ES2640449T3 - Conjugados de anticuerpos anti-her2-Pirrolobenzodiazepinas - Google Patents

Conjugados de anticuerpos anti-her2-Pirrolobenzodiazepinas Download PDF

Info

Publication number
ES2640449T3
ES2640449T3 ES13788691.7T ES13788691T ES2640449T3 ES 2640449 T3 ES2640449 T3 ES 2640449T3 ES 13788691 T ES13788691 T ES 13788691T ES 2640449 T3 ES2640449 T3 ES 2640449T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antibody
mmol
cancer
methoxy
drug
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13788691.7T
Other languages
English (en)
Inventor
Patricius Hendrikus Cornelis VAN BERKEL
Philip Wilson Howard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ADC Therapeutics SA
MedImmune Ltd
Original Assignee
ADC Therapeutics SA
MedImmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ADC Therapeutics SA, MedImmune Ltd filed Critical ADC Therapeutics SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2640449T3 publication Critical patent/ES2640449T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Abstract

Un conjugado de fórmula ConjA: **(Ver fórmula)** ConjB: **(Ver fórmula)** ConjC: **(Ver fórmula)** ConjD:: **(Ver fórmula)** o ConjE:: **(Ver fórmula)** en las que Ab es un anticuerpo que se une a HER2, comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que tiene la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 1; y en donde la carga de fármaco (p) de fármacos (D) al anticuerpo (Ab) es un número entero de 1 a aproximadamente 8.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCION
Conjugados de anticuerpos anti-her2-Pirrolobenzodiazepinas
La presente invencion se refiere a pirrolobenzodiazepinas (PBD), en particular a pirrolobenzodiazepinas que tienen un grupo protector C2 o N10 labil, en forma de un conector a un anticuerpo.
Antecedentes a la invencion
Pirrolobenzodiazepinas
Algunas pirrolobenzodiazepinas (PBD) tienen la capacidad de reconocer y unirse a secuencias especlficas de ADN; la secuencia preferida es PuGPu. El primer antibiotico antitumoral de PBD, la antramicina, se descubrio en 1965 (Leimgruber y col., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber y col., J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965)). Desde entonces, se ha informado de varias PBD que se producen naturalmente, y se han desarrollado mas de 10 rutas de slntesis para varios analogos (Thurston y col., Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994); Antonow, D. y Thurston, D.E., Chem. Rev. 2011 111 (4), 2815-2864). Miembros de la familia incluyen abeimicina (Hochlowski y col., J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), chicamicina (Konishi y col., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (patente japonesa 58-180 487; Thurston y col., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose y col., Tetrahedron, 48, 751758 (1992)), mazetramicina (Kuminoto y col., J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), neotramicinas A y B (Takeuchi y col., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), porotramicina (Tsunakawa y col., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), protracarcina (Shimizu y col., J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley y Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), sibanomicina (DC-102) (Hara y col., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh y col., J. Antibiotics, 41, 12811284 (1988)), sibiromicina (Leber y col., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) y tomamicina (Arima y col., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)). Las PBD son de la estructura general:
imagen1
Se diferencian en el numero, tipo y posicion de sustituyentes, en tanto sus anillos A aromaticos como anillos C de pirrolo, y en el grado de saturacion del anillo C. En el anillo B hay tanto una imina (N=C), una carbinolamina (NH- CH(OH)) como un eter metllico de carbinolamina (NH-CH(OMe)) en la posicion N10-C11 que es el centro electrofilo responsable de alquilar ADN. Todos los productos naturales conocidos tienen una configuracion (S) en la posicion C11 quiral que les proporciona un giro hacia la derecha cuando se miran desde el anillo C hacia el anillo A. Esto les da la forma tridimensional apropiada para isohelicidad con el surco menor del ADN de forma B, conduciendo a un encaje ajustado en el sitio de union (Kohn, en Antibiotics III. Springer-Verlag, Nueva York, pag. 3-11 (1975); Hurley y Needham-VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Su capacidad para formar un aducto en el surco menor les permite interferir con el procesamiento de ADN, de ahl su uso como agentes antitumorales.
Un compuesto de pirrolobenzodiazepina particularmente ventajoso se describe por Gregson y col. (Chem. Commun. 1999, 797-798) como el compuesto 1, y por Gregson y col. (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161-1174) como el compuesto 4a. Este compuesto, tambien conocido como SG2000, se muestra a continuacion:
imagen2
El documento WO 2007/085930 describe la preparacion de compuestos de PBD dimericos que tienen grupos conectores para la conexion a un anticuerpo, tal como un anticuerpo. El conector esta presente en el puente que une las unidades de PBD monomericas del dlmero.
Los presentes inventores han descrito compuestos de PBD dimericos que tienen grupos conectores para la conexion a un anticuerpo, tal como un anticuerpo, en el documento WO 2011/130613 y el documento WO 2011/130616. El conector en estos compuestos esta unido al nucleo de PBD a traves de la posicion C2 y, generalmente se escinde por accion de una enzima en el grupo conector. En el documento WO 2011/130598, el conector en estos compuestos esta unido a una de las posiciones N10 disponibles, y se escinden generalmente por la accion de una enzima sobre el grupo conector.
5
10
15
20
25
30
35
40
Conjugados de anticuerpo-farmaco
Se ha establecido la terapia con anticuerpos para el tratamiento dirigido de pacientes con cancer, trastornos inmunologicos y angiogenicos (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). El uso de conjugados de anticuerpo-farmaco (ADC), es decir, inmunoconjugados, para la administracion local de agentes citotoxicos o citostaticos, es decir, farmacos para destruir o inhibir celulas tumorales en el tratamiento de cancer, se dirige a la administracion de los restos de farmaco a tumores, y la acumulacion intracelular en su interior, mientras que la administracion sistemica de estos agentes de farmaco no conjugados puede producir niveles inaceptables de toxicidad a celulas normales (Xie y col. (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281 -291; Kovtun y col. (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law y col. (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu y col. (2005) Nature Biotech. 23(9):1137- 1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail y col. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328337; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614).
Asi se busca maxima eficacia con la minima toxicidad. Los esfuerzos para disenar y refinar ADC se han basado en la selectividad de anticuerpos monoclonales (mAb), ademas del mecanismo de accion del farmaco, enlace del farmaco, relacion de farmaco/anticuerpo (carga) y propiedades de liberacion de farmaco (Junutula y col., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan y col. (2009) Blood 114(13):2721-2729; documentos US 7521541; US 7723485; WO2009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299-307; Doronina y col. (2006) Bioconj. Chem. 17:114-124; Erickson y col. (2006) Cancer Res. 66(8):1-8; Sanderson y col. (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey y col. (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358; Hamblett y col. (2004) Clin. Cancer Res. 10:70637070). Los restos de farmaco pueden conferir sus efectos citotoxicos y citostaticos por mecanismos que incluyen union a tubulina, union a ADN, inhibicion de proteasoma y/o topoisomerasa. Algunos farmacos citotoxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con grandes anticuerpos o ligandos de receptores de proteina.
Los presentes inventores han desarrollado conjugados de anticuerpo dimeros de PBD particulares.
Divulgacion de la invencion
Un primer aspecto de la presente invencion comprende un conjugado de formula ConjA
imagen3
ConjB
imagen4
ConjC:
imagen5
5
imagen6
o
ConjE:
imagen7
en la que Ab es un anticuerpo que se une a HER2, comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que tiene la secuencia de acuerdo con la SEQ ID NO. 1; y en la que la carga de farmaco (p) de los farmacos (D) al anticuerpo (Ab) es un numero entero de 1 a aproximadamente 8.
5 Se proporciona un metodo para preparar un conjugado seleccionado del grupo que consiste en ConjA, ConjB, ConjC, ConjD y ConjE, que comprende la conjugacion de un compuesto que se selecciona respectivamente de A:
imagen8
imagen9
15
imagen10
C
D
y E:
5
imagen11
imagen12
con un anticuerpo tal como se define a continuacion.
El documento WO 2011/130615 divulga el compuesto 26:
10
imagen13
que es el compuesto parental de A. El compuesto A comprende este PBD con un conector para la union a un agente 15 de union celular. El agente de union celular proporciona un numero de restos de etilenglicol para proporcionar solubilidad que es util en la slntesis de conjugados.
Los documentos WO 2010/043380 y WO 2011/130613 divulgan el compuesto 30:
imagen14
El documento WO 2011/130613 tambien divulga el compuesto 51:
5
10
15
20
25
30
35
imagen15
El compuesto B difiere del compuesto 30 porque solo tiene una union (CH2)3 entre los restos PBD, en lugar de una union (CH2)5, lo que reduce la lipofilidad del dimero de PBD liberado. El grupo de union esta unido al grupo C2-fenilo en la posicion para en lugar de meta.
El documento WO 2011/130613 divulga el compuesto 93:
imagen16
El compuesto C difiere de esto en dos aspectos. El agente de union celular proporciona un numero incrementado de restos de etilenglicol para proporcionar solubilidad que es util en la sintesis de conjugados, y el sustituyente fenilo proporciona dos atomos de oxigeno en lugar de uno, lo cual tambien ayuda a la solubilidad. La estructura del compuesto C tambien puede significar que se une mas fuertemente en el surco menor.
Los compuestos A, B y C tienen dos centros sp2 en cada anillo en C, lo que puede permitir una union mas fuerte en el surco menor del ADN, que para compuestos con solo un centro sp2 en cada anillo en C.
El documento WO 2011/130598 divulga el compuesto 80:
imagen17
El compuesto D difiere de esto al comprender un grupo yodoacetamida para enlazar con el agente de union celular. Este grupo puede ofrecer ventajas sobre el compuesto 80 con respecto a su estabilidad cuando esta unido a un agente de union celular (vease mas adelante). El grupo malemida en el compuesto 80 puede experimentar una reaccion de retro-Michael, que se convierte en no conjugado del agente de union celular, y por lo tanto vulnerable al secuestro por otras moleculas biologicas que contienen tiol, tales como albumina y glutation. Tal no conjugacion no se puede producir con el compuesto A. Ademas, el grupo yodoacetamida puede evitar otras reacciones secundarias no deseadas.
El compuesto E se diferencia de los dimeros de PBD previamente desvelados con un conector de farmaco que tiene un doble enlace en endo C2-3 por tener un sustituyente C2 menos lipofilo mas pequeno, por ejemplo 4F-fenilo, propileno. Como tales, es menos probable que los conjugados del compuesto B (vease mas adelante) se agreguen una vez sintetizados. Tal agregacion de conjugados puede medirse por cromatografia de exclusion por tamano (SEC).
5
10
15
20
25
30
35
Tanto el compuesto D como el E tienen dos centros sp2 en cada anillo C, que pueden permitir union mas fuerte en el surco menor del ADN, que para compuestos con solo un centro sp2 en cada anillo C.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion es adecuada para su uso en proporcionar un compuesto de PBD a un sitio preferido en un sujeto. El conjugado permite la liberacion de un compuesto de PBD activo que no retiene ninguna parte del conector. No hay ninguna punta presente que pudiera afectar la reactividad del compuesto de PBD. Asf, ConjA liberarfa el compuesto RelA:
imagen18
ConjB liberarfa el compuesto RelB
imagen19
ConjC liberarfa el compuesto RelC:
imagen20
ConjD liberarfa el compuesto RelD:
imagen21
y ConjE liberarfa el compuesto RelE
imagen22
El enlace especificado entre el dfmero de PBD y el anticuerpo, en la presente invencion es preferentemente estable extracelularmente. Antes del transporte o administracion en una celula, el conjugado de anticuerpo-farmaco (ADC) es preferentemente estable y sigue intacto, es decir, el anticuerpo sigue ligado al resto de farmaco. Los conectores son estables fuera de la celula diana y pueden escindirse a alguna tasa eficaz dentro de la celula. Un conector eficaz: (i) mantendra las propiedades de union especffica del anticuerpo; (ii) permitira la administracion intracelular del conjugado o resto de farmaco; (iii) seguira siendo estable e intacto, es decir, no se escindira, hasta que el conjugado se haya administrado o transportado a su sitio elegido como diana; y (iv) mantendra un efecto citotoxico destructor de celulas o un efecto citostatico del resto de farmaco de PBD. La estabilidad del ADC puede medirse por tecnicas analfticas convencionales tales como espectroscopfa de masas, HPLC y la tecnica de separacion/analisis EM/CL.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
La administracion de los compuestos de formulas RelA, RelB, RelC, RelD o RelE se logra en el sitio de activacion deseado de los conjugados de formulas ConjA, ConjB, ConjC, ConjD o ConjE por la accion de una enzima, tal como catepsina, en el grupo de enlace, y en particular en el resto de dipeptido de valina-alanina.
Anticuerpo
En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo que se une a HER2, comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que tiene la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 1.
El anticuerpo puede comprender ademas un dominio VL. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende ademas un dominio VL que tiene la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende un dominio VH emparejado con un dominio VL, teniendo los dominios VH y VL las secuencias de SEQ ID No. 1 emparejada con la SEQ iD NO. 2.
El dominio o dominios VH y VL pueden emparejarse para formar un sitio de union a antlgeno de anticuerpo que se une a HER2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo intacto que comprende un dominio VH emparejado con un dominio VL, teniendo los dominios VH y VL las secuencias de SEQ ID NO. 1 emparejada con la sEq iD NO. 2. En una realizacion, el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 3 emparejada con una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 4. En una realizacion, el anticuerpo es un anticuerpo intacto que comprende dos cadenas pesadas que tienen la secuencia de SEQ ID NO. 3, cada una emparejada con una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo compite con el anticuerpo secretado por el hibridoma de numero de acceso en la ATCC CRL-10463 para la union a HER2. En una realizacion, el anticuerpo se une a HER2 con una constante de asociacion (Ka) no inferior a 2, 5 o 10 veces menor que el anticuerpo secretado por el hibridoma.
En un aspecto, el anticuerpo es el anticuerpo secretado por un hidridoma. En una realizacion, el hibridoma es el n.° de acceso en ATCC CRL-10463.
En un aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo como se describe en el presente documento que ha sido modificado (o modificado adicionalmente) como se describe a continuacion. En algunas realizaciones, el anticuerpo es una version humanizada, desinmunizada o reacondicionado de un anticuerpo divulgado en el presente documento.
Terminologia
El termino “anticuerpo” en el presente documento se usa en el sentido mas amplio y cubre especlficamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dlmeros, multlmeros, anticuerpos multiespeclficos (por ejemplo, anticuerpos biespeclficos), anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos, mientras que presenten la actividad biologica deseada, por ejemplo, la capacidad para unirse a HER2 (Miller y col. (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Los anticuerpos pueden ser murinos, humanos, humanizados, quimericos, o derivados de otras especies. Un anticuerpo es una protelna generada por el sistema inmunitario que puede reconocer y unirse a un antlgeno especlfico (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a ed., Garland Publishing, New York). Un antlgeno diana generalmente tiene numerosos sitios de union, tambien denominados epitopes, reconocidos por CDR sobre multiples anticuerpos. Cada anticuerpo que se une especlficamente a un epitope diferente tiene una estructura diferente. Asi, un antigeno puede tener mas de un anticuerpo correspondiente. Un anticuerpo incluye una molecula de inmunoglobulina de longitud completa o una porcion inmunologicamente activa de una molecula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molecula que contiene un sitio de union al antigeno que se une inmunoespecificamente a un antlgeno de una diana de interes o parte del mismo, incluyendo tales dianas, pero no se limitan a, celula cancerosa o celulas que producen anticuerpos autoinmunitarios asociados a una enfermedad autoinmunitaria. La inmunoglobulina puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase o alotipo (por ejemplo, G1m1 humano, G1m2, G1m3, no G1m1 [es decir, cualquier alotipo distinto de G1m1], G1m17, G2m23, G3m21, G3m28, G3m11, G3m5, G3m13, G3m14, G3m10, G3m15, G3m16, G3m6, G3m24, G3m26, G3m27, A2m1, A2m2, Km1, Km2 y Km3) de molecula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden derivarse de cualquier especie, que incluye origen humano, murino o de conejo.
Tal como se utiliza en el presente documento, "se une a HER2" se usa para significar que el anticuerpo se une a HER2 con una afinidad mas alta que un companero inespeclfico, tal como seroalbumina bovina (BSA, n.° de acceso de Genbank CAA76847, version CAA76847.1 GI: 3336842, fecha de actualizacion de registro: 7 de enero de 2011, 02:30 PM). En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a HER2 con una constante de asociacion (Ka) de al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 104, 105 o 106veces mas que la constante de asociacion del anticuerpo para BSA, cuando se mide en condiciones fisiologicas. Los anticuerpos de la invencion pueden unirse a HER2 con una alta afinidad. Por ejemplo, en algunas realizaciones el anticuerpo puede unirse a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
HER2 con un KD igual o inferior a aproximadamente 10"6 M, tal como 1 x 10-6, 10-7, 10-8, 10"9,10"10 o 10'14.
10'11
10-12, 10-13
Como se usa en el presente documento, HER2 se refiere al receptor de factor de crecimiento epidermico humano 2. En una realizacion, el polipeptido HER2 corresponde al n.° de acceso en Genbank AAA75493, version n.°. AAA75493.1 GI: 306840, fecha de actualizacion del registro: 23 de junio de 2010 08:47 AM. En una realizacion, el acido nucleico que codifica el polipeptido HER2 corresponde al n.° de acceso en Genbank M11730, version n.° M11730.1 GI: 183986, fecha de actualizacion del registro: 23 de junio de 2010, 08:47 AM
Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una porcion de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la region de union al antlgeno o variable del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y scFv; diacuerpos; anticuerpos lineales; fragmentos producidos por una biblioteca de expresion de Fab, anticuerpos antiidiotlpicos (anti-Id), CDR (region determinante de la complementariedad) y fragmentos de union al epitope de cualquiera de los anteriores que se unen inmunoespeclficamente a antlgenos de celulas cancerosas, antlgenos virales o antlgenos microbianos, moleculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespeclficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
El termino “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especlficos, estando dirigidos contra un unico sitio antigenico. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopes), cada anticuerpo monoclonal esta dirigido contra un unico determinante sobre el antlgeno. Ademas de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminar por otros anticuerpos. El adjetivo “monoclonal” indica el caracter del anticuerpo como que se obtiene de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogenea, y no debe interpretarse como que requiera la production del anticuerpo por cualquier metodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a usarse segun la presente invention pueden prepararse mediante el metodo de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col. (1975) Nature 256:495, o pueden prepararse mediante metodos de ADN recombinante (vease el documento US 4816567). Los anticuerpos monoclonales tambien pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fago usando las tecnicas descritas en Clackson y col. (1991) Nature, 352:624-628; Marks y col. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597, o de ratones transgenicos que llevan un sistema de inmunoglobulina completamente humana (Lonberg (2008) Curr. Opinion 20(4):450-459).
Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen especlficamente anticuerpos “quimericos” en los que una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es identico u homologo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, ademas de fragmentos de tales anticuerpos, mientras que presenten la actividad biologica deseada (documento US 4816567; y Morrison y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Los anticuerpos quimericos incluyen anticuerpos “primatizados” que comprenden secuencias de union al antlgeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo o simio superior) y secuencias de la region constante humanas.
Un “anticuerpo intacto” en el presente documento es uno que comprende un dominio VL y VH, ademas de un dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de la secuencia nativa humana) o variante de la secuencia de aminoacidos de la misma. El anticuerpo intacto puede tener una o mas “funciones efectoras”, que se refiere a aquellas actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una region Fc de la secuencia nativa o region Fc variante de la secuencia de aminoacidos) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen union a C1q; citotoxicidad dependiente del complemento; union al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por celula dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; y regulation por disminucion de receptores de la superficie celular tales como receptor de linfocitos B y BCR.
Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse anticuerpos intactos a diferentes “clases”. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en “subclases” (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que se corresponden con las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, 8, e, g y m, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son muy conocidas.
Modificacion de anticuerpos
Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden modificarse. Por ejemplo, para hacerlos menos inmunogenicos a un sujeto humano. Esto se puede conseguir usando cualquiera de una serie de tecnicas conocidas por el experto en la tecnica. Algunas de estas tecnicas se describen con mas detalle a continuation.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Humanization
Las tecnicas para reducir la inmunogenicidad in vivo de un anticuerpo no humano o fragmento de anticuerpo incluyen las denominadas “humanizacion”.
Un “anticuerpo humanizado” se refiere a un polipeptido que comprende al menos una porcion de una region variable modificada de un anticuerpo humano en el que una porcion de la region variable, preferentemente una porcion sustancialmente inferior al dominio variable humano intacto, se ha sustituido con la secuencia correspondiente de una especie no humana y en la que la region variable modificada esta unida a al menos otra parte de otra protelna, preferentemente la region constante de un anticuerpo humano. La expresion “anticuerpos humanizados” incluye anticuerpos humanos en los que uno o mas restos de aminoacidos de la region determinante de la complementariedad (“CDR”) y/o uno o mas restos de aminoacidos de la region estructural (“FW” o “FR”) estan sustituidos por restos de aminoacidos de sitios analogos en roedores u otros anticuerpos no humanos. La expresion “anticuerpo humanizado” tambien incluye una variante de la secuencia de aminoacidos de inmunoglobulina o fragmento de la misma que comprende una FR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina humana y una CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoacidos de una inmunoglobulina no humana.
Formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. O, visto de otra forma, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo humano que tambien contiene secuencias seleccionadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) en lugar de las secuencias humanas. Un anticuerpo humanizado puede incluir sustituciones de aminoacidos conservativas o restos no naturales de las mismas especies o de especies diferentes que no alteran significativamente su union y/o actividad biologica. Tales anticuerpos son anticuerpos quimericos que contienen secuencia minima derivada de inmunoglobulinas no humanas.
Hay varias tecnicas de humanizacion, que incluyen 'injerto de CD', 'selection guiada', 'desinmunizacion', 'acondicionamiento superficial' (tambien conocida como 'inactivation'), 'anticuerpos compuestos', 'optimization de contenidos de la cadena humana' y barajado de regiones estructurales.
Injerto de CDR
En esta tecnica, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que los restos de una region determinante de la complementariedad (CDR) del anticuerpo del receptor estan sustituidos por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo del donante) tal como raton, rata, camello, bovino, cabra o conejo que tiene las propiedades deseadas (de hecho, las CDR no humanas estan 'injertadas' sobre la region estructural humana). En algunos casos, los restos de la region estructural (FR) de la inmunoglobulina humana estan sustituidos por restos no humanos correspondientes (esto puede ocurrir cuando, por ejemplo, un resto de FR particular tiene efecto significativo sobre la union al antigeno).
Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que ni se encuentran en el anticuerpo del receptor ni en las CDR importadas o secuencias de la region estructural. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente y maximizar el rendimiento del anticuerpo. Asi, en general, un anticuerpo humanizado comprendera todos de al menos uno, y en un aspecto dos, dominios variables, en los que todos o todos los bucles hipervariables se corresponden con aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera opcionalmente al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), o aquella de una inmunoglobulina humana.
Seleccion guiada
El metodo consiste en combinar el dominio Vh o Vl de un anticuerpo no humano dado especifico para un epitope particular con una biblioteca de Vh o Vl humana y los dominios V humanos especificos se seleccionan contra el antigeno de interes. Este VH humano seleccionado se combina entonces con una biblioteca de VL para generar una combination de VHxVL completamente humana. El metodo se describe en Nature Biotechnology (N.Y.) 12, (1994) 899-903.
Anticuerpos compuestos
En este metodo, dos o mas segmentos de la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo humano se combinan dentro de la molecula de anticuerpo final. Se construyen combinando multiples segmentos de la secuencia de VH y VL humana en combinaciones que limitan o evitan los epitopes de linfocitos T humanos en las regiones V de anticuerpos compuestos finales. Si se requiere, los epitopes de linfocitos T se limitan o evitan intercambiando segmentos de las regiones V que contribuyen a o que codifican un epitope de linfocitos T con segmentos alternativos que evitan epitopes de linfocitos T. Este metodo se describe en el documento US 2008/0206239 A1.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Desinmunizacion
Este metodo implica la eliminacion de epitopes de linfocitos T humanos (u otra segunda especie) de las regiones V del anticuerpo terapeutico (u otra molecula). La secuencia de las regiones V de anticuerpos terapeuticos se analiza para la presencia de motivos de union al MHC de clase II por, por ejemplo, comparacion con bases de datos de motivos de union al MHC (tales como la base de datos de “motivos” alojada en
www.wehi.edu.au). Alternativamente, los motivos de union al MHC de clase II pueden identificarse usando metodos de plegamiento computacional tales como aquellos ideados por Altuvia y col. (J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)); en estos metodos, peptidos de solapamiento consecutivos de las secuencias de las regiones V estan probandose para sus energlas de union a protelnas del MHC de clase II. Estos datos pueden entonces combinarse con informacion sobre otras caracterlsticas de secuencias que se refieren a peptidos satisfactoriamente presentados, tales como anfipaticidad, motivos de Rothbard y sitios de escision para catepsina B y otras enzimas de procesamiento.
Una vez se han identificado posibles epitopes de linfocitos T de segundas especies (por ejemplo, humana), se eliminan por la alteracion de uno o mas aminoacidos. Los aminoacidos modificados estan normalmente dentro del propio epitope del linfocito T, pero tambien pueden estar adyacentes al epitope en terminos de la estructura primaria o secundaria de la proteina (y, por tanto, pueden no estar adyacentes en la estructura primaria). Lo mas normalmente, la alteracion es a modo de sustitucion pero, en algunas circunstancias, sera mas apropiada la adicion o delecion de aminoacidos.
Todas las alteraciones pueden llevarse a cabo por tecnologia de ADN recombinante, de manera que la molecula final pueda prepararse por expresion de un huesped recombinante usando metodos bien establecidos tales como mutagenesis dirigida al sitio. Sin embargo, tambien es posible el uso de quimica de proteinas o cualquier otro medio de alteracion molecular.
Acondicionamiento superficial
Este metodo implica:
(a) determinar la estructura conformacional de la region variable del anticuerpo no humano (por ejemplo, roedor) (o fragmento del mismo) construyendo un modelo tridimensional de la region variable del anticuerpo no humano;
(b) generar alineamientos de secuencias usando distribuciones de relativa accesibilidad a partir de estructuras cristalograficas de rayos X de un numero suficiente de cadenas pesadas y ligeras de las regiones variables de anticuerpos no humanos y humanos para dar un conjunto de posiciones de las regiones estructurales de las cadenas pesadas y ligeras en las que las posiciones de alineamiento son identicas en el 98 % del numero suficiente de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos no humanos;
(c) definir para el anticuerpo no humano que va a humanizarse un conjunto de restos de aminoacidos expuestos en la superficie de las cadenas pesadas y ligeras usando el conjunto de posiciones de la region estructural generadas en la etapa (b);
(d) identificar a partir de las secuencias de aminoacidos de anticuerpo humano un conjunto de restos de aminoacidos expuestos en la superficie de las cadenas pesadas y ligeras que es lo mas estrechamente identico al conjunto de restos de aminoacidos expuestos en la superficie definidos en la etapa (c), en el que la cadena pesada y ligera del anticuerpo humano estan o no estan naturalmente apareadas;
(e) sustituir, en la secuencia de aminoacidos del anticuerpo no humano que va a humanizarse, el conjunto de restos de aminoacidos expuestos en la superficie de las cadenas pesadas y ligeras definido en la etapa (c) con el conjunto de restos de aminoacidos expuestos en la superficie de las cadenas pesadas y ligeras identificado en la etapa (d);
(f) construir un modelo tridimensional de la region variable del anticuerpo no humano resultante de la sustitucion especificada en la etapa (e);
(g) identificar, comparando los modelos tridimensionales construidos en las etapas (a) y (f), cualquier resto de aminoacido de los conjuntos identificados en las etapas (c) o (d), que estan dentro de 5 Angstroms de cualquier atomo de cualquier resto de las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo no humano que va a humanizarse; y
(h) cambiar cualquier resto identificado en la etapa (g) del resto de aminoacido no humano original para asi definir un conjunto humanizante de anticuerpos no humanos de restos de aminoacidos expuestos en la superficie; con la condicion de que la etapa (a) no necesita realizarse primero, pero debe realizarse antes de etapa (g).
Superhumanizacion
El metodo compara la secuencia no humana con el repertorio de genes de la linea germinal humana funcional. Se seleccionan aquellos genes humanos que codifican estructuras canonicas identicas o estrechamente relacionadas con las secuencias no humanas. Se eligen aquellos genes humanos seleccionados con la mayor homologia dentro de las CDR como donantes de FR. Finalmente, las CDR no humanas se injertan sobre estas FR humanas. Este metodo se describe en la patente WO 2005/079479 A2.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Qptimizacion de contenidos de la cadena humana
Este metodo compara la secuencia no humana (por ejemplo, de raton) con el repertorio de genes de la llnea germinal humana y las diferencias se puntuan como contenido de la cadena humana (HSC) que cuantifica una secuencia al nivel de posibles epitopes de MHC/linfocitos T. A continuation, la secuencia diana se humaniza maximizando su HSC en vez de usando una medida de identidad global para generar multiples variantes humanizadas diversas (descritas en Molecular Immunology, 44, (2007) 1986-1998).
Barajado de regiones estructurales
Las CDR del anticuerpo no humano estan fusionadas en marco con conjuntos de ADNc que engloban todas las regiones estructurales de genes de la llnea germinal humana de cadenas pesadas y ligeras conocidas. A continuacion, los anticuerpos humanizados se seleccionan, por ejemplo, por inmunopurificacion de la biblioteca de anticuerpos expresados en fago. Esto se describe en Methods 36, 43-60 (2005).
Conjugados
La presente invention proporciona un conjugado que comprende un compuesto de PBD conectado al anticuerpo a traves de una unidad conectora.
La presente invencion es adecuada para su uso en la provision de un compuesto PBD a un sitio preferido en un sujeto. En las realizaciones preferidas, el conjugado permite la liberation de un compuesto de PBD activo que no retiene ninguna parte del conector. No hay ningun cabo presente que pueda afectar la reactividad del compuesto de PBD.
Los enlazadores del ADC previenen preferentemente la agregacion de moleculas de ADC y mantienen el ADC libremente soluble en medios acuosos y en un estado monomerico.
Los enlazadores del ADC son preferentemente estables extracelularmente. Antes del transporte o de la administration en una celula, el conjugado anticuerpo-farmaco (ADC) es preferentemente estable y permanece intacto, es decir, el anticuerpo permanece unido al resto del farmaco. Los enlazadores son estables fuera de la celula diana y pueden escindirse a alguna velocidad eficaz dentro de la celula. Un enlazador eficaz: (i) mantendra las propiedades de union especlficas del anticuerpo; (ii) permitira la administracion intracelular del conjugado o resto de farmaco; (iii) permanecera estable e intacto, es decir no escindido, hasta que el conjugado se haya sido administrado o transportado a su sitio diana; y (iv) mantendra un efecto citotoxico, de muerte celular o un efecto citostatico del resto de farmaco PBD. La estabilidad del ADC se puede medir mediante tecnicas anallticas estandar tales como espectroscopla de masas, HPLC, y la tecnica de separacion/analisis CL/EM .
Realizaciones
Las realizaciones de la presente invencion incluyen ConjA, en el que el anticuerpo es como se ha definido anteriormente.
Las realizaciones de la presente invencion incluyen ConjB, en el que el anticuerpo es como se ha definido anteriormente.
Las realizaciones de la presente invencion incluyen ConjC, en el que el anticuerpo es como se ha definido anteriormente.
Las realizaciones de la presente invencion incluyen ConjD, en el que el anticuerpo es como se ha definido anteriormente.
Las realizaciones de la presente invencion incluyen ConjE, en el que el anticuerpo es como se ha definido anteriormente.
Carga de farmaco
La carga de farmaco es el numero promedio de farmacos de PBD por anticuerpo. Si los compuestos de la invencion estan unidos a cistelnas, la carga de farmaco puede oscilar de 1 a 8 farmacos (D) por anticuerpo, es decir, en los que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 restos de farmaco estan covalentemente unidos al anticuerpo. Las composiciones de conjugados incluyen colecciones de anticuerpos, conjugados con un intervalo de farmacos, de 1 a 8.
El numero promedio de farmacos por anticuerpo en preparaciones de ADC de reacciones de conjugation puede caracterizarse mediante medios convencionales tales como UV, HPLC de fase inversa, HIC, espectroscopla de masas, ensayo de ELISA y electroforesis. Tambien puede determinarse la distribution cuantitativa de ADC en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
terminos de p. Por ELISA, puede determinarse el valor promediado de p en una preparacion particular de ADC (Hamblett y col. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Sanderson y col. (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852). Sin embargo, la distribucion de valores de p (farmaco) no es discernible por la union anticuerpo-antlgeno y la limitacion de la deteccion de ELISA. Por tanto, el ensayo de ELISA para la deteccion de conjugados de anticuerpo-farmaco no determina si los restos de farmaco estan unidos al anticuerpo, tal como los fragmentos de la cadena pesada o cadena ligera, o los restos de aminoacidos particulares. En algunos casos, puede lograrse separacion, purification y caracterizacion de ADC homogeneos en los que p es un cierto valor de ADC con otras cargas de farmaco por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis. Tales tecnicas tambien son aplicables a otros tipos de conjugados.
