KR101738203B1 - 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 N10 위치를 통해서 연결된 PBD 분자인 컨주게이트 및 컨주게이트를 제조하기 위한 화합물과 함께 암을 포함한 증식성 질환을 치료하기 위한 컨주게이트의 용도에 관한 것이다.

Description

피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트{PYRROLOBENZODIAZEPINES AND CONJUGATES THEREOF}
본 발명은 세포 결합제에 대한 링커의 형태인 피롤로벤조디아제핀 (PBDs), 특히 불안정한 N10 보호 그룹을 갖는 피롤로벤조디아제핀에 관한 것이다.
피롤로벤조디아제핀
일부의 피롤로벤조디아제핀 (PBDs)은 DNA의 특이적 서열을 인식하고, 그에 결합하는 능력을 가지며; 바람직한 서열은 PuGPu이다. 최초의 PBD 항종양 항생제인 안트라마이신은 1965 년에 발견되었다 [Lei㎎ruber, et al ., J. Am . Chem. Soc ., 87, 5793-5795 (1965); Lei㎎ruber, et al ., J. Am . Chem . Soc ., 87, 5791-5793 (1965)]. 그때 이후로, 다수의 천연적으로 존재하는 PBDs가 보고되었으며, 10 개 이상의 합성경로는 다양한 유사체를 개발하였다 [Thurston, et al ., Chem . Rev . 1994, 433-465 (1994)]. 패밀리 구성원에는 아베이마이신 (abbeymycin) [Hochlowski, et al., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)], 치카마이신 (chicamycin) [Konishi, et al., J. Antibiotics , 37, 200-206 (1984)], DC-81 [일본 특허 58-180 487; Thurston, et al., Chem . Brit ., 26, 767-772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)], 마제트라마이신 (mazethramycin) [Kuminoto, et al., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)], 네오트라마이신 (neothramycins) A 및 B [Takeuchi, et al., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)], 포로트라마이신 (porothramycin) [Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)], 프로트라카르신 (prothracarcin) [Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org . Chem ., 52, 91-97 (1987)], 시바노마이신 (sibanomicin) (DC-102) [Hara, et al ., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al ., J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988)], 시비로마이신 (sibiromycin) [Leber, et al ., J. Am . Chem . Soc ., 110, 2992-2993 (1988)] 및 토마마이신 (tomamycin) [Arima, et al ., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)]이 포함된다. PBDs는 하기의 일반 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00001
이들은 치환체의 수, 형태 및 위치에서, 이들의 방향족 A 환 및 피롤로 C 환 둘 다에서, 및 C 환의 포화도에 있어서 상이하다. B-환에는 DNA를 알킬화하는데 책임이 있는 친전자성 중심인 N10-C11 위치에 이민 (N=C), 카비놀아민 (NH-CH(OH)), 또는 카비놀아민 메틸 에테르 (NH-CH(OMe))가 존재한다. 공지된 천연 생성물은 모두 C 환으로부터 A 환 쪽으로 볼 때 오른손 쪽으로의 트위스트를 갖는 생성물을 제공하는 것으로 키랄 C11a 위치에서 (S)-배열을 갖는다. 이것은 이들에게, 결합부위에서 적합한 스너그 (sug)를 유도하도록 B-형태 DNA의 작은 그루브 (minor groove)를 갖는 이소헬리시티 (isohelicity)를 위해서 적절한 삼차원 형상을 제공한다 [Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res ., 19, 230-237 (1986)]. 작은 그루브 내에 부가물 (adduct)을 형성하는 그들의 능력은 이들이 DNA 처리 (processing)를 저해하고, 따라서 이들의 용도가 항종양제가 될 수 있도록 한다.
본 발명자들은 이전에 다음과 같이 C2 아릴 치환체를 보유하는 다이머성 PBD 화합물을 WO 2005/085251에 개시하였다:
Figure 112012086532911-pct00002
이들 화합물은 매우 유용한 세포독성제인 것으로 나타났다.
특히 유리한 피롤로벤조디아제핀 화합물은 그레그손 (Gregson) 등 [Chem. Commun . 1999, 797-798]에 의해서 화합물 1로서, 및 그레그손 등 [J. Med. Chem . 2001, 44, 1161-1174]에 의해서 화합물 4a로서 기술되었다. SJG-136으로 또한 공지되어 있는 이 화합물은 다음과 같이 나타낸다:
Figure 112012086532911-pct00003
본 발명자들은 이전에, PBD 화합물이 이들을 N10 위치에서 생체내 제거가능한 질소 보호 그룹에 의해서 보호함으로써 프로드럭으로 사용될 수 있음을 개시하였다 [WO 00/12507]. 이들 보호 그룹의 대부분은 카바메이트이며, 예를 들어, 다음과 같은 구조의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00004
여기에서 별표 (*)는 PBD의 N10 원자에 대한 부착점을 나타낸다.
본 발명자들은 또한, N10 위치에서 질소 카바메이트 보호 그룹을 갖는 PBD 화합물의 제조를 기술하였다 [WO 2005/023814]. 보호 그룹은 PBD 부위의 N10 위치로부터 N10-C11 이민 결합을 남기고 제거할 수 있다. 효소의 작용에 의해서 분해될 수 있는 그룹을 포함한 광범한 보호 그룹이 기술되었다.
WO 2007/085930은 항체와 같은 세포 결합제에 대한 연결을 위한 링커 그룹을 갖는 다이머 PBD 화합물의 제조를 기술하였다. 링커는 다이머의 모노머 PBD 유니트를 연결시키는 브릿지 (bridge)로 존재한다.
항체-약물 컨주게이트
항체 요법은 암, 면역학적 및 혈관신생성 장애가 있는 환자의 표적화된 치료를 위해서 확립되었다 [Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357]. 세포독성제 또는 세포증식 억제제, 즉 암의 치료 시에 종양세포를 죽이거나 억제하는 약물의 국소 송달을 위한 항체-약물 컨주게이트 (ADC), 즉 면역컨주게이트의 사용은 종양에 대한 약물 부위의 송달 및 그 안에서의 세포내 축적을 표적으로 하는 반면에 이들 비컨주게이트된 약제의 전신 투여는 제거되어야 할 것으로 생각되는 종양세포뿐만 아니라 정상세포에 대해서도 허용할 수 없는 레벨이 독성을 제공할 수 있다 [Xie et al (2006) Expert . Opin . Biol. Ther . 6(3):281-291; Kovtun et al (2006) Cancer Res . 66(6):3214-3121; Law et al (2006) Cancer Res . 66(4):2328-2337; Wu et al (2005) Nature Biotech . 23(9):1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin . in Pharmacol . 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin . Ther . Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol . Immunother . 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614].
이에 의해서 최소 독성을 갖는 최대 효능이 생각된다. ADC를 디자인하고 정제하기 위한 노력은 모노클로날 항체 (mAbs)의 선택성뿐만 아니라 약물의 작용 기전, 약물-연결, 약물/항체 비율 (부하), 및 약물-방출 특성에 초점을 맞추었다 [Junutula, et al ., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299-307; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson et al (2006) Cancer Res . 66(8):1-8; Sanderson et al (2005) Clin . Cancer Res . 11:843-852; Jeffrey et al (2005) J. Med . Chem . 48:1344-1358; Hamblett et al (2004) Clin . Cancer Res . 10:7063-7070]. 약물 부위는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 기전에 의한 그들의 세포독성 및 세포증식 억제 효과를 제공할 수 있다. 일부의 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 컨주게이트되는 경우에 불활성이되거나 덜 활성이 되는 경향이 있다.
본 발명자들은 세포 결합제와의 PBD 컨주게이트, 특히 PBD 항체 컨주게이트를 형성시키는 새로운 접근방법을 개발하였다.
발명의 요약
일반적 관점에서, 본 발명은 링커를 경유하여 N10 위치를 통해서 세포 결합제에 연결된 PBD 화합물을 포함하는 컨주게이트를 제공한다. 링커는 불안정한 링커이며, 효소 불안정성 링커일 수 있다. 세포 결합제는 바람직하게는 항체이다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 스페이서 (spacer)에 연결된 세포 결합제, 트리거 (trigger)에 연결된 스페이서, 자체-희생적 (self-immolative) 링커에 연결된 트리거, 및 PBD 화합물의 N10 위치에 연결된 자체-희생적 링커를 포함한다.
첫 번째 관점에서, 본 발명은 하기 화학식 A의 신규한 컨주게이트 화합물 및 그의 염 및 용매화물을 제공한다:
Figure 112012086532911-pct00005
상기 식에서,
점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중결합의 임의의 존재를 나타내며;
R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 독립적으로 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로로부터 더 선택되며;
여기에서 RD는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R6 및 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R8은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R10은 세포 결합제에 연결된 링커이고;
Q는 O, S 및 NH로부터 독립적으로 선택되며;
R11은 H 또는 R이거나, Q가 O인 경우에는 SO3M이고, 여기에서 M은 금속 양이온이며;
R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬, C3 -20　헤테로사이클릴 및 C5-20 아릴 그룹으로부터 선택되고, 임의로 그룹 NRR'와 관련하여서 R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클릭 환을 형성하거나;
R6 내지 R9에 인접한 그룹의 임의의 쌍은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하며, 여기에서 p는 1 또는 2이거나,
여기에서 화합물은 각각의 모노머가 화학식 A이거나, 하나의 모노머는 화학식 A이고, 다른 모노머는 하기 화학식 B인 다이머이고:
Figure 112012086532911-pct00006
여기에서 R2, R6, R9, R7, 및 R8은 화학식 A의 화합물에 따라 정의된 바와 같으며, 각각의 모노머의 R7 그룹 또는 R8 그룹은 함께 모노머를 연결하는 화학식 -X-R"-X-를 갖는 다이머 브릿지를 형성하고;
여기에서 R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속(interrupt)될 수 있고;
각각의 X는 O, S 또는 N(H)이거나;
여기에서 화합물은 각각의 모노머가 화학식 A인 다이머이며, 여기에서 모노머 중의 하나에서 그룹 R10은 캡핑 (capping) 그룹 RC이거나, 세포 결합제에 연결된 링커이다. 의심할 여지를 없애기 위해서, 세포 결합제는 그룹 R10의 부분이다.
본 발명은 또한, 표적 위치에서 하기 화학식 C의 화합물 및 그의 염 및 용매화물을 제공하기 위한 컨주게이트의 용도에 관한 것이다:
Figure 112012086532911-pct00007
상기 식에서,
점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중결합의 임의의 존재를 나타내며;
R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 독립적으로 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로로부터 더 선택되며;
여기에서 RD는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R6 및 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R8은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬, C3 -20　헤테로사이클릴 및 C5-20 아릴 그룹으로부터 선택되고, 임의로 그룹 NRR'와 관련하여서 R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클릭 환을 형성하거나;
R6 내지 R9에 인접한 그룹의 임의의 쌍은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하고, 여기에서 p는 1 또는 2이거나,
여기에서 화합물은 각각의 모노머가 화학식 C인 다이머이며, 각각의 모노머의 R7 그룹 또는 R8 그룹은 함께 모노머를 연결하는 화학식 -X-R"-X-를 갖는 다이머 브릿지를 형성하고;
여기에서 R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 NH2에 의해서 임의로 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있고;
각각의 X는 O, S 또는 N(H)이다.
본 발명은 또한, 표적 위치에서 하기 화학식 D의 화합물 및 그의 염 및 용매화물을 제공하기 위한 컨주게이트의 용도에 관한 것이다:
Figure 112012086532911-pct00008
상기 식에서,
점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중결합의 임의의 존재를 나타내며;
R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 독립적으로 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로로부터 더 선택되며;
여기에서 RD는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R6 및 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R8은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
Q는 O, S 및 NH로부터 독립적으로 선택되고;
R11은 H, 또는 R이거나, Q가 O인 경우에 SO3M이며, 여기에서 M은 금속 양이온이고;
R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬, C3 -20　헤테로사이클릴 및 C5 -20 아릴 그룹으로부터 선택되며, 임의로 그룹 NRR'와 관련하여서 R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클릭 환을 형성하거나;
R6 내지 R9에 인접한 그룹의 어떤 쌍은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하고, 여기에서 p는 1 또는 2이거나;
여기에서 화합물은 각각의 모노머가 화학식 D이거나, 하나의 모노머는 화학식 D이고 다른 것은 화학식 C인 다이머이며;
각각의 모노머의 R7 그룹 또는 R8 그룹은 함께 모노머를 연결하는 화학식 -X-R"-X-를 갖는 다이머 브릿지를 형성하고;
여기에서 R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 NH2에 의해서 임의로 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있고;
각각의 X는 O, S 또는 N(H)이며;
여기에서 화학식 C의 모노머 유니트는 상기 정의한 바와 같다.
본 발명은 또한, 본 발명의 컨주게이트 화합물의 제조에 사용하기 위한 화학식 E의 화합물 및 그의 염 및 용매화물을 제공한다:
Figure 112012086532911-pct00009
상기 식에서,
점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중결합의 임의의 존재를 나타내며;
R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 독립적으로 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로로부터 더 선택되며;
여기에서 RD는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R6 및 R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R8은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
RL은 세포 결합제에 연결하기 위한 링커이고;
Q는 O, S 및 NH로부터 독립적으로 선택되며;
R11은 H 또는 R이거나, Q가 O인 경우에 R11은 SO3M이고, 여기에서 M은 금속 양이온이며;
R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬, C3 -20　헤테로사이클릴 및 C5 -20 아릴 그룹으로부터 선택되고, 임의로 그룹 NRR'와 관련하여서 R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클릭 환을 형성하거나;
R6 내지 R9로부터의 인접한 그룹의 어떤 쌍은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하며, 여기에서 p는 1 또는 2이거나,
여기에서 화합물은 각각의 모노머가 화학식 E이거나, 하나의 모노머는 화학식 E이고, 다른 모노머는 하기 화학식 B인 다이머이고:
[화학식 B]
Figure 112012086532911-pct00010
여기에서 R2, R6, R9, R7, 및 R8은 화학식 A의 화합물에 따라 정의된 바와 같으며, 각각의 모노머의 R7 그룹 또는 R8 그룹은 함께 모노머를 연결하는 화학식 -X-R"-X-를 갖는 다이머 브릿지를 형성하고;
여기에서 R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 NH2에 의해서 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있고;
각각의 X는 O, S 또는 N(H)이며;
여기에서 화합물은 각각의 모노머가 화학식 E인 다이머이고, 여기에서 모노머 중의 하나에서 그룹 RL은 캡핑 그룹 RC이거나, 세포 결합제에 대한 연결을 위한 링커이다.
대안적으로, 한가지 구체예에서 R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이고, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 NH2에 의해서 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있다.
대안적으로, 신규한 컨주게이트 화합물은 상술한 바와 같은 화학식 A 및 화학식 A-I의 화합물로부터 선택될 수 있으며,
여기에서 A-I은 하기 화학식 A-A 및 A-B, 및 그의 염 및 용매화물로부터 선택되고:
Figure 112012086532911-pct00011
Figure 112012086532911-pct00012
상기 식에서,
R6, R9, R10, Q, R11, R 및 R'는 화학식 A의 화합물에 따라 정의된 바와 같으며;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되고;
R8은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되거나;
R6 내지 R9로부터의 인접한 그룹의 어떤 쌍은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하며, 여기에서 p는 1 또는 2이며,
R1 또는 R3와 함께 R2는 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하고;
V 및 W는 각각 (CH2)n, O, S, NR, CHR, 및 CRR'로부터 선택되며, 여기에서 n은 1, 2 또는　3이고, 단 R1 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 V는 C이며, R3 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 W는 C이고;
T는 CH2, NR, CO, BH, SO, 및 SO2로부터 선택되며;
U는 CH2, NR, O 및 S로부터 선택되고;
Y는 (CH2)n이며, 여기에서 n은 1, 2, 3 또는 4이고;
단 T, U 및 Y는 모두 CH2는 아니거나;
여기에서 화합물은 각각의 모노머가 화학식 A이거나, 각각의 모노머가 화학식 A-I이거나, 하나의 모노머가 화학식 (A)이고 다른 모노머는 상술한 바와 같은 화학식 B 또는 B-I이거나, 하나의 모노머는 화학식 A-I이고 다른 모노머는 화학식 B 또는 B-I인 다이머이며,
여기에서 B-I은 하기 화학식 B-A 및 B-B로부터 선택되고:
Figure 112012086532911-pct00013
Figure 112012086532911-pct00014
여기에서 R1, R2, R3, R6, R9, R7, 및 R8은 화학식 A-I의 화합물에 따라 정의한 바와 같으며, 각각의 모노머의 R7 그룹 또는 R8 그룹은 함께 모노머를 연결하는 화학식 -X-R"-X-를 갖는 다이머 브릿지를 형성하고;
여기에서 R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 NH2에 의해서 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있고;
각각의 X는 O, S 또는 N(H)이며;
여기에서 상기 화합물은 각각의 모노머가 화학식 A-I 및/또는 화학식 A인 다이머이고, 여기에서 모노머 중의 하나에서 그룹 R10은 캡핑 그룹 RC이거나, 세포 결합제에 연결된 링커이다.
편의상, A에 대한 모든 언급은 A-I (및 A-A 및 A-B)에 대해 적용될 수 있으며, B에 대한 모든 언급은 B-I (및 B-A 및 B-B)에 대해서 적용될 수 있다. C, D 및 E에 대한 유사한 언급은 또한, 필요에 따라, C-I, D-I 및 E-I에도 적절하다.
대안적으로, 컨주게이트는 표적 위치에서 화합물을 제공하기 위해서 사용될 수 있으며, 여기에서 상기 화합물은 상술한 바와 같은 화학식 C 또는 C-I의 화합물이고,
여기에서 C-I은 C-A 및 C-B, 및 그의 염 및 용매화물로부터 선택되며:
Figure 112012086532911-pct00015
Figure 112012086532911-pct00016
상기 식에서,
R6, R9, R 및 R'는 화학식 C의 화합물에 따라서 정의한 바와 같고;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R8은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되거나;
R6 내지 R9로부터의 인접한 그룹의 어떤 쌍은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하고, 여기에서 p는 1 또는 2이며,
R2와 R1 또는 R3 중의 어느 하나는 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하고;
V 및 W는 각각 (CH2)n, O, S, NR, CHR, 및 CRR'로부터 선택되며, 여기에서 n은 1, 2 또는　3이고, 단 R1 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 V는 C이며, R3 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 W는 C이고;
T는 CH2, NR, CO, BH, SO, 및 SO2로부터 선택되며;
U는 CH2, NR, O 및 S로부터 선택되고;
Y는 (CH2)n이며, 여기에서 n은 1, 2, 3 또는 4이고;
단 T, U 및 Y가 모두 CH2는 아니거나;
상기 화합물은 각각의 모노머가 화학식 C이거나, 각각의 모노머가 화학식 C-I이거나, 하나의 모노머는 화학식 C이고, 다른 것은 화학식 C-I인 다이머이며, 각각의 모노머의 R7 그룹 또는 R8 그룹은 함께 모노머를 연결하는 화학식 -X-R"-X-를 갖는 다이머 브릿지를 형성하고;
여기에서 R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 NH2에 의해서 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있고;
각각의 X는 O, S 또는 N(H)이다.
본 발명은 또한, 표적 위치에서 화합물을 제공하기 위한 컨주게이트의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 화합물은 상술한 바와 같은 화학식 D, 또는 화학식 D-I의 화합물이고,
여기에서 D-I은 D-A 및 D-B, 및 그의 염 및 용매화물로부터 선택되며:
Figure 112012086532911-pct00017
Figure 112012086532911-pct00018
상기 식에서,
R6, R9, R 및 R'는 화학식 D의 화합물에 따라서 정의한 바와 같고;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R8은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되거나;
R6 내지 R9로부터의 인접한 그룹의 어떤 쌍은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하고, 여기에서 p는 1 또는 2이며,
Q는 O, S 및 NH로부터 독립적으로 선택되고;
R11은 H 또는 R이거나, Q가 O인 경우에는 SO3M이며, 여기에서 M은 금속 양이온이고;
R2와 R1 또는 R3 중의 어느 하나는 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하며;
V 및 W는 각각 (CH2)n, O, S, NR, CHR, 및 CRR'로부터 선택되며, 여기에서 n은 1, 2 또는　3이고, 단 R1 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 V는 C이며, R3 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 W는 C이고;
T는 CH2, NR, CO, BH, SO, 및 SO2로부터 선택되며;
U는 CH2, NR, O 및 S로부터 선택되고;
Y는 (CH2)n이며, 여기에서 n은 1, 2, 3 또는 4이고;
단 T, U 및 Y가 모두 CH2는 아니거나;
상기 화합물은 각각의 모노머가 화학식 D이거나, 각각의 모노머가 화학식 D-I이거나, 하나의 모노머는 화학식 D이고, 다른 것은 화학식 D-I인 다이머이며, 각각의 모노머의 R7 그룹 또는 R8 그룹은 함께 모노머를 연결하는 화학식 -X-R"-X-를 갖는 다이머 브릿지를 형성하고;
여기에서 R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 NH2에 의해서 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있고;
각각의 X는 O, S 또는 N(H)이다.
대안적으로, 본 발명은 또한 본 발명의 컨주게이트 화합물의 제조에 사용하기 위한 상술한 바와 같은 화학식 E, 또는 화학식 E-I의 화합물을 제공하고,
여기에서 E-I은 E-A 및 E-B, 및 그의 염 및 용매화물로부터 선택되며:
Figure 112012086532911-pct00019
Figure 112012086532911-pct00020
상기 식에서,
R6, R9, R 및 R'는 화학식 D의 화합물에 따라서 정의한 바와 같고;
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되며;
R8은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택되거나;
R6 내지 R9로부터의 인접한 그룹의 어떤 쌍은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하고, 여기에서 p는 1 또는 2이며,
RL은 세포 결합제에 대한 연결을 위한 링커이고;
Q는 O, S 및 NH로부터 독립적으로 선택되고;
R11은 H 또는 R이거나, Q가 O인 경우에는 SO3M이며, 여기에서 M은 금속 양이온이고;
R2와 R1 또는 R3 중의 어느 하나는 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하며;
V 및 W는 각각 (CH2)n, O, S, NR, CHR, 및 CRR'로부터 선택되며, 여기에서 n은 1, 2 또는　3이고, 단 R1 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 V는 C이며, R3 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 W는 C이고;
T는 CH2, NR, CO, BH, SO, 및 SO2로부터 선택되며;
U는 CH2, NR, O 및 S로부터 선택되고;
Y는 (CH2)n이며, 여기에서 n은 1, 2, 3 또는 4이고;
단 T, U 및 Y가 모두 CH2는 아니거나;
상기 화합물은 각각의 모노머가 화학식 E이거나, 각각의 모노머가 화학식 E-I이거나, 하나의 모노머는 화학식 E 또는 E-I이고, 다른 것은 화학식 E, E-I, B 또는 B-I인 다이머이며,
각각의 모노머의 R7 그룹 또는 R8 그룹은 함께 모노머를 연결하는 화학식 -X-R"-X-를 갖는 다이머 브릿지를 형성하고;
여기에서 R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 NH2에 의해서 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있고;
각각의 X는 O, S 또는 N(H)이다.
도 1은 본 발명의 특별한 구체예를 나타낸다;
도 2 내지 6은 본 발명의 특별한 구체예에 대한 생물학적 시험의 결과를 나타낸다.
본 발명은 링커에 의해 N10 위치를 통해서 세포 결합제에 연결된 PBD 화합물을 포함하는 컨주게이트를 제공한다. 한가지 구체예에서, 상기 컨주게이트는 스페이서 연결 그룹에 연결된 세포 결합제, 트리거에 연결된 스페이서, 자체-희생적 링커에 연결된 트리거, 및 PBD 화합물의 N10 위치에 연결된 자체-희생적 링커를 포함한다. 이러한 컨주게이트는 다음에 예시된다:
Figure 112012086532911-pct00021
여기에서 CBA는 세포 결합제이고, PBD는 본 발명에 기술된 바와 같은 피롤로벤조디아제핀 화합물이다. 예시도는 본 발명의 특정한 구체예에서의 R10, A, L1 및 L2에 상응하는 부분을 나타낸다.
본 발명은 대상체에서 바람직한 부위에 PBD 화합물을 제공하는데 사용하기에 적합하다. 바람직한 구체예에서, 컨주게이트는 링커의 어떤 부분도 보유하지 않는 활성 PBD 화합물의 방출을 가능하게 한다. 여기에는 PBD 화합물의 반응성에 영향을 미칠 수 있는 어떤 스터브 (stub)도 존재하지 않는다.
특정의 구체예에서, 본 발명은 세포 결합제에 연결된 링커를 갖는 PBD 다이머 그룹을 포함하는 컨주게이트를 제공한다. 본 발명자들은 본 발명에, 이러한 다이머 컨주게이트가 신규의 PBD 비대칭화 (desymmetrisation) 기술을 사용하여 제조되도록 할 수 있는 합성방법을 기술한다.
바람직한 대상
다음의 바람직한 대상은 상술한 바와 같은 본 발명의 모든 관점에 적용될 수 있거나, 단일 관점에 관한 것일 수 있다. 바람직한 대상은 어떤 조합으로나 함께 조합될 수 있다.
이중결합
한가지 구체예에서, 여기에는 C1과 C2, 및 C2와 C3 사이에 어떤 이중결합도 존재하지 않는다.
한가지 구체예에서, 점선은 이하에 나타낸 바와 같이 C2와 C3 사이에 이중결합이 임의로 존재함을 나타낸다:
Figure 112012086532911-pct00022
한가지 구체예에서, 이중결합은 R2가 C5 -20 아릴 또는 C1 -12 알킬인 경우에 C2와 C3 사이에 존재한다.
한가지 구체예에서, 점선은 이하에 나타낸 바와 같이 C1과 C2 사이에 이중결합이 임의로 존재함을 나타낸다:
Figure 112012086532911-pct00023
한가지 구체예에서, 이중결합은 R2가 C5 -20 아릴 또는 C1 -12 알킬인 경우에 C1과 C2 사이에 존재한다.
R 2
한가지 구체예에서, R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 독립적으로 선택되며, 임의로 할로 또는 디할로로부터 더 선택된다.
한가지 구체예에서, R2는 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, R2는 H, =O, =CH2, R, =CH-RD, 및 =C(RD)2로부터 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 H이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 =O이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 =CH2이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 =CH-RD이다. PBD 화합물 내에서, 그룹 =CH-RD는 이하에 나타낸 배열 중의 하나를 가질 수 있다:
Figure 112012086532911-pct00024
한가지 구체예에서, 배열은 배열 (I)이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 =C(RD)2이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 =CF2이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 R이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 임의로 치환된 C5 -7 아릴이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 임의로 치환된 C8 -10 아릴이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 임의로 치환된 페닐이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 임의로 치환된 나프틸이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 임의로 치환된 피리딜이다.
한가지 구체예에서, R2는 독립적으로 임의로 치환된 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다.
한가지 구체예에서, R2는 1 내지 3 개의 치환체 그룹을 가지며, 여기에서 1 및 2 개가 바람직하고, 단일 치환된 그룹이 가장 바람직하다. 치환체는 어떤 위치에나 있을 수 있다.
R2가 C5 -7 아릴 그룹인 경우에, 단일 치환체는 바람직하게는 화합물의 나머지에 대한 결합에 인접하지 않는 환 원자 상에 존재하며, 즉 이것은 바람직하게는 화합물의 나머지에 대한 결합에 대해서 β 또는 γ이다. 따라서, C5 -7 아릴 그룹이 페닐인 경우에, 치환체는 바람직하게는 메타- 또는 파라-위치에 존재하고, 더욱 바람직하게는 파라-위치에 존재한다.
한가지 구체예에서, R2는 다음의 그룹으로부터 선택된다:
Figure 112012086532911-pct00025
여기에서 별표는 부착점을 나타낸다.
R2가 C8 -10 아릴 그룹, 예를 들어, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐인 경우에, 이것은 퀴놀린 또는 이소퀴놀린 환의 어떤 위치에 어떤 수의 치환체라도 가질 수 있다. 일부의 구체예에서, 이것은 1, 2 또는 3 개의 치환체를 가지며, 이들은 근위 및 원위 환 또는 둘 다 (하나를 초과하는 치환체인 경우)에 존재할 수 있다.
한가지 구체예에서, R2가 임의로 치환된 경우에, 치환체는 이하의 치환체 항목에 제시된 치환체들로부터 선택된다.
R이 임의로 치환된 경우에, 치환체는 바람직하게는 할로, 하이드록실, 에테르, 포르밀, 아실, 카복시, 에스테르, 아실옥시, 아미노, 아미도, 아실아미도, 아미노카보닐옥시, 우레이도, 니트로, 시아노 및 티오에테르로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, R 또는 R2가 임의로 치환된 경우에, 치환체는 R, OR, SR, NRR', NO2, 할로, CO2R, COR, CONH2, CONHR, 및 CONRR'로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
R2가 C1 -12 알킬인 경우에, 임의의 치환체는 추가로 C3 -20　헤테로사이클릴 및 C5 -20 아릴 그룹을 포함할 수 있다.
R2가 C3 -20　헤테로사이클릴인 경우에, 임의의 치환체는 추가로 C1 -12 알킬 및 C5 -20 아릴 그룹을 포함할 수 있다.
R2가 C5 -20 이릴 그룹인 경우에, 임의의 치환체는 추가로 C3 -20　헤테로사이클릴 및 C1 -12 알킬 그룹을 포함할 수 있다.
용어 "알킬"은 서브-클래스인 알케닐 및 알키닐뿐만 아니라 사이클로알킬을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, R2가 임의로 치환된 C1 -12 알킬인 경우에, 알킬 그룹은 임의로, 컨주게이트된 시스템의 일부분을 형성할 수 있는 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 또는 삼중결합을 함유하는 것으로 이해된다. 한가지 구체예에서, 임의로 치환된 C1 -12 알킬 그룹은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 또는 삼중결합을 함유하며, 이 결합은 C1과 C2, 또는 C2와 C3 사이에 존재하는 이중결합과 컨주게이트된다. 한가지 구체예에서, C1 -12 알킬 그룹은 포화된 C1 -12 알킬, C2 -12　알케닐, C2 -12 알키닐 및 C3 -12 사이클로알킬로부터 선택된 그룹이다.
R2 상의 치환체가 할로인 경우에, 이것은 바람직하게는 F 또는 Cl, 더욱 바람직하게는 Cl이다.
R2 상의 치환체가 에테르인 경우에, 이것은 일부의 구체예에서 알콕시 그룹, 예를 들어, C1 -7 알콕시 그룹 (예를 들어, 메톡시, 에톡시)일 수 있거나, 이것은 일부의 구체예에서 C5 -7 아릴옥시 그룹 (예를 들어, 페녹시, 피리딜옥시, 푸라닐옥시)일 수 있다.
R2 상의 치환체가 C1 -7 알킬인 경우에, 이것은 바람직하게는 C1 -4 알킬 그룹 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸)일 수 있다.
R2 상의 치환체가 C3 -7 헤테로사이클릴인 경우에, 이것은 일부의 구체예에서 C6 질소 함유 헤테로사이클릴 그룹, 예를 들어, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 피페리디닐, 피페라지닐일 수 있다. 이들 그룹은 질소 원자를 통해서 PBD 부분의 나머지에 결합할 수 있다. 이들 그룹은 예를 들어, C1 -4 알킬 그룹에 의해서 더 치환될 수 있다.
R2 상의 치환체가 비스-옥시-C1 -3 알킬렌인 경우에, 이것은 바람직하게는 비스-옥시-메틸렌 또는 비스-옥시-에틸렌이다.
R2에 대해 특히 바람직한 치환체에는 메톡시, 에톡시, 플루오로, 클로로, 시아노, 비스-옥시-메틸렌, 메틸-피페라지닐, 모르폴리노 및 메틸-티에닐이 포함된다.
특히 바람직한 치환된 R2 그룹에는 4-메톡시-페닐, 3-메톡시페닐, 4-에톡시-페닐, 3-에톡시-페닐, 4-플루오로-페닐, 4-클로로-페닐, 3,4-비스옥시메틸렌-페닐, 4-메틸티에닐, 4-시아노페닐, 4-페녹시페닐, 퀴놀린-3-일 및 퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-3-일 및 이소퀴놀린-6-일, 2-티에닐, 2-푸라닐, 메톡시나프틸, 및 나프틸이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
한가지 구체예에서, R2는 할로 또는 디할로이다. 한가지 구체예에서, R2는 -F 또는 -F2이며, 이 치환체는 각각 식 (III) 및 (IV)로 이하에 예시된다:
Figure 112012086532911-pct00026
R D
한가지 구체예에서, RD는 R, CO2R, COR, CHO, CO2H, 및 할로로부터 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, RD는 독립적으로 R이다.
한가지 구체예에서, RD는 독립적으로 할로이다.
R 6
한가지 구체예에서, R6는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn- 및 할로로부터 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, R6는 H, OH, OR, SH, NH2, NO2 및 할로로부터 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, R6는 H 및 할로로부터 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, R6는 독립적으로 H이다.
한가지 구체예에서, R6 및 R7은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하며, 여기에서 p는 1 또는 2이다.
R 7
R7은 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, R7은 독립적으로 OR이다.
한가지 구체예에서, R7은 독립적으로 OR7A이며, 여기에서 R7A는 독립적으로 임의로 치환된 C1 -6　알킬이다.
한가지 구체예에서, R7A는 독립적으로 임의로 치환된 포화 C1 -6 알킬이다.
한가지 구체예에서, R7A는 독립적으로 임의로 치환된 C2 -4 알케닐이다.
한가지 구체예에서, R7A는 독립적으로 Me이다.
한가지 구체예에서, R7A는 독립적으로 CH2Ph이다.
한가지 구체예에서, R7A는 독립적으로 알릴이다.
한가지 구체예에서, 화합물은 각각의 모노머의 R7 그룹이 함께 모노머를 연결하는 화학식 X-R"-X를 갖는 다이머 브릿지를 형성하는 다이머이다.
R 8
한가지 구체예에서, 화합물은 각각의 모노머의 R8 그룹이 함께 모노머를 연결하는 화학식 X-R"-X를 갖는 다이머 브릿지를 형성하는 다이머이다.
한가지 구체예에서, R8은 독립적으로 OR8A이며, 여기에서 R8A는 독립적으로 임의로 치환된 C1 -4　알킬이다.
한가지 구체예에서, R8A는 독립적으로 임의로 치환된 포화 C1 -6 알킬 또는 임의로 치환된 C2 -4 알케닐이다.
한가지 구체예에서, R8A는 독립적으로 Me이다.
한가지 구체예에서, R8A는 독립적으로 CH2Ph이다.
한가지 구체예에서, R8A는 독립적으로 알릴이다.
한가지 구체예에서, R8 및 R7은 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하며, 여기에서 p는 1 또는 2이다.
한가지 구체예에서, R8 및 R9는 함께 그룹 -O-(CH2)p-O-를 형성하며, 여기에서 p는 1 또는 2이다.
R 9
한가지 구체예에서, R9는 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn- 및 할로로부터 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, R9는 독립적으로 H이다.
한가지 구체예에서, R9는 독립적으로 R 또는 OR이다.
R 10
불확실함을 피하기 위해서, R10이 세포 결합제에 연결된 링커인 경우에, 세포 결합제는 그룹 R10의 일부분이다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 컨주게이트가 2 개의 모노머 A를 포함하는 다이머인 경우에, 하나의 모노머는 세포 결합제에 연결된 링커인 그룹 R10을 갖고, 다른 모노머는 세포 결합제에 연결된 링커 또는 캡핑 그룹 RC인 그룹 R10을 갖는다. 바람직하게는, 다른 모노머는 캡핑 그룹 RC인 그룹 R10을 갖는다. 따라서, 바람직한 구체예에서 여기에는 세포 결합제에 대한 단일 연결이 있다.
한가지 구체예에서, 그룹 R10은 PBD 부분의 N10 위치로부터 제거하여 이하에 예시된 바와 같은 N10-C11 이민 결합, 카비놀아민, 치환된 카비놀아민 (여기에서 QR11은 OSO3M이다), 비설파이트 부가물, 티오카비놀아민, 치환된 티오카보닐아민, 또는 치환된 카비날아민을 남길 수 있다:
Figure 112012086532911-pct00027
여기에서 R 및 M은 본 발명의 컨주게이트에 대해서 정의된 바와 같다.
한가지 구체예에서, 그룹 R10은 PBD 부분의 N10 위치로부터 제거되어 N10-C11 이민 결합을 남길 수 있다.
일부의 구체예에서, 본 발명의 컨주게이트는 화학식 A의 모노머 및 화학식 B의 모노머를 포함하는 다이머 화합물이다. 이 구체예에서, 모노머 (B)는 생물학적 활성을 위해서 N10 및 C11 위치에 적합한 작용기를 갖기 때문에 그룹 R10은 N10 위치로부터 제거하는 것이 필요하지 않다.
그러나, 그룹 R10이 제거됨으로써 두 개의 모노머 유니트 모두에서 N10 및 C11 위치에 적합한 작용기를 갖는 다이머를 제공할 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 작용기는 PBD 다이머의 교차결합 활성을 허용하는데 필요한 것으로 생각된다.
본 출원은 특히 N10 위치에 대한 카바메이트 연결을 갖는 이들 R10 그룹에 관한 것이다.
링커는 세포 결합제 (CBA), 예를 들어, 항체를 공유결합(들)에 의해서 PBD 약물 부분 D에 부착시킨다. 링커는 하나 또는 그 이상의 약물 부분 (D) 및 항체 유니트 (Ab)를 연결시켜 항체-약물 컨주게이트 (ADC)를 형성시키는데 사용될 수 있는 이작용성 또는 다작용성 부분이다. 링커 (L)은 세포의 외부에서, 즉 세포외에서 안정할 수 있거나, 이것은 효소적 활성, 가수분해, 또는 그 밖의 다른 대사적 조건에 의해서 분해될 수 있다. 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 약물 부분에 대한 및 항체에 대한 결합을 위한 반응성 작용기를 갖는 링커를 사용하여 편리하게 제조될 수 있다. 항체 (Ab)의 시스테인 티올, 또는 아민, 예를 들어, N-말단 또는 리신과 같은 아미노산 측쇄는 링커 또는 스페이서 시약, PBD 약물 부분 (D) 또는 약물-링커 시약 (D-L)의 작용기 그룹과의 결합을 형성할 수 있다.
PBD 부분의 N10 위치에 부착된 링커 상의 다수의 작용기 그룹은 세포 결합제와 반응하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 에스테르, 티오에스테르, 아미드, 티오아미드, 카바메이트, 티오카바메이트, 우레아, 티오우레아, 에테르, 티오에테르, 또는 디설파이드 결합이 링커-PBD 약물 중간체와 세포 결합제의 반응으로부터 형성될 수 있다.
ADC의 링커는 바람직하게는 ADC 분자의 응집을 방지하며, ADC가 수성 매질 내에서, 및 모노머 상태에서 잘 용해하도록 유지시킨다.
ADC의 링커는 바람직하게는 세포외적으로 안정하다. 세포 내로의 수송 또는 송달 전에, 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 바람직하게는 안정하며, 온전하게 유지되고, 즉 항체는 약물 부분에 연결된 채로 유지된다. 링커는 표적 세포 외부에서 안정하고, 세포 내부에서 약간의 효과적인 비율로 분해될 수 있다. 효과적인 링커는 (i) 항체의 특이적 결합 특성을 유지시키고; (ii) 컨주게이트 또는 약물 부분의 세포내 송달을 허용하고; (iii) 컨주게이트가 그의 표적 부위로 송달 또는 수송될 때까지 안정하고 온전하게 유지되며; (iv) PBD 약물 부분의 세포독성, 세포-사멸 효과 또는 세포증식억제 효과를 유지시킬 것이다. ADC의 안정성은 질량 분광분석, HPLC, 및 분리/분석 기술 LC/MS와 같은 표준 분석기술에 의해서 측정될 수 있다.
항체와 약물 부분의 공유적 부착은 2 개의 반응성 작용기 그룹을 갖도록 하는, 즉 반응성 개념에서 2가인 링커를 필요로 한다. 펩타이드, 핵산, 약물, 독소, 항체, 합텐, 및 리포터 그룹과 같은 2 개 또는 그 이상의 작용기 또는 생물학적 활성 부분을 부착시키는데 유용한 2가 링커 시약은 공지되어 있으며, 방법은 그들의 생성되는 컨주게이트를 기술하고 있다 [Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p 234-242].
또 다른 구체예에서, 링커는 응집, 용해도 또는 반응성을 변조시키는 그룹에 의해서 치환될 수 있다. 예를 들어, 설포네이트 치환체는 시약의 수용성을 증가시키고, 링커 시약과 항체 또는 약물 부분의 커플링 반응을 촉진시키거나, 또는 ADC를 제조하기 위해서 사용된 합성경로에 따라 Ab-L과 D, 또는 D-L과 Ab의 커플링 반응을 촉진시킬 수 있다.
한가지 구체예에서, R10은 하기의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00028
여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, CBA는 세포 결합제이며, L1은 링커이고, A는 L1을 세포 결합제에 연결하는 연결 그룹이며, L2는 공유 결합이거나, -OC(=O)-와 함께 자체-희생적 링커를 형성하고, L1 또는 L2는 분해가능한 링커이다.
L1은 바람직하게는 분해가능한 링커이며, 분해를 위한 링커의 활성화를 위한 트리거로 불릴 수 있다.
존재하는 경우에 L1 및 L2의 성질은 광범하게 변화할 수 있다. 이들 그룹은 컨주게이트가 송달되는 부위에서의 조건에 의해서 지시되는 그들의 분해 특징을 기초로 하여 선택된다. 효소의 작용에 의해서 분해되는 이들 링커가 바람직하지만, pH 변화 (예를 들어, 산 또는 염기 불안정성), 온도 또는 조사 (예를 들어, 광불안정성)에 의해서 분해가능한 링커가 사용될 수도 있다. 환원 또는 산화 조건 하에서 분해가능한 링커가 본 발명에서의 용도를 가질 수도 있다.
L1은 아미노산의 인접 서열 (contiguous sequence)을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 효소적 분해를 위한 표적 기질일 수 있으며, 이에 의해서 N10 위치로부터 R10의 방출이 허용될 수 있다.
한가지 구체예에서, L1은 효소의 작용에 의해서 분해될 수 있다. 한가지 구체예에서, 효소는 에스테라제 또는 펩티다제이다.
한가지 구체예에서는, L2가 존재하고, -C(=O)O-와 함께 자체-희생적 링커를 형성한다. 한가지 구체예에서, L2는 효소적 활성을 위한 기질이고, 이에 의해서 N10 위치로부터 R10의 방출이 허용된다.
한가지 구체예에서, L1이 효소의 작용에 의해서 분해가능하고, L2가 존재하는 경우에, 효소는 L1과 L2 사이의 결합을 분해시킨다.
L1 및 L2가 존재하는 경우에 이들은 -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, 및 -NHC(=O)NH-로부터 선택된 결합에 의해서 연결될 수 있다.
L2에 연결하는 L1의 아미노 그룹은 아미노산의 N-말단일 수 있거나, 아미노산 측쇄, 예를 들어, 리신 아미노산 측쇄의 아미노 그룹으로부터 유도될 수 있다.
L2에 연결하는 L1의 카복실 그룹은 아미노산의 C-말단일 수 있거나, 아미노산 측쇄, 예를 들어, 글루탐산 아미노산 측쇄의 카복실 그룹으로부터 유도될 수 있다.
L2에 연결하는 L1의 하이드록실 그룹은 아미노산 측쇄, 예를 들어, 세린 아미노산 측쇄의 하이드록실 그룹으로부터 유도될 수 있다.
용어 "아미노산 측쇄"에는 다음에서 발견되는 것이 포함된다: (i) 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린과 같은 천연적으로 존재하는 아미노산; (ii) 오르니틴 및 시트룰린과 같은 소수의 아미노산; (iii) 비천연 아미노산, 베타-아미노산, 천연적으로 존재하는 아미노산의 합성 유사체 및 유도체; 및 (iv) 그의 모든 에난티오머, 부분입체이성체, 이성체적으로 풍부한 형태, 동위원소 표지된 (예를 들어, 2H, 3H, 14C, 15N) 형태, 보호된 형태, 및 라세미 혼합물.
한가지 구체예에서, -C(=O)O- 및 L2는 함께 다음의 그룹을 형성한다:
Figure 112012086532911-pct00029
여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L1에 대한 부착점을 나타내며, Y는 -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- 또는 -C(=O)O-이고, n은 0 내지 3이다. 페닐렌 환은 본 명세서에 기술된 바와 같이 1, 2 또는 3 개의 치환체에 의해서 임의로 치환된다. 한가지 구체예에서, 페닐렌 그룹은 할로, NO2, R 또는 OR에 의해서 임의로 치환된다.
한가지 구체예에서, Y는 NH이다.
한가지 구체예에서, n은 0 또는 1이다. 바람직하게는, n은 0이다.
Y가 NH이고, n이 0인 경우에, 자체-희생적 링커는 p-아미노벤질카보닐 링커 (PABC)로 불릴 수 있다.
자체-희생적 링커는 원위 부위가 활성화되는 경우에, 이하에 나타낸 선을 따라 진행하는 보호된 화합물의 방출을 허용한다 (n=0인 경우):
Figure 112012086532911-pct00030
여기에서 L*은 링커의 나머지 부분의 활성화된 형태이다. 이들 그룹은 보호된 화합물로부터 활성화의 부위를 분리시키는 이점을 갖는다. 상술한 바와 같이, 페닐렌 그룹은 임의로 치환될 수 있다.
본 발명에 기술된 한가지 구체예에서, 그룹 L*은 디펩타이드 그룹을 포함할 수 있는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 링커 L1이다.
또 다른 구체예에서, -C(=O)O- 및 L2은 함께 다음의 식으로부터 선택된 그룹을 형성한다:
Figure 112012086532911-pct00031
여기에서 별표, 파선, Y, 및 n은 상기 정의한 바와 같다. 각각의 페닐렌 환은 본 명세서에 기술된 바와 같이 1, 2 또는 3 개의 치환체에 의해서 임의로 치환된다. 한가지 구체예에서, Y 치환체를 갖는 페닐렌 환은 임의로 치환되고, Y 치환체를 갖지 않는 페닐렌 환은 비치환된다. 한가지 구체예에서, Y 치환체를 갖는 페닐렌 환은 비치환되고, Y 치환체를 갖지 않는 페닐렌 환은 임의로 치환된다.
또 다른 구체예에서, -C(=O)O- 및 L2은 함께 다음 식으로부터 선택된 그룹을 형성한다:
Figure 112012086532911-pct00032
여기에서 별표, 파선, Y, 및 n은 상기 정의한 바와 같고, E는 O, S 또는 NR이며, D는 N, CH, 또는 CR이고, F는 N, CH, 또는 CR이다.
한가지 구체예에서, D는 N이다.
한가지 구체예에서, D는 CH이다.
한가지 구체예에서, E는 O 또는 S이다.
한가지 구체예에서, F는 CH이다.
바람직한 구체예에서, 링커는 카텝신 불안정성 링커이다.
한가지 구체예에서, L1은 디펩타이드를 포함한다. 디펩타이드는 -NH-X1-X2-CO-로 나타낼 수 있으며, 여기에서 -NH- 및 -CO-는 각각 아미노산 그룹 X1 및 X2의 N- 및 C-말단을 나타낸다. 디펩타이드 내의 아미노산은 천연 아미노산의 어떤 조합이라도 될 수 있다. 링커가 카텝신 불안정성 링커인 경우에, 디펩타이드는 카텝신-매개된 분해를 위한 작용의 부위일 수 있다.
추가로, 카복실 또는 아미노 측쇄 작용기를 갖는 아미노산 그룹, 예를 들어, 각각 Glu 및 Lys인 경우에, CO 및 NH는 그 측쇄 작용기를 나타낼 수 있다.
한가지 구체예에서, 디펩타이드 -NH-X1-X2-CO- 내의 그룹 -X1-X2-는 다음으로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-,
-Val-Cit-,
-Phe-Cit-,
-Leu-Cit-,
-Ile-Cit-,
-Phe-Arg-,
-Trp-Cit-
여기에서 Cit는 시트룰린이다.
바람직하게는, 디펩타이드 -NH-X1-X2-CO- 내의 그룹 -X1-X2-는 다음으로부터 선택된다:
-Phe-Lys-,
-Val-Ala-,
-Val-Lys-,
-Ala-Lys-,
-Val-Cit-.
가장 바람직하게는, 디펩타이드 -NH-X1-X2-CO- 내의 그룹 -X1-X2-는 -Phe-Lys- 또는 -Val-Ala-이다.
본 발명에 참고로 포함된 문헌 [Dubowchik et 　 al ., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13, 855-869]에 기술된 것들을 포함한 그 밖의 다른 디펩타이드 조합이 사용될 수 있다.
한가지 구체예에서, 아미노산 측쇄는 적절한 경우에 유도체화된다. 예를 들어, 아미노산 측쇄의 아미노 그룹 또는 카복시 그룹이 유도체화될 수 있다. 한가지 구체예에서, 리신과 같은 측쇄 아미노산의 아미노 그룹 NH2는 NHR 및 NRR'로 구성된 그룹으로부터 선택된 유도체화된 형태이다. 한가지 구체예에서, 아스파르트산과 같은 측쇄 아미노산의 카복시 그룹 COOH는 COOR, CONH2, CONHR 및 CONRR'로 구성된 그룹으로부터 선택된 유도체화된 형태이다.
한가지 구체예에서, 아미노산 측쇄는 적절한 경우에 화학적으로 보호된다. 측쇄 보호 그룹은 그룹 RL에 관해서 이하에 거론한 바와 같은 그룹일 수 있다. 본 발명자들은 보호된 아미노산 서열은 효소에 의해서 분해가능한 것을 정립하였다. 예를 들어, Boc 측쇄-보호된 Lys 잔기를 포함하는 디펩타이드 서열은 카텝신에 의해서 분해가능한 것으로 정립되었다.
아미노산의 측쇄에 대한 보호 그룹은 본 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 노바비오켐 카탈로그 (Novabiochem Catalog)에 기술되어 있다. 추가의 보호 그룹 전략은 문헌 [Protective Groups in Organic Synthesis, Greene and Wuts]에 기술되어 있다.
가능한 측쇄 보호 그룹은 반응성 측쇄 작용기를 갖는 이들 아미노산에 대해서 이하에 나타낸다:
Arg: Z, Mtr, Tos;
Asn: Trt, Xan;
Asp: Bzl, t-Bu;
Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt;
Glu: Bzl, t-Bu;
Gln: Trt, Xan;
His: Boc, Dnp, Tos, Trt;
Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc;
Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS;
Thr: Bz;
Trp: Boc;
Tyr: Bzl, Z, Z-Br.
한가지 구체예에서, 측쇄 보호는 존재하는 경우에 캡핑 그룹으로서, 또는 그의 일부분으로서 제공된 그룹에 대해서 직교하도록 선택된다. 따라서, 측쇄 보호 그룹의 제거는 캡핑 그룹, 또는 캡핑 그룹의 일부분인 어떤 보호 그룹 작용기를 제거하지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 선택된 아미노산은 반응성 측쇄 작용기를 갖지 않는 것이다. 예를 들어, 아미노산은 Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, 및 Val로부터 선택될 수 있다.
한가지 구체예에서, 디펩타이드는 자체-희생적 링커와 함께 사용된다. 자체-희생적 링커는 -X2-에 연결될 수 있다.
자체-희생적 링커가 존재하는 경우에, -X2-는 자체-희생적 링커에 직접 연결된다. 바람직하게는, 그룹 -X2-CO-는 Y에 연결되며, 여기에서 Y는 NH이고, 이에 의해서 그룹 -X2-CO-NH-를 형성한다.
-NH-X1-은 A에 직접 연결된다. A는 작용기 -CO-를 포함하며, 이에 의해서 -X1-와의 아미드 연결을 형성할 수 있다.
한가지 구체예에서, L1 및 L2는 -OC(=O)-와 함께 그룹 NH-X1-X2-CO-PABC-를 포함한다. PABC 그룹은 N10 위치에 직접 연결된다. 바람직하게는, 자체-희생적 링커 및 디펩타이드는 함께 이하에 예시되는 그룹 -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-를 형성한다:
Figure 112012086532911-pct00033
여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L1의 나머지 부분에 대한 부착점 또는 A에 대한 부착점을 나타낸다. 바람직하게는, 파선은 A에 대한 부착점을 나타낸다. Lys 아미노산의 측쇄는 예를 들어, 상술한 바와 같이 Boc, Fmoc, 또는 Alloc에 의해서 보호될 수 있다.
대안적으로, 자체-희생적 링커와 디펩타이드는 함께 이하에 예시된 그룹 -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-를 형성한다:
Figure 112012086532911-pct00034
여기에서 별표 및 파선은 상기에서 정의한 바와 같다.
대신으로, 자체-희생적 링커와 디펩타이드는 함께 이하에 예시된 그룹 -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-를 형성한다:
Figure 112012086532911-pct00035
여기에서 별표 및 파선은 상기에서 정의한 바와 같다.
본 발명의 일부의 구체예에서, PBD/약물 부분이 비보호된 이민 결합을 함유한다면, 예를 들어, 부위 B가 존재한다면, 링커는 유리 아미노 (H2N-) 그룹을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 링커가 구조 -A-L1-L2-를 갖는다면, 이것은 바람직하게는 유리 아미노 그룹을 함유하지 않을 수 있다. 이러한 바람직한 대상은 링커가 예를 들어, L1으로서 디펩타이드를 함유하는 경우에 특히 적절하다; 이 구체예에서, 2 개의 아미노산 중의 하나는 리신으로부터 선택되지 않는 것이 바람직할 수 있다.
이론적으로 구속박고 싶지 않지만, 본 발명자들은 약물 부분 내의 비보호된 이민 결합과 링커 내의 유리 아미노 그룹의 조합은 이러한 약물-링커 부분의 항체에 대한 컨주게이션을 저해할 수 있는 약물-링커 부분의 다이머화를 야기할 수 있음을 발견하였다. 이들 그룹의 교차-반응은 강산 (예를 들어, TFA)을 사용하여 유리 아미노 그룹을 탈보호시킨 경우와 같이 유리 아미노 그룹이 암모늄 이온 (H3N+-)으로 존재하는 경우에 가속화될 수 있다.
한가지 구체예에서, A는 공유결합이다. 따라서, L1과 세포 결합제는 직접 연결된다. 예를 들어, L1이 접속 아미노산 서열을 포함하는 경우에, 서열의 N-말단은 세포 결합제에 직접 연결될 수 있다.
따라서, A가 공유결합인 경우에, 세포 결합제와 L1 사이의 연결은 다음으로부터 선택될 수 있다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH-,
-C(=O)NHC(=O)-,
-S-,
-S-S-,
-CH2C(=O)-, 및
=N-NH-.
세포 결합제에 연결하는 L1의 아미노 그룹은 아미노산의 N-말단일 수 있거나, 아미노산 측쇄, 예를 들어, 리신 아미노산 측쇄의 아미노 그룹으로부터 유도될 수 있다.
세포 결합제에 연결하는 L1의 카복실 그룹은 아미노산의 C-말단일 수 있거나, 아미노산 측쇄, 예를 들어, 글루탐산 아미노산 측쇄의 카복실 그룹으로부터 유도될 수 있다.
세포 결합제에 연결하는 L1의 하이드록실 그룹은 아미노산 측쇄, 예를 들어, 세린 아미노산 측쇄의 하이드록실 그룹으로부터 유도될 수 있다.
세포 결합제에 연결하는 L1의 티올 그룹은 아미노산 측쇄, 예를 들어, 세린 아미노산 측쇄의 티올 그룹으로부터 유도될 수 있다.
L1의 아미노, 카복실, 하이드록실 및 티올 그룹에 관한 상기의 언급은 또한 세포 결합제에도 적용된다.
한가지 구체예에서, L2는 -OC(=O)-와 함께 다음의 그룹을 나타낸다:
Figure 112012086532911-pct00036
여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 L1에 대한 부착점을 나타내며, n은 0 내지 3이고, Y는 공유결합 또는 작용 그룹이며, E는 예를 들어, 효소적 작용 또는 광선에 의해서 활성화될 수 있는 그룹으로, 이에 의해서 자체-희생적 유니트가 생성된다. 페닐렌 환은 임의로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 1, 2 또는 3 개의 치환체에 의해서 더 치환된다. 한가지 구체예에서, 페닐렌 환은 임의로 할로, NO2, R 또는 OR에 의해서 더 치환된다. 바람직하게는 n은 0 또는 1이고, 가장 바람직하게는 0이다.
E는 그룹이 예를 들어, 광선에 의한 또는 효소의 작용에 의한 활성화에 민감하도록 선택된다. E는 -NO2 또는 글루코론산일 수 있다. 전자는 니트로리덕타제 (nitroreductase)의 작용에 민감할 수 있으며, 후자는 β-글루코로니다제의 작용에 민감할 수 있다.
이 구체예에서, 자체-희생적 링커는 E가 활성화되면 이하에 나타낸 선을 따라 진행하는 보호된 화합물의 방출을 가능하게 할 것이다 (n=0인 경우):
Figure 112012086532911-pct00037
여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, E*는 E의 활성화된 형태이며, Y는 상술한 바와 같다. 이들 그룹은 보호될 화합물로부터 활성화의 부위를 분리시키는 이점을 갖는다. 상술한 바와 같이, 페닐렌 그룹은 임의로 더 치환될 수 있다.
그룹 Y는 L1에 대한 공유결합일 수 있다.
그룹 Y는 다음으로부터 선택된 작용 그룹일 수 있다:
-C(=O)-
-NH-
-O-
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH,
-C(=O)NHC(=O)-, 및
-S-.
L1이 디펩타이드인 경우에, Y는 -NH- 또는 -C(=O)-이며, 이에 의해서 L1과 Y 사이의 아미드 결합을 형성시키는 것이 바람직하다. 이 구체예에서, 디펩타이드 서열은 효소적 활성에 대한 기질일 필요가 없다.
또 다른 구체예에서, A는 스페이서 그룹이다. 따라서, L1과 세포 결합제는 간접적으로 연결된다.
L1 및 A는 다음의 결합으로부터 선택된 결합에 의해서 연결될 수 있다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-, 및
-NHC(=O)NH-.
바람직하게는, 링커는 세포 결합제 상의 친핵성 작용 그룹과의 반응을 위한 친전자성 작용 그룹을 함유한다. 항체 상의 친핵성 그룹에는 다음의 그룹이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다: (i) N-말단 아민 그룹, (ii) 측쇄 아민 그룹, 예를 들어, 리신, (iii) 측쇄 티올 그룹, 예를 들어, 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화된 경우에 당 하이드록실 또는 아미노 그룹. 아민, 티올, 및 하이드록실 그룹은 친핵성이며, 다음의 그룹을 포함하는 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자성 그룹과 공유결합을 형성하도록 반응할 수 있다: (i) 말레이미드 그룹, (ii) 활성화된 디설파이드, (iii) NHS (N-하이드록시석신이미드) 에스테르, HOBt (N-하이드록시벤조트리아졸) 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드와 같은 활성 에스테르; (iv) 할로아세트아미드와 같은 알킬 및 벤질 할라이드; 및 (v) 알데히드, 케톤, 카복실, 및 이들 중의 일부는 다음과 같이 예시된다:
Figure 112012086532911-pct00038
특정의 항체는 환원가능한 쇄간 디설파이드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 DTT (디티오트레이톨)와 같은 환원제로 처리함으로써 링커 시약과의 컨주게이션에 대해 반응성으로 만들 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론적으로 2 개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 수 있다. 추가의 친핵성 그룹은 아민의 티올로의 전환을 야기하는 리신과 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut's) 시약)의 반응을 통해서 항체 내로 도입될 수 있다. 반응성 티올 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 도입시킴으로써 (예를 들어, 하나 또는 그 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 돌연변이체 항체를 제조함으로써) 항체 (또는 그의 단편) 내로 도입될 수 있다. 미국특허 7521541호는 반응성 시스테인 아미노산의 도입에 의한 항체의 조작을 교시하였다.
일부의 구체예에서, 링커는 항체 상에 존재하는 친전자성 그룹과 반응성인 반응성 친핵성 그룹을 갖는다. 항체 상의 유용한 친전자성 그룹에는 알데히드 및 케톤 카보닐 그룹이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 링커의 친핵성 그룹의 헤테로 원자는 항체 상의 친전자성 그룹과 반응하고, 항체 유니트에 대한 공유결합을 형성할 수 있다. 링커 상의 유용한 친핵성 그룹에는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드록실, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드가 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 항체 상의 친전자성 그룹은 링커에 대한 부착을 위한 공유적 부위를 제공한다.
한가지 구체예에서, 그룹 A는 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00039
여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내며, 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 내지 6이다. 한가지 구체예에서, n은 5이다.
한가지 구체예에서, 그룹 A는 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00040
여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내며, 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 내지 6이다. 한가지 구체예에서, n은 5이다.
한가지 구체예에서, 그룹 A는 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00041
