞」は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。本発明によれば、「免疫エフェクタ細胞」という用語はまた、適切な刺激で免疫細胞（Ｔ細胞、特にＴヘルパー細胞、または細胞溶解性Ｔ細胞など）に成熟することができる細胞を含む。免疫エフェクタ細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未成熟および成熟Ｔ細胞ならびに未成熟および成熟Ｂ細胞を含む。Ｔ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、抗原に曝露された場合、免疫系のクローン選択に類似する。活性化されると、細胞傷害性リンパ球は標的細胞の破壊を引き起こす。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、以下の手段のいずれかまたは両方によって標的細胞の破壊を引き起こす。第１に、活性化されると、Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンなどの細胞毒を放出する。パーフォリンおよびグラニュライシンは標的細胞に細孔を作り、グランザイムは細胞に進入し、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する細胞質のカスパーゼカスケードを引き起こす。第２に、アポトーシスは、Ｔ細胞と標的細胞との間のＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を介して誘導され得る。
「リンパ系細胞」は、細胞性免疫応答などの免疫応答を生成することができる細胞、またはそのような細胞の前駆細胞であり、リンパ球、好ましくはＴリンパ球、リンパ芽球および形質細胞を含む。リンパ系細胞は、本明細書に記載される免疫エフェクタ細胞であり得る。好ましいリンパ系細胞はＴ細胞である。
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。「抗原特異的Ｔ細胞」、「抗原に特異的なＴ細胞」という用語または同様の用語は、特にＭＨＣ分子に関連して抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面に提示された場合、Ｔ細胞が標的とする抗原を認識し、好ましくはＴ細胞のエフェクタ機能を発揮するＴ細胞に関する。
Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるこれらの細胞表面上の特別な受容体の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他のリンパ球型と区別することができる。胸腺は、Ｔ細胞の成熟に関与する主要な器官である。Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されており、それぞれが異なる機能を有する。
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも特に、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。活性化されると、これらは速やかに分裂し、能動免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、身体のほぼあらゆる細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。
Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。Ｔ細胞のＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、標的細胞の表面に提示される免疫原性ペプチド（エピトープ）と相互作用することができる。ＴＣＲの特異的結合は、Ｔ細胞内のシグナルカスケードを誘発し、増殖および成熟エフェクタＴ細胞への分化をもたらす。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から産生され、α－ＴＣＲ鎖およびβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの別個のペプチド鎖で構成される。γδ Ｔ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットである。しかし、γδ Ｔ細胞では、ＴＣＲは１本のγ鎖と１本のδ鎖で構成される。このＴ細胞の群は、αβ Ｔ細胞よりもはるかにまれである（全Ｔ細胞の２％）。
「体液性免疫」または「体液性免疫応答」は、分泌抗体、補体タンパク質、および特定の抗菌ペプチドなどの細胞外液に見出される高分子によって媒介される免疫の態様である。これは、細胞媒介性免疫とは対照的である。抗体が関与するその態様は、しばしば抗体媒介性免疫と呼ばれる。
本開示は、保護的、防御的、予防的および／または治療的であり得る免疫応答を企図する。本明細書で使用される場合、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」は、誘導前に特定の抗原に対する免疫応答が存在しなかったことを示し得るか、または誘導前に特定の抗原に対する基礎レベルの免疫応答があり、これが誘導後に増強されたことを示し得る。したがって、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」は、「免疫応答を増強する（または増強すること）」を含む。
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導または増強することによる疾患または状態の治療に関する。「免疫療法」という用語は、抗原免疫化または抗原ワクチン接種および免疫刺激を含む。
「免疫化」または「ワクチン接種」という用語は、例えば治療上または予防上の理由により、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与するプロセスを表す。