Para algunos conjugados de anticuerpo-farmaco, p puede estar limitado por el numero de sitios de union sobre el anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos tiol de cistelna, o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos mediante los cuales puede unirse un conector. Mayor carga de farmaco, por ejemplo, p >5, puede producir agregacion, insolubilidad, toxicidad o perdida de la permeabilidad celular de ciertos conjugados de anticuerpo-farmaco.
Normalmente, menos del maximo teorico de los restos de farmaco estan conjugados con un anticuerpo durante una reaction de conjugation. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos restos de lisina que no reaccionan con el producto intermedio de farmaco-conector (D-L) o reactivo conector. Solo los grupos lisina mas reactivos pueden reaccionar con un reactivo de conector reactivo con amina. Por tanto, solo los grupos tiol de cistelna mas reactivos pueden reaccionar con un reactivo de conector reactivo con tiol. Generalmente, los anticuerpos no contienen muchos, si alguno, grupos tiol de cistelna libres y reactivos que puedan ligarse a un resto de farmaco. La mayorla de los restos de tiol de cistelna en los anticuerpos de los compuestos existen como puentes de disulfuro y deben reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o TCEP, bajo condiciones reductoras parciales o totales. La carga (relation de farmaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de varias maneras diferentes, que incluyen: (i) limitando el exceso molar de producto intermedio de farmaco-conector (D-L) o reactivo de conector con respecto al anticuerpo, (ii) limitando el tiempo de reaccion de la conjugacion o temperatura, y (iii) condiciones reductoras parciales o reductoras limitantes para la modification del tiol de cistelna.
Ciertos anticuerpos tienen disulfuros entre cadenas reducibles, es decir, puentes de cistelna. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugacion con reactivos de conector mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente de cistelna formara asl, teoricamente, dos nucleofilos de tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleofilos adicionales en anticuerpos mediante la reaccion de lisinas con 2- iminotiolano (reactivo de Traut) produciendo la conversion de una amina en un tiol. Los grupos tiol reactivos pueden introducirse en el anticuerpo (o fragmento del mismo) manipulando uno, dos, tres, cuatro o mas restos de cistelna (por ejemplo, preparando anticuerpos mutantes que comprenden uno o mas restos del aminoacido cistelna no nativos). El documento US 7521541 ensena a manipular anticuerpos por introduction de aminoacidos de cistelna reactivos.
Los aminoacidos de cistelna pueden manipularse en sitios reactivos en un anticuerpo y que no forman enlaces disulfuro entre cadenas o intermoleculares (Junutula y col., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan y col. (2009) Blood 114(13):2721-2729; documentos US 7521541; US 7723485; WO2009/052249). Los tioles de cistelna manipulados pueden reaccionar con reactivos de conector o los reactivos de farmaco-conector de la presente invention que tienen grupos electrofilos reactivos con tiol tales como maleimida o alfa-haloamidas para formar ADC con anticuerpos manipulados por cistelna y el resto de farmacos de PBD. Asl, la localization del resto de farmaco puede disenarse, controlarse y conocerse. La carga de farmaco puede controlarse, ya que los grupos tiol de cistelna manipulados normalmente reaccionan con reactivos de conector reactivos con tiol o reactivos de farmaco-conector en alto rendimiento. La manipulation de un anticuerpo IgG para introducir un aminoacido de cistelna por sustitucion en un unico sitio sobre la cadena pesada o ligera da dos nuevas cistelnas sobre el anticuerpo simetrico. Una carga de farmaco proxima a 2 puede lograrse con casi homogeneidad del producto de conjugacion ADC.
Alternativamente, la conjugacion especifica del sitio se puede conseguir mediante ingenierla de anticuerpos para contener aminoacidos no naturales en sus cadenas pesada y/o ligera como se describe en Axup et al. ((2012), Proc Natl Acad Sci USA. 109(40):16101-16116). Los aminoacidos no naturales proporcionan la ventaja adicional de que la qulmica ortogonal puede disenarse para unir el reactivo de union y el farmaco.
Si mas de un grupo nucleofilo o electrofilo del anticuerpo reacciona con un producto intermedio de farmaco-conector, o reactivo de conector seguido de resto de farmaco reactivo, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos de ADC con una distribucion de restos de farmaco unidos a un anticuerpo, por ejemplo, 1, 2, 3, etc. Los metodos de cromatografla de llquidos tales como fase inversa polimerica (PLRP) e interaction hidrofoba (HIC) pueden separar compuestos en la mezcla por el valor de carga del farmaco. Las preparaciones de ADC con un unico valor de carga de farmaco (p) pueden aislarse, sin embargo, estos ADC de valor de carga unico pueden todavla ser mezclas heterogeneas debido a que los restos de farmaco pueden unirse, mediante el conector, en diferentes sitios sobre el anticuerpo.
Asl, las composiciones de conjugado de anticuerpo-farmaco de la invencion incluyen mezclas de compuestos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
conjugados de anticuerpo-farmaco en las que el anticuerpo tiene uno o mas restos de farmaco de PBD y en las que los restos de farmaco pueden unirse al anticuerpo en diversos restos de aminoacidos.
En una realization, el numero promedio de grupos de pirrolobenzodiazepina dimericos por anticuerpo esta en el intervalo de 1 a 8, 2 a 8, 2 a 6, 2 a 4, y 4 a 8.
En algunas realizaciones, hay un grupo de pirrolobenzodiazepina dimerico por anticuerpo.
Incluye otras formas
A menos que se especifique de otro modo, en lo anterior se incluyen las formas ionicas, de sal, solvato y protegidas muy conocidas de estos sustituyentes. Por ejemplo, una referencia a acido carboxllico (-COOH) tambien incluye la forma anionica (carboxilato) (-COO-), una sal o solvato de la misma, ademas de formas protegidas convencionales. Similarmente, una referencia a un grupo amino incluye la forma protonada (-N+HR1R2), una sal o solvato del grupo amino, por ejemplo, una sal de clorhidrato, ademas de formas protegidas convencionales de un grupo amino. Similarmente, una referencia a un grupo hidroxilo tambien incluye la forma anionica (-O-), una sal o solvato de la misma, ademas de formas protegidas convencionales.
Sales
Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar y/o manipular una sal correspondiente del compuesto activo, por ejemplo, una sal farmaceuticamente aceptable. Ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables se tratan en Berge y col., J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977).
Por ejemplo, si el compuesto es anionico, o tiene un grupo funcional que puede ser anionico (por ejemplo, -COOH puede ser -COO-), entonces puede formarse una sal con un cation adecuado. Ejemplos de cationes inorganicos adecuados incluyen, pero sin limitaciones, iones de metales alcalinos tales como Na+ y K+, cationes alcalinoterreos tales como Ca2+ y Mg2+, y otros cationes tales como Al+3. Ejemplos de cationes organicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ion amonio (es decir, NH4+) e iones amonio sustituidos (por ejemplo, NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+). Ejemplos de algunos iones amonio sustituidos adecuados son aquellos derivados de: etilamina, dietilamina, diciclohexilamina, trietilamina, butilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, bencilamina, fenilbencilamina, colina, meglumina y trometamina, ademas de aminoacidos, tales como lisina y arginina. Un ejemplo de un ion amonio cuaternario comun es N(CH3)4+.
Si el compuesto es cationico, o tiene un grupo funcional que pueda ser cationico (por ejemplo, -NH2 puede ser - NH3+), entonces puede formarse una sal con un anion adecuado. Ejemplos de aniones inorganicos adecuados incluyen, pero sin limitaciones, aquellos derivados de los siguientes acidos inorganicos: clorhldrico, bromhldrico, yodhldrico, sulfurico, sulfuroso, nltrico, nitroso, fosforico y fosforoso.
Ejemplos de aniones organicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de los siguientes acidos organicos: acido 2-acetoxibenzoico, acetico, ascorbico, aspartico, benzoico, canforsulfonico, cinamico, cltrico, edetico, etanodisulfonico, etanosulfonico, fumarico, gluceptonico, gluconico, glutamico, glicolico, hidroximaleico, hidroxinaftalenocarboxllico, isetionico, lactico, lactobionico, laurico, maleico, malico, metanosulfonico, mucico, oleico, oxalico, palmltico, pamoico, pantotenico, fenilacetico, fenilsulfonico, propionico, piruvico, salicllico, estearico, succlnico, sulfanllico, tartarico, toluenosulfonico, trifluoroacetico y valerico. Ejemplos de aniones organicos polimericos adecuados incluyen, pero sin limitaciones, aquellos derivados de los siguientes acidos polimericos: acido tanico, carboximetilcelulosa.
Solvatos
Puede ser conveniente o deseable preparar, purificar y/o manipular un solvato correspondiente del compuesto activo. El termino “solvato” se usa en el presente documento en el sentido convencional para referirse a un complejo de soluto (por ejemplo, compuesto activo, sal de compuesto activo) y disolvente. Si el disolvente es agua, el solvato puede denominarse convenientemente un hidrato, por ejemplo, un mono-hidrato, un di-hidrato, un tri-hidrato, etc.
La invention incluye compuestos en los que un disolvente se anade a traves del enlace imina del resto de PBD, que se ilustra a continuacion, en el que el disolvente es agua o un alcohol (RAOH en la que RA es alquilo C1-4):
imagen23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Estas formas pueden denominarse formas carbinolamina y de eter de carbinolamina de PBD (como se describe en la seccion referente a R10 anterior). El equilibrio de estos equilibrios depende de las condiciones a las que los compuestos se encuentran, ademas de la naturaleza del propio resto.
Estos compuestos particulares pueden aislarse en forma solida, por ejemplo, por liofilizacion.
Isomeros
Ciertos compuestos de la invencion pueden existir en una o mas formas geometricas, opticas, enantiomericas, diastereomericas, epimericas, atropicas, estereoisomericas, tautomeras, conformacionales o anomericas particulares, que incluyen, pero no se limitan a, formas cis y trans; formas E y Z; formas c, t y r; formas endo y exo; formas R, S y meso; formas D y L, formas d y l; formas (+) y (-); formas ceto, enol y enolato; formas sin y anti; formas sinclinales y anticlinales; formas a y b; formas axiales y ecuatoriales; formas de barco, silla, giro, sobre y media silla; y combinaciones de las mismas, denominadas conjuntamente en lo sucesivo “isomeros” (o “formas isomericas”).
El termino “quiral” se refiere a moleculas que tienen la propiedad de no superponibilidad del componente de la imagen especular, mientras que el termino “aquiral” se refiere a moleculas que son superponibles sobre su componente de imagen especular.
El termino “estereoisomeros” se refiere a compuestos que tienen constitucion qulmica identica, pero se diferencian con respecto a la disposicion de los atomos o grupos en el espacio.
“Diaestereomero” se refiere a un estereoisomero con dos o mas centros que quiralidad y cuyas moleculas no son imagenes especulares entre si. Los diaestereomeros tienen diferentes propiedades flsicas, por ejemplo, puntos de fusion, puntos de ebullicion, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diaestereomeros pueden separarse bajo procedimientos anallticos de alta resolucion tales como electroforesis y cromatografla.
“Enantiomeros” se refiere a dos estereoisomeros de un compuesto que son imagenes especulares no superponibles entre si.
Las definiciones estereoqulmicas y convenciones usadas en el presente documento generalmente siguen a S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; y Eliel, E. y Wilen, S., “Stereochemistry of Organic Compounds”, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1994. Los compuestos de la invencion pueden contener centros asimetricos o quirales y, por tanto, existen en diferentes formas estereoisomericas. Se pretende que todas las formas estereoisomericas de los compuestos de la invencion, que incluyen, pero no se limitan a, diaestereomeros, enantiomeros y atropisomeros, ademas de mezclas de los mismos, tales como mezclas racemicas, formen parte de la presente invencion. Muchos compuestos organicos existen en formas opticamente activas, es decir, tienen la capacidad de girar el plano del plano-luz polarizada. En la descripcion de un compuesto opticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, se usan para indicar la configuracion absoluta de la molecula alrededor de su(s) centro(s) quiral(es). Los prefijos d y I o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotacion del plano-luz polarizada por el compuesto, significando (-) o I que el compuesto es levogiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrogiro. Para una estructura qulmica dada, estos estereoisomeros son identicos, excepto en que son imagenes especulares entre si. Un estereoisomero especlfico tambien puede denominarse un enantiomero, y una mezcla de tales isomeros se denomina frecuentemente mezcla enantiomerica. Una mezcla 50:50 de enantiomeros se denomina una mezcla racemica o un racemato, que puede producirse si no ha habido estereoseleccion o estereoespecificidad en una reaccion qulmica o metodo. Los terminos “mezcla racemica” y “racemato” se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantiomericas, que carecen de la actividad optica.
Observese que, excepto como se trata mas adelante para las formas tautomeras, especlficamente excluidas del termino “isomeros”, como se usa en el presente documento, son isomeros estructurales (o constitucionales) (es decir, isomeros que se diferencian en las conexiones entre atomos en vez de simplemente por la posicion de atomos en el espacio). Por ejemplo, una referencia a un grupo metoxi, -OCH3, no debe interpretarse como una referencia a su isomero estructural, un grupo hidroximetilo, -CH2OH. Similarmente, una referencia al orto-clorofenilo no debe interpretarse como una referencia a su isomero estructural, meta-clorofenilo. Sin embargo, una referencia a una clase de estructuras puede incluir bien formas estructuralmente isomericas que se encuentran dentro de esa clase (por ejemplo, alquilo C1-7 incluye n-propilo e iso-propilo; butilo incluye n-, iso-, sec- y terc-butilo; metoxifenilo incluye orto-, meta- y para-metoxifenilo).
La exclusion anterior no se refiere a formas tautomeras, por ejemplo, formas ceto, enol y enolato, como en, por ejemplo, los siguientes pares tautomeros: ceto/enol (ilustrados mas adelante), imina/enamina, amida/iminoalcohol, amidina/amidina, nitroso/oxima, tiocetona/enetiol, -nitroso/hidroxiazo y nitro/aci-nitro.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
imagen24
El termino “tautomero” o “forma tautomera” se refiere a isomeros estructurales de diferentes energfas que son interconvertibles mediante una barrera de baja energfa. Por ejemplo, los tautomeros de protones (tambien conocidos como tautomeros prototropicos) incluyen interconversiones mediante la migration de un proton, tales como isomerizaciones ceto-enol e imina-enamina. Los tautomeros de Valencia incluyen interconversiones por reorganization de algunos de los electrones de enlace.
Observese que especfficamente incluidos en el termino “isomero” estan compuestos con una o mas sustituciones isotopicas. Por ejemplo, H puede estar en cualquier forma isotopica, que incluye 1H, 2H (D) y 3H (T); C puede estar en cualquier forma isotopica, que incluye C, C y C; O puede estar en cualquier forma isotopica, que incluye O y 18O; y similares.
Ejemplos de isotopos que pueden incorporarse en compuestos de la invention incluyen isotopos de hidrogeno, carbono, nitrogeno, oxfgeno, fosforo, fluor y cloro, tales como, pero no se limitan a 2H (deuterio, D), 3H (tritio), 11C, 13C, 14C, 15N, 18F, 31P, 3-2P, 35S, 36Cl y 125I. Diversos compuestos isotopicamente marcados de la presente invencion, por ejemplo, aquellos en los que los isotopos radiactivos tales como 3H, 13C y 14C se incorporan. Tales compuestos isotopicamente marcados pueden ser utiles en estudios metabolicos, estudios de cinetica de reaction, tecnicas de detection u obtencion de imagenes, tales como tomograffa de emision de positrones (PET) o tomograffa computerizada de emision monofotonica (SPECT) que incluyen ensayos de distribution en tejido de farmaco o sustrato, o en el tratamiento radiactivo de pacientes. Los compuestos terapeuticos marcados o sustituidos con deuterio de la invencion pueden tener propiedades de DMPK mejoradas (metabolismo y farmacocinetica del farmaco), referentes a la distribucion, metabolismo y secretion (ADME). La sustitucion con isotopos mas pesados tales como deuterio puede proporcionar ciertas ventajas terapeuticas resultantes de mayor estabilidad metabolica, por ejemplo, elevada semivida in vivo o requisitos de dosificacion reducidos. Un compuesto marcado con 18F puede ser util para estudios de PET o SPECT. Los compuestos isotopicamente marcados de la presente invencion y profarmacos de los mismos pueden prepararse generalmente llevando a cabo los procedimientos desvelados en los esquemas o en los ejemplos y preparaciones descritos mas adelante sustituyendo un reactivo no isotopicamente marcado por un reactivo isotopicamente marcado facilmente disponible. Ademas, la sustitucion con isotopos mas pesados, particularmente deuterio (es decir, 2H o D), puede proporcionar ciertas ventajas terapeuticas resultantes de mayor estabilidad metabolica, por ejemplo, elevada semivida in vivo o requisitos de dosificacion reducidos o una mejora en el fndice terapeutico. Se entiende que el deuterio en este contexto se considera un sustituyente. La concentration de un isotopo mas pesado tal, especfficamente deuterio, puede definirse por un factor de enriquecimiento isotopico En los compuestos de la presente invencion, cualquier atomo no especfficamente designado como un isotopo particular se indica que representa cualquier isotopo estable de ese atomo.
A menos que se especifique de otro modo, una referencia a un compuesto particular incluye todas aquellas formas isomericas, que incluyen mezclas (completa o parcialmente) racemicas y otras mezclas de las mismas. Los metodos para la preparation (por ejemplo, sfntesis asimetrica) y separation (por ejemplo, cristalizacion fraccionada y medios cromatograficos) de tales formas isomericas son tanto conocidos en la tecnica como se obtienen facilmente adaptando los metodos ensenados en el presente documento, o metodos conocidos, de una manera conocida.
Actividad biologica
Ensayos de proliferation celular in vitro
Generalmente, la actividad citotoxica o citostatica de un conjugado de anticuerpo-farmaco (ADC) se mide: exponiendo las celulas de mamffero que tienen protefnas al anticuerpo del ADC en un medio de cultivo celular; cultivar las celulas durante un periodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 dfas; y medir la viabilidad celular. Los ensayos in vitro basados en celulas se usan para medir la viabilidad (proliferacion), citotoxicidad e induction de apoptosis (activation por caspasas) de un ADC de la invencion.
La potencia in vitro de conjugados de anticuerpo-farmaco puede medirse por un ensayo de proliferacion celular. El ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® es un metodo de ensayo homogeneo comercialmente disponible (Promega Corp., Madison, WI) basado en la expresion recombinante de luciferasa de coleopteros (patentes de EE.UU. n° 5583024; 5674713 y 5700670). Este ensayo de proliferacion celular determina el numero de celulas viables en cultivo basandose en la cuantificacion de ATP presente, un indicador de celulas metabolicamente activas (Crouch y col. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88; documento US 6602677). El CellTiter-Glo® se realiza en formato de 96 pocillos, haciendolo susceptible a cribado de alta resolucion automatizado (HTS) (Cree y col. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404). El procedimiento de ensayo homogeneo implica anadir el unico reactivo (reactivo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CellTiter-Glo®) directamente a las celulas cultivadas en medio complementado con suero. No se requieren el lavado de celulas, eliminacion de medio y multiples etapas de pipeteado. El sistema detecta tan solo 15 celulas/pocillo en un formato de 384 pocillos en 10 minutos despues de anadir reactivo y mezclar. Las celulas pueden tratarse continuamente con ADC, o pueden tratarse y separarse de ADC. Generalmente, las celulas tratadas brevemente, es decir, 3 horas, mostraron los mismos efectos de potencia que las celulas continuamente tratadas.
El formato “anadir-mezclar-medir” homogeneo produce la lisis celular y generacion de una senal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente. La cantidad de ATP es directamente proporcional al numero de celulas presentes en el cultivo. El ensayo CellTiter-Glo® genera una senal luminiscente “de tipo brillo”, producida por la reaccion de la luciferasa, que tiene una semivida generalmente superior a cinco horas, dependiendo del tipo de celula y del medio usado. Las celulas viables se reflejan en unidades relativas de luminiscencia (URL). El sustrato, luciferina de escarabajo, se descarboxila oxidativamente por luciferasa de luciernaga recombinante, con la conversion concomitante de ATP en AMP y generacion de fotones.
La potencia in vitro de conjugados de anticuerpo-farmaco tambien puede medirse por un ensayo de citotoxicidad. Se lavan celulas adherentes cultivadas con PBS, se desprenden con tripsina, se diluyen en medio completo, que contiene 10 % de SBF, se centrifugan, se resuspenden en medio fresco y se cuentan con un hemocitometro. Los cultivos en suspension se cuentan directamente. Suspensiones monodispersas de celulas adecuadas para el recuento pueden requerir la agitacion de la suspension por aspiracion repetida para romper los grupos de celulas.
La suspension de celulas se diluye a la densidad de siembra deseada y se dispensa (100 pl por pocillo) en placas de 96 pocillos negras. Se incuban placas de llneas de celulas adherentes durante la noche para permitir la adherencia. Pueden usarse cultivos celulares en suspension el dla de la siembra.
Se prepara una solucion madre (1 ml) de ADC (20 pg/ml) en el medio de cultivo celular apropiado. Se preparan diluciones de 10 veces en serie de ADC de solucion madre en tubos de centrlfuga de 15 ml transfiriendo en serie 100 pl a 900 pl de medio de cultivo celular.
Se dispensan cuatro pocillos por duplicado de cada dilucion de ADC (100 pl) en placas de 96 pocillos negras, previamente sembradas con suspension de celulas (100 pl), produciendo un volumen final de 200 pl. Los pocillos de control reciben medio de cultivo celular (100 pl).
Si el tiempo de duplication de la llnea celular es superior a 30 horas, la incubation de ADC es durante 5 dlas, si no se hace una incubacion de cuatro dlas.
Al final del periodo de incubacion, se evalua la viabilidad celular con el ensayo de azul Alamar. Se dispensa azul Alamar (Invitrogen) sobre la placa completa (20 pl por pocillo) y se incuba durante 4 horas. Se mide la fluorescencia de azul Alamar a la excitation de 570 nm, emision de 585 nm sobre el lector de placas Varioskan Flash. El porcentaje de supervivencia celular se calcula a partir de la fluorescencia media en los pocillos tratados con ADC en comparacion con la fluorescencia media en los pocillos de control.
Uso
Los conjugados de la invention pueden usarse para proporcionar un compuesto de PBD en una localization diana.
La localizacion diana es preferentemente una poblacion de celulas proliferativas. El anticuerpo es un anticuerpo para un antlgeno presente sobre una poblacion de celulas proliferativas.
En una realization, el antlgeno esta ausente o presente a un nivel reducido en una poblacion de celulas no proliferativas en comparacion con la cantidad de antlgeno presente en la poblacion de celulas proliferativas, por ejemplo, una poblacion de celulas tumorales.
En la localizacion diana, el conector puede escindirse de manera que libere un compuesto RelA, RelB, RelC, RelD o RelBRelE. Asl, el conjugado puede usarse para proporcionar selectivamente un compuesto RelA, RelB, Rel C, RelD o RelBRelE a la localizacion diana.
El conector puede escindirse por una enzima presente en la localizacion diana.
La localizacion diana puede ser in vitro, in vivo o ex vivo.
Los compuestos de conjugado de anticuerpo-farmaco (ADC) de la invencion incluyen aquellos con utilidad para actividad contra el cancer. En particular, los compuestos incluyen un anticuerpo conjugado, es decir, covalentemente unido por un conector, a un resto de farmaco de PBD, es decir, toxina. Si el farmaco no esta conjugado a un anticuerpo, el farmaco de PBD tiene un efecto citotoxico. La actividad biologica del resto de farmaco de PBD se modula asl por conjugation con un anticuerpo. Los conjugados de anticuerpo-farmaco (ADC) de la invencion administran selectivamente una dosis eficaz de un agente citotoxico a tejido tumoral, por lo que puede conseguirse
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
mayor selectividad, es decir, una menor dosis eficaz.
Asl, en un aspecto, la presente invention proporciona un compuesto de conjugado como se describe en el presente documento para su uso en terapia.
En otro aspecto tambien se proporciona un compuesto de conjugado como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa. Un segundo aspecto de la presente invencion proporciona el uso de un compuesto conjugado en la fabrication de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad proliferativa.
Un experto habitual en la materia puede determinar facilmente si un conjugado candidato trata o no una afeccion proliferativa para cualquier tipo de celula particular. Por ejemplo, ensayos que pueden usarse convenientemente para evaluar la actividad ofrecida por un compuesto particular se describen en los siguientes ejemplos.
El termino “enfermedad proliferativa” se refiere a una proliferation celular no deseada o no controlada de celulas excesivas o anormales que es no deseada, tal como crecimiento neoplasico o hiperplasico, tanto in vitro como in vivo.
Ejemplos de afecciones proliferativas incluyen, pero sin limitaciones, proliferacion celular benigna, pre-maligna y maligna, que incluyen, pero sin limitaciones, neoplasias y tumores (por ejemplo, histiocitoma, glioma, astrocitoma, osteoma), canceres (por ejemplo, cancer de pulmon, cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer gastrointestinal, cancer del intestino, cancer de colon, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, cancer de prostata, cancer testicular, cancer de hlgado, cancer de rinon, cancer de vejiga, cancer de pancreas, cancer cerebral, sarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma), linfomas, leucemias, psoriasis, enfermedades de los huesos, trastornos fibroproliferativos (por ejemplo, de tejidos conjuntivos) y aterosclerosis. Canceres de particular interes incluyen, pero sin limitaciones, leucemias y canceres de ovario.
Puede tratarse cualquier tipo de celula, que incluye, pero no se limita a, pulmon, gastrointestinal (que incluye, por ejemplo, intestino, colon), mama (mamario), de ovario, prostata, hlgado (hepatico), rinon (renal), vejiga, pancreas, cerebro y piel.
Canceres de interes concreto incluyen, entre otros, canceres de mama, gastrico o de vejiga urinaria.
Se contempla que los conjugados de anticuerpo-farmaco (ADC) de la presente invencion pueden usarse para tratar diversas enfermedades o trastornos, por ejemplo, caracterizados por la expresion en exceso de un antlgeno de tumor. Afecciones o trastornos hiperproliferativos a modo de ejemplo incluyen tumores benignos o malignos; leucemia, tumores malignos hematologicos y linfoides. Otros incluyen trastornos neuronales, de la glia, astroclticos, hipotalamicos, glandulares, macrofagicos, epiteliales, del estroma, blastocelicos, inflamatorios, angiogenicos e inmunologicos, que incluyen autoinmunitarios.
Generalmente, la enfermedad o trastorno que va a tratarse es una enfermedad hiperproliferativa tal como cancer. Ejemplos de cancer que van a tratarse en el presente documento incluyen, pero sin limitaciones, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Mas ejemplos particulares de tales canceres incluyen cancer de celulas escamosas (por ejemplo, cancer de celulas escamosas epiteliales), cancer de pulmon que incluye cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de pulmon de celulas no pequenas, adenocarcinoma de pulmon y carcinoma escamoso de pulmon, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrico o del estomago que incluye cancer gastrointestinal, cancer pancreatico, glioblastoma, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de hlgado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer rectal, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glandulas salivares, cancer de rinon o renal, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico, carcinoma anal, carcinoma de pene, ademas de cancer de cabeza y cuello.
Enfermedades autoinmunitarias para las que los compuestos de ADC pueden usarse en el tratamiento incluyen trastornos reumatologicos (tales como, por ejemplo, artritis reumatoide, slndrome de Sjogren, esclerodermia, lupus tales como LES y nefritis lupica, polimiositis/dermatomiositis, crioglobulinemia, slndrome de anticuerpos antifosfollpidos y artritis psoriasica), osteoartritis, trastornos autoinmunitarios gastrointestinales y del hlgado (tales como, por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), gastritis autoinmunitaria y anemia perniciosa, hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria y celiaqula), vasculitis (tal como, por ejemplo, vasculitis asociada a ANCA, que incluye vasculitis de Churg- Strauss, granulomatosis de Wegener y poliarteritis), trastornos neurologicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, esclerosis multiple, slndrome de opsoclono-mioclono, miastenia grave, neuromielitis optica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y polineuropatlas autoinmunitarias), trastornos renales (tales como, por ejemplo, glomerulonefritis, slndrome de Goodpasture y enfermedad de Berger), trastornos dermatologicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, psoriasis, urticaria, ronchas, penfigo vulgar, penfigoide bulloso y lupus eritematoso cutaneo), trastornos hematologicos (tales como, por ejemplo, purpura trombocitopenica, purpura trombocitopenica trombotica, purpura post-transfusion y anemia hemolltica autoinmune), aterosclerosis, uveitis,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
enfermedades auditivas autoinmunitarias (tales como, por ejemplo, enfermedad del oldo interno y sordera parcial), enfermedad de Behcet, slndrome de Raynaud, trasplante de organos y trastornos endocrinos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias relacionadas con la diabetes tales como diabetes mellitus dependiente de insulina (DMDI), enfermedad de Addison y enfermedad tiroidea autoinmunitaria (por ejemplo, enfermedad de Graves y tiroiditis)). Tales enfermedades mas preferidas incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, vasculitis asociada a ANCA, lupus, esclerosis multiple, slndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, DMDI, anemia perniciosa, tiroiditis y glomerulonefritis.
Metodos de tratamiento
Los conjugados de la presente invention pueden usarse en un metodo de terapia.
La cantidad real administrada, y la tasa y tiempo-ciclo de administration, dependera de la naturaleza y gravedad de lo que este tratandose. La prescription del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificacion, esta dentro de la responsabilidad de medicos generales y otros doctores medicos.
Un compuesto de la invencion puede administrarse solo o en combination con otros tratamientos, tanto simultaneamente como secuencialmente dependiendo de la afeccion que vaya a tratarse. Ejemplos de tratamientos y terapias incluyen, pero sin limitaciones, quimioterapia (la administracion de agentes activos, que incluyen, por ejemplo, farmacos, tales como quimioterapeuticos); cirugla; y radioterapia.
Un “agente quimioterapeutico” es un compuesto qulmico util en el tratamiento de cancer, independientemente del mecanismo de action. Clases de agentes quimioterapeuticos incluyen, pero sin limitaciones, agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de las plantas de venenos del huso, antibioticos citotoxicos/antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, anticuerpos, fotosensibilizadores e inhibidores de cinasas. Los agentes quimioterapeuticos incluyen compuestos usados en “terapia dirigida” y quimioterapia convencional.
Ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen: erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), docetaxel (TaXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (fluorouracilo, 5-fluorouracilo, CAS n° 51-21-8), gemcitabina (GEmZaR®, Lilly), PD-0325901 (CAS n° 391210-10-9, Pfizer), cisplatino (cis-diamina, dicloroplatino (II), CAS n° 15663-27-1), carboplatino (CAS n° 41575-94-4), paclitaxel (tAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomida (4-metil-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabiciclo[4.3.0]nona-2,7,9- trieno-9-carboxamida, CAS n° 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tamoxifeno ((Z)-2-[4-(1,2- difenilbut-1-enil)fenoxi]-N,N-dimetiletanamina, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALoDeX®) y doxorubicina
(ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD y rapamicina.
Mas ejemplos de agentes quimioterapeuticos incluyen: oxaliplatino (ELOXATIN®, Sanofi), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITiNiB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), mesilato de imatinib (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (inhibidor Mek, Exelixis, documento WO 2007/044515), ARRY-886 (inhibidor de Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (inhibidor de PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ-235 (inhibidor de PI3K, Novartis), XL-147 (inhibidor de PI3K, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), leucovorina (acido follnico), rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SARASAR™, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotecan (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTrA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (sin Cremophor), formulaciones de nanopartlculas manipuladas con albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), clorambucilo, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSmithKline), canfosfamida (TELCYTA®, Telik), tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®); alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); una camptotecina (incluyendo el analogo sintetico topotecan); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus analogos sinteticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los analogos sinteticos KW- 2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas del nitrogeno tales como clorambucilo, clornafacina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibioticos tales como los antibioticos de enedilna (por ejemplo, caliqueamicina, caliqueamicina gamma 1I, caliqueamicina omega l1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; ademas de cromoforo de neocarzinostatina y cromoforos antibioticos de cromoprotelna enedilna relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, nemorubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
fluorouracilo (5-FU); analogos de acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenergicos tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de acido folico tal como acido frollnico; aceglatona; glucosido de aldofosfamida; acido aminolevullnico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio, hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; acido podofillnico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacaridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; acido tenuazonico; triazicuona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; analogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®, Roche); ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como acido retinoico; y sales, acidos y derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Tambien se incluyen en la definicion de “agente quimioterapeutico”: (i) agentes antihormonales que actuan para regular o inhibir la accion de hormonas sobre tumores tales como antiestrogenos y moduladores de receptores de estrogenos selectivos (SERM), que incluyen, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona y FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la produccion de estrogenos en las glandulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer), formestanio, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) y ARIMIDAX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrogenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; ademas de troxacitabina (un analogo de 1,3- dioxolano nucleosido citosina); (iv) inhibidores de protelnas cinasas tales como inhibidores de MEK (documento WO 2007/044515); (v) inhibidores de llpido cinasas; (vi) oligonucleotidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresion de genes en rutas de senalizacion que participan en la proliferacion celular anomala, por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras, tales como oblimersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (vii) ribozimas tales como inhibidores de la expresion de VEGF (por ejemplo, ANGIOZYME®) e inhibidores de la expresion de HER2; (viii) vacunas tales como vacunas de terapia genica, por ejemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® y VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidores de la topoisomerasa 1 tales como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; (ix) agentes antiangiogenicos tales como bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); y sales, acidos y derivados farmaceuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Tambien se incluyen en la definicion de “agente quimioterapeutico” anticuerpos terapeuticos tales como alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuximab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen),M rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), ofatumumab (ARzErRA®, GSK), pertuzumab (PERJEtA™, OMNITArG™, 2C4, Genentech), trastuzumab (hErCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), y el conjugado de anticuerpo-farmaco gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth).
