BR112020023380A2 - anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, polinucleotídeo isolado, vetor recombinante, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo ou um fragmento de aglutinação ao antígeno do mesmo e para tratar ou detectar câncer, conjugado de anticorpo ,e, composição farmacêutica - Google Patents

anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, polinucleotídeo isolado, vetor recombinante, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo ou um fragmento de aglutinação ao antígeno do mesmo e para tratar ou detectar câncer, conjugado de anticorpo ,e, composição farmacêutica Download PDF

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Liahng-Yirn Liu
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Yu-Yu Lin
Shu-Lun TANG
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Abstract

São aqui descritos anticorpos humanizados, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, e conjugados de anticorpo, que são capazes de se ligar especificamente a certos antígenos de Lewis biantenário, cujos antígenos são expressos em uma variedade de cânceres. Os anticorpos atualmente descritos são úteis para alvejar células que expressam o antígeno para o tratamento ou detecção de doença, incluindo vários cânceres. São também providos polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras para produzir os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos descritos. Composições farmacêuticas, métodos de tratamento e detecção, e usos dos anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados de anticorpo e composições também são providos.

Description

1 / 152
ANTICORPO ISOLADO OU UM FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO OU UM FRAGMENTO DE AGLUTINAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO E PARA TRATAR OU DETECTAR CÂNCER, CONJUGADO DE ANTICORPO ,E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do pedido provisório U.S. 62/678.890, depositado em 31 de maio de 2018, cujo pedido é aqui incorporado pela referência na sua íntegra.
DECLARAÇÃO RELATIVA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] A Listagem de Sequência associada ao pedido é provida no formato text em vez de uma cópia em papel, e é aqui incorporada pela referência na especificação. O nome do arquivo text contendo a Listagem de Sequência é 400100_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt. O arquivo text apresenta 43,3 KB, foi criado em 30 de maio de 2019, e está sendo enviado eletronicamente por meio de EFS-Web.
CAMPO TÉCNICO
[003] Modalidades da presente descrição se referem em geral aos anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, os quais são capazes de se ligar especificamente a certos antígenos de Lewis, e aos métodos para preparar e usar os mesmos. São também providas composições, polinucleotídeos, vetores, proteínas de fusão, e células hospedeiras relacionados aos anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos. Em certas modalidades, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos atualmente descritos são capazes de se ligar especificamente aos antígenos biantenários LeB/LeB, LeY/LeY, LeB/ LeY, e LeY/LeB, e são úteis para tratar ou detectar doenças caracterizadas pela
2 / 152 expressão de tais antígenos, tal como câncer.
FUNDAMENTOS
[004] Imunoterapias são uma modalidade emergente para tratar uma variedade de doenças, incluindo vários cânceres. Por exemplo, a eficiência clínica de anticorpos monoclonais (mAbs) com atividade antitumor tem sido demonstrada desde o final dos anos de 1990 (vide, por exemplo, Topalian et al., J. Clin. Oncol. 29(36):4828-4836 (2011)), e vários fármacos de sucesso são mAbs (por exemplo, rituximabe, trastuzumabe, e bevacizumabe).
[005] Terapias à base de anticorpo podem alvejar especificamente células que expressam antígeno, tais como células tumorais, e podem realizar, por exemplo, atividade citotóxica através de inúmeros meios, incluindo provocar citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade mediada pelo complemento (CDC) e citotoxicidade mediada por célula T. Outras abordagens envolvem usar anticorpos como veículos carreadores para liberar seletivamente, por exemplo, agentes citotóxicos ou antiproliferativos para matar células alvo, e/ou inibir o crescimento e disseminação metastática de tais células.
[006] Critérios relevantes para terapias com anticorpo monoclonal incluem, por exemplo, a capacidade do anticorpo reconhecer especificamente e se ligar ao antígeno desejado, em vez de se ligar promiscuamente a um ou mais outros epítopos potenciais, por exemplo, proteínas ou glicanos que são expressos em células saudáveis. Igualmente, o anticorpo não deve ser imunogênico para o paciente. Em relação a isso, anticorpos específicos para antígenos de doença humana são frequentemente gerados em hospedeiros não humanos, tais como camundongos e coelhos, e podem possuir, por exemplo, sequências de aminoácidos e/ou motivos de carboidrato da espécie hospedeira que podem ser imunogênicos em um paciente humano. Dessa maneira, um anticorpo preferido para uso na terapia não apresenta ou apresenta propriedades imunogênicas potencialmente mínimas. Características do
3 / 152 antígeno alvo também devem ser consideradas. Preferivelmente, o antígeno é expresso de maneira seletiva, ou é altamente superexpresso, no estado de doença particular (por exemplo, câncer), de maneira tal que a terapia mediada por anticorpo não apresentará efeitos prejudiciais indesejados “no alvo, fora do tumor” contra tecido saudável.
[007] Glicosilação anormal (por exemplo, superexpressão ou expressão errada de glicoproteínas e glicolipídeos) é uma característica comum a vários cânceres (vide, por exemplo, Blanas et al., Front. Oncol. 8:39 (2018). Sem querer ficar preso à teoria, glicosilação anormal pode afetar inúmeros processos celulares que levam à progressão do câncer e metástase (por exemplo, crescimento celular e metabolismo, angiogênese, interações na matriz celular, e adesão célula-célula). Antígenos de carboidrato exemplares que são expressos de maneira anormal em cânceres incluem antígenos de Lewis tipo I e tipo II, que são epítopos de carboidrato fucosilados terminalmente (na terminação não redutora) do sistema de antígeno Lewis. Os antígenos de Lewis tipo I e tipo II incluem os antígenos estruturalmente relacionados H1, H2, e de Lewis A, B, X e Y, todos os quais compartilham três unidades de monossacarídeo: uma acetilglicosamina terminal (redutora) (GlcNac); galactose (Gal); e Fucose (Fuc). Antígenos de Lewis tipo I diferem do tipo II em virtude da natureza das ligações glicosídicas em suas cadeias principais de lactosamina (Galβ1→3GlcNac: Tipo I; Galβ1→4GlcNac: Tipo II), e existem em uma variedade de estruturas (por exemplo, linear ou ramificada, com uma, duas, ou mais antenas compreendendo motivos do antígeno). Antígenos de Lewis apresentam níveis de expressão moderada em tecidos de adultos saudáveis (por exemplo, epitélios digestivo e reprodutivo), mas são superexpressos na superfície celular em inúmeros cânceres sólidos incluindo, por exemplo, cânceres do pulmão, mama, fígado, rim, bexiga, pâncreas e próstata, e também são associados à leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda, e linfoma não Hodgkin.
4 / 152
[008] Algumas terapias que alvejam antígenos de Lewis para tratar câncer são conhecidas, incluindo o conjugado anticorpo-fármaco “cBR96- Dox” suspenso, de Seattle Genetics/Bristol Meyers Squibb, que libera doxorubicina para células de tumor que expressam antígeno LeY usando o anticorpo monoclonal BR96 (Hellstrom et al., Cancer Res. 50(7):2183-2190 (1990)) como uma molécula carreadora. Evidentemente, ainda permanece a necessidade na técnica por terapias adicionais para tratar cânceres, tais como cânceres que expressam antígenos de Lewis como antígenos associados ao tumor, ou antígenos específicos para tumor. As modalidades atualmente descritas atendem esta necessidade e provêm outras vantagens relacionadas.
BREVE SUMÁRIO
[009] De acordo com certas modalidades atualmente descritas, é provido um anticorpo isolado compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 10, e uma cadeia leve de imunoglobulina com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 11.
[0010] Em certas modalidades, é provido um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo: uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 35; e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 5, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1-
5 / 152 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário LeX que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário LeX que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno monoantenário H tipo 2 que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno biantenário H tipo 2 que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno monoantenário H tipo 1 que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].
[0011] Em certas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é provido compreendendo: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (VH CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (VH CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 3; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (VH CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4; e (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (VL CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6; uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (VL CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7; e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (VL CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ
6 / 152 ID NO: 8; em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno monoantenário H tipo 2 que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno biantenário H tipo 2 que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno monoantenário H tipo 1 que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].
[0012] Em certas modalidades aqui descritas, um anticorpo isolado pode ser um anticorpo monoclonal. Em certas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo humanizado. Em certas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado de um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fv, um anticorpo de cadeia Fv simples (ScFv), e um diacorpo.
[0013] São também aqui providas modalidades em que um anticorpo
7 / 152 isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 35; e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 5, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno monoantenário H tipo 2 que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno biantenário H tipo 2 que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno monoantenário H tipo 1 que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].
8 / 152
[0014] Em certas modalidades, a presente descrição provê um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (VH CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:2; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (VH CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:3; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (VH CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:4; e (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (VL CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:6; uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (VL CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7; e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (VL CDR3), compreendendo a sequência
9 / 152 de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8.
[0015] Em certas modalidades adicionais, é provido um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a presente descrição, compreendendo (i), (ii), (iii), (iv), (v), ou (vi) da maneira a seguir, ou qualquer combinação dos mesmos: (i) uma VH CDR1 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2, em que a variação consiste em uma substituição Y→A na posição 33, de acordo com numeração Kabat; (ii) uma VH CDR3 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4, em que a variante consiste em uma substituição Y→A na posição 104, de acordo com numeração Kabat; (iii) uma VH CDR3 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4, em que a variante consiste em uma substituição H→A na posição 106, de acordo com numeração Kabat; (iv) uma VL CDR1 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6, em que a variante consiste em uma substituição Y→A na posição 30, de acordo com numeração Kabat; (v) uma VL CDR2 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7, em que a variante consiste em uma substituição G→A na posição 50, de acordo com numeração Kabat; ou (vi) uma VL CDR3 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8, em que a variante consiste em um T→S substituição na posição 93, de acordo com numeração Kabat.
[0016] Em certas modalidades adicionais, é provido um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da maneira aqui descrita (isto é,
10 / 152 CDRs com pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NOs:2, 3, 4, 6, 7, e 8, respectivamente, incluindo aquelas variantes de CDR com as substituições de aminoácido aqui descritas), e compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 35; e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:5.
[0017] Em quaisquer das modalidades aqui descritas, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição, pode exibir ligação reduzida (por exemplo, diminuída de uma maneira estatisticamente significativa, da maneira determinada usando uma metodologia aceita pela técnica) (incluindo, em certas modalidades, nenhuma ligação) a um antígeno monoantenário de Lewis B ou um antígeno monoantenário de Lewis Y, comparado a um anticorpo “BBC” que, da maneira aqui descrita, compreende um domínio VL com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 27, e um VH domínio com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 28. Lewis B monovalente é um antígeno do grupo sanguíneo que é expresso em tecidos humanos normais; dessa maneira, anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno e conjugados anticorpo-fármaco atualmente descritos apresentam melhor especificidade por um antígeno de câncer, e ligação reduzida a um antígeno de Lewis B monoantenário que é expresso em tecidos humanos normais, comparado ao anticorpo BBC. Em certas modalidades, um anticorpo aqui descrito, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado anticorpo- fármaco apresenta um aumento de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7
11 / 152 vezes, 8 vezes ou mais na ligação a um antígeno expresso na superfície celular, de acordo com qualquer uma ou mais das fórmulas [I]-[VIII] aqui, da maneira comparada à ligação a um antígeno de Lewis B monoantenário.
[0018] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado anticorpo-fármaco se liga a um antígeno de Lewis B monoantenário com 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3, ou 1/2 da afinidade de BR96, por exemplo, da maneira medida em um ensaio de ligação de ELISA.
[0019] Em quaisquer das modalidades aqui descritas, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição, se liga aos antígenos que são distintos do antígeno monoantenário LeY reconhecido pelo anticorpo BR96, e de acordo com teoria não limitante pode permitir alvejamento mais seguro e mais específico de células de câncer em aplicações terapêuticas, comparado ao BR96. Em quaisquer das modalidades aqui descritas, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um conjugado anticorpo- fármaco compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição, se liga às células de câncer que expressam antígeno, internaliza de maneira eficiente e estável em lisossomos de tais células, e é seguramente tolerado em doses terapêuticos em um modelo primata não humano.
[0020] Em um outro aspecto, a presente descrição provê polinucleotídeo isolados que codificam os anticorpos aqui descritos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Em certas modalidades, o polinucleotídeo é otimizado por códon para expressão em uma célula hospedeira. Em certas modalidades relacionadas, vetores recombinantes que são providos compreendem um polinucleotídeo que codifica um anticorpo aqui descrito, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas
12 / 152 modalidades, um vetor recombinante compreende uma sequência de controle de expressão operavelmente ligada ao polinucleotídeo que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em modalidades particulares, um vetor recombinante é um vetor de expressão em que a sequência de controle de expressão compreende um promotor.
[0021] Em uma outra modalidade, são providas células hospedeiras que compreendem um recombinante e/ou vetor de expressão da presente descrição. Em certas outras modalidades, são providos métodos relacionados para produzir um anticorpo aqui descrito, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno monoantenário H tipo 2 que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno biantenário H tipo 2 que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno monoantenário H tipo 1 que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV], em que os métodos
13 / 152 compreendem: cultivar uma célula hospedeira da maneira aqui descrita em condições e por um tempo suficientes para expressão pela célula hospedeira do polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para obter por meio disso uma cultura compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e recuperar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a partir da cultura.
[0022] Em uma outra modalidade, conjugados de anticorpo que são providos compreendem um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da presente descrição; e uma molécula de carga útil ligada ao mesmo. Em certas modalidades, uma molécula de carga útil é covalentemente ligada por um ligante ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas modalidades o ligante é selecionado de um ligante clivável e um ligante não clivável. Em certas modalidades o ligante clivável é um ligante sensível à protease, um ligante sensível ao pH, ou um ligante sensível à glutationa. Em certas modalidades, o ligante clivável é um ligante sensível à protease compreendendo um dipeptídeo valina-citrulina. Em algumas modalidades, o ligante compreende um grupo maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo aqui descrito ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma ponte de dissulfeto reduzida em uma região de dobradiça e a ponte de dissulfeto reduzida é acoplada ao grupo maleimida. São também aqui providas modalidades em que o ligante compreende adicionalmente um grupo autodestrutivo tal como, por exemplo, álcool para- aminobenzílico (PABC).
[0023] Em certas modalidades, um conjugado de anticorpo compreende um anticorpo aqui descrito, ou fragmento de ligação ao antígeno, e uma molécula de carga útil que é selecionada de um agente terapêutico e um indicador detectável. Em certas modalidades, a molécula de carga útil é um agente terapêutico selecionado de um agente anti-mitótico que alveja tubulina, uma toxina à base de peptídeo, um dímero de pirrolobenzodiazepina (PBD),
14 / 152 um antibiótico, um inibidor da síntese de pirimidina, um anti-metabólito, um agente de alquilação de DNA, e um inibidor de topoisomerase. Em certas modalidades, a molécula de carga útil é selecionada de um maintansinóide, uma auristatina, doxorubicina, caliqueamicina, um dímero de PBD, monometilauristatina E (MMAE), e monometilauristatina F (MMAF). Em certas outras modalidades, a molécula de carga útil é um indicador detectável. Em certas modalidades adicionais, o indicador detectável é selecionado de um radionuclídeo, um corante, um radiometal, uma fração fluorescente, um agente de contraste MRI, uma microbolha, um nanotubo de carbono, uma partícula de ouro, fluordesoxiglicose, uma enzima, um cromóforo, e um marcador radiopaco. Em modalidades particulares, o indicador detectável é um radionuclídeo selecionado de 68Ga, 64Cu, 86Y, 89Zr, 124 I, 99m Tc, 123 I, 111 In, 177 131 76 78 18 124 Lu, I, Br, Zr, F, e T. Em certas modalidades, o conjugado de anticorpo compreende um quelante de radionuclídeo selecionado de DOTA marcado com maleimida, N-hidroxisuccinimida-DOTA, e desferrioxamina (DFO).
[0024] Composições farmacêuticas também são aqui providas e, em algumas modalidades, compreendem um anticorpo isolado aqui descrito, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado de anticorpo; e um carreador farmacêutico.
[0025] A presente descrição também provê, em certas modalidades, métodos terapêuticos ou de detecção compreendendo o uso dos anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, e/ou conjugados de anticorpo atualmente descritos. Em algumas modalidades, métodos para tratar ou detectar câncer são providos, em que os métodos compreendem administrar uma composição farmacêutica da maneira aqui descrita a um sujeito que precisa do mesmo. Em certas modalidades, o sujeito apresenta ou é suspeito de apresentar um câncer que é selecionado de câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer linfático, câncer de fígado, câncer de ovário,
15 / 152 pancreático, câncer de próstata, câncer uterino e carcinoma de célula escamosa. Em certas modalidades, o câncer é selecionado de um adenocarcinoma gástrico, um adenocarcinoma mucinoso de estômago, um adenocarcinoma gástrico não diferenciado, um carcinoma gástrico de célula em anel de sinete, um adenocarcinoma de cólon, um carcinoma ductal de mama invasivo, um carcinoma hepatocelular, um adenocarcinoma pulmonar, um carcinoma de célula escamosa, um adenocarcinoma de linfonodo metastático, um adenocarcinoma ovariano mucinoso, um adenocarcinoma ductal pancreático, um adenocarcinoma papilar pancreático, um adenocarcinoma de próstata, e um de próstata endometrióide. Em certas modalidades, é provido um método que compreende administrar a um sujeito uma composição atualmente descrita (por exemplo, compreendendo um anticorpo aqui descrito ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) por uma via que é selecionada de intravenosa, parenteral, intragástrica, intrapleural, intrapulmonar, intrarretal, intradermal, intraperitoneal, intratumoral, subcutaneous, oral, topical, transdermal, intracisternal, intrathecal, intranasal e intramuscular. Em certas modalidades adicionais dos métodos atualmente descritos para detectar ou tratar câncer, o sujeito está recebendo ou recebeu previamente: (a) uma terapia imunossupressora; (b) uma molécula de ponto de controle imunológico estimulador; (c) uma terapia de radiação; (d) uma quimioterapia; (e) uma imunoterapia celular; ou (f) qualquer combinação de (a)-(e).
[0026] Estes e outros aspectos e modalidades da presente descrição se tornarão evidentes mediante referência à descrição detalhada a seguir e desenhos em anexo. Todas as referências aqui descritas são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra, como se cada um fosse incorporado individualmente.
BREVE DESCRIÇÃO DE VÁRIAS VISTAS DOS DESENHOS
[0027] Figura 1 mostra alinhamentos múltiplos da sequência de
16 / 152 aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo “BBC” atualmente descrito (SEQ ID NO:28) para selecionar sequências de aminoácido receptora humana candidatas (1-8; que corresponde a SEQ ID NOs:44-51, respectivamente). Linha 3 (em caixa com linha tracejada) mostra a sequência receptora humana que foi selecionada para enxertar CDR. Na porção média da figura, o aminoácido simples em caixa (V/I/M) é uma metionina rara na sequência receptora humana; este resíduo foi substituído pela isoleucina mais comum durante a humanização.
[0028] Figura 2A mostra alinhamentos da sequência de aminoácido de sequências de região variável de cadeia leve (LC) do anticorpo IMH2/BBC (SEQ ID NO: 27) e variantes humanizadas: hBBC.8 (SEQ ID NO: 31); hBBC.9 e hBBC.9.1 (SEQ ID NO: 33); e hBBC.10, hBBC.10.1, e hBBC.10.1FQ (SEQ ID NO: 5). Sequências de hBBC CDR são mostradas em caixas (linhas tracejadas), e sequências CDR receptoras humanas são sublinhadas. Na porção inferior da figura, os dois resíduos de aminoácido em caixa única (R/G e Y/F) mostram diferenças na sequência da região de estrutura. Figura 2B mostra atividade relativa de BBC, hBBC.8, hBBC.8 com mutação por substituição R66G, anticorpos hBBC.9, e hBBC.10 em um ensaio de ligação celular AGS. hBBC-LC com mutação F71Y representa hBBC.9. hBBC-LC com mutações F71Y e R66G representa hBBC.10. Figuras 2C-2E mostram especificidade de ligação de anticorpos de variante gerados adicionalmente (2C) para células AGS e (2D, 2E) para células AGS comparadas ao antígeno monoantenário LeB sintético.
[0029] Figura 3 provê alinhamentos de sequência de anticorpo hBBC.10.1 (SEQ ID NO:38), anticorpo hBBC.10.1FQ (SEQ ID NO:39), e dois anticorpos terapêuticos humanizados aprovados por FDA (referência 1 e referência 2) (SEQ ID NOs:40 e 41, respectivamente) na região 3 de estrutura de cadeia pesada.
[0030] Figuras 4A e 4B mostram sequenciamento MALDI-MSMS de
17 / 152 Fuc4(LacNAc)3Lac de células COLO 205 GSL em m/z 2521, em frações não ligadas (4A) e ligadas ao BBC (eluídas) (4B). Nas figuras 4A-7B, os glicanos são representados da maneira a seguir: círculos abertos = Gal; círculos preenchidos = Glc; quadrados preenchidos = GlcNac; triângulos fechados = Fuc. As mesmas convenções são usadas nas figuras 8A-8B com a diferença de que círculos fechados = Man.
[0031] Figuras 5A e 5B a seguir, respectivamente, perfis MALDI-MS de glicanos que se ligam ao BBC (fundo) e que não se ligam (topo) de células (a) NCI-N87 e (B) SW1116 GSL.
[0032] Figuras 6A e 6B mostram sequenciamento MALDI-MSMS de Fuc4(LacNAc)3Lac de células NCI-N87 (6A) e SW1116 GSL (6B) em m/z 2521, na fração ligada ao BBC (eluída).
[0033] Figuras 7A e 7B proveem o sequenciamento MALDI-MSMS de Fuc4(LacNAc)3Lac e Fuc6(LacNAc)5Lac de células NCI-N87 GSL em m/z 2970 (7A) e m/z 3767 (7B), em fração ligada ao BBC (eluída).
[0034] Figuras 8A e 8B mostram sequenciamento MALDI-Q/TOF MS/MS de AGS N-glicano enriquecido com BBC.
[0035] Figuras 9A e 9B mostram, respectivamente, gráficos de titulação de ITC de antígenos glicanos (a) LeY-pentaose e (B) LeB-pentaose com anticorpo hBBC.10.1.
[0036] Figuras 10A-10C mostram gráficos de titulação de ITC de antígenos glicanos adicionais com anticorpo hBBC.10.1: (a) LeY/LeY-ASGA; (B) LeY/LeY-antígeno I; (C) LeY/LeB-antígeno I.
[0037] Figuras 11A-11F mostram gráficos de titulação de ITC de outros antígenos glicanos com anticorpo hBBC.10.1: (a) LeX-tetraose; (B) LeA-tetraose; (C) antígeno H tipo I; (D) antígeno H tipo II; (E) H-ASGP; (F) LeX/LeX-ASGP.
[0038] Figuras 12A-12C proveem gráficos de titulação de ITC de antígenos glicanos com um anticorpo de referência “BR96”: (a) LeY-pentaose;
18 / 152 (B) LeY/LeY-antígeno I, e C) LeY/LeY-ASGP.
[0039] Figuras 13A e 13B mostram sensorgramas de ressonância de plasma de superfície (SPR) de hBBC.10.1 e BR96 contra os antígenos glicanos indicados: (a) LeY-Gal e LeY/LeY-ASGA; (B) LeB-Gal e LeB/LeB- ASGA.
[0040] Figuras 14A e 14B mostram resultados de ELISA indireto de hBBC.10.1 que se liga aos antígenos de Lewis revestidos nas concentrações indicadas: (a) LeY/LeY-ASGA-Biotina; (B) LeY-Gal-Biotina.
[0041] Figura 15 mostra resultados de ELISA indireto de ligação de hBBC.10.1 aos antígenos de Lewis revestidos (LeB/LeB-ASGA vs LeY/LeY- ASGA e LeB-Gal) nas concentrações indicadas.
[0042] Figura 16A mostra resultados de ELISA de ligação ao antígeno de hBBC.10.1 aos antígenos glicanos, incluindo LeY-Gal-sp3-biotina (LeY-Gal), LeB-Gal-LC-biotina (LeB-Gal), LeY/LeY-ASGA-biotina (LeY/LeY- ASGA), LeB/LeB-ASGA-biotina (LeB/LeB-ASGA), 3-LeY/6-LeB-ASGA- Biotina (LeY/LeB-ASGA), e 3-LeB/6-LeY-ASGA-Biotina (LeB/LeY-ASGA). A quantidade de revestimento de todos os antígenos foi a mesma (1,87 pmol)). Figuras 16B e 16C mostram, respectivamente, resultados de experimentos de ELISA de ligação ao antígeno, comparando a afinidade e seletividade de anticorpo BBC (16B) e anticorpo hBBC.10.1 (16C) em relação ao antígeno.
[0043] Figura 17 provê imagens de microscopia de fluorescência que mostram endocitose de hBBC.10.1 por células de câncer gástrico AGS. Painéis à esquerda: hBBC.10.1 corado por IgG anti-humano conjugado com Alexa488 (canal verde). Painéis à direita: sobreposição com corante F-actina marcado com faloidina rodamina (canal vermelho). Regiões em que a fluoresceina e rodamina co-distribuídas aparecem como amarelo no microscópio, e aparecem como sinal fluorescente co-localizado na imagem mesclada.
[0044] Figura 18 provê imagens de microscopia de fluorescência que
19 / 152 mostram localização lisossomal de hBBC.10.1 em células de câncer gástrico AGS. Painéis à esquerda: hBBC.10.1 corado por IgG anti-humano conjugado com Alexa488 (canal verde). Painéis médios: lisossomo marcado com anticorpo anti-Lamp-1, seguido por IgG anti-coelho (canal vermelho). Painéis à direita: Mesclado.
[0045] Figuras 19A e 19B mostram atividade antitumor de hBBC.10.1 em um experimento de xenoenxerto in vivo, em que camundongos SCID imunodeficientes foram administrados com (a) DLD-1 de humano ou (B) células de tumor COLO 205, seguido por anticorpo uma vez que os tumores se desenvolveram.
[0046] Figuras 20A e 20B mostram, respectivamente, atividade antitumor de várias concentrações de (a) hBBC.10.1 e (B) BR96 em experimentos de xenoenxerto in vivo, em que camundongos SCID imunodeficientes foram administrados com células de adenocarcinoma de câncer gástrico AGS de humano, seguido pelo anticorpo, uma vez que os tumores se desenvolveram. Figuras 20C e 20D mostram atividade antitumor de anticorpos hBBC da presente descrição em experimentos de xenoenxerto in vivo.
[0047] Figura 21 mostra morte direta de células de tumor AGS por hBBC.10.1 (“hBBC”) e BR96 em várias concentrações de anticorpo. A morte foi avaliada como um percentual de células alvo coradas com iodeto de propídio (PI).
[0048] Figura 22 mostra atividade antitumor de hBBC.10.1 (“hBBC”) e BR96 em um experimento de xenoenxerto in vivo, em que camundongos SCID imunodeficientes foram administrados com células de carcinoma gástrico TSGH 9201 de humano, seguido pelo anticorpo, uma vez que os tumores se desenvolveram.
[0049] Figura 23 mostra atividade antitumor de várias concentrações de hBBC.10.1 (“hBBC”) em um experimento de xenoenxerto in vivo, em que
20 / 152 camundongos SCID imunodeficientes foram administrados com células de adenocarcinoma colorretal COLO 201 de humano, seguido pelo anticorpo, uma vez que os tumores se desenvolveram.
[0050] Figuras 24A e 24B mostram atividade antitumor de (a) hBBC.10.1 (“hBBC”) e (B) BR96 em experimentos de xenoenxerto in vivo, em que camundongos SCID imunodeficientes foram administrados com células de adenocarcinoma colorretal COLO 201 de humano, seguido pelo anticorpo, uma vez que os tumores se desenvolveram.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0051] SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácido do domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo hBBC.10.1FQ:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYTWHWIR QHPGKGLEWLGYIHYTGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNTFYLQMNSLT TEDTAVYYCGREALRGYDAGFWFTYWGQGTLVTV.
[0052] SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácido da região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (VH CDR1) do anticorpo IMH2/BBC, anticorpo hBBC.8, anticorpo hBBC.9, anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ: SGYTWH.
[0053] SEQ ID NO:3 é a sequência de aminoácido da VH CDR2 do anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ: YIHYTGNTKYSPSLKS.
[0054] SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácido da VH CDR3 do anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ: EALRGYDAGFWFTY.
[0055] SEQ ID NO:5 é a sequência de aminoácido do domínio variável de cadeia leve (VL) do anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ:
21 / 152
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASEDIYNRLTWYQQK PGKVPRLLISGATSLDTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYC QQYWTTPWTFGQGTKLEIK.
[0056] SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácido da região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (VL CDR1) do anticorpo IMH2/BBC, anticorpo hBBC.8, anticorpo hBBC.9, anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ: TASEDIYNRLT.
[0057] SEQ ID NO:7 é a sequência de aminoácido da VL CDR2 do anticorpo IMH2/BBC, anticorpo hBBC.8, anticorpo hBBC.9, anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ: GATSLDT.
[0058] SEQ ID NO:8 é a sequência de aminoácido da VL CDR3 do anticorpo IMH2/BBC, anticorpo hBBC.8, anticorpo hBBC.9, anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ: QQYWTTPWT.
[0059] SEQ ID NO:9 é a sequência de aminoácido de um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado do anticorpo hBBC.10.1, na orientação [VL-VH]:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASEDIYNRLTWYQQK
PGKVPRLLISGATSLDTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYC QQYWTTPWTFGQGTKLEIK(GGGGS)xQVQLQESGPGLVKPSQTLSLT
CTVSGYSITSGYTWHWIRQHPGKGLEWLGYIHYTGNTKYSPSLKSRL
SISRDTSKNQFFLKLSSVTTEDTAVYYCGREALRGYDAGFWFTYWGQ GTLVTV, em que “x” pode ser 1, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais repetições, da sequência GGGGS mostrada entre parênteses.
22 / 152
[0060] SEQ ID NO:10 é a sequência de aminoácido da cadeia pesada de tamanho completo (HC) do anticorpo hBBC.10.1:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYTWHWIR QHPGKGLEWLGYIHYTGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNQFFLKLSSVT TEDTAVYYCGREALRGYDAGFWFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[0061] SEQ ID NO:11 é a sequência de aminoácido da cadeia leve de tamanho completo (LC) do anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1 e anticorpo hBBC.10.1FQ:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASEDIYNRLTWYQQK PGKVPRLLISGATSLDTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYC QQYWTTPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
[0062] SEQ ID NO:12 é uma sequência de nucleotídeo que codifica o domínio variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo hBBC.10.1: caggtgcagctgcaggaaagcggcccgggcctggtgaaaccgagccagaccctgag cctgacctgcaccgtgagcggctatagcattaccagcggctatacctggcattggattcgccagcatccgggc aaaggcctggaatggctgggctatattcattataccggcaacaccaaatatagcccgagcctgaaaagccgcc tgagcattagccgcgataccagcaaaaaccagttcttcctgaaactgagcagcgtgaccaccgaagataccgc ggtgtattattgcggccgcgaagcgctgcgcggctatgatgctggcttctggtttacctattggggccaaggca ccctggtgaccgtg.
[0063] SEQ ID NO:13 é uma sequência de nucleotídeo que codifica a
23 / 152 região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (VH CDR1) do anticorpo IMH2/BBC, anticorpo hBBC.8, anticorpo hBBC.9, anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10, hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ: agcggctatacctggcat.
