JP7115856B2 - 抗pvrig抗体及び使用方法 - Google Patents
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- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
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- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/74—Inducing cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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-
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Landscapes
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Description
本出願は、米国特許法第119条の下で、2015年2月19日出願のUSSN 62
/118,208、及び2015年3月31日出願のUSSN 62/141,120、
及び2015年10月1日出願のUSSN 62/235,823に対する優先権を主張
するものであり、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込
まれる。
)からの2つの独立したシグナルを受容しなければならない。第1のシグナル1は、抗原
特異的であり、T細胞抗原受容体がAPC上の適切な抗原-MHC複合体に出会うと生じ
る。免疫応答の運命は、そのAPCで発現されるリガンドを結合するT細胞共刺激分子を
介して送達される、第2の抗原非依存性シグナル(シグナル2)によって決定付けられる
。この第2のシグナルは、刺激性(正の共刺激)または抑制性(負の共刺激または共抑制
)のいずれかであり得る。共刺激シグナルの不在下、または共抑制シグナルの存在下では
、T細胞活性化は損なわれるかまたは中断され、これが抗原特異的不応答性(T細胞アネ
ルギーとして知られる)状態につながり得るか、またはT細胞アポトーシス死をもたらし
得る。
らの同種の受容体からなる。共刺激分子のリガンド/受容体ペアの原型は、B7/CD2
8及びCD40/CD40Lである。B7ファミリーは、免疫応答への刺激性または抑制
性入力を提供し得る、構造的に関連する細胞表面タンパク質リガンドからなる。B7ファ
ミリーのメンバーは、構造的に関連しており、このうち細胞外ドメインが、少なくとも1
つの可変または定常免疫グロブリンドメインを含有する。
な役割を果たし、これらのシグナルを媒介する分子は、免疫調節の有効な標的であること
が判明している。この知識に基づいて、共刺激分子を標的とすることを伴ういくつかの治
療的アプローチが開発されてきており、癌の予防及び治療において、癌患者における免疫
応答をオンにすること、または免疫応答がオフになるのを予防することによって有用であ
ること、また、自己免疫疾患及び炎症性疾患の予防及び治療、ならびに同種移植拒絶に対
しても、それぞれ、これらの病的状態を有する対象における無制御な免疫応答をオフにす
ることによって、または負の共刺激(または共抑制)による「オフシグナル」の誘導によ
って、有用であることが示された。
移植片拒絶の治療において有望性を示してきた。治療的戦略には、共刺激ペアのリガンド
もしくは受容体に対するモノクローナル抗体を用いた、またはその適切なリガンドに結合
しそれを遮断し得る共刺激受容体から構成される可溶性融合タンパク質を用いた、共刺激
の妨害が含まれる。別のアプローチは、抑制リガンドの可溶性融合タンパク質を用いた共
抑制の誘導である。これらのアプローチは、共刺激(これは細胞生存遺伝子を誘導する)
の不在下でT細胞がアポトーシス誘導の影響を高度に受けやすくなることを恐らくは理由
とする、自己反応性または同種反応性T細胞(これは、それぞれ自己免疫疾患または移植
における病的過程に関与する)の最終的な消失に少なくとも部分的に依存する。故に、病
原体から防御する免疫系の能力を損なうことなく共刺激シグナルを調節することが可能で
ある新規の薬剤が、かかる病的状態の治療及び予防に高度に有利である。
-CD28及びTNFファミリーにおける共刺激因子の抑制を通してT細胞活性化を妨げ
ることによって、ならびに調節T細胞を誘引することで抗腫瘍T細胞応答を抑制すること
によって、免疫による破壊を回避することが示されてきた(Wang(2006), “
Immune Suppression by Tumor Specific CD4
+Regulatory T cells in Cancer”, Semin.Ca
ncer.Biol.16:73-79、Greenwald, et al.(200
5), “The B7 Family Revisited”, Ann.Rev.I
mmunol.23:515-48、Watts(2005), “TNF/TNFR
Family Members in Co-stimulation of T Ce
ll Responses”, Ann.Rev.Immunol.23:23-68、
Sadum, et al.,(2007)“Immune Signatures o
f Murine and Human Cancers Reveal Unique
Mechanisms of Tumor Escape and New Targ
ets for Cancer Immunotherapy”, Clin.Canc
.Res.13(13):4016-4025を参照されたい)。かかる腫瘍で発現され
る共刺激分子は、魅力的な癌バイオマーカーとなってきており、腫瘍関連抗原(TAA)
としての役目を果たし得る。更に、共刺激経路が、腫瘍転移においてT細胞依存性免疫応
答を開始及びエフェクター機能の両方のレベルで減弱する、免疫チェックポイントとして
特定されてきた。操作された癌ワクチンが改善され続けるにつれて、かかる免疫チェック
ポイントが、治療的な抗腫瘍応答を誘導するワクチンの能力に対する主要な障壁であるこ
とが明白になりつつある。この点において、共刺激分子は、免疫寛容を阻止し、免疫系を
刺激するための戦略を提供する、能動的(ワクチン接種)及び受動的(抗体媒介性)癌免
疫療法のための免疫賦活剤としての役目を果たすことができる。
物質が、自己免疫疾患、移植片拒絶、アレルギー、及び癌の治療のために開発されてきた
。例えば、CTLA4-Ig(Abatacept、Orencia(登録商標))はR
Aの治療のために、突然変異CTLA4-Ig(Belatacept、Nulojix
(登録商標))は急性腎臓移植拒絶の予防のために認可され、抗CTLA4抗体(Ipi
limumab、Yervoy(登録商標))においては、黒色腫の治療のために最近認
可されている。Merck(Keytruda(登録商標))及びBMS(Opdivo
(登録商標))の抗PD-1抗体等の、他の共刺激調節因子が認可されてきており、癌治
療のために認可されてきており、また、ウイルス感染に対しても試験段階にある。
IG抗体を患者に投与することを含み、患者のCTLのサブセットが活性化される、方法
を提供することが、本発明の目的である。
含み、患者のNK細胞のサブセットが活性化される、方法を提供することが、本発明の更
なる目的である。
を含み、患者のγδT細胞のサブセットが活性化される、方法を提供することが、本発明
の追加の目的である。
を含み、患者のTh1細胞のサブセットが活性化される、方法を提供することが、本発明
の更なる目的である。
用を阻害する方法であって、抗PVRIG抗体を患者に投与することを含む、方法を提供
することが、本発明の追加の目的である。
み、該癌が治療される、方法を提供することが、本発明の更なる目的である。
.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA
.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA
.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA
.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA
.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA
.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA
.7.049、及びCPA.7.050からなる群から選択される抗体由来のvhCDR
1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2及びvlCDR3配列を
含む、方法を提供することが、本発明の追加の目的である。
001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.
008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.
012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.
017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.
022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.
034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.
047、CPA.7.049、及びCPA.7.050からなる群から選択される抗体由
来のvhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2及びvl
CDR3配列を含む抗体と競合する、方法を提供することが、本発明の追加の目的である
。
.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA
.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA
.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA
.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA
.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA
.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA
.7.049、及びCPA.7.050からなる群から選択される、方法を提供すること
が、本発明の更なる目的である。
001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.
008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.
012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.
017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.
022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.
034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.
047、CPA.7.049、及びCPA.7.050からなる群から選択される抗体と
競合する、方法を提供することが、本発明の追加の目的である。
.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA
.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA
.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524
、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530
、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538
.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7
.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7
.549、CHA.7.550、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7
.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7
.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7
.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7
.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7
.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7
.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049、及びCPA
.7.050からなる群から選択される抗体由来のvhCDR1、vhCDR2、vhC
DR3、vlCDR1、vlCDR2及びvlCDR3配列を含む、方法を提供すること
が、本発明の更なる目的である。
A.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CH
A.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、
CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.52
6、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.53
4、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.
538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.
7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.
7.550、CPA.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.
7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.
7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.
7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.
7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.
7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.
7.046、CPA.7.047、CPA.7.049、及びCPA.7.050からな
る群から選択される抗体由来のvhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR
1、vlCDR2及びvlCDR3配列を含む、抗PVRIG抗体からなる群から選択さ
れる抗体と競合する、上記に概説される方法を提供することが、本発明の追加の目的であ
る。
と、b)癌の存在の指標としての組織におけるPVRIGの過剰発現の存在を決定するこ
とと、を含む、方法を提供することが、本発明の更なる目的である。抗PVRIG抗体は
、本明細書に記載され、上記に概説される通りであり得る。
、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011
、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015
、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021
、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033
、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046
、CPA.7.047、CPA.7.049、及びCPA.7.050からなる群から選
択される抗体由来のvhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlC
DR2及びvlCDR3配列を含む抗PVRIG抗体である抗体を含む、抗原結合ドメイ
ンを提供することが、本発明の追加の目的である。
、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011
、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015
、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021
、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033
、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046
、CPA.7.047、CPA.7.049、及びCPA.7.050からなる群から選
択される抗PVRIG抗体である、抗PVRIG抗原結合ドメイン(抗体を含む)組成物
を提供することが、本発明の更なる目的である。
-1、h524-2、h524-3、h524-4、h530-1、h530-2、h5
30-3、h530-4、h530-5、h538.1-1、h538.1-2、h53
8.1-3、h538.1-4、h538.2-1、h538.2-2、及びh538.
2-3(図90に図示される)からなる群から選択される抗PVRIG抗体である、抗P
VRIG抗原結合ドメイン(抗体を含む)組成物を提供することが、本発明の更なる目的
である。
、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516
、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7
.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7
.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7
.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、C
HA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、C
HA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CPA.7.001、C
PA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、C
PA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、C
PA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、C
PA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、C
PA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、C
PA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、C
PA.7.049、及びCPA.7.050からなる群から選択される抗体由来のvhC
DR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2及びvlCDR3配
列を含む抗PVRIG抗体である抗体を含む、抗原結合ドメインを提供することが、本発
明の追加の目的である。
をコードする第1の核酸と、b)抗体由来のvlCDR1、vlCDR2及びvlCDR
3を含む軽鎖可変ドメインをコードする第2の核酸とを含む、核酸組成物を提供すること
が、本発明の更なる目的である。抗体は、CPA.7.001、CPA.7.003、C
PA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.009、C
PA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.013、C
PA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.018、C
PA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.023、C
PA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.036、C
PA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.049、C
PA.7.050、CHA.7.502、CHA.7.503、CHA.7.506、C
HA.7.508、CHA.7.510、CHA.7.512、CHA.7.514、C
HA.7.516、CHA.7.518、CHA.7.520.1、CHA.7.520
.2、CHA.7.522、CHA.7.524、CHA.7.526、CHA.7.5
27、CHA.7.528、CHA.7.530、CHA.7.534、CHA.7.5
35、CHA.7.537、CHA.7.538.1、CHA.7.538.2、CHA
.7.543、CHA.7.544、CHA.7.545、CHA.7.546、CHA
.7.547、CHA.7.548、CHA.7.549、CHA.7.550、CPA
.7.001、CPA.7.003、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA
.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA
.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA
.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA
.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA
.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA
.7.047、CPA.7.049、及びCPA.7.050からなる群から選択される
。
ることが、本発明の追加の目的である。
含む宿主細胞を提供することが、本発明の更なる目的である。
することと、b)該抗体を回収することとを含む、抗PVRIG抗体を作製する方法を提
供することが、本発明の追加の目的である。
癌は、患者が癌性細胞を認識し排除する能力を持たないものと見なすことができる。多
くの場合、これらの転換した(例えば、癌性)細胞は、免疫監視に反作用する。体内での
T細胞活性化を制限して無制限なT細胞活性を予防する天然の制御機序が存在し、これを
、癌性細胞が免疫応答を回避または抑制するために利用し得る。免疫エフェクター細胞、
特にT細胞が癌を認識し排除する能力を回復させることが、免疫療法の目的である。「免
疫療法」と称されることがある免疫腫瘍学の分野は、急速に進化しており、Yervoy
、Keytruda、及びOpdivo等のT細胞チェックポイント阻害抗体が、いくつ
かの最近認可されたものである。これらの抗体は、それらがT細胞性免疫の通常は負の調
節因子を妨害するため、一般に「チェックポイント阻害剤」と称される。共刺激性及び共
抑制性両方の種々の免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を統合する
ことができると一般に理解されている。一般的に、これらの抗体は、通常の状況下では細
胞傷害性T細胞(CTL)の活性化を予防または抑制する、CTLA-4及びPD-1等
のチェックポイント阻害剤タンパク質に結合する。チェックポイントタンパク質を阻害す
ることにより、例えば、これらのタンパク質を結合する抗体の使用を介して、腫瘍に対す
る増加したT細胞応答を達成することができる。つまり、これらの癌チェックポイントタ
ンパク質は免疫応答を抑制し、タンパク質が、例えばチェックポイントタンパク質に対す
る抗体を使用して妨害されるとき、免疫系が活性化されることで免疫刺激につながり、そ
の結果、癌及び感染性疾患等の状態の治療をもたらす。
ルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有タンパク質または「PVRIG」に対する抗
体の使用を対象とする。PVRIGは、NK及びT細胞の細胞表面上で発現され、他の既
知の免疫チェックポイントといくつかの類似点を共有する。
ムを解析した。細胞表面タンパク質であり、Igドメインを有し、腫瘍微小環境内の免疫
細胞上、具体的には、受容体であると推測される腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)上で発現
されることが予期される遺伝子を特定した。単一IgVドメインを有し、細胞内ITIM
様モチーフを有するタンパク質を特定し、これらは、免疫チェックポイントとして作用し
、T細胞及び/またはNK細胞に対する抑制効果を有することを示唆する。計算的に特定
した後、PVRIGがリンパ球上及び腫瘍微小環境内のリンパ球上で発現され、NK及び
T細胞に対して抑制効果を有することを実証する発現研究(ノックダウン実験及びPVR
IGに向けられた抗体の両方によって実証)を含む、種々の検証実験を行った。PVRL
2を、PVRIGの対応物であると特定/確認した。PVRIGと結合する抗体を生成し
た後、PVRIGとの結合と、PVRIG及びPVLR2の相互作用の妨害との両方を行
うこれらのサブセットを特定した。
及びT細胞の標的細胞に対する免疫応答を減弱させるように作用する(即ち、PD-1/
PDL1に類似した)抑制シグナルが励起される。PVRL2のPVRIGへの結合の妨
害により、PVRIGのこの抑制シグナルが遮断され、その結果、NK及びT細胞の免疫
応答が調節される。PVRL2との結合を妨害するPVRIGに対する抗体の利用は、N
K及びT細胞による癌細胞の殺傷を増強し得る治療的アプローチである。PVRIGに結
合し、そのリガンドであるPVRL2の結合を妨害する妨害抗体を生成した。
質であるPD-1の発現と正相関した。加えて、PVRIGの導入(細胞外ドメイン(E
CD)融合タンパク質として)によりT細胞の活性化が阻害されることが示されたため、
抗PVRIG抗体の使用はT細胞活性化につながる。したがって、抗PVRIG抗体を使
用して、癌等のT細胞またはNK細胞活性化が所望される状態を治療することができる。
る変化を測定することによって、インビトロで(また、以下でより十分に説明するように
、いくつかの場合にはインビボで)評価することができる:増殖、サイトカイン放出、及
び細胞表面マーカー。NK細胞については、細胞増殖、細胞傷害性(CD107a、グラ
ンザイム、及びパーフォリン発現の増加によって、または標的細胞の殺傷を直接測定する
ことによって測定した、標的細胞を殺傷する能力)、サイトカイン産生(例えば、IFN
-γ及びTNF)、及び細胞表面受容体発現(例えば、CD25)の増加は、免疫調節、
例えば、癌細胞の増強された殺傷を示す。T細胞については、増殖の増加、活性化の細胞
表面マーカーの発現(例えば、CD25、CD69、CD137、及びPD1)の増加、
細胞傷害性(標的細胞を殺傷する能力)、及びサイトカイン産生(例えば、IL-2、I
L-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、IL-17A)は、免疫調節、
例えば、癌細胞の増強された殺傷を示す。
体と、T細胞及び/またはNK細胞を活性化して、癌及び感染性疾患等の疾患、ならびに
増加した免疫活性が治療をもたらす他の状態を治療する方法とを提供する。
本発明は、PVRIGタンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。本文脈における
「タンパク質」は、「ポリペプチド」と互換的に使用され、ペプチドも含む。本発明は、
PVRIGタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。PVRIGは、シグナルペプ
チド(アミノ酸1から40に及ぶ)、細胞外ドメイン(アミノ酸41から171に及ぶ)
、膜貫通ドメイン(アミノ酸172から190に及ぶ)、及び細胞質ドメイン(アミノ酸
191から326に及ぶ)を有する326アミノ酸長の膜貫通ドメインタンパク質である
。完全長ヒトPVRIGタンパク質を図25に示す。開始コドンであり得るメチオニンは
2つあるが、成熟タンパク質は同一である。
」または「PVRIGポリペプチド」という用語は、本明細書に記載の既知のまたは野生
型PVRIGを非限定的に含む、任意のかかるタンパク質、またはその変異体、コンジュ
ゲート、または断片、ならびに任意の天然に存在するスプライス変異体、アミノ酸変異体
またはアイソフォーム、及び特にPVRIGのECD断片を任意選択で含んでもよい。P
VRIGの「可溶性」形態という用語もまた、「可溶性外部ドメイン(ECD)」または
「外部ドメイン」または「細胞外ドメイン(ECD)」、ならびに「PVRIGポリペプ
チドの断片」という用語とも互換的に使用され、これは、以下の任意選択のポリペプチド
のうちの1つ以上を広範囲に指し得る:
疫グロブリン(Ig)ドメインを含む。PVR様Ig折り畳みドメインは、他のB7ファ
ミリーメンバーへの類似性により、機能的対応物結合に関与し得る。細胞外ドメインのP
VR様Ig折り畳みドメインは、ドメイン内システイン残基間に形成される1つのジスル
フィド結合を含み、これは、この折り畳みに典型的であり、構造・機能に重要であり得る
。これらのシステインは、残基22及び93(または94)に位置する。一実施形態では
、PVRIG抗体の試験に使用することができるPVRIG可溶性断片が提供される。
RIG ECD断片はまた、PVRIGタンパク質の機能領域を含むことが当然に予測さ
れる、図67に列挙するポリペプチド配列のうちのいずれか1つを指す。この予測は、I
gタンパク質の複合体(例えば、CTLA4及びCD86の複合体を説明するPDB I
D 1i85)を含む解いた3D構造によるタンパク質複合体のセットの系統的解析に基
づく。各PDBからの各「共同構造(co-structure)」分子間接触残基を収
集し、PVRIGの配列にプロジェクションした。いくつかの接触マップによって支持さ
れた相互作用している残基のクラスターを有するいくつかの領域を特定し、一連のペプチ
ドとして合成したら、これが無傷の完全長タンパク質の構造を模倣し、それによりPVR
IGが免疫及び特異的免疫細胞型に与える影響のうちの1つ以上を調節することが、当然
に予期される。本発明の少なくとも一部の実施形態に従い、図67に列挙するポリペプチ
ド配列によって表されるPVRIG ECD断片は、以下のように位置する(図25のヒ
トPVRIG ECDと比較して、ECDの第1のアミノ酸から計数する):PVRIG
断片Aは46~66位に位置し;PVRIG断片Bは46~79位に位置し;PVRIG
断片Cは63~79位に位置し;PVRIG 断片Dは91~106位に位置し;PVR
IG 断片Eは91~114位に位置し;PVRIG 断片Fは11~25位に位置し;
PVRIG 断片Gは3~24位に位置し;PVRIG 断片Hは18~36位に位置し
;PVRIG 断片Iは29~52位に位置し;PVRIG 断片Jは73~98位に位
置する。
L2による活性化の防止(例えば、最も一般的には、PVRIGとPVLR2との相互作
用を妨害することによって)との両方を行う抗PVRIG抗体(抗原結合断片を含む)は
、T細胞及び/またはNK細胞活性化を増強するために使用され、また癌及び病原体感染
等の疾患の治療に使用される。
したがって、本発明は抗PVRIG抗体を提供する。ポリオウイルス受容体関連免疫グ
ロブリンドメイン含有タンパク質、Q6DKI7またはC7orf15とも称されるPV
RIGは、図25に示すRefSeq受託識別子NP_076975に示されるアミノ酸
及び核酸配列に関係する。本発明の抗体は、以下でより十分に概説するように、PVRI
G細胞外ドメインに特異的である。
を見出す抗体は、以下に記載の、従来の抗体、ならびに抗体誘導体、断片、及び模倣体を
含む、本明細書に記載のいくつかの形式をとることができる。一般に、「抗体」という用
語は、以下でより十分に説明するように、少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む任意
のポリペプチドを含む。抗体は、本明細書に記載のポリクローナル、モノクローナル、異
種、同種、同系、またはそれらの修飾形態であってもよく、モノクローナル抗体が多くの
実施形態において特別に使用を見出す。一部の実施形態では、本発明の抗体は、PVRI
G分子に特異的または実質的に特異的に結合する。「モノクローナル抗体」及び「モノク
ローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原の特定のエピトー
プと免疫反応することができる1種類のみの抗原結合部位を含有する抗体分子の集団を指
し、一方「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相
互作用することができる複数の種類の抗原結合部位を含有する抗体分子の集団を指す。モ
ノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原に対する単一の
結合親和性を示す。
には、2つの同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、1つの「軽」鎖(典型的には、
約25kDaの分子量)と、1つの「重」鎖(典型的には、約50~70kDaの分子量
)を有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖としてクラス分けされる。本発明は
、IgGクラスを対象とし、これは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含
むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。このため、「アイソタイプ
」は、本明細書で使用される場合、それらの定常領域の化学及び抗原特性によって定義さ
れる免疫グロブリンサブクラスのいずれかを意味する。本明細書では「CPA」と称する
例示的な抗体は図38に示すようにIgG1重定常領域に基づくが、本発明の抗PVRI
G抗体は、IgG2、IgG3、及びIgG4配列、またはこれらの組み合わせを使用す
るものを含む。例えば、当該技術分野で既知であるように、異なるIgG アイソタイプ
は、望ましい場合もそうでない場合もある異なるエフェクター機能を有する。したがって
、本発明のCPA抗体は、IgG1定常ドメインを、IgG2、IgG3、またはIgG
4定常ドメインと交換することもでき(図66に図示)、IgG2及びIgG4が、いく
つかの状況において、例えば製造の容易性のために、特別な使用を見出し、あるいは低減
したエフェクター機能が所望の場合には、一部の状況において後者が所望される。
生成したマウス抗体であるため、一般に、これらは、概してフレームワーク領域(重可変
領域及び軽可変領域の各々についてF1~F4)において当該技術分野で既知であるよう
にヒト化した後、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4定常重及び軽ドメ
インにグラフティングする(図66に図示)。ここでも、以下でより十分に説明するよう
に、IgG4が特別な使用を見出す。
び本明細書では一般に称される、抗原認識に主に関与する約100~110以上のアミノ
酸の可変領域を含む。可変領域において、重鎖及び軽鎖のVドメインの各々について3つ
のループが集約されて、抗原結合部位を形成する。ループの各々は、相補性決定領域(本
明細書では「CDR」と称される)を指し、これにおいて、アミノ酸配列における変形が
最も顕著である。「可変」は、可変領域のある特定のセグメントが抗体間で配列において
大きく異なることを指す。可変領域内の可変性は均一に分布していない。その代わり、V
領域は、「超可変領域」と称される極可変性のより短い領域によって分離される15~3
0個のアミノ酸のフレームワーク領域(FR)と称される比較的不変のストレッチで構成
される。
DR2-FR3-CDR3-FR4の順序で配列された3つの超可変領域(「相補性決定
領域」、「CDR」)及び4つのFRで構成される。
R1;「L」は軽鎖を表す)、50~56(LCDR2)、及び89~97(LCDR3
)、ならびに重鎖可変領域においてはおよそ約31~35B(HCDR1;「H」は重鎖
を表す)、50~65(HCDR2)、及び95~102(HCDR3)からのアミノ酸
残基を含み(場合によっては、付番は、当業者には理解されるであろう通り、わずかにシ
フトする;Kabat et al.,SEQUENCES OF PROTEINS
OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5 th Ed.Public
Health Service,National Institutes of H
ealth,Bethesda,Md.(1991))かつ/または超可変ループを形成
する残基(例えば、軽鎖可変領域における残基26~32(LCDR1)、50~52(
LCDR2)、及び91~96(LCDR3)、ならびに重鎖可変領域における26~3
2(HCDR1)、53~55(HCDR2)、及び96-101(HCDR3)を含む
(Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:90
1-917)。本発明の特異的CDRは、以下に記載され、また図40に示される。
Kabatらは、重鎖及び軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程
度に基づき、Kabatらは、個々の一次配列をCDR及びフレームワークに分類し、そ
のリストを作成した(参照により全体が組み込まれるSEQUENCES OF IMM
UNOLOGICAL INTEREST,5 th edition,NIH pub
lication,No.91-3242,E.A.Kabat et al.を参照さ
れたい)。
インがいくつかある。本明細書の「免疫グロブリン(Ig)ドメイン」は、明確に異なる
三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重(CH)ドメイン及びヒンジ
ドメインを含む重鎖ドメインが本発明における関心対象である。IgG抗体の文脈におい
て、IgGアイソタイプは、各々、3つのCH領域を有する。したがって、IgGの文脈
における「CH」ドメイン は以下の通りである:「CH1」は、Kabatの通りEU
インデックスに従う118~220位を指す。「CH2」は、KabatにおけるEUイ
ンデックスに従う237~340位を指し、「CH3」は、KabatにおけるEUイン
デックスに従う341~447位を指す。
ドメイン、重定常ドメイン、軽定常ドメイン、及びFcドメインを提供する。「可変領域
」は、本明細書で使用される場合、実質的にVκまたはVλのいずれかでコードされる1
つ以上のIgドメイン、ならびに/または、それぞれ、カッパ、ラムダ、及び重鎖免疫グ
ロブリン遺伝子座を構成するVH遺伝子を含む、免疫グロブリンの領域を意味する。した
がって、可変重ドメインはvhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vh
FR3-vhCDR3-vhFR4を含み、可変軽ドメインはvlFR1-vlCDR1
-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4を含む。本明細書
における「重定常領域」は、抗体のCH1-ヒンジ-CH2-CH3部分を意味する。「
Fc」または「Fc領域」または「Fcドメイン」は、本明細書で使用される場合、第1
の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域、及び一部の場合にはヒンジ部
分を含むポリペプチドを意味する。このため、Fcは、IgA、IgD、及びIgGの最
後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、IgE及びIgMの最後の3つの定常領域
免疫グロブリンドメイン、及びこれらのドメインに対する可動性ヒンジN末端を指す。I
gA及びIgMについては、FcはJ鎖を含んでもよい。IgGについては、Fcドメイ
ンは、免疫グロブリンドメインCγ2及びCγ3(Cγ2及びCγ3)、及びCγ1(C
γ1)とCγ2(Cγ2)との間のより下のヒンジ領域を含む。Fc領域の境界は異なり
得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、そのカルボキシ末端に残基C226またはP
230を含むと定義され、これにおいて、付番はKabatにおけるEUインデックスに
従う。一部の実施形態では、以下でより十分に説明するように、例えば、1つ以上のFc
γR受容体またはFcRn受容体への結合を改変するためのアミノ酸修飾がFc領域に行
われる。
ドメインにアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のFc変異体は、それらを
含むアミノ酸修飾に従って定義される。このため、例えば、N434Sまたは434Sは
、親Fc ポリペプチドに対する434位で置換セリンを有するFc変異体であり、ここ
での付番はEUインデックスに従う。同様に、M428L/N434Sは、親Fc ポリ
ペプチドに対する置換M428L及びN434Sを有するFc変異体を定義する。WTア
ミノ酸の素性は特定されていない場合があり、その場合、前述の変異体は428L/43
4Sと称される。置換が提供される順序は任意であり、つまり、例えば、428L/43
4SはM428L/N434Sと同じFc変異体である(以降同様)ことに留意されたい
。抗体に関して本発明で考察する全ての位置について、別途記述のない限り、アミノ酸位
置付番はEUインデックスに従う。
びCL免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Fabは、単離している
この領域、または完全長抗体、抗体断片、もしくはFab融合タンパク質との関連でのこ
の領域を指し得る。本明細書で使用される「Fv」または「Fv断片」または「Fv領域
」とは、単一抗体のVL及びVHドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者には理
解されるであろう通り、それらは、一般に、2つの鎖で構成されている。
かは、一般に、可変ドメイン内の残基(およそ、軽鎖可変領域の残基1~107及び重鎖
可変領域の残基1~113)を指す場合に使用される(例えば、Kabat et al
.(上記参照)(1991))。Kabatで見られるようなEU付番は、一般に、定常
ドメイン及び/またはFcドメインに使用される。
に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内
の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側
鎖等の分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。
単一抗原は、2つ以上のエピトープを有し得る。
れる)及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドに
よって効果的に遮断されるアミノ酸残基(言い換えれば、このアミノ酸残基は、特異的抗
原結合ペプチドのフットプリント内にある)を含み得る。
直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されたアミノ酸によって産
生される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって産生され
たものである。立体配座エピトープ及び非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で後
者ではなく前者への結合が失われるという点で区別され得る。
は、少なくとも5個、または8~10個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗
体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を
示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。特異的ビニングについては、以下に記載
される。
互換的に使用される)も「抗体」の定義内に含まれる。つまり、本発明の目的のために、
本発明の抗体は、それがPVRIG抗原に結合する最低限の機能要件を有する。当業者に
は理解されるであろう通り、抗原に結合する能力を保持するにも関わらず、(i)VL、
VH、CL、及びCH1ドメインからなるFab断片、(ii)VH及びCH1ドメイン
からなるFd断片、(iii)F(ab’)2断片(2つの連結されたFab断片を含む
二価断片)、(vii)一本鎖Fv分子(scFv)(VHドメイン及びVLドメインが
ペプチドリンカーによって連結され、これにより、これらの2つのドメインが会合して抗
原結合部位を形成することが可能になる)(Bird et al.,1988,Sci
ence 242:423-426,Huston et al.,1988,Proc
.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883(参照により全
体が組み込まれる))、(iv)「ダイアボディ」または「トリボディ」(遺伝子融合に
よって構築される多価または多特異性断片)(Tomlinson et.al.,20
00,Methods Enzymol.326:461-479、WO94/1380
4、Holliger et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.90:6444-6448(参照により全体が組み込まれる))、(v
)「ドメイン抗体」または「dAb」(「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と称される
ことがあり、齧歯類(例えば、WO00/29004に開示されるもの)、テンジクザメ
、及びラクダ科V-HH dAb等の他の種由来の単一抗体可変ドメインを含む)、(v
i)SMIP(小分子免疫医薬品)、キャメルボディ、ナノボディ、及びIgNARを含
むが、これらに限定されない、代替構造も有する多数の抗原断片及び誘導体が存在する。
の抗体または抗体部分と1つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有会合または非
共有会合によって形成される大きい免疫接着分子(「融合タンパク質」と称されることも
ある)の一部であり得る。免疫接着分子の例は、四量体scFv分子を作製するためのス
トレプトアビジンコア領域の使用、ならびに二価及びビオチン化scFv分子を作製する
ためのシステイン残基、マーカーペプチド、及びC末端ポリヒスチジンタグの使用を含む
。抗体部分、例えば、Fab及びF(ab’)2断片は、それぞれ、全抗体のパパイン消
化またはペプシン消化等の従来の技法を使用して全抗体から調製され得る。更に、抗体、
抗体部分、及び免疫接着分子は、本明細書に記載の標準の組み換えDNA技法を使用して
得ることができる。
換え」とは、広範に、産物、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、もしくはベクター
に関して、細胞、核酸、タンパク質、もしくはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質
の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、または
その細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。故に、例えば、組み換え細
胞は、その細胞の天然(非組み換え)型には見られない遺伝子を発現するか、または別様
に異常に発現されるか、過小発現されるか、または全く発現されない天然遺伝子を発現す
る。
現、作製、または単離された全ての抗体、例えば、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子に対
してトランスジェニックもしくは導入染色体性である動物(例えば、マウス)、またはそ
れから調製されたハイブリドーマ(以下に更に記載される)から単離された抗体、(b)
ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから
単離された抗体、(c)組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗
体、及び(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを伴
う任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体を含む。かかる組み
換えヒト抗体は、フレームワーク及びCDR領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由
来する可変領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組み換えヒト
抗体が、インビトロ突然変異誘発(または、ヒトIg配列に対するトランスジェニック動
物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発)を受け得るため、組み換え抗体のV
H及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH及びVL配列に由来し、かつそれに
関連する一方で、インビボではヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しない場
合がある配列である。
本発明の抗体は、アミノ酸置換によってアミノ酸配列を改変するように修飾または操作
され得る。
位置のアミノ酸の異なるアミノ酸との置き換えを意味する。具体的には、一部の実施形態
では、置換は、その生物内またはいずれの生物内のいずれにも天然には存在しない、その
特定の位置では天然に存在しないアミノ酸に対するものである。例えば、置換E272Y
とは、272位のグルタミン酸がチロシンで置き換えられる変異体ポリペプチド、この場
合、Fc変異体を指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、開始アミノ
酸は変化させない(例えば、(アルギニンをコードする)CGGを(依然としてアルギニ
ンをコードする)CGAと交換して、宿主生物の発現レベルを増加させる)ように操作さ
れたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではなく、つまり、同じタンパク質をコードする新
たな遺伝子の作製にも関わらず、そのタンパク質が、それが開始した同じアミノ酸をその
特定の位置に有する場合、それは、アミノ酸置換ではない。
の親和性を改変し(以下により完全に概説されるよう、結合の増加及び低減の両方を含む
)、本抗体の追加の機能特性も改変するために行われ得る。例えば、本抗体は、Fc領域
内に修飾を含むように、典型的には、本抗体の1つ以上の機能特性、例えば、血清半減期
、補体結合、Fc受容体結合、及び/または抗原依存性細胞傷害性を改変するように操作
され得る。更に、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う抗体は、化学修飾される(例
えば、1つ以上の化学的部分が本抗体に結合し得る)か、またはそのグリコシル化を改変
するように修飾されて、この場合も同様に本抗体の1つ以上の機能特性を改変することが
できる。かかる実施形態については、以下に更に記載される。Fc領域内の残基の付数は
、KabatのEUインデックスの付数である。
れる、例えば、増加または減少するように修飾される。このアプローチについては、米国
特許第5,677,425号(Bodmerら)に更に記載されている。CH1のヒンジ
領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリを容易にするように
、または本抗体の安定性を増加もしくは減少させるように改変される。
うに突然変異される。より具体的には、1つ以上のアミノ酸突然変異は、本抗体が天然F
c-ヒンジドメインSpA結合と比較して正常な機能が損なわれたStaphyloco
ccylタンパク質A(SpA)結合を有するように、Fc-ヒンジ断片のCH2-CH
3ドメイン界面領域に導入される。このアプローチについては、米国特許第6,165,
745号(Wardら)に更に詳細に記載されている。
めに、Fc領域内で行われ得る。本明細書で使用される「Fcガンマ受容体」、「Fcγ
R」、または「FcgammaR」とは、IgG抗体Fc領域に結合し、かつFcγR遺
伝子によってコードされる任意の数のタンパク質ファミリーを意味する。ヒトにおいて、
このファミリーとしては、FcγRI(CD64)(アイソフォームFcγRIa、Fc
γRIb、及びFcγRIcを含む);FcγRII(CD32)(アイソフォームFc
γRIIa(アロタイプH131及びR131等)、FcγRIIb(FcγRIIb-
1及びFcγRIIb-2等)、及びFcγRIIcを含む);ならびにFcγRIII
(CD16)(アイソフォームFcγRIIIa(アロタイプV158及びF158等)
及びFcγRIIIb(アロタイプFcγRIIIb-NA1及びFcγRIIIb-N
A2等)を含む)(Jefferis et al.,2002,Immunol Le
tt 82:57-65(参照により全体が組み込まれる))、ならびに任意の発見され
ていないヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプが挙げられるが
、これらに限定されない。FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含む
が、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスFcγRとしては、Fcγ
RI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII-1(CD16)、及び
FcγRIII-2(CD16-2)、ならびに任意の発見されていないマウスFcγR
またはFcγRアイソフォームもしくはアロタイプが挙げられるが、これらに限定されな
い。
なFc置換が存在する。結合の増加ならびに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る
。例えば、FcγRIIIaへの結合の増加は、一般に、ADCC(FcγRを発現する
非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引
き起こす細胞媒介性反応である抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性の増加をもたらすことが
知られている。同様に、いくつかの状況下では、FcγRIIb(抑制性受容体)への結
合の減少も有益であり得る。本発明において使用を見出すアミノ酸置換は、米国第11/
124,620号(特に図41)及び米国特許第6,737,056号(いずれも参照に
よりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる)に列記されるもの、具体的にはそ
れらに開示される変異体を含む。使用を見出す具体的な変異体としては、236A、23
9D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、32
8F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、23
9D、332E/330L、299T、及び297Nが挙げられるが、これらに限定され
ない。
アプローチが可能である。例えば、米国特許第6,277,375号(Ward)に記載
されるように、以下の突然変異:T252L、T254S、T256Fのうちの1つ以上
が導入され得る。あるいは、生物学的半減期を増加するために、本抗体は、米国特許第5
,869,046号及び同第6,121,022号(Prestaら)に記載されるよう
に、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるサルベージ受容体結
合エピトープを含むようにCH1またはCL領域内で改変され得る。血清半減期を増加さ
せるための更なる突然変異は、米国特許第8,883,973号、同第6,737,05
6号、及び同第7,371,826号に開示されており、428L、434A、434S
、及び428L/434Sを含む。
なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置き換えることによって改変される
。例えば、本抗体が、エフェクターリガンドに対する改変された親和性を有するが、親抗
体の抗原結合能力を保持するように、アミノ酸残基234、235、236、237、2
97、318、320、及び322から選択される1つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ
酸残基に置き換えられ得る。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Fc
受容体または補体のC1成分であり得る。このアプローチについては、米国特許第5,6
24,821号及び同第5,648,260号(いずれもWinterら)に更に詳細に
記載されている。
依存性細胞傷害性(CDC)を有するように、アミノ酸残基329、331、及び322
から選択される1つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このア
プローチについては、米国特許第6,194,551号(Idusogieら)に更に詳
細に記載されている。
それにより、補体を固定する抗体の能力が改変される。このアプローチについては、PC
T公開第WO94/29351号(Bodmerら)に更に記載されている。
、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272
、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293
、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312
、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333
、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382
、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437
、438、もしくは439の1つ以上のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細
胞傷害性(ADCC)を媒介する本抗体の能力を増加させ、かつ/またはFcγ受容体に
対する本抗体の親和性を増加させるように修飾される。このアプローチについては、PC
T公開第WO00/42072号(Presta)に更に記載されている。更に、Fcγ
RI、FcγRII、FcγRIII、及びFcRnに対するヒトIgG1上の結合部位
がマッピングされており、結合が改善された変異体が記載されている(Shields,
R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276:6591-660
4).256、290、298、333、334、及び339位での特異的突然変異が、
FcyRIIIへの結合を改善することが示されている。加えて、以下の組み合わせ突然
変異体:T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A、
及びS298A/E333A/K334Aが、FcγRIII結合を改善することが示さ
れている。更に、M252Y/S254T/T256EまたはM428L/N434S等
の突然変異が、FcRnへの結合を改善し、抗体の循環半減期を増加させる(Chan
CA and Carter PJ(2010)Nature Rev Immunol
10:301-316を参照されたい)。
飾され得る。具体的には、このプロセスは、機能的に一価である二重特異性抗体を効果的
にもたらす他のIgG4抗体間でのIgG4半分子(重鎖1つ+軽鎖1つ)の交換を伴う
。重鎖のヒンジ領域及び定常ドメインに対する突然変異がこの交換を抑止する(Aalb
erse,RC,Schuurman J.,2002,Immunology 105
:9-19を参照されたい)。
体が作製され得る(即ち、抗体がグリコシル化を欠いている)。グリコシル化は、例えば
、抗原に対する本抗体の親和性を増加させるか、またはADCC等のエフェクター機能を
低減するように改変され得る。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の1つ以上の
グリコシル化部位、例えば、N297を改変することによって達成され得る。例えば、1
つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化領域の排除をもたらし、それにより、その
部位でのグリコシル化を排除する1つ以上のアミノ酸置換が行われ得る。
ル残基の量が低減した低フコシル化抗体または二分GlcNac構造が増加した抗体が作
製され得る。かかるグリコシル化パターンの改変が抗体のADCC能力を増加させると実
証されている。かかる炭水化物修飾は、例えば、本抗体をグリコシル化機構が改変された
宿主細胞で発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構が改変された細胞に
ついては、当該技術分野で説明されており、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う組
み換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が改変された抗体を産生する宿主細胞と
して使用され得る。例えば、細胞株Ms704、Ms705、及びMs709は、フコシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8(α(1,6)フコシルトランスフェラーゼ)を
欠き、これにより、Ms704、Ms705、及びMs709細胞株で発現される抗体が
、それらの炭水化物上のフコースを欠く。Ms704、Ms705、及びMs709 F
UT8細胞株は、2つの置換ベクターの使用によるCHO/DG44細胞内でのFUT8
遺伝子の標的破壊によって作製される(米国特許公開第20040110704号(Ya
maneら)及びYamane-Ohnuki et al.(2004)Biotec
hnol Bioeng 87:614-22を参照されたい)。別の例として、EP1
,176,195(Hanaiら)は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的
に破壊されたFUT8遺伝子を有する細胞株について記載しており、かかる細胞株で発現
された抗体は、α1,6結合関連酵素を低減または排除することによって低フコシル化を
呈する。Hanaiらは、フコースを、本抗体のFc領域に結合するか、または酵素活性
を有しないN-アセチルグルコサミンに付加するための低酵素活性を有する細胞株、例え
ば、ラット骨髄腫細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)についても記載して
いる。PCT公開第WO03/035835号(Presta)は、フコースをAsn(
297)結合炭水化物に結合させる能力が低減し、その宿主細胞で発現された抗体の低フ
コシル化ももたらす変異体CHO細胞株、Lec13細胞について記載している(Shi
elds,R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277:267
33-26740)。PCT公開第WO99/54342号(Umanaら)は、操作さ
れた細胞株で発現された抗体が、本抗体のADCC活性の増加をもたらす二分GlcNa
c構造の増加を呈するように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば
、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII
))を発現させるように操作された細胞株について記載している(Umana et a
l.(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。あるいは、本抗体
のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断され得る。例えば、フコシダーゼα
-L-フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する(Tarentino,A.L
.et al.(1975)Biochem.14:5516-23)。
るための、他の水溶性部分、典型的には、ポリマーのペグ化または付加である。抗体は、
例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を増加させるためにペグ化され得る。抗
体をペグ化するために、抗体またはその断片は、典型的には、1つ以上のPEG群がその
抗体または抗体断片に結合する条件下で、ポリエチレングリコール(PEG)、例えば、
PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と反応させられる。好ましくは、ペグ化
は、反応性PEG分子(または類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはア
ルキル化反応によって行われる。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール
」という用語は、モノ(C1~C10)アルコキシ-またはアリールオキシ-ポリエチレ
ングリコールまたはポリエチレングリコール-マレイミド等の他のタンパク質を誘導体化
するために使用されているPEGの形態のうちのいずれかを包含するよう意図されている
。ある特定の実施形態では、ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク
質をペグ化するための方法が当該技術分野で既知であり、本発明の少なくとも一部の実施
形態に従う抗体に適用され得る。例えば、EP 0 154 316(Nishimur
aら)及びEP 0 401 384(Ishikawaら)を参照されたい。
血清半減期を増加させるために行われる置換に加えて、以下に更に詳細に記載されるよう
に、追加の抗体修飾が行われ得る。
性突然変異」と称されることがある。「親和性成熟」抗体は、1つ以上のCDRに1つ以
上の改変(複数可)を有するものであり、それらの改変(複数可)を有しない親抗体と比
較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。いくつかの場合には、まれではある
が、その抗原に対する抗体の親和性を低減することが望ましくあり得るが、これは、一般
に、好ましくない。
うちの1つ以上で行われる。一般に、1個のみ、または2個もしくは3個のアミノ酸がい
ずれの単一CDRで置換され、一般に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または1
0個より多くの変化が一組のCDR内に加えられない。しかしながら、任意のCDRでの
置換なし、1つの置換、2つの置換、または3つの置換の任意の組み合わせが、独立して
、任意に、任意の他の置換と組み合わせられ得ることを理解されたい。
なくとも約10%~50-100-150%以上、または1~5倍増加させるために行わ
れ得る。好ましい親和性成熟抗体は、PVRIG抗原に対するナノモル親和性または更に
はピコモル親和性を有する。親和性成熟抗体は、既知の手技によって産生される。例えば
、可変重鎖(VH)及び可変軽鎖(VL)ドメインシャッフリングによる親和性成熟につ
いて記載しているMarks et al.,1992,Biotechnology
10:779-783を参照されたい。CDR及び/またはフレームワーク残基のランダ
ム突然変異誘発については、例えば、Barbas,et al.1994,Proc.
Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813、Shier et a
l.,1995,Gene 169:147-155、Yelton et al.,1
995,J.Immunol.155:1994-2004、Jackson et a
l.,1995,J.Immunol.154(7):3310-9、及びHawkin
s et al,1992,J.Mol.Biol.226:889-896に記載され
ている。
ば、抗原に対する抗体の親和性を著しく改変しない「サイレント」である。これらは、(
本発明の抗体をコードする核酸に対して行われ得る)発現の最適化を含むいくつかの理由
で行われ得る。
本発明の抗体は、本発明の列挙される抗体のCDRのうちの1つ以上にアミノ酸修飾を含
み得る。加えて、以下に概説されるように、アミノ酸修飾は、独立して、任意に、フレー
ムワーク及び定常領域を含むCDR外の任意の領域でも行われ得る。
本発明は抗PVRIG抗体を提供する。(便宜上、「抗PVRIG抗体」及び「PVR
IG抗体」は互換的に使用される)。本発明の抗PVRIG抗体は、図25に図示するよ
うに、ヒトPVRIG、及び好ましくはヒトVISG1のECDと特異的に結合する。
-4M、少なくとも約10-5M、少なくとも約10-6M、少なくとも約10-7M、
少なくとも約10-8M、少なくとも約10-9M、代替的に少なくとも約10-10M
、少なくとも約10-11M、少なくとも約10-12M以上のKDを有する抗体によっ
て呈され得、KDは、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に
特異的に結合する抗体は、PVRIG抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して
、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍、
またはそれを超えて大きいKDを有することになる。
への最適な結合のためには、本抗体は、好ましくは50nM未満、及び最も好ましくは1
nM未満のKDを有し、0.1nM未満ならびに1pM及び0.1pM未満が本発明の方
法において使用を見出す。
エピトープについてのKAまたはKaが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なく
とも20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍
、またはそれを超えて大きい抗体によって呈され得、KAまたはKaは、特定の抗体-抗
原相互作用の会合速度を指す。
10nM以下、もしくは1nM以下(つまり、より高い結合親和性)、または1pM以下
のKDでヒトPVRIGと結合し、KDは、既知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴(
SPR、例えば、Biacoreアッセイ)、ELISA、KINEXA、最も典型的に
は25℃または37℃でのSPRによって決定される。
本発明は、6つのCDRのいくつかの特異的な列挙するセットを含む完全長抗体を含む
抗原結合ドメインを提供する。
.7.013」を有する。これは、例えば、図38及び図39に図示するように、可変重
鎖及び可変軽鎖の組み合わせを表す。「CPA.7.013.VH」はCPA.7.01
3の可変重部分を指し、一方で「CPA.7.013.VL」は可変軽鎖である。「CP
A.7.013.vhCDR1」、「CPA.7.013.vhCDR2」、「CPA.
7.013.vhCDR3」、「CPA.7.013.vlCDR1」、「CPA.7.
013.vlCDR2」、及び「CPA.7.013.vlCDR3」は、CDRが示さ
れるを指す。「CPA.7.013.HC」は、この分子の重鎖全体(例えば、可変及び
定常ドメイン)を指し、「CPA.7.013.LC」は、同じ分子の軽軽鎖全体(例え
ば、可変及び定常ドメイン)を指す。「CPA.7.013.H1」は、ヒトIgG1の
定常ドメイン(故にH1;IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4配列は図66に
示す)を含む可変重及び軽ドメインを含む完全長抗体を指す。したがって、「CPA.7
.013.H2」は、ヒトIgG2に連結したCPA.7.013可変ドメインであり得
る。「CPA.7.013.H3」は、ヒトIgG3に連結したCPA.7.013 可
変ドメインであり得、「CPA.7.013.H4」は、ヒトIgG4に連結したCPA
.7.013可変ドメインであり得る。
G及びPVLR2の結合を妨害する。図52に示すように、受容体-リガンド相互作用の
結合と妨害との両方を行うCPA抗体は以下の通りであり、これらの構成要素も概説され
る。
.7.001.HC、CPA.7.001.LC及びCPA.7.001.H1、CPA
.7.001.H2、CPA.7.001.H3、CPA.7.001.H4;CPA.
7.001.vhCDR1、CPA.7.001.vhCDR2、CPA.7.001.
vhCDR3、CPA.7.001.vlCDR1、CPA.7.001.vlCDR2
、及びCPA.7.001.vlCDR3;
CPA.7.003、CPA.7.003.VH、CPA.7.003.VL、CPA
.7.003.HC、CPA.7.003.LC、CPA.7.003.H1、CPA.
7.003.H2、CPA.7.003.H3、CPA.7.003.H4;CPA.7
.003.vhCDR1、CPA.7.003.vhCDR2、CPA.7.003.v
hCDR3、CPA.7.003.vlCDR1、CPA.7.003.vlCDR2、
及びCPA.7.003.vlCDR3;
CPA.7.004、CPA.7.004.VH、CPA.7.004.VL、CPA
.7.004.HC、CPA.7.004.LC、CPA.7.004.H1、CPA.
7.004.H2、CPA.7.004.H3 CPA.7.004.H4;CPA.7
.004.vhCDR1、CPA.7.004.vhCDR2、CPA.7.004.v
hCDR3、CPA.7.004.vlCDR1、CPA.7.004.vlCDR2、
及びCPA.7.004.vlCDR3;
CPA.7.006、CPA.7.006.VH、CPA.7.006.VL、CPA
.7.006.HC、CPA.7.006.LC、CPA.7.006.H1、CPA.
7.006.H2、CPA.7.006.H3 CPA.7.006.H4;CPA.7
.006.vhCDR1、CPA.7.006.vhCDR2、CPA.7.006.v
hCDR3、CPA.7.006.vlCDR1、CPA.7.006.vlCDR2、
及びCPA.7.006.vlCDR3;
CPA.7.008、CPA.7.008.VH、CPA.7.008.VL、CPA
.7.008.HC、CPA.7.008.LC、CPA.7.008.H1、CPA.
7.008.H2、CPA.7.008.H3 CPA.7.008.H4;CPA.7
.008.vhCDR1、CPA.7.008.vhCDR2、CPA.7.008.v
hCDR3、CPA.7.008.vlCDR1、CPA.7.008.vlCDR2、
及びCPA.7.008.vlCDR3;
CPA.7.009、CPA.7.009.VH、CPA.7.009.VL、CPA
.7.009.HC、CPA.7.009.LC、CPA.7.009.H1、CPA.
7.009.H2、CPA.7.009.H3 CPA.7.009.H4;CPA.7
.009.vhCDR1、CPA.7.009.vhCDR2、CPA.7.009.v
hCDR3、CPA.7.009.vlCDR1、CPA.7.009.vlCDR2、
及びCPA.7.009.vlCDR3;
CPA.7.010、CPA.7.010.VH、CPA.7.010.VL、CPA
.7.010.HC、CPA.7.010.LC、CPA.7.010.H1、CPA.
7.010.H2、CPA.7.010.H3 CPA.7.010.H4;CPA.7
.010.vhCDR1、CPA.7.010.vhCDR2、CPA.7.010.v
hCDR3、CPA.7.010.vlCDR1、CPA.7.010.vlCDR2、
及びCPA.7.010.vlCDR3;
CPA.7.011、CPA.7.011.VH、CPA.7.011.VL、CPA
.7.011.HC、CPA.7.011.LC、CPA.7.011.H1、CPA.
7.011.H2、CPA.7.011.H3 CPA.7.011.H4;CPA.7
.011.vhCDR1、CPA.7.011.vhCDR2、CPA.7.011.v
hCDR3、CPA.7.011.vlCDR1、CPA.7.011.vlCDR2、
及びCPA.7.011.vlCDR3;
CPA.7.012、CPA.7.012.VH、CPA.7.012.VL、CPA
.7.012.HC、CPA.7.012.LC、CPA.7.012.H1、CPA.
7.012.H2、CPA.7.012.H3 CPA.7.012.H4;CPA.7
.012.vhCDR1、CPA.7.012.vhCDR2、CPA.7.012.v
hCDR3、CPA.7.012.vlCDR1、CPA.7.012.vlCDR2、
及びCPA.7.012.vlCDR3;
CPA.7.013、CPA.7.013.VH、CPA.7.013.VL、CPA
.7.013.HC、CPA.7.013.LC、CPA.7.013.H1、CPA.
7.013.H2、CPA.7.013.H3 CPA.7.013.H4;CPA.7
.013.vhCDR1、CPA.7.013.vhCDR2、CPA.7.013.v
hCDR3、CPA.7.013.vlCDR1、CPA.7.013.vlCDR2、
及びCPA.7.013.vlCDR3;
CPA.7.014、CPA.7.014.VH、CPA.7.014.VL、CPA
.7.014.HC、CPA.7.014.LC、CPA.7.014.H1、CPA.
7.014.H2、CPA.7.014.H3 CPA.7.014.H4;CPA.7
.014.vhCDR1、CPA.7.014.vhCDR2、CPA.7.014.v
hCDR3、CPA.7.014.vlCDR1、CPA.7.014.vlCDR2、
及びCPA.7.014.vlCDR3;
CPA.7.015、CPA.7.015.VH、CPA.7.015.VL、CPA
.7.015.HC、CPA.7.015.LC、CPA.7.015.H1、CPA.
7.015.H2、CPA.7.015.H3 CPA.7.015.H4;CPA.7
.015.vhCDR1、CPA.7.015.vhCDR2、CPA.7.015.v
hCDR3、CPA.7.015.vlCDR1、CPA.7.015.vlCDR2、
及びCPA.7.015.vlCDR3;
CPA.7.017、CPA.7.017.VH、CPA.7.017.VL、CPA
.7.017.HC、CPA.7.017.LC、CPA.7.017H1、CPA.7
.017.H2、CPA.7.017.H3 CPA.7.017.H4;CPA.7.
017.vhCDR1、CPA.7.000171.vhCDR2、CPA.7.017
.vhCDR3、CPA.7.017.vlCDR1、CPA.7.017.vlCDR
2、及びCPA.7.017.vlCDR3;
CPA.7.018、CPA.7.018.VH、CPA.7.018.VL、CPA
.7.018.HC、CPA.7.018.LC、CPA.7.018.H1、CPA.
7.018.H2、CPA.7.018.H3 CPA.7.018.H4;CPA.7
.017.vhCDR1、CPA.7.017.vhCDR2、CPA.7.017.v
hCDR3、CPA.7.017.vlCDR1、CPA.7.017.vlCDR2、
及びCPA.7.017.vlCDR3;
CPA.7.019、CPA.7.019.VH、CPA.7.019.VL、CPA
.7.019.HC、CPA.7.019.LC、CPA.7.019.H1、CPA.
7.019.H2、CPA.7.019.H3 CPA.7.019.H4;CPA.7
.019.vhCDR1、CPA.7.019.vhCDR2、CPA.7.019.v
hCDR3、CPA.7.019.vlCDR1、CPA.7.019.vlCDR2、
及びCPA.7.019.vlCDR3;
CPA.7.021、CPA.7.021.VH、CPA.7.021.VL、CPA
.7.021.HC、CPA.7.021.LC、CPA.7.021.H1、CPA.
7.021.H2、CPA.7.021.H3 CPA.7.021.H4;CPA.7
.021.vhCDR1、CPA.7.021.vhCDR2、CPA.7.021.v
hCDR3、CPA.7.021.vlCDR1、CPA.7.021.vlCDR2、
及びCPA.7.021.vlCDR3;
CPA.7.022、CPA.7.022.VH、CPA.7.022.VL、CPA
.7.022.HC、CPA.7.022.LC、CPA.7.022.H1、CPA.
7.022.H2、CPA.7.022.H3 CPA.7.022.H4;CPA.7
.022.vhCDR1、CPA.7.022.vhCDR2、CPA.7.00220
1.vhCDR3、CPA.7.022.vlCDR1、CPA.7.022.vlCD
R2、及びCPA.7.022.vlCDR3;
CPA.7.023、CPA.7.023.VH、CPA.7.023.VL、CPA
.7.023.HC、CPA.7.023.LC、CPA.7.023.H1、CPA.
7.023.H2、CPA.7.023.H3 CPA.7.023.H4;CPA.7
.023.vhCDR1、CPA.7.023.vhCDR2、CPA.7.023.v
hCDR3、CPA.7.023.vlCDR1、CPA.7.023.vlCDR2、
及びCPA.7.023.vlCDR3;
CPA.7.024、CPA.7.024.VH、CPA.7.024.VL、CPA
.7.024.HC、CPA.7.024.LC、CPA.7.024.H1、CPA.
7.024.H2、CPA.7.024.H3 CPA.7.024.H4;CPA.7
.024.vhCDR1、CPA.7.024.vhCDR2、CPA.7.024.v
hCDR3、CPA.7.024.vlCDR1、CPA.7.024.vlCDR2、
及びCPA.7.024.vlCDR3;
CPA.7.033、CPA.7.033.VH、CPA.7.033.VL、CPA
.7.033.HC、CPA.7.033.LC、CPA.7.033.H1、CPA.
7.033.H2、CPA.7.033.H3 CPA.7.033.H4;CPA.7
.033.vhCDR1、CPA.7.033.vhCDR2、CPA.7.033.v
hCDR3、CPA.7.033.vlCDR1、CPA.7.033.vlCDR2、
及びCPA.7.033.vlCDR3;
CPA.7.034、CPA.7.034.VH、CPA.7.034.VL、CPA
.7.034.HC、CPA.7.034.LC、CPA.7.034.H1、CPA.
7.034.H2、CPA.7.034.H3 CPA.7.034.H4;CPA.7
.034.vhCDR1、CPA.7.034.vhCDR2、CPA.7.034.v
hCDR3、CPA.7.034.vlCDR1、CPA.7.034.vlCDR2、
及びCPA.7.034.vlCDR3;
CPA.7.036、CPA.7.036.VH、CPA.7.036.VL、CPA
.7.036.HC、CPA.7.036.LC、CPA.7.036.H1、CPA.
7.036.H2、CPA.7.036.H3 CPA.7.036.H4;CPA.7
.036.vhCDR1、CPA.7.036.vhCDR2、CPA.7.036.v
hCDR3、CPA.7.036.vlCDR1、CPA.7.036.vlCDR2、
及びCPA.7.036.vlCDR3;
CPA.7.040、CPA.7.040.VH、CPA.7.040.VL、CPA
.7.040.HC、CPA.7.040.LC、CPA.7.040.H1、CPA.
7.040.H2、CPA.7.040.H3、及びCPA.7.040.H4;CPA
.7.040.vhCDR1、CPA.7.040.vhCDR2、CPA.7.040
.vhCDR3、CPA.7.040.vlCDR1、CPA.7.040.vlCDR
2、及びCPA.7.040.vlCDR3;
CPA.7.046、CPA.7.046.VH、CPA.7.046.VL、CPA
.7.046.HC、CPA.7.046.LC、CPA.7.046.H1、CPA.
7.046.H2、CPA.7.046.H3 CPA.7.046.H4;CPA.7
.046.vhCDR1、CPA.7.046.vhCDR2、CPA.7.046.v
hCDR3、CPA.7.046.vlCDR1、CPA.7.046.vlCDR2、
及びCPA.7.046.vlCDR3;
CPA.7.047、CPA.7.047.VH、CPA.7.047.VL、CPA
.7.047.HC、CPA.7.047.LC、CPA.7.047.H1、CPA.
7.047.H2、CPA.7.047.H3 CPA.7.047.H4;CPA.7
.047.vhCDR1、CPA.7.047.vhCDR2、CPA.7.047.v
hCDR3、CPA.7.047.vlCDR1、CPA.7.004701.vlCD
R2、及びCPA.7.047.vlCDR3;
CPA.7.049、CPA.7.049.VH、CPA.7.049.VL、CPA
.7.049.HC、CPA.7.049.LC、CPA.7.049.H1、CPA.
7.049.H2、CPA.7.049.H3 CPA.7.049.H4;CPA.7
.049.vhCDR1、CPA.7.049.vhCDR2、CPA.7.049.v
hCDR3、CPA.7.049.vlCDR1、CPA.7.049.vlCDR2、
及びCPA.7.049.vlCDR3;ならびに
CPA.7.050、CPA.7.050.VH、CPA.7.050.VL、CPA
.7.050.HC、CPA.7.050.LC、CPA.7.050.H1、CPA.
7.050.H2、CPA.7.050.H3 CPA.7.050.H4、CPA.7
.050.vhCDR1、CPA.7.050.vhCDR2、CPA.7.050.v
hCDR3、CPA.7.050.vlCDR1、CPA.7.050.vlCDR2、
及びCPA.7.050.vlCDR3。
互作用を妨害しなかった、いくつかの本明細書で生成されるCPA抗体が存在し、その配
列のうちの8個のみが図40で本明細書に含まれ、その構成要素は、
CPA.7.028、CPA.7.028.VH、CPA.7.028.VL、CPA
.7.028.HC、CPA.7.028.LC、CPA.7.028.H1、CPA.
7.028.H2、CPA.7.028.H3、及びCPA.7.028.H4;CPA
.7.028.vhCDR1、CPA.7.028.vhCDR2、CPA.7.028
.vhCDR3、CPA.7.028.vlCDR1、CPA.7.028.vlCDR
2、及びCPA.7.028.vlCDR3。
.7.030.HC、CPA.7.030.LC、CPA.7.030.H1、CPA.
7.030.H2、CPA.7.030.H3、及びCPA.7.030.H4;CPA
.7.030.vhCDR1、CPA.7.030.vhCDR2、CPA.7.030
.vhCDR3、CPA.7.030.vlCDR1、CPA.7.030.vlCDR
2、及びCPA.7.030.vlCDR3。
.7.041.HC、CPA.7.041.LC、CPA.7.041.H1、CPA.
7.041.H2、CPA.7.041.H3、及びCPA.7.041.H4;CPA
.7.041.vhCDR1、CPA.7.041.vhCDR2、CPA.7.041
.vhCDR3、CPA.7.041.vlCDR1、CPA.7.041.vlCDR
2、及びCPA.7.041.vlCDR3。
.7.016.HC、CPA.7.016.LC、CPA.7.016.H1、CPA.
7.016.H2、CPA.7.016.H3、及びCPA.7.016.H4;CPA
.7.016.vhCDR1、CPA.7.016.vhCDR2、CPA.7.016
.vhCDR3、CPA.7.016.vlCDR1、CPA.7.016.vlCDR
2、及びCPA.7.016.vlCDR3。
.7.020.HC、CPA.7.020.LC、CPA.7.020.H1、CPA.
7.020.H2、CPA.7.020.H3、及びCPA.7.020.H4;CPA
.7.020.vhCDR1、CPA.7.020.vhCDR2、CPA.7.020
.vhCDR3、CPA.7.020.vlCDR1、CPA.7.020.vlCDR
2、及びCPA.7.020.vlCDR3。
.7.038.HC、CPA.7.038.LC、CPA.7.038.H1、CPA.
7.038.H2、CPA.7.038.H3、及びCPA.7.038.H4;CPA
.7.038.vhCDR1、CPA.7.038.vhCDR2、CPA.7.038
.vhCDR3、CPA.7.038.vlCDR1、CPA.7.038.vlCDR
2、及びCPA.7.038.vlCDR3。
.7.044.HC、CPA.7.044.LC、CPA.7.044.H1、CPA.
7.044.H2、CPA.7.044.H3、及びCPA.7.044.H4;CPA
.7.044.vhCDR1、CPA.7.044.vhCDR2、CPA.7.044
.vhCDR3、CPA.7.044.vlCDR1、CPA.7.044.vlCDR
2、及びCPA.7.044.vlCDR3。
.7.045.HC、CPA.7.045.LC、CPA.7.045.H1、CPA.
7.045.H2、CPA.7.045.H3、及びCPA.7.045.H4;CPA
.7.045.vhCDR1、CPA.7.045.vhCDR2、CPA.7.045
.vhCDR3、CPA.7.045.vlCDR1、CPA.7.045.vlCDR
2、及びCPA.7.045.vlCDR3。
体を含む、上記の構成要素の変異体を更に提供する。加えて、可変重鎖は、本明細書の「
VH」配列と、80%、90%、95%、98%、または99%同一であり得、かつ/あ
るいは、Fc変異体を使用する場合、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個また
はそれよりも多くのアミノ酸変化を含み得る。本明細書の「VL」配列と、80%、90
%、95%、98%、または99%同一であり得、かつ/あるいは、Fc変異体を使用す
る場合、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれよりも多くのアミノ酸
変化を含み得る可変軽鎖が提供される。同様に、本明細書の「HC」及び「LC」配列と
、80%、90%、95%、98%、または99%同一であり、かつ/あるいは、Fc変
異体を使用する場合、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれよりも多
くのアミノ酸変化を含む重鎖重及び軽鎖が提供される。
抗体を提供する。当該技術分野で周知のように、6個のCDRは、ヒトフレームワーク可
変重及び可変軽領域に入れられる場合、または可変重及び軽ドメインがヒト化される場合
に有用である。
scFvドメインを提供し、その配列は図41に示される:
CHA.7.502.vhCDR1、CHA.7.502.vhCDR2、CHA.7
.502.vhCDR3、CHA.7.502.vlCDR1、CHA.7.502.v
lCDR2、及びCHA.7.502.vlCDR3。
.503.vhCDR3、CHA.7.503.vlCDR1、CHA.7.503.v
lCDR2、及びCHA.7.503.vlCDR3。
.506.vhCDR3、CHA.7.506.vlCDR1、CHA.7.506.v
lCDR2、及びCHA.7.506.vlCDR3。
.508.vhCDR3、CHA.7.508.vlCDR1、CHA.7.508.v
lCDR2、及びCHA.7.508.vlCDR3。
.510.vhCDR3、CHA.7.510.vlCDR1、CHA.7.510.v
lCDR2、及びCHA.7.510.vlCDR3。
.512.vhCDR3、CHA.7.512.vlCDR1、CHA.7.512.v
lCDR2、及びCHA.7.512.vlCDR3。
.514.vhCDR3、CHA.7.514.vlCDR1、CHA.7.514.v
lCDR2、及びCHA.7.514.vlCDR3。
.516.vhCDR3、CHA.7.516.vlCDR1、CHA.7.516.v
lCDR2、及びCHA.7.516.vlCDR3。
.518.vhCDR3、CHA.7.518.vlCDR1、CHA.7.518.v
lCDR2、及びCHA.7.518.vlCDR3。
HA.7.520_1.vhCDR3、CHA.7.520_1.vlCDR1、CHA
.7.520_1.vlCDR2、及びCHA.7.520_1.vlCDR3。
HA.7.520_2.vhCDR3、CHA.7.520_2.vlCDR1、CHA
.7.520_2.vlCDR2、及びCHA.7.520_2.vlCDR3。
.522.vhCDR3、CHA.7.522.vlCDR1、CHA.7.522.v
lCDR2、及びCHA.7.522.vlCDR3。
.524.vhCDR3、CHA.7.524.vlCDR1、CHA.7.524.v
lCDR2、及びCHA.7.524.vlCDR3。
.526.vhCDR3、CHA.7.526.vlCDR1、CHA.7.526.v
lCDR2、及びCHA.7.526.vlCDR3。
.527.vhCDR3、CHA.7.527.vlCDR1、CHA.7.527.v
lCDR2、及びCHA.7.527.vlCDR3。
.528.vhCDR3、CHA.7.528.vlCDR1、CHA.7.528.v
lCDR2、及びCHA.7.528.vlCDR3。
.530.vhCDR3、CHA.7.530.vlCDR1、CHA.7.530.v
lCDR2、及びCHA.7.530.vlCDR3。
.534.vhCDR3、CHA.7.534.vlCDR1、CHA.7.534.v
lCDR2、及びCHA.7.534.vlCDR3。
.535.vhCDR3、CHA.7.535.vlCDR1、CHA.7.535.v
lCDR2、及びCHA.7.535.vlCDR3。
.537.vhCDR3、CHA.7.537.vlCDR1、CHA.7.537.v
lCDR2、及びCHA.7.537.vlCDR3。
HA.7.538_1.vhCDR3、CHA.7.538_1.vlCDR1、CHA
.7.538_1.vlCDR2、及びCHA.7.538_1.vlCDR3。
HA.7.538_2.vhCDR3、CHA.7.538_2.vlCDR1、CHA
.7.538_2.vlCDR2、及びCHA.7.538_2.vlCDR3。
.543.vhCDR3、CHA.7.543.vlCDR1、CHA.7.543.v
lCDR2、及びCHA.7.543.vlCDR3。
.544.vhCDR3、CHA.7.544.vlCDR1、CHA.7.544.v
lCDR2、及びCHA.7.544.vlCDR3。
.545.vhCDR3、CHA.7.545.vlCDR1、CHA.7.545.v
lCDR2、及びCHA.7.545.vlCDR3。
.546.vhCDR3、CHA.7.546.vlCDR1、CHA.7.546.v
lCDR2、及びCHA.7.546.vlCDR3。
.547.vhCDR3、CHA.7.547.vlCDR1、CHA.7.547.v
lCDR2、及びCHA.7.547.vlCDR3。
.548.vhCDR3、CHA.7.548.vlCDR1、CHA.7.548.v
lCDR2、及びCHA.7.548.vlCDR3。
.549.vhCDR3、CHA.7.549.vlCDR1、CHA.7.549.v
lCDR2、及びCHA.7.549.vlCDR3。
.550.vhCDR3、CHA.7.550.vlCDR1、CHA.7.550.v
lCDR2、及びCHA.7.550.vlCDR3。
もよい。
うにヒト化することができ(時折、変異体が必要に応じてCDRにおいて生成される)、
このため、図41のVH及びVL鎖のヒト化変異体を生成することができる。更に、続い
てヒト化可変重及び軽ドメインを、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4からの
定常領域などのヒト定常領域と融合させることができる。
法について全体が参照により本明細書に組み込まれるYe et al.Nucleic
Acids Res.41:W34-W40(2013)において概説されるようにN
CBIウェブサイトのIgBLASTプログラムを使用して、当該技術分野で既知である
ようにヒト化することができる。IgBLASTは、マウスVH及び/またはVL配列を
採取し、それを既知のヒト生殖細胞系配列のライブラリと比較する。本明細書に示される
ように、本明細書で生成されるヒト化配列について、使用したデータベースは、IMGT
ヒトVH遺伝子(F+ORF、273生殖細胞系配列)及びIMGTヒトVLカッパ遺伝
子(F+ORF、74生殖細胞系配列)であった。例となる5つのCHA配列を選択した
:CHA.7.518、CHA.7.530、CHA.7.538_1、CHA.7.5
38_2、及びCHA.7.524(VH及びVL配列については図41を参照)。この
ヒト化の実施形態のために、ヒト生殖細胞系IGHV1-46(対立遺伝子1)を、アク
セプター配列及びヒト重鎖IGHJ4(対立遺伝子1)接合領域(J遺伝子)として5つ
全てについて選択した。4つ(CHA.7.518、CHA.7.530、CHA.7.
538_1、及びCHA.7.538_2)のうちの3つについては、ヒト生殖細胞系I
GKV1-39(対立遺伝子1)をアクセプター配列として選択し、ヒト軽鎖IGKJ2
(対立遺伝子1)(J遺伝子)を選択した。J遺伝子は、www.imgt.orgのi
nternational ImMunoGeneTics情報システム、IMGT(登
録商標)にてコンパイルされたヒト接合領域配列から選択した。CDRを、AbM定義(
www.bioinfo.org.uk/abs/を参照)に従って定義した。図88は
、ヒト化配列、ならびにPVRIGへの結合を最適化するためのいくつかの可能性のある
変化を図示する。
業者には理解されるであろう通り、各ヒト化可変重(ヒト化重、HH)及び可変軽(ヒト
化軽、HL)配列は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4の定常領域と組
み合わせることができる。つまり、CHA.7.518.HH1は第1のヒト化可変重鎖
であり、CHA.7.518.HH1.1は、IgG1定常領域を伴う「HH1」ヒト化
配列を含む完全長重鎖である(CHA.7.518.HH1.2はIgG2を伴うCHA
.7.518.HH1である等)。
びVL配列が「ミックスアンドマッチ」(mixed and matched)されて
他の抗PVRIG抗体を創出することができる抗PVRIG抗体を含む。かかる「ミック
スアンドマッチ」抗体のPVRIG結合は、上記の結合アッセイを使用して試験すること
ができる。例えば、ELISA)。一部の実施形態では、VH及びVL鎖をミックスアン
ドマッチし、特定のVH/VL対からのVH配列を構造的に類似したVH配列で代置する
。同様に、一部の実施形態では、特定のVH/VL対からのVL配列 を構造的に類似し
たVL 配列で代置する。例えば、相同的抗体のVH及びVL配列は、ミックスアンドマ
ッチに特に適している。
したCDRアミノ酸配列とは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ
よりも多くのアミノ酸置換だけ異なる配列;(c)(a)または(b)で指定した配列と
の90%以上、95%以上、98%以上、または99%以上の配列同一性を有するアミノ
酸配列;(d)本明細書に列挙されるアミノ酸をコードする核酸配列を有するポリヌクレ
オチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択され
るCDRアミノ酸配列を含む。
体の定義に含まれる。つまり、ある特定の実施形態では、本発明に従う抗PVRIG抗体
は、それぞれ好ましい抗PVRIG 免疫分子の単離された抗PVRIGアミノ酸配列と
相同であるアミノ酸配列を含む重及び軽鎖可変領域を含み、ここで、本抗体は、親抗PV
RIG抗体の所望の機能特性を保持する。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配
列の最適なアラインメントのために導入する必要がある、ギャップの数及び各ギャップの
長さを考慮に入れた、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である(即ち、相同
性%=同一の位置の数/位置の総数×100)。配列の比較及び2つの配列間の同一性パ
ーセントの決定は、以下の非限定的な例において記載するように、数学アルゴリズムを使
用して達成することができる。
ght residue table)、12のギャップ長ペナルティ、及び4のギャッ
プペナルティを使用して、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれてい
るE.Meyers及びW.Miller(Comput.Appl.Biosci.,
4:11-17(1988))のアルゴリズムを使用して決定することができる。加えて
、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Blossum 62行列またはPAM
250行列のいずれか、ならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップ
量、及び1、2、3、4、5、または6の長さ量を使用して、GCGソフトウェアパッケ
ージ(市販されている)中のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman及
びWunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))アルゴリ
ズムを使用して決定することができる。
、例えば関連配列を特定するために、公的なデータベースに対して検索を行うことができ
る。かかる検索は、Altschul,et al.(1990)J Mol.Biol
.215:403-10のXBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して行う
ことができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、
ワード長=3で行って、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う抗体分子と相同である
アミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るため
に、Gapped BLASTを、Altschul et al.,(1997)Nu
cleic Acids Res.25(17):3389-3402に記載のように利
用することができる。BLAST及びGapped BLASTプログラムの利用時には
、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)の初期設定パラメー
タを使用することができる。
、少なくとも80%、少なくとも90%であり、少なくとも約95、96、97、98、
または99%の同一性パーセントが好ましい。同一性パーセンテージは、全アミノ酸配列
、例えば重鎖もしくは軽鎖全体にかかるか、または鎖の一部にかかるものであり得る。例
えば、可変領域全体にかけて(例えば、同一性が可変領域にかけて95または98%同一
である場合)、または定常領域全体にかけて、またはFcドメインのみにかけて同一性を
共有するものが、本発明の抗PVRIG抗体の定義に含まれる。
て変化を有し得る配列が含まれる。例えば、PVRIG抗体には、CDRは図63に示す
ものと同一であるが、可変領域にかけての同一性がより低い、例えば、95または98%
の同一性パーセントであり得るものが含まれる。
本発明は、列挙される抗体だけでなく、PVRIG分子と特異的に結合するために列挙
される抗体(PVRIGと特異的に結合する本明細書に列挙されるCPA及びCHA数)
と競合する追加の抗体も提供する。実施例11に示すように、本発明のPVRIG抗体は
、異なるエピトープビンに「ビン分別」される。4つの別個のビンを本明細書で概説する
;1)CPA.7.002、CPA.7.003、CPA.7.005、CPA.7.0
07、CPA.7.010、CPA.7.012、CPA.7.015、CPA.7.0
16、CPA.7.017、CPA.7.019、CPA.7.020、CPA.7.0
21、CPA.7.024、CPA.7.028、CPA.7.032、CPA.7.0
33、CPA.7.036、CPA.7.037、CPA.7.038、CPA.7.0
43、CPA.7.046、及びCPA.7.041の全てが入るエピトープビン;2)
CPA.7.004、CPA.7.009、CPA.7.011、CPA.7.014、
CPA.7.018、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.034、
CPA.7.040、CPA.7.045、及びCPA.7.047の全てが入るエピト
ープビン;3)ビン1がCPA.7.039結合を妨害し、ビン2がリガンドをCPA.
7.039でサンドイッチするという点においてビン1とビン2との区別を定義するCP
A.7.039、ならびにCPA.7.050を有するビン4)。
たはビン4にある抗体と結合について競合する抗PVRIG抗体を提供する。
で概して概説するように、生成される。競合的結合研究は、一般に、SPR/Biaco
re(登録商標)結合アッセイ、ならびにELISA及び細胞系アッセイを使用して、当
該技術分野で既知であるように行うことができる。
ヒトPVRIGに対する追加の抗体は、実施例において概説するもの等の周知の方法を
使用して、当該技術分野で周知の通りに成すことができる。このため、追加の抗PVRI
G抗体は、マウスの免疫付与(例えば、Aldevronによって使用されるもの等のD
NA免疫付与を使用する場合がある)、その後の、抗体精製及び回収を伴うヒトPVRI
Gタンパク質に対するスクリーニング及びハイブリドーマ生成等の従来の方法によって生
成することができる。
本発明の抗PVRIG抗体をコードする核酸組成物、ならびに核酸及び核酸でトランス
フェクトした宿主細胞を含む発現ベクター、及び/または発現ベクター組成物も提供され
る。当業者によって理解されるであろう通り、本明細書に示すタンパク質配列は、遺伝暗
号の縮退に起因して、任意の数の可能性のある核酸配列によってコードされ得る。
重鎖及び2つの軽鎖を含む従来の四量体抗体は、重鎖をコードする核酸及び軽鎖をコード
する核酸という2つの異なる核酸によってコードされる。これらは、当該技術分野で既知
であるように、宿主細胞に形質転換した単一の発現ベクターまたは2つの発現ベクターの
中に入れることができ、ここでそれらが発現されて本発明の抗体を形成する。一部の実施
形態では、例えばscFv構築物を使用する場合、可変重鎖-リンカー-可変軽鎖をコー
ドする単一の核酸が通常使用され、これを宿主細胞への形質転換のために発現ベクターの
中に挿入し得る。核酸は、シグナル及び分泌配列、調節配列、プロモーター、複製起点、
選択遺伝子等が挙げられるがこれらに限定されない、適当な転写及び翻訳制御配列を含む
発現ベクターの中に入れることができる。
乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)、PER.C6、HE
K293、及び当該技術分野で既知であるような他の細胞が含まれる。
的に純粋な形態において存在してもよい。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバン
ディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周
知の他のものを含む標準的な技法によって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、
他の細胞核酸またはタンパク質から精製されるときに、「単離される」または「実質的に
純粋にされる」。
ンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードする別の断
片に動作可能に連結させて、その結果、VH及びVL配列が連続した一本鎖タンパク質と
して、VL及びVH領域が可動性リンカーによって接合された状態で発現され得るように
する(例えば、Bird et al.(1988)Science 242:423-
426、Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85:5879-5883、McCafferty et al.,(19
90)Nature 348:552-554を参照)。
前述の方法の実施に使用される治療用組成物は、所望の送達方法に好適な担体を含む薬
学的組成物に製剤化することができる。好適な担体には、治療用組成物と組み合わせたと
きに、その治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ一般に患者の免疫系と反応性ではな
い任意の物質が含まれる。例としては、いくつかの標準的な薬学的担体、例えば、無菌リ
ン酸緩衝生理食塩水、静菌水等のうちの任意のものが挙げられるが、これらに限定されな
い(概して、Remington’s Pharmaceutical Science
s 16thEdition,A.Osal.,Ed.,1980を参照)。許容される
担体、賦形剤、または安定剤は、用いる用量及び濃度ではレシピエントに対して非毒性で
あり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸及びメチオ
ニンを含む抗酸化剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘ
キサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド;フェノ
ール、ブチル、もしくはベンジルアルコール;メチルもしくはプロピルパラベンなどのア
ルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール
;及びm-クレゾール等);低分子量(約10個未満の残基)ポリペプチド;血清アルブ
ミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの
親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もし
くはリジンなどのアミノ酸;単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、もしくはデキス
トリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、ト
レハロース、もしくはソルビトールなどの糖;甘味剤及び他の風味剤;微結晶性セルロー
ス、ラクトース、コーン、及び他のデンプンなどの充填剤;結合因子;添加剤;着色剤;
ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);なら
びに/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレン
グリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む。
の両方を含むことを意味する薬学的に許容される塩として存在する等、水溶性形態であっ
てもよい。「薬学的に許容される酸付加塩」は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫
酸、硝酸、リン酸等、及び有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビ
ン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息
香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホ
ン酸、サリチル酸等によって形成された、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物
学的に、ないしは別様に不適切でない塩を指す。「薬学的に許容される塩基付加塩」には
、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マ
グネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等に由来するものが含まれる。ア
ンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、及びマグネシウム塩が特に好ましい。
薬学的に許容される有機非毒性塩基に由来する塩には、1級、2級、及び3級アミン、天
然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびにイソプロピルアミン、
トリメチルアミン、ジエチルアミン、及びエタノールアミン等の塩基性イオン交換樹脂の
塩が含まれる。インビボ投与に使用されることになる製剤は無菌であることが好ましい。
これは、滅菌濾過膜を介した濾過または他の方法によって容易に達成される。
び静脈内を含むがこれらに限定されない様々な方法で行われ得る。皮下投与は、患者が薬
学的組成物を自己投与し得るため、状況次第で好ましくあり得る。多くのタンパク質治療
薬は、皮下投与に許容される最大量の治療有効量の製剤を可能にするために十分に強力で
はない。この問題は、アルギニン-HCl、ヒスチジン、及びポリソルベートを含むタン
パク質製剤の使用によって一部解決し得る(WO 04091658を参照)。本発明の
Fcポリペプチドは、例えば、増加した効能、改善した血清半減期、または増強した可溶
性に起因して、皮下投与により適している可能性がある。
って送達されることが多い。本発明の抗体も、かかる方法を使用して送達し得る。例えば
、投与は、注入ビヒクルとして0.9%の塩化ナトリウムを用いた静脈内注入によっても
よい。
異体を投与するために使用し得る。例としては、リポソーム、微粒子、ミクロスフェア(
例えば、PLA/PGAミクロスフェア)などへのカプセル化が挙げられるが、これらに
限定されない。あるいは、膜または繊維を含む、多孔質、非多孔質、またはゲル状物質の
埋め込みを使用してもよい。持続放出系は、ポリマー材料またはマトリックス、例えば、
ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ乳酸、L-グルタミン酸と
エチル-L-グタメート(gutamate)とのコポリマー、エチレン酢酸ビニル、L
UPRON DEPOT(登録商標)等の乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-D
-(-)-3-ヒドロキシブリル酸(hydroxyburyric acid)を含ん
でもよい。本明細書に開示の抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化してもよい。リポ
ソームは、治療薬の哺乳動物への送達に有用な、種々の種類の脂質、リン脂質、及び/ま
たは界面活性剤を含む小型のビヒクルである。本抗体を含むリポソームは、当該技術分野
で既知の方法、例えば、Epstein et al.,1985,Proc Natl
Acad Sci USA,82:3688、Hwang et al.,1980,
Proc Natl Acad Sci USA,77:4030、米国特許第4,48
5,045号、米国特許第4,544,545号、及びPCT WO 97/38731
に記載されているものによって調製される。循環時間が増強したリポソームは、米国特許
第5,013,556号に開示されている。リポソームの成分は、生体膜の脂質配列に似
た二層構成で一般的に配列される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コ
レステロール、及びPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を
含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、定義
された孔径のフィルターを通して押し出されて、所望の直径のリポソームを生む。化学療
法剤または他の治療的に活性な薬剤が任意選択でリポソーム内に含まれる(Gabizo
n et al.,1989,J National Cancer Inst 81:
1484)。
はゼラチンマイクロカプセル、またはポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル
を使用する)、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、
マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル)、ならびにマクロエマルションを
含むがこれらに限定されない方法によって調製されるマイクロカプセル中に封入してもよ
い。かかる技法は、Remington’s Pharmaceutical Scie
nces 16th edition,Osol,A.Ed.,1980に開示されてい
る。持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例としては、マトリックスが
成形品の形態である固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、例えば、フィルムまた
はマイクロカプセルが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、
ヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビ
ニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸
とガンマエチル-L-グルタミン酸塩グタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸
ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢
酸ロイプロリドで構成される注射可能なミクロスフェア)等の分解性乳酸-グリコール酸
コポリマー、ポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸、ならびにポリ-DL-ラクチド-
コ-グリコリド(PLG)のマトリックスに組み込まれた所望の生物活性分子で構成され
るミクロスフェアに基づく送達系であるProLease(登録商標)(Alkerme
sから市販されている)が挙げられる。
に選択される。当該技術分野で既知であるように、タンパク質分解、全身対局所送達、及
び新たなプロテアーゼ合成の速度、ならびに年齢、体重、全体的な健康、性別、食生活、
投与時間、薬物相互作用、及び状態の重症度に対する調整が必要であり得、これは、当業
者によって慣習的な実験を用いて確認可能となる。
、Fc変異体の濃度は、0.003~1.0モルの範囲である。患者を治療するために、
治療有効量の本発明のFc変異体を投与し得る。本明細書における「治療有効量」は、そ
れを投与した目的である効果を生む用量を意味する。正確な用量は治療の目的によること
になり、既知の技法を使用して当業者によって確認可能であろう。投薬量は、体重1kg
当たり0.0001~100mg以上、例えば体重1kg当たり0.1、1、10、また
は50mgの範囲であってもよく、1~10mg/kgが好ましい。
作製後、本発明の抗PVRIG抗体はいくつかの異なる用途における使用を見出す。
本発明の抗PVRIG抗体は、一般にPVRIGと関連する状態を有するヒト対象等の
患者を治療することにおける使用を見出す。「治療」という用語は、本明細書で使用する
場合、本例では癌の治療に関する療法的治療及び予防または予防手段の両方を指すが、以
下でも記載するように、抗体及び薬学的組成物の使用は、感染疾患、敗血症、及び/もし
くは自己免疫状態の治療法、ならびに/または遺伝子療法に続く望ましくない免疫活性化
の阻害も提供する。治療を必要としているものには、既に癌を患っているもの、及び癌が
予防されるべきものが含まれる。よって、本明細書における治療される哺乳動物は、癌を
有すると診断されていてもよく、または癌にかかりやすいかもしくは癌に感受性であって
もよい。本明細書で使用する場合、「治療すること」という用語は、有害な影響を予防す
ること、その発症を遅延させること、治癒すること、逆転すること、減弱させること、軽
減すること、最低限に抑えること、抑制すること、停止させること、または上記の癌性疾
患、障害、もしくは状態の認識可能な症状を安定化することを指す。これは、上記のよう
な癌を管理することも含む。「管理する」は、疾患の重症度を低減すること、疾患の発作
の頻度を低減すること、かかる発作の期間を低減すること、かかる発作の重症度を低減す
ること、癌細胞成長または増殖を遅延させる/低減すること、少なくとも1つの症状の進
行を遅延させること、少なくとも1つの測定可能な身体的パラメータの緩和等を意味する
。例えば、免疫刺激性抗PVRIG免疫分子は、標的細胞、例えば、癌、感染または病原
細胞に対するT細胞またはNKまたはサイトカイン免疫を促進し、それにより、疾患状態
に関与する細胞を枯渇させることによって癌または感染性疾患を治療するはずである。逆
に、免疫抑制性抗PVRIG免疫分子は、自己免疫、炎症、またはアレルギー状態等の一
部の免疫疾患の疾患病理に関与するT細胞もしくはNK活性及び/またはまたは炎症性サ
イトカインの分泌を低減し、それにより、かかる状態と関連し得る疾患病理及び組織破壊
(例えば、リウマチ性関節炎状態と関連する関節破壊)を治療または緩和するはずである
。
形態に従う「治療有効量」の抗PVRIG 免疫分子は、好ましくは、疾患症状の重症度
の減少、無疾患症状期間の頻度及び期間の増加、生存期間の増加、疾患寛解、または疾患
の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害の予防もしくは低減をもたらす。例えば、P
VRIG陽性腫瘍の治療について、「治療有効量」は、好ましくは、治療されていない対
象と比較して、少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、更により好ま
しくは少なくとも約60%、なおより好ましくは少なくとも約80%、細胞成長または腫
瘍成長を抑制する。化合物が腫瘍成長を抑制する能力は、ヒト腫瘍における効能を予測す
る動物モデル系において評価することができる。あるいは、組成物のこの特性は、当業者
に既知のアッセイによって化合物が抑制する能力、かかるインビトロの抑制を検査するこ
とによって評価することができる。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させ
るか、あるいは対象において症状を緩和することができる。
は投与経路などの因子に基づいて、治療有効量を決定することができるであろう。
本発明のPVRIG抗体は、癌の治療において際立った使用を見出す。一般に、本発明
の抗体は、癌性細胞を直接攻撃するというよりは、本発明の抗PVRIG抗体が概してP
VRIGの活性を阻害することによって免疫系を刺激するという点において、免疫調節性
である。このため、腫瘍成長及び発展に不可欠な分子経路を阻害すること、ならびに/ま
たは腫瘍細胞を枯渇させることを目的とする腫瘍標的化療法とは異なり、癌免疫療法は、
患者自身の免疫系を刺激して癌細胞を排除し、息の長い腫瘍破壊を提供することを目的と
する。種々のアプローチを癌免疫療法において使用することができ、腫瘍特異的T細胞応
答を誘導するための治療用癌ワクチン、及び免疫抑制経路を除去するための免疫刺激抗体
(即ち、抑制性受容体の拮抗物質=免疫チェックポイント)がその一部である。
発が起きるため、一過性である傾向にある。しかしながら、過去数年の癌免疫療法の臨床
使用により、この種の療法が永続的な臨床応答を有し得、長期的な生存率に対する劇的な
影響を示すことが示されている。しかしながら、応答は長期的ではあるが、少数の患者し
か応答しない(多数の患者が応答するが応答は一過性である従来のまたは標的化療法とは
対照的)。
ならびに種々の機序及び種々の免疫細胞を通して免疫抑制腫瘍微小環境を創出することに
よって、既に免疫防御系をかいくぐっている。
腫瘍学的機序の性質に起因して、PVRIGは、必ずしも特定の癌の種類上で過剰発現さ
れるか、またはそれと相関する必要はなく、これはつまり、目標は、抗PVRIG抗体に
T細胞及びNK細胞活性化の抑制を解除させて、免疫系が癌を狙うようにすることである
。
い細胞成長)を引き起こす異常かつ無制御な細胞分化を特徴とする任意の腫瘍性疾患(侵