Anticuerpos monoclonales humanizados con potencial terapeutico como agentes quimioterapeuticos en combinacion con los conjugados de la invencion incluyen: alemtuzumab, apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bevacizumab, bivatuzumab mertansine, cantuzumab mertansine, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daclizumab, eculizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicina, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, ocrelizumab, omalizumab, palivizumab, pascolizumab, pecfusituzumab, pectuzumab, pertuzumab, pexelizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, tacatuzumab tetraxetano, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, trastuzumab, tucotuzumab celmoleucina, tucusituzumab, umavizumab, urtoxazumab y visilizumab.
Las composiciones farmaceuticas segun la presente invencion, y para su uso segun la presente invencion, pueden comprender, ademas del principio activo, es decir, un compuesto de conjugado, un excipiente farmaceuticamente aceptable, vehlculo, tampon, estabilizador u otros materiales muy conocidos para aquellos expertos en la materia. Tales materiales deben ser no toxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehlculo u otro material dependera de la via de administration, que puede ser oral, o mediante inyeccion, por ejemplo, cutanea, subcutanea o intravenosa.
Las composiciones farmaceuticas para administracion por via oral pueden estar en forma de comprimido, capsula, polvo o llquido. Un comprimido puede comprender un vehlculo solido o un adyuvante. Las composiciones farmaceuticas llquidas generalmente comprenden un vehlculo llquido tal como agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintetico. Pueden incluirse solution salina fisiologica, dextrosa u otra solution de sacaridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Una capsula puede comprender un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
vehlcuio solido tal como una gelatina.
Para inyeccion intravenosa, cutanea o subcutanea, o inyeccion en el sitio de afliccion, el principio activo estara en forma de una solucion acuosa parenteralmente aceptable que esta libre de pirogenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Aquellos expertos habituales en la materia son perfectamente capaces de preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehlculos isotonicos tales como inyeccion de cloruro sodico, inyeccion de Ringer, inyeccion de Ringer con lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, segun se requiera.
Formulaciones
Aunque es posible usar el compuesto de conjugado (por ejemplo, administrarse) solo, frecuentemente es preferible que este presente como una composicion o formulacion.
En una realizacion, la composicion es una composicion farmaceutica (por ejemplo, formulacion, preparacion, medicamento) que comprende un compuesto de conjugado, como se describe en el presente documento, y un vehlculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
En una realizacion, la composicion es una composicion farmaceutica que comprende al menos un compuesto de conjugado, como se describe en el presente documento, junto con uno o varios de otros componentes farmaceuticamente aceptables muy conocidos para aquellos expertos en la materia, que incluyen, pero no se limitan a, vehlculos, diluyentes, excipientes, adyuvantes, cargas, tampones, conservantes, antioxidantes, lubricantes, estabilizadores, solubilizantes, tensioactivos (por ejemplo, agentes humectantes), agentes enmascaradores, agentes colorantes, aromatizantes y edulcorantes farmaceuticamente aceptables.
En una realizacion, la composicion comprende ademas otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes terapeuticos o profilacticos.
Vehlculos, diluyentes, excipientes adecuados, etc., pueden encontrarse en textos farmaceuticos estandar. Veanse, por ejemplo, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2a edicion (eds. M. Ash y I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, Nueva York, EE.UU.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edicion, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edicion, 1994.
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a metodos de preparacion de una composicion farmaceutica que comprenden mezclar al menos un conjugado radiomarcado con [11C] o compuesto similar a conjugado, como se define en el presente documento, junto con uno o varios de otros componentes farmaceuticamente aceptables muy conocidos para aquellos expertos en la materia, por ejemplo, vehlculos, diluyentes, excipientes, etc. Si se formulan como unidades discretas (por ejemplo, comprimidos, etc.), cada unidad contiene una cantidad predeterminada (dosificacion) del compuesto activo.
El termino “farmaceuticamente aceptable”, como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos, componentes, materiales, composiciones, formas de dosificacion, etc., que son, dentro del alcance del criterio medico sensato, adecuados para su uso en contacto con los tejidos del sujeto en cuestion (por ejemplo, humano) sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica, u otro problema o complicacion, proporcional a una relacion de beneficio/riesgo razonable. Cada vehlculo, diluyente, excipiente, etc., debe tambien ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros componentes de la formulacion.
Las formulaciones pueden prepararse por cualquier metodo muy conocido en la tecnica de la farmacia. Tales metodos incluyen la etapa de poner en asociacion el compuesto activo con un vehlculo que constituye uno o mas componentes accesorios. En general, las formulaciones se preparan poniendo uniforme e Intimamente en asociacion el compuesto activo con vehlculos (por ejemplo, vehlculos llquidos, vehlculo solido finamente dividido, etc.), y luego moldear el producto, si fuera necesario.
La formulacion puede prepararse para proporcionar liberacion rapida o lenta; inmediata, retardada, controlada o liberacion sostenida; o una combination de las mismas.
Las formulaciones adecuadas para administration parenteral (por ejemplo, mediante inyeccion) incluyen llquidos esteriles, libres de pirogenos, isotonicos, acuosos o no acuosos (por ejemplo, disoluciones, suspensiones), en los que el principio activo se disuelve, suspende o proporciona de otro modo (por ejemplo, en un liposoma u otra micropartlcula). Tales llquidos pueden contener adicionalmente otros componentes farmaceuticamente aceptables, tales como antioxidantes, tampones, conservantes, estabilizadores, bacteriostaticos, agentes de suspension, espesantes y solutos que convierten la formulacion en isotonica con la sangre (u otro fluido corporal relevante) del receptor previsto. Ejemplos de excipientes incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerol, aceites vegetales y similares. Ejemplos de vehlculos isotonicos adecuados para su uso en tales formulaciones incluyen inyeccion de cloruro sodico, solucion de Ringer o inyeccion de Ringer con lactato. Normalmente, la concentration del principio activo en el llquido es de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 10 pg/ml, por ejemplo, de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1 pg/ml. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes cerrados de dosis unitaria o multi-dosis, por ejemplo, ampollas y viales, y puede almacenarse en una condicion secada por congelation (liofilizada) que requiere solo la adicion del vehlculo llquido esteril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones para inyeccion extemporanea a partir de polvos esteriles, granulos y comprimidos.
Dosificacion
Se apreciara por un experto en la materia que las dosificaciones apropiadas del compuesto de conjugado, y composiciones que comprenden el compuesto de conjugado, pueden variar de paciente a paciente. Determinar la dosificacion optima implicara generalmente equilibrar el nivel de beneficio terapeutico contra cualquier riesgo o efectos secundarios perjudiciales. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de varios factores que incluyen, pero sin limitaciones, la actividad del compuesto particular, la via de administration, el momento de administration, la tasa de elimination del compuesto, la duration del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combination, la gravedad de la afeccion, y la especie, sexo, edad, peso, afeccion, salud general e historia medica previa del paciente. La cantidad de compuesto y la via de administracion seran por ultimo lugar a criterio del medico, veterinario o profesional cllnico, aunque generalmente la dosificacion se seleccionara para lograr concentraciones locales en el sitio de action que consiguen el efecto deseado sin causar efectos secundarios nocivos o perjudiciales sustanciales.
La administracion puede efectuarse en una dosis, continuamente o intermitentemente (por ejemplo, en dosis divididas a intervalos apropiados) durante el transcurso del tratamiento. Metodos de determination de los medios mas eficaces y de dosificacion de la administracion son muy conocidos para aquellos expertos en la materia y variaran con la formulation usada para la terapia, el fin de la terapia, la(s) celula(s) diana(s) que esta(n) tratandose y el sujeto que esta tratandose. Pueden llevarse a cabo administraciones individuales o multiples con el nivel de dosis y patron que se selecciona por el medico practico, veterinario o profesional cllnico.
En general, una dosis adecuada del compuesto activo esta en el intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 25 mg (mas normalmente aproximadamente 1 pg a aproximadamente 10 mg) por kilogramo de peso corporal del sujeto por dla. Si el compuesto activo es una sal, un ester, una amida, un profarmaco o similar, la cantidad administrada se calcula basandose en el compuesto parental y as! el peso real que va a usarse se aumenta proporcionalmente.
En una realization, el compuesto activo se administra a un paciente humano segun la siguiente pauta de dosificacion: aproximadamente 100 mg, 3 veces al dla.
En una realizacion, el compuesto activo se administra a un paciente humano segun la siguiente pauta de dosificacion: aproximadamente 150 mg, 2 veces al dla.
En una realizacion, el compuesto activo se administra a un paciente humano segun la siguiente pauta de dosificacion: aproximadamente 200 mg, 2 veces al dla.
Sin embargo en una realizacion, el compuesto de conjugado se administra a un paciente humano segun la siguiente pauta de dosificacion: aproximadamente 50 o aproximadamente 75 mg, 3 o 4 veces al dla.
En una realizacion, el compuesto de conjugado se administra a un paciente humano segun la siguiente pauta de dosificacion: aproximadamente 100 o aproximadamente 125 mg, 2 veces al dla.
Las cantidades de dosificacion descritas anteriormente pueden aplicarse al conjugado (incluyendo el resto de PBD y el conector al anticuerpo) o a la cantidad eficaz de compuesto de PBD proporcionada, por ejemplo, la cantidad de compuesto que es liberable despues de la escision del conector.
Para la prevention o tratamiento de enfermedad, la dosificacion apropiada de un ADC de la invention dependera del tipo de enfermedad que va a tratarse, como se ha definido anteriormente, la gravedad y transcurso de la enfermedad, si la molecula se administra para fines preventivos o terapeuticos, terapia previa, la historia cllnica del paciente y respuesta al anticuerpo, y el criterio del medico adjunto. La molecula se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de molecula es una dosificacion candidata inicial para administracion al paciente, tanto, por ejemplo, por una como mas administraciones separadas, o por infusion continua. Una dosificacion diaria tlpica podrla oscilar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Una dosificacion a modo de ejemplo de ADC que va a administrarse a un paciente esta en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso del paciente. Para administraciones repetidas durante varios dlas o mas, dependiendo de la afeccion, el tratamiento es sostenido hasta que se produce una supresion deseada de los slntomas de la enfermedad. Una pauta de dosificacion a modo de ejemplo comprende un ciclo de administracion de una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido de dosis adicionales cada semana, dos semanas o tres semanas de un ADC. Pueden ser utiles otras pautas de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
dosificacion. El progreso de esta terapia se monitoriza facilmente por tecnicas y ensayos convencionales. Tratamiento
El termino “tratamiento”, como se usa en el presente documento en el contexto de tratar una afeccion, se refiere generalmente a tratamiento y terapia, tanto de un ser humano como un animal (por ejemplo, en aplicaciones veterinarias), en el que se logra algun efecto terapeutico deseado, por ejemplo, la inhibicion del progreso de la afeccion, e incluye una reduccion en la tasa de progreso, una detencion en la tasa de progreso, regresion de la afeccion, mejora de la afeccion y cura de la afeccion. Tambien se incluye el tratamiento como medida profilactica (es decir, profilaxis, prevencion).
El termino “cantidad terapeuticamente eficaz”, como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un compuesto activo, o un material, composicion o dosificacion que comprende un compuesto activo, que es eficaz para producir algun efecto terapeutico deseado, proporcional a una relacion de beneficio/riesgo razonable, cuando se administra segun una pauta de tratamiento deseada.
Similarmente, el termino “cantidad profilacticamente eficaz”, como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un compuesto activo, o un material, composicion o dosificacion que comprende un compuesto activo, que es eficaz para producir algun efecto profilactico deseado, proporcional a una relacion de beneficio/riesgo razonable, cuando se administra segun una pauta de tratamiento deseada.
Preparation de conjugados de farmaco
Los conjugados de anticuerpo-farmaco pueden prepararse por varias vlas, empleando reacciones de qulmica organica, condiciones y reactivos conocidos para aquellos expertos en la materia, que incluyen reaccion de un grupo nucleofilo de un anticuerpo o anticuerpo con un farmaco-reactivo de conector. Este metodo puede emplearse para preparar los conjugados de anticuerpo-farmaco de la invencion.
Grupos nucleofilos sobre anticuerpos incluyen, pero sin limitaciones, grupos tiol de la cadena lateral, por ejemplo, cistelna. Los grupos tiol son nucleofilos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofilos sobre restos de conector tales como aquellos de la presente invencion. Ciertos anticuerpos tienen disulfuros entre cadenas reducibles, es decir, puentes de cistelna. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugacion con reactivos de conector mediante tratamiento con un agente reductor tal como DTT (reactivo de Cleland, ditiotreitol) o TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina; Getz y col. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Cada puente de disulfuro de cistelna formara asl, teoricamente, dos nucleofilos de tiol reactivos. Grupos nucleofilos adicionales pueden introducirse en anticuerpos mediante la reaccion de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut), produciendo la conversion de una amina en un tiol.
El sujetolpaciente
El sujeto/paciente puede ser un animal, mamlfero, un mamlfero placentario, un marsupial (por ejemplo, canguro, tejon australiano), un monotremo (por ejemplo, ornitorrinco), un roedor (por ejemplo, una cobaya, un hamster, una rata, un raton), murino (por ejemplo, un raton), un lagomorfo (por ejemplo, un conejo), aviar (por ejemplo, un ave), canino (por ejemplo, un perro), felino (por ejemplo, un gato), equino (por ejemplo, un caballo), porcino (por ejemplo, un cerdo), ovino (por ejemplo, una oveja), bovino (por ejemplo, una vaca), un primate, simio (por ejemplo, un simio inferior o simio superior), un simio inferior (por ejemplo, titl, babuino), un simio superior (por ejemplo, gorila, chimpance, orangutan, gibon), o un ser humano.
Ademas, el sujeto/paciente puede estar en cualquiera de sus formas de desarrollo, por ejemplo, un feto. En una realizacion preferida, el sujeto/paciente es un ser humano.
Ejemplos
Metodos experimentales generales
Las rotaciones opticas se midieron en un polarlmetro ADP 220 (Bellingham Stanley Ltd.) y las concentraciones (c) se facilitan en g/100 ml. Los puntos de fusion se midieron usando un aparato de punto de fusion digital (electrotermico). Los espectros de IR se registraron en un espectrometro de IR Spectrum 1000 FT de Perkin-Elmer. Los espectros de RMN 1H y 13C se adquirieron a 300 K usando un espectrometro de RMN de Bruker Avance a 400 y 100 MHz, respectivamente. Los desplazamientos qulmicos se informan con respecto a TEM (8 = 0,0 ppm) y las senales se designan s (singlete), d (doblete), t (triplete), dt (triplete doble), dd (doblete de dobletes), ddd (doblete doble de dobletes) o m (multiplete), con las constantes de acoplamiento dadas en hercios (Hz). Se recogieron datos de espectroscopla de masas (EM) usando un instrumento Micromass ZQ de Waters acoplado a una HPLC 2695 de Waters con una PDA 2996 de Waters. Los parametros de Micromass ZQ de Waters usados fueron: capilar (kV), 3,38; cono (V), 35; extractor (V), 3,0; temperatura de la fuente (°C), 100; temperatura de desolvatacion ( °C), 200; velocidad de flujo del cono (l/h), 50; velocidad de flujo de desolvatacion (l/h), 250. Los datos de espectroscopla de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
masas de alta resolution (HR-EM) se registraron en un Micromass QTOF Global de Waters en modo W positivo usando puntas de vidrio de borosilicato recubiertas de metal para introducir las muestras en el instrumento. Se realizo cromatografla en capa fina (CCF) sobre placas de aluminio de gel de sllice (Merck 60, F254), y la cromatografla ultrarrapida utilizo gel de sllice (Merck 60, 230-400 de malla ASTM). Excepto por el HOBt (NovaBiochem) y los reactivos soportados sobre solido (Argonaut), todos los otros productos qulmicos y disolventes se compraron de Sigma-Aldrich y se usaron como se suministraron sin mas purification. Se prepararon disolventes anhidros mediante destilacion bajo una atmosfera de nitrogeno seca en presencia de un agente secante apropiado, y se almacenaron sobre tamices moleculares de 4A o alambre de sodio. Eter de petroleo se refiere a la fraction que hierve a 40-60 °C.
Condiciones generales de CL/EM:
Metodo 1 (metodo predeterminado, utilizado a menos que se indique lo contrario)
La HPLC (Waters Alliance 2695) se realizo usando una fase movil de agua (A) (acido formico 0,1 %) y acetonitrilo (B) (acido formico 0,1 %). Gradiente: composition inicial 5 % de B durante 1,0 min, a continuation 5 % de B a 95 % de B durante un periodo de 3 min. La composicion se mantuvo durante 0,1 min al 95 % de B, y a continuacion volvio a 5 % de B en 0,03 minutos y se mantuvo all! durante 0,87 min. El tiempo de ejecucion total del gradiente es igual a 5 min.
Metodo 2
La HPLC (Waters Alliance 2695) se realizo usando una fase movil de agua (A) (acido formico 0,1 %) y acetonitrilo (B) (acido formico 0,1 %). Gradiente: composicion inicial 5 % de B durante 1,0 min, a continuacion 5 % de B a 95 % de B durante un periodo de 2.5 min. La composicion se mantuvo durante 0,5 min al 95 % de B, y a continuacion volvio a 5 % de B en 0,1 minutos y se mantuvo all! durante 0,9 min. El tiempo de ejecucion total del gradiente es igual a 5 min
Para ambos metodos
Velocidad de flujo 3,0 ml/min, se fraccionaron 400 pl mediante una pieza en T de volumen muerto cero que pasa al espectrometro de masas. Intervalo de detection de longitud de onda: 220 a 400 nm. Tipo de funcion: matriz de diodos (535 barridos). Columna: Phenomenex® Onyx Monolithic C18 50 x 4,60 mm
Las condiciones de purificacion ultrarrapida de fase inversa fueron las siguientes: Se llevo a cabo el sistema de purificacion ultrarrapida (Varian 971-Fp) usando una fase movil de agua (A) y acetonitrilo (B). Gradiente: composicion inicial 5 % de B sobre 20 C.V. (Volumen de la columna) y luego 5 % de B a 70 % de B dentro de 60 C.V. La composicion se mantuvo durante 15 °C. A 95 % de B, y luego se devolvio a 5 % de B en 5 C.V. y se mantuvo a 5 % de B durante 10 C.V. El tiempo de ejecucion del gradiente total es igual a 120 C.V. Caudal 6,0 ml/min. Alcance de deteccion de longitud de onda: 254 nm. Columna: Agilent AX1372-1 SF10-5.5gC8.
HPCL preparativa: Se realizo cromatografla llquida de alta resolucion de fase inversa (UPLC) en columnas Phenomenex Gemini NX 5p C-18 de las siguientes dimensiones: 150 x 4,6 mm Para el analisis, y 150 x 21,20 mm para el trabajo preparatorio. Todos los experimentos de UPLC se realizaron con condiciones de gradiente. Los eluyentes usados fueron disolvente A (H2O con acido formico al 0,1 %) y disolvente B (CH3CN con acido formico al 0,1 %). Los caudales usadps fueron de 1,0 ml/min para analltica y de 20,0 ml/min para HPLC preparativa. La deteccion estaba a 254 y 280 nm.
Sfntesis del intermedio 12
5
10
15
20
25
30
35
40
imagen25
(a) 1’,3’-Bis[2-metoxi-4-(metoxicarbonil)fenoxi]propano (3)
Se anadio azodicarboxilato de diisopropilo (71,3 ml, 73,2 g, 362 mmoles) gota a gota durante un periodo de 60 minutos a una solucion agitada superior de vanilato de metilo 2 (60,0 g, 329 mmol) y Pt^P (129,4 g, 494 mmol) en anhidro THF (800 ml) a 0-5 °C (hielo/acetona) en una atmosfera de nitrogeno. La mezcla de reaccion se dejo agitar a 0-5 °C durante 1 hora adicional, despues de lo cual se anadio gota a gota una solucion de 1,3-propanodiol (11,4 ml, 12,0 g, 158 mmol) en THF (12 ml) durante un periodo de 20 minutos. La mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante 5 dlas. El precipitado blanco resultante 3 se recogio mediante filtracion a vaclo, se lavo con THF y se seco en un desecador de vaclo hasta peso constante. Rendimiento = 54,7 g (84 % basado en 1,3 -propanodiol). Pureza satisfactoria mediante LC/MS (3,20 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 427 ([M + Na]+-, 10); RMN 1H (400 MHz, CDCla) 5 7,64 (dd, 2H, J = 1,8, 8,3 Hz), 7,54 (d, 2H, J = 1,8 Hz), 6,93 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 4,30 (t, 4H, J = 6,1 Hz), 3,90 (s, 6H), 3,89 (s, 6H), 2,40 (p, 2H, J = 6,0 Hz).
(a) 1 ’,3’-Bis[2-metoxi-4-(metoxicarbonil)-5-nitrofenoxi]propano (4)
Se anadio Cu(NO3)2.3H2O solido (81,5 g, 337,5 mmol) lentamente a una suspension agitada aerea del bis-ester 3 (54,7 g, 135 mmol) en anhldrido acetico (650 ml) a 0-5 °C (hielo /acetona). La mezcla de reaccion se dejo agitar durante 1 hora a 0-5 °C y despues se dejo calentar a temperatura ambiente. En esta etapa se observo una exotermia suave (aproximadamente 40-50 °C), acompanada por un espesamiento de la mezcla y evolucion de NO2. Se anadio anhldrido acetico adicional (300 ml) y la mezcla de reaccion se dejo agitar durante 16 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se vertio sobre hielo (~ 1,5 l), se agito y se dejo volver a temperatura ambiente. El precipitado amarillo resultante se recogio por filtracion a vaclo y se seco en un desecador para proporcionar el compuesto bis-nitro 4 deseado como un solido amarillo. Rendimiento 66,7 g (100 %). Pureza satisfactoria mediante LC/MS (3,25 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 517 ([M + Na]+, 40); RMN rH (400 MHz, CDCla) 5 7,49 (s, 2H), 7,06 (s, 2H), 4,32 (t, 4H, J = 6,0 Hz), 3,95 (s, 6H), 3,90 (s, 6H), 2,45-2,40 (m, 2H).
(c) 1',3'-Bis[4-carboxi-2-metoxi-5-nitrofenoxi]propano (5)
Una suspension del ester metllico 4 (66,7 g, 135 mmol) en THF (700 ml) se trato con NaOH 1 N (700 ml) y la mezcla de reaccion se dejo agitar vigorosamente a temperatura ambiente. Despues de 4 dlas de agitacion, la suspension se convirtio en una solucion de color oscuro que se sometio a evaporacion rotatoria a presion reducida para eliminar el THF. El residuo acuoso resultante se acidifico a pH 1 con HCl concentrado y el precipitado incoloro 5 se recogio y se seco completamente en un horno de vaclo (50 °C). Rendimiento 54,5 g (87 %). Pureza satisfactoria mediante LC/MS (2,65 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 489 ([M + Na]+, 30); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 7,62 (s, 2H), 7,30 (s, 2H), 4,29 (t, 4H, J = 6,0 Hz), 3,85 (s, 6H), 2,30 (s, 6H), -2,26-2,40 (m, 2H).
(d) 1,1'-[[(Propan-1,3-diil)dioxi]bis[(5-metoxi-2-nitro-1,4-fenilen)carbonil]]bis[(2S,4R)-metil-4-hidroxipirrolidin-2- carboxilato] (6)
Se anadio cloruro de oxalilo (24,5 ml, 35,6 g, 281 mmol) a una suspension agitada del acido nitrobenzoico 5 (43 g, 92,3 mmol) y DMF (6 ml) en DCM anhidro (600 ml). Despues de la efervescencia inicial, la suspension de reaccion
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
se convirtio en una solucion y la mezcla se dejo agitar a temperatura ambiente durante 16 horas. La conversion al cloruro de acido se confirmo tratando una muestra de la mezcla de reaccion con MeOH y se observo el ester bis- metllico resultante mediante CL/EM. La mayorla del disolvente se elimino por evaporacion a presion reducida; la solucion concentrada resultante se redisolvio en una cantidad minima de DCM seco y se trituro con eter dietllico. El precipitado amarillo resultante se recogio por filtracion, se lavo con eter dietllico frlo y se seco durante 1 hora en un horno de vaclo a 40 °C. El cloruro de acido solido se anadio en porciones durante un periodo de 25 minutos a una suspension agitada de clorhidrato de (2S, 4R) -metil-4-hidroxipirrolidina-2-carboxilato (38,1 g, 210 mmol) y TEA (64,5 ml, g, 463 mmol) en DCM (400 ml) a -40 °C (hielo seco/CH3CN). Inmediatamente, la reaccion se completo, segun se juzgo mediante CL/EM (2,47 min (ES +) m/z (intensidad relativa) 721 ([M + H]+, 100). La mezcla de reaccion se diluyo con DCM (200 ml) y se lavo con HCl 1N (300 ml), NaHCO3 saturado (300 ml), salmuera (400 ml), se seco (SO4), se filtro y el disolvente se evaporo a vaclo para dar el producto puro 6 en forma de solido naranja (66,7 g, 100 %). [a]22D = -46,1° (c = 0,47, CHCl 3); RMN 1H (400 MHz, CDCb) (rotamers) 5 7,63 (s, 2H), 6,82 (s, 2H), 4,79-4,72 (m, 2H), 4,49-4,28 (m, 6H), 3,96 (s, 6H), 3,79 (s, 6H), 3,46-3,38 (m, 2H), 3,02 (d, 2H, J = 11,1 Hz), 2,48-2,30 (m, 4H), 2,29-2,04 (m, 4H); RMN 13C (100 MHz, CDCla) (rotamers) 5 172,4, 166,7, 154,6, 148,4, 137,2, 127,0, 109,7, 108,2, 69,7, 65,1,57,4, 57,0, 56,7, 52,4, 37,8, 29,0; IR (ATR, CHCla) 3410 (br), 3010, 2953, 1741, 1622, 1577, 1519, 1455, 1429, 1334, 1274, 1211, 1177, 1072, 1050, 1008, 871 cm'1; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 721 ([M + H]\ 47), 388 (80); HRMS [M + H]+- teorico C31H36N4O16 m/z 721,2199, hallado (ES+) m/z 721,2227.
(e) 1, 1 '-[[(Propan-1,3-diil)dioxi]bis(11aS,2R)-2-(hidroxi)-7-metoxi-1, 2, 3, 10, 11, 11a-hexahidro-5H-pirrolo[2,1- c][1,4]-benzodiazepin-5,11-diona] (7)
Metodo A: Se anadio una solucion del nitroester 6 (44 g, 61,1 mmol) en MeOH (2,8 l) al niquel Raney® recien comprado (~ 50 g de una suspension al 50 % en H2O) y a los granulos anti-golpeo en un matraz de 5 litros de fondo redondo de 3 bocas. La mezcla se calento a reflujo y despues se trato gota a gota con una solucion de hidrato de hidrazina (21,6 ml, 22,2 g, 693 mmol) en MeOH (200 ml), en cuyo punto se observo una efervescencia vigorosa. Cuando se completo la adicion (~ 45 min), se anadio niquel Raney® adicional cuidadosamente hasta que ceso la efervescencia y se descargo el color amarillo inicial de la mezcla de reaccion. La mezcla se calento a reflujo durante otros 5 minutos, momento en el que se considero que la reaccion se habia completado por TLC (90:10 v/v CHCb/MeOH) y LC/MS (2.12 min (Es+) m/z (intensidad relativa) 597 ([M + H]+-, 100)). La mezcla de reaccion se filtro en caliente inmediatamente a traves de un embudo sinterizado que contenia celite con succion al vacio. El filtrado se redujo en volumen por evaporacion al vacio, momento en el que se formo un precipitado incoloro que se recogio por filtracion y se seco en un desecador de vaclo para proporcionar 7 (31 g, 85 %). [a]27D = +404° (c = 0.10, DMF); RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 5 10.2 (s, 2H, NH), 7.26 (s, 2H), 6.73 (s, 2H), 5.11 (d, 2H, J = 3.98 Hz, OH), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.19-4.07 (m, 6H), 3.78 (s, 6H), 3.62 (dd, 2H, J= 12.1, 3.60 Hz), 3.43 (dd, 2H, J = 12.0, 4.72 Hz), 2.67-2.57 (m, 2H), 2.26 (p, 2H, J = 5.90 Hz), 1.99-1.89 (m, 2H); RMN 13C (100 MHz, DMSO-de) b 169.1, 164.0, 149.9, 144.5, 129.8, 117.1, 111.3, 104.5, 54.8, 54.4, 53.1,33.5, 27.5; IR (ATR, neto) 3438, 1680, 1654, 1610, 1605, 1516, 1490, 1434, 1379, 1263, 1234, 1216, 1177, 1156, 1115, 1089, 1038, 1018, 952, 870 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 619 ([M + Na]+-, 10), 597 ([M + H]+., 52), 445 (12), 326 (11); HRMS [M + H]+. teoricol C29H32N4O10 m/z 597.2191, hallado (ES+) m/z 597.2205.
Metodo B: Se anadio una suspension de Pd al 10 % (7,5 g, 10 % p/p) en DMF (40 ml) a una solucion del nitromero 6 (75 g, 104 mmol) en DMF (360 ml). ). La suspension se hidrogeno en un aparato de hidrogenacion Parr durante 8 horas. El progreso de la reaccion se controlo mediante CL/EM despues de que se hubo detenido la absorcion de hidrogeno. El Pd/C solido se elimino por filtracion y el filtrado se concentro por evaporacion rotativa al vaclo (por debajo de 10 mbar) a 4 0 °C para proporcionar un aceite oscuro que contenia trazas de DMF y carbon residual. El residuo se digirio en EtOH (500 ml) a 4 0 °C en un bano de agua (bano de evaporador rotatorio) y la suspension resultante se filtro a traves de celite y se lavo con etanol (500 ml) para dar un filtrado claro. Se anadio hidrato de hidrazina (10 ml, 321 mmol) a la solucion y la mezcla de reaccion se calento a reflujo. Despues de 20 minutos se observo la formacion de un precipitado blanco y se dejo continuar el reflujo durante otros 30 minutos. La mezcla se dejo enfriar a temperatura ambiente y el precipitado se recupero por filtracion, se lavo con eter dietllico (volumen 2: 1 de precipitado) y se seco en un desecador de vacio para proporcionar 7 (50 g, 81 %). Datos anallticos para el metodo B: Identicos a los obtenidos para el Metodo A (rotacion optica, 1H NmR, LC/MS y TLC).
(f) 1,1,1 '-[[(Propan-1,3-diil)dioxi]bis( 11aS,2R)-2-(terc-butildimetilsililoxi)-7-metoxi-11,2,3,10,11,11a-hexahidro-5H- pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-diona] (8)
Se anadieron TBSCl (27,6 g, 182,9 mmol) e imidazol (29,9 g, 438,8 mmol) a una solucion turbia del tetra-lactama 7 (21,8 g, 36,6 mmol) en DMF anhidro (400 ml) a 0 °C (hielo/acetona). La mezcla se dejo agitar bajo una atmosfera de nitrogeno durante 3 horas despues de lo cual la reaccion se considero completa segun se juzgo por CL/EM (3,90 min (ES +) m/z (intensidad relativa) 825 ([M + H]+, 100). La mezcla de reaccion se vertio sobre hielo (~1,75 l) y se dejo calentar a temperatura ambiente con agitacion. El precipitado blanco resultante se recogio por filtracion al vaclo, se lavo con H2O, eter dietllico y se seco en el desecador al vacio para proporcionar 8 (30,1 g, 99 %). [a]23D = +234° (c = 0,41, CHCla); RMN 1H (400 MHz, CDCla) 5 8,65 (s, 2H, NH), 7,44 (s, 2H), 6,54 (s, 2H), 4,50 (p, 2H, J = 5,38 Hz), 4,21-4,10 (m, 6H), 3,87 (s, 6H), 3,73-3,63 (m, 4H), 2,85-2,79 (m, 2H), 2,36-2,29 (m, 2H), 2,07-1,99 (m, 2H), 0,86 (s, 18H), 0,08 (s, 12H); RMN 13C (100 MHz, CDCb) 5 170,4, 165,7, 151,4, 146,6, 129,7, 118,9, 112,8, 105,3, 69,2, 65,4, 56,3, 55,7, 54,2, 35,2, 28,7, 25,7, 18,0, -4,82 and -4,86; IR (ATR, CHCb) 3235, 2955, 2926, 2855, 1698, 1695, 1603,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
1518, 1491, 1446, 1380, 1356, 1251, 1220, 1120, 1099, 1033 cm'1; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 825 ([M + H]+-, 62), 721 (14), 440 (38); HRMS [M + H]+, teorico C41H60N4O10Si2 m/z 825,3921, hallado (ES+) m/z 825,3948.