[0064] SEQ ID NO:14 é uma sequência de nucleotídeo que codifica a VH CDR2 do anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10 e anticorpo hBBC.10.1FQ: tatattcattataccggcaacaccaaatatagcccgagcctgaaaagc.
[0065] SEQ ID NO:15 é uma sequência de nucleotídeo que codifica a VH CDR3 do anticorpo hBBC.10.1 e anticorpo hBBC.10.1FQ: gaagcgctgcgcggctatgatgctggcttctggtttacctat.
[0066] SEQ ID NO:16 é uma sequência de nucleotídeo que codifica o domínio variável de cadeia leve (VL) do anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ: gatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtg accattacctgcaccgcgagcgaagatatttataaccgcctgacctggtatcagcagaaaccgggcaaagtgc cgcgtctgctgatttctggcgcgaccagcctggataccggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcg gcaccgattacaccctgaccattagcagcctgcagccggaagatgtggcgacctattattgccagcagtattgg accaccccgtggacctttggccagggcaccaaactggaaattaaa.
[0067] SEQ ID NO:17 é uma sequência de nucleotídeo que codifica a região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (VL CDR1) do anticorpo IMH2/BBC, anticorpo hBBC.8, anticorpo hBBC.9, anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo anticorpo hBBC.10.1FQ: accgcgagcgaagatatttataaccgcctgacc.
[0068] SEQ ID NO:18 é uma sequência de nucleotídeo que codifica a VL CDR2 do anticorpo IMH2/BBC, anticorpo hBBC.8, anticorpo hBBC.9, anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ:
24 / 152 ggcgcgaccagcctggatacc.
[0069] SEQ ID NO:19 é uma sequência de nucleotídeo que codifica a VL CDR3 do anticorpo IMH2/BBC, anticorpo hBBC.8, anticorpo hBBC.9, anticorpo hBBC.9.1, anticorpo hBBC.10, anticorpo hBBC.10.1, e anticorpo hBBC.10.1FQ: cagcagtattggaccaccccgtggacc.
[0070] SEQ ID NO:20 é uma sequência de nucleotídeo que codifica um fragmento variável de cadeia simples (scFv) na orientação [VL-(L)-VH] derivada do anticorpo hBBC.10.1: gatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtg accattacctgcaccgcgagcgaagatatttataaccgcctgacctggtatcagcagaaaccgggcaaagtgc cgcgtctgctgatttctggcgcgaccagcctggataccggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcg gcaccgattacaccctgaccattagcagcctgcagccggaagatgtggcgacctattattgccagcagtattgg accaccccgtggacctttggccagggcaccaaactggaaattaaa(ggtggaggcggttct)xcaggtgcagc tgcaggaaagcggcccgggcctggtgaaaccgagccagaccctgagcctgacctgcaccgtgagcggctat agcattaccagcggctatacctggcattggattcgccagcatccgggcaaaggcctggaatggctgggctata ttcattataccggcaacaccaaatatagcccgagcctgaaaagccgcctgagcattagccgcgataccagcaa aaaccagttcttcctgaaactgagcagcgtgaccaccgaagataccgcggtgtattattgcggccgcgaagcg ctgcgcggctatgatgctggcttctggtttacctattggggccaaggcaccctggtgaccgtg, em que “x” pode ser 1, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais repetições da sequência ggtggaggcggttct mostrada entre parênteses.
[0071] SEQ ID NO:21 é uma sequência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada de tamanho completo (HC) do anticorpo hBBC.10.1: caggtgcagctgcaggaaagcggcccgggcctggtgaaaccgagccagaccctgag cctgacctgcaccgtgagcggctatagcattaccagcggctatacctggcattggattcgccagcatccgggc aaaggcctggaatggctgggctatattcattataccggcaacaccaaatatagcccgagcctgaaaagccgcc tgagcattagccgcgataccagcaaaaaccagttcttcctgaaactgagcagcgtgaccaccgaagataccgc ggtgtattattgcggccgcgaagcgctgcgcggctatgatgctggcttctggtttacctattggggccaaggca ccctggtgaccgtgtcgagcgcttccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcac
25 / 152 ctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaa ctcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagc agcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagc aacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagca cctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggac ccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtgga cggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagcc ctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccct gcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccag cgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg gactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa tga.
[0072] SEQ ID NO:22 é uma sequência de nucleotídeo que codifica a cadeia leve de tamanho completo (LC) do anticorpo hBBC.10.1 e anticorpo hBBC.10.1FQ: gatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtg accattacctgcaccgcgagcgaagatatttataaccgcctgacctggtatcagcagaaaccgggcaaagtgc cgcgtctgctgatttctggcgcgaccagcctggataccggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcg gcaccgattacaccctgaccattagcagcctgcagccggaagatgtggcgacctattattgccagcagtattgg accaccccgtggacctttggccagggcaccaaactggaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcat cttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagag aggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcag gacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacaca aagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt gttaa
[0073] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácido espaçadora ilustrativa EGKSSGSGSESKVD.
26 / 152
[0074] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácido espaçadora ilustrativa KESGSVSSEQLAQFRSLD.
[0075] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácido poliligantea flexível GGGGS.
[0076] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácido poliligantea flexível GGGGSGGGGSGGGGS.
[0077] SEQ ID NO: 27 é a sequência de aminoácido do domínio VL do anticorpo IMH2/BBC:
DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCTASEDIYNRLTWYQQK PGNVPRLLISGATSLDTGVPSRFSGSRSGKDYALSITSLQTEDVATYYC QQYWTTPWTFGGGTRLEIK.
[0078] SEQ ID NO: 28 é a sequência de aminoácido do domínio VH do anticorpo IMH2/BBC:
DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYTWHWIR QFPGNTLEWLGYIHYSGNTKYSPSLKSRLSVTRDTSKNQFFLQLNSVT TEDTATYYCGREALRGYDHGFWFTYWGQGTLVTV.
[0079] SEQ ID NO: 29 é a sequência de aminoácido do domínio VL de estrutura aceptora humana AAS01771.1:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQ KPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYY CQKYNSAPYTFGQGTKLEIK.
[0080] SEQ ID NO: 30 é a sequência de aminoácido do domínio VH de estrutura aceptora humana CAD89404.1:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGAYYWSWI RQHPGKGLEWIGYIYYSGTTYYNPSLKSRLSMSRDTSKNQFSLKLSSV TAADTAVYYCARGPYYDSPRPFDPWGQGTLVTV.
[0081] SEQ ID NO: 31 é a sequência de aminoácido do domínio VL do anticorpo hBBC.8:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASEDIYNRLTWYQQK
27 / 152
PGKVPRLLISGATSLDTGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC QQYWTTPWTFGQGTKLEIK.
[0082] SEQ ID NO: 32 é a sequência de aminoácido do domínio VH do anticorpo hBBC.8, anticorpo hBBC.9, e anticorpo hBBC.10:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYTWHWIR QHPGKGLEWLGYIHYSGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNQFFLKLSSVTT EDTAVYYCGREALRGYDHGFWFTYWGQGTLVTV.
[0083] SEQ ID NO: 33 é a sequência de aminoácido do domínio VL do anticorpo hBBC.9 e anticorpo hBBC.9.1:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTASEDIYNRLTWYQQK PGKVPRLLISGATSLDTGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDVATYYC QQYWTTPWTFGQGTKLEIK.
[0084] SEQ ID NO: 34 é a sequência de aminoácido do domínio VH do anticorpo hBBC.9.1:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYTWHWIR QHPGKGLEWLGYIHYTGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNQFFLKLSSVT TEDTAVYYCGREALRGADHGFWFTYWGQGTLVTV.
[0085] SEQ ID NO: 35 é a sequência de aminoácido do domínio VH do anticorpo hBBC.10.1:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYTWHWIR QHPGKGLEWLGYIHYTGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNQFFLKLSSVT TEDTAVYYCGREALRGYDAGFWFTYWGQGTLVTV.
[0086] SEQ ID NO: 36 é a sequência de aminoácido de um fragmento variável de cadeia simples (scFv) derivado do anticorpo hBBC.10.1 na orientação [VH-VL]:
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGYTWHWIR
QHPGKGLEWLGYIHYTGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNQFFLKLSSVT TEDTAVYYCGREALRGYDAGFWFTYWGQGTLVTV(GGGGS)xDIQMT
QSPSSLSASVGDRVTITCTASEDIYNRLTWYQQKPGKVPRLLISGATSL
28 / 152
DTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQYWTTPWTFGQG TKLEIK, em que “x” pode ser 1, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais repetições da sequência GGGGS mostrada entre parênteses.
[0087] SEQ ID NO: 37 é uma sequência de nucleotídeo que codifica um fragmento variável de cadeia simples (scFv) na orientação [VH-(L)-VL] derivada do anticorpo hBBC.10.1: caggtgcagctgcaggaaagcggcccgggcctggtgaaaccgagccagaccctgag cctgacctgcaccgtgagcggctatagcattaccagcggctatacctggcattggattcgccagcatccgggc aaaggcctggaatggctgggctatattcattataccggcaacaccaaatatagcccgagcctgaaaagccgcc tgagcattagccgcgataccagcaaaaaccagttcttcctgaaactgagcagcgtgaccaccgaagataccgc ggtgtattattgcggccgcgaagcgctgcgcggctatgatgctggcttctggtttacctattggggccaaggca ccctggtgaccgtg(ggtggaggcggttct)xgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcga gcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcaccgcgagcgaagatatttataaccgcctgacctggtatcagca gaaaccgggcaaagtgccgcgtctgctgatttctggcgcgaccagcctggataccggcgtgccgagccgctt tagcggcagcggcagcggcaccgattacaccctgaccattagcagcctgcagccggaagatgtggcgacct attattgccagcagtattggaccaccccgtggacctttggccagggcaccaaactggaaattaaa, em que “x” pode ser 1, ou 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais repetições da sequência ggtggaggcggttct mostrada entre parênteses.
[0088] Estas e outras sequências são providdas na Listagem de Sequência em anexo.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0089] A presente descrição se refere aos anticorpos humanizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, os quais são capazes de se ligar especificamente a certos antígenos de Lewis expressos em uma variedade de cânceres. Mais especificamente, da maneira aqui descrita pela primeira vez e apresentados em maiores detalhes a seguir, os presentes anticorpos humanizados quiméricos se ligam inesperadamente com B/Y especificidade extraordinária a certos antígenos Lewis biantenários, que são expressos em células de câncer, e apresentam atividade antitumoral
29 / 152 robusta in vivo. Adicionalmente, os anticorpos atualmente descritos apresentam vantajosamente ligação reduzida de maneira surpreendente (por exemplo, diminuída de uma maneira estatisticamente significativa) ao antígeno de Lewis B monoantenário (que é expresso em tecidos saudáveis), comparado a um anticorpo BBC que compreende um domínio VL com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 27, e um domínio VH com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:28. Os anticorpos aqui descritos se ligam aos antígenos que são distintos do antígeno LeY monoantenário reconhecido pelo anticorpo BR96 e, sem querer ficar preso à teoria, os presentes anticorpos podem permitir alvejamento mais seguro e mais específico de células de câncer em aplicações terapêuticas, comparado ao BR96. Além disso, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da presente descrição também se ligam às células de câncer que expressam antígeno, internalizam de maneira eficiente e estável em lisossomos de tais células, e são tolerados de maneira segura em doses terapêuticas em um modelo de primata não humano.
[0090] De acordo com certas modalidades preferidas, e adicionalmente de acordo com teoria não limitante, usos benéficos dos anticorpos atualmente descritos, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, se referem aos métodos para diagnosticar e/ou tratar cânceres tais como, por exemplo, vários cânceres gástricos, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer pancreático e outros cânceres. Estas e modalidades relacionadas são descritas aqui com mais detalhe.
POLIPEPTÍDEOS E PROTEÍNAS
[0091] Os termos “polipeptídeo”, “proteína”, e “peptídeo” e “glicoproteína” são úteis indiferentemente e se referem a um polímero de aminoácidos não limitado a nenhum tamanho particular. O termo não exclui modificações tais como miristilação, sulfatação, glicosilação, fosforilação, e adição ou eliminação de sequências de sinal. Os termos “polipeptídeo” ou
30 / 152 “proteína” podem significar uma ou mais cadeias de aminoácidos, em que cada cadeia compreende aminoácidos covalentemente ligados por ligações de peptídeo, e em que o dito polipeptídeo ou proteína pode compreender uma pluralidade de cadeias não covalentemente e/ou covalentemente ligadas por ligações de peptídeo, com a sequência de proteínas naturais, isto é, proteínas produzidas por células de ocorrência natural e especificamente não recombinantes, ou células geneticamente modificadas ou recombinantes, e compreendem moléculas com a sequência de aminoácido da proteína natural, ou moléculas com eliminações de, adições a, e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência natural. Assim, um “polipeptídeo” ou uma “proteína” pode compreender uma (denominado “um monômero”) ou uma pluralidade (denominado “um multímero”) de cadeias de aminoácido. Os termos “peptídeo,” “polipeptídeo” e “proteína” incluem especificamente os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da presente descrição, ou sequências que apresentam eliminações de, adições a e/ou substituições de um ou mais aminoácido de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[0092] Da maneira aqui usada, “aminoácido” se refere a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, bem como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são modificados posteriormente, por exemplo, hidroxiprolina, γ- carboxiglutamato e O-fosfoserina. Análogos de aminoácido se referem aos compostos que apresentam a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um α-carbono que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino, e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos apresentam grupos R modificados (por exemplo,
31 / 152 norleucina), ou partes principais de peptídeo modificado, mas mantêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácido se referem aos compostos químicos que apresentam uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.
[0093] Da maneira aqui usada, “mutação” se refere a uma alteração na sequência de uma molécula de ácido nucleico ou molécula de polipeptídeo, comparada a uma molécula de ácido nucleico ou molécula de polipeptídeo de referência ou tipo selvagem, respectivamente. Uma mutação pode resultar em vários tipos diferentes de alteração na sequência, incluindo substituição, inserção ou eliminação de nucleotídeo(s) ou aminoácido(s).
[0094] O termo “fragmento de polipeptídeo” se refere a um polipeptídeo (que pode ser monomérico ou multimérico), que apresenta uma eliminação amino-terminal, uma eliminação carboxil-terminal, e/ou um eliminação ou substituição interna de um polipeptídeo de ocorrência natural ou produzido recombinantemente. Da maneira aqui usada, “aminoácidos contíguos” se referem aos aminoácidos covalentemente ligados que correspondem a uma porção linear ininterrupta de uma sequência de aminoácido descrita. Em certas modalidades, um fragmento de polipeptídeo pode compreender uma cadeia de aminoácido com pelo menos 5 a cerca de 500 aminoácidos em tamanho. Será considerado que em certas modalidades os fragmentos apresentam pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 450 aminoácidos em tamanho.
[0095] Os termos “proteína isolada” e “polipeptídeo isolado” aqui referidos significam que uma proteína ou polipeptídeo em questão (1) é livre de pelo menos algumas outras proteínas ou polipeptídeos com os quais seriam
32 / 152 normalmente encontrados na natureza, (2) é essencialmente livre de outras proteínas ou polipeptídeos da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separado de pelo menos cerca de 50 porcento de polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos, ou outros materiais com os quais está associado na natureza, (5) não está associado (por interação covalente ou não covalente) com porções de uma proteína ou polipeptídeo com o qual a “proteína isolada” ou “polipeptídeo isolado” pode ser associado na natureza, (6) é operavelmente associado (por interação covalente ou não covalente) com um polipeptídeo com o qual não está associado na natureza, ou (7) não ocorre na natureza. Uma proteína isolada ou polipeptídeo como esta pode ser codificado por DNA genômico, DNAc, RNAm ou outro RNA, pode ser de origem sintética, de acordo com quaisquer das inúmeras químicas bem conhecidas para síntese de peptídeo e proteína artificial, ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a proteína isolada ou polipeptídeo é substancialmente livre de proteínas ou polipeptídeos, ou outros contaminantes, que são encontrados em seu ambiente natural, os quais interferem com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, pesquisa ou de outra forma).
[0096] Polipeptídeos podem compreender uma sequência sinal (ou líder) na extremidade N-terminal da proteína, que direciona co- traducionalmente ou pós-traducionalmente a transferência da proteína. O polipeptídeo também pode ser fundido em alinhamento ou conjugado a um ligante ou outras sequência para facilidade de síntese, purificação ou identificação do polipeptídeo (por exemplo, poli-His), ou para melhorar a ligação do polipeptídeo a um suporte sólido. Da maneira aqui usada, “proteína de fusão” ou “polipeptídeo de fusão” se refere a uma proteína que, em uma cadeia simples, apresenta pelo menos dois domínios distintos, em que os domínios não são naturalmente encontrados juntos em uma proteína. Um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão pode ser construído
33 / 152 usando PCR, recombinantemente modificado ou similares, ou tais proteínas de fusão podem ser sintetizados. Uma proteína de fusão pode conter adicionalmente outros componentes, tal como uma etiqueta, um ligante, ou um marcador de transdução. Os polipeptídeos do domínio de fusão podem ser unidos a um polipeptídeo na terminação N e/ou na terminação C, e podem incluir como exemplos não limitantes, sequências derivadas de imunoglobulina tais como sequências de região constante Ig ou porções das mesmas, etiquetas de afinidade tais como etiqueta His (por exemplo, hexa- histidina ou outras poli-histidina), FLAG™ ou myc ou outras etiquetas de afinidade de peptídeo, frações de polipeptídeo detectável, tal como proteína verde fluorescente (GFP) ou variantes das mesmas (por exemplo, proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente azul (BFP), outras aequorinas ou derivados das mesmas, etc.) ou outros domínios de fusão de polipeptídeo detectável, enzimas ou porções das mesmas tal como glutationa- S-transferase (GST) ou outros domínios de detecção enzimático e/ou de fusão repórter conhecidos, e similares, como será familiar aos versados na técnica. As frações detectáveis adicionais são aqui discutidas.
[0097] Os peptídeos contendo cisteína podem ser úteis como peptídeos de fusão que podem ser unidos na terminação N e/ou C de um polipeptídeo, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da presente descrição, para permitir montagem rápida de tais polipeptídeos em dímeros, trímeros, tetrâmeros ou multímeros maiores reticulados em dissulfeto, de acordo com metodologias estabelecidas. Por exemplo, polipeptídeos de fusão contendo sequências derivadas de elemento da superfamília do gene de imunoglobulina, que incluem resíduos de cisteína capazes de formar pontes de dissulfeto intercadeia são bem conhecidos, também são outras estratégias para modificar geneticamente multímeros ligados S-S (por exemplo, Reiter et al., 1994 Prot. Eng. 7:697; Zhu et al., 1997 Prot. Sci. 6:781; Mabry et al., 2010 Mabs 2:20; Gao et al., 1999 Proc.
34 / 152 Nat. Acad. Sci. Estados Unidos 96:6025; Lim et al., 2010 Biotechnol. Bioeng. 106:27). Abordagens alternativas também são contempladas para enxertar sequências de peptídeo que promovem montagem de multímero como domínios de fusão em um polipeptídeo desejado, tal como os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos (por exemplo, Fan et al., 2008 FASEB J. 22:3795).
[0098] As modificações de polipeptídeo podem ser realizadas biossinteticamente e/ou quimicamente, de acordo com uma ampla variedade de metodologias bem conhecidas, e também podem incluir conjugação com proteínas carreadoras (por exemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina sérica bovina (BSA), ovalbumina (OVA) ou outras moléculas), e imobilização covalente ou não covalente em suportes sólidos. A conjugação química ou biossintética a um carreador é contemplada, de acordo com certas modalidades, para a geração de conjugados que são multivalentes com relação aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos.
[0099] Também é contemplada a marcação com frações detectáveis indicadoras (algumas vezes referidas como frações repórteres) tais como fluoróforos (por exemplo, FITC, TRITC, vermelho Texas, etc.). Exemplos de uma ampla faixa de indicadores detectáveis (incluindo indicadores colorimétricos) que podem ser selecionados com propósitos específicos são descritos em Haugland, 2005 O Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies- Décima Ed., Invitrogen Corp./ Molecular Probes™, Eugene, OR; em Mohr, 1999 J. Mater. Chem., 9: 2259-2264; em Suslick et al., 2004 Tetrahedron 60:11133-11138; e na patente U.S.
6.323.039. (Vide também, por exemplo, Fluka Laboratory Products Catalog, 2001 Fluka, Milwaukee, WI; e Sigma Life Sciences Research Catalog, 2000, Sigma, St. Louis, MO.) Um indicador detectável pode ser um indicador fluorescente, um indicador luminescente, um indicador fosforescente, um
35 / 152 indicador radiométrico, um corante, uma enzima, um substrato de uma enzima, uma molécula de transferência de energia, ou uma marcação de afinidade.
[00100] Outros indicadores detectáveis para uso em certas modalidades aqui contempladas incluem reagentes de afinidade tais como anticorpos, lectinas, proteínas receptoras de imunoglobulina Fc (por exemplo, proteína A, proteína G ou outros receptores Fc de Staphylococcus aureus), avidina, biotina, outros ligantes, receptores ou contrarreceptores, ou seus análogos ou miméticos, e similares. Para tais metodologias de afinidade, os reagentes para medições imunométricas, tais como anticorpos ou lectinas marcados adequadamente, podem ser preparados incluindo, por exemplo, aqueles marcados com radionuclídeos (por exemplo, 76Br, 78Zr, 18Fl), com fluoróforos, com etiquetas de afinidade, com biotina ou sequências miméticas de biotina, ou preparados como conjugados anticorpo-enzima (vide, por exemplo, Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston; Scouten, W.H., 1987 Methods in Enzymology 135:30-65; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Haugland, Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies- Décima Ed., 2005 Invitrogen Corp. /Molecular Probes™, Eugene, OR; Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice, 1987, Springer-Verlag, NY; Hermanson, G.T. et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, 1992, Academic Press, Inc., NY; Luo et al., 1998 J. Biotechnol. 65:225 e referências citadas nos mesmos).
[00101] Uma sequência ligantea/espaçadora de peptídeo também pode ser empregada para separar componentes múltiplos de polipeptídeo por uma distância suficiente para garantir que cada polipeptídeo dobre em suas estruturas secundárias e/ou terciárias, se desejado. Uma sequência ligantea de peptídeo como essa pode ser incorporada em um polipeptídeo de fusão usando técnicas padrões bem conhecidas na técnica.
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[00102] Certas sequências espaçadoras de peptídeo podem ser escolhidas, por exemplo, com base em: (1) sua capacidade de adotar uma conformação estendida flexível; (2) sua incapacidade de adotar uma estrutura secundária que poderia interagir com epítopos funcionais nos primeiros e segundos polipeptídeos; e/ou (3) a ausência de resíduos hidrofóbicos ou resíduos carregados que podem reagir com os epítopos funcionais de polipeptídeo. Em certas modalidades, sequências espaçadoras de peptídeo contêm, por exemplo, resíduos Gly, Asn e Ser. Outros aminoácidos neutros próximos, tais como Thr e Ala, também podem ser incluídos em uma sequência espaçadora. Outras sequências de aminoácido, que podem ser empregadas de maneira útil como espaçadoras, incluem aquelas descritas em Maratea et al., Gene 40:39 46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 83:8258 8262 (1986); patente U.S. 4.935.233 e patente U.S.
4.751.180. Outros exemplos ilustrativos e não limitantes de espaçadores podem incluir, por exemplo, Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser- Lys-Val-Asp (SEQ ID NO: 23) (Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 87:1066-1070 (1990)) e Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser- Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 24) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988)).
[00103] Em algumas modalidades, sequências espaçadoras não são exigidas quando o primeiro e segundo polipeptídeos apresentam regiões de aminoácido N terminal não essencial, que podem ser úteis para separar os domínios funcionais e prevenir interferência estérica. Duas sequências codificantes podem ser fundidas diretamente sem nenhum espaçador, ou usando um poliligante flexível composto, por exemplo, do pentâmero Gly- Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 25) quando presente em uma iteração única ou repetida 1 a 5 ou mais vezes, ou mais; vide, por exemplo, SEQ ID NO: 26. Em certas modalidades ilustrativas e não limitantes, um espaçador de peptídeo pode apresentar entre 1 a 5 aminoácidos, entre 5 a 10 aminoácidos,
37 / 152 entre 5 a 25 aminoácidos, entre 5 a 50 aminoácidos, entre 10 a 25 aminoácidos, entre 10 a 50 aminoácidos, entre 10 a 100 aminoácidos, ou qualquer faixa intermediária de aminoácidos. Em outras modalidades ilustrativas, um espaçador de peptídeo compreende cerca de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais aminoácidos em tamanho.
[00104] Modificação(s) na sequência de aminoácido dos anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos, também é(são) contemplada(s) de acordo com certas modalidades. Modificações incluem, por exemplo, substituições conservativas e não conservativas de aminoácido. Uma “substituição conservativa” se refere às substituições de aminoácido que não afetam ou alteram significativamente uma característica particular (por exemplo, uma atividade de ligação, tal como uma atividade de ligação específica) de uma proteína particular. Em geral, substituições conservativas são aquelas nais quais um resíduo de aminoácido substituído é trocado por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral similar. Substituições conservativas incluem uma substituição observada em um dos seguinte grupos: Grupo 1: Alanina (Ala ou A), Glicina (Gly ou G), Serina (Ser ou S), Treonina (Thr ou T); Grupo 2: ácido aspártico (Asp ou D), ácido glutâmico (Glu ou Z); Grupo 3: Asparagina (Asn ou N), Glutamina (Gln ou Q); Grupo 4: Arginina (Arg ou R), Lisina (Lys ou K), Histidina (His ou H); Grupo 5: Isoleucina (Ile ou I), Leucina (Leu ou L), Metionina (Met ou M), Valina (Val ou V); e Grupo 6: Fenilalanina (Phe ou F), Tirosina (Tyr ou Y), Triptofano (Trp ou W). Adicionalmente ou alternativamente, os aminoácidos podem ser agrupados em grupos de substituição conservativa por função similar, estrutura química, ou composição (por exemplo, acídica, básica, alifática, aromática, ou contendo enxofre). Por exemplo, um agrupamento alifático por incluir, com propósitos de substituição, Gly, Ala, Val, Leu e Ile. Outros grupos de substituições conservativas incluem: contendo enxofre: Met e Cisteína (Cys ou C); acídicos: Asp, Glu, Asn, e Gln; resíduos alifáticos
38 / 152 pequenos, não polares ou levemente polares: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; resíduos polares carregados negativamente e suas amidas: Asp, Asn, Glu, e Gln; resíduos polares carregados positivamente: His, Arg, e Lys; resíduos alifáticos grandes não polares: Met, Leu, Ile, Val, e Cys; e resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr, e Trp. Informação adicional pode ser encontrada em Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company.
[00105] Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou propriedades biológicas de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Variantes na sequência de aminoácido podem ser preparadas, por exemplo, introduzindo alterações de nucleotídeo apropriadas em um polinucleotídeo que o codifica ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, eliminações de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos na sequência de aminoácido do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição pode ser realizada para atingir o anticorpo final ou variante de fragmento de ligação ao antígeno, contanto que a construção final possua as características desejadas (por exemplo, mantém ligação específica a um antígeno de Lewis biantenário da maneira aqui descrita, embora não se ligue de maneira detectável, ou que exibe ligação diminuida estatisticamente significativa a um antígeno LeX ou LeA ou H monoantenário, da maneira aqui descrita em outra parte). As alterações de aminoácido também podem alterar processos pós-traducionais do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tal como alterar o número ou posição de sítios de glicosilação.
[00106] A determinação das estruturas tridimensionais dos anticorpos representativos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, pode ser realizada por meio de metodologias de rotina, de maneira tal que a substituição, adição, eliminação ou inserção de um ou mais aminoácidos com aminoácidos selecionados naturais ou não naturais pode ser virtualmente
39 / 152 modelada com propósitos de determinar se uma variante estrutural assim derivada mantém as propriedades de preenchimento de espaço das espécies atualmente descritas. Vide, por exemplo, Donate et al., 1994 Prot. Sci. 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Raman et al. Science 327:1014-1018 (2010); Marcos et al., 2017 Science 355:201, e referências citadas nestes. Alguns exemplos não limitantes adicionais de algoritmos de computador que podem ser úteis para estas modalidades e outras relacionadas, tal como para o projeto racional de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da maneira aqui provida, incluem VMD, que é um programa de visualização molecular para exibir, animae e analisar grandes sistemas biomoleculares usando gráficos 3-D e roteiro integrado (vide o website para o Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois em Urbana-Champagne, at ks.uiuc.edu/Research/vmd/).
[00107] Muitos outros programa de computador são conhecidos na técnica e disponíveis pelos versados na técnica, e que permitem determinar dimensões atômicas de modelos de preenchimento de espaço (raios de van der Waals) de conformações minimizadas em energia; GRID, que busca determinar regiões de alta afinidade por diferentes grupos químicos, melhorando por meio disso a ligação, pesquisas de Monte Carlo que calculam alinhamento matemático, e CHARMM (Brooks et al. (1983) J. Comput. Chem. 4:187-217) e AMBER (Weiner et al (1981) J. Comput. Chem. 106: 765), que avaliam cálculos de campo de força, e análise (vide também, Eisenfield et al. (1991) Am. J. Physiol. 261:C376-386; Lybrand (1991) J. Pharm. Belg. 46:49-54; Froimowitz (1990) Biotechniques 8:640-644; Burbam et al. (1990) Proteins 7:99-111; Pedersen (1985) Environ. Health Perspect. 61:185-190; e Kini et al. (1991) J. Biomol. Struct. Dyn. 9:475-488). Uma
40 / 152 variedade de programas de computador cumputacionais apropriados também são comercialmente disponíveis, tal como a partir de Schrödinger (Munique, Alemanha).
ANTICORPOS
[00108] Certas modalidades preferidas da presente invenção se referem aos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente: a um antígeno biantenário Leb/Leb compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno monoantenário H tipo 2 que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno biantenário H tipo 2 que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII], ou a um antígeno monoantenário H tipo 1 que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV], e que em certas modalidades particularmente preferidas adicionais não se ligam especificamente a certos outros antígenos de Lewis biantenários ou monoantenários, da maneira aqui descrita.
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[00109] O termo “anticorpo” (Ab) da maneira aqui usada inclui anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos ou triespecíficos), anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos heteoconjugados, e fragmentos de anticorpo, contanto que exibam o atividade biológica desejada, por exemplo, mantenham a capacidade de se ligar especificamente aos antígenos de Lewis biantenário atualmente descritos. O termo “imunoglobulina” (Ig) é aqui usado indiferentemente com “anticorpo”.
[00110] A unidade de anticorpo básico é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por pelo menos uma (e tipicamente uma) ligação dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas uma na outra por uma ou mais ligações dissulfeto, dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L também apresenta pontes de dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia H apresenta na terminação N um domínio variável (VH), seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e γ cadeias e quatro domínios CH para isotipos µ e ε. Cada cadeia L apresenta na terminação N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. O VL é alinhadao com o VH e o CL é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acerdita-se que resíduos de aminoácidos particulares foram uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. O pareamento de um VH e VL formam juntos um sítio de ligação ao antígeno único.
[00111] A cadeia L de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um dos dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes (CL). Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser
42 / 152 atribuídas a diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, com cadeias pesadas denomiandas alfa (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (γ) e mu (µ), respectivamente. As classes γ e α são divididas adicionalmente em subclasses nà base de diferenças relativamente menores na sequência CH e função, por exemplo, expressam em humanos as seguintes subclasses: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Será entendido que mamíferos que codificam múltiplos isotipos Ig serão capazes de passar por mudança de classe de isotipo.
