CN113698485A - 抗-b7-h4抗体及免疫缀合物 - Google Patents

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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明提供抗‑B7‑H4抗体及免疫缀合物以及其使用方法。

Description

抗-B7-H4抗体及免疫缀合物
本申请是申请日为2015年09月11日、中国申请号为201580048445.X、发明名称为“抗-B7-H4抗体及免疫缀合物”的发明申请的分案申请。
本申请主张2014年9月12日申请之美国临时申请第62/049,701号之优先权，该临时申请以全文引用的方式并入本文中以达成任何目的。
序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。该序列表以2015年9月5日创建的题目为“2015-09-11_01146-0038-00PCT_Sequence_Listing_ST25.txt”的文件提供，其大小为200,604个字节。通过援引将该电子格式的序列表中的信息完整收入本文。
发明领域
本发明关于抗-B7-H4抗体及免疫缀合物以及其使用方法。
发明背景
B7-H4为I型跨膜蛋白且为提供辅助信号与T细胞受体抗原信号一起之蛋白质B7超家族一员。B7-H4为T细胞功能之负调控剂且T细胞之接合抑制其生长、细胞因子分泌及细胞毒性。小鼠中B7-H4之消除不影响免疫细胞稳态且无自体免疫征象。Zhu等人,Blood,113(8):1759-1767(2009)；Suh等人,Molecular and Cellular Biology,26(17):6403-6411(2006)。B7-H4之受体未知且未鉴别。
人B7-H4为282个氨基酸之蛋白质(包括氨基端信号序列)，其中在氨基端信号序列切割后预测约227个氨基酸在细胞外间隙中。B7-H4包含Ig样V结构域、Ig样C结构域、跨膜结构域及短胞质尾。
三重阴性乳腺癌(TNBC)占所有乳腺癌报导病例不到20％，且对临床医师而言，仍然为重大挑战。因为此等肿瘤对激素受体(ER及PR)及人表皮生长因子受体2(Her2)非阳性，所以TNBC患者不适合已有效治疗大部分彼等受体阳性乳腺癌的使用ER/PR/Her2受体拮抗剂之靶向疗法。基底样及富含Her2之两种其他乳腺癌亚型不大可能表达ER或PR且大部分基底样癌症亦为Her2阴性的。虽然TNBC与基底样均缺乏ER/PR及Her2表达，但仅仅80％TNBC显示与侵袭性基底样亚型相关之分子型态。出于此原因，TNBC及基底样视为不同亚型，但具有重迭之特征。TNBC及基底样具有侵袭性不如其他之各种组织学亚型(分泌性、腺样囊性、髓性、侵袭性导管及化生性)，但整体上大部分与早期发作及快速进展相关。一旦疾病变成转移性，自复发至死亡之中值时间比乳腺癌其他形式短得多。TNBC之当前治疗库包括蒽环霉素(anthracycline)、紫杉烷(taxane)、铂剂及使用生物试剂之临床试验。然而，尚无TNBC管理之公认标准照护且此等患者之预后仍然不良。
靶向TNBC之方法已限于寻找藉由抑制DNA修复(Chk1、Chk2 PARP)、血管生成(VEGF及VEGA)、EGFR、PI3K/Akt/mTor及Src信号传导路径来侵袭癌症之秘密途径。几种靶向方法包括雄激素受体，其在超过70％乳腺癌中表达；及FGFR，据报导其在4％TNBC中扩增。迄今为止，治疗TNBC尚无证实之分子标靶。
B7-H4为能够经由其共抑制信号以及T细胞受体对抗原依赖性信号传导下调免疫系统之B7家族一员。B7-H4在正常人组织中很少表达，但在包括女性生殖系统癌症(乳腺癌、卵巢癌及子宫内膜癌)之无数人癌症中高度过度表达。据报导B7-H4之流行率在构成原发性(约95％)及转移性乳腺癌(约97％)之侵袭性导管及小叶癌中为高的。虽然B7-H4染色增加与阴性PR及Her2状态相关，但表达与肿瘤级别或阶段无关。除彼等类型乳腺癌中高比例B7H4染色细胞之外，浸润性淋巴球数目亦伴随降低。近来，在肺部转移性乳腺癌之B7-H4基因剔除模型中，作者报导B7-H4-/-小鼠具有较少肺肿瘤结，且展示与野生型小鼠相比，对肿瘤攻击增强之存活及记忆反应。此归因于结合B7-H4-Ig融合蛋白之肿瘤相关嗜中性白血球对CD4及CD8细胞之免疫抑制作用。此亦可解释为何SCID小鼠中植入之过度表达B7-H4之SKOV3细胞比野生型SKOV3细胞更具侵袭性地生长。此外，展示在SKBR3细胞中B7-H4 mRNA及蛋白质之基因敲低导致增加的胱天蛋白酶活性及细胞凋亡。总体而言，存在足够证据确保研究B7-H4为乳腺癌之分子标靶。
在本领域中需要靶向B7-H4之药剂，以诊断及治疗B7-H4相关病症，诸如癌症。本发明实现此需要且提供其他益处。
发明概述
本发明提供抗-B7-H4抗体及免疫缀合物以及其使用方法。
在一些实施方案中，提供结合B7-H4之分离抗体，其包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3，及(iii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；或
(b)(i)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3，及(iii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2。
在一些实施方案中，该抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3；或
(b)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。
在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:53之重链框架FR3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含：(a)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:47之轻链框架FR3序列。
在一些实施方案中，该抗体包含：
(a)与SEQ ID NO:38之氨基酸序列具有至少95％序列同一性之VH序列；
(b)与SEQ ID NO:126之氨基酸序列具有至少95％序列同一性之VL序列；或
(c)与SEQ ID NO:127之氨基酸序列具有至少95％序列同一性之VH序列；或
(d)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列；或
(e)如(c)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:38或127之VH序列。在一些实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO:126之VL序列。
在一些实施方案中，提供结合B7-H4之分离抗体，其中该抗体包含(a)SEQ ID NO:38之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列；或(b)SEQ ID NO:127之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列。
在一些实施方案中，提供结合B7-H4之分离抗体，其中该抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3；或
(b)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
在本文中描述之任一实施方案中，抗体可为单克隆抗体。在本文中描述之任一实施方案中，抗体可为人、人源化或嵌合抗体。在本文中描述之任一实施方案中，抗体可为结合B7-H4之抗体片段。
在本文中描述之任一实施方案中，抗体可为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。在本文中描述之任一实施方案中，抗体可包含一或多个工程改造半胱氨酸氨基酸残基。在本文中描述之任一实施方案中，该一或多个工程改造半胱氨酸氨基酸残基可位于重链中。在本文中描述之任一实施方案中，该一或多个工程改造半胱氨酸氨基酸残基可位于轻链中。在本文中描述之任一实施方案中，抗体在重链恒定区中可包含至少一个选自A118C及S400C之突变。在本文中描述之任一实施方案中，抗体在轻链恒定区中可包含至少一个选自K149C及V205C之突变。
在一些实施方案中，提供一种结合B7-H4之分离抗体，其中该抗体包含(a)SEQ IDNO:132之重链序列及SEQ ID NO:134之轻链序列；或(b)SEQ ID NO:133之重链序列及SEQID NO:134之轻链序列；或(c)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:140之轻链序列；或(d)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:141之轻链序列；或(e)SEQ ID NO:131之重链序列及SEQ ID NO:140之轻链序列；或(f)SEQ ID NO:131之重链序列及141之轻链序列；或(g)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:142之轻链序列；或(h)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:143之轻链序列；或(i)SEQ ID NO:137之重链序列及SEQ ID NO:138之轻链序列；或(j)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；或(d)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:146之轻链序列；或(e)SEQ ID NO:131之重链序列及SEQ IDNO:145之轻链序列；或(f)SEQ ID NO:131之重链序列及146之轻链序列；或(g)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:147之轻链序列；或(h)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ IDNO:148之轻链序列。
在一些实施方案中，提供一种包含第一半抗体及第二半抗体之双表位抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元。在一些实施方案中，第一表位或第二表位为整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位。在一些实施方案中，第一表位或第二表位不在B7-H4 Ig-V结构域内或不完全在含有B7-H4 Ig-V之结构域内。在一些实施方案中，第一表位在整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内且第二表位不在B7-H4 Ig-V结构域内或不完全在含有B7-H4 Ig-V之结构域内；或其中第一表位不在B7-H4 Ig-V结构域内或不完全在含有B7-H4 Ig-V之结构域内，且第二表位在整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内。在一些实施方案中，第一表位及第二表位各独立地选自以下各者：
a)在整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位；
b)在整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位；以及
c)在整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位。
在一些实施方案中，含有B7-H4 Ig-V之结构域具有SEQ ID NO:73之氨基酸29-157之序列。在一些实施方案中，含有B7-H4 Ig-C之结构域具有SEQ ID NO:73之氨基酸158-250之序列。
在一些实施方案中，
a)第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位，且第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位；或
b)第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位，且第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位；或
c)第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位，且第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位；或
d)第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位，且第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位；或
e)第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位，且第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位；或
f)第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位，且第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位。
在一些实施方案中，第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位，且第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位；或其中第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位，且第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位。
在一些实施方案中，第一半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3；
(b)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:129之氨基酸序列之HVR-L3；
(c)SEQ ID NO:38之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列；或
(d)SEQ ID NO:127之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列。
在一些实施方案中，第二半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3；
(b)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:129之氨基酸序列之HVR-L3；
(c)SEQ ID NO:38之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列；或
(d)SEQ ID NO:127之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列。
在一些实施方案中，第一半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:63之氨基酸序列之HVR-L3；或
(b)SEQ ID NO:56之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列。
在一些实施方案中，第二半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:63之氨基酸序列之HVR-L3；或
(b)SEQ ID NO:56之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列。
在一些实施方案中，双表位抗体为IgG1或IgG4抗体。在一些实施方案中，第一半抗体含有包含节突变之第一重链恒定区且第二重链含有包含穴突变之第二重链恒定区；或其中第一半抗体含有包含穴突变之第一重链恒定区且第二重链含有包含节突变之第二重链恒定区。在一些实施方案中，双表位抗体为IgG1抗体且其中节突变包含T366W突变。在一些实施方案中，双表位抗体为IgG1抗体且其中穴突变包含至少一个、至少两个或三个选自T366S、L368A及Y407V之突变。在一些实施方案中，双表位抗体为IgG4抗体且其中节突变包含T366W突变。在一些实施方案中，双表位抗体为IgG4抗体且其中穴突变包含至少一个、至少两个或三个选自T366S、L368A及Y407V突变之突变。
在一些实施方案中，提供一种双表位抗体，其中：
a)包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列的第一半抗体；
b)包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列的第一半抗体；
c)包含SEQ ID NO:161或165之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列的第一半抗体；
d)包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列的第一半抗体；
e)包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列的第二半抗体；
f)包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列的第二半抗体；
g)包含SEQ ID NO:161或165之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列的第二半抗体；或
h)包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列的第二半抗体。
在一些实施方案中，提供一种双表位抗体，其中：
a)包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列的第一半抗体，及包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列的第二半抗体；或
b)包含SEQ ID NO:161或165之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列的第一半抗体，及包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列的第二半抗体。
在一些实施方案中，提供一种双表位抗体，其包含第一半抗体及第二半抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中第一半抗体包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列，且第二半抗体包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQID NO:147之轻链序列。
在本文中描述之任一实施方案中，B7-H4可为SEQ ID NO:73之人B7-H4。
在一些实施方案中，提供一种编码本文所述之抗体的分离核酸。在一些实施方案中，提供一种包含该核酸之宿主细胞。在一些实施方案中，提供一种产生本文所述之抗体的方法，其包含培养该宿主细胞，从而产生该抗体。
在一些实施方案中，提供包含本文所述之抗体及细胞毒性剂的免疫缀合物。在一些实施方案中，细胞毒性剂经由抗体序列中工程改造半胱氨酸缀合于抗体。在一些实施方案中，免疫缀合物具有式Ab-(L-D)p，其中：
(a)Ab为权利要求1至18中任一项之抗体；
(b)L为接头；
(c)D为药物；且
(d)p在1-8范围内。
在一些实施方案中，D或细胞毒性剂选自美登木素生物碱(maytansinoid)、奥瑞司他汀(auristatin)、加利车霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)、奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物及1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。在一些实施方案中，D或细胞毒性剂为奥瑞司他汀。在一些实施方案中，D或细胞毒性剂具有式DE
Figure BDA0003169464670000091
且其中R2及R6各为甲基，R3及R4各为异丙基，R5为H，R7为仲丁基，各R8独立地选自CH3、O-CH3、OH及H；R9为H；且R18为-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
在一些实施方案中，D或细胞毒性剂为MMAE。
在一些实施方案中，D或细胞毒性剂为式A之吡咯并苯并二氮卓：
Figure BDA0003169464670000092
其中点线指示C1与C2或C2与C3之间任选的存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且任选地进一步选自卤基或二卤基，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及卤基；
R6及R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及卤基；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及卤基；
Q独立地选自O、S及NH；
R11为H或R，或在Q为O的情况中，为SO3M，其中M为金属阳离子；
R及R'各独立地选自任选地经取代之C1-8烷基、C3-8杂环基及C5-20芳基，且任选地关于基团NRR'，R及R'连同其附着之氮原子一起形成任选地经取代之4、5、6或7员杂环；
R12、R16、R19及R17系如分别针对R2、R6、R9及R7所定义；
R”为C3-12亚烷基，该链可杂有一或多个杂原子及/或任选地经取代之芳环；且
X及X'独立地选自O、S及N(H)。
在一些实施方案中，D或细胞毒性剂具有如下结构：
Figure BDA0003169464670000101
其中n为0或1。
在一些实施方案中，D或细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。在一些实施方案中，D或细胞毒性剂具有选自以下之结构：
Figure BDA0003169464670000111
及
Figure BDA0003169464670000112
在一些实施方案中，细胞毒性剂包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。在一些实施方案中，细胞毒性剂具有下式：
Figure BDA0003169464670000113
其中
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或键结于L之键；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或键结于L之键；
Ra及Rb独立地选自H及任选地经一或多个F取代之C1-C6烷基，
或Ra及Rb形成五或六员杂环基；
T为选自C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)及(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)之栓系基团；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基及杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基及杂芳基独立且任选地经F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2及C1-C6烷基取代，其中烷基任选地经一或多个F取代；
或亚烷基、亚烯基、芳基及杂芳基独立且任选地经键结于L之键取代；
D'为选自以下各者之药物模块：
Figure BDA0003169464670000121
Figure BDA0003169464670000122
及
Figure BDA0003169464670000123
其中波形线指示与T之附着位点；
X1及X2独立地选自O及NR3，其中R3选自H及任选地经一或多个F取代之C1-C6烷基；
R4为H、CO2R或键结于接头(L)之键，其中R为C1-C6烷基或苯甲基；且
R5为H或C1-C6烷基。
在一些实施方案中，细胞毒性剂具有选自以下各者之结构：
Figure BDA0003169464670000124
Figure BDA0003169464670000131
Figure BDA0003169464670000132
及
Figure BDA0003169464670000133
在一些实施方案中，细胞毒性剂包含以下结构：
Figure BDA0003169464670000134
在一些实施方案中，免疫缀合物之接头可由蛋白酶切割。在一些实施方案中，接头包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。在一些实施方案中，接头对酸为不稳定的。在一些实施方案中，接头包含腙。
在一些实施方案中，提供具有下式之免疫缀合物：
Figure BDA0003169464670000135
其中S为硫原子。
在一些实施方案中，提供具有下式之免疫缀合物：
Figure BDA0003169464670000141
其中Ab为本文所述之抗体。
在一些实施方案中，提供具有选自以下各者之式的免疫缀合物：
Figure BDA0003169464670000142
Figure BDA0003169464670000151
Figure BDA0003169464670000152
及
Figure BDA0003169464670000153
其中Ab为本文所述之抗体。
在一些实施方案中，提供具有选自以下各者之式的免疫缀合物：
Figure BDA0003169464670000161
Figure BDA0003169464670000162
及
Figure BDA0003169464670000163
其中Ab为本文所述之抗体。
在任一本文所述之免疫缀合物中，p可在1.4-5、2-5、1-3或1.4-2范围内。
在一些实施方案中，提供一种免疫缀合物，其中该免疫缀合物包含与细胞毒性剂缀合之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000171
其中Ab为结合人B7-H4之抗体，其中该抗体含有包含SEQ ID NO:133之氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:134之氨基酸序列的轻链；且其中该细胞毒性剂与该抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为重链中之A118C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
在一些实施方案中，提供一种免疫缀合物，其中该免疫缀合物包含与细胞毒性剂缀合之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000172
其中Ab为结合人B7-H4之抗体，其中该抗体含有包含SEQ ID NO:134之氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:134之氨基酸序列的轻链；且其中该细胞毒性剂与该抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为重链中之A118C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
在一些实施方案中，提供一种免疫缀合物，其中该免疫缀合物包含与细胞毒性剂缀合之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000173
其中Ab为包含第一半抗体及第二半抗体之双表位抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中第一半抗体包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列，且第二半抗体包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQ ID NO:147之轻链序列；且其中细胞毒性剂与抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为轻链中之K149C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
在一些实施方案中，提供一种免疫缀合物，其中该免疫缀合物包含与细胞毒性剂缀合之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000181
其中Ab为包含第一半抗体及第二半抗体之双表位抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中第一半抗体包含SEQ ID NO:161或165之重链序列及SEQ ID NO:147之轻链序列，且第二半抗体包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；且其中细胞毒性剂与抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为轻链中之K149C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
在一些实施方案中，提供一种免疫缀合物，其中该免疫缀合物包含与细胞毒性剂缀合之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000182
其中Ab为包含第一半抗体及第二半抗体之双表位抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中第一半抗体包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；且其中细胞毒性剂与抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为轻链中之K149C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
在一些实施方案中，提供一种免疫缀合物，其中该免疫缀合物包含与细胞毒性剂缀合之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000183
其中Ab为包含第一半抗体及第二半抗体之双表位抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中第二半抗体包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；且其中细胞毒性剂与抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为轻链中之K149C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
在一些实施方案中，提供药物配制剂，其包含本文所述之免疫缀合物及药学可接受载剂。在一些实施方案中，药物配制剂进一步包含另一治疗剂。在一些实施方案中，另一治疗剂为
Figure BDA0003169464670000191
(贝伐单抗(bevacizumab))。
在一些实施方案中，提供治疗患有B7-H4阳性癌症之个体之方法，该方法包含向该个体施用有效量之本文所述之免疫缀合物。在一些实施方案中，B7-H4阳性癌症选自乳腺癌、卵巢癌及子宫内膜癌。在一些实施方案中，B7-H4阳性癌症为三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌。在一些实施方案中，该方法包含向该个体施用其它治疗剂。在一些实施方案中，其它治疗剂为
Figure BDA0003169464670000192
(贝伐单抗(bevacizumab))。在一些实施方案中，其它治疗剂选自多西他赛(docetaxel)、小红莓(doxorubicin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、卡铂(carboplatin)、帕利他赛(paclitaxel)、nab-帕利他赛、吉西他滨(gemcitabine)、顺铂及PARP抑制剂(诸如奥拉帕尼(olaparib)、依尼帕瑞(iniparib))。
在一些实施方案中，提供抑制B7-H4阳性细胞之增殖的方法，该方法包含将该细胞暴露于本文所述之免疫缀合物容许免疫缀合物与细胞表面上之B7-H4结合的条件下，由此抑制细胞增殖。在一些实施方案中，细胞为乳房、卵巢或子宫内膜癌细胞。在一些实施方案中，细胞为三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌。
在一些实施方案中，提供与标记缀合的本文所述之抗体。在一些实施方案中，标记为正电子发射体。在一些实施方案中，正电子发射体为89Zr。
在一些实施方案中，提供检测生物学样品中人B7-H4之方法，其包含使该生物学样品与本文所述之抗-B7-H4抗体在容许抗-B7-H4抗体与天然存在之人B7-H4结合之条件下接触，且检测生物学样品中在抗-B7-H4抗体与天然存在之人B7-H4之间是否形成复合物。在一些实施方案中，生物学样品为乳腺癌样品、卵巢癌样品或子宫内膜癌样品。在一些实施方案中，生物样本为三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌。
在一些实施方案中，提供检测B7-H4阳性癌症之方法，其包含(i)向患有或怀疑患有B7-H4阳性癌症之个体施用经标记之抗-B7-H4抗体，其中该经标记之抗-B7-H4抗体包含本文所述之抗-B7-H4抗体，及(ii)检测个体中经标记之抗-B7-H4抗体，其中经标记之抗-B7-H4抗体的检测指示个体中之B7-H4阳性癌症。在一些实施方案中，经标记之抗-B7-H4抗体包含与正电子发射体结合之抗-B7-H4抗体。在一些实施方案中，正电子发射体为89Zr。
本发明涉及下述实施方案。
1.一种结合B7-H4之分离抗体，其中该抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3，及(iii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；或
(b)(i)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3，及(iii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2。
2.如实施方案1之抗体，其中该抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3；或
(b)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。
3.如实施方案1或实施方案2之抗体，其进一步包含SEQ ID NO:53之重链框架FR3序列。
4.如前述实施方案中任一项之抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
5.如前述实施方案中任一项之抗体，其包含SEQ ID NO:47之轻链框架FR3序列。
6.如前述实施方案中任一项之抗体，其中该抗体包含
(a)与SEQ ID NO:38之氨基酸序列具有至少95％序列同一性之VH序列；
(b)与SEQ ID NO:126之氨基酸序列具有至少95％序列同一性之VL序列；或
(c)与SEQ ID NO:127之氨基酸序列具有至少95％序列同一性之VH序列；或
(d)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列；或
(e)如(c)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
7.如前述实施方案中任一项之抗体，其包含SEQ ID NO:38或127之VH序列。
8.如前述实施方案中任一项之抗体，其包含SEQ ID NO:126之VL序列。
9.一种结合B7-H4之分离抗体，其中该抗体包含(a)SEQ ID NO:38之VH序列及SEQID NO:126之VL序列；或(b)SEQ ID NO:127之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列。
10.一种结合B7-H4之分离抗体，其中该抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3；或
(b)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
11.如前述实施方案中任一项之抗体，其为单克隆抗体。
12.如前述实施方案中任一项之抗体，其为人、人源化或嵌合抗体。
13.如前述实施方案中任一项之抗体，其为结合B7-H4之抗体片段。
14.如前述实施方案中任一项之抗体，其为IgG1、IgG2a或IgG2b抗体。
15.如前述实施方案中任一项之抗体，其中该抗体包含一或多个工程改造半胱氨酸氨基酸残基。
16.如实施方案15之抗体，其中该一或多个工程改造半胱氨酸氨基酸残基位于轻链中。
17.如实施方案15之抗体，其中该一或多个工程改造半胱氨酸氨基酸残基位于重链中。
18.如实施方案17之抗体，其中该抗体在重链恒定区中包含至少一个选自A118C及S400C之突变。
19.如实施方案16之抗体，其中该抗体在轻链恒定区中包含至少一个选自K149C及V205C之突变。
20.一种结合B7-H4之分离抗体，其中该抗体包含(a)SEQ ID NO:132之重链序列及SEQ ID NO:134之轻链序列；或(b)SEQ ID NO:133之重链序列及SEQ ID NO:134之轻链序列；或(c)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:140之轻链序列；或(d)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:141之轻链序列；或(e)SEQ ID NO:131之重链序列及SEQ ID NO:140之轻链序列；或(f)SEQ ID NO:131之重链序列及141之轻链序列；或(g)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:142之轻链序列；或(h)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:143之轻链序列；或(i)SEQ ID NO:137之重链序列及SEQ ID NO:138之轻链序列；或(j)SEQ IDNO:130之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；或(d)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQID NO:146之轻链序列；或(e)SEQ ID NO:131之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；或(f)SEQ ID NO:131之重链序列及146之轻链序列；或(g)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQID NO:147之轻链序列；或(h)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:148之轻链序列。
21.一种双表位抗体，其包含第一半抗体及第二半抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位之第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位之第二VH/VL单元。
22.如实施方案21之双表位抗体，其中该第一表位或该第二表位为整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位。
23.如实施方案21或实施方案22之双表位抗体，其中该第一表位或该第二表位不在B7-H4 Ig-V结构域内或不完全在含有B7-H4 Ig-V之结构域内。
24.如实施方案23之双表位抗体，其中该第一表位在整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内且该第二表位不在B7-H4 Ig-V结构域内或不完全在含有B7-H4 Ig-V之结构域内；或其中该第一表位不在B7-H4 Ig-V结构域内或不完全在含有B7-H4 Ig-V之结构域内，且该第二表位在整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内。
25.如实施方案21至24中任一项之双表位抗体，其中该第一表位及该第二表位各独立地选自：
a)在整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位；
b)在整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位；以及
c)在整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位。
26.如实施方案25之双表位抗体，其中该含有B7-H4 Ig-V之结构域具有SEQ IDNO:73之氨基酸29-157之序列。
27.如实施方案25或实施方案26之双表位抗体，其中含有B7-H4 Ig-C之结构域具有SEQ ID NO:73之氨基酸158-250之序列。
28.如实施方案21至27中任一项之双表位抗体，其中：
a)该第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位，且该第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位；或
b)该第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位，且该第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位；或
c)该第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位，且该第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位；或
d)该第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位，且该第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位；或
e)该第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位，且该第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位；或
f)该第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位，且该第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域内的表位。
29.如实施方案28之双表位抗体，其中该第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4Ig-V之结构域内的表位，且该第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位；或其中该第一半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之结构域内的表位，且该第二半抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域内的表位。
30.如实施方案21至24中任一项之双表位抗体，其中该第一半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3；
(b)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:129之氨基酸序列之HVR-L3；
(c)SEQ ID NO:38之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列；或
(d)SEQ ID NO:127之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列。
31.如实施方案21至24中任一项之双表位抗体，其中该第二半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3；
(b)(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:129之氨基酸序列之HVR-L3；
(c)SEQ ID NO:38之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列；或
(d)SEQ ID NO:127之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列。
32.如实施方案21至24及31中任一项之双表位抗体，其中该第一半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:63之氨基酸序列之HVR-L3；或
(b)SEQ ID NO:56之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列。
33.如实施方案21至24及30中任一项之双表位抗体，其中该第二半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ IDNO:63之氨基酸序列之HVR-L3；或
(b)SEQ ID NO:56之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列。
34.如实施方案21至33中任一项之双表位抗体，其中该抗体为IgG1或IgG4抗体。
35.如实施方案21至34中任一项之双表位抗体，其中该第一半抗体含有包含节突变之第一重链恒定区且第二重链含有包含穴突变之第二重链恒定区；或其中该第一半抗体含有包含穴突变之第一重链恒定区且第二重链含有包含节突变之第二重链恒定区。
36.如实施方案21至35中任一项之双表位抗体，其中该抗体为IgG1抗体且其中该节突变包含T366W突变。
37.如实施方案21至36中任一项之双表位抗体，其中该抗体为IgG1抗体且其中该穴突变包含至少一个、至少两个或三个选自T366S、L368A及Y407V之突变。
38.如实施方案21至35中任一项之双表位抗体，其中该抗体为IgG4抗体且其中该节突变包含T366W突变。
39.如实施方案21至35中任一项之双表位抗体，其中该抗体为IgG4抗体且其中该穴突变包含至少一个、至少两个或三个选自T366S、L368A及Y407V突变之突变。
40.如实施方案21至35中任一项之双表位抗体，其中：
a)该第一半抗体包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列；
b)该第一半抗体包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列；
c)该第一半抗体包含SEQ ID NO:161或165之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列；
d)该第一半抗体包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列；
e)该第二半抗体包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列；
f)该第二半抗体包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列；
g)该第二半抗体包含SEQ ID NO:161或165之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列；或
h)该第二半抗体包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列。
41.如实施方案21至35中任一项之双表位抗体，其中：
a)该第一半抗体包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列，且该第二半抗体包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列；或
b)该第一半抗体包含SEQ ID NO:161或165之重链序列及SEQ ID NO:147或148之轻链序列，且该第二半抗体包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145或146之轻链序列。
42.一种双表位抗体，其包含第一半抗体及第二半抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中该第一半抗体包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列，且该第二半抗体包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQ ID NO:147之轻链序列。
43.一种双表位抗体，其包含第一半抗体及第二半抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中该第一半抗体包含SEQ ID NO:161或165之重链序列及SEQ ID NO:147之轻链序列，且该第二半抗体包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列。
44.如前述实施方案中任一项之抗体，其中B7-H4为SEQ ID NO:73之人B7-H4。
45.一种分离核酸，其编码：
a)如实施方案1至20及44中任一项之抗体；
b)如实施方案21至44中任一项之双表位抗体，
c)如实施方案21至44中任一项之双表位抗体之第一半抗体，或
d)如实施方案21至44中任一项之双表位抗体之第二半抗体。
46.一种宿主细胞，其包含如实施方案45之核酸。
47.一种产生抗体之方法，其包含培养如实施方案45之宿主细胞，从而产生该抗体或半抗体。
48.一种免疫缀合物，其包含如实施方案1至44中任一项之抗体及细胞毒性剂。
49.如实施方案48之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂经由该抗体序列中工程改造半胱氨酸与该抗体缀合。
50.如实施方案48或实施方案49之免疫缀合物，其具有式Ab-(L-D)p，其中：
(a)Ab为如实施方案1至44中任一项之抗体；
(b)L为接头；
(c)D为该细胞毒性剂；及
(d)p在1-8范围内。
51.如实施方案48至50中任一项之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂选自美登木素生物碱(maytansinoid)、奥瑞司他汀(auristatin)、加利车霉素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)、奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物及1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。
52.如实施方案48至51中任一项之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂为奥瑞司他汀。
53.如实施方案52之免疫缀合物，其中D具有式DE
Figure BDA0003169464670000271
且其中R2及R6各为甲基，R3及R4各为异丙基，R5为H，R7为仲丁基，各R8独立地选自CH3、O-CH3、OH及H；R9为H；且R18为-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
54.如实施方案53之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂为MMAE。
55.如实施方案49至51中任一项之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂为式A之吡咯并苯并二氮卓：
Figure BDA0003169464670000281
其中点线指示C1与C2或C2与C3之间任选的存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且任选地进一步选自卤基或二卤基，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及卤基；
R6及R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及卤基；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及卤基；
Q独立地选自O、S及NH；
R11为H或R，或在Q为O的情况中，为SO3M，其中M为金属阳离子；
R及R'各独立地选自任选地经取代之C1-8烷基、C3-8杂环基及C5-20芳基，且任选地关于基团NRR'，R及R'连同其附着之氮原子一起形成任选地经取代之4、5、6或7员杂环；
R12、R16、R19及R17如分别针对R2、R6、R9及R7所定义；
R”为C3-12亚烷基，该链可杂有一或多个杂原子及/或任选地经取代之芳环；且
X及X'独立地选自O、S及N(H)。
56.如实施方案55之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂具有如下结构：
Figure BDA0003169464670000282
其中n为0或1。
57.如实施方案49至51中任一项之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂为奈莫柔比星衍生物。
58.如实施方案57之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂具有选自以下各者之结构：
Figure BDA0003169464670000291
及
Figure BDA0003169464670000292
59.如实施方案49至51中任一项之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。
60.如实施方案59之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂具有下式：
Figure BDA0003169464670000293
其中
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或键结于L之键；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或键结于L之键；
Ra及Rb独立地选自H及任选地经一或多个F取代之C1-C6烷基，
或Ra及Rb形成五或六员杂环基；
T为选自C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)及(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)之栓系基团；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基及杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基及杂芳基独立且任选地经F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2及C1-C6烷基取代，其中烷基任选地经一或多个F取代；
或亚烷基、亚烯基、芳基及杂芳基独立且任选地经键结于L之键取代；
D'为选自以下各者之药物模块：
Figure BDA0003169464670000301
Figure BDA0003169464670000302
及
Figure BDA0003169464670000303
其中波形线指示与T之附着位点；
X1及X2独立地选自O及NR3，其中R3选自H及任选地经一或多个F取代之C1-C6烷基；
R4为H、CO2R或键结于接头(L)之键，其中R为C1-C6烷基或苯甲基；且
R5为H或C1-C6烷基。
61.如实施方案59或实施方案60之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂具有选自以下各者之结构：
Figure BDA0003169464670000311
Figure BDA0003169464670000312
及
Figure BDA0003169464670000313
62.如实施方案59或实施方案60之免疫缀合物，其中该细胞毒性剂包含如下结构：
Figure BDA0003169464670000314
63.如实施方案50至62中任一项之免疫缀合物，其中该接头可由蛋白酶切割。
64.如实施方案63之免疫缀合物，其中该接头包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。
65.如实施方案50至62中任一项之免疫缀合物，其中该接头对酸为不稳定。
66.如实施方案65之免疫缀合物，其中该接头包含腙。
67.如实施方案48至52中任一项之免疫缀合物，其具有下式：
Figure BDA0003169464670000321
其中S为硫原子。
68.如实施方案49、50或55之免疫缀合物，其具有下式：
Figure BDA0003169464670000322
69.如实施方案49、50、57或58之免疫缀合物，其具有选自以下各者之式：
Figure BDA0003169464670000323
Figure BDA0003169464670000331
Figure BDA0003169464670000332
及
Figure BDA0003169464670000341
70.如实施方案49、50及59至62中任一项之免疫缀合物，其具有选自以下各者之结构：
Figure BDA0003169464670000342
Figure BDA0003169464670000343
及
Figure BDA0003169464670000351
71.如实施方案50至70中任一项之免疫缀合物，其中p在2-5或1.4-2范围内。
72.如实施方案50至71中任一项之免疫缀合物，其包含如实施方案9、10、20或42之抗体。
73.一种药物配制剂，其包含如实施方案49至72中任一项之免疫缀合物及药学可接受载剂。
74.如实施方案73之药物配制剂，其进一步包含其它治疗剂。
75.如实施方案74之药物配制剂，其中该其它治疗剂为
Figure BDA0003169464670000352
(贝伐单抗(bevacizumab))。
76.一种治疗患有B7-H4阳性癌症之个体之方法，该方法包含向该个体施用有效量之如实施方案47至72中任一项之免疫缀合物。
77.如实施方案76之方法，其中该B7-H4阳性癌症选自乳腺癌、卵巢癌及子宫内膜癌。
78.如实施方案76或77之方法，其中该B7-H4阳性癌症为三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌。
79.如实施方案76至78中任一项之方法，其进一步包含向该个体施用其它治疗剂。
80.如实施方案79之方法，其中该其它治疗剂为
Figure BDA0003169464670000353
(贝伐单抗)。
81.一种抑制B7-H4阳性细胞之增殖的方法，该方法包含将该细胞暴露于如实施方案48至72中任一项之免疫缀合物在容许该免疫缀合物与该细胞表面上之B7-H4结合的条件下，由此抑制该细胞增殖。
82.如实施方案81之方法，其中该细胞为乳腺、卵巢或子宫内膜癌细胞。
83.如实施方案81或82之方法，其中该细胞为三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌。
84.如实施方案1至44中任一项之抗体，其缀合于标记物。
85.如实施方案84之抗体，其中该标记物为正电子发射体。
86.如实施方案85之抗体，其中该正电子发射体为89Zr。
87.一种检测生物学样品中人B7-H4之方法，其包含使该生物学样品与如实施方案1至44及84至86中任一项之抗-B7-H4抗体在容许该抗-B7-H4抗体与天然存在之人B7-H4结合的条件下接触，且检测该抗-B7-H4抗体与该生物学样品中天然存在之人B7-H4之间是否形成复合物。
88.如实施方案87之方法，其中该抗-B7-H4抗体为如实施方案9、10、20、42或43之抗体。
89.如实施方案87或实施方案88之方法，其中该生物学样品为乳腺癌样品、卵巢癌样品或子宫内膜癌样品。
90.如实施方案87至89中任一项之方法，其中该生物学样品为三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌。
91.一种检测B7-H4阳性癌症之方法，其包含(i)向患有或怀疑患有B7-H4阳性癌症之受试者施用经标记之抗-B7-H4抗体，其中该经标记之抗-B7-H4抗体包含如实施方案1至44中任一项之抗-B7-H4抗体，及(ii)检测该个体中该经标记之抗-B7-H4抗体，其中该经标记之抗-B7-H4抗体的检测指示该受试者中之B7-H4阳性癌症。
92.如实施方案91之方法，其中该经标记之抗-B7-H4抗体为经标记之如实施方案9、10、20、43或44之抗体。
93.如实施方案91或实施方案92之方法，其中该经标记之抗-B7-H4抗体包含缀合于正电子发射体之抗-B7-H4抗体。
94.如实施方案93之抗体，其中该正电子发射体为89Zr。
95.一种免疫缀合物，其包含缀合于细胞毒性剂之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000361
其中Ab为结合人B7-H4之抗体，其中该抗体含有包含SEQ ID NO:
133之氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:134之氨基酸序列的轻链；且其中该细胞毒性剂与该抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为重链中之A118C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
96.一种免疫缀合物，其包含缀合于细胞毒性剂之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000371
其中Ab为结合人B7-H4之抗体，其中该抗体含有包含SEQ ID NO:132之氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:134之氨基酸序列的轻链；且其中该细胞毒性剂与该抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为重链中之A118C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
97.一种免疫缀合物，其包含缀合于细胞毒性剂之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000372
其中Ab为包含第一半抗体及第二半抗体之双表位抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中该第一半抗体包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列，且该第二半抗体包含SEQ ID NO:162或166之重链序列及SEQ ID NO:147之轻链序列；且其中该细胞毒性剂与该抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为轻链中之K149C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
98.一种免疫缀合物，其包含缀合于细胞毒性剂之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000373
其中Ab为包含第一半抗体及第二半抗体之双表位抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中该第一半抗体包含SEQ ID NO:161或165之重链序列及SEQ ID NO:147之轻链序列，且该第二半抗体包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；且其中该细胞毒性剂与该抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为轻链中之K149C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
99.一种免疫缀合物，其包含缀合于细胞毒性剂之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000381
其中Ab为包含第一半抗体及第二半抗体之双表位抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中该第一半抗体包含SEQ ID NO:159或163之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；且其中该细胞毒性剂与该抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为轻链中之K149C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
100.一种免疫缀合物，其包含缀合于细胞毒性剂之抗体(Ab)且具有以下结构：