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって産生される食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物によって活性化されるマクロファージは、外来病原体をマクロファージ内に非特異的に貪食し、病原体の分解をもたらす加水分解および酸化攻撃によって死滅させる。分解されたタンパク質由来のペプチドはマクロファージ細胞表面に提示され、そこでＴ細胞によって認識され得、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用して、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化ならびに免疫応答のさらなる刺激をもたらすことができる。マクロファージは抗原提示細胞のクラスに属する。一実施形態では、マクロファージは脾臓マクロファージである。
「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞の別のサブタイプを指す。一実施形態では、樹状細胞は、造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初に未成熟な樹状細胞に変化する。これらの未成熟細胞は、高い食作用活性と低いＴ細胞活性化能とを特徴とする。未成熟な樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体について周囲環境を絶えずサンプリングする。それらは、提示可能な抗原と接触すると、活性化されて成熟樹状細胞となり、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小さな断片に分解し、成熟すると、ＭＨＣ分子を使用してそれらの断片を細胞表面に提示する。同時に、それらは、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化における共受容体として機能する細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を大幅に増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓に、またはリンパ系を通ってリンパ節に移動するように誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７を上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として働き、非抗原特異的共刺激シグナルと共に、抗原を提示することによってヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。したがって、樹状細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞に関連する免疫応答を積極的に誘導することができる。一実施形態では、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、その細胞表面上に（またはその細胞表面で）少なくとも１つの抗原または抗原断片を表示、獲得、および／または提示することができる様々な細胞の１つである。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞とに区別することができる。
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現しないが、インターフェロンγなどの特定のサイトカインによる刺激を受けると発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞としては、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞が挙げられる。
「抗原プロセシング」は、抗原の、前記抗原の断片であるプロセシング産物への分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）、および抗原提示細胞などの細胞による特異的Ｔ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
「抗原が関与する疾患」という用語は、抗原に関係する任意の疾患、例えば抗原の存在を特徴とする疾患を指す。抗原が関与する疾患は癌であり得る。上述のように、抗原は、腫瘍抗原などの疾患関連抗原であり得る。一実施形態では、抗原が関与する疾患は、抗原を発現する細胞が関与する疾患である。
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする個体における生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例としては、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が挙げられる。
本開示による「癌」という用語は、癌転移も含む。
本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認として意図されていない。これらの文書の内容に関する全ての記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。特定の装置、技術および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な変更は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書に記載され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。
実施例１．リボサイトカインＲＮＡ脂質ナノ粒子およびＲＮＡワクチンの調製