襲性または転移性問わず)を広義に指す。「癌」または「癌性」という用語は、本明細書
で使用する場合、悪性の成長または腫瘍を引き起こす異常かつ無制御な細胞分化を特徴と
する任意の腫瘍性疾患(侵襲性、非侵襲性、転移性を問わず)を包含すると理解されるべ
きであり、その非限定的な例が本明細書に記載される。これは、調節されていない細胞成
長を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的状態を含む。癌の例は、実施例におい
て例示し、本明細書にも記載する。
パ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。かかる癌のよ
り具体的な例には、扁平細胞癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の
扁平上皮癌)、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌(消化管癌を含む)、膵臓癌、膠芽腫、子宮頚
癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または
子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、及び種々の
型の頭頚部癌、ならびにB細胞リンパ腫(低悪性度/濾胞性非ホジキンリンパ腫(NHL
);小リンパ球性(SL)NHL;中悪性度/濾胞性NHL;中悪性度びまん性NHL;
高悪性度免疫芽球性NHL;高悪性度リンパ芽球性NHL;高悪性度小型非開裂細胞性N
HL;巨大病変NHL;マントル細胞リンパ腫;AIDS関連リンパ腫;及びワルデンシ
ュトレームマクログロブリン血症を含む);慢性リンパ球性白血病(CLL);急性リン
パ芽球性白血病(ALL);有毛細胞性白血病;慢性骨髄芽球性白血病;多発性骨髄腫、
ならびに移植後リンパ増殖性障害(PTLD)が含まれる。
またはリンパ性悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。かかる癌のより具体的な
例には、結腸直腸、膀胱、卵巣、黒色腫、扁平細胞癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌
、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌)、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌(消化管癌を含む)、膵
臓癌、膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直
腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺
癌、肝癌、及び種々の型の頭頚部癌、ならびにB細胞リンパ腫(低悪性度/濾胞性非ホジ
キンリンパ腫(NHL);小リンパ球性(SL)NHL;中悪性度/濾胞性NHL;中悪
性度びまん性NHL;高悪性度免疫芽球性NHL;高悪性度リンパ芽球性NHL;高悪性
度小型非開裂細胞性NHL;巨大病変NHL;マントル細胞リンパ腫;AIDS関連リン
パ腫;及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む);慢性リンパ球性白血病
(CLL);急性リンパ芽球性白血病(ALL);有毛細胞性白血病;慢性骨髄芽球性白
血病;及び移植後リンパ増殖性障害(PTLD)、ならびに母斑症に関連する異常な血管
増殖、浮腫(脳腫瘍に関連する浮腫など)、及びメイグス症候群が含まれる。好ましくは
、癌は、結腸直腸癌、乳癌、直腸癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫(NHL)、腎
臓細胞癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、軟組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌腫、頭
頚部癌、黒色腫、卵巣癌、中皮腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。例とな
る実施形態では、癌は、早期または末期(転移性を含む)膀胱、卵巣、または黒色腫であ
る。別の実施形態では、癌は結腸直腸癌である。本発明の治療に適した癌性状態には、P
VRIGを発現するかまたは発現しない癌が含まれ、更に、非転移性または非侵襲性癌な
らびに侵襲性または転移性癌が含まれ、これらにおいては、免疫、間質、または病変細胞
によるPVRIG発現が抗腫瘍応答及び抗侵襲性免疫応答を抑制する。本発明の方法は、
血管新生腫瘍の治療に特に好適である。
剰発現し、かつ/または腫瘍リンパ球浸潤と相関する(CD3、CD4、CD8、及びP
D-1発現との相関によって示される)ため、任意の癌の治療に有用であり、これらの癌
には、前立腺癌、肝臓癌(HCC)、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、
胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、肺癌、黒色腫、非黒色腫皮
膚癌(扁平及び基底細胞癌)、神経膠腫、腎臓癌(RCC)、リンパ腫(非ホジキンリン
パ腫(NHL)及びホジキンリンパ腫(HD))、急性骨髄性白血病(AML)、)、T
細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、精巣胚
細胞腫瘍、中皮腫、及び食道癌が含まれるが、これらに限定されない。
の1つ以上を緩和する任意の方法を指す。典型的には、かかる療法は、免疫刺激性抗PV
RIG抗体(抗原結合断片を含む)を、単独で、あるいは化学療法もしくは放射線療法、
または他の生物製剤との組み合わせで、その活性を強化するために、即ち、PVRIGの
発現が抗腫瘍応答及び化学療法もしくは放射線療法の効能または生物製剤の効能を抑制す
る個体において、投与することを含むことになる。
当該技術分野で既知であるように、疾患状態に特異的な、免疫療法標的を標的化する治
療用抗体及び追加の治療薬を含む併用療法は、極めて有望である。例えば、免疫療法の分
野では、抗PD-1のような免疫腫瘍抗体による化学療法剤(小分子薬または抗腫瘍抗体
のいずれか)を使用するため、本明細書で概説する抗PVRIG抗体が同じように置き換
えられ得る、いくつかの有望な併用療法が存在する。抗癌活性を呈する任意の化学療法剤
を本発明に従って使用することができ、種々の非限定的な例は本明細書に記載されている
。
疫チェックポイント妨害が、強力な抗腫瘍免疫応答が既に存在するときにのみ、経路の妨
害時に「解放(unleash)」されることになる腫瘍退縮を誘導することを主張する
。しかしながら、大部分の患者及び腫瘍型においては、図1に示すように、内因性抗腫瘍
免疫応答が弱いため、免疫チェックポイント妨害を有効にするために抗腫瘍免疫の誘導が
必要とされる。本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、PVRIG特異的抗体、抗
体断片、コンジュゲート、及びそれを含む組成物が、併用療法の癌免疫療法において全て
の型の癌の治療に使用される。
療薬の投与に限定されない。その代わり、これらの用語は、抗PVRIG抗体及び他の薬
剤(単数または複数)が、それらが共に作用して、本発明の抗PVRIG抗体または他の
薬剤(単数または複数)のいずれかのみによる治療と比較して増加した利益を提供するよ
うに、連続してある時間間隔内で投与されることを意味する。抗PVRIG抗体及び他の
薬剤(単数または複数)は相加的に作用することが好ましく、またそれらは相乗的に作用
することが特に好ましい。かかる分子は、意図する目的に効果的な量で組み合わせて存在
するのが好適である。熟練した医師であれば、経験的に、または薬剤の薬物動態及び作用
様式を考慮することによって、各治療薬の適切な用量(単数または複数)、ならびに投与
の適切なタイミング及び方法を決定することができる。
得る。追加の治療レジメンまたは薬剤を使用して、抗PVRIG抗体の効能または安全性
を改善し得る。また、追加の治療レジメンまたは薬剤を使用して、PVRIG抗体の作用
を改変するのではなく、同じ疾患または併存疾患を治療してもよい。例えば、本発明のP
VRIG抗体は、化学療法、放射線療法、または化学療法と放射線療法の両方と共に患者
に投与してもよい。
ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤、免疫刺激剤、免疫抑制剤、血
液細胞の増殖を促進する薬剤、血管新生抑制剤、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)
抑制剤、または他の治療薬を含むがこれらに限定されない、1つ以上の他の予防または治
療薬と組み合わせて投与してもよい。
分野で既知の標準のいずれかと組み合わせて使用し得る(例えば、http://www
.cancerで見出すことができる通り)。
剤、他の化合物もしくは免疫療法、または免疫刺激戦略と組み合わせた抗PVRIG抗体
を含み得る。腫瘍ワクチン、養子T細胞療法、Treg枯渇、抗体(例えば、ベバシズマ
ブ、エルビタックス)、ペプチド、ペプチボディ、小分子、細胞傷害及び細胞増殖抑制薬
剤などの化学療法剤(例えば、パクリタキセル、シスプラチン、ビノレルビン、ドセタキ
セル、ゲムシタビン、テモゾロミド、イリノテカン、5FU、カルボプラチン)、インタ
ーフェロン及びインターロイキン等の免疫修飾薬、免疫刺激抗体、成長ホルモンまたは他
のサイトカイン、葉酸、ビタミン、ミネラル、アロマターゼ阻害剤、RNAi、ヒストン
デアセチラーゼ阻害薬、プロテアソーム阻害剤、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、
シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、及びそれ自体では
患者にとって毒性または準毒性であるレベルでしか有効ではないシクロホスファミドヒド
ロキシウレアが含まれるが、これらに限定されない。シスプラチンは、4週間に1回、1
00mg/用量として静脈内投与され、アドリアマイシンは、21日ごとに1回、60~
75mg/用量mlとして静脈内投与される。
ることができる治療薬は、抗腫瘍応答を増強する他の増強剤、例えば、他の抗免疫チェッ
クポイント抗体、または内因性抗腫瘍応答を増加させるように主に調節される他の増強剤
、例えば、放射線療法、寒冷療法、抗腫瘍免疫応答を増強する従来的/伝統的な化学療法
、抗腫瘍免疫応答を増強する標的化療法、抗血管新生療法、Treg及びMDSC等の免
疫抑制細胞を標的化する治療薬、免疫刺激抗体、サイトカイン療法、治療用癌ワクチン、
養子細胞移入である。
スホスホネート、特にアミノ-ビスホスホネート(ABP)と組み合わせて使用される。
ABPと関連する活性の一部は、不活性及び適応免疫の界面をまたぎ、強力な抗腫瘍活性
を有するヒトγδT細胞にある。
ェクター機序を従事させることによって、腫瘍特異的免疫応答を刺激することできる(G
alluzzi et al,2012,Nature Reviews-Drug d
iscovery,Volume 11,pages 215-233)。
わせるための薬剤として使用される標的化療法は、本明細書に記載の通りである。
レッサー細胞(MDSC)等の調節性免疫抑制細胞を標的化する治療薬と組み合わせて使
用される。いくつかの一般に使用される化学療法剤は、Tregの非特異的な標的化をも
たらし、TregまたはMDSCの数または免疫抑制能力を低減する(Facciabe
ne A.et al 2012 Cancer Res;72(9)2162-71、
Byrne WL.et al 2011,Cancer Res.71:691520
、Gabrilovich DI.and Nagaraj S,Nature Rev
iews 2009 Volume 9,pages 162-174)。この点で、一
部の化学療法薬によるメトロノーム療法は、調節細胞の変調を介して、免疫抑制効果では
なく免疫刺激をもたらす。このため、本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、癌免
疫療法のための抗PVRIG 免疫分子は、非限定的に、シクロホスファミド、ゲムシタ
ビン、ミトキサントロン、フルダラビン、フルダラビン、ドセタキセル、パクリタキセル
、サリドマイド、サリドマイド誘導体から選択される薬物と組み合わせて使用される。
て使用され、これは、1)抗CD25 mAbであるダクリズマブ、バシリキシマブ等の
、Treg細胞表面受容体の認識を通してTregを直接標的化する枯渇または殺傷抗体
、あるいは2)デニロイキンジフチトクス(Ontak)(ヒトIL-2とジフテリア毒
素との融合タンパク質)、またはLMB-2(CD25に対するscFvと緑膿菌外毒素
との間の融合)等のリガンド標的化毒素、ならびに3)CTLA4、PD-1、OX40
、及びGITR等の抗体標的化Treg細胞表面受。容体、あるいは4)これまでに特定
したものなどの他のNK受容体を標的化する抗体、小分子、または融合タンパク質を含む
む;エクトヌクレオチダーゼ阻害剤またはA2Aアデノシン受容体の阻害剤等のアデノシ
ン作用(adenosinergic)経路に干渉する薬剤;フレソリムマブ(fres
olimumab)、レルデリムマブ(lerdelimumab)、メテリムマブ(m
etelimumab)、トラベデルセン、LY2157299、LY210976等の
TGF-β阻害剤;CCR4/CCL2/CCL22 経路等のケモカイン受容体阻害剤
を含む腫瘍組織へのTreg補充の妨害を含む、Treg誘導及び/または機能を分断す
るための選択肢のうちのいずれかと併用される。
キシゲナーゼ)阻害剤等の免疫抑制活性を発揮するサイトカイン及び酵素の阻害剤;IL
-10、IL-35、IL-4、及びIL-13等の免疫抑制性微小環境を促進する抗炎
症性サイトカインの阻害剤;Tregを低減しDCの分化を促すBevacizumab
(登録商標)を含む、免疫抑制性腫瘍微小環境を阻害する選択肢のうちのいずれかと併用
される。
ン酸(ATRA)等の、ビタミンD3、またはビタミンA代謝産物による抑制機能を有し
ない成熟骨髄細胞へのその分化を促進すること;COX2阻害剤、シルデナフィルのよう
なホスホジエステラーゼ5阻害剤、ニトロアスピリン等のROS阻害剤によるMDSC抑
制活性の抑制を含む、MDSC(骨髄由来抑制細胞)を標的化するための選択肢のうちの
いずれかと併用される。
強する他の薬剤と併用される(Pardoll J Exp Med.2012;209
(2):201-209)。免疫刺激抗体は、免疫機能を直接調節することによって、即
ち、他の抑制標的を妨害することによって、または免疫刺激タンパク質を増強することに
よって、抗腫瘍免疫を促進する。本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、癌免疫療
法のための抗-PVRIG免疫分子は、イピリムマブ、トレメリムマブ等の抗CTLA4
mAb;ニボルマブBMS-936558/MDX-1106/ONO-4538、A
MP224、CT-011、MK-3475等の抗PD-1、BMS-936559/M
DX-1105、MEDI4736、RG-7446/MPDL3280A等の抗PDL
-1拮抗物質;IMP-321等の抗LAG-3)、抗TIM-3、抗BTLA、抗B7
-H4、抗B7-H3、抗VISTA;CP-870,893、ルカツムマブ、ダセツズ
マブ等の抗CD40 mAbを含む、免疫刺激タンパク質を標的化する作用抗体;BMS
-663513ウレルマブ、PF-05082566等の抗CD137 mAb;抗OX
40等の抗OX40 mAb;TRX518等の抗GITR mAb;CDX-1127
等の抗CD27 mAb;ならびに抗ICOS mAbを含む、追加の免疫チェックポイ
ントを標的にする拮抗抗体と併用される。
トカインは、なかでもIL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL
-18及びIL-21、IL-23、IL-27、GM-CSF、IFNα(インターフ
ェロン α)、IFNβ、ならびにIFNγを含む、癌免疫療法のための抗腫瘍免疫応答
を増強する薬剤として臨床前または臨床開発中である。しかしながら、療法の効能は、深
刻な副作用及び不良な薬物動態特性によって阻まれる場合が多い。このため、サイトカイ
ンの全身投与に加えて、抗体-サイトカイン融合分子(免疫サイトカイン)、ポリエチレ
ングリコールへの化学的共役(PEG化)、自己全腫瘍細胞におけるサイトカインの形質
転換発現、サイトカイン遺伝子のDNAワクチンへの組み込み、サイトカイン遺伝子を送
達するための組み換えウイルスベクター等を含む、治療用サイトカインの送達及びその腫
瘍部位への局在化のための種々の戦略を、その薬物動態ならびにその効能及び/または毒
性を改善するために用い得る。免疫サイトカインの場合には、サイトカインの腫瘍特異的
抗体または抗体断片への融合により、標的化した送達、それにより改善した効能及び薬物
動態、ならびに低減した副作用が可能となる。
は、T細胞の改善した下準備、及び改善した抗原提示を可能にし、抗腫瘍免疫応答を増強
するための治療薬として使用することができる(Mellman I.et al.,2
011,Nature,480:22-29、Schlom J,2012,J Nat
l Cancer Inst;104:599-613)。
ば以下のものが含まれる。
注射して腫瘍細胞における抗原に対する免疫応答を誘導する、全腫瘍細胞ワクチン。この
腫瘍細胞ワクチンは、同種、即ち、患者自身の腫瘍であるか、または所与の腫瘍型の2つ
または3つの確立された特性評価されたヒト腫瘍細胞株であり得、これは例えば、GVA
Xワクチンプラットフォームである。
)、通常はタンパク質またはペプチドを、投与する(場合により、アジュバントと共に、
及び/または免疫調節剤もしくはGM-CSF等の樹状細胞の誘引剤と共に)、腫瘍抗原
ワクチン。この腫瘍抗原はある特定の種類の癌に特異的であり得るが、これらは特定の患
者用に作製されるものではない。
するための抗原の安定した供給を提供する方法として使用することができる。腫瘍抗原を
コードするベクターは患者に注射され(場合により、炎症性または他の誘引剤、例えばG
M-CSFと共に)、インビボで細胞によって取り込まれて、その後所望の免疫応答を誘
発し得る特異的抗原を作製する。ベクターを使用して、一度に1つ超の腫瘍抗原を送達し
て免疫応答を増加させ得る。加えて、組み換えウイルス、細菌、または酵母菌ベクターは
、それら自体の免疫応答をトリガするはずであり、これは、全体的な免疫応答も増強させ
得る。
OncoVex/T-VEC等の腫瘍溶解性ウイルスワクチン。GM-CSFを発現する
ようにも操作されるこのウイルスは、癌細胞の内部で複製して、その溶解を引き起こし、
新たなウイルス及び数々の腫瘍抗原を放出し、その過程でGM-CSFを分泌する。この
ため、かかる腫瘍溶解性ウイルスワクチンは、腫瘍微小環境においてDCの機能を増強し
て、抗腫瘍免疫応答を刺激する。
Nat.Rev.Cancer,12(4):265-277):樹状細胞(DC)、貧
食腫瘍細胞、及び腫瘍特異的T細胞に対する本腫瘍抗原。このアプローチでは、DCを、
癌患者から単離し、腫瘍特異的T細胞の提示のために準備する。このためには、いくつか
の方法を使用することができる:DCに腫瘍細胞または溶解物を充填する;DCに腫瘍抗
原の融合タンパク質またはペプチドを重点する;腫瘍抗原のDC標的化mAbへの結合。
DCを刺激因子(GM-CSF等)の存在下で処理し、エクスビボで活性化し成熟させた
後、癌細胞への免疫応答を誘発するために患者に再度注入し戻す。樹状細胞は、刺激性サ
イトカイン(GM-CSF等)を分泌するように操作した、照射した全腫瘍細胞を注射す
ることによって、インビボで準備することもできる。同様のアプローチを、単球を用いて
実行することができる。進行性前立腺癌の治療のために認可されている治療用癌ワクチン
Sipuleucel-T(Provenge)が樹状細胞ワクチンの一例である。
細胞の拡大、続いてこれを癌患者に養子導入し戻すことを伴う、養子T細胞療法または養
子細胞移入(ACT)と併用される(Restifo et al,2013,Canc
er Immunol.Immunother.62(4):727-36(2013)
Epub Dec 4 2012)。エクスビボ拡大後に患者に注入し戻された細胞は、
腫瘍へと促され、その破壊を媒介する。この養子移入の前に、宿主を放射線及び/または
化学療法によって免疫枯渇させ得る。リンパ枯渇、養子細胞移入、及びT細胞成長因子(
IL-2等)の組み合わせは、腫瘍患者における長期の腫瘍根絶につながり得る。より新
規のアプローチは、腫瘍関連抗原への特異性を付与するための正常な末梢血T細胞のエク
スビボの遺伝子修飾を伴う。例えば、抗腫瘍応答が特に良好であるT細胞のTCRのクロ
ーンをウイルス発現ベクターに挿入し、治療される患者由来の自己T細胞を感染させるた
めに使用し得る。別の選択肢は、Tボディとしても知られる本質的にキメラの免疫グロブ
リン-TCR分子であるキメラ抗原受容体(CAR)の使用である。CARは、抗体様特
異性を有し、T細胞を活性化することができるTCR細胞内ドメイン上にグラフティング
される標的細胞の表面上のMHC非制限的構造(細胞外標的結合モジュール)を認識する
(Restifo et al Cancer Immunol.Immunother
.62(4):727-36(2013)Epub Dec 4 2012、及びShi
et al,Nature 493:111-115 2013)。
る。組成物は、薬剤(免疫複合体として)に結合させることができ、または薬剤とは別に
投与することができる。後者の場合(個別投与)、組成物は、薬剤の前、後、または薬剤
と同時に投与することができ、あるいは他の既知の療法、例えば、抗癌療法、例えば、放
射線と一緒に共投与することができる。
との共投与は、ヒト腫瘍細胞への細胞傷害効果を生む異なる機序によって動作する2つの
抗癌剤を提供する。かかる共投与は、薬物への耐性の発現または腫瘍細胞の抗原性の変化
(抗体と非反応性にし得る)に起因する問題を解決し得る。他の実施形態では、対象を、
例えば、対象をサイトカインで治療することによって、FcyまたはFcy受容体の発現
または活性を調節する、例えば、強化または阻害する薬剤で更に治療し得る。
物(例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子)に結合したエフェクター細胞も、
治療薬として使用することができる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファー
ジ、好中球、または単球等のヒト白血球であり得る。他の細胞には、好酸球、ナチュラル
キラー細胞、及び他のIgG-またはIgA-受容体保持細胞が含まれる。所望の場合、
エフェクター細胞は、治療される対象から得ることができる。標的特異的エフェクター細
胞は、生理学的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与することができる。投与す
る細胞の数は、10-8~10-9程度であり得るが、治療目的に応じて変動することに
なる。一般に、量は、標的細胞、例えば、PVRIGタンパク質を発現している腫瘍細胞
での局在を得るため、及び例えば、貧食による細胞殺傷を生じさせるために十分な量とな
る。投与経路も異なり得る。
併せて行うことができる。例えば、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う組成物(例
えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子)及び/またはこれらの組成物を持ったエ
フェクター細胞を使用する抗腫瘍療法を、化学療法と併せて使用することができる。加え
て、併用免疫療法を使用して、2つの明確に異なる細胞傷害性エフェクター集団を腫瘍細
胞拒絶に向けてもよい。例えば、抗Fc-γRIまたは抗CD3に結合した抗PVRIG
免疫分子を、IgG-またはIgA-受容体特異的結合因子と併せて使用してもよい。
面上の受容体のキャッピング及び除去等によってエフェクター細胞上のFcγRまたはF
cγRレベルを調節するために使用することもできる。抗Fc 受容体の混合物もこの目
的に使用できる。
結合部位を有する、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う治療用組成物(例えば、ヒ
ト抗体、代替的骨格多特異性及び二重特異性分子、ならびに免疫複合体)も、補体の存在
下で使用することができる。一実施形態では、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う
結合因子及び適切なエフェクター細胞による標的細胞を含む細胞の集団のエクスビボ治療
は、補体、または補体を含む血清の添加によって補完される。本発明の少なくとも一部の
実施形態に従う結合因子でコーティングした標的細胞の貧食は、補体タンパク質の結合に
よって改善させ得る。別の実施形態では、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う組成
物(例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子)でコーティングした標的細胞は、
補体によって溶解され得る。更に別の実施形態では、本発明の少なくとも一部の実施形態
に従う組成物は補体を活性化しない。
格多特異性及び二重特異性分子、ならびに免疫複合体)は、補体と一緒に投与することも
できる。このため、本発明の少なくとも一部の実施形態に従うと、ヒト抗体、多特異性ま
たは二重特異性分子、及び血清または補体を含む組成物が存在する。これらの組成物は、
補体が、ヒト抗体、多特異性または二重特異性分子に近接して位置する点で有利である。
あるいは、ヒト抗体、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う多特異性または二重特異
性分子、及び補体または血清は、個々に投与することができる。
するものとして使用することができる。中和抗体(Nab)は、特定の抗原に結合してそ
れを中和するかまたは阻害することによって、その生物学的効果を阻害することができる
抗体である。。NAbは、その活性に必要な重要な表面分子を妨害することか、または標
的細胞上のその受容体への薬剤の結合に干渉することによって、薬剤の生物学的活性を部
分的または完全に無効にする。
T細胞活性の病理的抑制を予防することができる。
に/または治療薬のうちのいずれかを含み、薬学的に許容される希釈剤または担体を更に
含む、有効量の治療薬及び/もしくは薬学的組成物のうちのいずれか1つを、それを必要
とする対象に投与することによって免疫刺激を促進するための方法を提供する。
たはエクスビボで接触させて、免疫応答を調節することができる。治療薬と接触させるT
細胞は、α/β及びγ/δT細胞受容体を含むT細胞受容体を発現する任意の細胞である
ことができる。T細胞には、CD4及びCDSも発現するT細胞サブセットを含む、CD
3を発現する全ての細胞を含む。T細胞には、ナイーブ及びメモリー細胞とCD8+細胞
傷害性Tリンパ球(CTL)等のエフェクター細胞との両方が含まれる。T細胞には、T
h1、Tc1、Th2、Tc2、Th3、Th9、Th17、Th22、Treg、濾胞
ヘルパー細胞(TFH)、及びTr1細胞等の細胞も含まれる。T細胞は、iNKT、α
/βNKT及びγ/δNKT細胞といったNKT細胞、ならびに同様の固有クラスのT細
胞系列も含まれる。
細胞を標的とさせる二重特異性抗体と併用することができる(例えば、米国特許第5,9
22,845号及び同5第,837,243号を参照)。二重特異的抗体を使用して、2
つの別々の抗原を標的にすることができる。例えば、抗Fc 受容体/抗腫瘍抗原(例え
ば、Her-2/neu)二重特異性抗体は、マクロファージに腫瘍部位を標的とさせる
ために使用されている。この標的化は、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化し得る。こ
れらの応答のT細胞アームは、PVRIG妨害の使用によって増補され得る。あるいは、
抗原は、腫瘍抗原及び樹状細胞特異的細胞表面マーカーと結合する二重特異性抗体の使用
によってDCに直接送達してもよい。
によって発現され、免疫抑制性であるタンパク質の不活性化によって克服され得る。これ
らには、なかでも、TGF-β(Kehrl,J.et al.(1986)J.Exp
.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard,M.&O’Ga
rra,A.(1992)Immunology Today 13:198-200)
、及びFasリガンド(Hahne,M.et al.(1996)Science 2
74:1363-1365)が含まれる。これらの実体の各々に対する抗体を抗PVRI
Gと併用して、免疫抑制剤の影響に対抗し、宿主による腫瘍免疫応答を促し得る。
とができる。これらには、DC機能及び抗原提示を活性化する樹状細胞の表面上の分子が
含まれる。抗CD40抗体は、T細胞ヘルパー活性を効果的に置き換えることができ(R
idge.J.et al.(1998)Nature 393:474-478)、P
VRIG抗体と併用することができる(Ito,N.et al.(2000)Immu
nobiology 201(5)527-40)。OX-40(Weinberg,A
.et al.(2000)Immunol 164:2160-2169)、4-1B
B(Melero,I.et al.(1997)Nature Medicine 3
:682-685(1997)、及びICOS(Hutloff,A.et al.(1
999)Nature 397:262-266)等のT細胞共刺激分子に対する抗体、
ならびにCTLA-4(例えば、米国特許第5,811,097号、インプリムマブ(i
mplimumab))またはBTLA(Watanabe,N.et al.(200
3)Nat Immunol 4:670-9)、B7-H4(Sica,G L et
al.(2003)Immunity 18:849-61)PD-1等の負の共刺激
分子の活性を妨害する抗体の活性化は、T細胞活性化レベルの増加も提供し得る。
造血起源の種々の腫瘍を治療するために、骨髄移植が現在使用されている。移植片対宿主
病はこの治療の結果であるが、治療的利益が移植片対腫瘍応答から得られる場合がある。
PVRIG妨害を使用して、ドナーに移植された腫瘍特異的T細胞の有効性を増加させる
ことができる。
胞の拡大及びこれらの細胞のレシピエントへの養子移入を伴う実験的治療プロトコルもい
くつかある(Greenberg,R.&Riddell,S.(1999)Scien
ce 285:546-51)。これらの方法は、CMV等の感染因子へのT細胞応答を
活性化するためにも使用し得る。抗PVRIG免疫分子の存在下でのエクスビボの活性化
は、養子移入されたT細胞の頻度及び活性を増加させることが予期され得る。
ク質、ペプチド、及び炭水化物分子)、細胞、及び免疫刺激サイトカインをコードする遺
伝子でトランスフェクトした細胞(He et al(2004)J.Immunol.
173:4919-28)等の免疫原性剤と組み合わせることができる。使用できる腫瘍
ワクチンの非限定的な例としては、結腸癌の治療のためのMUC1のペプチド、ペプチド
s of 卵巣癌の治療のためのMUC-1/CEA/TRICOMのペプチド、または
サイトカインGM-CSFを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞(以下で更に
考察する)が挙げられる。
G妨害によるT細胞活性化の閾値を上げることによって、宿主における腫瘍応答が活性化
されると期待され得ることが予期される。
能性が高い。腫瘍に対するワクチン接種のための多くの実験的戦略が考案されている(R
osenberg,S.,2000,Development of Cancer V
accines,ASCO Educational Book Spring:60-
62、Logothetis,C.,2000,ASCO Educational B
ook Spring:300-302、Khayat,D.2000,ASCO Ed
ucational Book Spring:414-428、Foon,K.200
0,ASCO Educational Book Spring:730-738を参
照;また、Restifo,N.and Sznol, M.,Cancer Vacc
ines,Ch.61,pp.3023-3043 in DeVita,V.et a
l.(eds.),1997,Cancer:Principles and Prac
tice of Oncology.Fifth Editionを参照)。これらの戦
略のうちの1つでは、ワクチンは、自己または同種腫瘍細胞を使用して調製される。これ
らの細胞ワクチンは、腫瘍細胞がGM-CSFを発現するように形質導入されるときに最
も効果的であることが示されている。GM-CSFは、腫瘍ワクチン接種のための抗原提
示の強力な活性化因子であることが示されている(Dranoff et al.(19
93)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90:3539-43)。
特異的抗原の定義につながった(Rosenberg,S A(1999)Immuni
ty 10:281-7)。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、腫瘍において及び
腫瘍が生じた細胞において発現される分化抗原、例えば、メラニン細胞抗原gp100、
MAGE抗原、及びTrp-2である。より重要なことに、これらの抗原の多くは、宿主
中で見出される腫瘍特異的T細胞の標的であることが示され得る。PVRIG妨害は、こ
れらのタンパク質への免疫応答を生成するために、腫瘍中で発現される組み換えタンパク
質及び/またはペプチドのコレクションと併用してもよい。これらのタンパク質は、通常
、免疫系によって自己抗原と見なされるため、それに耐性である。腫瘍抗原はまた、タン
パク質テロメラーゼを含んでもよく、これは、染色体のテロメアの合成に必須であり、ヒ
ト癌の85%超において、限定数の体細胞組織中でのみ発現される(Kim,N et
al.(1994)Science 266:2011-2013)。(これらの体細胞
組織は、種々の手段によって免疫攻撃から保護され得る)。腫瘍抗原はまた、2つの無関
係の配列間でタンパク質配列を改変するかもしくは融合タンパク質を創出する体細胞突然
変異(即ち、フィラデルフィア染色体におけるbcr-ab1)、またはB細胞腫瘍から
のイディオタイプを原因として、癌細胞中で発現される「新生抗原」であり得る。
V)、及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス(KHSV)等のヒト癌に関係するウイルスから
のタンパク質を含み得る。PVRIG妨害と併用され得る腫瘍特異的抗原の別の形態は、
腫瘍組織自体から単離された精製された熱ショックタンパク質(HSP)である。これら
の熱ショックタンパク質は、腫瘍細胞由来のタンパク質の断片を含み、かつこれらのHS
Pは、腫瘍免疫の励起のための抗原提示細胞への送達において極めて効率的である(Su
ot,R&Srivastava,P(1995)Science 269:1585-
1588、Tamura,Y.et al.(1997)Science 278:11
7-120)。
原提示細胞である。DCは、エクスビボで産生させ、種々のタンパク質及びペプチド抗原
、ならびに腫瘍細胞抽出物を充填することができる(Nestle,F.et al.(
1998)Nature Medicine 4:328-332)。DCはまた、これ
らの腫瘍抗原を発現するように遺伝子的手段によって形質導入してもよい。また、DCは
、免疫付与を目的として腫瘍細胞に直接融合されている(Kugler,A.et al
.(2000)Nature Medicine 6:332-336)。ワクチン接種
の方法として、DC免疫付与をPVRIG妨害と効果的に組み合わせて、より強力な抗腫
瘍応答を活性化してもよい。
トとしての使用:
るが、腫瘍細胞によって発現される自己抗原と関連する耐性機序等のいくつかの困難及び
制限に直面する。B7.1(CD80)及びB7.2(CD86)等の共刺激分子は、動
物モデルにおける遺伝子系及び細胞系ワクチンの効能を改善させており、臨床試験におい
てアジュバントとして調査中である。このアジュバント活性は、共刺激シグナルの増強に
よって、または腫瘍細胞によって発現される負の共刺激因子によって発信される抑制シグ
ナルの妨害によって達成することができる(Neighbors et al.,200
8 J Immunother.;31(7):644-55)。
異的な、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体及び/または抗原結合断片及び/ま
たはそれを含むコンジュゲート、ならびに/あるいは代替的骨格のうちのいずれか1つを
、癌ワクチン接種のためのアジュバントとして使用することができる。少なくとも一部の
実施形態に従うと、本発明は、PVRIGタンパク質のいずれか1つに特異的な、ポリク
ローナルもしくはモノクローナル抗体及び/または抗原結合断片及び/またはそれを含む
コンジュゲート、ならびに/あるいは代替的骨格のうちのいずれか1つを、有効量で患者
に投与することを含む、TAAに対する免疫付与を改善させるための方法を提供する。
いて行うためのPVRIG抗体の使用を提供する:(a)炎症促進性サイトカインの上方
調節;(b)T細胞増殖の増加及び/または拡大;(c)T細胞によるインターフェロン
-γまたはTNF-α産生の増加;(d)IL-2分泌の増加;(e)抗体応答の刺激;
(f)癌細胞成長の阻害;(g)抗原特異的T細胞免疫の促進;(h)CD4+及び/ま
たはCD8+T細胞活性化の促進;(i)T細胞抑制の軽減;(j)NK細胞活性の促進
;(k)癌細胞のアポトーシスまたは溶解の促進;及び/または(l)癌細胞に対する細
胞傷害性または細胞増殖抑制性。
ための、本発明の少なくとも一部の実施形態に従う免疫刺激抗体、抗原結合断片、または
そのコンジュゲート(任意選択で薬学的組成物中で)の使用を提供する。
以下の効果のうちの少なくとも1つを媒介する。
せる、(iii)細胞傷害性T細胞活性を増加させる、(iv)NK及び/またはNKT
細胞活性を増加させる、(v)αβ及び/またはγδT細胞抑制を軽減させる、(vi)
炎症促進性サイトカイン分泌を増加させる、(vii)IL-2分泌を増加させる;(v
iii)インターフェロン-γ産生を増加させる、(ix)Th1応答を増加させる、(
x)Th2応答を減少させる、(xi)調節T細胞(Treg)の少なくとも1つの細胞
数及び/または活性化を減少させるかまたは排除する。
概して、本発明の抗PVRIG抗体は、癌を患う患者に投与され、効能は、本明細書に
記載するいくつかの方法で評価される。このため、例えば、癌量、腫瘍のサイズ、転移の
存在または程度の評価などの効能の標準的なアッセイを実行しながら、免疫腫瘍学的治療
を免疫状態評価に基づいて評価することもできる。これは、インビトロ及びインビボアッ
セイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。例えば、腫瘍組織量、サイズ、侵
襲性、LN関与、転移等といった「古典的な」測定と併せて、免疫状態の変化の評価(例
えば、ipi治療後のICOS+CD4+T細胞の存在)を行うことができる。このため
、以下のいずれかまたは全てを評価することができる:CD4+T細胞活性化もしくは増
殖、CD8+T(CTL)細胞活性化もしくは増殖、CD8+T細胞媒介性細胞傷害性活
性及び/もしくはCTL媒介性細胞枯渇、NK細胞活性及びNK媒介性細胞枯渇に対する
PVRIGの抑制効果、Treg細胞分化及び増殖ならびにTreg-もしくは骨髄由来
サプレッサー細胞(MDSC)媒介性免疫抑制もしくは免疫耐性に対するPVRIGの増
強効果、ならびに/または免疫細胞による炎症性サイトカイン産生、例えば、Tもしくは
他の免疫細胞によるIL-2、IFN-γ、もしくはTNF-α産生に対するPVRIG
の影響。
のKi67細胞内染色、及び3H-チミジン組み込み法を使用して、免疫細胞増殖を評価
することによって行われる。
D1、GITR、OX40、及びCD107Aの表面発現によって測定される細胞脱顆粒
のうちの1つ以上を含む、遺伝子発現の増加または活性化関連マーカーの増加したタンパ
ク質レベルを評価することによって行われる。
Goodkind et al.,Computers and Chem.Eng.2
9(3):589(2005)、Han et al.,Bioinform.Biol
.Insights 11/15/15 9(Suppl.1):29-46、Camp
o et al.,Nod.Pathol.2013 Jan、26 suppl.1:
S97-S110を参照されたい。これらの遺伝子発現測定技法は、参照により明示的に
本明細書に組み込まれる。
例えば、Wang et al.,Recent Advances in Capil
lary Electrophoresis-Based Proteomic Tec
hniques for Biomarker Discovery,Methods.
Mol.Biol.2013:984:1-12、Taylor et al,BioM
ed Res.Volume 2014,Article ID 361590,8 p
ages,Becerk et al.,Mutat.Res 2011 June 1
7:722(2):171-182を参照されたい。これらの測定技法は、参照により明
示的に本明細書に組み込まれる。
透過性、細胞接着、ATP産生、補酵素産生、及びヌクレオチド取り込み活性等の多数の
細胞パラメータを推測することを通した標的細胞生存検出によって測定される細胞傷害性
活性を評価することによって行われる。これらのアッセイの特定の例としては、トリパン
ブルーまたはPI染色、51Crまたは35S放出法、LDH活性、MTT及び/または
WSTアッセイ、カルセイン-AMアッセイ、発光系アッセイ、ならびに他のものが挙げ
られるが、これらに限定されない。
を評価することによって行われ、周知の技法を使用して、IFNγ、TNFα、GM-C
SF、IL2、IL6、IL4、IL5、IL10、IL13を含むがこれらに限定され
ないサイトカインを使用して、培養上清液中で細胞内のいずれかで測定する。
ことができる:(i)免疫応答を増加させる、(ii)αβ及び/またはγδT細胞の活
性化を増加させる、(iii)細胞傷害性T細胞活性を増加させる、(iv)NK及び/
またはNKT細胞活性を増加させる、(v)αβ及び/またはγδT細胞抑制を軽減させ
る、(vi)炎症促進性サイトカイン分泌を増加させる、(vii)IL-2分泌を増加
させる;(viii)インターフェロン-γ産生を増加させる、(ix)Th1応答を増
加させる、(x)Th2応答を減少させる、(xi)調節T細胞(Treg)の少なくと
も1つの細胞数及び/または活性化を減少させるかまたは排除する。
一部の実施形態では、T細胞活性化は、実施例23に記載のように、混合リンパ球反応
(MLR)アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適
切な増加を以下に概説する。
脱リン酸化によって、または他の翻訳後修飾を測定することによって測定される免疫応答
の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以
下に概説する。
または増殖によって、または例えば、CD137、CD107a、PD1等のような活性
化マーカーの発現の変化によって測定される、αβ及び/またはγδT細胞の活性化の増
加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に
概説する。
胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、ま
たは例えば、CD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化
によって測定される、細胞傷害性T細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は
免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えば、CD10
7a等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、NK及び/またはNK
T細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切
な増加を以下に概説する。
または増殖によって、または例えば、CD137、CD107a、PD1等のような活性
化マーカーの発現の変化によって測定される、αβ及び/またはγδT細胞抑制の増加ま
たは減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説
する。
Luminexによって、またはMultiplexビーズ系方法によって、または細胞
内染色及びFACS解析によって、またはAlispotなどによって測定される炎症促
進性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。
活性の適切な増加を以下に概説する。
Luminexによって、またはMultiplexビーズ系方法によって、または細胞
内染色及びFACS解析によって、またはAlispotなどによって測定されるIL-
2分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増
加を以下に概説する。
Luminexによって、またはMultiplexビーズ系方法によって、または細胞
内染色及びFACS解析によって、またはAlispotなどによって測定されるインタ
ーフェロン-γ産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活
性の適切な増加を以下に概説する。
または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるTh1応答の増加または減少を測
定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるTh2応答の増加または減少を測
定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
て、またはIHCによって測定される調節T細胞(Treg)の少なくとも1つの細胞数
及び/または活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切
な減少は、以下に概説する増加と同じである。
て、またはIHCによって測定されるM2マクロファージ細胞数の増加または減少を測定
する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じであ
る。
または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるM2マクロファージ腫瘍形成促進
活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以
下に概説する増加と同じである。
て、またはIHCによって測定されるN2好中球増加の増加または減少を測定する。応答
の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。
または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるN2好中球腫瘍形成促進活性の増
加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説
する増加と同じである。
または増殖によって、または例えば、CD137、CD107a、PD1等のような活性
化マーカーの発現の変化によって測定される、T細胞活性化の抑制の増加または減少を測
定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、ま
たは例えば、CD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化
によって測定される、CTL活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免
疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
によって測定される、αβ及び/またはγδT細胞枯渇の増加または減少を測定する。応
答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加と同じである。
または増殖によって、または例えば、CD137、CD107a、PD1等のような活性
化マーカーの発現の変化によって測定される、αβ及び/またはγδT細胞応答の増加ま
たは減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説
する。
または増殖によって、または例えば、CD45RA、CCR7等のような活性化マーカー
の発現の変化によって測定される、抗原特異的メモリー応答の刺激の増加または減少を測
定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。。
ルサインAM等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばCFSE希釈もしくはヨウ
化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌
細胞のアポトーシスまたは溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性
を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
ルサインAM等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばCFSE希釈もしくはヨウ
化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌
細胞に対する細胞傷害または細胞増殖抑制効果の刺激の増加または減少を測定する。活性
の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
ルサインAM等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばCFSE希釈もしくはヨウ
化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、癌
細胞の直接的な殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活
性の適切な増加を以下に概説する。
て、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるTh1
7活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増
加を以下に概説する。
ルサインAM等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばCFSE希釈もしくはヨウ
化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリー系アッセイによって測定される、補
体依存性細胞傷害性及び/または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性の誘導の増加または減
少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、
CD137、CD107a、PD1等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定
される。T細胞については、増殖、活性化の細胞表面マーカー(例えば、CD25、CD
69、CD137、PD1)、細胞傷害性(標的細胞を殺傷する能力)、及びサイトカイ
ン産生(例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IFNγ、TNF-a、IL-10、
IL-17A)の増加が、癌細胞の強化された殺傷と一貫する免疫調節を示し得る。
な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えば、CD107a等のよ
うな活性化マーカーの発現の変化によって測定される。NK細胞については、増殖、細胞
傷害性(標的細胞を殺傷し、CD107a、グランザイム、及びパーフォリン発現を増加
させる能力)、サイトカイン産生(例えば、IFNγ及びTNF)、及び細胞表面 受容
体発現(例えば、CD25)が、癌細胞の増強された殺傷と一貫し得る免疫調節を示し得
る。
殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
性化マーカーの発現の変化によって測定される。
は、参照試料または対照試料のいずれか、例えば、本発明の抗PVRIG抗体を含まない
試験試料におけるシグナルと比べた、10%、20%、30%、40%、50%、60%
、70%、80%、90%、95%、または98~99%パーセントの増加である。同様
に、increases of参照または対照試料と比較して少なくとも1倍、2倍、3
倍、4倍、または5倍の増加が、効能を示す。
少なくとも一部の実施形態に従うと、抗PVRIG抗体は、癌を治療することができる
のと同じ理由で、任意選択で感染疾患の治療に使用し得る。慢性感染症は、ウイルス特異
的T細胞応答の異なる程度の機能障害を特徴とする場合が多く、この異常が、宿主が執拗
な病原体を排除できない主な理由である。機能性エフェクターT細胞が感染の早期にまず
生成されるが、これらは、異質な抗原への持続的な露出の結果として、慢性感染症の経過
中に徐々に機能を喪失し、T細胞疲弊を引き起こす。疲弊したT細胞は、high 等
のCTLA-4、PD-1、及びLAG3等の複数の共抑制受容体を高レベルで発現する
(Crawford et al.,Curr Opin Immunol.2009;
21:179-186、Kaufmann et al.,J Immunol 200
9;182:5891-5897、Sharpe et al.,Nat Immuno
l 2007;8:239-245)。疲弊したT細胞によるPD-1過剰発現が、HI
V、HCV、及びHBVを含む慢性ウイルス感染を患っている患者において臨床的に観察
された(Crawford et al.,Curr Opin Immunol 20
09;21:179-186、Kaufmann et al.,J Immunol
2009;182:5891-5897、Sharpe et al.,Nat Imm
unol 2007;8:239-245)。他のウイルス、最近、及び寄生虫を含む更
なる病原体におけるこの経路についていくらかの調査が行われている(Hofmeyer
et al.,J Biomed Biotechnol.Vol 2011,Art
.ID 451694、Bhadra et al.,Proc Natl.Acad
Sci.2011;108(22):9196-201)。例えば、PD-1経路は、標
準的な盲腸ライゲーション及び穿刺法によって誘導した敗血症モデルを使用した細菌感染
の制御に関与することが示された。ノックアウトマウスにおけるPD-1の不在がこのモ
デルにおいて敗血症誘導死から保護した(Huang et al.,PNAS 200
9:106;6303-6308)。
とができるため(Rivas et al.,J Immunol.2009;183:
4284-91、Golden-Mason et al.,J Virol.2009
;83:9122-30、Hofmeyer et al.,J Biomed Bio
technol.Vol 2011,Art.ID 451694)、抗ウイルス免疫機
能の回復が可能である。ウイルス感染を治療するための共抑制妨害の治療可能性は、PD
-1/PD-L1 経路の妨害によって広く研究され、これは、アカゲザルにおける急性
及び慢性免疫不全ウイルス(SIV)感染(Valu et al.,Nature 2
009;458:206-210)、及びリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)等
の慢性ウイルス感染のマウスモデル(Barber et al.,Nature.20
06;439:682-7)、及びSJL/Jマウスにおけるタイラーマウス脳脊髄炎ウ
イルス(TMEV)モデル(Duncan and Miller PLoS One.
2011;6:e18548)を含むいくつかの感染症の動物モデルにおいて有効である
ことを示した。これらのモデルにおいて、PD-1/PD-L1妨害は、抗ウイルス応答
を改善し、執拗なウイルスのクリアランスを促進した。加えて、PD-1/PD-L1妨
害は、血漿における特異的抗ウイルス抗体の産生の上昇として現れる液性免疫を増加させ
、これと細胞応答の改善とが組み合わさって、血漿ウイルス量の減少及び生存率の増加を
もたらす。
いう用語は、互換的に使用され、個々の宿主生命体における病原性生物因子の存在及び/
または成長によって引き起こされる任意の障害、疾患、及び/または状態を含む。本明細
書で使用される場合、「感染症」という用語は、臨床的に顕在な疾病(即ち、疾患の特徴
的な医学的兆候及び/または症状)を呈し、かつ/またはその経過のほとんどもしくは全
てで無症候性である、上記の障害、疾患、及び/または状態を含む。本明細書で使用され
る場合、「感染症」という用語はまた、低減した増殖及びサイトカイン産生として現れる
機能不全を特徴とする疲弊T細胞表現型につながる異質な抗原の持続によって引き起こさ
れる障害、疾患、及び/または状態を含む。本明細書で使用される場合、「感染障害及び
/または疾患」及び/または「感染症」という用語は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感
染、及び/または寄生虫感染によって引き起こされる以下に挙げる感染障害、疾患、及び
/また状態のうちのいずれかを更に含む。
感染、真菌感染の治療に使用される1つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与すること
ができる。
ば、細胞傷害性T細胞もしくはNK活性に対するその抑制効果及び/または炎症性サイト
カインの産生に対するその抑制効果に拮抗するか、あるいはTRegに対するPVRIG
の刺激効果を阻害することで、感染細胞または病原体の枯渇または殺傷を促進し、対象の
免疫細胞による病原体または感染細胞の増強した殺傷に基づく疾患寛解をもたらす可能性
がある抗PVRIG抗体を投与される。
少なくとも一部の実施形態に従い、抗PVRIG抗体は敗血症の治療に使用される。本
明細書で使用される場合、「敗血症」または「敗血症関連状態」という用語は、敗血症、
重症敗血症、敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群(SIRS)、菌血症、敗血症(
Septicemia)、毒血症、敗血症性症候群を包含する。
の1つとして最近浮上した。PD-1/PDL-1経路は、例えば、敗血症の転帰の決定
因子であり、抗菌免疫応答による効果と損害との間の微妙なバランスを調節しているよう
に見える。実験モデルにおける敗血症の間、腹膜マクロファージ及び血中単球はPD-1
レベルを顕著に増加させ、これは、細胞障害の発現と関連した(Huang et al
2009 PNAS 106:6303-6308)。同様に、敗血症性ショックを有
する患者においては、末梢T細胞上のPD-1及び単球上のPDL-1の発現が劇的に上
方調節された(Zhang et al 2011 Crit.Care 15:R70
)。最近の動物研究により、抗PD1または抗PDL1抗体によるPD-1/PDL-1
経路の妨害が敗血症における生存率を改善したことが示された(Brahmamdam
et al 2010 J.Leukoc.Biol.88:233-240、Zhan
g et al 2010 Critical Care 14:R220、Chang
et al 2013 Critical Care 17:R85)。同様に、抗C
TLA4抗体によるCTLA-4の妨害は敗血症における生存率を改善した(Inoue
et al 2011 Shock 36:38-44、Chang et al 2
013 Critical Care 17:R85)。総合すると、これらの発見は、
負の共刺激分子を含む抑制タンパク質の妨害が、敗血症の有害作用を予防するための可能
性のある治療的アプローチであることを示唆する(Goyert and Silver
,J Leuk.Biol.,88(2):225-226,2010)。
の超炎症性段階におけるサイトカインストームを妨害する療法等の敗血症の治療に有効な
既知の治療薬と、及び/もしくは敗血症誘導性免疫抑抑制段階を克服するための免疫刺激
効果を有する療法と組み合わせて使用する、敗血症の治療を提供する。
t of Severe Sepsis and Septic Shock」(Del
linger et al 2013 Intensive Care Med 39:
165-228)によって推奨される敗血症に対する治療処置の標準との組み合わせは、
その一部が以下に記載される。
-治療は、敗血症が診断されるが、特定の病原体が特定されないときに開始する)-例、
セフォタキシム(Claforan(登録商標))、チカルシリン及びクラブラン酸(T
imentin(登録商標))、ピペラシリン及びタゾバクタム(Zosyn(登録商標
))、イミペネム及びシラスタチン(Primaxin(登録商標))、メロペネム(M
errem(登録商標))、クリンダマイシン(Cleocin)、メトロニダゾール(
Flagyl(登録商標))、セフトリアキソン(Rocephin(登録商標))、シ
プロフロキサシン(Cipro(登録商標))、セフェピム(Maxipime(登録商
標))、レボフロキサシン(Levaquin(登録商標))、バンコマイシン、または
列挙した薬物の任意の組み合わせ。
昇圧剤:例:ノルエピネフリン、ドーパミン、エピネフリン、バソプレシン。
ステロイド:例:ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、またはフルドロコルチゾン(静
脈内または別の方法)。
変力療法:例:心筋機能障害を有する敗血症患者へのドブタミン。
活性化)(DrotAA)。
sPLA2-IIAの選択的阻害剤(LY315920NA/S-5920等)。論理
的根拠:炎症中に放出されるIIA群分泌ホスホリパーゼA2(sPLA2-IIA)は
重度の敗血症において増加し、血漿レベルは生存率に反比例する。
ボ研究は、リポタンパク質が内毒素に結合して中和することを示し、実験動物研究は、リ
ポタンパク質が投与されたときの敗血症性死からの保護を実証する。内毒素中和は、リポ
タンパク質粒子中のリン脂質の量と相関する。
観察される多くの病態生理学的兆候及び症状を誘発する。
いて重要な役割を果たす。細菌細胞壁成分は、骨髄細胞上のCD14及び共受容体に結合
し、細胞活性化及び前炎症性メディエーターの産生をもたらす。抗CD14モノクローナ
ル抗体(IC14)が、内毒素血症の動物及びヒトモデルにおけるリポ多糖誘導応答を低
減することが示されている。
感染微生物が、それらの表面上に高度に保存された巨大分子(例えば、リポ多糖、ペプチ
ドグリカン)を呈する。これらの巨大分子が免疫細胞の表面上でパターン認識受容体(ト
ール様受容体[TLR]と呼ばれる)によって認識されると、宿主の免疫応答が開始され
る。これは、敗血症を特徴付ける過剰な全身性炎症応答に寄与し得る。いくつかのTLR
、具体的には、グラム陰性細菌外膜リポ多糖または内毒素の受容体であるTLR4の阻害
が、敗血症のための有力な療法として評価されている。TLR4発現及び経路を標的とす
る種々の薬物が敗血症における治療可能性を有する(Wittebole et al
2010 Mediators of Inflammation Vol 10 Ar
ticle ID 568396)。これらの中には、TLR4を標的とする抗体、可溶
性TLR4、スタチン(ロスバスタチン(登録商標)、シンバスタチン(登録商標)等)
、ケタミン、ニコチン類似体、エリトラン(E5564)、レサトルビド(TAK242
)がある。加えて、クロロキン等の他のTLR拮抗物質、TLR-2の中和抗体での阻害
(抗TLR-2)。
タラクトフェリンまたは組み換えヒトラクトフェリン。論理的根拠:ラクトフェリンは
、分泌及び免疫細胞に見られる抗感染及び抗抗炎症特性を有する糖タンパク質である。ヒ
トラクトフェリンの組み換え型であるタラクトフェリンアルファは、同様の特性を有し、
胃腸粘膜障壁の完全性の維持に重要な役割を果たす。タラクトフェリンは、敗血症の動物
モデル、及び重度の敗血症を有する患者における臨床試験における有効性を示した(Gu
ntupalli et al Crit Care Med.2013;41(3):
706-716)。
アポトーシス細胞と食細胞との間の架橋分子である。
迷走神経の刺激により、サイトカイン、または免疫系メディエーターの産生が低減され、
炎症が遮断される。「炎症反射」と呼ばれるこの神経「回路」は、「コリン作動性抗炎症
経路」と呼ばれる機構である、マクロファージ上で発現されるニコチン性アセチルコリン
受容体(α7nAChR)のα7サブユニットに対する、神経終末から放出されるアセチ
ルコリンの特異的作用によって行われる。迷走神経刺激または薬理学的α7作用物質によ
るこの経路の活性化は、複数の全身性炎症モデル、ショックモデル、及び敗血症モデルに
おける組織損傷を予防する(Matsuda et al 2012 J Nippon
Med Sch.79:4-18、Huston 2012 Surg.Infect
.13:187-193)。
血症における炎症応答に大いに寄与し、重要な要素は、局所炎症から有害な超炎症宿主応
答への移行の推進に関与する(Cinel and Opal 2009 Crit.C
are Med.37:291-304、Matsuda et al 2012 J
Nippon Med Sch.79:4-18)。
性化し、パラクリンシグナルを分泌して全身性及び局所炎症応答を制限し、免疫細胞を有
益に調節し、危険に曝された組織でのアポトーシスを低減して血管新生を刺激することに
よって組織治癒を促進し、かつ直接抗菌活性を呈する能力により、複数の有益な特性を呈
する。これらの効果は、敗血症動物モデルにおける臓器機能不全の軽減及び生存率の改善
と関連しており、MSCが有用な治療補助剤であり得るという証拠を提供している(Wa
nnemuehler et al 2012 J.Surg.Res.173:113
-26)。
調節薬物との併用。かかる薬剤は、特に敗血症誘導性低炎症及び免疫抑制状態等の免疫防
御(先天性及び/または適応性にかかわらず)が低下している状況下で、免疫応答性の増
加をもたらす。宿主免疫を増大させる治療薬による敗血症誘導性免疫麻痺の逆転は、二次
感染の発生を低減し、免疫抑制と立証された患者における転帰を改善し得る(Hotch
kiss et al 2013 Lancet Infect.Dis.13:260
-268、Payen et al 2013 Crit Care.17:118)。
することによって、または共刺激タンパク質を増強することによって、免疫応答を促進す
る。敗血症の実験モデルは、PD-1、PDL-1、またはCTLA-4等の阻害タンパ
ク質の抗体遮断による免疫刺激が、敗血症における生存率を改善したことを示しており(
Brahmamdam et al 2010 J.Leukoc.Biol.88:2
33-240、Zhang et al 2010 Critical Care 14
:R220、Chang et al 2013 Critical Care 17:
R85、Inoue et al 2011 Shock 36:38-44)、敗血症
誘導性免疫抑制の有害な影響を予防するための有力な療法としてのかかる免疫刺激剤を指
摘している(Goyert and Silver J Leuk.Biol.88(2
):225-226,2010)。免疫刺激抗体としては、以下のものが挙げられる:1
)抑制免疫チェックポイントを標的とする拮抗抗体(抗CTLA4 mAb(イピリムマ
ブ、トレメリムマブ等)、抗PD-1(ニボルマブBMS-936558/MDX-11
06/ONO-4538、AMP224、CT-011、ラムブロジルマブMK-347
5等)、抗PDL-1拮抗物質(BMS-936559/MDX-1105、MEDI4
736、RG-7446/MPDL3280A等)、IMP-321等の抗LAG-3)
、抗TIM-3、抗BTLA、抗B7-H4、抗B7-H3、抗VISTAを含む)。2
)免疫刺激タンパク質を増強する作用抗体(抗CD40 mAb(CP-870,893
、ルカツムマブ、ダセツズマブ等)、抗CD137 mAb(BMS-663513ウレ
ルマブ、PF-05082566等)、抗OX40 mAb(抗OX40等)、抗GIT
R mAb(TRX518等)、抗CD27 mAb(CDX-1127等)、及び抗I
COS mAbを含む)。
、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18及びIL-21、IL-
23、IL-27、GM-CSF、IFNα(インターフェロンα)、IFNβ、IFN
γは、敗血症療法のための抗GEN抗体と組み合わせて使用され得る。論理的根拠:サイ
トカインベースの療法は、患者自身の免疫系を刺激する直接的な試みを具現する。敗血症
の実験モデルは、IL-7及びIL-15等のサイトカインの投与により、T細胞生存能
が促進され、敗血症における生存率の改善がもたらされることを示している(Unsin
ger et al 2010 J.Immunol.184:3768-3779、I
noue et al 2010 J.Immunol.184:1401-1409)
。インターフェロン-γ(IFNγ)は、単球の敗血症誘導性免疫麻痺をインビトロで逆
転させる。インビボ研究により、IFNγがヒトにおける免疫麻痺をインビボで部分的に
逆転させることが示された。IFNγ及び顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(G
M-CSF)は、敗血症を有する患者のエクスビボで刺激された白血球の免疫能力を回復
させる(Mouktaroudi et al Crit Care.2010;14:
P17、Leentjens et al Am J Respir Crit Car
e Med Vol 186,pp 838-845,2012)。
免疫系及び適応性免疫系の両方の内因性調節因子としての役割を果たす天然に存在する胸
腺ペプチドである。これは、B型及びC型肝炎等のウイルス感染、ある特定の癌を含む免
疫機能障害に関連する疾患の治療のために、かつワクチン増強のために、世界中で使用さ
れている。注目すべきことに、免疫調節調査における最近の進展により、敗血症患者にお
けるTa1治療の有益な効果が示されている(Wu et al.Critical C
are 2013,17:R8)。
、抗生物質または他の薬剤に耐性を示すもの)により敗血症を発症する危険性のある対象
には、本発明による免疫刺激抗PVRIG抗体または抗原結合断片が投与され、この抗体
は、免疫に対する少なくとも1つのPVRIG媒介性効果、例えば、細胞傷害性T細胞ま
たはNK活性に対するその抑制効果及び/または炎症性サイトカインの産生に対するその
抑制効果に拮抗するか、あるいはTReg療法に対するPVRIGの刺激効果を阻害し、
それにより感染細胞または病原体の枯渇または殺傷を促進し、対象の内因性免疫細胞によ
る病原体または感染細胞の強化された殺傷に基づいて疾患寛解をもたらす可能性がある。
敗血症が臓器不全を急速にもたらし得るという理由から、この実施形態では、抗PVRI
G抗体断片がインタクトな抗体よりも素早く敗血症及び感染部位に到達し得るため、イン
タクトな抗体ではなくFab等の抗PVRIG抗体断片を投与することが有益であり得る
。かかる治療レジメンでは、この疾患が時に急速な罹患性であるため、抗体半減期につい
てはさほど懸念しなくてもよい。
提供される抗PVRIG抗体はまた、PVRIGを過剰発現する腫瘍の、撮像を含むイ
ンビトロまたはインビボでの診断において使用を見出す。しかしながら、本明細書で考察
するように、免疫腫瘍学的標的タンパク質としてのPVRIGは、必ずしも癌細胞上では
なく、むしろ癌における免疫浸潤物内で過剰発現されることに留意されたい。一部の場合
、癌診断をもたらすのは、むしろ、作用の機序、T細胞及びNK細胞等の免疫細胞の活性
化である。したがって、癌を診断するために抗PVRIG抗体を使用することができる。
瘍に浸潤している免疫細胞には、前立腺癌、肝臓癌(HCC)、結腸直腸癌、卵巣癌、子
宮内膜癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、頭頚部癌、甲状腺癌、精巣癌、尿路上皮癌、
肺癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌(扁平及び基底細胞癌)、神経膠腫、腎臓癌(RCC)、
リンパ腫(NHLまたはHL)、急性骨髄性白血病(AML)、T細胞急性リンパ芽球性
白血病(T-ALL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、及
び食道癌が含まれるが、これらに限定されない。
患者からの組織を、一般的には標識されているPVRIG抗体と接触させ、その結果、抗
体が内因性PVRIGと結合するようにする。シグナルのレベルを、同じ患者または参照
試料のいずれかに由来する正常な非癌性組織のレベルと比較して、癌の存否を決定する。
生検試料は、固形腫瘍、血液試料(リンパ腫及び白血病、例えば、ALL、T細胞リンパ
腫等に由来する)に由来し得る。
、蛍光光度計または他の光学検出系を使用して検出されるフルオロフォアまたは他の光標
識で標識する。代替的な実施形態では、二次標識抗体を、当該技術分野で既知であるよう
に、例えば、異なる哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ヤギなど)由来の抗ヒトIgG
抗体を使用して試料と接触させ、サンドイッチアッセイを形成する。あるいは、抗PVR
IG mAbを直接標識し(即ち、ビオチン)、当該技術分野の標識剤に向けられた二次
Abによって検出を行うことができる。
RIG抗体の投与に進め得る。
(抗体断片を含む)を患者に注射し、撮像を行う。この実施形態では、例えば、抗体を、
光標識、またはmAb(断片を含む)の放射性標識であるガドリニウムキレート剤等のM
RI標識で一般的には標識する。
に使用される。抗PVRIG抗体を診断と治療との両方に使用する場合、一部の実施形態
は、同じ抗体を両方に使用できる場合が一部はあるが、診断用抗体が治療用抗体と結合に
ついて競合しないように2つの異なるエピトープに対する2つの異なる抗PVRIG抗体
に依存する。例えば、これは、本明細書で概説するもの等の、異なるビンにある、例えば
、PVRIG上で異なるエピトープと結合する抗体を使用して行うことができる。このた
め、診断用抗体及び治療用抗体を含む組成物が本明細書に含まれ、一部の実施形態では、
診断用抗体は本明細書に記載のように標識される。加えて、治療用及び診断用抗体の組成
物は、本明細書に概説する他の薬物と共投与することもできる。
3、CPA.7.004、CPA.7.006、CPA.7.008、CPA.7.00
9、CPA.7.010、CPA.7.011、CPA.7.012、CPA.7.01
3、CPA.7.014、CPA.7.015、CPA.7.017、CPA.7.01
8、CPA.7.019、CPA.7.021、CPA.7.022、CPA.7.02
3、CPA.7.024、CPA.7.033、CPA.7.034、CPA.7.03
6、CPA.7.040、CPA.7.046、CPA.7.047、CPA.7.04
9、及びCPA.7.050を含む、列挙する抗体、または変異体配列を有するCDRを
利用する抗体、またはCPA.7.001~CPA.7.050のうちのいずれかと結合
について競合するもの、特に、PVRIGに結合し、かつ受容体結合を妨害するものが挙
げられるが、これらに限定されない。加えて、CPA.7.016、CAP.7.020
、CPA.7.028、CPA.7.030、CPA.7.038、CPA.7.044
、及びCPA.7.045を含む、結合するが妨害はしないものも使用することができる
。
を使用することができるため、他の形式にあるCDRセットを含む、以下のうちのいずれ
かに由来する可変重及び軽ドメインを診断に使用することができる:CHA.7.502
、CHA.7.503、CHA.7.506、CHA.7.508、CHA.7.510
、CHA.7.512、CHA.7.514、CHA.7.516、CHA.7.518
、CHA.7.520.1、CHA.7.520.2、CHA.7.522、CHA.7
.524、CHA.7.526、CHA.7.527、CHA.7.528、CHA.7
.530、CHA.7.534、CHA.7.535、CHA.7.537、CHA.7
.538.1、CHA.7.538.2、CHA.7.543、CHA.7.544、C
HA.7.545、CHA.7.546、CHA.7.547、CHA.7.548、C
HA.7.549、及びCHA.7.550由来。
本明細書に開示の抗体に、スクリーンまたは診断手順における検出を可能にするために1
つ以上の元素、同位体、または化学的化合物が結合することを意味する。一般に、標識は
、いくつかのクラスに分けられる:a)抗体によって認識される融合パートナーとして組
み込まれるエピトープであり得る、免疫標識、b)放射性または重同位体であり得る、同
位体標識、c)蛍光及び比色色素、または他の標識方法を可能にするビオチン等の分子を
含み得る、小分子標識、ならびにd)粒子(超音波標識用のバブルを含む)または身体撮
像を可能にする常磁性標識等の標識。標識は、当該技術分野で既知であるように、いずれ
の位置で抗体に組み込んでもよく、またタンパク質発現中にインビトロまたはインビボで
組み込んでもよい。
で、あるいは患者から取り出した試料においてインビトロで行うことができる。本文脈に
おける「試料」は、体液(血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門及び膣分泌物、汗、な
らびに精液を含むがこれらに限定されない)、ならびに関連組織の生検から得られるもの
等の組織試料を含むがこれらに限定されない、任意の数のものを含む。
、MRI、及びPETスキャン、ならびに身体表面付近の腫瘍に対して光標識を使用する
もの等の光学技法が含まれるが、これらに限定されない。
えば、99Tc標識、または別の.ベータ.線放射同位体による標識を使用して、抗PV
RIG抗体を標識してもよい。この技法の変形は、ガンマカメラ技法を通した撮像を改善
するために磁気共鳴画像法(MRI)の使用を含んでもよい。
ジュゲートした抗体を血流への注射等によって宿主に投与し、宿主における標識された抗
体の存在及び位置をアッセイする、インビボ撮像法を提供する。この技法及び本明細書で
提供する任意の他の診断方法によって、本発明は、ヒト患者またはヒト患者から採取した
生体試料における疾患に関係する細胞の存在についてスクリーニングするための方法を提
供する。
よって間接的に、抗PVRIG抗体に結合させてもよい。有用な媒介官能基には、エチレ
ンジアミン四酢酸塩及びジエチレントリアミン五酢酸キレート剤などのキレート剤(例え
ば、米国特許第5,057,313号を参照)が含まれ、放射性同位体コンジュゲート抗
PVRIG抗体を伴う診断アッセイにおいて、患者に送達されるコンジュゲート抗PVR
IG抗体の用量は、典型的には、検出及び正確な測定を可能にすることになる、最小の半
減期、最小の体内保持、及び最小量の同位体の最良の組み合わせのための同位体の選択に
よって、可能な限り低いレベルで維持する。
れる抗PVRIG抗体(ビオチン-ストレプトアビジン複合体によるもの等)、造影剤、
蛍光化合物または分子、及び磁気共鳴画像法(MRI)のための増強剤(例えば、常磁性
イオン)(例えば、MRI技法及びMRI増強剤抗体にコンジュゲートした抗体の調製を
説明している、米国特許第6,331,175号を参照されたい)を使用して行い得る。
かかる診断/検出薬剤は、磁気共鳴画像法における使用のための薬剤、及び蛍光化合物か
ら選択され得る。
するための多数のキレート基が結合する尾の長い試薬と反応させることが必要であり得る
。かかる尾は、ポリリジン、多糖、または例えば、ポルフィリン、ポリアミン、クラウン
エーテル、ビスチオセミカルバゾン、ポリオキシム、及びこの目的に有用であることが知
られている同様の基等のキレート基が結合することができるペンダント基を有する他の誘
導体化したまたは誘導体化可能な鎖等のポリマーであってもよい。
は、通常、免疫反応性の損失が最小であり、凝集及び/または内部架橋が最小である、分
子への結合の形成を可能にする基によって抗PVRIG抗体に連結する。
I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、99Tc、94T
c、11C、13N、5O、及び76Br等の60~4,000keVの一般的なエネル
ギー範囲にある診断用同位体と共に使用される2-ベンジル-DTPA及びそのモノメチ
ル及びシクロヘキシル類似体が挙げられる。
、超音波造影剤、及び光活性剤が含まれる。かかる診断剤は周知であり、任意のかかる既
知の診断剤を使用し得る。診断剤の非限定的な例としては、放射性核種、例えば、110
In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、6
7Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、1
20I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11
C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72
As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、または他の.ガンマ.-、.ベータ
.-、または陽電子放射体を挙げることができる。
鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(III)、銅(III)、ネオジム(III
)、サマリウム(III)、イッテルビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナ
ジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(II
I)またはエルビウム(III)を挙げることができ、金属造影剤としては、ランタン(
III)、金(III)、鉛(II)、またはビスマス(III)を挙げることができる
。
は、バリウム化合物、ガリウム化合物、及びタリウム化合物といった化合物から選択され
得る。
複合体化される場合に、抗PVRIG抗体と関連するMRI診断方法に有用であり得る。
NOTA、DOTA、及びTETA等の大環状キレート剤は、種々の金属及び放射性金属
、特に、それぞれ、ガリウム、イットリウム、及び銅の放射性核種と共にする場合に役立
つ。かかる金属-キレート剤複合体は、目的の金属に対して環サイズを調整することによ
って非常に安定にし得る。223Ra等の安定して結合した核種のために目的とする大環
状ポリエーテル等の他の環種のキレート剤も、診断方法において好適である。
コンピュータ断層撮影法、または超音波造影増強剤用のもの等)、または例えば、.ガン
マ.-、.ベータ.-、.アルファ.-、オージェ電子-、もしくは陽電子放射同位体で
あり得る放射性核種とコンジュゲートされる、診断用抗PVRIG抗体コンジュゲートを
提供する。
現を検出することにおいて有用であり得る。診断用途には、抗体は、典型的に、インビト
ロアッセイのために検出可能な部分で標識されることになる。当業者には理解されるであ
ろう通り、インビトロ試験における使用に好適な標識は豊富にある。本発明のこの態様に
おける使用に好適な染料には、ユーロピウム及びテルビウムのものを含む蛍光ランタニド
複合体、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオジン、エリスロシ
ン、クマリン、メチル-クマリン、量子ドット(「ナノ結晶」とも称される;参照により
本明細書に組み込まれる米国第09/315,584号を参照)、ピレン、マラサイト(
Malacite)グリーン、スチルベン、Lucifer Yellow、Casca
de Blue(商標)、Texas Red、Cy色素(Cy3、Cy5等)、アレク
サ色素(Alexa、フィコエリトシン(phycoerythin)、ボディパイ、及
び参照により本明細書に明示的に組み込まれるRichard P.Hauglandに
よるMolecular Probes Handbookの第6版に記載されている他
のものを含む)が含まれるが、これらに限定されない。
放射能について評価してもよい。かかる技法の使用によって得た画像を使用して、例えば
、PVRIGを侵襲性癌細胞の存在についてのバイオマーカーとして使用する背景におい
て、患者、哺乳動物、または組織中のPVRIGの生体内分布を評価してもよい。
5年3月31日出願のUSSN 62/141,168に対する優先権を主張する、「P
VRIG POLYPEPTIDES AND METHODS OF TREATME
NT」と題された2016年2月19日出願のUSSN XXを参照し、これらの全ては
、全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
実施例1A:
GDS3113データセット(http://www.ncbi.nlm.nih.g
ov/sites/GDSbrowser?acc=GDS3113)を解析して、リン
パ器官特異的パターンを有する遺伝子を特定した。PVRIGを、末梢血、骨髄、脾臓、
リンパ節、扁桃腺、及び胸腺を含む一次及び二次リンパ器官における高い発現に起因して
、リンパ球特異的であるとして特定した(図2)。他の組織型は、陰性であったか、また
はバックグラウンドレベルの発現を示した。免疫細胞の全集団内のどの特定の細胞型がP
VRIGを発現するかを調査するために、Gene Expression Omnib
us(www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO)からの追加のデータセット
を、本明細書の「方法」の節に記載するように解析した。末梢血及び骨髄に由来する免疫
細胞集団に対して解析を行った。PVRIGは、CD8 T細胞ナイーブ、エフェクター
、及びメモリーを含む、B細胞行数及びT細胞行数の両方においてリンパ球中で発現され
た(図3)。加えて、PVRIGは、NK細胞中で発現され、iNKT集団中で最も高い
発現を有した(図4)。リンパ球のiNKT集団は、実験モデルにおいて合成の作用物質
で刺激されると、抗腫瘍免疫の強力な活性化因子として作用する。しかしながら、一部の
状況では、iNKT細胞は、抗腫瘍免疫のサプレッサー及び調節因子として作用し得る(
Clin Dev Immunol.2012;2012:720803)。更に、iN
KT細胞に基づく免疫療法の早期の臨床試験において、リガンドパルス抗原提示細胞治療
及び/またはインビトロで活性化されたiNKT細胞の注入が肺癌及び頭頚部癌において
安全であり、耐容性良好であったことを示した(Clin Immunol.2011
Aug;140(2):167-76.)。
おいてPVRIGの発現を保持するかどうかであった。濾胞性リンパ腫、乳癌、及び結腸
癌からのTILの発現データの解析により、腫瘍に浸潤するTILにおけるPVRIGの
明白な発現を示した。結腸癌の例では、発現がCD45陽性集団(白血球特異的マーカー
)のみで見出され、EPCAM陽性集団(上皮特異的マーカー)またはCD45陰性EP
CAM陰性(間質細胞集団)では見出されないため、免疫浸潤性細胞への特異性が見られ
た。CD45はリンパ球特異的マーカーではないが、他の発現の記述は、それがリンパ球
集団上で発現されることを暗示する(図5Aは結腸癌、図5Bは乳癌、図5Cは濾胞性リ
ンパ腫)。
(TIL)において発現されることを示す。これらの結果は、PVRIG阻害活性と併せ
て、T細胞における分子の阻害的役割を示し、PVRIGへの阻害抗体がTILでのPV
RIGの抑制的役割を高め、それによりTILが癌に対する免疫応答を誘導できるように
なることを示唆する。示される作用機序は腫瘍細胞に対する直接的な効果ではなく腫瘍に
浸潤するTILを対象とするため、免疫浸潤を伴う任意の癌がPVRIG阻害抗体を使用
する治療の候補である。
タがMAS5フォーマットであった場合は、データを操作せずに取得した。データがLo
g MAS5であった場合には、データを線形データに変換した。データがRMAフォー
マットであった場合は、CELファイル(生データ)をダウンロードし、MAS5を使用
して再解析した。生のCELファイルを利用することができなかった場合、RMAフォー
マットを使用した。
正規化した。解析したデータセット:GSE49910、GSE47855、GSE39
397、GSE36765、GSE27928。
トランスクリプトーム参照をUCSC既知遺伝子モデル(http://hgdown
load.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/databa
se/knownGene.txt.gz)に基づいて生成した。全てのRNAシーケン
シングリードをまずトランスクリプトーム配列に整列させた。アイソフォームは多くのエ
クソンを共有するため、このアラインメントにより非固有マッピングを可能にした。次に
、トランスクリプトームマッチに基づいて各リードにゲノム座標及びエクソンジャンクシ
ョンを割り当てた。残りのマッピングされていないリードを、1つ以上のエクソンジャン
クションを考慮することによってゲノムに直接整列させた。最後に、リード数をBoら(
Bioinformatics 2010,26(4):493-500)によって説明
されているように正規化し、Trapnellら(Nat Biotechnol.20
10 May;28(5):511-5)によって説明されているように遺伝子発現値に
変換した。
x)データ(http://www.nature.com/ng/journal/v
45/n6/full/ng.2653.html、http://www.gtexp
ortal.org/home/)に基づくと、PVRIGは、主に血液細胞において、
種々の正常な組織においてはより少ない程度に、発現される。同じ結果がThe Can
cer Genome Atlas(TCGA)(http://cancergeno
me.nih.gov/)からの癌性組織において観察され、ここでは、高い発現がB-
細胞リンパ腫及びAMLのような血液の癌において見られる(図7)。遺伝子発現シグネ
チャを、発現パターンがPVRIGと高度に相関した遺伝子を特定することによって、G
TEx及びTCGAデータを使用して種々の癌及び正常な組織について生成した。
料で0RPKMを超えて発現された相関のみを考慮に入れた。これらの遺伝子発現シグネ
チャを、相互作用タンパク質、経路、及び疾患遺伝子の濃縮度について試験した。エンリ
ッチメントp値を各腫瘍型について計算し、平均-log(p値)を使用してスコアリン
グ遺伝子セットを順位付けした。図8に示すように、リンパ球及びT-細胞の明確なシグ
ネチャが種々の癌において観察された。例えば、タンパク質相互作用において最上位のス
コアを得た遺伝子はIL2であり、これは、IL2と相互作用することが知られている遺
伝子が、大部分の癌にわたって偶然に予想を上回ってPVRIGと相関することを意味す
る。更なる分析により、癌組織におけるPVRIG発現が通常より高いことが示された。
図5では、PVRIGの平均発現レベルは大部分の正常な固体組織にわたって1を下回っ
たが、図6では、多くの癌において明らかに1より高かった。例として、図7で並べて比
較すると、黒色腫PVRIGは正常な皮膚より高く発現された(図9)。癌における過剰
発現の源を更に特性評価した。PVRIGは、T細胞において高度に発現され、癌におけ
るT細胞のマーカーと高度に相関した。図10では、CD3、CD4、及びCD8とのP
VRIG相関を、3種の癌、即ち、肺腺癌、結腸腺癌、及び黒色腫における例として示す
。加えて、PVRIGは、T細胞上で発現されることが知られている癌における免疫療法
のための有効な標的であるPD1と高度に相関する(図10)。
度について試験した。図8に示すように、リンパ球及びT-細胞の明確なシグネチャが種
々の癌において観察された。PVRIGのPD1との相関を更に分析すると、乳、肺、膵
臓、及び腎臓を含む種々の腫瘍においてそれらの発現間の高い相関を示した(表2)。P
D-1及びPVRIGの両方が、活性化されたT細胞上で高度に発現される。PVRIG
は、癌におけるT細胞マーカー、即ち、CD8A、CD4、及びCD3Gとの高い相関を
示した(図13)。総合すると、これらのデータは、PVRIGの癌発現が腫瘍浸潤性リ
ンパ球と関連付けられることを示す。
子のうちの少なくとも1つについてlog2(FPKM+0.1)<log2(0.1)
を満たす試料を除外した。回帰線についてのピアソン積率相関係数(PCC)及び最小二
乗推定量を2つのリスト(遺伝子当たり1リスト)について計算した。値が0.5よりも
小さいPCC、ならびに2つの遺伝子の発現レベル間の線形相関を試験した際に有意な値
を示さなかったPCCを除外した。
etacore(https://portal.genego.com)、React
ome(http://www.reactome.org)、及びKEGG経路(ht
tp://www.genome.jp/kegg)から得た。所与の遺伝子リスト内で
濃縮度の高い経路及びプロセスを特定するために、超幾何学に基づくエンリッチメント解
析を実行した。超幾何学的p値を、Rプログラム(http://www.R-proj
ect.org)をコマンドphyper(x-1、m、n-m、k、及びlower.
tail=FALSE)で使用して計算した。ここで、xは経路のメンバーである遺伝子
リストからの遺伝子の数、mは経路中の遺伝子の数、nは全経路中の固有の遺伝子の総数
、及びkは少なくとも1つの経路中に存在したリストからの遺伝子の数である。結果とし
て得られるp値は、遺伝子リストのサイズを所与として、特定経路についての偶然による
濃縮の尤度を示す。 同じ解析手順を、所与の遺伝子と相互作用する全ての遺伝子を経路
として扱った遺伝子相互作用、または全ての関連する遺伝子を経路として扱った疾患と関
連する遺伝子に適用した。図64を参照されたい。
CD8、PD-1、TIM-3、及びTIGITの高い(第4の四分位)発現を有するT
CGAからの癌試料を選択した。次に、癌試料を、高レベル、変化なし、及び低レベルの
4つのマーカーの組み合わせた発現に分けた。PVRIGは、低い発現マーカーのいずれ
においても検出されなかった(疲弊したT細胞が少ないかまたは無い)。高レベルの疲弊
したT細胞と関連する腫瘍の大部分が高レベルのPVRIGを発現した(図22)。
ヒト及び非ヒト霊長類PVRIG RNA、ならびに細胞株及び一次白血球中のタンパ
ク質を評価した。
操作された過剰発現細胞のFACS解析:以下の細胞株を使用して、抗ヒトPVRIG
抗体の特異性を評価した:HEK 親及びHEK hPVRIG過剰発現細胞。これらの
細胞を、DMEM(Gibco)+10%のウシ胎仔血清(Gibco)+グルタマック
ス(Gibco)中で培養した。HEK hPVRIG過剰発現細胞については、0.5
ug/mlのピューロマイシン(Gibco)も、陽性選択のために培地に添加した。F
ACS解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採取し、ウェル当たり50,000~1
00,000細胞を96ウェルプレートに播種した。抗ヒトPVRIG抗体(ヒトIgG
1、hIgG1)及びその対応する対照を、一点希釈(5ug/ml)で、または30分
~1時間の氷上での30ug/mlから開始した8点滴定シリーズとして添加した。滴定
シリーズは、1:3または1:3.3倍いずれかの連続希釈として実施した。FACS
Canto II(BD Biosciences)を使用してデータを得て、Flow
Jo(Treestar)及びPrism(Graphpad)ソフトウェアを使用して
解析した。
び特異性を評価した:Jurkat、CA46、NK-92、OV-90、HepG2、
及びNCI-H441。Jurkat、CA46、及びNCI-H441細胞を、RPM
I培地+10%のウシ胎仔血清、グルタマックス、非必須アミノ酸(Gibco)、ピル
ビン酸ナトリウム(Gibco)、及びペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)
中で培養した。NK-92細胞を、RPMI培地+25%のウシ胎仔血清、グルタマック
ス、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン、及び5
00U/mlのIL-2(R&D systems)中で培養した。OV-90細胞を、
最終濃度1.5g/Lの重炭酸ナトリウム(Life Technologies)を含
有するMCDB 105培地(Sigma)と、最終濃度15%のウシ胎仔血清を有する
最終濃度2.2 g/Lの重炭酸ナトリウムを含有するMedia 199(Sigma
)との1:1の混合物中で培養した。HepG2細胞を、DMEM+10%のウシ胎仔血
清+グルタマックス中で培養した。FACS解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採
取し、ウェル当たり50,000~100,000細胞を96ウェルプレートに播種した
。抗ヒトPVRIG抗体(hIgG1)及びその対応する対照を、一点希釈(5ug/m
l)で、または30分~1時間の氷上における30ug/mlから開始した8点滴定シリ
ーズとして添加した。滴定シリーズは、1:3または1:3.3倍いずれかの連続希釈と
して実施した。FACS Canto IIを使用してデータを得て、FlowJo及び
Prismソフトウェアを使用して解析した。
lood Bank)のFicoll(GE Healthcare)勾配単離によって
得た。単離した末梢血単核細胞(PBMC)としての白血球を、10%のDMSO(Si
gma)、90%のウシ胎仔血清混合物中1×107~5×107細胞/mlの密度で液
体窒素中で凍結させた。PBMC上のPVRIGのタンパク質発現を評価するために、ヒ
ト抗PVRIG抗体を含む、腫瘍免疫サブセットに向けた抗体カクテルを設計した。抗ヒ
トPVRIG抗体(hIgG1)及びその対応する対照を、一点希釈(5ug/ml)で
、または一部の場合には30分~1時間の氷上における10もしくは30ug/mlから
開始した8点滴定シリーズとして添加した。
Live/Dead、Life Technologies)時に5×105 ~1×1
06細胞/ウェルで播種した蘇生したPBMCに添加した。抗体カクテルを、氷上で30
分~1時間、PBMCと共にインキュベートした。次に、PBMCを洗浄し、FACS
Canto IIを使用するFACSによってデータを得た。FlowJo及びPris
mソフトウェアを使用してデータを解析した。解析した免疫サブセットには、CD56薄
暗NK細胞、CD56明NK細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、非在来型T細胞(
例えば、NKT細胞及びγδT細胞)、B細胞、及び単球が含まれた。
の発現を、全PBMCから単離したかまたは全PBMC調製物中の活性化されたエフェク
ターリンパ球サブセット上で評価した。エフェクターリンパ球を、サイトカインの組み合
わせ、抗体及びサイトカインの組み合わせ、または病原性産物を用いて刺激した。活性化
された細胞上のPVRIG発現のFACS解析を、ナイーブ一次白血球について上述した
ように行った。
NK細胞培地(RPMI+10%のウシ胎仔血清、グルタマックス、ペニシリン/ストレ
プトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びベータ-メルカプトエタノ
ール[Gibco])において1~3日間、サイトカインの種々のカクテル中で培養した
。NK細胞を、製造業者の指示に従って抗ヒトCD56+マイクロビーズ(Milten
yi Biotec)またはヒトNK細胞単離キット(Miltenyi Biotec
)のいずれかを使用して選別した。NK細胞を刺激するために使用したサイトカインのカ
クテルは、IL-2、IL-12、IL-15、IL-2/IL-12、IL-2/IL
-15、IL-12/IL-15を含んだ(R&D systems)。
を、CD4+またはCD8+マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を使用
して単離した。単離した細胞を、T細胞培地(RPMI+10%のウシ胎仔血清、グルタ
マックス、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム)
中で種々の活性化条件の存在下で3日間培養した。単離したT細胞を刺激するために使用
した条件は、IL-2、またはT細胞をある特定の表現型(例えば、Th1、Th2、T
h17、及びT 調節表現型)に駆動するサイトカインカクテルを用いたヒトダイナビー
ズ(dynabead)刺激(CD3/CD28抗体に結合したビーズ、Life Te
chnologies)を含む。Th1駆動サイトカインは、組み換えIL-12(R&
D systems)及び抗IL-4中和抗体(Biolegend)である。Th2駆
動条件は、組み換えIL-4(R&D systems)及び抗IFN-ガンマ中和抗体
(Biolegend)である。Th17駆動条件は、組み換えIL-6(R&D sy
stems)、TGF-ベータ(R&D systems)、IL-23(R&D sy
stems)、ならびに抗IL-4及び抗 IFNγ中和抗体である。T調節駆動条件は
、組み換えTGF-ベータ及びIL-2、ならびに抗IL-4及び抗IFNγ中和抗体で
ある。
抗原(List Biological Laboratories)との刺激された全
PBMC培養において、またはCD4+T細胞を2もしくは5日間同種樹状細胞と共培養
する混合リンパ球反応(MLR)において、解析した。
価した。この場合、CD14+細胞を、RosetteSepヒト単球富化を製造業者の
指示に従って使用して富化した。CD14+細胞富化の後、単球を、RPMI+10%の
ウシ胎仔血清、グルタマックス、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピ
ルビン酸ナトリウム、及びベータ-メルカプトエタノール中での4日間のGM-CSF(
R&D systems)及びIL-4(R&D systems)との培養時に、樹状
細胞に極性化した。
について評価した細胞株は、Jurkat、CA46、Daudi、Raji、及びex
pi 293細胞であった。Jurkat、CA46、Raji、及びDaudi細胞を
、RPMI培地+10%のウシ胎仔血清、グルタマックス、非必須アミノ酸、ピルビン酸
ナトリウム、及びペニシリン/ストレプトマイシン中で培養した。Expi 293細胞
を、DMEM+10%のFCS+グルタマックス中で培養した。OV-90、HepG2
、及びNCI-H441 RNAを、癌細胞株アトラスのバイオインフォマティクススク
リーンによって解析した。qPCRによってRNA発現について評価した細胞株について
、細胞を対数増殖期に採取し、1,000,000細胞を採取し、PBS中で洗浄し、3
50ulのRLT緩衝液(Qiagen)中で溶解した。RLT緩衝液中で溶解した細胞
を使用まで-80℃で保管した。
+T細胞、及びCD14+単球であった。細胞集団を、ヒトCD56+、CD4+、CD
8+、及びCD14+陽性セレクションキットを製造業者(Miltenyi Biot
ec)の指示に従って使用して単離した。分類後、細胞を350ulのRLT緩衝液中で
溶解し、使用まで-80℃で保管した。一部の場合には、活性化されたPBMCサブセッ
ト(活性化条件は上で概説した)を、培養物から採取し、350ulのRLT緩衝液中で
溶解し、使用まで-80℃で保管した。
解した細胞から生成した。cDNAを、高性能cDNA逆転写キットを使用して生成した
。cDNAを使用するqPCRを、Taqmanプライマー(ThermoFisher
)及びApplied Biosystems Taqman fast advanc
ed mastermixを使用して行った。使用したPVRIGプライマーセットはT
aqmanカタログ番号:Hs04189293_g1であった。使用したベータ-アク
チンハウスキーピングプライマーセットはTaqmanカタログ番号:Hs010606
65_g1であった。転写産物の発現をCt値の定量化によって評価し、相対的発現を2
(-ΔΔCt)法によって計算した。Applied Biosystems Step
One Plus機器上でデータを得た。
抗ヒトPVRIG抗体のカニクイザルPVRIG(cPVRIG)との交差活性を評価し
た:expi親及びexpi cPVRIG過剰発現細胞。これらの細胞を、DMEM+
10%のウシ胎仔血清+グルタマックス中で培養した。expi cPVRIG一過性過
剰発現細胞を、Neonトランスフェクション系を使用して、cPVRIG DNAの親
Expi細胞へのエレクトロポレーションによって生成した。FACS解析のために、e
xpi cPVRIG細胞をトランスフェクションから1~3日後に使用した。Expi
細胞を対数増殖期から採取した。各種類、ウェル当たり50,000~100,000個
の細胞を96ウェルプレートに播種した。抗ヒトPVRIG抗体(hIgG1)及びその
対応する対照を、一点希釈(5ug/ml)で、または30分~1時間の氷上における1
00ug/mlから開始した8点滴定シリーズとして添加した。滴定シリーズは、1:3
または1:3.3倍いずれかの連続希釈として実施した。FACS Canto IIを
使用してデータを得て、FlowJo及びPrismソフトウェアを使用して解析した。
球を、発現解析前24時間以内に採血した新鮮血から得た。血液はBioreclama
tionから得た。カニクイザルPBMC上のPVRIGのタンパク質発現を評価するた
めに、ヒト抗PVRIG抗体を含む、腫瘍免疫サブセットに向けた抗体カクテルを設計し
た。抗ヒトPVRIG抗体(hIgG1)及びその対応する対照を、一点希釈(5ug/
ml)で添加した。
5 ~1×106細胞/ウェルで播種したPBMCに添加した。抗体カクテルを、氷上で
30分~1時間、PBMCと共にインキュベートした。次に、PBMCを洗浄し、FAC
S Canto IIを使用するFACSによってデータを得た。Prismソフトウェ
アを使用してデータを解析した。解析した免疫サブセットは、CD16+リンパ球、CD
14+/CD56+単球/骨髄細胞、及びCD3+T細胞を含んだ。
、CD56+、CD16+、及びCD56-/CD16-サブセットであった。細胞集団
を、非ヒト霊長類CD56及びCD16陽性セレクションキットを製造業者(Milte
nyi Biotec)の指示に従って使用して単離した。分類後、細胞を350ulの
RLT緩衝液中で溶解し、使用まで-80℃で保管した。
解した細胞から生成した。cDNAを、高性能cDNA逆転写キットを使用して生成した
。cDNAを使用するqPCRを、Taqmanプライマー及びApplied Bio
systems Taqman fast advanced mastermixを使
用して行った。アカゲザルPVRIGを検出するための2セットのプライマーは、Com
pugen USA,Incによって設計され、Genscriptによって製造された
。配列及びプライマーコードは以下である。
プライマーセット1
順方向:CTTGTGTTCACCACCTCTGG
逆方向:TGTTCTCATCGCAGGAGGTC
プライマーセット2
順方向:TTGGCTGTGGATACCTCCTT
逆方向:ATAAGGGTCGTGGAGAGCAG
はTaqmanカタログ番号:Mf04354341_g1であった。転写産物の発現を
Ct値の定量化によって評価し、相対的発現を2(-ΔΔCt)法によって計算した。ま
た、PVRIGプライマー及びベータ-アクチンプライマーを用いて生成した産物を、2
.5%のアガロースゲルを使用して従来のRT-PCRによってサイズ解析した。App
lied Biosystems Step One Plus機器を使用してqPCR
データを得た。
PVRIG抗体は過剰発現細胞上でPVRIGを認識する:PVRIGに特異的であっ
た抗体についてスクリーンするために、ファージキャンペーンから生成された抗体が、P
VRIGを過剰発現するように操作されたHEK細胞株に結合する能力を評価した。ヒト
IgG1への再フォーマット時のこのキャンペーンに由来する抗体の大部分がHEK h
PVRIG細胞に結合したが、親和性は様々であった。更に、これらの抗体の大部分はH
EK親細胞株への低いバックグラウンド結合も示し、これはPVRIGに対する高い特異
性を示す。図27は、PVRIG抗体の特異性の一例を示す。このファージキャンペーン
において生成された対照と比較したHEK hPVRIG細胞に対する抗体の全結合特性
の概要を図31に示す。
タンパク質発現の評価に使用し得る細胞株についてまずスクリーンするために、バイオイ
ンフォマティクスによって評価してPVRIG RNAが高かった細胞株について癌細胞
株アトラスを検査した。qPCR解析によって検証するために選択したPVRIG RN
Aの高い発現主体であった商業的に容易に入手できた4つの細胞株を見出した。これらの
細胞株は、Jurkat、CA46、Raji、及びDaudiであった。
インフォマティクス解析と一貫したことを検出した(図28)。陰性対照として、比較的
低いPVRIG RNA発現を有したExpi細胞を含めた。
て検出してPVRIGタンパク質に対して陽性である可能性が高いサブセットについてP
BMCをまずスクリーンするために、主要なPBMCサブセットを選別し、qPCRによ
ってPVRIG RNA発現を検査した。CD56+NK細胞、CD4+T細胞、CD8
+T細胞、及びCD14+単球におけるPVRIG RNAのレベルを、Jurkat、
HEK親、及びHEK hPVRIG細胞株におけるレベルと比較した。図29に示すよ
うに、HEK GFP細胞に対して正規化したとき、PVRIG RNAが最も高く、C
D4+T細胞、CD8+T細胞、及びCD56+NK細胞において最大50倍高かった。
図28と同様、Jurkat細胞も陽性発現を示した。対照的に、CD14+単球はHE
K GFP細胞と比べて高いPVRIG発現を示さず、これはPVRIG RNA発現が
非常に低いことを示す。
激条件下で活性化し、PVRIG RNAの発現を評価した。より具体的には、NK細胞
を刺激サイトカインの種々の組み合わせによって活性化し、一方でT細胞は、極性化サイ
トカインを用いてまたは用いずに、ヒト活性化Dynabeadsまたはブドウ球菌エン
テロトキシンB(SEB)によってポリクローナル的に活性化した(詳細についてはプロ
トコルの節を参照)。図30A及びBに示すように、PVRIG RNA発現は、種々の
刺激条件でNK細胞及びT細胞の両方において概して増加し、その程度は個々のドナーに
依存した。より具体的には、図30aは、ナイーブ及び活性化CD4 T細胞及びNK細
胞におけるPVRIG RNA発現を示す。図30bは、ナイーブ及び活性化CD8 T
細胞におけるPVRIG RNA発現を示す。
胞上のPVRIGタンパク質を認識する:ナイーブ及び活性化PBMCサブセットにおけ
るPVRIG RNA発現のRNA発現パターンを確認する際には、発明者らによるPV
RIG抗体パネルを使用してタンパク質発現を評価した。ナイーブPBMCサブセットに
おけるPVRIG発現をまず評価した。最も高いレベルのPVRIGを示す集団はNK細
胞であった。CD4+及びCD8+T細胞は低レベルのPVRIG示し、一方でB細胞及
び単球は検出可能な発現を有しなかった。発明者らの抗体によって検出されたNK細胞及
びCD8+T細胞上の発現の概要を図32に示す。他のより少数のサブセットもPVRI
G発現を示し、NKT細胞及びγδT細胞等の従来型ではないT細胞を含んだ。PBMC
サブセット上の発現パターンは、調達し解析した全ドナーにわたってよく似ていた。
びMLRを含む)の後に評価すると、PVRIGの着実な上方調節は、NK細胞ならびに
CD4+及びCD8+T細胞を含むいずれのPBMCサブセットでもなかった。更に、G
M-CSF及びIL-4を用いて樹状細胞に対してインビトロで極性化した単球は、非極
性化単球で見られたものと一致して、検出可能なPVRIG発現を示さなかった。
ク質発現についてのPBMCのスクリーニングに加えて、それが癌細胞株上でも発現され
たかどうかの理解を望んでいた。RNA発現によって特定した陽性細胞株を使用して(図
28)、発明者らの抗体をJurkat及びCA46細胞上でスクリーニングすることを
選択し、これは、それらが発明者らのハウスキーピング遺伝子に対して最も低い絶対Ct
値を示したためである。また、OV-90、NCI-H441、及びHepG2を含む発
明者らの抗体の特異性を更に検証するために、様々な陰性の細胞株を選択した。発明者ら
の抗体の一部は、Jurkat及びCA46細胞上でPVRIGタンパク質発現を検出し
たが(図31)、陰性の細胞株ではしなかった。Jurkat及びCA46でのPVRI
G検出の例を、代表的な抗体であるCPA.7.021を用いて図33に示す。Jurk
at及びCA46での発現は互いに一致し、発現の強度は2つの細胞株にわたって類似し
ていた。
出する:カニクイザルにおける薬理学的研究に対する発明者らの抗ヒトPVRIG抗体の
臨床前適合性を評価するために、発明者らの抗体がカニクイザルPVRIG(cPVRI
G)と交差反応するかどうかの理解を望んでいた。発明者らの抗体の一部は、Expi細
胞に一過性トランスフェクトしたcPVRIGを検出することができた(図29)。陰性
染色を生じた抗体(CPA.7.021)及び陽性染色を生じた抗体(CPA.7.02
4)の例を図34に示す。
C上でのPVRIGタンパク質の評価の前に、まずカニクイザルPBMCサブセットにお
けるPVRIG RNA発現プロファイルを決定することを望んでいた。cPVRIGプ
ライマーセットが存在しなかったため、cPVRIG遺伝子上の2つの明確に異なる部位
に向けた2つのセットを設計した。一方のプライマーセットはcPVRIGのX2変異体
に特異的であったが、他方のセットはX1変異体とX2変異体との両方を拾うことができ
た。図35に示すように、両方のプライマーセットが、互いに比較して同様のレベルでc
PVRIG RNAを検出することができた。更に、単球と比較してエフェクターリンパ
球(NK及びT細胞)において明確に異なるPVRIG RNAシグネチャが存在するヒ
トPBMCとは異なり、cPVRIG RNAは、評価した全ドナー由来の全PBMCサ
ブセットにわたって同様のレベルで発現された。
:カニクイザルPBMCに関するcPVRIG RNAプロファイルを確立した後、抗ヒ
トPVRIG抗体の選定したパネルを使用してカニクイザルPBMC上のcPVRIGタ
ンパク質の存在についてスクリーニングした。PBMCのスクリーニングに選択した抗体
は、cPVRIG一過性細胞に結合するその能力及び/または機能活性に基づいた。。図
36に示すように、様々な抗体に由来するCD16+リンパ球サブセット(NK細胞)上
のcPVRIGの低レベルの発現は検出することができたが、CD3+リンパ球サブセッ
ト(T細胞)またはCD14+ CD56+骨髄サブセット(単球)上ではできなかった
。このデータにも関わらず、対照を超えて陽性検出を示した抗体(黒色の実線で図示する
)は、cPVRIG一過性細胞に結合することができたものと相関しなかった。例えば、
CPA.7.021による染色のレベルは、前者がcPVRIG一過性細胞に結合しない
にも関わらず、CPA.7.024を上回った(図36参照)。
けたモノクローナル抗体を生成することに成功した。操作された過剰発現細胞及び一式の
癌細胞株を使用して、発明者らの抗体がPVRIG抗原に高度に特異的であり、RNA発
現と相関するタンパク質発現を検出できることを示した。ヒトPBMCサブセットの解析
の際に、PVRIGタンパク質がNK細胞上で最も高く発現され、従来のCD3+T細胞
上では低く発現し、B細胞及び骨髄細胞上では検出可能ではないことが示された。発現は
、これらの細胞型を種々の刺激条件に露出させた際、堅実には変化しなかった。また、発
明者らの抗体のパネルがカニクイザル(cyno)PVRIG抗原と交差反応性であるこ
とを、その過剰発現細胞への結合を評価することによって示した。しかしながら、この抗
体パネルのcyno PBMCへの低レベルの結合、RNAとのタンパク質相関の欠如、
及び過剰発現細胞と結合するその能力の不一致(PBMCと比較して)の組み合わせは、
PBMC上のPVRIG抗原が非常に低い/負であり得るか、またはそれが過剰発現細胞
と比較して異なる/より複雑な形態で発現されることを示す。
健常なドナー由来のPBMCサブセットにおけるPVRIGの発現:健常なドナー由来
のPBMCサブセットにおけるPVRIGの発現を試験した(ゲーティング戦略は図1a
に示す)。試験した試料において、PVRIGは、CD8+T細胞(データ割愛)、CD
8α+γδT細胞(データ割愛)、二重負γδT細胞(データ割愛)上で発現し、健常な
ドナーPBMC(n=5)のCD4+T細胞(データ割愛)でもより軽度に発現すること
を示した。
卵巣癌腹水、MSS、CRCのPBL、ならびに休止及び同種活性化された健常なPB
MCにおけるPD1、TIGIT、及びHLA-DRとのPVRIGの共発現:PVRI
Gは卵巣癌腹水におけるCD8+T細胞上でTIGITと共発現される(データ割愛)。
この試料では、様々なレベルのPVRIG発現が観察され、これはPD-1発現のものと
重複する。低レベルのHLA-DRは低レベルのPVRIG発現と相関した。非常に低レ
ベルのPVRIGがCD4+T細胞上で観察され、この特定の試料においてであり、PD
1、TIGIT、及びHLA-DRとの相関がないことを示す。
と共発現される(データ割愛)。PVRIGの低い発現レベルがこの試料において観察さ
れ、これは、低レベルのTIGIT及びHLA-DRと相関した。この患者由来のTIL
は、表面PVRIGについての染色が陽性であり、PD1及びTIGITについても陽性
であった小さいCD8+集団を有した(データ割愛)。細胞内染色は、PD-1の発現パ
ターンを反映する顕著なPVRIG染色を明らかにし、これは、PD1-PVRIG-及
びPD1+PVRIG+である2つの明確に異なる集団を示す(データ割愛)。細胞内P
VRIG+ CD8+T細胞は、HLA-DR+及びTIGIT+とより良好に相関する
ようである。PVRIGは、CD4+T細胞の表面上で検出可能ではなく、少数のみのC
D4+細胞がPD1+集団において陽性の細胞内PVRIG染色を示した。細胞内PVR
IG+集団が非常に小さいことにより、PVRIGがTIGIT及びHLA-DRと共発
現されるかどうかを決定することは困難である。
ITの発現パターンを反映し、これは、明確に異なるPD1-PVRIG-及びPD1+
PVRIG+集団、ならびに明確に異なるTIGIT-PVRIG-及びTIGIT+P
VRIG+集団を示す(データ割愛)。PVRIGはCD4+細胞上で検出されなかった
。興味深いことに、同種活性化の後で、PVRIG及びPD-1の共発現がCD4+上で
観察された(しかしCD8+上では観察されなかった)(データ割愛)。
PBLにおいてTIGITと、ならびにPD-1健常なドナーのPBMCと、及び健常な
ドナー由来の同種活性化されたPBMCのCD4+ T細胞においてPD1と共発現する
ことが示された。
正常なPBMC、尿膜管癌、結腸直腸癌、卵巣癌腹水、及び肺癌由来のリンパ球集団上
のPVRIGの発現:結果:CD4+及びCD8+T細胞、NK細胞、ならびにCD4+
及びCD8+NKT細胞上のPVRIGの発現を、健常なドナーのPBMC及び扁桃腺に
おいて、ならびに尿膜管癌、結腸直腸癌、卵巣癌腹水、肺癌、及び黒色腫由来のTILに
おいて解析した。
ルのPVRIG発現がNK細胞(データ割愛)及びCD8+NKT細胞(データ割愛)上
で検出され、CD8+T細胞(データ割愛)及びCD4+NKT(データ割愛)でもより
軽度の発現が検出された。CD4+T細胞も、一部のPBMCにおいてPVRIGについ
ての染色が陽性であったが、発現のレベルは極めて低かった(データ割愛)。
癌TIL(n=3)(データ割愛)及び尿膜管癌TIL(n=1)由来のNK細胞におい
て、PVRIG発現が検出された。
が不在であったためである。
更なる評価を行い、ヒト及びマウス細胞株においてPVRIGを過剰発現する更なる組
織を特定した。
)Hs04189293_g1、カタログ#4331182、ハウスキーピング遺伝子(
HSKG)のためのTaqManプローブ(Life technologies)ヒト
RPL19 Mm 01577060_gH、ヒトHPRT1 Hs02800695_
m1、ヒトSDHA Hs00417200_m1、ヒトPBGD Hs0060929
6_g1、及びヒトTATA Box Hs00375874_g1。マウスPVRIG
TaqManプローブ(Life technologies)CC70L8H、CC
6RN19 Custom TaqManプローブ。ハウスキーピング遺伝子(HSKG
)のためのTaqManプローブ(Life technologies)マウスRPL
19:Mm02601633_g1。ABI TaqMan Fast Advance
d Master mix、パーツ番号4444557、Applied Biosys
tem。American Type Culture Collection(ATC
C)及びCLS(Cell line service)からの市販のヒト及びマウス癌
細胞株は表1で詳述する。ヒト及びマウス細胞株からのRNA抽出を、RNAeasy
Mini Kit(Qiagenカタログ番号74014)を用いて行った。cDNAを
、High Capacity cDNA Reverse Transcriptio
n Kit(Applied Biosystemsカタログ番号4368814を使用
して産生させた。市販のマウスポリクローナル抗PVRIG Ab MaxPab(B0
1)、Abnova、カタログ番号H00079037-B01、1:200希釈。マウ
スIgG1、Life Technologies、カタログ番号MG100、1:20
0希釈。市販のマウスポリクローナル抗PVRIG Ab、Sigma、カタログ番号S
AB1407935、10ug/ml。Chrom pure Mouse IgG、全
分子、Jackson、カタログ番号015-000-003、10ug/ml。Goa
t Anti Mouse-PE、Jackson、カタログ番号115-116-14
6、1:100希釈。Custom polyclonal Rat-Anti mou
se PVRIG、バッチ番号20153456C.1、Aldevron、10ug/
ml。Custom Rat total IgG、バッチ番号GV20884.1、A
ldevron、10ug/ml。Goat Anti Rat-PE、Jackson
、カタログ番号112-116-143、1:100希釈。AF647にコンジュゲート
した抗ヒトPVRIG-CPA.7.024 mIgG1、10ug/ml。AF647
にコンジュゲートした抗ヒトPVRIG-CPA.7.050 mIgG1、10ug/
ml。AF647にコンジュゲートした抗ヒトPVRIG-CPA.7.005 mIg
G1、10ug/ml。AF647にコンジュゲートした抗ヒトPVRIG-CPA.7
.002 mIgG1、10ug/ml。AF647にコンジュゲートしたSynagi
s IgG1、10ug/ml。AF647にコンジュゲートした抗ヒトPVRIG-C
PA.7.021 mIgG1、10ug/ml。AF647にコンジュゲートしたSy
nagis IgG2、10ug/ml。ウサギポリクローナル抗PVRIG Ab、S
igma、カタログ番号HPA047497、1:300希釈。Goat Anti ウ
サギ-HRP、Jackson、カタログ番号111-035-003、1:100希釈
。VioBlue、Fixable viability stain 450、BD
Bioscience、カタログ番号562247、1:1000希釈。Human T
rustain FcX、Biolegend、カタログ番号422302。ラット抗マ
ウスCD16/CD32 Fcブロック、BD、カタログ番号553142。Ingen
io Electroporation solution、Mirus、カタログ番号
MIR50114。ON-TARGETplus Human PVRIG siRNA
-SMARTpool、Dharmacon、カタログ番号L-032703-02。O
N TARGET plus non targeting siRNA、Dharma
con、カタログ番号 D-001810-01-05。本研究で使用したヒト細胞株を
図54に示す。
1-5ug)抽出物(表1及び2に詳述)を、製造業者のプロトコルに従って行った。c
DNAを製造業者のプロトコルに従って調製した(20ulのcDNA混合反応物中で希
釈した1ugのRNA)。1:10で希釈した上記のように調製したcDNA(反応当た
り25ngのRNAを表す)を、遺伝子特異的TaqManプローブを使用して(材料及
び方法1.1 1~4に詳述)、qRT-PCR反応のための鋳型として使用した。検出
を、QuantStudio 12kデバイスを使用して行った。反応が閾値レベルの蛍
光を達成したサイクル(Ct=閾値サイクル)を記録し、RT反応における相対的転写産
物量を計算するために使用した。絶対量を、方程式Q=2^-Ctを使用して計算した。
結果として得た相対量を、ハウスキーピング遺伝子mRPL19またはhRPL19の相
対量に対して正規化した。
RIGの発現を、全細胞抽出物を使用してWBによって解析した(癌細胞株について45
ug、ならびに過剰発現細胞株及び陰性対照細胞株について30ug)。市販のウサギポ
リクローナル抗ヒトPVRIG pAb、Sigma、カタログ番号HPA047497
、5%のBSA/TBST中1:300希釈、続いてコンジュゲートした二次Abヤギ抗
ウサギ-ペルオキシダーゼ(Jackson、カタログ番号111-035-003)、
5%の乳TBST中1:20,000希釈。
の細胞表面発現をFACSによって解析した。ヒトまたはマウス細胞株を、PBS中1:
1000で希釈したVioBlue試薬で染色した。細胞を室温で15分間インキュベー
トした後、PBSで一度洗浄した。内因性タンパク質解析のための細胞株を、材料の節に
おいて上に列挙したFc 受容体遮断溶液と共に事前インキュベートした(2.5μl/
反応のヒト遮断薬及び1μl/反応のマウス遮断薬を製造業者の手順に従って使用した)
。ヒトPVRIGタンパク質を検出するために、細胞を、市販のポリクローナル抗ヒトP
VRIG、または10ug/mlもしくは1:200の濃度に希釈した(それぞれ、Si
gma Ab及びmAb、またはAbnova Abについて)カスタムモノクローナル
抗ヒトPVRIG mAb(Inc産生、上の材料及び方法の節に詳述)、または同じ濃
度のIgG1 アイソタイプ対照、続くヤギ抗マウスPEコンジュゲートAbで染色した
。
したカスタムラットポリクローナル抗マウスPVRIG pAb(Aldevron)、
または同じ濃度のアイソタイプ対照としてのラットIgG全分子、続く1:100希釈の
ロバ抗ラット-PEコンジュゲートAbで染色した。
トランスフェクションによって実行した。100pmolのPVRIG siRNAプー
ルまたはスクランブルsiRNAのトランスフェクションを、材料及び方法において上で
列挙したように、また製造業者の手順に従って、Amaxa nucleofector
デバイス及びMIRUS Ingenioエレクトロポレーション溶液を使用して、エレ
クトロポレーションによって行った。トランスフェクションから48時間後、qRT-P
CR及びFACSによる更なる解析のために細胞を収集した。
性発現
に列挙する)、qRT-PCRを、材料及び方法において上述したように特異的TaqM
anプローブを使用して行った。図56に示す通り、ヒトPVRIG転写産物は、Taq
ManプローブHs04189293_g1を使用して、Jurkat(A、B)、HU
T78(A、B)、及びHL60(B)細胞株において比較的高いレベルで観察された。
より低い転写産物レベルがTHP1、RPMI8226(B)細胞株において観察された
。全ての他の細胞株は、転写産物をほとんどまたは全く示さない。
細胞株におけるPVRIG転写産物の存在を検証するために(図55に列挙する)、qR
T-PCRを、材料及び方法において上述したように特異的TaqManプローブを使用
して行った。図57に示すように、マウスPVRIG転写産物は、TaqManプローブ
CC70L8Hを使用して、NIH/3T3、Renca、SaI/N、及びJ774A
.1(A)細胞株において比較的高いレベルで観察された。より低い転写産物レベルがC
T26(A)及びB-104-1-1(B)細胞株において観察された。全ての他の細胞
株は、非常に低い転写産物しか示さない。
ク質の内因性発現についてのWB解析を、上記の材料及び方法に記載のように市販の抗ヒ
トPVRIG pAb(Sigma、HPA047497)を使用して図54に詳述する
種々のヒト癌細胞株溶解物に対して実行した。陽性対照として、安定したHEK293細
胞プール過剰発現PVRIGの全細胞抽出物を使用し、一方で、空ベクターでトランスフ
ェクトした細胞を陰性対照として機能させた。図58に示す通り、約35kDに対応する
タンパク質バンドが、陽性対照HEK293過剰発現細胞(レーン2)において、及び細
胞株(レーン3)において検出された。ヒトPVRIGの発現は、陰性対照として働く空
ベクター細胞(レーン1)においてもZR75-1ヒト細胞株(レーン4)においても検
出されなかった。
株(図54で詳述)を、上記の材料及び方法に記載のように試験した。細胞株を、市販の
Ab(Abnova)またはアイソタイプ対照、続いて二次ヤギ抗マウスPE Abで染
色した。FACSによる解析を行った。アイソタイプ対照結合と比較して、Abnova
抗体の結合がJurkatヒト癌細胞株において観察された。Abnova Abの結合
は試験した他の細胞株においては観察されなかった:アイソタイプ対照結合と比較したC
apan2及びZR75-1について、追加のFACS解析を、種々のヒト細胞株に対し
てSigma販売のAbを使用して行うと(Jurkat、HUT78、Karpas2
99、及びNK-YTS)、結合はJurkat細胞のみで観察されたが、他の細胞株で
は結合は観察されなかった(データ割愛)。
明の種々のモノクローナル抗体の結合を試験することによって行った。Jurkat細胞
株を、AF647にコンジュゲートした5つの抗ヒトPVRIGカスタムmAb(CPA
.7.024、CPA.7.050、CPA.7.005、CPA.7.002、及びC
PA.7.021)、またはAF647にコンジュゲートした関連アイソタイプ対照Ab
で染色し、FACSによる解析を行った。Jurkatヒト細胞株におけるヒトPVRI
Gの発現が、アイソタイプ対照発現と比較して、CPA.7.021及びCPA.7.0
50のみで観察された。ヒトPVRIGへの結合は、他の3つのmAbを使用することに
よってではJurkat細胞株において観察されなかった。
ス細胞株:J774A.1、NIH/3T3、SaI/N、及びRenca(図55で詳
述)を、上記の材料及び方法に記載のように試験した。細胞株を、カスタムポリクローナ
ルラット抗マウスPVRIG Ab(Aldevron)によって、またはアイソタイプ
対照(Aldevron)、続いて二次ヤギ抗ラットPE Abによって染色した。FA
CSによる解析を行った。マウスPVRIGタンパク質への結合は、Aldevronポ
リクローナルAbによって試験したマウス細胞株のいずれにおいても観察されなかった(
データ割愛)。
RIGタンパク質の内因性発現を更に確認するために、ヒトPVRIG siRNAプー
ルを、材料及び方法に記載のようにノックダウンに使用した。siRNA トランスフェ
クションから48時間後、qRT-PCR及びFACSによる更なる解析のために採取し
た。
に示すように、ヒトPVRIG siRNAプールでトランスフェクトしたJurkat
細胞におけるヒトPVRIG転写産物レベルは、材料及び方法に記載のようにqRT-P
CRによって解析して、スクランブルsiRNAでトランスフェクトした細胞(左のヒス
トグラムバー)と比較して著しく低減した(右のヒストグラムバー)。
iRNAトランスフェクト細胞におけるヒトPVRIG膜発現の更なる解析をFACSに
よって行った。図60に示すように、ヒトPVRIGタンパク質の膜発現は、スクランブ
ルsiRNAでトランスフェクトした細胞(オレンジ色)と比較して、PVRIG si
RNAでトランスフェクトした細胞(CPA.7.021mAbについては緑色またはS
igma Abについては赤色)において低減する。Jurkat細胞株における倍率変
化(抗PVRIG対アイソタイプ対照)は、Sigma Abを使用することによって8
倍から3.3倍に、あるいはCPA.7.021 mAbを使用することによって15.
3倍から2.8倍に減少する。
細胞株におけるPVRIG内因性発現についての予備データを含む。
FACSによって試験した。
bnova)及びマウスモノクローナルAb(Inc)を使用することによって、ヒトP
VRIGの細胞表面発現がJurkat細胞株において観察された。これらの観察は、図
1A及びBに示すようにRNA転写レベルと、また図3に示すようにWB結果と相関する
。
よって行い、図5に示すように、PVRIG siRNAトランスフェクション後のRN
A転写産物の明白な低減を確認し、同様に、市販のAb及びモノクローナルAbによって
、図6に示すようにJurkat細胞株におけるタンパク質細胞表面発現の低減が観察さ
れた。
によって試験した。図2A及びBに示すように、転写レベルで、PVRIGの存在がJ7
74A.1、NIH/3T3、SaI/N、及びRenca細胞株で観察された。しかし
、マウスPVRIGの膜発現は、ポリクローナルAb(Aldevron)によって検出
したこれらの試験した細胞株において観察されなかった(データ割愛)。図61及び図6
2は、ノックダウンによって確認したqPCRとFACSとの間の相関を示す細胞株を強
調する、本報告に記載の所見の概要を示す。
この実験の目的は、ヒト黒色腫試料から単離し、黒色腫特異的抗原及びIL2の存在下
で繁殖させた休止または活性化ヒト(腫瘍浸潤性リンパ球)TIL上のPVRIGタンパ
ク質の発現を評価することである。ヒトPVRIGの細胞外ドメイン(ECD)に向けさ
せたヒトmAbを産生させた。FACS解析によって細胞上のPVRIGの発現を検査す
るために、これらのAbをAlexa flour 647で直接標識した。
TIL:この実験シリーズでは、3名の黒色腫患者の切除した転移に由来する3つの異
なる腫瘍-浸潤性リンパ球(TIL)を使用した:1)TIL-412- HLA-A2
-Mart1特異的、2)TIL-F4- HLA-A2-gp100特異的、及び3)
TIL-209- HLA-A2-gp100特異的。ヒトTIL(>90% CD8+
)を実験開始24時間前に解凍した。細胞を、300U/mlのrhIL2(Biole
gend 509129)を補充した12mlのTIL培地(IMDM+10%のヒト血
清+1%のGlutamax+1%のNa-ピルビン酸塩+1%の非必須アミノ酸+1%
のPen-Strep)中で解凍した。細胞を24時間凍結から回復させた。
mlのIL2(Biolegend、カタログ番号589106)を用いる、2)1 μ
g/mlのプレートに結合した抗CD3抗体(eBioscienceクローンOKT3
、カタログ番号16-0037-85)+2 μg/mlの抗CD28 ab(eBio
scienceクローンCD28.2、カタログ番号16-0289-85)+300U
/mlのIL2を使用するT細胞のポリクローナル活性化を用いる、3)Mel888(
LIMS ID:CL-216)黒色腫細胞(HLA-A2陰性)との共培養(1:1)
、及び4)Mel624(LIMS ID CL-218)黒色腫細胞(HLA-A2+
Mart1/gp100陽性)との共培養(1:1)。
間、1/1000の固定性生死判定染料efluor 450(BD horizon、
カタログ番号562247)を補充したPBSで染色した。染色後、細胞をPBSで2回
洗浄し、氷上で15分間、1/25のヒトTruestain FC-Block(Bi
olegend、422302)を補充したFACS緩衝液(PBS+0.5%のBSA
+2mMのEDTA+0.05%のアジド)で染色した。FC妨害後、細胞を、Ab及び
表1に列挙する濃度によって30分間氷上で染色した。
BD、552843)を使用して補償較正を行った。一滴のビーズを上記の抗体で30分
間染色した。ビーズ染色を細胞染色と同じ濃度で行った。ビーズ染色後、標準的な手順に
従ってMacsQuant FACSマシン上で補償を行った。全ての試料をMACSQ
uant解析器(Miltenyi)上で得て、データを、Tree Star Flo
wJoソフトウェア(v10.0.8)を使用して解析した。
培養した休止TILをPVRIG発現について染色し、FACSによって解析した。TI
Lのためのゲーティング戦略:リンパ球をまずFCS:SSCグラフにおいてサイズ及び
粒度に従ってゲーティングし、次に単細胞をFSC-H及びFSC-Aに従ってゲーティ
ングし、次に生細胞をVioblue:FSCグラフにおいて生死判定色素染色に従って
ゲーティングし、CD8+細胞をCD8:FSCグラフにおいてCD8染色に従ってゲー
ティングした。その後、PVRIGの発現レベルをヒストグラムにおいてPVRIG染色
に従ってプロットした。
調節される:抗CD3+抗CD28 ab+IL2と共に12時間培養したヒトTILを
、PVRIG発現について染色し、FACSによって解析した。検査した3つ全てのTI
Lの表面上のPVRIG発現は、休止TILと比較して、活性化の際に下方調節される(
データ割愛)。
る:Mel888細胞と共に12時間共培養したヒトTILを、PVRIG発現について
染色し、FACSによって解析した。検査した3つ全てのTILの表面上のPVRIG発
現は、休止TILと比較して、Mel888との共培養の際にわずかに下方調節される。
l624細胞と共に12時間共培養したヒトTILを、PVRIG発現について染色し、
FACSによって解析した。検査した3つ全てのTILの表面上のPVRIG発現は、休
止TILと比較して、Mel624との共培養の際にわずかに下方調節される。
を、CD96、PVR、PVRL2、TIGIT、及びDNAM1の発現について染色し
、FACSによって解析した。CD96、TIGIT、及びDNAM1は、3つ全ての検
査したTIL上で発現される。PVRも3つ全てのTILの表面上で発現されるが、レベ
ルは比較的低い。PVRL2は、TILのいずれでも検出されない。
:抗CD3及び抗CD28 abと共に12時間培養したヒトTILを、CD96、PV
R、PVRL2、TIGIT、及びDNAM1の発現について染色し、FACSによって
解析した。抗CD3+抗CD28 abによる活性化の際、CD96は下方調節され、P
VRはわずかに上方調節され、TIGITはわずかに上方調節され、DNAM1も上方調
節される。
と共に12時間共培養したヒトTILを、CD96、PVR、PVRL2、TIGIT、
及びDNAM1の発現について染色し、FACSによって解析した。Mel888との共
培養の際、CD96は下方調節され、PVRは大きく上方調節され、TIGIT及びDN
AM1は下方調節され、PVRL2もわずかに誘導される。
と共に12時間共培養したヒトTILを、CD96、PVR、PVRL2、TIGIT、
及びDNAM1の発現について染色し、FACSによって解析した。ゲーティング戦略を
図1に従って行った。Mel624との共培養の際、CD96は下方調節され、PVRは
大きく上方調節され、TIGITは安定しているかまたはわずかに上方調節され、DNA
M1は下方調節され、PVRL2はわずかに誘導される。
CD28 abによって活性化したか、またはMel888もしくはMel624細胞と
共に共培養したヒトTILを、PD1の発現について染色し、FACSによって解析した
。図16及び図17で見ることができるように、PD1は、休止TIL412上のみで発
現される。PD1発現の変化はMel888との共培養の際には見られないが、Mel6
24との共培養時または抗CD3+抗CD28 abによる活性化時に、PD1は3つ全
てのTILにおいて上方調節される。
●抗PVRIG-CPA.7.021 abはTILを染色する(最大2.6倍)
●PVRIG発現は抗CD3+抗CD28 abによる12時間の活性化時またはMe
l624との共培養時に下方調節される(ほぼバックグラウンドレベルまで)。
●休止TILはCD96、TIGIT、及びDNAM1を発現する(それぞれ、最大3
5、12、及び79倍)
●CD96発現は、活性化時(最大35~約11倍)または無関係の(HLA-A2-
)黒色腫との共培養時に下方調節される
●DNAM1発現は、αCD3/CD28 abとの活性化時(最大79~102倍)
に上方調節されるが、TILのMelとの共培養時に強く下方調節される(8倍まで)。
●TIGIT発現は、TILのmel888細胞株との共培養時にわずかに下方調節さ
れ、Mel624との共培養時または抗CD3+抗CD28 abによる活性化時には、
わずかな上方調節を伴って安定していた。
●PD1発現は活性化時に上方調節される(0~最大18倍)
●高レベルのPVRが黒色腫とのTILの共培養後に検出された(2未満~最大18倍
)。
わずかに陽性であるが、TIL-209は陰性である。異なる条件での試験した全パラメ
ータの発現レベルにおける変化の概要は、表2で見ることができる。
この実施例の目的は、休止及び活性化ヒト単離一次CD4+及びCD8+T細胞上、な
らびにヒト黒色腫試料から単離し、黒色腫特異的抗原及びIL2の存在下で繁殖させたT
IL(腫瘍浸潤性リンパ球)上のPVRIGタンパク質の発現を評価することであった。
ヒトPVRIGの細胞外ドメイン(ECD)に対するヒトmAbを産生させた。FACS
解析によって細胞上のPVRIGの発現を検査するために、これらのAbをAlexa
flour 647で直接標識した。
TIL:この実験シリーズでは、3名の黒色腫患者の切除した転移に由来する2つの異
なるTILを使用した:
TIL-Mart1-HLA-A2-Mart1特異的
TIL-209-HLA-A2-gp100特異的
U/mlのrhIL2(Biolegend 509129)を補充した12mlのTI
L培地(IMDM+10%のヒト血清+1%のGlutamax+1%のNa-ピルビン
酸塩+1%の非必須アミノ酸+1%のPen-Strep)中で解凍した。細胞を24時
間回復させた。
ドナー#147由来のCD4+及びCD8+
ドナー#186由来のCD4+及びCD8+
mlのrhIL2(Biolegend 509129)を補充したRPMI完全培地(
RPMI+10%のFBS+1%のGlutamax+1%のNa-ピルビン酸塩+1%
のPen-Strep)中で解凍した。細胞を24時間回復させた。
D-pharmingenクローンUcht-1、カタログ番号555329)、2 μ
g/mlの抗CD28 ab(eBioscience クローンCD28.2、カタロ
グ番号16-0289-85)、及び300U/mlのIL2によって、T細胞のポリク
ローナル活性化を使用して活性化した。
の固定性生死判定染料efluor 450(BD horizon、カタログ番号56
2247)を補充したPBSで染色した。染色後、細胞をPBSで2回洗浄し、
のEDTA+0.05%のアジド)中、氷上で30分間、及び
衝液中に再懸濁した。
たか、または材料及び方法に記載のように種々の時点でポリクローナル刺激した。細胞活
性化状態を、活性化CD8+、CD4+T細胞、及びTILについて示すように(それぞ
れ、図70A、B、及びC)、アイソタイプ対照(FMO)と比較した各時点でのCD1
37及びPD-1の表面発現の検出によって評価した。予測通り、PD-1及びCD13
7発現が検出され、活性化時に上昇した(図70A、B及びC)。
3倍)と比較してCD8+細胞上でより高く発現し(6~8倍)、活性化時に衰退した(
図71A、B、及びC)。活性化の3日~6日目に、PVRIG発現は、図71で見るこ
とができるようにCD8+(4~5 倍)及びCD4+(2~3倍)T細胞上で増加した
。
性化時に減少した(図72A、B、及びC)。活性化の3日~6日目に、PVRIG発現
は、活性化の1日~2日目と比較して、図72で見ることができるように増加した。
び特性評価
細胞株過剰発現PVRIGヒト及びマウスタンパク質の組み換え安定プールを、PVR
IGが免疫に与える影響の決定に使用するため、PVRIG特性評価のため、及び免疫調
節PVRIG系治療薬の特定のために生成した。
試薬:DNA構築物:
ヒトPVRIG flag pUC57
ヒトPVRIG flag pCDNA3.1
ヒトPVRIG flag pMSCV
組み換え細胞:
HEK293 pCDNA3.1ヒトPVRIG flag
HEK293 pMSCVヒトPVRIG flag
市販の抗体:
抗PVRIG、Sigmaカタログ番号HPA047497-ウサギポリクローナル
抗PVRIG、Abnovaカタログ番号H00079037-B01-マウスポリク
ローナル
して行った。
NAパネルの混合物を使用した:
1.cDNAパネルI、マウス、Biochain、カタログ番号C8334501(
心臓、脳、腎臓、肝臓)。
2.cDNAパネルII、マウス、Biochain、カタログ番号C8334502
(肺、膵臓、脾臓、骨格筋)。
3.cDNA、Clontech、カタログ番号637301(脳、心臓、7日目の胚
、精巣、脾臓)。
ヒト及びマウスPVRIG-flagの完全長クローニングを、ヒト転写産物に対して
コドン最適化し、マウス転写産物に対して最適化していない、pUC57ベクター中の配
列を使用する遺伝子合成(GenScript)によって行い、哺乳動物発現ベクター、
pcDNA3.1、またはpMSCVにサブクローニングして、発現プラスミドを創出し
た。
パク質の第2のメチオニンから始まり、一方でpMSCVにサブクローニングしたヒトP
VRIG配列は、ヒトPVRIGタンパク質の第1のメチオニンから始まる。
I制限酵素を使用するpcDNA3.1を使用するにサブクローニングした。
マウス配列をコードする4つの構築物を、以下のようにGenScriptによって合
成した:
1.標識なしの第1のメチオニン
2.Flagありの第1のメチオニン
3.標識なしの第2のメチオニン
4.Flagありの第2のメチオニン
合成遺伝子をpCDNA3.1にサブクローニングした
PVRIGタンパク質を過剰発現している安定したトランスフェクタントの生成
スフェクション及び安定性プール生成に使用した。発現構築物によってコードされるタン
パク質配列は図103に示す通りである。
ルの生成
HEK293(ATCC、カタログ番号:CRL-1573)細胞を、FUGENE
6 試薬(Roch、カタログ番号11-988-387)を使用して、pCDNA3.
1+ヒトPVRIG-flagプラスミドまたは空ベクター(陰性対照としてのpCDN
A3.1+)でトランスフェクトした。Geneticin、G418(Gibco、カ
タログ番号:11811-031)耐性コロニーを安定性プール生成のために選択した。
を、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Invitro
gen、カタログ番号11668019)を使用して、pMSCV-ヒトPVRIGまた
はpMSCV 空ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間
後、ビリオンを含む上清を収集し、以下のようにヒト細胞株の感染に直接使用した:
発現しているビリオン、または陰性対照としてpMSCV空ベクタービリオンに感染させ
、ピューロマイシン(Invivogen、カタログ番号:58-58-2)耐性コロニ
ーを安定性プール生成のために選択した。
ウェスタンブロットによる発現検証
細胞プールの全細胞抽出物(30ugの全タンパク質)をウェスタンブロットによって
解析した。陰性対照として、空ベクターでトランスフェクトした安定性細胞プールの全細
胞抽出物を使用した。ヒトPVRIG-flag検出には、抗flag及び抗PVRIG
抗体を以下のように使用した:
、TTBS/5%のBSA中で1:1000に希釈;
、TTBS/5%のBSA中で1:200に希釈。その後、ヤギ抗ウサギ-HRP、Ja
ckson、カタログ番号111-035-003、5%乳/TTBS
溶液中で1:20,000に希釈。
組み換え安定性プールにおけるヒトPVRIGタンパク質の細胞表面発現を検証するた
めに、1×105細胞を、室温で10分間、PBS中で1:1000に希釈した固定性生
死判定染料450(BD、562247)で染色した。続いて、1:200に希釈したマ
ウスポリクローナル抗PVRIG(Abnova、カタログ番号H00079037-B
01)またはマウスIgG1 アイソタイプ対照(Life Technologies
)を細胞に添加した後、ヤギ抗マウス-PE(Jackson、カタログ番号115-1
16-146)で染色した。
ール細胞の発現検証
安定してトランスフェクトしたHEK293細胞プールにおけるPVRIGタンパク質
の発現を検証するために、全細胞抽出物を、材料及び方法で説明するように、抗flag
抗体または抗PVRIG抗体(Abnova)を使用して、ウェスタンブロットによって
解析した。図24に示す結果は、ヒトPVRIGを発現しているHEK293細胞プール
の抽出物においては約33kDaの予期されたタンパク質サイズに対応するバンドを示す
が、空ベクターでトランスフェクトした細胞においては示さない。
DNA3.1ベクターを過剰発現している安定してトランスフェクトしたHEK293細
胞を、材料及び方法で説明するように、マウス抗PVRIG pAb(Abnova)を
使用して、FACSによって解析した。図25に提示する結果は、ヒトPVRIG-fl
agを安定して発現している細胞へのマウス抗PVRIG pAbの結合(灰色)が、空
ベクターでトランスフェクトした細胞によって観察されたもの(薄灰色)よりも高いこと
を示す。
マウスIgG2aのFcに融合したマウスPVRIGのECDで構成されるPVRIG
mECD-mIg融合タンパク質(図103参照)を、ProBioGen(Germ
any)にて、安定性細胞プールの12日間の培養、ならびに続く細胞採取物のタンパク
質A精製及び凝集除去のための分取SEC精製によってCHO-DG44細胞中で産生さ
せた。採集産生物を、5mMのクエン酸ナトリウム、5mMのNa/Kホスフェート、1
40mMのNaCl、pH5.5の0.01%のTween中で製剤化した。
G遺伝子は、CMV/EF1ハイブリッドプロモーター、続いてポリアデニル化シグナル
pA-1によって駆動される。ベクターは、ピューロマイシンを使用するトランスフェク
ト細胞の選択を可能にするピューロマイシンN-アセチル-トランスフェラーゼ遺伝子、
及びメトトレキサート(MTX)を使用するトランスフェクト細胞の選択を可能にするデ
ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む。
Fcに融合したヒトPVRIGのECDで構成されるPVRIG hECD-hIg融合
タンパク質(図103参照)を、GenScript(China)にて、CHO-3E
7細胞中の一過性トランスフェクト、その6日間の培養、及び続く細胞採集物のタンパク
質A精製によって産生させた。最終生成物をpH7.2のPBS中で製剤化した。
哺乳動物発現ベクターpTT5である。
合
PVRIGは、1つの理論に限定されるものではないが、T細胞上でCD28様受容体
として機能する新規の免疫チェックポイントタンパク質である。この研究では、ヒト末梢
血リンパ球上のPVRIGの発現、及びPVRIG-ECD-Ig(ヒトIgG1に融合
したヒトPVRIGの細胞外ドメインで構成される)の黒色腫細胞株への結合を評価した
。
HLA-A2背景においてMART-1抗原を提示する3つのヒト黒色腫細胞株(SK
-MEL-23、Mel-624、及びMel-624.38)をCTLの標的として使
用した。HLA-A2を発現しないMel-888は陰性対照として機能した。
得た。末梢血単核細胞をPHAで刺激し、3日間培養した後、MSCV系レトロウイルス
ベクター(pMSGV1)で形質導入した。形質導入に続いて、細胞を、更に5日間、リ
ンパ球培地(バイオターゲット培地、ウシ胎仔血清(10%)、Lグルタミンペニシリン
/ストレプトマイシン(100単位/ml)、IL-2 300IU)中で更に成長させ
た。
のPVRIGに特異的な抗体(マウスポリクローナル)で染色した。洗浄した後、細胞を
、4度の暗所で30分間、FACS緩衝液中のFITCコンジュゲートヤギ抗マウスmA
b(1:250)(Invitrogen、カタログ番号 A10667)で染色した。
FACS緩衝液中での2回の洗浄の後、試料を、Cytek HTSを用いてBD Bi
oscience FACS Calibur上で読み取った。
l-888へのPVRIG-Igの結合を評価するために、細胞を、F4形質導入または
非形質導入(w/oと表記)PBLと共培養した後、20ug/mlの融合タンパク質P
VRIG-Ig HH バッチ番号125で染色した。FACS緩衝液中の2回の洗浄の
後、試料を二次ヤギ抗ヒトPEで染色した(Jackson、カタログ番号109-11
6-098)。
一次ヒト白血球上のPVRIGの内因性発現を評価するために、PBLをPHAで刺激
した後、空ベクターで形質導入し、抗PVRIG特異的抗体で染色した。図11に示すよ
うに、アイソタイプ一致対照に対して、抗PVRIGで染色された2つの異なるドナーが
観察された。
的T細胞との共培養による影響を受けるかどうかを決定するため、4つの異なる黒色腫細
胞株(SK-MEL-23、Mel-624、Mel-624.38、及びmel-88
8)を、F4(gp100特異的TCR)を発現しているPBLまたは発現していないP
BLのいずれかと共培養した。その後、細胞を、ヒトIgG1のFc部分と融合したヒト
PVRIGの細胞外ドメインで構成される融合タンパク質で染色した。図12に示すよう
に、4つ全ての試験したヒト黒色腫細胞株がPVRIG-Igへの結合を呈する。結合強
度は、黒色腫反応性の操作されたT細胞との共培養後、T細胞依存性活性化による影響を
受けない。
PBL)上で発現されることを示す。加えて、この研究で試験した4つの黒色腫細胞株は
、ヒトIgG1のFc部分と融合したヒトPVRIGの細胞外ドメインで構成される融合
タンパク質と結合し、これは、これらの細胞株がPVRIGについての対応物を発現する
ことを示す。
第1の検証研究を、細胞マイクロアレイ技術を使用して行い、ヒトHEK293細胞に
おいて個々に発現された3559の完全長ヒト原形質膜タンパク質へのPVRIGの相互
作用をスクリーニングした。
ーでスポッティングしたスライド上で成長させた。発現ベクター(pIRES-hEGF
R-IRES-ZsGreen1)を全てのスライド上で4連でスポッティングし、これ
を使用して、全てのスライド上でトランスフェクション効率の最小閾値が達成されたか、
またはそれを超過したことを確実にした。ヒトHEK293細胞を逆トランスフェクショ
ン/発現に使用した。ヒトIgG1に融合したPVRIGのECDで構成される融合タン
パク質を、細胞固定後に、20ug/mlで各スライドに添加した。結合の検出を、適切
な蛍光二次抗体を使用して行った。2つの複製スライドセットをスクリーニングした。蛍
光画像を、ImageQuantソフトウェア(GE)を使用して解析し定量化した(ト
ランスフェクション効率のため)。
す二連スポットとして定義した。これは、ImageQuantソフトウェア上でグリッ
ドした画像を使用した目視検査によって達成した。ヒットを、二連スポットの強度に応じ
て「強、中、弱、または極弱」として分類した。ヒットを確認するために、一次スクリー
ニングで特定したヒットをコードする全てのベクターを新たなスライド上に配列した。同
一のスライドをまた適切な陰性対照でプローブしたことを除いて、確認/特異性スクリー
ニング及び解析を、一次スクリーニングの通りに実行した(n=試料当たり2つの複製ス
ライド)。加えて、ヒットをコードする全てのベクターをシーケンシングした。全ての一
次ヒットをコードするベクターをシーケンシングして、その素性を確認した。
K293細胞へのごくわずかな結合を示した(図13)。背景データに基づき、20ug
/mlを完全プロファイルに選択した。一次スクリーンは複数の二連ヒット(クローン)
をもたらし、その大部分は強度弱または極弱であった。特定した全てのヒット、及び対照
EGFR-ZsGreen1ベクターをスポッティングし、二連で再発現させ、確認/特
異性スクリーニングのために20ug/mlのPVRIGでプローブした。
であるMAGは、試験した他の融合タンパク質にも結合することが後で示されたため(デ
ータ割愛)、これが特異的ではないことを示す。これらの結果は、New Techno
logies&FrontlersのG.Quinonesによって最近公開された要約
https://www.yumpu.com/en/document/view/7
263720/sunday-december-4-late-abstracts-
1-molecular-biology-of-the-/133と一致する。PVR
L2は、共にT細胞及びNK細胞活性化の調節因子であるTIGIT及びDNAM1のた
めのリガンドとしての役割を果たすことが知られている。TIGITは、腫瘍細胞に向け
た免疫応答の抑制における要であることが最近報告されている(Noa Staniet
sky,journal of immunology,vol.106 no.42,
17858-17863、Robert J Johnston,Cancer cel
l,Volume 26,Issue 6,p923-937,8 December
2014)。TIGITと同じ対応物とのPVRIGの相互作用を示す実施例5に提示す
る結果は、癌免疫監視を調節する重要な調節経路へのPVRIGの関与を示すため、PV
RIGを癌治療のための可能性のある標的として位置付ける。
材料及び方法
材料
Fc融合タンパク質、His標識タンパク質、及び対照Ig:Fc融合タンパク質PV
RIG-Fc M:Mを結合研究に使用した。マウスIgG2aをアイソタイプ対照とし
て使用した。本研究で使用した他の市販のマウスタンパク質は、PVRL2-his(R
&D、3869-N2)、及びPVRL2-his(Sino Biological、
50318-M08H)であった。
成し(それぞれ、RC-287及びRC-286)、PVRL2のこれらの細胞への結合
を、空ベクターを発現しているHEK293細胞(EV)(RC-83)と比較した。H
EK293 OX マウスPVRL2スプライス変異体1及び2(sv1及びsv2)を
生成し(それぞれ、RC-334及びRC-335)、PVRIGのこれらの細胞への結
合を、EVを発現しているHEK293細胞と比較した。B16-F10細胞(CL-1
61、マウス皮膚黒色腫細胞を内因的に発現しているmPVRL2)も、PVRIG及び
PVRL2の相互作用を研究するために使用した。
、1:100)をPVRL2の検出に使用した。ラットIgG2A-PE(R&D、IC
006P、25μg/ml、1:100)をアイソタイプ対照として使用した。抗マウス
-PE(Jackson Immunoresearch、115-115-206、0
.5mg/ml、1:200)及び抗his Ab(Abcam、ab72467、0.
1mg/ml、1:300)を、組み換えタンパク質の結合を検出するために使用した。
抗DYKDDDDK Tag(抗FLAG)Ab(BioLegend、637302、
0.5mg/ml、1:300)を、HEK293 OXマウスPVRIG-FLAG上
のPVRIG発現の検出に使用した。PVRIG標識化には、Alexa Fluor(
登録商標)647 Antibody Labeling Kit(Molecular
Probes、A-20186)を製造業者のプロトコルに従って使用した。PVRI
Gのビオチン化には、DSB-X(商標)Biotin Protein Labeli
ng Kit(Molecular Probes、D-20655)を製造業者のプロ
トコルに従って使用した。ビオチン化PVRIGをストレプトアビジン-PE(SA-P
E)(Jackson Immunoresearch、016-110-084、0.
5mg/ml、1:300)によって検出した。
安定性HEK293細胞過剰発現(OX)マウスPVRL2またはB16-F10細胞
へのマウスPVRIG-Fc結合のFACS解析:HEK293細胞OX PVRL2(
sv1またはsv2)またはB16-F10細胞を、PBS中で106細胞/mlに懸濁
した。各1mlの細胞に、1μlの生死判定染料原液(BD Horizon Fixa
ble Viability Stain 450、カタログ番号562247、BD
Bioscience)を添加した。細胞を、室温で遮光しながら10分間インキュベー
トした。次に、細胞をPBSで2回洗浄し、Fcγ-受容体の妨害のために、15分間室
温で、FACS緩衝液(2%のFBS及び0.5mMのEDTAを補充したPBS)中で
1:50のヒトTruStain FcXTM(BioLegend 422302)の
存在下で3×106細胞/mlに懸濁した。その後、洗浄せずに、1×105細胞/ウェ
ルを96ウェルV字型プレート(Costar#3357)にプレーティングした。PV
RL2の発現を抗PVRL2抗体によって検査した(上記参照)。PVRIG-Fcの細
胞への結合を、概して60μg/mlで、またはいくつかの濃度を用いて、種々のバッチ
(上記参照)により検査した。細胞を、室温で40分間、抗体またはPVRIG-Fcと
共にインキュベートした後、1回洗浄した。二次抗体(抗マウス-PE)を室温で15分
間添加し、細胞を2回洗浄し、MACSQuant(登録商標)FACS解析器(Mil
tenyi Biotec)による解析に持ち込んだ後、Flow-Jo 10ソフトウ
ェアを使用してデータ解析を行った。
FACS解析:PVRIGレベルを抗FLAG抗体で検査した。PVRL2-his結合
を抗his抗体によって監視した。FACS解析を上記のように行った。
析:マウスPVRIG及びPVRL2間の相互作用を、Bar-Ilan Univer
sityにて、Biacore T100 SPR生物分子相互作用解析器において解析
した。タンパク質をpH4.0の酢酸緩衝液中で100nMに希釈し、標準的なアミン結
合化学を使用して、CM5 Series S Biacoreチップの固有フローセル
に共有結合させた。表面をEDC-NHSによって活性化し、後で1Mのエタノールアミ
ン(pH8.5)の注射によって妨害した。泳動緩衝液は、pH7.3の10mMのHe
pes、150mMのNaCl、3mMのEDTA、及び0.05%のTween-20
(HBS-EP+)であった。最終固定レベルは約1000RUであった。分析物として
使用したタンパク質を、2500nM、500nM、及び100nMに希釈した。各実行
において、1つの試験管が参照用のみに泳動緩衝液を含んだ。各実行の後、20μl/秒
での30秒間の4MのMgCl2による再生成ステップを行った。
マウスPVRIGのHEK293細胞OX PVRL2 sv1への結合:マウスPV
RIGとマウスPVRL2との間の相互作用を検証するために、まずPVRIG-Fcの
細胞過剰発現(OX)PVRL2への結合を試験した。HEK293 OX PVRL2
sv1上のPVRL2発現のレベルを、特異的抗マウスPVRL2抗体を使用して決定
した。マウスPVRL2発現は、空ベクターを発現しているHEK293細胞と比較して
10倍高かった(データ割愛)。PVRIG-Fcの4つのバッチをPVRL2 OX細
胞への結合について検査した。全てのPVRIG-Fcバッチが、空ベクター細胞と比較
して6~11倍の細胞OX PVRL2への結合を示した(データ割愛)。PVRIG-
FcのPVRL2 OX細胞への結合も、ビオチン化し蛍光標識(Alexa Fluo
r 647)したPVRIGタンパク質を使用して検査した。ビオチン化タンパク質が非
標識PVRIG-Fcと比較してわずかに強いPVRL2 OX細胞への結合を示した一
方で(データ割愛)、蛍光標識PVRIGは、はるかに弱い結合を示した(データ割愛)
。これらの結果は、PVLR2がHEK293細胞OC PVRL2の膜上で検出される
こと、マウスPVRIG-FcのPVLR2 OX細胞への結合が抗マウスIgG2A抗
体によって検出されること、ビオチン化マウスPVRIG-FcのPVLR2 OX細胞
への結合がストレプトアビジン-PEによって検出されること、及びAlexa Flu
or 647標識化PVRIG-FcのPVLR2 OX細胞への結合を示す。
マウスPVRL2との間の相互作用を更に検証するために、FLAG標識を用いる場合ま
たは用いない場合のPVRL2の細胞OX PVRIGへの結合を試験した。FLAG標
識を用いたHEK293細胞OX PVRIG上でのマウスPVRIGの膜発現を、抗F
LAG抗体を使用して確認した(データ割愛)。予測通り、FLAG標識のないHEK2
93細胞OX PVRIGは、抗FLAG抗体を使用した発現を示さなかった。抗PVR
IG上清(Aldeveron)を使用すると、これらの細胞は、FLAGタグのある細
胞OX PVRIGと比較して低いPVRIG発現を示した。市販のマウスPVRL2組
み換えタンパク質は、His標識タンパク質としてのみ入手可能であった。したがって、
検出に適切な抗His抗体及び条件を得るためには詳細な較正が必要であった。2つの異
なるソースからのHis標識PVRL2を、PVRIG OX細胞への結合について60
μg/mlで試験すると、空ベクターを発現しているHEK293細胞と比較して2倍(
データ割愛)及び3~4倍(データ割愛)の結合を示した。つまり、his標識マウスP
VLR2はHEK293 OX マウスPVRIGに結合し、マウスPVRIGは、HE
K293細胞OX PVRIGの膜上で発現される。
研究:マウスPVRIG-Fc及びマウスHis標識PVRL2間の相互作用を評価する
ために、両方のタンパク質をBiacoreチップに固定した。固定後、両方のタンパク
質及びPVRIG-Fc(データ割愛)を、2500、500、及び100nMの3つの
濃度で分析物として流した(PVRIGバッチ番号480及びPVRL2は分析物として
2回流した)。2つのタンパク質間の相互作用を、両方向で及びPVRIGの両方のバッ
チで検出した(データ割愛)。複合体動態に起因して、Biacore結果から正確なK
Dは決定できなかった。
IGの用量応答結合:上に示したように、マウスPVRIG OX細胞へのマウスPVR
L2結合は比較的低かった。マウスPVRIG及びマウスPVRL2間の相互作用を妨害
することができる抗マウスPVRIG抗体をスクリーニングするための方法を確立するた
めに、PVRIG-FcのPVRL2 OX細胞への結合を選択した。まず、マウスIg
G2A及びマウスPVRIG-Fcの細胞OXマウスPVRL2への用量応答結合曲線を
生成し、空ベクター(EV)を発現している細胞と比較した。用量応答を、50μg/m
lから0.1μg/mlへの2倍連続希釈(1:2)で行った。マウスIgG2A結合に
おける差異は観察されなかったが(データ割愛)、PVRIG-Fcは、12.5μg/
mlでの結合の飽和、及びタンパク質濃度の減少と相関して低減した結合を示した(デー
タ割愛)。PVRIG-Fcでも同様の結果を得た(データ割愛)。これらの結果は、こ
の結合アッセイを、妨害抗体のスクリーニングのために検討し得ることを示唆する。
F10細胞上のPVRL2の発現を、抗PVRL2抗体を使用して評価した。結果は、P
VRL2が上で発現されB16-F10細胞上で高度に発現されることを示す(データ割
愛)。このため、同様の用量応答結合曲線をマウスIgG2A及びマウスPVRIG-F
cのB16-F10細胞への結合について産出した。HEK293細胞OX PVRL2
によって得られた結果と同様に、マウスPVRIG-Fcは12.5μg/mlで飽和に
達するB16-F10細胞への用量応答結合を示したが、マウスIgG2Aの結合の変化
は検出されなかった(データ割愛)。
にてCell Microarray Technologyを使用して特定した。この
相互作用をマウス中でも検証するために、いくつかのアプローチを行った。そのいくつか
が、PVRIGまたはPVRL2 OX細胞の使用、及びSPR-Biacoreを使用
する生物物理学測定である。全てのアプローチが、マウスPVRIGがマウスPVRL2
と相互作用することを示した。しかしながら、マウスPVRL2の細胞OX PVRIG
への結合は、PVRIGの細胞OX PVRL2への結合と比較して相対的に低かった。
この理由は、市販のPVRL2が、Fc融合タンパク質としてではなくモノマーHis標
識タンパク質としてのみ入手可能であること(PVRIGと同様)であり得る。これを受
けて、カスタムのFc融合マウスPVRL2をGenScriptにて産生させた。しか
しながら、予備データからは、このタンパク質では結合のわずかな増加しか観察されなか
った(PVRL2-hisによる2~3倍と比較して約5倍)。このため、一部の他の因
子が、この比較的低い結合に影響している可能性があった。
PVRIG-Fc結合を使用する抗PVRIG抗体妨害アッセイを確立することを決定し
た。観察された用量応答曲線に従って、0.1、0.2、及び0.4μg/mlの3つの
作動濃度を提案した。B16-F10細胞を内因的に発現しているPVRL2へのPVR
IGの結合によって得られた同様の結果に従い、抗体妨害アッセイを、以下の濃度:0.
2、0.4、0.8μg/mlでこれらの細胞上でも行うことを提案した。
可溶性タンパク質としてのPVRL2及び細胞上で発現されるPVRIGを用いて行うべ
きである。このため、本系においても現在の形式で妨害活性を示す抗マウスPVRIG抗
体を検査することを検討すべきである。
この研究の目的は、新規の免疫腫瘍学的標的であるPVRIGの結合パートナーを確認
することである。予備研究は、これらのリガンドのうちの1つはPVRL2であることを
示す。この研究では、PVRIG軸におけるいくつかの可能性のあるリガンドへの組み換
えPVRIGタンパク質の結合をELISAによって調査した。
試薬の一覧:PVRIGタンパク質に関する最新文献は、可能性のあるリガンドが3つ
あることを提唱している:PVR(CD155)、PVRL2(CD112)、及びPV
RL3(CD113)。PVRIG受容体に結合するそれらの能力を調査するために、以
下のようにこれら3つのリガンドを商業的に得た:PVR及びPVRL3はSino B
iologicals Inc.から、PVRL2はR&D Systems及びSin
o Biologicals Inc.から。ヒトPVRIG組み換えタンパク質を、ヒ
トIgG1 Fcドメインに融合させたPVRIG細胞外ドメイン(ECD)(PVRI
GHH)としてCompugenにて生成した。
ンド、PVR、PVRL2、及びPVRL3を、高結合EIA/RIA プレート(Co
star 9018)のウェルに4℃で一晩コーティングした。無関係のHis標識タン
パク質を陰性対照として含めた。コーティングしたプレートウェルをPBSで2回濯ぎ、
300μLの遮断緩衝液(PBS中5%の脱脂粉乳、pH7.4)と共に1時間室温(R
T)でインキュベートした。遮断緩衝液を除去し、プレートをPBSで更に2回濯いだ。
プレートに結合したリガンドを、溶液中の様々な濃度のPVRIGHH(50μL/ウェ
ル体積において0.1μg/mL~4μg/mLの線形範囲)と共に1時間室温でインキ
ュベートした。プレートを、PBS-T(PBS7.4、0.05%のTween20)
で3回、その後PBSで3回洗浄し、50μL/ウェルのHRP標識二次抗体を添加した
(ヒトIgG Fcドメイン特異的、Jackson ImmunoResearch)
。これを1時間室温でインキュベートし、プレートを再度洗浄した。50μLのSure
blue TMB基質(KPL Inc)を添加し、5~20分間インキュベートするこ
とによって、全てのウェルにおいてELISAシグナルを発現させた。50μLの2N
H2SO4(VWR)を添加することによってHRP反応を停止させ、450nmでの吸
光シグナルをSpectraMax(Molecular Devices)またはEn
Vision(PerkinElmer)分光光度計上で読み取った。データをExce
l(Microsoft)にエクスポートし、GraphPad Prism(Grap
hPad Software,Inc.)においてプロットした。
ク質を、EIA/RIA プレート上に固定したPVR、PVRL2、及びPVRL3へ
の結合についてアッセイした。溶液相にある様々な濃度の受容体PVRIGを、固定した
リガンドと共にインキュベートした。データは、PVRIGHHのPVRL2への用量依
存性結合を明確に示すが、リガンドPVR、PVRL3、または陰性対照タンパク質への
結合は示さない(データ割愛)。ELISA A450シグナルを、一部位結合方程式を
使用して受容体濃度の関数としてプロットすると、13±1nMの平衡結合定数(KD)
が明らかとなった。
学的標的である。この生物学を明らかにする目的で、いくつかの可能性のあるリガンドへ
のその結合を検査した。PVRL2は、PVRIGの結合パートナーとして明確に特定さ
れた。定量分析によると、この相互作用は、KDが13±1nMで非常に強力であること
が示唆される。発明者らによる結果は、ヒトPVRIGがヒトPVR及びPVRL3に結
合しないか、または結合がELISAによる検出には弱すぎるかのいずれかであることも
示唆する。
この実施例では、PBMC細胞サブセット上のPVRIG発現を同種活性化の前後に評
価した。同種活性化の後で、PVRIGの発現は、CD4+ T細胞及びCD8+ T細
胞ならびに二重負ガンマデルタT細胞上で上方調節された。この上方調節は、試験した2
ドナーのうちの一方のPBMCにおいて観察された(図52参照)。
L3結合の表面プラズモン共鳴研究
材料及び方法
全ての実験は、22℃でProteOn XPR 36機器を使用して行った。
H10500)を、ProteOn XPR 36バイオセンサーを使用してGLCチッ
プの6つ全てのレーン上で調製した。抗ヒトfc表面に対する活性化ステップは水平流向
で行い、一方で高密度pAbに対する固定ステップは垂直流向で行った。妨害ステップは
、垂直位置及び水平位置の両方で行うことで、水平「インタースポット」を参照表面とし
て使用し得るようにした。平均約4400RUのヤギ抗ヒトpAbを各レーンに固定した
。
ト(ヒトfc、GenScriptロット451、448、125)、ヒトDNAM-1
融合タンパク質(ヒトfc、R&D Systems)、ヒトTIGIT融合タンパク質
(ヒトfc、R&D Systems)、及び対照ヒトIgG(Synagis)を、各
々、2μg/mLの濃度で2分間、異なる垂直レーン上で捕捉した。PVR、PVRL2
の2つのロット、及びPVRL3を、各々、異なるリガンド捕捉サイクルで捕捉した6つ
全てのリガンドに6つの異なる濃度で水平流向で注射した。注射は2分であり、50μL
/分の流量で10分の解離を続けた。PVR濃度範囲は3倍連続希釈で1.4nM~33
2nMであり、PVRL2の両ロットは3倍連続希釈で1.3nM~322nMの濃度範
囲で注射し、PVRL3は3倍連続希釈で1.4nM~334nMの濃度範囲で注射した
。全てのタンパク質試薬を泳動緩衝液中で調製し、この緩衝液は、0.05%のTwee
n 20及び0.01%のBSAを添加した脱気PBS緩衝液であった。抗ヒトfc捕捉
表面を、各サイクル後の146mMのリン酸の30秒パルス2回によって再生成した。
ースポット参照及び分析物注射と同一のプレブランク注射を利用して、ProteOn
Managerバージョン3.1.0.6を使用して処理及び二重参照(double-
reference)した。
a)PVR:捕捉したDNAM-1及びTIGITに弱く結合し、PVRIGの3つ全
てのロット及び対照IgGへの結合を示さない。DNAM-1及びTIGITとのPVR
相互作用のKDを見積もるのに十分な情報は生成されなかった(データ割愛)。
M-1への結合を示したが、TIGITへの結合は最低限であったかまたは皆無であり、
対照IgGへの結合は示さなかった。センサーグラムは複合体動態を示したため、結合定
数を見積もることはできなかった(データ割愛)。
なかった(データ割愛)。
これらの実験では、組み換え融合タンパク質PVRIG-ECD-Igの免疫調節活性
を、マウスT細胞活性化について調査した。PVRIG-ECD-IgがマウスCD4
T細胞の活性化に与える影響を、細胞活性化マーカー、サイトカイン分泌、及び増殖とい
ういくつかのインビトロのT細胞活性化読み出しを使用して調査した。
のfcに融合させたマウスpvrigのマウス細胞外ドメイン(ecd)(pvrig-
ecd ig m:mと表記)(配列番号29)を含む組み換えタンパク質を産生させた
。活性化マーカー及びサイトカイン分泌によって表される、抗cd3と共に固定したfc
融合タンパク質がマウスcd4 t細胞機能に与える影響を調査した。
Fc融合タンパク質及び対照Ig:Fc融合タンパク質PVRIG-ECD-Ig(バ
ッチ番号198)を試験した。マウスIgG2a(クローンMOPC-173、Biol
egend、またはC1.18.4、BioXcell)をアイソタイプ対照として使用
した。
ト(Miltenyiカタログ番号130-093-227)を製造業者の指示に従って
使用して、BALB/Cマウスの脾臓のプールから単離した。得られた純度は90%超で
あった。
145-2C11、BD Biosciences)を、種々の濃度(1、3、または1
0μg/ml)のPVRIG-ECD-Igタンパク質または対照Igと一緒に、96ウ
ェル平底組織培養プレート(Sigma、カタログ番号Z707910)上で、37℃で
3時間、共に固定した。ウェル当たり12μg/mlの総タンパク質濃度を達成するため
に、対照Igを各ウェルに添加した。ウェルをPBSで3回洗浄し、ウェル当たり1×1
05の精製したCD4+CD25- T細胞をプレーティングし、加湿した5%のCO2
、37℃のインキュベーター中に保った。一部の実験では、可溶性抗CD28(クローン
:37.51、eBioscience、1μg/ml)を添加。培養上清を、刺激後の
示す時間にて収集し、ELISAキット(R&D Systems)によってマウスIF
NγまたはIL-2分泌について解析した。PVRIG-ECD-Igタンパク質がマウ
スCD4+ T細胞上の活性化マーカーCD69の発現に与える影響(図103参照)を
、フローサイトメトリーによって解析した。細胞を、刺激から48時間後に、Fcγ-受
容体の妨害のために抗CD16/32(clone 2.4g2;BD Bioscie
nces)の存在下で、PerCP-抗CD4(クローンG41.5、Biolegen
d)、FITCまたはPE-抗CD69(クローンH1.2F3、Biolegend)
を含む抗体のカクテルで染色した。細胞を、MACSQuant analyzer 9
(Miltenyi)を使用して評価し、データを、BD CellQuestを使用し
て、またはMACSQuantify TM Softwareによって解析した。デー
タを、ExcelまたはPrism4ソフトウェアを使用して解析した。
PVRIG-ECD Ig M:MがマウスCD4+ T細胞機能に与える影響(図1
03参照):図15は、可溶性抗CD28(1ug/ml)の存在下で抗CD3(2ug
/ml)のみと共に固定したかまたは対照Ig(mIgG2a)もしくはPVRIG-E
CD-Ig(図103参照))(10ug/ml)と共に固定したマイクロプレートによ
って刺激した単離マウス脾臓T細胞(CD4+、純度95%超)上のPVRIG-ECD
-Ig(図103参照)のインビトロ免疫調節活性を示す。PVRIG-ECD-Ig(
図103参照)は、低減したCD69上方調節(図15A、D)及びTCR誘導性サイト
カイン(IL-2及びIFNγ)分泌の低減(図15B~C、E)によって表されるよう
に、用量依存性の様式でマウスCD4 T細胞活性化を抑制した。PVRIG-ECD-
Ig((図103参照))の抑制効果の大きさは30~100%の範囲であった。IFN
γ分泌に対するPVRIG-ECD-Ig((図103参照))の抑制効果は、3ug/
mlまで低い濃度で観察された(約60%、抑制対対照Ig)。
CD3と共に固定した場合、濃度依存性の様式でT細胞活性化を阻害する。最大の抑制効
果は、10ug/mlのPVRIG-ECD-Ig(図103参照)にて観察された。
れは、低減したサイトカイン 分泌、及び活性化マーカーCD69の上方調節の抑制によ
って表される。このT細胞活性化の抑制は、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、乾癬、及
び炎症性腸疾患等のT細胞駆動型自己免疫疾患、ならびに他の免疫関連疾患の治療、なら
びに/または遺伝子療法に続く望ましくない免疫活性化を低減させることにおける、本発
明に従う免疫抑制PVRIGタンパク質(PVRIGポリペプチド及び融合タンパク質)
の治療的可能性を支持する。加えて、これらの結果は、病変細胞のT細胞媒介性枯渇が治
療的に有利である、癌、感染性疾患、特に慢性感染症、及び敗血症等の増強したCTL免
疫及び炎症性サイトカインの恩恵を受けるはずの状態を治療するためのPVRIGの抑制
活性を低減する免疫刺激PVRIGタンパク質(PVRIG ポリペプチド及び融合タン
パク質)の治療的可能性も支持する。
活性
この実施例に記載する実験は、異なる黒色腫細胞株上のヒトPVRIGの異所性発現が
、CTL(細胞傷害性Tリンパ球)を活性化しこれらの細胞による殺傷の標的として働く
その能力に与える影響を評価した。
HLA-A2背景においてMART-1抗原を提示する3つのヒト黒色腫細胞株(SK
-MEL-23、Mel-624、及びMel-624.38)をCTLの標的として使
用した。HLA-A2を発現しないMel-888は陰性対照として機能した。
BL)培養においてヒトPVRIGを発現するために、PVRIGをコードするcDNA
を、特異的プライマーを使用して増幅し、MSCV系レトロウイルスベクター(pMSG
V1)または3部のベクターにクローニングした。CD8依存性F4 TCR α及びβ
鎖をP2A配列と連結させ、pMSGV1ベクターにクローニングし、内部リボソーム侵
入部位(IRES)及びPVRIGのいずれかを続けた。陰性対照としてのまたは3部の
ベクターにおけるNGFR1をコードするレトロウイルスベクター:CD8依存性F4
TCR α及びβ鎖をP2A配列と連結させ、pMSGV1ベクターにクローニングし、
内部リボソーム侵入部位(IRES)及びNGFRのいずれかを続けた。クローニングの
検証を、まず制限酵素消化を使用し、続いてシーケンシングすることによって行った。配
列確認時、大量のレトロウイルスベクター(マキシプレップ)を、後の使用のために産生
させた。
またはNGFR1をコードするレトロウイルスベクター、または陰性対照として空ベクタ
ーで形質導入した。形質導入を、レトロネクチン(retronectin)に基づくプ
ロトコルを使用して実行した。端的には、レトロウイルス上清を、レトロウイルスベクタ
ー及び両種性エンベロープ遺伝子(VSV-G)によるトランスフェクションの後、29
3GP細胞(レトロウイルスパッケージング細胞株)において産生させた。レトロウイル
ス上清を、形質導入の前に、レトロネクチンをコーティングしたプレート上にプレーティ
ングしてビリオンのプレートへの結合を可能にし、PBLを6時間プレートに添加した。
その後、細胞を新たな培養容器に補給した。形質導入したPBLを市販のPVRIG特異
的ウサギポリクローナル抗体または市販の抗NGFR(カタログ番号345108、Bi
oLegend)で染色することによって、形質導入効率及びタンパク質の発現を決定し
た。ウサギIgG(Sigmaカタログ番号I5006)をアイソタイプ対照として使用
し、二次抗体としては、APCにコンジュゲートした抗ウサギIgG(Jackson、
カタログ番号711-136-152)を使用した。
26-35-/HLA-A2ペプチド-MHC複合体を特異的に認識する、MART-1
特異的F4 TCRを発現するエフェクターリンパ球を得るために、PVRIG、NGF
R、または空ベクターのいずれかを発現するように事前に形質導入した新たに単離したヒ
トPBLを、PHAで刺激し、5~10日間培養した後、MART-1特異的F4 TC
Rからのα及びβ鎖の両方をコードするインビトロで転写したmRNAで形質導入した。
形質導入されたリンパ球を、2~3日ごとに補給したリンパ球培地(バイオターゲット培
地、ウシ胎仔血清(10%)、Lグルタミンペニシリン/ストレプトマイシン(100単
位/ml)、IL-2 300 IU)中で培養した。F4 TCR発現レベルを、形質
導入された特異的TCRからのベータ鎖の細胞外ドメインを認識する特異的モノクローナ
ル抗体を使用して、FACSによって検証した。(TCR-Vb12-PE、(カタログ
番号IM2291、Beckman Coulter)。
からの黒色腫細胞との共培養時のサイトカイン分泌:PVRIGまたはNGFR及びF4
-TCRを発現しているPBLを、操作していない黒色腫細胞と共培養した。105の形
質導入PBLを、105の黒色腫標的細胞と16時間共培養した。エフェクターCD8
T細胞の異なる腫瘍細胞株に対する応答を評価するために、サイトカイン分泌(IFNγ
、IL-2、及びTNF-α)を、ELISAアッセイの線形範囲にあるように希釈した
培養上清(IFNγ(カタログ番号DY285E)、IL-2(カタログ番号DY202
E)、TNF-α(カタログ番号DY210E)R&D SYSTEMS)中でELIS
Aによって測定した。
ために行った。PVRIG及びF4を、バイシストロン性ベクターを使用してPBL中で
発現させ、CFSEで標識した黒色腫標的細胞(2mMのCFSE(eBioscien
ce)で6分間標識)と一緒に、3:1のE:T比で18時間37℃で共培養した。細胞
を18時間後に収集し、細胞死の比を割り当てるために1mMのヨウ化プロピジウム(S
igma-Aldrich)を添加した。試料をCyAn-ADPフローサイトメーター
(Beckman Coulter)上に流した。
実験系の一般設計:本明細書に記載の実験系において、PVRIGをヒトPBL上で過
剰発現させ、これを次にMART1特異的及びHLA-A2制限的F4 TCRを発現す
るように操作する。次に、過剰発現細胞を、HLA-A2陽性(名称を挙げる)及びHL
A-A2陰性(名称)黒色腫細胞株(参照)と共培養する。F4 TCRは、最近、TC
Rをコードするレトロウイルスを使用することによって末梢血由来の同種リンパ球による
腫瘍認識を特異的に付与するために、末期症状の黒色腫患者における臨床試験に使用され
た(Morgan et al,2006 Science,314:126-129)
。同族黒色腫細胞との共培養によるCD8 T細胞の抗原特異的活性化に対するPVRI
G発現の影響を、サイトカイン 分泌によって評価した。
ように、PVRIGをコードするレトロウイルスベクター、または陰性対照として空ベク
ターで形質導入した。PVRIGのレベルを、形質導入後48時間でフローサイトメトリ
ーによって評価し、空ベクターで形質導入した細胞と比較した。導入遺伝子発現細胞のパ
ーセンテージは、図16に示すように62.4%であった。
ように、PVRIGをコードするレトロウイルスベクター、またはNGFR、または陰性
対照として空ベクターで形質導入した。PVRIGのレベルを、形質導入後48時間でフ
ローサイトメトリーによって評価し、空ベクターで形質導入した細胞と比較した。PVR
IGを発現している細胞のパーセンテージは20%の範囲であった。NGFRの発現は、
図17に示すように63%であった。PVRIGをPBL上で過剰発現させるいくつかの
更なる試みは失敗した。1つの可能性は、PVRIGを一次PBL中で発現させることの
困難が、これらの細胞における基線の内因性発現レベルから生じることである。
材料及び方法に記載のように、HLA-A2+/MART1+黒色腫細胞を認識する、F
4 TCRを発現するように操作したPBLを使用した。図18Aは、実験1で使用した
白血球のTCR形質導入時に得たF4 TCR発現のレベルを示し、図18Bは、実験2
で使用した白血球のTCR形質導入時に得たF4 TCR発現のレベルを示す。
びF4で形質導入したPBLを、黒色腫細胞株と共培養した。IFNγ分泌のレベルを、
共培養の16時間目で測定した。図19に示すように、PVRIG過剰発現に起因するI
FNγ分泌の抑制の大きさは、90%超であった。陰性対照として働くHLA-A2陰性
細胞株Mel-888との共培養は、F4で形質導入したリンパ球からの活性化依存性I
FNγ分泌をわずかに引き起こしただけであった。F4 TCRを発現していないPBL
(W/Oと表記)は、追加の陰性対照として働いた。
空ベクター、及びF4を、共形質導入において(図20A)またはバイシストロン性ベク
ターを使用して(図20B)、PBLに形質導入した。形質導入したPBLを黒色腫細胞
株と共培養した。IFNγ分泌のレベルを、共培養の16時間目で測定した。図20Aに
示すように、PVRIG過剰発現に起因するサイトカイン分泌の抑制の大きさは、30%
の範囲であった。陰性対照として働くHLA-A2陰性細胞株Mel-888との共培養
は、F4で形質導入したリンパ球からの活性化依存性IFNγ分泌をわずかに引き起こし
ただけであった。F4 TCRを発現していないPBL(W/Oと表記)は、追加の陰性
対照として働いた。図20Bに示すように、PVRIGをF4 TCRで共形質導入する
とき、IFNγの抑制は観察されなかった。
及びF4を、バイシストロン性ベクターを使用してPBLに形質導入し、CFSEで標識
した黒色腫細胞株と共培養した。図21に示すように、ヨウ化プロピジウム陽性事象(殺
傷活性の強度を反映する)のパーセンテージは、陰性対照NGFR形質導入細胞と比較し
て、PVRIGの発現により約50%減少した。PVRIGを発現している細胞の殺傷活
性は、黒色腫とF4 TCRを発現していないPBL(W/Oと表記)との間の共培養の
ものと同様であった。
パ球上の過剰発現がCTLによるサイトカイン分泌の低減をもたらすことを示し、PVR
IGがCTLに対して抑制効果を有することを示唆する。
この研究の目的は、PVRIG免疫腫瘍学的標的と高い親和性及び特異性で結合し、P
VRIGとその結合パートナーであるPVRL2との相互作用を妨害するヒト抗体を単離
することであった。これは、ヒトIgG1 Fc領域に融合したヒトPVRIG細胞外ド
メイン(ECD)を含む組み換えタンパク質に対してヒトfab断片ファージディスプレ
イライブラリをパニングすること、及び結果として得られる抗体を、PVRL2とのPV
RIG相互作用を妨害するその能力についてスクリーニングすることによって達成した。
試薬の機能的QC:パニング試薬であるヒトIgG1 Fcドメインに融合させたPV
RIG ECD(PVRIGHH)の純度を、LabChip Systemを使用する
Microfluidics Capillary Electrophoresis(
PerkinElmer)によって決定した。パニング試薬の活性を、それがそのリガン
ドPVRL2に結合する能力によって検証した。
組み換えタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で2μg/mLに希釈し、5
0μLのアリコートを、一晩4℃で高結合EIA/RIAプレート(Costar)のウ
ェルにコーティングした。コーティングしたプレートウェルをPBSで2回濯ぎ、300
μLの遮断緩衝液(PBS中5%の脱脂粉乳、pH7.4)と共に1時間室温(RT)で
インキュベートした。遮断緩衝液を除去し、プレートをPBSで更に2回濯いだ。プレー
トに結合したPVRL2を、溶液中の様々な濃度のPVRIGHH(50μL/ウェル体
積において0.1μg/mL~4 μg/mLの線形範囲)と共に1時間室温でインキュ
ベートした。プレートを、PBS-T(PBS7.4、0.05%のTween20)で
3回、その後PBSで3回洗浄し、50μL/ウェルのHRP標識二次抗体を添加した(
ヒトIgG Fcドメイン特異的)。これを1時間室温でインキュベートし、プレートを
再度洗浄した。50μLのSureblue TMB基質(KPL Inc)を添加し、
5~20分間インキュベートすることによって、全てのウェルにおいてELISAシグナ
ルを発現させた。50μLの2N H2SO4(VWR)を添加することによってHRP
反応を停止させ、450nmでの吸光シグナルをSpectraMax(Molecul
ar Devices)またはEnVision(PerkinElmer)分光光度計
上で読み取った。
溶液中のファージパニングを促進するために、PVRIGHH及び無関係のヒトIgG1
Fc アイソタイプ対照を、Lightning-Link(登録商標)Biotin
キット(Innova Biosciences)を使用してビオチン化した。ビオチン
化反応を製造業者のプロトコルに従って行い、ビオチン化試薬を更なるQC及びバイオパ
ニングのために4℃で保管した。ビオチン標識タンパク質の純度及び活性を、節2.1に
記載のようにLabChip及び機能ELISAによって評価した。加えて、ビオチン化
の程度を、2つのアプローチを使用してELISAによって評価した:1)ビオチン化試
薬を高結合EIA/RIAプレートに吸収させ、タンパク質を、HRPとコンジュゲート
させたストレプトアビジンを使用して検出した、2)ビオチン化タンパク質を、ストレプ
トアビジンを事前にコーティングしたEIA/RIAプレート上でインキュベートし、結
合を、HRPとコンジュゲートさせたヒトIgG Fcドメイン特異的二次抗体を使用し
て検出した。
ィング磁気ビーズを使用して溶液中で実行し、ビオチン化抗原を捕捉した。全ての洗浄及
び溶出ステップはビーズを捕捉するための磁気ラック(Promega)を使用して実施
したことに留意されたい。全てのインキュベーションステップは試験管回転器(BioE
xpress)上で穏やかに混合しながら室温で実施した。4回のパニングサブキャンペ
ーンを、毎回、抗原濃度、洗浄、及びFc結合因子枯渇ステップの異なる組み合わせを使
用して実施した(表1)。
た。パニングの各回について、ファージライブラリを、2つの連続ステップで100pm
olの無関係のヒトIgG1 Fcタンパク質に対して枯渇させた。枯渇後、サブキャン
ペーンA及びBは、それぞれ、厳密性の低い及び高い洗浄条件下で、各回において50n
Mの抗原に対するパニングに関与した。サブキャンペーンC及びDは、キャンペーンCで
はライブラリがパニング2周目及び3周目で10倍過剰の無関係のIgG1 Fcタンパ
ク質によって遮断されたことを除いて、サブキャンペーンBと同一であった。サブキャン
ペーンDは、3周目で5nMの抗原を使用したことが異なった。
、XOMA031ヒトfab抗体ファージディスプレイライブラリ(XOMA Corp
oration、Berkeley,CA)を使用した。ライブラリの50倍の過剰提示
に十分なファージを、PBS中の10%の脱脂粉乳(最終脱脂乳濃度5%)と1:1で混
合し、1時間インキュベートした。
Dynalストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(Life Technolog
ies)の3つの100μLのアリコートを、1mLの遮断緩衝液(PBS中5%の脱脂
粉乳)における懸濁によって遮断し、30分間インキュベートした。1つの遮断ビーズア
リコートを100pmolのビオチン化PVRIGHHと混合した。他の2つのアリコー
トを、Fc専用結合因子の枯渇のために100pmolの無関係の抗原と混合した。ビオ
チン標識した抗原を室温で30分間ビーズに結合させた。ビーズ懸濁液をPBSで2回洗
浄して、遊離抗原を除去し、100μLの遮断緩衝液中に再懸濁した。
ーズ結合因子の枯渇:ファージパニングが始まる前にストレプトアビジンビーズ及びPV
RIGHHのFc領域への不要な結合を除去することが必要であった。これを達成するた
めに、遮断したファージを、非結合ストレプトアビジンビーズの100μLのアリコート
と混合し、45分間インキュベートした。ビーズ(及び恐らく不要であるビーズ及びヒト
IgG1 Fc結合因子)を廃棄した。このステップを1回繰り返し、枯渇ファージライ
ブラリ上清をパニングのために取っておいた。
ビーズに結合させたビオチン化PVRIGHHと混合した。この懸濁液を、穏やかに回転
させながら室温で1時間インキュベートして、PVRIGHH特異的ファージの結合を許
容した。非特異的結合因子を、表1のプロトコルに従って洗浄することによって除去した
。洗浄後、結合したファージを、500μLの100mMトリエチルアミン(TEA)(
EMD)と共に室温で15分間インキュベートすることによって溶出させた。溶出物を、
500μLのpH8.0の1MのTris-HCl(Teknova)を添加することに
よって中和した。
はパニング溶出物(出力価)をPBS中で連続希釈した(10倍)。各ファージ希釈の9
0μLのアリコートを、600nm(OD 600nm)で約0.5の光学密度に成長さ
せた500μLのTG1 E.coli細胞と混合した。ファージを、30分間の固定イ
ンキュベーション、続く30分間の振盪インキュベーション(250rpm)を全て37
℃で行うことによって細胞に感染させた。各感染細胞培養物の10μLのアリコートを、
2%のグルコース及び100μg/mLのカルベニシリン(2YTCG、Teknova
)を補充した2YT寒天プレート上でスポッティングした。プレートを30℃で一晩イン
キュベートした。各10μLのスポットから成長するコロニーを計数し、これを使用して
入力価及び出力価を計算した。
D 600nmに成長させた10mLのTG1 E.coli細胞と混合した。ファージ
を、節2.5.1で詳述したように細胞に感染させた。感染細胞を、2500xGでの遠
心分離によってペレット化し、750μLの2YT培地(Teknova)中に再懸濁し
、2YTCG寒天プレート上に広げた。これらを37℃で一晩インキュベートし、結果と
して得られるE.coliローンを擦り取り、約20mLの液体2YTCG(Tekno
va)中に再懸濁した。再懸濁した細胞の少量のアリコートを50mLの2YTCGに接
種して0.05のOD 600nmを達成した後、ODが0.5に達するまで250rp
mで振盪しながら37℃で成長させた。結果として得られる培養物をM13K07ヘルパ
ーファージ(New England Biolabs)に感染させ、振盪しながら25
℃で一晩インキュベートして、ファージパッケージングを可能にした。レスキューしたフ
ァージ粒子を含む培養上清を2500xGでの遠心分離によって澄ませ、1mLを、a)
後続周のパニング、またはb)fab結合スクリーニングのいずれかに持ち越した。
リの代わりに前回からのレスキューしたファージ上清を使用したことを除いて上記のステ
ップのように実施した。使用した洗浄条件、枯渇、及び抗原濃度を表1に列挙した。
も機能するファージミド構築物に基づく。これらのベクターは、fab重鎖及び軽鎖発現
カセット、抗体遺伝子の発現を駆動するラクトースプロモーター、及びアンピリシン耐性
遺伝子を含む。抗体鎖は、N末端シグナルペプチドに付属して、細胞膜周辺腔へのそれら
の分泌を駆動する。重鎖のC末端は、ファージ粒子への組み込みのための短縮遺伝子II
Iタンパク質配列を持つ。重鎖はまた、ヘキサヒスチジン、c-myc、及びV5親和性
タグを持つ。これらのベクターのE.coliへの形質転換及びイソプロピルβ-D-1
-チオガラクトピラノシドによる誘導(IPTG)は、可溶性fab分子のペリプラスム
発現をもたらす。
釈し、TG1 E.coli細胞(Lucigen)に感染させて、2YTCG寒天プレ
ート上に広げたときに単一コロニーが生成されるようにした。これにより、単一fabク
ローンを持つ各コロニーがもたらされた。個々のクローンを、Qpix2機器(Mole
cular Devices)を使用して96ウェルの深いウェルブロック(VWR)中
で1mLの2YTCG種培養に接種した。これらの種培養を700rpmで振盪しながら
37℃でMultitron 3mmインキュベーター(Infors)中で一晩成長さ
せた。fab発現のため、20 μLの1mL種培養を、0.1%のグルコース及び10
0 μg/mLのアンピリシンを伴う1mLの2YTを含む深いウェルプレートの第2の
セットに移した。培養物を平均OD 600nmが0.5~1.0となるまで成長させ、
IPTG(Teknova)を1mMの最終濃度まで添加することによってタンパク質発
現を誘導した。発現培養物を、700rpmで振盪しながら25℃でMultitron
機器中で一晩インキュベートした。
胞を2500xGでの遠心分離によって採取し、上清を廃棄し、ペレットを75μLの氷
冷PPB緩衝液(Teknova)中に再懸濁した。抽出物を1000rpmで振盪しな
がら4℃で10分間インキュベートし、225μLの氷冷ddH2Oを添加し、更に1時
間インキュベートした。結果として得られるペリプラスム抽出物(PPE)を2500x
Gでの遠心分離によって澄ませ、ELISA及びFACS解析のために別のプレートまた
は試験管に移した。全ての抽出緩衝液はEDTA-free Complete Pro
tease Inhibitor(Roche)を含有した。
た。これらは、2つの1mLの培養物を意図的に接種しないままにした後、それらをfa
b PPEと同じように処理することで、細菌成長のない、したがってfab発現のない
使用を創出することによって創出した。
抽出物の96ウェルプレートを、ELISAによってPVRIGHHへの結合について試
験した。ビオチンまたはストレプトアビジン結合因子の選択を回避するために、非ビオチ
ン化バージョンのタンパク質をELISAスクリーニングに使用したことに留意されたい
。PVRIGHH組み換えタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で2μg/
mLに希釈し、50μLのアリコートを、一晩4℃で高結合EIA/RIAプレート(C
ostar)のウェルにコーティングした。コーティングしたプレートウェルをPBSで
2回濯ぎ、300μLの遮断緩衝液(PBS中5%の脱脂粉乳、pH7.4)と共に1時
間室温(RT)でインキュベートした。遮断緩衝液を除去し、プレートをPBSで更に2
回濯いだ。プレートに結合したPVRIGをPPEと共にインキュベートし、1時間室温
で3%の脱脂乳によって事前遮断した。プレートをPBS-T(PBS 7.4、0.0
5%のTween20)で3回、その後PBSで3回洗浄し、50μL/ウェルのHRP
にコンジュゲートした抗ヒトFab二次抗体(Jackson ImmunoResea
rch)を、PBS中5%の乳において1:2000希釈で添加した。これを1時間室温
でインキュベートし、プレートを再度洗浄した。50μLのSureblue TMB基
質(KPL Inc)を添加し、5~20分間インキュベートすることによって、全ての
ウェルにおいてELISAシグナルを発現させた。50μLの2N H2SO4(VWR
)を添加することによってHRP反応を停止させ、450nmでの吸光シグナルをSpe
ctraMax(Molecular Devices)またはEnVision(Pe
rkinElmer)分光光度計上で読み取った。背景(ブランクPPE)と比較したシ
グナルの比が3超を示したウェルを陽性ヒットとして示した。
ヒットを選択し、新たな96ウェルプレートに配列した。クローンを37℃で一晩成長さ
せ、プラスミドDNAを、重鎖及び軽鎖特異的プライマーを使用してシーケンシングした
。配列を組み立て、Xabtracker(XOMA)ソフトウェアを使用して解析した
。クローンを、重鎖CDR3の非保存的差異が1つ超あった場合に配列固有性と見なした
。重鎖が同じまたは同様であるが、軽鎖が著しく異なるクローンを、元のクローンの同胞
とした。
陽性fabクローンを選択し、蛍光活性化細胞分類(FACS)によって、PVRIG過
剰発現細胞に結合するそれらの能力について解析した。ヒトPVRIG抗原を過剰発現し
ているHEK293細胞を使用して解析を実施した。並列実験では、トランスフェクトし
ていないHEK293細胞を各fab試料に対する陰性対照として使用した。
全てのアッセイは、FACS緩衝液(PBS中の1%のBSA及び0.1%のアジ化ナト
リウム)を使用して実施した。ヒトPVRIG及びトランスフェクトしていないHEK2
93細胞を採取し、2回洗浄し、2×106細胞/mlの密度で再懸濁した。細胞の25
μlのアリコートを25μlの各PPE試料と混合し、穏やかに振盪しながら4℃で1時
間インキュベートした。2つのブランクPPE対照も解析に含めた。プレートを200μ
lのFACS緩衝液中で1回洗浄し、50μLのマウス抗C-myc抗体(Roche)
の2μg/mL希釈物を各ウェルに添加した。30分間4℃でのインキュベーション後、
細胞を再度洗浄し、25μlのヤギ抗マウスfab-AF647(Jackson Im
munoresearch)の5μg/mL希釈物を各PPE及び陰性対照ウェルに添加
した。全ての二次抗体を4℃で30分間インキュベートした。2回の洗浄の後、細胞を、
最終体積50μlの固定化緩衝液(FACS緩衝液中2%のパラホルムアルデヒド)中に
再懸濁した。試料をIntellicyt HTFCスクリーニングシステム上で読むと
、これは、指定のライブゲートにおいてウェル当たり約5000個の事象を記録した。デ
ータを、FlowJo(De Novo Software、CA,USA)を使用して
解析し、Excelにエクスポートした。ヒトPVRIG過剰発現HEK細胞についての
平均蛍光強度(MFI)及びトランスフェクトしていない293細胞との比を、Xabt
rackerソフトウェア(XOMA)を使用して計算した。各プレート上の陽性ヒット
は、平均したブランクPPE対照シグナルを5倍上回るMFI比を付与するものとして特
定した。
IG結合fabを、更なる特性評価のために完全長ヒトIgGに変換した。タンパク質発
現構築物を、可変重、ラムダ、及びカッパドメイン遺伝子のPCR増幅によって得て、こ
れを、それぞれ、pFUSE-CHIg-hG1(ヒトIgG1重鎖)、pFUSE2-
CLIg-hK(ヒトカッパ軽鎖)、またはpFUSE2-CLIg-hL2(ヒトラム
ダ2 軽鎖)ベクターにサブクローニングした(全ての発現ベクターはInvivoge
nから入手した)。
Life Technologies)中で6×105細胞/mlで播種し、125rp
mで振盪しながら、8%のCO2の加湿雰囲気において37℃で72時間インキュベート
した。この細胞ストックを使用して、発現培養物をExpi293培地において2.0×
106細胞/mlで播種した。これらの培養物を、135rpmで振盪しながら24時間
、上記のようにインキュベートした。
度希釈した。抗体重鎖及び軽鎖のためのタンパク質発現構築物を1:2の割合で混合した
。30mLの発現培養物体積ごとに、30μgのDNA及び81μLのExpifect
amine(Life Technologies)を、各々別々にOpti-MEM(
Life Technologies)によって1.5mLに希釈し、5分間インキュベ
ートした。次に、希釈したDNA及びExpifectamineを混合し、20分間室
温でインキュベートした。続いてこれを振盪フラスコ中で発現培養物に添加し、125r
pmで振盪しながら上記のようにインキュベートした。
3 transfection Enhancer 1及び1.5mLのExpiFec
tamine 293 Transfection Enhancer 2を各フラスコ
に添加した。培養物を更に5日間インキュベートし(合計でトランスフェクション後6日
)、上清を遠心分離によって採取した。IgGを、AKTA Pure FPLC(GE
Healthcare Bio-Sciences)及びHiTrap MabSel
ect Sure親和性カラム(GE Healthcare Bio-Science
s)をaccording to 製造業者の指示に従って使用して、上清から精製した
。
のFACSスクリーニングを、精製した抗体の用量依存性滴定を行ったことを除いて本明
細書に記載のPPE系スクリーニングと同様に行った。ヒトPVRIG過剰発現HEK2
93細胞またはトランスフェクトしていないHEK293細胞を、異なる濃度(0~10
μg/ml)の抗PVRIG抗体またはアイソタイプ対照と共に、60分間4℃で、FA
CS緩衝液中でインキュベートした。細胞をFACS緩衝液中で1回洗浄し、1:200
で希釈した50μlのAlexa Fluor 647にコンジュゲートした抗ヒトIg
G(Fab断片特異的)中に再懸濁し、暗所にて4℃で30分間インキュベートした。細
胞を2回洗浄し、1:1000で希釈した最終体積80μlのFACS緩衝液及びヨウ化
プロピジウム(Biolegend、カタログ番号421301)中に再懸濁した。試料
を、Intellicyt HTFCスクリーニングシステム(Intellicyt)
を使用して解析した。データを、FlowJo(DeNovo)を使用して解析し、Ex
cel(Microsoft)にエクスポートし、GraphPad Prism(Gr
aphPad Software,Inc.)においてプロットした。
PVRIGHH組み換えタンパク質の機能的QC:PVRIGHHタンパク質の純度を
、LabChipシステムを使用して、マイクロフルイディクスキャピラリー電気泳動に
よって評価した。還元条件下で、組み換えタンパク質は、80.4kDaのその計算した
分子量と一致する80kDaで移行し、99%の純度を示した(データ割愛)。非還元条
件下では1つの更なるピークが観察され、これは、Fc-Fc相互作用に起因するタンパ
ク質の二量体形態の存在の結果である可能性が高い。
対するリガンドとして知られる)へのその結合を評価することによって評定した。用量依
存性応答がPVRIGHHのPVRL2への結合について観察された(データ割愛)。一
方で、無関係のヒトIgG1 Fc対照については、結合は観察されなかった。総合する
と、これは、本PVRIGHH組み換えタンパク質が高純度のものであり、機能的に活性
であるため、バイオパニングに好適であることを示す。
パク質の純度を、LabChipシステムを使用して、マイクロフルイディクスキャピラ
リー電気泳動によって評価した。非ビオチン化組み換えタンパク質とビオチン化組み換え
タンパク質との間で顕著な差異は観察されなかった(データ割愛)。更なる44.3kD
aピークがビオチン化タンパク質試料において観察されたことに留意されたい。このピー
クは、PVRIGHHタンパク質の単量体形態に起因し得るか、またはビオチン化キット
のクエンチ反応の所産であり得る。
インキュベート、及びHRPにコンジュゲートした抗ヒトIgG1 Fc二次抗体を使用
する結合タンパク質の検出によって、ビオチン化の成功を確認した。ビオチン化PVRI
GHHのストレプトアビジンでコーティングしたEIA プレートへの結合は、商業的に
入手した無関係のビオチン化タンパク質に相当した(データ割愛)。
b抗体ファージディスプレイライブラリ(XOMA Corporation、Berk
eley,CA)に対するファージパニングに使用した。3回のバイオパニングを、洗浄
厳密性、抗原濃度、及びFc結合因子の枯渇の4つの異なる組み合わせ(サブキャンペー
ンA~D)の下で行った。各回の成功を、ファージ出力価を使用して予測した。1回目の
後のファージ力価の顕著な低減、2及び3回目の後のファージ力価の増加または維持、な
らびに漸増する洗浄厳密性または漸減する抗原濃度でのファージ力価の減少等の定量的ガ
イドラインを使用して、パニングサブキャンペーンの成功を定義した。4つ全てのサブキ
ャンペーンが、サブキャンペーンにわたって一貫した予測範囲のファージ力価をもたらし
た(データ割愛)。
々についてのfabクローン(PPEとして)の2つの96ウェルプレートをスクリーニ
ングして、バイオパニングの成功を評価した。結果を表3に要約し、以下で更に詳細に考
察する。全体的に、4つ全てのサブキャンペーンが相当数のPVRIGHH特異的fab
を生んだ。合計49個の標的特異的固有fabを特定した。サブキャンペーンB及びDが
最も高いELISAヒット率及びFACS相関を示し、これらを更なるスクリーニングに
選択した。
ニングしたクローンの総数、ELISAヒット、FACSヒット、及び配列固有性を列挙
する。オープンリーディングフレーム(ORF)は、完全長fabとしてシーケンシング
に成功したクローンを表す。特異性は、ELISAにおける無関係のタンパク質への非特
異的結合の欠如に基づく。FACS相関は、FACS陽性でもあった(PVRIG過剰発
現HEK293細胞に特異的に結合する)ELISAヒットのパーセントを表す。
有HC、14個の同胞
96ウェルプレート(182個のfabクローン)を、PVRIGHH組み換えタンパク
質に対してELISAによってスクリーニングした。ビオチン化タンパク質をパニングに
使用したが、ELISAスクリーニングには、ビオチンまたはストレプトアビジン特異的
結合因子の検出を回避した非ビオチン化バージョンを使用したことに留意されたい。4つ
のサブキャンペーンは、「陽性」シグナルについての閾値を3倍比の標的特異的結合:ブ
ランクPPE対照シグナルに設定したときに、24~37%のELISAヒット率をもた
らした。
A陽性クローンをシーケンシングして、非冗長fabを選択した。73個の配列固有性f
abクローンを特定した。19個のクローンはサブキャンペーンAに固有であり、13個
のクローンはサブキャンペーンBに固有であり、10個のクローンはサブキャンペーンC
に固有であり、18個のクローンはサブキャンペーンDに固有であり、一方で残りの23
個のクローンはキャンペーン間で共有された。配列固有性ELISA陽性fabクローン
をPPEとして再発現させ、FACSによって特異的結合についてスクリーニングした。
73個中計49個の固有性クローンをPVRIG特異的ELISA及びFACS結合因子
として特定した(2.6.5で確率した基準に従う)。49個のFACS結合因子は、固
有の重鎖を有する35個、及び固有の軽鎖を有するが、固有性クローンのうちの1つと重
鎖を共有する14個の同胞に対応した。FACS結合データの概要を表4に提示する。
が、ブランクPPE対照と比較して3倍を上回るアッセイシグナルでPVRIGHH組み
換えタンパク質に結合した。並列アッセイでは、fab PPEを、同じIgG1 Fc
領域を有する2つの無関係のタンパク質及びPVRL2組み換えタンパク質への結合につ
いて試験した。いずれのクローンも対照への顕著な非特異的結合を示さず、選択したfa
bが特異的for PVRIGに特異的であることを示唆した。
abをFACSによって解析した。PVRIG過剰発現HEK293細胞ならびにトラン
スフェクトしていないHEK293細胞についての平均蛍光強度(MFI)を測定した。
標的特異的結合対標的外結合のMFI比を計算した。MFI比が5を上回るクローンをヒ
ットとして選択し、以下に列挙する。
ELISA及びFACS結合因子を、Expi293細胞におけるヒトIgG1分子とし
ての発現に対して再フォーマットした。元の49個の抗体のうち、44個が完全長抗体と
しての発現に成功した。これらの再フォーマットした抗体を、無関係のヒトIgG1 ア
イソタイプ対照と並行してPVRIG過剰発現HEK293細胞への結合の保持について
試験した。全ての抗体を、トランスフェクトしていないHEK293細胞に対しても試験
した。得られた結合結果を使用して抗体の特異性を実証し、プロットも行って平衡結合定
数(KD)を計算した。残りの44個の抗体のうち9個が、弱い結合または顕著な非特異
的結合を示した。残りの35個の抗体を、細胞に基づく機能アッセイにおける更なる解析
のために選択した。これらの抗体のFACSに基づくKDを表6に列挙する。KD値は、
平均9.4nMで0.30nM~96nMの範囲であり、パニングキャンペーンから得た
大部分の抗体が極めて特異的であり、高い親和性でPVRIGと結合することを示唆する
。
S陽性fabをヒトIgG1骨格に再フォーマットした。FACS KD値を、PVRI
G過剰発現HEK293細胞に対する用量滴定によって決定した。標的外結合を、トラン
スフェクトしていないHEK293細胞に対する用量滴定によって決定した。
ファージディスプレイ抗体発見キャンペーンを実施し、抗原の組み換えFc標識バージ
ョンを使用して免疫腫瘍学的標的PVRIGに対する結合因子を単離した。品質管理分析
により、パニング抗原が純粋であり、機能的に活性であることが示された。パニングの試
みにより、組み換えタンパク質としても細胞表面上でもPVRIG標的に特異的に結合す
る49個のfabクローンを生んだ。これらのうち、35個がヒトIgG1抗体としての
産生に成功し、PVRIGへの特異的結合を保持することが示された。この抗体のプール
は、35個の抗体結合のうち18個が10nM未満のKDで結合して、FACSアッセイ
において高い親和性を呈した。
する能力のELISAによる実証。
方法:ヒトPVRL2-His(カタログ番号2229-N2-050/CF、R&D
Systems)をELISAプレートにコーティングした。5%の脱脂乳中で1:1
で希釈したFabペリプラスム抽出物(PPE)を、1ug/ml(最終濃度)のヒトP
VRIG-Fcと共に、室温で15分間プレインキュベートした。fab-受容体混合物
を、ELISAプレートにコーティングしたPVRL2-Hisに結合させた。PVRI
G-Fc/PVRL2-His相互作用を、HRPにコンジュゲートした抗ヒトFc抗体
(Jackson Immuno Research、カタログ番号709-035-0
98)を使用してプローブした。PPEの存在下(陰性ウェル)では、強い陽性シグナル
が予測された。fabを妨害するためには、シグナルは顕著に低減し得る。シグナルが陰
性ウェル(80%超の妨害)と比較して5倍超低いfabクローンを妨害fabとして選
択し得る。
ELISAプレート(Costar 9018)を50ulの2ug/ml抗原でコー
ティングして、一晩4℃で保管した。抗原をコーティングしたプレートを1倍PBSで3
回洗浄した。プレートを200μlのPBS中5%の脱脂乳で遮断し、RT(室温)で1
時間インキュベートした。次に、プレートを1倍PBで洗浄した。
を、対応するウェルに添加した1ug/mlのヒトPVRIG-Fcと共にプレインキュ
ベートした。「fabなし」対照を2つのウェルで実施した。
n Immuno Research、709-035-098)を添加した後、プレー
トを室温で1時間インキュベートした。
ウェルの2N H2SO4を添加することによって停止させた。吸光度を450nmにて
測定した。
図52は、抗PVRIG抗体がPVRIGへのPVRL2結合の少なくとも80%を妨
害する能力についての試験結果を示す。示すように、多数のかかる抗体が、結合の少なく
とも80%の妨害に成功することができた。具体的には、妨害に成功した抗体は以下のよ
うに表記される。
、CPA.7.008、CPA.7.009、CPA.7.010、CPA.7.011
、CPA.7.012、CPA.7.013、CPA.7.014、CPA.7.015
、CPA.7.017、CPA.7.018、CPA.7.019、CPA.7.021
、CPA.7.022、CPA.7.023、CPA.7.024、CPA.7.033
、CPA.7.034、CPA.7.036、CPA.7.040、CPA.7.046
、CPA.7.047、CPA.7.049、CPA.7.050、
体のエピトープビニングの表面プラズモン共鳴
材料及び方法
実験を、実験中全ての試料を4℃に保ちながら、22℃でProteOn XPR 3
6機器を使用して行った。
ウム中で約10μg/mLに希釈し、標準的なアミン結合を使用してProteOn G
LCバイオセンサーチップ上の別々のスポットに共有的に固定した:
Abを表面活性化後に4分間注射した。妨害ステップは、垂直位置及び水平位置の両方で
各5分間行うことで、水平方向「インタースポット」を参照表面として使用し得るように
した。MAbを約450RU~5000RUの範囲で固定した。追加のmAb CPA.
7.041も、この研究においてビニングしたが、溶液中の分析物としてのみであった。
以下を参照されたい。
#448、GenScript)を、25μL/分の流量で3分間、全ての固定したm
Ab上に注射した後、GLCチップアレイにおけるmAbの水平列に応じてpH2.0ま
たはpH2.5のいずれかにて、10mMのグリシン-HClを30秒間パルスすること
によって再生成する何回かのサイクルを伴った。抗原試料を、100μg/mLのBSA
を含む脱気PBST(0.05%のTween 20を含むPBS)泳動緩衝液中で調製
した。これらの予備実験は、クローンCPA.7.026及びCPA.7.029が抗原
と結合しなかったため、ビニングされなかったことを示した。ProteOnアレイ上の
残りのmAbは、抗原への再現可能な結合を示した。
二価性に起因して行った。このプロトコルでは、ステップ1で列挙した各mAb、それに
加えてmAb CPA.7.041をPVRIG抗原と共に予混合した後、全ての固定し
たmAb上に3分間注射した。各mAbのモル結合部位濃度は、モル抗原結合部位濃度を
超過した。各mAbの最終結合部位濃度は約400nMであり、抗原の最終結合部位濃度
は約20nMであった。実験全体にわたって固定したmAbの活性をモニタリングするた
め、まさに8回のmAb注射サイクルの後に抗原のみの対照サイクルを行った。緩衝液ブ
ランク注射も、二重参照のために約8回ごとの注射サイクルの後に行った。追加の参照は
、予混合注射サイクルと同一の濃度で全てのmAb上に単独で注射した各mAbを含んだ
。全ての表面を、アレイ中のどのmAb列を再生成するのかに応じてpH2.0またはp
H2.5のいずれかで、10mMのグリシン-HClを30秒間パルスすることによって
再生成し、全てのサイクルを25μL/分の流量で実行した。MAb及び抗原試料を、1
00μg/mLのBSAを含む脱気PBST泳動緩衝液中で調製した。
ブランクを使用して、ProteOn Manager Version 3.1.0.
6を使用して処理及び参照した。mAbのみの対照の注射を注射参照として使用すると、
これにおいてmAbのみの注射との顕著な結合が観察された。結合が固定したmAb上の
混合したmAb及び抗原の注射から観察されなかった場合、または同じ固定したmAb上
の抗原のみの対照注射と比較して結合が顕著に低減した場合には、抗体対を共有抗原結合
エピトープ(図43中の行列における赤色の「0」として表記)として部類した。混合し
たmAb及び抗原の注射が、同じ固定したmAb上の抗原のみの対照と同様であるかまた
はそれを上回る固定したmAbへの結合を示した場合には、抗体対を、異なる抗原エピト
ープに結合する、または抗原を「サンドイッチする」(図43中の行列における緑色の「
1」として表記)として分類した。
Cチップアレイが36個のスポットしか有しないために分析物としてのみ研究した。した
がって、一貫性のために、抗原と予混合した各mAbについての2値行列における結合パ
ターン(図42における垂直方向のパターン)の階層的クラスタリングを、JMPソフト
ウェアバージョン11.0.0を使用して行った。固定したmAbの妨害パターン(図4
2における水平方向のパターン)も、溶液中で予混合しったmAbの妨害パターンに対す
る比較としてクラスタリングした(データ割愛、考察には結果を参照)。
行列を示し、ここでは、mAbsは、垂直方向(表面上のmAb-「リガンド」)及び水
平方向(溶液中のmAb-「分析物」)の両方で同一の順序で列挙される。分析物として
の全てのmAbについての妨害パターンの同一の「ビン」は、同様の垂直方向パターンの
各群を黒色のボックスで囲むことによって図42でハイライトする。図43は、図42の
行列における垂直方向(分析物)の妨害パターンの樹状図を示す。同一の妨害パターンを
示すmAbのみを厳密に共にビニングするエピトープ「ビン」の最も厳格な定義では、全
部で4個の個別のビンが存在する。具体的には、ビニングした35個のmAbのうち33
個が2個のビンを含み、これらの2つのビンの唯一の差異は、mAbが、CPA.7.0
39でサンドイッチする(ビン2、図42及び図43参照)か、またはCPA.7.03
9への結合を妨害する(ビン1、図42及び図43参照)かである。これは、CPA.7
.039がそれ自体の別個のビンにあることを意味する。4番目のビンは、他の34個の
mAbのいずれに対する抗原結合も妨害することができないmAb CPA.7.050
のみで構成される。リガンドとしてのmAbの妨害パターンの階層的クラスタリング(図
42中の水平方向パターン)は、抗原をmAb CPA.7.039でサンドイッチして
いるmAb CPA.7.016を示すが、分析物としては、これは固定したCPA.7
.039への抗原結合を妨害する。よって、クローンCPA.7.016はビン1ではな
くビン2に置かれ得る。各結合中のmAbを図43に列挙する。各ビンを表す処理したセ
ンサーグラムデータを図44~図47に示す。
妨害パターンに従ってSPRを使用してビニングした。エピトープビンの最も厳格な定義
によると、全部で4個の個別のビンが存在する。35個のmAbのうちの33個が2個の
ビンを含み、これらは、それらの対応する構成要素mAbが、クローンCPA.7.03
9で抗原を妨害するかまたはサンドイッチするかのみによって異なる。
ラズモン共鳴動態スクリーニング
材料及び方法
全ての実験は、22℃でBiacore 3000機器及びProteOn XPR
36機器を使用して行った。
Biacore 3000機器を使用して定量化した。各fabを20倍に希釈した後、
CM5 Biacoreチップ(GE Healthcare)による標準的なアミン結
合を使用して調製した高密度抗ヒトfab(GE Healthcare 28-958
3-25)表面上に5μL/分で2分間注射した。次に、既知の濃度の標準的なヒトfa
b(Bethyl P80-115)を、fab上清と同じ条件で抗fab表面上に注射
した。試料を泳動緩衝液中で調製し、この緩衝液は、0.01%のBSAを添加した脱気
HBSP(0.01MのHEPES、0.15MのNaCl、0.005%のP20、p
H7.4)であった。各fab上清からの各SPRセンサーグラムの会合傾斜を、CLA
MP 3.40ソフトウェアを使用して既知の濃度の標準的なヒトfabのSPR会合傾
斜に対して適合させ、上清における各fabのモル濃度を推定した。
H10500)を、ProteOn XPR 36バイオセンサーを使用してGLCチッ
プの2つレーン上で標準的なアミン結合を使用して調製した。高密度抗マウスfc ポリ
クローナル抗体表面(GE Healthcare BR-1008-38)を、同じG
LCチップの2つの異なるレーン上で標準的なアミン結合を使用して調製した。4つ全て
の捕捉表面に対する活性化及び妨害ステップは、垂直流向で生じた。その後、上清中の各
fabを、それぞれサイクル当たり平均約200RU及び約290RUで1つの高密度抗
ヒトfc表面及び1つの抗マウスfc表面(それぞれ)に捕捉されたfc-融合ヒトPV
RIG(PVRIG-HH-2-1-1 #448、GenScript)及びfc-融
合マウスPVRIG(PVRIG-MM-2-1-1 #198、GenScript)
上に3つの濃度で注射した。各fab濃度シリーズを2分間注射した後、50μL/分の
流量で10分の解離を続けた。開始濃度範囲(ステップ1で決定した通り)は、各fab
について2回の最高濃度の3倍希釈により、約20nM~約400nMであった。Fab
を泳動緩衝液の中に希釈し、この緩衝液は、0.05%のTween 20及び0.01
%のBSAを添加した脱気PBSであった。抗ヒトfc捕捉表面を、各サイクル後の14
6mMのリン酸の30秒パルス2回によって再生成し、抗マウスfc表面を、各サイクル
後のpH1.7の10mMのグリシンの30秒のパルス2回によって再生成した。
を、ProteOn Managerバージョン3.1.0.6を使用して処理し二重参
照した。センサーグラムを、参照表面としての捕捉されたPVRIGがなく、fabの注
射と同一の条件下での捕捉されたPVRIG上のブランク注射を伴う対応する対抗種捕捉
表面を使用して二重参照した。可能な場合、次に、各fabの3つの異なる濃度について
のセンサーグラムを1:1の動態モデルに全体的に適合させて(質量移行についての項を
用いて)、会合及び解離速度定数を推定した。単純な1:1の結合を示さなかったセンサ
ーグラムは動態モデルに適合させなかったため、ka及びkdの推定を割り当てなかった
。
この研究に含めたfabのいずれも、マウスPVRIGへの結合活性を示さなかった(デ
ータ割愛)。ヒトPVRIGに対してスクリーニングした50個のfabのうち17個に
ついてのセンサーグラムを、それらの速度定数の信頼性のある予測に適合させることがで
きた。28個のクローンが複合体動態を示し、fabのうちの5個は捕捉したヒトPVR
IG融合タンパク質へのいずれの結合も示さず(CPA.7.025、CPA.7.02
6、CPA.7.027、CPA.7.029、CPA.7.035)、1個のクローン
(CPA.7.035)はステップ1で濃度決定を行ったときに力価を示さなかった。速
度定数及びそれらの対応するセンサーグラムを図49及び図50で以下に示す。以下に列
挙するクローンが複合体動態を示した。図51はこれらのデータの一部の例を示す。
gGクローンCPA.7.021の結合親和性の測定
材料及び方法
に結合するCPA.7.021 IgGの親和性を測定した。Alexa 647とコン
ジュゲートしたCPA.7.021を、96ウェルプレート中の17個のウェル上で一定
数の細胞(100,000細胞/ウェル)に2倍連続希釈した3pM~101nMの結合
部位濃度範囲で二連で添加した。1つのウェルは、ブランクウェルとして働く、IgGを
一切添加しない細胞を含んだ。細胞を、4℃でIgGを用いて4時間平衡化した。細胞を
2回洗浄した後、平均蛍光強度(MFI)を、Intellicyteフローサイトメー
ターを使用して約10,000の「事象」にわたって記録した。CPA.7.021 I
gG結合部位濃度の関数としての結果として得られたMFI値を以下に示す。ヒトPVR
IGを発現しているHEK 293細胞に結合するCPA.7.021のKDを、Dra
ke and Klakamp,Journal of Immunol Method
s,318(2007)147-152に詳述されているように、MFI対IgG結合部
位濃度曲線を1:1の平衡モデルと適合させることによって推定した。
発現しているHEK 293細胞で滴定し、結合シグナルを、フローサイトメトリーを使
用して測定した。二連対CPA.7.021の結合部位濃度におけるMFIを示す、結果
として得られる結合等温線を以下に提示する。赤線は、曲線の1:1の平衡適合であり、
これは、2.5nM±0.5nMのKD推定値を可能にする(適合の信頼区間95%、N
=1)。
TIL機構に与える効果
これらのアッセイ目的は、黒色腫標的細胞との共培養時の活性化マーカー及びサイトカ
イン分泌によって測定した、ヒト由来TILにおけるPVRIGの機能的能力を評価する
ことである。PD1を、ノックダウン(siRNA)研究のためのベンチマーク免疫チェ
ックポイントとして使用した。単独でまたは他の抗体(例えば、aTIGIT、DNAM
1)と組み合わせてPVRIG及びPVRL2間の相互作用を妨害することが示されてい
る抗PVRIG抗体(CPA.7.21)の効果を評価した。
TIL
3名の黒色腫患者由来の腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を使用した。
□TIL-412-HLA-A2-Mart1特異的
□TIL-F4-HLA-A2-gp100特異的
□TIL-209-HLA-A2-gp100特異的
Life technologies、35050-038)+1%のNa-ピルビン酸
塩(Biological Industries、03-042-1B)+1%の非必
須アミノ酸(Biological Industries、01-340-1B)+1
%のPen-Strep(Biological Industries、03-031
-1B)+300U/mlのrhIL2(Biolegend、509129)を補充し
たIMDM(BI、01-058-1A)完全培地内で解凍した。
との関連でMART-1及びgp-100抗原を発現する。細胞を、10%FBS(BI
、04-127-1A)、25mMのHEPES緩衝液(BI、03-025-1B)、
1%Glutamax(Life technologies、35050-038)、
及び1%Pen-Strep(Biological Industries、03-0
31-1B)を補充した完全DMEM培地(Biological Industrie
s、01-055-1A)内で培養した。
ダウン(KD)を、100pmolのDharmacon ON-TARGETplus
human PVRIG siRNA-SMARTpool(L-032703-02
)またはHuman PD1 siRNA - SMARTpool(L-004435
)または非標的化siRNA(D-001810-01-05)を使用して行った。si
RNAをTILにエレクトロポレーションした(AMAXA、program X-00
5)。解凍から24時間後にIL-2を補充した完全IMDM中で培養した休止TIL上
でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、TILを96ウェルT
Cプレートに播種して、24時間回復させた。24時間後、細胞を採取し、生死判定色素
(BD Horizon、カタログ番号562247、BD biosciences)
で染色し、PBSで洗浄し、30分間室温で抗ヒトPVRIG-CPA.7.021(C
PA.7.021 IgG2 A647、7.5ug/ml)または抗ヒトPD-1(B
iolegend、#329910 AF647、5ug/ml)で染色した。使用した
アイソタイプ対照は、それぞれ、Synagis(IgG2 A647、7.5ug/m
l)及びマウスIgG1(Biolegend #400130 A647、5ug/m
l)であった。全ての試料をMACSQuant解析器(Miltenyi)上に流し、
データを、Tree Star FlowJoソフトウェア(v10.0.8)を使用し
て解析した。
を採取し、96 TCプレートに5×104/ウェルで播種した。Mel-624細胞も
採取し、共培養中に1:1/1:3のエフェクター:標的比で播種した。プレートを37
℃、5%CO2で一晩(18時間)インキュベートした。
IT(クローン10A7)、及び抗DNAM1(クローンDX11)の影響を評価するた
めに、TIL(1×105細胞/ウェル)を、単独処置(10μg/mL)または併用処
置(各々最終10μg/mL)で、試験抗体または関連アイソタイプ対照と共にプレイン
キュベートした後、624黒色腫標的細胞を1:3のエフェクター:標的比で添加した。
プレートを37℃、5%CO2で一晩(18時間)インキュベートした。
n、カタログ番号562247、BD biosciences)で染色し、PBSで洗
浄し、Fc妨害溶液(カタログ番号309804、Biolegend)に露出させた後
、30分間4℃で抗CD8a(カタログ番号301048、Biolegend)及び抗
CD137(カタログ番号309804、Biolegend)で染色した。全ての試料
をMACSQuant解析器(Miltenyi)上に流し、データを、Tree St
ar FlowJoソフトウェア(v10.0.8)を使用して解析した。培養上清を収
集し、CBAキット(カタログ番号560484、BD)を用いてサイトカイン分泌につ
いて分析した。
TILにおけるPVRIGノックダウン:TIL MART-1及びTIL F4をI
L-2と共に24時間培養した。100pmolのON-TARGETplus hum
an PVRIG siRNA-SMART pool(L-032703-02)また
はヒトPD1 siRNA-SMARTpool(L-004435)または非標的化s
iRNA(D-001810-01-05)をTILにエレクトロポレーションした(A
MAXA、program X-005)。PVRIGまたはPD-1の検出を、エレク
トロポレーションから24時間後(及び共培養前)に行った。細胞を生死判定色素につい
て染色し、抗PVRIGまたは抗PD-1との30分の室温でのインキュベーションを続
けた。KD集団のパーセンテージを図82に示す。
TILを、ヒトPVRIGもしくはPD-1をコードするsiRNAまたは対照としてス
クランブル配列を用いてエレクトロポレーションした。TILを、エレクトロポレーショ
ンから24時間後のPVRIG及びPD-1発現について試験した。スクランブルのエレ
クトロポレーションしたTILと比較して、PVRIGの約80%のノックダウン及びP
D-1の約50%のノックダウンが観察された(図82)。
比で18時間培養し、CD137の発現について染色した。対照のスクランブルsiRN
Aと比較して、PD-1 siRNAを用いてエレクトロポレーションしたTILと同様
に、上昇したレベルの活性化マーカーCD137が、PVRIG siRNAを用いてエ
レクトロポレーションしたTIL MART-1において示された(図83A)。共培養
上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。PVRIG siRNAを用
いてエレクトロポレーションしたTILは、対照のSCR siRNAと比較して、IF
Nγ及びTNFレベルの顕著な増加を示す。同様の効果が、PD-1 siRNAを用い
てエレクトロポレーションしたTILにおいて示された(図83B~C)。
NAでエレクトロポレーションしたTIL F4をMel-624と共に1:3のエフェ
クター:標的比で共培養することによって、CD137表面発現のレベルの増加(図84
A)及び共培養上清中のIFNγの分泌の増加(図84B)がもたらされた。同様の傾向
が、PD-1 siRNAを用いてエレクトロポレーションしたTILにおいて観察され
た。
抗PVRIG及び抗TIGITのインビトロ単剤療法及び併用療法:209のTILを
Mel-624細胞と共に1:1のエフェクター:標的比で18時間培養した。共培養上
清を収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。抗TIGITによる処置は、I
FNγ分泌レベルにもTNF分泌レベルにも影響を及ぼさなかった。しかしながら、抗T
IGIT及び抗PVRIGを組み合わせで共培養に添加したときに、IFNγレベル及び
TNFレベルの増加が観察された(図85A~B)。
Mel-624細胞と共に1:1のエフェクター:標的比で18時間培養した。TILを
活性化マーカーCD137の表面発現について染色すると、抗DNAM-1による処置後
の発現レベルの低減を示した。共培養上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試
験した。抗DNAM-1の処置は、分泌されたサイトカインであるIFNγ及びTNFを
増加させる傾向を媒介した。抗DNAM-1及び抗PVRIGの組み合わせによる処置は
、CD137発現(図86C)に対する影響を部分的に逆転させ、サイトカイン分泌IF
Nγ及びTNFに対する影響を増強した(図5A~B)。MART-1 TILを、Me
l-624細胞と共に1:1のエフェクター:標的比で18時間培養した。共培養上清を
収集し、分泌サイトカインの存在について試験した。抗DNAM-1での処理により、T
IL上のCD137表面発現、ならびに分泌されたサイトカインIFNγ及びTNFも低
減した。抗DNAM-1及び抗PVRIGの組み合わせによる処置は、これらの効果を部
分的に逆転させた(図86D~F)。
PD1のKDは、IFNγならびにF4及びMART-1 TILにおける分泌によっ
て測定して、TIL活性を改善した。対照siRNAと比較して、IFNγ及びTNF分
泌の増加(約20%)がMART-1 TILにおけるPVRIG KDの際に観察され
た。同じ傾向が、F4 TIL上の624黒色腫細胞との共培養時にCD137発現にお
いて観察された。
NF分泌レベルにも影響を及ぼさなかったが、抗TIGIT及び抗PVRIG(CPA.
7.021)を併用して共培養に添加したときに、IFNγ及びTNFレベルの増加が観
察された。
るTIL-MART-1活性化の低減がもたらされ、抗PVRIG(CPA.7.21)
は、DNAM-1 Abとの併用療法においてこの影響を部分的に逆転することができた
。TIL 209においては、IFNγ及びTNF分泌レベルは、抗DNAM-1によっ
てわずかに上昇(約10%)し、抗DNAM1及び抗PVRIG(CPA.7.021)
を併用して共培養に添加したときに、IFNγ及びTNFレベルの増加(それぞれ、約4
0%及び30%)が観察された。まとめると、発明者らによる結果は、PVRIGが、P
VRL2に対する新たな共抑制性受容体であることを示唆する。
対する抗PVRIG抗体の効果
材料及び方法
TIL:3名の黒色腫患者由来の腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を使用した。
□TIL-412-HLA-A2-Mart1特異的
□TIL-F4-HLA-A2-gp100特異的
□TIL-209-HLA-A2-gp100特異的
Life technologies、35050-038)+1%のNa-ピルビン酸
塩(Biological Industries、03-042-1B)+1%の非必
須アミノ酸(Biological Industries、01-340-1B)+1
%のPen-Strep(Biological Industries、03-031
-1B)+300U/mlのrhIL2(Biolegend、509129)を補充し
たIMDM(BI、01-058-1A)完全培地内で解凍した。
との関連でMART-1及びgp-100抗原を発現する。細胞を、10%FBS(BI
、04-127-1A)、25mMのHEPES緩衝液(BI、03-025-1B)、
1%Glutamax(Life technologies、35050-038)、
及び1%Pen-Strep(Biological Industries、03-0
31-1B)を補充した完全DMEM培地(Biological Industrie
s、01-055-1A)内で培養した。
細胞との共培養:黒色腫特異的TIL活性に対する抗PVRIG抗体(CPA.7.02
1)、抗TIGIT(クローン10A7)、及び抗PD1(mAb 1B8、Merck
)の影響を評価するために、TIL(3×104細胞/ウェル)を、単独処置(10μg
/mL)または併用処置(各々最終10μg/mL)で、試験抗体または関連アイソタイ
プ対照と共にプレインキュベートした後、624黒色腫標的細胞を1:3のエフェクター
:標的比で添加した。プレートを37℃、5%CO2で一晩(18時間)インキュベート
した。
BD)を用いてサイトカイン分泌について分析した。
療法:F4 TIL(gp100特異的)をMel-624細胞と1:3のエフェクター
:標的比で18時間培養した。共培養上清を収集し、分泌サイトカインの存在について試
験した。抗TIGITまたは抗PD1の処置は、IFNγ分泌レベルにもTNF分泌レベ
ルにも影響を及ぼさなかった。しかしながら、抗PVRIGと併用して抗TIGITまた
は抗PD1を組み合わせで共培養に添加したときに、IFNγレベル及びTNFレベルの
増加が観察された(図87A~B)。
TILからのIFNγレベルにもTNF分泌レベルにも影響を及ぼさなかったが、抗TI
GITまたは抗PD1抗体を抗PVRIG(CPA.7.021)と併用して添加したと
きに、IFNγ及びTNFレベルの増加が観察された。提示したデータは、抗TIGIT
または抗PD1抗体との併用療法には相乗効果があることを示唆する。
IG抗体の効果
Jurkat-NFAT-Luc細胞株等のTCRシグナル伝達のためのレポーターア
ッセイ系を使用して、TCR媒介性シグナル伝達に対する抗PVRIG抗体の効果を試験
する。このJurkat細胞株誘導体は、NFAT応答要素の制御下でルシフェラーゼレ
ポーター遺伝子を発現する。これらの細胞を、完全長ヒトPVRIGをコードするベクタ
ーでトランスフェクトする。陰性対照として、空ベクターでトランスフェクトした細胞を
使用する。CD28及びPD-1等の共刺激または共阻害参照分子をコードするベクター
を有するトランスフェクタントが、陽性対照の役割を果たす。トランスフェクタントを、
抗PVRIG抗体の不在下または存在下で抗ヒトCD3(例えば、OKT3)を添加して
刺激する。アイソタイプ対照が、陰性対照の役割を果たす。参照分子に対する既知の機能
的抗体が、陽性対照の役割を果たす。機能的作用架橋抗体は、ルシフェラーゼ活性に対す
る抑制効果を示すと予想される。
プレート結合アッセイを使用して、T細胞活性化、増殖、及びサイトカイン分泌に対す
る抗PVRIG抗体の効果を試験する。精製ヒトバルクT細胞を、1ug/mlのプレー
ト結合抗ヒトCD3(例えば、OKT3)及び5ug/mlのPVRL2-Fc(PVR
IGの対応物であるPVRL2のECDから成る組み換え融合タンパク質)または陰性対
照を使用して刺激する。T細胞活性化を、活性化マーカー、例えば、CD137の発現に
よって、またはCFSE染色の希釈によって評価される細胞分裂によって評価する(T細
胞をCFSEで標識した後、それらを刺激する)。サイトカイン産生(例えば、IFNg
、IL-2)もT細胞活性化の追加の読み出しとして評価する。T細胞亜型マーカーを使
用して、CD4 T細胞またはCD8 T細胞に対する特異的効果を区別する。共固定P
VRL2-Fcは、T細胞上のPVRL2の既知の共刺激対応物受容体である内因性DN
AM1により媒介されるT細胞活性化に対して基礎刺激効果を有し得る。拮抗抗PVRI
G Abの存在下で、PVRL2-Fcのこの基礎刺激効果は、それらがT細胞活性化に
対する内因性PVRIGの抑制影響を阻止するため、更に増強されると予想される。した
がって、作用抗PVRIG Abは、T細胞活性化の抑制を示すと予想される。
の効果
細胞ベースのアッセイを使用して、T細胞活性化、増殖、及びサイトカイン分泌に対す
る抗PVRIG抗体の効果を試験する。精製ヒトバルクまたはCD4 T細胞もしくはC
D8 T細胞を、PVRL2または空ベクターを異所的に発現するCHO刺激因子細胞(
膜結合抗CD3を発現するCHO細胞)との共培養時に刺激する。T細胞活性化を、活性
化マーカー、例えば、CD137の発現によって、またはCFSE染色の希釈によって評
価される細胞分裂によって評価する(T細胞をCFSEで標識した後、それらを刺激する
)。サイトカイン産生(例えば、IFNγ、IL-2)もT細胞活性化の追加の読み出し
として評価する。T細胞亜型マーカーを使用して、CD4 T細胞またはCD8 T細胞
に対する特異的効果を区別する。PVRL2発現CHO刺激因子は、T細胞上のPVRL
2の既知の共刺激対応物受容体である内因性DNAM1により媒介されるT細胞活性化に
対して基礎実施例19刺激効果を有すると予想される。拮抗抗PVRIG Abの存在下
で、表面発現されたPVRL2のこの基礎刺激効果は、それらがT細胞活性化に対する内
因性PVRIGの抑制影響を阻止するため、更に増強されると予想される。したがって、
作用抗PVRIG Abは、T細胞活性化の抑制を示すと予想される。
抗PVRIG抗体を、Vβ3及びVβ8 T細胞受容体鎖を発現している全てのT細胞
を従事させ、活性化するために健常な立候補者由来の血液細胞及びSEB(ブドウ球菌エ
ンテロトキシンB)スーパー抗原を使用してT細胞活性に対するその効果について試験し
た。ヒトPBMCを、96ウェル丸底プレート中で培養し、試験抗体と共に30~60分
間プレインキュベートした。次にSEBを、10ng/mL~10 μg/mLの範囲の
種々の濃度で添加した。上清を培養の2~4日後に収集し、産生されたサイトカイン(例
えば、IL-2、IFNγ)の量を、ELISAによってか、または標準的なCBAキッ
トを使用して定量化した。SEBは、用量依存性の様式で全血細胞によってサイトカイン
産生を刺激した。抗PVRIG mAbがサイトカイン産生に与える効果を、いくつかの
Ab用量で試験した。抗PVRIG mAbの妨害は、対照IgGと比べてIL-2産生
を増強すると予想される。IL-2に加えて、AbがTNFα、IL-17、IL-7、
IL-6、及びIFNγ等の更なるサイトカインのレベルに与える効果を、このアッセイ
においてCBAキットを使用して試験することができる。
抗ヒトPVRIGが健常なドナー血液における既存のメモリーT細胞のAg特異的刺激
に与える機能的効果をプロファイリングするために使用されるアッセイは、破傷風トキソ
イド(TT)アッセイである。これを受けて、新たに調製したPBMC(2×105細胞
)を、完全RPMI 1640培地(5%の熱不活性化したヒト血清を含む)において9
6ウェル丸底プレート中でプレーティングし、異なる濃度の試験抗体と共にプレインキュ
ベートし、100ng/mLの濃度のTT(Astarte Biologics)で刺
激した。細胞を37℃で3~7日間インキュベートした後、上清を採取した。サイトカイ
ン濃度(例えば、IL-2、IFN-γ)をELISA及び/またはCBAキットによっ
て決定した。抗PVRIG Abの妨害は、T細胞増殖及びサイトカイン産生を、TT抗
原のみによって得られるものと比較して増強すると予想される。
セットアップを使用して、抗PVRIG Abが、CMV、EBV、インフルエンザHI
V、ムンプス、及びTB等の更なる抗原に対するリコール応答時のT細胞活性化に与える
効果を試験することができる。これは、KLH等の新抗原を使用してナイーブ細胞の刺激
に対する効果を試験するためにも使用することができる。
る患者の末梢血に由来する四量体選別Ag特異的CD8 T細胞の抗原特異的応答に対し
て試験する。四量体選別CD8 T細胞を、ペプチド充填同種PBMCと5日間共培養す
る。CD8 Ag特異的T細胞の増殖及びサイトカイン(例えば、IFNγ、IL2、T
NF-α)の分泌が上昇する。抗PVRIG抗体が、抗原のみと比較して増殖及びサイト
カイン産生を増強すると予測する。
この実施例は、細胞株及び一次白血球におけるハイブリドーマ由来抗体(CHA抗体)
のヒト及びカニクイザルPVRIGタンパク質への結合の特性評価、ならびにハイブリド
ーマ由来抗体がPVRIG及びPVRL2間の相互作用を遮断する能力の特性評価を示す
。
hPVRIGを過剰発現している細胞のFACS解析:以下の細胞株を使用して、抗ヒ
トPVRIG抗体の特異性を評価した:HEK 親及びHEK hPVRIG過剰発現細
胞。これらの細胞を、DMEM(Gibco)+10%のウシ胎仔血清(Gibco)+
グルタマックス(Gibco)中で培養した。HEK hPVRIG過剰発現細胞につい
ては、0.5ug/mlのピューロマイシン(Gibco)も、陽性選択のために培地に
添加した。FACS解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採取し、ウェル当たり50
,000~100,000細胞を96ウェルプレートに播種した。抗ヒトPVRIG抗体
(mIgG1またはmIgG2a)及びその対応する対照を、一点希釈(5ug/ml)
で、または30分~1時間の氷上での10ug/mlから開始した8点滴定シリーズとし
て添加した。滴定シリーズは、1:3または1:3.3倍いずれかの連続希釈として実施
した。FACS Canto II(BD Biosciences)またはIntel
liCyt(IntelliCyt Corporation)を使用してデータを得て
、FlowJo(Treestar)及びPrism(Graphpad)ソフトウェア
を使用して解析した。
VRIG抗体の発現及び特異性を評価した:Jurkat及びHepG2。Jurkat
細胞を、RPMI培地+10%のウシ胎仔血清、グルタマックス、非必須アミノ酸(Gi
bco)、ピルビン酸ナトリウム(Gibco)、及びペニシリン/ストレプトマイシン
(Gibco)中で培養した。HepG2細胞を、DMEM+10%のウシ胎仔血清+グ
ルタマックス中で培養した。FACS解析のため、全ての細胞株を対数増殖期に採取し、
ウェル当たり50,000~100,000細胞を96ウェルプレートに播種した。抗ヒ
トPVRIG抗体(mIgG1またはmIgG2a)及びその対応する対照を、一点希釈
(5ug/ml)で、または30分~1時間の氷上での10ug/mlから開始した8点
滴定シリーズとして添加した。滴定シリーズは、1:3または1:3.3倍いずれかの連
続希釈として実施した。FACS Canto IIまたはIntelliCyteを使
用してデータを得て、FlowJo及びPrismソフトウェアを使用して解析した。
Stanford Blood Bank)のFicoll(GE Healthcar
e)勾配単離によって得た。単離した末梢血単核細胞(PBMC)としての白血球を、1
0%のDMSO(Sigma)、90%のウシ胎仔血清混合物中1×107~5×107
細胞/mlの密度で液体窒素中で凍結させた。PBMC上のPVRIGのタンパク質発現
を評価するために、ヒト抗PVRIG抗体を含む、腫瘍免疫サブセットに向けた抗体カク
テルを設計した。抗ヒトPVRIG抗体(mIgG1またはmIgG2a)及びその対応
する対照を、一点希釈(5ug/ml)で、または一部の場合には30分~1時間の氷上
における10ug/mlから開始した4点滴定シリーズとして添加した。
Live/Dead、Life Technologies)時に5×105 ~1×1
06細胞/ウェルで播種した蘇生したPBMCに添加した。抗体カクテルを、氷上で30
分~1時間、PBMCと共にインキュベートした。次に、PBMCを洗浄し、FACS
Canto IIを使用するFACSによってデータを得た。FlowJo及びPris
mソフトウェアを使用してデータを解析した。解析した免疫サブセットには、CD56薄
暗NK細胞、CD56明NK細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、非在来型T細胞(
例えば、NKT細胞及びγδT細胞)、B細胞、及び単球が含まれた。
抗ヒトPVRIG抗体のカニクイザルPVRIG(cPVRIG)との交差活性を評価し
た:expi親及びexpi cPVRIG過剰発現細胞。これらの細胞を、DMEM+
10%のウシ胎仔血清+グルタマックス中で培養した。expi cPVRIG一過性過
剰発現細胞を、Neonトランスフェクション系を使用して、cPVRIG DNAの親
Expi細胞へのエレクトロポレーションによって生成した。FACS解析のために、e
xpi cPVRIG細胞をトランスフェクションから1~3日後に使用した。Expi
細胞を対数増殖期から採取した。各種類、ウェル当たり50,000~100,000個
の細胞を96ウェルプレートに播種した。抗ヒトPVRIG抗体(mIgG1またはmI
gG2a)及びその対応する対照を、一点希釈(5ug/ml)で、または30分~1時
間の氷上での10ug/mlから開始した8点滴定シリーズとして添加した。滴定シリー
ズは、1:3または1:3.3倍いずれかの連続希釈として実施した。FACS Can
to IIまたはIntelliCyteを使用してデータを得て、FlowJo及びP
rismソフトウェアを使用して解析した。
球を、発現解析前24時間以内に採血した新鮮血から得た。血液はBioreclama
tionから得た。カニクイザルPBMC上のPVRIGのタンパク質発現を評価するた
めに、ヒト抗PVRIG抗体を含む、腫瘍免疫サブセットに向けた抗体カクテルを設計し
た。抗ヒトPVRIG抗体(mIgG1またはmIgG2a)及びその対応する対照を、
一点希釈(5ug/ml)で、または30分~1時間の氷上での10ug/mlから開始
した8点滴定シリーズとして添加した。
5 ~1×106細胞/ウェルで播種したPBMCに添加した。抗体カクテルを、氷上で
30分~1時間、PBMCと共にインキュベートした。次に、PBMCを洗浄し、FAC
S Canto IIを使用するFACSによってデータを得た。Prismソフトウェ
アを使用してデータを解析した。解析した免疫サブセットは、CD16+リンパ球、CD
14+/CD56+単球/骨髄細胞、及びCD3+T細胞を含んだ。
の相互作用を遮断する能力を細胞競合アッセイにおいて評価した。このアッセイでは、リ
ガンドPVRL2を、操作していないHEK細胞上で内因的に発現させ、可溶性Fc標識
PVRIG(Genscriptが要望対応で製造した)を添加した。この場合、PVR
IG抗体がHEK細胞への可溶性PVRIG結合を遮断する能力を、33nMの可溶性P
VRIGタンパク質及びPVRIG抗体(0.066~66nM)を100,000個の
HEK細胞に同時添加し、氷上で1時間インキュベートすることによって評価した。PV
RIG Fc結合の程度を、氷上で20~30分間、抗ヒトFc Alexa 647(
Jackson Laboratories)を添加することによって検出した。細胞を
、FACS Canto IIを使用した取得のために、PBS中で2回洗浄した。デー
タを、FlowJo(Treestar)、Excel(Microsoft)、及びP
rism(GraphPad)を使用して解析した。
ハイブリドーマPVRIG抗体は過剰発現細胞上でPVRIGを認識する:PVRIG
に特異的であった抗体についてスクリーンするために、2つのハイブリドーマキャンペー
ンから生成された抗体が、ヒトPVRIGを過剰発現するように操作されたHEK細胞株
に結合する能力を評価した。これらのキャンペーンに由来する抗体の大部分がHEK h
PVRIG細胞に結合したが、親和性は様々であった。更に、これらの抗体の大部分はH
EK親細胞株への低いバックグラウンド結合も示し、これはPVRIGに対する高い特異
性を示す。図77は、PVRIG抗体の特異性の一例を示す。ハイブリドーマキャンペー
ンにおいて生成された対照と比較したHEK hPVRIG細胞に対する抗体の全結合特
性の概要を図79に示す。
ーブPBMCサブセット上で最高レベルのPVRIGを示した集団はNK及びCD8 T
細胞であり、これら2つの細胞サブセット間の発現の絶対レベルは同様であった(gMF
I)。CD4 T細胞はより低いレベルのPVRIGを示し、一方でB細胞及び単球は検
出可能な発現をほとんどまたは全く有しなかった。本抗体によって検出されたNK細胞及
びCD8+T細胞上の発現の概要を図32に示す。他のより少数のサブセットもPVRI
G発現を示し、NKT細胞及びγδT細胞等の従来型ではないT細胞を含んだ。PBMC
サブセット上の発現パターンは、調達し解析した全ドナーにわたってよく似ていた。
で検出された:PVRIGタンパク質発現についてのPBMCのスクリーニングに加えて
、それが癌細胞株上でも発現されたかどうかの理解を望んでいた。発明者らの抗体を、そ
れらのPVRIG RNAの高い発現を所与としてスクリーニングすることを選択した。
HepG2を陰性対照細胞株も、発明者らの抗体の特異性を更に検証するために選択した
。ハイブリドーマ由来抗体の大部分がJurkat細胞上のPVRIGタンパク質発現を
検出した(図79、一次ヒトPBMC、カニクイザル過剰発現細胞、及びカニクイザル一
次PBMCへのPVRIGハイブリドーマ抗体結合特性)。ExpiカニクイザルOEは
cPVRIGと共に一過的にトランスフェクトしたExpi細胞を表し、expi pa
rはexpi親細胞を表す。gMFIrは、それらの対照と比べたPVRIG抗体染色の
幾何学的MFIにおける倍率差異を示す。濃度は、gMFIrを計算した濃度を示す。試
験せずは、ヒトHEK hPVRIG、expi cPVRIG細胞に対する結合の不在
に起因して試験しなかったか、あるいはPBMCサブセットに対する結合要件を満たさな
かった抗体を示す。ハイライトした抗体は、ヒト化を行った4つの抗体である(図90参
照)。
G検出の例を、代表的な抗体であるCHA.7.518を用いて図78に示す。
リドーマ抗体をスクリーニングすると、PVRIG-PVRL2相互作用の明確な遮断因
子が20個、非遮断因子が9個あったことを見出した。遮断抗体の全てが、PVRIG
FcのHEK細胞との相互作用を少なくとも50%阻害し、これらの抗体の大部分がPV
RIG Fc結合を完全に無効にすることができた。遮断能力を示した抗体と関連するこ
れらのIC50値を図92に報告する。IC-50値の大部分は20~60nMであった
。
ハイブリドーマプラットフォームを使用して、ヒトPVRIG 抗原に向けたモノクロ
ーナル抗体を生成することに成功した。操作された過剰発現細胞及び一式の癌細胞株を使
用して、発明者らの抗体がPVRIG抗原に高度に特異的であり、RNA発現と相関する
タンパク質発現を検出できることを示した。ヒトPBMCサブセットの解析の際に、PV
RIGタンパク質がNK及びT細胞上で最も高く発現され、B細胞及び骨髄細胞上では低
く発現した/発現が陰性であったことが示された。また、これらの抗体の一部がカニクイ
ザル(cyno)PVRIG抗原と交差反応性であることを、その過剰発現細胞への結合
を評価することによって示した。更に、カニクイザルPBMC上の発現パターンはヒトP
BMCに類似する。最後に、FACS系競合アッセイによって、発明者らのハイブリドー
マ抗体の一部がPVRIGとそのリガンドであるPVRL2との相互作用を阻害できるこ
とを示すことができた。全ての上述のデータに関して最良の特性を示した特性抗体は、C
HA-7-518、CHA-7-524、CHA-7-530、及びCHA-7-538
であった。
抗ヒトPVRIG抗体の同種抗原応答に対する機能効果をプロファイリングするために
使用されるアッセイは、混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおけるヒトCD8+ T
細胞の増殖である。当該技術分野で既知であるように、MLRは、T細胞機能のインビト
ロでの相関を提供するエクスビボでの細胞免疫アッセイである。
D8 T細胞の増殖を増強すると予想される。ヒトT細胞は、ヒトT細胞Rosette
Sep RTM(StemCell Technologies)を製造業者の指示に従
って使用することによって、1つのドナー(例えばドナーA)の全血から濃縮する。分離
後、細胞をCFSE色素(Molecular Probes)で蛍光標識する。同種抗
原提示細胞(APC)として働かせるために、まず単核細胞をMHCミスマッチドナー(
例えばドナーB)由来の全血から単離した後、CD3+ T細胞を枯渇させる。次に、A
PCをセシウム照射器において2500ラドで照射する。
00個のAPCを、5日間、異なる濃度の抗PVRIG抗体と共に、150,000個の
CD8+ T細胞及びAPCを有する96ウェル平底プレート中で共培養する。5日目に
、細胞を採取し、洗浄し、抗CD8-ビオチン、続いてストレプトアビジン-PerCp
で染色する。試料をFACSによって流して、CFSE希釈によって示される増殖の程度
を評価する。機能妨害抗PVRIG抗体は、MHCミスマッチドナーからの細胞に応答し
てT細胞増殖及びサイトカイン分泌を増強すると予想される。
生化学的効果を特性評価し、ハイブリドーマ由来抗体がMLR環境においてT細胞増殖を
調節する能力を特性評価した。
混合リンパ球反応(MLR):混合リンパ球反応を、樹状細胞(DC)と、同種環境に
おける明確に異なるドナーに由来するT細胞との共培養によって確立した。DCは、精製
した単球を100ng/mlのGM-CSF(R&D systems)及び100ng
/mlのIL-4(R&D systems)と共に7日間培養することによって生成し
た。7日後、精製したCFSE標識CD3 T細胞をDCと10:1の割合で組み合わせ
、X vivo-20無血清培地(Lonza)中で5日間培養した。一部の条件におい
ては、コンジュゲートしていない抗PVRIG抗体またはアイソタイプ対照抗体を10u
g/mlでプレートに添加した。3つのMLRアッセイの並べ替えを設定し、これにおい
て、1つのドナー由来のDCを3つの個別の同種ドナー由来のCD3 T細胞と共に共培
養した。全ての血液製品はStanford Blood Bankから得た。
、CFSE希釈、ならびにCD25及びPD-1等の活性化 マーカーの発現によって評
価した。ファージキャンペーン及びハイブリドーマキャンペーン両方からの自家抗PVR
IG抗体を使用して、PVRIGの発現を評価した。PVRIGリガンドであるPVRL
2の発現も、DC上で動態の様式で評価した。全てのデータはフローサイトメトリーを使
用して取得し、データ解析はFlowJo(Treestar)及びPrism(Gra
phpad)ソフトウェアを使用して行った。
これらの抗体がFACSに基づく結合に基づいて「ビニング」されたエピトープであり得
るかどうか、及びこの「ビニング」が、アッセイにおいてT細胞活性化及び増殖の変化と
相関し得るかどうかの決定に興味を持った。これを行うために、アッセイから採取したT
細胞を、コンジュゲートしていないPVRIG抗体と共に事前インキュベートした後、異
なるクローンのコンジュゲートしたPVRIG抗体で対比染色した。コンジュゲートした
PVRIG抗体がT細胞上で付与したシグナルの程度は、この抗体がT細胞上でのPVR
IG結合についてコンジュゲートしていない抗体と競合しなければならなかったその程度
を示す。陰性または低いシグナルは、高い競合があったことを示し得、これは、2つの抗
体が同じエピトープ 「ビン」中あることを示す。高いシグナルは、競合が低いかまたは
皆無であることを示し得るため、抗体が異なる「ビン」にあるとみなされ得る。
単球由来DC上のPVRL2の発現:MLRアッセイのためにPVRL2がDC上で発
現され得るかどうかを決定するため、DCを単球から生成し、PVRL2発現を、GM-
CSF及びIL-4の添加後、1日ごとに動態の様式で評価した。図72に示すように、
PVRL2発現は、0日目から、発現がピークであった5日目まで増加した。6日目、発
現は5日目と比較してわずかに減少した。7日目、発現は6日目と同様であり、これらの
時点でのPVRL2発現の安定化を示した。このため、DCは、MLRアッセイにおける
使用に適切な時点でPVRL2を発現した。
細胞受容体は増殖T細胞上で発現される。このため、PVRIGも発現されるかどうかの
決定を望んだ。MLR共培養開始後5日目に増殖T細胞を解析し、CFSEのそれらの希
釈(即ち、CFSEが低い)によって特性評価した。図73及び図74に示すように、ア
イソタイプ対照(mIgG1)と比べて、PVRIGは、解析した3つのドナーにわたる
CD4細胞及びCD8 T細胞両方の複数のPVRIG抗体によって決定して、CFSE
が低い細胞上で発現された。CFSEが低い細胞上のPVRIGを示すFACSプロット
を図73に示し、図74の棒グラフはmIgG1と比べたPVRIGの発現のレベルを示
す。
上で発現されることを示したため、PVRIG抗体による処理がT細胞増殖のレベルに影
響し得るかどうかの決定を望んだ。図4に示すように、PVRIG抗体をMLRアッセイ
に加えたことで、対照と比較して、試験した全てのハイブリドーマ抗体にわたってCFS
Eが低い細胞のパーセンテージを増加させることができた。これは分析した全てのドナー
にわたって観察された。
VRIG上で異なるエピトープに結合するそれらの能力について比較するために、MLR
からのT細胞を発明者らのハイブリドーマキャンペーンに由来する非標識抗PVRIG抗
体と共に5日間培養した競合実験を行った。次に、T細胞を5日目で採取し、発明者らの
ファージキャンペーンに由来したコンジュゲートした抗PVRIG抗体(CPA.7.0
21)で対比染色した。図76に示すように、背景蛍光レベルと比較した場合、CPA.
7.021結合の完全またはほぼ完全な低減が、CHA.7.516-M1、CHA.7
.518-M1、CHA.7.524-M1、CHA.7.530-M1、及びCHA.
7.538-M1を含む条件下で観察され、これは、これらの抗体がエピトープ認識にお
いて重複し得ることを示唆する。CPA.7.021結合における部分的低減が、CHA
.7.537-M1、CHA.7.528-M1、及びCHA.7.548-M1で観察
され、これは、エピトープ認識における部分的重複を示唆する。CHA.7.543-M
1と共に事前培養した細胞においては、CPA.7.021結合における低減は観察され
ず、これは、エピトープ認識の不在を示唆する。まとめると、このデータは、発明者らの
キャンペーンからのPVRIG抗体が、CPA.7.021と比較して評価した場合、P
VRIG上で少なくとも3つの異なるエピトープを認識し得ることを示す。
らびにMLRにおけるそれらの機能について特性評価した。複数のPVRIG抗体の結合
が、増殖T細胞上で検出され、休止、特にCD8+サブセットと比較して、増殖T細胞上
でより高かった。このデータは、PVRIG発現がT細胞活性化の際に増加することを示
す。更に、いくつかのPVRIG抗体は、mIgG1アイソタイプと比較してT細胞増殖
を増加させ、これらがT細胞機能を調節することもできることを示した。上記のように、
これらの抗体は全て、PVRIGを、そのリガンドであるPVRL2によって妨害する能
力を有する。これに基づいて、PVRIG-PVRL2相互作用を妨害することによって
、これらの抗体が、癌の治療に使用され得る免疫チェックポイント阻害剤のための所望の
効果の代表的な指標であるT細胞活性化及び増殖の増加をもたらすと結論付けた。最後に
、複数のハイブリドーマ由来PVRIG抗体の活性化したT細胞への結合をファージ由来
抗体に対して比較した競合実験を行った。実験のこのシリーズから、発明者らのファージ
及びハイブリドーマ由来抗体のエピトープ多様性についての証拠を提供する。
胞活性化に与える影響
PVRIG妨害と、既知の免疫チェックポイント(例えば、PD1、PDL-1、また
はTIGIT)の妨害Abとの組み合わせは、上述のアッセイにおいてT細胞活性化に対
する刺激効果を更に増強すると予想される。
本発明のヒトPVRIG抗体を、一次細胞に基づくアッセイにおいて、PVRIGがそ
のリガンドであるPVRL2との相互作用を阻害する能力、及びエフェクターリンパ球機
能を調節するその能力について特性評価した。
細胞に基づく生化学アッセイ
PVRIG抗体がPVRIGとそのリガンドであるPVRL2との相互作用を阻害する
能力を、2つの配向で細胞内生化学アッセイ形式において評価した。
させ、可溶性ビオチン化Fc標識PVRIG(Genscriptが要望対応で製造した
)を添加した。この場合、PVRIG抗体がHEK細胞への可溶性PVRIG結合を遮断
する能力を、2つの並べ替えによって評価した。第1の並べ替えにおいては、種々の濃度
のPVRIG抗体(0.066~66nMの範囲)を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、
Gibco)中で30間氷上で33nMの可溶性PVRIGと共にプレインキュベートし
た。続いて、この複合体を100,000個のHEK細胞に添加し、氷上で更に1時間イ
ンキュベートした。1時間後、HEK細胞をPBS中で2回洗浄し、HEK細胞に結合し
た可溶性PVRIGの規模を、30分間氷上でAlexa 647(Jackson L
aboratories)にコンジュゲートしたストレプトアビジンを添加することによ
って検出した。HEK細胞をPBS中で2回洗浄し、FACS Canto II(BD
Biosciences)上での取得のために100ulのPBS中に再懸濁した。F
lowJo(Treestar)及びPrism(Graphpad)ソフトウェアを使
用してデータを解析した。第2の並べ替えでは、33nMの可溶性PVRIGタンパク質
及びPVRIG抗体(0.066~66nM)を100,000個のHEK細胞に同時に
添加し、1時間氷上でインキュベートした。この並べ替えを解析するための次のステップ
は、第1の並べ替えと同等である。
チン化Fc標識PVRL2(CD Biosciences)を添加した。この場合、1
60nMの可溶性PVRL2を伴う種々の濃度のPVRIG抗体(0~200nMの範囲
)を、100,000個のHEK hPVRIGまたは親HEK細胞に同時添加し、氷上
で1時間、PBS+1%のBSA+0.1%のアジ化ナトリウム(FACS緩衝液)中で
インキュベートした。可溶性PVRL2結合を、氷上で30分間、FACS緩衝液中のス
トレプトアビジンAlexa 647の添加によって検出した。細胞をFACS緩衝液中
で2回洗浄し、Intellicyt HTFC(Intellicyt)上での取得の
ために50ulのPBS中に再懸濁した。データを、FlowJo(Treestar)
、Excel(Microsoft)、及びPrism(GraphPad)を使用して
解析した。
PVRIGについての発現プロファイルが最も堅実であったPBMCサブセットはNK
細胞上にあった。このため、PVRL2発現腫瘍細胞とのNK細胞に基づく共培養アッセ
イを設計して、発明者らの抗体がこれらの標的に向けたNK細胞媒介性細胞傷害性を調節
し得るかどうかを決定した。選択した標的は、急性B細胞性リンパ球性白血病細胞株であ
るReh(ATCC細胞バンク)、及び急性骨髄性白血病細胞株であるMOLM-13(
DSMZ細胞バンク)であった。Reh及びMOLM-13細胞を、RPMI培地(Gi
bco)+20%のウシ胎仔血清(Gibco)、グルタマックス(Gibco)、ペニ
シリン/ストレプトマイシン(Gibco)、非必須アミノ酸(Gibco)、ピルビン
酸ナトリウム(Gibco)、HEPES(Gibco)、及びベータ-メルカプトエタ
ノール(Gibco)中で成長させた。
yi Biotec)を使用して単離し、RPMI培地+ 20%のウシ胎仔血清、グル
タマックス、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム
、HEPES、ベータ-メルカプトエタノール、及び250U/mlのIL-2(R&D
systems)中で培養した。アッセイ当日、NK細胞を採取し、数え、室温で15
~30分間、PVRIG抗体と共にプレインキュベートした。このインキュベーション中
、標的細胞を培養物から採取し、37℃で30分間、Calcein AM(Life
Technologies)によって標識し、培地中で洗浄し、アッセイのために数えた
。NK細胞媒介性細胞傷害性アッセイをセットアップし、ここでは、一定数の標的細胞(
50,000個)を5ug/mlのPVRIG抗体と共にプレインキュベートした(こう
してNK細胞対標的比を改変する)漸増濃度のNK細胞と共培養した。あるいは、固定の
NK細胞対標的比をアッセイにおいて使用したが、NK細胞を、用量漸増で改変する濃度
のPVRIG抗体(3.9ng/ml~5ug/mlの範囲)と共にプレインキュベート
した。NK細胞及び標的の添加時に、プレートを1分間1,400rpmでパルススパン
し、4時間、5%のCO2雰囲気中、37℃に置いた。4時間後、プレートを4分間1,
400rpmでスパンし、80ulの上清を採取して、標的細胞からのCalcein
AMの放出を定量化した。標的から放出されたCalcein AMの量をSpectr
amax Gemini XS蛍光光度計(Molecular Devices)によ
って評価した。Calcein AM放出についての対照として、全放出及び自然放出を
、アッセイ期間中、標的細胞を70%のエタノールまたは培地のみに露出させることによ
って評価した。NK細胞による殺傷(パーセンテージとして)のレベルを、以下の式を使
用して計算した:
(試料放出-自然放出)/(全放出-自然放出)*100
0A7、特許番号WO2009126688 A2)及びDNAM-1(Biolege
nd、クローン11A8)等のNK細胞受容体に向けた他の抗体も、コンパレーターとし
て加えた。
細胞に基づく生化学アッセイ:細胞生化学アッセイにおける発明者らのPVRIG抗体
のスクリーニングパネルの際、試験した抗体にわたって可変のレベルの抑制が存在し、抑
制のレベルはアッセイの並べ替え及び配向に依存したことを見出した(図98)。これら
の要点を例示するために特に4つの抗体を図93に示す。対照に対して最も堅実な抑制効
果を付与したアッセイの配向及び並べ替えは、PVRIG抗体と共にプレインキュベート
した可溶性PVRIGをHEK細胞に添加したときであった(図93a)。この並べ替え
では、CPA.7.021が、他の3つの抗体(CPA.7.002、CPA.7.00
5、及びCPA.7.050)と比較して最良の絶対的妨害能力を示した。妨害レベルの
差異にも関わらず、この並べ替えの全ての抗体が、同様の低いナノモル範囲であったIC
50値を示し、妨害能力は、より高い濃度でプラトーであった。
RIG及びPVRIG抗体をHEK細胞に同時添加したときに測定すると、アッセイにお
ける妨害のより大きい変動性が観察された(図93b)。やはりCPA.7.021が最
良の妨害抗体であった。しかしながら、CPA.7.002及びCPA.7.005は、
対照抗体と比較してHEK細胞への可溶性PVRIG結合を阻害する能力が顕著に低いこ
とを示した。CPA.7.050は、CPA.7.021、CPA.7.002、及びC
PA.7.005と比較して、中等レベルの妨害を示した。抑制の絶対レベルのこの差異
も、各抗体のIC50値の差異と対応した。CPA.7.021及びCPA.7.050
は再び低いナノモルIC50値を示したが、これらは両方とも、アッセイの第1の並べ替
えにおけるものよりも高かった。対照的に、CPA.7.002及びCPA.7.005
のIC50値はかなり増加し、CPA.7.002は約20倍、及びCPA.7.005
は約30倍であった。このデータは、抗体がどのようにPVRIG結合についてその同族
リガンドと競合する必要があるのかが、抗体がこの相互作用を妨害できる効力を示すこと
を示す。
RL2Fcを評価した)場合、4つのPVRIG抗体がPVRL2 Fc相互作用を妨害
する能力は可変であった(図93c)。HEK細胞を標的として使用した生化学アッセイ
(図93a~b)と一貫して、CPA.7.021及びCPA.7.050はHEK h
PVRIG細胞へのPVRL2 Fc結合を阻害し、結合を妨害するそれらの能力は類似
していた。しかしながら、驚くべきことに、HEK細胞を標的として使用したときには観
察されなかった、CPA.7.002及びCPA.7.005抗体の存在下におけるPV
RL2 Fc結合の増強が見られた。
いて調査した第1の標的はReh株であった。Rehは、元々はフローサイトメトリーに
よるPVRL2の堅牢なレベルを示したが、NKG2Dリガンド等の他の活性化リガンド
の低い頻度、及びPVRの低い発現を示したために選択した(図94)。K562等の伝
統的なNK細胞標的は、PVRIG抗体の機能的効果を隠し得る、それらのNKG2Dリ
ガンドの高頻度の発現、及びPVRの高い発現に起因して使用しなかった。重要なことに
、Reh細胞は、TIGIT、DNAM-1、及びPVRIG等のPVRL2及びPVR
と相互作用することが知られているいずれのNK細胞受容体を発現しなかった。
K細胞媒介性細胞傷害性を調節することができた抗体を4つ見出した(図99)。これら
4つの抗体は、生化学アッセイ結果の節で考察したもの、つまりCPA.7.002、C
PA.7.005、CPA.7.021、及びCPA.7.050であった。全ての場合
において、これらの抗体の添加により、Reh細胞に対するNK細胞媒介性細胞傷害性が
増強された(図95a~c)。CPA.7.002及びCPA.7.005の添加が、最
も堅牢に細胞傷害性を増強し(図95a~b)、同様のレベルの増強を示したCPA.7
.021及びCPA.7.050が続く(図95c)。図95dは、CPA.7.002
及びCPA.7.021によるNK細胞媒介性細胞傷害性の増強の濃度依存性解析を示す
。TIGIT及びDNAM-1等のPVRL2にも結合することが報告されている受容体
に対する妨害抗体を、Reh細胞をコンパレーターとして用いて、アッセイに加えた。図
95e~fに示すように、TIGIT及びDNAM-1抗体の添加は、このアッセイにお
いて機能的効果を示さなかった。
K細胞媒介性細胞傷害性を調節することができるかどうかを評価するために、MOLM-
13細胞を利用した。MOLM-13もReh細胞に類似してPVRL2を発現するが、
PVRの堅牢な発現も有する(図94)。Reh細胞と同様、MOLM-13は、いずれ
のNK細胞受容体も発現しなかった。Reh細胞に加えたこの細胞株の利用は、PVRI
G抗体が、異なる受容体-リガンド相互作用の文脈において、特にPVRが発現される場
合に、NK細胞媒介性細胞傷害性を調節することができるかどうかを示し得る。
.021の機能的効果が衰退し、対照レベルを上回るNK細胞媒介性細胞傷害性の顕著な
増強を示さなかったことを見出した(図97a)。対照的に、CPA.7.002及びC
PA.7.005は、このアッセイにおいてNK細胞媒介性細胞傷害性を増強することが
できた(図97a)。コンパレーター抗体を使用すると、TIGITの妨害は、対照と比
較した場合に、このアッセイにおいて機能的効果を示さなかった(図97b)。
発明者らの抗体ファージプラットフォームを使用して、PVRIGとそのリガンドであ
るPVRL2との相互作用を妨害し、2つの血液細胞株に対するNK細胞媒介性細胞傷害
性を増強する能力を示したヒトPVRIG抗原に対する抗体のパネルを生成した。PVR
IG抗体がPVRIG及びPVRL2間の相互作用を阻害する能力は、アッセイの配向及
びプレインキュベーションステップの影響を受け、これは、癌等の生理学的環境における
PVRIGによる可能性のある抗体動態を表す。4つの抗体がReh細胞株に対するNK
細胞媒介性細胞傷害性を増強する能力を示したが、MOLM-13細胞に対する細胞傷害
性を増強する能力を示した抗体は2つのみであった。この差異は、各細胞株のNK細胞媒
介性認識に関与する交互の受容体-リガンド相互作用、ならびに/または抗体の差別的な
特性及びPVRIGの機能の調節におけるそれらの効力により得る。
G抗体がGD T細胞活性化に与える効果
細胞ベースのアッセイを使用して、ガンマデルタT細胞活性化、増殖、及びサイトカイ
ン分泌に対する抗PVRIG抗体の効果を試験する。精製したヒトガンマデルタT細胞を
HMBPPまたはIPPによって活性化し、PVRL2を自然に発現している標的細胞(
例えば、REH、MOLM-13)と、またはPVRL2もしくは空ベクターを異所的に
発現している標的細胞(例えば、CHO、Raji、721.221)と共培養する。ガ
ンマデルタT細胞機能を、培養した上清中のサイトカイン産生(例えば、IFN-γ、I
L-17)、または標的細胞上の細胞傷害性活性を検査することによって評価する。PV
LR2発現は、ガンマデルタT細胞上のPVRL2の既知の共刺激対応物受容体である内
因性DNAM1により媒介されるガンマデルタT細胞活性化に対して基礎刺激効果を有す
ると予想される。拮抗抗PVRIG Abの存在下で、サイトカイン産生または細胞傷害
性活性は、それらがガンマデルタT細胞活性化に対する内因性PVRIGの抑制影響を妨
害するため、更に増強されると予想される。したがって、作用抗PVRIG Abは、ガ
ンマデルタT細胞活性化の抑制を示すと予想される。
T細胞に対するタンパク質の効果
材料及び方法
これらの実験では、同種PBMCの存在下で抗CD3及び抗CD28を使用して活性化
したヒトT細胞にPVRIGが与える効果を評価する。逆に、このアッセイは、抗PVR
IG抗体のT細胞活性化に対する効果をアッセイするためにも使用することができる。
Fcに融合したヒトPVRIGのECDで構成されるPVRIG hECD-hIg融合
タンパク質(図92BA参照)を、GenScript(China)にて、CHO-3
E7細胞中の一過性トランスフェクト、その6日間の培養、及び続く細胞採集物のタンパ
ク質A精製によって産生させた。最終生成物をpH7.2のPBS中で製剤化した。使用
した発現ベクターは、PVRIG遺伝子がCMVプロモーターによって駆動される哺乳動
物発現ベクターpTT5である。
nyiから購入する(カタログ番号130-094-131)。hIgG1対照(Syn
agis(登録商標))をMedimmune Incから入手する。抗ヒトCD3 A
b(OKT3、カタログ番号 16-0037)及び抗ヒトCD28 Ab(クローンC
D28.2、カタログ番号16-0289)をeBioscienceから購入する。D
ynabeads M-450 Epoxy(カタログ番号140.11)をInvit
rogenから購入する。ヒト血液の軟膜をLifeSourceから入手する。Fic
oll-Paque Plus(カタログ番号17-1440-02)をGE Heal
thCareから購入する。
-Vivo 20培地中に懸濁し、3000ラドで照射する。ナイーブCD4+ T細胞
を、CD4+ Human T cell Isolation Kit II(Mil
tenyi)を製造業者の指示に従って使用することで3名の健常なヒトドナーの血液の
軟膜から単離し、照射した同種PBMCと共に1:1の割合で(ウェル当たり、1.5×
105のT細胞を1.5×105の照射したPBMCと共に)共培養する。培養物を抗C
D3(0.5ug/ml)及び抗CD28(0.5 ug/ml)抗体によって活性化す
る。抗PVRIG抗体またはPVRIG ECDタンパク質のいずれかを、示される濃度
で培養物に添加する。24時間培養した後、細胞をH3-チミジンによってパルスする。
細胞を72時間培養した後で採取する。
引き起こすことが予期され、これは、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、乾癬、及び炎症
性腸疾患等のT細胞駆動型自己免疫疾患の治療、ならびに他の免疫関連疾患の治療、なら
びに/または遺伝子もしくは細胞療法に続く望ましくない免疫活性化を低減させることに
おける、免疫抑制PVRIG系治療薬(例えば、本発明の少なくとも一部の実施形態に従
うPVRIGポリペプチドまたは融合タンパク質)の治療的可能性を支持する。本質的に
は、PVRIGに作用する免疫抑制PVRIGタンパク質は、かかる状態の疾患病理に関
与するT細胞の活性化及び炎症性サイトカインの産生を予防または低減するはずである。
、例えば、癌、感染疾患、特に慢性感染症、及び敗血症等の免疫治療のためのPVRIG
の抑制活性を低減する免疫刺激性抗PVRIG抗体の治療的可能性を支持することも予期
される。本質的には、免疫刺激性抗PVRIG抗体は、T細胞の活性化を促進し、炎症性
サイトカインの産生を励起することによって、癌性もしくは感染細胞または感染因子の枯
渇を促進する。
これらの実験では、ビーズアッセイにおいてPVRIG ECDまたは抗PVRIG抗
体がT細胞活性化に与える効果。
ヒトT細胞の単離:健常なヒトドナーからの軟膜をStanford Blood B
ankから入手する。CD3+ T細胞を、RosetteSepキット(StemCe
ll Technologies)を製造業者の指示に従って使用して軟膜から単離する
。細胞を、フローサイトメトリーによって抗CD45及び抗CD3を用いて解析して、得
られるCD3+細胞のパーセントを評価する。生死を、アッセイ前に解凍した後で評価す
る。
Invitrogen、カタログ番号14013)を、2段階プロトコルにおいて抗CD
3 mAb及びPVRIG ECDタンパク質または抗PVRIG抗体のいずれかでコー
ティングする。2段階プロトコルとは、一晩37℃でのリン酸ナトリウム緩衝液中50u
g/mlのヒト抗CD3クローンUTCH1(R&D systems、カタログ番号m
ab 100)、続く0~320ug/mlのPVRIG ECDタンパク質または抗P
VRIG抗体のいずれかとの37℃でのもう一晩のインキュベーションである。
る。
ABヒト血清(Gibco、カタログ番号34005-100)、Glutmax(Gi
bco、カタログ番号35050-061)、ピルビン酸ナトリウム(Gibco、カタ
ログ番号11360-070)、MEM Non-Essential Amino A
cids Solution(Gibco、カタログ番号11140-050)、及び2
-メルカプトエタノール(Gibco、カタログ番号21985)を補充した完全IMD
M(Gibco、カタログ番号12440-053)中で5日間、種々の濃度のPVRI
Gタンパク質でコーティングした100kまたは200kのビーズと共に培養する。5日
間の培養の最後に、細胞を、抗CD25、抗CD4、抗CD8、及び固定性生死判定色素
で染色して、細胞の各サブセット上のCD25発現レベルを決定する。上清を収集し、E
LISA(ヒトINFγduoset、R&D systems、DY285)によって
IFNγ分泌についてアッセイする。
共培養したヒトCD3 T細胞を、そのCD25の発現のレベルについて解析する。CD
4+及びCD8+細胞の両方がPVRIG-ECD-融合タンパク質による用量依存性抑
制を示すことが予期され、あるいは逆に、CD4+及びCD8+細胞の両方がPVRIG
-抗体による用量依存性活性化を示すと予想される。
実施例29:抗ヒトPVRIG抗体に基づくカニクイザル交差活性のエピトープマッピン
グ
この研究の目的は、カニクイザル(cyno)オルソログに対する抗ヒトPVRIG抗
体の交差活性を決定するPVRIGタンパク質上のエピトープを特定することである。ヒ
トPVR標的に対する主要な抗体の多くは、これらの抗体の多くが同じエピトープビンに
属するということにも関わらず、異なる程度のカニクイザル交差活性を示す。ヒト/カニ
クイザル交差活性(またはその欠如)の分子的根拠を明らかにするために、いくつかのP
VRIG組み換えタンパク質のカニクイザルからヒトへの突然変異を設計し、発現させて
精製し、ELISAにおいて抗ヒトPVRIG抗体のパネルへの結合について試験した。
カニクイザルからヒトへのPVRIG変異体の設計:ヒト及びPVRIG細胞外ドメイ
ン(ECD)の配列アラインメントは、ヒトオルソログとカニクイザルオルソログとの間
の90%の配列同一性及び93%の配列相同性を示す(図100)。突然変異(保存対非
保存)の性質及び変異領域の二次構造(コイル対拡張)に基づいて、3つのカニクイザル
PVRIGの部位指向性突然変異を設計して、カニクイザル交差反応性に集中したエピト
ープマッピングをプローブした。これらの突然変異には、H61R、P67S、及びL9
5R/T97IカニクイザルPVRIGが含まれる。野生型カニクイザル及びヒトPVR
IGも生成した。
RIG変異体を、哺乳動物細胞中でC末端6XHisタグとのECD融合物として発現さ
せた。タンパク質を、親和性精製、イオン交換クロマトグラフィー、及びサイズ排除クロ
マトグラフィーによって精製した。精製したタンパク質をPBS緩衝液(pH7.4)に
緩衝液交換し、4℃で保管した。
うに行った:カニクイザル、ヒト、及びカニクイザル/ヒトハイブリッドPVRIG(H
is標識)組み換えタンパク質を一晩4℃でIAプレートに吸収させた。コーティングし
たプレートウェルをPBSで2回濯ぎ、300μLの遮断緩衝液(PBS中5%の脱脂粉
乳、pH7.4)と共に1時間室温(RT)でインキュベートした。遮断緩衝液を除去し
、プレートをPBSで更に2回濯いだ。プレートに結合したリガンドを、溶液中の抗ヒト
PVRIG mAb(ヒトIgG1 アイソタイプ)(50μL/ウェル体積において0
.1μg/mL~8μg/mLの線形範囲)と共に1時間室温でインキュベートした。プ
レートを、PBS-T(PBS7.4、0.05%のTween20)で3回、その後P
BSで3回洗浄し、50μL/ウェルのHRP標識二次抗体を添加した(ヒトIgG F
cドメイン特異的、Jackson ImmunoResearch)。これを1時間室
温でインキュベートし、プレートを再度洗浄した。50μLのSureblue TMB
基質(KPL Inc)を添加し、5~20分間インキュベートすることによって、全て
のウェルにおいてELISAシグナルを発現させた。50μLの2N H2SO4(VW
R)を添加することによってHRP反応を停止させ、450nmでの吸光シグナルをSp
ectraMax(Molecular Devices)またはEnVision(P
erkinElmer)分光光度計上で読み取った。データをExcel(Micros
oft)にエクスポートし、GraphPad Prism(GraphPad Sof
tware,Inc.)においてプロットした。
カニクイザル交差活性の決定基としてのS67、R95、及びI97残基:図101に
示す結合データは、S67、R95、及びI97残基が種々の抗体のカニクイザル交差活
性に影響することを明確に示す。P67Sのカニクイザルからヒトへの突然変異がCPA
.7.002及びCPA.7.041の結合に負の影響を及ぼす一方、L95R/T97
Iのカニクイザルからヒトへの突然変異は、CPA.7.002、CPA.7.021、
CPA.7.028、及びCPA.7.041の結合を顕著に改善する。他方では、H6
1Rカニクイザルからヒトへの突然変異は、試験した抗体のいずれの結合にも影響しない
。
:カニクイザル、ヒト、及びハイブリッドPVRIG変異体への抗体の相対的結合は、3
つの明確に異なるエピトープ群を示唆する。群1はR95/I97残基(CPA.7.0
21及びCPA.7.028)と結合する。群2はS67及びR95/I97残基(CP
A.7.002及びCPA.7.041)と結合する。群3はS67またはR95/I9
7残基(CPA.7.024及びCPA.7.050)と結合しない。エピトープ群は、
これらの抗体のカニクイザル交差活性の程度との強い相関を示す(
図102)。
PVRIG ECDにおけるカニクイザルからヒトへの変形に基づく制限されたエピト
ープマッピングにより、S67、R95、及びI97残基を、抗ヒトPVRIG抗体のカ
ニクイザル交差活性の決定基として特定した。CPA.7.021及びCPA.7.02
8抗体についてのL95R/T97IカニクイザルPVRIGへの結合の完全回復、なら
びにこの変異体へのCPA.7.002の改善した結合は、R95及びI97残基がこれ
らの抗体に不可欠なヒトPVRIGエピトープであることを強く示唆する。これらの発見
は、非ヒト霊長類PVRIGオルソログへの交差活性を、その一次アミノ酸配列に基づい
て予測する可能性のある方法も示唆する。
Claims (13)
- i)配列番号1434の重鎖可変ドメインと、
ii)配列番号1453の軽鎖可変ドメインとを含み、vhCDR1(配列番号885)、vhCDR2(配列番号886)、vhCDR3(配列番号887)、vlCDR1(配列番号889)、vlCDR2(配列番号890)及びvlCDR3(配列番号891)の配列を含む、抗PVRIG抗体。 - 核酸組成物であって、
a)配列番号1434の重鎖可変ドメインをコードする第1の核酸と、
b)配列番号1453の軽鎖可変ドメインをコードする第2の核酸と、を含み、前記核酸によってコードされるタンパク質配列がvhCDR1(配列番号885)、vhCDR2(配列番号886)、vhCDR3(配列番号887)、vlCDR1(配列番号889)、vlCDR2(配列番号890)及びvlCDR3(配列番号891)の配列を含む、核酸組成物。 - 発現ベクター組成物であって、
a)請求項2に記載の前記第1の核酸を含む第1の発現ベクターと、
b)請求項2に記載の前記第2の核酸を含む第2の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。 - 請求項2に記載の前記第1の核酸と、請求項2に記載の前記第2の核酸と、を含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
- 請求項3または4に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
- 抗PVRIG抗体を作製する方法であって、
a)請求項5に記載の宿主細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養することと、
b)前記抗体を回収することと、を含む、方法。 - i)配列番号1447の重鎖可変ドメインと、
ii)配列番号1462の軽鎖可変ドメインとを含み、vhCDR1(配列番号981)、vhCDR2(配列番号982)、vhCDR3(配列番号983)、vlCDR1(配列番号985)、vlCDR2(配列番号986)及びvlCDR3(配列番号987)の配列を含む、抗PVRIG抗体。 - 核酸組成物であって、
a)配列番号1447の重鎖可変ドメインをコードする第1の核酸と、
b)配列番号1462の軽鎖可変ドメインをコードする第2の核酸と、を含み、記核酸によってコードされるタンパク質配列がvhCDR1(配列番号981)、vhCDR2(配列番号982)、vhCDR3(配列番号983)、vlCDR1(配列番号985)、vlCDR2(配列番号986)及びvlCDR3(配列番号987)の配列を含む、核酸組成物。 - 発現ベクター組成物であって、
a)請求項8に記載の前記第1の核酸を含む第1の発現ベクターと、
b)請求項8に記載の前記第2の核酸を含む第2の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。 - 請求項8に記載の前記第1の核酸と、請求項8に記載の前記第2の核酸と、を含む発現ベクターを含む、発現ベクター組成物。
- 請求項9または10に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
- 抗PVRIG抗体を作製する方法であって、
a)請求項11に記載の宿主細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養することと、
b)前記抗体を回収することと、を含む、方法。 - 請求項1又は7に記載の抗PVRIG抗体を含む医薬組成物であって、癌の治療のための医薬組成物。
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