Figure BDA0003169464670000382
其中Ab为包含第一半抗体及第二半抗体之双表位抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位的第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位的第二VH/VL单元，其中该第二半抗体包含SEQ ID NO:160或164之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；且其中该细胞毒性剂与该抗体之一或多个工程改造半胱氨酸缀合，其中该工程改造半胱氨酸为轻链中之K149C半胱氨酸替代；且其中p为1.4-2。
附图简述
图1展示如实例A中所述各种组织中人B7-H4基因表达水平之图示。
图2展示如实例B中所述，藉由原位杂交，乳房癌样品中B7-H4之表达。
图3A-3E展示(3A)所有乳腺癌亚型中B7-H4表达之流行率，(3B)乳腺癌亚型中B7-H4染色之0、1+、2+及3+水平之流行率，(3C)乳房肿瘤中B7-H4之整体表达(藉由Western分析)，(3D)原发性乳房肿瘤中B7-H4之表达(藉由Western分析)，(3E)卵巢瘤中B7-H4之表达，如实例B中所述。
图4A-4B展示(4A)如实例中所述产生之某些抗-B7-H4单克隆抗体之特性，及(4B)本文所述之抗-B7-H4单克隆抗体之表位分组。
图5展示鼠类抗体1D11、32D6、9B9及22C10之轻链及重链可变区序列之比对。
图6展示鼠类抗体mu1D11及其人源化变异体之轻链可变区序列的比对。
图7展示鼠类抗体mu1D11及其人源化变异体之重链可变区序列的比对。
图8展示鼠类抗体mu22C10及其人源化变异体之轻链可变区序列。
图9展示鼠类抗体mu22C10及其人源化变异体之重链可变区序列。
图10展示来自人、黑猩猩、食蟹猕猴、大鼠及小鼠之B7-H4的比对。
图11展示抗-B7-H4抗体之物种交叉反应性。
图12展示嵌合抗体ch1D11及ch22C10及各种人源化变异体之亲和力测量。
图13展示抗-B7-H4抗体之内化，如藉由抗-B7-H4 9B9抗体之染色与SK-BR3细胞中EGF染色之重迭所证实。
图14展示抗-B7-H4抗体可到达MX-1之溶酶体。
图15展示抗-B7-H4免疫缀合物证实在MX-1乳腺癌异种移植物中之功效。
图16展示抗-B7-H4免疫缀合物证实在HBCX-24乳腺癌异种移植物中之功效。
图17展示抗-B7-H4免疫缀合物证实在MX-1乳腺癌异种移植物中之功效。
图18展示抗-B7-H4免疫缀合物证实在MX-1乳腺癌异种移植物中之功效。
图19A-19B展示(19A)藉由FACS及免疫组织化学，B7-H4在HCC-1569x2乳腺癌异种移植物上之表达，及(19B)抗-B7-H4免疫缀合物证实在HCC-1569x2乳腺癌异种移植物中之功效。
图20A-20B展示在正常人组织中之B7-H4表达：(20A)藉由来自各种正常人组织之蛋白质溶解物、过度表达B7-H4之293细胞及人乳腺癌之Western印迹法，使用mAb A57.1；以及(20B)藉由与人乳腺癌相比，在正常人胰脏、乳房、肾、肺及肝中免疫组织化学。
图21小图A-D展示hu1D11v1.9_VarD结合于重组人B7-H4之表位定位。(A)嵌合Ig-结构域及可溶性人B7-H4-IgV-Fc融合蛋白之质粒表达构建体之图；(B)检测hu1D11v1.9_VarD与B7-H4(Ig-V):MolX(Ig-C,TM,CD)之结合；(C)表达重组人B7-H4之293细胞上hu1D11v1.9_VarD经B7-H4-(Ig-V)-hIgG1Fc融合蛋白置换；以及(D)hu1D11v1.9_VarD与瞬时表达重组人B7-H4 S114A糖基化突变体之293细胞结合。
图22A-22B展示h1D11v1.9_VarC2及h1D11v1.9_VarD之(22A)轻链及(22B)重链之氨基酸序列。
图23A-23B展示(23A)hu1D11v1.9_VarC2及hu1D11v1.9_VarD对人、食蟹猕猴、小鼠及大鼠B7-H4之亲和力以及对在乳腺癌细胞系MX-1中表达之内源性人B7-H4的亲和力；以及(23B)h1D11v1.9_VarD抗体-药物缀合物针对过度表达重组人B7-H4之293细胞的体外效能。
图24A-24C展示(24A)藉由FACS(顶部)及IHC(底部)，B7-H4在HCC-1569x2(Her2+/ER-)乳腺癌细胞上之表达；以及(24B)h1D11v1.9_VarC2及(24C)h1D11v1.9_VarD抗体-药物缀合物在HCC-1569x2(Her2+/ER-)乳腺癌异种移植模型中之功效。
图25A-25B展示(25A)藉由FACS(顶部)及IHC(底部)，B7-H4在MX-1(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌细胞上之表达；以及(25B)h1D11v1.9_VarD抗体-药物缀合物在MX-1(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌异种移植模型中之功效。
图26A-26B展示(26A)藉由FACS(顶部)及IHC(底部)，B7-H4在TNBC(Her2-/ER-/PR-)肿瘤细胞上之表达；以及(26B)hu1D11v1.9_VarD抗体-药物缀合物在TNBC(Her2-/ER-/PR-)肿瘤异种移植模型中之功效。
图27展示89ZR标记之hu1D11v1.9_VarD IgG1 A118C(％ID/g)的组织吸收。图展示Ab-1及抗-gD抗体在脾、肾、肝、肺及血液中之分布。
图28小图A-D展示经89Zr标记之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C(右边)及经89Zr标记之同种型对照(左边)在来自每组两只大鼠之代表性大鼠中之组织分布：(A)给药后16小时、(B)给药后48小时、(C)给药后120小时；以及(D)hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C对Mx-1细胞上内源性B7-H4及来自各种物种之在293细胞中表达之B7-H4的识别。
图29展示施用hu1D11v1.9-VarD、同种型匹配抗体或作为阳性对照之mCTLA-4Ig的脑脊髓炎(EAE)模型小鼠中之发炎。
图30展示双表位抗体节-h1D11v1.9 varD:穴-h22C10v2.7(“KH1D+22C”)或节-h22C10v2:穴-7h1D11v1.9varD(“KH22C+1D”)及亲本单表位抗体与MX-1细胞之表面的结合。
图31A-31D展示单表位抗-B7-H4抗体(31A、31B)及双表位抗-B7H4抗体(31C、31D)之膜染色及内化。
图32A-32D展示单表位及双表位抗-B7H4抗体针对B7-H4阴性MCF-7细胞(32A)、B7-H4阳性293hB7-H4细胞(32B)、B7-H4阳性MX-1细胞(32C)及B7-H4阳性SKBR3细胞(32D)之体外效能。
发明详述
I.定义
出于本文之目的，“接受体人框架”为包含来源于如以下所定义之人免疫球蛋白框架或人共同框架之轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架之氨基酸序列的框架。“来源于”人免疫球蛋白框架或人共同框架之接受体人框架可包含人免疫球蛋白框架或人共同框架之相同氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化之数目为10个或10个以下、9个或9个以下、8个或8个以下、7个或7个以下、6个或6个以下、5个或5个以下、4个或4个以下、3个或3个以下、或2个或2个以下。在一些实施方案中，VL接受体人框架序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共同框架序列一致。
“亲和力”系指分子(例如抗体)之单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用之总和之强度。除非另外指明，否则如本文所用，“结合亲和力”系指反映结合对(例如抗体与抗原)成员之间1:1相互作用之固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y之亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。可藉由本领域中已知之常用方法(包括本文所述之方法)测量亲和力。用于测量结合亲和力之特定说明性及示例性实施方案描述于下文中。
“亲和力成熟”抗体系指相较于在一或多个高变区(HVR)中不具有一或多个变化之亲本抗体，具有此类变化之抗体，此等变化使抗体对抗原之亲和力得到提高。
术语“抗-B7-H4抗体”及“结合B7-H4之抗体”系指能够以足够亲和力结合B7-H4之抗体，使得抗体适用作靶向B7-H4中之诊断及/或治疗剂。在一个实施方案中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所测量，抗-B7-H4抗体与不相关之非B7-H4蛋白质之结合程度小于该抗体与B7-H4之结合的约10％。在某些实施方案中，结合B7-H4之抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗-B7-H4抗体结合于在来自不同物种之B7-H4中保守的B7-H4之表位。
术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用且涵盖各种抗体结构，包括(但不限于)单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，只要该等片段展示所需抗原结合活性。
“抗体片段”系指除完整抗体外之分子，其包含完整抗体之一部分，且结合完整抗体所结合之抗原。抗体片段之实例包括(但不限于)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；及由抗体片段形成之多特异性抗体。
与参考抗体“结合相同表位之抗体”系指在竞争分析中，阻断参考抗体与其抗原50％或50％以上之结合的抗体，且相反地，在竞争分析中，参考抗体阻断该抗体与其抗原结合达50％或50％以上。本文提供一种示例性竞争分析。
术语“癌症”及“癌性”系指或描述哺乳动物中通常特征为不受调控细胞生长/增殖之生理病状。癌症之实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤及白血病。此类癌症之更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰脏癌、神经胶瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌(包括三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、白血病及其他淋巴组织增生病症及各种类型头颈癌。
术语“嵌合”抗体系指重链及/或轻链之一部分来源于特定来源或物种，而重链及/或轻链之其余部分来源于不同来源或物种之抗体。
抗体之“类别”系指其重链所具有之恒定域或恒定区之类型。抗体存在五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别之免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用，术语“细胞毒性剂”系指抑制或预防细胞功能及/或引起细胞死亡或破坏之物质。细胞毒性剂包括(但不限于)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、小红莓、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道诺霉素(daunorubicin)或其他插入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源之酶促活性毒素，包括其片段及/或变异体；以及以下所揭示之各种抗肿瘤或抗癌剂。
“效应功能”系指可归因于抗体之Fc区之彼等生物活性，其随抗体同种型变化。抗体效应功能之实例包括：C1q结合及补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导之细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)之下调；及B细胞活化。
药剂(例如药物配制剂)之“有效量”系指以所需剂量及持续所需时间段有效达成所希望治疗或预防结果之量。
术语“表位”系指抗体结合之抗原分子上之特定位点。
本文中之术语“Fc区”用于定义含有至少一部分恒定区之免疫球蛋白重链之C端区。该术语包括天然序列Fc区及变异Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链之羧基端。然而，Fc区之C端赖氨酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基之编号系依据EU编号系统，亦称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“框架”或“FR”系指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域之FR一般由四个FR域：FR1、FR2、FR3及FR4组成。因此，在VH(或VL)中HVR及FR序列一般以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换使用且系指结构实质上类似于天然抗体结构或具有含有如本文所定义之Fc区之重链的抗体。
术语“B7-H4之糖基化形式”系指藉由添加碳水化合物残基而经翻译后修饰之B7-H4的天然存在之形式。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”及“宿主细胞培养物”可互换使用且系指已引入外源核酸之细胞，包括此类细胞之子代。宿主细胞包括“转化子”及“转化细胞”，其包括初级转化细胞及自其衍生之子代(不考虑继代次数)。子代之核酸含量可与亲本细胞不完全相同，且可能含有突变。本文包括如针对原始转化细胞筛选或选择，具有相同功能或生物活性之突变子代。
“人抗体”为氨基酸序列对应于由人或人细胞产生或来源于利用人抗体谱系或其他人抗体编码序列之非人来源的抗体之氨基酸序列的抗体。人抗体之此定义特定排除包含非人抗原结合残基之人源化抗体。
“人共同框架”为表示一系列人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最常出现之氨基酸残基之框架。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列选自可变域序列之亚组。一般而言，序列亚组为如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中之亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组为如Kabat等人,前述中之亚组κI。在一实施方案中，对于VH，亚组为如Kabat等人,前述中之亚组III。
“人源化”抗体系指包含来自非人HVR之氨基酸残基及来自人FR之氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变域之实质上全部，其中全部或实质上全部HVR(例如CDR)均对应于非人抗体之HVR，且全部或实质上全部FR皆对应于人抗体之FR。人源化抗体任选的可包含来源于人抗体之抗体恒定区之至少一部分。抗体(例如非人抗体)之“人源化形式”系指已经历人源化之抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”系指抗体可变域中在序列上具有高变性及/或形成结构上定义之环(“高变环”)的各区域。一般而言，天然四链抗体包含六个HVR；三个位于VH中(H1、H2、H3)，且三个位于VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环及/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性及/或与抗原识别相关。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出现在L1之氨基酸残基24-34、L2之氨基酸残基50-56、L3之氨基酸残基89-97、H1之氨基酸残基31-35B、H2之氨基酸残基50-65及H3之氨基酸残基95-102(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中之CDR1之外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR亦包含“特异性决定残基”或“SDR”，其为接触抗原之残基。SDR含于缩写称为-CDR或a-CDR之CDR区域内。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出现在L1之氨基酸残基31-34、L2之氨基酸残基50-55、L3之氨基酸残基89-96、H1之氨基酸残基31-35B、H2之氨基酸残基50-58及H3之氨基酸残基95-102(参见Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指示，否则在本文中根据前述Kabat等人对可变域中之HVR残基及其他残基(例如FR残基)进行编号。
“免疫缀合物”为缀合于一或多个异源分子，包括(但不限于)细胞毒性剂之抗体。
“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括(但不限于)家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗及马)、灵长类动物(例如人及非人灵长类动物，诸如猴)、家兔及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)。在某些实施方案中，该个体或受试者为人。
“分离抗体”为已与其天然环境之组分分离之抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％之纯度，如藉由例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)所测定。关于抗体纯度评估方法之综述，参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
“分离核酸”系指已与其天然环境之组分分离之核酸分子。分离核酸包括通常含有核酸分子之细胞中所含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置之染色体位置。
“编码抗-B7-H4抗体之分离核酸”系指编码抗体重链及轻链(或其片段)之一或多种核酸分子，包括单一载体或分开载体中之此类核酸分子及存在于宿主细胞中之一或多个位置之此类核酸分子。
如本文所用，术语“B7-H4”系指由细胞中B7-H4前体蛋白之加工所产生的任何天然成熟之B7-H4。除非另外指示，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人及食蟹猕猴)及啮齿动物(例如小鼠及大鼠)之B7-H4。该术语亦包括天然存在之B7-H4变异体，例如剪接变异体或对偶基因变异体。具有信号序列之示例性人B7-H4前体蛋白之氨基酸序列(具有信号序列，氨基酸1-28)展示在SEQ ID NO:73中。示例性成熟人B7-H4之氨基酸序列展示在SEQ ID NO:74中。示例性食蟹猕猴B7-H4前体之预测序列(具有信号序列，氨基酸1-28)及成熟序列分别展示在SEQ ID NO:75及76中。示例性大鼠B7-H4前体之氨基酸序列(具有信号序列，氨基酸1-28)及成熟序列分别展示在SEQ ID NO:77及78中。示例性小鼠B7-H4前体之氨基酸序列(具有信号序列，氨基酸1-28)及成熟序列分别展示在SEQ ID NO:79及80中。示例性黑猩猩B7-H4前体之氨基酸序列(具有信号序列，氨基酸1-24)及成熟序列分别展示在SEQ ID NO:81及82中。
术语“B7-H4阳性癌症”系指包含在表面上表达B7-H4之细胞的癌症。在一些实施方案中，细胞表面上B7-H4之表达例如在诸如免疫组织化学、FACS等方法中使用B7-H4之抗体来测定。或者，认为B7-H4 mRNA表达与细胞表面上B7-H4表达相关且可藉由选自原位杂交及RT-PCR(包括定量RT-PCR)之方法测定。
术语“B7-H4阳性细胞”系指在其表面上表达B7-H4之细胞。
如本文所用，术语“单克隆抗体”系指自实质上均质抗体之群体获得之抗体，亦即除可能变异抗体(例如含有天然存在之突变或在产生单克隆抗体制剂期间出现之变异抗体，此等变异体一般以较小量存在)之外，构成该群体之个别抗体相同及/或结合相同表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)之不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂之各单克隆抗体系针对抗原上之单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示抗体如自实质上均质之抗体群体获得之特性，且不应理解为需要藉由任何特定方法产生该抗体。举例而言，根据本发明使用之单克隆抗体可藉由多种技术制得，包括(但不限于)杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法及利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座之转基因动物的方法，此类方法及其他制备单克隆抗体之示例性方法在本文中描述。
“裸抗体”系指未与异源部分(例如细胞毒性部分)或放射性标记缀合之抗体。裸抗体可存在于药物配制剂中。
“天然抗体”系指具有变化结构之天然存在之免疫球蛋白分子。举例而言，天然IgG抗体为约150,000道尔顿之异四聚体糖蛋白，其由二硫化物键结之两条相同轻链及两条相同重链构成。自N端至C端，各重链具有可变区(VH)，亦称为可变重链域或重链可变域，接着为三个恒定域(CH1、CH2及CH3)。类似地，自N端至C端，各轻链具有可变区(VL)，亦称为可变轻链域或轻链可变域，接着为恒定轻链(CL)域。抗体轻链可基于其恒定域之氨基酸序列归为两种类型中之一种，称为κ及λ。
术语“包装插页”用于指通常包括于治疗性产品之商业包装中之说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、投药、组合疗法、与使用此类治疗性产品有关之禁忌症及/或警告之信息。
相对于参考多肽序列之“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对参考多肽序列与候选序列且必要时引入间隙以达成最大序列同一性百分比之后，且在不将任何保守性取代视为序列同一性之一部分之情况下，候选序列中与参考多肽序列中之氨基酸残基一致的氨基酸残基之百分比。用于测定氨基酸序列同一性百分比之目的之比对可以本领域之技能范围内之多种方式达成，例如使用公开可获得之计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列之适当参数，包括在所比较序列之全长内达成最大比对所需的任何算法。然而，出于本文之目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.设计，且源代码已在U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559申请用户文件，其中其注册在美国版权注册第TXU510087号下。ALIGN-2程序可公开获自Genentech,Inc.,South San Francisco,California，或可自源代码编写。ALIGN-2程序应经编写可用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变化。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较之情形下，既定氨基酸序列A相对于、与或针对既定氨基酸序列B之氨基酸序列同一性％(或者其可表述为，既定氨基酸序列A具有或包含相对于、与或针对既定氨基酸序列B的一定％氨基酸序列同一性)如下计算：
100乘以分数X/Y
其中X为在A与B之比对程序中藉由序列比对程序ALIGN-2评分为一致匹配之氨基酸残基数目，且其中Y为B中之氨基酸残基之总数目。应了解，在氨基酸序列A之长度与氨基酸序列B之长度不相等之情况下，A相对于B之氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A之氨基酸序列同一性％。除非另外特定陈述，否则本文所使用之所有氨基酸序列同一性％值如刚刚前段中所描述使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“药物配制剂”系指所呈形式允许其中所含活性成分之生物活性有效发挥，且不含对配制剂将施用之受试者具有不可接受毒性之其他组分的制剂。
“药学可接受载剂”系指药物配制剂中除活性成分外之对受试者无毒的成分。药学可接受载剂包括(但不限于)缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变化形式，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)系指试图改变所治疗个体之自然病程的临床介入且可出于防治目的或在临床病理学之病程期间进行。所需治疗作用包括(但不限于)预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病之任何直接或间接病理性后果、预防转移、减缓疾病进展速率、改善或缓和疾病病况及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明之抗体用于延迟疾病发展或减慢疾病进展。
“化学治疗剂”系指适用于治疗癌症之化合物。化学治疗剂之实例包括烷基化剂，诸如噻替派(thiotepa)及环磷酰胺(cyclosphosphamide)
Figure BDA0003169464670000481
烷基磺酸盐，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亚胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)及三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(尤其布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，
Figure BDA0003169464670000491
)；β-拉帕酮；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成模拟拓朴替康(topotecan)
Figure BDA0003169464670000492
CPT-11(伊立替康(irinotecan，
Figure BDA0003169464670000493
))、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、东莨菪素(scopolectin)及9-氨基喜树碱)；苔藓虫素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin))、卡折来新(carzelesin)及比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼穴毒素(podophyllotoxin)；鬼穴酸；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻环肽(cryptophycin)(尤其克瑞托欣(cryptophycin)1及克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；盘克斯塔叮(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如加利车霉素，尤其加利车霉素γ1I及加利车霉素ΩI1(参见例如Nicolaou等人,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323、口服α-4整合素抑制剂；达米辛(dynemicin)，包括达米辛A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白发色团及相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素d(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-侧氧基-L-正亮氨酸、小红莓(包括
Figure BDA0003169464670000494
)、吗啉基-小红莓、氰基吗啉基-小红莓、2-吡咯啉基-小红莓、小红莓HCl脂质体注射液
Figure BDA0003169464670000495
脂质体小红莓TLC D-99
Figure BDA0003169464670000496
聚乙二醇化脂质体小红莓
Figure BDA0003169464670000497
及脱氧小红莓(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、埃达霉素(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非罗霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲胺喋呤、吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA0003169464670000501
)、喃氟啶(tegafur)
Figure BDA0003169464670000502
)、卡培他滨(capecitabine)
Figure BDA0003169464670000503
埃坡霉素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、甲胺喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉宾(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫米嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸盐(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺剂，诸如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；埃达曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲(hydroxyurea)；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，诸如美登素(maytansine)及安丝菌素(ansamitocin)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比达摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0003169464670000504
多糖复合物(JHSNatural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2'-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其T-2毒素、弗纳库林(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A及胺癸叮(anguidine))；尿烷(urethan)；长春地辛(vindesine)
Figure BDA0003169464670000511
达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替派；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他赛
Figure BDA0003169464670000512
帕利他赛(ABRAXANETM)及多西他赛(docetaxel)
Figure BDA0003169464670000513
之经白蛋白工程改造之纳米粒子配制剂)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲胺喋呤；铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如
Figure BDA0003169464670000514
)及卡铂；长春花(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱
Figure BDA0003169464670000515
长春新碱
Figure BDA0003169464670000516
长春地辛
Figure BDA0003169464670000517
及长春瑞宾
Figure BDA0003169464670000518
依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；诺凡特龙(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素；氨基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine，DMFO)；类视黄素，诸如视黄酸，包括贝瑟罗汀(bexarotene)
Figure BDA0003169464670000519
双膦酸盐(bisphosphonate)，诸如氯屈膦酸盐(clodronate)(例如
Figure BDA00031694646700005110
或
Figure BDA00031694646700005111
))、依替膦酸盐(etidronate)
Figure BDA00031694646700005112
NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸盐(zoledronate)
Figure BDA00031694646700005113
阿仑膦酸盐(alendronate)
Figure BDA00031694646700005114
帕米膦酸盐(pamidronate)
Figure BDA00031694646700005115
替鲁膦酸盐(tiludronate)
Figure BDA00031694646700005116
或利塞膦酸盐(risedronate)
Figure BDA00031694646700005117
曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其抑制与异常细胞增殖相关之信号传导路径中基因表达之反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如
Figure BDA00031694646700005118
疫苗及基因疗法疫苗，例如
Figure BDA00031694646700005119
疫苗、
Figure BDA00031694646700005120
疫苗及
Figure BDA00031694646700005121
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如
Figure BDA00031694646700005122
)；rmRH(例如
Figure BDA00031694646700005123
)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)、
Figure BDA00031694646700005124
Pfizer)；哌立福新(perifosine)、COX-2抑制剂((例如塞内昔布(celecoxib)或依他昔布(etoricoxib))、蛋白体抑制剂(例如PS341)；硼替佐米(bortezomib)
Figure BDA00031694646700005125
CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；索拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如奥利默森钠(oblimersensodium)
Figure BDA0003169464670000521
匹蒽醌(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见以下定义)；酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)、
Figure BDA0003169464670000522
)；法呢基转移酶抑制剂，诸如洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636、SARASARTM)；以及以上任一者之药学可接受盐、酸或衍生物；以及以上药剂中之两者或两者以上之组合，诸如CHOP(环磷酰胺、小红莓、长春新碱及泼尼龙之组合疗法的缩写)；以及FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU及甲酰四氢叶酸组合之治疗方案的缩写)。
如本文所定义之化学治疗剂包括用来调节、减轻、阻断或抑制可促进癌症生长之激素作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。其本身可为激素，包括(但不限于)：具有混合激动剂/拮抗剂型态之抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen)
Figure BDA0003169464670000523
4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)
Figure BDA0003169464670000524
艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、雷诺昔酚(raloxifene)
Figure BDA0003169464670000525
曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)及选择性雌激素受体调节剂(SERM)(诸如SERM3)；不具有激动剂特性之纯抗雌激素，诸如氟维司群(fulvestrant)
Figure BDA0003169464670000526
及EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、增加ER转换及/或遏制ER含量)；芳香酶抑制剂，包括类固醇芳香酶抑制剂，诸如福美司坦(formestane)及依西美坦
Figure BDA0003169464670000527
及非类固醇芳香酶抑制剂，诸如阿那曲唑(anastrazole)
Figure BDA0003169464670000528
来曲唑(letrozole)
Figure BDA0003169464670000529
及胺鲁米特(aminoglutethimide)，及其他芳香酶抑制剂，包括伏罗唑(vorozole)
Figure BDA00031694646700005210
乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)
Figure BDA00031694646700005211
法屈唑(fadrozole)及4(5)-咪唑；释放促黄体激素之激素激动剂，包括亮丙立德(leuprolide)(
Figure BDA00031694646700005212
及
Figure BDA00031694646700005213
)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲特瑞林(tripterelin)；性类固醇，包括助孕素(诸如乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)及乙酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate))、雌激素(诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)及普雷马林(premarin))及雄激素/类视黄素(诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸及非瑞替尼(fenretinide))；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁胺(nilutamide)及比卡鲁胺(bicalutamide)；以及以上任一者之药学可接受盐、酸或衍生物；以及以上药剂中之两者或两者以上的组合。
如本文针对佐剂疗法所用，术语“免疫抑制剂”系指用来遏制或遮蔽本文中所治疗之哺乳动物之免疫系统的物质。此将包括遏制细胞因子产生、下调或遏制自身抗原表达或遮蔽MHC抗原之物质。此类药剂之实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代之嘧啶(参见美国专利第4,665,077号)；非类固醇消炎药(NSAID)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素(诸如皮质醇或醛固酮)、消炎药(诸如环加氧酶抑制剂、5-脂肪加氧酶抑制剂或白三烯受体拮抗剂)；嘌呤拮抗剂，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷基化剂，诸如环磷酰胺；溴麦角隐亭(bromocryptine)；达那唑(danazol)；胺苯砜(dapsone)；戊二醛(其遮蔽MHC抗原，如美国专利第4,120,649号中所述)；针对MHC抗原及MHC片段之抗个体基因型抗体；环孢素A；类固醇，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如泼尼松(prednisone)、甲基泼尼龙(methylprednisolone)，包括
Figure BDA0003169464670000532
甲基泼尼龙丁二酸钠及地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如甲胺喋呤(口服或皮下)；抗疟疾剂，诸如氯奎宁(chloroquine)及羟基氯奎(hydroxychloroquine)；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ抗体、抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(英利昔单抗(infliximab)
Figure BDA0003169464670000531
或阿达木单抗(adalimumab))、抗-TNF-α免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗-TNF-β抗体、抗-白介素-2(IL-2)抗体及抗-IL-2受体抗体及抗-白介素-6(IL-6)受体抗体及拮抗剂(诸如ACTEMRATM(托西利单抗(tocilizumab)))；抗-LFA-1抗体，包括抗-CD11a及抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；全-T抗体，较佳抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域之可溶性肽(WO 90/08187，公开于7/26/90)；链激酶；转化生长因子-β(TGF-β)；链道酶(streptodornase)；来自宿主之RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥；脱氧斯匹胍素(deoxyspergualin)；雷帕霉素；T细胞受体(Cohen等人,美国专利第5,114,721号)；T细胞受体片段(Offner等人,Science,251:430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341:482(1989)；及WO 91/01133)；BAFF拮抗剂，诸如BAFF抗体及BR3抗体及zTNF4拮抗剂(评述参见Mackay及Mackay,Trends Immunol.,23:113-5(2002)且亦参见下文定义)；干扰T细胞辅助信号之生物制剂，诸如抗-CD40受体或抗-CD40配体(CD154)，包括CD40-CD40配体(例如Durie等人,Science,261:1328-30(1993)；Mohan等人,J.Immunol.,154:1470-80(1995))及CTLA4-Ig(Finck等人,Science,265:1225-7(1994))之阻断抗体；及T细胞受体抗体(EP340,109)，诸如T10B9。本文中之一些较佳免疫抑制剂包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、来氟米特、MMF或甲胺喋呤。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”系指抑制PD-1轴结合搭配物与一或多种其结合搭配物之相互作用，以便移除由PD-1信号传导轴上信号传导引起之T细胞功能障碍的分子-结果为恢复或增强T细胞功能(例如增殖、细胞因子产生、标靶细胞杀死)。如本文所用，PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂及PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”系指减少、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与一或多种其结合搭配物(诸如PD-L1、PD-L2)之相互作用产生之信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂为抑制PD-1与一或多种其结合搭配物之结合的分子。在一特定方面中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1及/或PD-L2之结合。举例而言，PD-1结合拮抗剂包括抗-PD-1抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及降低、阻断、抑制、废除或干扰由PD-1与PD-L1及/或PD-L2之相互作用产生之信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-1结合拮抗剂减少藉由或经由在经由PD-1介导信号传导之T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导之负共刺激信号，以便降低功能异常T细胞之功能异常程度(例如增强对抗原识别之效应反应)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂为抗-PD-1抗体。在一特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文中所描述之MDX-1106(尼沃单抗(nivolumab))。在另一特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文中描述之MK-3475(拉立珠单抗(lambrolizumab))。在另一特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文中描述之CT-011(皮立珠单抗(pidilizumab))。在另一特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文中描述之AMP-224。在另一特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文中描述之PDR001。在另一特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文中描述之REGN2810。在另一特定方面中，PD-1结合拮抗剂为本文中描述之BGB-108。
术语“PD-L1结合拮抗剂”系指降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合搭配物中之任一或多者(诸如PD-1、B7-1)之相互作用引起的信号转导的分子。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂为抑制PD-L1与其结合搭配物之结合的分子。在一特定方面中，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1及/或B7-1之结合。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包括抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及其他降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其结合搭配物中之一或多者(诸如PD-1、B7-1)之相互作用引起的信号转导之分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂降低藉由或经由在经由PD-L1介导信号传导之T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导之负共刺激信号，以便降低功能异常T细胞之功能异常程度(例如增强对抗原识别之效应反应)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂为抗PD-L1抗体。在一特定方面中，抗-PD-L1抗体为本文中描述之MPDL3280A(阿特唑单抗(atezolizumab))。在另一特定方面中，抗-PD-L1抗体为本文中描述之MDX-1105。在再一特定方面中，抗-PD-L1抗体为本文中描述之YW243.55.S70。在再一特定方面中，抗-PD-L1抗体为本文中描述之MEDI4736(杜威路单抗(durvalumab))。在再一特定方面中，抗-PD-L1抗体为本文中描述之MSB0010718C(阿威路单抗(avelumab))。
术语“PD-L2结合拮抗剂”系指降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其结合搭配物中之任一或多者(诸如PD-1)之相互作用引起的信号转导之分子。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂为抑制PD-L2与其结合搭配物中之一或多者结合的分子。在一特定方面中，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1之结合。在一些实施方案中，PD-L2拮抗剂包括抗-PD-L2抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及其他降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其结合搭配物中之任一或多者(诸如PD-1)之相互作用引起的信号转导之分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂降低藉由或经由在经由PD-L2介导信号传导之T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导之负共刺激信号，以便降低功能异常T细胞之功能异常程度(例如增强对抗原识别之效应反应)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂为免疫黏附素。
术语“可变区”或“可变域”系指涉及抗体结合抗原之抗体重链或轻链域。天然抗体之重链及轻链(分别为VH及VL)可变域一般具有类似结构，其中各结构域均包含四个保守框架区(FR)及三个高变区(HVR)(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007))。单一VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用来自结合抗原之抗体的VH或VL域分离结合特定抗原之抗体以分别筛选互补VL或VH域之文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“载体”系指一种核酸分子，其能够传送其所连接之另一种核酸分子。该术语包括呈自我复制核酸结构之载体以及并入其已引入之宿主细胞之基因组中的载体。某些载体能够引导其可操作地连接之核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
“烷基”为含有正链、第二、第三或环状碳原子之C1-C18烃。实例为甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
如本文所用，术语“C1-C8烷基”系指具有1至8个碳原子之直链或分支链、饱和或不饱和烃。代表性“C1-C8烷基”包括(但不限于)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基及-正癸基；而分支链C1-C8烷基包括(但不限于)-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基；不饱和C1-C8烷基包括(但不限于)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-1-己基、2-己基、-3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1丁炔基。C1-C8烷基可未经取代或经一或多个包括(但不限于)以下各基之基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
如本文所用，术语“C1-C12烷基”系指具有1至12个碳原子之直链或分支链、饱和或不饱和烃。C1-C12烷基可未经取代或经一或多个包括(但不限于)以下各基之基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
如本文所用，术语“C1-C6烷基”系指具有1至6个碳原子之直链或分支链、饱和或不饱和烃。代表性“C1-C6烷基”包括(但不限于)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基及-正己基；而分支链C1-C6烷基包括(但不限于)-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基及2-甲基丁基；不饱和C1-C6烷基包括(但不限于)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-1-己基、2-己基及-3-己基。C1-C6烷基可未经取代或经一或多个如上针对C1-C8烷基所述之基团取代。
如本文所用，术语“C1-C4烷基”系指具有1至4个碳原子之直链或分支链、饱和或不饱和烃。代表性“C1-C4烷基”基团包括(但不限于)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基；而分支链C1-C4烷基包括(但不限于)-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基；不饱和C1-C4烷基包括(但不限于)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-异丁烯基。C1-C4烷基可未经取代或经一或多个如上针对C1-C8烷基所述之基团取代。
“烷氧基”为单一键结于氧之烷基。示例性烷氧基包括(但不限于)甲氧基(-OCH3)及乙氧基(-OCH2CH3)。“C1-C5烷氧基”为具有1至5个碳原子之烷氧基。烷氧基可未经取代或经一或多个如上针对烷基所述之基团取代。
“烯基”为含有正链、第二、第三或环状碳原子及至少一个不饱和位点，亦即碳-碳sp2双键的C2-C18烃。实例包括(但不限于)：乙烯或乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)及5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。“C2-C8烯基”为含有2至8个正链、第二、第三或环状碳原子及至少一个不饱和位点，亦即碳-碳sp2双键的烃。
“炔基”为含有正链、第二、第三或环状碳原子及至少一个不饱和位点，亦即碳-碳sp参键的C2-C18烃。实例包括(但不限于)：乙炔基(-C≡CH)及炔丙基(-CH2C≡CH)。“C2-C8炔基”为含有2至8个正链、第二、第三或环状碳原子及至少一个不饱和位点，亦即碳-碳sp参键的烃。
“亚烷基”系指具有1-18个碳原子且具有藉由自母烷烃之同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子所衍生之两个单价自由基中心的饱和、分支链或直链或环状烃基。典型亚烷基包括(但不限于)：亚甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)及其类似基团。
“C1-C10亚烷基”为式-(CH2)1-10-之直链饱和烃基。C1-C10亚烷基之实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基及亚癸基。
“亚烯基”系指具有2-18个碳原子且具有藉由自母体烯之同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子所衍生之两个单价自由基中心的不饱和、分支链或直链或环状烃基。典型亚烯基包括(但不限于)：1,2-亚乙基(-CH＝CH-)。
“亚炔基”系指具有2-18个碳原子且具有藉由自母体炔之同一个或两个不同碳原子移除两个氢原子所衍生之两个单价自由基中心的不饱和、分支链或直链或环状烃基。典型亚炔基包括(但不限于)：亚乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)及4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
“芳基”系指碳环芳族基。芳基之实例包括(但不限于)苯基、萘基及蒽基。碳环芳族基或杂环芳族基可未经取代或经一或多个包括(但不限于)以下各基之基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“C5-C20芳基”为碳环芳环中具有5至20个碳原子之芳基。C5-C20芳基之实例包括(但不限于)苯基、萘基及蒽基。C5-C20芳基可经如上针对芳基所述取代或未经取代。“C5-C14芳基”为碳环芳环中具有5至14个碳原子之芳基。C5-C14芳基之实例包括(但不限于)苯基、萘基及蒽基。C5-C14芳基可经如上针对芳基所述取代或未取代。
“伸芳基”为具有两个共价键且可呈如以下结构中所示之邻、间或对组态之芳基：
Figure BDA0003169464670000591
其中苯基可未经取代或经至多四个包括(但不限于)以下各基之基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“芳基烷基”系指其中键结于碳原子、通常末端或sp3碳原子之氢原子之一经芳基置换的非环状烷基。典型芳基烷基包括(但不限于)苯甲基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯基乙-1-基及其类似基团。芳基烷基包含6至20个碳原子，例如芳基烷基之烷基部分，包括烷基、烯基或炔基，为1至6个碳原子且芳基部分为5至14个碳原子。
“杂芳基烷基”系指其中键结于碳原子、通常末端或sp3碳原子之氢原子之一经杂芳基置换的非环状烷基。典型杂芳基烷基包括(但不限于)2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基及其类似基团。杂芳基烷基包含6至20个碳原子，例如杂芳基烷基之烷基部分，包括烷基、烯基或炔基为1至6个碳原子且杂芳基部分为5至14个碳原子及1至3个选自N、O、P及S之杂原子。杂芳基烷基之杂芳基部分可为具有3至7个环成员之单环(2至6个碳原子)或具有7至10个环成员之双环(4至9个碳原子及1至3个选自N、O、P及S之杂原子)，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。
“经取代之烷基”、“经取代之芳基”及“经取代之芳基烷基”分别意谓烷基、芳基及芳基烷基，其中一或多个氢原子各独立地经取代基置换。典型取代基包括(但不限于)-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO- 3、-PO3H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2、-C(＝NR)NR2，其中各X独立地为卤素：F、Cl、Br或I；且各R独立地为-H、C2-C18烷基、C6-C20芳基、C3-C14杂环、保护基或前药部分。如上所述之亚烷基、亚烯基及亚炔基亦可类似地经取代。
“杂芳基”及“杂环”系指其中一或多个环原子为杂原子，例如氮、氧及硫之环系统。杂环自由基包含3至20个碳原子及1至3个选自N、O、P及S之杂原子。杂环可为具有3至7个环成员之单环(2至6个碳原子及1至3个选自N、O、P及S之杂原子)或具有7至10个环成员之双环(4至9个碳原子及1至3个选自N、O、P及S之杂原子)，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。
示例性杂环描述于例如Paquette,Leo A.,“Principles of ModernHeterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968)，尤其章节1、3、4、6、7及9；“TheChemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs”(John Wiley&Sons,New York,1950至今)，尤其第13、14、16、19及28卷；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。
杂环之实例包括(作为实例而非限制)吡啶基、二氢吡啶基、四氢吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氢噻吩基、硫氧化四氢噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、吲哚烯基(indolenyl)、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、四氢呋喃基、双四氢呋喃基、四氢哌喃基、双四氢哌喃基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、八氢异喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻嗯基(thianthrenyl)、哌喃基、异苯并呋喃基、
Figure BDA0003169464670000601
烯基(chromenyl)、xanthenyl、啡恶噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、异噻唑基、异恶唑基、吡嗪基、哒嗪基、吲哚嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基(naphthyridinyl)、喹喏啉基(quinoxalinyl)、喹唑啉基(quinazolinyl)、噌啉基(cinnolinyl)、喋啶基(pteridinyl)、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、啡啶基(phenanthridinyl)、吖啶基(acridinyl)、嘧啶基、啡啉基(phenanthrolinyl)、啡嗪基(phenazinyl)、啡噻嗪基(phenothiazinyl)、呋呫基(furazanyl)、啡恶嗪基(phenoxazinyl)、异
Figure BDA0003169464670000602
烷基(isochromanyl)、
Figure BDA0003169464670000603
烷基(chromanyl)、咪唑啶基(imidazolidinyl)、咪唑啉基(imidazolinyl)、吡唑啶基(pyrazolidinyl)、吡唑啉基(pyrazolinyl)、哌嗪基、吲哚啉基(indolinyl)、异吲哚啉基(isoindolinyl)、quinuclidinyl、吗啉基、恶唑啶基(oxazolidinyl)、苯并三唑基、苯并异恶唑基(benzisoxazolyl)、羟吲哚基(oxindolyl)、苯并恶唑啉基(benzoxazolinyl)及靛红酰基(isatinoyl)。
作为实例而非限制，碳键结之杂环键结在吡啶之位置2、3、4、5或6处、哒嗪之位置3、4、5或6处、嘧啶之位置2、4、5或6处、吡嗪环之位置2、3、5或6处、呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯之位置2、3、4或5处、恶唑、咪唑或噻唑之位置2、4或5处、异恶唑、吡唑或异噻唑之位置3、4或5处、氮丙啶之位置2或3处、氮杂环丁烷之位置2、3或4处、喹啉之位置2、3、4、5、6、7或8处或异喹啉之位置1、3、4、5、6、7或8处。更通常，碳键结之杂环包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5吡啶基、6-吡啶基、3-哒嗪基、4-哒嗪基、5-哒嗪基、6-哒嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
作为实例而非限制，氮键结之杂环键结在氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑之位置1处、异吲哚或异吲哚啉之位置2处、吗啉之位置4处及咔唑或β-咔啉之位置9处。更通常，氮键结之杂环包括1-氮丙啶、1-氮杂环丁烷基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基及1-哌啶基。