[00112] Um anticorpo IgM consiste em cinco das unidades de heterotetrâmero básicas, junto com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J, e contém, portanto, dez sítios de ligação de antígeno, embora anticorpos IgA secretados possam polimerizar para formar montagens versáteis compreendendo duas a cinco das unidades de quatro cadeias básicas, junto com uma cadeia J. No caso de IgG, a unidade de quatro cadeias apresenta em geral um peso molecular de cerca de 150.000 daltons. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª edição, Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71, e capítulo 6.
[00113] O domínio variável (V) medeia ligação ao antígeno e define especificidade de um anticorpo particular por seu antígeno particular. A sequência de gene que codifica o domínio VH apresenta múltiplas cópias de segmentos de variável (V), diversidade (D) e junção (J). A sequência de genes que codifica o domínio VL contém múltiplas cópias de segmentos V e J. As regiões VH e VL passam por rearranjo genético (isto é, recombinação somática) para desenvolver especificidade antigênica diversa em anticorpos. O termo “variável” se refere ao fato de que certos segmentos dos domínios V diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos.
[00114] Entretanto, a variabilidade não distribuída de maneira
43 / 152 uniforme através do intervalo 110-aminoácido dos domínios variáveis. Ao contrário, as regiões V consistem em trechos relativamente invariantes denominadas regiões de estrutura (FRs), de 15-30 aminoácidos separadas por regiões curtas de variabilidade extrema denominadas “regiões hipervariáveis”. Estas regiões hipervariáveis são o resultado de hipermutação somática durante o processo de maturação por afinidade, e apresentam tipicamente cada qual 9- 18 aminoácidos em tamanho. Entretanto, observou-se que variam de 4-28 aminoácidos em tamanho, dependendo do epítopo particular. Por exemplo, regiões CDR3 até pelo menos 22 ou 23 aminoácidos em tamanho foram descritas. Vide, por exemplo, Morea V, et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (1998) e Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242 (1991). Posições de aminoácido do anticorpo (por exemplo, sequências CDR) podem ser determinadas de acordo com esquemas de numeração conhecidos, tais como os esquemas de numeração Kabat, Chothia, IMGT e/ou EU.
[00115] Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves naturais compreendem cada qual quatro regiões de estrutura (FRs), adotando amplamente uma configuração de folha β, conectada por três regiões hipervariáveis (também conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDR) e definidas adicionalmente a seguir), formando alças de conexão, e em alguns casos formando parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em muita proximidade pelas FRs e, em alguns casos, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de
44 / 152 anticorpo (ADCC), ou outros mecanismos que podem envolver a interação de um domínio de região constante com receptores Fc de superfície celular (FcR).
[00116] O termo “região hipervariável”, quando aqui usado, se refere aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende em geral resíduos de aminoácido de uma “região determinante de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, como pode ser determinado de acordo com numeração Kabat, algo torno de resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL, e algo torno de 28-36 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no VH; vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); e/ou de acordo com metodologias conhecidas na técnica para identificar CDRs, da maneira definida por Kabat, tais como aquelas descritas por Martin, “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”, em Antibody Engineering, R. Kontermann and S. Dubel, 2001, Springer-Verlag, Berlin, Alemanha, páginas 422-438) e/ou aqueles resíduos de uma “alça hipervariável” (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no VL, e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no VH; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
[00117] Um “anticorpo isolado” é aquele que foi separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que podem interferir com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo é purificado: (1) em mais de 95% em peso do anticorpo determinado pelo método de Bradford, e acima de tudo preferivelmente mais de 99% em peso; (2) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido N-
45 / 152 terminal ou interna, pelo uso de um sequenciador com recipiente giratório; ou (3) em homogeneidade por SDS-PAGE em condições de redução ou não redução, usando azul ou corante prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinante, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. De maneira ordinária, entretanto, anticorpo isolado será preparado em pelo menos uma etapa de purificação.
[00118] Um anticorpo “intacto” é aquele que compreende um sítio de ligação ao antígeno, bem como um CL e pelo menos domínios constantes de cadeia pesada, CH 1, CH 2 e CH 3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência natural (por exemplo, domínios constantes de sequência natural humana), ou sequência de variantes de aminoácido dos mesmos. Preferivelmente, o anticorpo intacto apresenta uma ou mais funções efetoras.
[00119] Um “fragmento de anticorpo” é um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente a região de ligação ao antígeno ou variável do anticorpo intacto. Exemplos dos fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (vide patente U.S. 5.641.870; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpos de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[00120] A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, denominados fragmentos “Fab”, e um fragmento residual “Fc”, uma designação que reflete a capacidade de cristalizar facilmente. O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira junto com o domínio variável da região da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH 1). Cada fragmento Fab é monovalente, com relação à ligação ao antígeno, isto é, apresenta um sítio de
46 / 152 ligação ao antígeno único. O tratamento com pepsina de um anticorpo rende um fragmento grande único F(ab')2 que corresponde aproximadamente aos fragmentos Fab ligados ao dissulfeto, com atividade de ligação ao antígeno divalente, e ainda é capaz de reticular antígeno. Tanto o Fab quanto F(ab’)2 são exemplos de “fragmentos de ligação ao antígeno”. Os fagmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab apresentando poucos resíduos adicionais na terminação carbóxi do domínio CH1, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos de Fab', que apresentam cisteínas de dobradiça entre estes. Outros acoplamentos químicos dos fragmentos de anticorpo também são conhecidos.
[00121] O fragmento “Fc” compreende as porções terminais carboxi (isto é, os domínios CH2 e CH3 de IgG) de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetortas dos anticorpos são determinadas pelas sequências na região Fc. O domínio Fc é a porção do anticorpo reconhecidas pelos receptores celulares, tal como o FcR, e no qual a proteína de ativação de complemento, C1q, se liga. Da maneira aqui discutida, modificações (por exemplo, substituições de aminoácido) podem ser realizadas em um domínio Fc, a fim de modificar (por exemplo, melhorar, reduzir ou remover) uma ou mais funcionalidades de um polipeptídeo contendo Fc (por exemplo, um anticorpo da presente descrição).
[00122] “Fv” é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio de reconhecimento de antígeno e de ligação ao antígeno completo. Este fragmento consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação firme não covalente. A partir dos mesmos dois domínios emanam seis alças hipervariáveis (três alças cada a partir da cadeia H e L) que contribuem para os resíduos de aminoácido se
47 / 152 ligarem ao antígeno, e conferem especificidade de ligação ao antígeno com o anticorpo. Entretanto, até um domínio variável único (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um antígeno) apresenta a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora tipicamente em uma afinidade menor do que o sítio de ligação completo.
[00123] “Fv de cadeia simples” também abreviado como “sFv” ou “scFv”, são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo VH e VL conectados em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeo sFv compreende adicionalmente um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL que possibilitam o sFv formar a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão de sFv, vide Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.
[00124] O termo “diacorpos” se refere aos fragmentos pequenos de anticorpo preparados construindo fragmentos sFv (vide parágrafo precedente) com ligantees curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL, de maneira tal que o pareamento intercadeia, mas não intracadeia, dos domínios V é atingido, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento com dois sítios de ligação ao antígeno. Diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv “cruzados”, em que os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias de polipeptídeo. Diacorpos são descritos de maneira mais completa em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 90:6444- 6448 (1993). Outros fragmentos de anticorpo e moléculas compreendendo o o mesmo incluem, por exemplo, anticorpos lineares, scFv em tandem, scFv-Fc, scFv-Fc em tandem, dímero scFv, scFv-zíper, diacorpo-Fc, diacorpo-CH3, Diacorpos sc, Diacorpos sc-Fc, Diacorpo sc-CH3, nanocorpos, TandAbs, minicorpos, minianticorpos, triacorpos, tetracorpos, scFab, Fab-scFv, Fab-
48 / 152 scFv-Fc, scFv-CH-CL-scFv, e F(ab’)2-scFv2, todos os quais são também contemplados aqui.
[00125] Em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição é um anticorpo multiespecífico, tal como um anticorpo biespecífico ou triespecífico. Os formatos para anticorpos biespecíficos são descritos em, por exemplo, Spiess et al., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015), e em Brinkmann e Kontermann, mAbs 9(2):182-212 (2017), cujos formatos biespecíficos e métodos de preparar os mesmos são aqui incorporados pela referência e incluem, por exemplo, Engajadores de Célula T Biespecíficos (BiTEs), DARTs, conjuntos Knobs-Into-Holes (KIH), conjuntos scFv-CH3-KIH, anticorpos de cadeia leve comuns KIH, TandAbs, Triple Bodies, TriBi Minicorpos, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab’)2- scFv2, HCabs, Intrabodies tetravalente, CrossMabs, Fabs de ação dupla (DAFs) (dois-em-um ou quatro-em-um), DutaMabs, DT-IgG, pares de carga, alteração de Fab-arm, SEEDbodies, Triomabs, conjuntos LUZ-Y, Fcabs, κλ- bodies, Fabs ortogonal, DVD-IgGs, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody, e DVI-IgG (quatro-em- um).
[00126] Da maneira aqui usada, o termo “anticorpo policlonal” se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos específicos de antígeno que reconhecem mais de um epítopo do antígeno específico. “Antígeno” ou “imunógeno” se refere a um peptídeo, lipídeo, polissacarídeo ou polinucleotídeo que é reconhecido pelo sistema imune adaptivo. Antígenos podem ser moléculas próprias ou não próprias. Exemplos de antígenos incluem, mas sem limitação, componentes da parede celular bacteriana, pólen e fator rh. A região de um antígeno que é especificamente reconhecida por um anticorpo específico é um “epítopo” ou “determinante antigênico”. Um antígeno simples pode apresentar epítopos múltiplos.
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[00127] O termo “anticorpo monoclonal” (mAb), da maneira aqui usada, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, exceto pela possibilidade de mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em menor quantidade. Anticorpos monoclonais são muito específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário do das preparações de anticorpo policlonal, que incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes epítopos, cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único epítopo do antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos, uma vez que os mesmos podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador “monoclonal” não deve ser interpretado como exigindo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem ser preparados pela metodologia de hibridoma descrita primeiro por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser preparados usando métodos de DNA recombinante em células bacterianas, de animal eucarioto ou células de planta (vide, por exemplo, patente U.S. 4.816.567). Os “anticorpos monoclonais” também podem ser isolados a partir de biblioteca de anticorpos de fago, usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por exemplo.
[00128] Os anticorpos monoclonais incluem aqui “anticorpos quiméricos”, em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie, ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie, ou que pertencem a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como
50 / 152 fragmentos de tais anticorpos, contanto que exibam a atividade biológica desejada (vide, patentes U.S. 4.816.567; 5.530.101 e 7.498.415; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 81:6851-6855 (1984)). Por exemplo, anticorpos quiméricos podem compreender resíduo humanos e não humanos. Além disso, anticorpos quiméricos podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são realizadas para aperfeiçoar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Para detalhes adicionais, vide Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Anticorpos quiméricos também incluem anticorpos primatizados e humanizados.
[00129] Um “anticorpo humanizado” é em geral considerado como um anticorpo humano que apresenta um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos, a partir de uma fonte que é não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são obtidos tipicamente de um domínio variável. A humanização é realizada tradicionalmente seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), substituindo sequências variáveis não humanas pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Dessa maneira, tais anticorpos “humanizado” são anticorpos quiméricos (patentes U.S. 4.816.567; 5.530.101 e 7.498.415) em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondentes de uma espécie não humana. Em alguns exemplos, um anticorpo “humanizado” é aquele que é produzido por uma célula ou animal não humano e compreende sequências humanas, por exemplo, domínios HC.
[00130] Um “anticorpo humano” é um anticorpo contendo apenas sequências presentes em um anticorpo naturalmente produzido por um humano. Entretanto, da maneira aqui usada, anticorpos humanos podem
51 / 152 compreender resíduos ou modificações não encontrados em um anticorpo humano de ocorrência natural, incluindo aquelas modificações e sequências de variante aqui descritas. Estas são realizadas tipicamente para aperfeiçoar ou melhorar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em alguns exemplos, anticorpos humanos são produzidos por animais transgênicos. Por exemplo, vide patentes U.S. 5.770.429; 6.596.541 e 7.049.426.
[00131] “Funções efetoras” de anticorpo se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência natural ou região Fc de variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo, e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos das funções efetoras do anticorpo incluem: ligação C1q e citotoxicidade dependente do complemento; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; infrarregulação de receptores superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de célula B. As modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) para modificar (por exemplo, melhorar, reduzir ou remover) funcionalidades Fc incluem, por exemplo, as mutações T250Q/M428L, M252Y/S254T/T256E, H433K/N434F, M428L/N434S, E233P/L234V/L235A/G236 + A327G/A330S/P331S, E333A, S239D/A330L/I332E, P257I/Q311, K326W/E333S, S239D/I332E/G236A, N297Q, K322A, S228P, L235E + E318A/K320A/K322A, L234A/L235A, e L234A/L235A/P329G, cujas mutações são resumidas e anotadas em “Engineered Fc Regions”, publicado por InvivoGen (2011) e disponível online em www. invivogen.com/PDF/review/review-Engineered-Fc-Regions- invivogen.pdf?utm_source=review&utm_medium=pdf&utm_ campaign=review&utm_content=Engineered-Fc-Regions, e são aqui incorporadas pela referência.
[00132] A frase “fragmento funcional ou análogo” de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é um composto com atividade
52 / 152 biológica qualitativa em comum com um anticorpo de tamanho completo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
[00133] Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, com uma “característica biológica” de um anticorpo indicado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é aquele que possui uma ou mais do características biológicas do mesmo fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo, que o distingue de outros anticorpos ou fragmentos de ligação derivados de anticorpo. Por exemplo, em certas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, com uma característica biológica de um anticorpo indicado, se ligará ao mesmo epítopo daquele ligado pelo anticorpo indicado, e/ou apresentará uma função efetora comum com anticorpo indicado.
[00134] Da maneira aqui usada, um anticorpo é condiderado “imunoespecífico”, “específico para” ou “se liga especificamente a” um antígeno se reagir em um nível detectável com o antígeno, preferivelmente com uma constante de afinidade, Ka, maior que ou igual a cerca de 104 M-1, ou maior que ou igual a cerca de 105 M-1, maior que ou igual a cerca de 106 M-1, maior que ou igual a cerca de 107 M-1, ou maior que ou igual a 108 M-1. Afinidade de um anticorpo por seu antígeno cognato também é comumente expressa como uma constante de dissociação KD, e em certas modalidades um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a um antígeno de Lewis da presente descrição, se se ligar com uma KD menor ou igual a 10-4 M, menor que ou igual a cerca de 10-5 M, menor que ou igual a cerca de 10-6 M, menor que ou igual a 10-7 M, ou menor que ou igual a 10-8 M. Afinidades de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno podem ser facilmente determinadas usando técnicas convencionais, por exemplo, aquelas descritas por Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. Estados Unidos 51:660 (1949)), ou por ressonância de plasma de superfície (SPR) (por exemplo, Hearty et al., 2012 Meths. Mol. Biol. 907:411), por
53 / 152 calorimetria de titulação isométrica (ITC) (por exemplo, Dam et al., 2008 J. Biol. Chem. 283: 31366), por ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) (por exemplo, Bobrovnik, 2003 J. Biochem. Biophys. Meths. 75(3): 213), ou por outras metodologias familiares aos versados na técnica.
[00135] As propriedades de ligação de um anticorpo aos antígenos, células ou tecidos dos mesmos podem ser em geral determinadas e avaliadas usando métodos de imunodetecção incluindo, por exemplo, ensaios à base de imunofluorescência, tais como imuno-histoquímica (IHC) e/ou classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Outros métodos de determinar a ligação de um anticorpo a um antígeno incluem, por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), calorimetria de titulação isométrica (ITC), e técnicas de ressonância de plasma de superfície (SPR).
[00136] “Carreadores”, da maneira aqui usada, incluem carreadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que não são tóxicos para a célula ou mamífero que é exposto ao mesmos nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente, o carreador fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquosa. Exemplos de carreadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; álcoois de açúcar tal como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal tal como sódio; e/ou agentes tensoativos não iônicos tais como polissorbato 20 (TWEEN™) polietileno glicol (PEG), e poloxâmeros (PLURONICS™), e similares. POLINUCLEOTÍDEOS, VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS
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[00137] Em aspectos adicionais, a presente descrição provê, em certas modalidades, polinucleotídeos isolados que codificam anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, da maneira aqui descrita, e também provê vetores compreendendo os mesmos. Ácidos nucleicos compreendendo polinucleotídeos podem compreender DNA ou RNA e podem ser completamente ou parcialmente sintéticos.
[00138] O termo “polinucleotídeo” da maneira aqui referida significa um polímero de ácido nucleico de fita simples ou fita dupla, e inclui especificamente forma de DNA de fita simples e dupla. Polinucleotídeos podem ser gerados, por exemplo, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) ou por tradução in vitro, e fragmentos gerados por quaisquer de ligação, cisão, ação de endonuclease ou ação de exonuclease. Em certas modalidades, os polinucleotídeos da presente descrição são produzidos por PCR. Polinucleotídeos podem ser compostos de monômeros que são nucleotídeos de ocorrência natural (tais como desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos), análogos de nucleotídeos de ocorrência natural (por exemplo, formas α- enantioméricas de nucleotídeos de ocorrência natural), ou uma combinação de ambos. Em modalidades adicionais, nucleotídeos compreendendo um polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos, ou uma forma modificada de cada tipo de nucleotídeo.
[00139] O termo “nucleotídeos de ocorrência natural” inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo “nucleotídeos modificados” inclui nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos, e similares (por exemplo, modificados com bromouridina, arabinosídeo, ou 2’3’-didesoxirribose). O termo “ligações de oligonucleotídeo” inclui ligações de oligonucleotídeo tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e similares. Vide, por exemplo, LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc.,
55 / 152 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al., 1991, Anti- Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al., U.S. Pat. No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543, cujas descrições são aqui incorporadas pela referência para qualquer propósito. Um oligonucleotídeo pode incluir uma marca detectável para possibilitar a detecção do oligonucleotídeo ou hibridização do mesmo.
[00140] O termo “polinucleotídeo isolado”, da maneira aqui usada, pode significar um polinucleotídeo de DNA genômico, DNAc ou de origem sintética, ou algumas combinações dos mesmos, em que, em virtude da sua origem, o polinucleotídeo isolado (1) não está associado com todo ou uma porção de um polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, (2) é ligado a um polinucleotídeo para o qual não está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de um sequência maior.
[00141] A referência a uma sequência de nucleotídeo, da maneira aqui apresentada, inclui uma molécula de DNA com a sequência especificada, e inclui uma molécula de RNA com a sequência especificada, em que U é substituída por T, a menos que o contexto exija de outra forma.
[00142] O termo “operavelmente ligado” significa que os componentes nos quais o termo é aplicado estão em uma relação que permite que os mesmos realizem suas funções inerentes em condições adequadas. Por exemplo, uma sequência de controle de transcrição “operavelmente ligada” a uma sequência que codifica proteína está ligada a esta, de maneira tal que a expressão da sequência que codifca proteína é atingida em condições compatíveis com a atividade transcricional das sequências controle.
[00143] O termo “sequência controle”, da maneira aqui usada, se refere às sequências de polinucleotídeo que podem afetar a expressão, processamento ou localização intracelular de sequências codificantes para as
56 / 152 quais são ligadas ou operavelmente ligadas. A natureza de tais sequências de controle pode depender do organismo hospedeiro. Em modalidades particulares, sequências de controle de transcrição para procariotos podem incluir um promotor, sítio de ligação ribossomal, e sequência de terminação transcricional. Em outras modalidades particulares, as sequências de controle de transcrição para eucariotos podem incluir promotores que compreendem um ou uma pluralidade de sítios de reconhecimento para fatores de transcrição, sequências melhoradoras de transcrição, sequências de finalização de transcrição e sequências de poliadenilação. Em certas modalidades, “sequências controle” podem incluir sequências líderes e/ou sequências parceiras de fusão. Sequências de controle de expressão podem incluir sequências de início de transcrição apropriada, terminação, promotoras e melhoradoras; sinais de processamento de RNA eficientes tais como sinais de emenda e poliadenilação; sequências que estabilizam RNAm citoplásmico; sequências melhoram a eficiência de tradução (isto é, sequências consensuais de Kozak); sequências que melhoram a estabilidade de proteína; e possivelmente sequências que melhoram a secreção de proteína. Sequências de controle de expressão podem ser operavelmente ligadas, se forem contíguas com o gene de interesse, e sequências de controle de expressão que atuam em trans ou em uma distância para controlar o gene de interesse.
[00144] A expressão inclui, mas sem limitação, processos tais como transcrição, tradução e processamento de RNA, se íntrons estiverem presentes.
[00145] Da maneira entendida pelos versados na técnica, os polinucleotídeos podem incluir sequências genômicas, sequências extra- genômicas e codificadas por plasmídeos, e segmentos de gene geneticamente modificados menores que expressam, ou podem ser adaptados para expressar, proteínas, polipeptídeos, peptídeos e similares. Tais segmentos podem ser naturalmente isolados, ou modificados sinteticamente pelos versados na
57 / 152 técnica.
[00146] Como também será reconhecido pelos versados na técnica, os polinucleotídeos podem ser de fita simples (de codificação ou antissentido) ou dupla fita, e podem ser moléculas de DNA (genômico, DNAc ou sintético) ou RNA. As moléculas de RNA podem incluir moléculas de HnRNA, que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA de uma maneira uma-a-uma, e moléculas de RNAm que não contêm íntrons. Sequências codificantes e não codificantes adicionais podem estar presentes, mas não é necessário, em um polinucleotídeo de acordo com a presente descrição, e um polinucleotídeo pode estar, mas não é necessário, ligado à outras moléculas e/ou materiais de suporte. Polinucleotídeos podem compreender uma sequência natural ou podem compreender uma sequência que codifica uma variante ou derivada de uma sequência como esta.
[00147] Portanto, de acordo com estas e outras modalidades relacionadas, a presente descrição também provê polinucleotídeos que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da maneira aqui descrita.
[00148] Em outras modalidades relacionadas, as variantes de polinucleotídeo podem apresentar identidade substancial com uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui descrito. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo compreendendo pelo menos 70% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou mais identidade de sequência, comparada a uma sequência de polinucleotídeo de referência, tal como uma sequência que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui descrito, usando os métodos aqui descritos, (por exemplo, análise BLAST usando parâmetros padrões, da maneira descrita a seguir). Os versados na técnica reconhecerão que estes valores podem ser ajustados apropriadamente
58 / 152 para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas sequências de nucleotídeo, levando em conta a degeneração do códon, similaridade de aminoácido, posicionamento de quadro de leitura e similares.
[00149] Tipicamente, variantes de polinucleotídeo conterão uma ou mais substituições, adições, eliminações e/ou inserções, preferivelmente de maneira tal que a afinidade de ligação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, codificada pela variante de polinucleotídeo, não seja substancialmente diminuída em relação a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo codificado por uma sequência de polinucleotídeo especificamente aqui apresentada (por exemplo, com relação ao anticorpo aqui referido como hBBC.10.1, que compreende a cadeia pesada de imunoglobulina com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 10, e a cadeia leve de imunoglobulina com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 11).
[00150] Em certas outras modalidades relacionadas, fragmentos de polinucleotídeo podem compreender ou consistir essencialmente em vários tamanhos de trechos contíguos de sequência idêntica a, ou complementar a, uma sequência que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da maneira aqui descrita. Por exemplo, polinucleotídeos que são providos compreendem ou consistem essencialmente em pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos contíguos de sequências para codificar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou variante dos mesmos aqui descritos, bem como todos os tamanhos intermediários entre estes. Será facilmente entendido que “tamanhos intermediários”, neste contexto, significa qualquer tamanho entre os valores cotados, tais como 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluindo
59 / 152 todos os números inteiros entre 200-500; 500-1.000 e similares. Uma sequência de polinucleotídeo da maneira aqui descrita pode ser estendida em uma ou ambas extremidades por nucleotídeos adicionais não encontrados na sequência natural. Esta sequência adicional pode consistir em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 nucleotídeos em cada extremidade de um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui descrito, ou em ambas as extremidades de um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui descrito.
[00151] Em uma outra modalidade, polinucleotídeos que são providos são capazes de hibridizar em condições de severidade moderadas a elevadas em uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou variante do mesmo, aqui provido, ou um fragmento do mesmo, ou uma sequência complementar do mesmo. As técnicas de hibridização são bem conhecidas na técnica de biologia molecular. Com propósito de ilustração, condições de severidade moderadamente adequadas para testar a hibridização de um polinucleotídeo, da maneira aqui provida, com outros polinucleotídeos incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, SDS 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0); hibridização em 50ºC-60ºC, 5 X SSC, por toda a noite; seguido pela lavagem por duas vezes a 65ºC por 20 minutos, com cada qual de SSC 2X, 0,5X e 0,2X contendo SDS 0,1%. Os versados na técnica entenderão que a gravidade de hibridização pode ser facilmente manipulada, tal como alterando o teor de sal da solução de hibridização e/ou a temperatura na qual a hibridização é realizada. Por exemplo, em uma outra modalidade, condições de hibridização muito severas adequadas incluem aquelas descritas anteriormente, com a exceção de que a temperatura de hibridização é aumentada, por exemplo, para 60ºC-65ºC ou 65ºC-70ºC.
[00152] Em certas modalidades, os polinucleotídeos descritos
60 / 152 anteriormente, por exemplo, variantes de polinucleotídeo, fragmentos e sequências de hibridização, codificam anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a um antígeno de Lewis biantenário da maneira aqui descrita. Em outras modalidades, tais polinucleotídeos codificam anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ou variantes dos mesmos, que se ligam a um antígeno de Lewis atualmente descrito pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, e em certas modalidades, pelo menos cerca de 90%, bem como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui apresentado especificamente (por exemplo, anticorpo hBBC.10.1). Em modalidades adicionais, tais polinucleotídeos codificam anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ou variantes dos mesmos, que se ligam a um antígeno de Lewis atualmente descrito, com maior afinidade do que os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui apresentados especificamente, por exemplo, que se ligam quantitativamente pelo menos cerca de 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, ou 110%, bem como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui apresentado especificamente.
[00153] Da maneira aqui descrita em outra parte, a determinação das estruturas tridimensionais dos anticorpos atualmente descritos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, pode ser realizada por meio de metodologias de rotina, de maneira tal que substituição, adição, eliminação ou inserção de um ou mais aminoácidos com aminoácidos naturais ou não naturais selecionados pode ser modelada virtualmente, com o propósito de determinar se uma variante estrutural assim derivada mantém as propriedades de preenchimento de espaço da espécie atualmente descrita. Uma variedade de programas de computador é conhecida pelos versados na técnica para determinar as substituições de aminoácido apropriadas (ou polinucleotídeos apropriados que codificam a sequência de aminoácido) em um anticorpo ou
61 / 152 fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de maneira tal que, por exemplo, a afinidade seja mantida ou melhor afinidade seja atingida. Vide, por exemplo, Donate et al., 1994 Prot. Sci. 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Raman et al. Science 327:1014-1018 (2010); Marcos et al., 2017 Science 355:201, e referências aqui citadas.
[00154] Os polinucleotídeos aqui descritos, ou fragmentos dos mesmos, independente do tamanho da própria sequência de codificação, podem ser combinados com outras sequências de DNA, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de restrição de enzima adicional, sítios de clonagem múltipla, outros segmentos de codificação e similares, de maneira tal que seu tamanho completo possa variar consideravelmente. Portanto, contempla-se que um fragmento de ácido nucleico praticamente de qualquer tamanho pode ser empregado, com o tamanho total sendo preferivelmente limitado pela facilidade de preparação e uso no protocolo de DNA recombinante pretendido. Por exemplo, segmentos de polinucleotídeo ilustrativos com tamanhos totais de cerca de 10.000, cerca de 5.000, cerca de
3.000, cerca de 2.000, cerca de 1.000, cerca de 500, cerca de 200, cerca de 100, cerca de 50 pares de base em tamanho e similares (incluindo todos os tamanhos intermediários) são contemplados para serem úteis.
[00155] Ao comparar as sequências de polinucleotídeo, duas sequências são consideradas “idêntica” se a sequência de nucleotídeos nas duas sequências for a mesma quando alinhadas por correspondência máxima, da maneira descrita a seguir. Comparações entre duas sequências são tipicamente realizadas comparando as sequências, em relação a uma janela de comparação, para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma “janela de comparação”, da maneira aqui usada, se refere a
62 / 152 um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, em geral 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número das posições contíguas após as duas sequências serem alinhadas de maneira ideal.
[00156] O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido usando o programa Megalign no suite DNASTAR® Lasergene do software de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, WI), usando parâmetros padrões. Este programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins – Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. and Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor 11:105 (1971); Santou, N. Nes, M., Mol. Biol. Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., Numerical Taxonomy – the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad., Sci. Estados Unidos 80:726-730 (1983).
[00157] Alternativamente, o alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de identidade local de Smith e Waterman, Add. APL. Math 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de identidade Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa por métodos similares de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas dos mesmos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no pacote de Software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science
63 / 152 Dr., Madison, WI), ou por inspeção.
[00158] Um exemplo preferido de algoritmos que são adequados para determinar a identidade de sequência percentual e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 podem ser úteis, por exemplo, com os parâmetros aqui descritos, para determinar identidade de sequência percentual entre dois ou mais dos polinucleotídeos. Software para realizar a análise BLAST é disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information. Em um exemplo ilustrativo, pontuações cumulativas podem ser calculadas usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos de combinação; sempre >0) e N (pontuação com penalidade para resíduos incompatíveis; sempre <0). A extensão das palavras em comum em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X, a partir de seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa vai a zero ou menos, em virtude do acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa; ou a extremidade de cada sequência é atingida. Os parâmetros do algoritmo BLAST, W, T e X, determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como parâmetros um tamanho de letra (W) de 11, e expectativa (E) de 10, e os alinhamentos da matriz de pontuação BLOSUM62 (vide Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89:10915 (1989)), (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e um comparação de ambas as fitas.
[00159] Em certas modalidades, o “percentual de identidade de sequência” é determinado comparando duas sequências alinhadas de maneira ideal em relação a uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode
64 / 152 compreender adições ou eliminações (isto é, intervalos) de 20 por cento ou menos, em geral 5 a 15 por cento, ou 10 a 12 por cento, da maneira comparada com as sequências de referência (que não compreendem adições ou eliminações) para alinhamento ideal das duas sequências. O percentual é calculado determinando o número de posições no qual as bases de ácido nucleico idênticas ocorrem em ambas as, para render o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para render o percentual de identidade de sequência.
[00160] Será entendido pelos versados na técnica que, em função da degeneração do código genético, existem muitas sequências de nucleotídeo que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da maneira aqui descrita. Alguns tais polinucleotídeos carregam identidade de sequência mínima com a sequência de nucleotídeo, de uma sequência de polinucleotídeo natural ou original que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui descrito. Entretanto, polinucleotídeos que variam em virtude das diferenças no uso do códon são expressamente contemplados pela presente descrição. Em certas modalidades, sequências que tiveram o códon otimizado para expressão em mamífero, são especificamente contempladas. A otimização de códon pode ser realizada usando técnicas e ferramentas conhecidas, por exemplo, usando a ferramenta GenScript® OptimiumGeneTM. As sequências com códon otimizado incluem sequências que apresentam códon parcialmente otimizado (isto é, pelo menos um códon é otimizado para expressão na célula hospedeira), e aquelas que apresentam códon completamente otimizado.