여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내며, 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구체예에서, n은 1이고, m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는 8이다. 또 다른 구체예에서, m은 10 내지 30, 바람직하게는 20 내지 30이다. 대신으로, m은 0 내지 50이다. 이 구체예에서, m은 바람직하게는 10-40이고, n은 1이다.
한가지 구체예에서, 그룹 A는 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00042
여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내며, 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다. 바람직한 구체예에서, n은 1이고, m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는 8이다. 또 다른 구체예에서, m은 10 내지 30, 바람직하게는 20 내지 30이다. 대신으로, m은 0 내지 50이다. 이 구체예에서, m은 바람직하게는 10-40이고, n은 1이다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제와 A 사이의 연결은 세포 결합제의 티올 잔기 및 A의 말레이미드 그룹을 통해서 이루어진다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제와 A 사이의 연결은 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00043
여기에서 별표는 A의 나머지 부분에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 세포 결합제의 나머지 부분에 대한 부착점을 나타낸다. 이 구체예에서, S 원자는 전형적으로 세포 결합제로부터 유도된다.
상기 각각의 구체예에서, 대체 작용기가 이하에 나타낸 말레이미드-유도된 그룹 대신에 사용될 수 있다:
Figure 112012086532911-pct00044
여기에서 파선은 전술한 바와 같은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내고, 별표는 A 그룹의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다.
한가지 구체예에서, 말레이미드-유도된 그룹은 다음의 그룹으로 대체된다:
Figure 112012086532911-pct00045
여기에서 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내고, 별표는 A 그룹의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다..
한가지 구체예에서, 말레이미드-유도된 그룹은 임의로 세포 결합제와 함께 다음으로부터 선택되는 그룹으로 대체된다:
-C(=O)NH-,
-C(=O)O-,
-NHC(=O)-,
-OC(=O)-,
-OC(=O)O-,
-NHC(=O)O-,
-OC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH-,
-NHC(=O)NH,
-C(=O)NHC(=O)-,
-S-,
-S-S-,
-CH2C(=O)-
-C(=O)CH2-,
=N-NH-, 및
-NH-N=.
한가지 구체예에서, 말레이미드-유도된 그룹은 임의로 세포 결합제와 함께 다음으로부터 선택되는 그룹으로 대체된다:
Figure 112012086532911-pct00046
여기에서 파선은 세포 결합제에 대한 부착점 또는 A 그룹의 나머지 부분에 대한 결합 중의 하나를 나타내며, 별표는 세포 결합제에 대한 부착점 또는 A 그룹의 나머지 부분에 대한 결합 중의 다른 것을 나타낸다.
세포 결합제에 L1을 연결하는데 적합한 다른 그룹은 WO　2005/082023에 기술되어 있다.
그룹 R10은 그룹 RL로부터 유도될 수 있다. 그룹 RL은 세포 결합제를 RL의 작용 그룹에 연결시킴으로써 그룹 R10으로 전환될 수 있다. 다른 단계는 RL을 R10으로 전환시키도록 수행될 수 있다. 이들 단계는 보호 그룹이 존재하는 경우에 이들의 제거, 또는 적절한 작용 그룹의 제공을 유도할 수 있다.
Q
한가지 구체예에서, Q는 O, S, 또는 N(H)로부터 선택된다.
바람직하게는, Q는 O이다.
R 11
한가지 구체예에서, R11은 H 또는 R이거나, Q가 O인 경우에는 SO3M이며, 여기에서 M은 금속 양이온이다.
한가지 구체예에서, R11은 H이다.
한가지 구체예에서, R11은 R이다.
한가지 구체예에서, Q가 O인 경우에 R11은 SO3M이며, 여기에서 M은 금속 양이온이다. 상기 양이온은 Na+일 수 있다.
R L
한가지 구체예에서, RL은 세포 결합제에 대한 연결을 위한 링커이다.
한가지 구체예에서, 링커는 세포 결합제에 대한 연결을 형성시키기 위한 작용 그룹을 갖는다. 이러한 적용은 특히 N10 위치에 대한 카바메이트 결합을 갖는 이들 RL 그룹에 관한 것이다. 상기 R10에서 연결 그룹의 설명은 또한, 여기에서 그들의 중간 전구체에 대해서도 적절하다.
RL은 세포 결합제와의 반응에 적합하지 않은 RC와 상이하다. 그러나, 일부의 구체예에서 RC는 예를 들어, RC이거나 RC의 일부분을 형성하는 보호 그룹 및 그 밖의 다른 작용기의 적절한 조작에 의해서 그룹 RL로 전환될 수 있다.
한가지 구체예에서, RL은 다음의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00047
여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, G1은 세포 결합제에 대한 연결을 형성시키기 위한 작용 그룹이며, L1은 링커이고, L2는 공유결합이거나, -OC(=O)-와 함께 자체-희생적 링커를 형성하며, L1 또는 L2는 분해가능한 링커이다.
L1 및 L2는 R10과 관련하여 상기 정의한 바와 같다. A에 대한 연결에 대한 바람직한 사항은 여기에서 G1에 대한 연결에 대해 언급한 것으로 해석될 수 있다.
한가지 구체예에서, L1이 아미노산을 포함하는 경우에, 그 아미노산의 측쇄는 보호될 수 있다. 한가지 구체예에서, 측쇄 보호 그룹은 화합물 내에 다른 보호 그룹이 존재하는 경우에 이들에 의해 제거할 수 있다. 다른 구체예에서, 보호 그룹은 분자 내에 다른 보호 그룹이 존재하는 경우에 이에 대해서 직교할 수 있다.
아미노산 측쇄에 대해서 적합한 보호 그룹은 노바비오켐 카탈로그 2006/2007에 기술된 그룹들을 포함한다. 카텝신 불안정성 링커에 사용하기 위한 보호 그룹은 또한 두보우치크 (Dubowchik) 등에서 거론된다.
본 발명의 특정의 구체예에서, 그룹 L1은 Lys 아미노산 잔기를 포함한다. 이 아미노산의 측쇄는 Boc 또는 Alloc 보호된 그룹에 의해서 보호될 수 있다. Boc 보호 그룹이 가장 바람직하다.
작용 그룹 G1은 세포 결합제와 반응시에 연결 그룹 A를 형성한다.
한가지 구체예에서, 작용 그룹 G1은 세포 결합제 상의 적절한 그룹과의 반응을 위해서 아미노, 카복실산, 하이드록실, 티올 또는 말레이미드 그룹이거나, 이러한 그룹을 포함한다. 바람직한 구체예에서, G1은 말레이미드 그룹을 포함한다.
한가지 구체예에서, 그룹 G1은 알킬 말레이미드 그룹이다. 이 그룹은 세포 결합제 내에 존재하는, 예를 들어, 항체 내에 존재하는 티올 그룹, 특히 시스테인 티올 그룹과의 반응에 적합하다.
한가지 구체예에서, 그룹 G1은 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00048
여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 내지 6이다. 한가지 구체예에서, n은 5이다.
한가지 구체예에서, 그룹 G1은 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00049
여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 내지 6이다. 한가지 구체예에서, n은 5이다.
한가지 구체예에서, 그룹 G1은 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00050
여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 또는 1이며, m은 0 내지　30이다. 바람직한 구체예에서, n은 1이고, m은 0 내지 10, 1 내지 2, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는　8이다. 대신으로, m은 0 내지 50이다. 이 구체예에서, m은 바람직하게는 10-40이고, n은 1이다.
한가지 구체예에서, 그룹 G1은 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00051
여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 또는 1이며, m은 0 내지　30이다. 바람직한 구체예에서, n은 1이고, m은 0 내지 10, 1 내지 8, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는 8이다. 대신으로, m은 0 내지 50이다. 이 구체예에서, m은 바람직하게는 10-40이며, n은 1이다.
상기 구체예의 각각에서는, 이하에 나타낸 말레이미드 그룹 대신에 대체 작용기가 사용될 수 있다:
Figure 112012086532911-pct00052
여기에서 별표는 G 그룹의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다.
한가지 구체예에서, 말레이미드-유도된 그룹은 다음의 그룹으로 대체된다:
Figure 112012086532911-pct00053
여기에서 별표는 G 그룹의 나머지 부분에 대한 결합을 나타낸다.
한가지 구체예에서, 말레이미드 그룹은 다음의 그룹들로부터 선택된 그룹에 의해서 대체된다:
-C(=O)OH,
-OH,
-NH2,
-SH,
-C(=O)CH-2D (여기에서 D는 Cl, Br 또는 I이다),
-CHO,
-NHNH2
-C≡CH, 및
-N3 (아지드).
한가지 구체예에서, L1이 존재하는 경우에 G1은 -NH2, -NHMe, -COOH, -OH 또는 -SH이다.
한가지 구체예에서, L1이 존재하는 경우에 G1은 -NH2 또는 -NHMe이다. 어느 하나의 그룹은 L1 아미노산 서열의 N-말단일 수 있다.
한가지 구체예에서, L1이 존재하는 경우에 G1은 -NH2이고, L1은 R10에 관하여 상기 정의한 바와 같은 아미노산 서열 -X1-X2-이다.
한가지 구체예에서, L1이 존재하는 경우에 G1은 COOH이다. 이 그룹은 L1아미노산 서열의 C-말단일 수 있다.
한가지 구체예에서, L1이 존재하는 경우에 G1은 OH이다.
한가지 구체예에서, L1이 존재하는 경우에 G1은 SH이다.
그룹 G1은 하나의 작용 그룹으로부터 또 다른 것으로 전환될 수 있다. 한가지 구체예에서, L1이 존재하는 경우에 G1은 -NH2이다. 이 그룹은 말레이미드 그룹을 포함하는 또 다른 그룹 G1으로 전환될 수 있다. 예를 들어, 그룹 -NH2는 상기에 나타낸 말레이미드를 포함하는 이들 G1 그룹의 산 또는 활성화된 산 (예를 들어, N-석신이미드 형태)과 반응할 수 있다.
따라서, 그룹 G1은 세포 결합제와의 반응에 더욱 적절한 작용 그룹으로 전환될 수 있다.
다른 구체예에서, RL은 작용 그룹이 제공된 링커에 대한 전구체인 그룹이다.
상기에 나타낸 바와 같이, 한가지 구체예에서 L1이 존재하는 경우에, G1은 -NH2, -NHMe, -COOH, -OH 또는 -SH이다. 추가의 구체예에서, 이들 그룹은 화학적으로 보호된 형태로 제공된다. 따라서, 화학적으로 보호된 형태는 작용 그룹이 제공된 링커에 대한 전구체이다.
한가지 구체예에서, G1은 화학적으로 보호된 형태의 -NH2이다. 이 그룹은 카바메이트 보호 그룹에 의해서 보호될 수 있다. 카바메이트 보호 그룹은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Cbz 및 PNZ.
바람직하게는, G1이 -NH2인 경우에 이것은 Alloc 또는 Fmoc 그룹에 의해서 보호된다.
한가지 구체예에서, G1이 -NH2인 경우에 이것은 Fmoc 그룹에 의해서 보호된다.
한가지 구체예에서, 보호 그룹은 캡핑 그룹의 카바메이트 보호 그룹과 동일하다.
한가지 구체예에서, 보호 그룹은 캡핑 그룹의 카바메이트 보호 그룹과 동일하지 않다. 이 구체예에서, 보호 그룹은 캡핑 그룹의 카바메이트 보호 그룹을 제거하지 않는 조건 하에서 제거될 수 있는 것이 바람직하다.
화학적 보호 그룹은 제거되어 세포 결합제에 대한 연결을 형성하는 작용 그룹을 제공할 수 있다. 임의로, 이 작용 그룹은 그 후에 상술한 바와 같은 또 다른 작용 그룹으로 전환될 수 있다.
한가지 구체예에서, 활성 그룹은 아민이다. 이 아민은 바람직하게는 펩타이드의 N-말단 아민이며, 본 발명의 바람직한 디펩타이드의 N-말단 아민일 수 있다.
활성 그룹은 세포 결합제에 대한 연결을 형성시키도록 예정된 작용 그룹을 수득하도록 반응시킬 수 있다.
다른 구체예에서, 링커는 활성 그룹을 갖는 링커에 대한 전구체이다. 이 구체예에서, 링커는 보호 그룹을 이용하여 보호된 활성 그룹을 포함한다. 보호 그룹을 제거하여 활성 그룹을 갖는 링커를 제공할 수 있다.
활성 그룹이 아민인 경우에, 보호 그룹은 그린 (Green) 우츠 (Wuts)에 의해서 기술된 것과 같은 아민 보호 그룹일 수 있다.
보호 그룹은 바람직하게는 그룹 RL에 존재하는 다른 보호 그룹에 대해서 직교한다.
한가지 구체예에서, 보호 그룹은 캡핑 그룹에 대해서 직교한다. 따라서, 활성 그룹 보호 그룹은 캡핑 그룹은 유지시키면서 제거될 수 있다. 다른 구체예에서, 보호 그룹 및 캡핑 그룹은 캡핑 그룹을 제거하기 위해서 사용된 것과 같은 동일한 조건 하에서 제거될 수 있다.
한가지 구체예에서, RL은 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00054
여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L1의 나머지 부분에 대한 부착점 또는 G1에 대한 부착점을 나타낸다. 바람직하게는, 파선은 G1에 대한 부착점을 나타낸다.
한가지 구체예에서, RL은 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00055
여기에서 별표 및 파선은 상기 정의한 바와 같다.
한가지 구체예에서, RL은 다음과 같다:
Figure 112012086532911-pct00056
여기에서 별표 및 파선은 상기 정의한 바와 같다.
L1과 세포 결합제 사이의 연결을 형성시키는데 사용하기에 적합한 그 밖의 다른 작용 그룹은 WO 2005/082023에 기술되어 있다.
링커는 하나 또는 그 이상의 아미노산 유니트를 포함하는 프로테아제-분해가능한 펩타이드 부분을 포함할 수 있다. 펩타이드 링커 시약은 레이닌 심포니 (Rainin Symphony) 펩타이드 합성기 (Protein Technologies, Inc., Tucson, AZ), 또는 모델 (Model) 433 (Applied Biosystems, Foster City, CA)과 같은 자동화 합성기 상에서 t-BOC 화학 [Geiser et al., "Automation of solid-phase peptide synthesis" in Macromolecular Sequencing and Synthesis, Alan R. Liss, Inc., 1988, pp. 199-218] 및 Fmoc/HBTU 화학 [Fields, G. and Noble, R. (1990), "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl amino acids", Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214]을 포함한, 펩타이드 화학의 분야에서 잘 알려진 고체상 또는 액체상 합성방법 [E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, volume 1, pp 76-136 (1965) Academic Press]에 의해서 제조될 수 있다.
예시적인 아미노산 링커에는 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드 또는 펜타펩타이드가 포함된다. 예시적인 디펩타이드에는 다음이 포함된다: 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe). 예시적인 트리펩타이드에는 다음이 포함된다: 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly). 아미노산 링커 성분을 포함하는 아미노산 잔기에는 천연적으로 존재하는 것뿐만 아니라 소수의 아미노산 및 비-천연적으로 존재하는 아미노산 유사체, 예를 들어, 시트룰린이 포함된다. 아미노산 링커 성분은 특별한 효소, 예를 들어, 종양-연관된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라즈민 프로테아제에 의한 효소적 분해에 대한 그들의 선택성에 관해서 디자인되고 최적화될 수 있다.
아미노산 측쇄에는 천연적으로 존재하는 것뿐만 아니라 소수의 아미노산 및 비-천연적으로 존재하는 아미노산 유사체, 예를 들어, 시트룰린이 포함된다. 아미노산 측쇄에는 수소, 메틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, 벤질, p-하이드록시벤질, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-피리딜메틸-, 3-피리딜메틸-, 4-피리딜메틸-, 페닐, 사이클로헥실뿐만 아니라 다음 구조의 그룹이 포함된다:
Figure 112012086532911-pct00057
아미노산 측쇄가 수소가 아닌 것을 포함하는 경우에 (글리신), 아미노산 측쇄가 부착된 탄소 원자는 키랄성이다. 아미노산 측쇄가 부착된 각각의 탄소 원자는 독립적으로 (S) 또는 (R) 배열로 존재하거나, 라세미 혼합물이다. 따라서, 약물-링커 시약은 에탄티오머적으로 순수하거나, 라세미이거나 부분입체이성체일 수 있다.
예시적인 구체예에서, 아미노산 측쇄는 알라닌, 2-아미노-2-사이클로헥실아세트산, 2-아미노-2-페닐아세트산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, γ-아미노부티르산, α,α-디메틸 γ-아미노부티르산, β,β-디메틸 γ-아미노부티르산, 오르니틴, 및 시트룰린 (Cit)을 포함한 천연 및 비-천연 아미노산의 측쇄로부터 선택된다.
파라-아미노벤질카바모일 (PAB) 자체-희생적 스페이서를 갖는 세포 결합제, 예를 들어, 항체에 대한 컨주게이션을 위한 링커-PBD 약물 부분 중간체를 구성하는데 유용한 예시적인 발린-시트룰린 (val-cit 또는 vc) 디펩타이드 링커 시약은 다음의 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00058
여기에서 Q는 C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -NO2 또는 -CN이며; m은 0 내지 4 범위의 정수이다.
p-아미노벤질 그룹을 갖는 예시적인 phe-lys(Mtr) 디펩타이드 링커 시약은 문헌 [Dubowchik, et al., (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60]에 따라 제조될 수 있으며, 다음의 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00059
여기에서 Mtr은 모노-4-메톡시트리틸이고, Q는 C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -NO2 또는 -CN이며; m은 0-4 범위의 정수이다.
"자체-희생적 링커" PAB (파라-아미노벤질옥시카보닐)는 항체 약물 컨주게이트에서 약물 부분을 항체에 부착시킨다 [Carl et al (1981) J. Med. Chem. 24:479-480; Chakravarty et al (1983) J. Med. Chem. 26:638-644; US 6214345; US20030130189; US20030096743; US6759509; US20040052793; US6218519; US6835807; US6268488; US20040018194; WO98/13059; US20040052793; US6677435; US5621002; US20040121940; WO2004/032828]. PAB 이외의 자체-희생적 스페이서의 다른 예로는 다음이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: (i) 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 [Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237], 티아졸 (US 7375078), 다수의 연장된 PAB 유니트 [de Groot et al (2001) J. Org. Chem. 66:8815-8830]; 및 오르토 또는 파라-아미노벤질아세탈과 같은 PAB 그룹과 전자적으로 유사한 방향족 화합물; 및 (ii) 동족체화된 (homologated) 스티릴 PAB 유사체 (US 7223837). 치환 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 [Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223], 적절하게 치환된 비사이클로[2.2.1] 및 비사이클로[2.2.2] 환 시스템 [Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815] 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 [Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5867]와 같이 아미드 결합 가수분해에 따라 폐환을 겪는 스페이서가 사용될 수 있다. 글리신에서 치환된 아민-함유 약물의 제거 [Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1447]는 또한 ADC에서 유용한 자체-희생적 스페이서의 예이다.
한가지 구체예에서, 발린-시트룰린 디펩타이드 PAB 유사체 시약은 2,6 디메틸 페닐 그룹을 가지며, 다음을 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00060
본 발명의 항체 약물 컨주게이트에 유용한 링커 시약에는 다음이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB (석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트), 및 비스-말레이미드 시약: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, 1,8-비스-말레이미도디에틸렌글리콜 (BM(PEO)2), 및 1,11-비스-말레이미도트리에틸렌글리콜 (BM(PEO)3) (이들은 Pierce Biotechnology, Inc., ThermoScientific, Rockford, IL, 및 그 밖의 다른 시약 공급자들로부터 상업적으로 입수할 수 있다). 비스-말레이미드 시약은 순차적 또는 동시적 방식으로 티올-함유 약물 부분, 라벨 또는 링커 중간체에 대한 항체의 시스테인 잔기의 유리 티올 그룹의 부착을 허용한다. 말레이미드 이외에 항체, PBD 약물 부분, 또는 링커 중간체의 티올 그룹과 반응성인 그 밖의 다른 작용 그룹에는 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디설파이드, 피리딜 디설파이드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트가 포함된다.
Figure 112012086532911-pct00061
링커 시약의 그 밖의 다른 구체예는 다음과 같다: N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 [SPDP, Carlsson et al (1978) Biochem. J. 173:723-737], 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예를 들어, 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예를 들어, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠). 유용한 링커 시약은 또한 Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO)와 같은 다른 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 문헌 [Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828]에 기술된 절차에 따라 합성될 수도 있다.
링커는 분지화 (branching) 다작용성 링커 부분을 통한 항체에 대한 하나 이상의 약물 부분의 공유적 부착을 위해서 수지상 (dendritic) 타입 링커일 수도 있다 [US 2006/116422; US 2005/271615; de Groot et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4490-4494; Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4494-4499; Shamis et al (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:1726-1731; Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768; King et al (2002) Tetrahedron Letters 43:1987-1990]. 수지상 링커는 항체에 대한 약물의 몰비율, 즉 ADC의 효능과 관련된 부하량을 증가시킬 수 있다. 따라서, 항체가 단지 하나의 반응성 시스테인 티올 그룹을 갖는 경우에, 다수의 약물 부분은 수지상 또는 분지된 링커를 통해서 부착될 수 있다.
수지상 타입 링커의 한가지 예시적 구체예는 다음의 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00062
여기에서 별표는 PBD 부분의 N10 위치에 대한 부착점을 나타낸다.
세포 결합제
세포 결합제는 어떤 종류의 것이라도 될 수 있으며, 펩타이드 및 비-펩타이드를 포함한다. 이들에는 항체 또는 적어도 하나 결합 부위를 함유하는 항체의 단편, 림포킨, 호르몬, 성장 인자, 영양소-수송 (nutrient-transport) 분자, 또는 그 밖의 다른 세포 결합 분자 또는 물질이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "항체"는 광범한 개념으로 사용되며, 구체적으로는 이들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다이머, 멀티머, 다중특이성 (multispecific) 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체), 및 항체 단편을 포함한다 [Miller et al (2003) Jour . of Immunology 170:4854-4861]. 항체는 쥐, 인간, 인간화, 키메릭 항체이거나, 또는 다른 종으로부터 유도된 것일 수 있다. 항체는 특이적 항체를 인식하고, 그에 대해 결합할 수 있는 면역 시스템에 의해서 생성된 단백질이다 [Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology , 5 th Ed., Garland Publishing, New York]. 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDRs에 의해서 인식되는 것으로, 에피토프 (epitope)로도 불리는 다수의 결합 부위를 갖는다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각각의 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다. 항체는 전체-길이 면역글로불린 분자 또는 전체-길이 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 관심이 있는 표적의 항원 또는 그의 일부분 (이러한 표적은 자가면역 질병과 연관된 자가면역 항체를 생산하는 암세포 또는 세포들을 포함하나 이들로 제한되지 않는다)을 면역특이적으로 결합시키는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린은 어떤 타입 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자라도 될 수 있다. 면역글로불린은 인간, 쥐 또는 토끼 기원을 포함하는 어떤 종으로부터라도 유도될 수 있다.
"항체 단편"은 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 구역인 전체 길이 항체의 일부분을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디 (diabodies); 선형 항체; 암세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 면역특이적으로 결합하는 Fab 발현 라이브러리에 의해서 생산된 단편, 항-이디오타입 (안티-Id) 항체, CDR (상보성 결정 구역), 및 상기한 것 중의 어떤 것의 에피토프-결합 단편, 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함된다.
본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉 소량으로 존재할 수 있는 천연적으로 존재하는 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단을 포함하는 개별적인 항체를 나타낸다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 유도되는 것으로서 매우 특이적이다. 더구나, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 그들의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해서 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내며, 어떤 특별한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 코흘러 (Kohler) 등에 의해서 최초로 기술된 하이브리도마 방법 [Kohler et al (1975) Nature 256:495]에 의해서 제조될 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (참조: US 4816567)에 의해서 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 문헌 [Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597]에 기술된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수도 있다.
본 발명에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특별한 종으로부터 유도되거나 특별한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 그와 상동성인 한편 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 그와 상동성인 "키메릭" 항체뿐만 아니라, 이들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 [US 4816567; and Morrison et al (1984) Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 81:6851-6855]. 키메릭 항체는 비-인간 영장류로부터 유도된 가변 영역 항원-결합 서열 및 인간 불변 구역 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다.
본 발명에서 "온전한 항체"는 VL 및 VH 영역뿐만 아니라 경쇄 불변 영역 (CL) 및 중쇄 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 영역은 천연 서열 불변 영역 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 영역) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 온전한 항체는 항체의 Fc 구역 (천연 서열 Fc 구역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 구역)에 기인하는 이들 생물학적 활성을 나타내는 하나 또는 그 이상의 "효과기 기능"을 가질 수 있다. 항체 효과기 기능의 예로는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식작용; 및 B 세포 수용체 및 BCR과 같은 세포 표면 수용체의 하류 조절이 포함된다.
그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 온전한 항체는 상이한 "클래스"로 지정될 수 있다. 온전한 항체에는 5 가지의 주된 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM가 있으며, 이들 중의 몇 가지는 "서브클래스" (이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 항체의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유니트 구조 및 삼차원 배열은 잘 알려져 있다.
세포 결합제의 예로는 본 명세서에 포함된 WO　2007/085930에서 사용하기 위해서 기술된 성분이 포함된다.
세포 결합제는 폴리펩타이드일 수 있거나, 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 사이클릭 폴리펩타이드일 수 있다. 세포 결합제는 항체일 수 있다. 따라서, 한가지 구체예에서 본 발명은 항체-약물 컨주게이트 (ADC)를 제공한다.
약물 부하량
약물 부하량은 항체당 PBD 약물의 평균 수이다. 약물 부하량은 항체 (Ab)당 1 내지 8 개의 약물 (D)의 범위일 수 있으며, 즉 여기에서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 개의 약물 부분이 항체에 공유적으로 부착된다. ADC의 조성물은 1 내지 8 개 범위의 약물과 컨주게이트된 항체의 수집물을 포함한다. 컨주게이션 반응으로부터의 ADC의 제제에서 항체당 약물의 평균 수는 질량 분광분석, ELISA 분석, 전기영동, 및 HPLC와 같은 통상적인 방법에 의해서 특정화될 수 있다. p의 관점에서의 ADC의 정량적 분포가 또한 결정될 수 있다. ELISA에 의해 ADC의 특별한 제제에서의 p의 평균값이 결정될 수 있다 [Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852]. 그러나, p (약물) 값의 분포는 항체-항원 결합 및 ELISA의 검출 한계에 의해서 식별할 수 없다. 또한, 항체-약물 컨주게이트의 검출을 위한 ELISA 분석은 약물 부분이 중쇄 또는 경쇄 단편, 또는 특별한 아미노산 잔기와 같은 항체에 부착된 것을 결정하지 못한다. 일부의 경우에, 다른 약물 부하량을 갖는 ADC로부터 p가 특정한 값인 균질한 ADC의 분리, 정제 및 특정화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 방법에 의해서 달성될 수 있다.
일부의 항체-약물 컨주게이트의 경우에, p는 항체 상의 부착점의 수에 의해서 제한될 수 있다. 예를 들어, 항체는 단지 한 개 또는 몇 개의 시스테인 티올 그룹을 가질 수 있거나, 링커가 그를 통해서 부착될 수 있는 단지 한 개 또는 몇 개의 충분히 반응성인 티올 그룹을 가질 수 있다. 더 큰 약물 부하량, 예를 들어, p >5는 특정의 항체-약물 컨주게이트의 응집, 불용성, 독성 또는 세포 투과성의 상실을 야기할 수 있다.
전형적으로는, 약물 부분의 이론적 최대량보다 더 적은 수가 컨주게이션 반응 중에 항체에 컨주게이트된다. 항체는 예를 들어, 약물-링커 중간체 (D-L) 또는 링커 시약과 반응하지 않는 다수의 리신 잔기를 함유할 수 있다. 가장 반응성인 리신 그룹만이 아민-반응성 링커 시약과 반응할 수 있다. 또한, 가장 반응성인 시스테인 티올 그룹만이 티올-반응성 링커 시약과 반응할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 부분에 연결될 수 있는 유리 반응성 시스테인 티올 그룹을 있다고 하더라도 다수 함유하지 않는다. 화합물의 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디설파이드 브릿지로서 존재하며, 부분적이거나 완전한 환원조건 하에서 디티오트레이톨 (DTT) 또는 TCEP와 같은 환원제에 의해서 환원되어야 한다. ADC의 부하량 (약물/항체 비)은 (i) 항체에 대비한 약물-링커 중간체 (D-L) 또는 링커 시약의 몰과량의 제한, (ii) 컨주게이션 반응 시간 또는 온도의 제한, (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적이거나 제한적인 환원 조건을 포함한 몇 가지 상이한 방식으로 제어될 수 있다.
시스테인 아미노산은 항체 내의 반응성 부위에서 조작될 수 있고, 이것은 쇄내 또는 분자간 디설파이드 결합을 형성하지 않는다 [Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO2009/052249]. 조작된 시스테인 티올은 말레이미드 또는 알파-할로 아미드와 같은 티올-반응성 친전자성 그룹을 갖는 본 발명의 약물-링커 시약 또는 링커 시약과 반응하여 시스테인 조작된 항체와 PBD 약물 부분을 갖는 ADC를 형성할 수 있다. 이렇게 하여 약물 부분의 위치는 디자인되고, 제어되고, 알려질 수 있다. 조작된 시스테인 티올 그룹은 전형적으로 고수율로 티올-반응성 링커 시약 또는 약물-링커 시약과 반응하기 때문에 약물 부하량이 제어될 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 상의 단일 부위에서의 치환에 의해 시스테인 아미노산을 도입시켜 IgG 항체를 조작하는 것은 대칭적 항체 상에 2 개의 새로운 시스테인을 제공한다. 2에 가까운 약물 부하량이 달성되고, 컨주게이션 생성물 ADC의 균질성에 접근할 수 있다.
항체의 하나 이상의 친핵성 또는 친전자성 그룹이 약물-링커 중간체와 반응하거나, 링커 시약과 반응하고 이어서 약물 부분 시약과 반응하는 경우에, 생성된 생성물은 예를 들어, 1, 2, 3 등의 항체에 부착된 약물 부분의 분포를 갖는 ADC 화합물의 혼합물이다. 폴리머 역상 (PLRP) 및 소수성 상호작용 (HIC)과 같은 액체 크로마토그래피 방법은 약물 부하량 값에 의해 혼합물 내의 화합물을 분리시킬 수 있다. 단일 약물 부하량 값 (p)을 갖는 ADC의 제제가 분리될 수 있지만, 약물 부분은 항체 상의 상이한 부위에서 링커를 통해 부착될 수 있기 때문에 이들 단일 부하량 값 ADCs는 여전히 불균질한 혼합물일 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체-약물 컨주게이트 조성물은 항체가 하나 또는 그 이상의 PBD 약물 부분을 갖는 경우 및 약물 부분이 다양한 아미노산 잔기에서 항체에 부착될 수 있는 경우에 항체-약물 컨주게이트 화합물의 혼합물을 포함한다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제당 모노머 또는 다이머 피롤로벤조디아제핀 그룹의 평균 수는 1 내지 20의 범위이다. 일부의 구체예에서, 상기 범위는 1 내지 8, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 4, 및 4 내지 8로부터 선택된다. 일부의 구체예에서는, 세포 결합제당 하나의 모노머 또는 다이머 피롤로벤조디아제핀 그룹이 존재한다.
펩타이드
한가지 구체예에서, 세포 결합제는 4-20 개, 바람직하게는 6-20 개의 접속 아미노산 잔기를 포함하는 선형 또는 사이클릭 펩타이드이다. 이 구체예에서, 하나의 세포 결합제는 하나의 모노머 또는 다이머 피롤로벤조디아제핀 화합물에 연결되는 것이 바람직하다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제는 인테그린 αvβ6에 결합하는 펩타이드를 포함한다. 펩타이드는 XYS에 비해 αvβ6에 대해서 선택적일 수 있다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제는 A20FMDV-Cys 폴리펩타이드를 포함한다. A20FMDV-Cys는 서열 NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC를 갖는다. 대신으로, A20FMDV-Cys 서열의 변이체가 사용될 수 있으며, 여기에서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산 잔기에 의해서 치환된다.
한가지 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체; 키메릭 항체; 인간화된 항체; 완전한 인간 항체; 또는 단일쇄 항체이다. 한가지 구체예에서, 항체는 생물학적 활성을 갖는 이들 항체 중의 하나의 단편이다. 이러한 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편이 포함된다.
이들 구체예에서, 각각의 항체는 하나 또는 몇 개의 모노머 또는 다이머 피롤로벤조디아제핀 그룹에 연결될 수 있다. 세포 결합제에 대한 피롤로벤조디아제핀의 바람직한 비는 상기에 제시된다.
항체는 영역 항체 (domain antibody; DAB)일 수 있다.
한가지 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체에는 본 명세서에 포함된 WO 2005/082023에 기술된 항체가 포함된다. 특히 바람직한 것은 종양-연관된 항원에 대한 항체이다. 본 기술분야에서 공지된 이들 항원의 예로는 WO 2005/082023에 제시된 종양-연관된 항원이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 41-55 면을 참조한다.
본 발명의 컨주게이트는 그들의 세포 표면 항원을 통해서 종양 세포를 표적화하도록 디자인된다. 항원들은 통상적으로 과발현되거나 비정상적인 시기에 발현된 정상적인 세포 표면 항원이다. 이상적으로는 표적 항원은 증식성 세포 (바람직하게는 종양 세포) 상에서만 발현되지만, 이것은 실제로는 거의 관찰되지 않는다. 결과적으로, 표적 항원은 통상적으로 증식성 조직과 건강한 조직 사이의 차등 발현을 기초로 하여 선택된다.
항체는 다음을 포함하는 특이적인 종양 관련 항원을 표적화하도록 유도되었다: Cripto, CD30, CD19, CD33, 당단백질 NMB, CanAg, Her2 (ErbB2/Neu), CD56 (NCAM), CD22 (Siglec2), CD33 (Siglec3), CD79, CD138, PSCA, PSMA (전립선 특이적 막 항원), BCMA, CD20, CD70, E-셀렉틴, EphB2, 멜라노트랜스페린 (Melanotransferin), Muc16 및 TMEFF2.
종양-연관된 항원 (TAA)은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 본 기술분야에서 잘 알려진 방법 및 정보를 사용하여 항체를 생성시키는데 사용하기 위해 제조될 수 있다. 암 진단 및 치료를 위한 효과적인 세포 표적을 발견하기 위한 시도에서, 연구자들은 하나 또는 그 이상의 정상적인 비-암성 세포(들) 상에서보다 하나 또는 그 이상의 특별한 타입(들)의 암세포의 표면 상에서 특이적으로 발현되는 경막성이거나 다른 점에서 종양-연관된 폴리펩타이드를 확인하도록 노력하였다. 종종, 이러한 종양-연관된 폴리펩타이드는 비-암성 세포의 표면 상에서보다 암세포의 표면 상에서 더 풍부하게 발현된다. 이러한 종양-연관된 세포 표면 항원 폴리펩타이드의 확인은 항체-기본 치료법을 통한 파괴를 위해서 암세포를 특이적으로 표적화하는 능력을 발생시켰다.
TAA의 예로는 이하에 열거된 TAA (1)-(36)이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 편의상, 모두 본 기술분야에서 공지되어 있는 이들 항원에 관한 정보는 이하에 열거되며, NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 핵산 및 단백질 서열 확인 규정 다음에 명칭, 대체 명칭, 진뱅크 (Genbank) 수탁번호 및 주요 문헌(들)을 포함한다. TAA (1)-(36)에 상응하는 핵산 및 단백질 서열은 진뱅크와 같은 공용 데이터베이스에서 이용할 수 있다. 항체에 의해서 표적화된 종양-연관된 항원에는 인용된 문헌에서 확인된 서열에 대비한 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖거나, 실질적으로 인용된 문헌에서 제공된 서열을 갖는 TAA로서의 동일한 생물학적 특성 또는 특징을 나타내는 모든 아미노산 서열 변이체 및 이소형태를 포함한다. 예를 들어, 변이체 서열을 갖는 TAA는 일반적으로, 열거된 상응하는 서열을 갖는 TAA에 대해 특이적으로 결합하는 항체에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명에 구체적으로 열거된 문헌에서의 서열 및 설명은 명백하게 참고로 포함된다.
종양-연관된 항원 (1)-(36):
(1) BMPR1B (골형성 단백질 수용체-타입 IB, Genbank 수탁번호 NM_001203) ten Dijke,P., et al Science 264 (5155):101-104 (1994), Oncogene 14 (11):1377-1382 (1997)); WO2004/063362 (Claim 2); WO2003/042661 (Claim 12); US2003/134790-A1 (Page 38-39); WO2002/102235 (Claim 13; Page 296); WO2003/055443 (Page 91-92); WO2002/99122 (Example 2; Page 528-530); WO2003/029421 (Claim 6); WO2003/024392 (Claim 2; Fig 112); WO2002/98358 (Claim 1; Page 183); WO2002/54940 (Page 100-101); WO2002/59377(Page 349-350); WO2002/30268 (Claim 27; Page 376); WO2001/48204 (Example; Fig 4); NP_001194 골형성 단백질 수용체, 타입 IB /pid=NP_001194.1. 교차 참조: MIM:603248; NP_001194.1; AY065994
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, Genbank 수탁번호 NM_003486) Biochem . Biophys. Res . Commun . 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):288-291 (1998), Gaugitsch, H.W., et al (1992) J. Biol . Chem . 267 (16):11267-11273); WO2004/048938 (Example 2); WO2004/032842 (Example IV); WO2003/042661 (Claim 12); WO2003/016475 (Claim 1); WO2002/78524 (Example 2); WO2002/99074 (Claim 19; Page 127-129); WO2002/86443 (Claim 27; Pages 222, 393); WO2003/003906 (Claim 10; Page 293); WO2002/64798 (Claim 33; Page 93-95); WO2000/14228 (Claim 5; Page 133-136); US2003/224454 (Fig 3); WO2003/025138 (Claim 12; Page 150); NP_003477 용질 담체 (solute carrier) 패밀리 7 (양이온성 아미노산 수송체, y+시스템), 멤버 5 /pid=NP_003477.3 - 호모 사피엔스 (Homo sapiens); 교차 참조: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
(3) STEAP1 (전립선의 6 개의 경막 상피 항원, Genbank 수탁번호 NM_012449); Cancer Res . 61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert, R.S., et al (1999) Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A. 96 (25):14523-14528); WO2004/065577 (Claim 6); WO2004/027049 (Fig 1L); EP1394274 (Example 11); WO2004/016225 (Claim 2); WO2003/042661 (Claim 12); US2003/157089 (Example 5); US2003/185830 (Example 5); US2003/064397 (Fig 2); WO2002/89747 (Example 5; Page 618-619); WO2003/022995 (Example 9; Fig 13A, Example 53; Page 173, Example 2; Fig 2A); NP_036581 전립선의 6 개의 경막 상피 항원; 교차 참조: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
(4) 0772P (CA125, MUC16, Genbank 수탁번호 AF361486); J. Biol . Chem . 276 (29):27371-27375 (2001)); WO2004/045553 (Claim 14); WO2002/92836 (Claim 6; Fig 12); WO2002/83866 (Claim 15; Page 116-121); US2003/124140 (Example 16); 교차 참조: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 증강 인자, 메소텔린, Genbank 수탁번호 NM_005823) Yamaguchi, N., et al Biol . Chem . 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A. 96 (20):11531-11536 (1999), Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 93 (1):136-140 (1996), J. Biol . Chem . 270 (37):21984-21990 (1995)); WO2003/101283 (Claim 14); (WO2002/102235 (Claim 13; Page 287-288); WO2002/101075 (Claim 4; Page 308-309); WO2002/71928 (Page 320-321); WO94/10312 (Page 52-57); 교차 참조: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 패밀리 34 (인산나트륨), 멤버 2, 타입 II 나트륨-의존성 포스페이트 수송체 3b, Genbank 수탁번호 NM_006424) J. Biol . Chem . 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al (1999) Biochem . Biophys . Res . Commun . 258 (3):578-582); WO2004/022778 (Claim 2); EP1394274 (Example 11); WO2002/102235 (Claim 13; Page 326); EP0875569 (Claim 1; Page 17-19); WO2001/57188 (Claim 20; Page 329); WO2004/032842 (Example IV); WO2001/75177 (Claim 24; Page 139-140); 교차 참조: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 (Semaphorin) 5b Hlog, 세마 (sema) 영역, 7 개의 트롬보스폰딘 반복체 (타입 1 및 타입 1-유사), 경막 영역 (TM) 및 짧은 세포질 영역, (세마포린) 5B, Genbank 수탁번호 AB040878); Nagase T., et al (2000) DNA Res . 7 (2):143-150); WO2004/000997 (Claim 1); WO2003/003984 (Claim 1); WO2002/06339 (Claim 1; Page 50); WO2001/88133 (Claim 1; Page 41-43, 48-58); WO2003/054152 (Claim 20); WO2003/101400 (Claim 11); Accession: Q9P283; EMBL; AB040878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, Genbank 수탁번호 AY358628); Ross et al (2002) Cancer Res . 62:2546-2553; US2003/129192 (Claim 2); US2004/044180 (Claim 12); US2004/044179 (Claim 11); US2003/096961 (Claim 11); US2003/232056 (Example 5); WO2003/105758 (Claim 12); US2003/206918 (Example 5); EP1347046 (Claim 1); WO2003/025148 (Claim 20); 교차 참조: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
(9) ETBR (엔도텔린 타입 B 수용체, Genbank 수탁번호 AY275463); Nakamuta M., et al Biochem . Biophys . Res . Commun . 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al Biochem . Biophys . Res. Commun . 178, 248-255, 1991; Arai H., et al Jpn . Circ . J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al J. Biol . Chem . 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al Biochem . Biophys. Res . Commun . 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N.A., et al J. Biol . Chem . 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al J. Cardiovasc . Pharmacol . 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; Bourgeois C., et al J. Clin . Endocrinol . Metab . 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al Biol . Chem . 272, 21589-21596, 1997; Verheij J.B., et al Am . J. Med . Genet . 108, 223-225, 2002; Hofstra R.M.W., et al Eur . J. Hum . Genet . 5, 180-185, 1997; Puffenberger E.G., et al Cell 79, 1257-1266, 1994; Attie T., et al , Hum . Mol . Genet . 4, 2407-2409, 1995; Auricchio A., et al Hum . Mol . Genet . 5:351-354, 1996; Amiel J., et al Hum . Mol. Genet . 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W., et al Nat . Genet . 12, 445-447, 1996; Svensson P.J., et al Hum . Genet . 103, 145-148, 1998; Fuchs S., et al Mol . Med . 7, 115-124, 2001; Pingault V., et al (2002) Hum . Genet . 111, 198-206; WO2004/045516 (Claim 1); WO2004/048938 (Example 2); WO2004/040000 (Claim 151); WO2003/087768 (Claim 1); WO2003/016475 (Claim 1); WO2003/016475 (Claim 1); WO2002/61087 (Fig 1); WO2003/016494 (Fig 6); WO2003/025138 (Claim 12; Page 144); WO2001/98351 (Claim 1; Page 124-125); EP0522868 (Claim 8; Fig 2); WO2001/77172 (Claim 1; Page 297-299); US2003/109676; US6518404 (Fig 3); US5773223 (Claim 1a; Col 31-34); WO2004/001004
(10) MSG783 (RNF124, 가상적 단백질 FLJ20315, Genbank 수탁번호 NM_017763); WO2003/104275 (Claim 1); WO2004/046342 (Example 2); WO2003/042661 (Claim 12); WO2003/083074 (Claim 14; Page 61); WO2003/018621 (Claim 1); WO2003/024392 (Claim 2; Fig 93); WO2001/66689 (Example 6); 교차 참조: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 연관된 유전자 1, 전립선암 연관된 단백질 1, 전립선의 6 개의 경막 상피 항원 2, 6 개의 경막 전립선 단백질, Genbank 수탁번호 AF455138); Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)); WO2003/087306; US2003/064397 (Claim 1; Fig 1); WO2002/72596 (Claim 13; Page 54-55); WO2001/72962 (Claim 1; Fig 4B); WO2003/104270 (Claim 11); WO2003/104270 (Claim 16); US2004/005598 (Claim 22); WO2003/042661 (Claim 12); US2003/060612 (Claim 12; Fig 10); WO2002/26822 (Claim 23; Fig 2); WO2002/16429 (Claim 12; Fig 10); 교차 참조: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재성 양이온 채널, 서브패밀리 M, 멤버 4, Genbank 수탁번호 NM_017636); Xu, X.Z., et al Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol . Chem. 278 (33):30813-30820 (2003)); US2003/143557 (Claim 4); WO2000/40614 (Claim 14; Page 100-103); WO2002/10382 (Claim 1; Fig 9A); WO2003/042661 (Claim 12); WO2002/30268 (Claim 27; Page 391); US2003/219806 (Claim 4); WO2001/62794 (Claim 14; Fig 1A-D); 교차 참조: MIM:606936; NP_060106.2; NM_017636_1
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유도된 성장인자, Genbank 수탁번호 NP_003203 or NM_003212); Ciccodicola, A., et al EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am . J. Hum . Genet . 49 (3):555-565 (1991)); US2003/224411 (Claim 1); WO2003/083041 (Example 1); WO2003/034984 (Claim 12); WO2002/88170 (Claim 2; Page 52-53); WO2003/024392 (Claim 2; Fig 58); WO2002/16413 (Claim 1; Page 94-95, 105); WO2002/22808 (Claim 2; Fig 1); US5854399 (Example 2; Col 17-18); US5792616 (Fig 2); 교차 참조: MIM:187395; NP_003203.1; NM_003212_1
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바르 (Epstein Barr) 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792 Genbank 수탁번호 M26004); Fujisaku et al (1989) J. Biol . Chem . 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al J. Exp . Med . 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al Mol . Immunol . 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (1993) J. Immunol . 150, 5311-5320; WO2004/045520 (Example 4); US2004/005538 (Example 1); WO2003/062401 (Claim 9); WO2004/045520 (Example 4); WO91/02536 (Fig 9.1-9.9); WO2004/020595 (Claim 1); Accession: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
(15) CD79b (CD79B, CD79b, IGb (면역글로불린-연관된 베타), B29, Genbank 수탁번호 NM_000626 또는 11038674); Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al (1992) Eur . J. Immunol . 22 (6):1621-1625); WO2004/016225 (claim 2, Fig 140); WO2003/087768, US2004/101874 (claim 1, page 102); WO2003/062401 (claim 9); WO2002/78524 (Example 2); US2002/150573 (claim 5, page 15); US5644033; WO2003/048202 (claim 1, pages 306 및 309); WO 99/58658, US6534482 (claim 13, Fig 17A/B); WO2000/55351 (claim 11, pages 1145-1146); 교차 참조: MIM:147245; NP_000617.1; NM_000626_1
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 영역 함유 포스파타제 앵커 (anchor) 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, Genbank 수탁번호 NM_030764, AY358130); Genome Res . 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys . Res. Commun . 280 (3):768-775; WO2004/016225 (Claim 2); WO2003/077836; WO2001/38490 (Claim 5; Fig 18D-1-18D-2); WO2003/097803 (Claim 12); WO2003/089624 (Claim 25); 교차 참조: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
(17) HER2 (ErbB2, Genbank 수탁번호 M11730); Coussens L., et al Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J.M., et al J. Cell Biol . 165, 869-880, 2004; Kuhns J.J., et al J. Biol . Chem . 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al Nature 421, 756-760, 2003; Ehsani A., et al (1993) Genomics 15, 426-429; WO2004/048938 (Example 2); WO2004/027049 (Fig 1I); WO2004/009622; WO2003/081210; WO2003/089904 (Claim 9); WO2003/016475 (Claim 1); US2003/118592; WO2003/008537 (Claim 1); WO2003/055439 (Claim 29; Fig 1A-B); WO2003/025228 (Claim 37; Fig 5C); WO2002/22636 (Example 13; Page 95-107); WO2002/12341 (Claim 68; Fig 7); WO2002/13847 (Page 71-74); WO2002/14503 (Page 114-117); WO2001/53463 (Claim 2; Page 41-46); WO2001/41787 (Page 15); WO2000/44899 (Claim 52; Fig 7); WO2000/20579 (Claim 3; Fig 2); US5869445 (Claim 3; Col 31-38); WO9630514 (Claim 2; Page 56-61); EP1439393 (Claim 7); WO2004/043361 (Claim 7); WO2004/022709; WO2001/00244 (Example 3; Fig 4); Accession: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761; AAA35808.1
(18) NCA (CEACAM6, Genbank 수탁번호 M18728); Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al Biochem . Biophys . Res . Commun . 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 99:16899-16903, 2002; WO2004/063709; EP1439393 (Claim 7); WO2004/044178 (Example 4); WO2004/031238; WO2003/042661 (Claim 12); WO2002/78524 (Example 2); WO2002/86443 (Claim 27; Page 427); WO2002/60317 (Claim 2); Accession: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728
(19) MDP (DPEP1, Genbank 수탁번호 BC017023); Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 99 (26):16899-16903 (2002)); WO2003/016475 (Claim 1); WO2002/64798 (Claim 33; Page 85-87); JP05003790 (Fig 6-8); WO99/46284 (Fig 9); 교차 참조: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023_1
(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, Genbank 수탁번호 AF184971); Clark H.F., et al Genome Res . 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumberg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al J. Immunol . 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al J. Biol . Chem . 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al (2004) J. Immunol . 172, 2006-2010; EP1394274 (Example 11); US2004/005320 (Example 5); WO2003/029262 (Page 74-75); WO2003/002717 (Claim 2; Page 63); WO2002/22153 (Page 45-47); US2002/042366 (Page 20-21); WO2001/46261 (Page 57-59); WO2001/46232 (Page 63-65); WO98/37193 (Claim 1; Page 55-59); Accession: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAF01320.1.
(21) Brevican (BCAN, BEHAB, Genbank 수탁번호 AF229053); Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000; Clark H.F., et al Genome Res . 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R.L., et al Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 99, 16899-16903, 2002; US2003/186372 (Claim 11); US2003/186373 (Claim 11); US2003/119131 (Claim 1; Fig 52); US2003/119122 (Claim 1; Fig 52); US2003/119126 (Claim 1); US2003/119121 (Claim 1; Fig 52); US2003/119129 (Claim 1); US2003/119130 (Claim 1); US2003/119128 (Claim 1; Fig 52); US2003/119125 (Claim 1); WO2003/016475 (Claim 1); WO2002/02634 (Claim 1)
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, Genbank 수탁번호 NM_004442); Chan,J. and Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)); WO2003042661 (Claim 12); WO200053216 (Claim 1; Page 41); WO2004065576 (Claim 1); WO2004020583 (Claim 9); WO2003004529 (Page 128-132); WO200053216 (Claim 1; Page 42); 교차 참조: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
(23) ASLG659 (B7h, Genbank 수탁번호 AX092328); US2004/0101899 (Claim 2); WO2003104399 (Claim 11); WO2004000221 (Fig 3); US2003/165504 (Claim 1); US2003/124140 (Example 2); US2003/065143 (Fig 60); WO2002/102235 (Claim 13; Page 299); US2003/091580 (Example 2); WO2002/10187 (Claim 6; Fig 10); WO2001/94641 (Claim 12; Fig 7b); WO2002/02624 (Claim 13; Fig 1A-1B); US2002/034749 (Claim 54; Page 45-46); WO2002/06317 (Example 2; Page 320-321, Claim 34; Page 321-322); WO2002/71928 (Page 468-469); WO2002/02587 (Example 1; Fig 1); WO2001/40269 (Example 3; Pages 190-192); WO2000/36107 (Example 2; Page 205-207); WO2004/053079 (Claim 12); WO2003/004989 (Claim 1); WO2002/71928 (Page 233-234, 452-453); WO 01/16318