“C3-C8杂环”系指其中一至四个环碳原子独立地经来自由O、S及N组成之群之杂原子置换的芳族或非芳族C3-C8碳环。C3-C8杂环之代表性实例包括(但不限于)苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、异喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异恶唑基及四唑基。C3-C8杂环可未经取代或经至多七个包括(但不限于)以下各基之基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“C3-C8杂环基”系指如上文所定义之C3-C8杂环基，其中杂环氢原子之一经一键置换。C3-C8杂环基可未经取代或经至多六个包括(但不限于)以下各基之基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“C3-C20杂环”系指其中一至四个环碳原子独立地经来自由O、S及N组成之群之杂原子置换的芳族或非芳族C3-C8碳环。C3-C20杂环可未经取代或经至多七个包括(但不限于)以下各基之基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“C3-C20杂环基”系指如上文所定义之C3-C20杂环基团，其中杂环氢原子之一经一键置换。
“碳环”意谓作为单环，具有3至7个碳原子或作为双环，具有7至12个碳原子之饱和或不饱和环。单环碳环具有3至6个环原子，更通常具有5或6个环原子。双环碳环具有7至12个环原子，例如配置为双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，或9或10个环原子，配置为双环[5,6]或[6,6]系统。单环碳环之实例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环庚基及环辛基。
“C3-C8碳环”为3、4、5、6、7或8员饱和或不饱和非芳族碳环。代表性C3-C8碳环包括(但不限于)-环丙基、-环丁基、-环戊基、-环戊二烯基、-环己基、-环己烯基、-1,3-环己二烯基、-1,4-环己二烯基、-环庚基、-1,3-环庚二烯基、-1,3,5-环庚三烯基、-环辛基及-环辛二烯基。C3-C8碳环基可未经取代或经一或多个包括(但不限于)以下各基之基团取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'独立地选自H、-C1-C8烷基及芳基。
“C3-C8碳环基”系指如上文所定义之C3-C8碳环基团，其中碳环氢原子之一经一键置换。
“接头”系指包含共价附着抗体于药物模块之共价键或原子链的化学部分。在各种实施方案中，接头包括二价自由基，诸如烷二基、芳二基、杂芳二基、诸如-(CR2)nO(CR2)n-之部分、烷基氧基(例如聚亚乙基氧基、PEG、聚亚甲基氧基)及烷氨基(例如聚亚乙基氨基、JeffamineTM)之重复单元以及二酸酯及酰胺，包括丁二酸酯、顺丁烯二酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯及己酰胺。在各种实施方案中，接头可包含一或多个氨基酸残基，诸如缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸及高赖氨酸。
术语“手性”系指具有镜像搭配物之非重迭性特性的分子，而术语“非手性”系指在其镜像搭配物上可重迭之分子。
术语“立体异构体”系指具有一致的化学构成但在原子或基团在空间中之配置方面不同的化合物。
“非对映异构体”系指具有两个或两个以上手性中心且其分子并不互为镜像之立体异构体。非对映异构体具有不同物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性及反应性。可在诸如电泳及层析之高分辨率分析程序下分离非对映异构体之混合物。
“对映异构体”系指化合物之两个互为不可重迭镜像的立体异构体。
本文中使用之立体化学定义及惯例一般遵循S.P.Parker编辑,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；及Eliel,E.及Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。许多有机化合物以光学活性形式存在，亦即其能够使平面偏振光之平面旋转。在对光学活性化合物之描述中，使用前缀D及L或R及S表示分子围绕其手性中心之绝对组态。采用前缀d及l或(+)及(-)指明平面偏振光由化合物引起旋转之迹象，其中(-)或l意谓化合物为左旋的。具有前缀(+)或d之化合物为右旋的。对于既定化学结构，此等立体异构体为一致的，例外之处在于其互为镜像。特定立体异构体亦可称为对映异构体，且此类异构体之混合物通常称为对映异构体混合物。对映异构体之50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，其可在化学反应或制程中尚未具有立体选择或立体特异性时出现。术语“外消旋混合物”及“外消旋体”系指两种对映异构物质之等摩尔混合物，其缺乏光学活性。
“离去基”系指可经另一官能基取代之官能基。某些离去基为本领域中熟知，且实例包括(但不限于)卤基(例如氯基、溴基、碘基)、甲烷磺酰基(甲磺酰基)、对甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)、三氟甲基磺酰基(三氟甲磺酸酯基)及三氟甲基磺酸酯基。
术语“保护基”系指通常用以封闭或保护特定官能基同时使化合物上之其他官能基反应的取代基。举例而言，“氨基保护基”为附着于氨基，封闭或保护化合物中之氨基官能基之取代基。适合氨基保护基包括(但不限于)乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苯甲氧羰基(CBZ)及9-茀基亚甲氧基羰基(Fmoc)。关于保护基及其使用之一般描述，参见T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1991或随后版本。
II.组合物及方法
在一个方面中，本发明部分基于结合B7-H4之抗体及包含此类抗体之免疫缀合物。本发明之抗体及免疫缀合物适用于例如诊断或治疗B7-H4阳性癌症。
A.示例性抗-B7-H4抗体
在一些实施方案中，本发明提供结合B7-H4之分离抗体。B7-H4为例如在抗原呈递细胞(APC)表面上发现之I型跨膜蛋白。如本文中证实，B7-H4在检验之约80％乳腺癌样品中及约60％卵巢肿瘤样品中表达。
一种示例性天然存在之具有信号序列(氨基酸1-28)之人B7-H4前体蛋白序列提供于SEQ ID NO:73中，且对应成熟B7-H4蛋白质序列展示在SEQ ID NO:74(对应于SEQ ID NO:73之氨基酸29-282)中。
在某些实施方案中，抗-B7-H4抗体具有以下特征中之至少一或多者，呈任何组合：
(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位，及
(b)结合B7-H4之亲和力≤100nM、≤50nM、≤10nM或≤9nM或≤8nM或≤7nM或≤6nM或≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM，且任选的≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM。
非限制性示例性此类抗体包括本文中描述之hu1D11.v1.9 varC2及hu1D11.v1.9varD。在一些实施方案中，B7-H4为人B7-H4。在一些实施方案中，B7-H4选自人、食蟹猕猴、小鼠及大鼠B7-H4。
在一些实施方案中，抗-B7-H4抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位。在一些实施方案中，抗-B7-H4抗体结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位。在一些实施方案中，抗-B7-H4抗体结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位。在一些实施方案中，抗-B7-H4抗体结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位。在一些实施方案中，抗-B7-H4抗体结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。在一些此类实施方案中，抗-B7-H4抗体结合B7-H4之亲和力≤100nM、≤50nM、≤10nM或≤9nM或≤8nM或≤7nM或≤6nM或≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM，且任选的≥0.0001nM或≥0.001nM或≥0.01nM。非限制性示例性此类抗体包括本文中描述之hu1D11.v1.9 varC2及hu1D11.v1.9 varD。在一些实施方案中，B7-H4为人B7-H4。在一些实施方案中，B7-H4为人B7-H4或食蟹猕猴B7-H4。在一些实施方案中，B7-H4为小鼠B7-H4或大鼠B7-H4。
分析
为确定抗-B7-H4抗体是否“结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ IDNO:73之氨基酸29-157)内的表位”或“结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域(SEQ IDNO:73之氨基酸158-250)内的表位”或“结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQID NO:73之氨基酸29-250)内的表位”或“结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位”或“结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位”，如本文在实例F中所述，藉由如藉由FACS评估之竞争性结合来测定。
是否抗-B7-H4抗体“结合之亲和力≤100nM、≤50nM、≤10nM或≤9nM或≤8nM或≤7nM或≤6nM或≤5nM或≤4nM或≤3nM或≤2nM或≤1nM”如本文在实例E中所述来测定。使用放射性配体细胞结合分析测定所选人源化变异体之解离常数。简言之，将约250pM 125I-抗体示踪剂(与未标记之抗体竞争者相同)与100,000MX-1细胞或293B7-H4稳定细胞系在以1000nM开始2倍稀释之未标记抗体存在下一起培育。将抗体/细胞混合物在DMEM(1％BSA、300nM人IgG、0.1％迭氮化物)中在25℃下培育2小时且接着使用Millipore多筛滤板收集且过滤。使用Perkin Elmer Wizard 1470自动γ计数器计数Durapore膜过滤器10分钟。抗体亲和力常数(Kd)藉由史卡查分析(Scatchard)，使用NewLigand软件测定。
抗体1D11v1.9变异体及其他实施方案
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下各者之HVR的抗-B7-H4抗体：(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下各者之HVR的抗-B7-H4抗体：(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
在一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:40之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2。在另一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3。
在一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:40之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2。在另一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明之抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含选自SEQ ID NO:128之氨基酸序列的HVR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明之抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含选自SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:128之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
在任一以上实施方案中，抗-B7-H4抗体人源化。在一个实施方案中，抗-B7-H4抗体包含如任一以上实施方案中之HVR且进一步包含人接受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共同框架。在某些实施方案中，人接受体框架为人VLκI共同(VLKI)框架及/或VH框架VH1。在某些实施方案中，人接受体框架为包含任一以下突变之人VLκI共同(VLKI)框架及/或VH框架VH1：轻链框架区FR3中之Y49H、V58I、T69R及/或F71Y突变；重链框架区FR3中之V67A、I69L、R71A、T73K及/或T75S突变。
在一些实施方案中，抗-B7-H4抗体包含如任一以上实施方案中之HVR且进一步包含SEQ ID NO:53之重链框架FR3序列。在一些此类实施方案中，重链可变域框架为具有SEQID NO:53之FR3序列的经修饰之人VH1框架。
在另一个方面中，抗-B7-H4抗体包含与SEQ ID NO:38或127之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:38或127之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:38或127中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:38或127中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。
任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ ID NO:38之VH序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ IDNO:41之氨基酸序列之HVR-H3。
任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ ID NO:127之VH序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ IDNO:128之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:126之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:126之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:126中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:126中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ ID NO:126之VL序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:129之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含如以上提供之任一实施方案中之VH及如以上提供之任一实施方案中之VL。
在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:126中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:127及SEQ ID NO:126中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。
在另一个方面中，本发明提供与本文提供之抗-B7-H4抗体结合相同表位之抗体。举例而言，在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:38之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:127之VH序列及SEQ ID NO:126之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。
在某些实施方案中，提供根据任一以上实施方案之抗体，其结合B7-H4且具有至少一个以下特征：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。在一些实施方案中，该抗体具有以下特征中之至少一者或多者，呈任何组合：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。
在本发明之另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗-B7-H4抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一实施方案中，抗体为实质上全长抗体，例如如本文中所定义之IgG1抗体或其他抗体类别或同种型。
在另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体可合并如以下所述之单一或组合之任一特征。
抗体1D11及其他实施方案
在一些实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下各者之HVR的抗-B7-H4抗体：(a)包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQID NO:6之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQID NO:8之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列之HVR-L3。在另一个实施方案中，本发明提供包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下各者之HVR的抗-B7-H4抗体：(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ IDNO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之HVR-L3。
在一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列之HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列之HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列之HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列之HVR-H3、包含SEQ IDNO:10之氨基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列之HVR-H2。在另一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列之HVR-H3。
在一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:40之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2。在另一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:40之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:9之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列之HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明之抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQID NO:6之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含选自SEQ ID NO:7之氨基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQID NO:8之氨基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明之抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含选自SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之HVR-L3。
在任一以上实施方案中，抗-B7-H4抗体人源化。在一个实施方案中，抗-B7-H4抗体包含如任一以上实施方案中之HVR且进一步包含人接受体框架，例如人免疫球蛋白框架或人共同框架。在某些实施方案中，人接受体框架为人VLκI共同(VLKI)框架及/或VH框架VH1。在某些实施方案中，人接受体框架为包含任一以下突变之人VLκI共同(VLKI)框架及/或VH框架VH1：轻链框架区FR3中之Y49H、V58I、T69R及/或F71Y突变；重链框架区FR3中之V67A、I69L、R71A、T73K及/或T75S突变。
在一些实施方案中，抗-B7-H4抗体包含如任一以上实施方案中之HVR，且进一步包含SEQ ID NO:51、52或53之重链框架FR3序列。在一些此类实施方案中，重链可变域框架为具有SEQ ID NO:51、52或53之FR3序列的经修饰之人VH1框架。
在另一个方面中，抗-B7-H4抗体包含与SEQ ID NO:4之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:4之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:4中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQID NO:4中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ ID NO:4之VH序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:5之氨基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:6之氨基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO:7之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，抗-B7-H4抗体包含与SEQ ID NO:36、37、38、99、100、101、102或103之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:36、37、38、99、100、101、102或103之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:36、37、38、99、100、101、102或103中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:36、37、38、99、100、101、102或103中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ ID NO:36、37、38、99、100、101、102或103之VH序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:39之氨基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:40之氨基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO:41之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:3之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:3之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:3中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:3中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQID NO:3之VL序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:8之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:9之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:10之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:35、93、94、95、96、97或98之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:35、93、94、95、96、97或98之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:35、93、94、95、96、97或98中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:35、93、94、95、96、97或98中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ ID NO:35、93、94、95、96、97或98之VL序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:42之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:43之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:44之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含如以上提供之任一实施方案中之VH及如以上提供之任一实施方案中之VL。
在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:101及SEQID NO:93中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:101及SEQ ID NO:97中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:102及SEQ ID NO:98中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:103及SEQ ID NO:98中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:101及SEQ ID NO:96中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:101及SEQ ID NO:95中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:101及SEQ ID NO:94中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:100及SEQ IDNO:93中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:99及SEQ ID NO:93中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:36及SEQ ID NO:93中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:36及SEQ ID NO:35中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰.在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:37及SEQ ID NO:35中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:38及SEQ ID NO:35中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。
在另一个方面中，本发明提供与本文提供之抗-B7-H4抗体结合相同表位之抗体。举例而言，在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:4之VH序列及SEQ ID NO:3之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:101之VH序列及SEQ ID NO:93之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:101之VH序列及SEQ ID NO:97之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:102之VH序列及SEQ ID NO:98之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:103之VH序列及SEQ ID NO:98之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:101之VH序列及SEQ ID NO:96之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:101之VH序列及SEQ ID NO:95之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:101之VH序列及SEQ ID NO:94之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:100之VH序列及SEQ ID NO:93之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:99之VH序列及SEQ ID NO:93之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ IDNO:36之VH序列及SEQ ID NO:93之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:36之VH序列及SEQ ID NO:35之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:37之VH序列及SEQ ID NO:35之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ IDNO:38之VH序列及SEQ ID NO:35之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。
在某些实施方案中，提供根据任一以上实施方案之抗体，其结合B7-H4且具有至少一个以下特征：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。在一些实施方案中，该抗体具有以下特征中之至少一者或多者，呈任何组合：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。
在本发明之另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体为单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方案中，抗-B7-H4抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一实施方案中，抗体为实质上全长抗体，例如如本文中所定义之IgG1抗体或其他抗体类别或同种型。
在另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体可合并如以下所述之单一或组合之任一特征。
抗体22C10及其他实施方案
在一个方面中，本发明提供一种抗-B7-H4抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:29之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:31之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:32之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:33之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗-B7-H4抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3。
在一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:29之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:30之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:31之氨基酸序列之HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:31之氨基酸序列之HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:31之氨基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:31之氨基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO:30之氨基酸序列之HVR-H2。在另一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:29之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:30之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:31之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:59之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3，及包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2。在另一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:59之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:32之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:33之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:32之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:33之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:62之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明之抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:29之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:30之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:31之氨基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQID NO:32之氨基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:33之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明之抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:29之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:30之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:31之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:32之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:33之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含选自SEQ ID NO:34之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含选自SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3。
在任一上述实施方案中，抗-B7-H4抗体为人抗体。
在另一个方面中，抗-B7-H4抗体包含与SEQ ID NO:28之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:28之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:28中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:28中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ IDNO:28之VH序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:29之氨基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:30之氨基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO:31之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含具有与SEQ ID NO:27之氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:27之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:27中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:27中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ ID NO:27之VL序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:32之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:33之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:34之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含具有与SEQ ID NO:55、57、104、105或106之氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:55、57、104、105或106之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:55、57、104、105或106中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:55、57、104、105或106中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ IDNO:55、57、104、105或106之VL序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含如以上提供之任一实施方案中之VH及如以上提供之任一实施方案中之VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:104中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:55中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:112及SEQ ID NO:55中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:113及SEQ ID NO:55中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:114及SEQ ID NO:55中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:111及SEQ ID NO:105中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:111及SEQ IDNO:106中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:110及SEQ ID NO:55中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:109及SEQ ID NO:55中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:108及SEQ ID NO:55中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:107及SEQ ID NO:55中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:55中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在另一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:57中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。
在另一个方面中，本发明提供与本文提供之抗-B7-H4抗体结合相同表位之抗体。举例而言，在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:28之VH序列及SEQ ID NO:27之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:111之VH序列及SEQ ID NO:104之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:111之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:112之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:113之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:114之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:111之VH序列及SEQ ID NO:105之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ IDNO:111之VH序列及SEQ ID NO:106之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:110之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:109之VH序列及SEQ IDNO:55之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQID NO:108之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:107之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:56之VH序列及SEQID NO:55之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:56之VH序列及SEQ ID NO:之VL序列57的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。
在某些实施方案中，提供根据任一以上实施方案之抗体，其结合B7-H4且具有至少一个以下特征：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。在一些实施方案中，该抗体具有以下特征中之至少一者或多者，呈任何组合：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。
在本发明之另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗-B7-H4抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一实施方案中，抗体为实质上全长抗体，例如IgG2a抗体或如本文所定义之其他抗体类别或同种型。
在另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体可合并如以下所述之单一或组合之任一特征。
抗体32D6及其他实施方案
在一个方面中，本发明提供一种抗-B7-H4抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:14之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:15之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:16之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:17之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:18之氨基酸序列之HVR-L3。
在一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:14之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:15之氨基酸序列之HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:15之氨基酸序列之HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:15之氨基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO:18之氨基酸序列之HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:15之氨基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO:18之氨基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO:14之氨基酸序列之HVR-H2。在另一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:14之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:15之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:16之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:17之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:18之氨基酸序列之HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:16之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:17之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:18之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明之抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:14之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:15之氨基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQID NO:16之氨基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:17之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:18之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:14之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:15之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:16之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:17之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含选自SEQ ID NO:18之氨基酸序列之HVR-L3。
在任一上述实施方案中，抗-B7-H4抗体为人抗体。
在另一个方面中，抗-B7-H4抗体包含与SEQ ID NO:12之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:12之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:12中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:12中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ IDNO:12之VH序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:13之氨基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:14之氨基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO:15之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:11之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:11之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:11中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:11中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ ID NO:11之VL序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:16之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:17之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:18之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含如以上提供之任一实施方案中之VH及如以上提供之任一实施方案中之VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:11中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。在另一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:11中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。
在另一个方面中，本发明提供与本文提供之抗-B7-H4抗体结合相同表位之抗体。举例而言，在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:12之VH序列及SEQ ID NO:11之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。
在某些实施方案中，提供根据任一以上实施方案之抗体，其结合B7-H4且具有至少一个以下特征：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。在一些实施方案中，该抗体具有以下特征中之至少一者或多者，呈任何组合：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。
在本发明之另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗-B7-H4抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一实施方案中，抗体为实质上全长抗体，例如IgG2a抗体或如本文所定义之其他抗体类别或同种型。
在另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体可合并如以下所述之单一或组合之任一特征。
抗体9B9及其他实施方案
在一个方面中，本发明提供一种抗-B7-H4抗体，其包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:21之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:22之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:23之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:24之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:25之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO:26之氨基酸序列之HVR-L3。
在一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:21之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:22之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:23之氨基酸序列之HVR-H3。在一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:23之氨基酸序列之HVR-H3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:23之氨基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO:26之氨基酸序列之HVR-L3。在另一个实施方案中，该抗体含有包含SEQ ID NO:23之氨基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO:26之氨基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO:22之氨基酸序列之HVR-H2。在另一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:21之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ IDNO:22之氨基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO:23之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO:24之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ IDNO:25之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:26之氨基酸序列之HVR-L3。在一个实施方案中，该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:24之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:25之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:26之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明之抗体包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO:21之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:22之氨基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO:23之氨基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个选自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQID NO:24之氨基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:25之氨基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO:26之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，本发明提供一种抗体，其包含(a)包含SEQ ID NO:21之氨基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:22之氨基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:23之氨基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:24之氨基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:25之氨基酸序列之HVR-L2；及(f)包含选自SEQ ID NO:26之氨基酸序列之HVR-L3。
在任一上述实施方案中，抗-B7-H4抗体为人抗体。
在另一个方面中，抗-B7-H4抗体包含与SEQ ID NO:20之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:20之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:20中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:20中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ IDNO:20之VH序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VH包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:21之氨基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:22之氨基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO:23之氨基酸序列之HVR-H3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:19之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:19之氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含该序列之抗-B7-H4抗体保留结合B7-H4之能力。在某些实施方案中，SEQ ID NO:19中总计1至5个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，SEQ ID NO:19中总计1至10个氨基酸已经取代、插入及/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失发生在HVR外部区域中(亦即在FR中)。任选的，抗-B7-H4抗体包含SEQ ID NO:11之VL序列，包括该序列之翻译后修饰。在一特定实施方案中，VL包含一个、两个或三个选自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO:24之氨基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO:25之氨基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO:26之氨基酸序列之HVR-L3。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体，其中该抗体包含如以上提供之任一实施方案中之VH及如以上提供之任一实施方案中之VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:19中之VH及VL序列，包括彼等序列之翻译后修饰。
在另一个方面中，本发明提供与本文提供之抗-B7-H4抗体结合相同表位之抗体。举例而言，在某些实施方案中，提供与包含SEQ ID NO:20之VH序列及SEQ ID NO:19之VL序列的抗-B7-H4抗体结合相同表位的抗体。
在某些实施方案中，提供根据任一以上实施方案之抗体，其结合B7-H4且具有至少一种以下特征：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。在一些实施方案中，该抗体具有以下特征中之至少一者或多者，呈任何组合：(a)结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-V之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-157)内的表位；或结合整个或一部分含有B7-H4 Ig-C之结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸158-250)内的表位；或结合整个或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C结构域(SEQ ID NO:73之氨基酸29-250)内的表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:74(成熟人B7-H4)内之表位；或结合整个或一部分SEQ ID NO:73(前体人B7-H4)内之表位。
在本发明之另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体为单克隆抗体，包括人抗体。在一个实施方案中，抗-B7-H4抗体为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一实施方案中，抗体为实质上全长抗体，例如IgG2a抗体或如本文所定义之其他抗体类别或同种型。
在另一方面中，根据任一以上实施方案之抗-B7-H4抗体可合并如以下所述之单一或组合之任一特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供之抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM且任选的可≥10-13M(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一个实施方案中，Kd藉由放射性标记之抗原结合分析(RIA)测量，该分析利用相关抗体之Fab型式及其抗原，如藉由以下分析所述进行。Fab对抗原之溶液结合亲和力藉由在一系列滴定未标记抗原存在下使Fab与最低浓度之(125I)-标记抗原平衡，接着用抗-Fab抗体包被之板捕捉结合抗原来测量(参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为确定分析条件，将