[00161] Portanto, em uma outra modalidade, uma abordagem de mutagênese, tal como mutagênese sítio-específica, pode ser empregada para a preparação de variantes e/ou derivados dos anticorpos, ou fragmentos de
65 / 152 ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos. Com esta abordagem, modificações específicas em uma sequência de polipeptídeo podem ser realizadas por meio da mutagênese dos polinucleotídeos sublinhados que codificam a mesma. Estas técnicas proveem uma abordagem direta para preparar e testar variantes de sequência, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações precedentes, introduzindo uma ou mais alterações de sequência de nucleotídeo no polinucleotídeo.
[00162] Mutagênese sítio-específica permite a produção de mutantes através do uso de sequências específicas de oligonucleotídeo, as quais codificam a sequência de DNA da mutação desejada, bem como um número suficiente de nucleotídeos adjacentes, para prover uma sequência iniciadora de tamanho suficiente e complexidade de sequência para formar um duplex estável em ambos os lados da junção de eliminação, que é transversa. Mutações podem ser empregadas em uma sequência selecionada de polinucleotídeo para melhorar, alterar, diminuir, modificar, ou alterar de outra forma as propriedades do próprio polinucleotídeo, e/ou alterar as propriedades, atividade, composição, estabilidade ou sequência principal do polipeptídeo codificado.
[00163] Em certas modalidades, os presentes inventores contemplam a mutagênese das sequências de polinucleotídeo que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo aqui descrito, ou uma variante do mesmo, para alterar uma ou mais propriedades do polipeptídeo codificado, tal como a afinidade de ligação com um antígeno de Lewis, de acordo com a presente descrição. Técnicas de mutagênese específicas são bem conhecidas na técnica, e são amplamente usadas para criar variantes tanto de polipeptídeos quanto de polinucleotídeos. Por exemplo, a mutagênese sítio- específica é frequentemente usada para alterar uma porção específica de uma molécula de DNA. Em tais modalidades, um oligonucleotídeo iniciador compreendendo tipicamente cerca de 14 a cerca de 25 nucleotídeos ou algo
66 / 152 assim em tamanho é empregado, com cerca de 5 a cerca de 10 resíduos em ambos os lados da junção da sequência sendo alterados.
[00164] Como será entendido pelos versados na técnica, técnicas de mutagênese sítio-específica frequentemente empregam um vetor fago, que existe tanto na forma de fita simples quanto fita dupla. Os vetores típicos úteis na mutagênese sítio direcionada incluem vetores tal coo o fago M13. Estes fagos são facilmente disponíveis comercialmente. Os plasmídeos de fita dupla também são rotineiramente empregados em mutagênese sítio direcionada, que elimina a etapa de transferir o gene de interesse a partir de um plasmídeo para um fago.
[00165] Em geral, mutagênese sítio-direcionada, de acordo com o presente, é realizada obtendo primeiro um vetor de fita simples ou fundindo independentemente duas fitas de um vetor de fita dupla, que inclui em sua sequência uma sequência de DNA que codifica o peptídeo desejado. Um oligonucleotídeo iniciador que carrega a sequência mutada desejada é preparado, em geral sinteticamente. Este oligonucleotídeo iniciador é enão anelado com o vetor de fita simples, e submetido às enzimas que polimerizam o DNA, tal como o fragmento polimerase I Klenow de E. coli, a fim de completar a síntese da fita que carrega a mutação. Assim, um heteroduplex é formado, em que uma fita codifica a sequência não mutada original e a segunda fita carrega a mutação desejada. Este vetor heteroduplex é então usado para transformar células apropriadas, tais como células de E. coli, e clones que são selecionados incluem vetores recombinantes que carregam o arranjo de sequência mutada.
[00166] A preparação de variantes de sequência dos segmentos de DNA que codificam o peptídeo selecionado, usando mutagênese sítio- direcionada, provê um meio de produzir espécie potencialmente usada, e não significa que seja limitante, uma vez que existem outras maneiras nas quais as variantes de sequência dos peptídeos e as sequências de DNA que codificam
67 / 152 as mesmas podem ser obtidas. Por exemplo, vetores recombinantes que codificam a sequência de peptídeo desejada podem ser tratados com agentes mutagênicos, tal como hidroxilamina, para obter varianates de sequência. Detalhes específicos com relação ao mesmos métodos e protocolos são encontrados nos preceitos de Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop e Bajpai, 1991; Kuby, 1994; e Maniatis et al., 1982, cada qual aqui incorporado pela referência, com este propósito.
[00167] Da maneira aqui usada, o termo “procedimento de mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo” se refere aos processos dependentes de molde e propagação mediada por vetor, que resultam em um aumento na concentração de uma molécula específica de ácido nucleico, com relação à sua concentração inicial, ou em um aumento na concentração de um sinal detectável, tal como amplificação. Da maneira aqui usada, o termo “procedimento de mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo” é pretendo para se referir a um processo que envolve a extensão dependente de molde de uma molécula de oligonucleotídeo iniciador. O termo processo dependente de molde se refere à síntese de ácido nucleico de uma molécula de RNA ou uma de DNA, em que a sequência da fita recentemente sintetizada de ácido nucleico é determinada pelas regras bem conhecidas de pareamento de base complementar (vide, por exemplo, Watson, 1987). Tipicamente, metodologias mediadas por vetor envolvem a introdução do fragmento de ácido nucleico em um vetor de DNA ou RNA, a amplificação clonal do vetor, e a recuperação do fragmento de ácido nucleico amplificado. Exemplos de tais metodologias são providos pela patente U.S. 4.237.224, especificamente aqui incorporada pela referência na sua íntegra.
[00168] Em uma outra abordagem para a produção de variantes de polipeptídeo, recombinação de sequência recursiva, da maneira descrita na patente U.S. 5.837.458, pode ser empregada. Nesta abordagem, ciclos repetitivos de recombinação e triagem, ou seleção, são realizados para
68 / 152 “evoluir” variantes do polinucleotídeo individual com, por exemplo, maior afinidade de ligação. Certas modalidades também proveem construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo da maneira aqui descrita.
[00169] O termo “vetor” é usado para se referir a qualquer molécula (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo ou vírus) usada para transferir informação codificante para uma célula hospedeira. O termo “vetor de expressão” se refere a um vetor que é adequado para a transformação de uma célula hospedeira, e contém sequências de ácido nucleico que direcionam e/ou controlam a expressão de sequências de ácido nucleico heterólogas inseridas. Os vetores de expressão que codificam anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos incluem vetores virais, tais como vetores lentivirais ou vetores γ-retrovirais. Vetores virais incluem retrovírus, adenovírus, parvovírus (por exemplo, vírus associados a adeno), coronavírus, vírus de RNA de fita negativa tais como orto-mixovírus (por exemplo, influenza vírus), rabdovírus (por exemplo, vírus da raiva e estomatite vesicular), paramyxovírus (por exemplo, sarampo e Sendai), vírus de RNA de fita positiva tais como picornavírus e alfavírus, e vírus de DNA de fita dupla, incluindo adenovírus, herpesvírus (por exemplo, Herpes vírus Simplex tipos 1 e 2, Epstein-Barr vírus, citomegalovírus), e poxvírus (por exemplo, vaccínia, varíola aviária e varíola dos canários). Outros vírus incluem Norwalk vírus, togavírus, flavivírus, reovírus, papovavírus, hepadnavírus e vírus de hepatite, por exemplo. Exemplos de retrovírus incluem leucose-sarcoma aviário, vírus de mamífero tipo C, tipo B, vírus tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivírus, espumavírus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott- Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
[00170] “Vetor lentiviral”, da maneira aqui usada, significa vetores lentivirais à base de HIV para liberação de gene, que podem ser integrativos
69 / 152 ou não integrativos, apresentam capacidade de empacotamento relativamente grande, e podem transduzir uma faixa de diferentes tipos celulares. Os vetores lentivirais são em geral gerados após transfecção transiente de três ou mais plasmídeos (empacotamento, envelope e transferência) em células produtoras. Como HIV, vetores lentivirais entram na célula alvo por meio da interação de glicoproteínas da superfície viral com os receptores na superfície celular. Na entrada, o RNA viral passa por transcrição reversa, que é mediada pelo complexo de transcriptase reversa viral. O produto de transcrição reversa é um DNA viral linear de fita dupla, que é o substrato para integração viral no DNA de células infectadas.
[00171] De acordo com certas modalidades relacionadas, é provida uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções da maneira aqui descrita; um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou variante do mesmo; e um método para produzir o produto codificado, cujo método compreende a expressão do ácido nucleico que codifica o mesmo. A expressão pode ser convenientemente atingida cultivando em condições apropriadas uma célula hospedeira recombinante contendo o ácido nucleico (por exemplo, em um vetor da presente descrição). Após produção pela expressão, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser isolado e/ou purificado usando qualquer técnica adequada, e a seguir usado da maneira desejada.
[00172] Sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de diferentes células hospedeiras são bem conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamífero, sistemas de levedura e baculovírus. As linhagens celulares de mamífero disponíveis na técnica para a expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster Chinês, células HeLa, células renais de hamster bebê (por exemplo, células HEK, tais como células HEK293-c18), células de melanoma
70 / 152 de camundongo NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano preferido comum é E. coli.
[00173] A expressão de peptídeos em células procariotas, tal como E. coli, é bem estabelecida na técnica. Para uma revisão vide por exemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucariotas na cultura também está disponível aos versados na técnica como uma opção para a produção de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, vide revisões recentes, por exemplo, Ref, M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J. J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.
[00174] Os vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo sequências regulatórias apropriadas, incluindo sequências promotoras, sequências finalizadoras, sequências de poliadenilação, sequências melhoradoras, genes marcadores e outras sequências da maneira apropriada. Vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, fago, ou fagemídeo, como apropriado. Para detalhes adicionais vide, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2ª edição, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, introdução de DNA nas células e expressão de genes, e análise de proteínas, são descritos em detalhes em Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992, ou atualizações subsequentes do mesmo.
[00175] O termo “célula hospedeira” é usado para se referir a uma célula na qual foi introduzida, ou que é capaz de ter introduzida nela, uma sequência de ácido nucleico que codifica um ou mais de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos, e que expressa adicionalmente ou é capaz de expressar um gene de interesse selecionado, tal
71 / 152 como um gene que codifica qualquer anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito. O termo inclui a progênie da célula parental, quer a progênie seja idêntica ou não em morfologia ou em constituição genética ao parental original, contanto que o gene selecionado esteja presente. Dessa maneira, também é contemplado um método que compreende introduzir tal ácido nucleico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, técnicas adequadas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-Dextran, eletroporação, transfecção mediadas por lipossomo e transdução usando retrovírus ou outro vírus, por exemplo, vaccínia ou, em relação a células de inseto, baculovírus. Em relação às células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir transformação com cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófago. A introdução pode ser seguida causando ou permitindo a expressão do ácido nucleico, por exemplo, cultivando células hospedeiras em condições para expressão do gene. Em uma modalidade, o ácido nucleico é integrado no genoma (por exemplo, cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrões.
[00176] A presente invenção também provê, em certas modalidades, um método que compreende usar uma construção, da maneira declarada anteriormente, em um sistema de expressão, a fim de expressar um polipeptídeo particular tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da maneira aqui descrita. O termo “transdução” é usado para se referir à transferência de genes de uma bactéria para outra, em geral por um fago. “Transdução” também se refere à aquisição e transferência de sequências de célula eucariota por retrovírus. O termo “transfecção” é usado para se referir à absorção do DNA externo ou exógeno por uma célula, e uma célula foi “transfectada” quando o DNA exógeno foi introduzido dentro de uma membrana celular. Inúmeras técnicas de transfecção são bem conhecidas
72 / 152 na tecnologia e são aqui descritas. Vide, por exemplo, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; e Chu et al., 1981, Gene 13:197. Tais técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais frações exógenas de DNA em células hospedeiras adequadas.
[00177] O termo “transformação”, da maneira aqui usada, se refere a uma alteração em uma característica genética da célula, e uma célula foi transformada quando foi modificada para conter um novo DNA. Por exemplo, uma célula é transformada, onde é geneticamente modificada a partir de seu estado natural. Após transfecção ou transdução, o DNA transformante pode recombinar com aquele da célula integrando fisicamente em um cromossomo da célula, ou pode ser mantido transientemente como um elemento epissomal sem ser replicado, ou pode replicar independentemente como um plasmídeo. Uma célula foi considerada estavelmente transformada quando o DNA é replicado com a divisão da célula. O termo “de ocorrência natural” ou “natural”, quando usado em conjunto com materiais biológicos, tal como moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos, células hospedeiras e similares, se refere aos materiais que são encontrados na natureza e não são manipulados por um humano. Similarmente, “de ocorrência não natural” ou “não natural”, da maneira aqui usada, se refere a um material que não é encontrado na natureza, ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado por um humano.
[00178] Será entendido que a prática das várias modalidades da presente invenção empregarão, a menos que indicado especificamente o contrário, métodos convencionais em virologia, imunologia, microbiologia, biologia molecular e técnicas de DNA recombinante que são conhecidos pelos versados na técnica, e muitos dos quais são descritos a seguir com o propósito de ilustração. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Vide,
73 / 152 por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology ou Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.Y.(2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3ª ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook e Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª Edição, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) e outras referências do tipo.
[00179] Certas modalidades atualmente descritas se referem à detecção e caracterização de atividade de ligação imunológica específica (por exemplo, atividade de ligação ao anticorpo), que é direcionada às estruturas antigênicas definidas por carboidrato. Os versados na técnica entenderão que existem várias metodologias pelas quais são gerados e testados reagentes imunológicos específicos de carboidrato, incluindo caracterização estrutural final de antígenos de carboidrato cognato. Exemplos não limitantes de tais tecnologias são descritos em Haji-Ghassemi et al., 2015 Glybiol. 25:920; Dingjan et al., 2015 Mol. Immunol. 67(2 Pt A):75-88; Soliman et al., 2017 Curr. Opin. Struct. Biol. 44:1-8; e Hakomori, 2001 Adv. Exp. Med. Biol. 491:369-402; e nas referências citadas nestes. Também podem ser encontradas em outro local descrições de fontes de antígenos definidos por carboidrato, e métodos para sua preparação, isolamento e caracterização estrutural. São aqui descritas aplicações exemplares e não limitantes de tais abordagens, e a presente descrição não é pretendida para ser dessa maneira limitada, e também contempla preparação sintética de antígenos de carboidratos estruturalmente definidos, incluindo pela exploração da requintada especificidade das enzimas biossintéticas conhecidas na técnica, como glicosiltransferases. Vide, por exemplo, Wu et al., Universal
74 / 152 phosphatase-coupled glycosyltransferase assay, Glycobiology 21(6): 727-733, 2011; Becker et al., Fucose: biosynthesis and biological function in mammals, Glycobiology 13(7): 41R-53R, 2003; de Vries et al., Fucosyltransferases: structure/function studies, Glycobiology 11(10): 119R– 128R, 2001.
[00180] Técnicas padrões podem ser usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeo, e cultura tecidual e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofeção). As reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante, ou da maneira comumente realizada na técnica, ou da maneira aqui descrita.
[00181] Estas técnicas e procedimentos, e outros relacionados, podem ser realizados no geral de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica, e da maneira descrita em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas em toda a presente especificação. Definições menos específicas são providas, a nomenclatura utilizada em conexão com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de, biologia molecular, química analítica, química orgânica sintética, e química farmacêutica medicinal aqui descrita são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrões podem ser usadas para tecnologia recombinante, biologia molecular, microbiologia, síntese química, análise de produtos químicos, preparação de produtos farmacêuticos, formulação e liberação, e tratamento de pacientes, aqui descritos adicionalmente.
COMPOSIÇÕES
[00182] Em certos aspectos, a presente descrição provê anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, bem como variantes dos mesmos, e composições compreendendo os mesmos. Em certas modalidades, um anticorpo isolado que é provido compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:
75 / 152 10, e uma cadeia leve de imunoglobulina com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 11.
[00183] Em certas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que é provido compreende : uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 35; e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 5, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno monoantenário H tipo 2 que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno biantenário H tipo 2 que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno monoantenário H tipo 1 que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].
[00184] Em outras modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de
76 / 152 ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (VH CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (VH CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 3; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (VH CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4; e (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (VL CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6; uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (VL CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7; e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (VL CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8; em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II],
[00185] a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que
77 / 152 compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno monoantenário H tipo 2 que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno biantenário H tipo 2 que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno monoantenário H tipo 1 que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].
[00186] Em certas modalidades atualmente descritas, um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é monoclonal.
[00187] Em certas modalidades atualmente descritas, um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é humanizado.
[00188] Em certas modalidades, um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é selecionado de um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fv, um anticorpo de cadeia Fv simples (ScFv), e um diacorpo.
[00189] Ainda em certas outras modalidades, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é provido, compreendendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 35; e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 5, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo
78 / 152 Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno monoantenário H tipo 2 que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno biantenário H tipo 2 que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno monoantenário H tipo 1 que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].
[00190] Em certas modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (VH CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:2; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (VH CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:3; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (VH
79 / 152 CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:4; e (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (VL CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:6; uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (VL CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7; e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (VL CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8.
[00191] Em outras modalidades, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende (i), (ii), (iii), (iv), (v), ou (vi) da maneira a seguir, ou qualquer combinação dos mesmos: (i) uma VH CDR1 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2, em que a variante consiste em uma substituição Y→A na posição 33, de acordo com numeração Kabat; (ii) uma VH CDR3 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4, em que a variante consiste em uma substituição Y→A na posição 104, de acordo com numeração Kabat; (iii) uma VH CDR3 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em
80 / 152 SEQ ID NO: 4, em que a variante consiste em uma substituição H→A na posição 106, de acordo com numeração Kabat; (iv) uma VL CDR1 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6, em que a variante consiste em uma substituição Y→A na posição 30, de acordo com numeração Kabat; (v) uma VL CDR2 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7, em que a variante consiste em uma substituição G→A na posição 50, de acordo com numeração Kabat; ou (vi) uma VL CDR3 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8, em que a variante consiste em um T→S substituição na posição 93, de acordo com numeração Kabat.
[00192] Em quaisquer das modalidades aqui descritas, um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode apresentar ligação reduzida (por exemplo, diminuída de uma maneira estatisticamente significativa) a um antígeno de Lewis B monoantenário ou um Lewis Y monoantenário, comparado ao anticorpo BBC, que compreende um domínio VL com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 27, e um domínio VH com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:28.
[00193] Em certas modalidades adicionais, é provido um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende CDRs da maneira aqui descrita (isto é, CDRs com pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NOs:2, 3, 4, 6, 7, e 8, respectivamente, incluindo aquelas variantes de CDR com as substituições de aminoácido aqui descritas), e compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 35; e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende ou consiste em uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
81 / 152 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:5.
[00194] Anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, tais como aqueles aqui descritos incluindo, mas sem limitação, scFv, em certas modalidades podem ser compreendidos de uma proteína de fusão que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno de Lewis, da maneira aqui descrita. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão é capaz de expressar em uma superfície de uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula T, célula NK, ou célula NK-T, e compreende um componente extracelular compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, da maneira aqui descrita, e um componente intracelular compreendendo um domínio efetor, que é capaz de promover diretamente ou indiretamente uma resposta imunológica em uma célula (por exemplo, célula do sistema imune, tal como uma célula T) durante o recebimento de um sinal apropriado (por exemplo, um domínio efetor de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, ou qualquer combinação dos mesmos), em que o componente extracelular e o componente intracelular são conectados por um domínio transmembrana (por exemplo, um domínio transmembrana CD8, um domínio transmembrana CD4, um domínio transmembrana CD27, ou um domínio transmembrana CD28), e o componente intracelular compreende opcionalmente um domínio co-estimulador ou porção do mesmo, selecionado de CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, um componente extracelular de uma proteína de fusão, compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição, compreende um polipeptídeo derivado de uma
82 / 152 proteína imunoglobulina; por exemplo, uma dobradiça-CH2-CH3 de IgG4.
[00195] Nestas e nas modalidades relacionadas, um fragmento de ligação ao antígeno pode compreender um fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito, tal como um scFv, e o componente extracelular pode compreender adicionalmente uma região conectora compreendendo uma dobradiça; por exemplo, em uma molécula receptora de antígeno quimérico (CAR), que pode ser expressa em uma superfície celular de uma célula hospedeira, tal como uma célula T, uma célula NK, ou uma célula NK-T para uso em uma imunoterapia celular. Moléculas CAR e princípios de projeto são descritos em, por exemplo: Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388 (2013); Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016); Stone et al., Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163 (2014); Xu et al., 2018 Oncotarget 9:13991; Androulla et al., 2018 Curr. Pharm. Biotechnol. Volume 19 (Abril de 2018); Wu et al., 2016 Expert Opin. Biol. Ther. 16:1469; Ren et al., 2017 Protein Cell 8:634; cujas moléculas CAR, projetos de CAR, e princípios de projeto de CAR são aqui incorporados pela referência na sua íntegra.
[00196] São também aqui providos os conjugados do anticorpo que compreendem um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente descrição; e uma molécula de carga útil ligada ao mesmo. Neste contexto, anticorpos monoclonais que alvejam especificamente antígenos podem ser úteis como moléculas carreadoras para liberar uma molécula terapêutica ou de carga útil detectável em um sítio de expressão de antígeno, por exemplo, uma célula de tumor que expressa o antígeno. A ligação por um conjugado do anticorpo ao antígeno pode permitir, por exemplo, liberação alvejada de uma carga citotóxica ou uma fração detectável em uma célula ou tecido doente para tratamento, ou detecção, imageamento, ou monitoramento de uma doença, por exemplo, um câncer. Em certas modalidades, um conjugado do anticorpo é internalizado por uma célula alvo que expressa o
83 / 152 antígeno após ou mediante ligação pelo conjugado de anticorpo. A internalização no citossol ou em um compartimento lisossomal da célula alvo pode permitir liberação seletiva de uma molécula de carga útil, por exemplo, para causar dano citotóxico à célula alvo.
[00197] Várias técnicas podem ser usadas para acoplar uma molécula de carga útil a um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para formar um conjugado do anticorpo da presente descrição. Em algumas modalidades, um conjugado do anticorpo compreende molécula de carga útil que é covalentemente ligada por um ligante ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Ligantees úteis em conjugados do anticorpo compreendendo agentes citotóxicos ou anti-proliferativos (por exemplo, conjugados anticorpo-fármaco) são tipicamente compostos orgânicos que estão em um dos dois grupos, organizados de acordo com o mecanismo pelo qual a molécula de carga útil é liberada da molécula carreadora. Os ligantees cliváveis são projetados para serem degradados ou clivados seletivamente, de acordo com uma propriedade inerente da célula alvo: três tipos de ligantees cliváveis são ligantees sensíveis à protease (em que a clivagem do ligante, por exemplo, um ligante compreendendo um dipeptídeo valina-citrulina ou fenilalanina-lisina, ou um tetrapeptídeo (por exemplo, GFLG ou ALAL), por proteases presente em um lisossomo de célula de tumor libera a molécula de carga útil); ligantees sensíveis ao pH, contendo um grupo lábil ao ácido, que é hidrolisado seletivamente pelo menor pH dos compartimentos endossomais e lisossomais, com relação ao pH citossólico; e ligantees sensíveis à glutationa, que compreendem uma ponte de dissulfeto que é reduzida por glutationa intracelular. Ligantees não cliváveis dependem da degradação não específica do conjugado do anticorpo para liberar a molécula de carga útil.
[00198] Ligantees específicos, cargas, químicas do ligante, e mecanismos e métodos relacionados são descritos em Nareshkumar et al., Pharm. Res. 32:3526-3540 (2015), cujas composições, métodos e técnicas são
84 / 152 aqui incorporadas pela referência na sua íntegra. Em certas modalidades, um conjugado do anticorpo que compreende um ligante é selecionado de um ligante clivável e um ligante não clivável. Em modalidades adicionais, o ligante é um ligante clivável selecionado de um ligante sensível à protease, um ligante sensível ao pH, ou um ligante sensível à glutationa. Em modalidades específicas, um ligante clivável é um ligante sensível à protease compreendendo um dipeptídeo valina-citrulina.
[00199] Um ligante pode ser conectado ou acoplado ao anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, usando qualquer técnica ou mecanismo apropriado. Em algumas modalidades, um ligante compreende um grupo maleimida (opcionalmente PEGuilado) capaz de reagir com uma ponte de dissulfeto reduzida, em uma região de dobradiça do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Outros sítios na molécula carreadora (isto é, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) adequados para conjugação a um ligante podem ser introduzidos ou geneticamente modificados, usando técnicas recombinantes, tal como introduzir resíduos de cisteína ou aminoácidos não naturais para a conjugação sítio-específica. Os métodos para introduzir tais modificações incluem, por exemplo, o método descrito nos exemplos 6.3-7 da publicação PCT WO 2012/032181.
[00200] Em algumas modalidades, um ligante compreende adicionalmente um grupo autodestrutivo, também referido como um grupo auto-imolativo ou um espaçador auto-imolativo, para auxiliar em uma reação de clivagem seletiva. Em certas modalidades, o grupo autodestrutivo é álcool para-aminobenzílico (PABC).
[00201] Químicas click usadas para gerar conjugados do anticorpo incluem aquelas descritas em Meyer et al., Bioconjug. Chem. 27(12):2791- 2807 (2016), e são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.
[00202] Em quaisquer dos conjugados do anticorpo aqui descritos, a
85 / 152 molécula de carga útil pode ser selecionada de um agente terapêutico e um indicador detectável. Agentes terapêuticos adequados para terapia de câncer incluem aqueles descritos em Parslow et al., Biomedicines 4:14 (2016), cujas cargas e princípios de projeto de ADC são aqui incorporados pela referência. Em certas modalidades, a molécula de carga útil é um agente terapêutico selecionado de um agente anti-mitótico que alveja tubulina, uma toxina à base de peptídeo, um dímero de pirrolobenzodiazepina (PBD), um antibiótico (por exemplo, caliqueamicina), um inibidor da síntese de pirimidina (por exemplo, 5-fluoruracil), um antimetabólito (por exemplo, metotrexato), um agente de alquilação de DNA, e um inibidor de topoisomerase (por exemplo, doxorubicina). Em modalidades adicionais, a molécula de carga útil é selecionada de um maintansinóide, uma auristatina, monometilauristatina E (MMAE), e monometilauristatina F (MMAF).
[00203] Em outras modalidades, a molécula de carga útil é um indicador detectável. Indicadores detectáveis adequados para uso em conjugados de anticorpo, bem como estratégias de marcação relacionadas e técnicas de imageamento (por exemplo, PET, MRI, NIR), incluem aqueles descritos em Friese e Wu, Mol. Immunol. 67(200):142-152 (2015) e Moek et al., J. Nucl. Med. 58:83S-90S (2017), todos os quais são aqui incorporados pela referência. Em certas modalidades, o indicador detectável é selecionado de um radionuclídeo, um corante, um radiometal, uma fração fluorescente, um agente de contraste MRI, uma microbolha, um nanotubo de carbono, uma partícula de ouro, fluordesoxiglicose, uma enzima, um cromóforo, e um marcador radiopaco. Em modalidades específicas, o indicador detectável é um 68 64 86 89 124 99m 123 111 radionuclídeo selecionado de Ga, Cu, Y, Zr, I, Tc, I, In, 177 131 Lu, I, 76Br, 78Zr, 18F, e 124 T. Em certas tais modalidades, um conjugado do anticorpo compreende adicionalmente um quelante de radionuclídeo selecionado de DOTA marcado com maleimida, N-hidroxisuccinimida- DOTA, e desferrioxamina (DFO).
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[00204] São também aqui providas composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo da presente descrição; e um carreador farmacêutico.
[00205] Em um outro aspecto, a presente descrição provê polinucleotídeo isolados que codificam um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da maneira aqui descrita, cujos polinucleotídeos incluem variantes de sequência com pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência comparada a uma sequência de nucleotídeo específica aqui descrita. Em certas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, incluindo um scFv, um Fab, um fragmento F(ab’2) f, um fragmento Fv, ou um diacorpo) da presente descrição, ou que codifica uma porção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, uma cadeia pesada, uma cadeia leve, VH, um VL, ou uma CDR), apresenta pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência da maneira comparada a qualquer uma de SEQ ID NOs:12-22 ou 37. Em certas modalidades, o polinucleotídeo é otimizado por códon para expressão em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula de mamífero. Em quaisquer das modalidades anteriormente mencionadas, um polinucleotídeo pode ser provido em um vetor recombinante. Em certas modalidades, um vetor compreende uma sequência de controle de expressão operavelmente ligada ao polinucleotídeo que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em certas tais modalidades, o vetor (por exemplo, vetor recombinante) é um vetor de expressão em que a sequência de controle de
87 / 152 expressão compreende um promotor.
[00206] Em um outro aspecto, células hospedeiras que são providas compreendem um vetor recombinante ou um vetor de expressão da maneira aqui descrita. Em um aspecto relacionado, os métodos são providos para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno monoantenário H tipo 2 que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno biantenário H tipo 2 que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno monoantenário H tipo 1 que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV], em que os métodos compreendem cultivar uma célula hospedeira da presente descrição em condições e por um tempo suficientes para expressão pela célula hospedeira do polinucleotídeo que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para obter por
88 / 152 meio disso uma cultura compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e recuperar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a partir da cultura.
MÉTODOS E USOS PARA DETECTAR E TRATAR DOENÇA
[00207] Em certas modalidades, os anticorpos atualmente descritos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, e conjugados do anticorpo são úteis em métodos para detectar ou tratar uma doença caracterizada pela expressão (por exemplo, superexpressão) de um antígeno de Lewis da maneira aqui descrita.
[00208] Da maneira entendida pelos versados na técnica médica, os termos “tratar” e “tratamento” se referem ao gerenciamento médico de uma doença, distúrbio, ou condição de um sujeito (isto é, paciente, hospedeiro, que pode ser um humano ou animal não humano) (vide, por exemplo, dicionário médico de Stedman). Em geral, uma dose apropriada e regime de tratamento proveem um ou mais de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo em uma quantidade suficiente para prover benefício terapêutico ou profilático. O benefício terapêutico ou profilático que resulta do tratamento terapêutico ou métodos profiláticos ou preventivos incluem, por exemplo, um melhor resultado clínico, em que o objetivo é prevenir ou retardar, ou de outra forma reduzir (por exemplo, diminuir de uma maneira estatisticamente significativa em relação a um controle não tratado) uma alteração fisiológica ou distúrbio indesejado, ou prevenir, retardar ou reduzir de outra forma a expansão ou gravidade de uma doença ou distúrbio como este. Os resultados clínicos benéficos ou desejados a partir do tratamento de um sujeito incluem redução, diminuição ou alívio dos sintomas que resultam ou estão associados à doença ou distúrbio a ser tratado; ocorrência diminuída dos sintomas; melhor qualidade de vida; estado sem doença mais longo (isto é, diminuir a probabilidade ou a propensão de que um sujeito apresente sintomas, com base nos quais um diagnóstico de uma doença
89 / 152 é realizado); diminuição da extensão da doença; estado estabilizado (isto é, sem piora) da doença; retardar ou desacelerar a progressão da doença; melhora ou paliação do estado da doença; e remissão (seja parcial ou total) seja detectável ou não detectável; ou sobrevivência total.