(g) 1,1’-[[(Propan-1,3-diil)dioxi]bis(11aS,2R)-2-(terc-butildimetilsililoxi)-7-metoxi-10-((2-(trimetilsi-lil)etoxi)meti)- 1,2,3,10,11,11a-hexahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-diona] (9)
Se anadio gota a gota una solucion de n-BuLi (68,3 ml de una solucion 1,6 M en hexano, 109 mmoles) a una suspension agitada de la tetralactama 8 (30,08 g, 36,4 mmol) en THF anhidro (600 ml) a -30 °C (hielo seco/etilenglicol) bajo una atmosfera de nitrogeno. La mezcla de reaccion se dejo agitar a esta temperatura durante 1 hora (ahora un color naranja rojizo), punto en el que se anadio gota a gota una solucion de SEMCl (19,3 ml, 18,2 g, 109 mmol) en THF anhidro (120 ml). La mezcla de reaccion se dejo calentar lentamente hasta la temperatura ambiente y se agito durante 16 horas bajo una atmosfera de nitrogeno. La reaccion se considero completa, segun se juzgo mediante TLC (EtOAc) (4,77 min (ES +) m/z (intensidad relativa) 1085 ([M + H]+, 100). El THF se elimino por evaporation al vaclo y el residuo resultante se disolvio en EtOAc (750 ml), se lavo con H2O (250 ml), salmuera (250 ml), se seco (MgSO4), se filtro y se evaporo a vaclo para proporcionar la tetralactama cruda protegida con N10-SEM 9 como un aceite (maxm 39,5 g, 100 %). El producto se llevo a la siguiente etapa sin purification. [a]23D = +163° (c = 0,41, CHCls); RMN 1H (400 MHz, CDCls) 5 7,33 (s, 2H), 7,22 (s, 2H), 5,47 (d, 2H, J = 9,98 Hz), 4,68 (d, 2H, J = 9,99 Hz), 4,57 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 4,29-4,19 (m, 6H), 3,89 (s, 6H), 3,79-3,51 (m, 8H), 2,87-2,81 (m, 2H), 2,41 (p, 2H, J = 5,81 Hz), 2,03-1,90 (m, 2H), 1,02-0,81 (m, 22H), 0,09 (s, 12H), 0,01 (s, 18H); RMN RMN 13C (100 MHz, CDCls) 5
170.0, 165,7, 151,2, 147,5, 133,8, 121,8, 111,6, 106,9, 78,1, 69,6, 67,1, 65,5, 56,6, 56,3, 53,7, 35,6, 30,0, 25,8, 18,4, 18,1, -1,24, -4,73; IR (ATR, CHCls) 2951, 1685, 1640, 1606, 1517, 1462, 1433, 1360, 1247, 1127, 1065 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 1113 ([M + Na]+, 48), 1085 ([M + H]+, 100), 1009 (5), 813 (6); HRMS [M + H]+' teorico C53H8sN4O12Si4 m/z 1085,5548, hallado (ES+) m/z 1085,5542.
(h) 1,1,1 ’-[[(Propan-1,3-diil)dioxi]bis(11aS,2R)-2-hidroxi-7-metoxi-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)meti)-1,2,3,10,11,11a- hexahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-diona] (10)
Se anadio una solucion de TBAF (150 ml de una solucion 1,0 M en THF, 150 mmol) a una solucion agitada del eter bis-silllico crudo 9 [84,0 g (maxm 56,8 g), 52,4 mmol] en THF (800 ml) a temperatura ambiente. Despues de agitar durante 1 hora, el analisis de la mezcla de reaccion por TLC (95:5 v/v CHCh/MeOH) revelo la finalization de la reaccion. El THF se elimino por evaporacion a presion reducida a temperatura ambiente y el residuo resultante se disolvio en EtOAc (500 ml) y se lavo con NH4Cl (300 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (60 ml), se secaron (MgSO4), se filtraron y se evaporaron a presion reducida para proporcionar el producto bruto. La purificacion por cromatografla ultrarrapida (gradiente de elucion: 100 % CHCh a 96:4 v/v CHCh/MeOH) dio la tetralactama pura 10 como una espuma blanca (36,0 g, 79 %). LC/MS 3,33 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 879 ([M + Na]+, 100), 857 ([M + H]+, 40); [a]23D = +202°[c = 0,34, CHCl 3); RMN 1H (400 MHz, CDCls) 5 7,28 (s, 2H), 7,20 (s, 2H), 5,44 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,72 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,61-4,58 (m, 2H), 4,25 (t, 4H, J = 5,83 Hz), 4,20-4,16 (m, 2H), 3,91-3,85 (m, 8H), 3,77-3,54 (m, 6H), 3,01 (br s 2H, OH), 2,96-2,90 (m, 2H), 2,38 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 2,112,05 (m, 2H), 1,00-0,91 (m, 4H), 0,00 (s, 18H); RMN 13C (100 MHz, CDCls) 5 169,5, 165,9, 151,3, 147,4, 133,7, 121,5, 111,6, 106,9, 79,4, 69,3, 67,2, 65,2, 56,5, 56,2, 54,1,35,2, 29,1, 18,4, -1,23; IR (ATR, CHCls) 2956, 1684, 1625, 1604, 1518, 1464, 1434, 1361, 1238, 1058, 1021 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 885 ([M+29]+, 70), 857 ([M + H]+, 100), 711 (8), 448 (17); HRMS [M + H]+, teorico C41H60N4O^Si2 m/z 857,3819, hallado (ES+) m/z 857,3826.
(i) 1,1,1 ’-[[(Propan-1,3-diil)dioxi]bis(11aS)-7-metoxi-2-oxo-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1,2,3,10,11,11a-hexahidro- 5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-diona] (11)
Se disolvieron diol 10 (25,6 g, 30 mmol, 1 eq.), NaOAc (6,9 g, 84 mmol, 2,8 eq.) y TEMPO (188 mg, 1,2 mmol, 0,04 eq.) en DCM (326 ml) en Ar. Esto se enfrio a -8 °C (temperatura interna) y se anadio TCCA (9,7 g, 42 mmol, 1,4 eq.) en porciones durante 15 minutos. TLC (EtOAc) y lC/MS [3.60 min. (ES+) m/z (intensidad relativa) 854.21 ([M + H]+., 40), (ES-) m/z (intensidad relativa) 887,07 ([M -H + Cl]-, 10)] tras 30 minutos indico que la reaccion se habla completado. Se anadio DCM frlo (200 ml) y la mezcla se filtro a traves de una almohadilla de Celite antes de lavar con una solucion de bicarbonato sodico saturado/tiosulfato sodico (1: 1 v/v, 200 ml x 2). La capa organica se seco con MgSO4, se filtro y el disolvente se elimino a vaclo para producir una esponja amarilla/naranja. LC/MS [3.60 min. (ES+) m/z (intensidad relativa) 854,21 ([M + H]+, 40); [a]20D = +291° (c = 0,26, CHCl 3); RMN 1H (400 MHz, CDCh) 5 7,32 (s, 2H), 7,25 (s, 2H), 5,50 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,75 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,60 (dd, 2H, J = 9,85, 3,07 Hz), 4,314,18 (m, 6H), 3,89-3,84 (m, 8H), 3,78-3,62 (m, 4H), 3,55 (dd, 2H, J = 19,2, 2,85 Hz), 2,76 (dd, 2H, J = 19,2, 9,90 Hz), 2,42 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 0,98-0,91 (m, 4H), 0,00 (s, 18H); RMN 13C (100 MHz, CDCh) 5 206,8, 168,8, 165,9, 151,8,
148.0, 133,9, 120,9, 111,6, 107,2, 78,2, 67,3, 65,6, 56,3, 54,9, 52,4, 37,4, 29,0, 18,4, -1,24; IR (ATR, CHCh) 2957, 1763, 1685, 1644, 1606, 1516, 1457, 1434, 1360, 1247, 1209, 1098, 1066, 1023 cm-1; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 881 ([M + 29]+-, 38), 853 ([M + H]+-, 100), 707 (8), 542 (12); HRMS [M + H]+- teorica l C41H56N4O^Si2 m/z 853,3506, hallado (ES+) m/z 853,3502.
(j) 1,1,1 ’-[[(Propan-1,3-diil)dioxi]bis(11aS)-7-metoxi-2-[[((trifluorometil)sulfonil]oxi]-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)- 1,10,3,10,11,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-benzodiazepin-5,11-diona] (12)
5
10
15
20
25
30
Se inyecto 2,6 -lutidina anhidra (5,15 ml, 4,74 g, 44,2 mmol) en una porcion a una solucion vigorosamente agitada de bis-cetona 11 (6,08 g, 7,1 mmol) en DCM seco (180 ml) a -45 °C (hielo seco/acetonitrilo) en atmosfera de nitrogeno. Se inyecto rapidamente gota a gota anhldrido trifllico anhidro, tomado de una ampolla recien abierta (7,2 ml, 12,08 g, 42,8 mmol), mientras se mantenla la temperatura a -40 °C o menos. La mezcla de reaccion se dejo agitar a -45 °C durante 1 hora, punto en el que la TLC (50/50 v/v de n-hexano/EtOAc) revelo el consumo completo de material de partida. La mezcla de reaccion frla se diluyo inmediatamente con DCM (200 ml) y, con agitacion vigorosa, se lavo con agua (1 x 100 ml), solucion de acido cltrico al 5 % (1 x 200 ml), NaHCO3 saturado (200 ml), salmuera (100 ml) y se seco (MgSO4). La filtracion y evaporacion del disolvente a presion reducida proporciono el producto bruto que se purifico por cromatografla en columna ultrarrapida (gradiente de elucion: 90:10 v/v n-hexano/EtOAc to 70:30 v/v n- hexano/EtOAc) para dar bis-enol triflato 12 como una espuma amarilla (5,5 g, 70 %). LC/MS 4.32 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1139 ([M + Na]+-, 20); [a]24D = +271° (c = 0,18, CHCLb); RMN 1H (400 MHz, CDCh) 5 7,33 (s, 2H), 7,26 (s, 2H), 7,14 (t, 2H, J = 1,97 Hz), 5,51 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,76 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,62 (dd, 2H, J =
11,0, 3,69 Hz), 4,32-4,23 (m, 4H), 3,94-3,90 (m, 8H), 3,81-3,64 (m, 4H), 3,16 (ddd, 2H, J = 16,3, 11,0, 2,36 Hz), 2,43 (p, 2H, J = 5,85 Hz), 1,23-0,92 (m, 4H), 0,02 (s, 18H); RMN 1X (100 MHz, CDCls) 5 167,1, 162,7, 151,9, 148,0, 138,4, 133,6, 120,2, 118,8, 111,9, 107,4, 78,6, 67,5, 65,6, 56,7, 56,3, 30,8, 29,0, 18,4, -1,25; IR (ATR, CHCls) 2958, 1690, 1646, 1605, 1517, 1456, 1428, 1360, 1327, 1207, 1136, 1096, 1060, 1022, 938, 913 cm'1; MS (ES+) m/z (intensidad relativa) 1144 ([M + 28]+, 100), 1117 ([M + H]+, 48), 1041 (40), 578 (8); H RMS [M + H]+, teorico C43H54N4O16Si2S2F6 m/z 1117,2491, hallado (ES+) m/z 1117,2465.
Ejemplo 1
SEM SEM SEM SEM
imagen26
(a) Trifluorometanosulfonato de (S)-8-(3-(((S)-2-(4-aminofenil)-7-metoxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetisilil)etoxi)metil)- 5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5,11-dioxo-10-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1 H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][ 1,4jdiazepin-2-ilo (13)
Se anadio Pd(PPh3)4 (116,9 mg, 0,101 mmol)) a una mezcla agitada de bis-enol triflato 12 (5,65 g, 5,06 mmoles), ester de pinacol de acido 4-aminofenilboronico (1 g, 4,56 mmoles) Na2CO3 (2,46 g, 23,2 mmol), MeOH (37 ml), tolueno (74 ml) y agua (37 ml). La mezcla de reaccion se dejo agitar a 30 °C en atmosfera de nitrogeno durante 24 horas, despues de lo cual se ha consumido todo el ester boronico. La mezcla de reaccion se evaporo a sequedad antes de que el residuo se recogiera en EtOAc (150 ml) y se lavo con H2O (2 x 100ml), salmuera (150 ml), se seco (MgSO4), se filtro y se evaporo a presion reducida para proporcionar el producto bruto. La purificacion por
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
cromatografla ultrarrapida (gradiente de elucion: 80:20 v/v Hexano/EtOAc a 60:40 v/v Hexano/EtOAc) proporciono el producto 13 como una espuma amarillenta (2,4 g, 45 %). LC/MS 4,02 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1060,21 ([M+ H]+', 100); 1H-NMR: (CDCb, 400 MHz) 5 7,40 (s, 1H), 7,33 (s, 1 H), 7,27 (bs, 3H), 7,24 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 7,15 (t, 1H, J = 2,0 Hz), 6,66 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 5,52 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,77 (d, 1H, J = 10,0 Hz), 4,76 (d, 1H, J = 10,0 Hz), 4,62 (dd, 1H, J = 3,7, 11,0 Hz), 4,58 (dd, 1H, J = 3,4, 10,6 Hz), 4,29 (t, 4H, J = 5,6 Hz), 4,00-3,85 (m, 8H), 3,80 - 3,60 (m, 4H), 3,16 (ddd, 1H, J = 2,4, 11,0, 16,3 Hz), 3,11 (ddd, 1H, J = 2,2, 10,5, 16,1 Hz), 2,43 (p, 2H, J = 5,9 Hz), 1, 1 -0,9 (m, 4H), 0,2 (s, 18H). 13C-NMR: (CDCb, 100 MHz) 5 169,8, 168,3, 164,0, 162,7, 153,3, 152,6, 149,28, 149,0, 147,6, 139,6, 134,8, 134,5, 127,9, 127,5, 125,1, 123,21, 121,5, 120,5, 120,1, 116,4, 113,2, 108,7, 79,8, 79,6, 68,7, 68,5, 67,0, 66,8, 58,8, 58,0, 57,6, 32,8, 32,0, 30,3, 19,7, 0,25.
(b) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-ciclopropil-7-metoxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepine-5,11(10H,11aH)-diona (14)
Se disolvieron trifenilarsina (0,24 g, 0,8 mmol), oxido de plata (I) (1,02 g, 4,4 mmol), acido ciclopropilboronico (0,47 g, 5,5 mmol) y material de partida 13 (1,15 g, 1,1 mmol) en dioxano (30 ml) en una atmosfera de argon. El fosfato de potasio tribasico (2,8 g, 13,2 mmol) se trituro con un mortero y se anadio rapidamente a la mezcla de reaccion. La mezcla de reaccion se evacuo y se enjuago con argon 3 veces y se calento a 71 °C. Se anadio paladio (II) bis (cloruro de benzonitrilo) (84 mg, 0,22 mmol) y el recipiente de reaccion se evacuo y se enjuago con argon 3 veces. Despues de 10 minutos se tomo una pequena muestra para analisis por TLC (80:20 v/v de acetato de etilo/hexano) y CL/Em. Despues de 30 minutos, la reaccion habla terminado (el analisis CL/EM indico un consumo completo de material de partida) y la reaccion se filtro a traves de celite y la almohadilla de filtro se lavo con acetato de etilo (400 ml). El filtrado se lavo con agua (2 x 200 ml) y salmuera (2 x 200 ml). La capa organica se seco con MgSO4, se filtro y el disolvente se elimino a vaclo. La purification por cromatografla en columna de gel de sllice (Hexano/acetato de etilo 30:70 v/v) proporciono el producto 14 en forma de un solido naranja/amarillo (0,66 g, 63 %). Metodo 1, LC/MS (3,85 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 952,17 ([M + H]+, 100). RMN 1H (400 MHz, CDCb) 5 7,36 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,30 (s, 1 H), 7,25 -7,19 (m, 4H), 6,68 (s, 1 H), 6,62 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 5,49 (dd, 2H, J = 5,6, 10,0 Hz), 4,73 (app, t, 2H, J = 10,8 Hz), 4,54 (dd, 1 H, J = 3,2, 10,4 Hz), 4,40 (dd, 1H, J = 3,2, 10,4 Hz), 4,29 -4,23 (m, 4H), 3,91 - 3,85 (m, 7H), 3,80 -3,71 (m, 2H), 3,70 -3,61 (m, 2H), 3,38 -3,32 (m, 1H), 3,12 -3,01 (m, 1 H), 2,50 -2,69 (m, 1H), 2,40 (q, 2H, J = 5,6 Hz), 1,50 -1,43 (m, 1H), 0,99 -0,71 (m, 6H), 0,54 -0,59 (m, 2H), 0,00 (s, 18H) ppm.
(c) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-ciclopropil-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]di-azepin- 8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-5(11aH)-ona (15)
Se disolvio SEM dilactam 14 (0,66 g, 0,69 mmol) en THF (23 ml) y se enfrio a -78 °C en atmosfera de argon. Se anadio gota a gota solution Super-Hydride® (1,7 ml, 1 M en THF) durante 5 minutos mientras se monitorizaba la temperatura. Despues de 20 minutos se tomo una pequena muestra y se lavo con agua para analisis de CL/EM. Se anadio agua (50 ml) y se retiro el bano frlo. La capa organica se extrajo y se lavo con salmuera (60 ml). Las capas acuosas combinadas se lavaron con CH2Cb/MeOH (90/10 v/v) (2 x 50 ml). Las capas organicas combinadas se secaron con MgSO4, se filtraron y el disolvente se elimino a vaclo. El producto bruto se disolvio en MeOH (48 mlCH2Cl2 (18 ml) y agua (6 ml) y se anadio suficiente gel de sllice para proporcionar una suspension espesa. Despues de 5 dlas de agitation, la suspension se filtro a traves de un embudo sinterizado y se lavo con CH2Cl2/MeOH (9:1) (~ 200 ml) hasta que el producto dejo de eluir. La capa organica se lavo con salmuera (2 x 70 ml), se seco con MgSO4, se filtro y el disolvente se elimino a vaclo. La purificacion por cromatografla en columna de gel de sllice (100 % CHCl3 to 96/4 v/v CHCb/MeOH) proporciono el producto 15 en forma de un solido amarillo (302 mg, 66 %). Metodo 1, LC/MS (2,42 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 660,74 ([M + H]+, 30). RMN 1H (400 MHz, CDCb) 5 7,86 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,78 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 7,58 -7,44 (m, 3H), 7,34 -7,20 (m, 3H), 6,88 -6,66 (m, 4H), 4,35 -4,15 (m, 6H), 3,95 -3,75 (m, 7H), 3,39 -3,22 (m, 1H), 3,14 -3,04 (m, 1H), 2,93 -2,85 (m, 1H), 2,46 -2,36 (m, 2H), 1,49 -1,41 (m, 1H), 0,80 -0,72 (m, 2H), 0,58 -0,51 (app, s, 2H) ppm.
(d) ((2S)-1-(((2S)-1-((4-(B-(3-((2-ciclopropil-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]di-azepin-8- il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1 -oxobutan-2-il)carbamato de alilo (16)
En un matraz de fondo redondo desgasificado lleno con argon, se disolvieron HO-Ala-Val-alloc (149,6 mg, 0,549 mmol) y EEDQ (135,8 mg, 0,549 mmol) en una mezcla 9: 1 de CH2Cb/MeOH seco (5 ml). El matraz se envolvio en papel de aluminio y la mezcla de reaccion se dejo agitar a temperatura ambiente durante 1 hora antes de anadir el material de partida 15 (302 mg, 0,457 mmol). La mezcla de reaccion se dejo agitar durante otras 40 horas a temperatura ambiente antes de separar los volatiles mediante evaporation rotativa bajo presion reducida (a la reaccion le siguio CL/EM, material de partida TA 2,32 min, (ES+ 660,29 ([M+H]+,100)). El producto en bruto se purifico directamente mediante una columna de cromatografla en gel de sllice (100 % de CHCb a 90/10 v/v de CHCb/MeOH) para proporcionar el producto puro (16) con un rendimiento del 42 % (174 mg). Metodo 2, LC/MS (2,70 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 914,73 ([M+H]+, 60), 660,43 (60), 184,31 (100)).
(e) (2S)-2-amino-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]di- azepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-
5
10
15
20
25
30
35
oxopropan-2-il)amino)-3-metilbutanamida (17)
El material de partida 16 (170 mg, 0,185 mmol) se disolvio en CH2CI2 seco (5 ml) en un matraz de fondo redondo llenado con argon, antes de anadir pirrolidina (41 pl, 0,21 mmol). El matraz se purgo/relleno tres veces con argon antes de que se anadiera Pd(PPh3)4 (14 mg, 0,084 mmol) y se repitio la operacion de lavado. Despues de 1 hora, se observo el consumo completo de material de partida (a la reaccion le siguio CL/EM) y se anadio Et2O (50 ml) a la mezcla de reaccion que se dejo agitar hasta que todo el producto se habla estrellado de la solucion. El solido se filtro a traves de un embudo sinterizado y se lavo dos veces con Et2O (2 x 25 ml). El matraz colector se reemplazo y el solido aislado se disolvio en CHCl3 ((100 ml o hasta que todo el producto habla pasado a traves del embudo sinterizado). Los volatiles se eliminaron luego por evaporacion rotatoria a presion reducida para proporcionar el producto bruto 17 que se uso directamente en la siguiente etapa (168 mg). Metodo 2, LC/MS (2,70 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 830,27 ([M+H]+, 50), 660,13 (80), 171,15 (100)).
(f) N-((R)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-ciclopropil-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]di-
azepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1- oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-1-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)- 3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxaheptacosan-27-amida (18)
El material de partida 17 (154 mg, 0,185 mmol) y EDCl.HCl (110 mg, 0,185 mmol) se solubilizaron en CH2O2 seco (5 ml) en un matraz de fondo redondo purgado y se lleno con argon. La mezcla se dejo agitar a temperatura ambiente durante 1 hora antes de anadir PEG8-maleimida (35,6 mg, 0,185 mmol) y la mezcla de reaccion se agito durante 16 horas mas (o hasta que la reaccion se completo, controlada mediante CL/EM). La solucion de reaccion se diluyo con CH2O2 (50 ml) y las fases organicas se lavaron con H2O (50 ml) y salmuera (50 ml) antes de secar con MgSO4, se filtraron y el disolvente se separo por evaporacion rotatoria a presion reducida para proporcionar el producto bruto. La purificacion en cromatografla en columna de gel de sllice (100 % de CHCl3 a 85/15 v/v de CHCl3/MeOH) dio el producto deseado (135 mg), pero se observaron vestigios restantes de PEGa-maleimida sin reaccionar (por CL/EM, 2,21 min, metodo 2). La cromatografla de gel de sllice de fase inversa (H2O/CH3CN) (ver informacion general sobre las condiciones) elimino exitosamente la impureza, dando el producto final puro (18, 37 mg de producto puro a partir de 110 mg, 33 %). Rendimiento total = 17 %. Metodo 2, LC/MS (2,58 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1404,03 ([M+H]+, 20), 702,63 (100)). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 5 7,91 (t, J = 3,5 Hz, 1H), 7,80 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,7 Hz, 1 H), 7,54 -7,50 (m, 2H), 7,45 (s, 1 H), 7,39 -7,31 (m, 2H), 6,87 (d, J = 10,5 Hz,

2H), 6,76 (s, 1H), 6,72 -6,68 (m, 2H), 4,74 -4,62 (m, 1H), 4,45 -4,17 (m, 7H), 3,95 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,67 -3,58 (m,

34H), 3,54 (m, 2H), 3,42 (dd, J = 10,2, 5,2 Hz, 2H), 3,16 -3,07 (m, 1H), 2,92 (dd, J = 16,1,4,1 Hz, 1H), 2,62 -2,49 (m,

4H), 2,48 -2,39 (m, 2H), 2,37 -2,25 (m, 1H), 1,92 (s, 1H), 1,52 -1,44 (m, 3H), 1,10 -0,93 (m, 6H), 0,79 (dd, J = 9,2, 5,3
Hz, 2H), 0,57 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), NH no se observaron.
Ejemplo 2
imagen27
(a) Acido (R)-2-((R)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido) propanoico (20b)
5 Se disolvieron HO-Ala-Val-H 20a (350 mg, 1,86 mmol) y Na2CO3 (493 mg, 4,65 mmol) en H2O destilada (15 ml) y la mezcla se enfrio a 0 °C antes de anadir dioxano (15 ml) (precipitacion parcial de la sal de aminoacido). Se anadio gota a gota una solucion de Fmoc-Cl (504 mg, 1,95 mmol) en dioxano (15 ml) con agitacion vigorosa durante 10 minutos. La mezcla resultante se agito a 0 °C durante 2 horas antes de retirar el bano de hielo y se mantuvo la agitacion durante 16 horas. El disolvente se elimino por evaporacion rotatoria a presion reducida y el residuo se 10 disolvio en agua (150 ml). El pH se ajusto de 9 a 2 con HCl 1 N y la capa acuosa se extrajo posteriormente con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
EtOAc (3 x 100 ml). Los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron con MgSO4, se filtraron y se eliminaron los volatiles por evaporacion rotatoria a presion reducida para proporcionar HO-Ala-Val- Fmoc 20b (746 mg, 97 % de rendimiento). LC/MS 2.85 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 410,60; 1H-NMR (400 MHz, CDCb) 5 7,79 (d, J=7,77 Hz, 2H), 7,60(d, J=7,77 Hz, 2H), 7,43(d, J=7,5 Hz, 2H), 7,34 (d, J=7,5 Hz, 2H), 6,30 (bs, 1H), 5,30 (bs, 1H), 4,71-7,56 (m, 1H), 4,54-4,36 (m, 2H), 4,08-3,91 (m, 1H), 2,21-2,07 (m, 1H), 1,50 (d, J=7,1 Hz, 3H), 1,06-0,90 (m, 6H).
(b) (9H-fluoren-9-il)metil ((S)-3-metil-1-oxo-1-(((S)-1-oxo-1-((4-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)fe- nil)amino)propan-2-il)amino)butan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo (20)
Se anadio ester de pinacol de acido 4 -aminofenilboronico (146,9 mg, 0,67 mmol) a una solucion HO-Ala-Val-Fmoc 20b (330 mg, 0,8 mmol), DCC (166 mg, 0,8 mmol) y DMAP (5 mg, cat.) en DcM seco (8 ml) previamente agitada durante 30 minutos a temperatura ambiente en un matraz enjuagado con argon. Despues, la mezcla de reaccion se dejo agitar a temperatura ambiente durante la noche. A la reaccion le siguio LCMS y TLC. La mezcla de reaccion se diluyo con CH2O2 y las capas organicas se lavaron con H2O y salmuera antes de secarse con MgSO4, se filtraron y el disolvente se elimino por evaporacion rotatoria a presion reducida. El producto bruto se cargo en seco sobre una columna de cromatografla de gel de sllice (Hexano/EtOAc, 6: 4) y el producto 20 puro se aislo como un solido blanco con un rendimiento del 8 8 % (360 mg).
(c) Trifluoromethanesulfonato de 8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-3- metilbutanamido)propanamido)fenil)-7-metoxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]di-azepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a- tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-ilo (21)
Se disolvieron bis-triflato 12 (2,03 g, 1,81 mmol), ester de pinacol boronico (1 g, 1,63 mmol) y Na2CO3 ((881 mg, 8,31 mmol) en una mezcla de tolueno/MeOH/H2O, 2:1:1 (40 ml). El matraz de reaccion se purgo y se lleno con argon tres veces antes de anadir 41 mg (0,035 mmoles) de tetrafa (trifenilfosfina) paladio (0) y la mezcla de reaccion se calento a 30 °C durante la noche. Los disolventes se eliminaron a presion reducida y el residuo se suspendio en H2O (100 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron con MgSO4, se filtraron y se eliminaron los volatiles por evaporacion rotatoria a presion reducida. El producto bruto se purifico mediante columna de cromatografla en gel de sllice (Hexano/EtOAc, 8: 2 a 25:75) para dar 21 puro con un rendimiento del 33 % (885 mg). LC/MS 3,85 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1452,90; RMN 1H (400 MHz, CDCla) 5 7,78 -7,16 (m, 17H), 7,13 (s, 1H), 6,51 -6,24 (m, 1 H), 5,51 (dd, J = 10,0, 5,1 Hz, 2H), 5,36 -5,11 (m, 1H), 4,74 (dd, J = 10,1,4,4 Hz, 2H), 4,70 -4,53 (m, 2H), 4,47 (d, J = 6,4 Hz, 1 H), 4,37 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,27 (m, 4H), 4,20 -4,14 (m, 1H), 3,90 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,77 (ddd, J = 16,7, 9,0, 6,4 Hz, 3H), 3,71 -3,61 (m, 2H), 3,24 - 2,91 (m, 3H), 2,55 -2,33 (m, 2H), 2,22 -2,07 (m, 1H), 1,52 -1,37 (m, 3H), 1,04 -0,86 (m, 10H), 0,00 (s, 18H).
(d) (9H-fluoren-9-il)metil((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metoxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)- 5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5,11-dioxo-10-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato (22)
Se anadio trifenilarsina (42 mg, 0,137 mmol) a una mezcla de PBF-triflato 21 (250 mg, 0,172 mmol), acido ciclopropilboronico (73,9 mg, 0,86 mmol), oxido de plata (159 mg, 0,688 mmol) y fosfato de potasio tribasico (438 mg, 2,06 mmol) en dioxano seco (10 ml) en atmosfera de argon. La reaccion se purgo con argon 3 veces y se anadio cloruro de bis (benzonitrilo) paladio (N) (13,2 mg, 0,034 mmol). La reaccion se purgo con argon 3 veces mas antes de calentarse a 75 °C y se agito durante 10 minutos. La mezcla de reaccion se filtro a traves de una lamina de celite, que despues se aclaro con acetato de etilo. El disolvente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El residuo resultante se sometio a cromatografla rapida en columna (gel de sllice, metanol al 1 %/cloroformo). Se recogieron las fracciones puras y se combinaron, y el eluyente en exceso se elimino por evaporacion rotatoria a presion reducida para producir el producto 22 deseado (132 mg, 50 % de rendimiento). LC/MS 3,83 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1345,91; RMN 1H (400 MHz, CDCla) 5 7,88 -7,14 (m, 17H), 6,69 (s, 1H), 6,45 -6,25 (m, 1H), 5,57 -5,41 (m, 2H), 5,34 -5,14 (m, 1H), 4,78 -4,67 (m, 2H), 4,62 -4,55 (m, 1H), 4,50 -4,45 (m, 2H), 4,51 -4,44 (m, 1 H), 4,31 -4,21 (m, 4H), 4,16 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,82 -3,71 (m, 2H), 3,66 (m, 3H), 3,40 -3,28 (m, 1H), 3,07 (m, 1H), 2,70 -2,57 (m, 1H), 2,47 -2,36 (m, 2H), 2,15 (m, 1 H), 1,51 -1,40 (m, 3H), 1,03 -0,87 (m, 11H), 0,77 -0,71 (m, 2H), 0,60 -0,54 (m, 2H), 0,00 (t, J = 3,0 Hz, 18H).
(e) (9H-fluoren-9-il)metil((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirro-lo[1,2- a][1,4]diazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2- il)phenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato (23)
Se anadio gota a gota una solucion de Super-Hydride® (0,5 ml, 1M en THF) a una solucion de SEM dilactama 22 (265 mg g, 0,19 mmol) en THF (10 ml) a -78° C en atmosfera de argon. La adicion se completo durante 5 minutos con el fin de mantener constante la temperatura interna de la mezcla de reaccion. Despues de 20 minutos, se extinguio una allcuota con agua para analisis de CL/EM, lo que revelo que la reaccion estaba completa. Se anadio agua (20 ml) a la mezcla de reaccion y se retiro el bano frlo. La capa organica se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml) y los
5
10
15
20
25
30
35
40
extractos organicos combinados se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron con MgSO4, se filtraron y el disolvente se elimino por evaporacion rotatoria a presion reducida. El producto bruto se disolvio en MeOH (12 ml), ChhCh (6 ml) y agua (2 ml) y se anadio suficiente gel de sllice para formar una suspension espesa en agitacion. Despues de 5 dlas, la suspension se filtro a traves de un embudo sinterizado y se lavo con CH2Ch/MeOH (9:1) (200 ml) hasta que se hubo completado la elucion del producto. La capa organica se lavo con salmuera (2 x 70 ml), se seco con MgSO4, se filtro y se elimino el disolvente por evaporacion rotatoria a presion reducida. La purificacion por cromatografla en columna de gel de sllice (100 % CHCl3 a 96 % de CHCl3/ 4 % de MeOH) proporciono el producto 23 en forma de un solido amarillo (162 mg, 78 %). LC/MS 3,02 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1052,37.