Figure BDA0003169464670000891
多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中之5μg/ml捕捉抗-Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，且随后在室温(约23℃)下用PBS中之2％(w/v)牛血清白蛋白封闭2至5小时。在无吸附剂板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与相关Fab之连续稀释液混合(例如与抗-VEGF抗体Fab-12之评估一致，Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997))。接着将相关Fab培育过夜；然而，培育可持续较长时间段(例如约65小时)以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板中以在室温下培育(例如一小时)。随后移除溶液且用含0.1％聚山梨醇酯20
Figure BDA0003169464670000892
之PBS洗涤板八次。当板干燥时，添加150微升/孔之闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTMγ计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择提供小于或等于最大结合20％之各Fab的浓度用于竞争性结合分析。
根据另一个实施方案，Kd使用表面等离振子共振分析，使用
Figure BDA0003169464670000893
或
Figure BDA0003169464670000894
(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下，利用固定抗原CM5芯片，在约10反应单位(RU)下测量。简言之，根据供货商说明书，以N-乙基-N'-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，随后在5微升/分钟之流动速率下注射以获得大约10个反应单位(RU)之偶联蛋白。在抗原注射后，注射1M乙醇胺以封闭未反应之基团。关于动力学测量，在25℃下，以约25μl/min之流动速率注射于含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂之PBS(PBST)中之Fab两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)。使用简单的一比一朗格缪尔结合模型(one-to-one Langmuir bindingmodel)(
Figure BDA0003169464670000901
评估软件3.2版)，藉由同时拟合结合及解离感测图谱来计算缔合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)系依比率koff/kon计算。参见例如Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。若藉由以上表面等离振子共振分析测定之缔合速率超过106M-1s-1，则缔合速率可使用荧光淬灭技术测量，该技术在如光谱仪(诸如具有搅拌式光析槽之止流装备型分光光度计(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量之浓度增加之抗原存在下，测量在25℃下PBS中之20nM抗-抗原抗体(Fab形式)(pH 7.2)之荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)之增加或减少。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本文所提供之抗体为抗体片段。抗体片段包括(但不限于)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段以及下文描述之其他片段。关于某些抗体片段之综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段之评述，参见例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编辑,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；亦参见WO 93/16185；以及美国专利第5,571,894号及第5,587,458号。关于包含救助受体结合表位残基及具有延长之体内半衰期之Fab及F(ab')2片段的论述，参见美国专利第5,869,046号。
双抗体为可为二价或双特异性之具有两个抗原结合位点之抗体片段。参见例如EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三功能抗体及四功能抗体亦描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体为包含抗体之重链可变域全部或一部分或轻链可变域全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体为人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利第6,248,516B1号)。
抗体片段可藉由各种技术制得，包括(但不限于)蛋白水解消化完整抗体以及藉由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所描述。
3.嵌合及人源化抗体
在某些实施方案中，本文所提供之抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利第4,816,567号；及Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个实例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)之可变区)及人恒定区。在另一实例中，嵌合抗体为“类别转换”抗体，其中类别或子类别已自亲本抗体之类别或子类别改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体为人源化抗体。通常，对非人抗体进行人源化以降低对人之免疫原性，同时保留亲本非人抗体之特异性及亲和力。一般而言，人源化抗体包含一或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)来源于非人抗体，且FR(或其部分)来源于人抗体序列。人源化抗体任选的亦包含人恒定区之至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中之一些FR残基经来自非人抗体(例如HVR残基所来源之抗体)之相应残基取代以例如恢复或提高抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制造方法综述于例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号及第7,087,409号；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重修”)；Dall'Acqua等人,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)及Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组之“引导选择”方法)。
可用于人源化之人框架区包括(但不限于)：使用“最佳拟合”方法选择之框架区(参见例如Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于具有特定亚组轻链或重链可变区之人抗体的共同序列之框架区(参见例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人生殖系框架区(参见例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；及来源于筛选FR文库之框架区(参见例如Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本文所提供之抗体为人抗体。可使用本领域中已知之各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
人抗体可藉由将免疫原施用于已经修饰以响应抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区之完整抗体的转基因动物来制备。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合至动物染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座一般已不活化。关于自转基因动物获得人抗体之方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。亦参见例如美国专利第6,075,181号及第6,150,584号，描述XENOMOUSETM技术；美国专利第5,770,429号，描述
Figure BDA0003169464670000921
技术；及美国专利第7,041,870号，描述K-M
Figure BDA0003169464670000922
技术及美国专利申请公开案第US 2007/0061900号，描述
Figure BDA0003169464670000923
技术)。藉由此类动物产生之来自完整抗体之人可变区可例如藉由与不同人恒定区组合而经进一步修饰。
人抗体亦可藉由基于杂交瘤之方法制备。已描述用于产生人单克隆抗体之人骨髓瘤及小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术产生之人抗体亦描述于Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中。其他方法包括例如描述于美国专利第7,189,826号(描述单克隆人IgM抗体自杂交瘤细胞系之产生)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中之方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)亦描述于Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
人抗体亦可藉由分离选自人衍生噬菌体展示库之Fv克隆可变域序列产生。此类可变域序列接着可与所需人恒定域组合。下文描述用于自抗体文库选择人抗体之技术。
5.文库衍生之抗体
本发明之抗体可藉由针对具有所需活性之抗体筛选组合文库来分离。举例而言，本领域中已知多种方法用于产生噬菌体展示文库及针对具有所需结合特征之抗体筛选此类文库。此类方法综述于例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)且进一步描述于例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology248:161-175(Lo编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等人,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，VH及VL基因之谱系分别藉由聚合酶链式反应(PCR)分开克隆且在噬菌体文库中无规重组，接着可筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段形式展示抗体片段。来自经免疫来源之文库提供针对免疫原之高亲和力抗体而无需构建杂交瘤。或者，可克隆原始谱系(例如自人)以提供针对各种非自体抗原以及自体抗原之抗体之单一来源而无需任何免疫接种，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最终，亦可以合成方式藉由自干细胞克隆未经重排之V基因区段，且使用含有随机序列之PCR引物以编码高度可变CDR3区及实现体外重排来制备原始文库，如藉由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)描述。描述人抗体噬菌体文库之专利公开案包括例如：美国专利第5,750,373号及美国专利公开案第2005/0079574号、第2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号及第2009/0002360号。
自人抗体文库分离之抗体或抗体片段在本文中视为人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文所提供之抗体为多特异性抗体，例如双特异性抗体。如本文所用，术语“多特异性抗体”系指包含具有多表位特异性(亦即能够结合一个分子上两个或更多个不同表位或能够结合两个或更多个不同分子上之表位)之抗原结合域的抗体。
在一些实施方案中，多特异性抗体为对至少两个不同抗原结合位点具有结合特异性之单克隆抗体(诸如双特异性抗体)。在一些实施方案中，多特异性抗体之第一抗原结合域及第二抗原结合域可结合同一个分子内之两个表位(分子内结合)。举例而言，多特异性抗体之第一抗原结合域及第二抗原结合域可结合同一B7-H4分子上之两个不同表位。在某些实施方案中，多特异性抗体结合之两个不同表位为正常不同时藉由一种单特异性抗体(诸如常规抗体)或一种免疫球蛋白单一可变域结合的表位。在一些实施方案中，多特异性抗体之第一抗原结合域及第二抗原结合域可结合位于两个不同分子内之表位(分子间结合)。举例而言，多特异性抗体之第一抗原结合域可结合一种B7-H4分子上之一种表位，而多特异性抗体之第二抗原结合域可结合不同B7-H4分子上之另一表位，由此使两个分子交联。
在一些实施方案中，多特异性抗体(诸如双特异性抗体)之抗原结合域包含两个VH/VL单元，其中第一VH/VL单元结合第一表位且第二VH/VL单元结合第二表位，其中各VH/VL单元包含重链可变域(VH)及轻链可变域(VL)。此类多特异性抗体包括(但不限于)全长抗体、具有两个或两个以上VL及VH域之抗体及抗体片段(诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体及三抗体、已共价或非共价连接之抗体片段)。进一步包含重链可变区至少一部分及/或轻链可变区至少一部分之VH/VL单元亦可称为“臂”或“半体”或“半抗体”。在一些实施方案中，半体包含足以允许与第二半体形成二硫键之重链可变区部分。在一些实施方案中，半体包含节突变或穴突变，例如以允许与包含互补穴突变或节突变之第二半体或半抗体杂二聚。节突变及穴突变在下文中进一步论述。
在某些实施方案中，本文提供之多特异性抗体可为双特异性抗体。如本文所用，术语“双特异性抗体”系指包含能够结合一个分子上之两个不同表位或能够结合两个不同分子上之表位的抗原结合域的多特异性抗体。双特异性抗体亦可在本文中称为具有“双重特异性”或“双重特异性的”。示例性双特异性抗体可结合B7-H4与任何其他抗原。在某些实施方案中，结合特异性之一系针对B7-H4且另一系针对CD3。参见例如美国专利第5,821,337号。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合同一B7-H4分子之两个不同表位。
在某些实施方案中，双特异性抗体可结合两个不同B7-H4分子上之两个不同表位。双特异性抗体亦可用于将细胞毒性剂定位至表达B7-H4之细胞。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体之技术包括(但不限于)具有不同特异性之两个免疫球蛋白重链-轻链对之重组共表达(参见Milstein及Cuello,Nature305:537(1983)，WO 93/08829及Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))及“节入穴”工程改造(参见例如美国专利第5,731,168号、WO2009/089004、US2009/0182127、US2011/0287009，Marvin及Zhu,ActaPharmacol.Sin.(2005)26(6):649-658，及Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.,26:1-9)。如本文所用，术语“节入穴”或“KnH”技术系指体外或体内，藉由在相互作用界面处将突起(节)引入一种多肽及空腔(穴)引入另一多肽中来指导两个多肽配对在一起之技术。举例而言，KnH已引入抗体之Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面(参见例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431，Zhu等人,1997,Protein Science6:781-788，及WO2012/106587)。在一些实施方案中，在制造多特异性抗体期间KnH驱动两个不同重链配对在一起。举例而言，在Fc区中具有KnH之多特异性抗体可进一步包含连接于各Fc区之单一可变域，或进一步包含与类似或不同轻链可变域配对之不同重链可变域。KnH技术亦可用于将两个不同受体细胞外域配对在一起或配对包含不同标靶识别序列之任何其他多肽序列(例如包括亲和抗体、肽体及其他Fc融合物)。
如本文所用，术语“节突变”系指在多肽与另一多肽相互作用之界面处将突起(节)引入多肽之突变。在一些实施方案中，另一多肽具有穴突变。
如本文所用，术语“穴突变”系指在多肽与另一多肽相互作用之界面处将空腔(穴)引入多肽之突变。在一些实施方案中，另一多肽具有节突变。
以下提供简短非限制性论述。
“突起”系指自第一多肽之界面伸出且因此可定位于相邻界面(亦即第二多肽之界面)中之补偿空腔以便稳定化杂多聚体且由此促进例如杂多聚体形成而非均多聚体形成的至少一个氨基酸侧链。突起可存在于原始界面或可以合成方式(例如藉由改变编码界面之核酸)引入。在一些实施方案中，编码第一多肽之界面的核酸经改变以编码突起。为实现此，编码第一多肽之界面中之至少一个“原始”氨基酸残基的核酸经编码至少一个侧链体积大于原始氨基酸残基之“输入”氨基酸残基的核酸置换。应了解可存在一个以上原始及对应输入残基。各种氨基残基之侧链体积展示于例如US2011/0287009之表1。引入“突起”之突变可称为“节突变”。
在一些实施方案中，用于形成突起之输入残基为选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)及色氨酸(W)的天然存在之氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基为色氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中，用于形成突起之原始残基具有小侧链体积，诸如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
“空腔”系指自第二多肽之界面凹陷且因此容纳第一多肽之相邻界面上之对应突起的至少一个氨基酸侧链。空腔可存在于原始界面或可以合成方式(例如藉由改变编码界面之核酸)引入。在一些实施方案中，编码第二多肽之界面的核酸经改变以编码空腔。为实现此，编码第二多肽之界面中之至少一个“原始”氨基酸残基的核酸经编码至少一个侧链体积小于原始氨基酸残基之“输入”氨基酸残基之DNA置换。应了解可存在一个以上原始及对应输入残基。在一些实施方案中，用于形成空腔之输入残基为选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)及缬氨酸(V)的天然存在之氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基为丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，用于形成空腔之原始残基具有大侧链体积，诸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。引入“空腔”之突变可称为“穴突变”。
突起“可定位”于空腔中，此意谓分别第一多肽及第二多肽之界面上的突起及空腔之空间位置及突起及空腔之尺寸使得突起可位于空腔中，且不显著扰动第一及第二多肽在该界面之正常缔合。因为诸如Tyr、Phe及Trp之突起通常不自界面轴线垂直延长且具有较佳构形，所以突起与对应空腔之比对在一些情况下可依赖于基于三维结构，诸如藉由X射线结晶学或核磁共振(NMR)获得之三维结构将突起/空腔对模型化。此可使用本领域中公认之技术实现。
在一些实施方案中，IgG1恒定区中之节突变为T366W(EU编号)。在一些实施方案中，IgG1恒定区中之穴突变包含一或多个选自T366S、L368A及Y407V(EU编号)之突变。在一些实施方案中，IgG1恒定区中之穴突变包含T366S、L368A及Y407V(EU编号)。
在一些实施方案中，IgG4恒定区中之节突变为T366W(EU编号)。在一些实施方案中，IgG4恒定区中之穴突变包含一或多个选自T366S、L368A及Y407V(EU编号)之突变。在一些实施方案中，IgG4恒定区中之穴突变包含T366S、L368A及Y407V(EU编号)。
亦可藉由以下来制备多特异性抗体：工程改造静电转向作用以制备抗体Fc-杂二聚体分子(WO 2009/089004A1)；使两个或两个以上抗体或片段交联(参见例如美国专利第4,676,980号，及Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制造双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中描述。
本文中亦包括具有三个或三个以上功能抗原结合位点之工程改造抗体，包括“章鱼抗体”或“双重可变域免疫球蛋白”(DVD)(参见例如US2006/0025576A1，及Wu等人NatureBiotechnology(2007)))。本文之抗体或片段亦包括包含结合B7-H4以及另一不同抗原之抗原结合位点的“双作用FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。
7.抗体变异体
在某些实施方案中，涵盖本文所提供之抗体之氨基酸序列变异体。举例而言，可能需要提高抗体之结合亲和力及/或其他生物特性。抗体之氨基酸序列变异体可藉由将适当修饰引入编码该抗体之核苷酸序列中或藉由肽合成来制备。此类修饰包括例如发生于抗体氨基酸序列内的残基缺失及/或插入及/或取代。可进行缺失、插入及取代之任何组合以获得最终构建体，其限制条件为最终构建体具有所需特征，例如抗原结合。
a)取代、插入及缺失变异体
在某些实施方案中，提供具有一或多个氨基酸取代之抗体变异体。用于取代诱突之相关位点包括HVR及FR。保守取代展示于表1中标题“较佳取代”下。更多实质性变化提供于表1中标题“示例性取代”下，且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。氨基酸取代可引入相关抗体中且针对所需活性筛选产物，例如保留/提高抗原结合、降低免疫原性或改善ADCC或CDC的产物。
表1
Figure BDA0003169464670000971
Figure BDA0003169464670000981
氨基酸可根据共有侧链特性进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向之残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将此等类别中之一者之成员换成另一类别。
一种类型之取代变异体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体)之一或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究之所得变异体相对于亲本抗体将在某些生物特性方面具有修改(例如改善)(例如亲和力提高、免疫原性降低)及/或将实质上保留亲本抗体之某些生物特性。一种示例性取代变异体为亲和力成熟抗体，其可例如使用基于噬菌体展示之亲和力成熟技术(诸如本文所描述之技术)便利地产生。简言之，使一或多个HVR残基突变且在噬菌体上展示变异抗体且针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
改变(例如取代)可在HVR中进行以例如提高抗体亲和力。可在HVR“热点”(亦即由在体细胞成熟过程期间经历高频率突变之密码子所编码之残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)))及/或SDR(a-CDR)中用测试结合亲和力之所得变异VH或VL进行此类改变。藉由构建二级文库及自二级文库再选择来达成亲和力成熟已描述于例如Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟之一些实施方案中，藉由多种方法(例如易错PCR、链改组或寡核苷酸引导之诱突)中之任一者将多样性引入选择用于成熟之可变基因中。随后产生二级文库。随后筛选该文库以鉴别具有所需亲和力之任何抗体变异体。引入多样性之另一方法涉及HVR引导途径，其中将若干HVR残基(例如一次4-6个残基)随机分组。参与抗原结合之HVR残基可例如使用丙氨酸扫描诱突或模型化来特定鉴别。常常尤其以CDR-H3及CDR-L3为目标。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可发生在一或多个HVR内，只要此等改变不实质上降低抗体结合抗原之能力即可。举例而言，可在HVR中进行不实质上降低结合亲和力之保守改变(例如，如本文所提供之保守取代)。此类改变可在HVR“热点”或SDR外。在上文提供之变异VH及VL序列之某些实施方案中，各HVR未改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
一种适用于鉴别可靶向用于诱突之抗体之残基或区的方法称为“丙氨酸扫描诱突”，如由Cunningham及Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述。在此方法中，鉴别标靶残基之残基或群(例如带电残基，诸如arg、asp、his、lys及glu)且经中性或带负电氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)置换以确定抗体与抗原之相互作用是否受影响。可在对初始取代显示功能敏感性之氨基酸位置处引入其他取代。或者或另外，抗原-抗体复合物之晶体结构用于鉴别抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基及邻近残基可作为取代候选物之目标或排除在取代候选物之外。可筛选变异体以判定其是否含有所需特性。
氨基酸序列插入包括在一个残基至含有一百个或一百个以上残基之多肽长度范围内的氨基及/或羧基端融合物，以及具有单个或多个氨基酸残基之序列内插入。末端插入之实例包括具有N端甲硫胺酰基残基之抗体。抗体分子之其他插入变异体包括抗体之N端或C端与酶(例如对于ADEPT而言)或延长抗体之血清半衰期之多肽的融合物。
b)糖基化变异体
在某些实施方案中，对本文所提供之抗体进行改变以增加或降低抗体糖基化之程度。在抗体上添加糖基化位点或使抗体缺失糖基化位点可藉由改变氨基酸序列以便产生或移除一或多个糖基化位点来便利地实现。
在抗体包含Fc区之情况下，可改变附着于其上之碳水化合物。由哺乳动物细胞产生之天然抗体通常包含分支链双触角寡糖，其一般藉由N键附着于Fc区之CH2域的Asn297。参见例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附着于双触寡糖结构之“主干”中之GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可对本发明抗体中之寡糖进行修饰以便形成具有某些改良特性之抗体变异体。
在一个实施方案中，提供具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区之岩藻糖之碳水化合物结构的抗体变异体。举例而言，此类抗体中岩藻糖之量可为1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。岩藻糖之量藉由计算相对于如藉由MALDI-TOF质谱分析测量之附着于Asn 297之所有糖结构(例如复合、杂交及高甘露糖结构)的总和，糖链内Asn297处之岩藻糖之平均量来确定，如例如WO 2008/077546中所描述。Asn297系指位于Fc区中约位置297之天冬酰胺残基(Fc区残基之Eu编号)；然而，归因于抗体中微小序列变化，Asn297亦可位于位置294与300之间位置297之上游或下游约±3个氨基酸处。此类岩藻糖基化变异体可具有改善之ADCC功能。参见例如美国专利公开案第US2003/0157108号(Presta,L.)；第US 2004/0093621号(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。关于“去岩藻糖基化”或“缺乏岩藻糖”抗体变异体之公开案之实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体之细胞系之实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化之Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请第US 2003/0157108 A1号,Presta,L；以及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其实例11)，及基因剔除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、基因剔除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
进一步提供具有平分寡糖之抗体变异体，例如其中附着于抗体之Fc区的双触角寡糖藉由GlcNAc平分。此类抗体变异体可具有减少之岩藻糖基化及/或改善之ADCC功能。此类抗体变异体之实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利第6,602,684号(Umana等人)；以及US2005/0123546(Umana等人)。亦提供寡糖中之至少一个半乳糖残基与Fc区附着之抗体变异体。此类抗体变异体可具有改善之CDC功能。此类抗体变异体描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc区变异体
在某些实施方案中，可将一或多个氨基酸修饰引入本文所提供之抗体之Fc区中，从而产生Fc区变异体。Fc区变异体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)。
在某些实施方案中，本发明涵盖具有一些而非所有效应功能之抗体变异体，此使得该抗体成为对于其中体内抗体半衰期至关重要，而某些效应功能(诸如补体及ADCC)为不必要或有害的应用而言合乎需要之候选物。可进行体外及/或体内细胞毒性分析以确认CDC及/或ADCC活性之降低/消除。举例而言，可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体不具有FcγR结合能力(从而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC之初级细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血细胞上之表达概述于Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)之第464页之表3中。评估相关分子之ADCC活性之体外分析的非限制性实例描述于以下中：美国专利第5,500,362号(参见例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；第5,821,337号(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性分析方法(参见例如流式细胞术之ACTITM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；及CytoTox
Figure BDA0003169464670001021
非放射性细胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。适用于此类分析之效应细胞包括周边血液单核细胞(PBMC)及天然杀手(NK)细胞。或者或另外，可评估相关分子之体内ADCC活性，例如在动物模型(诸如Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所揭示)中。亦可进行C1q结合分析以确认抗体无法结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC分析(参见例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。亦可使用本领域中已知之方法测定FcRn结合及体内清除率/半衰期(参见例如Petkova,S.B.等人,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
在一些实施方案中，可将一或多个氨基酸修饰引入本文提供之抗体之Fc部分中以增加IgG与新生Fc受体之结合。在某些实施方案中，抗体包含根据EU编号之以下三个突变：M252Y、S254T及T256E(“YTE突变”)(美国专利第8,697,650号；亦参见Dall'Acqua等人,Journal of Biological Chemistry281(33):23514-23524(2006))。在某些实施方案中，YTE突变不影响抗体结合其关联抗原之能力。在某些实施方案中，与天然(亦即非YTE突变)抗体相比，YTE突变增加抗体之血清半衰期。在一些实施方案中，与天然(亦即非YTE突变)抗体相比，YTE突变增加抗体之血清半衰期3倍。在一些实施方案中，与天然(亦即非YTE突变)抗体相比，YTE突变增加抗体之血清半衰期2倍。在一些实施方案中，与天然(亦即非YTE突变)抗体相比，YTE突变增加抗体之血清半衰期4倍。在一些实施方案中，与天然(亦即非YTE突变)抗体相比，YTE突变增加抗体之血清半衰期至少5倍。在一些实施方案中，与天然(亦即非YTE突变)抗体相比，YTE突变增加抗体之血清半衰期至少10倍。参见例如美国专利第8,697,650号；亦参见Dall'Acqua等人,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524(2006)。
在某些实施方案中，YTE突变体提供一种调节抗体之抗体依赖性细胞介导之细胞毒性(ADCC)活性的方式。在某些实施方案中，YTEO突变体提供一种调节人源化IgG抗体针对人抗原之ADCC活性的方式。参见例如美国专利第8,697,650号；亦参见Dall'Acqua等人,Journal of Biological Chemistry281(33):23514-23524(2006)。
在某些实施方案中，YTE突变体允许同时调节血清半衰期、组织分布及抗体活性(例如IgG抗体之ADCC活性)。参见例如美国专利第8,697,650号；亦参见Dall'Acqua等人,Journal of Biological Chemistry 281(33):23514-23524(2006)。
具有减少之效应功能的抗体包括根据EU编号Fc区残基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者经取代的抗体(美国专利第6,737,056号)。此类Fc突变体包括在根据EU编号氨基酸位置265、269、270、297及327中之两者或两者以上经取代的Fc突变体，包括根据EU编号残基265及297取代为丙氨酸(亦即根据EU编号D265A及N297A)的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。在某些实施方案中，Fc突变体包含以下两个氨基酸取代：D265A及N297A。在某些实施方案中，Fc突变体由以下两个氨基酸取代组成：D265A及N297A。
在某些实施方案中，野生型人Fc区之位置329(EU编号)(P329)的脯氨酸经甘氨酸或精氨酸或大至足以破坏Fc/Fcγ受体界面内，在Fc之P329与FcgRIII之色氨酸残基W87及W110之间形成(Sondermann等人：Nature 406,267-273(2000年7月20日))之脯氨酸夹心的氨基酸残基取代。在另一个实施方案中，Fc变异体中之至少一个其他氨基酸取代为S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，且在另一个实施方案中，该至少一个其他氨基酸取代为人IgG1Fc区之L234A及L235A或人IgG4Fc区之S228P及L235E，均系根据EU编号(美国专利第8,969,526号，其以全文引用的方式并入本文中)。
在某些实施方案中，多肽包含野生型人IgGFc区之Fc变异体，其中该多肽之人IgGFc区P329经甘氨酸替代且其中Fc变异体包含人IgG1Fc区之L234A及L235A或人IgG4Fc区之S228P及L235E的至少两个其他氨基酸取代，且其中残基系根据EU编号进行编号(美国专利第8,969,526号，其以全文引用的方式并入本文中)。在某些实施方案中，包含P329G、L234A及L235A(EU编号)取代之多肽显示对人FcγRIIIA及FcγRIIA之亲和力减少，从而下调ADCC至藉由包含野生型人IgG Fc区之多肽诱发的ADCC之至少20％，及/或下调ADCP(美国专利第8,969,526号，其以全文引用的方式并入本文中)。
在一特定实施方案中，包含野生型人Fc多肽之Fc变异体的多肽包含三重突变：根据EU编号位置Pro329之氨基酸取代、L234A及L235A突变(P329/LALA)(美国专利第8,969,526号，其以全文引用的方式并入本文中)。在特定实施方案中，多肽包含以下氨基酸取代：P329G、L234A及L235A，根据EU编号。
描述具有提高或降低之与FcR之结合的某些抗体变异体(参见例如美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312，及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中，抗体变异体包含具有一或多个提高ADCC之氨基酸取代，例如Fc区之位置298、333及/或334(EU编号)之取代的Fc区。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，引起C1q结合及/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(亦即提高或降低)，例如如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中描述。
半衰期延长且与负责将母体IgG转移至胎儿之新生儿Fc受体(FcRn)(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))之结合改良的抗体描述于US 2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗体包含其中具有一或多个取代之Fc区，其中Fc区与FcRn之结合得以改善。此类Fc变异体包括在Fc区残基中之一或多者具有取代之Fc变异体：根据EU编号，238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc区残基434之取代(美国专利第7,371,826号)。关于Fc区变异体之其他实例，亦参见Duncan及Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；及WO 94/29351。
d)半胱氨酸工程改造之抗体变异体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程改造之抗体，例如“THIOMABTM抗体”，其中抗体之一或多个残基经半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，经取代之残基存在于抗体之可接近位点。藉由用半胱氨酸替代彼等残基，反应性硫醇基从而定位于抗体之可接近位点且可用于使抗体与其他部分(诸如药物模块或接头-药物模块)缀合以产生如本文中进一步描述之免疫缀合物。在某些实施方案中，以下残基中之任一或多者可经半胱氨酸替代：轻链之V205(Kabat编号)；重链之A140(EU编号)；重链之L174(EU编号)；重链之Y373(EU编号)；轻链之K149(Kabat编号)；重链之A118(EU编号)；以及重链Fc区之S400(EU编号)。在特定实施方案中，本文所述之抗体包含HC-A140C(EU编号)半胱氨酸替代。在特定实施方案中，本文所述之抗体包含LC-K149C(Kabat编号)半胱氨酸替代。在特定实施方案中，本文所述之抗体包含HC-A118C(EU编号)半胱氨酸替代。可如例如美国专利第7,521,541号中所述产生半胱氨酸工程改造之抗体。
在某些实施方案中，抗体包含以下重链半胱氨酸替代之一：
链(HC/LC) 残基 EU突变位点# Kabat突变位点#
HC T 114 110
HC A 140 136
HC L 174 170
HC L 179 175
HC T 187 183
HC T 209 205
HC V 262 258
HC G 371 367
HC Y 373 369
HC E 382 378
HC S 424 420
HC N 434 430
HC Q 438 434
在某些实施方案中，抗体包含以下轻链半胱氨酸替代之一：
链(HC/LC) 残基 EU突变位点# Kabat突变位点#
LC I 106 106
LC R 108 108
LC R 142 142
LC K 149 149
非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2重链(HC)A118C THIOMABTM具有分别SEQ IDNO:132及134之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD重链(HC)A118CTHIOMABTM具有分别SEQ ID NO:133及134之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7重链(HC)A118CTHIOMABTM具有分别SEQ ID NO:137及138之重链及轻链氨基酸序列。
示例性S400C半胱氨酸工程改造之重链恒定区展示在SEQ ID NO:135中。S400C半胱氨酸工程改造之重链恒定区可与SEQ ID NO:127中展示之hu1D11.v1.9 varC2重链可变区之C端融合。所得hu1D11.v1.9 varC2 HC S400C重链可与hu1D11.v1.9 varC2κ轻链，诸如SEQ ID NO:134中展示之轻链配对。S400C半胱氨酸工程改造之重链恒定区可与SEQ ID NO:38中展示之hu1D11.v1.9 varD重链可变区之C端融合。所得hu1D11.v1.9 varD HC S400C重链可与hu1D11.v1.9 varDκ轻链，诸如SEQ ID NO:134中展示之轻链配对。S400C半胱氨酸工程改造之重链恒定区可与SEQ ID NO:56中展示之hu22C10.v2.7重链可变区之C端融合。所得hu22C10.v2.7 HC S400C重链可与hu22C10.v2.7κ轻链，诸如SEQ ID NO:138中展示之轻链配对。
非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2轻链(LC)K149C THIOMABTM具有分别SEQ IDNO:130及140之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2轻链(LC)K149C THIOMABTM具有分别SEQ ID NO:130及145之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD轻链(LC)K149C THIOMABTM具有分别SEQ ID NO:131及140之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD轻链(LC)K149C THIOMABTM具有分别SEQ IDNO:131及145之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7轻链(LC)K149CTHIOMABTM具有分别SEQ ID NO:144及142之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7轻链(LC)K149CTHIOMABTM具有分别SEQ ID NO:144及147之重链及轻链氨基酸序列。
非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2轻链(LC)V205C THIOMABTM具有分别SEQ IDNO:130及141之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2轻链(LC)V205C THIOMABTM具有分别SEQ ID NO:130及146之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD轻链(LC)V205C THIOMABTM具有分别SEQ ID NO:131及141之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD轻链(LC)V205C THIOMABTM具有分别SEQ IDNO:131及146之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7轻链(LC)V205CTHIOMABTM具有分别SEQ ID NO:144及143之重链及轻链氨基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7轻链(LC)V205CTHIOMABTM具有分别SEQ ID NO:144及148之重链及轻链氨基酸序列。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，可将本文中所提供之抗体进一步修饰以含有本领域中已知且可易于获得之其他非蛋白质部分。适合于抗体衍生化之部分包括(但不限于)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性实例包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三恶烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其于水中之稳定性而可具有制造优势。聚合物可具有任何分子量，且可为分支或未分支的。与抗体附着之聚合物的数目可变化，且若连接一个以上聚合物，则聚合物可相同或不同分子。一般而言，用于衍生作用之聚合物之数目及/或类型可基于包括(但不限于)待改善抗体之特殊特性或功能，抗体衍生物是否将用于指定病症下之疗法等考虑因素来确定。
在另一实施方案中，提供抗体与可藉由暴露于放射线选择性地加热之非蛋白质部分之结合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分为碳纳米管(Kam等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。放射线可具有任何波长，且包括(但不限于)不损害普通细胞但将非蛋白质部分加热至杀死靠近抗体-非蛋白质部分之细胞之温度的波长。
B.重组方法及组合物
可使用例如如美国专利4,816,567中所描述之重组方法及组合物产生抗体。在一个实施方案中，提供编码本文所述之抗-B7-H4抗体之分离核酸。此类核酸可编码构成抗体之VL之氨基酸序列及/或构成VH之氨基酸序列(例如抗体之轻链及/或重链)。在另一实施方案中，提供包含此类核酸之一或多种载体(例如表达载体)。在又一实施方案中，提供包含此类核酸之宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经以下转化)：(1)包含编码构成抗体VL之氨基酸序列及构成抗体VH之氨基酸序列之核酸的载体；或(2)包含编码构成抗体VL之氨基酸序列之核酸的第一载体及包含编码构成抗体VH之氨基酸序列之核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种制备抗-B7-H4抗体之方法，其中该方法包含在适合于表达抗体之条件下培养如上文所提供之包含编码抗体之核酸的宿主细胞且任选的自宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
为重组产生抗-B7-H4抗体，分离例如如上所述之编码抗体之核酸且插入一或多种载体中以在宿主细胞中进一步克隆及/或表达。此类核酸可易于使用常规程序(例如藉由使用能够与编码抗体之重链及轻链之基因特异性结合的寡核苷酸探针)分离及测序。
适于克隆或表达抗体编码载体之宿主细胞包括本文所描述之原核或真核细胞。举例而言，抗体可于细菌中产生，尤其当不需要糖基化及Fc效应功能时。关于抗体片段及多肽在细菌中之表达，参见例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号及第5,840,523号(亦参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，描述大肠杆菌中抗体片段之表达)。在表达之后，抗体可以可溶性洗脱份自细菌细胞糊状物分离且其可进一步经纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之真核微生物为抗体编码载体之适合克隆或表达宿主，包括糖基化路径已经“人源化”，从而使得所产生之抗体具有部分或完全人糖基化型态的真菌及酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)及Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体之适合宿主细胞亦来源于多细胞生物体(无脊椎动物及脊椎动物)。无脊椎动物细胞之实例包括植物及昆虫细胞。已鉴别出众多可与昆虫细胞联合使用，尤其用于转染草地黏虫(Spodoptera frugiperda)细胞之杆状病毒株。
植物细胞培养物亦可用作宿主。参见例如美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号及第6,417,429号(描述在转基因植物中产生抗体之PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞亦可用作宿主。举例而言，适于在悬浮液中生长之哺乳动物细胞系可为适用的。适用哺乳动物宿主细胞系之其他实例为经SV40(COS-7)转化之猴肾CV1系；人胚肾细胞系(如例如在Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述之293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(mouse sertoli cell)(如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述之TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人子宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(buffalo ratliver cell)(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；如例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述之TRI细胞；MRC 5细胞；及FS4细胞。其他适用之哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0及Sp2/0。关于适于抗体产生之某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
C.分析
可藉由本领域中已知之各种分析对本文所提供之抗-B7-H4抗体针对其物理/化学特性及/或生物活性进行鉴别、筛选或表征。
在一个方面中，例如藉由已知之方法，诸如ELISA、
Figure BDA0003169464670001091
FACS或Western印迹法测试本发明抗体之抗原结合活性。
在另一方面中，可使用竞争分析来鉴别与本文中描述之任一抗体竞争结合B7-H4之抗体。在某些实施方案中，此类竞争抗体结合由本文所述之抗体所结合者相同之表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体结合之表位的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。
在一示例性竞争分析中，在如下溶液中培育固定B7-H4，该溶液包含结合B7-H4之第一标记抗体(例如本文所述之任一抗体)及测试与第一抗体竞争结合B7-H4之能力的第二未标记抗体。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一标记抗体但无第二未标记抗体之溶液中培育固定B7-H4。在允许第一抗体结合B7-H4之条件下培育之后，移除过量未结合抗体，且测量与固定B7-H4缔合之标记之量。若测试样本中与固定B7-H4缔合之标记之量相对于对照样本中实质上降低，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合B7-H4。参见Harlow及Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D.免疫缀合物
本发明亦提供免疫缀合物，其包含本文中缀合于一或多种细胞毒性剂之抗-B7-H4抗体，该一或多种细胞毒性剂诸如为化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源之蛋白质毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性缀合物)。
免疫缀合物允许药物模块靶向传递至肿瘤且在一些实施方案中其中在胞内累积，其中全身性施用未缀合药物可对正常细胞造成不可接受之毒性水平(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。
抗体-药物缀合物(ADC)为靶向型化学治疗分子，其藉由将有效细胞毒性药物靶向表达抗原之肿瘤细胞，将抗体与细胞毒性药物之特性组合(Teicher,B.A.(2009)CurrentCancer Drug Targets 9:982-1004)，由此藉由最大化功效且最小化脱靶毒性而增强治疗指数(Carter,P.J.及Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)。
本发明之ADC化合物包括具有抗癌活性之化合物。在一些实施方案中，ADC化合物包括缀合，亦即共价附着于药物模块之抗体。在一些实施方案中，抗体经由接头共价连接于药物模块。本发明之抗体-药物缀合物(ADC)选择性地传递有效剂量之药物至肿瘤组织，从而可实现较大选择性，亦即较低有效剂量，同时增加治疗指数(“治疗窗”)。
抗体-药物缀合物(ADC)之药物模块(D)可包括具有细胞毒性或细胞生长抑制作用之任何化合物、部分或基团。药物模块可藉由包括(但不限于)微管蛋白结合、DNA结合或插入及抑制RNA聚合酶、蛋白质合成及/或拓扑异构酶来赋予其细胞毒性及细胞生长抑制作用。示例性药物模块包括(但不限于)美登木素生物碱、海兔毒素、奥瑞司他汀、加利车霉素、吡咯并苯并二氮卓(PBD)、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽环霉素(anthracycline)、倍癌霉素、长春花生物碱、紫杉烷、单端孢霉烯族毒素、CC1065、喜树碱(camptothecin)、依利奈法德(elinafide)及具有细胞毒活性之其立体异构体、电子等排体、类似物及衍生物。此类免疫缀合物之非限制性实例进一步详细论述于下文中。
1.示例性抗体-药物缀合物
抗体-药物缀合物(ADC)化合物之一示例性实施方案包含靶向肿瘤细胞之抗体(Ab)、药物模块(D)及附着Ab与D之接头部分(L)。在一些实施方案中，抗体经由一或多个氨基酸残基，诸如赖氨酸及/或半胱氨酸附着于接头部分(L)。
一示例性ADC具有式I：
Ab-(L-D)p I
其中p为1至约20。在一些实施方案中，可缀合于抗体之药物模块的数目由游离半胱氨酸残基之数目限制。在一些实施方案中，游离半胱氨酸残基藉由本文所描述之方法引入抗体氨基酸序列中。示例性式I之ADC包括(但不限于)具有1、2、3或4个工程改造半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.等人(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。在一些实施方案中，一或多个游离半胱氨酸残基不使用工程改造已存在于抗体中，在此情况下现有游离半胱氨酸残基可用于将抗体缀合于药物。在一些实施方案中，抗体在抗体缀合前暴露于还原条件以产生一或多个游离半胱氨酸残基。
a)示例性接头
“接头”(L)为可用于连接一或多个药物模块(D)于抗体(Ab)以形成式I之抗体-药物缀合物(ADC)的双官能或多官能部分。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物(ADC)可使用具有用于共价附着于药物及抗体之反应性官能基之接头制备。举例而言，在一些实施方案中，抗体(Ab)之半胱氨酸硫醇可与接头或药物-接头中间物之反应性官能基形成一键以制备ADC。
在一个方面中，接头具有能够与抗体上存在之游离半胱氨酸反应形成共价键的官能基。非限制性示例性此类反应性官能基包括顺丁烯二酰亚胺、卤乙酰胺、α-卤乙酰基、活化酯(诸如丁二酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯)、酸酐、酸氯化物、磺酰基氯、异氰酸酯及异硫氰酸酯。参见例如Klussman等人(2004),Bioconjugate Chemistry15(4):765-773第766页之缀合方法，及其中之实例。
在一些实施方案中，接头具有能够使抗体上存在之亲电子基团反应的官能基。示例性此类亲电子基团包括(但不限于)醛及酮羰基。在一些实施方案中，接头之反应性官能基之杂原子可与抗体上之亲电子基团反应且形成与抗体之共价键。非限制性示例性此类反应性官能基包括(但不限于)酰肼、肟、氨基、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基酰肼。
接头可包含一或多种接头组分。示例性接头组分包括6-顺丁烯二酰亚氨基己酰基(“MC”)、顺丁烯二酰亚氨基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苯甲氧基羰基(“PAB”)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二酰亚氨基酯(“SPP”)及环己烷-1-甲酸4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)酯(“MCC”)。各种接头组分为本领域中已知，其中一些在下文中描述。
接头可为“可切割接头”，促进药物之释放。非限制性示例性可切割接头包括酸不稳定接头(例如包含腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)接头、光不稳定接头或含二硫化物之接头(Chari等人,Cancer Research 52:127-131(1992)；US 5208020)。
在某些实施方案中，接头具有下式II：
-Aa-Ww-Yy- II
其中A为“延伸子单元”，且a为0至1之整数；W为“氨基酸单元”，且w为0至12之整数；Y为“间隔子单元”，且y为0、1或2；且Ab、D及p如上文针对式I所定义。此类接头之示例性实施方案描述于明确地以引用的方式并入本文中之美国专利第7,498,298号中。
在一些实施方案中，接头组分包含将抗体连接于另一接头组分或药物模块之“延伸子单元”。非限制性示例性延伸子单元展示如下(其中波形线指示共价连接于抗体、药物或其他接头组分之位点)：
Figure BDA0003169464670001121
在一些实施方案中，接头可为肽模拟接头，诸如WO2015/095227、WO2015/095124或WO2015/095223中描述之肽模拟接头，该等文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，接头组分包含“氨基酸单元”。在一些此类实施方案中，氨基酸单元允许接头藉由蛋白酶切割，由此促进药物在暴露于胞内蛋白酶，诸如溶酶体酶时自免疫缀合物释放(Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784)。示例性氨基酸单元包括(但不限于)二肽、三肽、四肽及五肽。示例性二肽包括(但不限于)缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)；苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)；苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-高lys)；及N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括(但不限于)甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)及甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。氨基酸单元可包含天然存在之氨基酸残基及/或次要氨基酸及/或非天然存在之氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸单元可针对藉由特定酶，例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C及D或纤维蛋白溶酶蛋白酶之酶切割进行设计且优化。
在一些实施方案中，接头组分包含将抗体直接或经由延伸子单元及/或氨基酸单元连接于药物模块的“间隔子”单元。间隔子单元可为“自分解型”或“非自分解型”。“非自分解型”间隔子单元为在ADC切割时部分或所有间隔子单元仍然结合于药物模块之间隔子单元。非自分解型间隔子单元之实例包括(但不限于)甘氨酸间隔子单元及甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。在一些实施方案中，含有甘氨酸-甘氨酸间隔子单元之ADC藉由肿瘤细胞相关蛋白酶进行酶切割，使得甘氨酸-甘氨酸-药物模块自ADC之其余部分释放。在一些此类实施方案中，甘氨酸-甘氨酸-药物模块在肿瘤细胞中进行水解步骤，因此自药物模块切割甘氨酸-甘氨酸间隔子单元。
“自分解型”间隔子单元允许释放药物模块。在某些实施方案中，接头之间隔子单元包含对氨基苯甲基单元。在一些此类实施方案中，对氨基苯甲基醇经由酰胺键附着于氨基酸单元，且在苯甲醇与药物之间制得氨基甲酸酯、甲基氨基甲酸酯或碳酸酯(Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在一些实施方案中，间隔子单元为对氨基苯甲氧基羰基(PAB)。在一些实施方案中，包含自分解型接头之ADC具有以下结构：
Figure BDA0003169464670001131
其中Q为-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-硝基或-氰基；m为在0至4范围内之整数；且p在1至约20范围内。在一些实施方案中，p在1至10、1至7、1至5或1至4范围内。
自分解型间隔子之其他实例包括(但不限于)电子上类似于PAB基团之芳族化合物，诸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美国专利第7,375,078号；Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)及邻或对氨基苯甲基乙醛。在一些实施方案中，可使用在酰胺键水解时进行环化之间隔子，诸如经取代及未经取代之4-氨基丁酰胺(Rodrigues等人(1995)Chemistry Biology 2:223)、适当经取代之双环[2.2.1]及双环[2.2.2]环系统(Storm等人(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)及2-氨基苯基丙酰胺(Amsberry等人(1990)J.Org.Chem.55:5867)。药物与甘氨酸残基之α-碳的连接为适用于ADC之自分解型间隔子的另一实例(Kingsbury等人(1984)J.Med.Chem.27:1447)。
在一些实施方案中，接头L可为用于经由分支之多官能接头部分共价连接一个以上药物模块于抗体的树突型接头(Sun等人(2002)Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters 12:2213-2215；Sun等人(2003)Bioorganic&Medicinal Chemistry 11:1761-1768)。树突状接头可增加药物与抗体之摩尔比，亦即负载，其与ADC效能有关。因此，在抗体仅仅载有一个反应性半胱氨酸硫醇基之情况下，可经由树突状接头附着多个药物模块。
下文展示在式I之ADC之情况下非限制性示例性接头：
Figure BDA0003169464670001141
其他非限制性示例性ADC包括如下结构：
Figure BDA0003169464670001151
其中X为：
Figure BDA0003169464670001152
Y为：
Figure BDA0003169464670001153
各R独立地为H或C1-C6烷基；且n为1至12。
通常，肽型接头可藉由在两个或两个以上氨基酸及/或肽片段之间形成肽键来制备。例如根据液相合成方法可制备此类肽键(例如E.
Figure BDA0003169464670001154
及K.Lübke(1965)“ThePeptides”,第1卷,第76-136页,Academic Press)。
在一些实施方案中，接头经调节溶解性及/或反应性之基团取代。作为一非限制性实例，诸如磺酸根(-SO3 -)或铵之带电取代基可增加接头试剂之水溶性且促进接头试剂与抗体及/或药物模块之偶联反应，或促进Ab-L(抗体-接头中间物)与D或D-L(药物-接头中间物)与Ab之偶联反应，视用于制备ADC之合成途径而定。在一些实施方案中，接头一部分与抗体偶联且接头一部分与药物偶联，且接着Ab-(接头部分)a与药物-(接头部分)b偶联以形成式I之ADC。在一些此类实施方案中，抗体包含一个以上(接头部分)a取代基，使得在式I之ADC中一个以上药物与抗体偶联。
本发明之化合物明确涵盖(但不限于)用以下接头试剂制备之ADC：双-顺丁烯二酰亚氨基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-顺丁烯二酰亚氨基丙基氧基)-N-羟基丁二酰亚胺酯(BMPS)、N-(ε-顺丁烯二酰亚氨基己酰基氧基)丁二酰亚胺酯(EMCS)、N-[γ-顺丁烯二酰亚氨基丁酰基氧基]丁二酰亚胺酯(GMBS)、1,6-己烷-双-乙烯基砜(HBVS)、4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸)丁二酰亚氨基酯(LC-SMCC)、间顺丁烯二酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯(MBS)、4-(4-N-顺丁烯二酰亚氨基苯基)丁酰肼(MPBH)、3-(溴乙酰氨基)丙酸丁二酰亚胺酯(SBAP)、碘乙酸丁二酰亚胺酯(SIA)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸丁二酰亚胺酯(SIAB)、N-丁二酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-丁二酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、4-(N-顺丁烯二酰亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸丁二酰亚胺酯(SMCC)、4-(对顺丁烯二酰亚氨基苯基)丁酸丁二酰亚胺酯(SMPB)、6-[(β-顺丁烯二酰亚氨基丙酰氨基)己酸丁二酰亚胺酯](SMPH)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB以及丁二酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯(SVSB)，且包括双-顺丁烯二酰亚氨基试剂：二硫基双顺丁烯二酰亚氨基乙烷(DTME)、1,4-双顺丁烯二酰亚氨基丁烷(BMB)、1,4-双顺丁烯二酰亚氨基-2,3-二羟基丁烷(BMDB)、双顺丁烯二酰亚氨基己烷(BMH)、双顺丁烯二酰亚氨基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(下文展示)及BM(PEG)3(下文展示)；酰亚胺酯之双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(诸如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双迭氮基化合物(诸如双(对迭氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些实施方案中，双顺丁烯二酰亚胺试剂允许抗体中半胱氨酸之硫醇基附着于含硫醇之药物模块、接头或接头-药物中间物。与硫醇基反应之其他官能基包括(但不限于)碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫键、吡啶基二硫键、异氰酸酯及异硫氰酸酯。
Figure BDA0003169464670001161
某些适用之接头试剂可自各种商业来源获得，诸如Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)、Molecular Biosciences Inc.(Boulder,CO)，或根据本领域中描述之程序合成；例如Toki等人(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；Dubowchik等人(1997)TetrahedronLetters,38:5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60:5352-5355；Frisch等人(1996)Bioconjugate Chem.7:180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；及WO 04/032828。
碳14标记之1-异硫氰基苯甲基-3-甲基二亚乙三胺五乙酸(MX-DTPA)为用于将放射性核苷酸缀合于抗体之示例性螯合剂。参见例如WO94/11026。
b)示例性药物模块
(1)美登素及美登木素生物碱
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合于一或多个美登木素生物碱分子之抗体。美登木素生物碱为美登素之衍生物，且为藉由抑制微管蛋白聚合而起作用之有丝分裂抑制剂。美登素首次系自东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离而得(美国专利第3896111号)。随后，发现某些微生物亦产生美登木素生物碱，诸如美登醇及C-3美登醇酯(美国专利第4,151,042号)。合成美登木素生物碱揭示于例如美国专利第4,137,230号；第4,248,870号；第4,256,746号；第4,260,608号；第4,265,814号；第4,294,757号；第4,307,016号；第4,308,268号；第4,308,269号；第4,309,428号；第4,313,946号；第4,315,929号；第4,317,821号；第4,322,348号；第4,331,598号；第4,361,650号；第4,364,866号；第4,424,219号；第4,450,254号；第4,362,663号；及第4,371,533号。
美登木素生物碱药物模块为抗体-药物缀合物中具有吸引力之药物模块，因为其：(i)藉由发酵或发酵产物之化学修饰或衍生，相对易于制备；(ii)易由适合于经由非二硫化物接头缀合于抗体的官能基衍生；(iii)在血浆中稳定；及(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。
适用作美登木素生物碱药物模块之某些美登木素生物碱为本领域中已知，且可自天然来源根据已知方法分离，或使用基因工程改造技术产生(参见例如Yu等人(2002)PNAS99:7968-7973)。美登木素生物碱亦可根据已知方法以合成方式制备。
示例性美登木素生物碱药物模块包括(但不限于)具有经修饰之芳环的美登木素生物碱，诸如：C-19-去氯(美国专利第4256746号)(例如藉由氢化锂铝还原安莎霉素P2制备)；C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利第4361650号及第4307016号)(例如藉由使用链霉菌或放线菌去甲基化或使用LAH去氯来制备)；及C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去氯(美国专利第4,294,757号)(例如藉由使用酰基氯酰化来制备)及在芳环其他位置具有修饰之美登木素生物碱。
示例性美登木素生物碱药物模块亦包括具有诸如以下修饰之美登木素生物碱：C-9-SH(美国专利第4424219号)(例如藉由美登醇与H2S或P2S5反应制备)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2 OR)(US 4331598)；C-14-羟基甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利第4450254号)(例如由诺卡菌属(Nocardia)制备)；C-15-羟基/酰氧基(US 4364866)(例如藉由链霉菌转化美登醇制备)；C-15-甲氧基(美国专利第4313946号及第4315929号)(例如自滑桃树属(Trewia nudlflora)制备)；C-18-N-去甲基(美国专利第4362663号及第4322348号)(例如藉由美登醇由链霉菌去甲基化制备)；及4,5-脱氧基(US4371533)(例如藉由三氯化钛/LAH还原美登醇制备)。
美登木素生物碱化合物上之许多位置适用作连接位置。举例而言，酯键可藉由使用常规偶联技术与羟基反应形成。在一些实施方案中，反应可在具有羟基之C-3位置、经羟基甲基修饰之C-14位置、经羟基修饰之C-15位置及具有羟基之C-20位置发生。在一些实施方案中，键在美登醇或美登醇类似物之C-3位置形成。
美登木素生物碱药物模块包括具有以下结构之美登木素生物碱药物模块：
Figure BDA0003169464670001181
其中波形线指示美登木素生物碱药物模块之硫原子共价附着于ADC之接头。各R可独立地为H或C1-C6烷基。将酰氨基附着于硫原子之亚烷基链可为甲基、乙基或丙基，亦即m为1、2或3(US 633410；US 5208020；Chari等人(1992)Cancer Res.52:127-131；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.SciUSA93:8618-8623)。
本发明之ADC涵盖美登木素生物碱药物模块之所有立体异构体，亦即手性碳R及S构型之任何组合(US 7276497；US 6913748；US 6441163；US633410(RE39151)；US 5208020；Widdison等人(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408，以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，美登木素生物碱药物模块具有以下立体化学：
Figure BDA0003169464670001191
美登木素生物碱药物模块之示例性实施方案包括(但不限于)DM1；DM3；及DM4，具有以下结构：
Figure BDA0003169464670001192
Figure BDA0003169464670001201
其中波形线指示药物之硫原子共价连接于抗体-药物缀合物之接头(L)。
其他示例性美登木素生物碱抗体-药物缀合物具有以下结构及缩写(其中Ab为抗体且p为1至约20。在一些实施方案中，p在1至10，p为1至7，p为1至5，或p为1至4)：
Figure BDA0003169464670001202
Figure BDA0003169464670001211
其中DM1经由BMPEO接头连接于抗体之硫醇基的示例性抗体-药物缀合物具有以下结构及缩写：
Figure BDA0003169464670001212
其中Ab为抗体；n为0、1或2；且p为1至约20。在一些实施方案中，p在1至10，p为1至7，p为1至5，或p为1至4。
含有美登木素生物碱之免疫缀合物、其制备方法及其治疗用途例如揭示于美国专利第5,208,020号及第5,416,064号、US 2005/0276812 A1及欧洲专利EP 0 425 235B1(揭示内容以引用的方式明确并入本文中)中。亦参见Liu等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)；及Chari等人Cancer Research 52:127-131(1992)。
在一些实施方案中，抗体-美登木素生物碱缀合物可藉由化学连接抗体于美登木素生物碱分子来制备，不显著降低抗体或美登木素生物碱分子之生物活性。参见例如美国专利第5,208,020号(揭示内容以引用的方式明确并入本文中)。在一些实施方案中，每个抗体分子平均缀合3-4个美登木素生物碱分子之ADC已展示增强标靶细胞之细胞毒性的功效，不负面影响抗体之功能或溶解性。在一些情况下，即使一个分子毒素/抗体亦预期与使用裸抗体相比，增强细胞毒性。
用于制备抗体-美登木素生物碱缀合物之示例性连接基团包括例如本文中描述之连接基团及以下中揭示之连接基团：美国专利第5208020号；EP专利0 425 235B1；Chari等人Cancer Research 52:127-131(1992)；US2005/0276812A1；及US 2005/016993 A1，揭示内容以引用的方式明确并入本文中。
(2)奥瑞司他汀及海兔毒素
药物模块包括海兔毒素、奥瑞司他汀及其类似物及衍生物(US 5635483；US5780588；US 5767237；US 6124431)。奥瑞司他汀为海洋软体动物化合物海兔毒素-10之衍生物。虽然不欲受任何特定理论束缚，但海兔毒素及奥瑞司他汀已展示干扰微管动力学、GTP水解及核及细胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US5663149)及抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965)。海兔毒素/奥瑞司他汀药物模块可经由肽药物模块之N(氨基)端或C(羧基)端附着于抗体(WO 02/088172；Doronina等人(2003)Nature Biotechnology21(7):778-784；Francisco等人(2003)Blood 102(4):1458-1465)。
示例性奥瑞司他汀实施方案包括N端连接之单甲基奥瑞司他汀药物模块DE及DF，揭示于US 7498298及US 7659241(揭示内容以全文引用之方式明确并入)中：
Figure BDA0003169464670001221
其中DE及DF之波形线指示共价连接于抗体或抗体-接头组分之位点，且在各位置独立地：
R2选自H及C1-C8烷基；
R3选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环及C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R4选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环及C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
R5选自H及甲基；
或R4及R5共同形成碳环且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra及Rb独立地选自H、C1-C8烷基及C3-C8碳环且n选自2、3、4、5及6；
R6选自H及C1-C8烷基；
R7选自H、C1-C8烷基、C3-C8碳环、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳环)、C3-C8杂环及C1-C8烷基-(C3-C8杂环)；
各R8独立地选自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳环及O-(C1-C8烷基)；
R9选自H及C1-C8烷基；
R10选自芳基或C3-C8杂环；
Z为O、S、NH或NR12，其中R12为C1-C8烷基；
R11选自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8杂环、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；
m为在1-1000范围内之整数；
R13为C2-C8烷基；
R14为H或C1-C8烷基；
R15每次出现时独立地为H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；
R16每次出现时独立地为H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；
R18选自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8杂环)及-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳环)；且
n为在0至6范围内之整数。
在一个实施方案中，R3、R4及R7独立地为异丙基或仲丁基且R5为-H或甲基。在一示例性实施方案中，R3及R4各为异丙基，R5为-H，且R7为仲丁基。
在另一实施方案中，R2及R6各为甲基，且R9为-H。
在另一实施方案中，每次出现时R8为-OCH3。
在一示例性实施方案中，R3及R4各为异丙基，R2及R6各为甲基，R5为-H，R7为仲丁基，R8每次出现时为-OCH3，且R9为-H。
在一个实施方案中，Z为-O-或-NH-。
在一个实施方案中，R10为芳基。
在一示例性实施方案中，R10为-苯基。
在一示例性实施方案中，当Z为-O-时，R11为-H、甲基或叔丁基。
在一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-N(R16)2，且R16为-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一个实施方案中，当Z为-NH时，R11为-CH(R15)2，其中R15为-(CH2)n-SO3H。
式DE之一示例性奥瑞司他汀实施方案为MMAE，其中波形线指示与抗体-药物缀合物之接头(L)的共价附着：
Figure BDA0003169464670001241
式DF之一示例性奥瑞司他汀实施方案为MMAF，其中波形线指示与抗体-药物缀合物之接头(L)的共价附着：
Figure BDA0003169464670001242
其他示例性实施方案包括在五肽奥瑞司他汀药物模块之C端具有苯丙氨酸羧基修饰之单甲基缬氨酸化合物(WO 2007/008848)及在五肽奥瑞司他汀药物模块之C端具有苯丙氨酸侧链修饰之单甲基缬氨酸化合物(WO2007/008603)。
包含MMAE或MMAF及各种接头组分之式I之ADC的非限制性示例性实施方案具有以下结构及缩写(其中“Ab”为抗体；p为1至约8，“Val-Cit”为缬氨酸-瓜氨酸二肽；且“S”为硫原子：
Figure BDA0003169464670001243
Figure BDA0003169464670001251
包含MMAF及各种接头组分之式I之ADC的非限制性示例性实施方案进一步包括Ab-MC-PAB-MMAF及Ab-PAB-MMAF。包含藉由非蛋白水解可切割之接头附着于抗体之MMAF的免疫缀合物已展示具有与包含藉由蛋白水解可切割接头附着于抗体之MMAF的免疫缀合物相当之活性(Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124)。在一些此类实施方案中，相信药物释放由抗体在细胞中降解来实现。
通常，基于肽之药物模块可藉由在两个或两个以上氨基酸及/或肽片段之间形成肽键来制备。例如根据液相合成方法可制备此类肽键(参见例如E.
Figure BDA0003169464670001252
及K.Lübke,“The Peptides”,第1卷,第76-136页,1965,Academic Press)。在一些实施方案中，奥瑞司他汀/海兔毒素药物模块可根据以下之方法制备：US 7498298；US 5635483；US 5780588；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer DrugDesign 13:243-277；Pettit,G.R.等人,Synthesis,1996,719-725；Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5:859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7):778-784。
在一些实施方案中，式DE(诸如MMAE)及DF(诸如MMAF)之奥瑞司他汀/海兔毒素药物模块及其药物-接头中间物及衍生物(诸如MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF及MC-vc-PAB-MMAE)可使用US 7498298、Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17:114-124及Doronina等人(2003)Nat.Biotech.21:778-784中所述方法制备，且接着缀合于相关抗体。
(3)加利车霉素
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合于一或多个加利车霉素分子之抗体。抗生素之加利车霉素家族及其类似物能够在低于皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂(Hinman等人,(1993)Cancer Research 53:3336-3342；Lode等人,(1998)Cancer Research 58:2925-2928)。加利车霉素具有胞内作用位点，但在某些情况下，不容易跨过质膜。因此，在一些实施方案中，此等药剂经由抗体介导之内化的细胞吸收可大大增强其细胞毒性作用。制备具有加利车霉素药物模块之抗体-药物缀合物之非限制性示例性方法描述于例如US5712374、US 5714586、US 5739116及US 5767285中。
在一些实施方案中，缀合于抗体之加利车霉素药物模块为具有下式之化合物：
Figure BDA0003169464670001261
其中X为Br或I；L为接头；R为氢、C1-6烷基或-C(＝O)C1-6烷基；且Ra为氢或C1-6烷基。
在一些实施方案中，X为Br，Ra为氢且R为异丙基。
在其他实施方案中，X为Br，Ra为氢且R为乙基。
在其他实施方案中，X为I，Ra为氢且R为异丙基。
在其他实施方案中，X为I，Ra为氢且R为乙基。
在一些实施方案中，X为Br，Ra为氢且R为-C(＝O)CH3。
在其他实施方案中，X为I，Ra为氢且R为-C(＝O)CH3。
在其他实施方案中，X为I，Ra为乙基且R为-C(＝O)CH3。
在其他实施方案中，X为Br，Ra为乙基且R为-C(＝O)CH3。
(4)吡咯并苯并二氮卓
在一些实施方案中，ADC包含吡咯并苯并二氮卓(PBD)。在一些实施方案中，PDB二聚体识别且结合于特定DNA序列。天然产物安曲霉素(一种PBD)于1965年首次报导(Leimgruber等人,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5793-5795；Leimgruber等人,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5791-5793)。此后，已报导许多PBD，天然存在之PBD与类似物(Thurston等人,(1994)Chem.Rev.1994,433-465，包括三环PBD骨架之二聚体(US 6884799；US 7049311；US 7067511；US 7265105；US 7511032；US 7528126；US 7557099)。不欲受任何特定理论束缚，相信二聚体结构用B形式DNA之小沟赋予适当等螺旋性三维形状，使得在结合位点紧密贴合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,New York,第3-11页(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19:230-237)。载有C2芳基取代基之二聚PBD化合物已展示适用作细胞毒性剂(Hartley等人(2010)Cancer Res.70(17):6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941；Howard等人(2009)Bioorganicand Med.Chem.Letters19(22):6463-6466)。
在一些实施方案中，PBD化合物可藉由在N10位置经体内可移除之氮保护基保护而用作前药(WO 00/12507；WO 2005/023814)。
PBD二聚体已缀合于抗体且所得ADC展示具有抗癌特性(US2010/0203007)。PBD二聚体上非限制性示例性连接位点包括五员吡咯环(PBD单元之间的栓系子)及N10-C11亚氨基(WO 2009/016516；US2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO2011/130598)。
ADC之非限制性示例性PBD二聚体组分具有式A：
Figure BDA0003169464670001271
及其盐及溶剂合物，其中：
波形线指示共价附着于接头之位点；
点线指示C1与C2或C2与C3之间任选的存在双键；
R2独立地选自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且任选地进一步选自卤基或二卤基，其中RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及卤基；
R6及R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及卤基；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及卤基；
Q独立地选自O、S及NH；
R11为H或R，或在Q为O的情况中，为SO3M，其中M为金属阳离子；
R及R'各独立地选自任选地经取代之C1-8烷基、C1-12烷基、C3-8杂环基、C3-20杂环及C5-20芳基，且任选地关于基团NRR'，R及R'连同其附着之氮原子一起形成任选地经取代之4、5、6或7员杂环；
R12、R16、R19及R17系如分别针对R2、R6、R9及R7所定义；
R”为C3-12亚烷基，该链可杂有一或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe及/或芳环，例如苯或吡啶，该等环任选地经取代；且
X及X'独立地选自O、S及N(H)。
在一些实施方案中，R及R'各独立地选自任选地经取代之C1-12烷基、C3-20杂环及C5-20芳基，且任选地关于基团NRR'，R及R'连同其附着之氮原子一起形成任选地经取代之4、5、6或7员杂环。
在一些实施方案中，R9及R19为H。
在一些实施方案中，R6及R16为H。
在一些实施方案中，R7为R17均为OR7A，其中R7A为任选地经取代之C1-4烷基。在一些实施方案中，R7A为Me。在一些实施方案中，R7A为Ch2Ph，其中Ph为苯基。
在一些实施方案中，X为O。
在一些实施方案中，R11为H。
在一些实施方案中，各单体单元中C2与C3之间存在双键。
在一些实施方案中，R2及R12独立地选自H及R。在一些实施方案中，R2及R12独立地为R。在一些实施方案中，R2及R12独立地为任选地经取代之C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些实施方案中，R2及R12独立地为任选地经取代之苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或异喹啉基。在一些实施方案中，R2及R12独立地选自＝O、＝CH2、＝CH-RD及＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2及R12各为＝CH2。在一些实施方案中，R2及R12各为H。在一些实施方案中，R2及R12各为＝O。在一些实施方案中，R2及R12各为＝CF2。在一些实施方案中，R2及/或R12独立地为＝C(RD)2。在一些实施方案中，R2及/或R12独立地为＝CH-RD。
在一些实施方案中，当R2及/或R12为＝CH-RD时，各基团可独立地具有下文所示之任一构造：
Figure BDA0003169464670001281
在一些实施方案中，＝CH-RD呈组态(I)。
在一些实施方案中，R”为C3亚烷基或C5亚烷基。
在一些实施方案中，ADC之一示例性PBD二聚体组分具有式A(I)之结构：
Figure BDA0003169464670001291
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC之一示例性PBD二聚体组分具有式A(II)之结构：
Figure BDA0003169464670001292
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC之一示例性PBD二聚体组分具有式A(III)之结构：
Figure BDA0003169464670001293
其中RE及RE”各独立地选自H或RD，其中RD如上所定义；且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，n为0。在一些实施方案中，n为1。在一些实施方案中，RE及/或RE”为H。在一些实施方案中，RE及RE”为H。在一些实施方案中，RE及/或RE”为RD，其中RD为任选地经取代之C1-12烷基。在一些实施方案中，RE及/或RE”为RD，其中RD为甲基。
在一些实施方案中，ADC之一示例性PBD二聚体组分具有式A(IV)之结构：
Figure BDA0003169464670001301
其中Ar1及Ar2各独立地为任选地经取代之C5-20芳基；其中Ar1及Ar2可相同或不同；且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，ADC之示例性PBD二聚体组分具有式A(V)之结构：
Figure BDA0003169464670001302
其中Ar1及Ar2各独立地为任选地经取代之C5-20芳基；其中Ar1及Ar2可相同或不同；且
其中n为0或1。
在一些实施方案中，Ar1及Ar2各独立地选自任选地经取代之苯基、呋喃基、噻吩基及吡啶基。在一些实施方案中，Ar1及Ar2各独立地为任选地经取代之苯基。在一些实施方案中，Ar1及Ar2各独立地为任选地经取代之噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些实施方案中，Ar1及Ar2各独立地为任选地经取代之喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基可经由任何可用环位置结合于PBD核心。举例而言，喹啉基可为喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基及喹啉-8-基。在一些实施方案中，喹啉基选自喹啉-3-基及喹啉-6-基。异喹啉基可为异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基及异喹啉-8-基。在一些实施方案中，异喹啉基选自异喹啉-3-基及异喹啉-6-基。
ADC之其他非限制性示例性PBD二聚体组分具有式B：
Figure BDA0003169464670001303
及其盐及溶剂合物，其中：
波形线指示共价附着于接头之位点；
连接于OH之波形线指示S或R组态；
RV1及RV2独立地选自H、甲基、乙基及苯基(该苯基可任选地经氟取代，尤其在4位置中)及C5-6杂环基；其中RV1及RV2可相同或不同；且
n为0或1。
在一些实施方案中，RV1及RV2独立地选自H、苯基及4-氟苯基。
在一些实施方案中，接头可附着在PBD二聚体药物模块之各种位点之一，包括B环之N10亚胺、C环之C-2内/外位置或连接A环之栓系单元(参见以下结构C(I)及C(II))。
ADC之非限制性示例性PBD二聚体组分包括式C(I)及C(II)：
Figure BDA0003169464670001311
式C(I)及C(II)呈其N10-C11亚胺形式展示。示例性PBD药物模块亦包括甲醇胺以及经保护之甲醇胺形式，如下表中所示：
Figure BDA0003169464670001312
其中：
X为CH2(n＝1至5)、N或O；
Z及Z'独立地选自OR及NR2，其中R为含有1至5个碳原子之一级、二级或三级烷基链；
R1、R'1、R2及R'2各独立地选自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括经取代之芳基)、C5-20杂芳基、-NH2、-NHMe、-OH及-SH，其中在一些实施方案中，烷基、烯基及炔基链包含至多5个碳原子；
R3及R'3独立地选自H、OR、NHR及NR2，其中R为含有1至5个碳原子之一级、二级或三级烷基链；
R4及R'4独立地选自H、Me及OMe；
R5选自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括经卤基、硝基、氰基、烷氧基、烷基、杂环基取代之芳基)及C5-20杂芳基，其中在一些实施方案中，烷基、烯基及炔基链包含至多5个碳原子；
R11为H、C1-C8烷基或保护基(诸如乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)、9-茀基亚甲基氧基羰基(Fmoc)或包含自分解型单元之部分，诸如缬氨酸-瓜氨酸-PAB)；
R12为H、C1-C8烷基或保护基；
其中R1、R'1、R2、R'2、R5或R12中之一者之氢或A环之间的-OCH2CH2(X)nCH2CH2O-间隔子之氢经连接于ADC之接头之键置换。
ADC之示例性PDB二聚体部分包括(但不限于)(波形线指示共价附着于接头之位点)：
Figure BDA0003169464670001321
PBD二聚体；
包含PBD二聚体之ADC之非限制性示例性实施方案具有以下结构：
Figure BDA0003169464670001322
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab；
Figure BDA0003169464670001331
PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab，其中：
n为0至12。在一些实施方案中，n为2至10。在一些实施方案中，n为4至8。在一些实施方案中，n选自4、5、6、7及8。
在一些实施方案中，包含本文中描述之PBD二聚体之ADC可藉由包括吡啶离去基之接头-药物中间物经由硫原子与抗体之半胱氨酸硫醇缀合以形成双硫键来制备。此外，在一些实施方案中，包含本文中描述之PBD二聚体之ADC可藉由缀合包括硫基吡啶基之接头-药物中间物来制备，其中吡啶环经一或多个硝基取代。在一些实施方案中，吡啶环经-NO2单取代。在一些实施方案中，-NO2单取代相对于二硫化物为对位。在一些实施方案中，PBD二聚体经由N10位置连接。举例而言，包含PBD二聚体之非限制性示例性ADC可藉由单甲基乙基吡啶基二硫化物、N10连接之PBD接头中间物(以下展示)缀合于抗体来制备：
Figure BDA0003169464670001333
在一些实施方案中，缀合以上N10连接之PBD接头中间物产生如下文所示之单甲基二硫化物N10连接之PBD抗体-药物缀合物：
Figure BDA0003169464670001341
参见例如PCT公开案第WO 2013/055987号。
PBD二聚体-val-cit-PAB-Ab及PBD二聚体-Phe-Lys-PAB-Ab之接头为蛋白酶可切割的，而PBD二聚体-顺丁烯二酰亚胺-缩醛之接头对酸为不稳定的。
PBD二聚体及包含PBD二聚体之ADC可根据本领域中已知之方法制备。参见例如WO2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US2009/036431；US 2011/0256157；WO2011/130598；WO 2013/055987。
(5)1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体药物模块
在一些实施方案中，ADC包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。DNA小沟烷基化剂之5-氨基-1-(氯甲基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚(氨基CBI)类别为有效细胞毒素(Atwell等人(1999)J.Med.Chem.,42:3400)，且已在设计用于癌症疗法之许多类别前药中用作效应单元。此等包括抗体缀合物(Jeffrey等人(2005)J.Med.Chem.,48:1344)、基于氨基甲酸硝基苯甲酯之用于基因疗法的前药(Hay等人(2003)J.Med.Chem.46:2456)及呈低氧活化之前药形式之对应硝基-CBI衍生物(Tercel等人(2011)Angew.Chem.,Int.Ed.,50:2606-2609)。CBI及吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮卓(PBD)药效团已藉由烷基链连接在一起(Tercel等人(2003)J.Med.Chem 46:2132-2151)。
在一些实施方案中，ADC包含1-(氯甲基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚体(WO 2015/023355)。在一些此类实施方案中，二聚体为其中二聚体之一半为CBI部分且二聚体之另一半为PBD部分的杂二聚体。
在一些实施方案中，CBI二聚体包含下式：
Figure BDA0003169464670001351
其中：
R1选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或键结于接头(L)之键；
R2选自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或键结于接头(L)之键；
Ra及Rb独立地选自H及任选地经一或多个F取代之C1-C6烷基，或Ra及Rb形成五或六员杂环基；
T为选自C3-C12亚烷基、Y、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)-Y-(C1-C6亚烷基)、(C2-C6亚烯基)-Y-(C2-C6亚烯基)及(C2-C6亚炔基)-Y-(C2-C6亚炔基)之栓系基团；
其中Y独立地选自O、S、NR1、芳基及杂芳基；
其中亚烷基、亚烯基、芳基及杂芳基独立且任选地经F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2及C1-C6烷基取代，其中烷基任选地经一或多个F取代；
或亚烷基、亚烯基、芳基及杂芳基独立且任选地经键结于L之键取代；
D'为选自以下各者之药物模块：
Figure BDA0003169464670001352
Figure BDA0003169464670001353
及
Figure BDA0003169464670001361
其中波形线指示与T之附着位点；
X1及X2独立地选自O及NR3，其中R3选自H及任选地经一或多个F取代之C1-C6烷基；
R4为H、CO2R或键结于接头(L)之键，其中R为C1-C6烷基或苯甲基；且
R5为H或C1-C6烷基。
ADC之示例性CBI二聚体部分包括(但不限于)以下CBI-PBD二聚体(波形线指示共价附着于接头之位点)：
Figure BDA0003169464670001362
Figure BDA0003169464670001363
及
以下CBI-CBI二聚体：
Figure BDA0003169464670001371
包含CBI二聚体之ADC之非限制性示例性实施方案具有以下结构：
Figure BDA0003169464670001372
CBI-PBD-二硫化物-Ab；或
Figure BDA0003169464670001373
CBI-PBD(哌嗪-氨基甲酸酯前药)-二硫化物-Ab；
Figure BDA0003169464670001374
CBI-PBD(磷酸酯)-二硫化物-Ab；及
Figure BDA0003169464670001381
CBI-CBI(磷酸酯)-缩醛-顺丁烯二酰亚胺-Ab。
(6)蒽环霉素
在一些实施方案中，ADC包含蒽环霉素。蒽环霉素为显示细胞毒活性之抗生素化合物。虽然不欲受任何特定理论束缚，但研究已指示蒽环霉素可藉由许多不同机制用以杀死细胞，包括：1)药物分子插入细胞DNA中，由此抑制DNA依赖性核酸合成；2)藉由药物产生自由基，接着自由基与细胞大分子反应，对细胞造成损害，及/或3)药物分子与细胞膜相互作用(参见例如C.Peterson等人,“Transport And Storage Of Anthracycline InExperimental Systems And Human Leukemia”,Anthracycline Antibiotics In CancerTherapy；N.R.Bachur,“Free Radical Damage”同上第97-102页)。因为具有细胞毒性潜能，所以蒽环霉素已用于治疗大量癌症，诸如白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌及肉瘤(参见例如P.H-Wiernik,Anthracycline:Current Status And New Developments第11页)。
非限制性示例性蒽环霉素包括小红莓、表柔比星、埃达霉素、道诺霉素、奈莫柔比星及其衍生物。已制备及研究道诺霉素及小红莓之免疫缀合物及前药(Kratz等人(2006)Current Med.Chem.13:477-523；Jeffrey等人(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362；Torgov等人(2005)Bioconj.Chem.16:717-721；Nagy等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834；Dubowchik等人(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532；King等人(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343；EP 0328147；US 6630579)。抗体-药物缀合物BR96-小红莓与肿瘤相关抗原刘易斯-Y(Lewis-Y)特异性反应且已在I及II阶段研究中评估(Saleh等人(2000)J.Clin.Oncology 18:2282-2292；Ajani等人(2000)Cancer Jour.6:78-81；Tolcher等人(1999)J.Clin.Oncology 17:478-484)。
PNU-159682为奈莫柔比星之有效代谢物(或衍生物)(Quintieri等人(2005)Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617)。奈莫柔比星为在小红莓之糖苷氨基上具有2-甲氧基吗啉基之小红莓半合成类似物，且已处于临床评定下(Grandi等人(1990)Cancer Treat.Rev.17:133；Ripamonti等人(1992)Brit.J.Cancer 65:703)，包括针对肝细胞癌之阶段II/III试验(Sun等人(2003)Proceedings of the American Society forClinical Oncology 22,Abs1448；Quintieri(2003)Proceedings of the AmericanAssociation of Cancer Research,第44:1版,Abs 4649；Pacciarini等人(2006)Jour.Clin.Oncology 24:14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之一非限制性示例性ADC展示于式Ia中：
Figure BDA0003169464670001391
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基，且R2为C1-C5烷氧基，或其药学可接受盐；
L1及Z一起为如本文所述之接头(L)；
T为如本文所述之抗体(Ab)；且
m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些实施方案中，R1及R2均为甲氧基(-OMe)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之另一非限制性示例性ADC展示于式Ib中：
Figure BDA0003169464670001401
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基，且R2为C1-C5烷氧基，或其药学可接受盐；
L2及Z一起为如本文所述之接头(L)；
T为如本文所述之抗体(Ab)；且
m为1至约20。在一些实施方案中，m为1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些实施方案中，R1及R2均为甲氧基(-OMe)。
在一些实施方案中，含奈莫柔比星之ADC之奈莫柔比星组分为PNU-159682。在一些此类实施方案中，ADC之药物部分可具有以下结构之一：
Figure BDA0003169464670001402
Figure BDA0003169464670001411
其中波形线指示连接于接头(L)。
包括PNU-159682之蒽环霉素可经由若干连接位点及多种接头缀合于抗体(US2011/0076287；WO2009/099741；US 2010/0034837；WO 2010/009124)，包括本文中描述之接头。
包含奈莫柔比星及接头之示例性ADC包括(但不限于)：
Figure BDA0003169464670001412
PNU-159682顺丁烯二酰亚胺缩醛-Ab；
Figure BDA0003169464670001413
PNU-159682-val-cit-PAB-Ab；
Figure BDA0003169464670001421
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子-Ab；
Figure BDA0003169464670001422
PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子(R1R2)-Ab，其中：
R1及R2独立地选自H及C1-C6烷基；且
Figure BDA0003169464670001423
PNU-159682-顺丁烯二酰亚胺-Ab。
PNU-159682顺丁烯二酰亚胺缩醛-Ab之接头对酸为不稳定的，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab,PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子-Ab及PNU-159682-val-cit-PAB-间隔子(R1R2)-Ab为蛋白酶可切割的。
(7)毒伞毒素(Amatoxin)
在一些实施方案中，免疫缀合物包含缀合于一或多个毒伞毒素分子之抗体。毒伞毒素为由8个氨基酸构成之环状肽。其可自条蕈(Amanita phalloides)蘑菇中分离或以合成方式制备。毒伞毒素特异性抑制哺乳动物细胞之DNA依赖性RNA聚合酶II，且由此亦抑制所影响细胞之转录及蛋白质生物合成。细胞中转录之抑制引起生长及增殖停止。参见例如Moldenhauer等人JNCI 104:1-13(2012)、WO2010115629、WO2012041504、WO2012119787、WO2014043403、WO2014135282及WO2012119787，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，一或多个毒伞毒素分子为一或多个α-瓢菌素分子。
(8)其他药物模块
药物模块亦包括格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)J.Nat.CancerInst.92(19):1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters 10:1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13:786-791)；及酶活性毒素及其片段，包括(但不限于)白喉A链、白喉毒素之非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa))、篦麻毒素A链、相思子毒素A链、莫迪素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树素、有丝分裂素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素(enomycin)及霉菌毒素(tricothecene)。参见例如WO 93/21232。
药物模块亦包括具有溶核活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶)。
在某些实施方案中，免疫缀合物可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合之抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。在一些实施方案中，当免疫缀合物用于检测时，其可包含用于闪烁摄影研究之放射性原子，例如TC99或I123；或用于核磁共振(NMR)成像(亦称磁共振成像，MRI)之自旋标记物，诸如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。锆-89可与各种金属螯合剂复合且缀合于抗体，例如用于PET成像(WO 2011/056983)。
放射性或其他标记可以已知方式并入免疫缀合物中。举例而言，肽可使用包含例如一或多个氟-19原子代替一或多个氢之适合氨基酸前驱物生物合成或化学合成。在一些实施方案中，诸如Tc99、I123、Re186、Re188及In111之标记可经由抗体中之半胱氨酸残基附着。在一些实施方案中，钇-90可经由抗体之赖氨酸残基附着。在一些实施方案中，IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用于并入碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”(Chatal,CRC Press 1989)描述某些其他方法。
在某些实施方案中，免疫缀合物可包含缀合于前药活化酶之抗体。在一些此类实施方案中，前药活化酶将前药(例如肽基化学治疗剂，参见WO81/01145)转化为活性药物，诸如抗癌药物。在一些实施方案中，此类免疫缀合物适用于抗体依赖性酶介导之前药疗法(“ADEPT”)。可缀合于抗体之酶包括(但不限于)碱性磷酸酶，其适用于将含磷酸酯基之前药转变成游离药物；芳基硫酸酯酶，其适用于将含硫酸酯基之前药转变成游离药物；胞嘧啶去胺酶，其适用于将无毒5-氟胞嘧啶转变成抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，诸如沙雷菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧基肽酶及组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B及L)，其适用于将含肽前药转变成游离药物；D-丙胺酰基羧基肽酶，其适用于转变含有D-氨基酸取代基之前药；碳水化合物切割酶，诸如β-半乳糖苷酶及神经氨酸苷酶，其适用于将糖基化前药转变成游离药物；β-内酰胺酶，其适用于将经β-内酰胺衍生之药物转变成游离药物；以及青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶及青霉素G酰胺酶，其适用于将分别在胺氮经苯氧基乙酰基或苯乙基衍生之药物转变成游离药物。在一些实施方案中，酶可藉由本领域中熟知之重组DNA技术共价结合于抗体。参见例如Neuberger等人,Nature 312:604-608(1984)。
c)药物负载
药物负载由p表示，为式I之分子中每个抗体之药物模块之平均数目。药物负载可在每个抗体1至20个药物模块(D)之范围内。式I之ADC包括与1至20个之范围的药物模块缀合之抗体的集合。在由缀合反应制备ADC时，每个抗体之药物模块之平均数目可藉由诸如质谱分析、ELISA分析及HPLC之常规方式表征。亦可测定就p而言之ADC之定量分布。在一些情况下，可藉由诸如反相HPLC或电泳之方式来实现其中p为来自具有其他药物负载之ADC之一定值的均质ADC之分离、纯化及表征。
对于一些抗体-药物缀合物，p可受抗体上之附着位点之数目限制。举例而言，在附着为半胱氨酸硫醇之情况下，如在以上某些示例性实施方案中，抗体可仅仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基，或可仅仅具有一个或若干个可附着接头之足够反应性硫醇基。在某些实施方案中，较高药物负载(例如p>5)可造成某些抗体-药物缀合物之凝聚、不可溶性、毒性或细胞渗透性丧失。在某些实施方案中，ADC之平均药物负载在1至约8、约2至约6或约3至约5之范围内。实际上，已展示对于某些ADC而言，每个抗体之药物模块的最佳比率可小于8，且可为约2至约5(US 7498298)。
在某些实施方案中，在缀合反应期间使少于理论最大值之药物模块缀合于抗体。抗体可含有例如不与药物-接头中间产物或接头试剂反应的赖氨酸残基，如下文所论述。一般而言，抗体不含许多可连接于药物模块之游离及反应性半胱氨酸硫醇基；实际上抗体中之大部分半胱氨酸硫醇残基以二硫桥键之形式存在。在某些实施方案中，抗体可用诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之还原剂在部分或完全还原条件下还原，产生反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施方案中，抗体经受变性条件，展现反应性亲核基团，诸如赖氨酸或半胱氨酸。
ADC之负载(药物/抗体比率)可用不同方式控制，且例如藉由如下来控制：(i)限制药物-接头中间物或接头试剂相对于抗体之摩尔过量；(ii)限制缀合反应时间或温度；及(iii)针对半胱氨酸硫醇修饰之部分或限制性还原条件。
应了解在一个以上亲核基团与药物-接头中间物或接头试剂反应之情况下，所得产物为具有一或多个药物模块附着于抗体之分布的ADC化合物之混合物。每个抗体之药物之平均数目(药物-抗体比率或DAR)可藉由双重ELISA抗体分析自混合物计算，该分析对抗体具有特异性且对药物具有特异性。个别ADC分子可在混合物中藉由质谱分析鉴别，且藉由HPLC，例如疏水相互作用层析法分离(参见例如McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7):299-307；Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett,K.J.等人“Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,”文摘号624,American Association for Cancer Research,2004Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月；Alley,S.C.等人“Controlling thelocation of drug attachment in antibody-drug conjugates,”文摘号627,AmericanAssociation for Cancer Research,2004Annual Meeting,2004年3月27-31日,Proceedings of the AACR,第45卷,2004年3月)。在某些实施方案中，具有单一负载值之均质ADC可藉由电泳或层析法自缀合物混合物分离。
d)制备免疫缀合物之某些方法
式I之ADC可藉由若干途径，采用本领域技术人员已知之有机化学反应、条件及试剂制备，包括以下：(1)抗体之亲核基团与二价接头试剂反应，经由共价键形成Ab-L，接着与药物模块D反应；及(2)药物模块之亲核基团与二价接头试剂反应，经由共价键形成D-L，接着与抗体之亲核基团反应。经由后一途径制备式I之ADC的示例性方法描述于以引用的方式明确并入本文中之US 7498298中。
抗体上之亲核基团包括(但不限于)：(i)N端氨基；(ii)侧链氨基，例如赖氨酸；(iii)侧链硫醇基，例如半胱氨酸；及(iv)在抗体发生糖基化下糖羟基或氨基。胺、硫醇及羟基为亲核性的且能够与接头部分及接头试剂上之亲电基团反应形成共价键，该等亲电基团包括：(i)活性酯，诸如NHS酯、HOBt酯、卤基甲酸酯及酸卤化物；(ii)烷基及苯甲基卤化物，诸如卤乙酰胺；及(iii)醛、酮、羧基及顺丁烯二酰亚氨基。某些抗体具有可还原之链间二硫键，亦即半胱氨酸桥键。藉由用诸如DTT(二硫苏糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)之还原剂处理，使得抗体完全或部分还原，可使抗体具有反应性，以与接头试剂缀合。理论上各半胱氨酸桥键将因此形成两个反应性硫醇亲核体。可经由例如使赖氨酸残基与2-亚氨基硫杂环戊烷(妥特氏试剂(Traut's reagent))反应，修饰赖氨酸残基，使胺转化成硫醇，而将额外亲核基团引入抗体中。亦可藉由引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如藉由制备包含一或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基之变异抗体)，而将反应性硫醇基引入抗体中。
本发明之抗体-药物缀合物亦可藉由抗体上之亲电基团(诸如醛或酮羰基)与接头试剂或药物上之亲核基团之间发生反应来产生。接头试剂上之适用亲核基团包括(但不限于)酰肼、肟、氨基、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基酰肼。在一个实施方案中，抗体经修饰以引入能够与接头试剂或药物上之亲核取代基反应之亲电部分。在另一个实施方案中，糖基化抗体之糖可例如用过碘酸盐氧化试剂氧化，以形成醛基或酮基，其可与接头试剂或药物模块之氨基反应。所得亚胺希夫碱(Schiff base)基团可形成稳定键，或可例如藉由硼氢化物试剂还原，以形成稳定之胺键。在一个实施方案中，糖基化抗体之碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏过碘酸钠反应可在抗体中产生羰基(醛及酮)，其可与药物(Hermanson,Bioconjugate Techniques)上之适当基团反应。在另一个实施方案中，含有N端丝氨酸或苏氨酸残基之抗体可与偏过碘酸钠反应，产生醛代替第一氨基酸(Geoghegan及Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146；US 5362852)。此类醛可与药物模块或接头亲核试剂反应。
药物模块上之示例性亲核基团包括(但不限于)：能够与接头部分及接头试剂上之亲电基团反应形成共价键的胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基酰肼基团，该等亲电基团包括：(i)活性酯，诸如NHS酯、HOBt酯、卤基甲酸酯及酸卤化物；(ii)烷基及苯甲基卤化物，诸如卤乙酰胺；及(iii)醛、酮、羧基及顺丁烯二酰亚氨基。
可用于制备ADC之非限制性示例性交联试剂在本文中描述于标题为“示例性接头”之章节下。使用此类交联试剂连接两个部分，包括蛋白质部分及化学部分之方法为本领域中已知。在一些实施方案中，包含抗体及细胞毒性剂之融合蛋白可例如藉由重组技术或肽合成来制备。重组DNA分子可包含编码缀合物之抗体及细胞毒性部分的区域，该等区域彼此相邻或由编码不破坏缀合物之所需特性之接头肽的区域分离。
在又一实施方案中，抗体可缀合于“受体”(诸如抗生蛋白链菌素)，以用于肿瘤预先靶向中，其中抗体-受体缀合物施用患者，接着使用清除剂将未结合之缀合物自循环中移除且接着施用缀合于细胞毒性剂(例如药物或放射性核苷酸)之“配体”(例如亲合素)。
表A之抗体-药物缀合物51-58可藉由使药物模块与接头试剂偶联且根据WO 2013/055987、WO 2015/023355、WO 2010/009124、WO 2015/095227，且与任一本文所述之抗-B7-H4抗体，包括经半胱氨酸工程改造之抗体缀合来制备。
表A：抗体-药物缀合物51-58
Figure BDA0003169464670001481
Figure BDA0003169464670001491
其他示例性抗体-药物缀合物包括：
Figure BDA0003169464670001492
Figure BDA0003169464670001501
应注意为简单起见，以上结构及ADC 51至58之彼等结构仅仅展示一个接头-药物基团附着于抗体。如上文所提及，一个以上接头-药物基团可附着于抗体。
E.用于诊断及检测之方法及组合物
在某些实施方案中，任一本文提供之抗-B7-H4抗体适用于检测生物学样品中B7-H4之存在。如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。“生物学样品”包含例如细胞或组织(例如生检材料，包括癌性或可能癌性乳房、子宫内膜或卵巢组织)。
在一个实施方案中，提供一种用于诊断或检测方法之抗-B7-H4抗体。在另一方面中，提供一种检测生物学样品中B7-H4之存在的方法。在某些实施方案中，该方法包含使生物学样品与如本文所述之抗-B7-H4抗体在允许抗-B7-H4抗体结合B7-H4之条件下接触，且检测生物学样品中抗-B7-H4抗体与B7-H4之间是否形成复合物。此类方法可为体外或体内方法。在一个实施方案中，抗-B7-H4抗体用于选择适于用抗-B7-H4抗体治疗之受试者，例如其中B7-H4为选择患者之生物标记物。在另一个实施方案中，生物学样品为细胞或组织(例如生检材料，包括癌性或可能癌性乳房、子宫内膜或卵巢组织)。
在另一个实施方案中，抗-B7-H4抗体体内用于例如藉由体内成像来检测受试者之B7-H4阳性癌症，例如以诊断、预后癌症或将癌症分期，确定适当治疗过程，或监测癌症对疗法之反应。一种本领域中已知用于体内检测之方法为免疫-正电子发射断层摄影法(免疫-PET)，如例如van Dongen等人,The Oncologist 12:1379-1389(2007)及Verel等人,J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)中所述。在此类实施方案中，提供一种用于检测受试者之B7-H4阳性癌症的方法，该方法包含向患有或怀疑患有B7-H4阳性癌症之受试者施用经标记之抗-B7-H4抗体，且检测该受试者中经标记之抗-B7-H4抗体，其中该经标记之抗-B7-H4抗体之检测指示该受试者患有B7-H4阳性癌症。在某些此类实施方案中，经标记之抗-B7-H4抗体包含与诸如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I之正电子发射体缀合之抗-B7-H4抗体。在一特定实施方案中，正电子发射体为89Zr。
在其他实施方案中，诊断或检测之方法包含使固定于基质之第一抗-B7-H4抗体与待测试B7-H4之存在的生物学样品接触，将该基质暴露于第二抗-B7-H4抗体，且检测该生物学样品中该第二抗-B7-H4是否结合于该第一抗-B7-H4抗体与B7-H4之间的复合物。基质可为任何支撑介质，例如玻璃、金属、陶瓷、聚合物珠粒、载玻片、芯片及其他基质。在某些实施方案中，生物学样品包含细胞或组织(例如生检材料，包括癌性或可能癌性乳房、子宫内膜或卵巢组织)。在某些实施方案中，第一或第二抗-B7-H4抗体为任一本文所述之抗体。
可根据任一以上实施方案诊断或检测之示例性病症包括B7-H4阳性癌症，诸如B7-H4阳性乳腺癌、B7-H4阳性卵巢癌及B7-H4阳性子宫内膜癌。在一些实施方案中，B7-H4阳性癌症为三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌。在一些实施方案中，B7-H4阳性癌症为在本文实例B中描述之条件下抗-B7-H4免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)评分超过“0”之癌症，0对应于超过90％肿瘤细胞中染色非常弱或无染色。在另一个实施方案中，B7-H4阳性癌症以如在本文实例B中描述之条件下所定义，1+、2+或3+水平表达B7-H4。在一些实施方案中，B7-H4阳性癌症为根据检测B7-H4mRNA之逆转录酶PCR(RT-PCR)分析表达B7-H4的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
在某些实施方案中，提供经标记之抗-B7-H4抗体。标记包括(但不限于)直接检测之标记或部分(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光及放射性标记)，以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测之部分(诸如酶或配体)。示例性标记包括(但不限于)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；荧光团，诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物；若丹明及其衍生物；丹酰基；伞酮；荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶及细菌荧光素酶(美国专利第4,737,456号)；荧光素；2,3-二氢酞嗪二酮；辣根过氧化酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氢酶；杂环氧化酶，诸如尿酸酶及黄嘌呤氧化酶，其与采用过氧化氢氧化染料前体之酶(诸如HRP、乳过氧化酶或微过氧化酶)偶联；生物素/亲合素；自旋标记；噬菌体标记；稳定自由基及其类似标记。在另一个实施方案中，标记为正电子发射体。正电子发射体包括(但不限于)68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I。在一特定实施方案中，正电子发射体为89Zr。
F.药物配制剂
如本文所述之抗-B7-H4抗体或免疫缀合物之药物配制剂藉由将具有所需纯度之此类抗体或免疫缀合物与一或多种任选的选用之药学可接受载剂混合来制备(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))，呈冻干配制剂或水溶液形式。药学可接受载剂在所用剂量及浓度下一般对接受者而言无毒，且包括(但不限于)：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苯甲基铵；氯化六羟季铵；氯化苯甲烃铵；苄索氯铵(benzethoniumchloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、岩藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；及/或非离子型表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中之示例性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0003169464670001531
Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开案第2005/0260186号及第2006/0104968号中。在一个方面中，sHASEGP与一或多种其他葡萄糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性冻干抗体或免疫缀合物配制剂描述于美国专利第6,267,958号中。抗体或免疫缀合物配制剂水溶液包括美国专利第6,171,586号及WO2006/044908中描述之抗体或免疫缀合物配制剂水溶液，后者之配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中之配制剂亦可含有一种以上为所治疗之特定适应症所必需之活性成分，较佳为具有不会对彼此产生不利影响之补充性活性的活性成分。举例而言，在一些情况下，可能需要进一步提供
Figure BDA0003169464670001532
(贝伐单抗)例如用于治疗B7-H4阳性癌症，诸如B7-H4阳性乳腺癌(包括B7-H4阳性三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌)、B7-H4阳性卵巢癌或B7-H4阳性子宫内膜癌。
活性成分可包覆于微胶囊中，例如藉由凝聚技术或藉由界面聚合法所制备之微胶囊，例如分别为羟基甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊；包覆于胶态药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊)中或巨乳液中。此类技术揭示于Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂之适合实例包括含有抗体或免疫缀合物之固体疏水性聚合物之半渗透基质，该等基质呈成形制品形式，例如薄膜或微胶囊。
用于体内施用之配制剂一般为无菌的。无菌性可容易藉由例如无菌过滤膜过滤来实现。
G.治疗方法及组合物
本文提供之任一抗-B7-H4抗体或免疫缀合物可用于例如治疗方法之方法中。
在一个方面中，本文提供之抗-B7-H4抗体或免疫缀合物用于抑制B7-H4阳性细胞增殖之方法中，该方法包含在容许抗-B7-H4抗体或免疫缀合物结合于细胞表面上之B7-H4之条件下将该细胞暴露于抗-B7-H4抗体或免疫缀合物，由此抑制细胞增殖。在某些实施方案中，方法为体外或体内方法。在其他实施方案中，细胞为乳房、卵巢或子宫内膜细胞。
体外细胞增殖之抑制可使用可购自Promega(Madison,WI)之CellTiter-GloTM发光细胞活力分析来分析。该分析基于存在之ATP(其指示代谢活性细胞)之定量，确定培养物中活细胞之数目。参见Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；美国专利第6602677号。分析可以96或384孔格式进行，易于进行自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等人(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404。分析程序涉及向培养细胞中直接添加单一试剂(
Figure BDA0003169464670001541
试剂)。此导致细胞溶解及由荧光素酶反应产生之发光信号之产生。发光信号与存在之ATP之量成比例，ATP之量与培养物中存在之活细胞数目成正比。数据可藉由光度计或CCD相机成像装置记录。发光输出表示为相对光单位(RLU)。
在另一个方面中，提供一种抗-B7-H4抗体或免疫缀合物，其适用作药剂。在其他方面中，提供一种抗-B7-H4抗体或免疫缀合物，其用于治疗方法中。在某些实施方案中，提供一种抗-B7-H4抗体或免疫缀合物，其用于治疗B7-H4阳性癌症。在某些实施方案中，本发明提供一种抗-B7-H4抗体或免疫缀合物，其用于治疗患有B7-H4阳性癌症之个体的方法中，该方法包含向该个体施用有效量之抗-B7-H4抗体或免疫缀合物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包含向个体施用有效量之至少一种例如如下文所描述之其它治疗剂。
在另一方面中，本发明提供抗-B7-H4抗体或免疫缀合物之用途，其用于制造或制备药剂。在一个实施方案中，该药剂系用于治疗B7-H4阳性癌症。在另一个实施方案中，药剂系用于治疗B7-H4阳性癌症之方法中，该方法包含向患有B7-H4阳性癌症之个体施用有效量之药剂。在一个此类实施方案中，该方法进一步包含向个体施用有效量之至少一种例如如下文所描述之其它治疗剂。
在另一方面中，本发明提供一种治疗B7-H4阳性癌症之方法。在一个实施方案中，该方法包含向患有此类B7-H4阳性癌症之个体施用有效量之抗-B7-H4抗体或免疫缀合物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包含向个体施用有效量之至少一种例如如下文所描述之其它治疗剂。
根据任一以上实施方案之B7-H4阳性癌症可为例如B7-H4阳性乳腺癌(包括B7-H4阳性三重阴性乳腺癌)(ER-/PR-/Her2-)、B7-H4阳性卵巢癌及B7-H4阳性子宫内膜癌。在一些实施方案中，B7-H4阳性癌症为在本文实例B中描述之条件下抗-B7-H4免疫组织化学(IHC)或原位杂交(ISH)评分超过“0”之癌症，0对应于超过90％肿瘤细胞中染色非常弱或无染色。在另一个实施方案中，B7-H4阳性癌症以如在本文实例B中描述之条件下所定义，1+、2+或3+水平表达B7-H4。在一些实施方案中，B7-H4阳性癌症为根据检测B7-H4mRNA之逆转录酶PCR(RT-PCR)分析表达B7-H4的癌症。在一些实施方案中，RT-PCR为定量RT-PCR。
根据任一以上实施方案之“个体”可为人。
在另一方面中，本发明提供包含本文提供之任一抗-B7-H4抗体或免疫缀合物的药物配制剂，其例如用于任一以上治疗方法中。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文提供之任一抗-B7-H4抗体或免疫缀合物及药学可接受载剂。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文提供之任一抗-B7-H4抗体或免疫缀合物及至少一种例如如下所描述之其它治疗剂。
本发明之抗体或免疫缀合物可单独或与其他药剂组合用于疗法中。举例而言，本发明之抗体或免疫缀合物可与至少一种其它治疗剂共同施用。在某些实施方案中，其它治疗剂为
Figure BDA0003169464670001551
(贝伐单抗)，例如用于治疗B7-H4阳性癌症，诸如B7-H4阳性乳腺癌(包括B7-H4阳性三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌)。在一些实施方案中，其它治疗剂选自多西他赛、小红莓、环磷酰胺、卡铂、帕利他赛、nab-帕利他赛、吉西他滨、顺铂及PARP抑制剂(诸如奥拉帕尼、依尼帕瑞)，例如用于治疗B7-H4阳性癌症，诸如B7-H4阳性乳腺癌(包括B7-H4阳性三重阴性(ER-/PR-/Her2-)乳腺癌)。在某些实施方案中，例如当癌症为Her2+癌症时，其它治疗剂为
Figure BDA0003169464670001561
(曲妥珠单抗恩他新(Trastuzumab emtansine))或
Figure BDA0003169464670001562
(帕妥珠单抗(pertuzumab))。
以上所指出之此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或两种以上治疗剂包括于同一或分开配制剂中)及分开施用，在此情况下本发明之抗体或免疫缀合物之施用可在其它治疗剂及/或佐剂施用之前、与其同时及/或在其之后进行。本发明之抗体或免疫缀合物亦可与放射疗法组合使用。
本发明之抗体或免疫缀合物(及任何其它治疗剂)可藉由任何适合之方式，包括非经肠、肺内及鼻内且必要时针对局部治疗，病灶内施用来施用。非经肠输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下投药。给药可藉由任何适当途径(例如藉由注射，诸如静脉内或皮下注射)给药，部分视施用之短期或长期性而定。本文中涵盖各种给药时程，包括(但不限于)单次施用或经各个时间点多次施用、快速施用及脉冲式输注。
本发明之抗体或免疫缀合物以符合良好医学实务之方式调配、给药及施用。在此情形下考虑之因素包括所治疗之特定病症、所治疗之特定哺乳动物、个别患者之临床病状、病症起因、药剂传递部位、投药方法、投药时程及医学从业者已知之其他因素。抗体或免疫缀合物无需但任选的与一或多种当前用于预防或治疗所述病症之药剂一起配制。此类其他药剂之有效量视存在于配制剂中之抗体或免疫缀合物之量、病症或治疗之类型及如上文所述之其他因素而定。此等药剂一般以与本文所描述相同之剂量且用如本文所描述之施用途径使用，或以本文所描述之剂量之约1％至99％使用，或以凭经验/临床上确定为适当之任何剂量及任何途径使用。
为预防或治疗疾病，本发明之抗体或免疫缀合物(当单独或与一或多种其他额外治疗剂组合使用时)之适当剂量将视待治疗之疾病类型、抗体或免疫缀合物之类型、疾病之严重程度及过程、抗体或免疫缀合物系出于预防性还是治疗性目的施用、先前疗法、患者临床病史及对抗体或免疫缀合物之反应、及主治医师之判断而定。该抗体或免疫缀合物系一次性或历经一系列治疗适当地施用患者。视疾病之类型及严重程度而定，施用患者之初始候选剂量可为约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体或免疫缀合物，无论例如藉由一或多次分开施用还是藉由连续输注。一种典型日剂量可在约1μg/kg至100mg/kg或100mg/kg以上之范围内，视上文所提及之因素而定。对于经历数日或更长时间重复投药，视病状而定，治疗一般持续至疾病症状出现所需抑制为止。抗体或免疫缀合物之一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg之范围内。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)之一或多种剂量。此类剂量可间歇地施用，例如每周或每三周(例如以使得患者接受约二至约二十或例如约六剂抗体)。初始可施用较高起始剂量，随后可施用一或多种较低剂量。然而，其他给药方案可能适用。很容易藉由常规技术及分析来监测此疗法之进程。
应了解任一以上配制剂或治疗方法可使用本发明之免疫缀合物与抗-B7-H4抗体进行。
H.制品
在本发明之另一方面中，提供含有适用于治疗、预防及/或诊断上述病症之物质的制品。制品包含容器及附于或链接于容器之标签或药品说明书。适合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器装有单独或与有效治疗、预防及/或诊断病症之另一组合物组合之组合物，且可具有无菌接取口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿之塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中之至少一种活性剂为本发明之抗体或免疫缀合物。卷标或药品说明书指示组合物用于治疗所选病状。此外，制品可包含(a)其中含有组合物之第一容器，其中该组合物包含本发明之抗体或免疫缀合物；及(b)其中含有组合物之第二容器，其中该组合物包含另一细胞毒性剂或其它治疗剂。本发明之此实施方案中之制品可进一步包含指示组合物可用于治疗特定病状之药品说明书。或者或另外，制品可进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理食盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其可进一步包括就商业及使用者观点而言所需之其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。
III.实例
以下为本发明之方法及组合物之实例。应了解，考虑到上文提供之一般描述，可实施各种其他实施方案。
A.人B7-H4基因表达
1.B7-H4 mRNA之表达
使用含有基因表达信息之专用数据库(
Figure BDA0003169464670001581
Gene Logic Inc.,Gaithersburg,MD)分析人B7-H4基因表达。使用微阵列型态查看器进行
Figure BDA0003169464670001582
数据库之图形分析。图1为各种组织中人B7-H4基因表达之图示。y轴上之刻度指示基于杂交信号强度之基因表达水平。点出现在自各列出组织之名称延伸之线的左边与右边。出现在线左边之点表示正常组织中之基因表达，且出现在线右边之点表示肿瘤及患病组织中之基因表达。图1展示在某些肿瘤或患病组织中，相对于其正常对应物，B-H4基因表达增加。详言之，B7-H4实质上在乳房、子宫内膜及卵巢肿瘤中过度表达。
2.B7-H4蛋白质之表达
自Genentech之人组织实验室获得人正常组织。按照制造商说明书，藉由在Complete Lysis-M(Roche)中均匀化，自冷冻组织提取蛋白质。所有蛋白质溶解物均使用Nanodrop 1000定量，且针对完整性及浓度同一性，藉由SDS-PAGE检查。
藉由Western印迹法，各样本使用约50μg蛋白质溶解产物且在4℃下用于含有0.05％Tween-20之Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor,Lincoln,NE)中1μg/ml之A57.1 mAb(diaDexus,South San Francisco,CA)探测过夜，来确定完全B7-H4蛋白质之评估。在用TBST缓冲液洗涤之后，与1:15,000之山羊抗小鼠IRDye 800CW二级抗体(Li-Cor)一起培育且印迹在Odyssey红外成像器(Li-Cor)上成像。
自US Biomax(Rockville,MD)获得正常人(FDA999c)、食蟹猕猴(CyFDA1a)、小鼠(MO541)及大鼠(Rat901)组织微阵列(TMA)。免疫组织化学(IHC)在Ventana Discovery XT自动染色仪(Ventana Medical Systems,Tucson,AZ)上进行。将福尔马林固定之石蜡包埋的组织微阵列切片去石蜡且用CC1溶液(Ventana Medical Systems)预处理60分钟，接着与1.5μg/ml A57.1兔mAb或原始兔IgG一起在37℃下培育60分钟。用OmniMap抗兔HRP及DAB(Ventana Medical Systems)检测16分钟，接着用苏木精II及发蓝试剂(Ventana MedicalSystems)复染。藉由有经验之病理学家，考虑染色剂之强度及宽度，对样本进行评分。评分：0(阴性)：在超过90％细胞中非常弱或无杂交；1+(轻度)：主要杂交模式为弱的；2+(中度)：主要杂交模式在大部分(>50％)细胞中为中等强度的；3+(强)：主要杂交模式在大部分(>50％)细胞中为强的。
B7-H4在来自过度表达rhB7-H4之293细胞及乳房腺癌之代表性病例的蛋白质溶解物中高度表达(图20A)。与乳腺癌样品相比，在胎盘、心脏、乳房、肾、胰脏、食道、肝、肺及睾丸中微弱地检测到B7-H4之高度糖基化形式(约60kDa)，而非B7-H4之未糖基化形式(约28kDa)。藉由IHC，仅仅在以下正常组织上观测到B7-H4在细胞膜上之表达(图20B)：乳房导管上皮细胞、胰脏之腺泡及导管上皮细胞、肾之小管上皮细胞、胆管上皮细胞及气管/肺、子宫颈及胎盘之上皮细胞。亦有证据表明肝细胞中B7-H4之胞内表达而非膜表达。总体而言，来自Western印迹法及IHC之结果一致。对于食蟹猕猴观测到类似WB及IHC结果(数据未展示)。利用在Genentech研发之B7-H4之兔mAb独立地证实使用A57.1之Western印迹及IHC结果(资料未展示)。结果指示大部分正常组织之B7-H4表达水平低，仅仅几个组织在其细胞表面上呈现B7-H4。
B.乳房及卵巢癌中人B7-H4之流行率
为评估乳房癌中B7-H4之表达，自多个来源获得202个原发性乳房癌。使用如Bubendorf L等人,J Pathol.2001年9月；195(1):72-9中所述之复制核，组装组织微阵列(TMA)，且包括来自匹配情况之正常乳房样品。
藉由免疫组织化学，使用针对人B7-H4之A57.1抗体(diaDexus,South SanFrancisco,CAB7-H4)测定B7-H4表达。根据以下流程，考虑强度(银粒)以及染色宽度，藉由训练有素之病理学家对杂交强度进行评分。
0(阴性)：超过90％肿瘤细胞中杂交非常弱或无杂交
1+(轻度)：主要杂交模式为弱的
2+(中度)：大部分(>50％)赘生性细胞中主要杂交模式中等强度
3+(强)：大部分(>50％)赘生性细胞中主要杂交模式为强的
相同A57.1抗体用作正常乳房组织中杂交特异性之对照。
图2展示具有0、1+、2+及3+染色水平之示例性乳房癌切片。影像中银粒之沉积指示抗体之杂交及B7-H4蛋白质之表达。约80％情况展示环形膜及细胞质染色，65％样品中B7-H4染色为中度(2+)至高度(3+)(总计：评分0(40)；1+(31)；2+(74)；3+(57))。
为评估不同乳腺癌亚型中B7-H4表达及流行率之重要性，将乳腺癌样品汇集且基于原发性肿瘤之人表皮生长因子受体2(Her2)、激素受体(HR)及三重阴性(TN)状态，分成三个亚型。表达B7-H4之肿瘤的百分比如上所述进行及评分。
如图3A中所示，B7-H4表达在所有乳腺癌亚型中流行，其中所有亚型之约65％为阳性(评分1-3)。详言之，约60％Her2+及HR+乳腺癌亚型亦表达B7-H4且约80％TN乳腺癌为B7-H4阳性。图3B展示藉由免疫组织化学所测量，在乳腺癌亚型中B7-H4染色之0、1+、2+及3+水平之流行率。约20％Her2+及HR+乳腺癌亚型及约25％TN乳腺癌亚型展示针对B7-H4，1+之染色水平。约28％Her2+及TN乳腺癌亚型及约18％HR+乳腺癌亚型展示针对B7-H4，2+之染色水平。分别约15％、约20％及约25％之Her2+、HR+及TN乳腺癌亚型展示针对B7-H4，3+之染色水平。
Western印迹分析亦提出，乳房肿瘤中B7-H4之总表达为约70％，其中在约40％彼等乳房肿瘤中表达相当高，如图3C中所示。MX-1肿瘤模型用作内源性阳性对照，且BT549(对B7-H4呈阴性之肿瘤细胞系)作为内源性阴性对照，且与4个正常乳房组织(正常定义为与肿瘤相邻之正常组织)相比，评估10个不同乳房肿瘤样品之B7-H4蛋白质表达。亦包括293野生型细胞及经人B7-H4转染之293细胞作为对照。B-肌动蛋白含量用于校正负载不一致。
如使用A57.1抗体，使用Western印迹分析所检测，B7-H4在82％原发性乳房肿瘤(Xentech小组)中表达。如图3D中所示，在23/28个测试之原发性乳房肿瘤中B7-H4呈约62Kd亮带出现。
Western印迹分析亦提出，卵巢瘤中B7-H4之总表达为约80％，其中在约60％彼等卵巢瘤中表达相当高，如图3E中所示。
C.小鼠单克隆抗体产生
使用以下程序产生针对人B7-H4之单克隆抗体。将两组分开之Balb/C小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)用过度表达重组人B7-H4之293细胞或人B7-H4之DNA表达构建体超免疫，且将第三组小鼠B7-H4 KO BL/6N小鼠用在鼠类骨髓瘤表达系统中表达之具有C端Fc之小鼠B7-H4细胞外域(ECD；氨基酸29-258)免疫。
向Balb/c小鼠(Charles River Laboratories International,Inc.,Hollister,CA,USA)注射于PBS中之过度表达人B7-H4之293细胞(五百万/剂，经由腹膜内)或于乳酸林格氏溶液中之huB7-H4质粒DNA(经由尾静脉)，接着用重组人B7-H4ECD(4微克/剂，腹膜内)进行蛋白质加强。向小鼠B7-H4 KO BL/6N小鼠注射于含有可代谢角鲨烯(4％v/v)、Tween80(0.2％v/v)、岩藻糖6,6-二霉菌酸酯(0.05％w/v)及单磷酰基脂质A(0.05％w/v；SigmaAldrich,USA)之佐剂中的如上所述之重组小鼠B7-H4 ECD(经由后脚垫)。在6-9次注射后，藉由标准酶联免疫吸附分析(ELISA)及FACS评估血清效价。使自血清B7-H4阳性小鼠收获之脾B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(X63.Ag8.653；美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection),Manassas,VA,USA)藉由电融合(Hybrimune；Harvard Apparatus,Inc.,Holliston,MA,USA)进行融合。在10-14天之后，针对抗体分泌，藉由ELISA筛选杂交瘤上清液。接着对所有阳性克隆进行扩增且针对与huB7-H4及muB7-H4之结合，藉由ELISA及FACS再次筛选。藉由荧光活化细胞分选术(FACs)，使用表达重组人、食蟹猕猴及小鼠-B7-H4之稳定细胞系，鉴别四种杂交瘤克隆：1D11(自小鼠B7-H4免疫之mB7-H4 KO小鼠鉴别)、2.32D6(自人B7-H4对DNA免疫之小鼠鉴别)及9B9及3.22.C10(自使用过度表达重组人B7-H4之293细胞的细胞免疫鉴别)反应强烈。
图4A展示所产生之某些单克隆抗体以及某些特性，其中一些将在下文进一步详细描述。
D.小鼠单克隆抗体之克隆及嵌合
单克隆抗体1D11、32D6、9B9及22C10系如下进行克隆及嵌合。
使用标准方法，自产生鼠类1D11、32D6、9B9及22C10之杂交瘤细胞提取全部RNA。使用RT-PCR，利用简并引物，将可变轻链(VL)及可变重链(VH)域扩增成重链及轻链。正向引物对VL及VH区之N端氨基酸序列具有特异性。LC及HC反向引物经设计以分别黏接于在物种间高度保守之恒定轻链域(CL)及恒定重链域1(CH1)中之区域。使用常规测序方法测定插入物之聚核苷酸序列。1D11 VL及VH氨基酸序列展示于SEQ ID NO:3及4中。1D11重链高变区(HVR)H1、H2及H3分别展示于SEQ ID NO:5、6及7中。1D11轻链高变区(HVR)L1、L2及L3分别展示于SEQ ID NO:8、9及10中。32D6 VL及VH氨基酸序列展示于SEQ ID NO:11及12中。32D6重链高变区(HVR)H1、H2及H3分别展示于SEQ ID NO:13、14及15中。32D6轻链高变区(HVR)L1、L2及L3分别展示于SEQ ID NO:16、17及18中。9B9 VL及VH氨基酸序列展示于SEQ ID NO:19及20中。9B9重链高变区(HVR)H1、H2及H3分别展示于SEQ ID NO:21、22及23中。9B9轻链高变区(HVR)L1、L2及L3分别展示于SEQ ID NO:24、25及26中。22C10 VL及VH氨基酸序列展示于SEQ ID NO:27及28中。22C10重链高变区(HVR)H1、H2及H3分别展示于SEQ ID NO:29、30及31中。22C10轻链高变区(HVR)L1、L2及L3分别展示于SEQ ID NO:32、33及34中。抗体1D11、32D6、9B9及22C10之轻链及重链可变区之比对展示于图5中。
各抗体藉由将小鼠重链可变区克隆至人IgG1重链恒定区上且将轻链可变区克隆至人κ轻链恒定区上来嵌合，除了9B9，其克隆至人λ轻链恒定区上。
E.1D11及22C10之人源化
单克隆抗体1D11及22C10系如下所述进行人源化。残基编号系根据Kabat等人,Sequences of proteins of immunological interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。
高变区直接移植至接受体人共同框架上
在1D11及22C10之人源化期间构建的变异体呈IgG形式评估。将来自鼠类1D11及22C10之VL及VH域与人VLκI(VLKI)及人VH亚组I(VHI)共同序列比对。
来自鼠类1D11(mu1D11)抗体之高变区经工程改造至VLKI及VHI接受体框架中以产生人源化1D11.v1(h1D11.v1)、1D11.v2(h1D11.v2)、1D11.v3(h1D11.v3)、1D11.v4(h1D11.v4)、1D11.v1.1(h1D11.v1.1)、1D11.v1.2(h1D11.v1.2)、1D11.v1.3(h1D11.v1.3)、1D11.v1.4(h1D11.v1.4)、1D11.v1.5(h1D11.v1.5)、1D11.v1.6(h1D11.v1.6)、1D11.v1.7(h1D11.v1.7)、1D11.v1.8(h1D11.v1.9)及1D11.v1.9(h1D11.v1.9)。具体言之，自mu1D11VL域，位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)移植至VLKI中。自mu1D11 VH域，位置26-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)移植至VHI中。
另外，发现某些残基为充当“维尼尔(Vernier)”区之框架残基之一部分，维尼尔区可调整CDR结构且微调抗原配合。参见例如Foote及Winter,J.Mol.Biol.224:487-499(1992)(图5及6)。此等CDR定义包括藉由其序列高变性(Wu,T.T.及Kabat,E.A.(1970))、其结构位置(Chothia,C.及Lesk,A.M.(1987))及其参与抗原-抗体接触(MacCallum等人J.Mol.Biol.262:732-745(1996))定义之位置。举例而言，VH及VL中之以下位置在以下人源化1D11变异体中自小鼠序列保留：
h1D11.v1--VH之框架III中的位置67、69及71；VL之框架II中的位置49以及VL之框架III中的位置69及71
h1D11.v2--VH之框架III中的位置67、69及71；VL之框架II中的位置49以及VL之框架III中的位置71
h1D11.v3--VH之框架III中的位置67、69、71及73；VL之框架II中的位置49以及VL之框架III中的位置58、69及71
h1D11.v4--VH之框架III中的位置67、69、71、73及75；VL之框架II中的位置49以及VL之框架III中的位置58、69及71
h1D11.v1.1--VH之框架III中的位置67、69及71；VL之框架III中的位置69及71
h1D11.v1.2--VH之框架III中的位置67、69及71；VL之框架II中的位置49以及VL之框架III中的位置71
h1D11.v1.3--VH之框架III中的位置67、69及71；VL之框架II中的位置49以及VL之框架III中的位置69
h1D11.v1.4--VH之框架III中的位置69及71；VL之框架II中的位置49以及VL之框架III中的位置69及71
h1D11.v1.5--VH之框架III中的位置67及71；VL之框架II中的位置49以及VL之框架III中的位置69及71
h1D11.v1.6--VH之框架III中的位置67及69；VL之框架II中的位置49以及VL之框架III中的位置69及71
h1D11.v1.7--VH之框架III中的位置67及69；VL之框架III中的位置69及71
h1D11.v1.8--VH之框架III中的位置67；VL之框架III中的位置69及71
h1D11.v1.9-VH中无变化；VL之框架III中的位置69及71
1D11之各种人源化变异体之轻链可变区序列及重链可变区序列分别展示于图6及图7中。
在所有四种h1D11变异体(h1D11.v1-4)中，藉由利用FACS，在表达人B7-H4之293细胞上，与小鼠1D11比较，h1D11.v1展示保留最接近亲和力。因此，藉由如上所述，修饰重链及轻链可变区之不同维尼尔位置，产生其他h1D11.v1变异体。
来自鼠类22C10(mu22C10)抗体之高变区经工程改造至VLKI及VHI接受体框架中以产生各种人源化22C10。具体言之，自mu22C10 VL域，位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)移植至VLKI。自mu22C10 VH域，位置26-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)移植至VHI中。
举例而言，VH及VL中之以下位置在以下人源化22C10变异体中自小鼠序列保留：
h22C10.v1--VH之框架III中的位置67、69、71及93；VL之框架II中的位置46及47以及VL之框架III中的位置71
h22C10.v2--VH之框架III中的位置67、69、71及93；VL之框架II中的位置46及47
h22C10.v3--VH之框架III中的位置67、69、71、73及93；VL之框架II中的位置46及47
h22C10.v4--VH之框架III中的位置67、69、71、76及93；VL之框架II中的位置46及47
h22C10.v5--VH之框架III中的位置67、69、71、75、76及93；VL之框架II中的位置46及47
h22C10.v2.1--VH之框架III中的位置67、69、71及93；VL之框架II中的位置47
h22C10.v2.2--VH之框架III中的位置67、69、71及93；VL之框架II中的位置46
h22C10.v2.3--VH之框架III中的位置69、71及93；VL之框架II中的位置46及47
h22C10.v2.4--VH之框架III中的位置67、71及93；VL之框架II中的位置46及47
h22C10.v2.5--VH之框架III中的位置67、69及93；VL之框架II中的位置46及47
h22C10.v2.6--VH之框架III中的位置67、69及71；VL之框架II中的位置46及47
h22C10.v2.7-VH中无变化；VL之框架II中的位置46及47
h22C10.v2.8-VH中无变化；VL之框架II中的位置46
22C10之各种人源化变异体之轻链可变区序列及重链可变区序列分别展示于图8及图9中。
1D11及22C10之人源化变异体藉由Kunkel诱突，针对各高变区使用分开寡核苷酸来产生。藉由DNA测序鉴别正确克隆。
评估变异体
出于筛选之目的，最初在293细胞中产生IgG变异体。将编码VL及VH之载体转染至293细胞中。藉由蛋白A亲和层析，自细胞培养基纯化IgG。
最初藉由FACS及史卡查分析，筛选小规模制剂，以确定物种特异性及对重组及内源性B7-H4之亲和力(Kd)。藉由将不同浓度(0-10μg/ml)人源化变异体与过度表达重组人、食蟹猕猴或小鼠-B7-H4之293细胞及表达内源性人B7-H4之肿瘤细胞系MX-1一起在4℃下培育40分钟，接着洗涤且在4℃下用缀合于Dylight-650之二级山羊抗人IgG抗体染色20分钟，来确定初始EC50及物种特异性。利用BD FACS Calibur获得荧光信号且藉由Graph Pad程序Prism 4确定EC50值。
1.物种交叉反应性
测试单克隆抗体以确定其是否与来自除人外之物种的B7-H4交叉反应。图10展示人(SEQ ID NO:73)、黑猩猩(SEQ ID NO:81)、食蟹猕猴(SEQ ID NO:75)、大鼠(SEQ ID NO:77)及小鼠(SEQ ID NO:79)B7-H4之间的比对。在所有五个物种中一致之残基藉由红框内之分组指示。不同之残基藉由红点指示。B7-H4直系同源物具有极高序列同一性：人B7-H4100％；黑猩猩B7-H496.09％；食蟹猕猴B7-H4 98.6％、大鼠B7-H4 86.87％及小鼠B7-H487.63％。详言之，大鼠B7-H4与小鼠B7-H4 97.17％一致。B7-H4直系同源物亦具有极高序列相似性：人B7-H4 100％；黑猩猩B7-H4 97.42％；食蟹猕猴B7-H498.8％、大鼠B7-H4 89.3％及小鼠B7-H4 90.12％。
藉由经B7-H4(人、黑猩猩、食蟹猕猴、大鼠或小鼠B7-H4)稳定转染的293细胞之FACS分析，确定与各物种B7-H4之结合；Dylight-650缀合之山羊抗人抗体染色。未转染之293细胞通常不表达B7-H4。
如图11中所示，代表性FACs筛选资料展示hu1D11v1.7-9及hu22C10v2.7-8以亲本嵌合抗体范围内之EC50结合于重组人、食蟹猕猴及小鼠B7-H4。
2.抗体亲和力
按照标准程序(Holmes等人,Science 256:1205-1210(1992))进行史卡查分析以确定ch1D11、ch9B9、ch2210及ch32D6抗体之相对结合亲和力。
使用间接Iodogen法对抗-B7-H4抗体进行[I125]标记。藉由使用NAP-5管柱(GEHealthcare)之凝胶过滤，自游离125I-Na纯化[I125]标记之抗-B7-H4抗体；经纯化之碘化抗-B7-H4抗体具有8-10μCi/μg之范围的特定活性。将50μL体积含有固定浓度之[I125]标记抗体及递减浓度之连续稀释之未标记抗体的竞争分析混合物置于96孔板中。将稳定表达人、食蟹猕猴、大鼠或小鼠B7-H4之293细胞或MX-1肿瘤细胞在生长培养基中在37℃下在5％CO2中培养。使用Sigma细胞解离溶液将细胞自烧瓶分离且用结合缓冲液洗涤，该结合缓冲液由具有1％牛血清白蛋白(BSA)之达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModified EagleMedium，DMEM)、300mM人IgG及0.1％迭氮化钠组成。将经洗涤之细胞以0.2mL结合缓冲液中100,000个细胞之密度添加至96孔板。各孔中[I125]标记抗体之最终浓度为约250pM。竞争分析中未标记抗体之最终浓度在1000nM，经十次2倍数稀释步骤，至0nM仅仅缓冲液分析物之范围内。竞争分析一式三份地进行。将竞争分析物在室温下培育2小时。在培育2小时之后，将竞争分析物转移至Millipore多筛滤板(Billerica,MA)中且用结合缓冲液洗涤4次以将游离与结合之[I125]标记抗体分开。过滤器在Wallac Wizard1470γ计数器(PerkinElmerLife and Analytical Sciences Inc.；Wellesley,MA)上计数。使用NewLigand软件(Genentech)评估结合数据，该软件使用Munson及Robard之拟合算法确定抗体之结合亲和力(Munson及Robard 1980)。
如图4A中所示，ch1D11分别以6.1nM、4.1nM、9.4nM及4.1nM之亲和力结合于在稳定转染之293细胞上表达的人B7-H4、食蟹猕猴B7-H4、小鼠B7-H4及大鼠B7-H4。ch22C10分别以6.6nM、4.6nM、18.3nM及5.7nM之亲和力结合于在稳定转染之293细胞上表达的人B7-H4、食蟹猕猴B7-H4、小鼠B7-H4及大鼠B7-H4。ch9B9分别以6.6nM、5.2nM、13.7nM及4.7nM之亲和力结合于在稳定转染之293细胞上表达的人B7-H4、食蟹猕猴B7-H4、小鼠B7-H4及大鼠B7-H4。ch32D6分别以4.8nM及3.1nM之亲和力结合于在稳定转染之293细胞上表达的人B7-H4及食蟹猕猴B7-H4。
亦使用如上所述之史卡查分析评估各种人源化抗-B7-H4抗体之亲和力。将稳定表达人B7-H4之MX-1肿瘤细胞在生长培养基中在37℃下在5％CO2中培养。如图12中所示，hu1D11.v1.7、hu1D11.v1.8及hu1D11.v1.9分别以8.3nM、8.7nM及7.8nM之亲和力结合于人B7-H4(与亲本1D11抗体之7.8nM相比)。hu22C10.v2.7及hu22C10.v2.8分别以6.3nM及10nM之亲和力结合于人B7-H4(与亲本22C10抗体之4.9nM相比)。
F.单克隆抗体表位分组
为确定单克隆抗体之表位分组，进行FACS分析以评估其他抗体是否可替换参考抗体。
使用基于细胞之竞争结合FACS分析测定表位分组。将表达重组人B7-H4之293细胞与Dylight-488标记之示踪剂抗体(0.3-1μg/ml)一起在未标记抗体(0、0.05、0.5、5、50μg/ml)存在下培育。当示踪剂由未标记抗体替换时，已发生竞争，指示抗体特异性结合B7-H4上相同或类似之区域-此应发生在相同抗体用作示踪剂及竞争剂时。当示踪剂未由不同未标记抗体替换时，未标记抗体结合B7-H4中之不同区域。
为确定B7-H4抗体结合B7-H4之Ig-V还是Ig-C域，使用标准分子克隆方法，对含有B7-H4(IgV；包括间隔子S151-V157之G28-F150)-不相关(Ig-C)(构建体-88)或不相关(Ig-V)-B7-H4(Ig-C；包括TM/CD D237-K282之D158-G236)(构建体-88B)膜蛋白质的嵌合Ig域分子进行工程改造。附着N端或胞质标签以证实经此等构建体转染之293细胞在细胞膜上表达蛋白质(资料未展示)。简言之，使用polyfect，293细胞经构建体88及88B瞬时转染。在48小时之后，在4℃下将细胞用10μg/ml Dylight-488或Dylight-650标记之ch9B9、ch1D11、ch22C10或ch32D6染色30-40分钟，洗涤且在BD FACS calibur上分析。
另外，用经工程改造之可溶性B7-H4(Ig-V；G28-V157)-Fc融合蛋白独立地证实该等结果。当在3-300倍浓度之染料标记之示踪剂抗体下培育时，如藉由FACS所测定，封闭示踪剂与293-huB7-H4细胞之结合。
B7-H4(Ig-V)域含有单一N连接之糖基化位点(N112-S114)，且为确定糖基化是否影响抗体与B7-H4之结合，使用标准位点特异性诱突，将S114经丙氨酸替代以防止全长人B7-H4膜构建体中之糖基化。突变S114A人B7-H4构建体用polyfect转染至293细胞中，且48小时后，藉由FACS，与293-huB7-H4稳定细胞系一起分析抗体结合。
图4A概述标题为“表位群”之列中的结果。如图4A中所示，抗体1D11及9B9均结合于分组在“A”下之表位，而抗体22.C10结合于分组在“B”下之表位，且抗体32D6结合于分组在“C”下之表位。
进一步证实三个单克隆抗体明确结合B7-H4 Ig-V域，其中ch22C10可能结合包含Ig-V/Ig-C之表位且此类结合与糖基化无关-所有4种抗体结合超过同种型对照100倍。ch1D11及ch22C10之代表性资料展示于图4B中。所用ch1D11型式为ch1D11之略微修饰型式，其中1D11 mAb轻链含有C43G之取代。未检测到任一单克隆抗体与B7-H4 Ig-C域之结合。
G.抗-B7-H4抗体之内化
ADC标靶之一种所希望属性为能够将抗体内化至细胞中之降解隔室。为确定抗-B7-H4抗体在结合时是否内化，将SKBR3腺癌细胞接种于经细胞培养物处理之4孔腔室载玻片(Nalge Nunc International)，且在4℃下与Dylight594缀合之抗-B7-H4 9B9 mAb(10μg/mL)或作为膜染色对照之抗-EGF-Alexa488(3μg/mL)一起培育2小时。为内化，添加两者且在4℃下培育2小时。接着洗涤细胞且在溶酶体蛋白酶抑制剂胃酶抑素(5μg/mL)/抗纤维蛋白溶酶肽(10μg/mL)存在下经受16小时追逐。所有处理组接着在室温下固定在3％对甲醛(Polysciences,Inc.)中20分钟，且用50mM氯化铵及PBS洗涤，且随后用DAPI将核染色。Leica SP5共焦显微镜(Leica Microsystems)用于图像分析。
如图13中所示，细胞内9B9及EGF(用作溶酶体标记物)染色明显相当大重迭。此等结果预测抗-B7-H4 ADC应有效地内化，进行降解，且释放药物以杀死癌细胞。
为证实抗-B7-H4抗体到达溶酶体，将经染料缀合物标记之ch1D11及ch22C10抗-B7-H4抗体与MX-1癌瘤细胞一起培育且荧光共振能量转移(FRET)用于追踪抗体在胞内之位置。FRET为两个发色团(在此情况下为供体及接受体染料)之间能量转移的机制。简言之，ch1D11或ch22C10缀合于两种染料FAM及TAMRA，藉由含有组织蛋白酶切割位点之肽间隔子固持在一起。在未切割状态中，归因于红色染料(接受体)接近，绿色染料(供体)猝灭，因此膜及胞浆染色出现红色。当抗体缀合物进入溶酶体时，溶酶体酶组织蛋白酶将肽间隔子切割，增加供体与接受体之距离，因此防止能量转移至红色染料且允许绿色染料可见。为实现此，将细胞与2μg/ml抗体缀合物一起在冰上培育30分钟。利用Leica SP5共焦显微镜与延时摄影，在10小时时间段内在37℃下，立即将细胞成像以展示膜染色(T0)。如图14中所示，ch1D11及ch22C10定位于完整(红色)及切割(绿色)缀合物之溶酶体合并影像中，展示其中两种缀合物共定位于溶酶体中之黄色区域。
H.产生抗-B7-H4抗体-药物缀合物
对于更大规模之抗体产生，在CHO细胞中产生抗体。编码VL及VH之载体转染至CHO细胞中且藉由蛋白A亲和层析，自细胞培养基纯化IgG。
抗-B7-H4抗体-药物缀合物(ADC)藉由1D11、22C10及9B9缀合于本文中描绘之药物-接头部分MC-vc-PAB-MMAE来产生。为方便起见，药物-接头部分MC-vc-PAB-MMAE在此等实例及图中有时称为“vcMMAE”或“VCE”。在缀合前，抗体使用标准方法，根据WO 2004/010957 A2中描述之方法用TCEP部分还原。部分还原之抗体使用标准方法，根据例如Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21:778-784及US 2005/0238649 A1中描述之方法缀合于药物-接头部分。简言之，部分还原之抗体与药物-接头部分组合，以允许药物-接头部分缀合于抗体之还原半胱氨酸残基。将缀合反应猝灭，且纯化ADC。
另外，抗-B7-H4抗体-药物缀合物(ADC)藉由用本文中描绘之缩醛接头(PNU-159682顺丁烯二酰亚胺缩醛接头)将1D11缀合于药物-接头部分PNU-159682顺丁烯二酰亚胺来产生。
测定各ADC之药物负载(每个抗体之药物模块之平均数目)且对于抗-B7-H4抗体，在3.5-3.9(奥瑞司他汀)及1.6-1.9(奈莫柔比星)之间。
I.MX-1人乳腺癌细胞系异种移植物中抗-B7-H4抗体-药物缀合物之功效
使用MX-1人乳腺癌异种移植模型研究抗-B7-H4 ADC之功效。MX-1细胞系为三重阴性(TN；ER(-)/PR(-)/Her2(-))乳房导管癌细胞系(NCI-Frederick Cancer Center DCTTumor Repository)。B7-H4在MX-1细胞中高度表达且藉由IHC、FACS、IF及共聚焦显微镜及Western印迹证实。MX-1肿瘤片段(1mm3)(藉由FACS，使用9B9，B7-H4阳性)皮下植入10只小鼠/组之背侧腰窝中，且当接种后植入物达到100-150mm3时，向小鼠单次静脉内注射3mg/kg或10mg/kg人抗-gD 5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物、3mg/kg或10mg/kg ch9B9-vcMMAE抗体-药物缀合物、ch22C10-vcMMAE抗体-药物缀合物、ch1D11-vcMMAE抗体-药物缀合物或10mg/kg ch9B9裸抗体或单独媒剂(PBS)。藉由在注射后1、7及14天PK抽血，证实抗体之存在。
如图15中所示，在两种测试浓度下用所有三种抗-B7-H4抗体-药物缀合物实现实质性肿瘤生长抑制。
J.HBCX-24乳腺癌细胞系异种移植物中抗-B7-H4抗体-药物缀合物之功效
使用HBCX-24乳腺癌异种移植模型研究抗-B7-H4 ADC之功效。HBCX-24细胞系为三重阴性(TN；ER(-)/PR(-)/Her2(-))乳腺癌细胞系。B7-H4在HBCX-24乳腺癌细胞中高度表达，且藉由IHC、FACS、IF及共聚焦显微镜及Western印迹证实。在HBCX-24乳腺癌细胞中存在B7-H4染色之1+及2+水平之流行率，藉由免疫组织化学测量。HBCX-24肿瘤片段(20mm3)皮下植入5-10只小鼠/组之背侧腰窝中，且当接种后植入物达到75-200mm3时，向小鼠单次静脉内注射6mg/kg或10mg/kg人抗-gD 5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物、3mg/kg、6mg/kg或10mg/kg ch9B9-vcMMAE抗体-药物缀合物或10mg/kg ch9B9裸抗体或单独媒剂(PBS)。藉由在注射后1、7及14天PK抽血，证实抗体之存在。
如图16中所示，在所有测试浓度下用ch9B9抗-B7-H4抗体-药物缀合物实现实质性肿瘤生长抑制。
K.MX-1乳腺癌细胞异种移植物中抗-B7-H4抗体-药物缀合物之功效
使用MX-1乳腺癌异种移植模型研究藉由用缩醛接头将1D11缀合于药物-接头部分PNU-159682顺丁烯二酰亚胺所产生之抗-B7-H4 ADC的功效。MX-1肿瘤片段(1mm3)皮下植入10只小鼠/组之背侧腰窝中，且当接种后植入物达到100-150mm3时，向小鼠单次静脉内注射0.1mg/kg、0.5mg/kg或2.5mg/kg人抗-gD 5B6-vcMMAE对照抗体-药物缀合物或0.1mg/kg、0.5mg/kg或2.5mg/kg具有缩醛接头之ch1D11-PNU-159682顺丁烯二酰亚胺或单独媒剂(PBS)。藉由在注射后1、7及14天PK抽血，证实抗体之存在。
如图17中所示，发现2.5mg/kg剂量之ch1D11 ADC延缓肿瘤生长，而较低剂量之0.1mg/kg及0.5mg/kg对肿瘤生长作用不明显。
L.MX-1乳腺癌细胞异种移植物中抗-B7-H4抗体-药物缀合物之功效
使用如实例K中所述之MX-1异种移植模型，研究hu22C10v2.7之抗-B7-H4 ADC之功效。小鼠分成10个一组，且施用以下单一静脉内剂量：hu22C10v2.7裸抗体，12mg/kg；hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE，0.5mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg、9mg/kg、12mg/kg；人抗-gD-5B6-vc-PAB-MMAE，6或12mg/kg；或单独媒剂(PBS)。藉由PK抽血，证实抗体之存在。肿瘤生长抑制(TGI)计算为各处理组相对于媒剂，每天经拟合之肿瘤体积-时间曲线(AUC)下面积％，使用下式：
％TGI＝100'(1-AUC处理/天，AUC媒剂/天)
100％之TGI值指示肿瘤停滞，TGI>1％但<100％指示肿瘤生长延迟，且TGI>100％指示肿瘤消退。
如图18中所示，hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE展示6、9及12mg/kg剂量分别91％、106％及108％之显著肿瘤生长抑制；其中在9mg/kg剂量下38％部分反应(PR)及62％完全反应(CR)。在媒剂或对照ADC下未观测到反应。
M.HCC-1569x2乳腺癌细胞异种移植物中抗-B7-H4抗体-药物缀合物之功效
使用HCC-1569x2(Her2+/ER-)乳腺癌细胞异种移植模型研究hu22C10v2.7之抗-B7-H4 ADC的功效。HCC-1569x2为体内衍生之细胞系，自NCR裸小鼠(Taconic,Cambridge City,IN)中来源于亲本HCC1569细胞(ATCC,Manassas,VA)之异种移植肿瘤的两个随后继代产生。B7-H4在HCC-1569x2异种移植物中高度表达且藉由IHC及FACS证实(图19A)。SCID米色小鼠用HCC-1569x2细胞(于基质胶中5×106)接种至其乳房脂肪垫中，且监测直至肿瘤体积达到250-375mm3。小鼠分至10个一组，且施用以下单一静脉内剂量：ch22C10-vc-PAB-MMAE，5mg/kg；或hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE，3mg/kg或5mg/kg；或人抗-gD-5B6-vc-PAB-MMAE，5mg/kg；或单独媒剂(PBS)。藉由PK抽血，证实抗体之存在。
如图19B中所示，在5mg/kg剂量下ch22C10-vc-PAB-MMAE及hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE分别展示107％及105％之肿瘤生长抑制(TGI)。在嵌合或人源化22C10抗体-药物缀合物之间，功效无显著差异。与媒剂或对照ADC相比，较低3mg/kg剂量之hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE展示94％之肿瘤生长抑制(TGI)。
N.h1D11v1.9之变异体
使用如章节F(“单克隆抗体表位分组”)中所述之位点特异性诱突的标准分子生物学方案制备h1D11v1.9之变异体。
对轻链之修饰展示于图22A中。在h1D11v1.9_VarC2及h1D11v1.9_VarD之轻链的CDR-L3中进行氨基酸取代N93D。
对重链之修饰展示于图22B中。在重链h1D11v1.9_VarC2之CDR-H3中进行氨基酸取代D96A。将工程改造半胱氨酸(A118C)并入h1D11v1.9_VarC2及h1D11v1.9_VarD之重链恒定区中，且亦并入h22C10v2.7中，以位点特异性附着接头药物缀合物。
O.h1D11v1.9之变异体之某些特性
1.物种交叉反应性及亲和力
藉由如先前在章节E(“抗体亲和力”)中描述之史卡查分析，测定h1D11v1.9变异体C2及D之亲和力。
如图23A中所示，抗体变异体维持亲本抗体物种特异性与对重组人或食蟹猕猴或小鼠或大鼠B7-H4及对乳腺癌细胞系MX-1中表达之内源性人B7-H4的高亲和性。VarC2之亲和力为0.9nM(重组人B7-H4)、2.0nM(MX-1细胞上之人B7-H4)、1.0nM(重组食蟹猕猴B7-H4)、2.1nM(重组小鼠B7-H4)及1.2nM(重组大鼠B7-H4)，且VarD之亲和力为2.9nM(重组人B7-H4)、7.4nM(MX-1细胞上之B7-H4)、3.7nM(重组食蟹猕猴B7-H4)、5.0nM(重组小鼠B7-H4)及2.7nM(重组大鼠B7-H4)。
2.表位定位
使用如图21顶部(亦参见图4B)中所示的表达B7-H4之Ig-V或Ig-C样域之嵌合Ig分子且实质上如实例F中所述，测定h1D11v1.9变异体D(h1D11v1.9varD)抗体在重组人B7-H4上之结合位点。所有构建体展示嵌合Ig之细胞表面表达，如藉由N端Herpes-gD标签之10-100倍染色所判断。h1D11v1.9varD展示与模拟转染293细胞(图21，左图)相比，与表达B7-H4Ig-V域之Ig-嵌合体显著结合(约44倍)。此观测结果藉由在3倍连续浓度(0.1-300μg/ml)可溶性B7-H4 IgV-Fc融合蛋白存在下h1D11v1.9varD(1μg/ml)竞争结合于稳定表达人B7-H4之293细胞所证实。在此情况下，B7-H4 Ig-V-Fc以剂量依赖性方式抑制h1D11v1.9varD与293-hB7H4之结合(图21，中图)。h1D11v1.9varD与具有B7-H4之Ig-C域之Ig-嵌合体不结合，但在Mol-X Ig-V特定抗体下检测到显著结合(39倍)。
B7-H4之Ig-V样域在位置N112-S114含有单一N连接之糖基化位点。S114经丙氨酸替代，因此移除NXS/T基元，不会引起h1D11v1.9varD之结合显著丧失(图21，右图)。总之，此等观测结果指示h1D11v1.9varD类似于亲本抗体，以与糖基化无关之方式结合于人B7-H4之Ig-V域。
P.抗-B7-H4抗体-药物缀合物之体外效能
使用过度表达重组人B7-H4之293细胞，测定抗-B7-H4hu1D11v1.9-varD、hu22C10v2.7、hu1D11v1.9-varD IgG1 A118C及hu22C10v2.7IgG1 A118C抗体-药物缀合物之效能。
实质上如本文在实例H中所述，Hu1D11v1.9-varD、hu22C10v2.7、hu1D11v1.9-varDIgG1 A118C及hu22C10v2.7 IgG1 A118C结合于MC-vc-PAB-MMAE。亦参见Junutula等人,2008,Nat.Biotechnol.26:925-32。每个mAb缀合之MC-vc-PAB-MMAE分子之数目藉由LC/MS分析，使用6530Accurate-Mass Quadrupole飞行时间(Q-TOF)LC/MS(AgilentTechnologies)定量。藉由尺寸排阻层析测定纯度。简言之，样本在加热至80℃之
Figure BDA0003169464670001731
8μm之PRLP-S管柱(50mm×2.1mm，Agilent Technologies)上层析。使用在4.3分钟内30-60％B之线性梯度(溶剂A，含0.05％TFA之水；溶剂B，含0.04％TFA之乙腈)且使用电喷射来源直接将洗脱液电离。收集数据且使用Agilent Mass Hunter定性分析软件去卷积。在LC/MS分析前，将抗体-药物缀合物用赖氨酰基内肽酶(Wako)在1:100w/w酶与抗体比率、pH 8.0及37℃下处理30分钟以产生Fab及Fc部分，从而易于分析。选择层析条件以实现Fab及Fab+1药物在不同峰中之基线分辨率。使用280nm下UV层析图之积分峰面积且与LC/MS去卷积结果中存在之离子丰度正交计算药物与抗体比率(DAR)。使用LC/MS鉴别峰。A118C硫基mab之药物:Fab比率为约1:1，且完整A118C硫基mab抗体之药物:抗体比率(DAR)为约2:1(或约2之DAR)。完整非硫基mab抗体-药物缀合物之DAR为约3。
在96孔板中，将150μl表达B7-H4之293细胞以1.33×104个细胞/毫升涂铺且允许恢复24小时。次日，非硫基mab抗体-药物缀合物(ADC)以在0.003至10μg/ml范围内之3倍连续稀释液添加，且A118C硫基mab ADC以在0.0045至15μg/ml范围内之3倍稀释液添加。硫基mab ADC剂量更高以校正ADC之间药物负载之差异。ADC之稀释液以4X最终浓度制得；将连续稀释之药物以50μl添加至适当孔中。细胞在37℃与5％CO2下培育4天。使用试剂CellTiter-Glo(Promega)测定细胞活力，在Envision 2012Multi-Label读数器(Perkin Elmer)上获得资料，且用Prism 4分析资料。
如图23B中所示，实线表示非硫基mab ADC且短划线表示A118C硫基mab ADC(“TDC”)。与对应阴性对照抗-gD-5B6 ADC相比，对于非硫基mab ADC及A118C硫基mab ADC，观测到过度表达B7-H4之293细胞的类似体外杀死。hu1D11v1.9-varD-vc-MMAE及hu1D11v1.9-varD IgG1 A118C-vc-MMAE之EC50分别为55.4ng/ml及81.9ng/ml，且hu22C10v2.7-vc-MMAE及hu22C10v2.7 IgG1 A118C-vc-MMAE之EC50分别为33.9ng/ml及40.5ng/ml。
Q.Her2+HCC-1569x2乳腺癌细胞异种移植模型中抗-B7-H4变异体C2及D抗体-药物缀合物之功效
使用HCC-1569x2(Her2+/ER-)乳腺癌细胞异种移植模型研究抗-B7-H4hu1D11v1.9-VarC2-vc-MMAE、hu1D11v1.9-VarD-vc-MMAE、hu1D11v1.9-VarC2 IgG1A118C-vc-MMAE及hu1D11v1.9-VarD ADC IgG1A118C-vc-MMAE之功效。B7-H4在HCC-1569x2肿瘤异种移植物(解离活肿瘤异种移植细胞或FFPE切片)中高度表达，且藉由IHC及FACS证实(图24A)。SCID米色小鼠(Charles River Laboratories,San Diego,CA)用HCC-1569x2细胞(于基质胶中5×106)接种至#2/3乳房脂肪垫中，且监测直至肿瘤体积达到约330mm3。小鼠分至8个(VarC2)或9个(VarD)一组，且施用以下单一静脉内剂量：hu1D11v1.9-VarC2 IgG1A118C-vc-MMAE，1.5mg/kg或3mg/kg或6mg/kg或9mg/kg；或对照抗-gD-5B6-vc-MMAE，3mg/kg或9mg/kg；或单独媒剂(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液)。藉由PK抽血，证实抗体之存在。
将第二组小鼠分成9只一组之各组，且施用以下单一静脉内剂量：hu1D11v1.9-VarD-vc-MMAE，3mg/kg；或hu1D11v1.9-VarD IgG1A118C-vc-MMAE，1.5mg/kg或3mg/kg或6mg/kg或9mg/kg；对照抗-gD-5B6-vc-MMAE，3mg/kg；对照抗-gD-5B6-IgG1 A118C-vc-MMAE，3mg/kg或9mg/kg；裸h1D11v1.9-VarD IgG1 A118C，或施用单独媒剂(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液)。藉由PK抽血，证实抗体之存在。
测量肿瘤且对于研究之持续时间，体重一周收集两次。肿瘤体积(mm3)系使用下式计算：(长度×宽度2×0.5)。肿瘤生长抑制(TGI)计算为各处理组相对于媒剂，每天经拟合之肿瘤体积-时间曲线(AUC)下面积％，使用下式：
％TGI＝100×(1-AUC处理/天÷AUC媒剂/天)
100％之TGI值指示肿瘤停滞，TGI>1％但<100％指示肿瘤生长延迟，且TGI>100％指示肿瘤消退。
如图24B中所示，观测到h1D11v1.9-VarC2 IgG1 A118C-vc-MMAE在9mg/kg下具有实质功效，其中％TGI为118％(4/8部分反应及4/8完全反应)。亦在3mg/kg及6mg/kg组中看到肿瘤消退，其中％TGI为96％(1/8部分反应)及108％(3/8部分反应)。另外，未观测到任何处理组重量减轻。在对照ADC或媒剂下未观测到反应。
如图24C中所示，观测到剂量依赖性功效，其中1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg及9mg/kg单一剂量之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE分别引起56％、75％、91％及93％之％TGI。在3mg/kg剂量下之功效大致相等，无论小鼠接受hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE还是hu1D11v1.9-VarD-vc-MMAE。未观测到任何处理组重量减轻。在裸hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C与对照ADC或媒剂下未观测到反应。
R.TNBC MX-1乳腺癌细胞异种移植模型中抗-B7-H4抗体-药物缀合物之功效
使用MX-1(Her2-/ER-/PR-)乳腺癌异种移植模型，研究hu1D11v1.9-VarD及hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C ADC之抗-B7-H4 TDC或ADC的功效。B7-H4在MX-1肿瘤异种移植物(解离活肿瘤异种移植细胞或FFPE切片)中高度表达，且藉由IHC及FACS证实(图25A)。NCR裸小鼠(Taconic,Cambridge City,IN)用MX-1细胞(于基质胶中1×106)接种至#2/3乳房脂肪垫中，且监测直至肿瘤体积达到约240mm3。小鼠分至九个一组，且施用以下单一静脉内剂量：hu1D11v1.9-VarD-vc-MMAE，3mg/kg；或hu1D11v1.9-VarD IgG1A118C-vc-MMAE，1.5mg/kg或3mg/kg或6mg/kg或9mg/kg；hu1D11v1.9-VarD，9mg/kg；或对照抗-gD-5B6 IgG1A118C-vc-MMAE，3mg/kg或9mg/kg；或单独媒剂(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液)。藉由PK抽血，证实抗体之存在。
如图25B中所示，所有剂量之hu1D11v1.9-VarD-vc-MMAE或hu1D11v1.9-VarD IgG1A118C-vc-MMAE均实现实质性肿瘤消退，其中％TGI在95-119％范围内(3、6及9mg/kg剂量之hu1D11v1.9-VarD IgG1A118C-vc-MMAE分别引起114％、117％及119％之％TGI)。在3mg/kg剂量下非硫基mab ADC及硫基mab ADC之功效类似，但对3mg/kg硫基mab ADC之反应在给药后持续大约25天，其中肿瘤再生小于给与3mg/kg非硫基mab ADC之动物。在整个该研究中，两组中体重维持。在6mg/kg或9mg/kg hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE下功效提高，因为在研究结束时在此等组中无肿瘤再生征象或体重减轻(第29天)。媒剂及阴性对照组未展示显著肿瘤抑制或体重减轻。
S.HCI-002乳腺癌细胞异种移植模型中抗-B7-H4抗体-药物缀合物之功效
使用藉由Huntsman Cancer Institute(University ofUtah)研发之来源于患者之三重阴性乳腺癌(TNBC；Her2-/ER-/PR-)异种移植模型(HCI-002)研究抗-B7-H4hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE及hu22C10v2.7-vc-MMAE ADC之功效。藉由FACS，B7-H4在来自HCI-002肿瘤异种移植物之解离细胞之细胞表面上表达，不过其低于在MX-1模型中观测到之情况。IHC展示在FFPE异种移植切片上表达水平类似(图26A)。NCR裸小鼠用2×2mm肿瘤片段接种至#2/3乳房脂肪垫中，且监测直至肿瘤体积达到约260mm3。小鼠分至七个一组，且施用以下单一静脉内剂量：hu22C10v2.7-vc-MMAE，3mg/kg；或hu1D11v1.9-VarDIgG1 A118C-vc-MMAE，3mg/kg或6mg/kg或9mg/kg；对照抗-gD 5B6 IgG1 A118C-vc-MMAE，3mg/kg或9mg/kg；单独媒剂(20mM组氨酸乙酸盐缓冲液)。藉由PK抽血，证实抗体之存在。
如图26B中所示，所有剂量之hu22C10v2.7-vc-MMAE或hu1D11v1.9-VarD IgG1A118C-vc-MMAE均实现实质性肿瘤消退，其中％TGI在112-115％范围内(3、6及9mg/kg剂量之hu1D11v1.9-VarD IgG1A118C-vc-MMAE分别引起112％、114％及114％之％TGI)。在3mg/kg下hu22C10v2.7-vc-MMAE与hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE之间无显著差异，但两组中之几个动物在大约第25天开始展示肿瘤再生。在3mg/kg组中整体上未观测到体重显著减轻。在6mg/kg及9mg/kg hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE下功效略微提高，因为在研究结束时在此等组中无肿瘤再生征象或体重减轻(第33天)。媒剂及阴性对照组未展示显著肿瘤抑制，其中例外为给与9mg/kg抗-gD 5B6 IgG1 A118C-vc-MMAE之小鼠，其延迟肿瘤生长直至第20天，但在研究结束前或结束时达到最大允许肿瘤体积。
在先前实验中，发现2-3mg/kg剂量之常规ADC靠近在人临床试验研究中观测到之剂量限制毒性(DLT；2.4mg/kg)。参见Junutula等人,2008,Nat.Biotechnol.26:925-932。已报导THIOMABTM技术(亦即具有工程改造半胱氨酸之抗体，诸如本文中论述之A118C)与相等细胞毒性药物剂量之常规抗体-药物缀合物相比，提高安全性且不丧失功效。同上。数据表明归因于在循环中滞溜时间较长且与常规ADC相比药物与抗体比率较低，3-6mg/kg之间的抗-B7-H4-vc-MMAE THIOMABTM剂量应产生更佳功效及安全性。
T.大鼠中之抗-B7-H4抗体组织分布
藉由锆iPET成像，使用经由侧链赖氨酸缀合于去铁敏B(DFO)螯合基之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C，评估组织分布。参见例如Verel等人,2003,J.Nucl.Med.44:1271-81。所有研究均根据Genentech,Inc.之AAALAC批准之机构动物护理及使用委员会的指导原则进行。
动物用3.5％七氟烷轻微麻醉以约束，且藉由升温气流维持体温。向大鼠(n＝2个/组)经由侧向尾静脉注射1mCi(700μL，0.7mg/ml)89Zr-mAb。使用Siemens Inveon PET/CT扫描仪(Siemens Preclinical Solutions,Knoxville,TN,USA)之PET扫描在第0天及第1天之时间点为15分钟静态扫描，且在第2天增加至30分钟静态扫描，且在第5天增加至1小时扫描，以补偿放射性衰变。CT扫描紧随所有PET扫描，以供解剖参考及PET数据之衰减校正。每只大鼠需要扫描两次以容纳整个身体长度。使用供货商提供之迭代OP-MAP实施，使用设为0.05之β平滑化参数，将列表模式数据重构成具有0.4×0.4mm之256×256共平面立体像素及0.8mm经平面立体像素厚度的影像。参见例如Qi等人,2000,IEEE transactions onmedical imaging,19:493-506。
未校正之吸收表示为每公克特定相关区域(ROI；在此实验中，为诸如卵巢、肺、肝等组织)之平均注射剂量(ID)。每公克放射能之注射剂量百分比(ID)如下确定：％ID/g＝ROI活性除以放射能所注射剂量乘以100％。ROI活性为相关区域(ROI)中累积之放射能，其测量为影像扫描上之像素。
如图27中所示，89Zr标记之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C展示至第5天，与同种型匹配对照89Zr-抗-gD类似的组织分布(血液、脾、肾、肝及肺)，除了卵巢。在16小时之后，89Zr标记之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C展示在血池及卵巢中分布(图28小图A)。当抗体自血池消散时，最大强度投影展示89Zr-标记之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C与同种型对照相比仅仅在卵巢中显著累积，吸收值分别为2.75％+/-0.4及1.0％+/-0.2(图28小图B、C)。此结果并不意外，因为hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C结合重组大鼠B7-H4(图28小图D)。藉由至第5天，无其他组织展示累积任一成像抗体。
U.抗-B7-H4抗体不增强小鼠模型中之发炎
在脑脊髓炎(EAE)之实验模型中评估mu1D11。在第0天，将C57BL/6小鼠用0.2ml含有300μg MOG 35-55肽于0.1ml PBS及0.1ml CFA中之乳液免疫接种。所有组亦接受百日咳毒素(200ng)于0.1ml PBS中之IP注射。测试物品以10mg/kg 3次/周IV施用3周。第二IP剂量百日咳毒素在第2天给与。临床评估开始于第7天且藉由临床检查，小鼠评估一周3次，直至第25天。临床评分如下：0-正常小鼠；无明显疾病征象。1-尾巴疲软或后肢无力，但非两者。2-尾部疲软及后肢无力。3-部分后肢麻痹。4a-完全后肢麻痹；4b-完全后肢麻痹且前肢中度至严重无力。5-藉由EAE，濒死状态或死亡。测试物品：阳性对照(mCTLA-4-Ig，mIgG2a)、阴性对照(抗-gp120，mIgG2a)、抗-B7-H4mu1D11(mIgG2a)。如图29中所示，藉由mCTLA-4Ig改善EAE，但同种型匹配Ig对照或mu1D11(“Ab-11”)抗体在减轻或加重疾病发作或严重程度上之间无显著差异。不欲受任何特定理论束缚，CIA(资料未展示)及EAE模型中缺乏增强之发炎表明肿瘤抑制系归因于MMAE之作用，而非重新开始抗-B7-H4抗体之抗肿瘤免疫性。
V.抗-B7H4双表位抗体
hu1D11v1.9 varD/hu22C10v2.7之双表位抗体分子以节及穴格式藉由分开表达节及穴型半抗体臂来产生。表达之半抗体臂分开纯化且接着在体外组装成双表位抗体。简言之，将hu1D11v1.9之重链重新格式化成hu1D11v1.9节pHIS重链(SEQ ID NO:149)及hu1D11v1.9穴FLAG重链(SEQ ID NO:151)。将hu22C10v2.7之重链重新格式化成hu22C10v2.7节pHIS重链(SEQ ID NO:154)及hu22C10v2.7穴FLAG重链(SEQ ID NO:156)。将聚his标签(pHIS)添加至节臂之羧基端且FLAG标签添加至穴臂之羧基端，以纯化体外组装之双表位分子。hu1D11v1.9 varD之轻链包括用于药物缀合之K149C突变(SEQ ID NO:145)，hu22C10v2.7之轻链(SEQ ID NO:147)亦如此。为产生hu1D11v1.9 varD K149C.节pHIS/hu22C10v2.7 K149C.穴FLAG，将hu1D11v1.9 varD节HIS重链(SEQ ID NO:149)/hu1D11v1.9varD K149C轻链(SEQ ID NO:145)及hu22C10v2.7穴FLAG重链(SEQ ID NO:156)/hu22C10v2.7 K149C轻链(SEQ ID NO:147)分开在Expi293细胞中表达，如下所述。为产生hu22C10v2.7K149C.节pHIS/hu1D11v1.9 varD K149C.穴FLAG，将hu22C10v2.7节pHIS重链(SEQ ID NO:154)/hu22C10v2.7 K149C轻链(SEQ ID NO:147)及hu1D11v1.9varD K149C.穴FLAG重链(SEQ ID NO:151)/hu1D11v1.9 varD K149C轻链(SEQ ID NO:145)分开在Expi293细胞中表达，如下所述。
双表位抗体之各臂在30mL哺乳动物瞬时表达培养物中表达为半抗体。简言之，Expi293细胞(Invitrogen,Inc.)经编码各半抗体之重链及轻链(His标记之节重链与轻链对，或FLAG标记之穴重链与轻链对)之质粒DNA转染且按照制造商方案培养。将细胞培养物上清液转移至含有0.1mL MabSelect Sure树脂(GE Healthcare Life Sciences)之新鲜管且在平台震荡器(Innova 2000,New Brunswick Scientific)上以200rpm培育过夜。在静置之后，树脂转移至滤板且用1mL PBS缓冲液pH 7.4洗涤两次以移除未结合之蛋白质及培养基组分。在3个连续洗脱步骤(洗脱总体积为约0.51mL)中用洗脱缓冲液(50mM磷酸，pH2.9)自树脂洗脱结合之半抗体，且藉由添加中和缓冲液(1M精氨酸、0.685M丁二酸盐，pH 5.0)提高pH值。在分光光度计(Nanodrop 8000,Thermo Scientific)上在280nm之波长下测量吸光度之后计算半抗体制剂之浓度。
分离之半抗体校正至相同浓度且以1:1比率混合。藉由添加1M精氨酸pH 9.5溶液，将混合物之pH值提高至8.0。添加还原之L-谷胱甘肽(于1M精氨酸中之0.5M储备液，pH9.5)，使得谷胱甘肽浓度比溶液中蛋白质之量过量200倍。此混合物在32℃下培育24小时以允许半抗体组装成双表位抗体。
使用2步过程，如上所述产生之所需双表位抗体(由节及穴半抗体构成之杂二聚体)与其他物质(未组装之半抗体及节-节或穴-穴均二聚体)分离。第一步包括使用液体处置尖端(Dynamic Devices LLC,1.25mL)，其通常填充(Glycen Corp.)0.1mL Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)。使用Lynx LM1200液体处置工作站，藉由吸液15个循环，将所有HIS标记之物质(包括未组装之节半抗体、节-节均二聚体及节-穴杂二聚体)捕捉至树脂尖端上。将树脂尖端用1mL PBS pH 7.4洗涤，且以2个连续洗脱步骤(洗脱总体积为约0.5mL)，用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠、500mM氯化钠、300mM咪唑pH 7.5)将HIS标记之物质自尖端洗脱。洗脱样本用试剂级水1:2稀释以准备用于下一步骤。
在第一阶段分离之后，将0.4mL 50％抗-FLAG抗体树脂浆液(Genentech)添加至洗脱样本且在4℃下在震荡器上以200rpm培育所得混合物3小时。藉由以1000rpm离心5分钟，树脂与上清液分离。将树脂转移至滤板且用1mL PBS pH 7.4洗涤以移除未结合之蛋白质。在3个连续洗脱中，使用总共约1.57mL洗脱缓冲液(50mM磷酸，pH 2.9)将结合之双表位抗体(杂二聚体)自树脂洗脱，且经0.11mL 20x PBS pH 11.0中和，以调整经纯化之双表位抗体溶液之pH值至6.0。
W.藉由抗-B7-H4双表位抗体之功能结合
评估经组装之抗-B7-H4双表位抗体与MX-1细胞之细胞表面上的肿瘤衍生内源性人B7-H4的结合。将双表位抗体节-h1D11v1.9 varD:穴-h22C10v2.7(“KH1D+22C”)或节-h22C10v2:穴-7h1D11v1.9varD(“KH22C+1D”)(各包含轻链K149C突变用于附着细胞毒性剂且各经Dylight-650缀合物标记)与MX-1细胞在0.01至10μg/ml范围内3倍步骤之浓度下在冰上一起培育40分钟。将细胞洗涤且在碘化丙锭存在下再悬浮，紧接着在BD FACSCaliburTM上使用4色参数进行分析。
图30展示抗-B7-H4双表位抗体结合MX-1细胞之表面上之B7-H4，亲和力与亲本单表位抗体相当。
X.双表位抗体膜染色及内化
上述Dylight-650缀合之抗体用于监测抗体与MX-1细胞之膜的结合及其随后内化至细胞。MX-1细胞以每腔室约30,000个细胞涂铺在NuncTMLab-TekTM1.0隔室硼硅酸盐盖片上。使细胞恢复且生长一天，接着用h1D11v1.9 varD、h22C10v2.7、双表位抗体节-h1D11v1.9 varD:穴-h22C10v2.7或双表位节-h22C10v2:穴-7h1D11v1.9varD染色。将细胞用15μg/ml荧光缀合之抗体(各具有每个Ab分子大约6个染料分子)在冰上染色1小时。移除含有抗体之培养基且经新鲜冰冷培养基置换，且保存在冰上，直至成像或转变至37℃。藉由共聚焦显微镜，在以下时间点捕捉影像：0小时、1小时、2小时、3小时、4小时及5小时。制备腔室载玻片用于每个时间点，以将Dylight-650抗体缀合物由于暴露于光源之光致漂白降至最低。
图31A-31B展示单表位亲本抗-B7-H4抗体之结果且图31C-31D展示双表位抗-B7-H4抗体之结果。5小时时间点展示于图31A-31D中。31C及31D中之影像展示对于双表位抗体，与亲本单表位抗体相比，细胞内更强染色及更多荧光点。
Y.藉由双表位抗-B7-H4抗体体外杀死乳房肿瘤细胞系
实质上如实例P中所述对单特异性及双表位抗-B7-H4抗体之体外效能进行评估。所有抗体均包含轻链K149C突变且缀合于vc-PAB-MMAE且药物抗体比率(DAR)为约2。针对B7-H4阴性MCF-7细胞、B7-H4阳性293hB7-H4细胞、B7-H4阳性MX-1细胞及B7-H4阳性SKBR3细胞测试抗体。
实验结果展示于图32A-32D中。如图32A中所示，单表位或双表位抗-B7-H4 ADC均对B7-H4-乳房肿瘤细胞系MCF-7无影响。相比之下，所有ADC展示针对293-hB7-H4细胞类似之效能，该等细胞在细胞表面上表达大量B7-H4拷贝(每个细胞约1.2×106个拷贝，如使用抗体h1D11v1.9varD所测量)。参见图32B。如图32C及32D中所示，在细胞膜上B7-H4含量显著较低(如使用抗体h1D11v1.9varD所测量，MX-1每个细胞约1×105个拷贝，且SKBR3每个细胞约1.9×104个拷贝)之乳房肿瘤细胞系MX-1(三重阴性)及SKBR3(Her2+)中，抗-B7-H4双表位抗体与亲本单表位抗体相比，更有效地抑制肿瘤细胞生长。
虽然不欲受任何特定理论束缚，但图31A-31D中之结果指示与单表位抗体相比，在双表位抗体下内化程度可更高，表明图32C及32D中所展示之增强之体外杀死可能为药物传递至肿瘤细胞提高的结果。
Z.合成某些接头-药物(LD)中间物用于制备表A中示例之某些抗体-药物缀合物
ADC-51之接头-药物中间物：(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-侧氧基-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮卓-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亚甲基-5-侧氧基-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮卓-10(5H)-甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(MS(ESI):875[M+H]+)可藉由WO2013/055987之程序制备。
Figure BDA0003169464670001811
在氩气氛围下在0℃(冰/丙酮)下将硫酰氯(2.35mL 1.0M于DCM中之溶液，2.35mmol)逐滴添加至经搅拌之5-硝基吡啶-2-硫醇(334mg，2.14mmol)于无水DCM(7.5mL)中之悬浮液中。反应混合物自黄色悬浮液变为黄色溶液且升温至室温，接着搅拌2小时，此后藉由真空蒸发来移除溶剂，得到黄色固体。在0℃下在氩气氛围下使固体再溶解于DCM(15mL)中且用(R)-2-巯基丙-1-醇(213mg，2.31mmol)于无水DCM(7.5mL)中之溶液逐滴处理。使反应混合物升温至室温且搅拌20小时，此时藉由LC/MS分析显示在滞留时间1.41分钟形成实质性产物(ES+)m/z 247([M+H]+，约100％相对强度)。藉由过滤移除沉淀且真空蒸发滤液，得到橙色固体，其经H2O(20mL)处理且用氢氧化铵溶液碱化。将混合物用DCM(3×25mL)萃取且经合并之萃取物用H2O(20mL)、盐水(20mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且真空蒸发，得到粗产物。藉由急骤层析法(梯度洗脱以1％增量增加：100％DCM至98:2v/v DCM/MeOH)纯化，得到呈油状之(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙-1-醇(111mg，21％产率)。
将三光气(48mg，0.16mmol)添加至搅拌之(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙-1-醇(111mg，0.45mmol)及吡啶(34μL，33.5mg，0.42mmol)于无水DCM(5mL)中之溶液中。将反应混合物在氩气氛围下搅拌45分钟，此后藉由真空蒸发来移除溶剂，得到呈黄色膜状之氯甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯。产物未经纯化或分析即用于下一步骤。
Figure BDA0003169464670001821
在室温下将氯甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(约139mg，0.45mmol)于无水DCM(5mL)中之溶液逐滴添加至经搅拌之((戊-1,5-二基双(氧基))双(6-((2R)-2-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基环戊烷-1-羰基)-4-甲氧基-3,1-伸苯基))二氨基甲酸二-叔丁酯51a(可藉由WO2013/055987中实例1之程序制备)(430mg,约0.45mmol)及吡啶(40μL，39mg，0.49mmol)于无水DCM(12mL)中之溶液中。在氩气氛围下将反应混合搅拌2.5小时，此时藉由LC/MS分析显示在滞留时间2.42分钟形成实质性产物(ES+)m/z 1226([M+H]+，约20％相对强度)、1248([M+Na]+，约60％相对强度)。将混合物用DCM(20mL)稀释且用SiO2处理，且藉由真空蒸发来移除溶剂。所得残余物藉由急骤层析法(梯度洗脱以10％增量增加：80:20v/v己烷/EtOAc至70:30v/v己烷/EtOAc)进行纯化，得到呈黄色泡沫状之(2-((S)-2-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯啶-1-羰基)-5-((5-(4-((S)-2-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-4-亚甲基吡咯啶-1-羰基)-2-甲氧基-5-((((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙氧基)羰基)氨基)苯氧基)戊基)氧基)-4-甲氧基苯基)氨基甲酸叔丁酯51b(419mg，76％产率)。(MS(ESI):1224[M+H]+)
Figure BDA0003169464670001831
将冰醋酸(24mL)添加至经搅拌的经TBS保护之51b(419mg，0.34mmol)于THF(8mL)及H2O(8mL)中之溶液中。将反应混合物搅拌16小时，此时藉由LC/MS分析显示反应完成，其中在滞留时间1.82分钟观测到所需产物(ES+)m/z 997([M+H]+，约100％相对强度)、1019([M+Na]+，约45％相对强度)。将反应混合物逐滴添加至冷却(0-5℃)饱和NaHCO3溶液(400mL)。使中性溶液升温至室温且用EtOAc(4×100mL)萃取，且将经合并之有机层用H2O(80mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且真空蒸发，得到粗产物。藉由急骤层析法(梯度洗脱以1％增量增加：100％DCM至98:2v/vDCM/MeOH)纯化，得到呈微黄色泡沫状之(2-((S)-2-(羟基甲基)-4-亚甲基吡咯啶-1-羰基)-5-((5-(4-((S)-2-(羟基甲基)-4-亚甲基吡咯啶-1-羰基)-2-甲氧基-5-((((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙氧基)羰基)氨基)苯氧基)戊基)氧基)-4-甲氧基苯基)氨基甲酸叔丁酯51c(341mg，100％产率)。(MS(ESI):995[M+H]+)
Figure BDA0003169464670001832
在氩气氛围下在-45℃(干冰/CH3CN)下将无水DMSO(107μL，188mg，1.50mmol)于无水DCM(7.5mL)中之溶液逐滴添加至经搅拌之乙二酰氯(410μL 2.0M于DCM中之溶液，0.82mmol)于无水DCM(7.5mL)中之溶液中。在-45℃下搅拌15分钟之后，将反应混合物用51c(341mg，0.34mmol)于无水DCM(15mL)中之溶液逐滴处理。在-45℃下又搅拌1小时之后，将反应混合物用TEA(476μL，342mg，3.42mmol)于无水DCM(7.5mL)中之溶液逐滴处理。经1.5小时之时间使反应混合物升温至室温且用DCM(50mL)稀释，接着用饱和NH4Cl(15mL)、饱和NaHCO3(15mL)、盐水(15mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且真空蒸发，得到粗产物。藉由急骤层析法(梯度洗脱以0.4％增量增加：100％DCM至98.4:1.6v/v DCM/MeOH)纯化，得到呈微黄色泡沫状之(11S,11aS)-11-羟基-8-((5-(((11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-10-(((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙氧基)羰基)-5-侧氧基-2,3,5,10,11,11a-六氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮卓-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-侧氧基-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮卓-10(5H)-甲酸叔丁酯51d(227mg，67％产率)：LC/MS滞留时间1.69分钟(ES+)m/z 993([M+H]+，约80％相对强度)、1015([M+Na]+，约20％相对强度)。
在0℃(冰/丙酮)下将95:5v/v TFA/H2O溶液(4mL)添加至51d(216mg，0.22mmol)之粗样本中。在0℃下搅拌30分钟之后，反应可如藉由LC/MS判断，认为完成，所需产物峰在滞留时间1.60分钟下(ES+)m/z 875([M+H]+，约100％相对强度)。保持反应混合物为冷的，且逐滴添加至冷却之饱和NaHCO3水溶液(100mL)中。将混合物用DCM(3×30mL)萃取且经合并之有机层用盐水(50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤且真空蒸发，得到粗产物。藉由急骤层析法(梯度洗脱以0.4％增量增加：100％CHCl3至98.4:1.6v/v CHCl3/MeOH)纯化，得到呈黄色泡沫状之LD-51(127mg，66％产率)：LC/MS(操作15分钟)，滞留时间6.18分钟(ES+)m/z 875([M+H]+，约100％相对强度)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.21(s,1H),8.30(d,1H,J＝8.8Hz),7.69(d,1H,J＝4.5Hz),7.62(d,1H,J＝8.9Hz),7.49(s,1H),7.25(s,1H),6.79(s,1H),6.74(s,1H),5.58(dd,1H,J＝4.4,9.8Hz),5.22-5.10(m,4H),4.43(d,1H,J＝3.7Hz),4.33-4.25(m,4H),4.15-3.98(m,5H),3.95-3.80(m,7H),3.68-3.59(m,1H),3.20-3.07(m,2H),2.99-2.87(m,2H),2.76-2.68(m,2H),1.99-1.83(m,4H),1.72-1.57(m,2H),1.19(d,3H,J＝6.6Hz)。
ADC-52之接头-药物中间物：(2,5-双((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-3-侧氧基丙-1-烯-1-基)苯基)氨基甲酸2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(MS(ESI):1098[M+H]+)可藉由WO2015/023355LD-53之程序制备。二氢磷酸(S)-1-(氯甲基)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦酰氧基)-1,2-二氢-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-3-侧氧基丙-1-烯-1-基)-2-(2-(2-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)苯基)丙烯酰基)-2,3-二氢-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯(MS(ESI):994[M+H]+)可藉由WO 2015/023355之程序制备。
ADC-54之接头-药物中间物：(11S,11aS)-11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-侧氧基-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮卓-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亚甲基-5-侧氧基-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮卓-10(5H)-甲酸(R)-2-((3-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(MS(ESI):876[M+H]+)可藉由WO 2013/055987之程序制备。
ADC-55之接头-药物中间物：双(甲基氨基甲酸)4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二侧氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苯甲酯(2-侧氧基-2-((2S,4S)-2,5,12-三羟基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-哌喃并[4',3':4,5]恶唑并[2,3-c][1,4]恶嗪-3-基)氧基)-6,11-二侧氧基-1,2,3,4,6,11-六氢并四苯-2-基)乙基)乙-1,2-二基酯。
按照US 8389697之实例3，向PNU-159682(15.3mg，0.02038mmol)(其可如WO 1998/02446及US 8470984实例1中报导制备)于3ml甲醇及2ml H2O中之溶液中添加NaIO4(5.1mg，0.0238mmol)于1ml H2O中之溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时，直至无法检测到起始物质(TLC及HPLC分析)。溶剂减压移除，且粗红色固体(2S,4S)-2,5,12-三羟基-7-甲氧基-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-哌喃并[4',3':4,5][1,3]恶唑并[2,3-c][1,4]恶嗪-3-基]氧基}-6,11-二侧氧基-1,2,3,4,6,11-六氢并四苯-2-甲酸55a(MS(ESI):628[M+H]+)藉由WO 2010/009124之程序转化成LD-55(MS(ESI):1355[M+H]+)。
Figure BDA0003169464670001851
ADC-56之接头-药物中间物：(2S,4S)-2,5,12-三羟基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-哌喃并[4',3':4,5]恶唑并[2,3-c][1,4]恶嗪-3-基)氧基)-N-(2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)乙基)-6,11-二侧氧基-1,2,3,4,6,11-六氢并四苯-2-甲酰胺(MS(ESI):842[M+H]+)可藉由WO2013/055987之程序制备。
ADC-57之接头-药物中间物：(2S,4S)-2,5,12-三羟基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-哌喃并[4',3':4,5]恶唑并[2,3-c][1,4]恶嗪-3-基)氧基)-N-(2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙基)-6,11-二侧氧基-1,2,3,4,6,11-六氢并四苯-2-甲酰胺(MS(ESI):856[M+H]+)可藉由US8389697之程序制备。
ADC-58之接头-药物中间物：(2S,4S)-2,5,12-三羟基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氢-1H-哌喃并[4',3':4,5]恶唑并[2,3-c][1,4]恶嗪-3-基)氧基)-N-(2-甲基-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙基)-6,11-二侧氧基-1,2,3,4,6,11-六氢并四苯-2-甲酰胺(MS(ESI):870[M+H]+)可藉由US8389697之程序制备。
虽然出于清楚了解之目的，前述本发明已藉助于说明及实例详细地描述，但描述及实例不应解释为限制本发明之范畴。本文引用的所有专利及科学文献之揭示内容以全文引用的方式明确并入本文中。
序列表
Figure BDA0003169464670001871
Figure BDA0003169464670001881
Figure BDA0003169464670001891
Figure BDA0003169464670001901
Figure BDA0003169464670001911
Figure BDA0003169464670001921
Figure BDA0003169464670001931
Figure BDA0003169464670001941
Figure BDA0003169464670001951
Figure BDA0003169464670001961
Figure BDA0003169464670001971
Figure BDA0003169464670001981
Figure BDA0003169464670001991
Figure BDA0003169464670002001
Figure BDA0003169464670002011
Figure BDA0003169464670002021
Figure BDA0003169464670002031
Figure BDA0003169464670002041
Figure BDA0003169464670002051
Figure BDA0003169464670002061
序列表
<110> 基因泰克公司（GENENTECH, INC.）
<120> 抗-B7-H4抗体及免疫缀合物
<130> 01146-0038-00PCT
<150> US 62/049,701
<151> 2014-09-12
<160> 166
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(108)
<223> hukI
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
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<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(112)
<223> huVH1
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 3
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<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(108)
<223> mu1D11轻链可变区
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Cys Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr
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Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<212> PRT
<213> 小鼠
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<221> misc_feature
<222> (1)..(121)
<223> mu1D11重链可变区
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Phe Glu Trp Ile
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Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
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Gln Gly Thr Ser Ile Thr Val Ser Ser
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<210> 5
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<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> mu1D11 HVR H1
<400> 5
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His
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<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> mu1D11 HVR H2
<400> 6
Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
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Gly
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<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<223> mu1D11 HVR H3
<400> 7
Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(11)
<223> mu1D11 HVR L1
<400> 8
Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 9
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<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> mu1D11 HVR L2
<400> 9
Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> mu1D11 HVR L3
<400> 10
Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr Ala
1 5
<210> 11
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(113)
<223> mu32D6轻链可变区
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ile Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser
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Gly Ser Gln Arg Asn Tyr Leu Thr Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Arg
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Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ile Ser Ser Val Gln Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Glu
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Lys
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(120)
<223> mu32D6重链可变区
<400> 12
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Asp Pro Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Ala Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> mu32D6 HVR H1
<400> 13
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> mu32D6 HVR H2
<400> 14
Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Asp Pro Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(11)
<223> mu32D6 HVR H3
<400> 15
Val Leu Phe Tyr Tyr Gly Ser Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> mu32D6 HVR L1
<400> 16
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asp Ser Gly Ser Gln Arg Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> mu32D6 HVR L2
<400> 17
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> mu32D6 HVR L3
<400> 18
Gln Asn Asp Tyr Ser Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(107)
<223> mu9B9轻链可变区
<400> 19
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Asp
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Val Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Met Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(121)
<223> mu9B9重链可变区
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Ser Ile Thr Thr Tyr Asn Ala Lys Phe
50 55 60
Lys Val Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Phe Gly Ser Ser Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> mu9B9 HVR H1
<400> 21
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Ile Glu
1 5 10
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> mu9B9 HVR H2
<400> 22
Glu Ile Leu Pro Gly Thr Ser Ile Thr Thr Tyr Asn Ala Lys Phe Lys
1 5 10 15
Val
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> mu9B9 HVR H3
<400> 23
Ala Arg Tyr Tyr Phe Gly Ser Ser Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> mu9B9 HVR L1
<400> 24
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> mu9B9 HVR L2
<400> 25
Gly Thr Asn Asn Arg Val Pro
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> mu9B9 HVR L3
<400> 26
Ala Leu Trp Tyr Asn Asn His Trp Val
1 5
<210> 27
<211> 106
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> mu22C10轻链可变区
<400> 27
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Gly Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(116)
<223> mu22C10重链可变区
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Ile Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> mu22C10 HVR H1
<400> 29
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp Ile His
1 5 10
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> mu22C10 HVR H2
<400> 30
Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> mu22C10 HVR H3
<400> 31
Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> mu22C10 HVR L1
<400> 32
Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> mu22C10 HVR L2
<400> 33
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(9)
<223> mu22C10 HVR L3
<400> 34
His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 35
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.7轻链可变区
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 36
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.6重链可变区; hu1D11.v1.7重链可变区
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.8重链可变区
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 38
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 链可变区
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HVR H1
<400> 39
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HVR H2
<400> 40
Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HVR H3
<400> 41
Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HVR L1
<400> 42
Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HVR L2
<400> 43
Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HVR L3
<400> 44
Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr Ala
1 5
<210> 45
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11轻链(LC)框架1 (FR1)
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.1 LC FR2
<400> 46
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 47
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 LC FR3
<400> 47
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 LC FR4
<400> 48
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 49
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11重链(HC)框架1 (FR1)
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HC FR2
<400> 50
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HC FR3
<400> 51
Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 52
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HC FR3
<400> 52
Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HC FR3
<400> 53
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HC FR4
<400> 54
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10轻链可变区
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7重链可变区; hu22C10.v2.8重链可变区
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 57
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.8轻链可变区
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HVR H1
<400> 58
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe Trp Ile His
1 5 10
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HVR H2
<400> 59
Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HVR H3
<400> 60
Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr
1 5
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HVR L1
<400> 61
Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HVR L2
<400> 62
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HVR L3
<400> 63
His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 64
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 LC FR1
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 LC FR2
<400> 65
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.8 LC FR2
<400> 66
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 67
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 LC FR3
<400> 67
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 LC FR4
<400> 68
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 69
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HC FR1
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 70
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HC FR2
<400> 70
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 71
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HC FR3
<400> 71
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HC FR4
<400> 72
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 73
<211> 282
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(282)
<223> 人B7_H4前体; 信号序列 = 氨基酸1-28
<400> 73
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu
260 265 270
Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys
275 280
<210> 74
<211> 254
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(254)
<223> 人B7-H4成熟的, 无信号序列; 氨基酸29-282
<400> 74
Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val
35 40 45
Leu Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu
50 55 60
Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
130 135 140
Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile
225 230 235 240
Ser Trp Ala Leu Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys
245 250
<210> 75
<211> 282
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Cynomolgus monkey）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(282)
<223> 食蟹猴B7-H4前体; 信号序列 = 氨基酸1-28
<400> 75
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile
1 5 10 15
Phe Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Ile Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Leu Ala Ile Ser Trp Ala Leu
260 265 270
Leu Pro Leu Ala Pro Tyr Leu Met Leu Lys
275 280
<210> 76
<211> 254
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Cynomolgus monkey）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(254)
<223> 食蟹猴B7-H4成熟的, 无信号序列; 氨基酸29-282
<400> 76
Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val
35 40 45
Ile Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu
50 55 60
Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
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Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Leu Ala Ile
225 230 235 240
Ser Trp Ala Leu Leu Pro Leu Ala Pro Tyr Leu Met Leu Lys
245 250
<210> 77
<211> 282
<212> PRT
<213> 大鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(282)
<223> 大鼠B7-H4前体; 信号序列 = 氨基酸1-28
<400> 77
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Ile Phe Trp Ser Ile Ile Asn Val Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Val Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile Lys Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln Gln His Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Val Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Thr Cys Tyr Ile His Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ile Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Gly Pro Ser Pro Cys Val Ser Ser Val Ser Ala Ala Gly Trp Ala Leu
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Cys Cys Leu Met Leu Arg
275 280
<210> 78
<211> 254
<212> PRT
<213> 大鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(254)
<223> 大鼠B7-H4成熟的, 无信号序列; 氨基酸29-282
<400> 78
Phe Gly Ile Ser Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile
35 40 45
Lys Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln
50 55 60
Gln His Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Val Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Tyr Ile His Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ile Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
130 135 140
Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Glu
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Gly Pro Ser Pro Cys Val Ser Ser Val Ser Ala Ala
225 230 235 240
Gly Trp Ala Leu Leu Ser Leu Ser Cys Cys Leu Met Leu Arg
245 250
<210> 79
<211> 283
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(283)
<223> 小鼠B7-H4前体; 信号序列 = 氨基酸1-28
<400> 79
Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Ile Phe Trp Ser Ile Ile Asn Ile Ile
1 5 10 15
Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser
20 25 30
Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser Ala Gly Asn Ile
35 40 45
Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu
50 55 60
Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile Lys Gly Leu Val
65 70 75 80
His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln Gln His Glu Met
85 90 95
Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Val Val Gly Asn
100 105 110
Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr
115 120 125
Thr Cys Tyr Ile Arg Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu
130 135 140
Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ile Asn Val Asp Tyr Asn
145 150 155 160
Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln
165 170 175
Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser
180 185 190
Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met
195 200 205
Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser
210 215 220
Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val
225 230 235 240
Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Gln Leu Leu Asn Ser
245 250 255
Gly Pro Ser Pro Cys Val Phe Ser Ser Ala Phe Ala Ala Gly Trp Ala
260 265 270
Leu Leu Ser Leu Ser Cys Cys Leu Met Leu Arg
275 280
<210> 80
<211> 255
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(255)
<223> 小鼠B7-H4成熟的, 无信号序列; 氨基酸29-283
<400> 80
Phe Gly Ile Ser Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile
35 40 45
Lys Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln
50 55 60
Gln His Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Val Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Thr Cys Tyr Ile Arg Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ile Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
130 135 140
Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Gln
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Gly Pro Ser Pro Cys Val Phe Ser Ser Ala Phe Ala
225 230 235 240
Ala Gly Trp Ala Leu Leu Ser Leu Ser Cys Cys Leu Met Leu Arg
245 250 255
<210> 81
<211> 278
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(278)
<223> 黑猩猩B7-H4前体; 信号序列 = 氨基酸1-24
<400> 81
Met Lys Pro Leu Thr Ser Arg Ile Ile Ser Ile Ile Ile Ile Leu Ala
1 5 10 15
Gly Ala Ile Arg Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser
20 25 30
Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly
35 40 45
Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val
50 55 60
Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val His Glu Phe Lys
65 70 75 80
Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg
100 105 110
Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile
115 120 125
Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly
130 135 140
Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu
145 150 155 160
Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val
165 170 175
Trp Ala Ser Gln Ile Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn
180 185 190
Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser
195 200 205
Val Leu Tyr Asn Ala Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu
210 215 220
Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu
225 230 235 240
Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser Leu
245 250 255
Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu Leu Pro Leu Ser
260 265 270
Pro Tyr Leu Met Leu Lys
275
<210> 82
<211> 254
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(254)
<223> 黑猩猩B7-H4成熟的, 无信号序列; 氨基酸25-278
<400> 82
Phe Gly Ile Ser Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Ala Gly Asn Ile Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro
20 25 30
Asp Ile Lys Leu Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val
35 40 45
Leu Gly Leu Val His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu
50 55 60
Gln Asp Glu Met Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val
65 70 75 80
Ile Val Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp
85 90 95
Ala Gly Thr Tyr Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn
100 105 110
Ala Asn Leu Glu Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn
115 120 125
Val Asp Tyr Asn Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg
130 135 140
Trp Phe Pro Gln Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Ile Asp Gln Gly
145 150 155 160
Ala Asn Phe Ser Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu
165 170 175
Asn Val Thr Met Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Ala Thr Ile Asn
180 185 190
Asn Thr Tyr Ser Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly
195 200 205
Asp Ile Lys Val Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln
210 215 220
Leu Leu Asn Ser Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile
225 230 235 240
Ser Trp Ala Leu Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys
245 250
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 LC FR2
<400> 83
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1 5 10 15
<210> 84
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v2 LC FR3
<400> 84
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 85
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 LC FR3
<400> 85
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 86
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.2 LC FR3
<400> 86
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 87
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.3 LC FR3
<400> 87
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 88
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11 HC FR3
<400> 88
Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 89
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v3 HC FR3
<400> 89
Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 90
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v4 HC FR3
<400> 90
Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 91
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.4 HC FR3
<400> 91
Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
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Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 92
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.5 HC FR3
<400> 92
Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 93
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11轻链可变区
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 94
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.3轻链可变区
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 95
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.2轻链可变区
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 96
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.1轻链可变区
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 97
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v2轻链可变区
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 98
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v3轻链可变区; hu1D11.v4轻链可变区
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asn Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 99
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.5重链可变区
<400> 99
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.4重链可变区
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 101
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11重链可变区
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v3重链可变区
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 103
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v4重链可变区
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 104
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v1轻链可变区
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 105
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.1轻链可变区
<400> 105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 106
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.2轻链可变区; hu22C10.v2.8轻链可变区
<400> 106
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.6重链可变区
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 108
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.5重链可变区
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 109
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.4重链可变区
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 110
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.3重链可变区
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 111
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10重链可变区
<400> 111
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 112
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v3重链可变区
<400> 112
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 113
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v4重链可变区
<400> 113
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 114
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v5重链可变区
<400> 114
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.1 LC FR2
<400> 115
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 116
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.2 LC FR2
<400> 116
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 117
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v1 LC FR3
<400> 117
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 118
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.6 HC FR3
<400> 118
Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 119
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.5 HC FR3
<400> 119
Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
20 25 30
<210> 120
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.4 HC FR3
<400> 120
Arg Ala Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
20 25 30
<210> 121
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.3 HC FR3
<400> 121
Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
20 25 30
<210> 122
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10 HC FR3
<400> 122
Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
20 25 30
<210> 123
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v3 HC FR3
<400> 123
Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
20 25 30
<210> 124
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v4 HC FR3
<400> 124
Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
20 25 30
<210> 125
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v5 HC FR3
<400> 125
Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
20 25 30
<210> 126
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2轻链可变区
<400> 126
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 127
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2重链可变区
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2 HVR H3
<400> 128
Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser
1 5 10
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2 HVR L3
<400> 129
Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr Ala
1 5
<210> 130
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2 IgG1重链
<400> 130
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 131
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varD IgG1重链
<400> 131
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 132
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2 IgG1 A118C重链
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 133
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varD IgG1 A118C重链
<400> 133
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asp Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 134
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2, varD IgK轻链
<400> 134
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 135
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: IgG1 S400C重链恒定区
<400> 135
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Cys Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 136
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: IgK V205C轻链恒定区
<400> 136
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 137
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 IgG1 A118C重链
<400> 137
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Cys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 138
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 IgK轻链
<400> 138
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 139
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: IgK K149C轻链恒定区
<400> 139
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 140
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2, varD IgK K149C轻链前体
<400> 140
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe
35 40 45
Asn Lys Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp
100 105 110
Leu Leu Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 141
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2, varD IgK V205C轻链前体
<400> 141
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe
35 40 45
Asn Lys Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp
100 105 110
Leu Leu Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Cys
210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 142
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 IgK K149C轻链前体
<400> 142
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile
35 40 45
Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly
50 55 60
Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
85 90 95
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr
100 105 110
Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 143
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 IgK V205C轻链前体
<400> 143
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile
35 40 45
Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly
50 55 60
Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
85 90 95
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr
100 105 110
Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
145 150 155 160
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 144
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 IgG1重链
<400> 144
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 145
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2, varD IgK K149C轻链
<400> 145
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 146
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varC2, varD IgK V205C轻链
<400> 146
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Asp Leu Leu Tyr
85 90 95
Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 147
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 IgK K149C轻链
<400> 147
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Cys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 148
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 IgK V205C轻链
<400> 148
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Gly Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala His Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Arg Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 149
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varD重链 节 pHIS
<400> 149
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly His His His His His His
450 455
<210> 150
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 例示性hu1D11.v1.9 varD重链 节 pHIS编码序列
<400> 150
gaggttcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaaaaaac caggggcctc agtgaaagtg 60
tcctgtaaag cttctggata caccttcact agctactgga taggttgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtcagg gcctggaatg gatcggcgat atttaccctg gaggtggtta tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggccg tgttactatc acccgtgaca cctccaccag cacagcctac 240
ctagaactga gcagcttaag aagcgaggac actgccgtct attattgcgc gcgtctcgct 300
ggtagtagtt acagaggggc tatggactcc tggggtcaag gaaccctggt caccgtctcc 360
tcggcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg actgtgccct ctagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggaa 1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgtgg tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt ggcggtggac atcatcacca tcaccactga 1380
<210> 151
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varD重链 穴 FLAG
<400> 151
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
450 455 460
<210> 152
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 例示性hu1D11.v1.9 varD重链 穴 FLAG编码序列
<400> 152
gaggttcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaaaaaac caggggcctc agtgaaagtg 60
tcctgtaaag cttctggata caccttcact agctactgga taggttgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtcagg gcctggaatg gatcggcgat atttaccctg gaggtggtta tactaactac 180
aatgagaagt tcaagggccg tgttactatc acccgtgaca cctccaccag cacagcctac 240
ctagaactga gcagcttaag aagcgaggac actgccgtct attattgcgc gcgtctcgct 300
ggtagtagtt acagaggggc tatggactcc tggggtcaag gaaccctggt caccgtctcc 360
tcggcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg actgtgccct ctagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggaa 1080
gagatgacca agaaccaggt cagcctgagc tgcgcggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt ggcggtggcg attataagga cgatgacgat 1380
aaatga 1386
<210> 153
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 例示性hu1D11.v1.9 varD Igk K149C轻链编码序列
<400> 153
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgca aggcaagcca aggctttaac aagtatgtag cttggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaagcttct gatttactat acatctacat tacagccagg agtcccttct 180
cgcttctctg gtagcggttc cgggagagat tatactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtctacag tatggtgacc ttctgtacgc gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggtgcgtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 645
<210> 154
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 重链 节 pHIS
<400> 154
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly
435 440 445
His His His His His His
450
<210> 155
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 例示性hu22C10.v2.7 重链 节 pHIS编码序列
<400> 155
gaggttcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaaaaaac caggggcctc agtgaaagtg 60
tcctgtaaag cttctggcta cacgttcacc aacttctgga tacactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtcagg gcctggaatg gatcggcgag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180
aatcaaaagt tcaagggccg tgttactatc acccgtgaca cctccaccag cacagcctac 240
ctagaactga gcagcttaag aagcgaggac actgccgtct attattgcgc tagagagatt 300
actacggtgg actactgggg tcaaggaacc ctggtcaccg tctcctcggc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgactgt gccctctagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaagagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggtggcgg tggacatcat caccatcacc actga 1365
<210> 156
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 重链 穴 FLAG
<400> 156
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
450 455
<210> 157
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 例示性hu22C10.v2.7 重链 穴 FLAG编码序列
<400> 157
gaggttcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaaaaaac caggggcctc agtgaaagtg 60
tcctgtaaag cttctggcta cacgttcacc aacttctgga tacactgggt gcgtcaggcc 120
ccgggtcagg gcctggaatg gatcggcgag attgatcctt ctgatagtta tactaactac 180
aatcaaaagt tcaagggccg tgttactatc acccgtgaca cctccaccag cacagcctac 240
ctagaactga gcagcttaag aagcgaggac actgccgtct attattgcgc tagagagatt 300
actacggtgg actactgggg tcaaggaacc ctggtcaccg tctcctcggc ctccaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgactgt gccctctagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaagagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgagctgcgc ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctcgtcag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggtggcgg tggcgattat aaggacgatg acgataaatg a 1371
<210> 158
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: 例示性hu22C10.v2.7 Igk K149C轻链编码序列
<400> 158
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgca gtgccacttc aagtataagt tacatgcact ggtatcaaca gaaaccagga 120
aaagctccga agggatggat ttatgacaca tccaaactgg ctcatggagt cccttctcgc 180
ttctctggta gcggttccgg gacggatttc actctgacca tcagcagtct gcagccggaa 240
gacttcgcaa cttattactg tcatcagcgg agaagttacc cattcacgtt cggacagggt 300
accaaggtgg agatcaaacg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gtgcgtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt aa 642
<210> 159
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varD重链 节
<400> 159
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 160
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varD重链 穴
<400> 160
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 161
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 重链 节
<400> 161
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 162
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7 重链 穴
<400> 162
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 163
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varD重链 节
<400> 163
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 164
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu1D11.v1.9 varD重链 穴
<400> 164
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Gly Ser Ser Tyr Arg Gly Ala Met Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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355 360 365
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Pro Gly
450
<210> 165
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7重链 节
<400> 165
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 166
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: hu22C10.v2.7重链 穴
<400> 166
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ile Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
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370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445

Claims (10)

1.一种结合B7-H4之分离抗体，其中该抗体包含(a)SEQ ID NO:132之重链序列及SEQID NO:134之轻链序列；或(b)SEQ ID NO:133之重链序列及SEQ ID NO:134之轻链序列；或(c)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:140之轻链序列；或(d)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:141之轻链序列；或(e)SEQ ID NO:131之重链序列及SEQ ID NO:140之轻链序列；或(f)SEQ ID NO:131之重链序列及141之轻链序列；或(g)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:142之轻链序列；或(h)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:143之轻链序列；或(i)SEQ ID NO:137之重链序列及SEQ ID NO:138之轻链序列；或(j)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；或(d)SEQ ID NO:130之重链序列及SEQ ID NO:146之轻链序列；或(e)SEQ ID NO:131之重链序列及SEQ ID NO:145之轻链序列；或(f)SEQID NO:131之重链序列及146之轻链序列；或(g)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:147之轻链序列；或(h)SEQ ID NO:144之重链序列及SEQ ID NO:148之轻链序列。
2.一种双表位抗体，其包含第一半抗体及第二半抗体，其中该第一半抗体包含结合B7-H4之第一表位之第一VH/VL单元，且其中该第二半抗体包含结合B7-H4之第二表位之第二VH/VL单元。
3.如权利要求2之双表位抗体，其中该第一半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3；或
(b)SEQ ID NO:56之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列。
4.如权利要求2之双表位抗体，其中该第二半抗体包含：
(a)(i)包含SEQ ID NO:58之氨基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:59之氨基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO:60之氨基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO:61之氨基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO:62之氨基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO:63之氨基酸序列之HVR-L3；或
(b)SEQ ID NO:56之VH序列及SEQ ID NO:55之VL序列。
5.一种分离核酸，其编码：
a)如权利要求1之抗体；或
b)如权利要求2至4中任一项之双表位抗体。
6.一种宿主细胞，其包含如权利要求5之核酸。
7.一种产生抗体之方法，其包含培养如权利要求6之宿主细胞，从而产生该抗体或半抗体。
8.一种免疫缀合物，其包含如权利要求1至4中任一项之抗体及细胞毒性剂。
9.一种药物配制剂，其包含如权利要求8之免疫缀合物及药学可接受载剂。
10.一种治疗患有B7-H4阳性癌症之个体之方法，该方法包含向该个体施用有效量之如权利要求8之免疫缀合物。
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