[00209] “Tratamento” também pode significar prologar a sobrevivência quando comparada à sobrevivência esperada, se um sujeito não tiver recebido tratamento. Sujeitos que precisam dos métodos e composições aqui descritos incluem aqueles que já apresentaram a doença ou distúrbio, bem como sujeitos propensos a apresentar ou em risco de desenvolver a doença ou distúrbio. Sujeitos que precisam de tratamento para reduzir a probabilidade de ocorrência ou recorrência da doença ou distúrbio, ou que precisam de tratamento profilático podem incluir sujeitos nos quais a doença, condição ou distúrbio será reduzido em gravidade, ou parcialmente ou completamente evitado ou incompletamente ou completamente prevenido (por exemplo, diminuir a probabilidade de ocorrência ou recorrência da doença ou distúrbio, o que pode incluir, mas não necessariamente exigir, prevenção absoluta). O benefício clínico provido pelas composições (e preparações compreendendo as composições) e métodos aqui descritos pode ser avaliado por elaboração e execução de ensaios in vitro, estudos pré- clínicos e estudos clínicos em sujeitos para os quais a administração das composições é pretendida para beneficiar, da maneira descrita nos exemplos.
[00210] Por exemplo, em certas modalidades, são providos métodos para tratar ou detectar câncer (isto é, um câncer que expressa um antígeno de Lewis, da maneira aqui descrita), em que os métodos compreendem administrar uma composição farmacêutica da presente descrição a um sujeito que precisa do mesmo. Da maneira aqui usada, “câncer” se refere a uma condição caracterizada por proliferação anormal ou descontrolada (por exemplo, hiperproliferação) de células doentes, o que pode ser caracterizado pela dispersão maligna de um primeiro tecido ou sítio para um tecido, ou
90 / 152 tecidos e sítios adjacentes ou distantes no corpo.
[00211] Em modalidades particulares dos métodos, o sujeito apresenta ou é suspeito de apresentar um câncer que é selecionado de câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer linfático, câncer de fígado, câncer de ovário, pancreático, câncer de próstata, câncer uterino e carcinoma de célula escamosa. Em modalidades adicionais, o câncer é selecionado de um adenocarcinoma gástrico, um adenocarcinoma mucinoso de estômago, um adenocarcinoma gástrico não diferenciado, um carcinoma gástrico de célula em anel de sinete, um adenocarcinoma de cólon, um carcinoma ductal de mama invasivo, um carcinoma hepatocelular, um adenocarcinoma pulmonar, um carcinoma de célula escamosa, um adenocarcinoma de linfonodo metastático, um adenocarcinoma ovariano mucinoso, um adenocarcinoma ductal pancreático, um adenocarcinoma papilar pancreático, um adenocarcinoma de próstata, e um de próstata endometrióide. A administração dos anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, ou conjugados do anticorpo aqui descritos, na forma pura ou em uma composição farmacêutica apropriada, pode ser realizada por meio de quaisquer dos modos de administração aceitos de agentes para serviços de utilidade similares. As composições farmacêuticas podem ser preparadas combinando um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo com um carreador, diluente ou excipiente fisiologicamente apropriado, e podem ser formuladas em preparações nas formas sólidas, semissólidas, líquidas ou gasosas contendo micropartícula (por exemplo, microgotícula), tais como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, emplastros, soluções, supositórios, injeções, inaladores, géis, microesferas e aerossóis. Além disso, outros ingredientes farmaceuticamente ativos (incluindo outros agentes imunosupressores, da maneira aqui descrita em outra parte) e/ou excipientes adequados, tais como sais, tampões e estabilizantes podem estar presentes, mas não necessariamente, na composição.
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[00212] A dosagem exata e duração de tratamento pode ser uma função da condição ou doença que está sendo tratada, e pode ser determinada empiricamente usando protocolos de testes conhecidos, ou testando as composições em sistemas de modelo conhecidos na técnica e extrapolando dos mesmos. Testes clínicos controlados também podem ser realizados. Dosagens também podem variar com a gravidade da condição a ser aliviada. Uma composição farmacêutica é em geral formulada e administrada para exercer um efeito terapeuticamente usado, minimizando ao mesmo tempo efeitos colaterais indesejados. A composição pode ser administrada uma vez, ou pode ser dividida em inúmeras doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. Para qualquer sujeito particular, regimes de dosagem específicos podem ser ajustados com o tempo, de acordo com a necessidade individual.
[00213] Uma “quantidade eficiente” de uma composição se refere a uma quantidade suficiente, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir os resultados clínicos desejados ou tratamento benéfico, da maneira aqui descrita. Uma quantidade eficiente pode ser liberada em uma ou mais administrações. Se a administração for em um sujeito já conhecido ou confirmado por apresentar uma doença ou estado de doença, o termo “quantidade terapêutica” pode ser usado em referência ao tratamento, ao passo que “quantidade profilaticamente eficiente” pode ser usada para descrever a administração de uma quantidade eficiente em um sujeito que é susceptível a, ou em risco de desenvolver uma doença ou estado de doença (por exemplo, recorrência) como um curso benéfico e/ou protetor de reduzir (por exemplo, de uma maneira estatisticamente significativa com relação a um estado não tratado) a probabilidade de ocorrência e/ou gravidade da doença ou estado da doença.
[00214] Em várias modalidades, um conjugado do anticorpo da presente descrição compreende uma carga detectável, da maneira aqui
92 / 152 descrita, e pode ser usado para detectar uma doença tal como um câncer tanto in vivo, in vitro, quanto ex vivo. Em certas das mesmas e outras modalidades, os anticorpos (isto é, um ou mais anticorpo) ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos são conjugados (por exemplo, covalentemente) em uma marca detectável, que pode ser detectada diretamente ou indiretamente. Na presente descrição, quaisquer dos anticorpos monoclonais, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, e conjugados do anticorpo descritos podem ser ligados a uma marca detectável (por exemplo, além de uma molécula de carga útil detectável ou terapêutica de um conjugado de anticorpo). Na “detecção direta”, apenas um anticorpo detectável é usado, isto é, um anticorpo detectável primário. Assim, a detecção direta significa que o anticorpo que é conjugado a uma marca detectável pode ser detectado, per se, sem a necessidade da adição de um segundo anticorpo (anticorpo secundário).
[00215] Uma “marca detectável” é uma molécula ou material que pode produzir um sinal detectável (tal como visualmente, eletronicamente ou de outra forma) que indica a presença e/ou concentração da marca em uma amostra. Quando conjugada em um peptídeo, a marca detectável pode ser usada para localizar e/ou quantificar o alvo, no qual o peptídeo específico é ligado. Por meio disso, a presença e/ou concentração do alvo em uma amostra pode ser detectada pela detecção do sinal produzido pela marca detectável. Uma marca detectável pode ser detectada diretamente ou indiretamente, e várias marcas detectáveis diferentes conjugadas em diferentes anticorpos específicos podem ser usadas em combinação para detectar um ou mais alvos.
[00216] Exemplos de marcas detectáveis, que podem ser detectadas diretamente, incluem corantes fluorescentes e substâncias radioativas, e partículas metálicas. Ao contrário, a detecção indireta exige a aplicação de um ou mais anticorpos adicionais, isto é, anticorpos secundários, após aplicação do anticorpo primário. Assim, a detecção é realizada pela detecção da ligação
93 / 152 do anticorpo secundário ou agente de ligação ao anticorpo primário detectável. Exemplos de agentes de ligação detectáveis primários, ou anticorpos que exigem a adição de um agente de ligação ou ou anticorpo secundário, incluem agentes de ligação detectáveis enzimáticos e agentes de ligação ou anticorpos detectáveis por hapteno.
[00217] Em algumas modalidades, a marca detectável é conjugada em um polímero de ácido nucleico que compreende o primeiro agente de ligação (por exemplo, em um processo ISH, WISH ou FISH). Em outras modalidades, a marca detectável é conjugada a um anticorpo que compreende o primeiro agente de ligação (por exemplo, em um processo IHC).
[00218] Exemplos de marcas detectáveis que podem ser conjugadas com os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, e conjugados do anticorpo úteis nos métodos da presente descrição incluem marcas fluorescentes, marcas enzimáticas, radioisótopos, marcas quimioluminescentes, marcas eletroquimioluminescentes, marcas bioluminescentes, polímeros, partículas de polímero, partículas de metal, haptenos e corantes.
[00219] Exemplos de marcas fluorescentes incluem 5-(e 6)- carboxifluoresceína, 5- ou 6-carboxifluoresceína, ácido 6-(fluoresceína)-5-(e 6)-carboxamido hexanóico, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, e corantes tais como Cy2, Cy3, e Cy5, coumarina opcionalmente substituída, incluindo AMCA, PerCP, ficobiliproteínas incluindo R-ficoeritrina (RPE) e aloficoeritrina (APC), vermelho Texas, vermelho Princeton, proteína fluorescente verde (GFP) e análogos dos mesmos, e conjugados de R-ficoeritrina ou aloficoeritrina, marcas fluorescentes inorgânicas, tais como partículas à base de material semicondutor do tipo nanocristalitos de CdSe revestidos.
[00220] Exemplos de marcas de partícula de polímero incluem micropartículas ou partículas de látex de polistireno, PMMA ou sílica, que
94 / 152 podem ser embutidas com corantes fluorescentes, ou micelas ou cápsulas de polímero que contêm corantes, enzimas ou substratos.
[00221] Exemplos de marcas de partícula de metal incluem partículas de ouro e partículas revestidas de ouro, que podem ser convertidas por corantes prata. Exemplos de haptenos incluem DNP, isotiocianato de fluoresceína (FITC), biotina e digoxigenina. Exemplos de marcas enzimáticas incluem peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina (ALP ou AP), β-galactosidase (GAL), glicose-6-fosfato desidrogenase, β-N- acetilglucosamimidase, β-glucuronidase, invertase, Xantina Oxidase, luciferase de vagalume e glicose oxidase (GO). Exemplos de substratos comumente úteis para peroxidase de rábano silvestre incluem 3,3'- diaminobenzidina (DAB), diaminobenzidina com realce por níquel, 3-amino- 9-etilcarbazol (AEC), dicloridrato de benzidina (BDHC), reagente Hanker- Yates (HYR), azul Indophane (IB), tetrametilbenzidina (TMB), 4-cloro-1- naftol (CN), pironina .alfa.-naftol (.alfa.-NP), o-dianisidina (OD), 5-bromo-4- cloro-3-indolilfosfato (BCIP), Nitroazul de tetrazólio (NBT), cloreto de 2-(p- iodofenil)-3-p-nitrofenil-1-5-fenil tetrazólio (INT), tetranitroazul de tetrazólio (TNBT), 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-galactosídeo/ferro-ferricianida (BCIG/FF).
[00222] Exemplos de substratos comumente úteis para fosfatase alcalina incluem Naftol-AS-B 1-fosfato/Fast Red TR (NABP/FR), Naftol-AS- MX-fosfato/Fast Red TR (NAMP/FR), Naftol-AS-B1-fosfato/- Fast Red TR (NABP/FR), Naftol-AS-MX-fosfato/Fast Red TR (NAMP/FR), Naftol-AS- B1-fosfato/nova fucsina (NABP/NF), bromocloroindolil fosfato/nitroazul de tetrazólio (BCIP/NBT), 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-b-- d-galactopiranosídeo (BCIG).
[00223] Exemplos de marcas luminescentes incluem luminol, isoluminol, ésteres de acridínio, 1,2-dioxetanos e piridopiridazinas. Exemplos de marcas eletroquimioluminescentes incluem derivados de rutênio.
95 / 152 Exemplos de marcas radioativas incluem isótopos radioativos de iodeto, cobalto, selênio, trítio, carbono, enxofre e fósforo.
[00224] Marcas detectáveis podem ser ligadas aos anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, e conjugados do anticorpo aqui descritos, ou a qualquer outra molécula que se liga especificamente a um marcador biológico de interesse, por exemplo, um anticorpo, uma sonda de ácido nucleico ou um polímero. Além disso, os versados na técnica entenderão que marcas detectáveis também podem ser conjugadas com segundos, e/ou terceiros, e/ou quartos e/ou quintos agentes de ligação ou anticorpos, etc. Além do mais, os versados na técnica entenderão que cada agente de ligação ou anticorpo adicional usado para caracterizar um marcador biológico de interesse pode funcionar como uma etapa de amplificação de sinal. O marcador biológico pode ser detectado visualmente usando, por exemplo, microscopia ótica, microscopia fluorescente, microscopia eletrônica, onde a substância detectável é, por exemplo, um corante, uma partícula de ouro coloidal, um reagente luminescente. As substâncias detectáveis visualmente, ligadas a um marcador biológico, também podem ser detectadas usando um espectrofotômetro. Onde a substância detectável é um isótopo radioativo, a detecção pode ser visualmente por autorradiografia, ou não visualmente usando um contador de cintilação. Vide, por exemplo, Larsson, 1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.); Methods in Molecular Biology, vol. 80 1998, John D. Pound (ed.) (Humana Press, Totowa, N.J.).
[00225] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em um método para detectar ou diagnosticar uma doença associada à expressão de um antígeno de Lewis, da maneira aqui descrita, em que o método compreende colocar o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo em contato com uma amostra de um sujeito suspeito
96 / 152 de apresentar, ou em risco de apresentar, a doença, e detectar a formação de um complexo anticorpo:antígeno, e/ou detectar ligação específica do anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo na amostra. Em certas modalidades, a amostra compreende sangue (por exemplo, sangue periférico), um tecido, um tumor, ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o método de diagnóstico ou detecção é realizado ex vivo ou in vitro.
[00226] Métodos para detecção in vivo de conjugados dos anticorpos com carga detectável ou marcas detectáveis incluem aqueles descritos em em Friese e Wu, Mol. Immunol. 67(200):142-152 (2015) e Moek et al., J. Nucl. Med. 58:83S-90S (2017), todos os quais são aqui incorporados pela referência. Em certas modalidades, detectar um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo compreende realizar Tomografia por emissão de pósitrons (PET), Imageamento por ressonância magnética (MRI), Imageamento por infravermelho próximo (NRI), Tomografia computadorizada com raios-X (CT), Tomografia computadorizada com emissão de fóton único (SPECT), Imageamento ótico, ultrassonografia ou qualquer combinação dos mesmos.
[00227] Modos de administração preferidos dependem da natureza da condição a ser tratada, que em certas modalidades se referirá a uma condição prejudicial ou clinicamente indesejável na extensão, gravidade, probabilidade de ocorrer e/ou duração, da qual pode ser diminuída (por exemplo, reduzida de uma maneira estatisticamente significativa em relação a uma situação controle apropriada, tal como um controle não tratado), de acordo com certos métodos aqui providos. Uma quantidade que, após administração, reduz de maneira detectável, inibe, previne pelo menos parcialmente, diminui a gravidade ou probabilidade de ocorrência de, ou retarda uma condição como esta, por exemplo, a redução parcial ou completa de uma carga tumoral, ou redução parcial ou completa de dispersão metastática, é considerada eficiente.
97 / 152 Os versados na técnica serão familiares com qualquer dos inúmeros critérios de diagnóstico, cirúrgico e/ou outros critérios clínicos que podem indicar a adequação clínica de, e/ou para a qual pode ser adaptada, administração das composições aqui descritas. Vide, por exemplo, Hanahan and Weinberg, 2011 Cell 144:646; Hanahan and Weinberg 2000 Cell 100:57; Cavallo et al., 2011 Canc. Immunol. Immunother. 60:319; Kyrigideis et al., 2010 J. Carcinog. 9:3; Park et al. 2009 Molec. Therap. 17:219; Cheever et al., 2009 Clin Cancer Res 15 (17):5323‐ 5337; Lu et al., 2013 Curr. Pharm. Biotechnol. 14:714-22; Layke et al., 2004 Am. Fam. Physician 69:1133049; Bunn, 2012 Arch. Pathol. Lab. Med. 136:1478-81; Manne et al., 2005 Drug Discov. Today 10:965; Schmoll et al. (Eds.), 2009 ESMO Handbook of Cancer Diagnosis and Treatment Evaluation, CRC Press, Boca Raton, FL; Faix, 2013 Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 50(1):23-36 (“Biomarkers of Sepsis”); Wiersinga et al., 2014 Virulence 5(1):36-44 (“Host innate immune responses to sepsis”); Hotchkiss et al., 2013 Nat. Rev. Immunol. 13:862; Aziz et al., 2013 J. Leukoc. Biol. 93(3):329; Beyrau et al., 2012 Open Biol. 2:120134; Fry, 2012 Amer. Surg. 78:1; Kellum et al., 2007 Arch. Intern. Med. 167(15):1655; Remick, 2007 Am. J. Pathol. 170(5):1435; Hotchkiss et al., 2003 New Engl. J. Med. 348:138- 150; Humar et al., Atlas of Organ Transplantation, 2006, Springer; Kuo et al., Comprehensive Atlas of Transplantation, 2004 Lippincott, Williams & Wilkins; Gruessner et al., Living Donor Organ Transplantation, 2007 McGraw-Hill Professional; Antin et al., Manual of Stem Cell and Bone Marrow Transplantation, 2009 Cambridge University Press; Wingard et al. (Ed.), Hematopoietic Stem Cell Transplantation: A Handbook for Clinicians, 2009 American Association of Blood Banks; e referências cistadas nestes.
[00228] As vias de administração típicas de administrar estas e outras composições farmacêuticas relacionadas incluem assim, sem limitação, oral, tópica, transdérmica, inalação, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal e intranasal. O termo parenteral, da maneira aqui usada, inclui injeções
98 / 152 subcutâneas, injeção intravenosa, intramuscular, intraesternal ou técnicas de infusão. Composições farmacêuticas de acordo com certas modalidades da presente invenção são formuladas de maneira a permitir que os ingredientes ativos contidos nestes estejam biodisponíveis mediante administração da composição a um paciente. Composições que serão administradas a um sujeito ou paciente podem assumir a forma de uma ou mais unidades de dosagem, por exemplo, onde um comprimido pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente aqui descrito de anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ou conjugados do anticorpo em forma de aerossol pode manter uma pluralidade de unidades de dosagem. Métodos atuais para preparar tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão evidentes, pelos versados na técnica; por exemplo, vide Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ª Edição (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). A composição a ser administrada conterá, em qualquer evento, uma quantidade terapeuticamente eficiente de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo da presente descrição, para tratamento de uma doença ou condição de interesse, de acordo com os preceitos aqui. Em certas modalidades, administrar compreende administrar por uma via que é selecionada de intravenosa, parenteral, intragástrica, intrapleural, intrapulmonar, intrarretal, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral, subcutânea, oral, tópica, transdérmica, intracisternal, intratecal, intranasal e intramuscular.
[00229] Uma composição farmacêutica pode estar na forma de um sólido ou líquido. Em uma modalidade, o(s) carreador(s) são particulados, de maneira tal que as composições estão, por exemplo, na forma de comprimido ou pó. O(s) carreadores(s) podem ser líquidos, com as composições sendo, por exemplo, um óleo oral, líquido injetável ou um aerossol, que é usado em, por exemplo, administração inalatória. Quando pretendida para administração oral, a composição farmacêutica está preferivelmente tanto na forma sólida
99 / 152 quanto na forma líquida, onde as formas semissólidas, semilíquida, suspensão e gel são incluídas nas formas aqui consideradas tanto como sólida quanto líquida.
[00230] Como uma composição sólida para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada em um pó, grânulo, comprimido prensado, pílula, cápsula, goma de mascar, hóstia ou similares. Uma composição líquida como esta conterá tipicamente um ou mais diluentes inertes ou carreadores comestíveis. Alpem disso, um ou mais dos seguintes pode estar presente: aglutinantes tais como carboximetilcelulose, etilcelulose, celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; excipientes tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes de desintegração tais como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e similares; lubrificantes tais como estearato de magnésio ou Sterotex; antiaderentes tais como dióxido de silicone coloidal; agentes adoçantes tais como sacarose ou sacarina; um agente flavorizante tal como hortelã-pimenta, metil salicilato ou flavorizante de laranja; e um agente de coloração. Quando a composição farmacêutica está na forma de uma cápsula, por exemplo, uma cápsula de gelatina, esta pode conter, além dos materiais do tipo anterior, um carreador líquido tal como polietileno glicol ou óleo.
[00231] A composição farmacêutica pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. O líquido pode ser para administração oral ou para liberação por injeção, como dois exemplos. Quando pretendida para administração oral, a composição preferida contém, além dos presentes compostos, um ou mais de um agente adoçante, conservantes, corante/colorante e intensificador de sabor. Em uma composição pretendida para ser administrada por injeção, um ou mais de um agente tensoativo, conservante, agente de umectação, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizante e agente isotônico agente podem ser incluídos.
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[00232] As composições farmacêuticas líquidas, quer sejam soluções, suspensões ou outro tipo de forma, podem incluir um ou mais dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis, tais como água para injeção, solução salina, preferivelmente salina fisiológica, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos tais como mono ou diglicerídeos sintéticos que podem funcionar como o solvente ou meio de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos tal como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminatetra-acético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajuste de tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico. A salina fisiológica é um adjuvante preferido. Uma composição farmacêutica injetável é preferivelmente estéril.
[00233] Uma composição farmacêutica líquida, pretendida tanto para administração parenteral quanto oral, pode conter uma quantidade de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo da maneira aqui descrita, de maneira tal que uma dosagem adequada será obtida. Tipicamente, esta quantidade é pelo menos 0,01% do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno na composição. Quando pretendida para administração oral, esta quantidade pode ser variada para estar entre 0,1 e cerca de 70% do peso da composição. Certas composições farmacêuticas orais contêm entre cerca de 4% e cerca de 75% do anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado de anticorpo. Em certas modalidades, composições farmacêuticas e preparações de acordo com a presente invenção são preparadas, de maneira tal que uma única dosagem parenteral contenha entre 0,01 a 10% em peso de anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo antes da diluição.
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[00234] A composição farmacêutica pode ser pretendida para administração tópica, caso no qual o carreador pode compreender adequadamente uma solução, emulsão, emplastro ou base de gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: petrolato, lanolina, polietileno glicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes tais como água e álcool, e emulsificantes e estabilizantes. Agentes espessantes podem estar presentes em uma composição farmacêutica para administração tópica. Se pretendida para administração transdérmica, a composição pode incluir um adesivo transdérmico ou dispositivo de iontoforese. A composição farmacêutica pode ser pretendida para administração retal, na forma, por exemplo, de um supositório, que derreterá no reto e liberará o fármaco. A composição para administração retal pode conter uma base oleaginosa como um excipiente não irritante adequado. Tais bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietileno glicol.
[00235] A composição farmacêutica pode incluir vários materiais que modificam a forma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam uma capa de revestimento em torno dos ingredientes ativos. Os materiais que formam a capa de revestimento são tipicamente inertes, e podem ser selecionados de, por exemplo, açúcar, goma-laca e outros agentes de revestimento entérico. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser encapsulados em uma cápsula de gelatina. A composição farmacêutica na forma sólida ou líquida pode incluir um agente que se liga ao anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo da invenção, e auxilia assim na liberação do composto. Agentes adequados que podem atuar com esta capacidade incluem anticorpos monoclonal ou policlonais, uma ou mais proteínas ou um lipossomo. A composição farmacêutica pode consistir essencialmente em unidades de dosagem que podem ser administradas como um aerossol. O termo aerossol é usado para indicar uma variedade de sistemas
102 / 152 que variam daqueles de natureza coloidal para sistemas que consistem em embalagens pressurizadas. A liberação pode ser por um gás liquefeito ou comprimido, ou por um sistema de bomba adequado que dispensa os ingredientes ativos. Aerossóis podem ser liberados em sistemas de fase única, bifásicos ou trifásicos, a fim de liberar o(s) ingrediente(s) ativo(s). A liberação do aerossol inclui o recipiente necessário, ativadores, válvulas, sub- recipientes e similares, que juntos podem formar um kit. Os versados na técnica podem determinar sem experimentação indevida os aerossóis preferidos.
[00236] As composições farmacêuticas podem ser preparadas por metodologia bem conhecida na técnica farmacêutica. Por exemplo, uma composição farmacêutica pretendida para ser administrada por injeção pode ser preparada combinando uma composição que compreende um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo da maneira aqui descrita e, opcionalmente, uma ou mais de sais, tampões e/ou estabilizantes com água destilada estéril, de maneira a formar uma solução. Um agente tensoativo pode ser adicionado para facilitar a formação de uma solução ou suspensão homogênea. Agentes tensoativos são compostos que interagem de maneira não covalente com a composição de peptídeo, de maneira a facilitar a dissolução ou suspensão homogênea do anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo no sistema de liberação aquoso.
[00237] As composições são administradas em uma quantidade terapeuticamente eficiente, que variará dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado; a estabilidade metabólica e a duração da ação do composto; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o modo e tempo de administração; a taxa de excreção; a combinação de fármaco; a gravidade do distúrbio ou condição particular; e o sujeito que é submetido à terapia. Em
103 / 152 geral, uma dose diária terapeuticamente eficiente é (para um mamífero de 70 kg) de cerca de 0,001 mg/kg (isto é, 0,07 mg) a cerca de 100 mg/kg (isto é, 7,0 g); preferivelmente, uma dose terapeuticamente eficiente é (para um mamífero de 70 kg) de cerca de 0,01 mg/kg (isto é, 0,7 mg) a cerca de 50 mg/kg (isto é, 3,5 g); mais preferivelmente, uma dose terapeuticamente eficiente é (para um mamífero de 70 kg) de cerca de 1 mg/kg (isto é, 70 mg) a cerca de 25 mg/kg (isto é, 1,75 g).
[00238] Composições compreendendo os anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ou conjugados do anticorpo da presente descrição também podem ser administradas simultaneamente com, antes de, ou após a administração de um ou mais outros agentes terapêuticos. Tal terapia de combinação pode incluir a administração de uma formulação de dosagem farmacêutica única, que contém um composto da invenção e um ou mais agentes ativos, bem como administração das composições compreendendo anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ou conjugados do anticorpo da invenção, e cada agente ativo em sua própria formulação de dosagem farmacêutica separada. Por exemplo, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo, da maneira aqui descrita, e o outro agente ativo podem ser administrados ao paciente juntos em uma composição de dosagem oral única, tal como um comprimido ou cápsula, ou cada agente administrado em formulações de dosagem oral separadas. De maneira similar, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo, da maneira aqui descrita, e o outro agente podem ser administrados ao paciente juntos, em uma composição de dosagem parenteral única tal como em uma solução salina, ou outra solução fisiologicamente aceitável, ou cada agente administrado em formulações de dosagem parenteral separadas. Onde separadas, as formulações de dosagem são usadas, as composições compreendendo anticorpos e um ou mais agentes ativos adicionais podem ser
104 / 152 administradas essencialmente ao mesmo tempo, isto é, simultaneamente, ou em vezes escalonadas separadamente, isto é, sequencialmente e em qualquer ordem; terapia de combinação é entendida para incluir todos estes regimes.
[00239] Assim, em certas modalidades, contempla-se também a administração de anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ou conjugados do anticorpo desta descrição em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Tais agentes terapêuticos podem ser aceitos na técnica como um tratamento padrão para um estado de doença particular, da maneira aqui descrita, tal como um câncer. Agentes terapêuticos exemplares contemplados incluem citocinas, fatores de crescimento, esteroides, NSAIDs, DMARDs, anti-inflamatórios, quimioterapêuticos, inibidores do ponto de controle imunológico, RNAs de interferência, agonistas de molécula de ponto de controle imunológico estimulatório, um outro anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo que alveja o câncer, ou outros agentes ativos e agentes auxiliares.
[00240] Da maneira aqui usada, o termo “agente de supressão imune” ou “agente de imunossupressão” se refere a uma ou mais células, proteínas, moléculas, compostos ou complexos que proveem sinais inibitórios para auxiliar no controle ou supressão de uma resposta imune. Por exemplo, agentes de supressão imune incluem aquelas moléculas que bloqueiam parcialmente ou totalmente o estímulo imune; diminuem, previnem ou retardam a ativação imune; ou aumentam, ativam ou regulam positivamente a supressão imune. Os agentes de imunossupressão exemplares para alvejar (por exemplo, com um inibidor de ponto de controle imunológico) incluem PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CTLA4, B7-H3, B7-H4, CD244/2B4, HVEM, BTLA, CD160, TIM3, GAL9, KIR, PVR1G (CD112R), PVRL2, adenosina, A2aR, citocinas imunosupressoras (por exemplo, IL-10, IL-4, IL-1RA, IL- 35), IDO, arginase, VISTA, TIGIT, LAIR1, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, células Treg, ou qualquer combinação dos mesmos.
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[00241] Um inibidor de agente de supressão imune (também referido como um inibidor do ponto de controle imunológico) pode ser um composto, um anticorpo, um anticorpo fragmento ou polipeptídeo de fusão (por exemplo, fusão Fc, tal como CTLA4-Fc ou LAG3-Fc), uma molécula antissentido, uma ribozima ou molécula RNAi, ou uma molécula orgânica de baixo peso molecular. Em quaisquer das modalidades aqui descritas, um método pode compreender administrar um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição com um ou mais inibidores de qualquer um dos componentes de supressão imune a seguir, individualmente ou em qualquer combinação.
[00242] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de PD-1, por exemplo um anticorpo específico PD-1, tal como pidilizumab, nivolumab, pembrolizumab, MEDI0680 (anteriormente AMP-514), AMP-224, BMS-936558, ou um fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos, ou qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades adicionais, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um anticorpo específico PD-L1, tal como BMS-936559, durvalumab (MEDI4736), atezolizumab (RG7446), avelumab (MSB0010718C), MPDL3280A, ou um fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00243] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de LAG3, tal como LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00244] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de CTLA4. Em modalidades particulares, um
106 / 152 anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um anticorpo específico CTLA4 ou fragmento de ligação do mesmo, tal como ipilimumab, tremelimumab, proteínas de fusão CTLA4-Ig (por exemplo, abatacept, belatacept), ou qualquer combinação dos mesmos.
[00245] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um anticorpo específico B7-H3 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tal como enoblituzumab (MGA271), 376.96, ou ambos. Um fragmento de ligação ao anticorpo B7-H4 pode ser um scFv ou proteína de fusão do mesmo, da maneira descrita em, por exemplo, Dangaj et al., Cancer Res. 73:4820, 2013, bem como aqueles descritos na patente U.S.
9.574.000 e publicações de patente PCT WO 2016/40724A1 e WO 2013/025779A1.
[00246] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de CD244. Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de BLTA, HVEM, CD160, ou qualquer combinação dos mesmos. Anticorpos anti- CD160 são descritos em, por exemplo, publicação PCT WO 2010/084158.
[00247] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de TIM3. Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de Gal9.
[00248] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de sinalização de adenosina, tal como um
107 / 152 receptor de adenosina inativo. Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de A2aR.
[00249] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de KIR, tal como lirilumab (BMS-986015). Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de uma citocina inibitória (tipicamente, uma citocina sem ser TGFβ) ou desenvolvimento ou atividade de Treg.
[00250] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor IDO, tal como levo-1-metil triptofano, epacadostat (INCB024360; Liu et al., Blood 115:3520-30, 2010), ebselen (Terentis et al., Biochem. 49:591-600, 2010), indoximod, NLG919 (Mautino et al., American Association for Cancer Research 104º Annual Meeting 2013; 6-10 de abril de 2013), 1-metil-triptofano (1-MT)-tira-pazamina, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00251] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de arginase, tal cmo N(omega)-Nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), ácido N‐omega‐hidroxi‐nor‐l‐arginina (nor‐NOHA), L-NOHA, 2(S)-amino-6-borono-hexanóico (ABH), S-(2-boronoetil)-L- cisteína (BEC), ou qualquer combinação dos mesmos.