(f) (2S)-2-amino-N-((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]di- azepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1- oxopropan-2-il)amino)-3-metilbutanamida (17)
Se anadio piperidina en exceso (0,2 ml, 2 mmol) a una solucion de SEM-dilactama 23 (76 mg, 0,073 mmol) en DMF (1 ml). La mezcla se dejo agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, momento en el que la reaccion habla terminado (segun se observo mediante CL/EM). La mezcla de reaccion se diluyo con CH2O2 (75 ml) y la fase organica se lavo con H2O (3x75 ml) hasta la eliminacion completa de piperidina. La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se elimino el exceso de disolvente por evaporacion rotatoria a presion reducida para producir el producto bruto 17 que se uso como tal en la siguiente etapa. LC/MS 2,32 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 830,00.
(g) N-((2S)-1-(((2S)-1-((4-(8-(3-((2-ciclopropil-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]di-azepin-8- il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-1-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3,6,9,12,15,18,21,24- octaoxaheptacosan-27-amida (18)
Se anadio clorhidrato de EDCI (14 mg, 0,0732 mmol) a una suspension de maleimida-PEGa-acido (43,4 mg, 0,0732 mmol) en CH2Cl2 seco (5 ml) en atmosfera de argon. La mezcla se agito durante 1 hora a temperatura ambiente antes de anadir PBD 17 (60,7 mg, 0,0732 mmol). Se mantuvo la agitacion hasta que se completo la reaccion (normalmente 5 horas). La reaccion se diluyo con CH2Cl2 y la fase organica se lavo con H2O y salmuera antes de secarse con MgSO4, se filtro y el disolvente en exceso se elimino por evaporacion rotatoria a presion reducida mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El producto se purifico por cromatografla cuidadosa en gel de sllice (elucion lenta comenzando con CHCl3 al 100 % hasta CHCl3/MeOH9:1), seguido de cromatografla de fase inversa para eliminar el acido maleimida-PEG8 sin reaccionar. El producto 18 se aislo en 17,6 % (21,8 mg). LC/MS 2,57 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1405,30; RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 5 7,91 (t, J = 3,5 Hz, 1H), 7,80 (d, J = 4,0 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,69 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,54 -7,50 (m, 2H), 7,45 (s, 1 H), 7,39 -7,31 (m, 2H), 6,87 (d, J = 10,5 Hz, 2H), 6,76 (s, 1H), 6,72 -6,68 (m, 2H), 4,74 -4,62 (m, 1H), 4,45 -4,17 (m, 7H), 3,95 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,67 -3,58 (m, 34H), 3,54 (m, 2H), 3,42 (dd, J = 10,2, 5,2 Hz, 2H), 3,16 -3,07 (m, 1H), 2,92 (dd, J = 16,1,4,1 Hz, 1H), 2,62 -2,49 (m, 4H), 2,48 -2,39 (m, 2H), 2,37 -2,25 (m, 1 H), 1,92 (s, 1H), 1,52 -1,44 (m, 3H), 1,10 -0,93 (m, 6H), 0,79 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), 0,57 (dd, J = 9,2, 5,3 Hz, 2H), NH no se observaron.
Ejemplo 3
5
10
15
20
25
imagen28
(a) Trifluorometaanosulfonato de (S)-7-metoxi-8-(3-(((S)-7-metoxi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5,11-dioxo-10-((2- (trimetilsi-lil)etoxi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-5,11-dioxo-10-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-ilo (24)
Se anadio Pd(PPh3)4 (20,6 mg, 0,018 mmol)) a una mezcla agitada de bis-enol triflato 12 (500 mg, 0,44 mmoles), ester boronico de N-metilpiperazina (100 mg, 0,4 mmoles) Na2CO3 (218 mg, 2,05 mmol), MeOH (2,5 ml), tolueno (5 ml) y agua (2,5 ml). La mezcla de reaccion se dejo agitar a 30 °C en atmosfera de nitrogeno durante 24 horas, despues de lo cual se ha consumido todo el ester boronico. La mezcla de reaccion se evaporo a sequedad antes de que el residuo se recogiera en EtOAc (100 ml) y se lavo con H2O (2 x 50ml), salmuera (50 ml), se seco (MgSO4), se filtro y se evaporo a presion reducida para proporcionar el producto bruto. La purificacion por cromatografla ultrarrapida (gradiente de elucion: 80:20 v/v Hexano/EtOAc a 60:40 v/v Hexano/EtoAc) proporciono el producto 24 como una espuma amarillenta (122,6 mg, 25 %).
LC/MS 3,15 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1144 ([M+ H]+, 20 %).
(b) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metoxi-8-(3-(((S)-7-metoxi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fe-nil)-5,11-dioxo-10-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-5,11-dioxo-10-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodi-azepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2- il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo (25)
Se disolvieron PBD-triflato 24 (359 mg, 0,314 mmol), ester de pinacol boronico 20 (250 mg, 0,408 mmol) y trietilamina (0,35 ml, 2,1 mmol) en una mezcla de tolueno/MeOH/H2O, 2:1:1 (3 ml). El vaso de microondas se purgo y se lleno con argon tres veces antes de anadir 21,7 mg (0,018 mmoles) de tetrafa (trifenilfosfina) paladio (0) y la mezcla de reaccion se colocaron en el microondas a 80 °C durante 10 minutos. Posteriormente, se anadio CH2O2 (100 ml) y las capas organicas se lavaron con agua (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml) antes de secar con MgSO4, se filtraron y se eliminaron los volatiles mediante evaporacion rotatoria a presion reducida El producto bruto se purifico mediante columna de cromatografla en gel de sllice (CHCh/MeOH, 100 % a 9:1) para dar 25 puro (200 mg,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
rendimiento del 43 %). LC/MS 3,27 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1478 ([M+ H]+, 100 %).
(c) (9H-fluoren-9-il)metil((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metoxi-8-(3-(((S)-7-metoxi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5-oxo- 5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirro/o[2,1- c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato (26)
Se anadio gota a gota una solucion de Super-Hydride® (0,34 ml, 1M en THF) a una solucion de SEM dilactama 25 (200 mg g, 0,135 mmol) en THF (5 ml) a -78 °C en atmosfera de argon. La adicion se completo durante 5 minutos con el fin de mantener constante la temperatura interna de la mezcla de reaccion. Despues de 20 minutos, se extinguio una allcuota con agua para analisis de CL/EM, lo que revelo que la reaccion estaba completa. Se anadio agua (20 ml) a la mezcla de reaccion y se retiro el bano frlo. La capa organica se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml) y los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron con MgSO4, se filtraron y el disolvente se elimino por evaporation rotatoria a presion reducida. El producto bruto se disolvio en MeOH (6 ml), CH2O2 (3 ml) y agua (1 ml) y se anadio suficiente gel de sllice para formar una suspension espesa en agitation. Despues de 5 dlas, la suspension se filtro a traves de un embudo sinterizado y se lavo con CH2Cb/MeOH (9:1) (100 ml) hasta que se hubo completado la elucion del producto. La capa organica se lavo con salmuera (2 x 50 ml), se seco con MgSO4, se filtro y se elimino el disolvente por evaporacion rotatoria a presion reducida. La purification por cromatografla en columna de gel de sllice (100 % CHCl3 a 96 % de CHCb/ 4 % de MeOH) proporciono el producto 26 en forma de un solido amarillo (100 mg, 63 %). LC/MS 2,67 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1186 ([M+ H]+, 5 %).
(d) (S)-2-amino-N-((S)-1-((4-((R)-7-metoxi-8-(3-(((R)-7-metoxi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)fenil)-5-oxo-5,11a-di-hidro- 1H-pirro/o[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-i/)oxi)propoxi)-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2- il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)-3-metilbutanamida (27)
Se anadio piperidina en exceso (0,1 ml, 1 mmol) a una solucion de PBD 26 (36,4 mg, 0,03 mmol) en DMF (0,9 ml). La mezcla se dejo agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos, momento en el que la reaccion habla terminado (segun se observo mediante CL/EM). La mezcla de reaccion se diluyo con CH2O2 (50 ml) y la fase organica se lavo con H2O (3 x 50 ml) hasta la elimination completa de piperidina. La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se elimino el exceso de disolvente por evaporacion rotatoria a presion reducida para producir el producto bruto 27 que se uso como tal en la siguiente etapa. LC/MS 2,20 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 964 ([M+ H]+, 5 %).
(e) 6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-metoxi-8-(3-(((S)-7-metoxi-2-(4-(4-metil- piperazin-1-il)fenil)-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-5-oxo-5,11a-dihidro-1H- pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)hexanamida (28)
Se anadio clorhidrato de EDCI (4,7 mg, 0,03 mmol) a una suspension de acido 6-maleimidohexanoico (6,5 mg, 0,03 mmol) en CH2O2 seco (3 ml) en atmosfera de argon. La mezcla se agito durante 1 hora a temperatura ambiente antes de anadir PBD 27 (34 mg, en bruto). Se mantuvo la agitacion hasta que se completo la reaccion (6 horas). La reaccion se diluyo con CH2Cl2 y la fase organica se lavo con H2O y salmuera antes de secarse con MgSO4, se filtro y el disolvente en exceso se elimino por evaporacion rotatoria a presion reducida mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El producto se purifico por cromatografla cuidadosa en gel de sllice (elucion lenta comenzando con CHCb al 100 % hasta CHCb/MeOH 9:1), seguido de cromatografla de fase inversa para eliminar el acido maleimida- PEG8 sin reaccionar. El producto 28 se aislo en 41 % en dos etapas (14,6 mg). LC/MS 2,40 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1157 ([M+ H]+, 5 %).
Ejemplo 4 Sfntesis alternativa del compuesto 25
imagen29
Se disolvieron PBD-triflato 21 (469 mg, 0,323 mmol), ester de pinacol boronico (146,5 mg, 0,484 mmol) y Na2CO3 ((157 mg, 1,48 mmol) en una mezcla de tolueno/MeOH/H2O, 2:1:1 (10 ml). El matraz de reaccion se purgo y se lleno con argon tres veces antes
de anadir tetraquis(trifenilfosfona)paladio (0) (7,41 mg, 0,0064 mmoles) y la mezcla de reaccion se calento a 30 °C 5 durante la noche. Los disolventes se eliminaron a presion reducida y el residuo se suspendio en H2O (500 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (100 ml), se secaron con MgSO4, se filtraron y se eliminaron los volatiles por evaporacion rotatoria a presion reducida. El producto bruto se purifico mediante cromatografla en columna en gel de sllice (CHCh 100 % a CHCh/MeOH 95 %:5 %) para dar 25 puro con un rendimiento del 33 % (885 mg). LC/MS 3,27 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1478 ([M+ H]+, 100 %).
10
Ejemplo 5
imagen30
15 (a) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metoxi-5,11-dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-
5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)- 1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5,11(10H, 11aH)-diona (29)
Se disolvieron acido 3,4-(metilendioxi)fenil boronico (356 mg, 2,1 mmol, 1,3 equivalentes), TEA (1,8 ml, 12,9 mmol, 8 20 equ.) y triflato/anilina 13 (1,75 g, 1,7 mmol, 1 eq.) en una mezcla de etanol (7 ml), tolueno (13 ml) y agua (2 ml) en una atmosfera de Ar. La mezcla de reaccion se evacuo y se lavo con Ar 3 veces, antes de la adicion de tetrakis
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(trifenilfosfina) paladio (0) (114 mg, 0,1 mmol, 0,06 equiv.). El matraz se evacuo de nuevo y se lavo con Ar 3 veces y se calento en un microondas a 80 °C durante 8 minutos con 30 segundos de tiempo de preagitacion. El analisis mediante TLC (acetato de etilo/hexano 80:20 v/v) indico un consumo completo del material de partida. La mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (50 ml) y se lavo con agua (50 ml). La capa organica se seco con MgSO4, se filtro y el disolvente se elimino a vaclo. La purificacion mediante cromatografla en columna de gel de sllice (Hexano/acetato de etilo 60:40 a 20:80 v/v) proporciono el producto 29 en forma de un solido amarillo (1,21 g, 71 %). LC/MS 3,92 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1032,44 ([M+ H]+, 100).
(b) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5( 11aH)-ona (30)
Se disolvio SEM dilactam 29 (0,25 g, 0,24 mmol, 1 equiv.) en THF (8 ml) y se enfrio a -78 °C en atmosfera de argon. Se anadio gota a gota solucion Super-Hydride® (0,6 ml, 1 M en THF, 2,5 equiv.) durante 5 minutos mientras se monitorizaba la temperatura. Tras 20 minutos se extrajo una muestra pequena y se proceso para analisis LCMS. Se anadio agua (50 ml), el bano frlo se retiro y la solucion se lavo con acetato de etilo (50 ml). La capa organica se extrajo y se lavo con salmuera (60 x 70 ml), se seco con MgSO4, se filtro y el disolvente se elimino al vaclo. El producto bruto se disolvio en EtOH (15 ml), Ch2CI2 (7.5 ml) y agua (2,5 ml) y se anadio suficiente gel de sllice hasta obtener una suspension espesa. Despues de 5 dlas de agitacion, se filtro a traves de un embudo sinterizado y se lavo con CH2Cl2/MeOH (9:1) (100 ml) hasta que el producto dejo de eluir. La capa organica se lavo con salmuera (2 x 50 ml), se seco con MgSO4, se filtro y el disolvente se elimino a vaclo. La purificacion mediante cromatografla en columna de gel de sllice (CHCI3 con un gradiente de 1 % a 4 % de MeOH) proporciono el producto 30 en forma de un solido amarillo (94 mg, 53 %). LC/MS (2,53 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 739,64 ([M]+, 70).
(c) ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2- il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de alilo (3l)
En atmosfera de Ar, se agito Alanina-Valina-Alloc (180 mg, 0,66 mmol, 1,2 equiv.) con EEDQ (163 mg, 0,66 mmol, 1,2 equiv.) en CH2CI2 anhidro (21 ml) y metanol (1 ml) durante 1 hora. El PBD 30 (407 mg, 0,55 mmol, 1 equiv.) se disolvio en CH2CI2 anhidro (21 ml) y metanol (1 ml) y se anadio a la reaccion. La CL/EM despues de 5 dlas de agitacion a temperatura ambiente mostro la formacion del producto mayoritario. El disolvente se elimino al vaclo antes de purificar mediante cromatografla en columna (CH2CI2 con gradiente de MeOH al 1 % a 6 %) para dar el producto 3l como un solido amarillo (184 mg, 34 %). LC/MS (2,95 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 994,95 ([M+ H]+, 60).
(d) (S)-2-Amino-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-8-i/)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2- il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)-3-metilbutanamida (32)
Se disolvio la imina 31 (100 mg, 0,1 mmol, 1 equiv.) en DCM anhidro (10 ml) (con la ayuda de una gota de metanol para ayudar a la disolucion) en atmosfera de Ar. Se anadio pirrolidina (30 pl, 0,15 mmol, 1,5 equiv.) gota a gota antes de evacuar el matraz y se aclaro con Ar tres veces. Se anadio Pd(PPh3)4 (7 mg, 6 pmol, 0,06 equiv.) y el matraz se evacuo y se aclaro con Ar tres veces. El analisis CL/EM despues de 1 hora indico la formacion del producto y la perdida completa del material de partida. Se anadio Et2O (60 ml) a la mezcla de reaccion y se dejo agitar hasta que todo el producto habla precipitado en la solucion. El precipitado se filtro a traves de un embudo sinterizado y se lavo dos veces con Et2O (2 x 20 ml). Se reemplazo el matraz de recogida y el solido aislado se disolvio y se lavo a traves del sinterizado con CHCI3 (100 ml). El disolvente se elimino al vaclo para proporcionar el producto bruto 32 como un solido amarillo que se uso directamente en la siguiente etapa. LC/MS (1,14 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 910,40 ([M+ H]+, 67).
(e) N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(Benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2- il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)-1-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1- il)propanamido)-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxaheptacosan-27-amida (33)
Se disolvio la imina 32 (92 mg, 0,1 mmol, 1,1 equiv.) en CHCI3 (6 ml) con una gota de MeOH anhidro para ayudar a la disolucion. Se anadio maleimida-PEGs-acido (53 mg, 0,09 mmol, 1 equiv.) seguido de EEDQ (33 mg, 0,14 mmol, 1,5 equiv.). Se dejo agitar energicamente a temperatura ambiente en Ar durante 4 dlas hasta que el analisis CL/EM mostro una formacion de producto mayoritario. El disolvente se elimino al vaclo y el producto bruto se purifico parcialmente mediante cromatografla en columna de gel de sllice (CHCI3 con gradiente de MeOH al 1 % a 10 %), lo que dio 33 (81 mg). El material se purifico adicionalmente mediante HPLC preparativa, dando 33 en forma de un solido amarillo (26,3 mg, 18 %). Ciclo rapido con formico: LC/MS (1,39 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1485,00 ([M+ H]+, 64).
5
10
15
20
25
30
35
Ejemplo 6
imagen31
(a) 9H-Fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metoxi-5,11-dioxo-10-((2- (trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5,11- dioxo-10-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1- oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato (34)
Se disolvieron el triflato 21 (0,5 g, 0,35 mmol, 1 equiv.), acido 3,4-(metilendioxi)fenilbor6nico (75 mg, 0,45 mmol, 1,3 equivy Na2CO3 (0,17 g, 1,6 mmol, 4,5 equiv.) en tolueno (11 ml), EtOH (5,5 ml) y agua (5,5 ml) en atm6sfera de Ar. El matraz se evacu6 y se aclar6 con Ar tres veces. Se anadi6 Pd(PPh3)4 (24 mg, 0,02 mmol, 0,06 equiv.) y el matraz se evacu6 de nuevo y se aclar6 con Ar tres veces. Esto se calent6 a 30 °C y se dej6 agitando durante una noche. El analisis mediante CL/EM mostr6 perdida completa del material de partida. El disolvente se elimin6 al vaclo y el residuo se disolvi6 en agua (60 ml) antes de lavar con acetato de etilo (60 ml x 3). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron con MgSO4, se filtraron y el disolvente se elimin6 al vaclo. La purificaci6n mediante cromatografla en columna (Hexano/acetato de etilo 50:50 a 25:75 v/v) proporcion6 el producto 34 en forma de un s6lido amarillo (310 mg, 64 %). LC/MS 1,44 min (ES) m/z (intensidad relativa) 1423,35 ([M -H]"-, 79).
(b) (9H-Fluoren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro- 1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato (35)
Se disolvi6 SEM dilactam 34 (0,31 g, 0,22 mmol, 1 equiv.) en THF (10 ml) y se enfri6 a -78 °C en atm6sfera de arg6n. Se anadi6 gota a gota soluci6n Super-Hydride® (0,5 ml, 1 M en THF, 2,5 equiv.) durante 5 minutos mientras se monitorizaba la temperatura. Tras 30 minutos se extrajo una muestra pequena y se proces6 para analisis LC/MS. Se anadi6 agua (50 ml), el bano frlo se retir6 y la soluci6n se lav6 con acetato de etilo (50 ml). La capa organica se extrajo y se lav6 con salmuera (60 x 70 ml), se sec6 con MgSO4, se filtr6 y el disolvente se elimin6 al vaclo. El producto bruto se disolvi6 en EtOH (13,2 ml), CH2Cl2 (6,6 ml) y agua (2,2 ml) y se anadi6 suficiente gel de sllice hasta obtener una suspensi6n espesa. Despues de 5 dlas de agitaci6n, se filtr6 a traves de un embudo sinterizado y se lav6 con CH2Ch/MeOH (9:1) (100 ml) hasta que el producto dej6 de eluir. La capa organica se lav6 con salmuera (2 x 50 ml), se sec6 con MgSO4, se filtr6 y el disolvente se elimin6 a vaclo. La purificaci6n mediante cromatografla en columna de gel de sllice (CHCl3 con un gradiente de 1 % a 4 % de MeOH) proporcion6 el producto puro 35 en forma de un s6lido amarillo (185 mg, 75 %). LC/MS (1,70 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1132,85 ([M+ H]+, 60).
(c) (S)-2-Amino-N-((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-il)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1- c][1,4]benzodiazepin-8-il)oxi)propoxi)-7-metoxi-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-2- il)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)-3-metilbutanamida (32)
5
10
15
20
25
30
35
40
Se disolvio la imina 35 (82 mg, 0,07 mmol, 1 equiv.) en DMF (1 ml) antes de anadir lentamente piperidina (0,2 ml, 2 mmol, exceso). Se dejo agitar esta solucion a temperatura ambiente durante 20 minutos hasta que el analisis CL/EM mostro un consumo completo de material de partida. La mezcla de reaccion se diluyo con CH2O2 (50 ml), se lavo con agua (50 ml x 4), se seco con MgSO4, se filtro y el disolvente se elimino al vaclo. El producto 33 se uso en la siguiente etapa sin purification adicional. LC/MS 1,15 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 910,60 ([M+ H]+, 58).
Ejemplo 7
(i) (S)-(2-amino-5-metoxi-4-((triisopropilsilil)oxi)fenil)(2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1- il)metanona (49)
imagen32
(a) 5-metoxi-2-nitro-4-((triisopropilsilil)oxi)benzaldehido (42)
Se anadio cloruro de triisopropilsililo puro (56,4 ml, 262 mmoles) a una mezcla de imidazol (48,7 g, 715,23 mmoles) y 4-hidroxi-5-metoxi-2-nitrobenzaldehldo 41 (47 g, 238 mmoles) (molidos juntos). La mezcla se calento hasta que el fenol e imidazol se fundieron y se disolvieron (100 °C). La mezcla de reaccion se dejo con agitation durante 15 minutos y a continuation se dejo enfriar, tras lo cual se observo que se formaba un solido en el fondo del matraz (cloruro de imidazol). La mezcla de reaccion se diluyo con 5 % de EtOAc/ hexanos y se cargo directamente sobre gel de sllice y la almohadilla se eluyo con 5 % de EtOAc/ hexanos, seguido de 10 % de EtOAc/hexanos (debido al bajo exceso, se encontro muy poco TIPSCI sin reaccionar en el producto). El producto deseado se eluyo con 5 % de acetato de etilo en hexano. El exceso de eluyente se elimino mediante evaporation rotatoria a presion reducida, seguido de secado bajo alto vaclo proporcionando un solido cristalino sensible a la luz (74,4 g, 88 %). Pureza satisfactoria por EM/CL (4,22 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 353,88 ([M + H]+', 100)); RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 10,43 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,40 (s, 1 H), 3,96 (s, 3H), 1,35 -1,24 (m, 3H), 1,10 (m, 18H).
(b) acido 5-metoxi-2-nitro-4-((triisopropilsilil)oxi)benzoico (43)
Una solucion de clorito de sodio (47,3 g, 523 mmoles, calidad tecnica al 80 %) y dihidrogenofosfato de sodio monobasico (35,2 g, 293 mmoles) (NaH2PO4) en agua (800 ml) se anadio a una solucion del compuesto 2 (74 g, 209 mmoles) en tetrahidrofurano (500 ml) a temperatura ambiente. Inmediatamente se anadio peroxido de hidrogeno (60 % de peso/peso, 140 ml, 2,93 moles) a la mezcla bifasica vigorosamente agitada. La mezcla de reaccion desprendio gas (oxlgeno), se disolvio el material de partida y la temperatura de la mezcla de reaccion subio a 45 °C. Despues de 30 minutos, la EM/CL revelo que la reaccion se habla completado. La mezcla de reaccion se enfrio en un bano de hielo y se anadio acido clorhldrico (1 M) para reducir el pH a 3 (esta etapa se encontro innecesaria en muchos casos, ya que el pH al final de la reaccion es casi acido; por favor, comprobar el pH antes de la extraction). A continuacion, la mezcla de reaccion se extrajo con acetato de etilo (1 l) y las fases organicas se lavaron con salmuera (2 x 100 ml) y se secaron sobre sulfato de magnesio. La fase organica se filtro y el exceso de disolvente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida proporcionando el producto 43 con rendimiento
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
cuantitativo como un solido amarillo. EM/CL (3,93 min (ES-) m/z (intensidad relativa) 367,74 ([M -Hj", 100)); RMN 1H (400 MHz, CDCb) 8 7,36 (s, 1H), 7,24 (s, 1H), 3,93 (s, 3H), 1,34 -1,22 (m, 3H), 1,10 (m, 18H).
(c) ((2S,4R)-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-hidroxipirrolidin-1-il)(5-metoxi-2-nitro-4- ((triisopropilsilil)oxi)fenil)metanona (45)
Se anadio DCC (29,2 g, 141 mmoles, 1,2 eq) a una solucion del acido 3 (43,5 g, 117,8 mmoles, 1 eq) e hidroxibenzotriazol hidratado (19,8 g, 129,6 mmoles, 1,1 eq) en diclorometano (200 ml) a 0 °C. Se retiro el bano frlo y la reaccion se dejo avanzar durante 30 min a temperatura ambiente, momento en el que se anadio rapidamente una solucion de (2S,4R)-2-t-butildimetilsililoximetil-4-hidroxipirrolidina 44 (30 g, 129,6 mmoles, 1,1 eq) y trietilamina (24,66 ml, 176 mmoles, 1,5 eq) en diclorometano (100 ml) a -10 °C bajo argon (a gran escala, el tiempo de adicion podrla acortarse enfriando la mezcla de reaccion incluso adicionalmente. La mezcla de reaccion se dejo con agitacion a temperatura ambiente durante 40 minutos a 1 hora y se monitorizo por EM/CL y CCF (EtOAc). Los solidos se eliminaron por filtracion sobre Celite y la fase organica se lavo con HCl 0,1 M acuoso frlo hasta que el pH se midio a 4 o 5. A continuacion, la fase organica se lavo con agua, seguido de bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el disolvente en exceso se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto se sometio a cromatografla ultrarrapida en columna (gel de sllice; gradiente 40/60 de acetato de etilo/hexano a 80/20 de acetato de etilo/hexano). El exceso de disolvente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida dando el producto puro 45 (45,5 g de producto puro, 66 %, y 17 g de producto ligeramente impuro, el 90 % en total). EM/CL 4,43 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 582,92 ([M + Hj+, 100); RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 7,66 (s, 1 H), 6,74 (s, 1 H), 4,54 (s, 1H), 4,40 (s, 1 H), 4,13 (s, 1 H), 3,86 (s, 3H), 3,77 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 3,36 (dd, J = 11,3, 4,5 Hz, 1 H), 3,14 -3,02 (m, 1 H), 2,38 -2,28 (m, 1 H), 2,10 (ddd, J = 13,3, 8,4, 2,2 Hz, 1 H), 1,36 -1,19 (m, 3H), 1,15 -1,05 (m, 18H), 0,91 (s, 9H), 0,17 -0,05 (m, 6H), (presencia de rotameros).
(d) (S)-5-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-1-(5-metoxi-2-nitro-4-((triisopropilsilil)oxi)benzoil)pirrolidin-3-ona (46)
Se anadio TCCA (8,82 g, 40 mmoles, 0,7 eq) a una solucion con agitacion de 45 (31,7 g, 54 mmoles, 1 eq) y TEMPO (0,85 g, 5,4 mmoles, 0,1 eq) en diclorometano seco (250 ml) a 0 °C. La mezcla de reaccion se agito vigorosamente durante 20 minutos, momento en el que la CCF (50/50 de acetato de etilo/hexano) revelo el consumo completo de material de partida. La mezcla de reaccion se filtro a traves de Celite y el filtrado se lavo con bicarbonato sodico saturado acuoso (100 ml), tiosulfato de sodio (9 g en 300 ml), salmuera (100 ml) y se seco sobre sulfato de magnesio. La evaporacion rotatoria a presion reducida dio el producto 46 con rendimiento cuantitativo. EM/CL 4,52 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 581,08 ([M + Hj+, 100); RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 7,78 -7,60 (m, 1H), 6,85 -6,62 (m, 1H), 4,94 (dd, J = 30,8, 7,8 Hz, 1 H), 4,50 -4,16 (m, 1 H), 3,99 -3,82 (m, 3H), 3,80 -3,34 (m, 3H), 2,92 -2,17 (m, 2H), 1,40 -1,18 (m, 3H), 1,11 (t, J = 6,2 Hz, 18H), 0,97 -0,75 (m, 9H), 0,15 --0,06 (m, 6H), (presencia de rotameros).
(e) trifluorometanosulfonato de (S)-5-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-1-(5-metoxi-2-nitro-4-
((triisopropilsilil)oxi)benzoil)-4,5-dihidro-1H-pirrol-3-ilo (47)
Se inyecto anhldrido trlflico (27,7 ml, 46,4 g, 165 mmoles, 3 eq) (temperatura controlada) a una suspension vigorosamente agitada de la cetona 46 (31,9 g, 55 mmoles, 1 eq) en diclorometano seco (900 ml) en presencia de 2,6-lutidina (25,6 ml, 23,5 g, 220 mmoles, 4 eq, secada sobre tamices) a -50 °C (bano de acetona/ nieve carbonica). La mezcla de reaccion se dejo con agitacion durante 1,5 horas cuando la EM/CL, tras un mini-procesamiento (agua/diclorometano), revelo que la reaccion se habla completado. Se anadio agua a la mezcla de reaccion todavla frla y la fase organica se separo y se lavo con bicarbonato sodico saturado, salmuera y sulfato de magnesio. La fase organica se filtro y el exceso de disolvente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto se sometio a cromatografla ultrarrapida en columna (gel de sllice; 10/90 v/v de acetato de etilo/hexano), la elimination del exceso de eluyente proporciono el producto 47 (37,6 g, 96 %). EM/CL, metodo 2, 4,32 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 712,89 ([M + Hj+', 100); RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8 7,71 (s, 1 H), 6,75 (s, 1 H), 6,05 (d, J = 1,8 Hz, 1 H), 4,78 (dd, J = 9,8, 5,5 Hz, 1H), 4,15 -3,75 (m, 5H), 3,17 (ddd, J= 16,2, 10,4, 2,3 Hz, 1H), 2,99 (ddd, J = 16,3, 4,0, 1,6 Hz, 1 H), 1,45 -1,19 (m, 3H), 1,15 -1,08 (m, 18H), 1,05 (s, 6H), 0,95 -0,87 (m, 9H), 0,15 -0,08 (m, 6H).
(f) (S)-(2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-il)(5-metoxi-2-nitro-4- ((triisopropilsilil)oxi)fenil)metanona (48)
Se anadio trifenilarsina (1,71 g, 5,60 mmoles, 0,4 eq) a una mezcla de triflato 47 (10,00 g, 14 mmoles, 1 eq.), acido metilboronico (2,94 g, 49,1 mmoles, 3,5 eq), oxido de plata (13 g, 56 mmoles, 4 eq) y fosfato de potasio tribasico (17,8 g, 84 mmoles, 6 eq) en dioxano seco (80 ml) bajo una atmosfera de argon. La reaccion se lavo con argon 3 veces y se anadio cloruro de bis(benzonitrilo)paladio (II) (540 mg, 1,40 mmoles, 0,1 eq). La reaccion se lavo con argon 3 veces mas antes de calentarse instantaneamente a 110 °C (el bloque termico Drysyn se calento previamente a 110 °C antes de la adicion del matraz). Despues de 10 min, la reaccion se enfrio a temperatura ambiente y se filtro a traves de una almohadilla de Celite. El disolvente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida en columna (gel de sllice; 10 % de acetato de etilo/hexano). Se recogieron fracciones puras y se combinaron, y el exceso de eluyente se elimino
5
10
15
20
25
30
35
mediante evaporacion rotatoria a presion reducida dando el producto 48 (4,5 g, 55 %). EM/CL, 4,27 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 579,18 ([M + H]+', 100); RMN 1H (400 MHz, CDCb) 8 7,70 (s, 1 H), 6,77 (s, 1 H), 5,51 (d, J = 1,7 Hz, 1 H), 4,77 -4,59 (m, 1 H), 3,89 (s, 3H), 2,92 -2,65 (m, 1H), 2,55 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 1,62 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 1,40 -1,18 (m, 3H), 1,11 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,11 (d, J = 2,3 Hz, 6H).
(g) (S)-(2-amino-5-metoxi-4-((triisopropilsilil)oxi)fenil)(2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1- il)metanona (49)
Se anadio polvo de cinc (28 g, 430 mmoles, 37 eq) a una solucion del compuesto 48 (6,7 g, 11,58 mmoles) en 5 % de acido formico en etanol v/v (70 ml) a aproximadamente 15 °C. La exotermia resultante se controlo usando un bano de hielo para mantener la temperatura de la mezcla de reaccion por debajo de 30 °C. Despues de 30 minutos la mezcla de reaccion se filtro a traves de una almohadilla de Celite. El filtrado se diluyo con acetato de etilo y la fase organica se lavo con agua, bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de disolvente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida (gel de sllice; 10 % de acetato de etilo en hexano). Las fracciones puras se recogieron y se combinaron y el exceso de disolvente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida proporcionando el producto 49 (5,1 g, 80 %). EM/CL, 4,23 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 550,21 ([M + H]+', 100); RMN 1H (400 MHz, CDCb) 8 7,28 (s, 1H), 6,67 (s, 1H), 6,19 (s, 1 H), 4,64 -4,53 (m, J = 4,1 Hz, 1H), 4,17 (s, 1 H), 3,87 (s, 1 H), 3,77 -3,69 (m, 1 H), 3,66 (s, 3H), 2,71 -2,60 (m, 1 H), 2,53 -2,43 (m, 1 H), 2,04 - 1,97 (m, J = 11,9 Hz, 1 H), 1,62 (s, 3H), 1,26 -1,13 (m, 3H), 1,08 -0,99 (m, 18H), 0,82 (s, 9H), 0,03 --0,03 (m, J = 6,2 Hz, 6H).