リボサイトカインｍＲＮＡを、ヌクレオシドウリジンをＮ１－メチルプソイドウリジンで置換して、Ｋｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｍｍｕｎｏｌ．ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６，１５７７－８７（２００７））に基づくインビトロ転写によって作製した。得られたｍＲＮＡはキャップ１構造を備えており、二本鎖（ｄｓＲＮＡ）分子をセルロース精製によって枯渇させた（Ｂａｉｅｒｓｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１９））。精製したｍＲＮＡをＨ２Ｏで溶出し、さらに使用するまで－８０°Ｃで保存した。記載されている全てのｍＲＮＡ構築物のインビトロ転写は、ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＲＮＡ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＧｍｂＨで実施された。修飾ＲＮＡを、ｉ．ｖ．投与後の肝臓へのＲＮＡの選択的送達を媒介する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に封入した。ワクチン接種のためのＲＮＡを、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップを使用してＫｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｌｍｍｕｎｏｌ．ｌｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６，１５７７－８７（２００７））に基づいて作製した。Ｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１６）に基づいてＲＮＡ－ＬＰＸ製剤化を行った。
実施例２．ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８の投与はマウスにおいて毒性をもたらすが、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２の投与は毒性をもたらさない
本発明者らは、２つの合理的な組合せパートナーである、ＩＬ－７をコードするリボサイトカイン（ｈＩＬ７－ｈＡｌｂ）および抗原をコードするＴ細胞ワクチン（ＲＮＡ－リポプレックス（ＲＮＡ－ＬＰＸ））を用いてｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８投与の潜在的な有害作用を評価することを目指した。この目的のために、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを、５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸ、３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８、および３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂ（ｎ＝７）；３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８および３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂ（ｎ＝７）；５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸおよび３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８（ｎ＝７）；または５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸ、３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２および３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂ（ｎ＝７）の三重の組合せのいずれかでｉ．ｖ．処置した。ＮａＣｌ処置動物を陰性対照とした（ｎ＝７）。
実験でモニターしたパラメータには、体重ならびにＡＬＡＴ、ＡＳＡＴおよびＬＤＨの活性が含まれた。処置後２日目および３日目に動物の体重を記録した。体重変化を、各動物の現在の体重対処置前（０日目）の体重の比として計算した。全ての酵素を、肝臓および組織の損傷の代用として３日目に分析した。酵素レベルの分析のために、標準的な手順に従って顔面静脈から血液試料を採取した。血清分離管に血液を採取した後、遠心分離前に試料を約３０分間凝固させた。遠心分離直後に血清を凍結し、保存した。測定の前に、血清を周囲温度で解凍し、水で希釈し、酵素活性を、Ｉｎｄｉｋｏ（商標）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造業者のプロトコルに従って決定した。
ｈＩＬ７－ｈＡｌｂおよびＲＮＡ－ＬＰＸワクチン接種と組み合わせた３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８によるマウスの投与は、処置後３日以内に１０％を超える有意な体重減少をもたらしたが、３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２では体重減少をもたらさなかった（図１Ａ）。ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８をｈＩＬ７－ｈＡｌｂまたはＲＮＡ－ＬＰＸのみと一緒に投与した群でわずかに少ない体重減少が観察され、両方の組合せパートナーが全体的な毒性に寄与することが示された。同様に、肝酵素ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、およびＬＤＨの活性の有意な増加は、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８を投与した群でのみ検出され、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２では検出されなかった（図１Ｂ）。
実施例３．ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８は、最初の処置後にのみＮＫ細胞の一時的な増加を誘発する
実施例１に記載される望ましくない効果の潜在的なメディエータの１つはＮＫ細胞であると仮定された。活性化ＮＫ細胞は、ＩＬ１５スーパーアゴニストによって誘導される免疫毒性の原因となる大量のＩＦＮγを分泌することが示された（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５）。この目的のために、本発明者らは、ＣＴ２６結腸癌を担持するマウスにおけるＮＫ細胞動態を検討した。ｈｌＬ７－ｈＡｌｂ、ｈＡｌｂ－ｈｌＬ２、ならびにｈＡｌｂ－ｈｌＬ２＿Ａ４ｓ８を、ＣＴ２６腫瘍特異的抗原ｇｐ７０に対するＲＮＡ－ＬＰＸワクチン接種と一緒に評価した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０日目に５×１０５個のＣＴ２６結腸癌細胞を皮下（ｓ．ｃ．）接種した。１０日後、マウスを、腫瘍体積に従ってそれぞれ１１匹のマウスからなる４つの処置群に層別化した。処置は、１０、１７、２４および３１日目に、ｉ．ｖ．投与したリボサイトカイン（ｈＡｌｂ－ｈｌＬ２、ＩＬ７－ｈＡｌｂまたはｈＡｌｂ－ｈｌＬ２＿Ａ４ｓ８；それぞれ３μｇ）および同時に２０μｇのｇｐ７０ ＲＮＡ－ＬＰＸワクチンの週１回で合計４回の注射からなった。対照群には、６μｇのｈＡｌｂをコードするＲＮＡを投与した。