(24) PSCA (전립선 줄기세포 항원 전구체, Genbank 수탁번호 AJ297436); Reiter R.E., et al Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al Oncogene 19, 1288-1296, 2000; Biochem . Biophys . Res . Commun . (2000) 275(3):783-788; WO2004/022709; EP1394274 (Example 11); US2004/018553 (Claim 17); WO2003/008537 (Claim 1); WO2002/81646 (Claim 1; Page 164); WO2003/003906 (Claim 10; Page 288); WO2001/40309 (Example 1; Fig 17); US2001/055751 (Example 1; Fig 1b); WO2000/32752 (Claim 18; Fig 1); WO98/51805 (Claim 17; Page 97); WO98/51824 (Claim 10; Page 94); WO98/40403 (Claim 2; Fig 1B); Accession: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1
(25) GEDA (Genbank 수탁번호 AY260763); AAP14954 지방종 H㎎IC 융합-파트너-유사 단백질 /pid=AAP14954.1 - 호모 사피엔스 (인간); WO2003/054152 (Claim 20); WO2003/000842 (Claim 1); WO2003/023013 (Example 3, Claim 20); US2003/194704 (Claim 45); 교차 참조: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
(26) BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3, Genbank 수탁번호 AF116456); BAFF 수용체 /pid=NP_443177.1 - 호모 사피엔스: Thompson, J.S., et al Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO2004/058309; WO2004/011611; WO2003/045422 (Example; Page 32-33); WO2003/014294 (Claim 35; Fig 6B); WO2003/035846 (Claim 70; Page 615-616); WO2002/94852 (Col 136-137); WO2002/38766 (Claim 3; Page 133); WO2002/24909 (Example 3; Fig 3); 교차 참조: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1; AF132600
(27) CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 이소형태, BL-CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, Genbank 수탁번호 AK026467); Wilson et al (1991) J. Exp. Med . 173:137-146; WO2003/072036 (Claim 1; Fig 1); 교차 참조: MIM:107266; NP_001762.1; NM_001771_1
(28) CD79a (CD79A, CD79a, 면역글로불린-연관된 알파, Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호작용하고, Ig M 분자와 표면 상에서 컴플렉스를 형성하며, B-세포 분화에 연루된 시그날을 전달하는 B 세포-특이적 단백질), pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] 유전자 염색체: 19q13.2, Genbank 수탁번호 NP_001774.10); WO2003/088808, US2003/0228319; WO2003/062401 (claim 9); US2002/150573 (claim 4, pages 13-14); WO99/58658 (claim 13, Fig 16); WO92/07574 (Fig 1); US5644033; Ha et al (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Muller et al (1992) Eur . J. Immunol .. 22:1621-1625; Hashimoto et al (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al (1992) Clin . Exp . Immunol. 90(1):141-146; Yu et al (1992) J. Immunol . 148(2) 633-637; Sakaguchi et al (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464
(29) CXCR5 (버킷 (Burkitt) 림프종 수용체 1, CXCL13 케모킨에 의해서 활성화되고, 림프구 이동 및 체액 방어에 작용하며, HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병의 발생에 역할을 하는 G 단백질-커플링된 수용체); 372 aa, pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] 유전자 염색체: 11q23.3, Genbank 수탁번호 NP_001707.1); WO2004/040000; WO2004/015426; US2003/105292 (Example 2); US6555339 (Example 2); WO2002/61087 (Fig 1); WO2001/57188 (Claim 20, page 269); WO2001/72830 (pages 12-13); WO2000/22129 (Example 1, pages 152-153, Example 2, pages 254-256); WO99/28468 (claim 1, page 38); US5440021 (Example 2, col 49-52); WO94/28931 (pages 56-58); WO92/17497 (claim 7, Fig 5); Dobner et al (1992) Eur . J. Immunol . 22:2795-2799; Barella et al (1995) Biochem . J. 309:773-779
(30) HLA-DOB (펩타이드에 결합하고, 이들을 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 클래스 II 분자 (Ia 항원)의 베타 서브유니트); 273 aa, pI: 6.56, MW: 30820.TM: 1 [P] 유전자 염색체: 6p21.3, Genbank 수탁번호 NP_002111.1); Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al (1992) J. Mol . Biol . 228:433-441; Strausberg et al (2002) Proc . Natl . Acad . Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol . Chem . 262:8759-8766; Beck et al (1996) J. Mol. Biol . 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens 59:512-519; WO99/58658 (claim 13, Fig 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168-170); US6011146 (col 145-146); Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol . Chem . 260(26):14111-14119
(31) P2X5 (세포외 ATP에 의해서 개폐되는 이온 채널인 퓨린 작동성 수용체 P2X 리간드-개폐 이온 채널이 시냅스성 전달 및 신경발생에 연루될 수 있으며, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정성의 병태생리학의 원인이 될 수 있다); 422 aa), pI: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 17p13.3, Genbank 수탁번호 NP_002552.2); Le et al (1997) FEBS Lett . 418(1-2):195-199; WO2004/047749; WO2003/072035 (claim 10); Touchman et al (2000) Genome Res . 10:165-173; WO2002/22660 (claim 20); WO2003/093444 (claim 1); WO2003/087768 (claim 1); WO2003/029277 (page 82)
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2); 359 aa, pI: 8.66, MW: 40225, TM: 1 [P] 유전자 염색체: 9p13.3, Genbank 수탁번호 NP_001773.1); WO2004042346 (claim 65); WO2003/026493 (pages 51-52, 57-58); WO2000/75655 (pages 105-106); Von Hoegen et al (1990) J. Immunol . 144(12):4870-4877; Strausberg et al (2002) Proc . Natl . Acad . Sci USA 99:16899-16903.
(33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복체 (LRR) 패밀리의 타입 I 막단백질, B-세포 활성화 및 세포소멸을 조절하며, 기능의 상실은 전신성 홍반성 루푸스가 있는 환자에게서 증가된 질병 활성과 연관된다); 661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 5q12, Genbank 수탁번호 NP_005573.1); US2002/193567; WO97/07198 (claim 11, pages 39-42); Miura et al (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822; WO2003/083047; WO97/44452 (claim 8, pages 57-61); WO2000/12130 (pages 24-26)
(34) FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1, C2 타입 Ig-유사 및 ITAM 영역을 함유하며, B-림프구 분화에 역할을 할 수 있는 면역글로불린 Fc 영역에 대한 추정상의 수용체); 429 aa, pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] 유전자 염색체: 1q21-1q22, Genbank 수탁번호 NP_443170.1); WO2003/077836; WO2001/38490 (claim 6, Fig 18E-1-18-E-2); Davis et al (2001) Proc . Natl . Acad . Sci USA 98(17):9772-9777; WO2003/089624 (claim 8); EP1347046 (claim 1); WO2003/089624 (claim 7)
(35) IRTA2 (면역글로불린 슈퍼패밀리 수용체 전좌 연관된 2, B 세포 발생 및 림프종 형성에 가능한 역할을 갖는 추정상의 면역수용체; 전좌에 의한 유전자의 탈조절 (deregulation)은 일부의 B 세포 악성종양에서 나타난다); 977 aa, pI: 6.88, MW: 106468, TM: 1 [P] 유전자 염색체: 1q21, Genbank 수탁번호 인간:AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Mouse:AK089756, AY158090, AY506558; NP_112571.1; WO2003/024392 (claim 2, Fig 97); Nakayama et al (2000) Biochem . Biophys . Res . Commun . 277(1):124-127; WO2003/077836; WO2001/38490 (claim 3, Fig 18B-1-18B-2)
(36) TENB2 (TMEFF2, 토모레귤린 (tomoregulin), TPEF, HPP1, TR, 성장인자 및 폴리스타틴의 EGF/헤레귤린 (heregulin) 패밀리와 관련된 추정상의 경막 프로테오글리칸); 374 aa, NCBI Accession: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeq: NP_057276; NCBI 유전자: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; Genbank 수탁번호 AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436; WO2004/074320; JP2004113151; WO2003/042661; WO2003/009814; EP1295944 (pages 69-70); WO2002/30268 (page 329); WO2001/90304; US2004/249130; US2004/022727; WO2004/063355; US2004/197325; US2003/232350; US2004/005563; US2003/124579; Horie et al (2000) Genomics 67:146-152; Uchida et al (1999) Biochem . Biophys. Res . Commun . 266:593-602; Liang et al (2000) Cancer Res . 60:4907-12; Glynne-Jones et al (2001) Int J Cancer . Oct 15; 94(2):178-84.
모 항체는 또한 알부민-결합 펩타이드 (ABP) 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있다 [Dennis et al . (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins" J Biol Chem . 277:35035-35043; WO 01/45746]. 본 발명의 항체는 (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 at Tables III and IV, page 35038; (ii) US 2004/0001827 at [0076]; 및 (iii) WO 01/45746 at pages 12-13 (이들은 모두 본 발명에 참고로 포함된다)에 의해서 교시된 ABP 서열을 갖는 융합 단백질을 포함한다.
한가지 구체예에서, 항체는 종양 관련된 항원 αvβ6을 특이적으로 표적화하도록 유도되었다.
세포 결합제는 링커에 연결된다. 한가지 구체예에서, 세포 결합제는 존재하는 경우에 링커의 A에 연결된다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제와 링커 사이의 연결은 티오에테르 결합을 통해서 이루어진다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제와 링커 사이의 연결은 디설파이드 결합을 통해서 이루어진다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제와 링커 사이의 연결은 아미드 결합을 통해서 이루어진다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제와 링커 사이의 연결은 에스테르 결합을 통해서 이루어진다.
한가지 구체예에서, 세포 결합제와 링커 사이의 연결은 세포 결합제의 시스테인 잔기의 티올 그룹과 링커의 말레이미드 그룹 사이에서 형성된다.
세포 결합제의 시스테인 잔기는 연결을 형성시키기 위한 RL의 작용 그룹과의 반응에 이용할 수 있다. 다른 구체예에서, 예를 들어, 세포 결합제가 항체인 경우에 항체의 티올 그룹은 쇄간 디설파이드 결합에 참여할 수 있다. 이들 쇄간 결합은 예를 들어, 항체를 RL의 작용 그룹과 반응시키기 전에 DTT로 처리함으로써 유리 티올 그룹으로 전환될 수 있다.
세포 결합제는 예를 들어, 컨주게이트, 또는 컨주게이트의 일부분으로 통합시키기 전에 세포 결합제의 검출 또는 정제를 돕기 위해서 표지될 수 있다. 라벨은 비오틴 라벨일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포 결합제는 방사성 동위원소로 표지될 수 있다.
R 및 R'
한가지 구체예에서, R은 임의로 치환된 C1 -12 알킬, C3 -20　헤테로사이클릴 및 C5 -20 아릴 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 이들 그룹은 각각 이하의 치환체 항목에서 정의된다.
한가지 구체예에서, R은 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬이다.
한가지 구체예에서, R은 독립적으로 임의로 치환된 C3 -20　헤테로사이클릴이다.
한가지 구체예에서, R은 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이다.
한가지 구체예에서, R은 독립적으로 임의로 치환된 C1 -12 알킬이다.
R2에 관하여 상술한 것은 바람직한 알킬 및 아릴 그룹 및 임의의 치환체의 주체성 및 수에 관한 다양한 구체예이다. R2에 대해 기술된 바람직한 사항은 이것이 R에 적용하는 것이기 때문에, 적절한 경우에 모든 다른 그룹 R, 예를 들어, R6, R7, R8 또는 R9가 R인 경우에 적용할 수 있다.
R에 대한 바람직한 사항은 또한 R'에도 적용한다.
본 발명의 일부의 구체예에서는 치환체 그룹 -NRR'를 갖는 화합물이 제공된다. 한가지 구체예에서, R 및 R'는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로사이클릭 환을 형성한다. 상기의 환은 추가의 헤테로 원자, 예를 들어, N, O 또는 S를 함유할 수 있다.
한가지 구체예에서, 헤테로사이클릭 환은 그 자체가 그룹 R에 의해서 치환된다. 추가의 N 헤테로 원자가 존재하는 경우에, 치환체는 N 헤테로 원자 상에 존재할 수 있다.
R"
R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있다.
한가지 구체예에서, R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자 및/또는 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있다.
한가지 구체예에서, 알킬렌 그룹은 O, S, 및 NMe로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자 및/또는 임의로 치환된 방향족 환에 의해서 임의로 단속될 수 있다.
한가지 구체예에서, 방향족 환은 C5 -20 아릴렌 그룹이고, 여기에서 아릴렌이 방향족 화합물의 2 개의 방향족 환 원자로부터 2 개의 수소 원자를 제거함으로써 수득된 2 가 부분에 관한 것인 경우에, 이 부분은 5 내지 20 개의 환 원자를 갖는다.
한가지 구체예에서, R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이며, 이 쇄는 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자, 예를 들어, O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 NH2에 의해서 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 단속될 수 있다.
한가지 구체예에서, R"는 C3 -12 알킬렌 그룹이다.
한가지 구체예에서, R"는 C3, C5, C7, C9 및 C11 알킬렌 그룹으로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, R"는 C3, C5 및 C7 알킬렌 그룹으로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, R"는 C3 및 C5 알킬렌 그룹으로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, R"는 C3 알킬렌 그룹이다.
한가지 구체예에서, R"는 C5 알킬렌 그룹이다.
상기 열거된 알킬렌 그룹은 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자 및/또는 임의로 치환된 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 임의로 단속될 수 있다.
상기 열거된 알킬렌 그룹은 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자 및/또는 방향족 환, 예를 들어, 벤젠 또는 피리딘에 의해서 임의로 단속될 수 있다.
상기 열거된 알킬렌 그룹은 비치환된 선형 지방족 알킬렌 그룹일 수 있다.
X
한가지 구체예에서, X는 O, S, 또는 N(H)로부터 선택된다.
바람직하게는 X는 O이다.
A-A, B-A, C-A, D-A 및 E-A
화학식 A-A, B-A, C-A, D-A 및 E-A의 화합물은 그룹 R2를 가지며, 이것은 R1 또는 R3와 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성한다. 임의로 치환된 벤젠 환은 피롤로벤조디아제핀의 C 환에 융합된 것으로 간주될 수 있다. 융합된 벤젠 환은 D 환으로 불릴 수 있다. 융합된 환의 구조는 이하에 예시된다:
Figure 112012086532911-pct00063
여기에서 D1, D2, D3 및 D4의 각각은 H 또는 치환체를 나타낸다.
한가지 구체예에서, 벤젠 환은 비치환된다.
한가지 구체예에서, 벤젠 환은 OH, CN, R, OR, O-SO2-R, CO2R, COR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4 개의 그룹에 의해서 임의로 치환된다.
한가지 구체예에서, 벤젠 환은 일치환된다. 일치환체는 D1, D2, D3 또는 D4 중의 어느 하나일 수 있다 (나머지는 H이다). 한가지 구체예에서, 벤젠 환은 D2에서 치환되고, D1, D3 및 D4는 각각 H이다. 한가지 구체예에서, 벤젠 환은 D3에서 치환되고, D1, D2 및 D4는 각각 H이다.
한가지 구체예에서, R2와 R1은 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성한다.
V 및 W에 대한 바람직한 사항은 이하에 설명된다.
A-B, B-B, C-B, D-B 및 E-B
한가지 구체예에서, T가 NR, BH, SO, 또는 SO2인 경우에 U는 CH2이다.
한가지 구체예에서, U가 NR, O 또는 S인 경우에 T는 CH2 또는 CO이다.
한가지 구체예에서, T는 CH2 및 CO로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, U는 NR, O 및 S로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, Y는 (CH2)n이고, 여기에서 n은 1 또는 2이다.
한가지 구체예에서, 화합물 A-B의 C 환은 이하에 나타낸 것으로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00064
V 및 W
V 및 W는 각각 (CH2)n, O, S, NR, CHR, 및 CRR'로부터 선택되고, 여기에서 n은 2,3 또는 4이며, 단 R1 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 V는 C이고, R3 및 R2가 이들이 부착된 C 환의 탄소 원자와 함께 임의로 치환된 벤젠 환을 형성하는 경우에 W는 C이다.
한가지 구체예에서, V 및 W 중의 하나가 C인 경우에, V 및 W 중의 다른 것은 CH2 및 NR로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, V 및 W 중의 하나가 C인 경우에, V 및 W 중의 다른 것은 CH2이다.
다이머 화합물
한가지 구체예에서, 본 발명의 첫 번째 관점의 컨주게이트, 화합물 C, 화합물 D 및 화합물 E는 각각 다이머이다.
컨주게이트
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 각각의 모노머가 화학식 A의 모노머인 다이머이다.
한가지 구체예에서, 다이머 화합물은 각각의 모노머가 화학식 A의 모노머인 다이머이며, 상기 화합물은 이하에 나타낸 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00065
여기에서 R2 ", R6 ", R7 ", R9 ", R10 ", X", Q" 및 R11 "는 각각 R2, R6, R7, R9, R10, X, 및 R11에 따라 정의한 바와 같다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 각각의 모노머가 화학식 A의 모노머인 다이머이고, 상기 화합물은 이하에 나타낸 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00066
여기에서 R2 ", R6 ", R7 ", R9 ", X", Q" 및 R11 "는 각각 R2, R6, R7, R9, X, 및 R11에 따라 정의된 바와 같고, RC는 캡핑 그룹이다. 이 구체예에서, 각각의 그룹 R10은 세포 결합제에 연결된 링커이다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 하나의 모노머가 화학식 A의 모노머이고, 다른 것은 화학식 B의 모노머인 다이머이다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 하나의 모노머가 화학식 A의 모노머이고, 다른 것은 화학식 B의 모노머인 다이머이며, 상기 화합물은 이하에 나타낸 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00067
여기에서 R2 ", R6 ", R7 ", R9 ", X" 및 R11 "는 각각 R2, R6, R7, R9, X, 및 R11에 따라 정의된 바와 같다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 각각의 모노머가 화학식 A의 모노머인 다이머이며, 그룹 R2, R6, R9, X, R11 및 R7 및 R8은 적절한 경우에 동일하다.
한가지 구체예에서, 화합물은 각각의 모노머가 화학식 A의 모노머인 다이머이며, 그룹 R2, R6, R9, X, R11, R10, 및 R7 및 R8는 적절한 경우에 동일하다. 이러한 화합물은 대칭적 다이머로 불릴 수 있다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 하나의 모노머가 화학식 A의 모노머이고, 다른 것이 화학식 B의 모노머인 다이머이며, A의 그룹 R2, R6, R9, 및 R7 및 R8은 경우에 따라 화합물 B의 이들 그룹과 동일하다.
상기 다이머 화합물의 각각에 대해서, 화학식 A 또는 B의 모노머는 본 발명에 기술된 바와 같은 화학식 A-I 또는 B-I의 모노머로 대체될 수 있다.
화합물 C
한가지 구체예에서, 화합물 C는 다이머이다.
한가지 구체예에서, 화합물 C는 이하에 나타낸 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00068
여기에서 R2 ", R6 ", R7 ", R9 ", 및 X"는 각각 R2, R6, R7, R9, 및 X에 따라 정의된 바와 같다.
화합물 D
한가지 구체예에서, 화합물 D는 다이머이다.
한가지 구체예에서, 화합물 D는 이하에 나타낸 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00069
여기에서 R2 ", R6 ", R7 ", R9 ", Q", R11 ", 및 X"는 각각 R2, R6, R7, R9, Q, R11 및 X에 따라 정의된 바와 같다.
화합물 E
한가지 구체예에서, 화합물 E는 다이머이다.
한가지 구체예에서, 화합물 E는 이하에 나타낸 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00070
여기에서 R2 ", R6 ", R7 ", R9 ", R11 ", RL ", Q" 및 X"는 각각 R2, R6, R7, R9, R11, RL 및 X에 따라 정의된 바와 같다.
한가지 구체예에서, 화합물 E는 이하에 나타낸 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00071
여기에서 R2 ", R6 ", R7 ", R9 ", R11 ", Q" 및 X"는 각각 R2, R6, R7, R9, R11, 및 X에 따라 정의된 바와 같다. RC는 캡핑 그룹이다.
한가지 구체예에서, 화합물 E는 이하에 나타낸 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00072
여기에서 R2 ", R6 ", R7 ", R9 ", 및 X"는 각각 R2, R6, R7, R9, 및 X에 따라 정의된 바와 같다.
모노머 화합물
한가지 구체예에서, 본 발명의 첫 번째 관점의 컨주게이트, 화합물 C, 화합물 D 및 화합물 E는 모노머이다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트 또는 화학식 C, D 또는 E의 화합물은 본 발명에 기술된 바와 같은 화학식 A-I, C-I, D-I 또는 E-I의 모노머로 대체될 수 있다.
R C , 캡핑 그룹
본 발명의 첫 번째 관점의 컨주게이트는 N10 위치에서 캡핑 그룹 RC를 가질 수 있다. 화합물 E는 캡핑 그룹 RC를 가질 수 있다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트가 각각의 모노머가 화학식 A의 모노머인 다이머인 경우에, 모노머 유니트 중의 하나에서 그룹 R10은 캡핑 그룹 RC이거나 그룹 R10이다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트가 각각의 모노머가 화학식 A의 모노머인 다이머인 경우에, 모노머 유니트 중의 하나에서 그룹 R10은 캡핑 그룹 RC이다.
한가지 구체예에서, 화합물 E가 각각의 모노머가 화학식 E의 모노머인 다이머인 경우에, 모노머 유니트 중의 하나에서 그룹 RL은 캡핑 그룹 RC이거나, 세포 결합제에 대한 연결을 위한 링커이다.
한가지 구체예에서, 화합물 E가 각각의 모노머가 화학식 E의 모노머인 다이머인 경우에, 모노머 유니트 중의 하나에서 그룹 RL은 캡핑 그룹 RC이다.
그룹 RC는 PBD 부분의 N10 위치로부터 제거되어 N10-C11 이민 결합, 카비놀아민, 치환된 카비놀아민, QR11이 OSO3M인 경우의 비설파이트 부가물, 티오카비놀아민, 치환된 티오카비놀아민, 또는 치환된 카비날아민을 남길 수 있다.
한가지 구체예에서, RC는 N10-C11 이민 결합, 카비놀아민, 치환된 카비놀아민, 또는 QR11이 OSO3M이 경우의 비설파이트 부가물이 남도록 제거될 수 있는 보호 그룹일 수 있다. 한가지 구체예에서, RC는 N10-C11 이민 결합이 남도록 제거될 수 있는 보호 그룹이다.
그룹 Rc는 그룹 R10의 제거를 위해서 필요한 것과 동일한 조건 하에서 제거되어 예를 들어, N10-C11 이민 결합, 카비놀아민 등을 수득할 수 있도록 계획된다. 캡핑 그룹은 N10 위치에서의 계획된 작용기를 위한 보호 그룹으로서 작용한다. 캡핑 그룹은 세포 결합제에 대해서는 반응이 있도록 계획되지 않는다. 예를 들어, RC는 RL과 동일하지 않다.
캡핑 그룹을 갖는 화합물은 이민 모노머를 갖는 다이머의 합성 시에 중간체로 사용될 수 있다. 대신으로, 캡핑 그룹을 갖는 화합물은 컨주게이트로서 사용될 수 있으며, 이 경우에 캡핑 그룹은 표적 위치에서 제거되어 이민, 카비놀아민, 치환된 카비놀아민 등을 제공한다. 따라서, 이 구체예에서 캡핑 그룹은 본 발명자들의 더 선행 출원인 WO 00/12507에서 정의된 바와 같은, 치료학적으로 제거가능한 질소 보호 그룹으로 불릴 수 있다.
한가지 구체예에서, 그룹 RC는 그룹 R10의 링커 RL를 분해시키는 조건 하에서 제거할 수 있다. 따라서, 한가지 구체예에서 캡핑 그룹은 효소의 작용에 의해서 분해될 수 있다.
대체 구체예에서, 캡핑 그룹은 링커 RL을 세포 결합제 연결하기 전에 제거될 수 있다. 이 구체예에서, 캡핑 그룹은 링커 RL을 분해시키지 않는 조건 하에서 제거될 수 있다.
화합물이 세포 결합제에 대한 연결을 형성시키기 위한 작용 그룹 G1을 포함하는 경우에, 캡핑 그룹은 G1의 부가 또는 노출 (unmasking) 전에 제거될 수 있다.
캡핑 그룹은 다이머 내의 모노머 유니트 중의 단지 하나만이 세포 결합제에 연결되는 것을 보장하기 위한 보호 그룹 전략의 일부분으로 사용될 수 있다.
캡핑 그룹은 N10-C11 이민 결합에 대한 차폐제 (mask)로 사용될 수 있다. 캡핑 그룹은 이민 작용기가 화합물 내에서 필요한 것과 같은 시기에 제거될 수 있다. 캡핑 그룹은 또한, 상술한 바와 같은 카비놀아민, 치환된 카비놀아민, 및 비설파이트 부가물에 대한 차폐제이다.
RC는 본 발명자들의 선행 출원인 WO 00/12507에 기술된 그룹과 같은 N10 보호 그룹일 수 있다. 한가지 구체예에서, RC는 본 발명자들의 선행 출원인 WO 00/12507에서 정의된 바와 같은 치료학적으로 제거가능한 질소 보호 그룹이다.
한가지 구체예에서, RC는 카바메이트 보호 그룹이다.
한가지 구체예에서, 카바메이트 보호 그룹은 Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz 및 PNZ로부터 선택된다. 임의로, 카바메이트 보호 그룹은 Moc로부터 더 선택된다.
한가지 구체예에서, RC는 세포 결합제에 대한 연결을 위한 작용 그룹을 결여하는 링커 그룹 RL이다.
본 출원은 특히 카바메이트인 이들 RC 그룹과 관계가 있다.
한가지 구체예에서, RC는 하기의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00073
여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, G2는 말단화 (terminating) 그룹이며, L3은 공유 결합 또는 분해가능한 링커 L1이고, L2는 공유 결합이거나 OC(=O)와 함께 자체-희생적 링커를 형성한다.
L3 및 L2이 둘 다 공유 결합인 경우에, G2 및 OC(=O)는 함께 상기 정의한 바와 같은 카바메이트 보호 그룹을 형성한다.
L1은 R10과 관련하여 상기에서 정의된 바와 같다.
L2는 R10과 관련하여 상기에서 정의한 바와 같다.
다양한 말단화 그룹은 잘 알려진 보호 그룹을 기초로 하는 것을 포함하여 이하에 기술된다.
한가지 구체예에서, L3은 분해가능한 링커 L1이며, L2는 OC(=O)와 함께 자체-희생적 링커를 형성한다. 이 구체예에서, G2는 Ac (아세틸) 또는 Moc, 또는 Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz 및 PNZ로부터 선택된 카바메이트 보호 그룹이다.
임의로, 카바메이트 보호 그룹은 Moc로부터 더 선택된다.
또 다른 구체예에서, G2는 아실 그룹 -C(=O)G3이며, 여기에서 G3는 알킬 (사이클로알킬, 알케닐 및 알키닐을 포함), 헤테로알킬, 헤테로사이클릴 및 아릴 (헤테로아릴 및 카보아릴을 포함)로부터 선택된다. 이들 그룹은 임의로 치환될 수 있다. 아실 그룹은 경우에 따라 L3 또는 L2의 아미노 그룹과 함께 아미드 결합을 형성할 수 있다. 아실 그룹은 경우에 따라 L3 또는 L2의 하이드록시 그룹과 함께 에스테르 결합을 형성할 수 있다.
한가지 구체예에서, G3은 헤테로알킬이다. 헤테로알킬 그룹은 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 헤테로알킬 그룹은 아실 그룹에 인접한 O 또는 N과 같은 헤테로 원자를 가질 수 있으며, 이에 의해서 경우에 따라, 적절한 경우에 그룹 L3 또는 L2 내에 존재하는 헤테로 원자를 갖는 카바메이트 또는 카보네이트 그룹을 형성할 수 있다.
한가지 구체예에서, G3는 NH2, NHR 및 NRR'로부터 선택된다. 바람직하게는 G3는 NRR'이다.
한가지 구체예에서, G2는 하기의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00074
여기에서 별표는 L3에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 내지 6이며, G4는 OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, 및 할로로부터 선택된다. 그룹 OH, SH, NH2 및 NHR은 보호된다. 한가지 구체예에서, n은 1 내지 6이며, 바람직하게는 n은 5이다. 한가지 구체예에서, G4는 OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' 및 NRR이다. 한가지 구체예에서, G4는 OR, SR, 및 NRR'이다. 바람직하게는 G4는 OR 및 NRR'로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 G4는 OR이다. 가장 바람직하게는 G4는 OMe이다.
한가지 구체예에서, 그룹 G2는 하기의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00075
여기에서 별표는 L3에 대한 부착점을 나타내고, n 및 G4는 상기에서 정의한 바와 같다.
한가지 구체예에서, 그룹 G2는 하기의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00076
여기에서 별표는 L3에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 또는 1이며, m은 0 내지　50이고, G4는 OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, 및 할로로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, n은 1이고, m은 0 내지 10, 1 내지 2, 바람직하게는 4 내지 8, 가장 바람직하게는 4 또는 8이다. 또 다른 구체예에서, n은 1이고, m은 10 내지 50, 바람직하게는 20 내지 40이다. 그룹 OH, SH, NH2 및 NHR은 보호된다. 한가지 구체예에서, G4는 OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', 및 NRR'이다. 한가지 구체예에서, G4는 OR, SR, 및 NRR'이다. 바람직하게는 G4는 OR 및 NRR'로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 G4는 OR이다. 바람직하게는 G4는 OMe이다.
한가지 구체예에서, 그룹 G2는 하기의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00077
여기에서 별표는 L3에 대한 부착점을 나타내고, n, m 및 G4는 상기에서 정의된 바와 같다.
한가지 구체예에서, 그룹 G2는 하기의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00078
여기에서 n은 1-20이고, m은 0-6이며, G4는 OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, 및 할로로부터 선택된다. 한가지 구체예에서, n은 1-10이다. 또 다른 구체예에서, n은 10 내지 50, 바람직하게는 20 내지 40이다. 한가지 구체예에서, n은 1이다. 한가지 구체예에서, m은 1이다. 그룹 OH, SH, NH2 및 NHR은 보호된다. 한가지 구체예에서, G4는 OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR' 및 NRR'이다. 한가지 구체예에서, G4는 OR, SR, 및 NRR'이다. 바람직하게는 G4는 OR 및 NRR'로부터 선택되고. 가장 바람직하게는 G4는 OR이다. 바람직하게는 G4는 OMe이다.
한가지 구체예에서, 그룹 G2는 하기의 그룹이다:
Figure 112012086532911-pct00079
여기에서 별표는 L3에 대한 부착점을 나타내고, n, m 및 G4는 상기에서 정의한 바와 같다.
상기의 각각의 구체예에서, G4는 OH, SH, NH2 및 NHR일 수 있다. 이들 그룹은 바람직하게는 보호된다.
한가지 구체예에서, OH는 Bzl, TBDMS, 또는 TBDPS에 의해서 보호된다.
한가지 구체예에서, SH는 Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, 또는 Trt에 의해서 보호된다.
한가지 구체예에서, NH2 또는 NHR은 Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z, 또는 Alloc에 의해서 보호된다.
한가지 구체예에서, 그룹 G2는 그룹 L3와 함께 존재하며, 이 그룹은 디펩타이드이다.
캡핑 그룹은 세포 결합제에 대한 연결을 위해서 계획된 것이 아니다. 따라서, 다이머 내에 존재하는 다른 모노머는 링커를 통한 세포 결합제에 대한 연결점으로 작용한다. 따라서, 캡핑 그룹 내에 존재하는 작용기는 세포 결합제와의 반응에 이용할 수 없는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직하게는 OH, SH, NH2, COOH와 같은 반응성 작용 그룹은 회피된다. 그러나, 이러한 작용기는 상술한 바와 같이 보호되는 경우에 캡핑 그룹 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 화합물의 제조 시에 캡핑 그룹은 링커 RL을 제조하기 위해서 사용될 수 있다.
항체-약물 컨주게이트 (ADC) 화합물의 예시적인 구체예는 항체 (Ab), 및 PBD 약물 부분 (PBD)을 포함하며, 여기에서 항체는 링커 부분 (L)에 의해서 PBD에 부착되고; 조성물은 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00080
여기에서 p는 1 내지 약 8의 정수이며, 약물 부하량을 나타낸다. Ab가 시스테인 조작된 항체인 경우에. 티올 반응성 링커 부분을 통해서 항체 분자에 컨주게이트될 수 있는 약물 부분의 수는 본 발명에 기술된 방법에 의해서 도입된 시스테인 잔기의 수에 의해서 제한된다. 따라서, 예시적인 ADC는 1, 2, 3, 또는 4 개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함한다.
바람직한 화합물
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다이머이고, 여기에서 각각의 모노머는 C2 메틸렌 그룹을 갖고, 즉 각각의 R2는 =CH2이다. 세포 결합제는 항체인 것이 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 컨주게이트는 다이머이고, 여기에서 각각의 모노머는 C2 아릴 그룹을 갖고, 즉 각각의 R2는 임의로 치환된 C5 -20 아릴이다. 세포 결합제는 항체인 것이 바람직하다.
C2 알킬렌
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 하기의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00081
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1 및 L2는 이전에 정의한 바와 같으며, RE 및 RE"는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 하기의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00082
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1, L2 및 G2는 이전에 정의한 바와 같으며, RE 및 RE "는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 하기의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00083
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1은 이전에 정의한 바와 같으며, RE 및 RE "는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 하기의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00084
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1은 이전에 정의한 바와 같으며, RE 및 RE "는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 하기의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00085
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1은 이전에 정의한 바와 같으며, RE 및 RE "는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 하기의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00086
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1은 이전에 정의한 바와 같으며, RE 및 RE "는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택된다.
상기 각각의 화합물에 대해서, 경우에 따라 이하의 바람직한 사항이 적용될 수 있다:
n은 0이고;
n은 1이며;
RE는 H이고;
RE는 RD이며, 여기에서 RD는 임의로 치환된 알킬이고;
RE는 RD이며, 여기에서 RD는 메틸이고;
CBA는 항체이며;
CBA는 사이클릭 펩타이드이고;
L1은 디펩타이드이거나 디펩타이드를 포함하며;
L1은 (H2N)-Val-Ala-(CO) 또는 (H2N)-Phe-Lys-(CO)이고, 여기에서 (H2N) 및 (CO)는 각각의 N 및 C 말단을 나타내며;
L2는 p-아미노벤질렌이고;
G2는 Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz 및 PNZ로부터 선택된다.
상기의 바람직한 사항 이외에도 이하의 바람직한 사항이 또한 적용될 수 있다:
G2는 다음과 같고:
Figure 112012086532911-pct00087
여기에서 별표는 L1의 N 말단에 대한 부착점을 나타내며;
A는 다음과 같고:
Figure 112012086532911-pct00088
여기에서 별표는 L1의 N 말단에 대한 부착점을 나타내며, 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내고, m은 4 또는 8이며;
A는 다음과 같고:
Figure 112012086532911-pct00089
여기에서 별표는 L1의 N 말단에 대한 부착점을 나타내며, 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내고, m은 4 또는 8이다.
특히 바람직한 구체예에서, n은 1이고; RE는 H이며; CBA는 항체이고; L1은 (H2N)-Val-Ala-(CO) 또는 (H2N)-Phe-Lys-(CO)이며, 여기에서 (H2N) 및 (CO)는 각각의 N 및 C 말단을 나타내고; L2는 p-아미노벤질렌이며; G2는 다음과 같고:
Figure 112012086532911-pct00090
여기에서 별표는 L1의 N 말단에 대한 부착점을 나타내고; A는 다음과 같으며:
Figure 112012086532911-pct00091
여기에서 별표는 L1의 N 말단에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타낸다.
C2 아릴
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00092
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, L1 및 L2는 이전에 정의된 바와 같고, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이며, n은 0 또는 1이다. Ar1 및 Ar2는 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00093
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, L1, L2 및 G2는 이전에 정의된 바와 같고, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이며, n은 0 또는 1이다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00094
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, L1은 이전에 정의된 바와 같고, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이며, n은 0 또는 1이다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00095
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, L1은 이전에 정의된 바와 같고, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이며, n은 0 또는 1이다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00096
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1은 이전에 정의된 바와 같고, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이며, n은 0 또는 1이다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00097
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1은 이전에 정의된 바와 같고, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이며, n은 0 또는 1이다.
한가지 구체예에서, 상기 각각의 구체예에서 Ar1 및 Ar2는 임의로 치환된 페닐, 푸라닐, 티오페닐 및 피리딜로부터 각각 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, 상기 각각의 구체예에서 Ar1 및 Ar2는 임의로 치환된 페닐이다.
한가지 구체예에서, 상기 각각의 구체예에서 Ar1 및 Ar2는 임의로 치환된 티오펜-2-일 또는 티오펜-3-일이다.
한가지 구체예에서, 상기 각각의 구체예에서 Ar1 및 Ar2는 임의로 치환된 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다.
퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 그룹은 어떤 이용가능한 환 위치를 통해서라도 PBD 코어에 결합될 수 있다. 예를 들어, 퀴놀리닐은 퀴놀린-2-일, 퀴놀린-3-일, 퀴놀린-4-일, 퀴놀린-5-일, 퀴놀린-6-일, 퀴놀린-7-일 및 퀴놀린-8-일일 수 있다. 이들 중에서 퀴놀린-3-일 퀴놀린-6-일이 바람직할 수 있다. 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-1-일, 이소퀴놀린-3-일, 이소퀴놀린-4-일, 이소퀴놀린-5-일, 이소퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-7-일 및 이소퀴놀린-8-일일 수 있다. 이들 중에서 이소퀴놀린-3-일 및 이소퀴놀린-6-일이 바람직할 수 있다.
C2 비닐
한가지 구체예에서,, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00098
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, L1 및 L2는 이전에 정의한 바와 같고, RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (이 페닐은 플루오로에 의해, 특히 4 위치에서 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 또는 1이다. RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00099
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, L1, L2 및 G2는 이전에 정의한 바와 같고, RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (이 페닐은 플루오로에 의해, 특히 4 위치에서 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 또는 1이다. RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00100
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, L1은 이전에 정의한 바와 같고, RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (이 페닐은 플루오로에 의해, 특히 4 위치에서 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 또는 1이다. RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00101
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, L1은 이전에 정의한 바와 같고, RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (이 페닐은 플루오로에 의해, 특히 4 위치에서 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 또는 1이다. RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00102
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1은 이전에 정의한 바와 같고, RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (이 페닐은 플루오로에 의해, 특히 4 위치에서 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 또는 1이다. RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00103
여기에서 CBA는 항체 또는 사이클릭 또는 선형 펩타이드와 같은 세포 결합제이며, n은 0 또는 1이다. L1은 이전에 정의한 바와 같고, RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (이 페닐은 플루오로에 의해, 특히 4 위치에서 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 또는 1이다. RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 구체예 중의 일부에서, RV1 및 RV2는 H, 페닐, 및 4-플루오로페닐로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
바람직한 중간체
본 발명은 또한, 본 발명에 기술된 컨주게이트 화합물의 제조에 사용하기 위한 중간체를 제공한다.
바람직한 중간체는 이하에 기술되며, 상술한 바람직한 컨주게이트와 매우 일치한다.
한가지 구체예에서, 중간체는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00104
여기에서 n은 0 또는 1이고, G1, L1 및 L2는 이전에 정의한 바와 같으며, RE 및 RE "는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, 중간체는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00105
여기에서 G1, L1 및 L2는 이전에 정의한 바와 같으며, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이고, n은 0 또는 1이다. Ar1 및 Ar2는 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 중간체는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00106
여기에서 G1, L1 및 L2는 이전에 정의한 바와 같으며, RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (이 페닐은 플루오로에 의해, 특히 4 위치에서 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 또는 1이다. RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 중간체는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00107
여기에서 n은 0 또는 1이고, L1은 이전에 정의한 바와 같으며, RE 및 RE "는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, 중간체는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00108
여기에서 L1은 이전에 정의한 바와 같고, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이며, n은 0 또는 1이다.
한가지 구체예에서, 중간체는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00109
여기에서 L1은 이전에 정의한 바와 같으며, RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (이 페닐은 플루오로에 의해, 특히 4 위치에서 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 또는 1이다. RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있다.
한가지 구체예에서, 중간체는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00110
여기에서 n은 0 또는 1이고, L1은 이전에 정의한 바와 같으며, RE 및 RE "는 H 또는 RD로부터 각각 독립적으로 선택된다.
한가지 구체예에서, 중간체는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00111
여기에서 n은 0 또는 1이며, L1은 이전에 정의한 바와 같고, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5 -20 아릴이며, n은 0 또는 1이다.
한가지 구체예에서, 중간체는 다음의 화합물이다:
Figure 112012086532911-pct00112
여기에서 L1은 이전에 정의한 바와 같으며, RV1 및 RV2는 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (이 페닐은 플루오로에 의해, 특히 4 위치에서 임의로 치환될 수 있다) 및 C5 -6 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 또는 1이다. RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있다.
치환체
본 명세서에서 사용된 것으로서 문구 "임의로 치환된"은 비치환될 수 있거나 치환될 수 있는 모 그룹에 관한 것이다.
별도로 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "치환된"은 하나 또는 그 이상의 치환체를 갖는 모 그룹에 관한 것이다. 용어 "치환체"는 본 명세서에서 통상적인 개념으로 사용되며, 모 그룹에 공유적으로 부착되거나, 경우에 따라 모 그룹에 융합된 화학적 부분을 나타낸다. 광범한 종류의 치환체는 잘 알려져 있으며, 다양한 종류의 모 그룹에 대한 이들의 형성 및 도입을 위한 방법도 또한 잘 알려져 있다.
바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기술된 치환체 (임의의 치환체를 포함)는 세포 결합제에 대한 반응성이 없는 이들 그룹으로 제한된다. 본 발명의 경우에 세포 결합제에 대한 연결은 세포 결합제에 대해 링커 그룹 (예를 들어, L1, L2 및 A를 포함)을 통해서 PBD 화합물의 N10 위치로부터 형성된다. PBD 구조의 다른 부분에 위치하는 반응성 작용 그룹은 세포 결합제에 대한 추가의 결합을 형성할 수 있다 (이것은 교차결합으로 불릴 수 있다). 이들 추가의 결합은 컨주게이트의 수송 및 생물학적 활성을 변화시킬 수 있다. 따라서, 일부의 구체예에서 추가의 치환체는 반응성 작용기를 결여하는 것으로 제한된다.
한가지 구체예에서, 치환체는 R, OR, SR, NRR', NO2, 할로, CO2R, COR, CONH2, CONHR, 및 CONRR'로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, 치환체는 R, OR, SR, NRR', NO2, CO2R, COR, CONH2, CONHR, 및 CONRR'로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, 치환체는 R, OR, SR, NRR', NO2, 및 할로로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
한가지 구체예에서, 치환체는 R, OR, SR, NRR', 및 NO2로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
상기 언급된 구체예 중의 어느 하나는 본 발명에 기술된 치환체 중의 어느 하나에라도 적용될 수 있다. 대신으로, 치환체는 이하에 열거된 그룹 중의 하나 또는 그 이상으로부터 선택될 수 있다.
치환체의 예는 이하에 더 상세히 기술된다.
C1 -12 알킬: 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C1 -12 알킬"은 지방족 또는 지환족일 수 있고, 포화 또는 불포화 (예를 들어, 부분적으로 불포화, 완전히 불포화)될 수 있는 것으로서, 1 내지 12 개의 탄소 원자를 갖는 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득된 일가 부분에 관한 것이다. 따라서, 용어 "알킬"은 이하에 거론된 서브-클래스 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 등을 포함한다.
포화된 알킬 그룹의 예로는 메틸 (C1), 에틸 (C2), 프로필 (C3), 부틸 (C4), 펜틸 (C5), 헥실 (C6) 및 헵틸 (C7)이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
포화된 선형 알킬 그룹의 예로는 메틸 (C1), 에틸 (C2), n-프로필 (C3), n-부틸 (C4), n-펜틸 (amyl) (C5), n-헥실 (C6) 및 n-헵틸 (C7)이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다.
포화되고 분지된 알킬 그룹의 예로는 이소-프로필 (C3), 이소-부틸 (C4), sec-부틸 (C4), tert-부틸 (C4), 이소-펜틸 (C5), 및 네오-펜틸　(C5)이 포함된다.
알킬 그룹은 O, N(H) 및 S로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자에 의해서 임의로 단속될 수 있다. 이러한 그룹은 "헤테로알킬"로 불릴 수 있다.
C2 -20 헤테로알킬: 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C2 -12 헤테로알킬"은 2 내지 12 개의 탄소 원자, 및 O, N(H) 및 S, 바람직하게는 O 및 S로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자를 갖는 탄화수소 화합물의 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득된 일가 부분에 관한 것이다.
헤테로알킬 그룹의 예로는 타입 -(OCH2CH2)-의 하나 또는 그 이상의 에틸렌 글리콜 유니트를 포함하는 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 헤테로알킬 그룹의 말단은 헤테로 원자의 일차 형태, 예를 들어, -OH, -SH 또는 -NH2일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 말단은 -CH3이다.
C2 -12 알케닐: 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C2 -12 알케닐"은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 알킬 그룹에 관한 것이다.
불포화된 알케닐 그룹의 예로는 에테닐 (비닐, -CH=CH2), 1-프로페닐 (-CH=CH-CH3), 2-프로페닐 (알릴, -CH-CH=CH2), 이소프로페닐 (1-메틸비닐, -C(CH3)=CH2), 부테닐 (C4), 펜테닐 (C5), 및 헥세닐 (C6)이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
C2 -12 알키닐: 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C2 -12 알키닐"은 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 알킬 그룹에 관한 것이다.
불포화된 알키닐 그룹의 예로는 에티닐 (-C≡CH) 및 2-프로페닐 (프로파길, -CH2-C≡CH)이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
C3 -12 사이클로알킬: 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C3 -12 사이클로알킬"은 또한 사이클릴 그룹인 알킬 그룹, 즉 사이클릭 탄화수소 (카보사이클릭) 화합물의 지환족 환 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 것으로 3 내지 7 개의 환 원자를 포함한 3 내지 7 개의 탄소 원자를 갖는 일가 부분에 관한 것이다.
사이클로알킬 그룹의 예로는 다음으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다:
포화된 모노사이클릭 탄화수소 화합물:
사이클로프로판 (C3), 사이클로부탄 (C4), 사이클로펜탄 (C5), 사이클로헥산 (C6), 사이클로헵탄 (C7), 메틸사이클로프로판 (C4), 디메틸사이클로프로판 (C5), 메틸사이클로부탄 (C5), 디메틸사이클로부탄　(C6), 메틸사이클로펜탄 (C6), 디메틸사이클로펜탄　(C7) 및 메틸사이클로헥산　(C7);
불포화된 모노사이클릭 탄화수소 화합물:
사이클로프로펜　(C3), 사이클로부텐　(C4), 사이클로펜텐　(C5), 사이클로헥센　(C6), 메틸사이클로프로펜　(C4), 디메틸사이클로프로펜 (C5), 메틸사이클로부텐 (C5), 디메틸사이클로부텐 (C6), 메틸사이클로펜텐 (C6), 디메틸사이클로펜텐　(C7) 및 메틸사이클로헥센 (C7); 및
포화된 폴리사이클릭 탄화수소 화합물:
노르카레인 (C7), 노르피난 (C7), 노르보르난 (C7).
C3 -20 헤테로사이클릴: 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C3 -20 헤테로사이클릴"은 헤테로사이클릭 화합물의 환 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득되는 것으로서 3 내지 20 개의 환 원자 (이 중에서 1 내지 10 개는 환 헤테로 원자이다)를 갖는 일가 부분에 관한 것이다. 바람직하게는, 각각의 환은 3 내지 7 개의 환 원자를 가지며, 이 중에서 1 내지 4 개는 환 헤테로 원자이다.
이러한 관계에서, 접두사 (예를 들어, C3 -20, C3 -7, C5 -6 등)는 탄소 원자이든 헤테로 원자이든 환 원자의 수, 또는 환 원자의 수의 범위를 나타낸다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C5 -6 헤테로사이클릴"은 5 또는 6 개의 환 원자를 갖는 헤테로사이클릴 그룹에 관한 것이다.
모노사이클릭 헤테로사이클릴 그룹의 예로는 다음으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다:
N1: 아지리딘 (C3), 아제티딘 (C4), 피롤리딘 (테트라하이드로피롤) (C5), 피롤린 (예를 들어, 3-피롤린, 2,5-디하이드로피롤) (C5), 2H-피롤 또는 3H-피롤 (이소피롤, 이소아졸) (C5), 피페리딘 (C6), 디하이드로피리딘 (C6), 테트라하이드로피리딘 (C6), 아제핀　(C7);
O1: 옥시란 (C3), 옥세탄 (C4), 옥솔란 (테트라하이드로푸란) (C5), 옥솔 (디하이드로푸란) (C5), 옥산 (테트라하이드로피란) (C6), 디하이드로피란 (C6), 피란 (C6), 옥세핀 (C7);
S1: 티이란 (C3), 티에탄 (C4), 티올란 (테트라하이드로티오펜) (C5), 티안 (테트라하이드로티오피란) (C6), 티에판 (C7);
O2: 디옥솔란 (C5), 디옥산 (C6), 및 디옥세판 (C7);
O3: 트리옥산 (C6);
N2: 이미다졸리딘 (C5), 피라졸리딘 (디아졸리딘) (C5), 이미다졸린 (C5), 피라졸린 (디하이드로피라졸) (C5), 피페라진 (C6);
N1O1: 테트라하이드로옥사졸 (C5), 디하이드로옥사졸 (C5), 테트라하이드로이속사졸 (C5), 디하이드로이속사졸 (C5), 모르폴린 (C6), 테트라하이드로옥사진 (C6), 디하이드로옥사진 (C6), 옥사진 (C6);
N1S1: 티아졸린 (C5), 티아졸리딘 (C5), 티오모르폴린　(C6);
N2O1: 옥사디아진 (C6);
O1S1: 옥사티올 (C5) 및 옥사티안 (티옥산) (C6); 및
N1O1S1: 옥사티아진 (C6).
치환된 모노사이클릭 헤테로사이클릴 그룹의 예로는 사이클릭 형태인 사카라이드, 예를 들어, 아라비노푸라노즈, 릭소푸라노즈, 리보푸라노즈 및 크실로푸라노즈와 같은 푸라노즈 (C5), 및 알로피라노즈, 알트로피라노즈, 글루코피라노즈, 만노피라노즈, 굴로피라노즈, 이도피라노즈, 갈락토피라노즈, 및 탈로피라노즈와 같은 피라노즈 (C6)로부터 유도된 것이 포함된다.
C5 -20 아릴: 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C5 -20 아릴"은 방향족 화합물의 방향족 환 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 수득된 것으로서 3 내지 20 개의 환 원자를 갖는 일가 부분에 관한 것이다. 바람직하게는, 각각의 환은 5 내지 7 개의 환 원자를 갖는다.
이러한 관계에서,
이러한 관계에서, 접두사 (예를 들어, C3 -20, C5 -7, C5 -6 등)는 탄소 원자이든 헤테로 원자이든 환 원자의 수, 또는 환 원자의 수의 범위를 나타낸다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C5 -6 아릴"은 5 또는 6 개의 환 원자를 갖는 아릴 그룹에 관한 것이다.
환 원자는 "카보아릴 그룹"에서와 같이 모두 탄소 원자일 수 있다. 카보아릴 그룹의 예로는 벤젠 (즉, 페닐) (C6), 나프탈렌 (C10), 아줄렌 (C10), 안트라센 (C14), 페난트렌 (C14), 나프타센 (C18), 및 피렌 (C16)으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
융합된 환 (이들 중의 적어도 하나는 방향족 환이다)을 포함하는 아릴 그룹의 예로는 인단 (예를 들어,　2,3-디하이드로-1H-인덴) (C9), 인덴 (C9), 이소인덴 (C9), 테트랄린 (1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌) (C10), 아세나프텐 (C12), 플루오렌 (C13), 페날렌 (C13), 아세페난트렌 (C15), 및 아세안트렌 (C16)으로부터 유도된 그룹이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