[00252] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de VISTA, tal como CA-170 (Curis, Lexington, Mass.).
[00253] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao
108 / 152 antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de TIGIT tal como, por exemplo, COM902 (Compugen, Toronto, Ontario Canadá), um inibidor de CD155 tal como, por exemplo, COM701 (Compugen), ou ambos.
[00254] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de PVRIG, PVRL2 ou ambos. Anticorpos anti- PVRIG são descritos em, por exemplo, publicação PCT WO 2016/134333. Anticorpos anti-PVRL2 são descritos em, por exemplo, publicação PCT WO 2017/021526.
[00255] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de LAIR1.
[00256] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um inibidor de CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00257] Em certas modalidades, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição é usado em combinação com um agente que aumenta a atividade (isto é, é um agonista) de uma molécula de ponto de controle imunológico estimulatório. Por exemplo, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição pode ser usado em combinação com um agonista de CD137 (4-1BB) (tal como, por exemplo, urelumab), um agonista de CD134 (OX-40) (tal como, por exemplo, MEDI6469, MEDI6383, ou MEDI0562), lenalidomida, pomalidomida, um agonista de CD27 (tal como, por exemplo, CDX-1127), um agonista de CD28 (tal como, por exemplo, TGN1412, CD80, ou CD86), um agonista de CD40 (tal como, por exemplo, CP-870,893, rhuCD40L, ou SGN-40), um agonista de CD122 (tal como, por
109 / 152 exemplo, IL-2) um agonista de GITR (tal como, por exemplo, anticorpos monoclonais humanizados descritos na publicação de patente PCT WO 2016/054638), um agonista de ICOS (CD278) (tal como, por exemplo, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8, ou qualquer combinação dos mesmos). Em quaisquer das modalidades aqui descritas, um método pode compreender administrar um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição com um ou mais agonistas de uma molécula de ponto de controle imunológico estimulatório, incluindo quaisquer dos precedentes, individualmente ou em qualquer combinação.
[00258] Em certas modalidades, uma terapia de combinação compreende um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição, e uma terapia secundária compreendendo um ou mais de: um outro anticorpo, fragmento de ligação de antígeno do mesmo, ou conjugado do anticorpo que é específico para um antígeno de câncer expresso pelo câncer (isto é, o mesmo ou um antígeno diferente), um tratamento por radiação, uma cirurgia, um agente quimioterapêutico, uma citocina, RNAi, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00259] Em certas modalidades, um método de terapia de combinação compreende administrar um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição, e administrar adicionalmente um tratamento por radiação ou uma cirurgia. Terapia de radiação é bem conhecia na técnica e inclui terapias de raios-X, tal como irradiação gama, e terapias radiofarmacêuticas. Cirurgias e técnicas cirúrgicas apropriadas para tratar um dado câncer em um sujeito são bem conhecidas pelos versados na técnica. As terapias com próton são revisadas em Thariat et al., Bull. Cancer pii:S0007-4551(1)300001-8 (2018).
[00260] Em certas modalidades, um método de terapia de combinação compreende administrar um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou
110 / 152 conjugado do anticorpo da presente descrição, e administrar adicionalmente um agente quimioterapêutico.
Um agente quimioterapêutico inclui, mas sem limitação, um inibidor de função de cromatina, um inibidor de topoisomerase, um fármaco inibidor de microtúbulo, um agente que danifica o DNA, um antimetabólito (tal como antagonistas de folato, análogos de pirimidina, análogos de purina, e análogos modificados por açúcar), um inibidor da síntese de DNA, um agente de interação com o DNA (tal como um agente intercalante), e um inibidor de reparo de DNA.
Agentes quimioterapêuticos ilustrativos incluem, sem limitação, os seguintes grupos: agentes anti- metabólitos/anti-câncer, tais como análogos de pirimidina (5-fluoruracil, floxuridina, capecitabina, gencitabina e citarabina) e análogos de purina, antagonistas de folato e inibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentoestatina e 2-clorodesoxiadenosina (cladribina); agentes antiproliferativos/antimitóticos incluindo produtos naturais tais como alcalóides da vinca (vinblastina, vincristina e vinorelbina), desreguladores de microtúbulo tais como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas e navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposido, teniposido), agentes que danificam o DNA (actinomicina, ansacrina, antraciclinas, bleomicina, bussulfano, camptotecina, carboplatina, clorambucil, cisplatina, cialofosfamida, Citoxan, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, hexametilmelamineoxaliplatina, ifosfamida, melfalano, mercloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosoureia, plicamicina, procarbazina, taxol, taxotere, temozolamida, teniposida, trietilenetiofosforamida e etoposida (VP 16)); antibióticos tais como dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mithramicina) e mitomicina; enzimas (L-asparaginase que metaboliza sistemicamente L-asparagina e priva células que não apresenram a capacidade de seintetizar sua própria asparagina); agentes antiplaquetários;
111 / 152 agentes de alquilação antiproliferativos/antimitóticos tais como mostardas de nitrogênio (mecloretamina, ciclofosfamida e análogos, melfalano, clorambucil), etileniminas e metilmelaminas (hexametilmelamina e tiotepa), alquil sulfonatos -bussulfano, nitrosoureias (carmustina (BCNU) e análogos, estreptozocina), trazenos- dacarbazinina (DTIC); antimetabólitos antiproliferativos/antimitóticos tais como análogos de ácido fólico (metotrexato); compelxos de coordenação de platina (cisplatina, carboplatina), procarbazina, hidroxiureia, mitotano, aminoglutetimida; hormônios, análogos de hormônio (estrógeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inibidores de aromatase (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sais de heparina sintética e outros inibidores de trombina); agentes fibrinolíticos (tais como ativador de plasminogênio tecidual, estreptoquinase e uroquinase), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratórios; agentes anti-secretores (breveldina); imunosupressores (ciclosporina, tacrolimo (FK-506), sirolimo (rapamicina), azatioprina, micofenolato mofetil); compostos anti- angiogênicos (TNP470, genisteina) e inibidores de fator de crescimento (inibidores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), inibidores do fator de crescimento de fibroblasto (FGF)); bloqueador do receptor de angiotensina; doadores de óxido nítrico; oligonucleotídeos antissentido; anticorpos (trastuzumabe, rituximabe); receptores de antígeno quimérico; inibidores do ciclo celular e indutores de diferenciação (tretinoina); inibidores de mTOR, inibidores de topoisomerase (doxorubicina (adriamicina), ansacrina, camptotecina, daunorubicina, dactinomicina, eniposido, epirubicina, etoposido, idarubicina, irinotecan (CPT-11) e mitoxantrona, topotecan, irinotecan), corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilpednisolona, prednisona e prenisolona); inibidoes de quinase de transdução de sinal do fator de crescimento; indutores de disfunção mitocondrial, toxinas tais como toxina do cólera, ricina, exotoxina
112 / 152 de Pseudomonas, toxina adenilato ciclase de Bordetella pertussis, ou toxina da difteria, e ativadores de caspase; e desreguladores de cromatina.
[00261] Citocinas podem ser usadas para manipular resposta imune no hospedeiro em relação à atividade anticâncer. Vide, por exemplo, Floros & Tarhini, Semin. Oncol. 42(4):539-548, 2015. Citocinas usadas para promover resposta imune anticâncer ou antitumor incluem, por exemplo, IFN-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-24, e GM-CSF, individualmente ou em qualquer combinação com um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo da presente descrição desta descrição.
[00262] Imunoterapias celulares, incluindo aquelas que envolvem células T, células NK, ou células NK-T que expressam TCRs e CARs naturais ou recombinantes específicos para antígenos de câncer, e incluindo transferência adotiva de tais células para um receptor, são uma modalidade terapêutica emergente para câncer (vide, por exemplo, Bonini e Mondino, Eur. J. Immunol. 45(9):2457-69 (2015) e Metha e Rezvani, Front. Immunol. 9:283 (2018)). Em certas modalidades, um sujeito que recebe um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, ou conjugado do anticorpo (ou composição farmacêutica) da presente descrição apresenta ou está (isto é, concomitantemente, simultaneamente ou sequencialmente) recebendo uma imunoterapia celular que alveja o câncer.
[00263] São também aqui providos quaisquer dos anticorpos atualmente descritos, fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados de anticorpo, polinucleotídeos, vetores, células hospedeiras, e composições para uso em tratar, detectar ou diagnosticar uma doença caracterizada pela expressão (por exemplo, superexpressão) de um antígeno de Lewis, da maneira aqui descrita. Em certas modalidades, a doença é um câncer, tal como qualquer câncer da maneira aqui descrita. Em certas modalidades, o anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno, conjugado de anticorpo ou
113 / 152 composição é usado em qualquer terapia de combinação da maneira aqui descrita.
[00264] São aqui também providos quaisquer dos anticorpos atualmente descritos, fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados de anticorpo, polinucleotídeos, vetores, células hospedeiras e composições para uso na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença caracterizada pela expressão (por exemplo, superexpressão) de um antígeno de Lewis, da maneira aqui descrita. Em certas modalidades, a doença é um câncer, tal como qualquer câncer da maneira aqui descrita. Em certas modalidades, o medicamento compreende ou é usado em qualquer terapia de combinação da maneira aqui descrita.
[00265] Da maneira usada nesta especificação e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem as referências no plural, a menos que o conteúdo dite claramente de outra forma. Adicionalmente, o uso da alternativa (por exemplo, “ou”) pode ser entendido para significar tanto uma, ambas, ou qualquer combinação das mesmas alternativas.
[00266] Em toda esta especificação, a menos que o contexto exija de outra forma, as palavras “compreendem”, “apresentam”, ou variações tais como “apresenta”, “apresentando”, “compreende” ou “compreendendo”, serão entendidas para implicar a inclusão de um elemento ou número inteiro declarado, ou grupos de elementos ou números inteiros, mas não a exclusão de nenhum outro elemento ou número inteiro, ou grupos de elementos ou números inteiros. Na presente descrição, qualquer faixa de concentração, faixa de percentual, faixa de razão ou faixa de número inteiro deve ser entendida para incluir o valor de qualquer número inteiro na faixa citada e, quando apropriado, frações dos mesmos (tal como um décimo e um centésimo de um número inteiro), a menos que de outra forma indicada. Igualmente, qualquer faixa de número aqui citada relacionada a qualquer característica
114 / 152 física, tal como subunidades de polímero, tamanho ou espessura, deve ser entendida para incluir qualquer número inteiro na faixa citada, a menos que de outra forma indicada.
[00267] Da maneira aqui usada, o termo “cerca de” significa ± não mais que 20% da faixa indicada, valor ou estrutura, a menos que de outra forma indicada, ou em certas modalidades + não mais que 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7, 6, ou 5% da faixa indicada, valor, ou estrutura, a menos que de outra forma indicada.
[00268] Além disso, pode ser entendido que os compostos individuais, ou grupos de compostos, derivados das várias combinações das estruturas e substituintes aqui descritos, são descritos pelo presente pedido na mesma medida como se cada composto ou grupos de composto fosse apresentada individualmente. Assim, a seleção de estruturas particulares ou substituintes particulares está no escopo da presente descrição.
[00269] O termo “consistindo essencialmente em” não é equivalente a “compreendendo”, e se refere aos materiais especificados ou etapas de uma reivindicação, ou àqueles que não afetam de maneira material as características básicas de um assunto reivindicado.
[00270] Cada modalidade nesta especificação deve ser aplicada mutatis mutandis a cada outra modalidade, a menos que expressamente declarado de outra forma.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
GERAÇÃO DE ANTICORPO BBC QUIMÉRICO Isolamento de DNAs de região variável do anticorpo
[00271] Células de hibridoma que expressam anticorpo IMH2/BBC de murino, que compreende um domínio VL com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 27, e um domínio VH com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:28, foram obtidas com o Dr. S.
115 / 152 Hakomori (Cancer Research 52:3739-3745 (1992)). Para preparar RNA para síntese de DNAc, 9 × 106 células de hibridoma foram inicialmente coletadas por centrifugação em velocidade baixa (300 g por 5 minutos), seguido pelo isolamento de RNA usando um “total RNA miniprep purification kit”TM (GeneMark™, GMbiolab Co. Ltd., Taichung City, Taiwan, ROC), de acordo com o protocolo do fabricante. Os genes do anticorpo que codificam IMH2 foram então clonados a partir do RNA purificado, usando o SMART RACE cDNA Amplification KitTM (Takara/ BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA) com menos modificações, comparado ao protocolo recomendado pelo fornecedor.
[00272] Resumidamente, após a síntese da primeira fita de DNAc e dC-tailing, o DNAc que codifica especificamente regiões variáveis de cadeia leve de IMH2 foi isolado por duas etapas de PCR, usando oligonucleotídeos iniciadores fornecidos pelo kit, e oligonucleotídeos iniciadores específicos, desenhados com base na sequência de cadeia kappa de camundongo conhecida na região constante. O primeiro PCR foi realizado por 5 ciclos de 30 segundos a 94 °C e 1 minuto a 72 °C; seguido por 5 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 67 °C e 1 minuto a 72 °C. Vinte e sete (27) ciclos adicionais de reação de PCR compreendendo 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 62 °C e 1 minuto a 72 °C foram adicionados para garantir amplificação satisfatória. Uma segunda PCR aninhada, que inclui uma etapa de pré-aquecimento a 94 °C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 54 °C e 1 minuto a 72 °C, e uma etapa de extensão final a 72 °C por 3 minutos foi então executada para melhorar adicionalmente a fidelidade.
[00273] A estratégia de clonagem para o gene de cadeia pesada foi um pouco diferente. Primeiro, o molde de DNAc de fita simples usado para reação de PCR foi preparado a partir do RNA, com um oligonucleotídeo iniciador específico para IgG3 de camundongo no domínio constante 1
116 / 152 (CH1). O isolamento de gene foi então realizado por uma PCR em única etapa, da maneira a seguir: pré-aquecer a 94 °C por 5 minutos, 35 ciclos de reação de PCR compreendendo 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 62 °C, 1 minuto a 72 °C, seguido por uma etapa de extensão final a 72 °C por 5 minutos, na presença de oligonucleotídeo iniciador NUP (kit de amplificação SMART™ RACE, Clontech, Palo Alto, CA) e um oligonucleotídeo iniciador aninhado no domínio CH1 de camundongo. DNAc que codifica a região variável dos fragmentos tanto de cadeia leve quanto pesada foi a seguir purificado usando um kit de purificação de PCR (GeneMarkTM GMbiolab Co. Ltd., ROC), e introduzido no vetor de clonagem yT&A (Yeastern BiotechTM, Taipei, Taiwan, ROC) para identificação de clone positivo e determinação de sequência. Construção dos Plasmídeos de Expressão de Anticorpo
[00274] Para construir plasmídeos de expressão para produzir o anticorpo aqui referido como anticorpo “BBC”, oligonucleotídeos iniciadores de PCR e os genes do anticorpo clonados no vetor yT&A descritos anteriormente foram úteis para preparar apenas os DNAcs que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada maduras (sem peptídeo líder). PCR foi realizada da maneira a seguir: pré-aquecendo a 94 °C por 5 minutos, 35 ciclos de reação de PCR compreendendo 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 65 °C e 60 segundos a 72 °C, e uma etapa de extensão final a 72 °C por 3 minutos. Sequências de reconhecimento de enzima de restrição foram incorporadas durante a reação de PCR nas extremidades 5′ (NheI) e 3′ (ApaI) de DNAc VH, e nas extremidades 5′ (NheI) e 3′ (BsiWI) de DNAc VL para facilitar plasmídeos de expressão geneticamente modificados subsequentes. Os fragmentos de DNAc amplificados foram a seguir digeridos sequencialmente com enzimas de restrição ApaI/NheI para genes de cadeia pesada e NheI/BsiWI para cadeia leve. Após purificação em gel, os DNAcs VH e VL recuperados foram ligados ao vetor pGNX-RhcG1 (VH) ou pGNX-
117 / 152 Rhck (VL), nos mesmos sítios de clonagem de enzima de restrição para obter os vetores de expressão pGNX-RhcG1-BBC e pGNX-Rhck-BBC, respectivamente. As sequências de DNAc inseridas foram confirmadas usando um oligonucleotídeo iniciador à montante no sítio de clonagem múltiplo. Produção Transiente de Anticorpo
[00275] Para a produção transiente do anticorpo quimérico BBC, células HEK293-c18 foram co-transfectadas com plasmídeos de expressão pGNX-RhcG1-BBC e pGNX-Rhck-BBC que codificam cadeia pesada e leve, na presença de polietilenimina. O sobrenadante da cultura foi coletado no final do dia 7 após transfecção para análise. EXEMPLO 2
GERAÇÃO DE ANTICORPOS BBC HUMANIZADOS
[00276] Para produzir formas humanizadas do anticorpo BBC (descrito anteriormente no exemplo 1), sequências homólogas de anticorpo humano (receptor humano) foram selecionadas para realizar enxerto de CDR. Resumidamente, sequências humanas receptoras potenciais foram identificadas pesquisando à base de dados de proteína NCBI para localizar as sequências que exibem a maior homologia com as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 28) e leve (SEQ ID NO: 27) do anticorpo BBC. As estruturas aceptoras humanas CAD89404.1 (Vh) e AAS01771.1 (Vl) foram escolhidas (Figura 1). Entretanto, inserir diretamente sequências de CDR não humanas em estruturas aceptoras humanas pode resultar na perda de afinidade de ligação. Afinidade de ligação pode ser restabelecida após transferir resíduos de estrutura do receptor humano de volta para a sequência doadora não humana. Mutações reversas preferidas restabelecem a afinidade de ligação, mantendo conformações originais de CDR.
[00277] Para restabelecer a afinidade de ligação pós-enxerto de CDR, um modelo 3-D do anticorpo foi construído primeiro, com base nos dados de
118 / 152 estrutura cristalina de BBC, usando o software Accelrys Discovery Studio™ (BIOVIA, San Diego, CA). Aminoácidos importantes foram então previstos para a mutação reversa examinando a estrutura da maneira a seguir:
1. A energia da mutação (para estabilidade) de resíduos alterados na estrutura humanizada foi calculada. Valores positivos de energia de mutação correspondem a um efeito desestabilizador da mutação e vice versa.
[00278] 2. As distâncias espaciais entre os resíduos de estrutura e regiões CDR foram examinadas. Os resíduos mais próximos das CDRs foram levados em consideração (em 4Å).
[00279] 3. Os resíduos localizados na interface de região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve foram examinados. Estes resíduos contribuíram para a montagem da cadeia pesada e cadeia leve e, portanto, podem apresentar um impacto significativo na estrutura do anticorpo.
[00280] Dez (10) posições influentes (3 na cadeia leve e 7 na cadeia pesada), baseadas nos critérios de previsão, foram escolhidas inicialmente para mutação reversa. Além disso, o resíduo de metionina (M) na posição 70 (de acordo com numeração Kabat) do molde de cadeia pesada de humano selecionado pareceu ser um motivo pouco frequente e, portanto, foi substituído pela isoleucina muito conservada (I) neste sítio (Figura 1; resíduos reversamente mutados (Receptor humano → hBBC.8) são sublinhados na tabela 3 a seguir; o resíduo Met→Ile é mostrado sublinhado com negrito e itálico na tabela 3, e em caixa na figura 1). Estas conversões de aminoácido produziram o anticorpo humanizado “hBBC.8”.
[00281] Alterações adicionais foram introduzidas para melhorar adicionalmente o anticorpo. Primeiro, duas posições na cadeia leve hBBC.8 (R66 e F71) que variam entre as sequências de camundongo e de humano foram mutadas para produzir “hBBC.9” (contendo mutação F71Y) e
119 / 152 “hBBC.10” (contendo mutações F71Y e R66G) (Figura 2A; resíduos em negrito e em itálico, sem nenhum sublinhado, na tabela 3). A ligação de BBC e as variantes humanizadas geradas hBBC.9 e hBBC.10, em células AGS, é mostrada na figura 2B. Resumidamente, linhagem celular de câncer gástrico humano AGS (ATCC CRL-1739; ATCC, Manassas, VA) foi mantida regularmente em meio F12, e suplementada com soro fetal bovino dialisado 10%. Para realizar estudos de ligação celular, aproximadamente 3 x 105 células em 100 μL de PBS foram misturadas com um volume igual de anticorpo diluído. Após 1 hora de incubação em temperatura ambiente, 2 mL de PBS foram adicionados em cada amostra para lavar o anticorpo não ligado. Subsequente à centrifugação, o precipitado celular recuperado foi re-suspenso diretamente em 200 μL de Fluoresceína (FITC)-IgG anti-humana de cabra AffiniPure™, Fcγ Fragmento Specific (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat. 109-095-098) diluído 1:200 em PBS. Após incubação em temperatura ambiente por 30 minutos, a lavagem com PBS foi repetida para eliminar anticorpo secundário não ligado. As células coletadas foram re- suspensas em 200 uL de PBS e analisadas em um sistema de citometria de fluxo BD FACSCanto™ (BD Biosciences, San Jose, CA). Análises adicionais foram realizadas para identificar sequências potencialmente imunogênicas.
[00282] Mutações adicionais em cadeia pesada ou leve produziram as variantes adicionais “hBBC.9.1” e “hBBC.10.1” (resíduos em negrito e sublinhados, sem itálico, na tabela 3 a seguir). Especificamente, estruturas cristalinas dos anticorpos BBC e hBBC.8 e dos complexos antígeno/anticorpo simulados foram analisadas. Vários resíduos nas regiões de CDR de cadeia pesada e leve (posições especificadas, de acordo com numeração Kabat) foram identificados por substituição de aminoácido de sítio único. Alteração de aminoácido na(s) posição(s) designada(s) do gene de cadeia leve ou pesada do anticorpo foi realizada por duas etapas de reação de PCR, com oligonucleotídeos iniciadores especificamente desenhados. Para facilitar a
120 / 152 inserção de fragmentos de DNAc de anticorpo mutado em vetores de expressão, um sítio de restrição foi incorporado em cada extremidade (5’NheI e 3’ApaI para a cadeia de DNAc, 5’NheI e 3’BsiWI para DNAc de cadeia leve) durante a reação de PCR. Os fragmentos de DNA foram produzidos após uma segunda reação de PCR, cortados com NheI/ApaI ou NheI/BsiWI, e ligados nos mesmos sítios dos vetores pGNX-RhcG1 e pGNX-Rhck para a construção de gene de cadeia pesada e cadeia leve, respectivamente. Os sítios mutados e alterações são mostrados na tabela 1. Tabela 1. Mutações de sítio único de hBBC.8 Localização da cadeia leve Posição e aminoácido original Aminoácidos alterados CDR1 E27 A Y30 A N31 A T34 S, V CDR2 G50 A S53 A CDR3 Q89 A T93 A, S, V, D Localização de cadeia pesada Posição e aminoácido original Aminoácidos alterados CDR1 S31 A Y33 A CDR2 Y54 A S55 T N57 A, D, Q, Y, W S61 A CDR3 Y104 A D105 A H106 A
[00283] Inúmeros mutantes exibiram atividades de ligação in vitro iguais ou maiores que 1/2 da atividade do anticorpo quimérico (BBC) no ensaio de ligação de célula AGS (Figura 2C, vide também tabela 2). Além disso, alguns mutantes também exibiram melhoria de especificidade por reatividade cruzada reduzida com uma estrutura de Lewis B monovalente (igual a ou menor que 1/8 da intensidade comparado ao BBC), em um ensaio ELISA, da maneira mostrada na tabela 2. Lewis B monovalente é um antígeno do grupo sanguíneo que é expresso em tecidos humanos normais. Tabela 2. Atividade de ligação de Mutantes BBC CDR
121 / 152 Atividade de ELISA Localização da Aminoácido Aminoácidos ligação AGS LeB cadeia leve original e posição mutados CDR1 Y30 A = R32 A - CDR2 G50 A = - W92 A - - CDR3 T93 S = - Atividade de ELISA Localização de Aminoácido Aminoácidos ligação AGS LeB cadeia pesada original e posição alterados Y33 A = CDR1 T34 A - CDR2 S55 T + - CDR3 Y104 A = - H106 A = - (=) nenhuma alteração na atividade de ligação com relação ao BBC (-) diminuição na atividade de ligação com relação ao BBC (+) aumento na atividade de ligação com relação ao BBC
[00284] Uma vez que hBBC.8 exibiu aproximadamente 1/3 da atividade de ligação de célula AGS comparado ao BBC (Figura 2B), e exibiu inibição tumoral muito boa no modelo de xenoenxerto de camundongo (vide exemplo 6), estes mutantes de anticorpo substituídos por aminoácido único apresentam o potencial para exibir atividade antitumor. As posições e substituições de aminoácido dos mesmos clones analisados são sumarizadas na tabela 1. Para confirmar adicionalmente sua capacidade de afinidade e/ou melhoria de especificidade, um total de sete (7) sítios de mutação simples (Tabela 2) foi selecionado para avaliar em um molde de anticorpo humanizado. Estes incluíram cinco substituições de resíduo único (três na cadeia leve e duas na cadeia pesada), que foram testadas em relação ao seus efeitos na ligação do anticorpo às células AGS (Figura 2C), duas substituições de resíduo único de cadeia pesada, que foram testadas em relação aos seus efeitos na especificidade de ligação ao anticorpo (em células AGS comparado ao LeB purificado, e duas substituições de resíduo duplo de cadeia pesada, que foram analisadas de maneira similar (Figura 2D).
[00285] Uma comparação adicional de várias versões de BBC humanizado, construídas para a forma quimérica original em termos de afinidade (ensaio de ligação de célula AGS) e especificidade (ensaio ELISA
122 / 152 de Lewis b) é mostrada na figura 2E.
[00286] Análise Epibase de hBBC.9 (Applied Protein Services, Lonza Biologics, Cambridge, Reino Unido) previu uma região na região de cadeia pesada com um forte risco de imunogenicidade. Para minimizar o problema de imunogenicidade potencial, 6 alterações de aminoácido adicionais na região de estrutura 3 de cadeia pesada (posições 78, 80, 82-84 e 86) foram incluídas para combinar anticorpos humanizados de referência com estes locais (Figura 3). Estas conversões forneceram a estrutura de cadeia pesada para “hBBC.10.1FQ”. As sequências de aminoácido das várias regiões de cadeia pesada e leve descritas neste exemplo são sumarizadas na tabela 3. Tabela 3. Sequências de aminoácido de regiões VH e VL de anticorpo Anticorpo Região variável de cadeia leve Região variável de cadeia pesada IMH2/BBC DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCTAS DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGY
EDIYNRLTWYQQKPGNVPRLLISG SITSGYTWHWIRQFPGNTLEWLGYIH ATSLDTGVPSRFSGSRSGKDYALSIT YSGNTKYSPSLKSRLSVTRDTSKNQF
SLQTEDVATYYCQQYWTTPWTFG FLQLNSVTTEDTATYYCGREALRGYD GGTRLEIK (SEQ ID NO:27) HGFWFTYWGQGTLVTV (SEQ ID NO:28) Receptor DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGG humano QGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYA SISSGAYYWSWIRQHPGKGLEWIGYI
ASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS YYSGTTYYNPSLKSRLSMSRDTSKNQ
SLQPEDVATYYCQKYNSAPYTFGQ FSLKLSSVTAADTAVYYCARGPYYDS GTKLEIK (SEQ ID NO:29) PRPFDPWGQGTLVTV (SEQ ID NO:30) hBBC.8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTAS QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGY
EDIYNRLTWYQQKPGKVPRLLISG SITSGYTWHWIRQHPGKGLEWLGYIH ATSLDTGVPSRFSGSRSGTDFTLTIS YSGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNQFF
SLQPEDVATYYCQQYWTTPWTFG LKLSSVTTEDTAVYYCGREALRGYD QGTKLEIK(SEQ ID NO:31) HGFWFTYWGQGTLVTV (SEQ ID NO:32) hBBC.9 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTAS (hBBC.8 região variável de cadeia pesada EDIYNRLTWYQQKPGKVPRLLISG (SEQ ID NO:32))
ATSLDTGVPSRFSGSRSGTDYTLTIS
SLQPEDVATYYCQQYWTTPWTFG QGTKLEIK (SEQ ID NO:33) hBBC.9.1 (hBBC.9 região variável de cadeia leve QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGY (SEQ ID NO:33)) SITSGYTWHWIRQHPGKGLEWLGYIH
YTGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNQFF
LKLSSVTTEDTAVYYCGREALRGAD HGFWFTYWGQGTLVTV (SEQ ID NO:34) hBBC.10 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTAS (hBBC.8 região variável de cadeia pesada EDIYNRLTWYQQKPGKVPRLLISG (SEQ ID NO:32))
ATSLDTGVPSRFSGSGSGTDYTLTIS
SLQPEDVATYYCQQYWTTPWTFG QGTKLEIK (SEQ ID NO:5)
123 / 152 Anticorpo Região variável de cadeia leve Região variável de cadeia pesada hBBC.10.1 (hBBC.10 região variável de cadeia leve QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGY (SEQ ID NO:5)) SITSGYTWHWIRQHPGKGLEWLGYIH
YTGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNQFF
LKLSSVTTEDTAVYYCGREALRGYD AGFWFTYWGQGTLVTV (SEQ ID NO:35) hBBC.10.1FQ (hBBC.10 região variável de cadeia leve QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGY (SEQ ID NO:5)) SITSGYTWHWIRQHPGKGLEWLGYIH
YTGNTKYSPSLKSRLSISRDTSKNTFY
LQMNSLTTEDTAVYYCGREALRGYD AGFWFTYWGQGTLVTV (SEQ ID NO:1) EXEMPLO 3 CARACTERIZAÇÃO DE EPÍTOPO hBBC
[00287] BBC e as variantes aqui descritas foram projetados como anticorpos monoclonais de ligação a glicano. Com base nos dados de especificidade publicados do anticorpo parental IMH2 (BBC) (Ito et al., Cancer Res. 52:3739, 1992), hipotetizou-se que o epítopo alvo dos anticorpos BBCs gerados está relacionado aos antígenos LeB e LeY. Os estudos de caracterização de epítopo a seguir foram realizados usando hBBC.10.1, também referido nos exemplos a seguir e figuras referenciadas como “hBBC”. Imunopurificação
[00288] Os glicanos deriavados de GSL linhagem celular de câncer colorretal Colo-205 foram isolados e imunopurificados usando BBC. Os glicanos em frações ligadas e eluídas foram permetilados e perfilados com análise MALDI-MS, da maneira mostrada nas figuras 4A e 4B. O perfil de glicano da fração não ligada foi similar ao perfil de glicano de entrada, indicando que a maioria dos glicanos derivados de GSL, da COLO 205, não se ligaram ao BBC. Na fração eluída (ligada ao BBC), entretanto, o glicano Fuc4(LacNAc)3Lac foi exclusivamente purificado por BBC. Especificamente, observou-se surpreendentemente que o glicano purificado por hBBC carreou um LeB/Y biantenário (isto é, LeB/LeB, LeB/LeY, ou LeY/LeY, com base na observação de ambos os fragmentos de rastro de LeB e LeY no experimento MS/MS nos antígenos de ramificação I, ao passo que o glicano na fração não
124 / 152 ligada era uma estrutura linear, potencialmente LeB-LeA-LeA-Lac. Este resultado indicou que LeB/Y biantenário em antígenos I é o epítopo de BBC.