処置した動物の血液中のＣＤ４９ｂ＋ＣＤ１９－ＣＤ４－ＣＤ８－ＮＫ細胞の数を、１７、２４および３１日目にフローサイトメトリによって分析した。手短に述べると、５０μＬの血液を滴定量の抗体で染色し、その後、ＢＤ溶解溶液を用いて赤血球を溶解した。細胞をＰＢＳで洗浄し、再懸濁し、Ｔｒｕｃｏｕｎｔチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移した。ＢＤ ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（商標）フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．３およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．４で分析した。
ｈＡｌｂ－ｈｌＬ２＿Ａ４ｓ８処置は、最初の投与の１週間後にＮＫ細胞の一時的な２．８倍の増加をもたらした（図２Ａ）。数は最初の処置後１４日以内に正常化し、１７および２４日目のその後のｈＡｌｂ－ｈｌＬ２＿Ａ４ｓ８投与によって上昇しなかった。ｈＡｌｂ－ｈｌＬ２注射もＩＬ７－ｈＡｌｂ注射も、顕著なＮＫ細胞拡大をもたらさなかった。
ＮＫ細胞拡大に対するＲＮＡワクチンの潜在的な寄与に対処するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに５×１０５個のＣＴ２６結腸癌細胞を０日目にｓ．ｃ．接種した。１０日後、マウスを腫瘍体積に従ってそれぞれ１１匹のマウスからなる４つの処置群に層別化し、２０μｇのｇｐ７０ ＲＮＡ－ＬＰＸ、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８をコードする３μｇのＬＮＰ製剤化ＲＮＡ、または両方の組合せでｉ．ｖ．処置した。対照群には、ＲＮＡ－ＬＰＸ（いかなる抗原もコードしない）＋３μｇのＬＮＰ製剤化ｈＡｌｂコードＲＮＡを投与した。上記のように末梢血中のＮＫ細胞数を評価した。
ｇｐ７０－ＲＮＡ－ＬＰＸワクチン接種にかかわらず、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８処置は、処置の７日後（腫瘍接種後１７日目；図２Ｂ）にＮＫ細胞の有意な２．８倍の増加をもたらした。ｇｐ７０－ＲＮＡ－ＬＰＸ注射単独後に細胞数の変化は観察されなかった。これらの結果は、ＲＮＡ－ＬＰＸワクチンではなく、ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８自体が観察されたＮＫ細胞拡大の原因であることを示唆する。
まとめると、これらの所見は、最初の投与後にＮＫ細胞拡大を駆動するｈＡｌｂ－ｈｌＬ２＿Ａ４ｓ８の能力を強調し、この後に急速な収縮およびその後の処置に対する不応答性が続く。
実施例４．ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８関連毒性はＮＫ細胞に依存する
ＮＫ細胞がｈＡｌｂ－ｈｌＬ２＿Ａ４ｓ８処置マウスで観察された毒性を説明するかどうかを決定するために（実施例１）、本発明者らは、処置開始の１日前に２０μＬの抗アシアロＧＭ１抗体を腹腔内投与することによるＮＫ細胞枯渇を伴ってまたは伴わずに、０、７、１４および２１日目に３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８、３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂおよびＲＮＡ－ＬＰＸで処置したマウスにおける体重動態および血清肝酵素活性を比較した（ｎ＝７／群）。
処置開始前のＮＫ細胞枯渇は、体重減少を予防し（図３Ａ）、初回投与後にＮＫ細胞枯渇抗体を投与されなかった群で観察された肝酵素活性の上昇を妨げた（３日目；図３Ｂ）。
これらのデータは、ＮＫ細胞をｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８処置の毒性作用に直接結び付ける。
実施例５．低用量ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８の前処置は処置忍容性を高める
ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８処置の毒性副作用は、ＮＫ細胞の一時的な拡大に依存することが示された（実施例４）。重要なことに、ＮＫ細胞は、最初のｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８注射後にのみ拡大することができ、その後は抵抗性のままであった（実施例３）。これらの所見に基づいて、本発明者らは、ＮＫ細胞活性化がより低い、より毒性の少ない用量で実現可能であり、初期低用量のｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８がその後の高用量の忍容性を改善すると仮定した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７／群）を、ＮａＣｌ（対照）；０日目に５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸワクチン、３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８および３μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂ（３μｇ）、または０、７、１４および２１日目に５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸワクチン、０．５μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８および０．５μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂ（０．５μｇ）のいずれかでｉ．ｖ．処置した。３μｇまたは０．５μｇのサイトカイン用量の処置忍容性を、０日目に５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸ、０．５μｇのｈＩＬ７－ｈＡｌｂおよび０．５μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８による前処置を受け、７、１４および２１日目に５μｇのＲＮＡ－ＬＰＸおよび３μｇの各サイトカインで処置された群（０．５／３μｇ）と比較した。体重ならびに血清中の肝酵素活性を、実施例２に記載されるように決定した。