대신으로, 환 원자는 "헤테로아릴 그룹"에서와 같이 하나 또는 그 이상의 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 모노사이클릭 헤테로아릴 그룹의 예로는 다음으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다:
N1: 피롤 (아졸) (C5), 피리딘 (아진) (C6);
O1: 푸란 (옥솔) (C5);
S1: 티오펜 (티올) (C5);
N1O1: 옥사졸 (C5), 이속사졸 (C5), 이속사진 (C6);
N2O1: 옥사디아졸 (푸라잔) (C5);
N3O1: 옥사트리아졸 (C5);
N1S1: 티아졸 (C5), 이소티아졸 (C5);
N2: 이미다졸 (1,3-디아졸) (C5), 피라졸 (1,2-디아졸)　(C5), 피리다진 (1,2-디아진) (C6), 피리미딘 (1,3-디아진) (C6) (예를 들어, 사이토신, 티민, 우라실), 피라진 (1,4-디아진) (C6);
N3: 트리아졸 (C5), 트리아진 (C6); 및
N4: 테트라졸 (C5).
융합된 환을 포함하는 헤테로아릴의 예로는 다음이 포함되나 이들로 제한되지 않는다:
벤조푸란 (O1), 이소벤조푸란 (O1), 인돌 (N1), 이소인돌　(N1), 인돌리진 (N1), 인돌린 (N1), 이소인돌린 (N1), 퓨린 (N4) (예를 들어, 아데닌, 구아닌), 벤즈이미다졸 (N2), 인다졸 (N2), 벤즈옥사졸 (N1O1), 벤즈이속사졸 (N1O1), 벤조디옥솔 (O2), 벤조푸라잔 (N2O1), 벤조트리아졸 (N3), 벤조티오푸란 (S1), 벤조티아졸 (N1S1), 벤조티아디아졸　(N2S)로부터 유도된 C9 (2 개의 융합된 환을 가짐);
크로멘 (O1), 이소크로멘 (O1), 크로만 (O1), 이소크로만 (O1), 벤조디옥산 (O2), 퀴놀린 (N1), 이소퀴놀린 (N1), 퀴놀리진 (N1), 벤즈옥사진 (N1O1), 벤조디아진 (N2), 피리도피리딘 (N2), 퀴녹살린 (N2), 퀴나졸린 (N2), 신놀린 (N2), 프탈라진 (N2), 나프티리딘 (N2), 프테리딘 (N4)으로부터 유도된 C10 (2 개의 융합된 환을 가짐);
벤조디아제핀 (N2)으로부터 유도된 C11 (2 개의 융합된 환을 가짐);
카바졸 (N1), 디벤조푸란 (O1), 디벤조티오펜 (S1), 카볼린 (N2), 페리미딘 (N2), 피리도인돌 (N2)로부터 유도된 C13 (3 개의 융합된 환을 가짐); 및
아크리딘 (N1), 크산텐 (O1), 티오크산텐 (S1), 옥산트렌 (O2), 페녹사티인 (O1S1), 페나진 (N2), 페녹사진 (N1O1), 페노티아진 (N1S1), 티안트렌 (S2), 페난트리딘 (N1), 페난트롤린 (N2), 페나진 (N2)으로부터 유도된 C14 (3 개의 융합된 환을 가짐).
상기의 그룹은 단독으로든 또 다른 치환체의 일부이든 그들 자체가 그들 자체 및 이하에 열거된 추가의 치환체로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 그룹에 의해서 임의로 치환될 수 있다.
할로: -F, -Cl, -Br, 및 -I.
하이드록시: -OH.
에테르: -OR (여기에서, R은 에테르 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹 (또한, 이하에 거론된 C1 -7 알콕시 그룹으로 칭함), C3 -20 헤테로사이클릴 그룹 (또한, C3 -20 헤테로사이클릴옥시 그룹으로 칭함), 또는 C5 -20 아릴 그룹 (또한, C5-20 아릴옥시 그룹으로 칭함), 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다).
알콕시: -OR (여기에서, R은 알킬 그룹, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹이다). C1 -7 알콕시 그룹의 예로는 -OMe (메톡시), -OEt (에톡시), -O(nPr) (n-프로폭시), -O(iPr) (이소프로폭시), -O(nBu) (n-부톡시), -O(sBu) (sec-부톡시), -O(iBu) (이소부톡시), 및 -O(tBu) (tert-부톡시)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
아세탈: -CH(OR1)(OR2) (여기에서, R1 및 R2는 독립적으로 아세탈 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이거나, "사이클릭" 아세탈 그룹의 경우에 R1 및 R2는 이들이 부착된 2 개의 산소 원자, 및 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 4 내지 8 개의 환 원자를 갖는 헤테로사이클릭 환을 형성한다). 아세탈 그룹의 예로는 -CH(OMe)2, -CH(OEt)2, 및 -CH(OMe)(OEt)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
헤미아세탈: -CH(OH)(OR1) (여기에서, R1은 헤미아세탈 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 헤미아세탈 그룹의 예로는 -CH(OH)(OMe) 및 -CH(OH)(OEt)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
케탈: -CR(OR1)(OR2) (여기에서, R1 및 R2는 아세탈에 대해서 정의된 바와 같으며, R은 수소 이외의 케탈 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 케탈 그룹의 예로는 -C(Me)(OMe)2, -C(Me)(OEt)2, -C(Me)(OMe)(OEt), -C(Et)(OMe)2, -C(Et)(OEt)2, 및 -C(Et)(OMe)(OEt)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
헤미케탈: -CR(OH)(OR1) (여기에서, R1은 헤미아세탈에 대해서 정의된 바와 같으며, R은 수소 이외의 헤미케탈 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 헤미아세탈 그룹의 예로는 -C(Me)(OH)(OMe), -C(Et)(OH)(OMe), -C(Me)(OH)(OEt), 및 -C(Et)(OH)(OEt)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
옥소 (케토, -온): =O.
티온 (티오케톤): =S.
이미노 (이민): =NR (여기에서, R은 이미노 치환체, 예를 들어, 수소, C1-7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 C1 -7 알킬 그룹이다). 에스테르 그룹의 예로는 =NH, =NMe, =NEt, 및 =NPh가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
포르밀 (카브알데히드, 카복스알데히드): -C(=O)H.
아실 (케토): -C(=O)R (여기에서, R은 아실 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹 (또한 C1 -7 알킬아실 또는 C1 -7 알카노일로 칭함), C3 -20 헤테로사이클릴 그룹 (또한 C3 -20 헤테로사이클릴아실로 칭함), 또는 C5 -20 아릴 그룹 (또한, C5 -20 아릴아실로 칭함), 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 아실 그룹의 예로는 -C(=O)CH3 (아세틸), -C(=O)CH2CH3 (프로피오닐), -C(=O)C(CH3)3 (t-부티릴), 및 -C(=O)Ph (벤조일, 페논)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
카복시 (카복실산): -C(=O)OH.
티오카복시 (티오카복실산): -C(=S)SH.
티올로카복시 (티올로카복실산): -C(=O)SH.
티오노카복시 (티오노카복실산): -C(=S)OH.
이미드산: -C(=NH)OH.
하이드록삼산: -C(=NOH)OH.
에스테르 (카복실레이트, 카복실산 에스테르, 옥시카보닐): -C(=O)OR (여기에서, R은 에스테르 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 에스테르 그룹의 예로는 -C(=O)OCH3, -C(=O)OCH2CH3, -C(=O)OC(CH3)3, 및 -C(=O)OPh가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
아실옥시 (역 에스테르): -OC(=O)R (여기에서, R은 아실옥시 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 아실옥시 그룹의 예로는 -OC(=O)CH3 (아세톡시), -OC(=O)CH2CH3, -OC(=O)C(CH3)3, -OC(=O)Ph, 및 -OC(=O)CH2Ph가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
옥시카보닐옥시: -OC(=O)OR (여기에서, R은 에스테르 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 에스테르 그룹의 예로는 -OC(=O)OCH3, -OC(=O)OCH2CH3, -OC(=O)OC(CH3)3, 및 -OC(=O)OPh가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
아미노: -NR1R2 (여기에서, R1 및 R2는 독립적으로 아미노 치환체, 예를 들어, 수소, C1 -7 알킬 그룹 (또한 C1 -7 알킬아미노 또는 디-C1 -7 알킬아미노로 칭함), C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 H 또는 C1 -7 알킬 그룹이거나, "사이클릭" 아미노 그룹의 경우에 R1 및 R2는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 4 내지 8 개의 환 원자를 갖는 헤테로사이클릭 환을 형성한다). 아미노 그룹은 일급 (-NH2), 이급 (-NHR1), 또는 삼급 (-NHR1R2)일 수 있고, 양이온 형태로는 4급 (-+NR1R2R3)일 수 있다. 아미노 그룹의 예로는 -NH2, -NHCH3, -NHC(CH3)2, -N(CH3)2, -N(CH2CH3)2, 및 -NHPh가 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 사이클릭 아미노 그룹의 예로는 아지리디노, 아제티디노, 피롤리디노, 피페리디노, 피페라지노, 모르폴리노 및 티오모르폴리노가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
아미도 (카바모일, 카바밀, 아미노카보닐, 카복사미드): -C(=O)NR1R2 (여기에서, R1 및 R2는 독립적으로 아미노 그룹에 대해서 정의된 바와 같은 아미노 치환체이다). 아미도 그룹의 예로는 -C(=O)NH2, -C(=O)NHCH3, -C(=O)N(CH3)2, -C(=O)NHCH2CH3, 및 -C(=O)N(CH2CH3)2뿐만 아니라, R1 및 R2가 이들이 부착된 질소 원자와 함께 예를 들어, 피페리디노카보닐, 모르폴리노카보닐, 티오모르폴리노카보닐, 및 피페라지노카보닐에서와 같은 헤테로사이클릭 구조를 형성하는 아미도 그룹이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
티오아미도 (티오카바밀): -C(=S)NR1R2 (여기에서, R1 및 R2는 독립적으로 아미노 그룹에 대해서 정의된 바와 같은 아미노 치환체이다). 아미도 그룹의 예로는 -C(=S)NH2, -C(=S)NHCH3, -C(=S)N(CH3)2, 및 -C(=S)NHCH2CH3가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
아실아미도 (아실아미노): -NR1C(=O)R2 (여기에서, R1은 아미드 치환체, 예를 들어, 수소, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 H 또는 C1 -7 알킬 그룹이고, R2는 아실 치환체, 예를 들어, C1-7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 C1 -7 알킬 그룹이다). 아실아미드 그룹의 예로는 -NHC(=O)CH3, -NHC(=O)CH2CH3, 및 -NHC(=O)Ph가 포함되나 이들로 제한되지 않는다. R1　및 R2는 함께 예를 들어, 석신이미딜, 말레이미딜 및 프탈이미딜에서와 같이 사이클릭 구조를 형성할 수 있다:
Figure 112012086532911-pct00113
아미노카보닐옥시: -OC(=O)NR1R2 (여기에서, R1 및 R2는 독립적으로 아미노 그룹에 대해서 정의된 바와 같은 아미노 치환체이다). 아미노카보닐옥시 그룹의 예로는 -OC(=O)NH2, -OC(=O)NHMe, -OC(=O)NMe2, 및 -OC(=O)NEt2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
우레이도: -N(R1)CONR2R3 (여기에서, R2 및 R3는 독립적으로 아미노 그룹에 대해서 정의된 바와 같은 아미노 치환체이며, R1은 우레이도 치환체, 예를 들어, 수소, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 수소 또는 C1 -7 알킬 그룹이다). 우레이도 그룹의 예로는 -NHCONH2, -NHCONHMe, -NHCONHEt, -NHCONMe2, -NHCONEt2, -NMeCONH2, -NMeCONHMe, -NMeCONHEt, -NMeCONMe2, 및 -NMeCONEt2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
구아니디노: -NH-C(=NH)NH2.
테트라졸릴: 4 개의 질소 원자 및 하나의 탄소 원자를 갖는 5-원 방향족 환
Figure 112012086532911-pct00114
이미노: =NR (여기에서, R은 이미노 치환체, 예를 들어, 수소, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 H 또는 C1-7 알킬 그룹이다). 이미노 그룹의 예로는 =NH, =NMe, 및 =NEt가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
아미딘 (아미디노): -C(=NR)NR2 (여기에서, 각각의 R은 아미딘 치환체, 예를 들어, 수소, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 H 또는 C1 -7 알킬 그룹이다). 아미딘 그룹의 예로는 -C(=NH)NH2, -C(=NH)NMe2, 및 -C(=NMe)NMe2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
니트로: -NO2.
니트로소: -NO.
아지도: -N3.
시아노 (니트릴, 카보니트릴): -CN.
이소시아노: -NC.
시아나토: -OCN.
이소시아나토: -NCO.
티오시아노 (티오시아나토): -SCN.
이소티오사이노 (이소티오시아나토): -NCS.
설프히드릴 (티올, 머캅토): -SH.
티오에테르 (설파이드): -SR (여기에서, R은 티오에테르 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹 (또한 C1 -7 알킬티오 그룹으로 칭함), C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). C1 -7 알킬티오 그룹의 예로는 -SCH3 및 -SCH2CH3가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
디설파이드: -SS-R (여기에서, R은 디설파이드 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹 (또한, 여기에서는 C1 -7 알킬 디설파이드로 칭함)이다). C1 -7 알킬 디설파이드 그룹의 예로는 -SSCH3 및 -SSCH2CH3가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설핀 (설피닐, 설폭사이드): -S(=O)R (여기에서, R은 설핀 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 설핀 그룹의 예로는 -S(=O)CH3 및 -S(=O)CH2CH3가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설폰 (설포닐): -S(=O)2R (여기에서, R은 설폰 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 불소화되거나 과불소화된 C1 -7 알킬 그룹을 포함한 C1 -7 알킬 그룹이다). 설폰 그룹의 예로는 -S(=O)2CH3 (메탄설포닐, 메실), -S(=O)2CF3 (트리플릴), -S(=O)2CH2CH3 (에실), -S(=O)2C4F9 (노나플릴), -S(=O)2CH2CF3 (트레실), -S(=O)2CH2CH2NH2 (타우릴), -S(=O)2Ph (페닐설포닐, 베실), 4-메틸페닐설포닐 (토실), 4-클로로페닐설포닐 (클로실), 4-브로모페닐설포닐 (브로실), 4-니트로페닐 (노실), 2-나프탈렌설포네이트 (나프실), 및 5-디메틸아미노-나프탈렌-1-일설포네이트 (단실)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설핀산 (설피노): -S(=O)OH, -SO2H.
설폰산 (설포): -S(=O)2OH, -SO3H.
설피네이트 (설핀산 에스테르): -S(=O)OR (여기에서, R은 설피네이트 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 설피네이트 그룹의 예로는 -S(=O)OCH3 (메톡시설피닐; 메틸 설피네이트) 및 -S(=O)OCH2CH3 (에톡시설피닐; 에틸 설피네이트)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설포네이트 (설폰산 에스테르): -S(=O)2OR (여기에서, R은 설포네이트 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 설포네이트 그룹의 예로는 -S(=O)2OCH3 (메톡시설포닐; 메틸 설포네이트) 및 -S(=O)2OCH2CH3 (에톡시설포닐; 에틸 설포네이트)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설피닐옥시: -OS(=O)R (여기에서, R은 설피닐옥시 치환체, 예를 들어, C1-7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1-7 알킬 그룹이다). 설피닐옥시 그룹의 예로는 -OS(=O)CH3 및 -OS(=O)CH2CH3가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설포닐옥시: -OS(=O)2R (여기에서, R은 설포닐옥시 치환체, 예를 들어, C1-7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1-7 알킬 그룹이다). 설포닐옥시 그룹의 예로는 -OS(=O)2CH3 (메실레이트) 및 -OS(=O)2CH2CH3 (에실레이트)가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설페이트: -OS(=O)2OR (여기에서, R은 설페이트 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 설페이트 그룹의 예로는 -OS(=O)2OCH3 및 -SO(=O)2OCH2CH3가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설파밀 (설파모일; 설핀산 아미드; 설핀아미드): -S(=O)NR1R2 (여기에서, R1 및 R2는 독립적으로 아미노 그룹에 대해서 정의된 바와 같은 아미노 치환체이다). 설파닐 그룹의 예로는 -S(=O)NH2, -S(=O)NH(CH3), -S(=O)N(CH3)2, -S(=O)NH(CH2CH3), -S(=O)N(CH2CH3)2, 및 -S(=O)NHPh가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설폰아미도 (설피나모일; 설폰산 아미드; 설폰아미드): -S(=O)2NR1R2 (여기에서, R1 및 R2는 독립적으로 아미노 그룹에 대해서 정의된 바와 같은 아미노 치환체이다). 설폰아미도 그룹의 예로는 -S(=O)2NH2, -S(=O)2NH(CH3), -S(=O)2N(CH3)2, -S(=O)2NH(CH2CH3), -S(=O)2N(CH2CH3)2, 및 -S(=O)2NHPh가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설파미노: -NR1S(=O)2OH (여기에서, R1은 아미노 그룹에 대해서 정의된 바와 같은 아미노 치환체이다). 설파미노 그룹의 예로는 -NHS(=O)2OH 및 -N(CH3)S(=O)2OH가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설폰아미노: -NR1S(=O)2R (여기에서, R1은 아미노 그룹에 대해서 정의된 바와 같은 아미노 치환체이며, R은 설폰아미노 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 설폰아미노 그룹의 예로는 -NHS(=O)2CH3 및 -N(CH3)S(=O)2C6H5가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
설핀아미노: -NR1S(=O)R (여기에서, R1은 아미노 그룹에 대해서 정의된 바와 같은 아미노 치환체이며, R은 설핀아미노 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹이다). 설핀아미노 그룹의 예로는 -NHS(=O)CH3 및 -N(CH3)S(=O)C6H5가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
포스피노 (포스핀): -PR2 (여기에서, R은 포스피노 치환체, 예를 들어, -H, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹이다). 포스피노 그룹의 예로는 -PH2, -P(CH3)2, -P(CH2CH3)2, -P(t-Bu)2, 및 -P(Ph)2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
포스포: -P(=O)2.
포스피닐 (포스핀 옥사이드): -P(=O)R2 (여기에서, R은 포스피닐 치환체, 예를 들어, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 C1 -7 알킬 그룹 또는 C5 -20 아릴 그룹이다). 포스피닐 그룹의 예로는 -P(=O)(CH3)2, -P(=O)(CH2CH3)2, -P(=O)(t-Bu)2, 및 -P(=O)(Ph)2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
포스폰산 (포스포노): -P(=O)(OH)2.
포스포네이트 (포스포노 에스테르): -P(=O)(OR)2 (여기에서, R은 포스포네이트 치환체, 예를 들어, -H, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹이다). 포스포네이트 그룹의 예로는 -P(=O)(OCH3)2, -P(=O)(OCH2CH3)2, -P(=O)(O-t-Bu)2, 및 -P(=O)(OPh)2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
인산 (포스포노옥시): -OP(=O)(OH)2.
포스페이트 (포스포노옥시 에스테르): -OP(=O)(OR)2 (여기에서, R은 포스페이트 치환체, 예를 들어, -H, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹이다). 포스페이트 그룹의 예로는 -OP(=O)(OCH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)2, -OP(=O)(O-t-Bu)2, 및 -OP(=O)(OPh)2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
아인산: -OP(OH)2.
포스파이트: -OP(OR)2 (여기에서, R은 포스파이트 치환체, 예를 들어, -H, C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹이다). 포스파이트 그룹의 예로는 -OP(OCH3)2, -OP(OCH2CH3)2, -OP(O-t-Bu)2, 및 -OP(OPh)2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
포스포르아미다이트: -OP(OR1)-NR2 2 (여기에서, R1 및 R2는 포스포르아미다이트 치환체, 예를 들어, -H, (임의로 치환된) C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹이다). 포스포르아미다이트 그룹의 예로는 -OP(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2, 및 -OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
포스포르아미데이트: -OP(=O)(OR1)-NR2 2 (여기에서, R1 및 R2는 포스포르아미데이트 치환체, 예를 들어, -H, (임의로 치환된) C1 -7 알킬 그룹, C3 -20 헤테로사이클릴 그룹, 또는 C5 -20 아릴 그룹, 바람직하게는 -H, C1 -7 알킬 그룹, 또는 C5-20 아릴 그룹이다). 포스포르아미데이트 그룹의 예로는 -OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2, -OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2, 및 -OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
알킬렌
C3 -12 알킬렌: 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "C3 -12 알킬렌"은 지방족 또는 지환족일 수 있으며, 포화, 부분적으로 불포화, 또는 완전히 불포화될 수 있는 3 내지 12 개의 탄소 원자 (다른 식으로 명시되지 않는 한)를 갖는 탄화수소 화합물의 2 개의 수소 원자를, 둘 다 동일한 탄소 원자로부터 또는 2 개의 상이한 탄소 원자 각각으로부터 하나씩 제거함으로써 수득된 2 자리 (bidenate) 부분에 관한 것이다. 따라서, 용어 "알킬렌"은 이하에 거론되는 서브-클래스 알케닐렌, 알키닐렌, 사이클로알킬렌 등을 포함한다.
선형 포화 C3 -12 알킬렌 그룹의 예로는 -(CH2)n- (여기에서, n은 3 내지 12의 정수이다), 예를 들어, -CH2CH2CH2- (프로필렌), -CH2CH2CH2CH2- (부틸렌), -CH2CH2CH2CH2CH2- (펜틸렌) 및 -CH2CH2CH2CH-2CH2CH2CH2- (헵틸렌)이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
분지된 포화 C3 -12 알킬렌 그룹의 예로는 -CH(CH3)CH2-, -CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH3)CH2CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2-, -CH2CH(CH3)CH2CH2-, -CH(CH2CH3)-, -CH(CH2CH3)CH2-, 및 -CH2CH(CH2CH3)CH2-가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
선형의 부분적으로 불포화된 C3 -12 알킬렌 그룹 (C3 -12 알케닐렌, 및 알키닐렌 그룹)의 예로는 -CH=CH-CH2-, -CH2-CH=CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH2-CH2-, -CH=CH-CH=CH-, -CH=CH-CH=CH-CH2-, -CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-, -CH=CH-CH2-CH=CH-, -CH=CH-CH2-CH2-CH=CH-, 및 -CH2-C≡C-CH2-가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
분지된, 부분적으로 불포화된 C3 -12 알킬렌 그룹 (C3 -12 알케닐렌 및 알키닐렌 그룹)의 예로는 -C(CH3)=CH-, -C(CH3)=CH-CH2-, -CH=CH-CH(CH3)- 및 -C≡C-CH(CH3)-가 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
지환족 포화 C3 -12 알킬렌 그룹 (C3 -12 사이클로알킬렌)의 예로는 사이클로펜틸렌 (예를 들어, 사이클로펜트-1,3-일렌), 및 사이클로헥실렌 (예를 들어, 사이클로헥스-1,4-일렌)이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
지환족의 부분적으로 불포화된 C3 -12 알킬렌 그룹 (C3 -12 사이클로알킬렌)의 예로는 사이클로펜테닐렌 (예를 들어, 4-사이클로펜텐-1,3-일렌), 사이클로헥세닐렌 (예를 들어, 2-사이클로헥센-1,4-일렌; 3-사이클로헥센-1,2-일렌; 2,5-사이클로헥사디엔-1,4-일렌)이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
그 밖의 다른 형태를 포함
다른 식으로 명시되지 않는 한, 상기한 것에는 이들 치환체의 잘 알려진 이온, 염, 용매화물, 및 보호된 형태가 포함된다. 예를 들어, 카복실산 (-COOH)에 대한 언급은 또한 음이온 (카복실레이트) 형태 (-COO-), 그의 염 또는 용매화물뿐만 아니라 통상적인 보호된 형태를 포함한다. 마찬가지로, 아미노 그룹에 대한 언급은 양자화된 형태 (-N+HR1R2), 아미노 그룹의 염 또는 용매화물, 예를 들어, 하이드로클로라이드 염뿐만 아니라 아미노 그룹의 통상적인 보호된 형태를 포함한다. 마찬가지로, 하이드록실 그룹에 대한 언급은 음이온 형태 (-O-), 그의 염 또는 용매화물뿐만 아니라 통상적인 보호된 형태를 포함한다.
염
활성 화합물의 상응하는 염, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 염을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는 문헌 [Berge, et al ., J.　 Pharm . Sci ., 66, 1-19 (1977)]에 기술되어 있다.
예를 들어, 화합물이 음이온성이거나, 음이온성일 수 있는 작용 그룹을 갖는 경우에 (예를 들어, -COOH는 -COO-일 수 있다), 염은 적합한 양이온에 의해서 형성될 수 있다. 적합한 무기 양이온의 예로는 Na+ 및 K+와 같은 알칼리 금속 이온, Ca2+ 및 Mg2 +와 같은 알칼리 토금속 양이온, 및 Al+3과 같은 그 밖의 다른 양이온이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 적합한 유기 양이온의 예로는 암모늄 이온 (즉 NH4 +) 및 치환된 암모늄 이온 (예를 들어, NH3R+, NH2R2 +, NHR3 +, NR4 +)이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 일부의 적합한 치환된 암모늄 이온의 예는 에틸아민, 디에틸아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민, 및 트로메타민뿐만 아니라 리신 및 아르기닌과 같은 아미노산으로부터 유도된 것이다. 통상적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH3)4 +이다.
화합물이 양이온성이거나 양이온성일 수 있는 작용 그룹을 갖는 경우에 (예를 들어, -NH2는 -NH3 +일 수 있다), 염은 적합한 음이온에 의해서 형성될 수 있다. 적합한 무기 음이온의 예로는 다음의 무기산으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산 및 아질산.
적합한 유기 음이온의 예로는 다음의 유기산으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: 2-아세톡시벤조산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 캄포설폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에탄디설폰산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루켑톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프탈렌 카복실산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 메탄설폰산, 무스산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐설폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 설파닐산, 타르타르산, 톨루엔설폰산, 트리플루오로아세트산 및 발레르산. 적합한 폴리머 유기 음이온의 예로는 다음의 폴리머산으로부터 유도된 것이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: 탄닌산, 카복시메틸 셀룰로즈.
용매화물
활성 화합물의 상응하는 용매화물을 제조, 정제 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 바람직할 수 있다. 용어 "용매화물"은 용질 (예를 들어, 활성 화합물, 활성 화합물의 염)과 용매의 컴플렉스를 나타내기 위한 통상적인 개념으로 본 명세서에서 사용된다. 용매가 물이면, 용매화물은 편리하게는 하이드레이트, 예를 들어, 모노-하이드레이트, 디-하이드레이트, 트리-하이드레이트 등으로 불릴 수 있다.
본 발명은 용매가 PBD 부분의 이만 결합을 가로질러서 부가된 화합물을 포함하며, 이것은 이하에 예시되고, 여기에서 용매는 물 또는 알콜 (RAOH, 여기에서 RA는 C1 -4 알킬이다)이다:
Figure 112012086532911-pct00115
이들 형태는 PBD의 카비놀아민 및 카비놀아민 에테르 형태 (상기 R10에 관한 항목에 기술된 바와 같음)로 불릴 수 있다. 이들 평형상태의 균형은 화합물이 존재하는 조건뿐만 아니라 그 부분 자체의 성질에 따라 좌우된다.
이들 특별한 화합물은 예를 들어, 동결건조에 의해 고체 형태로 분리될 수 있다.
이성체
본 발명의 특정한 화합물은 시스- 및 트랜스-형태; E- 및 Z-형태; c-, t-, 및 r-형태; 엔도- 및 엑소-형태; R-, S-, 및 메소-형태; D- 및 L-형태; d- 및 l-형태; (+) 및 (-) 형태; 케토-, 에놀-, 및 에놀레이트-형태; syn- 및 안티 (anti)-형태; 향사 (synclinal)- 및 배사 (anticlinal)-형태; α- 및 β-형태; 축 및 수평 방향 형태; 보트-, 체어-, 트위스트-, 엔벨로프 (envelope)-, 및 핼프체어 (halfchair)-형태; 및 이들의 조합을 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 하나 또는 그 이상의 특별한 기하이성체, 광학이성체, 에난티오머, 부분입체이성체, 에피머, 회전장애 (atropic) 이성체, 입체이성체, 호변이성체, 형태이성체 또는 아노머 (anomeric) 형태로 존재할 수 있으며, 이하에서는 총괄적으로 "이성체" (또는 "이성체 형태") 로 칭한다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너의 비-중첩성 (non-superimposability)의 특성을 갖는 분자를 나타내는 반면에, 용어 "아키랄 (achiral)"은 그들의 거울상 파트너 상에 중첩할 수 있는 분자를 나타낸다.
용어 "입체이성체"는 동일한 화학적 구성을 갖지만, 공간에서 원자 또는 그룹의 배열에 관해서는 상이한 화합물을 나타낸다.
"부분입체이성체"는 2 개 또는 그 이상의 키랄 중심을 가지며, 그의 분자가 서로의 거울상이 아닌 입체이성체를 나타낸다. 부분입체이성체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어, 융점, 비점, 분광 특성 및 반응성을 갖는다. 부분입체이성체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고분할 분석절차에 따라 분리시킬 수 있다.
"에난티오머"는 서로의 비-중첩성 거울상인 화합물의 2 개의 입체이성체를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 입체화학적 정의 및 규약은 문헌 [S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994]에 따른다. 본 발명의 화합물은 비대칭 또는 키랄 중심을 함유할 수 있으며, 따라서 상이한 입체이성체 형태로 존재할 수 있다. 부분입체이성체, 에난티오머 및 회전장애 이성체뿐만 아니라 라세미 혼합물과 같은 이들의 혼합물을 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 본 발명의 화합물의 모든 입체이성체 형태는 본 발명의 일부를 형성하는 것으로 한다. 다수의 유기 화합물은 광학적 활성 형태로 존재하며, 즉 이들은 평면편광의 평면을 회전하는 능력을 갖는다. 광학적 활성 화합물을 기술하는 경우에, 접두어 D 및 L, 또는 R 및 S는 그의 키랄 중심(들)에 관한 분자의 절대배열을 나타내기 위해서 사용된다. 접두어 d 및 l 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면편광의 회전의 사인을 지정하기 위해서 사용되는데, 여기에서 (-) 또는 l은 화합물이 좌선성인 것을 나타낸다. (+) 또는 d가 접두어인 화합물은 우선성이다. 소정의 화학적 구조에 대해서 이들 입체이성체는 이들이 서로의 거울상인 것을 제외하고는 동일하다. 특정의 입체이성체는 또한 에난티오머로 불릴 수 있으며, 이러한 이성체의 혼합물은 종종 에난티오머 혼합물로 칭할 수 있다. 에난티오머의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세메이트로 불리며, 이것은 화학적 반응 또는 과정에서 입체선택성 또는 입체특이성이 없는 경우에 나타날 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세메이트"는 광학적 활성이 없는 2 개의 에난티오머 종의 동몰성 혼합물을 나타낸다.
호변이성체 형태에 대해서 이하에 거론된 것을 제외하고, 특히 본 발명에서 사용된 용어 "이성체"로부터 구조 (또는 구성) 이성체 (즉, 단순히 공간에서의 원자의 위치에 의해서가 아니라 원자들 사이의 연결이 상이한 이성체)는 제외되는 것을 유의하여야 한다. 예를 들어, 메톡시 그룹 -OCH3에 대한 언급은 그의 구조 이성체인 하이드록시메틸 그룹 -CH2OH에 대한 언급으로 이해되지 않는다. 마찬가지로, 오르토-클로로페닐에 대한 언급은 그의 구조 이성체인 메타-클로로페닐에 대한 언급으로 이해되지 않는다. 그러나, 구조의 클래스에 대한 언급은 그 클래스 내에 속하는 구조적 이성체 형태를 역시 포함할 수 있다 (예를 들어, C1 -7 알킬은 n-프로필 및 이소-프로필을 포함하고; 부틸은 n-, 이소-, sec-, 및 tert-부틸을 포함하며; 메톡시페닐은 오르토-, 메타-, 및 파라-메톡시페닐을 포함한다).
상기의 배제사항은 예를 들어, 다음의 호변이성체 쌍에서와 같은 호변이성체 형태, 예를 들어, 케토-, 에놀-, 및 에놀레이트-형태에 관한 것은 아니다: 케토/에놀 (이하에 예시됨), 이민/엔아민, 아미드/이미노 알콜, 아미딘/아미딘, 니트로소/옥심, 티오케톤/에네티올, N-니트로소/하이드록시아조, 및 니트로/아시-니트로.
Figure 112012086532911-pct00116
용어 "호변이성체" 또는 "호변이성체 형태"는 저에너지 장벽을 통해서 상호전환가능한 상이한 에너지의 구조 이성체를 나타낸다. 예를 들어, 양자 호변이성체 (또한 프로토트로픽 (prototropic) 호변이성체로 공지됨)는 케토-에놀 및 이민-엔아민 이성체화와 같은 양자의 이동을 통한 상호전환을 포함한다. 원자가 이성체는 결합 전자 중의 일부의 개편에 의한 상호전환을 포함한다.
용어 "이성체"에는 특히 하나 또는 그 이상의 동위원소 치환이 있는 화합물이 포함된다는 것을 유의하여야 한다. 예를 들어, H는 1H, 2H (D), 및 3H (T)를 포함한 어떤 동위원소 형태라도 될 수 있으며; C는 12C, 13C, 및 14C를 포함한 어떤 동위원소 형태라도 될 수 있고; O는 16O 및 18O을 포함한 어떤 동위원소 형태라도 될 수 있는 등이다.
본 발명의 화합물 내에 통합될 수 있는 동위원소의 예로는 2H (중수소, D), 3H (삼중수소), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 32P, 35S, 36Cl, 및 125I와 같은 (단 이들로 제한되지 않는다) 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 불소 및 염소의 동위원소가 포함된다. 본 발명의 다양한 동위원소 표지된 화합물은 예를 들어, 3H, 13C, 및 14C와 같은 방사성 동위원소가 통합된 것이다. 이러한 동위원소 표지된 화합물은 약물 또는 기질 조직 분포시험을 포함한 may be useful in metabolic studies, reaction kinetic studies, detection or imaging techniques, such as 양전자 방출 단층촬영 (PET) 또는 단일-양자 방출 컴퓨터 촬영 (SPECT)과 같은 대사 연구, 반응속도 연구, 검출 또는 영상화 기술에서, 또는 환자의 방사성 치료에서 유용할 수 있다. 본 발명의 중수소 표지되거나 치환된 치료학적 화합물은 분포, 대사 및 배설 (ADME)에 관한 개선된 DMPK (약물 대사 및 약력학) 특성을 가질 수 있다. 중수소와 같은 더 중질의 동위원소에 의한 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투약량 필요조건으로 인한 특정의 치료학적 이점을 제공할 수 있다. 18F 표지된 화합물은 PET 또는 SPECT 연구에 유용할 수 있다. 본 발명의 동위원소 표지된 화합물 및 그의 프로드럭은 일반적으로 반응식에, 또는 비-동위원소 표지된 시약을 쉽게 이용할 수 있는 동위원소 표지된 시약으로 치환시켜 이하에 기술된 실시예 및 제조예에 기술된 절차를 수행함으로써 제조될 수 있다. 또한, 더 중질의 동위원소, 특히 중수소 (즉, 2H 또는 D)에 의한 치환은 더 큰 대사 안정성, 예를 들어, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투약량 필요조건 또는 치료지수의 개선으로 인한 특정의 치료학적 이점을 제공할 수 있다. 이러한 관계에서 중수소는 치환체로 간주되는 것으로 이해된다. 이러한 더 중질의 동위원소, 특히 중수소의 농도는 동위원소 부화계수 (isotopic enrichment factor)에 의해서 정의될 수 있다. 본 발명의 화합물에서, 특별한 동위원소로 구체적으로 지정된 어떤 원자는 그 원자의 모든 안정한 동위원소를 나타내는 것을 의미한다.
다른 식으로 명시되지 않는 한, 특별한 화합물에 대한 언급은 (전체적으로 또는 부분적으로) 라세미 및 그 밖의 다른 이들의 혼합물을 포함한 이러한 이성체 형태 모두를 포함한다. 이러한 이성체 형태의 제조 (예를 들어, 비대칭 합성) 및 분리 (예를 들어, 분별 결정화 및 크로마토그래피 방법)를 위한 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있거나, 본 명세서에 교시된 방법 또는 공지된 방법을 공지된 방식으로 변경함으로써 쉽게 수득된다.
생물학적 활성
시험관내 세포 증식시험
일반적으로, 항체-약물 컨주게이트 (ADC)의 세포독성 또는 세포증식 억제활성은 수용체 단백질, 예를 들어, HER2를 갖는 포유동물 세포를 세포 배양 배지 내의 ADC의 항체에 노출시키고; 세포를 약 6 시간 내지 약 5일의 기간 동안 배양하고; 세포 생존도를 측정함으로써 측정된다. 세포-기반 시험관내 시험을 사용하여 본 발명의 ADC의 생존도 (증식), 세포독성, 및 세포소멸 (카스파제 활성화)의 유도를 측정한다.
항체-약물 컨주게이트의 시험관내 효력은 세포 증식시험에 의해서 측정될 수 있다. 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo®) 발광 세포 생존도 시험은 콜레오프테라 (Coleoptera) 루시퍼라제의 재조합체 발현을 기초로 하는 균질한 시험방법 (미국 특허 제 5583024; 5674713 및 5700670 호)으로 상업적으로 이용할 수 있다. 이 세포 증식시험은 대사적으로 활성인 세포의 지표인 존재하는 ATP의 정량화에 근거한 배양물 내의 생존 세포의 수를 결정한다 [Crouch et al (1993) J. Immunol . Meth . 160:81-88; US 6602677]. 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo®) 시험은 자동화된 초고속 스크리닝 (HTS)에 따라서 96 웰 포맷 (format)으로 수행된다 [Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404]. 균질한 시험절차는 단일 시약 (CellTiter-Glo® 시약)을 혈청-보충된 배지에서 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 포함한다. 세포 세척, 배지의 제거 및 다수의 피펫팅 (pipetting) 단계는 필요하지 않다. 이 시스템은 시약을 첨가하고 혼합시킨 후 10 분 이내에 384-웰 포맷에서 겨우 15 세포/웰을 검출한다. 세포는 ADC에 의해서 연속적으로 처리할 수 있거나, 이들은 처리하고 ADC로부터 분리시킬 수 있다. 일반적으로, 간단히, 즉 3 시간 동안 처리된 세포는 연속적으로 처리된 세포와 동일한 효력 효과를 나타내었다.
균질한 "첨가-혼합-측정 (add-mix-measure)" 포맷은 세포 용해 및 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 시그날의 생성을 제공한다. ATP의 양은 배양물 내에 존재하는 세포의 수에 정비례한다. 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo®) 시험은 사용된 세포 타입 및 배지에 따라 일반적으로 5 시간보다 더 큰 반감기를 갖는 루시퍼라제 반응에 의해서 생산된 "글로-타입 (glow-type)" 발광 시그날을 생성시킨다. 생존 세포는 상대적 발광 유니트 (relative luminescence units; RLU)에 반영된다. 기질인 비틀 (Beetle) 루시페린은 재조합체 개똥벌레 루시퍼라제에 의해서 ATP의 AMP로의 동시 전환 및 양자의 생성과 함께 산화적으로 탈카복실화된다.
생체내 효능
본 발명의 항체-약물 컨주게이트 (ADC)의 생체내 효능은 마우스에서의 종양 이종이식 시험에 의해서 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 안티-HER2 ADC의 생체내 효능은 고발현 HER2 유전자이식 외식편 마우스 모델에 의해서 측정될 수 있다. 동종이식편은 헤르셉틴 (HERCEPTIN®) 치료법에 대해서 반응하지 않거나 열등하게 반응하는 Fo5 mmtv 유전자이식 마우스로부터 증식된다. 대상체는 특정의 용량 레벨 (㎎/㎏) 및 PBD 약물 노출 (㎍/㎡)로 ADC, 및 위약 완충액 대조군 (비히클)에 의해서 1 회 처리하고, 2 주일 또는 그 이상에 걸쳐서 모니터링하여 종양 배가, 로그 세포 사멸, 및 종양 위축까지의 시간을 측정하였다.
용도
본 발명의 컨주게이트를 사용하여 표적 위치에서 PBD 화합물을 제공할 수 있다.
표적 위치는 바람직하게는 증식성 세포 집단이다. 항체는 증식성 세포 집단에 존재하는 항원에 대한 항체이다.
한가지 구체예에서, 항원은 증식성 세포 집단, 예를 들어, 종양 세포 집단에 존재하는 항원의 양에 비해 비-증식성 세포 집단에서는 부재하거나 감소된 레벨로 존재한다.
표적 위치에서 링커는 분해되어 화학식 D의 화합물을 방출할 수 있다. 따라서, 컨주게이트는 표적 위치에서 화학식 D의 화합물을 선택적으로 제공하기 위해서 사용될 수 있다.
링커는 표적 위치에 존재하는 효소에 의해서 분해될 수 있다.
표적 위치는 시험관내, 생체내 또는 생체외일 수 있다.
본 발명의 항체-약물 컨주게이트 (ADC) 화합물은 항암 활성에 대한 유용성을 갖는 것이 포함된다. 특히, 화합물은 PBD 약물 부분, 즉 독소에 컨주게이트된, 즉 링커에 의해서 공유적으로 부착된 항체를 포함한다. 약물이 항체에 컨주게이트되지 않은 경우에, PBD 약물은 세포독성 효과를 갖는다. 따라서, PBD 약물 부분의 생물학적 활성은 항체에 대한 컨주게이션에 의해서 변조된다. 본 발명의 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 유효량의 세포독성제를 종양 조직에 선택적으로 송달함으로써 더 큰 선택성, 즉 더 작은 유효량이 달성될 수 있다.
따라서, 한가지 관점에서 본 발명은 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 기술된 바와 같은 컨주게이트 화합물을 제공한다.
추가의 관점에서는 또한, 증식성 질환의 치료에서 사용하기 위한, 본 발명에 기술된 바와 같은 컨주게이트 화합물이 제공된다. 본 발명의 두 번째 관점은 증식성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 컨주게이트 화합물의 용도를 제공한다.
본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 후보 컨주게이트가 어떤 특별한 세포 타입에 대한 증식성 상태를 치료하는지 여부에 대해서 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 특별한 화합물에 의해서 제공되는 활성을 평가하기 위해서 편리하게 사용될 수 있는 시험방법은 이하의 실시예에 기술된다.
용어 "증식성 질환"은 시험관내이든 생체내이든, 신생물성 또는 과형성성 성장과 같은 바람직하지 않은 과도하거나 비정상적인 세포의 원치않거나 제어되지 않은 세포 증식에 관한 것이다.
증식성 상태의 예로는 신생물 및 종양 (예를 들어, 조직구종, 신경교종, 성상세포종, 골종), 암 (예를 들어, 폐암, 소세포 폐암, 위장암, 대장암, 결장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 고환암, 간암, 신장암, 방광암, 췌장암, 뇌암, 육종, 골육종, 카포시 (Kaposi) 육종, 흑색종), 백혈병, 건선, 골질환, 섬유증식성 장애 (예를 들어, 결합조직의) 및 아테롬성 경화증을 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 양성, 전-악성 및 악성 세포 증식이 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 특별히 관심이 있는 암에는 백혈병 및 난소암이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
폐, 위장 (예를 들어, 대장, 결장을 포함), 유방 (유선), 난소, 전립선, 간 (간성), 신장 (신성), 방광, 췌장, 뇌 및 피부를 포함한 (단, 이들로 제한되지 않는다) 어떤 타입이 세포라도 치료될 수 있다.
한가지 구체예에서, 치료는 췌장암의 치료이다.
한가지 구체예에서, 치료는 세포의 표면 상에 αvβ6 인테그린을 갖는 종양의 치료이다.
본 발명의 항체-약물 컨주게이트 (ADC)는 예를 들어, 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 다양한 질환 또는 장애를 치료하기 위해서 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 예시적인 상태 또는 과증식성 장애에는 양성 또는 악성 종양; 백혈병, 혈액학적 및 림프성 악성 종양이 포함된다. 그 밖의 다른 것에는 뉴론성, 신경교성, 성상세포성, 시상하부성, 선성, 대식세포성, 상피성, 기질성, 분할강성, 염증성, 혈관형성성, 및 자가면역을 포함한 면역학적 장애가 포함된다.
일반적으로, 치료될 질환 또는 장애는 암과 같은 과증식성 질환이다. 본 발명에서 치료될 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양이 포함되나, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더욱 특별한 예로는 편평세포암 (예를 들어, 상피 편평세포암), 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암, 및 폐의 편평세포 암종을 포함하는 폐암, 복막의 암, 간세포암, 위장암을 포함한 위 또는 위부의 암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 내피 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장 또는 신성 암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간암종, 항문함종, 음경암종뿐만 아니라 두경부암이 포함된다.
치료에 ADC 화합물이 사용될 수 있는 자가면역 질환에는 류마티스성 장애 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 경피증, SLE 및 루푸스 신염과 같은 루푸스, 다발성근염/피부근염, 한랭글로불린혈증, 항-인지질 항체 증후군, 및 건선성 관절염s), 골관절염, 자가면역 위장 및 간 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환 (예를 들어, 궤양성 대장염 및 크론병), 자가면역 위염 및 악성 빈혈, 자가면역 간염, 원발성 담즙성 경화증, 원발성 경화성 담관염, 및 셀리악병), 맥관염 (예를 들어, 처그-스트라우스 (Churg-Strauss) 맥관염, 베게너 (Wegener) 육아종증 및 다발동맥염을 포함한 ANCA-관련된 맥관염),　자가면역 신경학적 장애 (예를 들어, 다발성 경화증, 안진전-근간대 증후군, 중증 근무력증, 신경성 척수염, 파킨슨병, 알츠하이머병, 및 자가면역 다발신경병증), 신장 장애 (예를 들어, 사구체신염, 굿파스춰 (Goodpasture) 증후군, ?? 버거 (Berger)병), 자가면역 피부과적 장애 (예를 들어, 건선, 담마진, 두드러기, 심상성 천포창, 수포성 유천포창, 및 피부 홍반성 루푸스), 혈액학적 장애 (예를 들어, 혈소판감소성 자반병, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 수혈-후 자반병, 및 가자면역 용혈성 빈혈), 아테롬성 경화증, 포도막염, 자가면역 청각 질환 (예를 들어, 내이 질환 및 청력 상실), 베체트 (Behcet)병, 레이노드 (Raynaud) 증후군, 기관 이식, 및 가자면역 내분비 장애 (예를 들어, 인슐란-의존성 진성 당뇨병 (IDDM)과 같은 당뇨병-관련 자가면역 질환, 애디슨 (Addison)병, 및 자가면역 갑상선 질환 (예를 들어, 그레이브스 (Graves)병 및 갑상선염))이 포함된다. 더욱 바람직한 이러한 질환에는 예를 들어, 류마티스성 관절염, 궤양성 대장염, ANCA-관련된 맥관염, 루푸스, 다발성 경화증, 쇼그렌 증후군, 그레이브스병, IDDM, 악성 빈혈, 갑상선염, 및 사구체신염이 포함된다.
치료의 방법
본 발명의 컨주게이트는 치료방법에서 사용될 수 있다. 또한, 치료가 필요한 대상체에게 본 발명의 컨주게이트 화합물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 치료방법이 제공된다. 용어 "치료학적 유효량"은 환자에게 효과를 나타내는데 충분한 양이다. 이러한 효과는 적어도, 적어도 하나의 증상의 개선일 수 있다. 투여되는 실제량, 투여의 속도 및 경과는 치료되는 것의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투약량에 대한 결정은 일반 개업의 및 그 밖의 다른 의사의 책임 하에 있다.
본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 치료와 함께, 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 치료 및 치료법의 예로는 화학요법 (예를 들어, 화학요법제와 같은 약물을 포함하는 활성 약제의 투여); 수술; 및 방사선 요법이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.
"화학요법제"는 작용의 기전과는 관계가 없이 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 클래스에는 알킬화제, 항대사산물, 스핀들 독 (spindle poison) 식물 알칼로이드, 세포독성/항종양 항생제, 토포이소머라제 억제제, 항체, 감광제, 및 키나제 억제제가 포함되나 이들로 제한되지 않는다. 화학요법제에는 "표적화 요법" 및 통상적인 화학요법에서 사용되는 화합물이 포함된다.
화학요법제의 예로는 다음이 포함된다: 에를로티닙 (erlotinib) (타르세바 (TARCEVA®), Genentech/OSI Pharm.), 도세탁셀 (탁소테레 (TAXOTERE®), Sanofi-Aventis), 5-FU (플루오로우라실, 5-플루오로우라실, CAS No. 51-21-8), 젬시타빈 (젬자르 (GEMZAR®), Lilly), PD-0325901 (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), 시스플라틴 (시스-디아민, 디클로로플라티늄(II), CAS No. 15663-27-1), 카보플라틴 (CAS No. 41575-94-4), 파클리탁셀 (탁솔 (TAXOL®), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 트라스투주맙 (trastuzumab) (헤르셉틴 (HERCEPTIN®), Genentech), 테모졸로미드 (4-메틸-5-옥소-2,3,4,6,8-펜트아자비사이클로 [4.3.0] 노노-2,7,9-트리엔-9-카복사미드, CAS No. 85622-93-1, 테모다르 (TEMODAR®), 데모달 (TEMODAL®), Schering Plough), 타목시펜 ((Z)-2-[4-(1,2-디페닐부트-1-에닐)페녹시]-N,N-디메틸에탄아민, 놀바덱스 (NOLVADEX®), 이스투발 (ISTUBAL®), 발로덱스 (VALODEX®), 및 독소루비신 (아드리아마이신 (ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD, 및 라파마이신.
화학요법제의 추가의 예로는 다음이 포함된다: 옥살리플라틴 (엘록사틴 (ELOXATIN®), Sanofi), 보르테조밉 (bortezomib) (벨케이드 (VELCADE®), Millennium Pharm.), 수텐트 (수니티닙 (SUNITINIB®), SU11248, Pfizer), 레트로졸 (페마라 (FEMARA®), Novartis), 이마티닙 메실레이트 (글리벡 (GLEEVEC®), Novartis), XL-518 (Mek 억제제, 엑셀릭시스 (Exelixis), WO 2007/044515), ARRY-886 (Mek 억제제, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (PI3K 억제제, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (PI3K 억제제, Novartis), XL-147 (PI3K 억제제, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), 풀베스트란트 (파슬로덱스 (FASLODEX®), AstraZeneca), 류코보린 (폴린산), 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨 (RAPAMUNE®), Wyeth), 라파티닙 (타이커브 (TYKERB®), GSK572016, Glaxo Smith Kline), 로나파르닙 (사라사르 (SARASAR®), SCH 66336, Schering Plough), 소라페닙 (넥사바르 (NEXAVAR®), BAY43-9006, Bayer Labs), 제피티닙 (이레사 (IRESSA®), AstraZeneca), 이리노테칸 (캄프토사르 (CAMPTOSAR®), CPT-11, Pfizer), 티피파르닙 (자르네스트라 (ZARNESTRA®), Johnson & Johnson), 아브락산 (ABRAXANE™) (무-크레모포 (Cremophor)), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il), 반데타닙 (rINN, ZD6474, 작티마 (ZACTIMA®), AstraZeneca), 클로람부실, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), 템시롤리무스 (토리셀 (TORISEL®), Wyeth), 파조파닙 (GlaxoSmithKline), 칸포스파미드 (텐사이타 (TELCYTA®), Telik), 티오테파 및 사이클로포스파미드 (사이톡산 (CYTOXAN®), 네오사르 (NEOSAR®)); 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조도파, 카보쿠온, 메트유레도파 및 유레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸을 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함); 엘류테로빈; 판크래티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜파란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴과 같은 니트로소우레아; 항생제, 예를 들어, 엔디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 칼리케아미신 감마1I, 칼리케아미신 오메가I1 [Angew Chem . Intl . Ed . Engl. (1994) 33:183-186]; 다이네미신, 다이네미신 A; 클로드로네이트와 같은 비포스포네이트; 에스페라미신뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 크로모포어 및 관련된 크로모프로테인 엔디인 항생제 크로모포어), 아클라시노마이신, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아자-5-옥소-L-노르류신, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 네모루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 항-대사산물; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸어, 사이타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘과 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테트이미드, 미토테인, 트릴로스테인과 같은 항-아드레날 (anti-adrenals); 프롤린산과 같은 엽산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴라사카라이드 컴플렉스 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피로브로만; 가사이토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈 (나벨빈 (NAVELBINE®)); 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 카페시타빈 (젤로다 (XELODA®), Roche); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 및 상기한 것 중의 어떤 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 및 유도체.
또한 "화학요법제"의 정의에는 다음이 포함된다: (i) 예를 들어, 타목시펜 (놀바덱스 (NOLVADEX®)를 포함; 타목시펜 시트레이트), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤 (FARESTON®) (토레미핀 시트레이트)을 포함하는, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 변조물질 (SERMs)과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제; (ii) 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테트이미드, 메가세 (MEGASE®) (메게스트롤 아세테이트), 아로마신 (AROMASIN®) (엑세메스탄; Pfizer), 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르 (RIVISOR®) (보로졸), 페마라 (FEMARA®) (레트로졸; Novartis), 및 아리미덱스 (ARIMIDEX®) (아나스트로졸; AstraZeneca)와 같은, 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제; (iii) 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체)과 같은 항-안드로겐; (iv) MEK 억제제 (WO 2007/044515)와 같은 단백질 키나제 억제제; (v) 지질 키나제 억제제; (vi) 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상적인 세포 증식에 연루된 시그날링 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어, 오블리머센 (제나센스 (GENASENSE®), Genta Inc.)와 같은 PKC-알파, Raf 및 H-Ras; (vii) VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임 (ANGIOZYME®) 및 HER2 발현 억제제와 같은 리보자임; (viii) 유전자 요법 백신, 예를 들어, 알로벡틴 (ALLOVECTIN®), 류벡틴 (LEUVECTIN®) 및 백시드 (VAXID®); 프로류킨 (PROLEUKIN®) rIL-2과 같은 백신; 류프로테칸 (LURTOTECAN®); 아바렐릭스 (ABARELIX®) rmRH와 같은 토포이소머라제 1 억제제; (ix) 베바시주맙 (아바스틴 (AVASTIN®), Genentech)과 같은 항-혈관형성제; 및 상기한 것 중의 어떤 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 및 유도체.
"화학요법제"의 정의에는 또한 알렘투주맙 (캄패스 (Campath)), 베바시주맙 (아바스틴 (AVASTIN®), Genentech); 세툭시맙 (에르비툭스 (ERBITUX®), Imclone); 파니투무맙 (벡티빅스 (VECTIBIX®), A㎎en), 리툭시맙 (리툭산 (RITUXAN®), Genentech/Biogen Idec), 퍼투주맙 (옴니타그 (OMNITARG®), 2C4, Genentech), 트라스투주맙 (헤르셉틴 (HERCEPTIN®), Genentech), 토시투모맙 (벡사르 (Bexxar), 코릭시아 (Corixia)), 및 항체 약물 컨주게이트, 젬투주맙 오조가미신 (마일로타그 (MYLOTARG®), Wyeth)와 같은 치료학적 항체가 포함된다.
본 발명의 컨주게이트와 함께 화학요법제로서 치료학적 잠재력을 갖는 인간화된 모노클로날 항체에는 다음이 포함된다: 알렘투주맙, 아폴리주맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 바피뉴주맙, 베바시주맙, 비바투주맙 메르탄신, 칸투주맙 메르탄신, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 시드푸시투주맙, 시드투주맙, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에를리주맙, 펠비주맙, 폰톨리주맙, 젬투주맙 오조가미신, 이노투주맙 오조가미신, 이필리무맙, 라베투주맙, 린투주맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 모토비주맙, 나탈리주맙, 니모투주맙, 놀로비주맙, 누마비주맙, 오크렐리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파스콜리주맙, 펙푸시투주맙, 펙투주맙, 퍼투주맙, 펙셀리주맙, 랄리비주맙, 라니비주맙, 레슬리비주맙, 레슬리주맙, 레시비주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 시브로투주맙, 시플리주맙, 손투주맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 테피바주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 트라스투주맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투쿠시투주맙, 우마비주맙, 유르톡사주맙, 및 비실리주맙.
본 발명에 따르며 본 발명에 따라서 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 성분, 즉 컨주게이트 화합물 이외에 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 그 밖의 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독서이어야 하며, 활성 성분의 효능을 저해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 경구적이거나 주사, 예를 들어, 피부, 피하, 또는 정맥내 주사에 의한 것일 수 있는 투여의 경로에 따라 좌우될 것이다.
경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 정제, 캅셀제, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성유와 같은 액체 담체를 포함한다. 생리식염수 용액, 덱스트로즈 또는 그 밖의 다른 사카라이드 용액 또는 에틸렌 글리콜 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 캅셀제는 젤라틴과 같은 고체 담체를 포함할 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 질병 부위에서의 주사의 경우에, 활성 성분은 발열성 물질이 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 예를 들어, 염화나트륨 주사, 링커 주사, 락테이트화 링거 주사와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다.
제형
컨주게이트 화합물은 단독으로 사용될 (예를 들어, 투여될) 수 있지만, 이것은 종종 조성물 또는 제형으로 존재하는 것이 바람직하다.
한가지 구체예에서, 조성물은 본 발명에 기술된 바와 같은 컨주게이트 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물 (예를 들어, 제형, 제제, 의약)이다.
한가지 구체예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 보조제, 충진제, 완충제, 보존제, 항산화제, 윤활제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제 (예를 들어, 습윤제), 차폐제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 포함하는 (단, 이들로 제한되지 않는다) 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 하나 또는 그 이상의 다른 약제학적으로 허용되는 성분과 함께 본 발명에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 컨주게이트 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이다.
한가지 구체예에서, 조성물은 추가로 다른 활성 약제, 예를 들어, 다른 치료학적 또는 예방적 약제를 포함한다.
적합한 담체, 희석제, 부형제 등은 표준 약제학 텍스트에서 확인될 수 있다 [참조: 예를 들어, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA), Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994].
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 [11C]-방사성 표지된 컨주게이트 또는 컨주게이트-유사 화합물을 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 하나 또는 그 이상의 다른 약제학적으로 허용되는 성분, 예를 들어, 담체, 희석제, 부형제들과 함께 혼합시키는 것을 포함하여 약제학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 분리된 유니트 (예를 들어, 정제 등)으로 제형화되는 경우에, 각각의 유니트는 예정된 양 (투약량)의 활성 화합물을 함유한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "약제학적으로 허용되는"은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서, 이상적인 이익-위험 비 (benefit/risk ratio)와 균형을 이루어 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이 문제가 되는 대상체 (예를 들어, 인간)의 조직과 접촉시켜 사용하는데 적합한 화합물, 성분, 물질, 조성물, 투약형 등에 관한 것이다. 각각의 담체, 희석제, 부형제 등도 또한 제형의 다른 성분들과 상화적이라는 개념에서 반드시 "허용되어야" 한다.
제형은 약제학의 기술분야에서 잘 알려진 어떤 방법에 의해서라도 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 화합물을 하나 또는 그 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합하도록 유도하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 화합물을 담체 (예를 들어, 액체 담체, 미분된 고체 담체 등)와 균일하고 긴밀하게 회합하도록 한 다음에, 필요한 경우에 생성물을 성형함으로써 제조된다.
제형은 빠르거나 느린 방출; 즉시, 지연, 정기적 (timed) 또는 지속 방출; 또는 이들의 조합을 제공하도록 제조될 수 있다.
비경구 투여 (예를 들어, 주사에 의함)에 적합한 제형은 활성 화합물이 용해되거나, 현탁되거나, 또는 다른 식으로 제공된 (예를 들어, 리포좀 또는 다른 미립자 내에) 수성 또는 비수성, 등장성, 무-발열성물질, 멸균 액체를 포함한다. 이러한 액체는 추가로 항산화제, 완충제, 보존제, 안정화제, 정균제, 현탁화제, 농조화제, 및 제형이 계획된 수용주의 혈액 (또는 다른 적절한 체액)과 등장성이 되도록 하는 용질과 같은 그 밖의 다른 약제학적으로 허용되는 성분을 함유할 수 있다. 부형제의 예로는 예를 들어, 물, 알콜, 폴리올, 글리세롤, 식물유 등이 포함된다. 이러한 제형에서 사용하기에 적합한 등장성 담체의 예로는 염화나트륨 주사, 링거 용액, 또는 락테이트화 링거 주사가 포함된다. 전형적으로, 액체 내의 활성 성분의 농도는 약 1 ng/㎖ 내지 약 10 ㎍/㎖, 예를 들어, 약 10　ng/㎖ 내지 약 1 ㎍/㎖이다. 제형은 단위-용량 또는 수회-용량형 밀봉 용기, 예를 들어, 앰플 및 바이알 내에 제공될 수 있으며, 사용하기 직전에 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주사용 물을 첨가하는 것만을 필요로 하는 동결-건조된 (동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
투약량
컨주게이트 화합물, 및 컨주게이트 화합물을 포함하는 조성물의 적절한 투약량이 환자에 따라서 달라질 수 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 인식될 수 있을 것이다. 최적 투약량을 결정하는 것은 일반적으로, 치료학적 이익의 레벨을 모든 위험 또는 유해한 부작용에 대해서 균형이 잡히게 하는 것을 포함한다. 선택된 투약량 레벨은 개별적인 화합물의 활성, 투여의 경로, 투여의 시기, 화합물의 배설률, 치료의 지속기간, 조합물 내의 그 밖의 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 상태의 중증도, 및 환자의 종, 성별, 연령, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 선형 병력을 포함하는 (단, 이들로 제한되지 않는다) 다양한 인자에 따라 좌우될 수 있다. 화합물의 양 및 투여의 경로는 궁극적으로 의사, 수의사 또는 임상의의 판단에 의할 수 있지만, 투약량은 일반적으로, 작용 부위에서 실질적으로 위험하거나 해로운 부작용을 야기함이 없이 바람직한 효과를 달성하는 국소 농도를 달성하도록 선택될 것이다.
투여는 치료의 과정 전체에 걸쳐서 단일 용량으로 연속적으로 또는 간헐적으로 (예를 들어, 적절한 간격으로 분할된 용량으로) 이루어질 수 있다. 가장 효과적인 투여의 수단 및 투약량을 결정하는 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 치료에 사용된 제형, 치료의 목적, 치료될 표적 세포(들), 및 치료될 대상체에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 수회 투여는 치료하는 의사, 수의사 또는 임상의에 의해서 선택되는 용량 레벨 및 패턴으로 수행될 수 있다.
일반적으로, 활성 화합물의 적합한 용량은 1일에 대상체의 체중 킬로그램당 약 100　ng 내지 약 25 ㎎ (더욱 전형적으로 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎎)의 범위이다. 활성 화합물이 염, 에스테르, 아미드, 프로드럭 등인 경우에, 투여되는 양은 모화합물을 기준으로 계산되며, 따라서 사용되는 실중량은 비례해서 증가한다.
한가지 구체예에서, 활성 화합물은 다음의 투약 레지멘에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 100 ㎎, 1일 3 회.
한가지 구체예에서, 활성 화합물은 다음의 투약 레지멘에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 150 ㎎, 1일 2 회.
한가지 구체예에서, 활성 화합물은 다음의 투약 레지멘에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 200 ㎎, 1일 2 회.
그러나, 한가지 구체예에서 컨주게이트 화합물은 다음의 투약 레지멘에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 50 또는 약 75 ㎎, 1일 3 또는 4 회.
한가지 구체예에서, 컨주게이트 화합물은 다음의 투약 레지멘에 따라 인간 환자에게 투여된다: 약 100 또는 약 125 ㎎, 1일 2 회.
상술한 투약량은 컨주게이트 (PBD 부분 및 항체에 대한 링커를 포함)에 대해서, 또는 제공된 PBD 화합물의 유효량, 예를 들어, 링커의 분해 후에 방출될 수 있는 화합물의 양에 대해서 적용할 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 ADC의 적절한 투약량은 상기 정의된 바와 같은 치료될 질환의 타입, 질환의 중증도 및 과정, 분자가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 치료법, 항체에 대한 환자의 임상력 및 반응, 및 주치의의 판단에 따라 좌우될 것이다. 분자는 적합하게는 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐서 환자에게 투여된다. 질환의 타입 및 중증도에 따라서 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏ (예를 들어, 0.1-20 ㎎/㎏)의 분자가 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 별도의 투여에 의해서든, 또는 연속 주입에 의해서든, 환자에게 투여하기 위한 일차 후보 투약량이다. 전형적인 1일 투약량은 상기 언급된 인자에 따라서 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 것이다. 환자에게 투여될 ADC의 예시적인 투약량은 환자의 체중 ㎏당 약 0.1 내지 약 10 ㎎/kg의 범위이다. 며칠 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 치료는 질병 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속된다. 에시적인 투약 레지멘은 약 4 ㎎/㎏의 초기 부하용량에 이어서 ADC를 1 주일, 2 주일 또는 3 주일마다 추가의 용량으로 투여하는 과정을 포함한다. 그 밖의 다른 투약 레지멘도 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기술 및 시험방법에 의해서 쉽게 모니터링된다.
치료
상태를 치료하는 관계에서 본 명세서에서 사용된 용어 "치료"는 일반적으로 인간 또는 동물 (예를 들어, 수의과 분야에서)의 치료 및 치료법에 관한 것이며, 여기에서 일부의 바람직한 치료학적 효과, 예를 들어, 상태의 진행의 억제가 달성되고, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 상태의 회귀, 상태의 개선, 및 상태의 치유를 포함한다. 예방적 수단 (즉, 예방, 방지)으로서의 치료가 또한 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "치료학적 유효량"은 바람직한 치료 레지멘에 따라 투여되는 경우에 일부의 바람직한 치료학적 효과를 제공하는데 효과적이며, 이상적인 이익/위험 비에 적합한 활성 화합물, 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 투약형의 양에 관한 것이다.
마찬가지로, 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "예방적 유효량"은 바람직한 치료 레지멘에 따라 투여되는 경우에 일부의 바람직한 예방 효과를 제공하는데 효과적이며, 이상적인 이익/위험 비에 적합한 활성 화합물, 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 투약형의 양에 관한 것이다.
항체 약물 컨주게이트의 제조
항체 약물 컨주게이트는 다음을 포함하여, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 유기 화학, 반응, 조건 및 시약을 사용하는 몇 개의 경로에 의해서 제조될 수 있다: (1) 공유 결합을 통해서 항체-링커 중간체 Ab-L를 형성시키기 위한 항체의 친핵성 그룹 또는 친전자성 그룹과 2가 링커 시약의 반응에 이어서 활성화된 약물 부분 시약과의 반응; 및 (2) 공유 결합을 통해서 약물-링커 시약 D-L을 형성시키기 위한 약물 부분 시약과 링커 시약의 반응에 이어서 항체의 친핵성 그룹 또는 친전자성 그룹과의 반응. 컨주게이션 방법 (1) 및 (2)는 본 발명의 항체-약물 컨주게이트를 제조하기 위한 다양한 항체 및 링커와 함께 사용될 수 있다.
항체 상의 친핵성 그룹에는 다음이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: (i) N-말단 아민 그룹, (ii) 측쇄 아민 그룹, 예를 들어, 리신, (iii) 측쇄 티올 그룹, 예를 들어, 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화된 경우의 당 하이드록실 또는 아미노 그룹. 아민, 티올 및 하이드록실 그룹은 친핵성이며, (i) NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드와 같은 활성 에스테르; (ii) 할로아세트아미드와 같은 알킬 및 벤질 할라이드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실 및 말레이미드 그룹을 포함한 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자성 그룹과 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있다. 특정의 항체는 환원가능한 쇄간 디설파이드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 DTT (클리랜드 (Cleland) 시약, 디티오트레이톨) 또는 TCEP [트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA]와 같은 환원제로 처리함으로써 링커 시약과의 컨주게이션에 대해서 반응성으로 만들 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 브릿지는 이론적으로 2 개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 수 있다. 추가의 친핵성 그룹은 아민을 티올로 전환시키는 리신과 2-이미노티올란 (트라우트 (Traut) 시약)과의 반응을 통해서 항체 내에 도입될 수 있다.
항체-약물 컨주게이트는 또한, 링커 시약 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 부분을 도입시키도록 항체를 변형시킴으로써 생산될 수도 있다. 글리코실화된 항체의 당은 예를 들어, 퍼요오데이트 산화시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 부분의 아민 그룹과 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 그룹을 형성시킬 수 있다. 생성된 이민 쉬프 (Schiff) 염기 그룹은 안정한 결합을 형성할 수 있거나, 예를 들어, 보로하이드라이드 시약에 의해서 환원되어 안정한 이민 결합을 형성할 수 있다. 한가지 구체예에서, 글리코실화된 항체의 탄수화물 부분과 갈락토즈 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼요오데이트의 반응은 약물 상의 적절한 그룹과 반응할 수 있는 단백질 내의 카보닐 (알데히드 및 케톤) 그룹을 제공할 수 있다 [Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, p 234-242]. 다른 구체예에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 단백질은 나트륨 메타-퍼요오데이트와 반응하여 제1 아미노산 대신에 알데히드의 생산을 제공할 수 있다 [Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852]. 이러한 알데히드는 약물 부분 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
마찬가지로, 약물 부분 상의 친핵성 그룹에는 다음의 그룹이 포함되나 이들로 제한되지 않는다: (i) NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드와 같은 활성 에스테르; (ii) 할로아세트아미드와 같은 알킬 및 벤질 할라이드; (iii) 알데히드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 그룹을 포함한 링커 부분 및 링커 시약 상의 친전자성 그룹과의 공유 결합을 형성하도록 반응할 수 있는 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카르바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드 그룹. 반응성 친핵성 그룹은 표준 작용 그룹 상호전환에 의해서 안트라사이클린 유도체 화합물 상에 도입될 수 있다. 예를 들어, 하이드록실 그룹은 미추노부 (Mitsunobu)-타입 반응에 의해서 티올 그룹으로 전환되어 티올-변형된 약물 화합물을 형성시킬 수 있다 .
대상체 /환자
대상체/환자는 동물, 포유동물, 태반 포유동물, 유대류 포유동물 (예를 들어, 캥거루, 웜뱃 (wombat)), 단공류 동물 (예를 들어, 오리너구리 (duckbilled platypus)), 설치류 (예를 들어, 기니아피그, 햄스터, 랫트, 마우스), 쥣과의 동물 (예를 들어, 마우스), 토끼목 포유동물 (예를 들어, 토끼), 조류 (예를 들어, 새), 개과의 동물 (예를 들어, 개), 고양이과 동물 (예를 들어, 고양이), 말류 (예를 들어, 말), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 양류 (예를 들어, 양), 소류 (예를 들어, 소), 영장류, 유인원류 (예를 들어, 원숭이 또는 유인원), 원숭이 (예를 들어, 명주원숭이 (marmoset), 개코원숭이 (baboon)), 유인원류　(예를 들어, 고릴라, 침팬지, 오랑우탕, 긴팔원숭이 (gibbon)), 또는 인간일 수 있다.
더구나, 대상체/환자는 발육 중인 그의 모든 형태, 예를 들어, 태아일 수 있다. 한가지 바람직한 구체예에서, 대상체/환자는 인간이다.
한가지 구체예에서, 환자는 각각의 환자가 세포의 표면 상에 αvβ6 인테그린을 갖는 종양이 있는 집단이다.
합성
한가지 구체예에서, 화학식 VIII의 다이머 컨주게이트는 반응식 1에 나타낸 바와 같이 화합물 I 및 II로부터 제조될 수 있다.
[반응식 1]
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일반적으로, 비대칭 다이머는 화학식 IV의 비스-아미노 화합물을 분자의 대칭성을 파괴하기 위해서 1 당량의 상업적으로 이용할 수 있는 (또는 쉽게 제조되는) 클로로포르메이트 시약으로 처리함으로써 제조될 수 있다. 그 후, 나머지 유리 아민은 독립적으로 작용화되어 필요한 치료학적으로 불안정한 프로그룹 (RL)을 도입시킬 수 있다. 또한, PBD B-환에 근접시키기 위한 작용 그룹 조작은 보호 및 캡핑 그룹을 제거하고, 항체-연결 작용 그룹, 예를 들어, G1,을 도입시켜 표적 분자를 제공한다.
화학식 IV의 화합물은 전형적으로, 적합하게 작용화된 C-환 단편 (I)을 화학식 II의 A-환 함유 다이머 코어 (core)에 커플링시킴으로써 제조된다. C-환 단편은 공지의 카바메이트 보호된 메틸 4-옥소프롤리네이트 빌딩 블럭으로부터 제조될 수 있다. 위티그 (Wittig) 또는 호너-에몬스 (Horner-Emmons) 조건 하에서의 올레핀화를 사용하여 엔도- 또는 엑소-불포화된 알켄을 제공할 수 있다. 대신으로, 탠덤 트리플레이션 (tandem triflation) 및 수주키 (Suzuki) 커플링 반응을 사용하여 4-아릴 치환된 3,4 또는 4,5-불포화된 C-환 단편을 수득할 수 있다. C-환 및 A-환 단편은 A-환 단편의 산 클로라이드 유도체를 사용하여 트리에틸아민의 존재 하에 표준 조건 하에서 커플링시켜 화학식 III의 화합물을 제공할 수 있다. 타입 III의 화합물은 엔도 또는 엑소 C-환 불포화에 영향을 미치지 않고 아세트산 중의 아연으로 환원시켜 화학식 IV의 분자를 제공할 수 있다.
타입 VI의 비대칭적 카바메이트는 타입 IV의 비스-아민을 피리딘 도는 트리에틸아민의 존재 하에서 1 당량의 상업적으로 이용할 수 있는 (또는 쉽게 제조되는) 클로로포르메이트로 처리함으로써 제조될 수 있다. 클로로포르메이트는 프로그룹 (RL)에서 사용된 것과 직교하거나 동일한 카바메이트 캡핑 유니트 (RC)를 제공하도록 선택될 수 있다. 동일한 카바메이트는 보호 그룹 둘 다의 동시 제거를 가능하도록 하여 합성 단계를 절약하게 한다. 그러나, 캡핑 카바메이트 (RC)의 제거는 민감성 N10-C11 이민 또는 카비놀아민 부분의 존재 하에서 일어나는 항체-연결 작용기의 첨가를 필요로 한다. 필요한 경우에, 이 상황은 보호된 N10-C11 카비놀아민 부분을 유지시키면서 항체-연결 부분의 첨가를 허용하는 직교성 카바메이트 보호 그룹의 사용에 의해서 피할 수 있다. 이 전략에서, N10-C11 부분은 항체-연결 부분의 존재 하에서 노출되어야 하며, 사용된 시약은 반드시 이 부분과 상화적이어야 한다. 예를 들어, N10-C11 이민이 말레이미드 그룹의 존재 하에서 노출된다면, 탈보호제, Cd/Pb 커플 및 TBAF가 말레이미드 그룹에 영향을 미치지 않아야 하기 때문에 Troc 및 Teoc가 적합한 RC 그룹일 수 있다. 다른 한편으로, 피롤리딘과 같은 π-알릴 스캐빈저 (scavengers)는 말레이미드 그룹에 대해 1,4-양식으로 첨가할 수 있기 때문에 Alloc 그룹은 피하여야 한다. RL 카바메이트는 나머지 아미노 그룹을 이소시아네이트로 전환시키고, 이것을 RL 알콜로 ??칭함으로써 도입될 수 있다. 대신으로, RL 알콜은 클로로포르메이트 또는 작용성 등가물 (플루오로포르메이트, p-니트로카보네이트, 펜타플루오로카보네이트 또는 하이드록시벤조트리아졸 카보네이트)로 전환될 수 있다. 마지막으로, 나머지 아미노 그룹은 반응성 p-니트로카바메이트, 펜타플루오로카바메이트 또는 하이드록시벤조트리아졸 카바메이트로 전환시킬 수 있으며, 이들은 RL 알콜로 치환되어 화학식 VI의 분자를 제공할 수 있다.
화학식 VII의 분자는 화학식 VI의 분자로부터 아세테이트 보호 그룹을 수성 메탄올 중의 탄산칼륨에 의해서, 또는 RL 내의 Fmoc 그룹의 존재 하에서 리튬 트리에틸보로하이드라이드에 의해서 제거함으로써 제조될 수 있다. 데스-마틴 (Dess-Martin) 퍼요오디난 (또는 대신으로 TPAP/NMO, PDC 또는 스웨른 (Swern) 조건 하)에 의한 산화는 폐환된 생성물을 제공한다.
화학식 V의 컨주게이트는 화학식 VII의 분자로부터 캡핑 그룹 RC의 제거, 표준 조건 하에서 항체와 같은 세포 결합제에 컨주게이트될 수 있는 항체-연결 부분 (예를 들어, 말레이미도카프로일 그룹)을 포함시키기 위한 RL의 조작에 의해서 제조될 수 있다 [참조: Dubowchik et al. Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855-869]. RL의 조작은 그룹 G1과 같은 스페이서 요소를 포함시키도록 그룹을 연장시키는 단계를 포함할 수 있으며, 그 다음에 이 요소는 세포 결합제에 연결시키기 위해서 사용될 수 있다 (이에 의해서 그룹 A가 형성된다).
모노머 화합물 및 대칭적 다이머는 상술한 바와 같은 비대칭적 다이머와 유사한 방식으로 제조될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 화학식 XVIII의 컨주게이트는 반응식 2에 나타낸 바와 같이 화합물 IX로부터 제조될 수 있다.
화합물 II
화학식 II의 화합물의 합성은 본 출원인의 선행 출원인 WO 2006/111759에 기술되어 있으며, 또한 문헌 그레그손 (Gregson) 등 [J. Med . Chem . 2001, 44, 1161-1174]에 의해서도 기술되었다. 여기에 기술된 바와 같은 화합물 II의 제조는 구체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 화합물 IIa는 3 탄소 링커를 갖는다. 화합물 IIb는 5 탄소 링커를 갖는다.
[반응식 2]
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이 반응식에서, 그룹 R2는 C5 -20 아릴 그룹이다. 화학식 IX의 화합물은 WO 2004/043963에 기술되어 있다.
화학식 X의 화합물은 예를 들어, TCCA 및 TEMPO; BAIB 및 TEMPO; TPAP; 데스-마틴 조건; 또는 스웨른 조건을 사용한 산화반응에 의해서 화학식 IX의 화합물로부터 합성될 수 있다.
화학식 IX의 화합물은 화학식 B 및 C의 적절한 화합물, 또는 이들의 활성화된 유도체를 커플링시킴으로써 합성될 수 있다:
Figure 112012086532911-pct00120
화학식 B 및 C의 화합물은 일반적으로 상업적으로 이용할 수 있거나 쉽게 합성할 수 있다. 화합물 B가 다이머이면, 이것은 WO　00/12508에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다.
화학식 XI의 화합물은 X를 불활성 대기 하에 무수 유기 용매 중에서 -35℃ 또는 그 이하의 온도에서 적절한 무수물 및 무수 2,6-루티딘 또는 무수 2,6-tBu-피리딘으로 처리하는 것을 포함하는 방법에서 화학식 X의 화합물로부터 제조될 수 있다. XI은 C1-C2 이중 결합을 갖는 화합물을 실질적으로 갖지 않는다.
C1-C2 이중 결합을 갖는 화합물의 제조는 문헌 [Kang et al., Chem . Commun., 2003, 1680-1689]에 기술되어 있음을 유의하여야 한다.
화학식 XI의 화합물은 화학식 XII의 화합물로 전환될 수 있다. 전환반응 (수주키 커플링)은 XI과 적절한 아릴 붕소 유도체를 팔라듐 촉매화된 크로스 커플링 (cross coupling)시킴으로써 수행된다. 팔라듐 촉매는 모든 적합한 촉매, 예를 들어, Pd(PPh3)4, Pd(OCOCH3)2, PdCl2, Pd(dba)3일 수 있다.
화학식 XII의 화합물은 화합물 XIII을 통해서 화학식 XIV로 전환될 수 있다. 전환은 일차로 에스테르를 환원시키고, 아세테이트 (또는 대체 방법에서 실릴 에테르)로 재보호함으로써 달성된다. 환원은 예를 들어, LiAlH4 또는 NaBH4를 사용한 표준 방법에 의해서 달성될 수 있다. 아세테이트로서의 재보호는 예를 들어, 아세틸 클로라이드와 반응시킴으로써 달성될 수 있다 (실릴 에테르로서의 재보호는 예를 들어, 적절한 실릴 클로라이드와 반응시킴으로써 달성될 수 있다). 그 후, 니트로 그룹의 환원은 예를 들어, 아세트산 중의 아연을 사용하여 수행된다.
화학식 XIV의 화합물은 화학식 XV의 화합물로 전환될 수 있다. 이러한 전환은 통상적으로 XIV를 트리포스겐과 반응시켜 이소시아네이트를 수득하고, 이어서 RL-OH와 반응시킴으로써 달성된다. 이 방법은 WO 2005/023814에 기술되어 있다. 대신으로, 간단한 질소 보호 그룹은 또한 클로로포르메이트, 플루오로포르메이트 또는 아지도포르메이트로서 도입될 수 있다. 더 복잡한 질소 보호 그룹뿐만 아니라 간단한 질소 보호 그룹은 O-석신아미드 카보네이트, O-펜타플루오로페닐 카보네이트 및 O-니트로페닐 카보네이트로서 도입될 수 있다.
XV의 XVII로의 전환은 수성 메탄올 중의 탄산칼륨에 의한, 또는 리튬 트리에틸보로하이드라이드에 의한 아세테이트 보호 그룹의 초기 제거에 의해서 달성될 수 있다. 데스-마틴 퍼요오디난 (또는 대신으로 TPAP/NMO, TFAA/DMSO, SO3.피리딘 컴플렉스/DMSO, PDC, PCC, BAIB/TEMPO 또는 스웨른 조건 하)에 의한 산화는 폐환 생성물을 제공한다. 실릴 에테르가 아세테이트 대신에 사용된다면, XV의 XVII로의 전환은 예를 들어, THF 중의 TBAF, 수성 THF 중의 아세트산, DMF 중의 CsF, 또는 피리딘 중의 HF를 사용한 실릴 에테르 보호 그룹의 초기 제거에 이은 상술한 바와 같은 산화에 의해 달성될 수 있다.
그 후, 화합물 XVIII을 세포 결합제에 부착시킨다. XVII로부터 XVIII로의 일련의 단계 또는 단계들은 RL의 성질에 따라 좌우된다. 이 그룹을 변형시킨 다음에 세포 결합제에 부착시켜 본 발명의 컨주게이트를 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 보호 그룹 캡을 제거하여 세포 결합제와의 반응에 적합한 작용기를 제공할 수 있다. 다른 단계에서는, 이 동일한 작용기를 사용하여 그룹 G1과 같은 추가의 스페이서 요소에 연결시킬 수 있으며, 그 후에 이 스페이서 요소는 다시 세포 결합제에 연결될 수 있다 (이에 의해서 그룹 A가 형성된다).
본 발명의 일부의 구체예에서는, 화학식 A-A 및 A-B의 화합물을 포함한 화학식 A-I의 화합물이 제공된다. 이 타입의 화합물은 WO 2010/091150에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. WO 2010/091150에 기술된 중간체 화합물은 또한, 상술한 방법에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 단락 [164]에 나타낸 다이머 화합물 15가 상기 반응식 1에서 화합물 III으로 사용될 수 있다. 화합물 3, 6 및 9로 나타낸 타입의 모노머 화합물 및 추가의 개조는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다.
바람직한 합성
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 화합물 14이고, 반응식 3에 나타낸 바와 같이 제조된다. 디펩타이드 7a,b 및 8은 이하의 실험 항목에 기술된 바와 같이 제조된다. 이 반응식에서, 링커 부분 L1 및 L2는 다음의 구조를 갖는다:
Figure 112012086532911-pct00121
[반응식 3]
Figure 112012086532911-pct00122
Figure 112012086532911-pct00123
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디펩타이드가 L2에 상응하는 화합물 13c는 유사한 방법에 의해서 12c로부터 제조될 수 있다.
한가지 구체예에서, 컨주게이트는 화합물 16a 또는 16b이며, 이 화합물은 이하의 반응식 4에 나타낸 바와 같이 제조되고, 여기에서 화합물 12a는 상술한 바와 같이 제조될 수 있다:
[반응식 4]
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[반응식 5]
Figure 112012086532911-pct00126
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[반응식 9]
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[반응식 15]
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Figure 112012086532911-pct00137
본 발명은 이제 다음의 비-제한적 실시예를 참고로 하여 더 기술된다. 본 발명의 다른 구체예는 이들에 비추어서 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 생각될 수 있을 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌의 기술내용은, 이것이 본 발명을 수행하기 위해 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 사용될 수 있는 한, 이에 의해서 본 명세서에 교차 참조로 포함된다.
실험
일반 정보
반응 진행은 알루미늄 플레이트 상의 형광 표시기와 함께 머크 키에젤겔 (Merck Kieselgel) 60 F254 실리카겔을 사용한 박층 크로마토그래피 (TLC)에 의해서 모니터링하였다. TLC의 가시화는 다른 식으로 언급되지 않는 한 UV 광선 또는 요오드 증기에 의해서 달성되었다. 섬광 크로마토그래피는 머크 키에젤겔 60 F254 실리카겔을 사용하여 수행하였다. 추출 및 크로마토그래피 용매는 Fisher Scientific (U.K)으로부터 구입하여 더 정제하지 않고 사용하였다. 모든 화학물질들은 Aldrich, Lancaster 또는 BDH로부터 구입하였다.
LC/MS 조건은 다음과 같았다: HPLC (Waters Alliance 2695)는 물 (A) (포름산 0.1%) 및 아세토니트릴 (B) (포름산 0.1%)의 이동상을 사용하여 주행시켰다. 구배: 초기 조성 1.0 분에 걸쳐서 5% B, 다음에는 3 분 이내에 5% B에서 95% B. 조성은 0.5 분 동안 95% B에서 유지시킨 다음에, 0.3 분 이내에 5% B로 복귀시켰다. 총 구배 주행시간은 5 분이다. 유속 3.0 ㎖/분, 400 ㎕를 제로 불감 용적 티피스 (zero dead volume tee piece)를 통해서 분할시켜 이것을 질량 분석계로 통과시켰다. 검출 파장 범위: 220 내지 400 ㎚. 기능 타입: 다이오드 어레이 (535 스캔). 칼럼: 페녹메넥스 오닉스 모놀리식 (Phenomenex® Onyx Monolithic) C18 50 x 4.60 ㎜.
다음의 반-정제용 (semi-preparative) HPLC 방법이 사용되었다: 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 다음 크기의 조르박스 에클리스 (Zorbax Eclipse) XDB C-18 칼럼 상에서 수행되었다: 분석을 위해서는 150 x 4.6 ㎜, 및 정제 작용을 위해서는 250 x 9.4 ㎜. 모든 HPLC 실험은 다음의 구배 조건으로 수행되었다: 초기 고정 조성 20 분에 걸쳐서 5% B에서 50% B, 5 분 동안 50% B에서 유지시킨 다음에, 2 분 이내에 50% B에서 100% B, 3 분 동안 100% B에서 유지시키고, 2 분 이내에 5% B로 복귀시키고, 3 분 동안 유지시켰다. 구배 주행의 총 지속시간은 35 분이었다. 사용된 용출제는 용매 A (0.02% TFA를 함유하는 H2O) 및 용매 B (0.02% TFA를 함유하는 CH3CN)였다. 사용된 유속은 분석을 위해서는 1.20 ㎖/분이고, 정제용 HPLC를 위해서는 5.00 ㎖/분이었다.
화합물 2 - ( S )-2-( 메톡시카보닐 )-4- 메틸렌피롤리디늄 클로라이드
화합물 2는 또한, WO 2007/085930에서 PBD 화합물의 제조에서의 사용에 관해 기술되어 있다.
화합물 2는 여기에서 참고로 인용된 WO　2007/085930에 기술된 바와 같이 트랜스-4-하이드록시-프롤린으로부터 제조될 수 있다. 특히, 화합물 2의 TFA 염의 제조를 기술한 실시예 13이 특히 적절하다.
대안적으로, 화합물 2는 이하에 기술된 바와 같이 화합물 1로부터 제조될 수 있다.
( S )-1-tert-부틸-2-메틸 4-메틸렌피롤리딘-1,2-디카복실레이트
탄산칼륨 (19.92 g, 14 mmol, 3 당량)을 DMF (270 ㎖) 중의 화합물 1 (10.92 g, 48 mmol, 1 당량)의 교반된 용액에 첨가하였다. 생성된 백색 현탁액을실온에서 30 분 동안 교반하고, 이 시점에 요오도메탄 (21.48 g, 9.5 ㎖, 151 mmol, 3.15　당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하도록 하였다. 감압 하에서 회전 증발에 의해 DMF를 제거하여 황색 잔류물을 수득하고, 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배시켰다. 유기층을 분리하고, 수성상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 합하여 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 감압 하에서 회전 증발에 의해 에틸 아세테이트를 제거하여 황색 오일로서 조생성물을 제공하였다. 조생성물을 섬광 크로마토그래피 [85% n-헥산/15% 에틸 아세테이트]에 의해서 정제하여 무색 오일로서 생성물을 수득하였다 [참조: 또한 F Manfre et al., J. Org . Chem. 1992, 57, 2060-2065].
(S)-2-(메톡시카보닐)-4-메틸렌피롤리디늄 클로라이드
디옥산 중의 염산의 용액 (4 M, 63 ㎖, 254.4 mmol, 4.5 당량)을 실온에서 (S)-1-tert-부틸 2-메틸 4-메틸렌피롤리딘-1,2-디카복실레이트 (13.67 g, 56.6　mmol, 1　당량)에 첨가하였다. CO2의 유리 및 Boc 그룹의 제거를 나타내는 발포 (effervescence)가 관찰되었다. 생성물은 백색 고체로 침전하였으며, 추가의 디옥산을 첨가하여 교반을 용이하게 하고, 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반하도록 한 다음에 에테르로 희석하였다. 침전된 생성물을 진공 여과에 의해서 수거하고, 추가의 에테르로 세척하였다. 공기 건조시켜 백색 분말로서 원하는 생성물 2를 수득하였다 (9.42 g, 94%) [참조: 또한 P Herdwijn et al ., Canadian Journal of Chemistry. 1982, 60, 2903-7].
화합물 3
화합물 3은 WO 2006/111759 및 그레그손 (Gregson) 등의 문헌에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.
화합물 4
화합물 4는 화합물 3 및 화합물 2로부터 제조될 수 있다.
촉매량의 무수 DMF (0.5 ㎖)를 실온에서 무수 DCM (180 ㎖) 중의 옥살릴 클로라이드 (9.1 g, 6.25 ㎖, 71.7 mmol, 3 당량) 및 화합물 3 (11.82 g, 23.9 mmol, 1 당량)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. DMF를 첨가한 후에 격렬한 발포가 관찰되었으며, 반응 혼합물을 염화칼슘 건조 튜브 (drying tube)가 장착된 둥근 바닥 플라스크 내에서 18 시간 동안 교반하도록 하였다. 생성된 맑은 용액을 감압 하에서 증발시키고, 고체를 에테르와 함께 연마하였다. 고체 생성물을 진공 여과에 의해서 수거하고, 추가의 에테르로 세척하고, 진공 하에 40℃에서 1.5 시간 동안 건조시켰다. 그 후, 이 고체를 드라이아이스/아세토니트릴 욕의 도움을 받아 -40 내지 -50℃의 온도를 유지시키면서 TEA (12.08 g, 119.6 mmol, 5 당량) 및 무수 DCM (110 ㎖) 중의 화합물 2 (9.35 g, 52.6 mmol, 2.2 당량)의 현탁액에 조금씩 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 -40℃에서 1 시간 동안 교반하도록 한 다음에 실온으로 가온하였으며, 이 시점에 LCMS는 출발물질의 완전한 소비를 나타내었다. 반응 혼합물을 추가의 DCM으로 희석하고, 수성 염산 (1 M, 2 x 200 ㎖), 포화 수성 중탄산나트륨 (2 x 250 ㎖), 물 (250 ㎖), 염수 (250 ㎖)로 순차적으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시시켰다. DCM을 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 황색 포움 (foam)으로서 생성물을 수득하였다 (13.94 g, 79%). 분석 데이터: RT 3.95 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 741 ([M + 1]+., 100).
화합물 5
화합물 5는 화합물 4로부터 비스-알콜 및 비스-아세테이트를 거쳐서 3 단계로 제조될 수 있다.
비스-알콜
고체 리튬 보로하이드라이드 (0.093 g, 4.3 mmol, 3 당량)를 질소 대기 하에 0℃ (얼음욕)에서 무수 THF (10 ㎖) 중의 에스테르 4 (1.05 g, 142 mmol, 1 당량)의 용액에 한꺼번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30 분 동안 교반하도록 한 다음에, 실온으로 가온하였으며, 이 시점에 오렌지색 고무질 물질의 침전이 관찰되었다. 반응 혼합물을 실온에서 추가로 2 시간 동안 교반한 다음에, 얼음욕에서 냉각시키고, 물 (20 ㎖)로 처리하여 황색 현탁액을 수득하였다. 염산 (1 M)을 발포가 중지할 때까지 조심해서 첨가하였다 (격렬한 발포!). 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (4 x 50 ㎖)로 추출하고, 유기층을 합하여 물 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 에틸 아세테이트를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 황색 포움으로서 비스-알콜 생성물을 수득하였다 (0.96 g, 99%). 반응을 12.4 g 스케일로 반복하여 11.06 g의 생성물을 수득하였다 (96%). 분석 데이터: RT 3.37 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 685 ([M + 1]+., 100).
비스-아세테이트
무수 DCM (100 ㎖) 중의 아세틸 클로라이드 (3.4 g, 3.1 ㎖, 43.5 mmol, 2.6 당량)의 용액을 질소 대기 하에 0℃에서 무수 DCM (200 ㎖) 중의 비스-알콜 (11.46 g, 16.73 mmol, 1 당량) 및 트리에틸아민 (5.07 g, 6.98 ㎖, 50.2 mmol, 3 당량)의 교반된 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 교반을 1 시간 동안 계속하였다. TLC 및 LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 염수 (200 ㎖)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 감압 하에서 회전증발에 의해 DCM을 제거하여 조생성물을 제공하였다. 섬광 크로마토그래피 [구배 용출: 20% n-헥산/80% 에틸 아세테이트에서 10% n-헥산/90% 에틸 아세테이트]로 황색 포움으로서 순수한 비스-아세테이트를 제공하였다 (10.8 g, 84%). 분석 데이터: RT 3.35 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 769 ([M + 1]+., 100).
화합물 5
아연 분말 (14.2 g, 2.17 mmol, 30 당량)을 에탄올 (250 ㎖) 및 아세트산 (65 ㎖) 중의 비스-아세테이트 (5.56 g, 7.24 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하였다. 교반된 반응 혼합물을 환류 하에서 가열하여 황색 용액은 무색이 되었다 (아연 응집이 또한 관찰되었으며, 이것은 반응액의 교반을 어렵게 만들었다). 반응을 1 시간 동안 계속하도록 하였으며, 이 시점에 LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 셀라이트를 통해서 여과하고, 여과 패드를 DCM으로 세척하였다. 여액을 물 (3 x 500 ㎖), 포화 수성 중탄산나트륨 (2 x 250　㎖), 염수 (500 ㎖)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 감압 하에서 회전증발시켜 회백색 포움으로서 생성물 5를 수득하였다 (4.71 g, 92%). 분석 데이터: RT 3.33 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 709 ([M + 1]+., 100).
화합물 6
화합물 6은 화합물 5로부터 3 단계로 제조될 수 있다 .
모노-Alloc 생성물
무수 DCM (150 ㎖) 중의 알릴 클로로포르메이트 (0.634 g, 0.56 ㎖, 5.6 mmol, 0.9 당량)의 용액을 -78℃ (드라이아이스/아세톤 욕)에서 무수 DCM (500　㎖) 중의 화합물 5 (4.145 g, 5.8 mmol, 1 당량) 및 피리딘 (0.106 g, 0.11 ㎖, 11.1 mmol, 1.9 당량)의 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 1 시간 동안 교반한 다음에, 실온에 도달하도록 하였다. 반응 혼합물을 포화 황산구리 수용액 (2 x 300 ㎖), 물 (400 ㎖), 염수 (400 ㎖)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 감압 하에서 회전증발에 의해 검은색 포움으로서 조생성물을 수득하였다. 섬광 크로마토그래피 [40% n-헥산/60% 에틸 아세테이트 내지 5% 메탄올/95% 에틸 아세테이트]에 의해서 정제하여 비스-alloc 생성물 (0.84 g), 목적하는 모노-alloc 생성물 (1.94 g, 44%) 및 회수된 비스-알라닌 (0.81 g)을 제공하였다.
분석 데이터: RT 3.32 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 793 ([M + 1]+., 100); MS (ES-) m/z (상대 강도) 791 ([M - 1])-., 100).
이소시아네이트
트리에틸아민 (0.018 g, 25 ㎕, 0.18 mmol, 1.35 당량)을 -10℃에서 질소 대기 하에 무수 톨루엔 (5 ㎖) 중이 모노-alloc 생성물 (0.106 g, 0.134 mmol, 1 당량) 및 트리포스겐 (0.015 g, 4.8 x 10-2　mmol, 0.36 당량)의 교반된 용액에 첨가하였다. 1 시간 후에, IR 분광분석은 2268 ㎝-1에서 이소시아네이트 스트레치(isocyanate stretch)를 나타냈으며, 반응 혼합물은 실온에 도달하도록 하였다.
화합물 6
무수 THF (5 ㎖) 중의 알콜 6a (0.106 g, 0.15 mmol, 1.1 당량) 및 트리에틸아민 (0.018 g, 25 ㎕, 0.18　mmol, 1.35 당량)의 용액을 신선하게 제조된 이소시아네이트에 적가하였다. 반응 혼합물을 4 시간 동안 환류 하에서 가열하였으며, 이 시점에 TLC는 새로운 생성물의 형성을 나타내었다. 반응 혼합물을 증발 건고시키고, DCM과 물 사이에 분배시켰다. 수층을 분리하고, 유기상을 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 감압 하에서 회전증발에 의해 황색 오일로서 조생성물을 수득하고, 이것을 섬광 크로마토그래피 [구배 용출: 에틸 아세테이트에서 5%씩 증가시켜 40% n-헥산/60% 에틸 아세테이트 내지 20% n-헥산/80% 에틸 아세테이트]에 의해서 정제하여 백색 포움으로서 목적하는 생성물을 수득하였다 (0.092 g, 45% 수율).
분석 데이터: RT 4.05 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1540 ([M + 2]+., 30); 1557 ([M　+ 18])+., 50); MS (ES-) m/z (상대 강도) 1585 ([M - +2Na])-., 50).
화합물 7
화합물 7은 화합물 6으로부터 2 단계로 제조될 수 있다.
비스 탈아세틸화 생성물
THF 중의 슈퍼하이드라이드 (superhydride™)의 용액 (1 M, 0.35 ㎖, 0.35 mmol, 4 당량)을 -78℃ (드라이아이스/아세톤)에서 시린지를 통해서 무수 THF (7 ㎖) 중의 아세테이트 6 (0.135 g, 8.8 x 10-2 mmol, 1 당량)의 교반된 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 1 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 LCMS는 출발물질의 부재, 및 모노 및 비스 탈아세틸화 생성물에 해당하는 2 가지 새로운 화합물의 형성을 나타내었다. 슈퍼하이드라이드TM의 추가의 분취액 (1 M, 0.35 ㎖, 0.35 mmol, 4 당량)을 반응 혼합물에 첨가하고, 추가로 1 시간 동안 교반을 계속하였다. 이 시점에 LCMS는 비스 탈아세틸화 생성물로의 완전한 전환을 나타내었다. 시트르산 (1 M, 1 ㎖)을 반응 혼합물에 첨가 (격렬한 발포)한 다음에 실온에 도달하도록 하였고, 이 시점에 시트르산의 추가의 분취액 (1 M, 1 ㎖)을 첨가하였다. 용매를 감압 하에서 회전증발에 의해서 제거하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 (25 ㎖)와 물 (25 ㎖) 사이에 분배시켰다. 수성상을 분리하고, 에틸 아세테이트 층을 물 (25 ㎖), 염수 (25 ㎖)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 감압 하에서 회전증발에 의해 용매를 제거하여 황색 오일로서 조생성물을 수득하고, 이것을 섬광 크로마토그래피 [구배 용출: 에틸 아세테이트 → 1% 메탄올/99% 에틸 아세테이트 내지 2% 메탄올/98% 에틸 아세테이트]에 적용하여 무색 유리질 물질로서 순수한 생성물을 수득하였다 (0.056　g, 44%). 분석 데이터: RT 3.78 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1456 ([M + 1]+., 75).
화합물 7
데스-마틴 퍼요오디난 (0.026 g, 6.1 x 10-5 mol, 2.1 당량)을 질소 대기 하에서 무수 DCM (5 ㎖) 중의 비스 탈아세틸화 생성물 (0.042 g, 2.9 x 10-5 mol, 1 당량)의 용액에 한꺼번에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 흐린 현탁액을 DCM (20 ㎖)으로 세척하면서 여과하였다. 여액을 포화 중탄산나트륨 수용액 (25 ㎖), 물 (25 ㎖), 염수 (25 ㎖)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 회전증발에 의해서 제거하여 회백색 포움으로서 생성물 7을 제공하였다 (0.035 g, 84%). 분석 데이터: RT 3.70 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1451 ([M + 1]+., 30).
화합물 14
화합물 14a 또는 14b는 화합물 7로부터 화합물 8을 경유하여 제조할 수 있다. 화합물 7 내의 Alloc 보호 그룹은 적절한 조건 하에서, 예를 들어, 피롤리딘의 존재 하에서 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 사용하여 제거할 수 있다. 이들 조건 하에서는 또한, Fmoc 보호 그룹이 제거된다. 대신으로, Fmoc 그룹은 Alloc 그룹의 제거 전 또는 후에 DMF 중의 피페리딘을 사용하여 별도의 단계로 제거될 수 있다. 탈보호 단계의 생성물은 하나의 PBD 모노머의 N10-C11 위치에 이민 작용기, 및 다른 모노머의 N10-C11 위치에 카비놀아민 작용기를 갖는 이민-카비놀아민 생성물이며, 여기에서 카비놀아민은 N10 위치에 링커 -C(=O)-L1-NH2를 갖는다.
이민-카비놀아민을 염기의 존재 하에서 MC-OSu와 반응시켜 화합물 8을 생성시킬 수 있다 [참조: 예를 들어, Dubowchik et al., Bioconjugate Chem . 2002, 13, 855-869].
그 후, 아미노산 측쇄 보호 그룹을 예를 들어, 산성 조건 하에서, 화합물 8로부터 제거할 수 있다. 그 후, 생성된 생성물을 티올 작용기를 갖는 적절한 항체에 컨주게이트시켜 화합물 9를 제공할 수 있다.
한가지 예로서, 항체를 DTT로 처리하여 쇄간 디설파이드 결합을 환원시킬 수 있다. 그 후, 유리 티올 그룹을 갖는 생성된 항체를 화합물 8로부터 유도된 말레이미드-함유 화합물과 반응시켜 화합물 9를 생성시킬 수 있다. 화합물 9는 예를 들어, 투석여과 (diafiltration)에 의해서 정제할 수 있다 [참조: 예를 들어, Dubowchik et al., Bioconjugate Chem . 2002, 13, 855-869].
화합물 18
디사이클로헥실카보디이미드 (2.46 g, 11.92 mmol, 1.05 당량)를 0℃에서 무수 DCM (120 ㎖) 중의 N-하이드록시석신이미드 (1.44 g, 12.5 mmol, 1.1 당량) 및 N-alloc 페닐알라닌 (17) (2.83 g, 11.35 mmol, 1 당량)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 30 분 동안 교반한 다음 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 DCM (50 ㎖)에 재용해시키고, 1 시간 동안 정치시키고, 여과하여 침전된 디사이클로헥실우레아를 제거하였다. 감압 하에서 증발시켜 백색 고체로서 생성물을 제공하였다 (3.91 g, 99%). 분석 데이터: RT 2.93 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 369 ([M + Na]+., 50).
화합물 20
THF (50 ㎖) 중의 석신이미드 (18) (3.91 g, 11.29 mmol, 1 당량)의 용액을 THF (50 ㎖) 및 H2O (100 ㎖) 중의 H-Lys(Boc)-OH (19) (2.92 g, 11.85 mmol, 1.05 당량) 및 NaHCO3 (1.04 g, 12.42　mmol, 1.1 당량)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 72 시간 동안 교반하고, THF를 감압 하에서 증발시켰다. pH를 시트르산에 의해서 pH 3-4로 조정하여 백색 고무질 물질을 침전시켰다. 이것을 에틸 아세테이트 (2 x 250 ㎖)로 추출하고, 추출물을 합하여 H2O (200　㎖), 염수 (200 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 백색 포움으로서 생성물을 제공하였다 (4.89 g, 91%). 분석 데이터: RT 3.03 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 478 ([M + 1])+., 80).
화합물 7b
EEDQ (2.66 g, 10.75 mmol, 1.05 당량)를 무수 THF (75 ㎖) 중의 p-아미노벤질 알콜 (21) (1.32 g, 10.75 mmol, 1.05 당량) 및 Alloc-Phe-Lys(Boc)-OH (4.89 g, 10.24 mmol, 1.0　당량)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 연갈색 고체를 제공하였다. 이 고체를 디에틸 에테르와 함께 연마하고, 과량의 디에틸 에테르로 세척하면서 여과하였다. 이렇게 하여 백색 고체로서 생성물을 수득하였다 (4.54 g, 76%). 분석 데이터: RT 3.08 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 583.8 ([M + 1]+., 100).
7b의 합성은 이하의 반응식 12에 기술된다.
[반응식 12]
Figure 112012086532911-pct00138
화합물 9b
트리에틸아민 (0.18 g, 0.25 ㎖, 1.79 mmol, 2.3 당량)을 질소 대기 하에 -10℃에서 무수 THF (5 ㎖) 중의 모노-alloc 보호된 bis-아닐린 (6) (0.608 g, 0.77 mmol, 1.06 당량) 및 트리포스겐 (0.088 g, 0.3 mmol, 0.39 당량)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에 도달하도록 하고, 샘플을 메탄올로 처리하고, LCMS에 의해서 메틸 카바메이트로 분석하였다.
무수 THF (20 ㎖) 중의 벤질-알콜 (7b) (0.422 g, 0.72 mmol, 1.0 당량) 및 트리에틸아민 (0.18 g, 0.25 ㎖, 1.79 mmol, 2.3 당량)의 용액을 신선하게 제조된 이소시아네이트에 적가하였다. 반응 혼합물을 4 시간 동안 60-65℃에서 가열한 다음에, 실온에서 18 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 LCMS는 새로운 생성물의 형성을 나타내었다. 반응 혼합물을 증발 건고시켜 황색 오일로서 조생성물을 수득하고, 이것을 섬광 크로마토그래피 [구배 용출: 10%씩 증가시키면서 50% n-헥산/50% 에틸 아세테이트 내지 10% n-헥산/90% 에틸 아세테이트]에 의해서 정제하여 백색 포움으로서 목적하는 생성물을 제공하였다 (0.385 g, 38%). 분석 데이터: RT 3.78 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1402.8 ([M + H]+., 15).
화합물 10b
H2O (1 ㎖) 중의 K2CO3 (0.158 g, 1.15 mmol, 5 당량)의 용액을 메탄올 (6 ㎖) 중의 아세테이트 (9b) (0.32 g, 0.23 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 메탄올을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 H2O (50 ㎖)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3 x 75 ㎖)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 합하여 H2O (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 백색 포움으로서 생성물을 제공하였다 (0.292 g, 97%). 분석 데이터: RT 3.52 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1318.6 ([M + 1]+., 15).
화합물 11b
데스-마틴 퍼요오디난 (0.197 g, 0.465 mmol, 2.1 당량)을 질소 대기 하에서 무수 DCM (15 ㎖) 중의 비스 탈아세틸화 생성물 (10b) (0.292 g, 0.22 mmol, 1 당량)의 용액에 한꺼번에 첨가하였다. 용액을 실온에서 3.5 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 DCM (50 ㎖)으로 희석하고, 포화 중탄산나트륨 수용액 (3 x 100 ㎖), 물 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 조생성물을 제공하였다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 5%씩 증가시키면서 80% 에틸 아세테이트/20% n-헥산 내지 100% 에틸 아세테이트]에 의해서 정제하여 황색 포움으로서 생성물 11b를 제공하였다 (0.235 g, 81%). 분석 데이터: RT 3.42 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1314.8 ([M + 1]+., 8).
화합물 12a
Pd(PPh3)4 (4 ㎎, 3.5 x 10-6 moL, 0.02 당량)를 질소 대기 하에서 무수 DCM (10 ㎖) 중의 비스-alloc 화합물 (11b) (0.230 g, 0.175 mmol, 1 당량) 및 피롤리딘 (31 ㎎, 36 ㎕, 0.44　mmol, 2.5 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 3 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 LCMS는 미반응 물질 (11b)이 남아있음을 나타내었다. 추가의 당량의 피롤리딘 (31 ㎎, 36 ㎕, 0.44 mmol, 2.5 당량) 및 Pd(PPh3)4 (4　㎎, 3.5 x 10-6 mol, 0.02 당량)을 첨가하고, 반응액을 실온에서 추가로 18 시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 DCM (40 ㎖)으로 희석하고, 포화 염화암모늄 수용액 (100 ㎖), 물 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 황색 포움을 제공하였다. 이것을 디에틸 에테르와 함께 연마하여 생성물 (0.187 g, 95%)을 제공하고, 이것은 더 정제하지 않고 사용하였다. 분석 데이터: RT 2.80 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1128.5 ([M + 1]+., 20).
화합물 23
THF (50 ㎖) 중의 Alloc-Val-OSu (22) ((RT 2.67 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 321.4 ([M　+　Na]+., 57), 화합물 (16)의 제조방법에 따라 제조됨) (11.67 g, 39.0 mmol, 1 당량)를 THF (100　㎖) 및 H2O (100 ㎖) 중의 H-Ala-OH (3.66　g, 41.08 mmol, 1.05 당량) 및 NaHCO3 (3.61 g, 43.03 mmol, 1.1 당량)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 72 시간 동안 교반하고, THF를 감압 하에서 증발시켰다. pH를 시트르산에 의해서 pH　3-4로 조정하여 백색 고무질 물질을 침전시켰다. 이것을 에틸 아세테이트 (6 x 150 ㎖)로 추출하고, 추출물을 합하여 H2O (200 ㎖), 염수 (200 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 백색 고체를 제공하였다. 디에틸 에테르 (과량)와 함께 연마하여 백색 분말로서 순수한 생성물 23을 수득하였다 (7.93 g, 74%).
분석 데이터: RT 2.17 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 295 ([M + Na]+., 63), 273 ([M　+ 1]+., 60).
화합물 8
EEDQ (4.79 g, 19.3 mmol, 1.05 당량)를 무수 THF (100 ㎖) 중의 p-아미노벤질 알콜 (21) (2.38 g, 19.3 mmol, 1.05 당량) 및 Alloc-Val-Ala-OH (5.02 g, 18.4 mmol, 1.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 72 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켜 연갈색 고체를 제공하였다. 이 고체를 디에틸 에테르와 함께 연마하고, 과량의 디에틸 에테르 세척하면서 여과하였다. 이렇게 하여 백색 고체로서 생성물을 수득하였다 (6.2 g, 89%). 분석 데이터: RT 2.50 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 400.6 ([M + Na]+., 50), 378.6 ([M + 1]+., 60).
8의 합성은 이하의 반응식 13에 나타낸다.
[반응식 13]
Figure 112012086532911-pct00139
화합물 9c
트리에틸아민 (0.16 g, 0.22 ㎖ 1.59 mmol, 2.2 당량)을 질소 대기 하에 실온에서 무수 THF (20 ㎖) 중의 모노-alloc 보호된 비스-아닐린 (6) (0.572 g, 0.72 mmol, 1 당량) 및 트리포스겐 (0.077　g, 0.26 mmol, 0.36 당량)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 가열하고, 샘플을 메탄올로 처리하고, LCMS에 의해 메틸 카바메이트로서 분석하였다.
무수 THF (20 ㎖) 중의 벤질-알콜 (8) (0.4 g, 1.06 mmol, 1.5 당량) 및 트리에틸아민 (0.109　g, 0.15 ㎖, 1.08 mmol, 1.5 당량)의 용액을 신선하게 제조된 이소시아네이트에 적가하였다. 반응 혼합물을 30 분 간격으로 LCMS에 의해서 모니터링하였다. 3 시간 후에 LCMS는 생성물로의 전환, 메틸 카바메이트 및 모노-alloc 보호된 bis-아닐린 (6)의 존재를 나타내었다. 추가의 부분의 트리포스겐 (0.038 g, 0.128 mmol, 0.18 당량)을 첨가하고, 반응을 40℃에서 추가로 18 시간 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 증발 건고시켜 황색 오일로서 조생성물을 수득하고, 이것을 섬광 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름 내지 97% 클로로포름/0.5%씩 증가시키면서 3% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 포움으로서 목적하는 생성물을 제공하였다 (0.59 g, 69%). 분석 데이터: RT 3.58 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1197 ([M + 1]+., 60).
화합물 10c
H2O (1.4 ㎖) 중의 K2CO3 (0.195 g, 1.41 mmol, 5 당량)의 용액을 메탄올 (8.5 ㎖) 중의 아세테이트 (9c) (0.338 g, 0.282 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 메탄올을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 H2O (50 ㎖)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3 x 75　㎖)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 합하여 H2O (100 ㎖), 염수 (100　㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 백색 포움으로서 생성물을 제공하였다 (0.298 g, 95%). 분석 데이터: RT 3.28 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1113 ([M + 1]+., 40).
화합물 11c
데스-마틴 퍼요오디난 (0.312 g, 0.74 mmol, 2.1 당량)을 질소 대기 하에서 무수 DCM (20　㎖) 중의 비스 탈아세틸화 생성물 (10c) (0.39 g, 0.35 mmol, 1 당량)의 용액에 한꺼번에 첨가하였다. 용액을 실온에서 3.5 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 DCM (50 ㎖)으로 희석하고, 포화 중탄산나트륨 수용액 (3 x 100 ㎖), 물 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 용매를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 조생성물을 제공하였다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름 내지 97% 클로로포름/1%씩 증가시키면서 3% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 고체로서 생성물을 제공하였다 (0.201 g, 52%). 분석 데이터: RT 3.15 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1109 ([M + 1]+., 30), MS (ES-) m/z (상대 강도) 1107 ([M - 1]-., 100).
화합물 12c
Pd(PPh3)4 (8 ㎎, 7 x 10-6 moL, 0.04 당량)를 질소 대기 하에서 무수 DCM (5 ㎖) 중의 비스-alloc 화합물 (11c) (0.190 g, 0.17 mmol, 1.0 당량) 및 피롤리딘 (61 ㎎, 71 ㎕, 0.86　mmol, 5.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 3 시간 동안 교반하여 흐린 현탁액을 제공하였다. 용매를 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 함께 연마하여 회백색 고체를 제공하고, 이것을 여과에 의해 수거하여 생성물을 제공하고 (0.13 g, 82%). 이것은 더 정제하지 않고 사용하였다. 분석 데이터: RT 2.55 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 922 ([M + 1]+., 52).
화합물 13a
EEDQ (18.4 ㎎, 7.45 x 10-5 mol, 2.2 당량)를 DCM (2 ㎖) 및 메탄올 (1 ㎖) 중의 아민 디펩타이드 (12a) (40 ㎎, 3.5 x 10-5 mol, 1.0 당량) 및 말레이미드 카프로산 (8.2 ㎎, 3.9 x 10-5 mol, 1.1당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 40℃에서 72 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 DCM (50 ㎖)에 용해시키고, 포화 NaHCO3 수용액 (2 x 50 ㎖), H2O (50 ㎖), 염수 (50 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 백색 포움을 제공하였다. 이것을 디에틸 에테르와 함께 연마하고, 과량의 디에틸 에테르로 세척하면서 여과하여 백색 고체로서 생성물을 수득하였다 (36 ㎎, 78%). 분석 데이터: RT 3.27 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1320 ([M + 1]+., 75).
화합물 13b
냉 트리플루오로아세트산 (13 ㎖)을 0℃에서 말레이미드 유도체 (13a) (65 ㎎, 4.9　x　10-5 mol)에 첨가하였다. 용액을 이 온도에서 30 분 동안 교반하고, 트리플루오로아세트산을 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 무수 DCM (5 ㎖)에 재용해시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 디에틸 에테르와 함께 연마하고, 생성된 황색 고체를 여과에 의해 수거하고, 진공 하에서 건조시켰다 (64 ㎎, 97%). 분석 데이터: RT 2.83 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1222 ([M + 2]+., 5).
말레이미드-PEG-석신이미드 시약과 12a 또는 12b의 커플링은 PBD 약물-링커 15를 제공한다. 도 1a는 PBD 약물-링커 MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 15 ba, MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 15 bb 및 MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 15d의 구조를 나타내며, 여기에서 PEG는 에틸렌옥시이고, PAB는 파라-아미노벤질옥시카보닐이다.
화합물 15 aa
아민 디펩타이드 (12a) (83 ㎎, 7.4 x 10-5 mol, 1 당량)를 무수 10% DMF/DCM의 혼합물 (2 ㎖)에 용해시키고, 말레이미드-4Peg-석신이미드 (무수 DCM 중의 250 mmol 용액 353 ㎕)을 첨가하고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (8.2 ㎎, 11 ㎕, 8.1　x　10-5　mol, 1.1 당량)을 첨가하였다. 이 용액을 질소 대기 하에 실온에서 72 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름 내지 92% 클로로포름/1%씩 증가시키면서 8% 메탄올]에 의해서 정제하여 황색 포움으로서 생성물을 수득하였다 (85　㎎, 76%). 분석 데이터: RT 3.13 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1526 ([M + 1]+., 5).
화합물 15 ab
아민 디펩타이드 (12a) (70 ㎎, 76.2 x 10-5 mol, 1 당량)를 무수 10% DMF/DCM의 혼합물 (2 ㎖)에 용해시키고, 말레이미드-8Peg-석신이미드 (무수 DCM 중의 250 mmol 용액 263 ㎕)를 첨가하고, 이어서 N,N-디이소프로필에틸아민 (6.9 ㎎, 9.5 ㎕, 6.6 x 10-5 mol, 1.06 당량)를 첨가하였다. 이 용액을 질소 대기 하에 실온에서 72 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름 내지 92% 클로로포름/1%씩 증가시키면서 8% 메탄올]에 의해서 정제하여 갈색 포움으로서 생성물을 수득하였다 (44　㎎, 41.5%). 분석 데이터: RT 3.20 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1703 ([M + 2]+., 5).
화합물 15 ba ( MP - PEG4 - Phe - Lys - PAB - PBD ; (11S,11 aS )-4-((2S,5S)-2-(4- 아 미노부틸)-5-벤질-25-(2,5- 디옥소 -2,5- 디하이드로 -1H-피롤-1-일)-4,7,23- 트리 옥소-10,13,16,19- 테트라옥사 -3,6,22- 트리아자펜타코산아미도 )벤질 11- 하이드 록시-7- 메톡시 -8-(5-((S)-7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a- 테트라하이드로 -피 롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 )
냉 트리플루오로아세트산 (17 ㎖)을 0℃에서 말레이미드 유도체 (15 aa) (85 ㎎, 5.6　x　10-5　mol)에 첨가하였다. 이 용액을 이 온도에서 30 분 동안 교반하고, 트리플루오로아세트산을 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 무수 DCM (5 ㎖)에 재용해시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 디에틸 에테르와 함께 연마하고, 생성된 황색 고체를 여과에 의해서 수거하고, 진공 하에서 건조시켰다 (70 ㎎, 81%). 분석 데이터: RT 2.78 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1444 ([M + 2]+., 1).
화합물 15 bb ( MP - PEG8 - Phe - Lys - PAB - PBD ; (11S,11 aS )-4-((2S,5S)-2-(5- 아 미노부틸)-5-벤질-37-(2,5- 디옥소 -2,5- 디하이드로 -1H-피롤-1-일)-4,7,35- 트리 옥소-10,13,16,19,22,25,28,31- 옥타옥사 -3,6,34- 트리아자헵타트리아콘탄아미 도)벤질 11- 하이드록시 -7- 메톡시 -8-(5-((S)-7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a-테 트 라하이드로- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥 시)-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a- 테트라하이드로 - 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 )
냉 트리플루오로아세트산 (9 ㎖)을 0℃에서 말레이미드 유도체 (15 ab) (44 ㎎, 2.6　x　10-5　mol)에 첨가하였다. 이 용액을 이 온도에서 30 분 동안 교반하고, 트리플루오로아세트산을 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 무수 DCM (5 ㎖)에 재용해시켰다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 디에틸 에테르와 함께 연마하고, 생성된 황색 고체를 여과에 의해서 수거하고, 진공 하에서 건조시켰다 (40 ㎎, 91%).
분석 데이터: RT 2.80 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1603 ([M + 2]+., 1).
화합물 15d ( MP - PEG8 - Val - Ala - PAB - PBD ; (11S,11 aS )-4-((2S,5S)-37-(2,5-디옥소-2,5- 디하이드로 -1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2- 메틸 -4,7,35- 트리옥소 -10,13,16,19,22,25,28,31-옥타옥사-3,6,34- 트리아자헵타트리아콘탄아미도 )벤질 11-하 이드록 시-7- 메톡시 -8-(5-((S)-7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a- 테트 라하이드로- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a- 테트라하이드로 - 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 )
EEDQ (12 ㎎, 4.8 x 10-5 mol, 1.1 당량)를 무수 DCM (5 ㎖) 중의 아민 디펩타이드 (12c) (40.3 ㎎, 4.4 x 10-5 mol, 1.0 당량) 및 말레이미드-8Peg-산 (28 ㎎, 4.8 x 10-5 mol, 1.1 당량)의 현탁액에 첨가하였다. 무수 디메틸아세트아미드 (0.05 ㎖)를 첨가하여 연황색 용액을 제공하고, 이것을 실온에서 18 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 디에틸 에테르와 함께 연마하였다. 생성된 고체 생성물을 섬광 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 분석 데이터: RT 2.90 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1496 ([M + H]+., 40).
화합물 15e
N,N-디이소프로필디에틸아민 (10.8 ㎕, 8 ㎎, 7.6 x 10-5 mol, 2.2 당량)을 무수 DCM (5 ㎖) 중의 아민 디펩타이드 (12c) (32 ㎎, 3.5 x 10-5 mol, 1.0 당량) 및 말레이미드-dPeg®24-NHS 에스테르 (58 ㎎, 4.16 x 10-5 mol, 1.2 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 96 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (15 ㎖)으로 희석하고, 포화 NaHCO3 (25 ㎖), 염수 (25 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 연황색 유리질 물질을 수득하였다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름 내지 91% 클로로포름/1%씩 증가시키면서 9% 메탄올]에 의해서 정제하여 점성 황색 고무질 물질로서 생성물을 제공하였다 (17 ㎎, 22%).
화합물 16d
다수의 암에 의해서 상당히 상향-조절되는 인테그린 αvβ6에 대해서 매우 선택적인 펩타이드 비오틴-A20FMDV-Cys (59)를 PBD-링커 유도체의 컨주게이션을 위해서 선택하였다.
1/1 아세토니트릴/물 (2 ㎖) 중의 펩타이드 (59) (11.3 ㎎, 4.35 μmol, 0.98 당량)의 용액을 1/1 아세토니트릴/물 (3 ㎖) 중의 (15d) (6.91 ㎎, 4.62 μmol, 1.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 96 시간 동안 교반하였다. 아세토니트릴을 감압 하에서 증발시키고, 물을 동결건조에 의해서 제거하여 백색 포움을 제공하였다. 반-정제용 HPLC에 의해서 정제하고, 이어서 동결건조시켜 백색 포움으로서 생성물을 제공하였다 (3.8 ㎎, 21%). 분석 데이터: MS (MaldiTOF) m/z (상대 강도) 3991.1 ([M + H]+., 100).
화합물 24a
화합물 24a는 WO 2004/043963의 화합물 3으로 기술된다.
화합물 24b
고체 TCCA (18 g, 77.4 mmol, 1.1 당량)를 0℃에서 DCM (500 ㎖) 중의 TEMPO (730 ㎎, 4.67 mmol, 0.07 당량) 및 알콜 24a (25g, 70.5 mmol, 1당량)의 용액에 조금씩 첨가하였다. 약한 발열반응이 관찰되었다. 30 분 후의 TLC (에틸 아세테이트) 및 LC/MS (2.38 분 (ES+) m/z (상대 강도) 353.34 ([M + H]+., 100))에 의해서 반응이 완료된 것으로 생각되었다. 이 현탁액을 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM으로 세척하였다. 여액을 수성 중아황산나트륨으로 세척하고, 이어서 포화 NaHCO3 (주의, 격렬한 발포), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 여과하고, 진공 하에서 용매를 증발시켜 조생성물을 수득하고, 이것을 섬광 칼럼 크로마토그래피 (용출: 20:80 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해서 정제하여 백색 고체로서 케톤　24b를 수득하였다 (20 g, 80%). 분석 데이터: [α]26 D = 15° (c = 0.2, CHCl3); MS (ES+) m/z (상대 강도) 353.34 ([M + H]+., 100); IR (ATR, CHCl3) 1748, 1642, 1518, 1425, 1335, 1222, 1176, 1063, 1032, 986, 857, 785, 756 ㎝-1.
화합물 25
무수 2,6-루티딘 (0.395 ㎖, 365 ㎎, 3.40 mmol)을 질소 대기 하에 -45℃ (드라이아이스/아세토니트릴 냉각욕)에서 무수 DCM (10 ㎖) 중의 케톤 24b (200 ㎎, 0.57 mmol)의 격렬하게 교반된 용액에 한꺼번에 주입하였다. 새롭게 개봉된 앰플로부터 취한 무수 트리플산 무수물 (477 ㎕, 800 ㎎, 2.83 mmol)을 온도를 -40℃ 또는 그 이하에서 유지시키면서 빠르게 점적 주입하였다. 반응 혼합물을 -45℃에서 1 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 TLC (50/50　v/v n-헥산/EtOAc)는 출발물질의 완전한 소비를 나타내었다. 냉 반응 혼합물을 즉시 DCM (20 ㎖)으로 희석하고, 격렬하게 진탕하면서 물 (1 x 50 ㎖), 5% 시트르산 용액 (1 x 50 ㎖), 포화 NaHCO3 (50　㎖), 염수 (30 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 조생성물을 수득하고, 이것을 섬광 칼럼 크로마토그래피 (구배 용출: 60:40 v/v n-헥산/EtOAc 내지 50:50 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해서 정제하여 황색 포움으로서 트리플레이트 25를 수득하였다 (151 ㎎, 55%).
상응하는 1,2 불포화된 화합물은 어떤 것도 NMR에 의해서 나타나지 않았다. 분석 데이터: [α]28 D = -55° (c = 0.2, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.75 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 6.25 (t, 1H, J = 1.84 Hz), 5.19 (dd, 1H, J = 5.05, 11.93 Hz), 4.03 (s, 6H), 3.90 (s, 3H), 3.50 (ddd, 1H, J = 2.29, 11.96, 16.59 Hz), 3.02 (ddd, 1H, J = 1.60, 5.05, 16.58 Hz); IR (ATR, CHCl3) 1748, 1653, 1577, 1522, 1415, 1335, 1276, 1205, 1130, 1061, 1024, 933, 908, 820, 783, 757, 663 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 485.45 ([M + H]+., 100).
화합물 26
Pd(PPh3)4 (860 ㎎, 744 μmol, 0.04 당량)를 에놀 트리플레이트 25 (9.029 g, 18.6 mmol, 1 당량), 4-메톡시페닐보론산 (3.67 g, 24.1 mmol, 1.3　당량), Na2CO3 (5.13 g, 48.3 mmol, 2.6 당량), EtOH (45 ㎖), 톨루엔 (90 ㎖) 및 물 (45 ㎖)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 대기 하에서 밤새 교반한 후에 출발물질의 완전한 소비가 TLC (60/40 EtOAc/헥산) 및 LC/MS (3.10 분 (ES+) m/z (상대 강도) 443.38 ([M　+　H]+., 100)에 의해서 관찰되었다. 반응 혼합물을 EtOAc (400 ㎖)로 희석하고, H2O (2　x　300 ㎖), 염수 (200　㎖)로 세촉하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 감압 하에서 증발시켜 조생성물을 제공하였다. 섬광 크로마토그래피 (구배 용출: 60:40 v/v 헥산/EtOAc 내지 40:60 v/v 헥산/EtOAc)에 의해서 정제하여 오렌지색 고체로서C2-아릴 화합물 26을 수득하였다 (7.0 g, 85%). 분석 데이터: [α]25 D = -122° (c = 0.2, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.78 (s, 1H), 7.30 (d, 2H, J = 8.81 Hz), 6.95 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.83 (d, 2H, J = 8.88 Hz), 5.03 (dd, 1H, J = 11.71, 5.28 Hz), 3.95 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.48-3.43 (m, 1H), 2.99-2.93 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.7, 162.5, 158.4, 153.9, 149.1, 137.9, 126.3, 125.6, 125.3, 122.9, 122.3, 113.8, 110.03, 107.6, 59.7, 57.9, 56.5, 56.2, 55.1, 54.9, 52.2, 33.9, 20.7, 14.0; IR (ATR, CHCl3) 1736, 1624, 1575, 1516, 1424, 1326, 1253, 1178, 1069, 1031, 863, 820, 803, 786, 757, 653, 617 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 443.38 ([M + H]+., 100.
화합물 27
LiBH4 (464 ㎎, 21.3 mmol, 1.5 당량)를 무수 THF (100 ㎖) 및 EtOH (120 ㎖) 중의 에스테르 26 (6.28 g, 14.2 mmol, 1 당량)의 교반된 용액에 조금씩 첨가하였다. 격렬한 포움 발생을 동반한 발열반응이 관찰되었으며, 온도는 냉각욕 (얼음/물)의 도움을 받아 15℃와 25℃ 사이에서 유지시켰다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반한 후에, 출발물질의 완전한 전환이 TLC (에틸 아세테이트)에 의해서 관찰되었다. 반응 혼합물을 주의해서 에틸 아세테이트 (500 ㎖)로 희석하고, 과량의 보로하이드라이드를 냉 수성 시트르산으로 파괴시켰다. 유기층을 1 N 수성 HCl (100 ㎖)에 이어서 포화 수성 NaHCO3 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 35℃에서 감압 하에 증발시켜 중간체 알콜 (4.50 g, 10.8 mmol, 76% 중간체 수율)을 제공하고, 이것을 즉시 무수 DCM (200 ㎖)에 재용해시켰다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고, TEA (2.26 ㎖, 0.162　mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 이어서 무수 DCM (30 ㎖) 중의 아세틸 클로라이드 (1 ㎖, 14.0　mmol, 1.3　당량)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 1 시간 동안 반응시켰다. 반응의 완료가 TLC (EtOAc)에 의해서 관찰되었다. 용액을 2 N 수성 시트르산 (50 ㎖), 포화 수성 NaHCO3 (50 ㎖), 염수 (50　㎖)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피 (50/50부터 60/40까지의 EtOAc/헥산 구배)에 의해서 정제하여 오렌지색 고체로서 2.65 g (2 단계에 걸쳐서 41%)의 순수한 생성물을 수득하였다. 분석 데이터: [α]24 D = -130° (c = 0.28, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.74 (s, 1H), 7.12 (d, 2H, J = 8.84 Hz), 6.91 (br s, 1H), 6.80 (d, 2H, J = 8.88 Hz), 6.15 (s, 1H), 5.04-5.00 (m, 1H), 4.61-4.42 (m, 2H), 4.01 (s, 6H), 3.78 (s, 3H), 3.35-3.25 (m, 1H), 2.85-2.79 (m, 1H), 2.06 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.1, 159.1, 149.5, 126.1, 126.0, 114.1, 107.2, 56.8, 56.6, 55.3, 33.5, 20.9; IR (ATR, CHCl3) 1731, 1643, 1623, 1577, 1517, 1421, 1333, 1278, 1248, 1222, 1183, 1076, 1059, 1032, 864, 821, 802, 787, 756, 644, 619 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 456.81 ([M + H]+., 100).
화합물 28
아연 분말 (365 ㎎, 5.58 mmol, 15 당량)을 에탄올 (7.6 ㎖) 및 아세트산 (1.97 ㎖) 중의 화합물 27 (170　㎎, 0.372 mmol, 1당량)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 격렬하게 교반하고, 환류하도록 가열하였다. TLC 모니터링 (에틸 아세테이트) 및 LC/MS (2.97 분 (ES+) m/z (상대 강도) 427.57 ([M + H]+., 100))는 5 분 후에 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응액을 냉각시키고, 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM (50　㎖)으로 세척하였다. 여액을 물 (3 x 30 ㎖), 포화 NaHCO3 (2 x 30 ㎖), 염수 (30 ㎖)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피 (60/40으로부터 80/20까지의 EtOAc/헥산 구배)에 의해서 정제하여 백색 포움으로서 140 ㎎ (88%)의 순수한 생성물을 수득하였다. 분석 데이터: [α]24 D = -108° (c = 0.20, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.22 (d, 2H, J = 8.80 Hz), 6.89 (br s, 1H), 6.86 (d, 2H, J = 8.82 Hz), 6.80 (s, 1H), 6.29 (s, 1H), 5.02-4.96 (m, 1H), 4.50-4.40 (m, 4H), 3.89 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.81 (s, 1H), 3.30-3.25 (m, 1H), 2.85-2.79 (m, 1H), 2.06 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 194.6, 171.1, 171.0, 170.4, 164.0, 160.8, 155.1, 149.5, 146.2, 143.6, 130.5, 129.2, 125.8, 115.5, 114.1, 107.6, 105.4, 100.9, 63.5, 60.4, 56.9, 56.3, 37.4, 21.0, 20.6, 14.2; IR (ATR, CHCl3) 1733, 1589, 1512, 1396, 1209, 1176, 1113, 1031, 823, 791, 762 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 427.57 ([M + H]+., 100).
화합물 29
무수 THF 중의 아민 28 (400 ㎎, 0.93 mmol, 1 당량) 및 TEA (350 ㎕, 2.5 mmol, 2.6 당량)의 용액을 0℃에서 무수 THF (4 ㎖) 중의 트리포스겐 (125 ㎎, 0.42　mmol, 0.45 당량)의 신선하게 제조된 용액에 적가하였다. 백색 현탁액을 0℃에서 10 분 동안 교반하였다. 무수 THF (40 ㎖) 중의 알콜 7b (Alloc-Phe-Lys(Boc)-PABOH, 546 ㎎, 0.93　mmol, 1 당량) 및 TEA (350 ㎕, 2.5 mmol, 2.6 당량)의 용액을 빠르게 첨가하였다. 백색 현탁액을 실온에서 15 분 동안 교반한 다음에, 65℃에서 2 시간 동안 가열한 다음 실온에서 밤새 교반하였다. 백색 TEA 염을 면모 (cotton wool)를 통해서 여과하여 제거하였다. 여액을 농축시키고, 섬광 크로마토그래피 (구배: 클로로포름 중의 1% MeOH로부터 클로로포름 중의 3% MeOH까지)에 의해서 정제하여 700 ㎎의 목적하는 카바메이트를 수득하였다 (72%). 분석 데이터: [α]24 D = -30.2° (c = 0.18, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.54 (s, 1H), 8.43 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.45 (d, 2H, J = 8.43 Hz), 7.23 (d, 2H, J = 8.52 Hz), 7.16-7.06 (m, 7H), 6.78-6.72 (m, 4H), 6.46 (d, 1H, J = 7.84 Hz), 5.82-5.73 (m, 1H), 5.30 (s, 1H), 5.19-5.06 (m, 2H), 5.03 (d, 1H, J = 1.29 Hz), 4.93-4.87 (m, 1H), 4.63 (m, 1H), 4.47-4.28 (m, 6H), 3.87 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.72 (s, 1H), 3.16-3.09 (m, 1H), 3.07-2.95 (m, 4H), 2.72-2.67 (m, 1H), 1.95-1.83 (m, 1H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.43-1.39 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 1.28-1.19 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.5, 171.1, 169.2, 165.8, 159.1, 156.2, 153.8, 151.6, 144.1, 137.8, 135.8, 132.2, 131.9, 129.1, 129.0, 128.9, 127.3, 126.2, 125.9, 123.5, 123.4, 119.9, 118.2, 114.2, 111.3, 66.5, 66.2, 64.0, 56.5, 56.1, 55.3, 53.8, 33.1, 30.9, 29.4, 28.4, 22.6, 20.8; IR (ATR, CHCl3) 1697, 1652, 1604, 1516, 1456, 1418, 1245, 1225, 1177, 1115, 1033, 824, 750 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1036.25 ([M + H]+., 100).
화합물 30
탄산칼륨 (600 ㎎, 4.34 mmol, 5 당량)의 수용액 (3.3 ㎖)을 메탄올 (20 ㎖) 중의 아세테이트 에스테르 29 (920 ㎎, 0.89 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 50 분 동안 교반하였으며, 이 시점에서 TLC (클로로포름/메탄올, 90/10)는 완료를 나타내었다. 혼합물을 물 (150 ㎖)과 디클로로메탄 (200 ㎖) 사이에 분배시켰다. 유기상을 1 N 시트르산 (50 ㎖)으로 세척하고, 이어서 염수 (50 ㎖)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켜 목적하는 알콜 30 (700 ㎎, 79%)을 수득하였다. 분석 데이터: [α]24 D = -61° (c = 0.18, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.60 (s, 1H), 8.51 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.42 (d, 2H, J = 8.38 Hz), 7.24-7.18 (m, 2H), 7.1-7.05 (m, 7H), 6.83-6.66 (m, 5H), 5.81-5.71 (m, 1H), 5.43 (s, 1H), 5.18-5.08 (m, 2H), 4.99 (s, 2H), 4.75-4.69 (m, 2H), 4.48-4.25 (m, 5H), 3.86 (s, 3H), 3.82-3.76 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.19-3.12 (m, 1H), 3.05-2.92 (m, 4H), 2.62-2.57 (m, 1H), 1.85-1.75 (m, 2H), 1.59-1.51 (m, 1H), 1.38-1.34 (m, 11H), 1.28-1.18 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ　171.7, 169.5, 167.0, 159.2, 156.3, 153.9, 151.6, 144.4, 137.8, 135.9, 132.3, 131.9, 129.2, 128.8, 127.2, 126.0, 124.5, 123.3, 120.1, 118.1, 114.2, 111.3, 66.6, 66.1, 61.6, 56.5, 56.1, 55.3, 53.8, 39.9, 33.6, 31.1, 29.4, 28.4, 22.6; MS (ES+) m/z (상대 강도) 994.7 ([M + H]+., 100).
화합물 31
알콜 30 (500 ㎎, 0.503 mmol, 1 당량)을 실온에서 무수 DCM (50 ㎖)에 용해시켰다. 고체 데스-마틴 퍼요오디난 (300 ㎎, 0.707 mmol, 1.4 당량)을 혼합물에 첨가하고, 이어서 1 시간째에 추가로 75 ㎎, 이어서 2 시간째에 추가로 57 ㎎ 및 5 시간째에 31 ㎎을 첨가하여 총질량 463 ㎎ (1.09　mmol, 2.17 당량)까지의 데스-마틴 퍼요오디난을 취하였다. 반응을 TLC (클로로포름/메탄올, 95/5, 2 회의 용출)에 의해서 연속적으로 모니터링하였다. 6.5 시간 후에, 반응액을 DCM과 포화 수성 NaHSO3 사이에 분배시킴으로써 후처리하였다. 그 후, 유기층을 포화 수성 NaHCO3에 이어서 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피 (0/100부터 2/98까지의 메탄올/클로로포름 구배)에 의해서 정제하여 259 ㎎ (52%)의 순수한 생성물 31을 수득하였다. 분석 데이터: [α]24 D = +106° (c = 0.16, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.68 (s, 1H), 7.54-7.46 (m, 2H), 7.36 (s, 1H), 7.31-7.16 (m, 8H), 6.89 (d, 2H, J = 8.70 Hz), 6.75　(bs, 1H), 6.61 (s, 1H), 5.89-5.84 (m, 2H), 5.45 (d, 1H, J = 4.80 Hz), 5.28-5.08 (m, 3H), 4.84-4.76 (m, 2H), 4.58-4.47 (m, 4H), 4.28 (bs, 1H), 4.02-3.95 (m, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.74 (s, 2H), 3.41-3.32 (m, 1H), 3.16-3.02 (m, 5H), 2.03-1.83 (m, 1H), 1.68-1.61 (m, 1H), 1.55-1.39 (m, 11H), 1.36-1.28 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ　171.7, 169.5, 163.2, 159.1, 156.3, 151.1, 148.6, 138.0, 135.9, 132.3, 129.2, 128.8, 127.2, 126.3, 126.2, 121.7, 120.0, 118.2, 114.2, 112.7, 110.7, 86.2, 79.3, 67.6, 66.2, 59.5, 56.4, 56.15, 56.1, 55.3, 53.8, 39.9, 38.1, 35.1, 31.0, 29.4, 28.4, 22.7; IR (ATR, CHCl3) 3313, 2935, 2356, 1691, 1603, 1512, 1431, 1253, 1177, 1119, 1033, 824, 750, 698 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 992.41 ([M + H]+., 100).
화합물 32
고체 Pd(PPh3)4 (8 ㎎, 6.9 μmol, 0.02 당량)를 불활성 대기 하에 실온에서 무수 DCM (10 ㎖) 중의 출발물질 31 (346 ㎎, 0.349 mmol, 1 당량) 및 피롤리딘 (43.3 ㎕, 0.523　mmol, 1.5　당량)의 신선하게 제조된 용액에 첨가하였다. 반응은 TLC (90/10 v/v 클로로포름/메탄올) 및 LC/MS (2.93　분 (ES+) m/z (상대 강도) 908.09 ([M + H]+., 100))에 의해서 나타나는 바와 같이 45 분 후에 완료되었다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피 (2/98로부터 5/95까지의 메탄올/클로로포름 구배)에 의해서 정제하여 298 ㎎ (94%)의 순수한 생성물 32를 수득하였다. 분석 데이터: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.87 (s, 1H), 7.86 (d, 1H, J = 8.06 Hz), 7.51 (d, 2H, J = 8.42 Hz), 7.36-7.11 (m, 9H), 6.89 (d, 2H, J = 8.73 Hz), 6.58 (bs, 1H), 5.85 (d, 1H, J = 9.47 Hz), 5.32 (m, 1H), 4.83 (d, 1H, J = 11.68 Hz), 4.65 (m, 1H), 4.47 (q, 1H, J = 6.14 Hz), 4.03-3.97 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.74-3.69 (m, 4H), 3.39-3.33 (m, 1H), 3.26 (dd, 1H, J = 13.73 Hz, J = 4.00 Hz), 3.16-3.03 (m, 3H), 3.26 (dd, 1H, J = 8.91 Hz, J = 13.74 Hz), 2.05-1.96 (m, 1H), 1.78-1.49 (m, 3H), 1.48-1.42 (m, 9H), 1.42-1.24 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 175.45, 163.2, 159.1, 156.2, 148.6, 137.3, 129.3, 128.8, 127.0, 126.2, 126.2, 121.7, 119.8, 114.2, 112.6, 56.2, 55.3, 40.7, 35.1, 30.5, 28.4, 22.8; MS (ES+) m/z (상대 강도) 908.09 ([M + H]+., 100).
화합물 33
고체 EEDQ (108 ㎎, 0.436 mmol, 2 당량)를 DCM (6 ㎖) 및 메탄올 (3 ㎖)의 혼합물 중의 아민 32 (199 ㎎, 0.219 mmol, 1 당량) 및 말레이미도 헥사노산 (57 ㎎, 0.269, 1.23 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. LC/MS (3.45 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1101.78 ([M + H]+., 100))에 의해서 반응은 완료된 것으로 확인되었다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 DCM 및 포화 수성 NaHCO3 사이에 분배시키고, 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피 (1/99로부터 2.5/97.5까지의 메탄올/클로로포름 구배)에 의해서 정제하여 165 ㎎ (68%)의 순수한 생성물 33을 수득하였다. 분석 데이터: [α]24 D = +94° (c = 0.09, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.62 (s, 1H), 7.46-7.39 (m, 2H), 7.27 (s, 1H), 7.22-7.06 (m, 9H), 6.79 (d, 2H, J = 8.65 Hz), 6.75 (bs, 1H), 6.57 (s, 2H), 6.52 (s, 1H), 6.28 (s, 1H), 5.77 (bs, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.75-4.60 (m, 2H), 4.40 (q, 1H, J = 5.54 Hz), 3.93-3.86 (m, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.73 (s, 3H), 3.65 (s, 2H), 3.36 (t, 2H, J = 7.16 Hz), 3.30-3.23 (m, 1H), 3.08-2.90 (m, 5H), 2.09 (t, 2H, J = 7.14 Hz), 1.93-1.75 (m, 1H), 1.62-1.31 (m, 17H), 1.30-1.04 (m, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 173.5, 170.9, 170.3, 169.6, 163.2, 159.1, 156.3, 151.1, 148.6, 136.1, 134.0, 129.1, 128.7, 127.2, 126.3, 126.2, 124.9, 123.3, 121.7, 120.0, 114.2, 112.7, 110.7, 86.1, 79.3, 67.6, 59.5, 56.2, 56.1, 55.3, 54.6, 53.9, 53.4, 37.8, 37.5, 36.7, 35.2, 31.0, 29.4, 28.5, 28.2, 26.2, 24.8, 22.7; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1101.78 ([M + H]+., 100).
화합물 34
DCM 중의 10% TFA의 냉각된 용액 (12 ㎖)을 33 (75 ㎎, 0.068 mmol, 1 당량)의 냉각된 (-20℃) 샘플에 첨가하였다. 반응을 LC/MS (2.87　분 (ES+) m/z (상대 강도) 1001.13 ([M + H]+., 100))에 의해서 모니터링하였다. 온도는 부반응이 없이 -10℃의 최고점에 도달하였다. 반응은 4 시간 후에 완료되었다. 반응 혼합물을 탈이온수 (50 ㎖)에 붓고, 밤새 동결건조 (액체 질소욕에 이어서 재충전이 없이 증발시켰다)시켜 순수한 TFA 염 34를 수득하였다 (75　㎎, 99%). 분석 데이터: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.05 (s, 1H), 7.87-7.62 (m, 4H), 7.35 (m, 2H), 7.24 (s, 1H), 7.16-7.11 (m, 2H), 7.10-6.96 (m, 8H), 6.92 (s, 1H), 6.82-6.66 (m, 3H), 6.63-6.42 (m, 3H), 5.75 (d, 1H, J = 9.54 Hz), 5.15-5.03 (m, 1H), 4.77-4.74 (m, 1H), 4.68-4.56 (m, 1H), 4.39 (s, 1H), 3.97-3.84 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.72 (s, 3H), 3.65 (s, 2H), 3.33-3.21 (m, 3H), 3.04-2.69 (m, 5H), 2.04 (m, 2H), 1.979-1.64 (m, 1H), 1.63-1.45 (m, 3H), 1.44-1.12 (m, 6H), 1.07-0.95 (m, 2H); MS (ES+) m/z (상대 강도) 1001.13 ([M + H]+., 100).
화합물 35
아민 32 (99 ㎎, 0.109 mmol, 1 당량)을 무수 DCM (5 ㎖) 및 DMF (1 ㎖)의 혼합물 중의 NHS-PEG4-말레이미드 (Thermo Scientific, 61.6 ㎎, 0.120 mmol, 1.1 당량) 및 TEA (18.2 ㎕, 0.130　mmol, 1.2　당량)의 용액에 첨가하였다. 반응액을 실온에서 밤새 교반하였으며, 이 시점에서 LC/MS (3.27 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1307.55 ([M + H]+., 100))에 의해 반응이 거의 완료된 것으로 확인되었다. 휘발성 물질을 감압 하에서 증발시켜 제거하였다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피 (3/97로부터 5/95까지의 메탄올/클로로포름 구배)에 의해서 정제하여 71 ㎎ (50%)의 순수한 생성물 35를 수득하였다. 분석 데이터: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.58 (s, 1H), 7.50 (d, 2H, J = 8.47 Hz), 7.28 (s, 1H), 7.25-7.20 (m, 2H), 7.18-7.01 (m, 9H), 6.89 (d, 1H, J = 7.58 Hz), 6.79 (d, 2H, J = 8.68 Hz), 6.59 (s, 2H), 6.51 (s, 1H), 5.77 (d, 1H, J = 6.42 Hz), 5.25 (d, 1H, J = 11.43 Hz), 4.83-4.64 (m, 2H), 4.63-4.49 (m, 1H), 4.43-4.38 (m, 1H), 4.18 (s, 1H), 3.96-3.85 (m, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.76-3.56 (m, 9H), 3.57-3.34 (m, 15H), 3.34-3.20 (m, 3H), 3.15 (dd, 1H, J = 14.22 Hz, J = 5.60 Hz), 3.07-2.89 (m, 4H), 2.48-2.29 (m, 4H), 1.97-1.90 (m, 1H), 1.61-1.39 (m, 3H), 1.35 (s, 9H), 1.29-1.12 (m, 4H). MS (ES+) m/z (상대 강도) 1307.55 ([M + H]+., 100).
화합물 36
DCM 중의 10% TFA의 냉각된 용액 (10 ㎖)을 35 (70 ㎎, 0.054 mmol, 1 당량)의 냉각된 (-20℃) 샘플에 첨가하였다. 반응을 LC/MS (2.77 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1206.94 ([M + H]+., 100))에 의해서 모니터링하였다. 반응은 -25℃에서 18 시간 후에 완료에 도달하였다. 반응 혼합물을 탈이온수 (50 ㎖)에 붓고, 밤새 동결건조 (액체 질소욕, 재충전없이 증발되도록 하였다)시켜 순수한 TFA 염 36을 수득하였다 (75 ㎎, 99%).
화합물 37
메탄올 (1.5 ㎖) 중의 33 (9.5 ㎎, 8.6 μmol, 1 당량)의 용액을 메탄올 (2 ㎖) 및 물 (1 ㎖)의 혼합물 중의 사이클릭 티오펩타이드 c(RGDfC) (5 ㎎, 8.6 μmol, 1 당량, pepnet.com으로부터)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 생성된 침전을 여과에 의해서 수거하고, 메탄올 및 물 (0.6 ㎖/0.4 ㎖)의 혼합물로 세정하고, 진공 흡인에 의해서 건조시켜 LC/MS (3.03 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1681.19 ([M + H]+., 10), 790.85 (100))에 의해서 나타나는 바와 같이 8 ㎎ (55%)의 순수한 생성물을 제공하였다.
화합물 38
화합물 37 (7 ㎎)을 2 시간 동안 0℃ (얼음욕)에서 DCM 중의 10% TFA (1 ㎖)로 처리하였다. 반응은 LC/MS (2.70 분 (ES+) m/z (상대 강도) 791.44 ([(M + 2H)/2]+., 100))에 의해서 나타나는 바와 같이 완료된 것으로 확인되었다. 반응 혼합물을 탈이온수 (10 ㎖)에 붓고, 밤새 동결건조 (액체 질소욕, 재충전없이 증발하도록 한다)시켜 순수한 TFA 염 38을 수득하였다 (7 ㎎, 정량적 수율).
화합물 39a
화합물 39a 및 그의 합성은 WO 00/012508 및 WO 2006/111759에 기술된다.
화합물 39b
방법 I: 촉매량의 DMF (2 방울)룰 무수 THF (20 ㎖) 중의 니트로-산 39a (1.0 g, 2.15 mmol) 및 옥살릴 클로라이드 (0.95 ㎖, 1.36 g, 10.7　mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다 (발포!). 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하도록 하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 제거하였다. 생성된 잔류물을 무수 THF (20 ㎖)에 재용해시키고, 이 산 클로라이드 용액을 질소 대기 하에 -30℃ (드라이아이스/에틸렌 글리콜)에서 THF (10 ㎖) 중의 (2S,4R)-메틸-4-하이드록시피롤리딘-2-카복실레이트 하이드로클로라이드 (859 ㎎, 4.73 mmol) 및 TEA (6.6 ㎖, 4.79 g, 47.3 mmol)의 교반된 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 추가로 3 시간 동안 교반하였으며, 이 시간 후에 TLC (95:5 v/v CHCl3/MeOH) 및 LC/MS (2.45 분 (ES+) m/z (상대 강도) 721　([M + H]+., 20))는 생성물의 형성을 나타내었다. 과량의 THF를 회전증발에 의해서 제거하고, 생성된 잔류물을 DCM (50 ㎖)에 용해시켰다. 유기층을 1 N　HCl (2 x 15 ㎖), 포화 NaHCO3 (2 x 15 ㎖), H2O (20 ㎖), 염수 (30 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 여과하고, 용매를 증발시켜 짙은 색의 오일로서 조생성물을 제공하였다. 섬광 크로마토그래피 (구배 용출: 100% CHCl3 내지 96:4 v/v CHCl3/MeOH)에 의해서 정제하여 오렌지색 유리질 물질로서 순수한 아미드 39b를 분리시켰다 (840 ㎎, 54%).
방법 II: 옥살릴 클로라이드 (9.75 ㎖, 14.2 g, 111 mmol)를 무수 DCM (200 ㎖) 중의 니트로-산 39a (17.3 g, 37.1 mmol) 및 DMF (2 ㎖)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 초기 발포에 이어서 반응 현탁액은 용액이 되었으며, 혼합물은 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 산 클로라이드로의 전환은 반응 혼합물의 샘플을 MeOH로 처리함으로써 확인하였으며, 생성된 비스-메틸 에스테르를 LC/MS에 의해서 관찰하였다. 대부분의 용매를 진공 중에서 증발시켜 제거하고, 생성된 농축 용액을 최소량의 무수 DCM에 제용해시키고, 디에틸 에테르와 함께 연마하였다. 생성된 황색 침전을 여과에 의해서 수거하고, 냉 디에틸 에테르로 세척하고, 40℃의 진공 오븐 내에서 1 시간 동안 건조시켰다. 고체 산 클로라이드를 -40℃ (드라이아이스/CH3CN)에서 DCM (150 ㎖) 중의 (2S,4R)-메틸-4-하이드록시피롤리딘-2-카복실레이트 하이드로클로라이드 (15.2　g, 84.0　mmol) 및 TEA (25.7 ㎖, 18.7 g, 185 mmol)의 교반된 현탁액에 25 분의 기간에 걸쳐서 조금씩 첨가하였다. 즉시, 반응은 LC/MS (2.47 분 (ES+) m/z (상대 강도) 721 ([M + H]+., 100))에 의해서 판단되는 바와 같이 완료되었다. 혼합물을 DCM (150 ㎖)으로 희석하고, 1 N HCl (300 ㎖), 포화 NaHCO3 (300 ㎖), 염수 (300 ㎖)로 세척하고, 여과하고 (상분리기를 통함), 용매를 진공 중에서 증발시켜 오렌지색 고체로서 순수한 생성물　39b를 제공하였다 (21.8 g, 82%). 분석 데이터: [α]22 D = -46.1° (c = 0.47, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) (로타머) d 7.63 (s, 2H), 6.82 (s, 2H), 4.79-4.72 (m, 2H), 4.49-4.28 (m, 6H), 3.96 (s, 6H), 3.79 (s, 6H), 3.46-3.38 (m, 2H), 3.02 (d, 2H, J = 11.1 Hz), 2.48-2.30 (m, 4H), 2.29-2.04 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) (로타머) d 172.4, 166.7, 154.6, 148.4, 137.2, 127.0, 109.7, 108.2, 69.7, 65.1, 57.4, 57.0, 56.7, 52.4, 37.8, 29.0; IR (ATR, CHCl3) 3410 (br), 3010, 2953, 1741, 1622, 1577, 1519, 1455, 1429, 1334, 1274, 1211, 1177, 1072, 1050, 1008, 871 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 721 ([M + H]+., 47), 388 (80); HRMS [M + H]+. 이론적 C31H36N4O16 m/z 721.2199, 실측치 (ES+) m/z 721.2227.
화합물 39c
고체 TCCA (32 g, 137 mmol, 2.2 당량)를 0℃에서 표준 DCM (500 ㎖) 중의 TEMPO (1 g, 6.4 mmol, 0.1 당량) 및 비스-알콜 18 (45 g, 62.5 mmol, 1 당량)의 용액에 조금씩 첨가하였다. 약간의 발열반응이 관찰되었다. 30 분 후에 TLC (에틸 아세테이트) 및 LC /MS (2.95 분 (ES+) m/z (상대 강도) 718.10 ([M + H]+., 100))에 의해서, 반응이 완료된 것으로 생각되었다. 이 현탁액을 셀라이트를 통해서 여과하고, DCM으로 세척하였다. 여액을 수성 중아황산나트륨으로 세척하고, 이어서 포화 NaHCO3 (주의, 격렬한 발포), 염수 (200 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 조생성물을 수득하고, 이것을 섬광 칼럼 크로마토그래피 (용출: 20:80 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해서 정제하여 백색 고체로서 케톤 39c를 수득하였다 (28.23 g, 63%). 분석 데이터: [α]21 D = +18° (c = 0.2, CHCl3); MS (ES+) m/z (상대 강도) 718.10 ([M　+ H]+., 100); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 로타머의 혼합물 δ 7.70 (m, 2H), 6.79 (m, 2H), 5.27 (m, 1H), 4.44 (m, 1H), 4.30 (m, 4H), 3.93 (m, 6H), 3.81 (s, 3H), 3.75 (m, 1H), 3.63 (s, 2H), 3.58 (m, 1H), 3.09-2.89 (m, 2H), 2.74-2.53 (m, 2H), 2.40 (p, 2H, J = 5.73 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) 로타머의 혼합물 δ 206.5, 206.4, 206.0, 205.9, 171.2, 171.1, 170.6, 167.0, 166.7, 155.0, 154.5, 148.8, 137.7, 137.3, 126.4, 125.4, 109.8, 109.1, 108.6, 108.4, 108.4, 65.7, 65.6, 65.5, 60.4, 57.9, 56.7, 56.7, 55.1, 53.6, 52.9, 52.9, 51.6, 41.2, 40.1, 28.7, 28.6, 21.0, 14.1; IR (ATR, CHCl3) 1764, 1650, 1578, 1518, 1415, 1333, 1274, 1217, 1060, 870, 824 759 ㎝-1.
화합물 40
무수 2,6-루티딘 (4.26 ㎖, 3.92 g, 36.6 mmol)을 질소 대기 하에 -45℃ (드라이아이스/아세토니트릴 냉각욕)에서 무수 DCM (100 ㎖) 중의 비스-케톤 39c (4.23 g, 5.90 mmol)의 격렬하게 교반된 용액에 한꺼번에 주입하였다. 새롭게 개봉된 앰플로부터 취한 무수 트리플산 무수물 (5.96 ㎖, 10 g, 35.4 mmol)을, 온도를 -40℃ 또는 그 이하에서 유지시키면서 빠르게 점적 주입하였다. 반응 혼합물을 -45℃에서 1 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 TLC (50/50　v/v n-헥산/EtOAc)는 출발물질의 완전한 소비를 나타내었다. 냉 반응 혼합물을 즉시 DCM (200 ㎖)으로 희석하고, 격렬하게 진탕하면서 물 (1　x　300 ㎖), 5% 시트르산 용액 (1 x 200 ㎖), 포화 NaHCO3 (200 ㎖), 염수 (150　㎖)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 여과하고, 용매를 진공 중에서 증발시켜 조생성물을 수득하고, 이것을 섬광 칼럼 크로마토그래피 (구배 용출: 70:30 v/v n-헥산/EtOAc 내지 40:60 v/v n-헥산/EtOAc)에 의해서 정제하여 황색 포움으로서 비스-트리플레이트 40을 수득하였다 (1.32 g, 23%). 분석 데이터: [α]25 D = -68° (c = 0.2, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.73 (s, 2H), 6.85 (s, 2H), 6.20 (t, 2H, J = 1.81 Hz), 5.13 (dd, 2H, J = 5.05, 11.93 Hz), 4.33 (t, 4H, J = 5.91 Hz), 3.95 (s, 6H), 3.84 (s, 6H), 3.43 (ddd, 2H, J = 2.28, 11.92, 16.59 Hz), 2.96 (ddd, 2H, J = 1.60, 5.05, 16.58 Hz), 2.44 (p, 2H, J = 5.79 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ　169.4, 164.1, 154.7, 149.2, 138.0, 135.2, 124.4, 121.1, 120.0, 116.8, 110.0, 108.4, 65.7, 65.6, 57.0, 56.8, 53.1, 33.3, 28.6; IR (ATR, CHCl3) 1749, 1654, 1576, 1522, 1418, 1337, 1277, 1207, 1131, 1061, 1023, 910, 821, 757 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 981.86 ([M + H]+., 100).
화합물 41
Pd(PPh3)4 (660 ㎎, 571 μmol, 0.08 당량)를 비스 에놀 트리틀레이트 40 (7 g, 7.13 mmol, 1 당량), 4-플루오로페닐보론산 (2.6 g, 18.5 mmol, 2.6 당량), Na2CO3 (3.93　g, 37.0 mmol, 5.2 당량), EtOH (25 ㎖), 톨루엔 (50 ㎖) 및 물 (25 ㎖)의 교반된 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 대기 하에서 밤새 교반하였으며, 이 시간 후에 출발물질의 완전한 소비가 TLC (60/40 EtOAc/헥산) 및 LC/MS (3.68 분 (ES+) m/z (상대 강도) 873.90 ([M + H]+., 100))에 의해서 관찰되었다. 반응 혼합물을 EtOAc (300 ㎖)로 희석하고, H2O (2　x　200 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 감압 하에서 증발시켜 조생성물을 제공하였다. 섬광 크로마토그래피 (구배 용출: 50:50 v/v 헥산/EtOAc 내지 80:20 v/v 헥산/EtOAc)에 의해서 정제하여 오렌지색 고체로서 비스 C2-아릴 화합물 41을 수득하였다 (5.46 g, 88%). 분석 데이터: [α]22 D = -107° (c = 0.2, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (s, 2H), 7.14-7.04 (m, 4H), 6.97-6.87 (m, 6H), 6.31 (s, 2H), 5.18 (dd, 2H, J = 11.68, 5.03 Hz), 4.36 (t, 4H, J = 5.87 Hz), 3.97 (s, 6H), 3.84 (s, 6H), 3.53-3.39 (m, 2H), 3.00 (ddd, 2H, J = 1.22, 5.01, 16.28 Hz), 2.46 (p, 2H, J = 5.98 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.0, 163.3, 148.9, 138.0, 128.1, 126.3, 126.2, 125.8, 123.1, 122.6, 115.7, 115.5, 110.3, 108.5, 65.7, 58.3, 56.8, 34.7, 28.7; IR (ATR, CHCl3) 1738, 1650, 1578, 1512, 1416, 1333, 1275, 1212, 1064, 1023, 869, 808, 758, 654, 613 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 873.90 ([M + H]+., 100)).
화합물 42
LiBH4 (132 ㎎, 21.3 mmol, 3 당량)를 0℃에서 무수 THF (100 ㎖) 중의 에스테르 41 (5.30 g, 6.07 mmol, 1 당량)의 교반된 용액에 한꺼번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 1 시간 동안 교반하였으며, 그 후에 출발물질의 완전한 전환이 LC/MS (3.42 분 (ES+) m/z (상대 강도) 818.35 ([M + H]+., 100))에 의해서 직접 관찰되었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (500 ㎖)로 주의해서 희석하고, 과량의 보로하이드라이드를 냉 수성 시트르산으로 파괴시켰다. 유기층을 1 N 수성 HCl (100㎖)에 이어서 포화 수성 NaHCO3 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 35℃에서 증발시켜 중간체 알콜을 제공하고, 이것을 즉시 무수 DCM (200 ㎖)에 재용해시켰다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고, 이미다졸 (3.97　g, 58.0 mmol, 9.6 당량)을 첨가하고, 이어서 TBDMS-Cl (4.390　g, 29.1 mmol, 4.8　당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 가온하고, 2 시간 동안 반응시켰다. 완전한 반응이 TLC (EtOAc/헥산, 50/50) 및 LC/MS (4.23 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1045.99 ([M + H]+., 100))에 의해서 관찰되었다. 이 용액을 2 N 수성 시트르산 (50 ㎖), 포화 수성 NaHCO3 (50 ㎖), 염수 (50 ㎖)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피 (80/20으로부터 60/40까지의 헥산/EtOAc 구배)에 의해서 정제하여 오렌지색 고체로서 2.45 g (2 단계에 걸쳐서 38.6%)의 순수한 생성물을 수득하였다. 분석 데이터: [α]22 D = -123° (c = 0.18, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (s, 2H), 7.17-7.06 (m, 4H), 6.96-6.87 (m, 4H), 6.81 (s, 2H), 6.17 (s, 2H), 4.84-4.72 (m, 2H), 4.35 (t, 4H, J = 5.87 Hz), 3.93 (s, 6H), 3.25-3.07 (m, 2H), 3.03-2.91 (m, 2H) 2.45 (p, 2H, J = 5.92 Hz), 0.84 (s, 18H), 0.07 (s, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 163.2, 160.7, 154.5, 148.6, 137.9, 130.1, 130.0, 126.7, 126.3, 126.2, 124.3, 123.0, 115.6, 115.4, 110.0, 108.5, 65.7, 60.4, 59.2, 56.7, 33.2, 28.7, 25.8, 25.7, 21.0, 18.2, 14.2, -5.3; IR (ATR, CHCl3) 2953, 1742, 1650, 1576, 1512, 1417, 1334, 1274, 1214, 1063, 1023, 869, 808, 759, 654, 612 cm-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1045.99 ([M + H]+., 100).
화합물 43
에탄올 중의 포음산의 용액 (5% v/v, 100㎖)을 에탄올 (35 ㎖) 중의 비스-니트로 화합물 42 (2.35 g, 2.25 mmol, 1 당량) 및 아연 분말 (8.82 g, 0.135 mmol, 60　당량)의 현탁액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 25 분 동안 실온에서 교반하였으며, 이 시점에 TLC (메탄올/클로로포름, 2/98) 및 LC/MS (4.23 분 (ES+) m/z (상대 강도) 986.3 ([M + H]+., 10), 493.9 ([(M + 2H)/2]+., 100))는 반응의 완료를 나타내었다. 이 현탁액을 여과하고, 여액을 에틸 아세테이트 (400 ㎖)와 포화 수성 NaHCO3 (200 ㎖) 사이에 분배시켰다. 유기물을 염수 (100 ㎖)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켜 순수한 비스-아민 (2.20g, 98%)을 수득하였으며, 이것은 다음 단계로 직접 보내졌다.
화합물 44
무수 DCM (50 ㎖) 중의 알릴 클로로포르메이트 (0.209 ㎖, 1.97 mmol, 0.9 당량)의 용액을 -78℃에서 무수 DCM (250 ㎖) 중의 비스-아닐리노 화합물 43 (2.15 g, 2.18 mmol, 1 당량) 및 피리딘 (0.335 ㎖, 4.14 mmol, 1.9 당량)의 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 2 시간 동안 교반하고, 실온으로 가온하였다. 이 용액을 포화 수성 황산구리 (2 x 50 ㎖), 물 (250 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 섬광 크로마토그래피 (70/30으로부터 30/70까지의 헥산/EtOAc 구배)에 의해서 정제하여 LC/MS (4.45 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1154.32 ([M + H]+., 100))에 의해서 확인되는 바와 같이 668 ㎎ (26.5%)의 비스-Alloc 보호된 화합물, 및 800 ㎎의 약하게 오염된 목적하는 모노-alloc 보호된 화합물 (4.32 분 (ES+) m/z (상대 강도) 1070.58 ([M + H]+., 100))을 수득하였다. 이 화합물을 섬광 크로마토그래피 (40/60으로부터 20/80까지의 헥산/디에틸 에테르 구배)에 의해서 더 정제하여 700 ㎎ (30%)의 목적하는 순수한 모노-alloc 화합물을 제공하였다. 분석 데이터: [α]22 D = -41° (c = 0.16, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.72 (bs, 1H), 7.88 (s, 2H), 7.25-7.18 (m, 4H), 7.02-6.93 (m, 4H), 6.93-6.83 (m, 3H), 6.80 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 6.00-5.84 (m, 1H), 5.32 (dd, 1H, J = 1.37, J = 17.21 Hz), 5.21 (dd, 1H, J = 0.90, J = 10.40 Hz), 4.85-4.71 (m, 2H), 4.60 (dd, 2H, J = 1.02, J = 5.62 Hz), 4.46 (s, 2H), 4.31 (t, 2H, J = 5.96 Hz), 4.25 (t, 2H, J = 6.31 Hz), 3.98 (m, 2H), 3.86 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.19-3.05 (m, 2H), 3.05-2.93 (m, 2H), 2.41 (p, 2H, J = 6.16 Hz), 0.84 (m, 18H), 0.05 (m, 12H); IR (ATR, CHCl3) 2952, 2359, 1732, 1652, 1601, 1507, 1472, 1406, 1225, 1119, 836, 777, 668 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1070.58 ([M + H]+., 100).
화합물 45
무수 THF 중의 아민 44 (650 ㎎, 0.607 mmol, 1 당량) 및 TEA (220 ㎕, 1.58 mmol, 2.6　당량)의 용액을 0℃에서 무수 THF (4 ㎖) 중의 트리포스겐 (81　㎎, 0.273 mmol, 0.45 당량)의 신선하게 제조된 용액에 적가하였다. 백색 현탁액을 0℃에서 10 분 동안 교반하였다. 무수 THF (30 ㎖) 중의 알콜 (Alloc-Val-Ala-PABOH, 229 ㎎, 0.607 mmol, 1　당량) 및 TEA (220 ㎕, 1.58 mmol, 2.6 당량)의 용액을 빠르게 첨가하였다. 백색 현탁액을 실온에서 15 분 동안 교반한 다음에, 65℃에서 2 시간 동안 가열한 후, 실온에서 밤새 교반하였다. 백색 TEA 염을 면모를 통해서 여과하여 제거하였다. 여액을 농축시키고, 섬광 크로마토그래피 (구배: 클로로포름 중의 0% MeOH로부터 클로로포름 중의 3% MeOH까지)에 의해서 정제하여 220 ㎎의 목적하는 카바메이트를 수득하였다 (25%). 분석 데이터: [α]24 D = -46.1° (c = 0.13, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.70 (bs, 2H), 8.46 (s, 1H), 7.83 (s, 2H), 7.50 (m, 2H), 7.31 (d, 2H, J = 8.50 Hz), 7.25-7.15 (m, 4H), 7.03-6.93 (m, 4H), 6.92-6.77 (m, 4H), 6.51 (d, 1H, J = 7.48Hz), 5.99-5.81 (m, 1H), 5.38-5.15 (m, 5H), 5.13-5.03 (m, 2H), 4.77 (bs, 2H), 4.66-4.53 (m, 5H), 4.38-4.22 (m, 4H), 4.08-3.94 (m, 3H), 3.93-3.81 (m, 2H), 3.79 (s, 6H), 3.20-3.05 (m, 2H), 3.05-2.94 (m, 2H), 2.41 (p, 2H, J = 5.95 Hz), 2.22-2.08 (m, 1H), 1.45 (d, 3H, J = 7.03 Hz), 0.94 (dd, 6H, J = 6.81, 14.78 Hz), 0.84 (m, 18H), 0.14-0.02 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ　171.7, 169.8, 165.9, 163.1, 153.6, 151.0, 144.3, 137.8, 132.4, 132.3, 132.0, 130.2, 129.2, 126.2, 126.1, 125.3, 123.3, 123.2, 119.8, 118.2, 118.0, 115.7, 115.5, 112.0, 106.0, 66.5, 66.2, 65.8, 65.4, 62.5, 60.4, 59.5, 56.6, 49.6, 30.8, 28.9, 25.7, 19.2, 18.2, 18.1, 17.7, 17.3, 14.2, -5.4; IR (ATR, CHCl3) 2950, 2356, 1725, 1691, 1602, 1512, 1408, 1201, 1109, 1023, 832, 774, 668 ㎝-1; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1473.43 ([M　+　H]+., 100).
화합물 12
무수 에틸 아세테이트 (15 ㎖) 중의 1-벤질 19-(2,5-디옥소피롤리딘-1-일) 4,7,10,13,16-펜타옥사노나데칸-1,19-디오에이트 (11) (100 ㎎, 0.19 mmol, 1 당량)를 탄소 상의 10% 팔라듐 (10 ㎎, 10 wt%) 상에서 45 분 동안 30 psi에서 수소화시켰다. 반응 혼합물을 무수 에틸 아세테이트로 세척하면서 셀라이트를 통해서 여과하였다. 감압 하에서 증발시켜 무색 오일로서 생성물 I2를 제공하였다 (74 ㎎, 89%). 분석 데이터: RT (LC 상에서 볼 수 없음); MS (ES+) m/z (상대 강도) 458 ([M + Na]+, 55), 436 ([M + H]+., 12).
화합물 13
N,N-디이소프로필디에틸아민 (8.4 ㎕, 6 ㎎, 5.97 x 10-5 mol, 1.1 당량)을 무수 DCM (5 ㎖) 중의 아민 디펩타이드 (12c) (50 ㎎, 5.42 x 10-5 mol, 1.0 당량) 및 산-dPeg®5-NHS 에스테르 (12) (28 ㎎, 6.5 x 10-5 mol, 1.2 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 증발시켜 연황색 오일을 제공하였다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 96% 클로로포름/4% 메탄올 내지 92% 클로로포름/0.5%씩 증가시켜 8% 메탄올]에 의해서 정제하여 황색 유리질 물질로서 생성물 13를 제공하였다 (42 ㎎, 64%). 분석 데이터: RT 2.78 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1242 ([M + H]+.,40).
화합물 49
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 (9.1 ㎎, 4.76 x 10-5 mol, 1.6 당량)를 질소 대기 하에서 무수 DCM (6 ㎖) 중의 N-하이드록시석신이미드 (5.8 ㎎, 5.06 x 10-5 mol, 1.7 당량) 및 산 ( 13 )의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 이 용액을 DCM (10 ㎖)으로 세척하면서 여과하였다. DCM 용액을 물 (20 ㎖), 염수 (20 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켰다. 생성물 49 (32 ㎎, 80%)은 더 정제하지 않고 사용하였다. 분석 데이터: RT 2.88 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1339 ([M + H]+., 100).
화합물 50
Pd(PPh3)4 (61 ㎎, 0.053 mmol, 0.01 당량)를 질소 대기 하에서 무수 DCM 중의 alloc 화합물 (8) (2.0 g, 5.3 mmol, 1.0 당량) 및 피롤리딘 (0.47 g, 0.55 ㎖, 6.63 mmol, 1.25 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. LCMS는 미반응 alloc 화합물의 존재를 나타내었다. 추가 부분의 피롤리딘 (0.38 g, 0.44 ㎖, 5.3 mmol, 1.0 당량) 및 Pd(PPh3)4 (61 ㎎, 0.053 mmol, 0.01 당량)를 첨가하고, 반응을 추가로 30 분 동안 계속하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름, 다음에 98% 클로로포름/2% 메탄올 내지 90% 클로로포름/1%씩 증가시켜 10% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 분말로서 생성물 50을 제공하였다 (1.37 g, 88%). 분석 데이터: RT 0.33 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 294 ([M + H]+.,60 ), MS (ES-) m/z (상대 강도) 292 ([M - H]-., 100).
화합물 51
EEDQ (1.22 g, 4.93 mmol, 1.05 당량)를 무수 THF (60 ㎖) 중의 아민 디펩타이드 (50) (1.37 g, 4.69 mmol, 1 당량) 및 m-dPeg®2 산 (0.73 g, 4.93 mmol, 1.05 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 5일 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 섬광 칼럼 크로마토그래피 [100% 클로로포름 내지 95% 클로로포름/1%씩 증가시켜 5% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 고체로서 생성물 51을 제공하였다 (1.46 g, 74%). 분석 데이터: RT 2.22 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 446 ([M + Na]+., 80), 424 ([M　+　H]+., 70), MS (ES-) m/z (상대 강도) 422 ([M - H]-., 100).
51의 합성은 이하의 반응식 14에 나타낸다.
[반응식 14]
Figure 112012086532911-pct00140
화합물 52
트리에틸아민 (0.47 g, 0.65 ㎖, 4.66 mmol, 2.2 당량)을 질소 대기 하에 실온에서 무수 THF (40 ㎖) 중의 모노-alloc 보호된 비스-아닐린 (6) (1.68 g, 2.12 mmol, 1 당량) 및 트리포스겐 (0.226 g, 0.76 mmol, 0.36 당량)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 가열하고, 샘플을 메탄올로 처리하고, LCMS에 의해 메틸 카바메이트로서 분석하였다.
무수 THF (60 ㎖) 중의 dPeg®2-벤질-알콜 (51) (1.35 g, 3.18 mmol, 1.5 당량) 및 트리에틸아민 (0.32 g, 0.44 ㎖, 3.18 mmol, 1.5 당량)의 용액을 신선하게 제조된 이소시아네이트에 적가하였다. 반응 혼합물을 30 분 간격으로 LCMS에 의해서 모니터링하였다. 3 시간 후에 LC-MS는 생성물로의 전환, 메틸 카바메이트 및 모노-alloc 보호된 비스-아닐린 (9)의 존재를 나타내었다. 추가의 부분의 트리포스겐 (0.056 g, 0.19 mmol, 0.09 당량)을 첨가하고, 반응을 40℃에서 추가로 3 시간 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 증발 건고시켜 황색 오일로서 조생성물을 수득하고, 이것을 섬광 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름 내지 95% 클로로포름/1%씩 증가시켜 5% 메탄올]에 의해서 정제하여 황색 포움으로서 목적하는 생성물 52를 제공하였다 (1.91 g, 73%). 분석 데이터: RT 분 3.42 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1243 ([M + H]+., 50), MS (ES-) m/z (상대 강도) 1241 ([M - H])-., 100).
화합물 53
Pd(PPh3)4 (35 ㎎, 3.0 x 10-5 mol, 0.02 당량)를 질소 대기 하에서 무수 DCM (30 ㎖) 중의 alloc 화합물 (52) (1.87 g, 1.5 mmol, 1.0 당량) 및 피롤리딘 (0.27 ㎎, 310 ㎕, 3.8 mmol, 2.5 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시키고, 생성물을 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름 내지 95% 클로로포름/1%씩 증가시켜 5% 메탄올]에 의해서 정제하여 황색 포움으로서 생성물 53을 제공하였다 (1.57 g, 90%). 분석 데이터: RT 분 3.17 분 MS (ES+) m/z (상대 강도) 1159 ([M + H]+., 65).
화합물 54
트리에틸아민 (0.26 g, 0.36 ㎖, 2.6 mmol, 2.2 당량)을 질소 대기 하에 실온에서 무수 THF (40 ㎖) 중의 모노-보호된 비스-아닐린 (53) (1.37 g, 1.18 mmol, 1 당량) 및 트리포스겐 (0.126 g, 0.43　mmol, 0.36 당량)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 가열하고, 샘플을 메탄올로 처리하고, LC-MS에 의해서 완전한 이소시아네이트 형성을 나타내는 메틸 카바메이트로서 분석하였다.
무수 THF (50 ㎖) 중의 벤질 알콜 (8) (0.67 g, 1.8 mmol, 1.5 당량) 및 트리에틸아민 (0.18 g, 0.25 ㎖, 1.8 mmol, 1.5 당량)의 용액을 신선하게 제조된 이소시아네이트에 적가하였다. 반응 혼합물을 LCMS에 의해서 모니터링하고, 40℃에서 18 시간 후에 완료되었다. 반응 혼합물을 증발 건고시키고 황색 오일을 수득하고, 이것을 섬광 크로마토그래피 [구배 용출: 95% 에틸 아세테이트/5% 메탄올 내지 93% 에틸 아세테이트/1%씩 증가시켜 7% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 포움으로서 목적하는 생성물 54를 제공하였다 (1.21 g, 66%). 분석 데이터: RT 분 3.42 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1562 ([M + H]+., 15).
화합물 55