[00289] Este resultado foi confirmado por imunopurificação de glicanos que se ligam ao BBC, a partir de glicanos derivados de GSL das linhagens celulares NCI-N87 e SW1116, que foram selecionadas para expressão e glicolipídeo de LeB/Y biantenário em antígeno I. Da maneira esperada, BBC se ligou ao glicano derivado de GSL tetra-fucosilado Fuc4(LacNAc)3Lac, sem ser glicanos mono, bi e tri-fucosilados (Figuras 5A- 5B). Por meio do sequenciamento MSMS, o glicano de ligação ao BBC de NCI-N87 e SW1116 GSLs foi confirmado como o LeB/Y I biantenário que carreia antígeno (Figuras 6A e 6B).
[00290] Além de Fuc4(LacNAc)3Lac, um grupo de glicanos derivados de GSL, a partir de NCI-N87 e SW1116, que foi purificado apresentava fucosilação múltipla (quatro resíduos de fucose sendo a exigência mínima para ligação por BBC). Dois glicanos de ligação ao BBC dominantes de NCI- N87 GSLs, Fuc4(LacNAc)4Lac e Fuc6(LacNAc)4→5Lac, foram sequenciados usando MSMS e determinados como glicano que carreia antígeno I com LeY bi ou triantenário (Figuras 7A e 7B). Além disso, quando liberados, os N- glicanos derivados da linhagem celular foram imunopurificados com BBC, os N-glicanos enriquecidos foram observados como estruturas com LeY bi ou triantenário (Figuras 8A e 8B). Este resultado é consistente com o antígeno I enriquecido.
[00291] Estes dados mostraram que LeB/Y é a unidade de ligação de B/Y BBC. Entretanto, um Lewis monoantenário não é suficiente para render uma ligação forte com BBC. Os antígenos I exclusivos e N-glicanos com fucosilação totalmente terminal forneceram LeB/Y multivalente, que é indicado como o epítopo de ligação forte de BBC. Estudos de imunopurificação comparáveis também foram realizados em hBBC e mostraram especificidade de enriquecimento de glicano similar como BBC (dados não mostrados), o
125 / 152 que indicou que hBBC e BBC compartilham epítopos similares. Calorimetria de titulação isotérmica
[00292] Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi realizada para analisar a afinidade de ligação entre hBBC e um conjunto de glicanos lineares de LeY-Gal, LeB-Gal, LeA-Gal, e LeX-Gal, e glicanos ramificados de LeY/LeY- ASGP, LeX/LeX-ASGP, H-ASGP, antígeno LeY/LeY-I, e antígeno LeY/LeB-I. O anticorpo BR96 (descrito na patente U.S. 5.491.088 A; variantes descritas na patente U.S. 5.792.456 A) foi cincluído como um controle. Em decorrência dos glicanos caracterizados a partir dos experimentos de imunopurificação hBBC estarem presentes em quantidades limitadas, vários glicanos relacionados a LeB e LeY foram obtidos de uma fonte comercial (Elycityl SA, Crolles, França), ou foram sintetizados enzimaticamente internamente, de acordo com metodologias estabelecidas na técnica (por exemplo, Wu et al., 2011 Glycobiology 21(6): 727-733; Becker et al., 2003 Glycobiology 13(7): 41R-53R; de Vries et al., 2001 Glycobiology 11(10): 119R–128R.
[00293] Resumidamente, para calorimetria de titulação isotérmica (ITC), PBS filtrado pH 7,2 foi preparado internamente, e o mesmo lote do tampão foi usado em uma etapa de injeção de ITC. mAb foi pré-trocado em tampão PBS filtrado pH 7,2, com uma concentração de proteína de 50 μM. A quantidade de antígeno glicano foi quantificada por troca de ânion de alto desempenho, com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD, por exemplo, Rothenhofer et al., 2015 J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 988:106), análise de monossacarídeo com galactose como cálculo padrão. O antígeno glicano quantificado foi dissolvido em PBS filtrado pH 7,2 (mesmo lote que aquele para preparação de solução de mAb), e 60 μL de solução foram úteis para cada injeção.
[00294] O experimento de ITC foi realizado em um sistema MicroCal iTC200 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Reino Unido). Após preencher solução mAb (50 μM) na célula da amostra de iTC200, a temperatura do
126 / 152 sistema foi ajustada para 25 °C. Após a temperatura do sistema ter atingido 25 °C, a seringa foi preenchida com solução de antígeno glicano e reduzida lentamente na célula de amostra preenchida com mAb. Os parâmetros do experimento foram da maneira a seguir: número de injeções: 20; temperatura da célula: 25 °C; pó de referência: 6 μcal/s; demora inicial: 60 s; concentração celular da amostra: 50 μM; velocidade de agitação: 750 rpm com entrada de concentração de seringa com concentração de antígeno glicano medida. Os parâmetros de injeção foram da maneira a seguir: volume de injeção: 2 μL; duração: 4 s; espaçamento: 150 s; período de carga: 5 s; e o volume da primeira injeção foi ajustado em 1 μL. Quando todos os ajustes foram confirmados, o experimento foi iniciado, e os dados resultantes foram processados por Origin para iTC200. A curva de titulação foi ajustada com um conjunto de modelo de ajuste de sítios, com repetição de 100 iterações para obter o melhor resultado de ajuste. A K e KD foram, portanto, calculadas.
[00295] Os gráficos de titulação de ITC de vários antígenos glicanos com anticorpo hBBC são mostrados nas figuras 9A, 9B, 10A-10C, e 11A- 11F. Os gráficos de titulação de ITC de vários antígenos glicanos com BR96 anticorpo são mostrados nas figuras 12A-12C. Resumidamente, a análise ITC mostrou que hBBC apresenta maior especificidade de ligação contra LeB-Gal (KD = 26,2 μM) do que LeY-Gal (KD = 80,6 μM). Além disso, hBBC mostrou afinidade de ligação mais forte por estruturas biantenária (LeY/LeY- ASGP, LeY/LeY-antígeno I, e LeY/LeB-antígeno I) do que por antígenos LeY- Gal de cadeia simples. A afinidade de ligação de hBBC para LeY/LeY-ASGP, LeY/LeY-antígeno I e LeB/LeY-antígeno I pareceu similar, sugerindo que para epítopos de glicano biantenário, LeY e LeB, cadeias laterais apresentaram contribuições comparáveis em ligação específica. Além disso, da maneira mostrada nas figuras 11A-F, antígenos glicanos sem fração(s) LacNAc tetra- fucosilada(s), seja na forma de cadeia única ou biantenária (LeX-Gal, LeA-Gal, antígeno H tipo I, antígeno H tipo II, H-ASGP, e LeX/LeX-ASGP), não
127 / 152 mostraram nenhuma ligação específica com hBBC.
Estes resultados indicam que LacNAc tetra-fucosilado tanto com ligação tipo I quanto II é necessário para ligação específica por hBBC.
Em resumo, consistente com os dados de imunopurificação, os resultados ITC mostraram que hBBC se liga a um epítopo que inclui estruturas contendo LeY e/ou LeB (Tabela 4; glicanos são representados da maneira a seguir: círculos abertos = Gal; círculos preenchidos = Man; quadrados preenchidos = GlcNac; triângulos fechados = Fuc). O controle BR96 mostrou afinidade de ligação similar a levemente maior por LeY-Gal de cadeia única, da maneira comparada com o biantenário LeY/LeY-antígeno I e biantenário LeY/ LeY-ASGP (Figuras 12A-12C), sugerindo que BR96 não apresenta nenhuma seletividade específica entre glicanos LeY de cadeia única e biantenário.
Assim, hBBC possui especificidade exclusiva por epítopo, comparado ao BR96. Tabela 4. Resultados de calorimetria de titulação isotérmica Estrutura do antígeno Nome do antígeno hBBC BR96
LeY-Gal KD = 80,6 μM KD = 5,68 μM
LeB-Gal KD = 26,2 μM n/a
LeY/LeY-ASGP KD = 25,9 μM KD = 10,66 μM
Nenhuma ligação H-ASGP n/a específica detectada
Nenhuma ligação LeX/LeX-ASGP n/a específica detectada
128 / 152 Estrutura do antígeno Nome do antígeno hBBC BR96 LeY/LeY-antígeno I KD = 30,0 μM KD = 5,99 μM LeY/LeB-antígeno I KD = 40 μM n/a Nenhuma ligação LeA-Gal n/a específica detectada Nenhuma ligação LeX-Gal n/a específica detectada Nenhuma ligação antígeno H tipo I n/a específica detectada Nenhuma ligação antígeno H tipo II n/a específica detectada
[00296] Estes resultados caracterizam parcialmente os epítopos hBBC. Entretanto, a interação entre hBBC fluindo livremente e glicanos imobilizados provê informação adicional em relação ao epítopo; portanto, hBBC foi testado com uma série de glicanos imobilizados em ressonância de plasma de superfície (SPR) e experimentos de ELISA. Superfícies analíticas revestidas com estreptavidina e glicanos conjugados com biotina (LeY-Gal-biotina, LeB- Gal-biotina, LeY/LeY-ASGA-biotina, e LeB/LeB-ASGA-biotina para SPR; LeY-Gal-biotina, LeB-Gal-biotina, LeY/LeY-ASGA-biotina, LeB/LeB-ASGA- biotina, 3-LeY/6-LeB-ASGA-Biotina, e 3-LeB/6-LeY-ASGA-Biotina para ELISA) foram utilizados, da maneira mostrada na tabela 5 (mesmas representação de glicano como na tabela 4). Tabela 5. Estrutura e MW de antígenos glicanos úteis para SPR e ELISA Antígeno Estrutura Peso molecular LeY-Gal-sp3-biotina 1361,4
129 / 152 Antígeno Estrutura Peso molecular
LeB-Gal-LC-biotina 1191,25
LeY/LeY-ASGA-biotina 2679,61
LeB/LeB-ASGA-biotina 2679,61
3-LeY/6-LeB-ASGA-biotina 2679,61
3-LeB/6-LeY-ASGA-biotina 2679,61
Ressonância de plasma de superfície
130 / 152
[00297] A afinidade de ligação de hBBC por LeY-Gal-Biotina, LeB- Gal-Biotina e LeY/LeY-ASGA-Biotina foi analisada por ressonância de plasma de superfície (SPR) em chips revestidos com estreptavidina. Resumidamente, Biacore T100 foi usado com tampão HBS-EP+ (GE Healthcare), usado como tampão de corrida. Glicano biotinilado foi diluído em 10 pM e imobilizado pelo chip sensor SA (GE Healthcare), de acordo com o procedimento padrão. Os glicanos foram imobilizados em uma vazão de 10 μL/min por 60 s. hBBC ou BR96 tiveram o tampão trocado para o tampão HBS-EP+ com coluna de rotação de dessalinização Zeba (7K MWCO, 0,5mL,ThermoFisher), e diluído em série em 480, 240, 120, 60, e 30 nM com tampão HBS-EP+. Análise cinética de ciclo único foi realizada. Anticorpo foi associado aos glicanos na vazão de 30 μL/min por 150 s, e dissociado por 300 s. O chip foi regenerado com MgCl2 2 M a a vazão de 50 μL/min por 120 s. Os dados foram avaliados com software Biacore T200 Evaluation (GE Healthcare). Reação em dois estados foi usada para ajuste de curva e os melhores valores de ajuste de ka, kd e KD foram obtidos (Tabela 6). Sensorgramas SPR que mostram a ligação de hBBC e BR96 contra vários antígenos glicanos são providos nas figuras 13A e 13B. Tabela 6. Sumário de resultados SPR Nome do antígeno hBBC BR96 LeY-Gal-Biotina 40~59 μM 270 nM LeB-Gal-Biotina 2,3~3,1 μM n/a Le /LeY-ASGA-Biotina
Y 2~3 μM 1 μM LeB/LeB-ASGA-Biotina 1 μM n/a
[00298] SPR mostrou que o biantenário LeY/LeY-ASGA-Biotina apresentou maior afinidade com hBBC, comparado ao LeY-Gal-Biotina de cadeia única, o que foi consistente com o resultado de ITC. Além disso, LeB/LeB-ASGA-Biotina biantenário apresentou maior afinidade com hBBC, comparado ao LeB-Gal-Biotinade cadeia única, que também está de acordo com a tendência observada para antígenos LeY. hBBC apresentou maior afinidade com LeB-Gal-Biotina versus LeY-Gal-Biotina, que é comparável com o resultado ITC. SPR também mostrou que hBBC apresenta maior
131 / 152 afinidade de ligação com LeB/ LeB-ASGA-Biotina do que com LeY/ LeY- ASGA-Biotina, o que foi consistente com a observação de que hBBC apresenta maior atividade de ligação com antígeno à base de LeB do que antígeno à base de LeY. Os valores KD comparáveis de hBBC, obtidos de LeB/LeB-ASGA e LeY/LeY-ASGA, indicam adicionalmente que hBBC se associa especificamente com estruturas multi-fucosiladas, denominadas Lewis B ou Lewis Y bivalentes. Notavelmente, a resposta de hBBC ao LeB/LeB- ASGA foi mais forte (sensorgrama) do que a resposta ao LeB-Gal, embora valores KD similares tenham sido obtidos de dois antígenos. LeB/LeB-ASGA parece apresentar a estrutura de afinidade mais elevada para hBBC.
[00299] Por comparação, BR96 mostrou afinidade um pouco maior para LeY-Gal-Biotina e LeY/ LeY-ASGA-Biotina, o que é comparável ao resultado de ITC, quando se trata do antígeno estruturalmente similar LeY/ LeY-ASGP. Em resumo, os dados de SPR foram muito consistentes com os dados do experimento de ITC. ELISA indireto
[00300] Para avaliar afinidade de ligação de anticorpo por ELISA, os antígenos glicanos biotinilados foram diluídos na concentração adequada em tampão PBS. 100 μL de solução diluída de antígeno foram aplicados em uma placa de ensaio de 96 poços revestida com estreptavidina, e incubados em um agitador a 37 °C por 3,5 horas. A placa foi lavada com PBST (Tween-20 0,05% em tampão PBS) para remover antígenos glicanos em excesso. Anticorpos primários titulados em série em diluente (BSA 0,1% em tampão PBS) foram aplicados na placa de ensaio, e incubados em um agitador a 37 °C por 1 hora. Após lavagem com PBST, 100 μL de solução de anticorpo IgG anti-humano conjugado com HRP (SouthernBiotech, diluição 1:15.000 em diluente) foram incubados na placa de ensaio, em um agitador a 37 °C por 1 hora. Após lavar o anticorpo secundário em excesso, 100 μL de reagente TMB foi aplicado e incubado a 37 °C por 15 minutos, seguido por finalização
132 / 152 com 50 μL de HCl 0,5 N. O valor de OD foi detectado em 450 nm e subtraído pelo valor em 650 nm em um leitor de microplacas VERSA max (Molecular Devices). Os dados foram processados em Softmax Pro (Molecular Devices). LeY/LeY-ASGA vs LeY-Gal
[00301] Atividades de ligação de hBBC e o BR96 foram testadas em placas de ELISA revestidas com LeY-Gal-Biotina e revestidas com LeY/LeY- ASGA-Biotina. A quantidade de antígeno revestido foi da maneira indicada nas figuras 14A e 14B. hBBC mostrou ligação muito mais forte com LeY/LeY- ASGA do que com LeY-Gal. BR96 mostrou um padrão contrário com hBBC, em que se liga a LeY-Gal muito melhor que LeY/LeY-ASGA. Em suma, o ELISA indireto proveu resultados similares de afinidade de ligação, assim como os experimentos de ITC e SPR. LeB/LeB-ASGA vs LeY/LeY-ASGA e LeB-Gal
[00302] A seguir, hBBC foi testado em relação à ligação em placas de ELISA revestidas com LeB/LeB-ASGA-Biotina, LeY/LeY-ASGA-Biotina, e LeB-Gal-Biotina-revestida com estreptavidina. A quantidade de antígeno de revestimento foi da maneira indicada na figura 15. O resultado do ELISA indireto foi que hBBC mostrou ligação significativamente mais forte com LeB/LeB-ASGA do que com LeY/LeY-Gal e LeB-Gal. ELISA de ligação ao antígeno
[00303] Um ELISA de ligação ao antígeno foi desenvolvido para avaliar a afinidade de ligação relativa de hBBC com diferentes antígenos glicanos. Resumidamente, hBBC foi titulado em série e aplicado em uma placa de ensaio de 96 poços funcionalizada com estreptavidina, que foi revestida com diferentes antígenos glicanos. A ligação de hBBC aos antígenos glicanos foi detectada com um anticorpo específico de IgG de humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP), seguido por desenvolvimento de cor em reagente TMB. A absorbância em 450 nm, usando leitor de placas, foi proporcional à quantidade de hBBC ligado a seus
133 / 152 antígenos. A afinidade relativa foi determinada representando graficamente a OD como uma função de concentração de hBBC Preparação de antígeno
[00304] Um Lewis Y pentaose biotinilado, LeY-Gal-sp3-biotina, foi comprado de Elicityl (Crolles, França). Lewis B pentaose foi comprado de Elicityl e adicionalmente biotinilado internamente (LeB-Gal-LC-biotina). Os outros quatro glicanos biotinilados: LeY/LeY-ASGA-biotina, LeB/LeB-ASGA- biotina 3-LeY/6-LeB-ASGA-Biotina (LeY/LeB-ASGA-Biotina), e 3-LeB/6-LeY- ASGA-Biotina (LeB/LeY-ASGA-Biotina), foram sintetizados através de uma série de glicosilação enzimática, seguido por biotinilação química (Tabela 5). O glicano biotinilado foi analisado por cromatografia em camada fina (TLC) e espectrometria de massa com ionização por eletropulverização (ESI-MS) para ter certeza que a pureza atingiu pelo menos 95%, e estava livre de biotina não conjugada. A análise de monossacarídeo HPAEC-PAD foi aplicada para a quantificação do glicano biotinilado. Anticorpo
[00305] hBBC foi usado em ELISA de ligação ao antígeno.
ELISA
[00306] Antígenos glicanos biotinilados foram diluídos em 18,7 nM em tampão PBS. 100 μL de solução de antígeno diluída foram aplicados em uma placa de ensaio de 96 poços revestidos com estreptavidina, e incubados em um agitador a 37 °C por 3,5 horas. A placa foi lavada com PBST (Tween- 20 0,05% em tampão PBS) para remover antígenos glicanos em excesso. Anticorpos primários titulados em série em diluente (BSA 0,1% em tampão PBS) foram aplicados na placa do ensaio e incubados em um agitador a 37 °C por 1 hora. Após lavagem com PBST, 100 μL de solução de anticorpo IgG anti-humano conjugado com HRP (SouthernBiotech, 1:10.000 diluição em diluente) foram incubados na placa de ensaio, em um agitador, a 37 °C por 1 hora. Após lavar o anticorpo secundário em excesso, 100 μL de reagente
134 / 152 TMB foram aplicados e incubados a 37 °C por 15 minutos, seguido por finalização com 50 μL de HCl 0,5 N. O valor de OD foi detectado em 450 nm, e subtraído pelo valor em 650 nm, em um leitor de microplacas VERSA max (Molecular Devices). Os dados foram processados em Softmax Pro (Molecular Devices). Resultados
[00307] Os dados são mostrados na figura 16A. quando hBBC se ligou a LeB/LeB-ASGA, LeY/LeY-ASGA, 3-LeY/6-LeB-ASGA-Biotina, e 3-LeB/6- LeY-ASGA-Biotina em ELISA de ligação ao antígeno, o valor de OD aumentou em uma faixa estreita de baixa concentração de anticorpo (0.4-4 μg/mL), ao passo que a ligação de hBBC foi aparentemente mais fraca com LeY-Gal e LeB-Gal, indicando que um LeY, LeB, LeB/LeY, ou LeY/LeB bivalente em um glicano proveu uma maior afinidade de ligação ao hBBC do que uma única fração de Lewis Y/B. Comparação direta de antígeno-afinidade de ligação: hBBC.10.1 vs. BBC
[00308] O propósito do experimento foi comparar a afinidade por antígeno de hBBC.10.1 com aquele do anticorpo ancestral BBC por ELISA de ligação ao antígeno. Preparação de antígeno
[00309] Um Lewis Y pentaose biotinilado, LeY-Gal-sp3-biotina, foi comprado de Elicityl. Lewis B pentaose foi comprado de Elicityl e biotinilado internamente de maneira adicional (LeB-Gal-LC-biotina). Os outros quatro glicanos biotinilados: LeY/LeY-ASGA-biotina, LeB/LeB-ASGA-biotina 3- LeY/6-LeB-ASGA-Biotina (LeY/LeB-ASGA-Biotina), e 3-LeB/6-LeY-ASGA- Biotina (LeB/LeY-ASGA-Biotina), foram sintetizados por meio de uma série de glicosilação enzimática, seguido por biotinilação química (Tabela 5). O glicano biotinilado foi analisado por TLC e ESI-MS para ter certeza que a pureza atingiu 95%, e estava livre de biotina não conjugada. A análise de monossacarídeo HPAEC-PAD foi aplicada para a quantificação do glicano
135 / 152 biotinilado. Anticorpo
[00310] BBC e hBBC.10.1 foram úteis em ELISA de ligação ao antígeno. ELISA de ligação ao antígeno
[00311] Microplacas de 96 poços com estreptavidina EvenCoat™ (R&D Biosystems, MN, Cat No. CP004) foram incubadas com vários glicanos biotinilados em PBS em uma quantidade de 3,73 pmol/poço, a 4 ℃ por toda a noite. Após lavar 3 vezes com PBS/Tween 20 0,05% (Sigma, Cat No. P1379-500 mL), 100 μL de BBC ou anticorpos hBBC.10.1 diluídos foram adicionados nos poços revestidos com antígeno, e a seguir incubados a 37 ℃ por 1 hora. Os poços foram lavados 3 vezes com PBS/Tween 20 0,05%, seguido por incubação com 100 μL de IgG anti-humano de camundongo (Fc)- HRP diluído 10000x (Southern Biotech, Cat No. 9040-05) a 37 ℃ por 1 hora. Após lavar, 100 μL de SureBlue™ Reverse TMB (KPL, Cat No. 53-00-03) foram adicionados para desenvolvimento da cor a 37 ℃ por 15 minutos. A reação foi finalizada adicionando HCl 0,5 N. A absorbância foi lida em um comprimento de onda de 450 nm, com referência de 650 nm em um leitor de microplacas VERSAMAX™ (Molecular Devices, San Jose, CA), e os dados foram processados pelo software SoftmaxPro™ (Molecular Devices). Resultados:
[00312] ELISA de ligação ao antígeno de BBC (Figura 16B) e hBBC.10.1 (Figura 16C) mostrou que hBBC.10.1 apresentou menor afinidade por antígenos glicanos de cadeia simples (LeB-Gal e LeY-Gal), comparado ao BBC, e ambos os anticorpos apresentaram muita afinidade com os antígenos glicanos biantenários (LeB/LeB-ASGA, LeY/LeY-ASGA, 3-LeY/6-LeB-ASGA, e 3-LeB/6-LeY-ASGA). Estes dados sugerem que hBBC.10.1 apresentou melhor seletividade de ligação entre antígenos de cadeia simples e biantenários do que BBC.
136 / 152 Sumário
[00313] Os experimentos de caracterização de epítopo descritos neste exemplo indicam que hBBC se ligou especificamente ao antígeno I LeY/B bi e triantenário derivado de linhagem celular de câncer; e também aos N-glicanos LeY bi e triantenários. Além disso, o epítopo reconhecido por hBBC compreendeu parte principal(s) de LacNAc di-fucosilado. LeB/LeB-ASGA biantenário foi o antígeno com afinidade de ligação mais forte com hBBC. O LeY/LeY-ASGA, LeY/LeB-ASGA, e LeB/LeY-ASGA biantenário também mostrou alta afinidade com hBBC, comparado aos antígenos LeB-Gal e LeY- Gal de cadeia simples. Igualmente, se os antígenos estiverem em estuturas de single-cadeia ou biantenárias, apenas antígenos a base d LeB mostraram maior afinidade com hBBC do que apenas antígenos à base de LeY. Finalmente, o comportamento de ligação (cinética) e os epítopos de hBBC diferiram daqueles de BR96. EXEMPLO 4 INTERNALIZAÇÃO DE hBBC EM CÉLULAS ALVO
[00314] Anticorpos podem ser úteis como carreadores para liberar uma carga funcional em um sítio desejado. Por exemplo, algumas terapias contra câncer usam anticorpos específicos de antígeno para liberar fármacos citotóxicos (isto é, conjugados anticorpo-fármaco ou ADCs) nas células de tumor por meio de endocitose, também conhecida como internalização. Alguns ADCs atuais incluem ligantees cliváveis que são clivados no compartimento lisossomal e, portanto, liberam seletivamente o fármaco após internalização, com o benefício adicional de aumentar a estabilidade do fármaco no soro.
[00315] Para testar se hBBC internalizou eficientemente nas células de câncer, os experimentos a seguir foram realizados. Primeiro, em um ensaio de internalização convencional, anticorpo hBBC foi adicionado às células de câncer gástrico AGS em cultura, e a ligação foi realizada a 4 °C por 1 hora
137 / 152 para permitir a interação anticorpo/receptor específico, mas interrompe a endocitose. A seguir, anticorpo ligado não especificamente foi lavado e as células foram transferidas para 37 °C para permitir endocitose normal. Em 0 minutos e 30 minutos, as células foram fixadas e hBBC foi detectado usando anticorpo IgG anti-humano conjugado com Alexa488 (Figura 17, painéis do lado esquerdo). F-actina foi marcada por faloidina rodamina (painéis do lado direito; coloração co-distribuída apareceu como sinal fluorescente amarelo). Da maneira mostrada na figura 17, hBBC corou a membrana celular em 0 min, e a seguir passou por internalização e se localizou nas vesículas citossólicas em torno do núcleo após incubação a 37 °C (30 minutos, células permeabilizadas). O sinal citossólico foi demonstrado adicionalmente por controle não permeabilizado, em que apenas sinais fracos de membrana podem ser detectados (30 minutos, células não permeabilizadas). Estes dados mostram que hBBC internaliza eficientemente em células AGS em 30 minutos.
[00316] Em um segundo experimento, a localização intracelular em tempo real de hBBC foi examinada. Resumidamente, anticorpo hBBC foi adicionado nas células AGS e incubado por 4 ou 8 horas a 37 °C para facilitar a internalização. As células foram então fixas e a localização em tempo real de hBBC foi examinada usando anticorpo IgG anti-humano conjugado com Alexa488 (Figura 18, IgG anti-humano mostrado em painéis à esquerda). Os lisossomos foram marcados por anticorpo anti-Lamp-1, seguido por anticorpo IgG anti-coelho marcado (mostrado em painéis médios). Da maneira mostrada na figura 18, hBBC é co-localizado com Lamp-1 (Mesclado; painéis à direita) após uma incubação de 4 ou 8 horas, indicando que hBBC internalizado está localizado no compartimento lisossomal. Além disso, hBBC pode ser estabilizado no compartimento lisossomal sem degradação aparente por pelo menos 8 horas. Estes resultados indicam que hBBC apresenta utilidade para uso como em conjugados que alvejam antígeno, tais como ADCs.
138 / 152 EXEMPLO 5 IMUNOCOLORAÇÃO DE hBBC EM AMOSTRAS DE TECIDO
HUMANO
[00317] Amostras de tecido saudáveis e cancerosos foram obtidas e imunocoloração com hBBC 10.1 foi realizada em seções de tecido embebidas em parafina e fixas e formalina, de acordo com um protocolo padrão. Os resultados da coloração para tecidos saudáveis e cancerosos são sumarizados nas tabelas 7 e 8, respectivamente. Tabela 7. Imunocoloração com hBBC.10.1 de vários tecidos humanos normais. Tecido hBBC 10.1_2μg/mL Pâncreas ± (3/3) Língua (Tecido de glândula salivar) + (3/3) Larynx ++ (3/3) Esôfago ± (3/3) Estômago + (3/3) Intestino delgado +++ (3/3) Cólon - Hipófise - Mama - Cérebro - Cerebelo - Glândula adrenal - Glândula paratireoide - Ovário - Testículos - Baço - Tonsila - Glândula timo - Medula óssea - Pulmão - Coração - Fígado - Rim - Próstata - Útero - Colo uterino - Músculo estriado - Pele - Nervo - Omento maior - Endométrio - Tabela 8. Imunocoloração com hBBC em tecidos cancerosos humanos. Órgão Diagnóstico patológico Tipo Taxa positiva Adenocarcinoma 57/175 32,6% Adenocarcinoma Mucinoso 6/17 35,3% Estômago Maligno 33,2% Adenocarcinoma não diferenciado 1/2 50,0% Carcinoma de célula em anel de sinete 1/2 50,0%
139 / 152 Órgão Diagnóstico patológico Tipo Taxa positiva Adenocarcinoma 11/23 47,8% Cólon Maligno 44,0% Adenocarcinoma mucinoso 0/2 0,0% Carcinoma ductal invasivo 1/23 4,3% Mama Maligno 4,2% Carcinoma lobular e ductal misto 0/1 0,0% Fígado Carcinoma hepatocelular Maligno 1/40 2,5% 2,5% Adenocarcinoma 3/15 20,0% Pulmão Maligno 20,0% Carcinoma de célula escamosa 2/10 20,0% Linfonodo Adenocarcinoma metastático Metástase 13/40 32,5% 32,5% Adenocarcinoma seroso 0/33 0,0% Ovário Adenocarcinoma mucinoso Maligno 2/6 33,3% 5,0% Adenocarcinoma endometrióide 0/1 0,0% Adenocarcinoma ductal 11/24 45,8% Pâncreas Maligno 48,0% Adenocarcinoma papilar 1/1 100,0% Próstata Adenocarcinoma Maligno 1/25 4,0% 4,0% Útero Adenocarcinoma endometrióide Maligno 10/40 25,0% 25,0% Outros Carcinoma de célula escamosa Maligno 1/32 3,1% 3,1%
[00318] Além disso, várias linhagens celulares de câncer humano foram coradas com hBBC.10.1 para determinar padrões de expressão de epítopo. Os resultados são sumarizados na tabela 9. Tabela 9. Expressão do epítopo hBBC em linhagens celulares de câncer em humano. Tipo Linhagem celular Ligação ao hBBC.10.1 Câncer gástrico AGS +++ TSGH9201 + NCI-N87 ++ KATO III - MKN45 - MKN74 - MKN7 - LOVO - Câncer colônico Colon 205 - Colon 201 + SW1116 +++ DLD-1 ++ LS 174T + HT-29 - T84 - Câncer de mama MCF-7 ++ MDA-MB231 - MDA-MB453 - T47D - Câncer de ovário NIH OVCAR-3 + SW626 + SK-OV-3 - ES-2 - Câncer SU.86.86 - pancreático EBC-1 - PABC-1 - Câncer de pulmão NCI-H146 + NCI-H209 - Câncer de pele A431 - EXEMPLO 6
140 / 152 ATIVIDADE ANTITUMOR DE hBBC EM UM MODELO DE
XENOENXERTO DE CÂNCER DE CÓLON
[00319] Uma série de estudos em animais in vivo foram conduzidos para avaliar o efeito inibitório no tumor de hBBC em modelos de xenoenxerto SCID, que incluíram introduzir células de câncer de humano a partir de linhagens celulares de câncer gástrico AGS, TSGH9201, e das linhagens celulares de câncer de cólon COLO 201, COLO 205, DLD-1. hBBC.10.1 mostrou nível de ligação forte a moderado em todas as linhagens celulares, exceto COLO 205 (Tabela 9 do exemplo 5). hBBC.10.1 foi usado para todos os estudos de xenoenxerto, e BR96 foi usado como um controle. Atividade antitumor in vivo de hBBC.10.1 em modelos de xenoenxerto DLD- 1 e COLO 205
[00320] O objetivo do mesmo estudo foi examinar efeitos inibidores no tumor de uma alta dose de hBBC.10.1 em modelos de xenoenxerto DLD-1 e COLO 205. Resumidamente, linhagens celulares de câncer de cólon humano, DLD-1 e COLO 205, foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Estados Unidos). As células foram crescidas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino (FBS) 10%, e a cultura de células foi mantida em uma incubadora umidificada, em uma atmosfera de CO2 5% a 37 °C. As células na passagem 5-8 foram usadas para inoculação de tumor.
[00321] Camundongos fêmeas CB17 com imunodeficiência combinada grave (SCID) sem patógeno específico (SPF) foram comprados de BioLASCO (Taiwan), e aclimataram naturalmente por pelo menos uma semana antes de qualquer manipulação experimental. Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente (IVC), em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 2 °C), com umidade 50 ± 10%, em um ciclo claro-escuro de 12:12 horas. Todos os experimentos foram realizados seguindo os regulamentos e leis de proteção animal obrigatórios pelo
141 / 152 Conselho de Agricultura, Taiwan.
[00322] Células de câncer foram ressuspensas em uma densidade celular de 5 x 106/200 μL, em meio sem soro gelado contendo 50% de BD Matrigel (Cat. 354248), e injetadas subcutaneamente na região do flanco de camundongos SCID com 6-8 semanas. O tamanho do tumor foi medido semanalmente com um calibrador de Vernier (Laser Tools and Technics (LTT), Hsin Chu City, Taiwan,150 x 0,05 mm), e peso do tumor foi estimado como “peso em mg = (largura2 x altura) mm3 /2” (Ito et al. (1992) Cancer Res. 52:3739). Quando o peso do tumor atingiu 150-200 mg, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 9 grupos (n=6 por grupo) com cada grupo apresentando tamanhos comparáveis de tumor, e o tratamento com anticorpo foi iniciado. Camundongos SCID que carregam tumor foram injetados intraperitonealmente com hBBC.10.1 (lote: 17001) uma vez por semana em 50 mg/kg, por seis semanas. Camundongos SCID que carregam tumor injetados, intraperitonealmente com salina, funcionaram como controles negativos.
[00323] Os resultados dos experimentos de xenoenxerto de DLD-1 e COLO 205 são mostrados nas figuras 19A e 19B, respectivamente. hBBC.10.1 foi capaz de inibir eficientemente o crescimento do tumor DLD-1, mas não o crescimento do tumor COLO 205, com relação ao controle. Estes dados são consistentes com a capacidade observada de hBBC.10.1 se ligar às células DLD-1, mas não à COLO 205. Atividade antitumor de hBBC em um modelo de xenoenxerto de adenocarcinoma gástrico
[00324] O objetivo do mesmo estudo foi comparar a eficiência antitumor de hBBC.10.1 e BR96 em baixas doses que variam de 0,008 a 1 mg/kg no modelo de xenoenxerto AGS. Resumidamente, linhagem celular AGS de adenocarcinoma gástrico humano (CRL-1739) foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Estados Unidos).
142 / 152 Células AGS foram crescidas em meio Ham’s F-12K suplementado com soro fetal bovino (FBS) 10%, e a cultura de células foi mantida em uma incubadora umidificada em uma atmosfera de CO2 5%, a 37 °C. As células AGS em passagem 5-8 foram usadas para inoculação do tumor.
[00325] Camundongos fêmeas CB17 com imunodeficiência combinada grave (SCID) sem patógeno específico (SPF) foram comprados de BioLASCO (Taiwan), e aclimataram naturalmente por pelo menos uma semana antes de qualquer manipulação experimental. Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente (IVC), em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 2 °C ), com umidade 50 ± 10%, em um ciclo claro-escuro de 12:12 horas. Todos os experimentos foram realizados seguindo os regulamentos e leis de proteção animal obrigatórios pelo Conselho de Agricultura, Taiwan.
[00326] As células AGS foram ressuspensas em uma densidade celular de 5 x 106/200 μL, em meio sem soro gelado contendo 50% de BD Matrigel (Cat. 354248), e injetadas subcutaneamente na região do flanco de camundongos SCID com 6-8 semanas. O tamanho do tumor foi medido semanalmente com um calibrador de Vernier (Laser Tools and Technics (LTT), Hsin Chu City, Taiwan, 150 x 0,05 mm), e peso do tumor foi estimado como “peso em mg = (largura2 x altura) mm3 /2” [Ito et al. (1992) Cancer Res. 52:3739]. Quando o peso do tumor atingiu 150-200 mg, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 9 grupos (n=6 por grupo) com cada grupo apresentando tamanhos comparáveis de tumor, e o tratamento com anticorpo foi iniciado. Camundongos SCID que carregam tumor foram injetados intraperitonealmente tanto com hBBC.10.1 (lote: 17001) quanto com BR96 (lote: 17001) uma vez por semana, em 1, 0,2, 0,04, ou 0,008 mg/kg por seis semanas, com a primeira dose sendo fornecida em 1,5 vez da dose predeterminada. Camundongos SCID que carregam tumor injetados, intraperitonealmente com salina, funcionaram como controles negativos.
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[00327] Os resultados para camundongos tratados com hBBC.10.1 e tratados com BR96 são mostrados nas figuras 20A e 20B, respectivamente. Quando administrados em doses semanais de 1 e 0,2 mg/kg, tanto hBBC.10.1 quanto BR96 inibiram significativamente o crescimento do tumor, comparado ao controle. Entretanto, ambos os anticorpos falharam em mostrar efeitos inibitórios em doses menores (0,04 e 0,008 mg/kg). Em decorrência de considerações éticas, os camundongos foram sacrificados quando a carga tumoral foi maior que 10% do peso corporal. Alguns camundongos que receberam salina ou doses menores do anticorpo atingiram este ponto final em 60 dias após inoculação; consequentemente, análise estatística foi realizada apenas em dados gerados até o dia 60. Ao contrário, o crescimento do tumor em 10% do peso corporal foi eficientemente atrasado em camundongos que carregam o tumor AGS, administrados com doses maiores (1 e 0,2 mg/kg) de hBBC.10.1 ou BR96. Este estudo dose-resposta indica que hBBC.10.1 apresenta eficiência antitumor comparável ao BR96 em camundongos que carregam o tumor AGS.
[00328] A eficiência antitumor de hBBC.10.1 foi comparada com aquela de outros anticorpos hBBC gerados da presente descrição. Em um experimento, células AGS coletadas AGS foram lavadas com PBS duas vezes, e ressuspensas em uma densidade celular de 5 x 106/200 μL em PBS contendo 25% de BD Matrigel™ (BD Biosciences, Cat. 354248). Posteriormente, 200 μL da suspensão de célula AGS foram injetados subcutaneamente (5 x 106 células/camundongo), em camundongos SCID fêmeas (com 6-8 semanas), na região do flanco. O tamanho do tumor foi medido semanalmente com um calibrador de Vernier (Laser 150 x 0,05mm) e o peso do tumor foi estimado como “peso em mg = (largura2 x altura) mm3 /2” [Hisashi Ito et al. (1992)]. Quando o peso do tumor atingiu 150-200 mg, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 6 grupos (n=6 por grupo), com cada grupo apresentando tamanhos comparáveis de tumor, e
144 / 152 iniciados no tratamento com anticorpo. Camundongos SCID que carregam tumor foram injetados intraperitonealmente com hBBC.8 ou mutantes (hBBC.9, hBBC.9.1, hBBC.10.1), duas vezes por semana na dose de 0,25 mg/kg, por seis semanas. Além disso, hBBC.8 foi testado em uma dose maior, em 2 mg/kg. Camundongos SCID que carregam tumor injetados, intraperitonealmente com salina, funcionaram como controles negativos. Os dados são mostrados na figura 20C. Efeitos antitumor foram observados com hBBC.8, hBBC.9, e hBBC.9.1, embora o efeito tenha sido um pouco mais fraco que hBBC.10.1. A atividade antitumor comparável ao hBBC.10.1 (0,25 mg/kg) foi observada para hBBC.8 em uma dose mais elevada (2 mg/kg).
[00329] hBBC.10.1 também foi comparado ao hBBC.10.1FQ quanto à atividade antitumor. Resumidamente, células AGS coletadas foram lavadas com PBS duas vezes e ressuspensas em uma densidade celular de 5 x 106/200 μL em PBS contendo 25% de BD Matrigel™ (Cat. 354248). Posteriormente, 200 μL da suspensão de célula AGS foram injetados subcutaneamente (5 x 106 células/camundongo) em camundongos SCID fêmeas (com 6-8 semanas) na região do flanco. O tamanho do tumor foi medido semanalmente com um calibrador de Vernier (Laser 150 x 0,05mm) e o peso do tumor foi estimado como “peso em mg = (largura2 x altura) mm3 /2” [Hisashi Ito et al. (1992)]. Quando o peso do tumor atingiu 150-200 mg, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos (n=8 por grupo) com cada grupo apresentando tamanhos comparáveis de tumor, e iniciados no tratamento com anticorpo. Camundongos SCID que carregam tumor foram injetados intraperitonealmente tanto com BBC.10.1 quanto com hBBC.10.1FQ, uma vez por semana, na dose de 0,25 mg/kg por seis semanas, com a primeira dose sendo fornecida em um 1,5 vez da dose predeterminada. Camundongos SCID que carregam tumor injetados, intraperitonealmente com salina, funcionaram como controles negativos. Os dados (Figura 20D) mostram que hBBC.10.1FQ apresentou atividade antitumor um pouco mais forte.
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[00330] Nos experimentos a seguir, células AGS com xenoenxerto (xAGS) isoladas de tumores com xenoenxerto de AGS mostraram expressar pelo menos 2x epítopo hBBC, comparadas às células da linhagem celular AGS (dados não mostrados). Células xAGS também desencadearam atividade mais potente de ADCC e CDC por hBBC, da maneira comparada à linhagem celular parental (dados não mostrados). hBBC apresentou efeito de morte direta um pouco mais fraca em células xAGS alvo versus BR96 (coloração PI), da maneira mostrada na figura 21. Atividade antitumor de hBBC em um modelo de xenoenxerto de carcinoma gástrico
[00331] O objetivo do mesmo estudo foi comparar a eficiência antitumor de hBBC.10.1 e BR96 em baixas doses, que variam de 0,04 a 10 mg/kg no modelo de xenoenxerto de TSGH 9201. Resumidamente, linhagem celular de carcinoma gástrico humano TSGH 9201 (Cat. 60146) foi obtida do Bioresource Collection and Research Center (BCRC), do Food Industry Research and Development Institute (FIRDI, Hsinchu, Taiwan). Células TSGH 9201 com maior expressão do epítopo hBBC foram enriquecidas por 2 etapas de classificação de célula ativada fluorescente (FACS) (classificador de células BD FACSJAZZ™, BD Biosciences, Cingapura, Cat. 655486), usando uma coloração a seguir com anti-hBBC (lote: B24), seguido por Fluoresceína (FITC) 200 vezes diluída-IgG anti-humano de cabra AffiniPure™, fragmento específico Fcγ (Jackson ImmunoResearch Inc., West Grove, PA, Cat. 109-095-098). Comparado com células TSGH 9201 parentais, o nível de expressão do epítopo hBBC melhorou quase 4 vezes nas células enriquecidas, designadas TSGH 9201 (2s) (não mostrado). Tanto as células parentais quanto enriquecidas foram crescidas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com soro fetal bovino (FBS) 10%, e piruvato de sódio 1 mM. A cultura de células foi mantida em uma incubadora umidificada, em uma atmosfera de CO2 5%, a 37 °C. Células TSGH 9201 (2s) em passagem 5-
146 / 152 8 foram usadas para inoculação do tumor.
[00332] Camundongos fêmeas CB17 com imunodeficiência combinada grave (SCID) sem patógeno específico (SPF) foram comprados de BioLASCO (Taiwan), e aclimataram naturalmente por pelo menos uma semana antes de qualquer manipulação experimental. Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente (IVC), em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 2 °C), com umidade 50 ± 10%, em um ciclo claro-escuro de 12:12 horas. Todos os experimentos foram realizados seguindo os regulamentos e leis de proteção animal obrigatórios pelo Conselho de Agricultura, Taiwan.
[00333] Células TSGH 9201 (2s) foram ressuspensas em uma densidade celular de 5 x 106/200 μL, em meio sem soro gelado contendo 25% de BD Matrigel (Cat. 354248), e 200 μL da suspensão celular foram injetados subcutaneamente em camundongos SCID, com 6-8 semanas, na região do flanco. O tamanho do tumor foi medido semanalmente com um calibrador de Vernier (Laser Tools and Technics (LTT), Hsin Chu City, Taiwan, 150 x 0,05 mm), e peso do tumor foi estimado como “peso em mg = (largura2 x altura) mm3 /2” [Ito et al. (1992) Cancer Res. 52:3739]. Quando o peso do tumor atingiu 150-200 mg, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos (n=5 por grupo) com cada grupo apresentando tamanhos comparáveis de tumor, e foram iniciados no tratamento com anticorpo. Para avaliar a eficiência in vivo de hBBC.10.1 e BR96, camundongos SCID que carregam tumor foram injetados intraperitonealmente tanto com hBBC.10.1 (lote: B24) quanto com BR96 (lote: T05) em 10 mg/kg, uma vez por semana, por seis semanas, com a primeira dose sendo fornecida em 1,5 vez da dose indicada. Em um segundo estudo para comparar a atividade antitumor de hBBC.10.1 e BR96 em doses mais baixas, camundongos SCID que carregam tumor foram injetados intraperitonealmente tanto com hBBC.10.1 (lote: 17001) quanto com BR96 (lote: 17001), uma vez por semana, em 10, 1, 0,2, ou 0,04 mg/kg
147 / 152 por seis semanas, com a primeira dose sendo fornecida em 1,5 vez da dose indicada. Camundongos SCID que carregam tumor injetados, intraperitonealmente com salina, funcionaram como controles negativos.
[00334] Os resultados são mostrados na figura 22. Tanto hBBC.10.1 quanto BR96 inibiram significativamente o crescimento do tumor em uma dose semanal de 10 mg/kg, comparado ao grupo de salina. Atividade antitumor de hBBC.10.1 em um modelo de xenoenxerto de adenocarcinoma colorretal
[00335] Os objetivos do mesmo estudo foram: 1) examinar a capacidade de hBBC.10.1 inibir o crescimento do tumor com xenoenxerto de COLO 201; e 2) comparar as atividades antitumor de hBBC e BR96 em doses que variam de 0,008 a 1 mg/kg no modelo de xenoenxerto de COLO 201.
[00336] Resumidamente, a linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano, COLO 201 (CCL-224), derivada de fluidos de ascite, foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Estados Unidos). As células COLO 201 foram crescidas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com soro fetal bovino (FBS) 10%, e piruvato de sódio 1 mM. A cultura de células foi mantida em uma incubadora umidificada, em uma atmosfera de CO2 5%, a 37 °C. As células COLO 201 em passagem 5-8 foram usadas para inoculação do tumor.
[00337] Camundongos fêmeas CB17 com imunodeficiência combinada grave (SCID) sem patógeno específico (SPF) foram comprados de BioLASCO (Taiwan), e aclimataram naturalmente por pelo menos uma semana antes de qualquer manipulação experimental. Os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente (IVC), em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 2 °C ), com umidade 50 ± 10%, em um ciclo claro-escuro de 12:12 horas. Todos os experimentos foram realizados seguindo os regulamentos e leis de proteção animal obrigatórios pelo Conselho de Agricultura, Taiwan.
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[00338] As células COLO 201 foram ressuspensas em uma densidade celular de 2 x 106/200 μL, em meio sem soro gelado, e 200 μL da suspensão celular foram injetados subcutaneamente em camundongos SCID com 6-8 semanas, na região do flanco. O tamanho do tumor foi medido semanalmente com um calibrador de Vernier (Laser 150 x 0,05 mm), e peso do tumor foi estimado como “peso em mg = (largura2 x altura) mm3 /2” [Ito et al. (1992) Cancer Res. 52:3739]. Quando o peso do tumor atingiu 150-200 mg, os camundongos foram divididos aleatoriamente em grupos controle e de tratamento (n=6 por grupo), com cada grupo apresentando tamanhos comparáveis de tumor, e o tratamento com anticorpo foi iniciado. Dois estudos foram realizados para avaliar a eficiência in vivo de hBBC na inibição do crescimento do tumor COLO 201.
[00339] No primeiro estudo, os camundongos SCID que carregam tumor foram injetados intraperitonealmente com hBBC.10.1 (lote: B26) em doses que variam de 2 a 50 mg/kg, duas vezes por semana, por seis semanas, com a primeira dose sendo fornecida em 1,5 vez da dose indicada. Os resultados do primeiro estudo são mostrados na figura 23. O tratamento com hBBC.10.1 em 2-50 mg/kg inibiu significativamente o crescimento de tumor, comparado com o grupo de salina. Os tumores diminuíram rapidamente, e eventualmente desapareceram em uma única semana após a administração de hBBC, isto é, duas semanas após a inoculação do tumor.
[00340] No segundo estudo, foi realizada comparação adicional na atividade antitumor de hBBC.10.1 e BR96 em doses mais baixas. Camundongos SCID que carregam tumor foram injetados intraperitonealmente tanto com hBBC.10.1 (lote: 17001) quanto com BR96 (lote: 17001), uma vez por semana (iniciando no dia 7) em 1, 0,2, 0,04 e 0,008 mg/kg, por seis semanas, com a primeiro dose sendo fornecida em 1,5 vez da dose indicada. Camundongos SCID que carregam tumor injetados, intraperitonealmente com salina, funcionaram como controles negativos.
149 / 152 Anticorpo purificado hTKH2.2 (lote: 1020429) foi incluído como um anticorpo controle negativo, que é um anticorpo anti-STn humanizado, produzido internamente pela expressão transiente em células HEK293. Os resultados do segundo estudo são mostrados nas figuras 24A e 24B. Tanto hBBC.10.1 quanto BR96, em uma dose semanal de 1 ou 0,2 mg/kg, inibiram significativamente o crescimento do tumor, comparado com salina e grupos controle com hTKH2.2, enquanto doses menores (0,04 e 0,008 mg/kg hBBC.10.1; 0,04 mg/kg BR96) mostraram efeitos em reduzir o crescimento do tumor. Em decorrência de considerações éticas, os camundongos foram sacrificados quando a carga tumoral foi maior que 10% do peso corporal. Alguns camundongos que receberam salina ou doses mais baixas de hBBC.10.1 ou BR96 atingiram este ponto final em 49 dias após inoculação; consequentemente, análise estatística foi realizada apenas em dados obtidos até o dia 49.
[00341] Este estudo dose-resposta mostra que hBBC.10.1 apresenta eficiência antitumor comparável ao BR96 em camundongos que carregam tumor COLO 201. EXEMPLO 7 IMUNOCOLORAÇÃO DE hBBC EM TECIDOS DE PRIMATA E
HUMANO
[00342] Imunocoloração com hBBC.10.1 foi realizada em tecidos saudáveis correspondentes de humano e macaco cinomolgo (Macaca fascicularis). Resumidamente, a coloração foi realizada usando seções de tecido embebidas em parafina e fixas em formalina com 2μg/mL de hBBC.10.1, de acordo com um protocolo padrão. Os resultados são sumarizados na tabela 10 e mostraram padrões de coloração similares entre tecidos de humano e cinomolgo. Tabela 10. Imunocoloração com hBBC.10.1 de tecidos de humano e cinomolgo
150 / 152 Tecido Humano Cinomolgo Pâncreas ± (3/3) ± (3/3) Língua (tecido da glândula salivar) + (3/3) - Laringe ++ (3/3) + (3/3) Esôfago ± (3/3) - Estômago + (3/3) + (3/3) Intestino delgado +++ (3/3) +++ (3/3) Cólon - - Hipófise - - Mama - - Cérebro - - Cerebelo - - Glândula adrenal - - Glândula paratireoide - - Ovário - - Testículos - - Baço - - Tonsila - - Glândula Timo - - Medula óssea - - Pulmão - - Coração - - Fígado - - Rim - - Próstata - - Útero - - Colo uterino - - Músculo estriado - - Pele - - Nervo - - Omento maior - - Endométrio - - EXEMPLO 8 ESTUDO DE SEGURANÇA E TOLERABILIDADE DE hBBC.10.1 EM
UM MODELO DE PRIMATA
[00343] Para avaliar A tolerabilidade e faixa de dose aceitável de hbbc.10.1 em macacos cinomolgo, após uma única injeção em bolo intravenosa (iv), um estudo de tolerabilidade de dose única e de encontrar a faixa de dose foi realizado (não-glp). Resumidamente, macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) machos e fêmeas foram atribuídos em quatro grupos de um macho e uma fêmea em cada grupo. Os animais nos grupos 1 até 4 receberam níveis de dose de 0, 50, 200, e 300 mg/kg de hbbc.10.1, respectivamente. Os animais nos grupos 2 e 3 foram dosados uma vez por meio de injeção em bolo i.v. lenta, com uma duração de pelo menos 5 minutos. Os animais nos grupos 1 e 4 foram dosados uma vez por infusão i.v.
151 / 152 por 20 minuto (±1 minuto), usando uma bomba e linhagens de infusão preparadas. Aproximadamente 24 horas após a dosagem, a necropsia foi realizada. Durante a necropsia, observações grosseiras e pesos dos órgãos foram registrados, e o tecidos foram colocados para histopatologia. Alguns dos tecidos colorretais foram processados em lâminas e examinados microscopicamente.
[00344] Os resultados indicaram que hBBC.10.1 foi bem tolerado em macacos cinomolgos, a partir de uma faixa de dose de 50-300 mg/kg. Hemorragia mínima foi observada no ceco e/ou cólon, em animais que receberam 200 e 300 mg/kg e é provavelmente relacionado ao produto testado. Outras possíveis alterações relacionadas ao produto de teste são inflamação crônica e aguda no estômago de um animal que recebeu 200 mg/kg, infiltração de neutrófilos nas cristas do duodeno em um animal que recebe 200 mg/kg, e atrofia vilosa em um animal que recebe 300 mg/kg. Nenhum achado anormal foi observado em animais que receberam 50 mg/kg (Grupo 2).
[00345] As várias modalidades descritas anteriormente podem ser combinadas para prover modalidades adicionais. Todas as patentes U.S., publicações de pedido de patente U.S., pedido de patente U.S., patentes estrangeiras, pedido de patente estrangeira e publicações não associadas à patente referidos nesta especificação e/ou listados na folha de dados do pedido são aqui incorporados pela referência, na sua íntegra. Aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário, para empregar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para prover ainda modalidades adicionais.
[00346] Estas e outras alterações pode ser realizadas nas modalidades, à luz da descrição detalhada anteriormente. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos úteis não devem ser interpretados para limitar as reivindicações às modalidades específicas descritas na especificação e nas
152 / 152 reivindicações, mas devem ser interpretadas por incluir todas as modalidades possíveis, junto com o escopo completo de equivalentes, para as quais tais reivindicações são intituladas.
Dessa maneira, as reivindicações não são limitadas pela descrição.

Claims (1)

1 / 12
REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 35; e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 5, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno H tipo 2 monoantenário que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno H tipo 2 biantenário que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um monoantenário antígeno H tipo 1 que
2 / 12 compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].
2. Anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (VH CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:2; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (VH CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:3; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (VH CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:4; e (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (VL CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:6; uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (VL CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99
3 / 12 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7; e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (VL CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8, ou uma sequência de aminoácido que apresenta pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 porcento de identidade com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8.
3. Anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende (i), (ii), (iii), (iv), (v) ou (vi), da maneira a seguir ou qualquer combinação dos mesmos: (i) uma VH CDR1 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2, em que a variante consiste em uma substituição Y→A na posição 33 de acordo com numeração Kabat; e/ou (ii) uma VH CDR3 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4, em que a variante consiste em uma substituição Y→A na posição 104 de acordo com numeração Kabat; (iii) uma VH CDR3 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4, em que a variante consiste em uma substituição H→A na posição 106 de acordo com numeração Kabat; (iv) uma VL CDR1 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6, em que a variante consiste em uma substituição Y→A na posição 30 de acordo com numeração Kabat; (v) uma VL CDR2 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7, em que a variante consiste em uma substituição G→A na posição 50 de acordo com numeração Kabat; ou (vi) uma VL CDR3 compreendendo uma variante da sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8, em que a variação consiste em um T→S substituição na posição 93 de acordo com numeração Kabat.
4 / 12
4. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (VH CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 2; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2 (VH CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 3; uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3 (VH CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 4; e (b) uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (VL CDR1), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 6; uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 2 (VL CDR2), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 7; e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 3 (VL CDR3), compreendendo a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 8; em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II] a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do
5 / 12 mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno H tipo 2 monoantenário que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno H tipo 2 biantenário que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno H tipo 1 monoantenário que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].
5. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende: uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 35; e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 5, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] ou [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno
6 / 12 monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno H tipo 2 monoantenário que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno H tipo 2 biantenário que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno H tipo 1 monoantenário que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].
6. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO: 10 e uma cadeia leve de imunoglobulina com a sequência de aminoácido apresentada em SEQ ID NO:
11.
7. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ser monoclonal.
8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é monoclonal.
9. Anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 6 ou 7, ou o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.
10. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que é selecionado de um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fv, um anticorpo de cadeia Fv simples (ScFv), e um diacorpo.
11. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
12. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é otimizado por códon para
7 / 12 expressão em uma célula hospedeira.
13. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 11 ou 12.
14. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de controle de expressão operavelmente ligada ao polinucleotídeo que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
15. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é um vetor de expressão em que a sequência de controle de expressão compreende um promotor.
16. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor recombinante como definido na reivindicação 13.
17. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 15.
18. Método para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que é capaz de se ligar especificamente: a um antígeno biantenário LeB/LeB compreendendo estrutura [I] ou estrutura [II], a um antígeno biantenário LeY/LeY compreendendo Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] ou [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV], a um antígeno biantenário LeB/LeY compreendendo Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V], ou [Fucα1-2Galβ1- 3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI], e a um antígeno biantenário LeY/LeB compreendendo Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] ou [Fucα1-2Galβ1- 4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII], e em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo não se liga especificamente a um antígeno monoantenário Lex que
8 / 12 compreende Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], ou a um antígeno biantenário Lex que compreende [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], ou a um antígeno monoantenário LeA que compreende Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], ou a um antígeno H tipo 2 monoantenário que compreende Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], ou a um antígeno H tipo 2 biantenário que compreende (Fucα1- 2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] ou a um antígeno H tipo 1 monoantenário que compreende Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV], o método compreendendo: cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 16 em condições e por um tempo suficientes para expressão pela célula hospedeira do polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para assim obter uma cultura compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e recuperar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a partir da cultura.
19. Conjugado de anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10; e uma molécula de carga útil ligada ao mesmo.
20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: o anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou o conjugado do anticorpo como definido na reivindicação 19 ou como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 35; e um carreador farmacêutico.
21. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a molécula de carga útil é covalentemente ligada por um ligante ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
22. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 21,
9 / 12 caracterizado pelo fato de que o ligante é selecionado de um ligante clivável e um ligante não clivável.
23. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o ligante clivável é um ligante sensível à protease, um ligante sensível ao pH, ou um ligante sensível à glutationa.
24. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o ligante clivável é um ligante sensível à protease compreendendo um dipeptídeo valina-citrulina.
25. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende um grupo maleimida.
26. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma ponte de dissulfeto reduzida em uma região de dobradiça e a ponte de dissulfeto reduzida é acoplada ao grupo maleimida.
27. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende adicionalmente um grupo autodestrutivo.
28. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o grupo autodestrutivo é álcool para- aminobenzílico (PABC).
29. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicação 19, 21 a 28, caracterizado pelo fato de que a molécula de carga útil é selecionada de um agente terapêutico e um indicador detectável.
30. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a molécula de carga útil é um agente terapêutico selecionado de um agente anti-mitótico que alveja tubulina, uma toxina à base de peptídeo, um dímero de pirrolobenzodiazepina (PBD), um
10 / 12 antibiótico, um inibidor da síntese de pirimidina, um anti-metabólito, um agente de alquilação de DNA, e um inibidor de topoisomerase.
31. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a molécula de carga útil é selecionada de um maintansinóide, uma auristatina, doxorubicina, caliqueamicina, um dímero de PBD, monometilauristatina E (MMAE) e monometilauristatina F (MMAF).
32. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a molécula de carga útil é um indicador detectável.
33. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o indicador detectável é selecionado de um radionuclídeo, um corante, um radiometal, uma fração fluorescente, um agente de contraste MRI, uma microbolha, um nanotubo de carbono, uma partícula de ouro, fluordesoxiglicose, uma enzima, um cromóforo, e um marcador radiopaco.
34. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o indicador detectável é um radionuclídeo 68 64 86 89 124 99m 123 111 177 131 76 selecionado de Ga, Cu, Y, Zr, I, Tc, I, In, Lu, I, Br, 78 Zr, 18F e 124T.
35. Conjugado de anticorpo de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um quelante de radionuclídeo selecionado de DOTA marcado com maleimida, N- hidroxisuccinimida-DOTA e desferrioxamina (DFO).
36. Método para tratar ou detectar câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição farmacêutica como definida na reivindicação 20 a um sujeito que precisa do mesmo.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o sujeito apresenta ou é suspeito de apresentar um câncer que é selecionado de câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de
11 / 12 pulmão, câncer linfático, câncer de fígado, câncer de ovário, pancreático, câncer de próstata, câncer uterino e carcinoma de célula escamosa.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de um adenocarcinoma gástrico, um adenocarcinoma mucinoso de estômago, um adenocarcinoma gástrico não diferenciado, um carcinoma gástrico de célula em anel de sinete, um adenocarcinoma de cólon, um carcinoma ductal de mama invasivo, um carcinoma hepatocelular, um adenocarcinoma pulmonar, um carcinoma de célula escamosa, um adenocarcinoma de linfonodo metastático, um adenocarcinoma ovariano mucinoso, um adenocarcinoma ductal pancreático, um adenocarcinoma papilar pancreático, um adenocarcinoma de próstata, e um de próstata endometrióide.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 38, caracterizado pelo fato de que administrar compreende administrar por uma via que é selecionada de intravenosa, parenteral, intragástrica, intrapleural, intrapulmonar, intrarretal, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral, subcutânea, oral, tópica, transdérmica, intracisternal, intratecal, intranasal e intramuscular.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 39, caracterizado pelo fato de que o sujeito está recebendo ou recebeu previamente: (a) uma terapia imunossupressora; (b) uma molécula de ponto de controle imunológico estimulatório; (c) uma terapia de radiação; (d) uma quimioterapia (e) uma imunoterapia celular; ou (f) qualquer combinação de (a)-(e).
41. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações
12 / 12 1 a 10, a célula hospedeira como definida na reivindicação 16 ou 17, o conjugado do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 19, 21 a 35, ou a composição como definida na reivindicação 20, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento, diagnóstico, ou detecção de câncer.
42. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, o polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 11 ou 12, o vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 16 ou 17, o conjugado do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 21-35, ou a composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de ser para uso na preparação de um medicamento para o tratamento, diagnóstico ou detecção de câncer.
BR112020023380-3A 2018-05-31 2019-05-30 anticorpo isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, polinucleotídeo isolado, vetor recombinante, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo ou um fragmento de aglutinação ao antígeno do mesmo e para tratar ou detectar câncer, conjugado de anticorpo ,e, composição farmacêutica BR112020023380A2 (pt)

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