本発明者らは、初期低用量前処置が、その後の高サイトカイン用量（０．５／３μｇ群）の体重減少（図４Ａ）ならびに血清中の肝酵素活性の上昇（図４Ｂ）を軽減したことを見出した。高用量リボサイトカインで直接処置した動物（３μｇ群）は、処置開始から最初の３日以内に１４％を超える体重減少ならびに肝酵素活性の有意な上昇を示した。比較すると、０．５μｇのサイトカインのみを投与されたマウス（０．５μｇ群）では、対照動物と同様の体重増加が観察された。同様に、０．５μｇのサイトカインの１回の投与後または４回の投与後の肝酵素は、対照動物の範囲内にとどまった。
これらのデータは、動物がその後より高いリボサイトカイン用量を受けたか、または低用量リボサイトカインレジメンで維持されたかにかかわらず、最初の低用量リボサイトカインを受けた動物における堅固な処置忍容性を強調する。
実施例６．低用量前処置は、３週間の投与レジメンでさえもｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８の忍容性を高める
これまでに示した全ての実験は、週１回のリボサイトカイン投与を評価した。しかし、臨床現場では、リボサイトカインは３週間ごとなどのより緩和された頻度で投与される可能性が高い。理論的には、個々の処置間の時間の増加は、反復的なＮＫ細胞拡大および関連する毒性を可能にし得る。したがって、本発明者らは、前処置レジメンが、３週間ごとに緩和されるように投与された場合でもｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８の忍容性を高めるかどうかを試験した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、０、７および１４日目（週１回）、０および２１日目（３週間ごと）、または２１日目のみ（３週間目のみ）のいずれかに３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８を投与した。前処置レジメンは、０日目に１．５μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８用量、続いて２１日目に３μｇのｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８用量（３週間ごとに用量漸増）からなった。ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、実施例３に記載されるように、０、７、１４、２１、２８および３５日目に採取した血液試料においてフローサイトメトリによって決定した。ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８処置の忍容性を評価するために、各ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８注射後３日間連続して動物の体重を評価した。
ＮＫ細胞頻度は、最初のｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８注射の７日後（７日目）に、処置マウスの全ての群において３倍を超えて増加した（図５Ａ）。１４日目までに、ＮＫ細胞頻度は、処置スケジュールにかかわらず、ベースラインレベルに低下し、抵抗性のままであった。ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度もまた、最初のｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８投与の７日後に有意に増加し、全ての処置群において同様の値に達した（図５Ｂ）。３週間のスケジュールでは、これに続いて、１４日目までにベースラインレベルまで収縮し、その後２回目の投与時に同様の拡大動態を示した。これらのデータは、３週間の間隔の後、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、最初のリボサイトカイン注射時と同じ増殖能を依然として有し、ＮＫ細胞とは異なって、反復ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８処置に抵抗性ではないようであることを示した。
ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８での処置は、初期処置後３日以内に５％（１．５μｇ）から最大９％（３μｇ）までの用量依存的体重減少をもたらした（図６Ａ）。その後の週１回の処置は忍容性が高かった（図６Ｂ、Ｃ）。ＮＫ細胞拡大プロファイルから予想されるように（図５Ａ）、２１日目以降の毒性は、この時点で最初の３μｇ用量のｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８を投与されたマウスでのみ観察されたが、３週間前に１．５μｇで前処置されていたマウスでは観察されなかった（図６Ｄ、Ｅ）。
要約すると、本開示において、本発明者らは、ＮＫ細胞の拡大をもたらす任意の種類の免疫療法のための、潜在的な臨床的関連性のある忍容性の高いリボサイトカイン治療レジメンを同定した（例えばＩＬ－１５およびその変異体、ならびにＩ型インターフェロン誘導物質）。これらの治療スケジュールは、癌患者の緊急の医学的必要性を満たすことができる安全かつ有効な免疫療法の臨床開発のための重要なプラットフォームを提供する。

Claims (48)

  1. 対象において、サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡに対する望ましくない応答もしくは反応、またはその両方を低減する方法であって、
    前記ＲＮＡの第１の用量；
    前記ＲＮＡの第２の用量；
    を対象に投与する工程を含み、ならびに
    前記第１および第２の用量の投与量および投与期間が、前記対象において望ましくない応答または反応のレベルが低下するように選択される、方法。
  2. 前記第１の用量で投与される前記ＲＮＡの量が、前記第２の用量で投与される前記ＲＮＡの量の８０％、７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％以下である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１の用量で投与される前記ＲＮＡの量が、体重１ｋｇ当たり２００μｇ、１５０μｇ、１００μｇ、９０μｇ、８０μｇ、７０μｇ、６０μｇ、５０μｇ、４０μｇ、３０μｇ、２０μｇ、１０μｇ、５μｇ、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、０．５μｇ、０．４μｇ、０．３μｇ、０．２μｇ、または０．１μｇ以下であり、前記第２の用量が前記第１の用量よりも多い、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記第２の用量で投与される前記ＲＮＡの量が、体重１ｋｇ当たり２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、または４００μｇよりも多く、前記第２の用量が前記第１の用量よりも多い、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. １、２、３、４、５、６、７、１４、または２１日を超える日数により、前記第１の用量の投与の完了と前記第２の用量の投与の開始とが分けられる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ５６、４９、４２、３５、または２８日以下の日数により、前記第１の用量の投与の完了と前記第２の用量の投与の開始とが分けられる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡの１つ以上のさらなる用量を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記第１および第２の用量が、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、皮内または筋肉内注射または注入によって投与される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記第１および第２の用量が静脈内投与される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記望ましくない応答または反応がＮＫ細胞を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記望ましくない応答または反応が、ＮＫ細胞数の増加、発熱、倦怠感、体重の減少、肝酵素の活性の上昇、毛細血管漏出症候群、低血圧および浮腫からなる群より選択される１つ以上を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記肝酵素が、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）からなる群より選択される１つ以上を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記望ましくない応答または反応が、前記第１の用量を投与せずに前記第２の用量を投与した後に起こる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記第１の用量、前記第２の用量、またはその両方の投与後に、前記対象を望ましくない応答または反応の存在について評価する工程をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 検出可能な望ましくない応答または反応を引き起こさない、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 望ましくない応答または反応の減少をもたらす、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ワクチンを前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ワクチンを前記対象に投与する工程が、１つ以上の抗原エピトープをコードするＲＮＡを前記対象に投与する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記エピトープがＴ細胞エピトープである、請求項１８に記載の方法。
  20. サイトカインタンパク質を含む前記アミノ酸配列が延長薬物動態（ＰＫ）ポリペプチドを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記延長ＰＫポリペプチドが融合タンパク質を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記融合タンパク質が、薬物動態修飾基に融合したサイトカインタンパク質を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記薬物動態修飾基が、アルブミン、その機能的変異体、または前記アルブミンもしくはその機能的変異体の機能的断片を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記薬物動態修飾基が、ヒトアルブミン、その機能的変異体、または前記ヒトアルブミンもしくはその機能的変異体の機能的断片を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記薬物動態修飾基が、前記サイトカインタンパク質のＮ末端に融合される、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. サイトカインタンパク質を含む前記アミノ酸配列が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、Ｎ－薬物動態修飾基－ＧＳリンカー－サイトカインタンパク質－Ｃを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記サイトカインタンパク質がＩＬ２変異体を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ＩＬ２変異体がヒトＩＬ２変異体である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ヒトＩＬ２変異体が、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体の置換変異体を含む、請求項２８に記載の方法。