H2O (5.0 ㎖) 중의 K2CO3 (0.522 g, 3.78 mmol, 5 당량)의 용액을 메탄올 (29 ㎖) 중의 아세테이트 (54) (1.18 g, 0.756 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 메탄올을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 H2O (50 ㎖)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3 x 100 ㎖)로 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물을 합하여 H2O (200 ㎖), 염수 (200 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 백색 포움으로서 생성물 55를 제공하였다 (1.052　g, 94%). 분석 데이터: RT 분 3.15 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1478 ([M + H]+., 5), MS (ES-) m/z (상대 강도) 1477 ([M - H])-., 100).
화합물 56
데스-마틴 퍼요오디난 (0.152 g, 0.36 mmol, 2.1 당량)을 질소 대기 하에서 무수 DCM (5 ㎖) 중의 비스 탈아세틸화 생성물 (55) (0.252 g, 0.17 mmol, 1 당량)의 용액에 한꺼번에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 LCMS는 반응이 완료되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 DCM (50 ㎖)으로 희석하고, 포화 중탄산나트륨 수용액 (3 x 100 ㎖), 물 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 용매를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 조생성물을 제공하였다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름 내지 92% 클로로포름/1%씩 증가시켜 8% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 포움으로서 생성물 56을 제공하였다 (0.17 g, 68%). 분석 데이터: RT 분 6.17 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1474 ([M + H]+., 5), MS (ES-) m/z (상대 강도) 1472 ([M - H])-., 100).
화합물 57
Pd(PPh3)4 (8 ㎎, 6.9 μmol, 6.0 당량)를 질소 대기 하에서 무수 DCM (18 ㎖) 중의 alloc 화합물 (56) (160　㎎, 0.108 mmol, 1.0 당량), 및 DCM 중의 0.5 M 피롤리딘 용액 (0.27 ㎖, 0.135 mmol, 1.25 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 클로로포름 내지 91% 클로로포름/1%씩 증가시켜 9% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 분말로서 생성물 57을 제공하였다 (0.114 g, 74%). 분석 데이터: RT 분 2.60 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1390 ([M + H]+., 5).
말레이미드-PEG-석신이미드 시약과 57의 커플링은 PBD 약물-링커 58을 제공한다. 도 1b는 PBD 약물-링커 MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 58의 구조를 나타내며, 여기에서 MP는 말레이미도프로판아미드이고, PEG는 에틸렌옥시이며, PAB는 파라-아미노벤질옥시카보닐이고, imp는 N-10 이민 보호 그룹: 3-(2-메톡시에톡시)프로파노에이트-Val-Ala-PAB이다.
화합물 58 ( MP - PEG8 - Val - Ala - PAB -( imp ) PBD ; (11S,11 aS )-4-((2S,5S)-37-(2,5-디옥소-2,5- 디하이드로 -1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2- 메틸 -4,7,35- 트리 옥소-10,13,16,19,22,25,28,31- 옥타옥사 -3,6,34- 트리아자헵타트리아콘탄아미 도)벤질 11- 하이드록시 -8-(5-((11S,11 aS )-11- 하이드록시 -10-((4-((10S,13S)-10-이소프로필-13- 메틸 -8,11- 디옥소 -2,5- 디옥사 -9,12- 디아자테트라데칸아미도 )벤질옥시) 카보닐 )-7- 메 톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,10,11,11a- 헥사하이드로 - 피롤로벤조[2,1-c][1,4]디아제핀 -8- 일옥시 ) 펜틸옥시 )-7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a- 테트라하이드로 - 피롤로벤조[2,1-c][1,4]디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 )
무수 DCM 중의 N,N-디이소프로필디에틸아민의 0.5 M 용액 (176 ㎕, 8.8 x 10-5 mol, 2.2 당량)을 무수 DCM (6 ㎖) 중의 아민 디펩타이드 (57) (55 ㎎, 3.96 x 10-5 mol, 1.0 당량) 및 말레이미드-dPeg®8-NHS 에스테르 (33 ㎎, 4.75 x 10-5 mol, 1.2 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 DCM (50 ㎖)에 재용해시켰다. DCM 용액을 포화 중탄산나트륨 (2 x 100 ㎖), 물 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 추출하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 황색 고무질 물질을 제공하였다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 클로로포름 내지 91% 클로로포름/1%씩 증가시켜 9% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 포움으로서 생성물 58을 제공하였다 (41 ㎎, 52%). 분석 데이터: RT 분 5.8 분. MS (MaldiTOF) m/z (상대 강도) 1987.9 ([M + Na]+., 100).
컨주게이트 60
다수의 암에 의해서 상당히 상향-조절되는 인테그린 αvβ6에 대해서 매우 선택적인 펩타이드 비오틴-A20FMDV-Cys (59)를 PBD-링커 유도체의 컨주게이션을 위해서 선택하였다. 1/1 아세토니트릴/물 (1 ㎖) 중의 펩타이드 (59) (7.7 ㎎, 3.08 μmol, 1.2 당량)의 용액을 1/1 아세토니트릴/물 (2 ㎖) 중의 (58) (5.05 ㎎, 2.57 μmol, 1.0 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 아세토니트릴을 감압 하에서 증발시키고, 물을 동결건조에 의해서 제거하여 백색 포움으로서 생성물 60을 제공하였다. 반-정제용 HPLC에 의한 정제에 이어서 동결건조시켜 백색 포움으로서 생성물을 제공하였다 (3.4 ㎎, 29%). 분석 데이터: MS (MaldiTOF) m/z (상대 강도) 4458.3 ([M + H]+., 100).
화합물 61 ( MP - PEG24 - Val - Ala - PAB -( imp ) PBD ; (11 S ,11 a S )-4-((2 S ,5 S )-16-(2,5-디옥소-2,5- 디하이드로 -1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2- 메틸 -4,7,14- 트리 옥소-10-옥사-3,6,13- 트리아자헥사데칸아미도 )벤질 11- 하이드록시 -8-((5-(((11 S ,11a S )-11-하이드록시-10-(((4-((10 S ,13 S )-10-이소프로필-13- 메틸 -8,11-디옥소-2,5- 디옥사 -9,12- 디아자테트라데칸아미도 )벤질) 옥시 ) 카보닐 )-7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,10,11,11a- 헥사하이드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디 아제핀-8-일) 옥시 ) 펜틸 ) 옥시 )-7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a- 테트라하이드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 )
N,N-디이소프로필디에틸아민 (6 ㎕, 4.3 x 10-5 mol, 2.2 당량)을 무수 DCM (5 ㎖) 중의 아민 디펩타이드 (57) (27 ㎎, 1.94 x 10-5 mol, 1 당량) 및 말레이미드-dPeg®24-NHS 에스테르 (30 ㎎, 2.13 x 10-5 mol, 1.1 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 DCM (25 ㎖)에 재용해시켰다. DCM 용액을 포화 중탄산나트륨 (2 x 50 ㎖), 물 (50 ㎖), 염수 (50 ㎖)로 추출하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 황색 고무질 물질을 제공하였다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 클로로포름 내지 91% 클로로포름/1%씩 증가시켜 9% 메탄올]에 의해서 정제하여 무색 고무질 물질로서 생성물을 제공하였다 (22 ㎎, 42%). 분석 데이터: MS (MaldiTOF) m/z (상대 강도) 2691.8 ([M + H]+., 100).
(2S,2'S,E)-디메틸 1,1'-(4,4'-(프로판-1,3- 디일비스 ( 옥시 )) 비스 (5- 메톡 시-2- 니트로벤조일 )) 비스 (4-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-2,3- 디하이드로 -1H-피롤-2-카 복실레이 트) ( 71 )
테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (21.6 ㎎)을 톨루엔 (5 ㎖), 에탄올 (2.5 ㎖) 및 물 (2.5 ㎖)의 혼합물 중의 트리플레이트 40 (230 ㎎), 트랜스-프로페닐보론산 (52.3 ㎎) 및 탄산나트륨 (129 ㎎)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤 대기 하에 32℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 여과한 후에 과량의 에틸 아세테이트를 감압 하에서 회전증발에 의해서 제거하였다. 조 커플링 생성물을 섬광 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔; 구배 50%/50% 에틸 아세테이트/헥산 내지 80%/20% 에틸 아세테이트/헥산)에 의해서 정제하였다. 순수한 분획을 합하고, 과량의 용출제를 제거하여 오렌지색 고체로서 순수한 생성물 71을 수득하였다 (110 ㎎, 61.4% 수율, LC/MS 3.52 분, m/z ES+ 764.92). 이 반응을 대규모로 반복하여 7.21 g의 수주키 커플링 생성물을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.78 (s, 2H) 6.92 (s, 2H), 5.98 (d, 2H), 5.89 (s, 2H), 5.46-5.55 (m, 2H), 5.10 (dd, 2H), 4.37 (t, 4H), 3.93-4.00 (m, 6H), 3.86 (s, 6H), 3.19-3.26 (m,2H), 2.80 (dd, 2H), 2.45-2.51 (m, 2H), 1.77 (d, 6H OCH3).
(S,E)-((프로판-1,3- 디일비스 ( 옥시 )) 비스 (5- 메톡시 -2-니트로-4,1- 페닐 렌)) 비스 (((S)-2-( 하이드록시메틸 )-4-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-2,3- 디하이드로 -1H-피롤-1-일) 메타논 ) ( 72 )
비스-에스테르 71 (7.21 g)를 0℃ (얼음욕)에서 무수 테트라하이드로푸란 (300 ㎖) 중의 리튬 보로하이드라이드 (622 ㎎)의 용액에 고체로서 한꺼번에 첨가하였다. 얼음욕을 치우고, 반응 혼합물을 실온에 도달하도록 하였다. 1 시간 후에, TLC (에틸 아세테이트 물에 의한 소규모 후처리 후에)는 반응이 완료되지 않았음을 나타내었으며, 따라서 추가의 리튬 보로하이드라이드 (0.75 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가로 2.5 시간 동안 교반하였으며, 이 시점에 TLC (소규모 후처리 후)는 반응이 완료된 것을 나타내었다. 남아있는 리튬 보로하이드라이드를 대과량의 에틸 아세테이트러 ??칭하고 (얼음욕), 반응 혼합물을 50 분 동안 교반하였다. 유기상을 물, 염수로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 황산마그네슘을 진공 여과에 의해서 제거하고, 에틸 아세테이트를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 디올 72 (5.46 g, 82% 수율)를 수득하고, 이것은 더 정제하지 않고 다음 반응에서 사용하였다 (LC/MS 3.17 분, m/z ES+ 708.84). 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.78 (s, 2H), 6.85 (s, 2H), 5.97 (d, 2H), 5.77 (s, 2H), 5.61-5.53 (m, 2H), 4.75-4.82 (m, 2H), 4.38 (t, 4H), 3.89-4.00 (m, 12H), 3.01-3.08 (m, 2H) 2.46-2.51 (m, 4H), 1.77 (d, 6H OCH3).
((2S,2'S,E)-1,1'-(4,4'-(프로판-1,3- 디일비스 ( 옥시 )) 비스 (5- 메톡시 -2-니트로벤조일)) 비스 (4-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-2,3- 디하이드로 -1H-피롤-2,1- 디 일)) 비스 (메틸렌) 디아세테이트 ( 73 )
무수 디클로로메탄 (40 ㎖) 중의 아세틸 클로라이드 (1.64 ㎖)의 용액을 0℃에서 트리에틸아민 (3.68 ㎖)의 존재 하에, 디클로로메탄 (200 ㎖) 중의 비스 알콜 72 (6.2 g)의 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 반응을 TLC 및 LC/MS에 의해서 모니터링하였다. 일단 반응이 완료되면, 유기상을 물, 시트르산 (0.5 N), 포화 중탄산나트륨 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔; 구배, 60% 에틸 아세테이트/40% 헥산 내지 70% 에틸 아세테이트/30% 헥산)에 적용하였다. 순수한 분획을 합하고, 과량의 용출제를 제거하여 비스-아세테이트 73을 수득하였다 (2.50 g, 36% 수율, LC/MS 3.60 분, m/z ES+ 792.63). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.77 (d, J = 3.4 Hz, 2H), 6.89 (s, 2H), 5.99 (d, J = 15.2 Hz, 2H), 5.78 (s, 2H), 5.65-5.45 (m, J = 15.4, 6.8 Hz, 2H), 5.02-4.86 (m, J = 9.7, 5.5 Hz, 2H), 4.57 (s, 2H), 4.37 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 4.00 (s, 6H), 3.10-2.92 (m, J = 10.7 Hz, 2H), 2.60 (dd, J = 16.3, 3.1 Hz, 2H), 2.52-2.43 (m, 2H), 2.10 (s, 6H), 1.78 (d, J = 6.7 Hz, 4H).
((2S,2'S,E)-1,1'-(4,4'-(프로판-1,3- 디일비스 ( 옥시 )) 비스 (2-아미노-5-메톡시벤조일)) 비스 (4-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-2,3- 디하이드로 -1H-피롤-2,1- 디 일)) 비스 (메틸렌) 디아세테이트 ( 74 )
아연 분말 (10 g)을 에탄올 (20 ㎖) 및 에틸 아세테이트 (20 ㎖) 중의 비스-니트로 화합물 73 (2.5 g)의 용액에 첨가하고, 이어서 에탄올 중의 포름산의 용액 (5% v/v; 100 ㎖)을 첨가하였다. 반응은 온도가 33℃로 상승하는 발열반응이었으며, 온도를 얼음욕에 의해서 15℃로 유도하고, 반응 혼합물을 교반하면서 TLC 및 LC/MS에 의해서 면밀하게 모니터링하였다. 30 분 후에, 흔적량의 출발물질 또는 중간체가 검출되지 않았기 때문에 반응은 완료된 것으로 생각되었다. 혼합물을 경사시키고, 면모를 통해서 여과하였다. 여액을 에틸 아세테이트 (300 ㎖) 및 포화 수성 NaHCO3 (300 ㎖) 사이에 분배시켰다. 유기층을 염수 (200 ㎖)로 더 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 과량의 용매를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 생성물 74를 수득하였다 (2.09 g; 90% 수율, LC/MS 3.35 분, m/z ES+ 732.06). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.76 (s, 2H), 6.45 (s, 2H), 6.33 (s, 2H), 6.12 (d, J = 15.3 Hz, 2H), 5.54 (dq, J = 13.2, 6.6 Hz, 2H), 4.90 (td, J = 9.6, 4.5 Hz, 2H), 4.48 (s, 4H), 4.42-4.33 (m, 4H), 4.23 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 3.79 (s, 6H), 2.95 (dd, J = 16.0, 10.4 Hz, 2H), 2.55 (dd, J = 16.2, 3.5 Hz, 2H), 2.42-2.32 (m, 2H), 2.07 (s, 6H), 1.81 (d, J = 6.6 Hz, 6H).
((S)-1-(4-(3-(4-((S)-2-( 아세톡시메틸 )-4-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-2,3-디하이드로-1H-피롤-1- 카보닐 )-5-((( 알릴옥시 ) 카보닐 )아미노)-2- 메톡시페녹시 )프로폭시)-2-아미노-5- 메톡시벤조일 )-4-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-2,3- 디하이드로 -1H-피롤-2-일) 메틸 ( 75 )
무수 디클로로메탄 중의 알릴 클로로포르메이트의 용액을 -78℃에서 무수 디클로로메탄 중의 비스-아닐린 74 및 피리딘의 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 2 시간 동안 교반한 다음에 실온으로 복귀시켰다. 반응 혼합물을 수성 황산구리 II, 물, 포화 중탄산나트륨 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 진공 하에서 여과하고, 과량의 디클로로메탄을 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하였다. TLC 및 LC/MS는 목적하는 모노 Alloc 생성물 75 및 비스-Alloc 생성물 둘 다의 존재를 나타내었다. 생성물 혼합물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔; 구배 40% 에틸 아세테이트/60% 헥산 내지 70% 에틸 아세테이트/40% 헥산)에 적용하였다. 목적하는 모노 Alloc 생성물 75를 함유하는 순수한 분획을 수거하여 합하고, 과량의 용출제를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 생성물을 수득하였다 (580 ㎖, 25% 수율). LC/MS 3.58 분, ES+ 817.02, 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.60 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.37 (s, 1H), 6.33 (s, 1H), 6.08 (dd, J = 15.4, 6.1 Hz, 2H), 6.00-5.87 (m, 1H), 5.62-5.44 (m, 2H), 5.34 (dd, J = 17.2, 1.4 Hz, 1H), 5.23 (dd, J = 10.4, 1.2 Hz, 1H), 4.88 (qd, J = 9.5, 4.5 Hz, 2H), 4.67-4.57 (m, 2H), 4.50-4.25 (m, 8H), 4.22 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.00-2.85 (m, 2H), 2.58-2.47 (m, 2H), 2.37 (p, J = 6.1 Hz, 2H), 2.06 (s, 6H), 1.81-1.73 (m, 6H).
((2S)-1-(4-(3-(4-((S)-2-( 아세톡시메틸 )-4-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-2,3-디 하이 드로-1H-피롤-1- 카보닐 )-5-((((4-(2-(2-((( 알릴옥시 ) 카보닐 )아미노)-3-메 틸부탄아미 도) 프로판아미도 )벤질) 옥시 ) 카보닐 )아민)-2- 메톡시페녹시 ) 프로 폭시)-2-((( 알릴옥시 ) 카보닐 )아미노)-5- 메톡시벤조일 )-4-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-2,3- 디하이드로 -1H-피롤-2-일) 메틸 아세테이트 ( 76 )
무수 트리에틸아민 (0.206 ㎖)을 불활성 대기 하에서 무수 테트라하이드로푸란 (20 ㎖) 중의 모노-alloc 보호된 비스-아닐린 75 (560 ㎎) 및 트리포스겐 (72 ㎎)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 가열하고, 샘플을 분리하여 메탄올로 처리하였다. LC/MS는 유리 아민 그룹이 반응성 이소시아네이트 중간체로 성공적으로 전환되었음을 시사하는 메틸 카바메이트로의 완전한 전환을 나타내었다. 무수 테트라하이드로푸란 (20 ㎖) 중의 alloc-val-ala-PABOH (381 ㎎) 및 트리에틸아민 (0.14 ㎖)의 용액을 40℃에서 반응 용기 내로 빠르게 주입하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후에 샘플을 분리하여 메탄올로 처리하였다. LC/MS는 모든 이소시아네이트가 소비되었음을 시사하는 것으로 흔적량의 메틸 카바메이트도 나타내지 않았다. 반응 혼합물을 증발 건고시켜 조생성물을 수득하고, 이것을 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔; 구배 클로로포름 내지 2% 메탄올/98% 클로로포름)에 의해서 정제하였다. 순수한 분획을 수거하여 합하고, 과량을 용출제를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 순수한 생성물 76을 수득하였다 (691 ㎎, 84% 수율). LC/MS 3.73 분, ES+1220.21.
알릴 4-(2-(2-((( 알릴옥시 ) 카보닐 )아미노)-3- 메틸부탄아미도 ) 프로판아미 도)벤질 ((S,E)-(프로판-1,3- 디일비스 ( 옥시 )) 비스 (2-((S)-2-( 하이드록시메틸 )-4-((E)-프로프-1-엔-1-일)-2,3- 디하이드로 -1H-피롤-1- 카보닐 )-4- 메톡시 -5,1- 페닐렌 )) 디카바메이트 ( 77 )
탄산칼륨의 수용액 (4.8 ㎖의 물 중의 770 ㎎)을 실온에서 메탄올 (29 ㎖) 중의 비스-아세테이트 76 (680 ㎎)의 용액에 첨가하였다. 탈아세틸화는 LC/MS에 의해서 모니터링된 바와 같이 30 분 이내에 완료되었다. 반응 혼합물을 디클로로메탄 (200 ㎖)으로 희석하고, 유기상을 시트르산 (0.5 N, 100 ㎖), 물 (200 ㎖) 및 염수 (100 ㎖)로 순차적으로 세척하였다. 유기상을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 이 현탁액을 여과하고 (진공 여과), 과량의 용매를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하였다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔; 구배 1.5% 메탄올/98.5% 클로로포름 내지 3.5% 메탄올/96.5% 클로로포름)에 적용하였다. 순수한 분획을 합하고, 과량의 용출제를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 디올 77을 수득하였다 (530 ㎎, 84% 수율). LC/MS 3.40 분, ES+ 1136.49.
(11S,11 aS )-알릴 8-(3-(((11S,11 aS )-10-(((4-((S)-2-((S)-2-((( 알릴옥시 ) 카보닐 )아미노)-3- 메틸부탄아미도 ) 프로판아미도 )벤질) 옥시 ) 카보닐 )-11- 하이 드록시-7- 메톡시 -5-옥소-2-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-5,10,11,11a- 테트라하이드 로- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-11- 하이드록시 -7- 메 톡시-5-옥소-2-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-11,11a- 디하이드로 - 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 ( 78 )
데스-마틴 퍼요오디난 (373 ㎎, 4 당량)을 실온에서 무수 디클로로메탄 (10 ㎖) 중의 77 (250 ㎎) 및 피리딘 (0.36 ㎖, 20 당량)의 용액에 한꺼번에 첨가하였다. TLC (5% 메탄올/클로로포름)에 의한 면밀한 모니터링은 30 분 후에 출발물질의 소실을 나타내었다. 반응을 메타중아황산 나트륨 및 중탄산나트륨의 용액으로 후처리하고, 이어서 염수로 후처리하였다. 디클로로메탄 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 진공 여과하였다. 그 후, 디클로로메탄 용액을 촉매량의 DMAP (c. 10 ㎎)로 처리하여 TLC/LC/MS에 의해서 관찰되는 바와 같이 주생성물 스포트가 하나로 합체하도록 유도하였다. 용액을 여과하고, 디클로로메탄을 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하였다. 생성된 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (실리카겔; 구배 1.5% 메탄올/98.5% 클로로포름 내지 3% 메탄올/97% 클로로포름)에 적용하였다. 순수한 분획을 수거하고, 용출제를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 목적하는 폐환된 생성물 78을 수득하였다 (62 ㎎, 25% 수율). LC/MS 3.35 분, ES+1132.19, ES-1130.25.
(11S,11 aS )-4-((S)-2-((S)-2-아미노-3- 메틸부탄아미도 ) 프로판아미도 )벤질 11- 하이드록시 -7- 메톡시 -8-(3-(((S)-7- 메톡시 -5-옥소-2-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-5,11a- 디하이드로 - 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-2-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-11,11a- 디하이드로 - 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 ( 79 )
Pd(PPh3)4 (1.9 ㎎)를 아르곤 대기 하에서 무수 DCM (3 ㎖) 중의 alloc 화합물 (78) (62 ㎎) 및 피롤리딘 (22.6 ㎕)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 1.5 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출 3% 메탄올/97% 클로로포름 내지 90% 클로로포름/10% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 분말로서 생성물을 제공하였다 (26 ㎎, 50%). LC/MS: RT 2.70 분, MS (ES+) 946.17.
(11S,11 aS )-4-((2S,5S)-25-(2,5- 디옥소 -2,5- 디하이드로 -1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2- 메틸 -4,7,23- 트리옥소 -10,13,16,19- 테트라옥사 -3,6,22- 트리아 자펜타코산아미도)벤질 11- 하이드록시 -7- 메톡시 -8-(3-(((S)-7- 메톡시 -5-옥소-2-((E)-프로프-1-엔-1-일)-5,11a- 디하이드로 - 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 프로폭시 )-5-옥소-2-((E)- 프로프 -1-엔-1-일)-11,11a- 디하이드로 - 피 롤로벤조[ 2,1-c][1,4]디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 ( 80 )
N,N-디이소프로필디에틸아민 (2.6 ㎕)을 무수 DCM (4 ㎖) 중의 아민 디펩타이드 79 (13 ㎎) 및 말레이미드-dPeg®4-NHS 에스테르 (8.5 ㎎)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 반-정제용 TLC (10% 메탄올/90% 클로로포름)에 적용하여 목적하는 말레이미드 14의 순수한 샘플을 수득하였다. LC-MS 체류시간 2.87 분, ES+ 1344.29.
Boc - Val - Cit - PABOH ( 82 )
THF (50 ㎖) 중의 Boc-Val-OSu (10.0 g, 31.8 mmol, 1 당량)의 용액을 THF (50 ㎖) 및 H2O (100 ㎖) 중의 H-Cit-OH (5.85 g, 33.4 mmol, 1.05 당량) 및 NaHCO3 (2.94 g, 34.9 mmoL, 1.1 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 72 시간 동안 교반하고, THF를 감압 하에서 증발시켰다. pH를 시트르산에 의해서 3으로 조정하여 백색 고무질 물질을 침전시켰다. 이것을 10% IPA/에틸 아세테이트 (8 x 150 ㎖)로 추출하고, 추출물을 합하여 염수 (300 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 감압 하에서 증발시켜 백색 포움을 제공하고, 이것을 감압 하에서 18 시간 동안 건조시켰다. 포움을 초음파에 의해서 에테르 중에 현탁시키고, 이어서 여과하여 미세한 백색 분말로서 생성물을 제공하였다 (10.6 g, 89%). DCM/MeOH (100 ㎖/50 ㎖) 중의 이 물질의 일부분 (7.2 g, 19.2 mmol, 1 당량), p-아미노벤질 알콜 (2.6 g, 21.15 mmol, 1.1 당량) 및 EEDQ (9.5 g, 38.5 mmol, 2.0 당량)를 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시키고, 잔류하는 고무질 물질을 초음파 처리에 의해 에테르와 함께 연마하고, 생성된 생성물을 여과에 의해서 수거하고, 감압 하에서 건조시켜 백색 고체로서 생성물 82를 제공하였다 (6.6 g, 71%). 분석 데이터: RT 2.42 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 479.8 ([M + 1]+., 60), MS (ES-) m/z (상대 강도) 477.6 ([M - H])-., 90).
화합물 82의 합성은 이하의 반응식 16에 나타낸다.
[반응식 16]
Figure 112012086532911-pct00141
(( S )-1-(4-((5-(4-(( S )-2-( 아세톡시메틸 )-4- 메틸렌피롤리딘 -1- 카보닐 )-5-((((4-(( S )-2-(( S )-2-((tert-부톡시카보닐)아미노)-3- 메틸부탄아미도 )-5- 우 레이도펜탄아미도)벤질) 옥시 ) 카보닐 )아미노)-2- 메톡시페녹시 ) 펜틸 ) 옥시 )-2-(((알 릴옥 시) 카보닐 )아미노)-5- 메톡시벤조일 )-4- 메틸렌피롤리딘 -2-일) 메틸 아세테이트 ( 83 )
트리에틸아민 (0.14 g, 0.19 ㎖, 1.4 mmol, 2.2 당량)을 아르곤 대기 하에 실온에서 무수 THF (10 ㎖) 중의 모노-alloc 보호된 비스-아닐린 (6) (0.505 g, 0.64 mmol, 1 당량) 및 트리포스겐 (0.068 g, 0.23 mmol, 0.36 당량)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 가열하고, 샘플을 메탄올로 처리하고, LCMS에 의해 메틸 카바메이트로서 분석하였다.
무수 THF/DMF (20 ㎖/1 ㎖) 중의 벤질 알콜 (82) (0.46 g, 0.96 mmol, 1.5 당량) 및 트리에틸아민 (0.096 g, 0.13 ㎖, 0.96 mmol, 1.5 당량)의 용액을 신선하게 제조된 이소시아네이트에 적가하였다. 반응 혼합물을 LC-MS에 의해서 모니터링하였으며, 40℃에서 2 시간 후에 완료되었다. 반응 혼합물을 증발 건고시키고, 잔류물을 10% IPA/DCM과 물 사이에 분배시켰다. 유기성 부분을 분리하여 물 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 갈색 포움을 제공하였다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 클로로포름 내지 93% 클로로포름/1%씩 증가시켜 7% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 고체로서 생성물을 제공하였다 (0.5 g, 60%). 분석 데이터: RT 3.42 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1298 ([M + H]+., 100).
알릴 4-(( S )-2-(( S )-2-(( tert - 부톡시카보닐 )아미노)-3- 메틸부탄아미도 )-5-우 레이도펜탄아미 도)벤질 (( S )-(펜탄-1,5- 디일비스 ( 옥시 )) 비스 (2-(( S )-2-( 하 이드록시메틸)-4- 메틸렌피롤리딘 -1- 카보닐 )-4- 메톡시 -5,1- 페닐렌 )) 디카바메이트 ( 84 )
H2O (2 ㎖) 중의 K2CO3 (0.28 g, 2.0 mmol, 5.4 당량)의 용액을 메탄올 (10 ㎖) 중의 아세테이트 (83) (0.49 g, 0.4 mmol, 1 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 메탄올을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 H2O (10 ㎖)로 희석하고, 1 M 시트르산에 의해서 pH 3으로 산성화시켰다. 혼합물을 DCM (4 x 50 ㎖)으로 추출하고, 추출물을 합하여 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 백색 포움으로서 생성물을 제공하였다 (0.43 g, 94%). 분석 데이터: RT 3.12 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1214 ([M + H]+., 100), MS (ES-) m/z (상대 강도) 1212 ([M - H])-., 100).
(11 S ,11 a S )-알릴 8-((5-(((11 S ,11 a S )-10-(3-(4-(( S )-2-(( S )-2-(( tert - 부 톡시카보닐)아미노)-3- 메틸부탄아미도 )-5- 우레이도펜탄아미도 ) 페닐 ) 프로파노 일)-11- 하이드록시 -7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,10,11,11a- 헥사하이드로 -1H-피 롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제 핀-8-일) 옥시 ) 펜틸 ) 옥시 )-11- 하이드록시 -7- 메 톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a- 테트라하이드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 ( 85 )
안정화된 45wt% 2-요오독시벤조산 (IBX) (0.18 g, 0.29 mmol, 2.4 당량)을 질소 대기 하에서 무수 DMSO (4 ㎖) 중의 비스 탈아세틸화 생성물 (55) (0.147 g, 0.12 mmol, 1 당량)의 용액에 한꺼번에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 26 시간 동안 교반하였다. 추가의 부분의 IBX (15 ㎎, 2.4 x 10-5, 0.2 당량)를 첨가하고, 반응을 추가로 18 시간 동안 계속하였다. 반응 혼합물을 H2O (10 ㎖)로 희석하고, 10% MeOH/DCM (4 x 25 ㎖)으로 추출하고, 추출물을 합하여 포화 중탄산나트륨 수용액 (2 x 100 ㎖), 물 (100 ㎖), 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시켰다 (MgSO4). 용매를 감압 하에서 회전증발에 의해 제거하여 조생성물을 제공하였다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 100% 디클로로메탄 내지 94% 디클로로메탄/1%씩 증가시켜 6% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 고체로서 생성물 85를 제공하였다 (77 ㎎, 53%). 분석 데이터: RT 2.98 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1210 ([M + H]+., 100), MS (ES-) m/z (상대 강도) 1208 ([M - H])-., 100).
(11 S ,11 a S )-알릴 8-((5-(((11 S ,11 a S )-10-(((4-(( S )-2-(( S )-2-아미노-3-메틸부탄아미도)-5- 우레이도펜탄아미도 )벤질) 옥시 ) 카보닐 )-11- 하이드록시 -7- 메 톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,10,11,11a- 헥사하이드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤 조디아제핀-8-일) 옥시 ) 펜틸 ) 옥시 )-11- 하이드록시 -7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 ( 86 )
냉 트리플루오로아세트산 (3 ㎖)을 0℃에서 Boc 보호된 화합물 (85) (72 ㎎, 6.0 x 10-5 mol)에 첨가하였다. 이 용액을 이 온도에서 15 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 상에 붓고, pH를 포화 NaHCO3 용액에 의해서 pH 8로 조정하였다. 이 용액을 DCM (4 x 25 ㎖)으로 추출하고, 추출물을 합하여 포화 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 감압 하에서 증발시켜 백색 고체로서 생성물을 제공하였다 (55 ㎎, 83%). 분석 데이터: RT 2.53 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1110 ([M + H]+., 100), MS (ES-) m/z (상대 강도) 1108 ([M - H])-., 100).
(11 S ,11 a S )-4-(( S )-2-(( S )-2-아미노-3- 메틸부탄아미도 )-5- 우레이도펜탄 아미도)벤질 11- 하이드록시 -7- 메톡시 -8-((5-((( S )-7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a-테 트 라하이드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -8-일) 옥시 ) 펜 틸) 옥시 )-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a- 테트라하이드로 -1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 ( 86 )
Pd(PPh3)4 (2.7 ㎎, 2.3 μmol, 0.03 당량)를 질소 대기 하에서 무수 DCM (3 ㎖) 중의 alloc 화합물 (85) (80 ㎎, 72 μmol, 1.0 당량) 및 피롤리딘 (30 ㎕, 26 ㎎, 0.36 mmol, 5 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 90% 클로로포름/10% 메탄올 내지 76% 클로로포름/24% 메탄올]에 의해서 정제하여 백색 분말로서 생성물을 제공하였다 (62.5 g, 86%). 분석 데이터: RT 2.45 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1008 ([M + H]+., 80).
(11S,11 aS )-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5- 디옥소 -2,5- 디하이드로 -1H-피롤-1-일) 헥산아미도 )-3- 메틸부탄아미도 )-5- 우레이도펜탄아미도 )벤질 11- 하이드록시 -7-메 톡 시-8-((5-(((S)-7- 메톡시 -2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a- 테트라하이드로 -1H-피 롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제 핀-8-일) 옥시 ) 펜틸 ) 옥시 )-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H- 피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀 -10(5H)- 카복실레이트 ( 87 )
N,N-디이소프로필디에틸아민 (12 ㎕, 7.1 x 10-5 mol, 5.0 당량)을 아르곤 대기 하에서 무수 DCM/DMA (2 ㎖/0.2 ㎖) 중의 아민 디펩타이드 (86) (14.2 ㎎, 1.4 x 10-5 mol, 1 당량) 및 6-말레이미드-헥사노산-NHS 에스테르 (4.8 ㎎, 1.55 x 10-5 mol, 1.1 당량)의 용액에 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 72 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 증발시키고, 잔류물을 섬광 칼럼 크로마토그래피 [구배 용출: 클로로포름 내지 93% 클로로포름/1%씩 증가시켜 7% 메탄올]에 의해서 정제하여 회백색 포움으로서 생성물을 제공하였다 (5 ㎎, 29%). 분석 데이터: RT 2.83 분; MS (ES+) m/z (상대 강도) 1201 ([M + H]+., 100 ).
컨주게이션을 위한 ThioMabs 의 환원/산화
CHO 세포에서 발현된 전체 길이 시스테인 조작된 모노클로날 항체 (ThioMabs)를 37℃에서 3 시간 또는 실온에서 밤새, 2 mM EDTA를 함유하는 50 mM 트리스 pH 7.5 중의 약 20-40 배 과량의 TCEP (트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드) 또는 DTT (디티오트레이톨)에 의해서 환원시켰다 [Getz et al (1999) Anal . Biochem . Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA]. 환원된 ThioMab를 희석하고, 10 mM 나트륨 아세테이트 (pH 5) 중의 하이트랩 (HiTrap) S 칼럼 상에 부하시키고, 0.3 M 염화나트륨을 함유하는 PBS로 용출시켰다. 대신으로, 항체를 1/20 배 용적의 10% 아세트산을 첨가하여 산성화시키고, 10 mM 석신이미드 pH 5로 희석하고, 칼럼 상에 부하시킨 다음에, 10 칼럼 용적의 석신이미드 완충액으로 세척하였다. 칼럼을 50 mM 트리스 pH7.5, 2 mM EDTA로 용출시켰다.
용출된 환원된 ThioMab을 200 nM 수성 황산구리 (CuSO4) 또는 15 배 몰과량의 DHAA (데하이드로아스코르빈산)로 처리하였다. 쇄간 디설파이드 결합의 산화반응은 약 3 시간 또는 그 이상 이내에 완료되었다. 주변 공기 산화도 또한 효과적이다. 재-산화된 항체를 20 mM 나트륨 석시네이트 pH 5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA 내로 투석하고, -20℃에서 동결 저장하였다.
항체-약물 컨주게이트를 제조하기 위한 ThioMabs 와 약물-링커 화합물의 컨주게이션
상술한 바와 같이 재산화된 ThioMabs를 혼합된 2.5 내지 10 배 과량의 약물-링커 중간체 (15 ba, 15 bb, 15d, 58)와 조합하고, 실온에서 약 1 시간 동안 정치시켜 컨주게이션을 일으키고 표 1에서의 ThioMab 항체-약물 컨주게이트 101-115를 형성시켰다. 컨주게이션 혼합물을 겔여과, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 투석에 의해서 정제하여 과량의 약물-링커 중간체 및 그 밖의 다른 불순물을 제거하였다.
[표 1]
Figure 112012086532911-pct00142
Figure 112012086532911-pct00143
Tr = 티오 트라스투주맙, 안티 HER2, 4D5 HC A118C (일련 번호), A114C (카바트 (Kabat) 번호)
imp = N-10 이민 보호됨: 3-(2-메톡시에톡시)프로파노에이트-Val-Ala-PAB-
특히, 약물-링커 중간체 15d (MW 1496.65)를 DMA (디메틸아세트아미드)에 20 mM의 농도로 가용화시켰다. 재-산화된 시스테인 조작된 H118C 트라스투주맙 항체 (Tr)를 해동시키고, 3 배 몰과량의 15d를 첨가하였다. 실험이 더 높은 pH에서 증가된 항체 응집을 나타낸 후에, 반응은 pH 5에서 수행되었다. 약물 컨주게이션의 정도는 LC-MS 분석에 의해서 모니터링하였다. 추가로 1-배 당량의 15d를 3 시간 후에 첨가하고, 반응을 4℃에서 밤새 진행시켜 조 ADC 114를 제공하였다.
그 후, 항체-약물 컨주게이트인 트라스투주맙-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 114를 석시네이트로 희석한 후에 양이온 칼럼에 적용하고, 적어도 10 칼럼 용적의 석시네이트로 세척하고, PBS로 용출시켰다. 항체-약물 컨주게이트 114를 겔여과 칼럼을 사용하여 20 mM His/아세테이트 pH 5, 240 mM 슈크로즈 내에서 제제화하였다. 항체-약물 컨주게이트 114를 단백질 농도를 결정하기 위한 UV 분광법, 응집 분석을 위한 분석용 SEC (크기-배제 크로마토그래피) 및 약물 부하를 결정하기 위한 환원 전후의 LC-MS에 의해서 특정화하였다.
크기 배제 크로마토그래피는 0.25 mM 염화칼륨 및 15% IPA를 함유하는 0.2 M 인산칼륨 pH 6.2 중에서 쇼덱스 (Shodex) KW802.5 칼럼을 사용하여 0.75 ㎖/분의 유속으로 수행하였다. 컨주게이트의 응집 상태는 280 ㎚에서 용출된 피크 면적 흡광도의 적분에 의해서 결정되었다. SEC 분석은 8.08 분에서 응집된 ADC의 적분된 면적으로 4.1%, 및 8.99 분에서 95.9% 모노머 ADC 114를 나타내었다.
LC-MS 분석은 애질런트 (Agilent) QTOF 6520 ESI 기기를 사용하여 수행하였다. 예로서, 114 트라스투주맙-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD를 DTT (디티오트레이톨)로 환원시키고, 80℃로 가열된 1000 Å, 8 ㎛ PLRP-S 칼럼 (Varian) 상에 부하시키고, 5 분 동안에 30% B 내지 40% B의 구배로 용출시켰다. 이동상 A는 0.05% TFA를 함유하는 H2O였고, 이동상 B는 0.04% TFA를 함유하는 아세토니트릴이었다. 유속은 0.5 ㎖/분이었다. 단백질 용출은 전기분무 이온화 (electrospray ionization) 및 TOF 분석 전에 A 280 ㎚에서 UV 흡광도 검출에 의해서 모니터링하였다. 노출된 (naked) 경쇄, 잔류하는 노출된 중쇄 및 약물화된 (drugged) 중쇄의 기준선 (baseline) 크로마토그래피 분할이 달성되었다. 수득된 m/z 스펙트럼을 애질런트 매스 헌터 (Agilent Mass Hunter; TM) 소프트웨어를 사용해서 디컨볼루션 (deconvolution)하여 환원된 항체 단편의 질량을 계산하였다.
MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 58의 분자량 (MW) (도 1) = 1964 달톤
관찰된 디컨볼루션 질량:
23440 달톤은 노출된 LC의 MW에 해당한다
50627 달톤은 노출된 HC의 MW에 해당한다
52591 달톤은 약물화된 HC의 MW에 해당한다
따라서, 52591 달톤에서 관찰된 피크는 하나의 약물 부분인 약물-링커 중간체 58 (1964 달톤)을 갖는 예상되는 중쇄 (HC) 단편 (50627 달톤)에 해당한다.
PBD 약물-링커 중간체에 대한 컨주게이션을 위한 항체가 시스테인-조작된 항체가 아닌 경우에, 쇄간 디설파이드 결합은 37℃에서 2 시간 동안 포스페이트 pH 7.5 내에서 약 2.2 몰과량의 TCEP를 첨가함으로써 부분적으로 환원된다. 각 당량의 TCEP는 이론적으로 2 개의 반응성 시스테인을 제공한다. 약 3.5의 표적 약물/항체 비 (DAR)의 경우에는 전형적으로, 1.8-2 몰과량의 TCEP가 첨가된다. 환원 후에 정제단계는 전형적으로 필요하지 않다. 반응성 시스테인에 대한 약간 과량 (1.2-1.5 X)의 약물-링커 중간체, 항체에 대한 약 8 몰당량의 약물-링커 중간체를 첨가하고, 반응은 실온에서 약 1 시간 동안 수행한다. 정제는 투석여과, 이온교환 또는 겔여과에 의해서 수행될 수 있다. DAR은 UV A280 면적 적분을 사용하여 소수성-상호작용 크로마토그래피 (HIC), 또는 환원된 컨주게이트의 LC-MS에 의해서 결정될 수 있다.
시험관내 세포 증식시험
ADC의 효능은 다음의 프로토콜을 사용하는 세포 증식시험에 의해서 측정하였다 [CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al (2002) Cancer Res. 62:5485-5488]:
1. 배지 내에 약 104 세포 (예를 들어, KPL-4, 인간 유방암 세포주, Kurebayashi et al (1999) Brit. Jour. Cancer 79(5-6):707-717), SKBR-3, BT474, MCF7 또는 MDA-MB-468)를 함유하는 세포 배양액의 100 ㎕의 분취액을 96-웰의 불투명한 벽이 있는 플레이트의 각각의 웰에 침적시켰다.
2. 배지를 함유하고 세포가 없는 대조 웰을 준비하였다.
3. ADC를 실험 웰에 첨가하고, 3-5일 동안 배양하였다.
4. 플레이트를 약 30 분 동안 실온으로 평형화시켰다.
5. 각 웰에 존재하는 세포 배양 배지의 용적에 해당하는 용적의 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo) 시약을 첨가하였다.
6. 내용물을 궤도 진탕기 (orbital shaker) 상에서 2 분 동안 혼합시켜 세포 용해를 유도하였다.
7. 플레이트를 실온에서 10 분 동안 배양하여 발광 시그날을 안정화시켰다.
8. 발광을 RLU = 상대 발광 유니트로서 기록하고 그래프에 보고하였다.
특정의 세포를 96-웰 플레이트 (50 ㎕/웰) 내에 1000-2000/웰 또는 2000-3000/웰로 접종하였다. 1 또는 2일 후에, ADC를 9000, 3000, 1000, 333, 111, 37, 12.4, 4.1, 또는 1.4 ng/㎖의 최종 농도까지 50 ㎕ 용적으로 첨가하며, "no ADC" 대조 웰은 배지만을 단독으로 수용한다. 조건은 이중 또는 삼중으로 한다. 3-5일 후에, 100 ㎖/웰의 셀타이터 글로 (Cell TiterGlo) II를 첨가하고 (루시퍼라제-기본 시험; ATP 레벨에 의해서 측정된 증식), 세포수를 발광측정기 (luminometer)를 사용하여 결정한다. 데이터는 표준편차 오차 막대 (error bar)와 함께 중복된 각각의 세트에 대한 발광의 평균으로 도시한다. 프로토콜은 셀타이터 글로 발광 세포 생존도 시험 (CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega))의 변형이다:
1. 50 ㎕/웰의 FBS/글루타민 배지 내에 1000 세포/웰을 플레이팅한다. 세포는 밤새 부착되도록 한다.
2. ADC를 18 ㎍/㎖ (이것은 9 ㎍/㎖의 최종 농도를 제공한다)의 작업 농도에서 시작하여 배지 내에서 1:3 계열희석한다. 50 ㎕의 희석된 ADC를 웰 내에 이미 있는 50 ㎕의 세포 및 배지에 첨가한다.
3. 72-96 시간 동안 배양한다 (표준은 72 시간이지만, 0 ㎍/㎖ 농도를 관찰하여 세포가 85-95% 합류한 (confluent) 때에 시험을 중지시킨다).
4. 100 ㎕/웰의 프로메가 셀타이터 글로 (Promega Cell Titer Glo) 시약을 첨가하고, 3 분 동아 진탕하고, 발광측정기 상에서 판독한다.
결과
도 2는 다음 물질의 농도에 대비하여 5일째에 SK-BR-3 시험관내 세포 생존도의 플롯 (plot)을 나타낸다: Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101 (●), 안티CD22-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 102 (▲), Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103 (◆), 및 안티CD22-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 104 (여기에서 Tr은 안티 HER2 티오 트라스투주맙 4D5 HC A118C이며, 중쇄 시스테인 조작된 항체 돌연변이체는 일련 번호 방식으로 번호를 매긴다).
HER2 발현 SK-BR-3 세포의 증식은 안티HER2 항체-약물 컨주게이트 101 및 103에 의해서 선택적으로 억제되지만, 안티CD22 항체-약물 컨주게이트 102 및 104에 의해서는 억제되지 않는다. 이들 결과는 PBD 항체-약물 컨주게이트의 시험관내에서의 표적-의존적인 선택적 치사효과 (killing effect)를 확인한다.
도 3은 다음 물질의 농도에 대비하여 5일째에 KPL-4 시험관내 세포 생존도의 플롯을 나타낸다: Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101 (●), 안티CD22-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 102 (▲), Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103 (◆), 및 안티CD22-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 104 (▼) (여기에서 Tr은 안티 HER2 티오 트라스투주맙 4D5 HC A118C이며, 중쇄 시스테인 조작된 항체 돌연변이체는 일련 번호 방식으로 번호를 매긴다).
항체-약물 컨주게이트인 트라스투주맙-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 114 및 트라스투주맙-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 115를 SK-BR-3, KPL-4, 및 MCF-7 [Levenson et al (1997) Cancer Res . 57(15):3071-3078] 세포에 대해서 시험하여 5일 시험에서 시험관내 세포 생존도를 측정하였다. 114의 IC50 (㎍/㎖) 값은 SK-BR-3에 대해서는 17.2이고, KPL-4에 대해서는 68.1이었다. 115의 IC50 값은 SK-BR-3에 대해서는 12.3이고, KPL-4에 대해서는 50.7이었다. 114 및 115 둘 다는 HER2 비-발현성 인간 유방선암 세포주인 MCF-7에 대해서는 효과적으로 불활성이었다. 따라서, 컨주게이트 114 및 115는 표적화된 세포 치사효력을 입증한다.
종양 성장 억제, 고발현성 HER2 유전자이식 외식편 마우스에서의 생체내 효능
유전자이식 실험에 적합한 동물은 Taconic (Germantown, N.Y.)과 같은 표준 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 다수의 스트레인이 적합하지만, FVB 암컷 마우스가 그들의 종양 형성에 대한 더 큰 감수성으로 인하여 바람직하다. FVB 수컷을 교배를 위해서 사용하였으며, 정관절제수술을 한 CD.1 스터드 (studs)를 사용하여 가임신을 자극하였다. 정관절제수술을 한 마우스는 어떤 상업적 공급자로부터라도 수득할 수 있다. 파운더 (founders)를 FVB 마우스 또는 129/BL6 x FVB p53 이형접합성 (heterozygous) 마우스와 교배하였다. p53 대립유전자에서 이형접합성을 갖는 마우스를 사용하여 종양 형성을 잠재적으로 증가시켰다. 그러나, 이것은 불필요한 것으로 판명되었다. 따라서, 일부의 F1 종양은 혼합 스트레인의 것이다. 파운더 종양은 FVB만이다. 동배자 (litters)를 갖지 않고 약간의 발육성 종양을 갖는 6 개의 파운더가 수득되었다.
종양 (Fo5 mmtv 유전자이식 마우스로부터 번식된 동종이식편)을 갖는 동물을 ADC의 IV 주사에 의해서 단일 또는 수회 용량으로 처리하였다. 종양 용적은 주사 후의 다양한 시점에 평가하였다.
종양은 neu의 돌연변이적으로 활성화된 형태, HER2의 랫트 동족체는 유전자이식 마우스에서 쉽게 발생하지만, 인간 유방암에서 과발현되는 HER2는 돌연변이되지 않고, 종양 형성은 비돌연변이된 HER2를 과발현하는 유전자이식 마우스에서 훨씬 덜 왕성하다 [Webster et al (1994) Semin . Cancer Biol . 5:69-76].
비돌연변이된 HER2에 의한 종양 형성을 개선시키기 위해서, 다른 식으로는 HER2의 진정한 하류 개시 코돈으로부터의 해독 개시의 빈도를 감소시킬 수 있는 상류 ATG 개시 코돈에서의 해독의 개시를 방지하기 위해서 상류 ATG가 결실된 HER2 cDNA 플라스미드를 사용하여 유전자이식 마우스를 생산하였다 [예를 들어, Child et al (1999) J. Biol . Chem . 274: 24335-24341 참조]. 추가로, 더 이전에 보고된 바와 같이 발현의 레벨을 또한 증진시켜야 하는 키메릭 인트론 (chimeric intron)을 5' 말단에 첨가하였다 [Neuberger and Williams (1988) Nucleic Acids Res . 16:6713; Buchman and Berg (1988) Mol . Cell . Biol. 8:4395; Brinster et al (1988) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:836]. 키메릭 인트론은 프로메가 (Promega) 벡터, Pci-neo 포유동물 발현 벡터 (bp 890-1022)로부터 유도되었다. cDNA 3'-말단은 인간 성장 호르몬 엑손 4 및 5, 및 폴리아데닐화 서열의 측면에 둔다. 또한, FVB 마우스가 종양 발생에 더 감수성이 있기 때문에, 이 스트레인이 사용되었다. MMTV-LTR로부터의 프로모터를 사용하여 유선에서의 조직-특이적 HER2 발현을 보장하였다. 동물에게는 종양 형성에 대한 감수성을 증가시키기 위해서 AIN 76A 다이어트를 급여하였다 [Rao et al (1997) Breast Cancer Res . and Treatment 45:149-158].
Fo5 쥐 유방 종양 모델
Fo5 모델은 쥐 유방 종양 바이러스 프로모터 (MMTV-HER2)의 전사조절 하에 인간 HER2 유전자가 유방 상피에서 과발현되는 유전자이식 마우스 모델이다. 상기의 과발현은 인간 HER2 수용체를 과발현하는 유방 종양의 자발적인 발생을 야기한다. 파운더 동물 중의 하나 (파운더 #5 [Fo5])의 유방 종양을 종양 단편의 일련의 이식에 의해서 FVB 마우스의 후속 세대에 전파하였다. 생체내 효능시험에 사용하기 전에, MMTV-HER2 Fo5 유전자이식 유방 종양을 대략 2×2 ㎜로 측정된 단편으로 nu/nu 마우스 (Charles River Laboratories로부터)의 No. 2/3 유방 지방 패드 (mammary fat pad) 내로 수술에 의해 이식하였다. 종양이 바람직한 용적에 도달하면, 종양-보유 마우스를 무작위로 분류하고, ADC의 IV 주사에 의해 단일 용량을 제공하였다.
결과
도 4는 다음의 물질로 제0일에 단일 iv 투여한 후에, CRL nu/nu 마우스 내에 접종된 유방암-모델 MMTV-HER2 Fo5 유방 동종이식편 종양에서 시간의 경과에 따른 생체내 종양 용적 변화의 플롯을 나타낸다: (1) 비히클 20 mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240 mM 슈크로즈, (2) 10 ㎎/㎏의 안티Steap1-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 107, (3) 10 ㎎/㎏의 안티Steap1-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 108, (4) 10 ㎎/㎏의 Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101, 및 (5) 10 ㎎/㎏의 Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103. 도면에서 선은 다음의 심볼로 표시된다:
Figure 112012086532911-pct00144
안티-HER2 컨주게이트 101 및 103은 표적-특이적 종양 성장 억제를 나타내었다. 컨주게이트 101로 처리된 10 마리의 동물로부터 2 마리는 부분적인 반응을 나타내었다. 컨주게이트 103으로 처리된 10 마리의 동물로부터 3 마리는 부분적인 반응을 나타내었다. 비-표적화된 대조군 ADC 107 및 108는 종양 성장에 대해서 효과가 없었다.
또 다른 예시적 시험에서는, CRL nu/nu 마우스에게 접종된 유방암-모델 MMTV-HER2 Fo5 유방 동종이식편 종양에서 시간의 경과에 따른 생체내 평균 종양 용적 변화는 다음의 물질로 제0일에 단일 iv 투약한 후에 측정하였다: (1) 비히클 20 mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240 mM 슈크로즈; (2) 5 ㎎/㎏ (ADC 용량), 300 ㎍/㎡ (PBD 약물 노출)로 112 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD; (3) 10 ㎎/㎏, 600 ㎍/㎡로 112 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD; (4) 5 ㎎/㎏, 284 ㎍/㎡로 114 트라스투주맙-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD; (5) 10 ㎎/㎏, 569 ㎍/㎡로 114 트라스투주맙-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD; (6) 10 ㎎/㎏, 807 ㎍/㎡로 113 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD; 및 (7) 10 ㎎/㎏, 790 ㎍/㎡로 115 트라스투주맙-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD. 종양 크기는 0, 3, 7, 및 10일에 측정하였다. 10일 후에, 동물에게 다음으로 투약하였다: (1) 비히클은 10 마리의 동물 그룹에서 종양 크기 증가를 나타내고, 종양 억제를 나타내지 않았다; (2) 112는 10 마리의 동물 그룹에서 부분적이거나 완전한 반응을 나타내지 않았다; (3) 112는 10 마리의 동물 그룹에서 부분적이거나 완전한 반응을 나타내지 않았다; (4) 114는 10 마리의 동물 그룹에서 9 개의 부분적인 반응을 나타내었다; (5) 114는 10 마리의 동물 그룹에서 10 개의 부분적인 반응을 나타내었다; (6) 113은 10 마리의 동물 그룹에서 부분적이거나 완전한 반응을 나타내지 않았다; 및 (7) 115는 10 마리의 동물 그룹에서 10 개의 부분적인 반응을 나타내었다. 따라서, 안티HER2 표적화된 ADC 114 및 115는 표적화된 종양 억제를 나타내는 반면에, 음성 대조군인 비히클 및 비-표적화된 ADC 112 및 113은 그렇지 않았다.
LuCap35V 인간 전립선 종양 모델
워싱턴 대학 (University of Washington, Seattle, WA)으로부터 수득한 LuCap35V는 LuCap35 인간 전립성 외식편 종양 모델의 안드로겐-비의존성 변이체이다 [Corey E, Quinn JE, Buhler KR, et al. LuCap35: 안드로겐 비의존성으로 진행된 전립선암의 새로운 모델. The Prostate 2003;55:239-46]. LuCap35를 정착시키기 위해서 사용된 조직을 전이성 전립선암을 함유하는 서혜부 림프절의 생검물로부터 분리시키고, 이어서 마우스의 옆구리에 이식하였다 [Corey et al. 2003]. LuCap35V 외식편 모델은 워싱턴 대학에서는 38 계대동안 거세된 수컷 C.B-17 폭스 체이스 (Fox Chase) SCID 마우스에서, 이어서 Genentech에서는 계속된 계대동안 Charles River Laboratories로부터 입수한 거세된 수컷 C.B-17 SCID-베이지 마우스에서 계열 이식함으로써 유지시켰다. 생체내 효능시험에 사용하기 전에, LuCap35V 종양 조각 (약 20-30 ㎣)을 거세된 수컷 C.B-17 SCID-베이지 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 동물은 종양 이식하기 2 주일 전에 거세하여 잔류 테스토스테론 레벨이 0에 도달하도록 하였다. 종양이 원하는 용적에 도달하면, 종양-보유 마우스를 무작위로 분류하고, ADC의 IV 주사에 의해 단일 용량을 제공하였다.
결과
도 5는 (1) 비히클 20 mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240 mM 슈크로즈 (▲), (2) 5 ㎎/㎏의 안티CD22-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 110 (●), 및 (3) 5 ㎎/㎏의 안티Steap1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 109 (■)로 제0일에 단일 iv 투약한 후의 거세된 수컷 SCID 베이지 마우스에서의 전립선암-모델 LuCap35V 이종이식 종양에서 시간의 경과에 따른 생체내 평균 종양 용적 변화의 플롯을 나타낸다.
도 6은 (1) 비히클 20 mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240 mM 슈크로즈 (▲) (2) 9.8 ㎎/㎏, 60 ㎍/㎡의 107 안티Steap1-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD (■), (3) 19.5 ㎎/㎏, 120 ㎍/㎡의 107 안티Steap1-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD (●), (4) 3.3 ㎎/㎏, 60 ㎍/㎡의 108 안티Steap1-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD (□), (5) 6.5 ㎎/㎏, 120 ㎍/㎡의 108 안티iSteap1-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD (○), (6) 9.4 ㎎/㎏, 120 ㎍/㎡의 105 트라스투주맙-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD (◆) 및 (7) 8.6 ㎎/㎏ (ADC 용량), 120 ㎍/㎡ (PBD 약물 노출)의 106 트라스투주맙-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD (X)로 제0일에 단일 iv 투약한 후의 거세된 수컷 SCID 베이지 마우스에서의 전립선암-모델 LuCap35V 이종이식 종양에서 시간의 경과에 따른 생체내 평균 종양 용적 변화의 플롯을 나타낸다.
또 다른 예시적 시험에서, 거세된 수컷 SCID 베이지 마우스 내의 전립선암-모델 LuCap35V 이종이식 종양에 있어서 시간의 경과에 따른 생체내 평균 종양 용적 변화는 (1) 비히클 20 mM 히스티딘 아세테이트, pH 5.5, 240 mM 슈크로즈, (2) 3 ㎎/㎏ (ADC 용량), 68.3 ㎍/㎡ (PBD 약물 노출)의 112 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD, (3) 1 ㎎/㎏, 22.15 ㎍/㎡의 111 안티Steap1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD, (4) 3 ㎎/㎏, 66.4 ㎍/㎡의 111 안티Steap1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD, (5) 3 ㎎/㎏, 70.1 ㎍/㎡의 113 gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD, 및 (6) 3 ㎎/㎏, 64.6 ㎍/㎡의 109 안티Steap1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD으로 제0일에 단일 iv 투약한 후에 측정하였다. 종양 크기는 매 4일마다 측정하였다. 27일 후에, 동물에게 다음으로 투여하였다: (1) 비히클은 8 마리의 동물 그룹에서 종양 크기의 증가를 나타내고 종양 억제를 나타내지 않았다; (2) 112는 8 마리의 동물 그룹 중에서 하나의 부분적인 반응을 나타내었다; (3) 111은 6 마리의 동물 그룹에서 4 개의 부분적인 반응 및 4 개의 완전한 반응을 나타내었다; (4) 111은 5 마리의 동물 그룹에서 5 개의 부분적인 반응 및 3 개의 완전한 반응을 나타내었다; (5) 113은 8 마리의 동물 그룹에서 부분적이거나 완전한 반응을 나타내지 않았다; 및 (6) 109는 7 마리의 동물 그룹에서 7 개의 부분적인 반응 및 하나의 완전한 반응을 나타내었다. 안티Steap1 표적화된 ADC 109 및 111은 표적화된 종양 억제를 나타내는 반면에, 음성 대조 비히클 및 비-표적화된 ADC 112 및 113은 그렇지 않았다 .
약어
Ac 아세틸
Acm 아세트아미도메틸
Alloc 알릴옥시카보닐
Boc 디-tert-부틸 디카보네이트
t-Bu tert-부틸
Bzl 벤질, 여기에서 Bzl-OMe은 메톡시벤질이고, Bzl-Me는 메틸벤젠이다.
Cbz 또는 Z 벤질옥시-카보닐, 여기에서 Z-Cl 및 Z-Br은 각각 클로로- 및 브로모벤질옥시 카보닐이다.
DMF N,N-디메틸포름아미드
Dnp 디니트로페닐
DTT 디티오트레이톨
Fmoc 9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐
imp N-10 이민 보호 그룹: 3-(2-메톡시에톡시)프로파노에이트-Val-Ala-PAB
MC-OSu 말레이미도카프로일-O-N-석신이미드
Moc 메톡시카보닐
MP 말레이미도프로판아미드
Mtr 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠설포닐
PAB 파라-아미노벤질옥시카보닐
PEG 에틸렌옥시
PNZ p-니트로벤질 카바메이트
Psec 2-(페닐설포닐)에톡시카보닐
TBDMS tert-부틸디메틸실릴
TBDPS tert-부틸디페닐실릴
Teoc 2-(트리메틸실릴)에톡시카보닐
Tos 토실
Troc 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐 클로라이드
Trt 트리틸
Xan 크산틸
참고문헌
다음의 참고문헌들이 온전히 참고로 포함된다:
Figure 112012086532911-pct00145
Figure 112012086532911-pct00146
Figure 112012086532911-pct00147
Figure 112012086532911-pct00148
Figure 112012086532911-pct00149
Figure 112012086532911-pct00150
Figure 112012086532911-pct00151
Figure 112012086532911-pct00152
Figure 112012086532911-pct00153
Figure 112012086532911-pct00154