(ii) 11-((terc-bulildimetilsilil)oxi)-8-((5-vodopentil)oxi)-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-benzo[e1pirrolo[1.2-
a1[1,41diazepin-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-alilo
imagen33
(a) (2-(2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4-metoxi-5-
((triisopropilsilil)oxi)fenil)carbamato de (S)-alilo (50)
Se anadio cloroformiato de alilo (0,30 ml, 3,00 mmoles, 1,1 eq) a una solucion de amina 49 (1,5 g, 2,73 mmoles) en presencia de piridina seca (0,48 ml, 6,00 mmoles, 2,2 eq) en diclorometano seco (20 ml) a -78 °C (bano de acetona/nieve carbonica). Despues de 30 minutos, se retiro el bano y la mezcla de reaccion se dejo calentar hasta temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano y se anadio sulfato de cobre acuoso saturado. A continuacion, la fase organica se lavo secuencialmente con bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de disolvente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida proporcionando el producto 50, que se uso directamente en la siguiente reaccion. EM/CL, 4,45 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 632,91 ([M + H]+-, 100)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
(b) (2-(2-(hidroximetil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4-metoxi-5-((triisopropilsilil)oxi)fenil)carbamato de (S)- alilo (51)
El producto en bruto 50 se disolvio en una mezcla 7:1:1:2 de acido acetico/metanol/tetrahidrofurano/agua (28:4:4:8 ml) y se dejo con agitacion a temperatura ambiente. Despues de 3 horas, se observo la completa desaparicion del material de partida por EM/CL. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo y se lavo secuencialmente con agua (2 x 500 ml), bicarbonato sodico acuoso saturado (200 ml) y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de acetato de etilo se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, 25 % de acetato de etilo en hexano). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y el exceso de eluyente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida proporcionando el producto deseado 51 (1 g, 71 %). EM/CL, 3,70 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 519,13 ([M + H]+', 95); RMN 1H (400 MHz, CDCls) 8 8,34 (s, 1 H), 7,69 (s, 1 H), 6,78 (s, 1 H), 6,15 (s, 1H), 5,95 (ddt, J = 17,2, 10,5, 5,7 Hz, 1H), 5,33 (dq, J = 17,2, 1,5 Hz, 1H), 5,23 (ddd, J = 10,4, 2,6, 1,3 Hz, 1 H), 4,73 (tt, J = 7,8, 4,8 Hz, 1 H), 4,63 (dt, J = 5,7, 1,4 Hz, 2H), 4,54 (s, 1H), 3,89 -3,70 (m, 5H), 2,87 (dd, J = 16,5, 10,5 Hz, 1 H), 2,19 (dd, J = 16,8, 4,6 Hz, 1 H), 1,70 (d, J = 1,3 Hz, 3H), 1,38 -1,23 (m, 3H), 1,12 (s, 10H), 1,10 (s, 8H).
(c) 11-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-8-((triisopropilsilil)oxi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin- 10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-alilo (52)
Se anadio gota a gota sulfoxido de dimetilo (0,35 ml, 4,83 mmoles, 2,5 eq) a una solucion de cloruro de oxalilo (0,2 ml, 2,32 mmoles, 1,2 eq) en diclorometano seco (10 ml) a -78 °C (bano de nieve carbonica/acetona) bajo una atmosfera de argon. Despues de 10 minutos se anadio lentamente una solucion de 51 (1 g, 1,93 mmoles) en diclorometano seco (8 ml) con la temperatura todavla a -78 °C. Despues de 15 min se anadio gota a gota trietilamina (1,35 ml, secada sobre tamices moleculares de 4A, 9,65 mmoles, 5 eq) y se retiro el bano de nieve carbonica/acetona. Se dejo que la mezcla de reaccion alcanzara la temperatura ambiente y se extrajo con acido clorhldrico frlo (0,1 M), bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de diclorometano se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida proporcionando el producto 52 (658 mg, 66 %). EM/CL, 3,52 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 517,14 ([M+ H]+', 100); RMN 1H (400 MHz, CDCla) 5 7,20 (s, 1H), 6,75 -6,63 (m, J = 8,8, 4,0 Hz, 2H), 5,89 -5,64 (m, J = 9,6, 4,1 Hz, 2H), 5,23 -5,03 (m, 2H), 4,68 -4,38 (m, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,83 -3,77 (m, 1H), 3,40 (s, 1H), 3,05 -2,83 (m, 1H), 2,59 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 1,78 (d, J = 1,3 Hz, 3H), 1,33 -1,16 (m, 3H), 1,09 (d, J = 2,2 Hz, 9H), 1,07 (d, J = 2,1 Hz, 9H).
(d) 11-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-metoxi-2-metil-5-oxo-8-((triisopropilsilil)oxi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-alilo (53)
Se anadio triflato de terc-butildimetilsililo (0,70 ml, 3,00 mmoles, 3 eq) a una solucion del compuesto 52 (520 mg, 1,00 mmol) y 2,6-lutidina (0,46 ml, 4,00 mmoles, 4 eq) en diclorometano seco (40 ml) a 0 °C bajo argon. Despues de 10 min, se retiro el bano frlo y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reaccion se extrajo con agua, bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida (gel de sllice; gradiente, 10 % de acetato de etilo en hexano a 20 % de acetato de etilo en hexano). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y el exceso de eluyente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida dando el producto 53 (540 mg, 85 %). EM/CL, 4,42 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 653,14 ([M + Na]+', 100); RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 7,20 (s, 1 H), 6,71 -6,64 (m, J= 5,5 Hz, 2H), 5,83 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 5,80 -5,68 (m, J = 5,9 Hz, 1H), 5,14 -5,06 (m, 2H), 4,58 (dd, J = 13,2, 5,2 Hz, 1H), 4,36 (dd, J = 13,3, 5,5 Hz, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,71 (td, J = 10,1, 3,8 Hz, 1H), 2,91 (dd, J = 16,9, 10,3 Hz, 1H), 2,36 (d, J = 16,8 Hz, 1 H), 1,75 (s, 3H), 1,31 -1,16 (m, 3H), 1,12 -1,01 (m, J = 7,4, 2,1 Hz, 18H), 0,89 -0,81 (m, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,19 (s, 3H).
(e) 11-((terc-butildimetilsilil)oxi)-8-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-alilo (54)
Se anadio acetato de litio (87 mg, 0,85 mmoles) a una solucion del compuesto 53 (540 mg, 0,85 mmoles) en dimetilformamida humeda (6 ml, 50:1 de DMF/agua). Despues de 4 horas, la reaccion se habla completado y la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (25 ml) y se lavo con solucion acuosa de acido cltrico (pH ~ 3), agua y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de acetato de etilo se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida (gel de sllice; gradiente, 25 % al 75 % de acetato de etilo en hexano). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y el exceso de eluyente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida dando el producto 54 (400 mg, cuantitativo). EM/CL, (3,33 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 475,26 ([M+H]+, 100).
(f) 11-((terc-butildimetilsilil)oxi)-8-((5-yodopentil)oxi)-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-alilo (55)
Se anadieron diyodopentano (0,63 ml, 4,21 mmoles, 5 eq) y carbonato de potasio (116 mg, 0,84 mmoles, 1 eq) a una solucion del fenol 54 (400 mg, 0,84 mmoles) en acetona (4 ml, secada sobre tamices moleculares). A
5
10
15
20
25
continuacion, la mezcla de reaccion se calento hasta 60 °C y se agito durante 6 horas. Se elimino la acetona mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografia ultrarrapida (gel de sHice; 50/50, v/v, hexano/acetato de etilo). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y el exceso de eluyente se elimino proporcionando 55 con el 90 % de rendimiento. EM/CL, 3,90 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 670,91 ([M]+, 100). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 7,23 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,60 (s, 1 H), 5,87 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 5,83 -5,68 (m, J = 5,6 Hz, 1 H), 5,15 -5,01 (m, 2H), 4,67 -4,58 (m, 1 H), 4,45 -4,35 (m, 1 H), 4,04 -3,93 (m, 2H), 3,91 (s, 3H), 3,73 (td, J = 10,0, 3,8 Hz, 1 H), 3,25 -3,14 (m, J = 8,5, 7,0 Hz, 2H), 2,92 (dd, J = 16,8, 10,3 Hz, 1H), 2,38 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 1,95 -1,81 (m, 4H), 1,77 (s, 3H), 1,64 -1,49 (m, 2H), 0,88 (s, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,23 (s, 3H).
(iii)____________11-((terc-butildimetilsilil)oxi)-8-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-
a][1.41diazepin-10(5H)-carboxilato____de____(11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(aliloxi)-4-metil-1,2-dioxopentan-3-il)amino)-1-
oxopropan-2-il)hidrazinil)bencilo (70)
imagen34
(a) 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(((terc-butildimetilsilil)oxi)metil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4-metoxi-5-
((triisopropilsilil)oxi)fenil)carbamoil)oxi)metil)fenil)hidrazinil)propanamido)-4-metil-2-oxopentanoato de alilo (56)
Se anadio trietilamina (2,23 ml, 18,04 mmoles, 2,2 eq) a una solucion con agitacion de la amina 49 (4 g, 8,20 mmoles) y trifosgeno (778 mg, 2,95 mmoles, 0,36 eq) en tetrahidrofurano seco (40 ml) a 5 °C (bano de hielo). El progreso de la reaccion del isocianato se monitorizo sacando periodicamente alicuotas de la mezcla de reaccion y extinguiendo con metanol y realizando analisis de EM/CL. Una vez se habia completado la formacion de isocianato, se anadio rapidamente una solucion de alloc-Val-Ala-PABOH (4,12 g, 12,30 mmoles, 1,5 eq) y trietilamina (1,52 ml, 12,30 mmoles, 1,5 eq) en tetrahidrofurano seco (40 ml) mediante inyeccion al isocianato recientemente preparado. La mezcla de reaccion se dejo con agitacion a 40 °C durante 4 horas. Se elimino el exceso de disolvente mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografia ultrarrapida (gel de silice;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
gradiente, 1 % de metanol a 5 % de metanol en diclorometano) (tambien han sido satisfactorias condiciones alternativas de cromatografla usando EtOAc y hexano). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y el exceso de eluyente se elimino mediante evaporation rotatoria a presion reducida dando el producto 56 (3,9 g, 50 %). EM/CL, 4,23 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 952,36 ([M+ H]+', 100); RMN 1H (400 MHz, CDCH) 8 8,62 (s a, 1H), 8,46 (s, 1H), 7,77 (s a, 1H), 7,53 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,32 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,76 (s, 1 H), 6,57 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 6,17 (s, 1H), 6,03 -5,83 (m, 1 H), 5,26 (dd, J = 33,8, 13,5 Hz, 3H), 5,10 (s, 2H), 4,70 -4,60 (m, 2H), 4,58 (dd, J = 5,7, 1,3 Hz, 2H), 4,06 -3,99 (m, 1 H), 3,92 (s, 1 H), 3,82 -3,71 (m, 1 H), 3,75 (s, 3H), 2,79 -2,64 (m, 1 H), 2,54 (d, J = 12,9 Hz, 1 H), 2,16 (dq, J = 13,5, 6,7 Hz, 1 H), 1,67 (s, 3H), 1,46 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,35 -1,24 (m, 3H), 1,12 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,97 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,94 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,87 (s, 9H), 0,07--0,02 (m, 6H).
(b) 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(hidroximetil)-4-metil-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4-metoxi-5- ((triisopropilsilil)oxi)fenil)carbamoil)oxi)metil)fenil)hidrazinil)propanamido)-4-metil-2-oxopentanoato de alilo (57)
Se disolvio el eter de TBS 56 (1,32 g, 1,38 mmoles) en una mezcla 7:1:1:2 de acido
acetico/metanol/tetrahidrofurano/agua (14:2:2:4 ml) y se dejo con agitation a temperatura ambiente. Despues de 3 horas no se observo mas material de partida por EM/CL. La mezcla de reaction se diluyo con acetato de etilo (25 ml) y se lavo secuencialmente con agua, bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de acetato de etilo se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, 2 % de metanol en diclorometano). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y el exceso de eluyente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida proporcionando el producto deseado 57 (920 mg, 80 %). EM/CL, 3,60 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 838,18 ([M+H]+', 100). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 8,55 (s, 1 H), 8,35 (s, 1 H), 7,68 (s, 1 H), 7,52 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,77 (s, 1 H), 6,71 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,13 (s, 1 H), 5,97 - 5,82 (m, J = 5,7 Hz, 1H), 5,41 -5,15 (m, 3H), 5,10 (d, J = 3,5 Hz, 2H), 4,76 -4,42 (m, 5H), 4,03 (t, J = 6,6 Hz, 1 H), 3,77 (s, 5H), 2,84 (dd, J = 16,7, 10,4 Hz, 1 H), 2,26 -2,08 (m, 2H), 1,68 (s, 3H), 1,44 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,30 (dt, J = 14,7, 7,4 Hz, 3H), 1,12 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,96 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,8 Hz, 3H).
(c) 11-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-8-((triisopropilsilil)oxi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin- 10(5H)-carboxilato de (11S, 11aS)-4-(2-(1-((1-(aliloxi)-4-metil-1,2-dioxopentan-3-il)amino)-1-oxopropan-2- il)hidrazinil)bencilo (58)
Se anadio gota a gota sulfoxido de dimetilo (0,2 ml, 2,75 mmoles, 2,5 eq) a una solution de cloruro de oxalilo (0,11 ml, 1,32 mmoles, 1,2 eq) en diclorometano seco (7 ml) a -78 °C (bano de nieve carbonica/acetona) bajo una atmosfera de argon. Despues de 10 minutos se anadio lentamente una solucion de 57 (920 mg, 1,10 mmoles) en diclorometano seco (5 ml) con la temperatura todavla a -78 °C. Despues de 15 min se anadio gota a gota trietilamina (0,77 ml, secada sobre tamices moleculares de 4A, 5,50 mmoles, 5 eq) y se retiro el bano de nieve carbonica/acetona. Se dejo que la mezcla de reaccion alcanzara la temperatura ambiente y se extrajo con acido clorhldrico frlo (0,1 M), bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de diclorometano se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida en columna (gel de sllice; gradiente 2 % de metanol a 5 % de metanol en diclorometano). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y la elimination del exceso de eluyente mediante evaporacion rotatoria a presion reducida proporciono el producto 58 (550 mg, 60 %). EM/CL, 3,43 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 836,01 ([M]+', 100). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 8,39 (s, 1 H), 7,52 -7,40 (m, 2H), 7,21 -7,08 (m, J = 11,5 Hz, 2H), 6,67 (s, 1 H), 6,60 -6,47 (m, J = 7,4 Hz, 1 H), 5,97 -5,83 (m, 1 H), 5,79 -5,66 (m, 1 H), 5,38 -4,90 (m, 6H), 4,68 -4,52 (m, J = 18,4, 5,5 Hz, 4H), 4,04 -3,94 (m, J = 6,5 Hz, 1 H), 3,87 -3,76 (m, 5H), 3,00 - 2,88 (m, 1 H), 2,66 -2,49 (m, 2H), 2,21 -2,08 (m, 2H), 1,76 (s, 3H), 1,45 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,09 -0,98 (m, J = 8,9 Hz, 18H), 0,96 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,9 Hz, 3H).
(d) 11-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-metoxi-2-metil-5-oxo-8-((triisopropilsilil)oxi)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(aliloxi)-4-metil-1,2-dioxopentan-3-il)amino)-1- oxopropan-2-il)hidrazinil)bencilo (59)
Se anadio triflato de terc-butildimetilsililo (0,38 ml, 1,62 mmoles, 3 eq) a una solucion del compuesto 58 (450 mg, 0,54 mmoles) y 2,6-lutidina (0,25 ml, 2,16 mmoles, 4 eq) en diclorometano seco (5 ml) a 0 °C bajo argon. Despues de 10 min, se retiro el bano frlo y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reaccion se extrajo con agua, bicarbonato sodico acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de disolvente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida en columna (gel de sllice; 50/50 v/v de hexano/acetato de etilo). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y el exceso de eluyente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida dando el producto 59 (334 mg, 65 %). EM/CL, 4,18 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 950,50 ([M]+', 100). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8 8,53 (s, 1 H), 8,02 (s, 1 H), 7,44 (d, J= 7,6 Hz, 2H), 7,21 (s, 1 H), 7,08 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,72 -6,61 (m, J = 8,9 Hz, 2H), 6,16 (s, 1 H), 5,97 -5,79 (m, J = 24,4, 7,5 Hz, 2H), 5,41 -5,08 (m, 5H), 4,86 (d, J = 12,5 Hz, 1 H), 4,69 -4,60 (m, 1 H), 4,57 (s, 1 H), 4,03 (t, J = 6,7 Hz, 1 H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (td, J = 9,6, 3,6 Hz, 1 H), 2,43 -2,09 (m, J = 34,8, 19,4, 11,7 Hz, 3H), 1,76 (s, 3H), 1,43 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,30 -1,21 (m, 3H), 0,97 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 8,4 Hz, 3H), 0,84 (s, 9H), 0,23 (s, 3H), 0,12 (s, 3H).
5
10
15
20
25
30
35
(e) 11-((terc-butildimetilsilil)oxi)-8-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-
a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de (11S,11aS)-4-(2-(1-((1-(aliloxi)-4-metil-1,2-dioxopentan-3-il)amino)-1- oxopropan-2-il)hidrazinil)bencilo (60)
Se anadio acetato de litio (50 mg, 0,49 mmoles) a una solucion del compuesto 59 (470 mg, 0,49 mmoles) en dimetilformamida humeda (4 ml, 50:1 de DMF/agua). Despues de 4 horas, la reaccion se habla completado y la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo y se lavo con acido cltrico (pH ~ 3), agua y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de acetato de etilo se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida en columna (gel de sllice; gradiente, 50/50 a 25/75 v/v de hexano/acetato de etilo). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y el exceso de eluyente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida dando el producto 60 (400 mg, cuantitativo). EM/CL, 3,32 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 794,18 ([M+H]+, 100). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8 8,53 (s, 1 H), 8,02 (s, 1 H), 7,44 (d, J= 7,6 Hz, 2H), 7,21 (s, 1H), 7,08 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,72-6,61 (m, J = 8,9 Hz, 2H), 6,16 (s, 1H), 5,97 -5,79 (m, J = 24,4, 7,5 Hz, 2H), 5,41 -5,08 (m, 5H), 4,86 (d, J = 12,5 Hz, 1 H), 4,69 -4,60 (m, 1H), 4,57 (s, 1 H), 4,03 (t, J = 6,7 Hz, 1 H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (td, J = 9,6, 3,6 Hz, 1 H), 2,43 -2,09 (m, J = 34,8, 19,4, 11,7 Hz, 3H), 1,76 (s, 3H), 1,43 (d, J = 6,9 Hz, 3H), 1,30 -1,21 (m, 3H), 0,97 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 8,4 Hz, 3H), 0,84 (s, 9H), 0,23 (s, 3H), 0,12 (s, 3H).
(iv) 11-hidroxi-7-metoxi-8-((5-(((S)-7-metoxi-2-metil-5-oxo-5.11a-dihidro-1H-benzo[e1pirrolo[1,2-a1[1.41diazepin-8-
il)oxi)pentil)oxi)-2-metil-5-oxo-11.11a-dihidro-1H-benzo[e1pirrolo[1.2-a][1.41diazepin-10(5H)-carboxilato__________de
(11S,11aS)-4-((2S,5S)-37-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-isopropil-2-metil-4,7,35-trioxo- 10.13.16.19.22.25,28.31-octaoxa-3.6.34-triazaheptatriacontanamido)bencilo (64)
imagen35
(a) 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(aliloxi)-4-metil-1,2-dioxopentan-3-il)amino)-1-oxopropan-2-
il)hidrazinil)bencil)oxi)carbonil)-11-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-metoxi-2-metil-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-11-((terc-butildimetilsilil)oxi)-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a- dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de (11S)-alilo (61)
Se anadio carbonato de potasio (70 mg, 0,504 mmoles, 1 eq) a una solucion de 55 (370 mg, 0,552 mmoles, 1,2 eq) y fenol 60 (400 mg, 0,504 mmoles) en acetona seca (25 ml). La reaccion se agito 8 horas a 70 °C. La EM/CL mostro que todo el material de partida no se habla consumido, de manera que la reaccion se dejo con agitacion durante la noche a temperatura ambiente y se agito durante 2 horas adicionales al dla siguiente. Se elimino la acetona mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida (gel de sllice; 80 % de acetato de etilo en hexano al 100 % de acetato de etilo). Se recogieron fracciones puras y se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
combinaron y el exceso de eluyente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida dando el producto 61 (385 mg, 57 %). EM/CL, 4,07 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1336,55 ([M+H]+-, 50).
(b) 8-((5-(((11S)-10-(((4-(2-(1-((1-(aliloxi)-4-metil-1,2-dioxopentan-3-il)amino)-1-oxopropan-2- il)hidrazinil)bencil)oxi)carbonil)-11-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepin-8-il)oxi)pentil)oxi)-11-hidroxi-7-metoxi-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de (11S)-alilo (62)
Se anadio fluoruro de tetra-n-butilamonio (1 M, 0,34 ml, 0,34 mmoles, 2 eq) a una solucion de 61 (230 mg, 0,172 mmoles) en tetrahidrofurano seco (3 ml). El material de partida se consumio totalmente despues de 10 minutos. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (30 ml) y se lavo secuencialmente con agua y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de acetato de etilo se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante 62 se uso como una mezcla en bruto para la siguiente reaccion. EM/CL, 2,87 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 1108,11 ([M+H]+; 100).
(c) 11-hidroxi-7-metoxi-8-((5-((7-metoxi-2-metil-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oxi)pentil)oxi)-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de (11S)-4-(2- (1-((1-amino-3-metil-1-oxobutan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)hidrazinil)bencilo (63)
Se anadio tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0) (12 mg, 0,01 mmoles, 0,06 eq) a una solucion del producto en bruto 62 (0,172 mmoles) y pirrolidina (36 pl, 0,43 mmoles, 2,5 eq) en diclorometano seco (10 ml). La mezcla de reaccion se agito 20 minutos y se diluyo con diclorometano y se lavo secuencialmente con cloruro de amonio acuoso saturado y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de diclorometano se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante 63 se uso como una mezcla en bruto para la siguiente reaccion. EM/CL, 2,38 min (ES+) m/z (intensidad relativa) 922,16 ([M+H]+, 40).
(d) 11-hidroxi-7-metoxi-8-((5-(((S)-7-metoxi-2-metil-5-oxo-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-
il)oxi)pentil)oxi)-2-metil-5-oxo-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato de
(11S,11aS)-4-( (2S, 5S)-37-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-5-isopropil-2-metil-4,7,35-trioxo-
10,13,16,19,22,25,28,31-octaoxa-3,6,34-triazaheptatriacontanamido)bencilo (64)
Se anadio 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI, 33 mg, 0,172 mmoles) a una solucion del producto en bruto 63 (0,172 mmoles) y acido Mal-(PEG)s (100 mg, 0,172 mmoles) en diclorometano seco (10 ml). La reaccion se agito durante 2 horas y la presencia de material de partida ya no se observo por EM/CL. La reaccion se diluyo con diclorometano y se lavo secuencialmente con agua y salmuera. La fase organica se seco sobre sulfato de magnesio, se filtro y el exceso de diclorometano se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida. El resto resultante se sometio a cromatografla ultrarrapida (gel de sllice; 100 % de cloroformo a 10 % de metanol en cloroformo). Se recogieron fracciones puras y se combinaron y el exceso de eluyente se elimino mediante evaporacion rotatoria a presion reducida dando 64 (E) (60 mg, 25 % durante 3 etapas).
Ejemplo 8
imagen36
El compuesto 65 es el compuesto 79 del documento WO 2011/130598
(11 S)-4-( 1-yodo-20-isopropil-23-metil-2,18,21-trioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3,19,22-triazatetracosanamid)bencil-11- hidroxi-7-metoxi-8-(3-((7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-en-1-il)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oxi)propoxi)-5-oxo-2-((E)-prop-1-en-1-il)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-carboxilato (66)
Se anadio N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC, 4,71 ml, 0,0304 mmol) a una solucion de la amina 65 (0,0276 mmol) y yodo-(PEG)4-acido (13,1 mg, 0,0304 mmol) en diclorometano seco (0,8 ml). La reaccion se agito durante 3 horas y la presencia de material de partida ya no se observo mediante CL/EM. La mezcla de reaccion se cargo directamente sobre una placa de cromatografla en capa fina (TLC) y se purifico mediante TLC preparativa (metanol al 10 % en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
cloroformo). Las bandas puras se rasparon de la placa de TLC, se suspendieron en metanol al 10 % en cloroformo, se filtraron y se elimino el eluyente en exceso mediante evaporacion rotatoria a presion reducida para dar 66 (D) (20,9 mg, 56 %). CL/EM, metodo 2, 3,08 min (ES +) m/z (intensidad relativa) 1361,16 ([M+H]+, 100).
Metodos experimentales generales para el Ejemplo 9
Los datos de LCMS se obtuvieron usando una CL/EM de la serie Agilent 1200 con una MS de cuadrupolo Agilent 6110, con ionizacion por electropulverizacion. Fase movil A -0,1 % de acido acetico en agua. Fase movil B -0,1 % en acetonitrilo. Caudal de 1,00 ml/min. Gradiente de 5 % de B hasta 95 % de B durante 3 minutos, permaneciendo a 95 % de B durante 1 minuto y, despues, a 5 % de B durante 6 segundos. El tiempo total de ejecucion es de 5 minutos. Columna: Phenomenex Gemini-NX 3pm C18, 30 x 2,00 mm. Cromatogramas basados en la deteccion UV a 254 nm. Los espectros de masas se lograron utilizando la EM en modo positivo. Los valores de desplazamiento qulmico de RMN de protones se midieron en la escala delta a 400 MHz usando un Bruker AV400. Se han usado las abreviaturas siguientes: s, singlete; d, doblete; t, triplete; c, cuartetE; m, multiplete; br, ancho. Las constantes de acoplamiento se expresan en Hz. A menos que se indique lo contrario, se realizo cromatografla en columna (mediante procedimiento ultrarrapido) sobre sllice Merck Kieselgel (Art. 9385). Los datos de espectroscopia de masas (EM) se recogieron utilizando un instrumento Waters Micromass LCT acoplado a un modulo de separation de HPLC Waters 2795. La cromatografla en capa fina (TLC) se realizo sobre placas de aluminio de gel de sllice (Merck 60, F254). Todos los demas productos qulmicos y disolventes se adquirieron EN Sigma-Aldrich o Fisher Scientific y se usaron tal como se suministraron sin purification adicional.
Las rotaciones opticas se midieron en un polarlmetro ADP 220 (Bellingham Stanley Ltd.) y las concentraciones (c) se facilitan en g/100 ml. Los puntos de fusion se midieron usando un aparato de punto de fusion digital (electrotermico). Los espectros de IR se registraron en un espectrometro de IR Spectrum 1000 FT de Perkin-Elmer. Los espectros de RMN 1H y 13C se adquirieron a 300 K usando un espectrometro de RMN de Bruker Avance a 400 y 100 MHz, respectivamente. Los desplazamientos qulmicos se informan con respecto a TEM (8 = 0,0 ppm) y las senales se designan s (singlete), d (doblete), t (triplete), dt (triplete doble), dd (doblete de dobletes), ddd (doblete doble de dobletes) o m (multiplete), con las constantes de acoplamiento dadas en hercios (Hz). Se recogieron datos de espectroscopia de masas (EM) usando un instrumento Micromass ZQ de Waters acoplado a una HPLC 2695 de Waters con una PDA 2996 de Waters. Los parametros de Micromass ZQ de Waters usados fueron: capilar (kV), 3,38; cono (V), 35; extractor (V), 3,0; temperatura de la fuente ( °C), 100; temperatura de desolvatacion ( °C), 200; velocidad de flujo del cono (l/h), 50; velocidad de flujo de desolvatacion (l/h), 250. Los datos de espectroscopia de masas de alta resolution (HR-EM) se registraron en un Micromass QTOF Global de Waters en modo W positivo usando puntas de vidrio de borosilicato recubiertas de metal para introducir las muestras en el instrumento. Se realizo cromatografla en capa fina (CCF) sobre placas de aluminio de gel de sllice (Merck 60, F254), y la cromatografla ultrarrapida utilizo gel de sllice (Merck 60, 230-400 de malla ASTM). Excepto por el HOBt (NovaBiochem) y los reactivos soportados sobre solido (Argonaut), todos los otros productos quimicos y disolventes se compraron de Sigma-Aldrich y se usaron como se suministraron sin mas purificacion. Se prepararon disolventes anhidros mediante destilacion bajo una atmosfera de nitrogeno seca en presencia de un agente secante apropiado, y se almacenaron sobre tamices moleculares de 4A o alambre de sodio. Eter de petroleo se refiere a la fraction que hierve a 40-60 °C.
Condiciones de EM/CL generales: La HPLC (Waters Alliance 2695) se realizo usando una fase movil de agua (A) (acido formico 0,1 %) y acetonitrilo (B) (acido formico 0,1 %). Gradiente: composition inicial 5 % de B durante 1,0 min, a continuation 5 % de B a 95 % de B durante 2,5 min. La composicion se mantuvo durante 0,5 min al 95 % de B, y a continuacion volvio a 5 % de B en 0,1 minutos y se mantuvo all! durante 0,9 min. El tiempo de ejecucion total del gradiente es igual a 5 min. Velocidad de flujo 3,0 ml/min, se fraccionaron 400 pl mediante una pieza en T de volumen muerto cero que pasa al espectrometro de masas. Intervalo de deteccion de longitud de onda: 220 a 400 nm. Tipo de funcion: matriz de diodos (535 barridos). Columna: Phenomenex® Onyx Monolithic C18 50 x 4,60 mm
Ejemplo 9
(i) Intermedios clave
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
imagen37
(a-i) Acido (S)-2-(aliloxicarbonilamino)-3-metilbutanoico (I2)
Se anadio gota a gota cloroformiato de alilo (36,2 ml, 340,59 mmol, 1,2 eq) a una solucion agitada de L-valina (I1) (33,25 g, 283,82 mmol, 1,0 eq) y carbonato de potasio (59,27 g, 425,74 mmol, 1,5 eq) en agua (650 ml) y THF (650 ml). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 18 horas, despues el disolvente se concentro a presion reducida y la solucion restante se extrajo con eter dietllico (3 x 100 ml). La porcion acuosa se acidifico a pH 2 con HCl conc. y se extrajo con DCM (3 x 100 ml). Los extractos organicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida para proporcionar el producto en forma de un aceite incoloro (57,1 g, rendimiento supuesto del 100 %). CL/EM (1,966 min (eS +)), m/z: 202,1 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 12,57 (s a, 1H), 7,43 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 5,96-5,86 (m, 1H) 3,4 Hz), 5,18 (ddd, 1H, J =
10.4, 2,9, 1,6 Hz), 4,48 (dt, 2H, J = 5,3, 1,5 Hz), 3,85 (dd, 1H, J = 8,6, 6,0 Hz) 2,03 (oct, 1H, J = 6,6 Hz), 0,89 (d, 3H, J = 6,4 Hz), 0,87 (d, 3H, J = 6,5 Hz).
(a-ii) (S)-2,5-dioxopirrolidin-1-il-(aliloxicarbonilamino)-3-metilbutanoato (I3)
A una solucion agitada del acido protegido I2 (60,6 g, 301,16 mmol, 1,0 eq) y N-hidroxisuccinimida (34,66 g, 301,16 mmol, 1,0 eq) en THF seco (800 ml) se anadio diciclohexilcarbodiimida (62,14 g, 301,16 mmol, 1 eq). La reaccion se agito durante 18 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se filtro a continuacion, el solido se lavo con THF y el filtrado combinado se concentro a presion reducida. El residuo se volvio a disolver en DCM y se dejo reposar a 0 °C durante 30 minutos. La suspension se filtro y se lavo con DCM frlo. La concentracion del filtrado a presion reducida proporciono el producto como un aceite incoloro viscoso (84,7 g, rendimiento supuesto del100 %) que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional. CL/EM (2,124 min (ES+)), m/z: 321,0 [M + Na]+ RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6 8 8,0 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 5,97-5,87 (m, 1H), 5,30 (ddd, 1H, J = 17,2, 3,0, 1,7 Hz) Ddd, 1H, J =
10.4, 2,7, 1,4 Hz), 4,52 (dt, 2H, J = 5,3, 1,4 Hz), 4,32 (dd, 1H, J = 8,3, 6,6 Hz), 2,81 (m, 4H) (Oct, 1H, J = 6,7 Hz), 1,00 (d, 6H, J = 6,8 Hz).).