  30. １つ以上の前記置換が、βγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒβγ）に対する親和性を増強する、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ヒトＩＬ２またはその機能的変異体が、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた少なくとも８０位（ロイシン）、８１位（アルギニン）、８５位（ロイシン）および９２位（イソロイシン）で置換されている、請求項２９または３０に記載の方法。
  32. 野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた８０位（ロイシン）がフェニルアラニンで置換され、８１位（アルギニン）がグルタミン酸で置換され、８５位（ロイシン）がバリンで置換され、９２位（イソロイシン）がフェニルアラニンで置換されている、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ヒトＩＬ２またはその機能的変異体が、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた７４位（グルタミン）でさらに置換されている、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた７４位（グルタミン）がヒスチジンで置換されている、請求項３３に記載の方法。
  35. １つ以上の前記置換が、αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のαサブユニットに対する親和性を低下させる、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記αβγ ＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒαβγ）のαサブユニットに対する親和性を低下させる１つ以上の前記置換が、ＩＬ２Ｒαβγに対する親和性をＩＬ２Ｒβγに対する親和性よりも大きく低下させる、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ヒトＩＬ２またはその機能的変異体が、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた少なくとも４３位（リジン）および６１位（グルタミン酸）で置換されている、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. ４３位（リジン）がグルタミン酸で置換され、６１位（グルタミン酸）がリジンで置換されている、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＩＬ２変異体が、野生型ヒトＩＬ２と比較して制御性Ｔ細胞を刺激する能力が低下している、請求項２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記ＩＬ２変異体が、野生型ヒトＩＬ２と比較してエフェクタＴ細胞を刺激する能力が増加している、請求項２７～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記サイトカインタンパク質が、ヒトＩＬ２またはヒトＩＬ２の機能的変異体のムテインを含み、前記ヒトＩＬ２またはその機能的変異体が、野生型ヒトＩＬ２と比較して、野生型ヒトＩＬ２に従って番号付けされた少なくとも４３位（リジン）でグルタミン酸によって、６１位（グルタミン酸）でリジンによって、７４位（グルタミン）でヒスチジンによって、８０位（ロイシン）でフェニルアラニンによって、８１位（アルギニン）でグルタミン酸によって、８５位（ロイシン）でバリンによって、および９２位（イソロイシン）でフェニルアラニンによって置換されている、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. ヒトＩＬ２が、配列番号１に従うアミノ酸配列を有する、請求項２８～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. サイトカインタンパク質を含む前記アミノ酸配列が、配列番号６に従うアミノ酸配列（ｈＡｌｂ－ｈＩＬ２＿Ａ４ｓ８）を含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記対象がヒトである、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードする第１の用量のＲＮＡ；および
    サイトカインタンパク質を含むアミノ酸配列をコードする第２の用量のＲＮＡ；
    を含むキットであって、
    前記第１および第２の用量の投与量が、前記第１および第２の用量を対象に投与すると、前記対象において望ましくない応答または反応のレベルが低下するように選択される、キット。
  46. 前記第１の用量の前記ＲＮＡおよび／または前記第２の用量の前記ＲＮＡの組成および／または量が、前記請求項のいずれか一項で定義された通りである、請求項４５に記載のキット。
  47. 前記第１の用量の前記ＲＮＡと前記第２の用量の前記ＲＮＡとが別々のバイアル中に存在する、請求項４５または４６に記載のキット。
  48. 請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法において前記ＲＮＡを使用するための説明書を含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載のキット。
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