Claims (77)

  1. 링커 부분 (L)에 의해서 세포 결합제(CBA, cell binding agent)에 연결된 피롤로벤조디아제핀(PBD, pyrrolobenzodiazepine) 약물 부분 (D)을 포함하는 컨주게이트로서, 화학식 AB 또는 AC를 가지는 컨주게이트, 또는 그의 염, 또는 용매화물:
    Figure 112016124659514-pct00185

    또는
    Figure 112016124659514-pct00186

    상기 식에서,
    점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중결합의 존재 또는 부재를 나타내며;
    R2는 H, =CH2, R, =CH-RD, 및 =C(RD)2로부터 독립적으로 선택되고;
    여기에서 RD는 R이고;
    R6 및 R9는 H이며;
    R7은 C1-4 알콕시기이고;
    R10은 링커 부분(L)이 세포 결합제(CBA)에 연결된, 다음 구조를 가지는 그룹이고:
    Figure 112016124659514-pct00202

    여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고,
    CBA는 종양 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로부터 선택되는 세포 결합제이며,
    링커 부분(L)은 다음 구조를 가지며:
    Figure 112016124659514-pct00203

    L1은 표적 암 세포에 존재하는 효소의 작용에 의해 분해가능한 아미노산 서열이고,
    A는 L1을 세포 결합제에 연결하는 연결 그룹이며, 하기 (i) 및 (ii)로부터 선택되고:
    (i)
    Figure 112016124659514-pct00204

    (여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내며, n은 0 또는 6이다); 및
    (ii)
    Figure 112016124659514-pct00205

    (여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 세포 결합제에 대한 부착점을 나타내며, n은 0 또는 1이고, m은 0 내지 30이다),
    L2는 공유 결합이거나, -OC(=O)-와 함께 하기 구조를 갖는 자체-희생적 링커를 형성하며:
    Figure 112016124659514-pct00206

    (여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L1에 대한 부착점을 나타내며, Y는 NH, O, C(=O)NH 또는 C(=O)O이고, n은 0 내지 3이다);
    Q는 O, S 및 NH로부터 독립적으로 선택되며;
    R11은 H 또는 C1-7 알킬이거나, Q가 O인 경우에는 SO3M이고, 여기에서 M은 금속 양이온이며;
    R 및 R'는 각각 독립적으로 C1-12 알킬, N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 가지는 C3-20　헤테로사이클릴 및 C5-20 아릴 그룹(여기서, 상기 C5-20 아릴 그룹은 하나 이상의 C1-4 알콕시 또는 할로에 의해 치환 또는 비치환됨)으로부터 선택되고;
    R"는 C3-12 알킬렌 그룹이며;
    각각의 X는 O, S 또는 N(H)이며;
    R2", R6", R7", R9",X", Q" 및 R11"는 각각 R2, R6, R7, R9, X, Q 및 R11에 따라 정의되며, RC는 하기 구조를 가지는 캡핑(capping) 그룹이다:
    Figure 112016124659514-pct00207

    (여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, G2는 카바메이트 보호기이며, L3은 공유 결합이거나, 표적 암 세포에 존재하는 효소의 작용에 의해 분해가능한 아미노산 서열이고, L2는 공유결합이거나, OC(=O)와 함께 하기 구조를 가지는 자체-희생적 링커를 형성한다:
    Figure 112016124659514-pct00208

    여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L2에 대한 부착점을 나타내며, Y는 NH, O, C(=O)NH 또는 C(=O)O이고, n은 0 내지 3이다).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, R10에서 L1이 디펩타이드이고, 디펩타이드 -NH-X1-X2-CO- 내의 그룹 -X1-X2-가 다음으로부터 선택되는 컨주게이트:
    -Phe-Lys-,
    -Val-Ala-,
    -Val-Lys-,
    -Ala-Lys-,
    -Val-Cit-,
    -Phe-Cit-,
    -Leu-Cit-,
    -Ile-Cit-,
    -Phe-Arg-,
    -Trp-Cit-.
  5. 제 4항에 있어서, 디펩타이드 -NH-X1-X2-CO- 내의 그룹 -X1-X2-가 -Phe-Lys-, -Val-Ala- 또는 -Val-Cit-인 컨주게이트.
  6. 제 4항에 있어서, 그룹 X2-CO-가 L2에 연결되고, 그룹 NH-X1-이 A에 연결되는 컨주게이트.
  7. 제 4항에 있어서, R10에서 L2가 OC(=O)와 함께 다음의 그룹을 형성하는 컨주게이트:
    Figure 112016124659514-pct00209

    여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L1에 대한 부착점을 나타내며, Y는 NH, O, C(=O)NH 또는 C(=O)O이고, n은 0 내지 3이다).
  8. 제 5항에 있어서, R10에서 C(=O)O 및 L2가 함께 다음의 그룹을 형성하는 컨주게이트:
    Figure 112016124659514-pct00158

    여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L1에 대한 부착점을 나타내며, Y는 NH, O, C(=O)NH 또는 C(=O)O이고, n은 0 내지 3이다.
  9. 제 7항에 있어서, Y가 NH이고, n이 0인 컨주게이트.
  10. 제 1항에 있어서, L1 및 L2가 -OC(=O)-와 함께 다음으로부터 선택된 그룹을 포함하는 컨주게이트:
    Figure 112016124659514-pct00159

    여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 A에 대한 부착점을 나타낸다.
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서, 상기 세포 결합제가 적어도 하나의 시스테인 티올 잔기를 가지는 종양 특이적 항체이고, 상기 항체는 상기 항체의 시스테인 티올 잔기와 A의 말레이미드 그룹으로부터 형성된 티오에테르 결합을 통해서 A에 연결된 컨주게이트.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 1항에 있어서, R7이 독립적으로 OMe인 컨주게이트.
  17. 제 1항에 있어서, X가 O인 컨주게이트.
  18. 제 1항에 있어서, R11이 H인 컨주게이트.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 점선이 C2와 C3 사이의 이중 결합의 존재 또는 부재를 나타내는 컨주게이트.
  20. 제 1항에 있어서, R2가 =CH2, R 및 =CH-RD로부터 독립적으로 선택되는 컨주게이트.
  21. 제 20항에 있어서, R2가 독립적으로 =CH2인 컨주게이트.
  22. 제 20항에 있어서, R2가 독립적으로 하나 이상의 C1-4 알콕시 또는 할로에 의해 치환 또는 비치환된 C5-20 아릴인 컨주게이트.
  23. 제 1항에 있어서, R"가 C3 알킬렌 그룹 또는 C5 알킬렌 그룹인 컨주게이트.
  24. 삭제
  25. 제 1항에 있어서, RC가 다음으로부터 선택된 카바메이트 보호 그룹인 컨주게이트:
    Alloc (알릴옥시카보닐);
    Fmoc (9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐);
    Boc (디-tert-부틸옥시 디카보닐);
    Troc (2,2,2-트리클로르에톡시카보닐);
    Teoc (2-(트리메틸실릴)에톡시카보닐);
    Psec (2-(페닐설포닐)에톡시카보닐);
    Cbz (벤질옥시-카보닐); 및
    PNZ (p-니트로벤조일 카보닐).
  26. 제 1항에 있어서, L3이 디펩타이드이고, 디펩타이드 -NH-X1-X2-CO- 내의 그룹 -X1-X2-가 다음으로부터 선택되는 컨주게이트:
    -Phe-Lys-,
    -Val-Ala-,
    -Val-Lys-,
    -Ala-Lys-,
    -Val-Cit-,
    -Phe-Cit-,
    -Leu-Cit-,
    -Ile-Cit-,
    -Phe-Arg-,
    -Trp-Cit-.
  27. 제 26항에 있어서, 디펩타이드 -NH-X1-X2-CO- 내의 그룹 -X1-X2-가 -Phe-Lys-, -Val-Ala- 또는 -Val-Cit-인 컨주게이트.
  28. 제 1항에 있어서, RC에서 L2가 OC(=O)와 함께 다음의 그룹을 형성하는 컨주게이트:
    Figure 112016124659514-pct00210

    여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L2에 대한 부착점을 나타내며, Y는 NH, O, C(=O)NH 또는 C(=O)O이고, n은 0 내지 3이다.
  29. 제 1항에 있어서, G2가 Ac(아세틸) 또는 Moc(메톡시카보닐)이거나, 다음으로부터 선택된 카바메이트 보호 그룹인 컨주게이트:
    Alloc (알릴옥시카보닐);
    Fmoc (9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐);
    Boc (디-tert-부틸옥시 디카보닐);
    Troc (2,2,2-트리클로르에톡시카보닐);
    Teoc (2-(트리메틸실릴)에톡시카보닐);
    Psec (2-(페닐설포닐)에톡시카보닐);
    Cbz (벤질옥시-카보닐); 및
    PNZ (p-니트로벤조일 카보닐).
  30. 제 1항에 있어서, 치료법에 사용하기 위한 컨주게이트.
  31. 제 1항에 있어서, 대상체에서 암인 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 컨주게이트.
  32. 하기 화학식을 갖는 컨주게이트:
    Figure 112016124659514-pct00211

    여기에서 Ab는 링커 부분 (L)에 의해서 화학식 (AB) 또는 (AC) PBD(피롤로벤조디아제핀, pyrrolobenzodiazepine) 약물 부분 (D)에 부착된 종양 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, p는 1 내지 8의 정수이고, 화학식 AB 또는 AC의 링커 부분 (L) 및 PBD 약물 부분 (D)은 제 1항에서 정의된 바와 같다.
  33. 제 32항에 있어서, Ab가 다음의 (1)-(36)으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 종양-연관된 항원 또는 세포-표면 수용체에 결합하는 항체인 컨주게이트:
    (1) BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-타입 IB);
    (2) E16 (SLC7A5 solute carrier family 7 member 5);
    (3) STEAP1 (six transmembrane epithelial antigen of prostate);
    (4) 0772P (MUC16 mucin 16, cell surface associated);
    (5) MPF (메소텔린);
    (6) Napi3b (SLC34A2 solute carrier family 34 (sodium phosphate), member 2);
    (7) Sema 5b (Semaphorin 5b);
    (8) PSCA hlg (LYPD1　LY6/PLAUR domain containing 1);
    (9) ETBR (엔도텔린 타입 B 수용체);
    (10) MSG783 (RNF43　ring finger protein 43);
    (11) STEAP2 (six transmembrane epithelial antigen of prostate 2);
    (12) TrpM4 (transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 4);
    (13) CRIPTO (teratocarcinoma-derived growth factor);
    (14) CD21 (CR2 Complement receptor 2);
    (15) CD79b (CD79b molecule immunoglobulin-associated beta);
    (16) FcRH2 (FCRL2　Fc receptor-like 2);
    (17) HER2 (ERBB2　erb-b2 receptor tyrosine kinase 2);
    (18) NCA (CEACAM6 carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6);
    (19) MDP (DPEP1　dipeptidase 1);
    (20) IL20Ra (IL20RA　interleukin 20 receptor, alpha);
    (21) Brevican;
    (22) EphB2R (EPH receptor B2);
    (23) ASLG659 (Genbank Accession No. AX092328);
    (24) PSCA (Prostate stem cell antigen precursor);
    (25) GEDA (LHFPL3　lipoma HMGIC fusion partner-like 3);
    (26) BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체);
    (27) CD22 (B-cell receptor CD22-B isoform);
    (28) CD79a (CD79a molecule, immunoglobulin-associated alpha);
    (29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1);
    (30) HLA-DOB (MHC 클래스 II 분자의 베타 서브유니트);
    (31) P2X5 (퓨린작동성 수용체 P2X 리간드-개폐 이온 채널 5);
    (32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72);
    (33) LY64 (림프구 항원 64);
    (34) FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1);
    (35) IRTA2 (면역글로불린 슈퍼페밀리 수용체 전좌 연관된 2); 및
    (36) TENB2 (추정상의 경막 프로테오글리칸).
  34. 제 32항에 있어서, Ab가 반응성 시스테인 티올기를 갖도록 변형된 항체인 컨주게이트.
  35. 제 32항에 있어서, Ab가 ErbB (Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog) 수용체에 결합하는 항체인 컨주게이트.
  36. 제 35항에 있어서, Ab가 트라스투주맙인 컨주게이트.
  37. 제 32항에 있어서, Ab가 항-HER2(human epidermal growth factor receptor 2), 항-Steap1(six transmembrane epithelial antigen of prostate), 또는 항-CD22 (B-cell receptor CD22-B isoform) 항체인 컨주게이트.
  38. 제 32항에 있어서, p가 1, 2, 3, 또는 4인 컨주게이트.
  39. 제 32항에 있어서, 하기 화학식들로부터 선택된 화학식을 갖는 컨주게이트:
    Figure 112016124659514-pct00189

    Figure 112016124659514-pct00190

    Figure 112016124659514-pct00191

    여기에서 n은 1 내지 24의 정수이다.
  40. 제 39항에 있어서, n이 1 내지 12의 정수인 컨주게이트.
  41. 제 40항에 있어서, n이 4 또는 8인 컨주게이트.
  42. 제 1항, 제 4항 내지 제 10항, 제 12항, 제 16항 내지 제 23항, 및 제 25항 내지 제 41항 중 어느 한 항의 컨주게이트, 및 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물.
  43. 제 42항에 있어서, 치료학적 유효량의 화학요법제를 더 포함하는 약제학적 조성물.
  44. 제 42항에 있어서, 암이 유방암인 약제학적 조성물.
  45. 화학식 EB 또는 EC의 화합물 또는 그의 염 또는 용매화물:
    Figure 112016124659514-pct00212

    또는
    Figure 112016124659514-pct00213

    상기 식에서,
    점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중결합의 존재 또는 부재를 나타내며;
    R2는 H, =CH2, R, =CH-RD, 및 =C(RD)2로부터 독립적으로 선택되고;
    여기에서 RD는 R이고;
    R6 및 R9는 H이며;
    R7은 C1-4 알콕시기이고;
    RL은 다음의 그룹이며:
    Figure 112016124659514-pct00214

    여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고,
    L1은 표적 암 세포에 존재하는 효소의 작용에 의해 분해가능한 아미노산 서열이고,
    G1은 하기 (i) 및 (ii)로부터 선택되는 작용기이고:
    (i)
    Figure 112016124659514-pct00215

    (여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 내지 6이다); 및
    (ii)
    Figure 112016124659514-pct00216

    (여기에서 별표는 L1에 대한 부착점을 나타내고, n은 0 또는 1이며, m은 0 내지　30이다),
    L2는 공유결합이거나, -OC(=O)-와 함께 하기 구조를 갖는 자체-희생적 링커를 형성하며,
    Figure 112016124659514-pct00217

    (여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L1에 대한 부착점을 나타내며, Y는 -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- 또는 -C(=O)O-이고, n은 0 내지 3이다),
    Q는 O, S 및 NH로부터 독립적으로 선택되며;
    R11은 H 또는 R이거나, Q가 O인 경우에 R11은 SO3M이고, 여기에서 M은 금속 양이온이며;
    R 및 R'는 각각 독립적으로 C1-12 알킬, N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 가지는 C3-20　헤테로사이클릴 및 C5-20 아릴 그룹(여기서, 상기 C5-20 아릴 그룹은 하나 이상의 C1-4 알콕시 또는 할로에 의해 치환 또는 비치환됨)으로부터 선택되고;
    R"는 C3-12 알킬렌 그룹이며;
    각각의 X는 O, S 또는 N(H)이며;
    R2", R6", R7", R9",R11", Q" 및 X"는 각각 R2, R6, R7, R9, R11, Q 및 X에 따라 정의되며,
    RC는 하기 구조를 가지는 캡핑(capping) 그룹이고:
    Figure 112016124659514-pct00218

    (여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, G2는 카바메이트 보호기이며, L3은 공유 결합이거나, 표적 암 세포에 존재하는 효소의 작용에 의해 분해가능한 아미노산 서열이고, L2는 공유결합이거나, OC(=O)와 함께 하기 구조를 가지는 자체-희생적 링커를 형성한다:
    Figure 112016124659514-pct00219

    여기에서 별표는 N10 위치에 대한 부착점을 나타내고, 파선은 링커 L2에 대한 부착점을 나타내며, Y는 NH, O, C(=O)NH 또는 C(=O)O이고, n은 0 내지 3이다).
    RL은 RC와는 상이하다.
  46. 제 45항에 있어서, 하기의 구조를 갖는 화합물:
    Figure 112016035678943-pct00196
    ,
    Figure 112016035678943-pct00200
    또는
    Figure 112016035678943-pct00201

    여기에서 n은 1 내지 24의 정수이다.
  47. 제 46항에 있어서, n이 1 내지 12의 정수인 화합물.
  48. 제 47항에 있어서, n이 4 또는 8인 화합물.
  49. 제 45항에 있어서, 하기 (i), (ii) 및 (iii)으로부터 선택되는 화합물:
    Figure 112016035678943-pct00199
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