(a-iii) acido (S)-2-((S)-2-(aliloxicarbonilamino)-3-metilbutanamido) propanoico (14)
Se anadio una solucion de ester de succinimida I3 (12,99 g, 43,55 mmol, 1,0 eq) en THF (50 ml) a una solucion de L-alanina (4,07 g, 45,73 mmol, 1,05 eq) y NaHCOa (4,02 g, 47,90 mmol, 1,1 eq) en THF (100 ml) y H2O (100 ml). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 72 horas cuando se elimino el THF a presion reducida. El pH se ajusto a 3-4 con acido cltrico para precipitar una goma blanca. Despues de la extraccion con acetato de etilo (6 x 150 ml), los extractos organicos combinados se lavaron con H2O (200 ml), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presion reducida. La trituracion con eter dietllico proporciono el producto como un polvo blanco que se recogio por filtracion y se lavo con eter dietllico (5,78 g, 49 %). CL/EM (1,925 min (ES +)), m/z: 273,1 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6 8 12,47 (s ancho, 1H), 8,17 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,16 (d, 1H, J = 9,0 Hz), 5,95-5,85 (m, 1H), 5,29 (dd, 1H, J = 17,2, 1,7 Hz), 5,17 (dd, 1H, J = 10,4, 1,5 Hz), 4,46 (m, 2H), 4,18 (quin, 1H, J = 7,2 Hz) (Dd, 1H, J = 9,0, 7,1 Hz), 1,95 (oct, 1H, J = 6,8 Hz), 1,26 (d, 3H, J = 7,3 Hz), 0,88 (d, 3H, J = 6,8 Hz) (D, 3H, J = 6,8 Hz).
(a-iv) (S)-1-((S)-1-(4-(hidroximetil fenilamino)-1-oxopropan-2-ilamino)-3-metil-1-oxobutan-2-ilcarbamato) de alilo (I5)
Se anadio EEDQ (5,71 g, 22,29 mmol, 1,05 eq) a una solucion de alcohol p-aminobencllico (2,74 g, 22,29 mmol, 1,05 eq) y acido I4 (5,78 g, 21,23 mmol, 1 eq) en THF seco) y se agito a temperatura ambiente durante 72 horas. La mezcla de reaccion se concentro luego a presion reducida y el solido marron resultante se trituro con eter dietllico y se filtro con lavado posterior con un exceso de eter dietllico para dar el producto en forma de un solido blancuzco (7,1 g, 88 %). CL/EM (1,980 min (ES +)), m/z: 378,0 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,89 (br s, 1H), 8,13 (d, 1H, J = 7,0 Hz), 7,52 (d, 2H, J = 8,5 Hz) 5,23 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 5,91 (m, 1H), 5,30 (m, 1H), 5,17 (m, 1H), 4,46 (m, 2H), 5,09 (t, 1H, J = 5,6 Hz (M, 3H), 3,89 (dd, 1H, J = 8,6, 6,8 Hz), 1,97 (m, 1H), 1,30 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 0,88 (D, 3H, J = 6,8 Hz), 0,83 (d, 3H, J = 6,7 Hz).
5
10
15
20
25
30
imagen38
Acido 1-yodo-2-oxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-oico (I7)
Se anadio una solucion de anhldrido yodoacetico (0,250 g, 0,706 mmol, 1,1 eq) en DCM seco (1 ml) a amino-PEG (4)-acido I6 (0,170 g, 0,642 mmol, 1,0 eq) en DCM (1 ml). La mezcla se agito en oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reaccion se lavo con HCl 0,1 M, agua, se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, MeOH al 3 % y acido formico al 0,1 % en cloroformo hasta MeOH al 10 % y acido formico al 0,1 % en cloroformo) para dar el producto en forma de un aceite de color naranja (0,118 g, 42 %). CL/EM (1,623 min (ES +)), m/z: 433, 98 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCl3 8 8,069 (s, 1H), 7,22 (s a, 1H), 3,79 (t, 2H, J = 5,8 Hz), 3,74 (s, 2H)), 3,50-3,46 (m, 2H), 2,62 (t, 2H, J = 5,8 Hz).
(i)__________(terc-butildimetilsililoxi)-8-(3-vodopropoxi)-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo
[e]pirrolo[1.2-a[1.41diazepina-10(5H)-carboxilato de (11s, 11As)-alilo (74)
imagen39
(a) (S)-5-((terc-butildimetilsililoxi) metil)-1-(5-metoxi-2-nitro-4-(triisopropilsililoxi) benzoil)-4,5-dihidro-1H-pirrol-3-il trifluorometanosulfonato (47)
Se anadio gota a gota anhldrido trlflico (28,4 g, 100,0 mmol, 3,0 eq), durante 25 minutos, a una solucion agitada energicamente de la cetona 46 (19,5 g, 30,0 mmol, 1,0 eq) en DCM (550 ml) que contenla 2,6-Lutidina (14,4 g, 130,0 mmol, 4,0 eq) a-50 °C. La mezcla de reaccion se agito durante 1,5 horas cuando CL/EM indico una reaccion completa. La fase organica se lavo sucesivamente con agua (100 ml), bicarbonato sodico saturado (150 ml), salmuera (50 ml), y la fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, n-hexano/EtOAc 90/10 v/v) para proporcionar el producto en forma de un aceite amarillo palido (19,5 g, 82 %). CL/EM (4,391 min (ES +)), m/z: 713,25 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 5 7,68 (s, 1H), 6,72 (s, 1H), 6,02 (t, 1H, J = 1,9 Hz), 4,75 (m, 1H) (S, 3H), 3,15 (ddd, 1H, J = 16,2, 10,3, 2,3 Hz), 2,96 (ddd, 1H, J = 16,2, 4,0, 1,6 Hz), 1,28-1,21 (m, 3H), 18H, J = 7,2 Hz), 0,88 (s, 9H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3H).
(b) (S, E)-(2-(terc-butildimetilsililoxi) metil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-il) (5 metoxi-2-nitro-4-(triiso- propilsililoxi) fenil) metanona (67)
Se anadio tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0) (0,41 g, 0,35 mmol, 0,03 eq) a una mezcla del triflato 47 (8,4 g, 11,8 mmol, 1,0 eq), acido E-1-propeno-1-ilboronico G, 16,5 mmol, 1,4 eq) y fosfato de potasio (5,0 g, 23,6 mmol, 2,0 eq) en dioxano seco (60 ml) en atmosfera de nitrogeno. La mezcla se agito a 25 °C durante 120 minutos cuando CL/EM indico una reaccion completa. Se anadieron acetato de etilo (120 ml) y agua (120 ml), se elimino la fase organica, se lavo con salmuera (20 ml), se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, n/hexano/EtOAc 95/5 v/v hasta n/hexano/EtOAc 90/10 v/v) para proporcionar el producto en forma de una espuma amarilla (4,96 g, 70 %. CL/EM (4,477 min (ES+)), m/z: 605,0 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 5 7,67 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 5,93 (d, 1H, J = 15,4 Hz), 5,67 (s, 1H) (M, 1H), 1,72 (dd, 3H, J = 6,8, 1,0 Hz), 1,30-1,22 (m, 3H), 2,86 (m, 1H) 1,07 (d, 18H, J = 7,2 Hz), 0,87 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H).
(c) (S, E)-(2-(terc-butildimetilsililoxi) metil)-4-(prop-1-enil)-2,3-(2-amino-5-metoxi-4-(triisopropilsililoxi) fenil)-dihidro- 1H-pirrol-1-il) metanona (68)
Se anadio polvo de cinc (22,0 g, 0,33 mol, 37 eq) en porciones durante 20 minutos a una solucion del propenilo intermedio 67 (5,5 g, 9,1 mmol, 1,0 eq) en acido formico al 5 % v/v/etanol 55 ml), utilizando un bano de hielo para mantener la temperatura entre 25 y 30 °C. Despues de 30 minutos, la mezcla de reaccion se filtro a traves de un lecho corto de celite®. El celite® se lavo con acetato de etilo (65 ml) y los extractos organicos combinados se lavaron sucesivamente con agua (35 ml), bicarbonato de sodio saturado (35 ml) y salmuera (10 ml). La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, n-hexano/EtOAc 90/10 v/v) para proporcionar el producto en forma de un aceite amarillo palido (3,6 g, 69,0 %). CL/EM (4,439 min (ES +)), m/z: 575,2 [M + H]]. RMN 1H (400 MHz, CDCla 8 6,75 (m, 1H), 6,40 (s ancho, 1H), 6,28 (m, 1H), 6,11 (d, 1H, J = 15,4 Hz) 3,73 (s, 3H), 2,86 (dd, 1H, J = 15,7, 10,4 Hz), 4,67 (m, 1H), 4,36 (m, 2H), 3,93 (s a, 1H), 2,73 (dd, 1H, J = 15,9, 4,5 Hz), 1,80 (dd, 3H, J = 6,8, 1,3 Hz), 1,35-1,23 (m, 3H), 1,12 (d, 18H, J = 7,3 Hz) 0,89 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H).
(d) 2-(2-((terc-butildimetilsililoxi)metil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4-metoxi-5-(triisopropilsililoxi) fenilcarbamato de (S,E)-alilo (69)
Se anadio cloroformiato de alilo (0,83 g, 6,88 mmol, 1,1 eq) a una solucion de la amina 68 (3,6 g, 6,26 mmol, 1,0 eq) en DCM seco (80 ml) que contenla piridina seca (1,09 g, 13,77 mmol, 2,2 eq) a-78 °C. El hielo seco se retiro y la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. Despues de agitar durante 15 minutos mas, la CL/EM indico una reaccion completa. La fase organica se lavo sucesivamente con HCl 0,01 N (50 ml), bicarbonato sodico saturado (50 ml), salmuera (10 ml), se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida para dejar un aceite amarillo palido que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional (4,12 g, rendimiento supuesto del 100 %). CL/EM (4,862 min (ES+)), m/z: 659,2 [M + H]+.
(e) 2-(2-(hidroximetil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4-metoxi-5-(triisopropilsililoxi) fenilcarbamato (70)
Se disolvio el intermedio 69 bruto (rendimiento supuesto del 100 %, 4,12 g, 6,25 mmol, 1,0 eq) en una mezcla de acido acetico (70 ml), metanol (10 ml), THF (10 ml) y agua (20 ml) y se dejo agitar a temperatura ambiente. Despues de 6 horas, la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (500 ml) y se lavo sucesivamente con agua (2 x 500 ml), bicarbonato de sodio saturado (300 ml) y salmuera (50 ml). La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, 1/99 v/v de metanol/DCM hasta 5/95 v/v de metanol/DCM) para dar el producto como un aceite amarillo y se recupero 1 g adicional de material de partida sin reaccionar. Este material se sometio a las mismas condiciones de reaccion que anteriormente, pero se dejo en agitacion durante 16 horas. Despues de tratamiento y purificacion, se aislo producto adicional (2,7 g, 79 %, 2 etapas) CL/EM (3,742 min (ES +)), m/z: 545,2 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCh 8 8,38 (m, 1H), 7,72 (m, 1H), 6,81 (s, 1H), 6,37 (m, 1H), 6,10 (d, 1H, J = 15,8 Hz) (M, 1H), 5,53 (m, 1H), 5,36 (ddd, 1H, J = 17,2, 3,1, 1,5 Hz), 5,25 (ddd, 1H, J = 10,4, 2,5, 1,3 Hz) (D, 2H, J = 5,7, 1,3 Hz), 3,84 (m, 3H), 3,79 (s, 3H), 3,04 (dd, 1H, J = 16,7, 10,5 Hz), 2,40 (dd, 1H, J = 16,0, 4,5 Hz), 1,82 (dd, 3H, J = 6,8, 1,0 Hz), 1,36-1,26 (m, 3H), 1,14 (d, 18H, J = 7,3 Hz).
(f) 11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triisopropilsililoxi)-11,11a-dihidrobenzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepina-10 (5H)-carboxilato de (11S,11aS)-alilo (71)
Se anadio gota a gota dimetilsulfoxido seco (1,16 g, 14,87 mmol, 3,0 eq) a una solucion de cloruro de oxalilo (0,94 g, 7,43 mmol, 1,5 eq) en DCM (25 ml) a-78 °C en una atmosfera de nitrogeno. Manteniendo la temperatura a-78 °C, despues de 10 minutos se anadio gota a gota una solucion del alcohol primario 70 (2,7 g, 4,96 mmol, 1,0 eq) en DCM (20 ml). Despues de otros 15 minutos, se anadio trietilamina seca (2,5 g, 24,78 mmol, 5,0 eq) y la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se lavo sucesivamente con HCl 0,1 N frlo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
(50 ml), hidrogenocarbonato sodico saturado (50 ml) y salmuera (10 ml) y la capa organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida para dar el producto como Un aceite amarillo que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional (2,68 g, se supuso un rendimiento del 100 %). CL/EM (3,548 min (ES +)), m/z: 543,2 [M + H]+.
(g) 11-(terc-butildimetilsililoxi)-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triisopropilsililoxi)-11,11a-dihidro-1H-benzo [e] pirrolo[1,2-a][1,4] diazepina-10 (5H)-carboxilato de (11S, 11aS)-alilo (72)
Se anadio terc-butildimetilsililtrifluorometano sulfonato (3,93 g, 14,87 mmol, 3,0 eq) a una solucion de carbinolamina 71 (rendimiento supuesto del 100 %, 2,68 g, 4,96 mmol, 1,0 eq) y 2,6-lutidina (2,12 g, 19,83 mmol, 4,0 eq) en DCM seco (40 ml) a 0 °C bajo una atmosfera de nitrogeno. Despues de 10 minutos, la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante otros 60 minutos. La fase organica se lavo sucesivamente con agua (10 ml), bicarbonato de sodio saturado (10 ml) y salmuera (5 ml), se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, cloroformo hasta 2/98 v/v metanol/cloroformo) para dar el producto en forma de un aceite amarillo (2,0 g, 63 %, 2 etapas). CL/EM (4,748 min (ES +)), m/z: 657,2 [M + H] +. RMN 1H (400 MHz, CDCla 8 7,19 (s, 1H), 6,86 (m, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,22 (d, 1H, J = 15,4 Hz) 5,88 (m, 1H), 4,58 (dd, 1H, J = 13,4, 5,4 Hz), 5,88 (m, 1H), 5,48 (m, 1H), 5,11 (d, 1H, J = 5,0 Hz), 3,36 (s, 1H), 3,00 (dd, 1H, J = 15,6, 11,0 Hz), 2,53 (m, 1H), 4,35 (dd, 1H, J = 13,2, 5,7 Hz) 1,81 (dd, 3H, J = 6,8, 0,9 Hz), 1,30-1,18 (m, 3H), 1,08 (d, 9H, J = 2,3 Hz), 1,06 (d, 9H, J = 2,3 Hz), 0,86, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,18 (s, 3H).
(h) 11-(terc-butildimetilsililoxi)-8-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirrolo[1,2-a [1,4] diazepina-10 (5H)-carboxilato de (11S, 11aS) -alilo (73)
Se anadio dihidrato de acetato de litio (0,31 g, 3,04 mmol, 1,0 eq) a una solucion de la diazepina 72 (2,0 g, 3,04 mmol, 1,0 eq) en DMF humeda (20 ml) a 25 °C y se agito durante 4 horas. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (200 ml) y se lavo sucesivamente con acido cltrico 0,1 M (50 ml, pH 3), agua (50 ml) y salmuera (10 ml), se seco sobre MgSo4, se filtro y concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, n-hexano/EtOAc 50/50 v/v hasta n/hexano/EtOAc 25/75 v/v) para proporcionar el producto como un solido amarillo palido (0,68 g, 45 %). CL/EM (3,352 min (ES +)), m/z: 501,1 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCla 8 7,02 (s, 1H), 6,66 (m, 1H), 6,53 (s, 1H), 6,03 (d, 1H, J = 15,5 Hz) (M, 1H), 4,97 (m, 2H), 4,39 (dd, 1H, J =
13,5, 4,2 Hz), 4,20 (dd, 1H, J = 8,9 Hz) 1H, J = 13,2, 5,7 Hz), 3,73 (s, 3H), 3,59 (m, 1H), 2,81 (dd, 1H, J = 16,1, 10,5
Hz), 2,35 (d, 1H, J = 15,7 Hz) 1,61 (d, 3H, J = 6,4 Hz), 0,67 (s, 9H), 0,05 (s, 3H), 0,00 (s, 3H).
(i) 11-(terc-butildimetilsililoxi)-8-(3-yodopropoxi)-7-metoxi-5-oxo-2-(E)-prop-1-enil) 11a-dihidro-1 <i> H-benzo [e] pirrolo[1,2-a][1,4] diazepina-10(5H)-carboxilato de (11S, 11aS)-alilo (74)
Se anadieron diyodopropano (0,295 g, 1,00 mmol, 5,0 eq) y carbonato de potasio (0,028 g, 0,20 mmol, 1,0 eq) a una solucion del fenol 33 (0,100 g, 0,020 mmol, 1,0 eq) en acetona seca (5 ml). La mezcla de reaccion se calento a 60 °C durante 6 horas cuando CL/EM mostro una reaccion completa. La mezcla de reaccion se concentro a sequedad a presion reducida y el residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, n-hexano/EtOAc 75/25 v/v hasta 50/50 v/v de n-hexano/EtOAc) para proporcionar el producto como un aceite incoloro (0,074 g, 56 %). CL/EM (3,853 min (ES +)), m/z: 669,0 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCh 8 7,26 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,24 (d, 1H, J = 15,3 Hz) 4,97 (m, 1H), 5,13 (m, 1H), 5,12 (m, 1H), 5,22 (m, 1H) 3H), 3,81 (m, 1H), 3,40 (t, 2H, J = 6,7 Hz),
3,05 (dd, 1H, J = 16,3, 10,1 Hz) 1,84 (d, 3H, J = 6,6 Hz), 0,92 (s, 9H), 0,28 (s, 3H), 0,26 (s, 3H).
(iii) 11-(terc-butildimetilsililoxi)-8-hidroxi-3-metilbutanamido)propanamido)bencill-11-(terc-butildimetilsililoxi)-8-hidroxi- 7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-11.11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1.2-a1 [1,4]diazepin-10 (5H)-carboxilato de (11,S, 11As)-4-((S)-2((S)-2-(aliloxicarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamido)bencilo (79)
5
10
15
20
25
30
imagen40
(a) ((S)-1-(((S)-1-((4-(((2-((S)-2-((terc-butildimetilsilil) oxi) meti) 1-enil)-2,3-dihidro-1H-pir-role-1-carbonil)-4-metoxi-5- ((triisopropilsilil) oxi) fenil) carbamoil) oxi) Metil) fenil) amino)-1-oxopropan-2-il) amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il) carbamato de alilo (75)
Se anadio trietilamina (0,256 ml, 1,84 mmol, 2,2 eq) a una solucion agitada de la amina 68 (0,480 g, 0,835 mmol, 1,0 eq) y trifosgeno (0,089 g, 0,301 mmol, 0,36 eq) en THF seco (15 ml) a 5 °C (bano de hielo). El progreso de la reaccion de isocianato se controlo retirando periodicamente allcuotas de la mezcla de reaccion y apagando con metanol y realizando analisis de LCMS. Una vez completada la reaccion de isocianato, se anadio rapidamente una solucion de Alloc-Val-Ala-PABOH I5 (0,473 g, 1,25 mmol, 1,5 eq) y trietilamina (0,174 ml, 1,25 mmol, 1,5 eq) en THF seco (10 mL) Inyeccion al isocianato recien preparado. La reaccion se dejo agitar a 40 °C durante 4 horas seguido de agitacion a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se concentro a presion reducida y se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, n-hexano/EtOAc 20/80 v/v hasta 50/50 v/v de n-hexano/EtOAc, luego 1/99 v/v de DCM/MeOH a 5/95 v/v de DCM/MeOH) para proporcionar el producto como un solido amarillo (0,579 g, 71 %). CL/EM (4,468 min (ES +)), m/z: 978,55 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCla 8 8,63 (s a, 1H) J = 8,6 Hz), 6,76 (s, 1H), 6,59 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 6,36 (s a, 1H), 6,04 (d, 1H, J = 15,9 Hz)), 5,55 (m, 1H), 5,33-5,21 (m, 3H), 5,10 (s, 2H), 4,66 (m, 2H), 4,57 (dd, 2H, J = 5,6, 1,0 Hz) 1H, J = 7,3, 6,8 Hz), 3,90 (m, 1H), 3,81 (m, 1H), 3,78 (s, 3H), 2,82 (dd, 1H, J = 15,4, 9,6 Hz) 1H), 1,78 (dd, 3H, J = 6,5, 0,8 Hz), 1,46 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,29 (m, 3H), 1,11 (D, 3H, J = 6,8 Hz), 0,83 (s, 9H), 0,04 (s, 3H), 0,01 (d, (S, 3H).
(b) ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(hidroximetil)-4-(EE)-prop-1-en-1i-il)-2,3-dihidro-1H-pirrol-1-carbonil)-4-metoxi-5- ((triisopropilsilil)oxi)fenil)carbamoil)oxi)metil)fenil)amino-1-oxopropan-2-il) amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il) carbamato de alilo (76)
Se disolvio el eter silllico 75 (1,49 g, 1,52 mmol, 1,0 eq) en una mezcla 7: 1: 1: 2 de acido acetico/metanol/tetrahidrofurano/agua (14: 2: 2: 4 ml) y se agito a temperatura ambiente. Despues de 2 horas, la reaccion se diluyo con EtOAc (100 ml), se lavo secuencialmente con agua, bicarbonato sodico y luego salmuera. La fase organica se seco a continuacion sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, 100/0 y 99/1 a 92/8 v/v DCM/MeOH) para proporcionar el producto como un solido naranja (1,2 g, 92 %). CL/EM (3,649 min (ES +)), m/z: 865,44 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCl3 8 8,44 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 7,69 (s a, 1H), 7,53 (d, 2H, J = 8,7 Hz) 6,36 (m an, 1H), 6,05 (d, 1H, J = 14,9 Hz), 5,90 (m, 1H), 5,56 (m, 1H) (M, 1H), 5,30 (m, 1H), 5,12 (m, 1H), 5,10 (d, 2H, J = 3,1 Hz), 4,73 J = 16,3, 10,2 Hz), 2,38 (dd, 1H, J = 16,6, 3H), 3,79 (m, 2H), 3,76 (s, 3H) 1,1 (d, 3H, J = 6,8, 0,9 Hz), 1,46 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,29 (m, 3H), 1,11 (d,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
18H, J = 7,4 Hz), 0,97 (d, 3H, J = 6,7 Hz), 0,92 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
(c) 11-hidroxi-7-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triisopropilsililoxi)-11,11a-dihidro-1H-benzo [e] pirrolo[1,2-a][1,4] diazepina-10 (5H)-carboxilato de (11S, 11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloxicarbonilamino)-3-metilbutanamido) propanamido)bencilo (77)
Se anadio gota a gota dimetilsulfoxido seco (0,180 g, 2,3 mmol, 3,0 eq) a una solucion de cloruro de oxalilo (0,147 g, 1,1 mmol, 1,5 eq) en DCM (10 ml) a-78 °C bajo una atmosfera de nitrogeno. Manteniendo la temperatura a-78 °C, despues de 20 minutos, se anadio gota a gota una solucion del alcohol primario 76 (0,666 g, 0,77 mmol, 1,0 eq) en DCM (10 ml). Despues de otros 15 minutos, se anadio trietilamina seca (0,390 g, 3,85 mmol, 5,0 eq) y la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se lavo sucesivamente con HCl 0,1 N frlo (10 ml), hidrogenocarbonato sodico saturado (10 ml) y salmuera (5 ml). La capa organica se seco luego sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico despues por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, n/hexano/EtOAc 50/50 v/v hasta n/hexano/EtOAc 25/75 v/v) para proporcionar el producto como un solido blanco (0,356 g,). CL/EM (3,487 min (ES +)), m/z: 862,2 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCb 8 8,34 (br s, 1H), 7,47 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,17 (s, 1H), 7,14 (d, 2H, J = 7,5 Hz) 1H), 6,62 (d, 1H, J = 14,4 Hz), 5,80 (m, 1H), 5,40 (m, 1H), 5,53 (m, 1H), 5,32 (m, 1H), 5,21 (d, 2H, J = 9,6 Hz), 5,06 (d, 1H, J = 12,3 Hz), 4,90, 3,38 (m, 1H), 3,05 (dd, 1H, J = 16,0, 10,3 Hz), 2,76 (m, 1H) 1H), 1,80 (dd, 3H, J = 6,7, 0,8 Hz), 1,44 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,16 (m, 3H), 1,01 (d, 18H, J) = 6,6 Hz), 0,96 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,92 (d, 3H, J = 6,8 Hz).
(d) 11-(terc-butildimetilsililoxi)-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-8-(triisopropilsililoxi)-11,11a-dihidro-1H- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4] diazepina-10(5H)-carboxilato de (11S, 11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloxicarbonilamino)-3- metilbutanamido)propanamido)bencilo (78)
Se anadio terc-butildimetilsililtrifluorometano sulfonato (0,46 g, 1,74 mmol, 3,0 eq) a una solucion de alcohol secundario 77 (0,5 g, 0,58 mmol, 1,0 eq) y 2,6-lutidina (0,25 g, 2,32 mmol, 4,0 eq) en DCM seco (10 ml) a 0 °C bajo una atmosfera de nitrogeno. Despues de 10 minutos, la mezcla de reaccion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante otros 120 minutos. La fase organica se lavo sucesivamente con agua (10 ml), bicarbonato sodico saturado (10 ml) y salmuera (5 ml), se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, n-hexano/EtOAc 50/50 v/v) para proporcionar el producto en forma de un solido blanco (0,320 g, 57 %). CL/EM (4,415 min (ES +)), m/z: 976,52 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCla 8 8,31 (br s, 1H), 7,48 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,21 (s, 1H), 7,14 (d, 2H, J = 8,3 Hz) (D, 1H, J = 7,3 Hz), 6,25 (d, 1H, J = 14,6 Hz), 5,93 (m, 1H), 5,85 (d, 1H, J 5,5 (m, 1H), 5,24 (m, 2H), 5,15 (d, 1H, J = 12,5 Hz), 4,86 (d, 1H, J = 12,2 Hz) 4,62 (m, 3H), 4,01 (m, 1H), 3,86 (m, 1H), 3,04 (m, 1H), 2,56 (m, 1H), 2,20 (m, 1H) 1,84 (dd, 3H, J = 6,6, 0,7 Hz), 1,48 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 1,20 (m, 3H), 1,05 (d, 9H, J = 2,9 Hz), J = 2,9 Hz), 0,99 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,95 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,88 (s, 9H), 0,27 (s, 3H)).
(e) 11-(terc-butildimetilsililoxi)-8-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepina-10(5H)-carboxilato de (11S, 11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(aliloxicarbonilamino)-3-metilbutanamido) propanamido) bencilo (79)
Se anadio acetato de litio dihidratado (0,010 g, 0,10 mmol, 1,0 eq) a una solucion del eter de sililo 78 (0,100 g, 0,10 mmol, 1,0 eq) en DMF humeda (2 ml) a 25 °C durante 3 horas. Despues, la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (20 ml) y se lavo sucesivamente con acido cltrico 0,1 M (20 ml, pH 3), agua (20 ml) y salmuera (5 ml), se seco sobre MgSO4, presion. El residuo se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, 5/95 v/v de metanol/DCM) para proporcionar el producto en forma de un aceite amarillo palido (0,070 g, 83 %). CL/EM (3,362 min (ES +)), m/z: 820,2 [M + H]+. RMN 1H (400 MHz, CDCb 8 8,39 (s, 1H), 7,48 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 7,25 (s, 1H), 7,12 (d, 2H, J = 8,1 Hz) 1H), 6,67 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 6,24 (d, 1H, J = 15,2 Hz), 6,03 (s, 1H), 5,92 (m, 1H), 5,84 (M, 1H), 5,26 (m, 2H), 5,18 (d, 1H, J = 12,3 Hz), 4,80 (d, 1H, J = 8,9 Hz) J = 12,4 Hz), 4,66-4,60 (m, 3H), 4,02 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,81 (m, 1H), 3,03 (m, 1H), 2,57 (m, 1H) 1,84 (dd, 3H, J = 6,8, 0,8 Hz), 1,48 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 1,00 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,95 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,87 (s, 9H), 0,26 (s, 3H), 0,12 (s, 3H).
(iv)________11-hidroxi-7-metoxi-8-(3-((S)-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e1pirrolo[1.2-a1
[1,41 diazepin-8-iloxi) propoxi)-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-Dihidro-1H-benzo [e1pirrolo[1,2-a1 [1,41 diazepina-10 (5H)-carboxilato de (11S, 11aS)-4-((20S, 23S)-1-yodo-20-isopropil-23-metil-2.18.21-trioxo-6.9.12.15-tetraoxa-3. 19,22-triazatetracosanamido) bencilo (66, D)
imagen41
(a) ((11S, 11aS)-alil-8-(3-((11S, 11aS)-10-((4-((R)-2-(R)-2-(aliloxicarbonilamino)-3-
metilbutanamido)propanamida)benciloxi)carbonil)-11-(terc-butildimetilsililoxi)-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)- 5 5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8-iloxi)propoxi)-11-(terc-butildimetilsililoxi)-7-metoxi-5- oxo-2-((E)prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4] diazepin-10 (5H)-carboxilato (80)
Se anadio carbonato de potasio (0,030 g, 0,21 mmol, 1,0 eq) a una solucion del fenol 79 (0,175 g, 0,21 mmol, 1,0 eq) y el ligador yodo 74 (0,214 g, 0,32 mmol, 1,5 eq) en acetona Ml). La mezcla de reaccion se calento bajo una 10 atmosfera de nitrogeno a 75 °C en un matraz sellado durante 17 horas. La mezcla de reaccion se concentro a sequedad a presion reducida y se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, metanol/DCM 2/98 v/v a 5/95 v/v de metanol/DCM) para dar el producto como un solido amarillo palido (0,100 g, 35 %). CL/EM (4,293 min (ES +)),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
m/z: 1359,13 [M] +.
(b) 8-(3-((11S, 11aS)-10-((4-((R)-2-(R)-2-(aliloxicarbonilamino)-3-metilbutanamido)propanamida) benciloxi) carbonil)- 11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-5,10,11,11a-tetrahidro-1H-benzo [e ]-pirrolo[1,2-a][1,4] diazepin-8-iloxi) propoxi)-11-hidroxi-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1--11,11a-dihidro-1H-benzo [e] pirrolo[1,2-a][1,4] diazepina-10 (5H)- carboxilato de (11S, 11aS)-alilo (81)
Se anadio fluoruro de tetra-n-butilamonio (1 M, 0,22 ml, 0,22 mmol, 2,0 eq) a una solucion de eter silllico 80 (0,150 g, 0,11 mmol, 1,0 eq.) En THF seco (2 ml). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 20 minutos, despues de lo cual CL/EM indico reaccion completa. La mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (10 ml) y se lavo secuencialmente con agua (5 ml) y salmuera (5 ml). La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se concentro a presion reducida para dejar un solido amarillo. La purificacion por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice, 6/94 v/v de metanol/DCM hasta 10/90 v/v de metanol/DCM) proporciono el producto como un solido amarillo palido (0,090 g, 73 %). CL/EM (2,947 min (ES +)), m/z: 1154,0 [M + Na]+. RMN 1H (400 MHz, CDCb 8 8,39 (br s, 1H), 7,39 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,18 (d, 2H, J = 10,6 Hz), 7,10 (m, 3H) 1H), 6,55 (s, 1H), 6,22 (dd, 2H, J = 15,3, 6,6 Hz), 5,85 (m, 2H), 5,74 (m, 3H) (M, 2H), 4,41 (m, 2H), 4,09 (m, 4H), 3,85 (m, 11H), 5,52 (m, 2H), 5,22, 3,06 (m, 2H), 2,76 (m, 2H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (m, 1H), 1,79 (d, 6H, J = 6,4 Hz), 1,40 (d, 3H, J = 6,1 Hz), 0,90 (m, 6H).
(c) 11-hidroxi-7-metoxi-8-(3-((S)-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-5,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4] diazepin-8-iloxi) propoxi)-5-oxo-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo [e] pirrolo[1,2-a][1,4] diazepina-10 (5H)-carboxilato de (11S, 11aS)-4-((R)-2-((R)-2-amino-3-metilbutanamido) propanamido) bencilo (65)
Se anadio tetraquis (trifenilfosfeno) paladio (0) (0,005 g, 0,005 mmol, 0,06 eq) a una solucion de la bis-carbinolamina 81 (0,090 g, 0,08 mmol, 1,0 eq) y pirrolidina (16 ml, 0,20 mmol, 2,5 eq) En DCM seco (5 ml). Despues de 20 minutos, la mezcla de reaccion se diluyo con DCM (10 ml) y se lavo secuencialmente con cloruro de amonio saturado (5 ml) y salmuera (5 ml), se seco sobre MgSO4, se filtro y el disolvente se elimino a presion reducida para dejar el crudo Producto como un solido amarillo palido que se uso en la siguiente etapa sin purificacion adicional (0,075 g, rendimiento supuesto del 100 %). CL/EM (2,060 min (ES +)), m/z: 947,2 [M + H]+.
(d) 11-hidroxi-7-metoxi-8-(3-((S)-7-metoxi-5-oxo-2-((E)-prop-1-enil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e] pirrolo[1,2-a][1,4]
diazepin-8-iloxi)propoxi)-5-oxo-2-(E)-propenil)-11,11a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4] diazepina-10(5H)-
carboxilato de (11S, 11aS)-4-((20S, 23S)-1-yodo-20-isopropil-23-metil-2,18,21-trioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3, 19,22- triazatetracosanamido) bencilo (66, D)
Se anadio EDCl (0,015 g, 0,08 mmol, 1,0 eq) a una solucion de la amina 65 (rendimiento supuesto del 100 % 0,075 g, 0,08 mmol, 1,0 eq) y yodoacetamida-PEG4-acido I7 (0,034 g, 0,08 mmol, 1,0 eq) En diclorometano seco (5 ml) y la reaccion se agito en la oscuridad. Despues de 50 minutos, se anadio una cantidad adicional de yodoacetamida- PEG4-acido I7 (0,007 g, 0,016 mmol, 0,2 eq) junto con una cantidad adicional de EDCl (0,003 g, 0,016 mmol, 0,2 eq). Despues de un total de 2,5 horas, la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (15 ml) y se lavo
secuencialmente con agua (10 ml) y salmuera (10 ml). La fase organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se
concentro a presion reducida. El residuo resultante se purifico por cromatografla ultrarrapida (gel de sllice,
cloroformo 100 % a 90:10 v/v cloroformo: metanol). Las fracciones puras se combinaron para proporcionar el
producto (0,0254 g, 23 %, 2 etapas). Las fracciones brutas se recogieron y purificaron mediante TLC preparativa (gel de sllice, Cloroformo: metanol 90:10 v/v) para proporcionar un segundo lote de producto (0,0036 g, 3 %, 2 etapas). CL/EM (2,689 min (ES +)), m/z: 681,0 1/2 [M + 2H]+.
Ejemplo 10: Actividad de compuestos liberados
Ensayo de K562
Se mantuvieron celulas de leucemia mieloide cronica humana K562 en medio RPM1 1640 complementado con 10 % de suero bovino fetal y glutamina 2 mM a 37 °C en una atmosfera humidificada que contenla 5 % de CO2 y se incubaron con una dosis especificada de farmaco durante 1 hora o 96 horas a 37 °C en la oscuridad. La incubacion se termino por centrifugacion (5 min, 300 g) y las celulas se lavaron una vez con medio sin farmaco. Tras el tratamiento con el farmaco apropiado, las celulas se transfirieron a placas de microtitulacion de 96 pocillos (104 celulas por pocillo, 8 pocillos por muestra). A continuacion, las placas se mantuvieron en la oscuridad a 37 °C en una atmosfera humidificada que contenla 5 % de CO2. El ensayo se basa en la capacidad de las celulas viables para reducir una sal de tetrazolio soluble amarilla, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT, Aldrich-Sigma), a un precipitado de formazano purpura insoluble. Tras la incubacion de las placas durante 4 dlas (para permitir que las celulas de control aumenten en numero aproximadamente 10 veces), se anadieron 20 pl de solucion de mTt (5 mg/ml en solucion salina tamponada con fosfato) a cada pocillo y las placas se incubaron adicionalmente durante 5 h. A continuacion, las placas se centrifugaron durante 5 min a 300 g y se pipeteo volumen del medio del sedimento de celulas dejando 10-20 pl por pocillo. Se anadio DMSO (200 pl) a cada pocillo y las muestras se agitaron para garantizar la mezcla completa. A continuacion, la densidad optica se leyo a una longitud de onda de 550 nm sobre un lector de placas de ELISA Titertek Multiscan, y se construyo una curva de dosis- respuesta. Para cada curva, se leyo un valor de CI50 como la dosis requerida para reducir la densidad optica final al
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
50 % del valor de control.
El compuesto ReIC tiene una CI50 de 0,1 pM en este ensayo.
El compuesto ReIE tiene una CI50 de 0,425 pM en este ensayo.
Ejemplo 11: Formacion de conjugados
Procedimiento general de conjugacion de anticuerpos
Se diluyen anticuerpos a 1-5 mg/ml en un tampon de reduccion (ejemplos: solucion salina tamponada con fosfato PBS, tampon histidina, tampon borato de sodio, tampon Tris). Se anade una solucion recientemente preparada de TCEP (clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina) para reducir selectivamente los puentes de disulfuro de cistelna. La cantidad de TCEP es proporcional al nivel objetivo de reduccion, dentro de 1 a 4 equivalentes molares por anticuerpo, que generan 2 a 8 tioles reactivos. Despues de la reduccion durante varias horas a 37 °C, la mezcla se enfrla hasta temperatura ambiente y el exceso de farmaco-conector (A, B, C, D. E) se anade como una solucion de DMSO diluida (contenido de DMSO final de hasta el 10 % en volumen/volumen de mezcla de reaccion). La mezcla se agito suavemente a tanto 4 °C como a temperatura ambiente durante el tiempo apropiado, generalmente 1-3 horas para. El exceso de tioles reactivos puede hacerse reaccionar con un 'reactivo de encapuchado de tiol' como N- etilmaleimida (NEM) al final de la conjugacion. Los conjugados de anticuerpo-farmaco se concentran usando filtros de concentracion centrlfuga con un corte de peso molecular de 10 kDa o superior, a continuacion se purifican por filtracion de flujo tangencial (TFF) o cromatografla de llquidos rapida de protelnas (FPLC). Los de conjugados de anticuerpo-farmaco correspondientes pueden determinarse por analisis de cromatografla de llquidos de alta resolution (HPLC) o cromatografla de llquidos de resolution ultra-alta (UHPLC) para evaluar la relation de farmaco por anticuerpo (DAR) usando cromatografla de fase inversa (RP) o cromatografla de interaction hidrofoba (HIC), acoplada a detection UV-visible, de fluorescencia o por espectrometro de masas; el nivel de agregados y la pureza de los monomeros puede analizarse por HPLC o UHPLC usando cromatografla de exclusion por tamano acoplada a deteccion UV-visible, de fluorescencia o por espectrometro de masas. La concentracion de conjugado final se determina por una combination de ensayo espectroscopico (absorbancia a 280, 214 y 330 nm) y bioqulmico (ensayo con acido bicinconlnico BCA; Smith, P.K. y col. (1985) Anal. Biochem. 150 (1): 76-85; usando un anticuerpo IgG de concentracion conocida como referencia). Los conjugados de anticuerpo-farmaco se esterilizan generalmente por filtracion usando filtros de 0,2 pm bajo condiciones asepticas, y se guardan a +4 °C, -20 °C o -80 °C.
Determinacion de DAR
Se redujo el anticuerpo o ADC (aproximadamente 35 pg en 35 pl) mediante la adicion de 10 pl de tampon de borato (100 mM, pH 8,4) y 5 pl de DTT (0,5 M en agua) y se calento a 37 °C durante 15 minutos. La muestra se diluyo con 1 volumen de acetonitrilo: agua: acido formico (49 %: 49 %: 2 % v/v), y se inyecto en un Widepore 3,6 p XB-C18 150 x 2,1 mm (P/N 00F-4482-AN) a 80 °C en un sistema UPLC (Shimadzu Nexera) con un caudal de 1 ml/min equilibrado en tampon A al 75 % (agua, acido trifluoroacetico (0,1 % v/v) (TFA), 25 % de tampon B (acetonitrilo: agua: TFA 90 %: 10 %: 0,1 % v/v) El material unido se eluyo usando un gradiente de 25 % a 55 % de tampon B en 10 minutos. Los picos de absorcion de UV a 214 nm Se identificaron los siguientes picos para cada ADC o anticuerpo: cadena ligera de anticuerpo nativo (L0), cadena pesada de anticuerpo nativo (H0), y cada una de estas cadenas con agregadores de farmaco anadidos (marcados L1 para cadena ligera con un farmaco y H1, H2, H3 para la cadena pesada con 1,2 o 3 adyuvantes ligadores unidos.) El cromatograma UV a 330 nm se utilizo para la identification de fragmentos que contenlan farmacos conectores (es decir, L1, H1, H2, H3).
Se calculo una relacion molar PBD/protelna para las cadenas ligeras y las cadenas pesadas:
Farmaco %area a 214 nm para L1
--------------relacion en la cadena ligera ■-------------------------------------------------------------
Proteina % area a 214 nm para L0 y L1
Farmaco ... . . . « (% area a 214 nm para Hn)
relacion en la cadena pesada = ^ '
Proteina *rea a 214 nm Para Hn
La DAR final se calcula como:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
/ Farmaco Farmaco ^
DAR « 2 X I relacion en la cadena liaera^* -relacion en la cadena pesadal
\ Proteina ' Proteina - /
La medicion de DAR se lleva a cabo a 214 nm porque minimiza la interferencia de la absorbancia del conector de farmaco.
Generation de ADC
El anticuerpo A (que comprende un dominio variable que es la SEQ ID NO 1 emparejada con la SEQ ID NO: 2) se conjugo con el conector de farmaco A en dos experimentos para dar Conj A-A1 y Conj A-A2 y se midio el DAR como 3,51 (vease el cuadro siguiente) y 2,52, respectivamente.
El anticuerpo A (que comprende un dominio variable que es la SEQ ID NO 1 emparejada con la SEQ ID NO: 2) se conjugo con el conector de farmaco B para dar Conj A-B, y se midio el DAR como 2,87.
El anticuerpo A (que comprende un dominio variable que es la SEQ ID NO 1 emparejada con la SEQ ID NO: 2) se conjugo con el conector de farmaco D para dar Conj A-D, y se midio el DAR como 2,19 (vease la tabla siguiente).
El anticuerpo A (que comprende un dominio variable que es la SEQ ID NO 1 emparejada con la SEQ ID NO: 2) se conjugo con el farmaco E en dos experimentos para dar Conj A-E1 y Conj A-E2 y se midio el DAR como 2,24 (vease el cuadro siguiente) y 2,7, respectivamente.
Her y Trastuzumab son anticuerpos anti-Her2 que comprenden un dominio VH que tiene la secuencia segun SEC ID N°. 1 y un dominio VL que tiene la secuencia segun SEQ ID NO 2.
Como se ha descrito anteriormente, los ADC dirigidos a Her2 se generaron conjugando anticuerpos Her2 con el conector de farmaco A, E, D o B. Los ADC resultantes se enumeran en la tabla siguiente, junto con el DAR medido.
ADC
DAR Concentracion [mg/ml] Rendimiento [ %]
Her2-A
3,51 1,05 73
Her2-E
2,24 1,02 71
Her2-D
2,19 0,67 56
Her2-B
1,58 2,2 37
Ejemplo 12: Citotoxicidad in vitro de los ADC
Cultivo de celulas
BT-474 y MDA-MB-468 procedieron de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo. El medio de cultivo celular fue RPMI 1640 suplementado con L-glutamina y FBS al 10 %. Las celulas se cultivaron a 37 °C, 5 % de CO2, en una incubadora humidificada.
Ensayo de citotoxicidad
Se determino la concentracion y viabilidad de cultivos de celulas suspendidas (hasta 1 x 106/ml) mezclando 1: 1 con azul tripan y contando celulas claras (vivas)/azules (muertas) con un hemocitometro. La suspension de celulas se diluyo hasta la densidad de siembra requerida (generalmente 105/ml) y se dispenso en placas de fondo plano de 96 pocillos. Para el ensayo de azul de Alamar, se dispensaron 100 pl/pocillo en placas de pocillo negro. Para el ensayo MTS, se dispensaron 50 pl/pocillo en placas de pocillo claro. Se preparo una solucion madre (1 ml) de ADC (20 pg/ml) por dilucion de ADC esteril en filtro en medio de cultivo celular. Se preparo un conjunto de diluciones de 8 x 10 veces de ADC de reserva en una placa de 24 pocillos mediante transferencia en serie de 100 pl sobre 900 pl de medio de cultivo celular. Cada dilucion de ADC (100 pl/pocillo para el azul Alamar, 50 pl/pocillo para MTS) se dispenso en 4 pocillos de replicacion de la placa de 96 pocillos, que contenlan suspension celular. Los pocillos de control recibieron el mismo volumen de medio de cultivo solamente. Despues de la incubacion durante 4 dlas, la viabilidad celular se midio mediante ensayo de azul de Alamar o MTS.
Se dispenso AlamarBlue® (Invitrogen, numero de catalogo DAL1025) (20 pl por pocillo) en cada pocillo y se incubo durante 4 horas a 37 °C en el incubador de gas CO2. La fluorescencia del pozo se midio a la excitacion 570 nm, emision 585 nm. La supervivencia celular (%) se calculo a partir de la relacion de la fluorescencia media en los 4 pocillos tratados con aDc en comparacion con la fluorescencia media en los 4 pocillos de control (100 %).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Se dispenso MTS (Promega, numero de catalogo G5421) (20 pi por pocillo) en cada pocillo y se incubo durante 4 horas a 37 °C en la incubadora con gas de CO2. La absorbancia se midio a 490 nm. La supervivencia celular ( %) se calculo a partir de la absorbancia media en los 4 pocillos tratados con ADC en comparacion con la absorbancia media en los 4 pocillos de control (100 %). Se generaron curvas de respuesta a la dosis a partir de los datos medios de 3 experimentos repetidos y se determino la CE50 ajustando los datos a una curva dosis-respuesta sigmoidal con pendiente variable utilizando Prism (GraphPad, San Diego, CA).
Citotoxicidad in vitro
La eficacia de los ADC de los ADC Her anteriores se analizo contra celulas Her2 (+) BT-474. Como un control Her2- negativo, se utilizaron celulas MDA-MB-468.
La figura 1 muestra la eficacia in vitro de Her-A. Se incubaron diluciones en serie de 10 veces (pg/ml) de Her-A con celulas BT-474 o celulas MDA-MB-468SU-DHL-1. El ensayo Alamar Blue se realizo al final del perlodo de incubacion y se calculo la supervivencia celular. Los graficos representan el promedio de tres experimentos repetidos.
Her-A mostro una citotoxicidad significativa contra las celulas BT-474 (Figura 1].
Her-A
BT474 MDAMB468
CE50 (pg/ml)
0.02683 1.314
La figura 2 muestra la eficacia in vitro de Her-E. Se incubaron diluciones en serie de 10 veces (pg/ml) de Her-E con celulas BT-474 o celulas MDA-MB-468SU-DHL-1. El ensayo Alamar Blue se realizo al final del perlodo de incubacion y se calculo la supervivencia celular. Los graficos representan el promedio de tres experimentos repetidos.
Her-E mostro una citotoxicidad significativa contra las celulas BT-474 (Figura 2).
Her-E
BT474 MDAMB468
EC50 (pg/mL)
0.06933 0.9941
La figura 3 muestra la eficacia in vitro de Her-D. Se incubaron diluciones en serie de 10 veces (pg/ml) de Her-D con celulas BT-474 o celulas MDA-MB-468SU-DHL-1. El ensayo con Alamar Blue se realizo al final del perlodo de incubacion y se calculo la supervivencia celular. Los graficos representan el promedio de tres experimentos repetidos.
Her-D mostro citotoxicidad frente a las celulas BT-474 (Figura 3).
Her-D
BT474 MDAMB468
CE50 (pg/ml)
0.4302 0.6109
La figura 4 muestra la eficacia in vitro de Her-B. Se incubaron diluciones en serie de 10 veces (pg/ml) de Her-B con celulas BT-474 o celulas MDA-MB-468SU-DHL-1. El ensayo CON Alamar Blue se realizo al final del perlodo de incubacion y se calculo la supervivencia celular. Los graficos representan el promedio de tres experimentos repetidos.
Her-B mostro citotoxicidad frente a las celulas BT-474 (Figura 4).
Her-B
BT474 MDAMB468
CE50 (pg/ml)
0.2234 1.065
Ejemplo 13 Actividad antitumoral in vivo de ADC
de farmaco D, o B y se antitumoral
potencial observada con Trastuzumab solo, el anticuerpo sin PBD se analizo en el mismo ensayo.
Diseno del estudio
La llnea celular derivada de cancer de mama Her2 + (ve) BT-474 se uso para determinar el conector PBD mas potente para Her2 in vivo. El anticuerpo se conjugo con ligandos de cabeza de guerra A, E, ensayo en el modelo de xenoinjerto BT-474. Al mismo tiempo, para investigar cualquier actividad
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Medicamentos y tratamiento:
N.° de grupo
Animales por grupo ADC Nivel de dosis (mg/kg) Volumen de dosis (ml/kg)
1
10 [solo vehlculo] -
2
10 Trastuzumab [sin PBD] 1,0 10
3
10 Her-A 0,3 10
4
10 Her-A 1,0 10
5
10 Her-E 0,3 10
6
10 Her-E 1,0 10
7
10 Her-D 0,3 10
8
10 Her-D 1,0 10
9
10 Her-B 1,0 10
10
10
Her-B 1,0
10
Procedimientos:
• Establecer ratones CR hembra NCr nu/nu, de 8 anos de edad con celulas tumorales I xl BT474-SPN en 0 % Matrigel s.c. en el flanco.
• El volumen de inyeccion celular es de 0,1 ml/raton.
• Edad en la fecha de Inicio: 8 a 12 semanas,
• Realizar un apareamiento a cuando los tumores alcancen un tamano promedio de 100-150 mm3, y comience el tratamiento.
• Peso corporal: cada dla x 5, despues dos veces a la semana hasta el final
• Medicion de la pinza: dos veces a la semana hasta el final
• Informar inmediatamente cualquier reaccion adversa o muerte.
• Se sacrificara a cualquier animal individual con una sola observacion de> 30 % de perdida de peso corporal o tres medidas consecutivas de> 25 % de perdida de peso corporal.
• Cualquier grupo con dos mediciones de la perdida media de peso corporal de> 20 % o> 10 % de mortalidad detendra la dosificacion. No se sacrifica al grupo y se permite la recuperacion. En un grupo con> 20 % de perdida de peso, los individuos que alcancen el criterio de perdida de peso corporal individual seran sacrificados. Si la perdida de peso corporal relacionada con el grupo de tratamiento se recupera dentro de un 10 % de los pesos originales, la dosificacion puede reanudarse a una dosis mas baja o un programa de dosificacion menos frecuente. Las excepciones al porcentaje de recuperacion de peso corporal sin tratamiento pueden permitirse caso por caso.
• El criterio TGD. Los animales seran monitorizados individualmente. El criterio de valoracion del experimento es un volumen tumoral de 2000 mm3 o 60 dlas, sea cual sea el que aparezca primero. Los que responden pueden ser seguidos mas tiempo. .Cuando se alcanza el criterio de valoracion, se sacrificara a los animales.
Enfoque metodologico general
Para el calculo del volumen tumoral medio del grupo se aplico la siguiente regla: cuando un animal salio del estudio debido al tamano del tumor, se incluyo el volumen tumoral final registrado para el animal con los datos utilizados para calcular el volumen medio en puntos de tiempo posteriores. Las barras de error indican el error estandar de la media (SEM). No se usaron valores de volumenes de tumores para calcular los volumenes de tumores medios de grupo cuando menos del 50 % de los animales en un grupo permanecieron en el estudio. Prism (GraphPad, San Diego, CA) se utilizo para presentaciones graficas y analisis estadlsticos.
Resultados
La Figura 5 muestra la seleccion del conector de farmaco para los ADC de Her en el modelo de xenoinjerto BT-474. Los ratones se dosificaron cuando el volumen medio del tumor por grupo experimental alcanzo 0,1 cm3 y se trataron con una sola dosis de los ADC a 0,3 y 1 mg/kg (para union de aDc) via IV en la vena de la cola. Los datos representan el volumen tumoral medio (+/-SEM) de diez ratones en cada grupo.
Her-A y Her-B exhibieron la actividad antitumoral mas potente (Figura 5); Her-E y Her-D mostraron una actividad antitumoral fuerte, pero menos marcada. El trastuzumab sin PBD no mostro actividad antitumoral significativa en este ensayo.
Abreviaturas
Ac Acm Alloc Boc t-Bu Bzl Cbz o Z DMF Dnp DTT Fmoc imp MC-OSu Moc MP Mtr PAB PEG PNZ Psec TBDMS TBDPS Teoc Tos Troc Trt Xan
acetilo acetamidometilo aliloxicarbonilo dicarbonato de di-ferc-butilo terc-butilo bencilo, en el que Bzl-OMe es metoxibencilo y Bzl-Me es metilbenceno benciloxi-carbonilo, en el que Z-Cl y Z-Br son cloro-y bromobenciloxicarbonilo, respectivamente N,N-dimetilformamida dinitrofenilo ditiotreitol 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo grupo protector de imina N-10: 3-(2-metoxietoxi)propanoato-Val-Ala-PAB maleimidocaproil-O-N-succinimida metoxicarbonilo maleimidopropanamida 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo para-aminobenciloxicarbonilo etilenoxi carbamato de p-nitrobencilo 2-(fenilsulfonil)etoxicarbonilo terc-butildimetilsililo terc-butildifenilsililo 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo tosilo cloruro de 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo tritilo xantilo

Claims (14)

1. Un conjugado de formula ConjA:
imagen1
ConjB:
imagen2
10
ConjC:
imagen3
15 ConjD:
imagen4
o ConjE:
5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
imagen5
en las que Ab es un anticuerpo que se une a HER2, comprendiendo el anticuerpo un dominio VH que tiene la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 1; y
en donde la carga de farmaco (p) de farmacos (D) al anticuerpo (Ab) es un numero entero de 1 a aproximadamente 8.
2. El conjugado segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende un dominio VH emparejado con un dominio Vl, teniendo los dominios VH y VL las secuencias de SEQ ID NO. 1 emparejadas con la SEQ ID NO. 2.
3. El conjugado segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo intacto.
4. El conjugado segun la reivindicacion 3, en el que el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 3 emparejada con una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO.4.
5. El conjugado segun la reivindicacion 4, en el que el anticuerpo comprende dos cadenas pesadas que tienen la secuencia de SEQ ID NO. 3, cada una emparejada con una cadena ligera que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 4
6. El conjugado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo esta humanizado, desinmunizado o con la superficie acondicionada.
7. El conjugado segun la reivindicacion 1, en el que p es 1, 2, 3 o 4.
8. El conjugado segun la reivindicacion 1, que comprende una mezcla de los compuestos de conjugado anticuerpo- farmaco, en donde la carga promedio de farmaco por anticuerpo en la mezcla de los compuestos de conjugado anticuerpo-farmaco es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5.
9. El conjugado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en terapia.
10. El conjugado segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de una enfermedad proliferativa en un sujeto.
11. El conjugado segun la reivindicacion 10, en donde la enfermedad es cancer.
12. El conjugado segun la reivindicacion 11, en el que el cancer se selecciona del grupo que consiste en: cancer de mama, cancer gastrico, cancer de vejiga, cancer de pancreas, cancer colorrectal, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de endometrio, cancer de cabeza y cuello y carcinoma de glandulas salivales.
13. Una composicion farmaceutica que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un diluyente, un vehlculo o un excipiente farmaceuticamente aceptables.
14. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 13, que comprende ademas una cantidad terapeuticamente eficaz de un agente quimioterapeutico.
ES13788691.7T 2012-10-12 2013-10-11 Conjugados de anticuerpos anti-her2-Pirrolobenzodiazepinas Active ES2640449T3 (es)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261712928P 2012-10-12 2012-10-12
US201261712924P 2012-10-12 2012-10-12
US201261712924P 2012-10-12
US201261712928P 2012-10-12
US201361784249P 2013-03-14 2013-03-14
US201361784270P 2013-03-14 2013-03-14
US201361784233P 2013-03-14 2013-03-14
US201361784270P 2013-03-14
US201361784233P 2013-03-14
US201361784249P 2013-03-14
PCT/EP2013/071343 WO2014057115A1 (en) 2012-10-12 2013-10-11 Pyrrolobenzodiazepine-anti-her2 antibody conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2640449T3 true ES2640449T3 (es) 2017-11-03

Family

ID=49552324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13788691.7T Active ES2640449T3 (es) 2012-10-12 2013-10-11 Conjugados de anticuerpos anti-her2-Pirrolobenzodiazepinas

Country Status (21)

Country Link
US (1) US20150273077A1 (es)
EP (1) EP2906252B1 (es)
JP (1) JP2016502504A (es)
KR (1) KR20150083856A (es)
CN (1) CN104955485B (es)
AU (1) AU2013328621B2 (es)
BR (1) BR112015008177A2 (es)
CA (1) CA2887896A1 (es)
CY (1) CY1119287T1 (es)
DK (1) DK2906252T3 (es)
ES (1) ES2640449T3 (es)
HR (1) HRP20171264T1 (es)
HU (1) HUE034505T2 (es)
LT (1) LT2906252T (es)
MX (1) MX2015004423A (es)
PL (1) PL2906252T3 (es)
PT (1) PT2906252T (es)
RS (1) RS56222B1 (es)
SI (1) SI2906252T1 (es)
WO (1) WO2014057115A1 (es)
ZA (1) ZA201502267B (es)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0819095D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
JP5870400B2 (ja) 2010-04-15 2016-03-01 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 標的化ピロロベンゾジアゼピンコンジュゲート
EP2558475A1 (en) 2010-04-15 2013-02-20 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines used to treat proliferative diseases
AU2012311505B2 (en) 2011-09-20 2016-09-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines as unsymmetrical dimeric PBD compounds for inclusion in targeted conjugates
WO2013055990A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Seattle Genetics, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and targeted conjugates
CN110183470A (zh) 2011-10-14 2019-08-30 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓
KR101891859B1 (ko) 2011-10-14 2018-08-24 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀
CN103997893B (zh) 2011-10-14 2019-04-12 西雅图基因公司 吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物
CA3060520C (en) 2012-10-12 2022-05-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP2906249B1 (en) 2012-10-12 2018-06-27 MedImmune Limited Synthesis and intermediates of pyrrolobenzodiazepine derivatives for conjugation
ME03486B (me) 2012-10-12 2020-01-20 Medimmune Ltd Pirolobenzodiazepini i njihovi konjugati
EA031585B1 (ru) 2012-12-21 2019-01-31 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины и их конъюгаты
US9567340B2 (en) 2012-12-21 2017-02-14 Medimmune Limited Unsymmetrical pyrrolobenzodiazepines-dimers for use in the treatment of proliferative and autoimmune diseases
CA2904044C (en) 2013-03-13 2020-03-31 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
AR096287A1 (es) 2013-03-13 2015-12-23 Spirogen Sàrl Pirrolobenzodiacepinas y conjugados
WO2015052534A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201317981D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
MX2017003126A (es) 2014-09-12 2017-08-28 Genentech Inc Anticuerpos anti-her2 e inmunoconjugados.
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN107124870A (zh) * 2014-09-17 2017-09-01 基因泰克公司 包含抗her2抗体和吡咯并苯并二氮杂*的免疫缀合物
CA2968447A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates and their use to treat neoplasms
US9504694B2 (en) 2015-03-19 2016-11-29 Cellerant Therapeutics, Inc. Isoquinolidinobenzodiazepines
GB201506389D0 (en) * 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506394D0 (en) * 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
CA2949032A1 (en) 2015-11-30 2017-05-30 Pfizer Inc. Site specific her2 antibody drug conjugates
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CN106248971B (zh) * 2016-08-19 2017-10-03 合肥瀚科迈博生物技术有限公司 用于检测人血清中her2含量的elisa试剂盒、使用方法及用途
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201619490D0 (en) * 2016-11-17 2017-01-04 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
KR20200032243A (ko) 2017-02-08 2020-03-25 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 피롤로벤조디아제핀-항체 컨주게이트
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
HUE056289T2 (hu) 2017-02-08 2022-02-28 Adc Therapeutics Sa Pirrolobenzodiazepin-antitest konjugátumok
PT3612537T (pt) 2017-04-18 2022-08-29 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
BR112019021680A2 (pt) 2017-04-20 2020-05-12 Adc Therapeutics Sa Terapia de combinação com conjugado anticorpo-fármaco anti-cd25??
EP3612234B1 (en) 2017-04-20 2024-03-13 ADC Therapeutics SA Combination therapy with an anti-axl antibody-drug conjugate
CA3064681A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-cd25 adc
DK3668874T3 (da) 2017-08-18 2022-02-14 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepin-konjugater
CN117003875A (zh) 2017-09-29 2023-11-07 第一三共株式会社 抗体或其功能性片段、多核苷酸、表达载体、宿主细胞、糖链重构抗体、药物组合物、应用
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
US11141490B2 (en) * 2018-07-13 2021-10-12 Research Foundation Of The City University Of New York Antibody-drug conjugates based on gold compounds
TW202102225A (zh) * 2019-03-25 2021-01-16 日商第一三共股份有限公司 抗her2抗體-吡咯并苯二氮呯衍生物結合物
GB201908128D0 (en) 2019-06-07 2019-07-24 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP4013494A1 (en) 2019-08-12 2022-06-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Macrophage stimulating 1 receptor (mst1r) variants and uses thereof
GB202011993D0 (en) 2020-07-31 2020-09-16 Adc Therapeutics Sa ANTI-IL 13Ra2 antibodies

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005085251A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-15 Spirogen Limited 11-hydroxy-5h-pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-one derivatives as key intermediates for the preparation of c2 substituted pyrrolobenzodiazepines
GB0508084D0 (en) * 2005-04-21 2005-06-01 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
US20080112961A1 (en) * 2006-10-09 2008-05-15 Macrogenics, Inc. Identification and Engineering of Antibodies with Variant Fc Regions and Methods of Using Same
GB0819095D0 (en) * 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
AU2010265934B2 (en) * 2009-06-26 2015-04-23 Five Prime Therapeutics, Inc. Therapeutic antibody target validation and screening in vivo
EP2558475A1 (en) * 2010-04-15 2013-02-20 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines used to treat proliferative diseases
US20130028917A1 (en) * 2010-04-15 2013-01-31 Spirogen Developments Sàrl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
JP5870400B2 (ja) * 2010-04-15 2016-03-01 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 標的化ピロロベンゾジアゼピンコンジュゲート
US9586996B2 (en) * 2010-04-30 2017-03-07 Esperance Pharmaceuticals, Inc. Lytic-peptide-Her2/neu (human epidermal growth factor receptor 2) ligand conjugates and methods of use
EP3610889A1 (en) * 2011-05-08 2020-02-19 LegoChem Biosciences, Inc. Protein-active agent conjugates and method for preparing the same
AU2012322607B2 (en) * 2011-10-14 2017-02-16 Genentech, Inc. Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2013177481A1 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 Immunogen, Inc. Benzodiazepines and conjugates thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014057115A1 (en) 2014-04-17
MX2015004423A (es) 2015-10-29
KR20150083856A (ko) 2015-07-20
AU2013328621A1 (en) 2015-04-23
SI2906252T1 (sl) 2017-10-30
DK2906252T3 (en) 2017-09-11
RS56222B1 (sr) 2017-11-30
ZA201502267B (en) 2017-09-27
EP2906252B1 (en) 2017-06-14
US20150273077A1 (en) 2015-10-01
CA2887896A1 (en) 2014-04-17
BR112015008177A2 (pt) 2017-09-19
EP2906252A1 (en) 2015-08-19
HRP20171264T1 (hr) 2017-10-20
PT2906252T (pt) 2017-09-19
CN104955485A (zh) 2015-09-30
LT2906252T (lt) 2017-09-11
JP2016502504A (ja) 2016-01-28
PL2906252T3 (pl) 2017-11-30
AU2013328621B2 (en) 2016-12-01
CN104955485B (zh) 2018-01-30
HUE034505T2 (en) 2018-02-28
CY1119287T1 (el) 2018-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2640449T3 (es) Conjugados de anticuerpos anti-her2-Pirrolobenzodiazepinas
ES2690067T3 (es) Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-Pirrolobenzodiazepinas
ES2680153T3 (es) Conjugados de anticuerpos anti-PSMA-pirrolobenzodiazepinas
ES2660029T3 (es) Conjugados de anticuerpo-pirrolobenzodiazepinas
ES2670937T3 (es) Conjugados de anticuerpo-pirrolobenzodiazepina
ES2703151T3 (es) Conjugados de anticuerpos de pirrolobenzodiazepinas
US9956299B2 (en) Pyrrolobenzodiazepine—antibody conjugates
EP2906251B1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd22 antibody conjugates
US9950078B2 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US10010624B2 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
ES2713164T3 (es) Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
ES2738310T3 (es) Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas
US20160256561A1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates