CN102933236A - 吡咯并苯二氮卓类及其结合物 - Google Patents

吡咯并苯二氮卓类及其结合物 Download PDF

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Abstract

公开了用于制备作为经N10位置连接的PBD分子的结合物的结合物和化合物，以及该结合物用于治疗包括癌症的增殖性疾病的应用。

Description

吡咯并苯二氮卓类及其结合物
技术领域
本发明涉及吡咯并苯二氮
Figure BDA00002257755900011
（卓）类（pyrrolobenzodiazepines，PBD），尤其是具有以对于细胞结合剂的接头形式的不稳定N10保护基团的吡咯并苯二氮
Figure BDA00002257755900012
类。
背景技术
吡咯并苯二氮
Figure BDA00002257755900013
类
一些吡咯并苯二氮卓（
Figure BDA00002257755900014
)类（PBD，或吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA00002257755900015
类）具有识别并结合DNA特异序列的能力；优选序列为PuGPu。最早的PBD，抗肿瘤抗生素安曲霉素，于1965年被发现（Leimgruber,et al.,J.Am.Chem.Soc.,87,5793-5795(1965)；Leimgruber,et al.,J.Am.Chem.Soc.,87,5791-5793 (1965)）。从那时起，已报道了大量的天然存在的PBD，并且对于各种类似物开发了10种以上的合成路线（Thurston,et al.,Chem.Rev.1994,433-465(1994)）。家族成员包括赤霉素（Hochlowski,et al.,J.Antibiotics,40,145-148(1987)）、芝加霉素（Konishi,et al.,J.Antibiotics,37,200-206(1984)）、DC-81（日本专利58-180 487；Thurston,et al.,Chem.Brit.,26,767-772(1990)；Bose,et al.,Tetrahedron,48,751-758(1992)）、甲基氨茴霉素（mazethramycin）（Kuminoto,et al.,J.Antibiotics,33,665-667(1980)）、新茴霉素A和B（Takeuchi,et al.,J.Antibiotics,29,93-96(1976)）、porothramycin（Tsunakawa,et al.,J.Antibiotics,41,1366-1373(1988)）、prothracarcin（Shimizu,et al,J.Antibiotics,29,2492-2503(1982)；Langleyand Thurston,J.Org.Chem.,52,91-97(1987)）、西班米星（sibanomicin）（DC-102）（Hara,et al.,J.Antibiotics,41,702-704(1988)；Itoh,et al.,J.Antibiotics,41,1281-1284 (1988)）、西伯里亚霉素（sibiromycin）（Leber,et al.,J.Am.Chem.Soc.,110,2992-2993(1988)）、以及托马霉素（Arima,etal.,J.Antibiotics,25,437-444(1972)）。PBD为以下通用结构：
它们在它们的芳香A环和吡咯并C环中的取代基的数量、类型以及位置，以及C环的饱和度上存在差别。在B-环中，在负责烷基化DNA的亲电中心的N10-C11位置具有亚胺（N=C）、甲醇胺（NH-CH(OH)）或甲醇胺甲基醚（carbinolamine methyl ether）（NH-CH(OMe)）。所有已知的天然产物在手性C11具有(S)-构型，该位置使它们拥有从C环向A环看时的向右旋转的弯曲（right-handed twist）。这给予它们用于与B型DNA的小沟形成螺旋（isohelicity）的适当三维形状，带来在结合部位的紧密吻合（Kohn,In Antibiotics III.Springer-Verlag,New York,pp.3-11(1975)；Hurley and Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986)）。它们在小沟中形成加合物的能力，使它们能够干扰DNA加工，因此将它们作为抗肿瘤药使用。
本发明的发明人先前已经在WO.2005/085251公开含有C2芳基取代基的二聚的PBD化合物，如：
Figure BDA00002257755900021
已经证明这些化合物是高度有用的细胞毒素剂。
一个尤其有利的吡咯并苯二氮
Figure BDA00002257755900022
化合物由Gregson等人描述作为化合物1（Chem.Commun.1999,797-798）和由Gregson等人描述作为化合物4a（J.Med.Chem.2001,44,1161-1174）。该化合物也称为SJG-136，显示如下：
本发明的发明人先前已经公开PBD化合物可以通过用在体内可去除的氮保护基团在N10位置保护它们而作为前药（WO 00/12507）。许多的这些保护基团为氨基甲酸酯类，且为，例如，以下结构：
Figure BDA00002257755900024
其中，星号（*）表示与PBD的N10原子的连接点。
本发明的发明人也描述了在N10位置具有氮氨基甲酸酯保护基团的PBD化合物的制备（WO 2005/023814）。保护基团可从PBD部分的N10位置去除，以留下N10-C11亚胺键。描述了一系列的保护基团，包括可以在酶作用下断裂开的基团。
WO.2007/085930描述了具有用于与细胞结合剂连接的接头，如抗体的二聚体PBD化合物的制备。该接头存在于连接二聚体的单体PBD单元的桥中。
抗体药物结合物
已经建立了抗体疗法用于靶向治疗患有癌症、免疫和血管生成紊乱的患者（Carter,P.(2006)Nature Reviews Immunology 6:343-357）。抗体药物结合物（ADC），即免疫结合物，用于细胞毒剂或细胞抑制剂，即在治疗癌症中以杀死或抑制肿瘤细胞的药物的局部递送的应用，将药物部分靶向递送至肿瘤并在其中进行细胞内积累，然而这些非结合的药物的系统给予可能导致对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞不能接受的水平的毒性（Xie et al(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281-291；Kovtun et al(2006)Cancer Res.66(6):3214-3121；Law et al(2006)Cancer Res.66(4):2328-2337；Wu et al(2005)Nature Biotech.23(9):1137-1145;Lambert J.(2005)CurrentOpin.in Pharmacol.5:543-549;Hamann P.(2005)Expert Opin.Ther.Patents15(9):1087-1103；Payne,G.2003)Cancer Cell 3:207-212;Trail et al(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Syrigos and Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614）。
由此寻找具有最小毒性的最大效能。设计和改进ADC的努力已经集中于单克隆抗体类（mAbs）的选择性以及药物作用机制、药物连接、药物/抗体比率（负载）和药物释放性质（Junutula,et al.,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan et al(2009)Blood 114(13):2721-2729;US 7521541；US 7723485;WO2009/052249;McDonagh(2006)Protein Eng.Design & Sel.19(7):299-307;Doronina et al(2006)Bioconnj.Chem.17:114-124；Erickson etal(2006)Cancer Res.66(8):1-8;Sanderson et al(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852；Jeffrey et al(2005)J.Med.Chem.48:1344-1358；Hamblett et al(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070）。药物部分可通过包括微管蛋白结合、DNA结合，或拓扑异构酶抑制的机制给予它们的细胞毒素的和抑制细胞的作用。一些细胞毒药物在连接至大的抗体或蛋白受体配体时往往是无活性的或活性较低。
本发明的发明人已经开发以形成与细胞结合剂的PBD结合物，且尤其是PBD抗体结合物的新方法。
发明内容
在总的方面，本发明提供包括经由接头通过N10位置与细胞结合剂连接的PBD化合物的结合物。该接头是不稳定的接头，并且可以为酶不稳定接头。细胞结合剂优选为抗体。
在一个实施方式中，结合物包括与间隔区连接的细胞结合剂，该间隔区连接到触发器（trigger），该触发器连接到自脱落接头（self-immolativelinker），而该自脱落接头与PBD化合物的N10位置连接。
在第一方面中，本发明提供式（A）的新型结合物化合物：
Figure BDA00002257755900041
以及其盐和溶剂合物，其中：
虚线表示在C1和C2之间或在C2和C3之间的双键可选存在；
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且可选地进一步选自卤素或二卤素；
其中，RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤素；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R10是连接到细胞结合剂的接头；
Q独立地选自O、S和NH；
R11是H或R或，其中Q是O、SO3M，其中M是金属阳离子；
R和R’各自独立地选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基，并可选地与NRR’相关，R和R’与它们所连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环；
或从R6到R9的任何一对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，
或该化合物为每个单体是式（A）的二聚体或一个单体是式（A）而另一个单体是式（B）的二聚体：
Figure BDA00002257755900051
其中，R2、R6、R9、R7、和R8根据式（A）化合物来定义，且每个单体的R7基团或R8基团一起形成具有连接这两个单体的式-X-R″-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被以下中断：一个或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）；
以及每一X是O、S或N(H)；
或该化合物为每个单体是式（A）的二聚体，每个单体中的R10为封端基团，RC，或是连接到细胞结合剂的接头。为避免疑义，该细胞结合剂是基团R10的一部分。
本发明还有关于结合物以及其盐和溶剂合物用于在靶位置提供式（C）的化合物的应用：
Figure BDA00002257755900052
其中：
虚线表示C1和C2或C2和C3之间的双键可选存在；
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且可选地进一步选自卤素或二卤素；
其中，RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤素；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R和R’各自独立地选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基，并可选地与NRR’相关，R和R’与它们所连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环；
或从R6到R9的任何对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，
或该化合物为每个单体为式（C）的二聚体，且每个单体的R7基团或R8基团一起形成连接这两个单体的具有式-X-R”-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被以下中断：一个或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）；
以及每一X是O、S或N(H)。
本发明还有关于结合物以及其盐和溶剂合物用于在靶位置提供式（D）的化合物的应用：
Figure BDA00002257755900061
其中：
虚线表示在C1和C2之间或在C2和C3之间的双键可选存在；
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且可选地进一步选自卤素或二卤素；
其中，RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤素；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
Q独立地选自O、S和NH；
R11是H或R或，其中Q是O、SO3M，其中M是金属阳离子；
R和R’各自独立地选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基，并可选地与NRR’相关，R和R’与它们所连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环；
或从R6到R9的任何对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，；
或该化合物为每个单体是式（D）或一个单体的二聚体是式（D）而另一个单体是式（C）的二聚体；
且每个单体的R7基团或R8基团一起形成具有连接这两个单体的式-X-R”-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被一种或多种杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）中断；
以及每一X是O、S或N(H)；
其中，式（C）的单体单位如在上面所定义的。
本发明还提供用于制备本发明的结合物化合物的式（E）化合物：
以及其盐和溶剂合物，其中：
虚线表示C1和C2或C2和C3之间的双键可选存在；
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且可选地进一步选自卤素或二卤素；
其中，RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤素；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
RL是连接到细胞结合剂的接头；
Q独立地选自O、S和NH；
R11是H或R或，其中Q是O，R11是SO3M，其中M是金属阳离子；
R和R’各自独立地选自可选地取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基，并可选地与NRR’相关，R和R’与它们所连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环；
或从R6到R9的任何对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，；
或化合物为每个单体是式（E）的二聚体或一个单体是式（E）而另一个是式（B）的二聚体：
Figure BDA00002257755900081
其中，R2、R6、R9、R7、和R8根据式（A）化合物来定义，且每个单体的R7基团或R8基团一起形成具有连接这两个单体的式-X-R″-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被一种或多种杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）中断；
以及每一X是O、S或N(H)；
且该化合物为每个单体是式（E）的二聚体，在单体之一中的RL为封端基团（帽化基团）、RC，或是用于与细胞结合剂连接的接头。
选择性地在一个实施方式中，R”是C3-12亚烃基，其链可被一种或多种杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）中断。
选择性地，新型结合物化合物（conjugate compounds）可选自如上所描述的式（A）化合物和（A-I），
其中（A-I）选自（A-A）和（A-B）：
Figure BDA00002257755900091
以及其盐和溶剂合物，其中：
R6、R9、R10、Q、R11根据式（A）化合物来定义；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
或从R6到R9的任何一对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，
R2与R1或R3，与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环；
V和W各自选自(CH2)n、O、S、NR、CHR和CRR’，其中n为1、2或3，除了在R1和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选地取代的苯环时V为C，且在R3和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环时，W为C；
T选自CH2、NR、CO、BH、SO和SO2；
U选自CH2、NR、O和S；
Y为(CH2)n，其中，n是1、2、3或4；
除了T、U和Y不都是CH2；
或该化合物为的二聚体，其中每个单体是式（A）、每个单体是式（A-I）、一个单体是式（A）而另一个如上所描述的式（B）或（B-I)，或一个单体是式（A-I）而另一个单体是式（B）或（B-I)，
且（B-I）选自（B-A）和（B-B）：
Figure BDA00002257755900101
其中，R1、R2、R3、R6、R9、R7、和R8根据式（A-I）化合物来定义，且每个单体的R7基团或R8基团一起形成具有连接单体的式-X-R”-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被一种或多种杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）中断；
以及每个X是O、S或N(H)；
且该化合物为每个单体是式（A-I）和/或式（A）的二聚体，每个单体中的R10为封端基团（帽化基团）、RC，或是连接到细胞结合剂的接头。
为了方便起见，A的所有参考（reference，参照符号，提及）可以应用于A-I（和A-A和A-B），而B的所有参考可以应用于B-I（和B-A和B-B）。在适当的情况下，C、D和E的类似参考也是适于（C-I）、（D-I）和（E-I）。
替换地，结合物可用于在靶位置提供化合物，其中该化合物为如上所描述的式（C）化合物或（C-I），
其中（C-I）选自（C-A）和（C-B）：
Figure BDA00002257755900102
以及其盐和溶剂合物，其中：
R6、R9、R和R’根据式（C）的化合物来定义；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
或从R6到R9的任何一对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，
R2与R1或R3，与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环；
V和W各自选自(CH2)n、O、S、NR、CHR和CRR’，其中n为1、2或3，除了在R1和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环时V为C，且在R3和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环时，W为C；
T选自CH2、NR、CO、BH、SO和SO2；
U选自CH2、NR、O和S；
Y为(CH2)n，其中n是1、2、3或4；
除了T、U和Y不都是CH2；
或该化合物为其中每个单体为式（C）、每个单体是式（C-I），或一个单体是式（C）而另一个单体是式（C-I）的二聚体，且每个单体的R7基团或R8基团一起形成具有连接单体的式-X-R”-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被一个或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）间断；
以及每一X是O、S或N(H)。
本发明还有关于结合物用于在靶位置提供化合物的应用，其中该化合物为如上所描述的式（D）化合物或式（D-I）；
其中（D-I）选自（D-A）和（D-B）：
Figure BDA00002257755900111
以及其盐和溶剂合物，其中：
R6、R9、R和R’根据式（D）的化合物来定义；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
或从R6到R9的任何一对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，
Q独立地选自O、S和NH；
R11是H或R或，其中Q是O、SO3M，其中M是金属阳离子；
R2与R1或R3，与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环；
V和W各自选自(CH2)n、O、S、NR、CHR和CRR’，其中n为1、2或3，除了在R1和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环时V为C，且在R3和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环时，W为C；
T选自CH2、NR、CO、BH、SO和SO2；
U选自CH2、NR、O和S；
Y是(CH2)n，其中，n是1、2、3或4；
除了T、U和Y不都是CH2；
或该化合物为其中每个单体为式（D）、每个单体是式（D-I），或一个单体是式（D）而另一个是式（D-I）的二聚体，且每个单体的R7基团或R8基团一起形成具有连接单体的式-X-R”-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被一个或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）间断；
以及每一X是O、S或N(H)。
替换地，本发明还提供用于制备本发明的结合物化合物的如上所描述的式（E）化合物和（E-I）；
其中（E-I）选自（E-A）和（E-B）：
Figure BDA00002257755900121
以及其盐和溶剂合物，其中：
R6、R9、R和R’根据式（D）的化合物来定义；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
或从R6到R9的任何一对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，
RL是连接到细胞结合剂的接头；
Q独立地选自O、S和NH；
R11是H或R或，其中Q是O、SO3M，其中M是金属阳离子；
R2与R1或R3，与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环；
V和W各自选自(CH2)n、O、S、NR、CHR和CRR’，其中n为1、2或3，除了在R1和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环时V为C，且在R3和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环时，W为C；；
T选自CH2、NR、CO、BH、SO和SO2；
U选自CH2、NR、O和S；
Y是(CH2)n，其中，n是1、2、3或4；
除了T、U和Y不都是CH2；
或该化合物为每个单体是式（E）、每个单体是式（E-I），或一个单体是式（E）或（E-I）而另一个单体是式（E），（E-1），（B）或（B-1）的二聚体；
且每个单体的R7基团或R8基团一起形成具有连接单体的式-X-R”-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被一种或多种杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）间断；
以及每一X是O、S或N(H)。
附图说明
图1示出本发明的特别的实施方式；
图2至6示出对本发明的具体实施方式的生物测试的结果。
具体实施方式
本发明提供包括经由接头通过N10位置与细胞结合剂连接的PBD化合物的结合物。在一个实施方式中，结合物包括与间隔区连接基团的细胞结合剂，该间隔区连接到触发器，该触发器连接到自脱落接头（self-immolative linker），而该自脱落接头与PBD化合物的N10位置连接。这样的结合物图解说明如下：
如本文中所描述的，其中CBA是细胞结合剂，而PBD是吡咯并苯二氮(杂)
Figure BDA00002257755900142
化合物。图解显示在本发明的某些实施方式中与R10、A、L1以及L2对应的部分。
在本发明适于向患者的优选的部位提供PBD化合物。在优选的实施方式中，结合物允许不保留接头的任何部分来释放活性PBD化合物。没有能够影响PBD化合物的反应性的残端（stub）存在。
在某些实施方式中，本发明提供包括具有连接到细胞结合剂的接头的PBD二聚体基团的结合物。本发明的发明人在本文中描述使这样的二聚体结合物能够利用新PBD去对称技术而制备的合成方法。
优先选择
下列的优先选择可适用于如上所描述的本发明的所有方面，或可能与单一方面有关。优先选择可以以任何组合组合在一起。
双键
在一个实施方式中，在C1和C2之间，以及在C2和C3之间没有双键存在。
在一个实施方式中，虚线表示在C2和C3之间的双键可选存在，如下所示：
在一个实施方式中，在R2是C5-20芳基或C1-12烷基时，C2和C3之间存在双键。
在一个实施方式中，虚线表示在C1和C2之间的双键可选存在，如下所示：
Figure BDA00002257755900151
在一个实施方式中，在R2是C5-20芳基或C1-12烷基时，C1和C2之间存在双键。
R2
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且可选地进一步选自卤素或二卤素。
在一个实施方式中，R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR。
在一个实施方式中，R2独立地选自H、=O、=CH2、R、=CH-RD和=C(RD)2。
在一个实施方式中，R2独立地是H。
在一个实施方式中，R2独立地是=O。
在一个实施方式中，R2独立地是=CH2。
在一个实施方式中，R2独立地是=CH-RD。在PBD化合物内，基团=CH-RD可具有显示在下的任一种构型：
在一个实施方式中，该构型是构型（I）。
在一个实施方式中，R2独立地是=C(RD)2。
在一个实施方式中，R2独立地是=CF2。
在一个实施方式中，R2独立地是R。
在一个实施方式中，R2独立地是可选取代的C5-20芳基。
在一个实施方式中，R2独立地是可选取代的C1-12烷基。
在一个实施方式中，R2独立地是可选取代的C5-20芳基。
在一个实施方式中，R2独立地是可选取代的C5-7芳基。
在一个实施方式中，R2独立地是可选取代的C8-10芳基。
在一个实施方式中，R2独立地是可选取代的苯基。
在一个实施方式中，R2独立地是可选取代的萘基。
在一个实施方式中，R2独立地是可选取代的吡啶基。
在一个实施方式中，R2独立地是可选取代的喹啉基或异喹啉基。
在一个实施方式中，R2含有一到三个取代基，以1和2个是更优选的，单个取代基是最优选的。取代基可以在任何位置。
其中，R2是C5-7芳基，单个取代基优选在与化合物的其余部分的键不相邻的环原子上，即它优选对于化合物的其余部分的键的β或γ。因此，其中，C5-7芳基是苯基，取代基优选在间位或对位，且更优选在对位。
在一个实施方式中，R2选自：
其中，星号表示连接点。
其中，R2是C8-10芳基，例如喹啉基或异喹啉基，它可能在喹啉或异喹啉环的任何位置含有任意数量的取代基。在一些实施方式中，它含有一个、两个或三个取代基，且这些可以在近端环和远端环或两者（如果一个以上的取代基）。
在一个实施方式中，其中R2是可选地取代的，取代基选自在下列的取代基部分中给出的取代基。
其中R是可选取代的，取代基优先选自：
卤素、羟基、醚、甲酰基、酰基、羧基、酯、酸基、氨基、酰胺基（Amido）、丙烯酰胺基（Acylamido）、氨基羰基氧基（Aminocarbonyloxy）、脲基、硝基、氰基和硫醚。
在一个实施方式中，其中，R或R2是可选地取代的，取代基选自由R、OR、SR、NRR’、NO2、卤素、CO2R、COR、CONH2、CONHR，和CONRR’所组成的组。
其中，R2是C1-12烷基，可选的取代基可另外包括C3-20杂环基和C5-20芳基。
其中，R2是C3-20杂环基，可选的取代基可另外包括C1-12烷基和C5-20芳基。
其中，R2是C5-20芳基，可选的取代基可能另外包括C3-20杂环基和C1-12烷基。
应理解，术语“烷基”包括子类烯基和炔基以及环烷基。因此，在R2是可选取代的C1-12烷基时，应理解烷基可选地包含一个或多个碳－碳双键或三键，其可形成共轭体系的一部分。在一个实施方式中，可选取代的C1-12烷基包含至少一个碳－碳双键或三键，而该键与存在于C1和C2，或C2和C3之间的双键共轭。在一个实施方式中，C1-12烷基是选自饱和C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基和C3-12环烷基的基团。
如果R2上的取代基是卤素，它优选F或Cl，更优Cl。
如果R2上的取代基是醚，它可能在一些实施方式中是烷氧基，例如，C1-7烷氧基（例如甲氧基、乙氧基）或它可能在一些实施方式中是C5-7芳氧基（例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基）。
如果R2上的取代基是C1-7烷基，它可优选C1-4烷基（例如甲基、乙基、丙基、丁基）。
如果R2上的取代基是C3-7杂环基，它可能在一些实施方式中是包括杂环基的C6氮，例如吗啉代基、硫代吗啉代基、哌啶基、哌嗪基。这些基团可经由氮原子与PBD部分的其余部分结合。例如，这些基团进一步地被取代，例如，由C1-4烷基取代。
如果R2上的取代基是二-氧基-C1-3亚烷基，这优选二-氧基-亚甲基或二-氧基-亚乙基（或乙烯）。
对于R2尤其优选的取代基包括甲氧基、乙氧基、氟代、氯代、氰基、二-氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉代基和甲基-噻吩基。
尤其优选的取代的R2基团包括，但不限于4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-二氧基亚甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-氧基苯基、喹啉-3-基和喹啉-6-基、异喹啉-3-基和异喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基和萘基。
在一个实施方式中，R2是卤素或二卤代。在一个实施方式中，R2是-F或-F2，其取代基分别为以下例证的（III）和（IV）：
RD
在一个实施方式中，RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤素。
在一个实施方式中，RD独立地是R。
在一个实施方式中，RD独立地是卤素。
R6
在一个实施方式中，R6独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素。
在一个实施方式中，R6独立地选自H、OH、OR、SH、NH2、NO2和卤素。
在一个实施方式中，R6独立地选自H和卤素。
在一个实施方式中，R6独立地是H。
在一个实施方式中，R6和R7一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2。
R7
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素。
在一个实施方式中，R7独立地是OR。
在一个实施方式中，R7独立地是OR7A，其中，R7A独立地是可选取代的C1-6烷基。
在一个实施方式中，R7A独立地是可选取代的饱和C1-6烷基。
在一个实施方式中，R7A独立地是可选取代的C2-4烯基。
在一个实施方式中，R7A独立地是Me。
在一个实施方式中，R7A独立地是CH2Ph。
在一个实施方式中，R7A独立地是烯丙基。
在一个实施方式中，该化合物为二聚体，其中每个单体的R7基团一起形成连接这两个单体具有式X-R”-X的二聚体桥。
R8
在一个实施方式中，该化合物为二聚体，其中每个单体的R8基团一起形成连接这两个单体具有式X-R”-X的二聚体桥
在一个实施方式中，R8独立地是OR8A，其中R8A独立地是可选取代的C1-4烷基。
在一个实施方式中，R8A独立地是可选取代的饱和C1-6烷基，或可选取代的C2-4烯基。
在一个实施方式中，R8A独立地是Me。
在一个实施方式中，R8A独立地是CH2Ph。
在一个实施方式中，R8A独立地是烯丙基。
在一个实施方式中，R8和R7一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中，p是1或2。
在一个实施方式中，R8和R9一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中，p是1或2。
R9
R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn和卤素。
在一个实施方式中，R9独立地是H。
在一个实施方式中，R9独立地是R或OR。
R10
为了避免疑义，其中R10是与细胞结合剂连接的接头，该细胞结合剂是基团R10的一部分。
在本发明的某些实施方式中，其中结合物是包括两个单体A的二聚体，一个单体具有为与细胞结合剂连接的接头的基团R10，而另一个单体具有为与细胞结合剂连接的接头或封端基团（帽化基团）RC的基团R10。优选地，另一个单体具有为封端基团（帽化基团）RC的基团R10。因此，在该优选的实施方式中，仅有对细胞结合剂的单个连接。
在一个实施方式中，基团R10可从PBD部分的N10位置去除，以留下N10-C11亚胺键、甲醇胺、取代的甲醇胺，其中QR11是OSO3M、亚硫酸氢盐加合物、硫代甲醇胺、取代的硫代甲醇胺或取代的胺基甲胺（substituted carbinalamine），如下说明：
Figure BDA00002257755900201
N10-C11亚胺    甲醇胺    取代的甲醇胺    亚硫酸氢盐加合物
Figure BDA00002257755900202
硫代甲醇胺    取代的硫代甲醇胺    取代的胺基甲胺
其中R和M如对本发明的结合物所定义的。
在一个实施方式中，基团R10可从PBD部分的N10位置去除，以留下N10-C11亚胺键。
在一些实施方式中，本发明的结合物是包括式（A）的单体和式（B）的单体的二聚体化合物。在该实施方式中，基团R10不必从N10位置去除，因为该单体（B）在N10和C11位置具有对于生物活性的合适的官能度。
然而，优选基团R10是可去除的，由此来提供在两个单体单位中在N10和C11位置具有合适的官能度的二聚体。认为这样的官能度对于允许PBD二聚体的交联活性是必需的。
本申请尤其关注那些具有与N10位置连接的氨基甲酸酯的R10基团。
接头通过共价键将细胞结合剂（CBA），例如抗体，连接到PBD药物部分D。接头是双官能或多官能部分，其可以用于连接一个或多个药物部分（D）和抗体单位（Ab），以形成抗体药物结合物。接头（L）可在细胞外，即胞外是稳定的，或它可通过酶活性、水解或其他代谢条件裂开。抗体药物结合物（ADC）可以方便利用具有用于与药物部分和抗体结合的反应性官能度的接头来制备。半胱氨酸硫醇，或胺，例如抗体（Ab）的N-末端或氨基酸侧链（如赖氨酸），可以形成与接头或间隔区反应物（spacerreagent）、PBD药物部分（D）或药物-接头反应物（D-L）的官能团的结合。
连接PBD部分的N10位置的接头的许多官能团可用于与细胞结合剂反应。例如，可从接头-PBD药物中间体与细胞结合剂的反应中形成酯、硫酯、酰胺、硫代酰胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、尿素、硫脲、醚、硫醚或二硫键。
ADC的接头优选防止ADC分子聚集并保持ADC在水介质中并以单体状态随意地溶解。
ADC的接头优选细胞外稳定。在转运或递送入细胞之前，抗体药物结合物（ACD）优选稳定并且保持完整，即抗体保持与药物部分连接。在靶细胞外是稳定的，且可以在细胞内以一些有效比率断裂开。有效的接头将：（i）维持抗体的特异性结合的性质；（ii）允许结合物或药物部分的细胞内递送；（iii）保持稳定并完整，即不被断裂开，直到结合物已递送或转运到其靶点；（iv）保持PBD药物部分的细胞毒、杀细胞或抑制细胞的作用。可通过标准分析技术，如质谱法、HPLC和分离/分析技术LC/MS来测定ADC的稳定性。
抗体和药物部分的共价连接需要接头以具有两个反应官能团，即在一个反应官能（reactive sense）中的双效价（bivalency）。可用于连接两个或多个功能或生物活性部分，如肽、核酸、药物、毒素、抗体、半抗原以及报道基团（reporter groups）是已知的，且已描述它们所产生的结合物的方法（Hermanson,G.T.(1996)Bioconjugate Techniques;Academic Press:NewYork,p 234-242）。
在另外的实施方式中，接头可以用调节聚集、溶解度或反应性的基团取代。例如，磺酸盐/酯（sulfonate）取代基可增加反应物的水溶性，并促进接头反应物与抗体或药物部分的结合反应，或促进Ab-L与D，或D-L与Ab的结合反应，其取决于制备ADC所采用的合成路线。
在一个实施方式中，R10为以下基团：
其中星号表示与N10位置的连接点，CBA为细胞结合剂，L1是接头，A为连接L1与细胞结合剂的连接基团，L2是共价键或与-OC(=O)-一起形成自脱落接头，且L1或L2为可断裂接头。
L1优选可断裂接头，并且可以称为用于激活接头的断裂开的触发器。
所存在的L1和L2的性质可以广泛变化。这些基团是基于它们的断裂特征来选择的，其可由在结合物被递送到的位点的条件所要求。尽管还可以使用通过改变pH（例如酸或碱不稳定）、温度或在照射后（例如对光不稳）而可断裂的接头，在酶作用下断裂的这些接头是优选的。在还原或氧化条件下可断裂的接头也可以应用于本发明。
L1可包括氨基酸的连续序列。该氨基酸序列可能是用于酶断裂的靶底物，由此允许从N10位置释放R10。
在一个实施方式中，L1在酶的作用下可断裂。在一个实施方式中，该酶是酯酶或肽酶。
在一个实施方式中，L2存在并与-C(=O)O-一起形成自脱落接头。在一个实施方式中，L2是酶活性的底物，由此允许从N10位置释放R10。
在一个实施方式中，其中L1可被酶的作用断裂并且L2存在，该酶断裂L1和L2之间的键。
所存在的L1和L2可由选自以下的键连接：
-C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，以及
-NHC(=O)NH-。
与L2连接的L1的氨基可能是氨基酸的N-末端或可能是源于氨基酸侧链，例如赖氨酸侧链的氨基。
与L2连接的L1的羧基可能是氨基酸的C-末端或可能是源于氨基酸侧链，例如谷氨酸侧链的羧基。
与L2连接的L1的羟基可能是可能是源于氨基酸侧链，例如丝氨酸侧链的羟基。
术语“氨基酸侧链”包括在以下中发现的基团：（i）天然存在的氨基酸，例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；（ii）次要氨基酸类（minor amino acids），例如鸟氨酸和瓜氨酸；（iii）非天然氨基酸类、β-氨基酸、合成类似物以及天然存在的氨基酸的衍生物；（iv）所有的对映体、非对映体、富含异构体的、同位素标记的（例如2H、3H、14C、15N），受保护的形式，以及它们的外消旋混合物。
在一个实施方式中，-C(=O)O-与L2一起形成以下基团：
Figure BDA00002257755900231
其中星号表示与N10位置的连接点，波形线表示与所述接头L1的连接点，Y是-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，以及n为0至3。苯撑环（亚苯基环）用本文所描述的一个、两个或三个取代基可选地取代。在一个实施方式中，苯撑基（亚苯基环）可选用卤素、NO2、R或OR取代。
在一个实施方式中，Y是NH。
在一个实施方式中，n是0或1。优选地，n是0。
在Y是NH而n是0时，自脱落接头可以称为p-氨基苄基羰基接头（PABC）。
自脱落接头在远距离位点被激活时将允许释放受保护的化合物，沿下面所显示的线进行（用于n=0）：
Figure BDA00002257755900232
其中，L*是接头剩余部分的活化形式。这些基团具有将激活位点与受保护的化合物分开的优点。如上所描述的，苯撑基团可以可选取代。
在本文中所描述的一个实施方式中，基团L*是本文所描述的接头L1，其可包括二肽基团。
在另外的实施方式中，-C(=O)O-与L2一起形成选自以下的基团：
Figure BDA00002257755900233
其中，星号、波形线、Y和n如上面所定义的。每个苯撑环可选地用一个、两个或三个本文所描述的取代基取代。在一个实施方式中，具有Y取代基的苯撑环是可选地取代的，而没有Y取代基的苯撑环是未取代的。在一个实施方式中，具有Y取代基的苯撑环是未取代的，而没有Y取代基的苯撑环是可选取代的。
在另外的实施方式中，-C(=O)O-与L2一起形成选自以下的基团：
Figure BDA00002257755900241
其中，星号、波形线、Y和n如上面所定义的，E为O、S或NR，D是N、CH或CR，以及F是N、CH或CR。
在一个实施方式中，D是N。
在一个实施方式中，D是CH。
在一个实施方式中，E是O或S。
在一个实施方式中，F是CH。
在优选的实施方式中，该接头是组织蛋白酶不稳定接头。
在一个实施方式中，L1包括二肽。二肽可以以-NH-X1-X2-CO-呈现，其中-NH-和-CO-分别代表氨基酸基团X1和X2的N-和C-末端。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。在接头是组织蛋白酶不稳定接头时，二肽可以是组织蛋白酶-介导的断裂的作用位点。
另外，对于这些分别具有羧基或氨基侧链官能度的氨基酸基团，例如Glu和Lys，CO和NH可能代表该侧链官能度。
在一个实施方式中，在二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-，
-Phe-Cit-，
-Leu-Cit-，
-Ile-Cit-，
-Phe-Arg-，
-Trp-Cit-
其中，Cit是瓜氨酸。
优选地，在二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-，
-Val-Ala-，
-Val-Lys-，
-Ala-Lys-，
-Val-Cit-。
最优选地，在二肽-NH-X1-X2-CO-中的基团-X1-X2-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
可以使用其他二肽组合，包括由Dubowchik et al.,BioconjugateChemistry,2002,13,855-869所描述的那些，其通过参考并入本文。
在一个实施方式中，氨基酸侧链在适当情况下是衍生的。例如，可以衍生氨基酸侧链的氨基或羧基。
在一个实施方式中，侧链氨基酸（如赖氨酸）的氨基NH2是选自由NHR和NRR’所组成的组中的衍生形式。
在一个实施方式中，侧链氨基酸（如天冬氨酸）的羧基COOH是选自由COOR、CONH2、CONHR和CONRR’所组成的组中的衍生形式。
在一个实施方式中，氨基酸侧链在适当情况下是化学保护的。侧链保护基可以是有关于基团RL在下面所讨论的基团。本发明的发明人已经建立可由酶断裂的受保护的氨基酸序列。例如，已建立包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可由组织蛋白酶断裂。
用于氨基酸侧链的保护基团在本领域中是熟知的，并且在Novabiochem Catalog中描述。另外的保护基团策略在Protective Groups inOrganic Synthesis,Greene and Wuts中列出。
对于具有反应性侧链官能度的那些氨基酸，可能的侧链保护基团显示在下：
Arg：Z、Mtr、Tos；
Asn：Trt、Xan；
Asp：Bzl、t-Bu；
Cys：Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me、Trt；
Glu：Bzl、t-Bu；
Gln：Trt、Xan；
His：Boc、Dnp、Tos、Trt；
Lys：Boc、Z-Cl、Fmoc、Z、Alloc；
Ser：Bzl、TBDMS、TBDPS；
Thr：Bz；
Trp：Boc；
Tyr：Bzl、Z、Z-Br.
在一个实施方式中，选择侧链保护以垂直地向基团提供作为所存在的帽化基团或作为帽化基团（封端基团）的一部分。因此，去除侧链保护基团不会去除帽化基团，或为帽化基团的一部分的任何保护基团官能度。
在本发明的其他实施方式中，选择的氨基酸是那些没有反应性侧链官能度的。例如，这些氨基酸可选自：Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro和Val。
在一个实施方式中，二肽与自脱落接头的组合使用。该自脱落接头可以与-X2-连接。
其中，在自脱落接头存在时，-X2-直接与自脱落接头连接。优选地，基团-X2-CO-与Y连接，其中Y是NH，由此形成基团-X2-CO-NH-。
NH-X1-直接与A连接。A可包括官能度-CO-，由此形成与-X1-的酰胺连接。
在一个实施方式中，L1和L2与-OC(=O)-一起包括基团NH-X1-X2-CO-PABC-。PABC基团直接与N10位置连接。优选地，自脱落接头和二肽一起形成基团-NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-，其说明在下：
Figure BDA00002257755900261
其中，星号表示与N10位置的连接点，波形线表示与接头L1的余下部分的连接点或与A的连接点。优选地，波形线表示与A连接点。例如，如以上所描述的，Lys氨基酸的侧链可以用，例如Boc、Fmoc或Alloc来保护。
替换地，自脱落接头和二肽一起形成基团-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其图解如下：
Figure BDA00002257755900271
其中，星号和波形线如上面所定义的。
替换地，自脱落接头和二肽一起形成基团-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-，其图解如下：
Figure BDA00002257755900272
其中，星号和波形线如上面所定义的。
在本发明的一些实施方式中，可优选，如果PBD/药物部分包含无保护的亚胺键，例如如果部分B存在，则接头不包含游离的氨基（H2N-）基团。因此如果接头具有结构-A-L1-L2-，则这将优选不包含游离的氨基。在接头包含二肽例如，作为L1时，该优选尤其有关；在该实施方式中，将优选两个氨基酸中的一个不选自赖氨酸。
在没有希望受到理论限制的情况下，本发明的发明人已经发现，药物部分中的无保护的亚胺键的组合和接头中的游离氨基可以引起药物-接头部分的二聚化，其可能干扰此药物-接头部分与抗体的结合。在游离氨基作为铵离子（H3N+-）存在，如已使用强酸（例如TFA）用于去保护游离氨基的情况下会加速这些基团的交叉反应。
在一个实施方式中，A是共价键。因此，L1与细胞结合剂直接连接。例如，L1包括连续氨基酸序列，该序列的N末端可直与细胞结合剂连接。
因此，在A是共价键时，细胞结合剂与L1之间的连接可以选自：
-C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH-，
-C(=O)NHC(=O)-，
-S-，
-S-S-，
CH2C(=O)-，以及
=N-NH-。
连接到细胞结合剂的L1的氨基可以是氨基酸的N-末端或可源于氨基酸侧链，例如赖氨酸氨基酸侧链的氨基。
连接到细胞结合剂的L1的羧基可以是氨基酸的C-末端或可源于氨基酸侧链，例如谷氨酸氨基酸侧链的羧基。
与细胞结合剂连接的L1的羟基可以源于氨基酸侧链，例如丝氨酸氨基酸侧链的羟基。
与细胞结合剂连接的L1的巯基可以源于氨基酸侧链，例如丝氨酸氨基酸侧链的羟基。
以上有关L1的氨基、羧基、羟基和巯基的评论也适用于细胞结合剂。
在一个实施方式中，L2与-OC(=O)-一起表示：
Figure BDA00002257755900281
星号表示与N10位置的连接点，波形线表式与L1的连接点，n为0到3，Y是共价键或官能团，E是可活化基团，例如，通过酶作用或光，由此以产生自脱落单元。苯撑环用本文所描述的一个、两个或三个取代基可选地进一步取代。在一个实施方式中，苯撑基团用卤素、NO2、R或OR可选地进一步取代。优选地，n是0或1，最优选0。
选择E，使得该基团易于激活，例如通过光或通过酶作用。E可以为-NO2或葡萄糖醛酸。前者可对硝基还原酶的作用敏感，后者对β-糖苷酸酶的作用敏感。
在该实施方式中，自脱落接头在激活E时将允许释放受保护的化合物，其沿着在下面显示的线进行（用于n=0):
Figure BDA00002257755900291
星号表示与N10位置的连接点，E*是E的活化形式，而Y如上面所描述的。这些基团具有将激活位点与受保护化合物分开的优点。如上所描述的，苯撑基团可以可选地进一步取代。
基团Y可以是与L1的共价键。
基团Y可以为选自以下的官能团：
C(=O)-
NH-
O-
C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH，
-C(=O)NHC(=O)-，以及
-S-。
在L1是二肽时，优选Y为-NH-或-C(=O)-，由此以形成L1与Y之间的酰胺键。在该实施方式中，二肽序列不必是对于酶活性的底物。
在另外的实施方式中，A是间隔区基团。因此，L1与细胞结合剂间接连接。
L1和A可以由选自以下的键连接：
-C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，以及
-NHC(=O)NH-。
优选地，接头包含与细胞结合剂上的亲核官能团反应的亲电官能团。抗体上的亲核基团包括，但不限于：（i）N-末端胺组，（ii）侧链胺基团，例如赖氨酸，（iii）侧链巯基，例如半胱氨酸，以及（iv）在抗体糖基化时的糖羟基或氨基。胺、巯基和羟基是亲核的，并能够与接头部分上的亲电基团反应以形成共价键，且接头反应物包括：（i）马来酰亚胺基团，（ii）活化的二硫化物，（iii）活性酯，例如NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）酯、HOBt（N-羟基苯并三唑）酯、卤代甲酸酯（haloformates）和酸性卤化物（acidhalides）；（iv）烷基和苯甲基卤化物，例如卤代乙酰胺；以及（v）醛、酮、羧基，以及一些例证如下的：
Figure BDA00002257755900301
某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。将抗体用还原剂如DTT（二硫苏糖醇）处理可变得对与接头反应物的结合有反应性。理论上，每个半胱氨酸桥将因此形成两个反应性巯基亲核体。另外的亲核基团可以通过赖氨酸与2-亚氨基硫烷（Traut试剂）导致胺转变为巯基的反应而引入抗体。可以通过引入一个、二个、三个、四个，或更多个半胱氨酸残基（例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸残基的的突变抗体）而将反应性巯基引入抗体。美国7521541教授了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸的工程抗体。
在一些实施方式中，接头具有与抗体上的亲电基团反应的反应性亲核基团。抗体上可用的亲电基团包括，但不限于醛和酮羰基。接头的亲核基团的杂原子可以与抗体上的亲电基团反应，并形成与抗体单元的共价键。接头上可用的亲核基团包括，但不限于酰肼、肟、氨基、羟、肼、缩氨基硫脲、肼羰化物（hydrazine carboxylate）和芳酰肼（arylhydrazide）。抗体上的亲电基团提供与接头连接的方便位点。
在一个实施方式中，基团A是：
其中，星号表示与L1的连接点，波形线表示与细胞结合剂的连接点，而n为0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A是：
Figure BDA00002257755900312
其中，星号表示与L1的连接点，波形线表示与细胞结合剂的连接点，而n为0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团A是：
Figure BDA00002257755900313
其中，星号表示与L1的连接点，波形线表示与细胞结合剂的连接点，而n为0或1，m是0至30。在优选的实施方式中，n是1，而m是0至10、1至8，优选4至8，并且最优选4或8。在另外的实施方式中，m是10至30，并且优选20至30。替换地，m是0至50。在该实施方式中，m优选10-40，而n是1。
在一个实施方式中，基团A是：
Figure BDA00002257755900321
其中，星号表示与L1的连接点，波形线表示与细胞结合剂的连接点，而n为0或1，m是0至30。在优选的实施方式中，n是1，而m是0至10、1至8，优选4至8，并且最优选4或8。在另外的实施方式中，m是10至30，并且优选20至30。替换地，m是0至50。在该实施方式中，m优选10-40，而n是1。
在一个实施方式中，细胞结合剂和A之间是通过细胞结合剂的巯基和A基团的马来酰亚胺基来连接的。
在一个实施方式中，细胞结合剂和A之间的连接是：
Figure BDA00002257755900322
其中，星号表示与A的余下部分的连接点，而波形线表示与细胞结合剂的余下部分的连接点。在该实施方式中，S原子是典型地源于细胞结合剂。
在上面的每个实施方式中，可使用替换的官能度来代替在下面显示的马来酰亚胺衍生的基团：
Figure BDA00002257755900323
其中，波形线表示与细胞结合剂的连接点，而星号表示与A基团的余下部分的结合。
在一个实施方式中，马来酰亚胺衍生的基团用一下基团代替：
Figure BDA00002257755900331
其中，波形线表示与细胞结合剂的连接点，而星号表示与A基团的余下部分的结合。
在一个实施方式中，马来酰亚胺衍生的基团用可选地与细胞结合剂一起的基团代替，其选自：
-C(=O)NH-，
-C(=O)O-，
-NHC(=O)-，
-OC(=O)-，
-OC(=O)O-，
-NHC(=O)O-，
-OC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH-，
-NHC(=O)NH，
-C(=O)NHC(=O)-，
-S-，
-S-S-，
CH2C(=O)-
C(=O)CH2-，
=N-NH-，以及
NH-N=。
在一个实施方式中，马来酰亚胺衍生的基团用可选与细胞结合剂一起的基团代替，其选自：
Figure BDA00002257755900332
其中，波形线表示与细胞结合剂的连接点或与A基团的余下部分的结合，而星号表示另外的与细胞结合剂的连接点或与A基团的余下部分的结合。
适于将细胞结合剂与L1连接的其他基团在WO 2005/082023中描述。
基团R10可从基团RL衍生。基团RL可通过细胞结合剂与RL的官能团的连接转变成基团R10。可采用其他步骤将RL转化成R10。这些步骤可包括去除所存在的保护基团，或加入适当的官能团。
Q
在一个实施方式中，Q选自O、S或N(H)。
优选地，Q是O。
R11
在一个实施方式中，R11是H，或R或，其中Q是O、SO3M，其中M是金属阳离子。
在一个实施方式中，R11是H。
在一个实施方式中，R11是R。
在一个实施方式中，其中，Q是O，R11是SO3M，其中，M是金属阳离子。阳离子可以为Na+。
RL
在一个实施方式中，RL是用于与细胞结合剂结合的接头。
在一个实施方式中，接头提供有官能团，以形成与细胞结合剂的连接。本申请尤其关注那些具有与N10位置的氨基甲酸酯连接的RL基团。本文以上对连接基团R10的讨论也有关于它们的直接前体。
RL与RC不同，其不适于与细胞结合剂反应。然而，在一些实施方式中，可以将RC转换成基团RL，例如，通过适当处理保护基团和为Rc或形成部分Rc的其他官能度。
在一个实施方式中，RL为以下基团：
Figure BDA00002257755900341
其中，星号表示与N10位置的连接点，G1是用于形成与细胞结合剂的连接的官能基团，L1是接头，L2是共价键或者与OC(=O)一起形成自脱落接头，以及L1或L2为可断裂接头。
L1和L2如有关于R10所定义的。这里对A的连接的参考可以理解为对与G1的连接的参考。
在一个实施方式中，其中L1包括氨基酸，可保护该氨基酸的侧链。可使用任何合适的保护基团。在一个实施方式中，侧链保护基团可用所存在的化合物中的其他保护基团去除。在其他实施方式中，保护基团可垂直于所存在的分子中的其他保护基团。
适用于氨基酸侧链的保护基团包括那些在Novabiochem Catalog2006/2007中所描述的基团。用于组织蛋白酶不稳定接头的保护基还在Dubowchik et al中讨论。
在本发明的某些实施方式中，基团L1包括Lys氨基酸残基。该氨基酸的侧链可以用Boc或Alloc保护基团保护。最优选Boc保护基团。
官能团G1在与细胞结合剂反应后形成连接基团A。
在一个实施方式中，官能团G1为或包括用于与细胞结合剂上的适当基团反应的氨基、羧酸、羟、巯基或马来酰亚胺基团。在优选的实施方式中，G1包括马来酰亚胺基团。
在一个实施方式中，基团G1是烷基马来酰亚胺基团。该基团适于与存在于细胞结合剂，例如存在于抗体中的巯基，尤其是半胱氨酸巯基基团反应。
在一个实施方式中，基团G1是：
Figure BDA00002257755900351
其中，星号表式与L1的连接点，而n为0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团G1是：
Figure BDA00002257755900352
其中，星号表式与L1的连接点，而n为0至6。在一个实施方式中，n是5。
在一个实施方式中，基团G1是：
Figure BDA00002257755900361
其中，星号表示与L1的连接点，n为0或1，而m是0至30。在优选的实施方式中，n是1，而m是0至10、1至2，优选4至8，并且最优选4或8。替换地，m是0至50。在该实施方式中，m优选10-40，而n为1。
在一个实施方式中，基团G1是：
其中，星号表示与L1的连接点，n为0或1，而m是0至30。在优选的实施方式中，n是1，而m是0至10、1至8，优选4至8，并且最优选4或8。替换地，m是0至50。在该实施方式中，m优选10-40，而n是1。
在上面的每个实施方式中，替换的官能度可用于代替在下面显示的马来酰亚胺基团：
Figure BDA00002257755900363
其中，星号表示与G基团的余下部分的结合。
在一个实施方式中，马来酰亚胺衍生的基团用以下基团替换：
Figure BDA00002257755900364
其中，星号表示与G基团的余下部分的结合。
在一个实施方式中，马来酰亚胺衍生的基团用选自以下的基团替换：
-C(=O)OH，
-OH，
-NH2，
-SH，
C(=O)CH-2D，其中，D是Cl、Br或I，
CHO，
NHNH2
C≡CH，以及
N3(叠氮化物)。
在一个实施方式中，存在L1时，G1是-NH2、NH2N-NHMe、-COOH、-OH或-SH。
在一个实施方式中，存在L1时，G1是-NH2或-NHMe。任一基团可以为L1氨基酸序列的N-末端。
在一个实施方式中，存在L1时，G1是-NH2且L1为如上面关于R10所定义的氨基酸序列-X1-X2-。
在一个实施方式中，在L1存在时，G1是COOH。该基团可以为L1氨基酸序列的C-末端。
在一个实施方式中，在L1存在时，G1是OH。
在一个实施方式中，其中，L1存在时，G1是SH。
基团G1可从一个官能团转变成另一个（官能团）。在一个实施方式中，在L1存在时，G1是-NH2。该基团可转变成另外的包含马来酰亚胺基团的基团G1。例如，基团-NH2可以与这些现实在上面包含马来酰亚胺基的G1基团的酸或活化酸（例如N-琥珀酰亚胺形式）反应。
基团G1可能因此转变为更适于与细胞结合剂反应的官能团。
在其他实施方式中，RL是为提供有官能团的接头的前体的基团。
如上面所指出的，在一个实施方式中，在L1存在时，G1是-NH2、NH2N-NHMe、-COOH、-OH或-SH。在进一步的实施方式中，这些基团在化学上保护的形式中提供。化学上保护的形式因此是提供官能团的接头的前体。
在一个实施方式中，G1是以化学受保护形式的NH2。该基团可以用氨基甲酸酯保护基团保护。氨基甲酸酯保护基团可选自由以下所组成的组中的基团：
Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Cbz和PNZ。
优选地，在G1为-NH2时，其用Alloc或Fmoc基团保护。
在一个实施方式中，在G1是-NH2时，其用Fmoc基团保护。
在一个实施方式中，保护基团与帽化基团的氨基甲酸酯保护基团相同。
在一个实施方式中，保护基团与帽化基团的氨基甲酸酯保护基团不相同。在该实施方式中，优选在不去除帽化基团的氨基甲酸酯保护基团的条件下，保护基团是可去除的。
可除去化学保护基团以提供官能团来形成与细胞结合剂的连接。可选地，该官能团可能然后如上所描述地转变为另外的官能团。
在一个实施方式中，活性基团是胺。此胺优选肽的N-末端胺，并且可以为本发明的优选的二肽的N-末端胺。
活性基团可以反应以产生旨在形成与细胞结合剂的连接的官能团。
在其他实施方式中，接头是具有活性基团的接头的前体。在该实施方式中，该接头包含活性基团，其以保护基团的方式受保护。可除去保护基团以提供具有活性基团的接头。
在活性基团是胺时，保护基团可以是胺保护基团，如在Green和Wuts中所描述的那些。
保护基团优选垂直于在基团RL中所存在的其他保护基团。
在一个实施方式中，保护基团垂直于帽化基团。因此，活性基团保护基团是可去除的，同时保留帽化基团。在其他实施方式中，保护基团和帽化基团（封端基团）在用来去除帽化基团的那些相同条件下是可去除的。
在一个实施方式中，RL是：
Figure BDA00002257755900381
其中，星号表示与N10位置的连接点，而波形线表示与接头L1的余下部分的连接点或与G1的连接点。优选地，波形线表示与G1的连接点。
在一个实施方式中，RL是：
其中，星号和波形线如上面所定义的。
在一个实施方式中，RL为
Figure BDA00002257755900392
其中，星号和波形线如上面所定义的。
适用于在L1和细胞结合剂之间形成连接的其他官能团在WO2005/082023中描述。
接头可以包括蛋白酶-断裂的包含一个或多个氨基酸单元的肽部分。肽接头反应物可通过在肽化学领域熟知的固相或液相合成法制备（E.
Figure BDA00002257755900393
and K.Lübke,The Peptides,volume 1,pp 76-136(1965)AcademicPress），包括t-BOC化学（Geiser et al"Automation of solid-phase peptidesynthesis"in Macromolecular Sequencing and Synthesis,Alan R.Liss,Inc.,1988,pp.199-218），和Fmoc/HBTU化学（Fields,G.and Noble,R.(1990)"Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluoroenylmethoxycarbonyl aminoacids",Int.J.Peptide Protein Res.35:161-214），基于自动合成器如RaininSymphony Peptide Synthesizer（Protein Technologies,Inc.,Tucson,AZ），或Model 433（Applied Biosystems,Foster City,CA）。
示例性氨基酸接头包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸（vc或val-cit）、丙氨酸-苯丙氨酸（af或ala-phe）。示例性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸（gly-val-cit）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（gly-gly-gly）。包括氨基酸接头组分的氨基酸残基包括天然存在的那些，以及不常见氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。可以以它们对由特定酶，例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶的酶切割的选择性设计并优化氨基酸接头组分。
氨基酸侧链包括天然存在的那些，以及不常见氨基酸类和非天然存在的氨基酸类似物，如瓜氨酸。氨基酸侧链包括氢、甲基、异丙基、异丁基、sec-丁基、苯甲基、p-羟苯甲基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡啶基甲基-、3-吡啶基甲基-、4-吡啶基甲基-、苯基、环己基，以及下列结构：
Figure BDA00002257755900401
Figure BDA00002257755900402
或者
Figure BDA00002257755900403
在氨基酸侧链包含除氢（甘氨酸）之时，氨基酸侧链所连接的碳原子是手性的。氨基酸侧链所连接的每个碳原子独立地是在（S）或（R）构型，或外消旋混合物。药物-接头反应物可能因而是对映体纯的、消旋的或非对映体的。
在示例性实施方式中，氨基酸侧链选自那些天然和非天然的氨基酸，包括丙氨酸、2-氨基的-2-环己基醋酸、2-氨基-2-苯基醋酸酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸、α,α-甲基γ-氨基丁酸、β,β-二甲基γ-氨基丁酸、鸟氨酸和瓜氨酸（Cit）。
可用于构建用于与细胞结合剂，例如抗体，结合的接头-PBD药物部分中间体，具有氨基苄基氨甲酰基（aminobenzylcarbamoyl，PAB）自脱落间隔区的示例性缬氨酸-瓜氨酸（val-cit或vc）二肽接头反应物具有结构：
Figure BDA00002257755900411
其中，Q是C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-NO2或-CN；而m是范围从0-4的整数。
具有p-氨基苯甲基的示例性phe-lys(Mtr)二肽接头可以根据Dubowchik,et al.(1997)Tetrahedron Letters,38:5257-60来制备，并且具有结构：
Figure BDA00002257755900412
其中，Mtr是单-4甲氧基三苯甲基，Q是C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-卤素、-NO2或-CN；而m是范围从0-4的整数。
“自脱落接头”PAB（对-氨基苄氧基羰基）将抗体药物结合物中的药物部分与抗体连接（Carl et al (1981)J.Med.Chem.24:479-480；Chakravarty et al(1983)J.Med.Chem.26:638-644；US 6214345；US20030130189；US20030096743；US6759509；US20040052793；US6218519；US6835807；US6268488；US20040018194；WO98/13059；US20040052793；US6677435；US5621002；US20040121940；WO2004/032828）。除PAB之外的其他自脱落间隔区的实例包括，但不限于：（i）电子类似于PAB基团的芳香化合物，如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物（Hay et al.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237），噻唑类（美国7375078），多个伸长的PAB单元（de Groot et al (2001)J.Org.Chem.66:8815-8830）；以及垂直（ortho）或对-氨基苄基缩醛类；（ii）批准的苯乙烯基PAB类似物（美国7223837）。在酰胺键水解后经历环化的间隔区可以使用，如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺类（4-aminobutyric acidamides）（Rodrigues et al (1995)Chemistry Biology 2:223）、适当取代的二环[2.2.1]和二环[2.2.2]环系统（Storm et al(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815），以及2-氨基苯基丙酸酰胺类（2-aminophenylpropionic acidamides）（Amsberry,et al(1990)J.Org.Chem.55:5867）。在甘氨酸取代的包含胺的药物的消除（Kingsbury et al(1984)J.Med.Chem.27:1447）也是可用于ADC的自脱落间隔区的实例。
在一个实施方式中，缬氨酸-瓜氨酸二肽PAB类似物反应物具有2,6-二甲基苯基基团并且具有结构：
Figure BDA00002257755900421
可用于本发明的抗体药物结合物的接头反应物包括，但不限于：BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、和硫代-SMPB和SVSB（琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯），以及二-马来酰亚胺反应物：DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、1,8-二-马来酰亚胺二乙二醇（BM(PEO)2），和1,11-二-马来酰亚胺三乙二醇（BM(PEO)3），它们可从Pierce Biotechnology公司、ThermoScientifific、Rockford、IL和其他试剂供应商购买。二-马来酰亚胺反应物允许以相继或同时的方式将抗体的半胱氨酸残基的游离巯基的硫醇与包含巯基的药物部分、标签或接头中间体连接。除马来酰亚胺外的对抗体、PBD药物部分或接头中间体有反应性的其他官能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
Figure BDA00002257755900422
接头反应物的其他实施方式是：N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯（SPP），N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯（SPDP，Carlsson etal(1978)Biochem.J.173:723-737），琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯（SMCC），亚氨基硫烷（IT），酰亚胺酯类的双官能团衍生物（如己二酰亚胺酸二甲酯HCl），活性酯（如辛二酸二琥珀酰亚胺酯），醛（如戊二醛）、二-叠氮基化合物（如二(p-叠氮基苯甲酰基)己二胺），二-重氮衍生物（如二-(p-二叠氮基苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯（如甲苯2,6-二异氰酸酯）和二-活性氟化合物（如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。可用的接头反应物还可经其他商业来源，如Molecular Biosciences公司（Boulder，CO）获得，或根据在Toki et al (2002)J.Org.Chem.67:1866-1872；US6214345;WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；以及WO 04/032828中所描述的方法来合成。
接头可以是用于通过分支的多功能接头部分将多个药物部分与抗体共价连接的树枝状型接头（US 2006/116422;US 2005/271615;de Groot et al(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4490-4494;Amir et al(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499;Shamis et al(2004)J.Am.Chem.Soc.126:1726-1731;Sun et al(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215;Sun et al(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768;King et al(2002)Tetrahedron Letters 43:1987-1990）。树枝状接头可以增加药物与抗体的摩尔比，即负载，其与ADC的效能有关。因此，在抗体含有仅一个反应性半胱氨酸巯基时，多个药物部分可以通过树枝状或分支接头来连接。
树枝状类型接头的示例性实施方式具有结构：
Figure BDA00002257755900431
其中，星号表示与PBD部分的N10位置的连接点。
细胞结合剂
细胞结合剂可以是任何种类，并包括肽类和非肽类。这些可以包括包含至少一个结合位点的抗体或抗体的片段、淋巴因子、激素、生长因子、营养素运输分子或任何其它细胞结合分子或底物。
本文中术语“抗体”以最广泛的含义使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多聚特异性抗体（例如双特异性抗体），以及抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性（Miller et al(2003)Jour.ofImmunology 170:4854-4861）。抗体可以是老鼠的、人的、人化的、嵌合的，或源于其他物种。抗体是由免疫系统所产生的蛋白质，其能够识别并结合特异性抗原（Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology，5th Ed.,Garland Publishing,New York）。靶抗原通常具有众多结合位点，也称为表位，由多种抗体上的CDRs识别。与不同表位特异性结合的各种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可能有多种相应的抗体。抗体包括全长的免疫球蛋白分子或全长的免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原结合位点免疫特异性结合目标靶抗原或其部分的分子，这样的靶标包括但不限于，癌细胞或产生与自身免疫性疾病有关的自身免疫抗体的细胞。免疫球蛋白可以是任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA）、种类（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白类可以源于任何物种，包括人、老鼠，或兔子来源。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2，和Fv片段；双体（diabodies）；线抗体（linear antibodies）；由Fab表达库（expression library），抗独特型抗体（anti-idiotypic(anti-Id)antibodies），CDR（互补决定区）以及免疫特异性地结合到癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的以上任何的表位结合片段，单链抗体分子所产生的片段；和由抗体片段所形成的多特异性抗体。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”指从基本同源的抗体群所获得的抗体，即包括群的各个抗体是相同的，除了可能以小量存在的可能的天然存在的突变。单克隆抗体类是高度特异性的，直接针对单个抗原位点。而且，与包含直接针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体直接针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体类是有利的，因为它们可以通过其他抗体未污染地合成。修饰语“单克隆的”表明作为的基本同源的抗体群所获得的抗体的特性，并且不应理解为需要通过任何特别的方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过由Kohler et al(1975)Nature 256:495首次描述的杂交方法来制作，或可通过重组DNA方法（见，美国4816567）制作。使用单克隆抗体还可利用在Clackson et al (1991)Nature,352:624-628;Marks et al(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中所描述的技术从噬菌体抗体室（phageantibody libraries）中分离。
本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重和/或轻链的部分与源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该（这些）链的余下部分与源于另外的物种或属于另外的抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性（US 4816567;and Morrison et al(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855）。嵌合抗体包括源于非人类灵长类（例如猕猴科（Old WorldMonkey）或猩猩科（Ape））的可变区抗原-结合序列和人类恒定区序列的“灵长类动物化（primatized）”抗体。
本文中“完整抗体”是包括VL和VH区，以及轻链恒定区（CL）和重链恒定区，CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然序列恒定区（例如人天然序列恒定区）或其氨基酸序列变体。完整抗体可能具有一种或多种“效应器功能（effector functions）”，其是指可归因于抗体的Fc区（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）的那些生物活性。抗体效应器功能的实例包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）；吞噬作用；以及细胞表面受体如B细胞受体和BCR）的下调。
取决于它们的重链恒定区的氨基酸序列，完整抗体可以分成不同的“类别”。有五种主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可进一步地分成“亚类”（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA，和IgA2。与不同类别的抗体相对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。免疫球蛋白的不同类别的亚基结构和三锥构型是熟知的。
细胞结合剂的实例包括这些在用于WO 2007/085930中所描述的。
细胞结合剂可以为或包括多肽。多肽可以是环状多肽。细胞结合剂可以是抗体。因此，在一个实施方式中，本发明提供抗体-药物结合物（ADC）。
药物负载
药物负载是每抗体PBD药物的平均数。药物负载可在每个抗体（Ab）1至8个药物（D）范围内，即其中1、2、3、4、5、6、7、和8个药物部分与抗体共价结合。ADC组合物包括与范围从1至8的药物结合的抗体集合。在由结合反应制备ADC中的每抗体药物的平均数可以通过质谱法、ELISA测定、电泳和HPLC来表征。还可以测定以p表示的ADC的数量分布。通过ELISA，可测定在ADC特别制备中的p的平均值（Hamblett etal(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070;Sanderson et al(2005)Clin.CancerRes.11:843-852）。然而，通过抗体抗原结合和ELISA的检测限，不能辨别p（药物）值的分布。此外，用于检测抗体-药物结合的ELISA测试不能确定药物部分与抗体连接的部位，如重链或轻链片段，或特定的氨基酸残基。在某些情况下，在p是来自有其他药物负载的ADC的定值时同类ADC的分离、纯化和特征化可以通过方法如反相HPLC或电泳来实现。
对于一些抗体-药物结合物，p可能受到抗体上的连接点的数量的限制。例如，一个抗体可能只有一个或几个半胱氨酸巯基，或可能只有一个或几个有足够反应性的通过其于接头连接的巯基。更高的药物负载，例如p>5，可能引起某些抗体-药物结合物的聚集、不溶性、毒性或损失细胞通透性。
典型地，少于理论最高值的药物部分在结合反应中与抗体结合。抗体可能包括例如，许多不与药物-接头中间体（D-L）或接头反应物反应的赖氨酸残基。仅仅最具有反应性的赖氨酸基团可与胺-反应性接头反应物反应。此外，只有最具有反应性的半胱氨酸巯基基团可与巯基-反应性接头反应物反应。通常，抗体不包括许多，如果有，可以与药物部分连接的游离并有反应性的半胱氨酸巯基。化合物的抗体中的大多数半胱氨酸巯基残基以二硫键存在，并且在部分或完全还原条件下必须被还原剂如二硫苏糖醇（DTT）或TCEP还原。ADC的负载（药物/抗体比率）可以以几种不同的方式来控制，包括：（i）相对于抗体限制药物-接头中间体（D-L）或接头反应物的摩尔过量，（ii）限制结合反应时间或温度，以及（iii）部分地或限制用于半胱氨酸巯基改性的还原条件。
可以在抗体中的反应位点改造半胱氨酸氨基酸，且其不形成链内或分子间的二硫键（Junutula,et al.,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932;Dornanet al(2009)Blood 114(13):2721-2729;US 7521541;US 7723485;WO2009/052249）。改造的半胱氨酸巯基可与本发明的具有反应性巯基、亲电基团如马来酰亚胺或α-卤代酰胺的接头反应物或药物-接头反应物反应以形成具有半胱氨酸改造抗体和PBD药物部分的ADC。因而可以设计、控制并知道药物部分的位置。可以控制药物负载，因为改造的半胱氨酸巯基典型地以高产率与巯基-反应性接头反应物或药物-接头反应物反应。改造IgG抗体以通过在重或轻链上的单一位点的替换来引入半胱氨酸氨基酸带给在对称抗体上的两个新半胱氨酸。可以实现接近2的负载药物，并接近结合产物ADC的均一性。
其中，抗体的多个亲核或亲电基团与药物-接头中间体或接头反应物反应，则制得的产物为具有例如1、2、3个等的药物部分与一个抗体连接的分布的ADC化合物的混合物。液体色谱法（如聚合反相（polymericreverse phase，PLRP）以及疏水作用层析（HIC））可通过药物负载值分离混合物中的化合物。可以分离具有单一药物负载值（p）的ADC制剂，然而，这些单一负载值ADCs可能仍然是非均一混合物，因为药物部分可以经由接头在抗体的不同位点连接。
因此，本发明的抗体药物结合物组合物包括抗体-药物结合物化合物的混合物，其中抗体具有一个或多个PBD药物部分，且其中药物部分可以结合在抗体的各个氨基酸残基上。
在一个实施方式中，每个细胞结合剂单体或二聚体吡咯并苯（并）二氮
Figure BDA00002257755900461
基团的平均数范围为1至20个。在一些实施方式中，该范围选自1至8、2至8、2至6、2至4，以及4至8个。
在一些实施方式中，具有每个细胞结合剂一个单体或二聚体吡咯并苯二氮
Figure BDA00002257755900471
基团。
肽
在
一个实施方式中，细胞结合剂为包括4-20，优选地6-20个连续氨基酸残基的线性或环状肽。在该实施方式中，优选一个细胞结合剂与一个单体或二聚体吡咯并苯二氮
Figure BDA00002257755900472
连接。
在一个实施方式中，细胞结合剂包括结合整联蛋白的ανβ6的肽。该肽对αvβ6有选择性，超过XYS。
在一个实施方式中，细胞结合剂包括A20FMDV-Cys多肽。A20FMDV-Cys具有序列：NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC。替换地，可以使用A20FMDV-Cys序列的变体，其中一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸残基用另外的氨基酸残基替换。
在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体；嵌合抗体；人化抗体；完全人抗体；或单链抗体。一个实施方式，抗体为具有生物活性的这些抗体之一的片段。这样的片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2以及Fv片段。
在这些实施方式中，每个抗体可以与一个或几个单体或二聚体吡咯并苯并二氮
Figure BDA00002257755900473
基团连接。吡咯并苯并二氮
Figure BDA00002257755900474
与细胞结合剂的优选比率在上面给出。
抗体可以为结构域抗体（DAB）。
在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体。
用于本发明的抗体包括在并入本文中的WO 2005/082023中所描述的抗体。尤其优选那些用于肿瘤相关抗原的抗体。本领域已知的抗原的实例包括，但不限于，在WO 2005/082023中列出的肿瘤相关抗原。参见，例如，第41-55页。
本发明的结合物被设计用于经由肿瘤细胞的细胞表面抗原靶向肿瘤细胞。这些抗原通常是正常的细胞表面抗原，其或是过表达或是在异常时间表达。理想地，靶抗原仅在增殖细胞（优选地肿瘤细胞）上表达，然而这在实践中很少观察到。因此，靶抗原通常基于增殖的和健康的组织之间的差异表达来选择。
已经提出对于靶特异性肿瘤相关抗原的抗体，这些抗原包括：
Cripto、CD30、CD19、CD33、糖蛋白NMB、CanAg、Her2（ErbB2/神经鞘（Neu））、CD56（NCAM）、CD22（Siglec2）、CD33（Siglec3）、CD79、CD138、PSCA、PSMA（前列腺特异性膜抗原）、BCMA、CD20、CD70、E-选择素、EphB2、Melanotransferin、Muc 16和TMEFF2。
肿瘤相关抗原（TAA）是本领域中已知的，并且可以制备，用于利用本领域熟知的方法和信息来产生抗体。在试图发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶点时，研究人员已经试图确定，与一种或多种正常非癌细胞相比，在一种或多种特定类型的癌症细胞的表面上特异性表达的跨膜或否则肿瘤相关的多肽。通常，与在非癌细胞的表面上相比，这样的肿瘤相关多肽更大量地被表达于癌细胞的表面上。这样的肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定，已经产生用于经基于抗体的治疗来特异性地靶向癌细胞用于破坏的能力。
TAA的实例包括，但不限于在下面列出的TAA（1）-（36）。为方便起见，关于所有在本领域中已知的这些抗原的信息在下面列出并包括名称、通用交叉名称、Genbank登记号以及主要参考，接着是国家生物技术信息中心（NCBI）的核酸和蛋白序列鉴定规则。对应TAA（1）-（36）的核酸和蛋白质序列可在公共数据库如GenBank中获取。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括相对于所引证的参考中确认的序列具有至少约70%、80%、85%、90%，或95%序列同一性的，或表现出与具有在所引证的参考中找到的序列的TAA基本相同的生物性质或性状的所有氨基酸序列变体和亚型。例如，具有变体序列的TAA能够特异性地与特异性地与具有所列出的相应序列的TAA结合的抗体结合。本文中在具体引证的参考中的序列和公开清楚地通过参考并入。
肿瘤相关的抗原（1）-（36）：
（1）BMPR1B（骨形态生成蛋白受体类型IB，Genbank登记号NM_001203）ten Dijke,P.,et al Science 264(5155):101-104(1994),Oncogene 14(11):1377-1382(1997)；WO2004/063362（权利要求2）；WO2003/042661（权利要求12）；US2003/134790-A1（第38-39页）；WO2002/102235（权利要求13；第296页）；WO2003/055443（第91-92页）；WO2002/99122（实施例2；第528-530页）；WO2003/029421（权利要求6）；WO2003/024392（权利要求2；图112）；WO2002/98358（权利要求1；第183页）；WO2002/54940（第100-101页）；WO2002/59377（第349-350页）；WO2002/30268（权利要求27；第376页）；WO2001/48204（实例；图4）；NP_001194骨形态生成蛋白受体，类型IB/pid=NP_001194.1。相关引用：MIM：603248；NP_001194.1；AY065994
（2）E16（LAT1，SLC7A5，Genbank登记号NM_003486）Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999),Nature 395(6699):288-291(1998),Gaugitsch,H.W.,et al(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273)；WO2004/048938（实施例2）；WO2004/032842（实例IV)；WO2003/042661（权利要求12）；WO2003/016475（权利要求1）；WO2002/78524（实施例2）；WO2002/99074（权利要求19；第127-129页）；WO2002/86443（权利要求27；第222、393页）；WO2003/003906（权利要求10；第293页）；WO2002/64798（权利要求33；第93-95页）；WO2000/14228（权利要求5；第133-136页）；US2003/224454（图3）；WO2003/025138（权利要求12；第150页）；NP_003477溶质载体家族7（阳离子氨基酸转运蛋白（cationicamino acid transporter），y+系统），成员5/pid=NP_003477.3-人类；相关引用：MIM：600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1
（3）STEAP1（前列腺六次跨膜上皮抗原，Genbank登记号NM_012449）；Cancer Res.61(15),5857-5860(2001),Hubert,R.S.,et al(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528)；WO2004/065577（权利要求6）；WO2004/027049（图1L）；EP1394274（实施例11）；WO2004/016225（权利要求2）；WO2003/042661（权利要求12）；US2003/157089（实施例5）；US2003/185830（实施例5）；US2003/064397（图2）；WO2002/89747（实施例5；第618-619页）；WO2003/022995（实施例9；图13A，实施例53；第173页，实施例2；图2A）；NP_036581前列腺六次跨膜上皮抗原；相关引用：MIM：604415；NP_036581.1；NM_012449_1
（4）0772P（CA125、MUC16，Genbank登记号AF361486）；J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001))；WO2004/045553（权利要求14）；WO2002/92836（权利要求6；图12）；WO2002/83866（权利要求15；第116-121页）；US2003/124140（实施例16）；相关引用：GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1
（5）MPF成熟促进因子（MPF、MSLN、SMR、巨核细胞促进因子、间皮素，Genbank登记号NM_005823）Yamaguchi,N.,et al Biol.Chem.269(2),805-808(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996),J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995))WO2003/101283（权利要求14）；（WO2002/102235（权利要求13；第287-288页）；WO2002/101075（权利要求4；第308-309页）；WO2002/71928（第320-321页）；WO94/10312（第52-57页）；相关引用：MIM：601051；NP_005814.2；NM_005823_1
（6）Napi3b（NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2，溶质载体家族34（磷酸钠），成员2，II型钠依赖的磷酸转运体3b，Genbank登记号NM_006424）J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002),Genomics 62(2):281-284(1999),Feild,J.A.,et al(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582)；WO2004/022778（权利要求2）；EP1394274（实施例11）；WO2002/102235（权利要求13；第326页）；EP0875569（权利要求1；第17-19页）；WO2001/57188（权利要求20；第329页）；WO2004/032842（实施例IV)；WO2001/75177（权利要求24；第139-140页）；相关引用：MIM：604217；NP_006415.1；NM_006424_1
（7）Sema 5b（FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、臂板蛋白（信号素）5b Hlog、sema域、七凝血酶敏感蛋白重复（或七血小板反应蛋白重复）（型1和型-1样）、跨膜区（TM）和短胞质域、（臂板蛋白（信号素，semaphorin））5B，Genbank登记号AB040878）；Nagase T.,et al(2000)DNA Res.7(2):143-150)；7(2):143-150);WO2004/000997（权利要求1）；WO2003/003984（权利要求1）；WO2002/06339（权利要求1；第50页）；WO2001/88133（权利要求1；第41-43、48-58页）；WO2003/054152（权利要求20）；WO2003/101400（权利要求11）；登记号：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1.Genew；HGNC：10737
（8）PSCA hlg（2700050C12Rik，C530008O16Rik，RIKEN cDNA2700050C12，RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登记号AY358628）；Ross et al(2002)Cancer Res.62:2546-2553；US2003/129192（权利要求2）；US2004/044180（权利要求12）；US2004/044179（权利要求11）；US2003/096961（权利要求11）；US2003/232056（实施例5）；WO2003/105758（权利要求12）；US2003/206918（实施例5）；EP1347046（权利要求1）；WO2003/025148（权利要求20）；相关引用：GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1
（9）ETBR（内皮素B型受体，Genbank登记号AY275463）；NakamutaM.,et al Biochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991；Ogawa Y,et alBiochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991；Arai H.,et al Jpn.Circ.J.56,1303-1307,1992；Arai H.,et al J.Biol.Chem.268,3463-3470,1993；Sakamoto A.,Yanagisawa M.,et al Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991；Elshourbagy N.A.,et al J.Biol.Chem.268,3873-3879,1993；Haendler B.,et al J.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992；Tsutsumi M.,etal Gene 228,43-49,1999；Strausberg R.L.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；Bourgeois C.,et al J.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997；Okamoto Y.,et al Biol.Chem.272,21589-21596,1997；Verheij J.B.,et al Am.J Med.Genet.108,223-225,2002；Hofstra R.M.W.,etal Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997；Puffenberger E.G.,et al Cell 79,1257-1266,1994；Attie T.,et al,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995；Auricchio A.,et al Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996；Amiel J.,et al Hum.Mol.Genet.5,355-357,1996；Hofstra R.M.W.,et al Nat.Genet.12,445-447,1996；Svensson P.J.,et al Hum.Genet.103,145-148,1998；Fuchs S.,et al Mol.Med.7,115-124,2001；Pingault V.,et al(2002)Hum.Genet.111,198-206WO2004/045516（权利要求1）；WO2004/048938（实施例2）；WO2004/040000（权利要求151）；WO2003/087768（权利要求1）；WO2003/016475（权利要求1）；WO2003/016475（权利要求1）；WO2002/61087（图1）；WO2003/016494（图6）；WO2003/025138（权利要求12；第144页）；WO2001/98351（权利要求1；第124-125页）；EP0522868（权利要求8；图2）；WO2001/77172（权利要求1；第297-299页）；US2003/109676；US6518404（图3）；US5773223（权利要求1a；第31-34项）；WO2004/001004
（10）MSG783（RNF124，假定蛋白FLJ20315，Genbank登记号NM_017763）；WO2003/104275（权利要求1）；WO2004/046342（实施例2）；WO2003/042661（权利要求12）；WO2003/083074（权利要求14；第61页）；WO2003/018621（权利要求1）；WO2003/024392（权利要求2；图93）；WO2001/66689（实施例6）；相关引用：LocusID：54894；NP_060233.2；NM_017763_1
（11）STEAP2（HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺六次跨膜上皮抗原2、六次跨膜前列腺蛋白质Genbank登记号AF455138）；Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002))；WO2003/087306；US2003/064397（权利要求1；图1）；WO2002/72596（权利要求13；第54-55页）；WO2001/72962（权利要求1；图4B）；WO2003/104270（权利要求11）；WO2003/104270（权利要求16）；US2004/005598（权利要求22）；WO2003/042661（权利要求12）；US2003/060612（权利要求12；图10）；WO2002/26822（权利要求23；图2）；WO2002/16429（权利要求12；图10）；相关引用：GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1
（12）TrpM4（BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道蛋白，亚家族M，成员4，Genbank登记号NM_017636）；Xu,X.Z.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001),Cell109(3):397-407(2002),J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003))；US2003/143557（权利要求4）；WO2000/40614（权利要求14；第100-103页）；WO2002/10382（权利要求1；图9A）；WO2003/042661（权利要求12）；WO2002/30268（权利要求27；第391页）；US2003/219806（权利要求4）；WO2001/62794（权利要求14；图1A-D）；相关引用：MIM：606936；NP_060106.2；NM_017636_1
（13）CRIPTO（CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎瘤衍生生长因子；Genbank登记号NP_003203或NM_003212）；Ciccodicola,A.,etal EMBO J.8(7):1987-1991(1989),Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991))；US2003/224411（权利要求1）；WO2003/083041（实施例1）；WO2003/034984（权利要求12）；WO2002/88170（权利要求2；第52-53页）；WO2003/024392（权利要求2；图58）；WO2002/16413（权利要求1；第94-95、105页）；WO2002/22808（权利要求2；图1）；US5854399（实施例2；第17-18项）；US5792616（图2）；相关引用：MIM：187395；NP_003203.1；NM_003212_1
（14）CD21（CR2（补体受体2）或C3DR（C3d/爱泼斯坦-巴尔病毒受体（Epstein Barr virus receptor））或Hs.73792，Genbank登记号M26004）；Fujisaku et al(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125)；Weis J.J.,et al J.Exp.Med.167,1047-1066,1988；Moore M.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987；Barel M.,et al Mol.Immunol.35,1025-1031,1998；Weis J.J.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986；SinhaS.K.,et al(1993)J.Immunol.150,5311-5320；WO2004/045520（实施例4）；US2004/005538（实施例1）；WO2003/062401（权利要求9）；WO2004/045520（实施例4）；WO91/02536（图9.1-9.9）；WO2004/020595（权利要求1）；登记号：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1。
（15）CD79b（CD79B、CD79β、IGb（免疫球蛋白相关β）、B29，Genbank登记号NM_000626或11038674）；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131,Blood(2002)100(9):3068-3076,Muller et al(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625)；WO2004/016225（权利要求2，图140）；WO2003/087768，US2004/101874（权利要求1，第102页）；WO2003/062401（权利要求9）；WO2002/78524（实施例2）；US2002/150573（权利要求5，第15页）；US5644033；WO2003/048202（权利要求1，第306页和第309页）；WO 99/58658，US6534482（权利要求13，图17A/B）；WO2000/55351（权利要求11，第1145-1146页）；相关引用：MIM：147245；NP_000617.1；NM_000626_1
16）FcRH2（IFGP4、IRTA4、SPAP1A（包括磷酸酶锚定蛋白1a的SH2域）、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登记号NM_030764；AY358130）；Genome Res.13(10):2265-2270(2003),Immunogenetics54(2):87-95(2002),Blood 99(8):2662-2669(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001),Xu,M.J.,et al(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775；WO2004/016225（权利要求2）；WO2003/077836；WO2001/38490（权利要求5；图18D-1-18D-2）；WO2003/097803（权利要求12）；WO2003/089624（权利要求25）；相关引用：MIM：606509；NP_110391.2；NM_030764_1
（17）HER2（ErbB2，Genbank登记号M11730）；Coussens L.,et alScience(1985)230(4730):1132-1139)；Yamamoto T.,et al Nature 319,230-234,1986；Semba K.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985；Swiercz J.M.,et al J.Cell Biol.165,869-880,2004；Kuhns J.J.,et al J.Biol.Chem.274,36422-36427,1999；Cho H.-S.,et al Nature 421,756-760,2003；Ehsani A.,et al(1993)Genomics 15,426-429；WO2004/048938（实施例2）；WO2004/027049（图1I）；WO2004/009622；WO2003/081210；WO2003/089904（权利要求9）；WO2003/016475（权利要求1）；US2003/118592；WO2003/008537（权利要求1）；WO2003/055439（权利要求29；图1A-B）；WO2003/025228（权利要求37；图5C）；WO2002/22636（实施例13；第95-107页）；WO2002/12341（权利要求68；图7）；WO2002/13847（第71-74页）；WO2002/14503（第114-117页）；WO2001/53463（权利要求2；第41-46页）；WO2001/41787（第15页）；WO2000/44899（权利要求52；图7）；WO2000/20579（权利要求3；图2）；US5869445（权利要求3；第31-38项）；WO9630514（权利要求2；第56-61页）；EP1439393（权利要求7）；WO2004/043361（权利要求7）；WO2004/022709；WO2001/00244（实施例3；图4）；登记号：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1.EMBL；M11761；AAA35808.1
（18）NCA（CEACAM6，Genbank登记号M18728）；Barnett T.,et alGenomics 3,59-66,1988；Tawaragi Y.,et al Biochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988；Strausberg R.L.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903,2002；WO2004/063709；EP1439393（权利要求7）；WO2004/044178（实施例4）；WO2004/031238；WO2003/042661（权利要求12）；WO2002/78524（实施例2）；WO2002/86443（权利要求27；第427页）；WO2002/60317（权利要求2）；登记号：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728
（19）MDP（DPEP1，Genbank登记号BC017023）；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002))；WO2003/016475（权利要求1）；WO2002/64798（权利要求33；第85-87页）；JP05003790（图6-8）；WO99/46284（图9）；相关引用：MIM：179780；AAH17023.1；BC0170231
（20）IL20Rα（IL20Ra、ZCYTOR7，Genbank登记号AF184971）；Clark H.F.,et al Genome Res.13,2265-2270,2003；Mungall A.J.,et al Nature425,805-811,2003；Blumberg H.,et al Cell 104,9-19,2001；Dumoutier L.,etal J.Immunol.167,3545-3549,2001；Parrish-Novak J.,et al J.Biol.Chem.277,47517-47523,2002；Pletnev S.,et al (2003)Biochemistry42:12617-12624；Sheikh F.,et al(2004)J.Immunol.172,2006-2010；EP1394274（实施例11）；US2004/005320（实施例5）；WO2003/029262（第74-75页）；WO2003/002717（权利要求2；第63页）；WO2002/22153（第45-47页）；US2002/042366（第20-21页）；WO2001/46261（第57-59页）；WO2001/46232（第63-65页）；WO98/37193（权利要求1；第55-59页）；登记号：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1。
（21）短蛋白聚糖（BCAN、BEHAB，Genbank登记号AF229053）；Gary S.C.,et al Gene 256,139-147,2000;Clark H.F.,et al Genome Res.13,2265-2270,2003;Strausberg R.L.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；US2003/186372（权利要求11）；US2003/186373（权利要求11）；US2003/119131（权利要求1；图52）；US2003/119122（权利要求1；图52）；US2003/119126（权利要求1）；US2003/119121（权利要求1；图52）；US2003/119129（权利要求1）；US2003/119130（权利要求1）；US2003/119128（权利要求1；图52）；US2003/119125（权利要求1）；WO2003/016475（权利要求1）；WO2002/02634（权利要求1）
（22）EphB2R（DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5，Genbank登记号NM_004442）；Chan,J.and Watt,V.M.,Oncogene 6(6),1057-1061(1991)Oncogene 10(5):897-905(1995),Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998),Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000))；WO2003042661（权利要求12）；WO200053216（权利要求1；第41页）；WO2004065576（权利要求1）；WO2004020583（权利要求9）；WO2003004529（第128-132页）；WO200053216（权利要求1；第42页）；相关引用：MIM：600997；NP_004433.2；NM_004442_1
（23）ASLG659（B7h，Genbank登记号AX092328）；US2004/0101899（权利要求2）；WO2003104399（权利要求11）；WO2004000221（图3）；US2003/165504（权利要求1）；US2003/124140（实施例2）；US2003/065143（图60）；WO2002/102235（权利要求13；第299页）；US2003/091580（实施例2）；WO2002/10187（权利要求6；图10）；WO2001/94641（权利要求12；图7b）；WO2002/02624（权利要求13；图1A-1B）；US2002/034749（权利要求54；第45-46页）；WO2002/06317（实施例2；第320-321页，权利要求34；第321-322页）；WO2002/71928（第468-469页）；WO2002/02587（实施例1；图1）；WO2001/40269（实施例3；第190-192页）；WO2000/36107（实施例2；第205-207页）；WO2004/053079（权利要求12）；WO2003/004989（权利要求1）；WO2002/71928（第233-234、452-453页）；WO 01/16318
（24）PSCA（前列腺干细胞抗原前体，Genbank登记号AJ297436）；Reiter R.E.,et al Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998；Gu Z.,etal Oncogene 19,1288-1296,2000;Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788；EP1394274（实施例11）；US2004/018553（权利要求17）；WO2003/008537（权利要求1）；WO2002/81646（权利要求1；第164页）；WO2003/003906（权利要求10；第288页）；WO2001/40309（实施例1；图17）；US2001/055751（实施例1；图1b）；WO2000/32752（权利要求18；图1）；WO98/51805（权利要求17；第97页）；WO98/51824（权利要求10；第94页）；WO98/40403（权利要求2；图1B）；登记号：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1
（25）GEDA（Genbank登记号AY260763）；AAP14954脂肪瘤HMGIC融合-伴侣-样蛋白（lipoma HMGIC fusion-partner-like protein）/pid=AAP14954.1-人类（人）；WO2003/054152（权利要求20）；WO2003/000842（权利要求1）；WO2003/023013（实施例3，权利要求20）；US2003/194704（权利要求45）；相关引用：GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1
（26）BAFF-R（B细胞-激活因子受体、BLyS受体3、BR3，Genbank登记号AF116456）；BAFF受体/pid=NP 443177.1-人类：Thompson,J.S.,etal Science 293(5537),2108-2111(2001)；WO2004/058309；WO2004/011611；WO2003/045422（实例；第32-33页）；WO2003/014294（权利要求35；图6B）；WO2003/035846（权利要求70；第615-616页）；WO2002/94852（第136-137项）；WO2002/38766（权利要求3；第133页）；WO2002/24909（实施例3；图3）；相关引用：MIM：606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600
（27）CD22（B细胞受体CD22-B亚型、BL-CAM、Lyb-8、Lyb8、SIGLEC-2、FLJ22814，Genbank登记号AK026467）；Wilson et al(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003/072036（权利要求1；图1）；相关引用：MIM：107266；NP_001762.1；NM_001771_1
（28）CD79a（CD79A，CD79α，免疫球蛋白关联α，与Igβ共价相互作用并在表面与IgM分子形成复合物的B细胞特异性蛋白（CD79B），将参与B细胞分化的信号转导），pI：4.84，MW：25028，TM：2[P]，基因染色体：19q13.2，Genbank登记号NP_001774.10）；WO2003/088808，US2003/0228319；WO2003/062401（权利要求9）；US2002/150573（权利要求4，第13-14页）；WO99/58658（权利要求13，图16）；WO92/07574（图1）；US5644033；Ha et al(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531；Mülleret al(1992)Eur.J.Immunol..22:1621-1625；Hashimoto et al(1994)Immunogenetics 40(4):287-295；Preud’homme et al(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146；Yu et al(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi et al(1988)EMBO J.7(11):3457-3464
（29）CXCR5（伯基特淋巴瘤受体1（Burkitt's lymphoma receptor 1），由CXCL13趋化因子激活，在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥功能，在HIV-2感染并可能发展AIDS、淋巴肉瘤、骨髓瘤和白血病中起作用的G蛋白质偶联受体）；372aa，pI：8.54，MW：41959，TM：7[P]，基因染色体：11q23.3，Genbank登记号NP_001707.1）；WO2004/040000；WO2004/015426；US2003/105292（实施例2）；US6555339（实施例2）；WO2002/61087（图1）；WO2001/57188（权利要求20，第269页）；WO2001/72830（第12-13页）；WO2000/22129（实施例1，第152-153页，实施例2，第254-256页）；WO99/28468（权利要求1，第38页）；US5440021（实施例2，第49-52项）；WO94/28931（第56-58页）；WO92/17497（权利要求7，图5）；Dobner et al(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799；Barellaet al(1995)Biochem.J.309:773-779
（30）HLA-DOB（与肽结合并且将它们呈递给CD4+T淋巴细胞的MHC II类分子（Ia抗原）的β亚基）；273aa，pI：6.56，MW：30820，TM:1[P]，基因染色体：6p21.3，Genbank登记号NP_002111.1）；Tonnelleet al(1985)EMBO J.4(11):2839-2847；Jonsson et al(1989)Immunogenetics29(6):411-413；Beck et al(1992)J.Mol.Biol.228:433-441；Strausberg et al(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；Servenius et al(1987).Biol.Chem.262:8759-8766；Beck et al(1996)J.Mol.Biol.255:1-13；Naruseet al(2002)Tissue Antigens 59:512-519；WO99/58658（权利要求13，图15）；US6153408（第35-38项）；US5976551（第168-170项）；US6011146（第145-146项）；Kasahara et al(1989)Immunogenetics 30(1):66-68;Larhammaret al(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119
（31）P2X5（嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5（Purinergic receptorP2X ligand-gated ion channel 5））5，由细胞外ATP门控的离子通道，可参与突触传递和神经发生，缺陷可促成病理生理学的特发性逼尿肌不稳定）；422aa），pI：7.63，MW：47206，TM：1[P]，基因染色体：17p13.3，Genbank登记号NP_002552.2）；Le et al(1997)FEBS Lett.418(1-2):195-199；WO2004/047749；WO2003/072035（权利要求10）；Touchman et al(2000)Genome Res.10:165-173；WO2002/22660（权利要求20）；WO2003/093444（权利要求1）；WO2003/087768（权利要求1）；WO2003/029277（第82页）
（32）CD72（B细胞分化抗原CD72，Lyb-2）；359aa，pI：8.66，MW：40225，TM：1[P]，基因染色体：9p13.3，Genbank登记号NP_001773.1）；WO2004042346（权利要求65）；WO2003/026493（第51-52、57-58页）；WO2000/75655（第105-106页）；Von Hoegen et al(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877；Strausberg et al(2002)Proc.Natl.Acad.SciUSA 99:16899-16903；
（33）LY64（淋巴细胞抗原64（RP105），富含亮氨酸的重复（LRR）家族的I型膜蛋白，调节B-细胞激活和凋亡，功能的损失与患有系统性红斑狼疮患者的增加的疾病活性有关）；661aa，pI：6.20，MW：74147，TM：1[P]，基因染色体：5q12，Genbank登记号NP_005573.1）；US2002/193567；WO97/07198（权利要求11，第39-42页）；Miura et al(1996)Genomics38(3):299-304；Miura et al(1998)Blood 92:2815-2822；WO2003/083047；WO97/44452（权利要求8，第57-61页）；WO2000/12130（第24-26页）
（34）FcRH1（Fc受体样蛋白1，对于包括C2型Ig样和ITAM结构域（C2 type Ig-like and ITAM domains）的免疫球蛋白Fc结构域的假定受体，可能在B-淋巴细胞分化中发挥作用）；429aa，pI：5.28，MW：46925，TM：1[P]，基因染色体：1q21-1q22，Genbank登记号NP_443170.1）；WO2003/077836；WO2001/38490（权利要求6，图18E-1-18-E-2）；Davis etal(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17):9772-9777；Natl。Acad。WO2003/089624（权利要求8）；EP1347046（权利要求1）；WO2003/089624（权利要求7）
（35）IRTA2（免疫球蛋白超家族受体易位相关2（Immunoglobulinsuperfamily receptor translocation associated 2），在B细胞发展和淋巴肉瘤生成中可能起作用的假定免疫受体；由在一些B细胞恶性肿瘤中所发生的迁移导致的基因反常）；977aa，pI：6.88，MW：106468，TM：1[P]，基因染色体：1q21，Genbank登记号人：AF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK090423、AK090475、AL834187、AY358085；鼠：AK089756、AY158090、AY506558；NP_112571.1；WO2003/024392（权利要求2，图97）；Nakayama et al(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127；WO2001/38490（权利要求3，图18B-1-18B-2）
（36）TENB2（TMEFF2、脑肿瘤抑癌蛋白（tomoregulin）、TPEF、HPP1、TR、假定的跨膜蛋白聚糖（putative transmembrane proteoglycan,推定的跨膜蛋白聚糖），与生长因子和滤泡抑素的EGF/heregulin家族有关）；374aa，NCBI登记号AAD55776、AAF91397、AAG49451，NCBI RefSeq：NP_057276；NCBI基因：23671；OMIM：605734；SwissProt Q9UIK5；Genbank登记号AF179274；AY358907、CAF85723、CQ782436；WO2004/074320；JP2004113151；WO2003/042661；WO2003/009814；EP1295944（第69-70页）；WO2002/30268（第329页）；WO2001/90304；US2004/249130；US2004/022727；WO2004/063355；US2004/197325；US2003/232350；US2004/005563；US2003/124579；Horie et al(2000)Genomics 67:146-152；Uchida et al(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602；Liang et al(2000)Cancer Res.60:4907-12；Glynne-Jones et al(2001)Int J Cancer.Oct 15；94(2):178-84
亲本抗体还可以是包含白蛋白结合肽（ABP）序列的融合蛋白（Denniset al.(2002)“Albumin Binding As A General Strategy For Improving ThePharmacokinetics Of Proteins”J Biol Chem.277:35035-35043；WO01/45746）。本发明的抗体包括由以下教导的具有ABP序列的融合蛋白：（i）Dennis et al(2002)J Biol Chem.277:35035-35043 at Tables III and IV，page 35038；（ii）美国2004/0001827的[0076]；以及（iii）WO 01/45746的第12-13页，并且所有这些在本文中通过引用并入。
在一个实施方式中，提出用于靶向特异性肿瘤相关抗原ανβ6的抗体。
细胞结合剂与接头连接。在一个实施方式中，细胞结合剂与接头所存在的A连接。
在一个实施方式中，细胞结合剂和A之间的连接是通过硫醚键。
在一个实施方式中，细胞结合剂和接头之间的连接是二硫键。
在一个实施方式中，细胞结合剂和接头之间的连接是通过酰胺键。
在一个实施方式中，细胞结合剂和接头之间的连接是通过酯键。
在一个实施方式中，细胞结合剂和接头之间的连接由细胞结合剂的半胱氨酸的巯基和接头的马来酰亚胺基来形成。
细胞结合剂的半胱氨酸残基，可与RL的官能团反应以形成连接。在其他实施方式中，例如在细胞结合剂是抗体时，抗体的巯基可能参与链间二硫键。这些链间键可通过例如在与RL的官能团反应之前用DTT处理抗体而转变成游离巯基。
可以标记细胞结合剂，例如以在作为结合物掺入之前或作为结合物的一部分检测或纯化物质。标签可以是生物素标签。在另外的实施方式中，细胞结合剂可以用放射性同位素标记。
R和R’
在一个实施方式中，R独立地选自可选地取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基。这些基团各自在下列的取代基部分中定义。
在一个实施方式中，R独立地是可选取代的C1-12烷基。
在一个实施方式中，R独立地是可选取代的C3-20杂环基。
在一个实施方式中，R独立地是可选取代的C5-20芳基。
在一个实施方式中，R独立地是可选取代的C1-12烷基。
有关于R2的上面描述是涉及优选的烷基和芳基以及可选取代基的同一性和数量的各种实施方式。对于R2的优选在其应用于R时，在适当的时候，适用于所有的其他基团R，例如其中R6、R7、R8或R9是R。
对于R的优选也适于R’。
在本发明的一些实施方式中，提供具有取代基-NRR’的化合物。在一个实施方式中，R和R’与它们所连接的氮原子一起形成可选代替的4-、5-、6-或7-元的杂环。该环可能包括进一步的杂原子，例如N、O或S。
在一个实施方式中，杂环自身用基团R取代。在存在进一步的N杂原子时，取代基可在N杂原子上。
R”
其中，R”是C3-12亚烃基（或称C3-12亚烷基），其链可被一种或多种杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）中断。
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被一种或多种杂原子和/或芳环（例如苯或吡啶）间断。
在一个实施方式中，亚烃基可选地被选自O、S和NMe的一种或多种杂原子和/或芳环（其环可选地取代）中断。
在一个实施方式中，芳环为C5-20亚芳基，其中亚芳基属于通过从芳香化合物的两个芳环原子去除两个氢原子而获得的二价部分。
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被一种或多种杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代）间断。
在一个实施方式中，R”为C3-12亚烃基。
在一个实施方式中，R”选自C3、C5、C7、C9和C11亚烃基。
在一个实施方式中，R”选自C3、C5和C7亚烃基。
在一个实施方式中，R”选自C3和C5亚烃基。
在一个实施方式中，R”为C3亚烃基。
在一个实施方式中，R”为C5亚烃基。
以上所列的亚烃基可选地被一种或多种杂原子和/或芳环（例如苯或吡啶，其环可选地取代）中断。
以上所列的亚烃基可选地被一种或多种杂原子和/或芳环（例如苯或吡啶）中断。
在上面列出的亚烃基可以为未取代的线性脂族亚烃基。
X
在一个实施方式中，X选自O、S或N(H)。
优选地，X是O。
A-A、B-A、C-A、D-A和E-A
式A-A、B-A、C-A、D-A和E-A的化合物具有基团R2，其或与R1或与R3，与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环。可以认为可选取代的苯环与吡咯并苯二氮
Figure BDA00002257755900601
的C环稠合。稠合苯环可称为D环。该稠环的结构说明在下：
其中，D1、D2、D3和D4各自代表H或取代基。
在一个实施方式中，苯环是未取代的。
在一个实施方式中，苯环用选自OH、CN、R、OR、O-SO2-R、CO2R、COR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素中的四种基团中的一个、两个、三个取代。
在一个实施方式中，苯环为单取代。单取代基可以为D1、D2、D3或D4中的任何一种（其余为H）。在一个实施方式中，苯环在D2取代，D1、D3和D4各自为H。在一个实施方式中，苯环在D3取代，D1、D2和D4各自为H。
在一个实施方式中，R2与R1，与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环。
对于V和W的优选在下面列出。
A-B、B-B、C-B、D-B和E-B
在一个实施方式中，在T为NR、BH、SO或SO2时，U是CH2。
在一个实施方式中，在U为是NR、O或S时，T是CH2或CO。
在一个实施方式中，T独立地选自CH2和CO。
在一个实施方式中，T独立地选自NR、O和S。
在一个实施方式中，Y是(CH2)n，其中，n是1或2。
在一个实施方式中，化合物A-B的C环具有选自在下面示出的那些中的结构：
Figure BDA00002257755900611
V和W
V和W各自选自(CH2)n、O、S、NR、CHR和CRR’，其中n为2、3或4，除了在R1和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环时V为C，且在R3和R2与它们所连接的C环的碳原子一起形成可选取代的苯环时，W为C。
在一个实施方式中，在V和W中的一个是C时，V和W中的另一个选自CH2和NR
在一个实施方式中，在V和W中的一个是C时，V和W中的另一个为CH2。
二聚体化合物
在一个实施方式中，本发明的第一个方面的结合物、化合物C、化合物D和化合物E各自为二聚体。
结合物
在一个实施方式中，结合物为每个单体是式（A）的二聚体。
在一个实施方式中，结合物为每个单体是式（A）的二聚体，且该化合物具有显示在下的结构：
Figure BDA00002257755900612
其中，分别根据R2、R6、R7、R9、R10、X、和R11来定义R2”、R6”、R7”、R9”、R10”、X”、Q”和R11”。
在一个实施方式中，结合物为每个单体是式（A）的二聚体，且该化合物具有显示在下的结构：
Figure BDA00002257755900621
其中，分别根据R2、R6、R7、R9、R10、X、和R11来定义R2”、R6”、R7”、R9”、R10”、X”、Q”和R11”，而RC是封端基团。在一个实施方式中，R10是与细胞结合剂结合的接头。
在一个实施方式中，结合物为一个单体是式（A）而另一个单体是式（B）的二聚体。
在一个实施方式中，结合物为一个单体是式（A）而另一个单体是式（B）的二聚体，且该化合物具有显示在下的结构：
Figure BDA00002257755900622
其中，分别根据R2、R6、R7、R9、X和R11来定义R2”、R6”、R7”、R9”、X”和R11”，
在一个实施方式中，结合物为每个单体是式（A）的二聚体，且基团R2、R6、R9、X、R11以及R7和R8在适当的时候是相同的。
在一个实施方式中，结合物为每个单体是式（A）的二聚体，且基团R2、R6、R9、X、R10以及R7和R8在适当的时候是相同的。这样的化合物可以称为对称二聚体。
在一个实施方式中，结合物为一个单体是式（A）而另一个单体是式（B）的二聚体，且（A）的基团R2、R6、R9以及R7和R8在适当的时候与化合物（B）的那些相同。
对于以上的各个二聚体化合物，式（A）或（B）的单体可以用如本文所描述的式（A-I)或（B-I）单体代替。
化合物C
在一个实施方式中，化合物C为二聚体。
在一个实施方式中，化合物C具有显示在下的结构：
Figure BDA00002257755900631
其中，分别根据R2、R6、R7、R9和X来定义R2”、R6”、R7”、R9”和X”。
化合物D
在一个实施方式中，D是二聚体。
在一个实施方式中，化合物D具有显示在下的结构：
Figure BDA00002257755900632
其中，分别根据R2、R6、R7、R9、Q、R11和X来定义R2”、R6”、R7”、R9”、Q”、R11”和X”。
化合物E
在一个实施方式中，化合物E为二聚体。
在一个实施方式中，化合物E具有显示在下的结构：
Figure BDA00002257755900633
其中，分别根据R2、R6、R7、R9、R11、RL、和X来定义R2”、R6”、R7”、R9”、R11”、RL”、Q”和X”。
在一个实施方式中，化合物E具有显示在下的结构：
Figure BDA00002257755900641
其中，分别根据R2、R6、R7、R9、R11、和X来定义R2”、R6”、R7”、R9”、R11”、Q”和X”。RC为帽化基团。
在一个实施方式中，化合物E具有显示在下的结构：
Figure BDA00002257755900642
其中，分别根据R2、R6、R7、R9和X来定义R2”、R6”、R7”、R9”和X”。
单体化合物
在一个实施方式中，本发明的第一个方面的结合物，化合物C、化合物D和化合物E是单体。
在一个实施方式中，式（C）、（D）或（E）的结合物或化合物可以用如本文描述的式（A-I）、（C-I）、（D-I）或（E-I）的单体代替。
Rc，帽化基团
本发明的第一个方面的结合物可具有N10位置的帽化基团RC。化合物E可能具有帽化基团RC。
在一个实施方式中，其中结合物为每个单体是式（A）的二聚体，并且在单体单元中的一个中的基团R10是帽化基团RC或基团R10。
在一个实施方式中，其中结合物为每个单体是式（A）的二聚体，并且在单体单元中的一个中的基团R10是帽化基团RC。
在一个实施方式中，其中结合物为每个单体是式（E）的二聚体，在单体单元中的一个中的基团RL为帽化基团RC或是用于与细胞结合剂连接的接头。
在一个实施方式中，其中结合物为每个单体是式（E）的二聚体，在单体单元中的一个中的基团RL为帽化基团RC。
基团RC可从PBD部分的N10位置去除，以留下N10-C11亚胺键、甲醇胺、取代的甲醇胺，其中QR11是OSO3M、亚硫酸氢盐加合物、硫代甲醇胺、取代的硫代甲醇胺或取代的甲醇胺（carbinalamine）。
在一个实施方式中，RC可以是可去除的保护基团，以留下N10-C11亚胺键、甲醇胺、取代的甲醇胺，或其中，QR11是OSO3、亚硫酸氢盐加合物。在一个实施方式中，RC是可去除的保护基团，以留下N10-C11亚胺键。
预期基团Rc在与这些去除基团R10所要求的相同条件下可去除，例如以产生N10-C11亚胺键、甲醇胺等。帽化基团（封端基团）在N10位置用作用于预期的官能度的保护基团。预期帽化基团对细胞结合剂是没有反应性的。例如，RC与RL不同。
具有帽化基团的化合物可用作合成具有亚胺单体的二聚体的中间体。替换地，具有帽化基团的化合物可用作结合物，其中帽化基团可在靶位置去除以产生亚胺、甲醇胺、取代的甲醇胺等。因此，在该实施方式中，帽化基团可以称为治疗上可去除的氮保护基团，如在发明人的较早申请WO00/12507中所定义的。
在一个实施方式中，基团RC可在断开基团R10的接头RL的条件下去除。在一个实施方式中，帽化基团在酶的作用下可断裂。
在替换的实施方式中，帽化基团可在接头RL与细胞结合剂连接之前去除。在该实施方式中，帽化基团可在不断裂接头RL的条件下去除。
在化合物包括官能团G1以形成与细胞结合剂的连接时，帽化基团在加入或暴露G1之前是可去除的。
帽化基团可以用作部分的保护基团策略，以确保二聚体中仅一个单体单元与细胞结合剂连接。
帽化基团可用作N10-C11亚胺键的遮蔽物。帽化基团可在如要求化合物中的亚胺官能度时去除。帽化基团还是用于如上所描述的甲醇胺、取代的甲醇胺，和亚硫酸氢盐加合物的遮蔽物。
RC可以为N10保护基团，如这些在发明人的较早申请WO 00/12507中所描述的基团。在一个实施方式中，RC是治疗上可去除的氮保护基团，如在发明人的较早申请WO 00/12507中所定义的。
在一个实施方式中，RC为氨基甲酸酯保护基团。
在一个实施方式中，氨基甲酸酯保护基团选自：
Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Cbz和PNZ。
可选地，氨基甲酸酯保护基团进一步选自Moc。
在一个实施方式中，RC为缺少用于与细胞结合剂连接的官能团的接头基团RL。
本申请尤其关注为氨基甲酸酯的那些RC基团。
在一个实施方式中，RC为以下基团：
Figure BDA00002257755900661
其中，星号表示与N10位置的连接点，G2是末端基团，L3是共价键或可断裂的接头L1，L2是共价键或者与OC(＝O)一起形成自脱落接头。
其中，L3和L2均是共价键，G2和OC(=O)一起形成如上面所定义的氨基甲酸酯保护基团。
L1和L2如有关于R10所定义的。
L2如有关于R10所定义的。
各种末端基团描述如下，包括基于所熟知的保护基团的那些。
在一个实施方式中，L3是可断裂的接头L1，和L2，与OC(=O)一起形成自脱落接头。在该实施方式中，G2是Ac(乙酰)或Moc，或者氨基甲酸酯保护基团，选自：
Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Cbz和PNZ。
可选地，氨基甲酸酯保护基团进一步选自Moc。
在另外的实施方式中，G2是酰基-C(=O)G3，其中，G3选自烷基（包括环烷基、烯基和炔基）、杂烷基、杂环基和芳基（包括杂芳基和羰芳基（carboaryl））。这些基团是可以可选取代的。在适当的时候，酰基与L3或L2的氨基一起可形成酰胺键。在适当的时候，该酰胺键与L3或L2的羟基一起可形成酯键。
在一个实施方式中，G3为杂烷基。烷基可能包括聚乙二醇。烷基可能具有与酰基毗连的杂原子，如O或N，从而与适当地存在于L3或L2基团中的杂原子形成适当的氨基甲酸酯或碳酸酯基团。
在一个实施方式中，G3独立地选自NH2、NHR和NRR’。优选地，G3是NRR’。
在一个实施方式中，G2是以下基团：
Figure BDA00002257755900662
其中星号表示与L3的连接点，n是0至6，以及G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、NH2、NHR、NRR’、NO2和卤素。基团OH、SH、NH2和NHR是受保护的。在一个实施方式中，n为1至6，且优选n为5。在一个实施方式中，G4是OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’，和NRR’。在一个实施方式中，G4是OR、SR和NRR’。优选地，G4选自OR和NRR’，最优选G4是OR。最优选地，G4是OMe。
在一个实施方式中，基团G2是：
Figure BDA00002257755900671
其中，星号表示与L3的连接点，而n和G4如上所定义的。
在一个实施方式中，基团G2是：
Figure BDA00002257755900672
星号表示与L3的连接点，n是0或1，m是0至50，G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、NH2、NHR、NRR’、NO2和卤素。在优选的实施方式中，n是1，而m是0至10、1至2，优选4至8，并且最优选4或8。在另一个实施方式中，n是1而m为0至50，优选20至40。基团OH、SH、NH2和NHR是受保护的。在一个实施方式中，G4是OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’和NRR’。在一个实施方式中，G4是OR、SR和NRR’。优选地，G4选自OR和NRR’，最优选G4是OR。优选地，G4是OMe。
在一个实施方式中，基团G2是：
Figure BDA00002257755900673
其中，星号表示与L3的连接点，而n、m和G4如上面所定义的。
在一个实施方式中，基团G2是：
Figure BDA00002257755900674
其中，n是1-20，m是0-6，G4选自OH、OR、SH、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、NH2、NHR、NRR’、NO2和卤素。在一个实施方式中，n是1-10。在另外的实施方式中，n是10至50，优选20至40。在一个实施方式中，n是1。在一个实施方式中，m是1。基团OH、SH、NH2和NHR是受保护的。在一个实施方式中，G4是OR、SR、COOR、CONH2、CONHR、CONRR’、和NRR’。在一个实施方式中，G4是OR、SR和NRR’。优选地，G4选自OR和NRR’，最优选G4是OR。优选地，G4是OMe。
在一个实施方式中，基团G2是：
Figure BDA00002257755900681
其中，，星号表示与L3的连接点，而n、m和G4如上面所定义的。
在以上每个实施方式中，G4可以为OH、SH、NH2和NHR。这些基团优选是受保护的。
在一个实施方式中，OH用Bzl、TBDMS或TBDPS保护。
在一个实施方式中，SH用Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me或Trt保护。
在一个实施方式中，NH2或NHR用Boc、Moc、Z-Cl、Fmoc、Z，或Alloc保护。
在一个实施方式中，基团G2与为二肽的基团L3结合存在。
帽化基团不预期与细胞结合剂连接。因此，存在于二聚体中的其他单体用作经由接头与细胞结合剂连接的点。因此，优选存在于帽化基团中的官能度不可用于与细胞结合剂的反应。因此，优选避免反应性官能团如OH、SH、NH2、COOH。然而，如上所描述的，如果这样的官能度是受保护的，则可存在于帽化基团中。
在本发明化合物的制备中，帽化基团可用于制备接头RL。
抗体-药物结合物（ADC）化合物的示例性实施方式包括抗体（Ab），和PBD药物部分（PBD），其中该抗体通过接头部分（L）与PBD连接；该组合物具有下式：
Ab-(L-PBD)p
其中，p是从1至约8的整数，并且代表药物负载。如果Ab是半胱氨酸改造抗体，可经巯基反应性接头部分结合的药物部分的数量对于抗体分子可由通过本文中所描述的方法所引入的半胱氨酸残基的数量来限制。示例性ADC因此包括具有1、2、3，或4个修饰的半胱氨酸氨基酸的抗体。
优选化合物
在一个实施方式中，结合物是每个单体具有C2亚甲基的二聚体，即每个R2是=CH2。优选细胞结合剂为抗体。
在另外的实施方式中，结合物是每个单体具有C2芳基的二聚体，即每个R2为可选取代的C5-20芳基。优选细胞结合剂是抗体。
C2亚烷基
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900691
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，以及n为0或1。L1和L2如先前所定义的，并且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900692
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，以及n为0或1。L1、L2和G2如先前所定义的，并且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900701
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，以及n为0或1。L1如先前所定义的，并且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，以及n为0或1。L1如先前所定义的，并且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，以及n为0或1。L1如先前所定义的，并且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900712
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，以及n为0或1。L1如先前所定义的，并且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
对于以上每种化合物，下列优选在适当的时候可应用：
n是0；
n是1；
RE是H；
RE是RD，其中RD为可选地取代的烷基；
RE是RD，其中RD是甲基；
CBA是抗体；
CBA是环肽；
L1是或包括二肽；
L1是(H2N)-Val-Ala-(CO)或(H2N)-Phe-Lys-(CO），其中(H2N)和(CO)各自指示N和C端；
L2是p-氨基苄叉基（p-aminobenzylene）；
G2选自Alloc、Fmoc、Boc、Troc、Teoc、Psec、Cbz和PNZ。
除上面的优选之外，还可以应用下列优选：
G2是：
Figure BDA00002257755900721
其中，星号表示与L1的N端的连接点；
A是：
其中，星号表示与L1的N端的连接点，波形线表示与细胞结合剂的连接点，而m是4或8；
A是
Figure BDA00002257755900723
其中，星号表示与L1的N端的连接点，波形线表示与细胞结合剂的连接点，而m是4或8。
在尤其优选的实施方式中，n是1；RE是H；CBA是抗体；L1是(H2N)-Val-Ala-(CO)或(H2N)-Phe-Lys-(CO），其中(H2N)和(CO)指示各自的N和C端；L2是p-aminobenzylene；G2是：
其中，星号表示与L1的N端的连接点，而A为：
Figure BDA00002257755900731
其中，星号表示与L1的N端的连接点，而波形线表示与细胞结合剂的连接点。
C2芳基
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900732
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，L1和L2如先前所定义的，Ar1和Ar2各自独立地是可选取代的C5-20芳基，而n是0或1。Ar1和Ar2可以是相同或不同的。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900733
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，L1、L2和G2如先前所定义的，Ar1和Ar2各自独立地是可选取代的C5-20芳基，而n是0或1。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900741
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，L1如先前所定义的，Ar1和Ar2各自独立地是可选取代的C5-20芳基，而n是0或1。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900742
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，L1如先前所定义的，Ar1和Ar2各自独立地是可选取代的C5-20芳基，而n是0或1。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900751
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，而n是0或1。L1如先前所定义的，Ar1和Ar2各自独立地是可选取代的C5-20芳基，而n是0或1。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900752
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，而n是0或1。L1如先前所定义的，Ar1和Ar2各自独立地是可选取代的C5-20芳基，而n是0或1。
在一个实施方式中，Ar1和Ar2在以上每个实施方式中各自独立地选自可选取代的苯基、呋喃基、苯硫基和吡啶基。
在一个实施方式中，Ar1和Ar2在以上每个实施方式中为可选地取代的苯基。
在一个实施方式中，Ar1和Ar2在以上每个实施方式中为可选取代的噻吩-2-基或噻吩-3-基。
在一个实施方式中，Ar1和Ar2在以上每个实施方式中为可选取代的喹啉基或异喹啉基。
喹啉基或异喹啉基基团可通过任何可用的环位置与PBD核结合。例如，喹啉基可以是喹啉基-2-基、喹啉基-3-基、喹啉基-4-基、喹啉基-5-基、喹啉基-6-基、喹啉基-7-基和喹啉基-8-基。这些中可优选喹啉-3-基和喹啉-6-基。异喹啉基可以为异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。这些中可优选异喹啉-3-基和异喹啉-6-基。
C2乙烯基
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900761
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，L1如先前所定义的，RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基（其苯基可以可选地用氟取代，尤其是在4-位置）以及C5-6杂环基，而n是0或1。RV1和RV2可以是相同的或不同的。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900762
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，L1、L2和G2如先前所定义的，RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基（其苯基可以可选地用氟取代，尤其是在4位置）以及C5-6杂环基，而n是0或1。RV1和RV2可以是相同的或不同的。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900771
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，L1如先前所定义的，RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基（其苯基可以可选地用氟取代，尤其是在4位置）以及C5-6杂环基，而n是0或1。RV1和RV2可以是相同的或不同的。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900772
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，L1、L2和G2如先前所定义的，RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基（其苯基可以可选地用氟取代，尤其是在4位置）以及C5-6杂环基，而n是0或1。RV1和RV2可以是相同的或不同的。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900781
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，而n是0或1。L1如先前所定义的，RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基（其苯基可以可选地用氟取代，尤其是在4-位置）以及C5-6杂环基，而n是0或1。RV1和RV2可以是相同的或不同的。
在一个实施方式中，结合物为以下化合物：
Figure BDA00002257755900782
其中CBA是细胞结合剂，如抗体或环状或线性肽，而n是0或1。L1如先前所定义的，RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基（其苯基可以可选地用氟取代，尤其是在4-位置）以及C5-6杂环基，而n是0或1。RV1和RV2可以是相同的或不同的。
在上面的一些实施方式中，RV1和RV2可独立地选自H、苯基和4-氟代苯基。
优选中间体
本发明还提供用于制备本文所描述的结合物化合物的中间体。
优选的中间体描述如下，并且与上面描述的结合物紧密相符。
在一个实施方式中，中间体为以下化合物：
Figure BDA00002257755900791
其中，n是0或1，G1、L1和L2如先前所定义的，且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在一个实施方式中，中间体为以下化合物：
Figure BDA00002257755900792
其中，G1、L1和L2如先前所定义的，Ar1和Ar2各自独立地为可选取代的C5-20芳基，而n是0或1。Ar1和Ar2可以是相同的或不同的。
在一个实施方式中，中间体为以下化合物：
Figure BDA00002257755900793
其中，G1、L1和L2如先前所定义的，RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基（其苯基可以可选地用氟取代，尤其是在4位置）以及C5-6杂环基，而n是0或1。RV1和RV2可以是相同的或不同的。
在一个实施方式中，中间体为以下化合物：
Figure BDA00002257755900801
其中，n是0或1，L1如先前所定义的，且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在一个实施方式中，中间体为以下化合物：
Figure BDA00002257755900802
其中，L1如先前所定义的，Ar1和Ar2各自独立地为可选取代的C5-20芳基，而n是0或1。
在一个实施方式中，中间体为以下化合物：
Figure BDA00002257755900811
其中，L1如先前所定义的，且RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基（其苯基可以可选地用氟取代，尤其是在4-位置）以及C5-6杂环基，而n是0或1。RV1和RV2可以是相同的或不同的。
在一个实施方式中，中间体为以下化合物：
Figure BDA00002257755900812
其中，n是0或1，L1如先前所定义的，且RE和RE”各自独立地选自H或RD。
在一个实施方式中，中间体为以下化合物：
Figure BDA00002257755900821
其中，n是0或1，L1如先前所定义的，Ar1和Ar2各自独立地为可选地取代的C5-20芳基，而n是0或1。
在一个实施方式中，中间体为以下化合物：
Figure BDA00002257755900822
其中，L1如先前所定义的，且RV1和RV2独立地选自H、甲基、乙基和苯基（其苯基可以可选地用氟取代，尤其是在4-位置）以及C5-6杂环基，而n是0或1。RV1和RV2可以是相同的或不同的。
取代基
如本文中使用的术语“可选取代的”属于可以是未取代的或取代的母核基团（parent group）。
除非另有说明，如本文中使用的术语“取代的”，属于含有一个或多个取代基的母核基团。术语“取代基”在本文中以常规含义使用并且指的是共价连接或如果适当稠合至母核基团的化学部分。众多取代基是熟知的，而用于它们的形成和引入到各种母核基团的方法也是熟知的。
在优选的实施方式中，本文中所描述的取代基（其包括可选的取代基）限于对细胞结合剂没有反应性的这些基团。在目前的情况下，与细胞结合剂的连接通过接头基团（包括，例如，L1、L2和A）由PBD化合物的N10位置与细胞结合剂来形成。位于PBD结构的其他部分的反应性官能团可能能够形成与细胞结合剂的另外的键（这可以称为交联）。这些另外的键可能改变结合物的转运和生物活性。因此，在一些实施方式中，另外的取代基限于缺乏反应性官能度的那些。
在一个实施方式中，取代基选自由R、OR、SR、NRR’、NO2、卤素、CO2R、COR、CONH2、CONHR，和CONRR’所组成的组。
在一个实施方式中，，取代基选自由R、OR、SR、NRR’、NO2、CO2R、COR、CONH2、CONHR，和CONRR’所组成的组。
在一个实施方式中，取代基选自由R、OR、SR、NRR’、NO2和卤素所组成的组。
在一个实施方式中，取代基选自选自由R、OR、SR、NRR’和NO2所组成的组。
上面提及的实施方式中的任何一个可应用于本文所描述的任何一种取代基。替换地，取代基可以选自在下面列出的一种或多种基团。
取代基的实例在下面更加详细地描述。
C1-12烷基：如本文中使用的术语“C1-12烷基”属于由从具有1至12个碳原子的烃化合物的碳原子去除氢原子所获得的单价部分，其可以是脂族或脂环族的，并且其可以是饱和或不饱和的（例如部分不饱和、完全不饱和）。因此，术语“烷基”包括在下面讨论的亚类烯基、炔基、环烷基等。
饱和烷基的实例包括，但不限于甲基（C1）、乙基（C2）、丙基（C3）、丁基（C4）、戊基（C5）、己基（C6）和庚基（C7）。
饱和线性烷基的实例包括，但不限于甲基（C1）、乙基（C2）、正丙基（C3）、正丁基（C4）、正戊基（C5）、正己基（C6）和正庚基（C7）。
饱和支链烷基的实例包括异丙基（C3）、异丁基（C4）、仲丁基（C4），叔丁基（C4）、异戊基（C5）和新戊基（C5）。
烷基可以可选地被被一个或多个选自O、N(H)和S的杂原子中断。这样的基团可以称为“杂烷基”。
C2-20杂烷基：如本文中使用的术语“C2-12杂烷基”属于由从具有2至12个碳原子和一个或多个选自O、N(H)和S，优选O和S的杂原子的烃化合物的碳原子去除氢原子所获得的单价部分。
杂烷基的实例包括，但不限于包括一个或多个-(OCH2CH2)-型的乙二醇单元。烷基的末端可以为杂原子的主要形式，例如-OH、-SH或-NH2。在优选的实施方式中，末端是-CH3。
C2-12烯基：如本文中使用的术语“-C2-12烯基”属于具有一个或多个碳－碳双键的烷基。
不饱和烯基的实例包括，但不限于，乙烯基（次乙基，-CH=CH2）、1-丙烯基（-CH=CH-CH3）、2-丙烯基（烯丙基，-CH-CH=CH2）、异丙烯基（1-甲基乙烯基，-C(CH3)=CH2)、丁烯基（C4）、戊烯基（C5）和己烯基（C6）。
C2-12炔基：如本文中使用的术语“C2-12炔基”属于具有一个或多个碳－碳三键的烷基。
不饱和炔基的实例包括，但不限于乙炔基（-C≡CH）和2-丙炔基（炔丙基proparia，-CH2-C≡CH）。
C3-12环烷基：如本文中使用的术语“C3-12环烷基”属于也是环烷基的烷基；也就是，由从环烃（碳环的）化合物的脂环原子去除氢原子所获得的单价部分，其部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。
环烷基的实例包括，但不限于，源于以下的那些：
饱和单环烃化合物：
环丙烷（C3）、环丁烷（C4）、环戊烷（C5）、环己烷（C6）、环庚烷（C7）、甲基环丙烷（C4）、二甲基环丙烷（C5）、甲基环丁烷（C5）、二甲基环丁烷（C6）、甲基环戊烷（C6）、二甲基环戊烷（C7）和甲基环己烷（C7）；
不饱和单环烃化合物：
环丙烯（C3）、环丁烯（C4）、环戊烯（C5）、环己烯（C6）、甲基环丙烯（C4）、二甲基环丙烯（C5）、甲基环丁烯（C5）、二甲基环丁烯（C6）、甲基环戊烯（C6）、二甲基环戊烯（C7）和甲基环己烯（C7）；和
饱和多环烃化合物：降蒈烷（norcarane）（C7）、原蒎烷（norpinane）（C7）、降莰烷（C7）。
C3-20杂环基：如本文中使用的术语“C3-20杂环基”属于由从杂环化合物的环原子去除氢原子所获得的单价部分，该部分具有3至20个环原子，其中的1至10个为环杂原子。优选地，每个环具有3至7个环原子，其中的1至4个位杂原子。
在该背景下，前缀（例如C3-20、C3-7、C5-6等）。表示环原子的数量，或环原子的数量的范围，无论碳原子还是杂原子。例如，如本文中使用的术语“C5-6环烷基”属于具有5或6个环原子的杂环基。
单环杂环基的实例包括，但不限于，源于以下的那些：
N1：氮丙啶（C3）、吖丁啶（C4）、吡咯烷（四氢吡咯）（C5）、吡咯啉（例如3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯）（C5）、2H-吡咯或3H-吡咯（异吡咯（isopyrrole、isoazole））（C5）、哌啶（C6）、二氢吡啶（C6）、四氢吡啶（C6）、氮杂卓（C7）；
O1：环氧乙烷（C3）、环氧丙烷（C4）、oxolane（四氢呋喃）（C5）、呋喃（oxole）（二氢呋喃）（C5）、噁烷（四氢吡喃）（C6）、二氢吡喃（C6）、吡喃（C6）、噁庚（oxepin）（C7）；
S1：硫杂丙环（C3）、噻呾（thietane）（C4）、硫杂环戊烷（四氢噻吩）（C5）、硫代环己烷（thiane）（四氢硫代噻喃）（C6）、硫代环庚烷（thiepane）（C7）；
O2：二氧戊烷（C5）、二噁烷（C6）和二氧杂环庚烷（C7）；
O3：三噁烷（C6）；
N2：咪唑啉（C5）、咪唑烷（C5）、咪唑啉（C5）、吡唑啉（二氢吡唑）（C5）、哌嗪（C6）；
N1O1：四氢噁唑（C5）、二氢噁唑（C5）、四氢异噁唑（C5）、二氢异噁唑（C5）、吗啉（C6）、四氢噁嗪（C6）、二氢噁嗪（C6）、噁嗪（C6）；
N1S1：噻唑啉（C5）、噻唑烷（C5）、硫吗啉（C6）；
N2O1：氧二氮芑（C6）；
O1S1：氧硫杂环戊吡咯（oxathiole）（C5）和噻噁烷（C6）；以及，
N1O1S1：噁噻嗪（C6）。
取代的单环杂环基的实例包括以环状形式的糖类，例如呋喃糖（C5）（如阿拉伯呋喃糖、来苏呋喃糖（lyxofuranose）、呋喃核糖和xylofuranse），以及吡喃糖（C6）（如阿洛糖、阿卓糖、吡喃葡萄糖、甘露吡喃糖、古洛糖、艾杜糖、吡喃半乳糖和塔罗糖）。
C5-20芳基：如本文中使用的术语“C5-20芳基”属于由从从芳香化合物的芳环原子去除氢原子所获得的单价部分，该部分具有3至20个环原子。优选地，每个环具有5至7个环原子。
在该背景下，前缀（例如C3-20、C5-7、C5-6等）表示环原子的数量，或环原子的数量的范围，无论碳原子还是杂原子。例如，如本文中使用的术语“C5-6芳基”，属于具有5或6个环原子的芳基。
环原子可以为如在“碳芳基（carboaryl）”中的所有碳原子。
碳芳基的实例包括，但不限于，源于苯（即苯基）（C6）、萘（C10）、甙菊环烃（azulene）（C10）、蒽（C14）、菲（C14）、萘并萘（C18）和芘（C16）的那些。
包括稠环的芳基的实例，包括稠环（其中的至少一个是芳环）包括，但不限于，源于茚满（例如。2,3-二氢-1H-茚）（C9）、茚（C9）、异茚（C9）、四氢化萘（1,2,3,4-四氢萘（C10））、苊（C12）、芴（C13）、菲（非那烯）（C13）、醋菲（acephenanthrene）（C15）和醋蒽（C16）的那些。
替换地，环原子可包括一种或多种杂原子，如同“杂芳基”。单环杂芳基的实例包括，但不限于，源于以下的那些：
N1：吡咯（氮杂茂）（C5）、吡啶（吖嗪）（C6）；
O1：呋喃（oxole）（C5）；
S1：噻吩（硫茂）（C5）；
N1O1：噁唑（C5）、异噁唑（C5）、isoxazine（C6）；
N2O1：噁二唑（furazan）（C5）；
N3O1：噁三唑（C5）；
N1S1：噻唑（C5）、异噻唑（C5）；
N2：咪唑（1,3-二唑）（C5）、吡唑（1,2-二唑）（C5）、哒唪（1,2-二嗪）（C6）、嘧啶（1,3-二嗪）（C6）（例如胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶）、吡嗪（pyrazine）（1,4-二嗪）（C6）；
N3：三唑（C5）、三嗪（C6）；以及，
N4：四唑（C5）。
包括稠环的杂芳基的实例包括，但不限于：
C9（具有2个稠环），源于苯并呋喃（O1）、异苯并呋喃（O1）、吲哚（N1）、异吲哚（N1）、吲嗪（N1）、二氢吲哚（N1）、异二氢吲哚（N1）、嘌呤（N4）（例如腺嘌呤、鸟嘌呤）、苯并咪唑（N2）、吲唑（N2）、苯并噁唑（N1O1）、苯异噁唑（N1O1）、苯并二茂（O2）、苯并呋咱（N2O1）、苯并三唑（N3）、苯并硫代呋喃（benzothiofuran）（S1）、苯并噻唑（N1S1）、
苯并噻二唑（benzothiadiazole）（N2S）；
C10（具有2个稠环），源于色烯（O1）、异色烯（O1）、色满（O1）、异色满（O1）、苯并二噁烷（O2）、喹啉（N1）、异喹啉（N1）、喹嗪（N1）、苯并噁嗪（N1O1）、苯并二嗪（N2）、吡啶并吡啶（N2）、喹噁啉（N2）、喹唑啉（N2）、噌啉（N2）、酞嗪（N2）、二氮萘（N2）、蝶啶（N4）；
C11（具有2个稠环）源于苯并二氮卓（N2）；
C13（具有3个稠环），源于咔唑（N1）、二苯并呋喃（O1）、二苯并噻吩（S1）、咔啉（N2）、萘嵌间二氮杂苯（perimidine）（N2）、吡啶并吲哚（N2）；以及，
C14（具有3个稠环），源于吖啶（N1）、夹氧杂蒽（xanthene）（O1）、噻吨（S1）、牛蒽烯（oxanthrene）（O2）、吩噻噁（O1S1）、吩嗪（N2）、吩噁嗪（N1O1）、吩噻嗪（N1S1）、噻蒽（S2）、菲啶（N1）、菲咯啉（N2）、吩嗪（N2）中获取。
上面的基团，无论单独还是另外的取代基的部分，可它们自己可选地用一种或多种选自它们自己的基团和以下列出的另外的取代基取代。
卤素：-F、-氯、-Br以及-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R是醚取代基，例如，C1-7烷基（也称为在下面讨论的C1-7烷氧基）、C3-20杂环基（也称为C3-20杂环基氧基）或C5-20芳基（也称为C5-20芳氧基），优选C1-7烷基。
烷氧基：-OR，其中R是烷基，例如，C1-7烷基。C1-7烷氧基的实例包括，但不限于，-OMe（甲氧基）、-OEt（乙氧基）、-O(nPr)（正丙氧基）、-O(iPr)（异丙氧基）、-O(nBu)（正丁氧基）、-O(sBu)（仲丁氧基）、-O（iBu）（异丁氧基），和-O(tBu)（叔丁氧基）。
缩醛：-CH(OR1)(OR2)，其中R1和R2独立地是缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，或在“环状”缩醛基团的情况下，R1和R2与它们所连接的两个氧原子，以及它们所连接的碳原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括，但不限于，-CH(Me)2、-CH(OEt)2、以及-CH(OMe)(OEt)。
半缩醛：-CH(OH)(OR1)，其中R1是半缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括，但不限于，-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。缩酮：-CR(OR1)(OR2)，其中R1和R2如对于缩醛所定义的，而R是除氢之外的缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。缩酮基团的实例包括，但不限于，-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2、以及-C(Et)(OMe)(OEt)。
半酮缩：-CR(OH)(OR1)，其中R1如对于半缩醛所定义的，R是除氢之外的半酮缩取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括，但不限于，-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)，以及-C(Et)(OH)(OEt)。
氧代（酮类的（keto），-酮（one））：=O。
硫酮（硫酮（thioketone））：=S。
亚胺基（Imino）（亚胺）：=NR，其中R是亚胺基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酯基团的实例包括，但不限于=NH、=NMe、=NEt和=NPh。
甲酰基（甲醛（carbaldehyde，carboxaldehyde）：-C(=O)H。
酰基（酮类的（keto））：-C(=O)R，其中R是酰基取代基，例如，C1-7烷基（也称为C1-7烷酰基或C1-7alkanoyl）、C3-20杂环基（也称为C3-20杂环酰基）或C5-20芳基（也称为C5-20芳酰基），优选C1-7烷基。酰基的实例包括，但不限于，-C(=O)CH3（乙酰基）、-C(=O)CH2CH3（丙酰基）、-C(=O)C(CH3)3（叔丁酰基）和-C(=O)Ph（苯甲酰基，酰苯）。
羧基（羧酸）：-C(=O)OH。
硫代羧基（硫代羧酸）：-C(=S)SH。
硫氢基羧基（Thiolocarboxy）（硫氢基羧酸（thiolocarboxylic acid））：-C(=O)SH。
硫代羰羧基（Thionocarboxy）（硫代羰羧酸（thionocarboxylic acid））：-C(=S)OH。
亚氨酸：-C(=NH)OH。
异羟肟酸：-C(=NOH)OH。
酯（羰化物、羧酸酯、氧基羰基）：-C(=O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括，但不限于，-C(=O)OCH3、-C(=O)OCH2CH3、-C(=O)OC(CH3)3和-C(=O)OPh。
酰氧基（反相酯（reverse ester））：-OC(=O)R，其中R是酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酰氧基的实例包括，但不限于，-OC(=O)CH3（乙酰氧基）、-OC(=O)CH2CH3、-OC(=O)C(CH3)3、-OC(=O)Ph和-OC(=O)CH2Ph。
氧基羰基氧基（Oxycarboyloxy）：-OC(=O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括，但不限于，-OC(=O)OCH3、-OC(=O)OCH2CH3、-OC(=O)OC(CH3)3和-OC(=O)OPh。
氨基：-NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基（也称为C1-7烷氨基或二-C1-7烷烷基）、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基，或在一个“环”氨基的情况下，R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。氨基可以是一元的（-NH2）、二元的（-NHR1）或三元的（-NHR1R2），在阳离子形式中，可以为四元的（-+NR1R2R3）。氨基的实例包括，但不限于，-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2，和-NHPh。环氨基的实例包括，但不限于氮杂环丙基（aziridino）、azetidino、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉代和硫代吗啉代。
酰氨基（氨基甲酰，氨甲酰，氨基羰基，羧酰胺（carboxamide））：-C(=O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如对于氨基所定义的。酰氨基的实例包括，但不限于，-C(=O)NH2、-C(=O)NHCH3、-C(=O)N(CH3)2、-C(=O)NHCH2CH3和-C(=O)N(CH2CH3)2，以及酰氨基，其中R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成杂环结构，如在，例如，哌啶代羰基、吗啉代羰基、硫代吗啉代羰基（thiomorpholinocarbonyl）和哌嗪代羰基中的。
硫代氨基（硫代氨甲酰基（Thiocarbamyl））：-C(=S)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如对于氨基所定义的。氨基的实例包括，但不限于，-C(=S)NH2、-C(=S)NHCH3、-C(=S)N(CH3)2和-C(=S)NHCH2CH3。
酰胺基（Acylamido）（酰氨基（acylamino））：-NR1C(=O)R2，其中R1是酰胺取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基，以及R2是酰取代基，例如，C1-7烷基，C3-20杂环基，或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酰胺基团的实例包括，但不限于-NHC(=O)CH3、-NHC(=O)CH2CH3和-NHC(=O)Ph。R1和R2可一起形成环结构，如在，例如琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和酞内酰胺中的：
Figure BDA00002257755900891
琥珀酰亚胺基     马来酰亚胺基  邻苯二甲酰亚胺基
氨基羰基氧基：-OC(=O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如对于氨基所定义的。氨基羰基氧基的实例包括，但不限于-OC(=O)NH2、-OC(=O)NHMe、-OC(=O)NMe2和-OC(=O)NEt2。
脲基：-N(R1)CONR2R3，其中R2和R3独立地是氨基取代基，如对于氨基所定义的，而R1是脲基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。脲基的实例包括，但不限于，-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2和-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(=NH)NH2。
四唑基：具有四个氮原子和一个碳原子的五元芳环，
Figure BDA00002257755900901
亚胺基：=NR，其中R是亚胺基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。亚胺基的实例包括，但不限于=NH、=NMe和=NEt。
脒（脒基）：-C(=NR)NR2，其中每个R是脒取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。脒基的实例包括，但不限于-C(=NH)NH2、-C(=NH)NMe2和-C(=NMe)NMe2。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基（腈（nitrile，carbonitrile））：-CN。
异氰：-NC。
氰氧基：-OCN。
异氰氧基：-NCO。
硫氰基（硫氰酸根合（thiocyanato））：-SCN。
异硫氰基（异硫氰酸根合（isothiocyanato））：-NCS。
巯基（硫醇，巯氢基）：-SH。
硫醚（硫化物）：-SR，其中R是硫醚取代基，例如，C1-7烷基（也称为C1-7烷硫基（alkylthio））、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。烷硫基的实例包括，但不限于-SCH3和-SCH2CH3。
二硫化物：-SS-R，其中R是二硫化物取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基（本文制中也称为C1-7烷基二硫化物）。烷基二硫化物的实例包括，但不限于-SSCH3和-SSCH2CH3。
硫肟（亚磺酰基，亚砜）：-S(=O)R，其中R是硫肟取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫肟基的实例包括，但不限于，-S(=O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
砜（磺酰基）：-S(=O)2R，其中R是砜取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，包括，例如，氟化的或全氟化（perfluorinated）的C1-7烷基。砜基团的实例包括，但不限于，-S(=O)2CH3（甲基磺酰基，甲磺酰）、-S(=O)2CF3（三氟甲磺酰基，triflyl）、-S(=O)2CH2CH3（esyl）、-S(=O)2C4F9（nonaflyl）、-S(=O)2CH2CF3（tresyl）、-S(=O)2CH2CH2NH2（牛磺酰基（tauryl））、-S(=O)2Ph（苯磺酰基、besyl）、4-甲基苯磺酰基（甲苯磺酰基）、4-氯苯磺酰（closyl）、4-溴本磺酰基（brosyl）、4-硝基苯基（nosyl）、2-萘磺酸盐/酯（naphthalenesulfonate）（napsyl），以及5-二甲氨基-萘亚甲基-1-基磺酸盐/酯（dansyl）。
亚磺酸（亚磺基）：-S(=O)OH、-SO2H。
磺酸（磺基）：-S(=O)2OH、-SO3H。
亚磺酸酯（sulflnic acid ester）：-S(=O)OR，其中R是亚磺酸酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酸酯基的实例包括，但不限于，-S(=O)OCH3（甲氧基亚磺酰基；亚磺酸甲酯）和-S(=O)OCH2CH3（乙氧基亚磺酰基；亚磺酸乙酯）。
磺酸酯（磺酸酯）：-S(=O)2OR，其中R是磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酸酯基的实例包括，但不限于，-S(=O)2OCH3（甲氧基磺酰基；磺酸甲酯）和-S(=O)2OCH2CH3（乙氧基磺酰基；磺酸乙酯）。
亚磺酰基氧基：-OS(=O)R，其中R是亚磺酰基氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酰基氧基的实例包括，但不限于，-OS(=O)CH3和-OS(=O)CH2CH3。
磺酰基氧基：-OS(=O)2R，其中R是磺酰基氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰基氧基的实例包括，但不限于-OS(=O)2CH3（甲磺酸酯（mesylate））和-OS(=O)2CH2CH3（乙磺酸酯（esylate））。
硫酸酯：-OS(=O)2OR，其中R是硫酸酯取代基，例如C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫酸酯基的实例包括，但不限于，-OS(=O)2OCH3和-SO(=O)2OCH2CH3。
氨磺酰（氨磺酰；亚磺酸酰胺；氨磺酰）：-S(=O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如对于氨基所定义的。氨磺酰基的实例包括，但不限于，-S(=O)NH2、-S(=O)NH(CH3)、-S(=O)N(CH3)2、-S(=O)NH(CH2CH3)、-S(=O)N(CH2CH3)2和-S(=O)NHPh。
氨亚磺酰基（sulflnamoyl；磺酸酰胺；氨苯磺胺）：-S(=O)2NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如对于氨基所定义的。亚磺酰氨基的实例包括，但不限于，-S(=O)2NH2、-S(=O)2NH(CH3)、-S(=O)2N(CH3)2、-S(=O)2NH(CH2CH3)、-S(=O)2N(CH2CH3)2和-S(=O)2NHPh。
磺氨基（Sulfamino）：-NR1S(=O)2OH，其中R1是氨基的取代基，如对于氨基所定义的。磺氨基的实例包括，但不限于，-NHS(=O)2OH和-N(CH3)S(=O)2OH。
亚磺酰氨基：-NR1S(=O)2R，其中R1是氨基取代基，如对于氨基所定义的，R是亚磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酰氨基的实例包括，但不限于，-NHS(=O)2CH3和-N(CH3)S(=O)2C6H5。
磺酰氨基：-NR1S(=O)R，其中R1是氨基的取代基，如对于氨基所定义的，R是磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰氨基的实例包括，但不限于，-NHS(=O)CH3和-N(CH3)S(=O)C6H5。
膦基（膦）：-PR2，其中R是膦基取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦基的实例包括，但不限于-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2和-P(Ph)2。
二氧膦基：-P(=O)2。
磷酰基（Phosphinyl）（膦氧化物（phosphine oxide））：-P(=O)R2，其中R是磷酰基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基或C5-20芳基。磷酰基的实例包括，但不限于-P(=O)(CH3)2、-P(=O)(CH2CH3)2、-P(=O)(t-Bu)2和-P(=O)(Ph)2。
膦酸基（phosphono）：-P(=O)(OH)2。
膦酸酯（phosphono ester）：-P(=O)(OR)2，其中，R是膦酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦酸酯的实例包括，但不限于-P(=O)(OCH3)2、-P(=O)(OCH2CH3)2、-P(=O)(O-t-Bu)2和-P(=O)(OPh)2。
磷酸（Phosphoric acid）（膦酰氧基）：-OP(=O)(OH)2。
磷酸酯（膦酰氧基酯）：-OP(=O)(OR)2，其中，R是磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酸酯基团的实例包括，但不限于-OP(=O)(OCH3)2、-OP(=O)(OCH2CH3)2、-OP(=O)(O-t-Bu)2和-OP(=O)(OPh)2。
亚磷酸：-OP(OH)2。
亚磷酸酯：-OP(OR)2，其中，R是亚磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酸酯基团的实例包括，但不限于-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2。
亚磷酰胺：-OP(OR1)-NR2 2，其中，R1和R2是亚磷酰胺取代基，例如，-H、（可选地取代的）C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酰胺基团的实例包括，但不限于-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
氨基磷酸酯（Phosphoramidate）：-OP(=O)(OR1)-NR2 2，其中，R1和R2是磷酰胺酯取代基，例如，-H、（可选地取代的）C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酰胺酯基团的实例包括，但不限于-OP(=O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(=O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(=O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
亚烃基
C3-12亚烃基：如本文中使用的术语“C3-12亚烃基”属于由从具有3至12个碳原子（除非另外说明）烃化合物（其可以是脂族或脂环的，且可以是饱和的、部分不饱和的，或完全不饱和的）的相同碳原子去除两个氢原子或两个不同碳原子各自去除一个氢原子所获得的二配位基（bidentate）部分。因此，术语“烷基”包括在下面讨论的亚类亚烯基、亚炔基、环亚烷基等。
线性饱和C3-12亚烃基的实例包括，但不限于，-(CH2)n-，其中n为3至12的整数，例如，-CH2CH2CH2-（亚丙基）、-CH2CH2CH2CH2-（亚丁基）、-CH2CH2CH2CH2CH2-（亚戊基）和-CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-（亚庚基）。
支链饱和C3-12亚烃基的实例包括，但不限于，-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-和-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
线性的部分不饱和C3-12亚烃基（C3-12亚烯基和亚炔基）的实例包括，但不限于，-CH=CH-CH2-、-CH2-CH=CH2-、-CH=CH-CH2-CH2-、-CH=CH-CH2-CH2-CH2-、-CH=CH-CH=CH-、-CH=CH-CH=CH-CH2-、-CH=CH-CH=CH-CH2-CH2-、-CH=CH-CH2-CH=CH-、-CH=CH-CH2-CH2-CH=CH-、和-CH2-C≡C-CH2-。
支链的部分不饱和C3-12亚烃基（C3-12亚烯基和亚炔基）的实例包括，但不限于，-C(CH3)=CH-、-C(CH3)=CH-CH2-、-CH=CH-CH(CH3)-和-C≡C-CH(CH3)-。
脂环饱和C3-12亚烃基（C3-12环亚烷基）的实例包括，但不限于，环亚戊基（例如环戊-1,3-亚基），和环亚己基（例如，环己-1,4-亚基）。
脂环的部分不饱和C3-12亚烃基（C3-12环亚烃基）的实例包括，但不限于，环亚戊烯基（cyclopentenylene）（例如4-环戊烯-1,3-亚基)、环亚己烯基（cyclohexenylene）（例如2-环己烯-1,4-亚基；3-环己烯-1,2-亚基；2,5-环己二烯-1,4-亚基)。
包括其他形式
除非另有说明，包含在上面的中的是熟知的离子、盐、溶剂合物以及这些取代基的保护形式。例如，羧酸（-COOH）所涉及的也包括其阴离子型（羰化物）形式（-COO-）、盐或溶剂合物，以及常规保护形式。同样，氨基所涉及的包括质子化形式（-N+HR1R2），氨基的盐或溶剂合物，例如，盐酸盐，以及氨基的常规保护形式。同样，羟基所涉及的也包括其阴离子型形式（-O-）、盐或溶剂合物，以及常规保护形式。
盐
可以方便或期望制备、纯化，和/或处理活性化合物的相应盐，例如药用盐。药用盐的实例在Berge,et al.,J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)中讨论。
例如，如果化合物是阴离子型，或具有可以是阴离子型的官能团（例如-COOH可以为-COO-），那么用合适的阳离子可以形成盐。合适的无机阳离子的实例包括，但不限于碱金属离子（如Na+和K+，碱土阳离子（如Ca2+和Mg2+）以及其他阳离子如Al+3。合适的有机阳离子的实例包括，但不限于，铵离子，即NH4 +和取代的铵离子（例如NH3R+，NH2R2 +，NHR3 +，NR4 +）。一些合适的取代的铵离子的实例为源于以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨基丁三醇，以及氨基酸类，如赖氨酸和精氨酸。通常的四元铵离子的例子是N(CH3)4 +。
如果化合物是阳离子型，或具有可以是阳离子型的官能团（例如-NH2可以-NH3 +），那么可与合适的阴离子形成盐。合适的无机阴离子的实例包括，但不限于，那些源于以下的无机酸：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。
合适的有机阴离子的实例包括，但不限于，那些源于以下的有机酸：2-乙酰氧基苯甲酸（2-acetyoxybenzoic）、醋酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、枸橼酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙磺酸、延胡索酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、羟乙酸、羟基马来酸、羟萘羧酸（hydroxynaphthalene carboxylic）、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、乙二酸、棕榈酸、巴莫酸（pamoic）、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸和缬草酸。合适的聚合有机阴离子的实例包括，但不限于，那些源于以下的聚合酸：鞣酸、羧甲基纤维素。
溶剂合物
可以方便或期望制备、纯化，和/或处理活性化合物的相应溶剂合物。术语“溶剂合物”在本文中以常规含义使用，以是指溶质（例如活性化合物、活性化合物的盐）与溶剂的复合物。如果溶剂是水，溶剂合物可方便地称为水合物，例如，单水合物、二水合物、三水合物等。
本发明包括溶剂增加跨PBD部分的亚胺键的化合物，以下说明在溶剂是水或醇（RAOH，其中RA是C1-4烷基）时：
Figure BDA00002257755900951
这些形式可以称为PBD（如上面有关于R10的部分中所描述的）甲醇胺和甲醇胺醚形式。这些平衡的平衡取决于发现化合物的条件，以及该部分自身的性质。
例如，这些特别的化合物通过，例如冷冻干燥可以以固体形式分离。
异构体
本发明的某些化合物可以以一种或多种特别的几何的、光学的、对映体、非对映异构体（diasteriomeric）、差向异构的（epimeric）、异位性的（atropic）、立体异构的、互变异构的、构象的，或形式存在，包括但不限于，顺-和反-式；E-和Z-形式；c-、t-，和r-形式；endo-和exo-形式；R-、S-，和meso-形式；D-和L-形式；d-和l-形式；（+）和（-）形式；酮-、烯醇l-，和烯醇化物-形式；syn-和anti-形式；顺错（synclinal-）和反错（anticlinal-）形式；α-和β-形式；轴向（axial）和赤道（equatorial）形式；船式、椅式、扭曲形、信封形，和半椅式；以及其组合，在下统称为“同分异构体”（或“同分异构形式”）。
术语“手性的”指的是具有镜像配对（mirror image partner）的非重叠性能的分子，而术语“非手性的”指的是与它们的镜像配对重叠的分子。
术语“立体异构体”指的是具有相同的化学结构，但关于原子或基团在空间的排列不同的化合物。
“非对映异构体”指的是具有两个或更多手性中心的，且分子不是彼此的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、波谱性质和反应性。非对映异构体的混合物可在高分辨率分析操作（如电泳和层析）下分离。
“对映异构体”指的是彼此的非重叠镜像的化合物的两个立体异构体。
本文使用的立体化学的定义和规则一般遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill BookCompany,New York;and Eliel,E.and Wilen,S.,“Stereochemistry of OrganicCompounds”,John Wiley & Sons,Inc.,New York,1994。预期本发明的化合物的所有立体异构的形式，包括但不限于，非对映异构体、对映异构体和阻转异构体，以及其混合物，如外消旋混合物，形成本发明的一部分。许多有机化合物以旋光形式存在，即它们具有旋转平面偏振光的平面的能力。在描述旋光化合物时，使用前缀D和L或R和S以表示分子关于其（多个）手性中心的绝对构型。采用前缀d和l或（+）和（-）以指示化合物的平面偏振光的旋转的符号，（-）或l意为化合物是左旋的。前缀为（+）或d的化合物为右旋的。对于给定的化学结构，除了它们是彼此的镜像，这些立体异构体相同。具体立体异构体还可以称为对映异构体，且这样的异构体的混合物经常被称为对映体混合物。对映异构体的50:50的混合物称为外消旋混合物或消旋物，其在化学反应或过程中没有立体选择性或立体专一性的时候可能发生。术语“外消旋混合物”和“消旋物”指的是两种对映体类的等摩尔的混合物，缺乏光学活性。
注意，除如以下对于互变异构形式所讨论的，特别从术语“异构体”中排除，如本文中使用的，是结构（或组成）异构体（即，。在原子之间的连接不同而不是仅是在空间的原子位置的异构体）。例如，甲氧基-OCH3所涉及的将不被当作其结构异构体，羟甲基，-CH2OH所涉及的。同样，邻氯苯基所涉及的将不被当作其结构异构体，间氯苯基所涉及的。不过，结构的分类所涉及的很可能包括属于该类（例如C1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正、异、仲和叔丁基；甲氧苯基包括邻、间和对甲氧苯基）的结构异构体形式。
上面的排除不属于互变异构形式，例如，酮-、烯醇-，和烯醇化物-形式，如在，例如，下面的互变异构对中：酮/烯醇（在下面说明）、亚胺/烯胺、酰胺/亚胺基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/enethiol、N-亚硝基/羟偶氮（hyroxyazo）和硝基/异硝基。
Figure BDA00002257755900971
酮类        烯醇           烯醇化物
术语“互变异构体”或“互变异构形式”指的是不同活力的结构异构体，这经由低能屏障是可互换的。例如，质子互变异构体（也称为质子转移互变异构体）包括经由质子迁移的互换，如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。化合价互变异构体包括一些连接电子的重组的变换。
注意，特别包含在术语“异构体”中的是具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，H可以为任何同位素形式，包括1H、2H（D）和3H（T）；C可以为任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可以为任何同位素形式，包括16O和18O；等。
可以合并到本发明的化合物中的同位素的实例，包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如，但不限于2H（氘，D）、3H（氚）、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl和125I。本发明各种同位素标记的化合物，例如合并入放射性同位素（如3H、13C和14C）的那些。这样的同位素标记的化合物可以用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术，如正电子发射层描记术（PET）或单光子发射型计算机体层摄影（SPECT），包括药物或底物组织分布试验或在对患者的放射性治疗。本发明氘标记或取代的治疗化合物可能已改善DMPK（药物代谢和药代动力学）性质，涉及分布、代谢和排泄（ADME）。用重同位素如氘取代可能产生某些引起更高代谢稳定性的治疗益处，例如增加体内半衰期或减少剂量需求。18F标记的化合物可用于PET或SPECT研究。本发明同位素标记的化合物和其前药一般可以通过实施在下面所描述的路线或实施例以及制备中所公开的操作，由易于取得的同位素标记的试剂取代非-同位素标记的试剂而制备。而且，用重同位素取代，尤其是氘（即2H或D)可能产生引起更高的代谢稳定性的治疗益处，例如增加的体内半衰期或减少的剂量需求或治疗指数的提高。应理解，认为在该背景下的氘为取代基。这样的重同位素的浓度，特别是氘，可以由同位素富集因子确定。在本发明的化合物中，不特别指定为特别的同位素的任何原子意指代表该原子的任何稳定同位素。
除非另有说明，特别的化合物所涉及的包括所有这样的同分异构形式，包括其（完全或部分）消旋和其他的混合物。用于制备（例如，不对称合成）和分离（例如分布结晶和色层方法）这样的同分异构形式的方法在本领域中是已知的或者容易地通过以已知的方式适应本文所教授的方法或已知的方法而获得。
生物活性
体外细胞增殖化验
通常，抗体药物结合物的细胞毒或抑制细胞活性通过以下测定：在细胞培养基中使具有受体蛋白质的哺乳动物细胞，例如HER2，与ADC的抗体接触；培养细胞约6小时至约5天的时间；然后测定细胞活力。基于细胞的体外测试用于测定本发明的ADC的活力（增殖）、细胞毒性和诱导凋亡（半胱天冬酶（caspase）激活）。
抗体药物结合物的体外有效性可以通过细胞增殖试验来测定。CellTiter-
Figure BDA00002257755900981
发光细胞活力试验（Luminescent Cell Viability Assay）是商业上可获得的（Promega公司，Madison，WI），基于甲虫类萤光素酶的重组表达的均一测试方法（美国专利第5583024；5674713和5700670号）。该细胞增殖测试基于所存在ATP的定量来确定培养物中的活性细胞的数量（Crouch et al(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88;US 6602677）。<CellTiter-
Figure BDA00002257755900982
Assay在96孔板中进行，使它易于自动高通量筛查（HTS）（Cree et al(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404）。均一测试操作涉及将单个试剂（CellTiter-
Figure BDA00002257755900983
Reagent）直接加入到在添加血清的培养基中培养的细胞中。细胞洗涤、去除培养基以及多个吸取步骤是不必需的。该系统检测出在加入反应物并混合后10分钟内在384-孔板中仅15个细胞/孔。细胞可以用ADC连续处理，或者可以处理它们并与ADC分开。通常，短暂处理，即3个小时的细胞显示与连续处理的细胞相同的有效性。
均一的“加入-混合-测定”格式导致细胞裂解并产生与所存在的ATP的量成比例的发光信号。ATP的量直接与培养物中所存在的细胞数量成比例。CellTiter-
Figure BDA00002257755900984
Assay产生“发光型”的发光信号，其由萤光素酶反应所生产，取决于细胞类型和所使用的基质具有通常大于五小时的半衰期。活细胞以相对发光单位（RLU）来反映。底物（甲虫萤光素（BeetleLuciferin））由重组萤火虫萤光素酶氧化脱羧，伴随ATP转化为AMP并产生光子。
体内有效性
本发明的抗体药物结合物的体内有效性可以通过老鼠的肿瘤异种移植研究来测定。例如，本发明的抗HER2ADC的体内有效性可以通过高表达HER2转基因的外植体鼠模型来测定。同种异体移植物从对
Figure BDA00002257755900985
治疗没有相应或相应很低的Fo5mmtv转基因鼠增殖。以某剂量水平（mg/kg）的ADC和PBD药物接触（μg/m2）处理对象一次；接着安慰剂缓冲剂对照（载体），并且检测二周或两周以上以测定到肿瘤体积倍增、细胞对数杀灭（log cell kill），和肿瘤收缩的时间。
应用
本发明的结合物可用于在靶位置提供PBD化合物。
靶位置优选增殖性细胞群。抗体是对于存在于增殖性细胞群中的抗原。
在一个实施方式中，与存在于增殖性细胞群，例如肿瘤细胞群中的抗原的量相比，该抗原在非增殖性细胞群中不存在或以降低的水平存在。
在靶位置中，接头可以断裂以释放式（D）的化合物。因此，结合物可以选择性地向靶位置提供式（D）的化合物。
接头可以由存在于靶位置的酶断裂。
靶位置可以是体外的、体内的或离体的。
本发明的抗体-药物结合物（ADC）化合物包括具有用于抗癌活性的效用的那些。尤其是，该化合物包括结合的抗体，即通过接头共价连接到PBD药物部分（即毒素）。在药物不结合至抗体时，PBD药物具有细胞毒作用。PBD药物部分的生物活性因而通过与抗体的结合而调节。本发明的抗体药物结合物选择性地将有效剂量的细胞毒素剂递送至肿瘤组织，由此更高的选择性，即更低的有效剂量，可以实现。
因此，一方面，本发明提供本文中所描述的用于在治疗中使用的结合物化合物。
在进一步的方面中，还提供了本文中所描述的用于在治疗增殖性疾病中使用结合物化合物。本发明第二方面，提供了结合物化合物在制造用于治疗增生性疾病的药剂中的应用。
本领域的普通技术人员很容易地能够确定是否候选结合物治疗对于任何特别细胞类型的增殖性疾病。例如，可以方便地使用以评估由特定化合物赋予的活性的试验在下面的实施例中描述。
术语“增殖性疾病”属于不期望的过度的（excessive）或异常细胞的不希望的或不受控制的细胞增殖，如，瘤的或增生的生长，无论体外还是体内。
增殖性疾病的实例包括，但不限于，良性的、恶变前的，和恶性细胞增殖，包括但不限于，瘤（neoplasms）和肿瘤（例如组织细胞瘤、胶质瘤、星形细胞瘤（astrocyoma）、骨瘤），癌症（例如肺癌、小细胞肺癌、胃肠癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌，睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、黑色素瘤）、白血病、银屑病、骨疾病、纤维增生疾病（例如结缔组织的），以及动脉粥样硬化。特别的兴趣的癌包括，但不限于自细胞瘤和卵巢癌。
可以治疗任何类型的细胞，包括但不限于，肺、胃肠（包括，例如肠、结肠）、乳腺（乳房）、卵巢、前列腺、肝（肝脏）、肾（肾脏）、膀胱、胰腺、脑和皮肤的。
在一个实施方式中，治疗是对胰腺癌的。
在一个实施方式中，治疗是对在细胞表面上有ανβ6整联蛋白的肿瘤。
考虑本发明的抗体-药物结合物（ADC）可用于治疗各种疾病或紊乱，例如以肿瘤抗原的过表达为特征的。示例性疾病或过度增殖的紊乱包括良性或恶性肿瘤；白血病、血液的和淋巴恶性肿瘤。其它包括神经元的，神经胶质的，星形胶质细胞（astrocytal），下丘脑的、腺体的、巨噬細胞的（macrophagal），上皮的，间质的，囊胚腔的、炎症性的、血管原的和免疫学的（包括自身免疫性的）疾病。
通常，待治疗疾病或紊乱是过度增殖性疾病，如癌症。本文中，要治疗的癌症的实例治疗包括，但不限于上皮癌（carcinoma）、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这样的癌症的更多特别实例包括鳞状细胞癌（例如上皮鳞状细胞癌）、肺癌（包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌）、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃的癌（包括胃肠癌）、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾脏的癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌，以及头颈癌。
可使用ADC化合物治疗的自身免疫性性疾病包括风湿病学紊乱（如，例如，类风湿性关节炎、干燥综合症（
Figure BDA00002257755901001
syndrome）、硬皮病、狼疮如SLE和狼疮肾炎、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征、牛皮癣关节炎）、骨关节炎、自体免疫胃肠疾病和肝疾病（如、例如、炎性肠疾病（例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病）、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、乳糜泻）、脉管炎（如、例如、ANCA相关脉管炎、包括丘-施二氏血管炎、韦格内氏肉芽肿病、多动脉炎）、自身免疫性神经疾病（如、例如、多发性硬化、眼阵挛-肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病、阿尔茨海默症、以及自身免疫性多神经病）、肾脏疾病（如、例如、肾小球肾炎、古德帕斯丘综合征、贝格尔病）、自身免疫性皮肤病（autoimmune dermatologic disorders）（如、例如、银屑病、荨麻疹、假膜性喉头炎、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮、皮肤红斑狼疮）、血液学疾病（如、例如、血小板减少性紫癜、血栓形成血小板减少性紫癜、输血后紫癜、自身免疫性溶血性贫血）、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听力疾病（如、例如、内耳疾病和听觉失灵）、贝切特病、雷诺氏综合征、器官移植、自身免疫性内分泌紊乱（如、例如、与糖尿病相关的自身免疫性疾病、例如胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）、艾迪生病、自身免疫性甲状腺疾病（例如格雷夫斯病和甲状腺炎））。例如，更优选的这样的疾病包括类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA-相关脉管炎、狼疮、多发性硬化、干燥综合症、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球肾炎。
治疗方法
本发明的结合物可用于治疗方法。还提供的是治疗方法，包括给予需要治疗的对象治疗有效量的本发明的结合物化合物。术语“治疗有效量”是足以显示有益于患者的量。这样的益处可以至少是至少一种症状的改善。实际给予的量，以及给予的速率和时程将取决于治疗的性质和严重性。治疗的处方，例如决定剂量，在医师和其他医生的责任之内。
本发明的化合物可以单独或与其他治疗联合，同时得或相继地给予，取决于要治疗的疾病。处理和疗法的实例包括，但不限于化学疗法（给予活性物质，包括，例如药物，如化疗药物）；手术；放射治疗。
“化疗剂”是可用于治疗癌症的化合物，不考虑作用机制。化疗剂的分类包括，但不限于：烷化剂、抗代谢药、纺锤体毒植物生物碱（spindlepoison plant alkaloids）、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化疗剂包括用于“靶向治疗”和常规的化学疗法的化合物。
化疗剂的实例包括：埃罗替尼（erlotinib）（
Figure BDA00002257755901011
Genentech/OSI Pharm.）、多西他赛（
Figure BDA00002257755901012
Sanofi-Aventis）、5-FU（氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CASNo.51-21-8）、吉西他滨（
Figure BDA00002257755901013
Lilly）、PD-0325901（CAS No.391210-10-9，Pfizer）、顺铂（顺-二氨，二氯铂（II），CAS No.15663-27-1）、卡铂（CAS No.41575-94-4）、紫杉醇（Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.）、曲妥珠单抗（trastuzumab）（
Figure BDA00002257755901015
Genentech）、替莫唑胺（4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CAS No.85622-93-1，
Figure BDA00002257755901016
Figure BDA00002257755901017
Schering Plough）、他莫昔芬（tamoxifen）（：(Z)-2-(4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基)-N,N-二甲基乙胺，
Figure BDA00002257755901018
Figure BDA00002257755901019
Figure BDA000022577559010110
），和多柔比星
Figure BDA000022577559010111
Akti-1/2，HPPD，以及雷帕霉素（rapamycin）。
化疗剂的更多的实例包括：奥沙利铂（oxaliplatin）（
Figure BDA000022577559010112
Sanofi）、硼替佐米（bortezomib）（
Figure BDA000022577559010113
Millennium Pharm.）、舒尼替尼（sutent）（
Figure BDA00002257755901021
SU11248，Pfizer）、来曲唑（letrozole）（
Figure BDA00002257755901022
Novartis）、甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate）（
Figure BDA00002257755901023
Novartis）、XL-518（Mek抑制剂，Exelixis，WO2007/044515）、ARRY-886（Mek抑制剂，AZD6244，Array BioPharma，Astra Zeneca）、SF-1126（PI3K抑制剂，Semafore Pharmaceuticals）、BEZ-235（PI3K抑制剂，Novartis）、XL-147（PI3K抑制剂，Exelixis）、PTK787/ZK222584（Novartis）、氟维司群（fulvestrant）（
Figure BDA00002257755901024
AstraZeneca）、甲酰四氢叶酸（leucovorin）（亚叶酸）、雷帕霉素（西罗莫司（sirolimus），Wyeth）、拉帕替尼(lapatinib）（
Figure BDA00002257755901026
GSK572016，Glaxo Smith Kline）、法尼醇蛋白转移酶抑制剂（lonafarnib）（SARASARTM，SCH 66336，Schering Plough）、索拉非尼（sorafenib）（
Figure BDA00002257755901027
BAY43-9006，Bayer Labs）、吉非替尼（AstraZeneca）、伊立替康（irinotecan）（
Figure BDA00002257755901029
CPT-11，Pfizer）、替吡法尼（tipifarnib）（ZARNESTRA，Johnson & Johnson）、ABRAXANETM（Cremophor-free）、紫杉醇白蛋白改造的纳米颗粒制剂（albumin-engineered nanoparticleformulations of paclitaxel）（American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Il）、vandetanib（rINN，ZD6474，
Figure BDA000022577559010210
AstraZeneca）、氯氨布西（chloranmbucil）、AG1478、AG1571（Su 5271；Sugen）、腾西罗莫司（temsirolimus）（
Figure BDA000022577559010211
Wyeth）、帕唑帕尼（pazopanib）（GlaxoSmithKline）、canfosfamide（
Figure BDA000022577559010212
Telik）、塞替派（thiotepa）和环磷酰胺（cyclosphosphamide）（
Figure BDA000022577559010214
）；烷基磺酸盐类（alkyl sulfonates），如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，如benzodopa、卡波醌（carboquone）、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺类和methylamelamine类，包括六甲蜜胺（altretamine）、三乙烯三聚氰胺（triethylenemelamine）、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺（triethylenethiophosphoramide）和trimethylomelamine；多聚乙酰（尤其是布拉它辛（bullatacin）和布拉它辛酮（bullatacinone））；喜树碱（包括合成类似物托泊替坎（topotecan））；苔藓抑素（bryostatin）；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新（adozelesin）、卡折来新（carzelesin）和比折来新（bizelesin）合成类似物）；cryptophycins（尤其是cryptophycin 1和cryptophycin 8）；多拉司他汀（dolastatin）；多卡米星（duocarmycin）（包括合成类似物、KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素（eleutherobin）；水鬼蕉碱（pancratistatin）；匍枝珊瑚醇（sarcodictyin）；spongistatin；氮芥类（nitrogen mustards），如苯丁酸氮芥，萘氮芥，氯代磷酰胺（chlorophosphamide），雌莫司汀（estramustine），异环磷酰胺，氮芥（mechlorethamine），氧化氮芥盐酸盐（mechlorethamine oxidehydrochloride），美法仑，新氮芥（novembichin），苯芥胆甾醇（phenesterine），泼尼莫司汀（prednimustine），曲磷胺（trofosfamide），尿嘧啶氮芥（uracilmustard）；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素（chlorozotocin）、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀（ranimnustine）；抗生素如烯二炔（enediyne）抗生素类（例如卡奇霉素（calicheamicin）、卡奇霉素γ1I（calicheamicin gamma1I）、卡奇霉素ωI1（calicheamicin omegaI1）（AngewChem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186）；达内霉素（dynemicin），达内霉素A；双磷酸盐类（bisphosphonates）如氯屈膦酸盐（clodronate）；埃斯波霉素（esperamicin）；以及新制癌菌素生色团（neocarzinostatinchromophore）和相关色蛋白烯双炔抗生素生色团（related chromoproteinenediyne antibiotic chromophores）），aclacinomysins，放线菌素，安曲霉素（authramycin），偶氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C，卡柔比星（carabicin），洋红霉素，嗜癌霉素（carzinophilin），色霉素（chromomycinis），放线菌素D，柔红霉素，地托比星，6-重氮基的-5-氧代-L-正亮氨酸，吗啉代-多柔比星，含氰吗啉代多柔比星（cyanomorpholino-doxorubicin），2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星（deoxydoxorubicin），表柔比星，依索比星，伊达比星，奈莫柔比星，麻西罗霉素，丝裂霉素类，如丝裂霉素C，麦考酚酸，诺拉霉素，橄榄霉素，培洛霉素，泊非霉素，嘌呤霉素，三铁阿霉素（quelamycin），罗多比星，链黑霉素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他丁，佐柔比星；抗代谢药，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶（5-FU）；叶酸类似物，如二甲叶酸（denopterin）、甲氨蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙（trimeterxate）；嘌呤类似物，如氟达拉滨，6-巯基嘌吟，硫咪嘌呤（thiamiprine），硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨，阿扎胞苷，6-阿扎尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，双脱氧法尿苷（dideoxyuridine），去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷；雄激素类，如卡普睾酮，丙酸甲雄烷酮（dromostanolonepropionate），环硫雄醇，美雄烷，睾内酪；抗肾上腺类，如氨鲁米特，米托坦，曲洛司坦；叶酸补充剂，如frolinic acid；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷（aldophosphamide glycoside）；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶（eniluracil）；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙（edatraxate）；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸（elfornithine）；依利醋铵；埃博霉素（epothilone）；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明（lonidainine）；正美登木素（maytansinoids），如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；二胺硝吖啶（nitraerine）；喷司他丁；蛋氨氮芥（phenamet）；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸（podophyllinic acid）；2-乙基酰肼（2-ethylhydrazide）；丙卡巴肼；
Figure BDA00002257755901031
多糖复合物（JHS Natural Products，Eugene，OR）；雷佐生；根霉素（rhizoxin）；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸（tenuazonic acid）；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙基胺；单端孢霉烯类（特别是T-2毒素、疣疱菌素A（verracurin A）、杆孢菌素A和蛇形菌素（anguidine））；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷（“Ara-C”）；环磷酰胺；塞替派；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷（VP-16）；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨
Figure BDA00002257755901041
诺肖林（novantrone）；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨（
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Roche）；伊班膦酸盐（ibandronate）；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸（difluoromethylornithine）（DMFO）；维生素a酸类，例如维a酸（retinoicacid）；以及任何上面的药用盐、酸及衍生物。
还包括在对“化疗剂”的定义中的为：（i）调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素物质，如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂（SERMs），包括，例如，他莫昔芬（包括
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他莫昔芬柠檬酸盐）、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen）、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬（keoxifene）、LY117018、奥那司酮和
Figure BDA00002257755901044
（托瑞米芬柠檬酸盐）；（ii）抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中雌二醇的生产，如，例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、
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（甲地孕酮乙酸盐）、
Figure BDA00002257755901046
（依西美坦；Pfizer）、福美坦（formestanie）、法倔唑、
Figure BDA00002257755901047
（伏氯唑）、
Figure BDA00002257755901048
（来曲唑；Novartis），和
Figure BDA00002257755901049
（阿那曲唑；AstraZeneca）；（iii）抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林（leuprolide）和戈舍瑞林；以及曲沙他滨（troxacitabine）（1,3-二氧戊烷核苷胞嘧啶（1,3-dioxolane nucleoside cytosine）类似物）；（iv）蛋白激酶抑制剂，如MEK抑制剂（WO 2007/044515）；（v）脂激酶抑制剂；（vi）反义寡核苷酸，尤其是抑制牵涉异常细胞增殖的信号通路中的基因表达的那些，例如，PKC-α、Raf和H-Ras，如oblimersen（
Figure BDA000022577559010410
Genta公司）；（vii）核糖酶类，如VEGF表达抑制剂（例如
Figure BDA000022577559010411
和HER2表达抑制剂；（viii）疫苗如基因治疗疫苗，例如，
Figure BDA000022577559010412
Figure BDA000022577559010413
和
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rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂如，
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Figure BDA000022577559010417
rmRH；（ix）抗血管生成剂，如贝伐单抗（bevacizumab）（Genentech）；以及任何上面的药用盐、酸和衍生物。
1.还包括在对“化疗剂”的定义中的是如阿仑珠单抗（alemtuzumab）（Campath）、贝伐单抗（bevacizumab）；（Genentech）；西妥昔单抗（cetuximab）（
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Imclone）；帕尼单抗（panitumumab）（Amgen）、利妥昔单抗（rituximab）（
Figure BDA000022577559010422
Genentech/Biogen Idec），帕妥珠单抗（pertuzumab）（OMNITARG，2C4，Genentech）、曲妥珠单抗（trastuzumab）（
Figure BDA000022577559010423
Genentech）、托西莫单抗（tositumomab）（Bexxar，Corixia）和抗体药物结合物、（gemtuzumab ozogamicin）（Wyeth）。
具有作为与本发明的结合物联合的化疗剂的治疗潜力的人化单克隆抗体包括：阿仑珠单抗（alemtuzumab）、阿泊珠单抗（apolizumab）、阿塞珠单抗(aselizumab)、atlizumab、巴皮纽阻单抗（bapineuzumab）、贝伐单抗（bevacizumab）、bivatuzumab mertansine、美坎珠单抗（cantuzumabmertansine）、西利珠单抗（cedelizumab）、培瑟妥珠单抗（certolizumabpegol）、cidfusituzumab、cidtuzumab、达珠单抗（daclizumab）、依库珠单抗eculizumab、依法珠单抗（efalizumab）、依帕珠单抗（epratuzumab）、erlizumab、非维珠单抗（felvizumab）、芳妥珠单抗（fontolizumab）、吉妥珠单抗奥唑米星（gemtuzumab ozogamicin）、伊珠单抗奥唑米星（inotuzumab ozogamicin）、伊匹单抗（ipilimumab）、拉贝珠单抗（labetuzumab）、林妥珠单抗（lintuzumab）、马妥珠单抗（matuzumab）、美泊利单抗（mepolizumab）、莫维珠单抗（motavizumab）、motovizumab、那他珠单抗（natalizumab）、尼妥珠单抗（nimotuzumab）、nolovizumab、numavizumab、奥瑞珠单抗（ocrelizumab）、奥马佐单抗（omalizumab）、帕利珠单抗（palivizumab）、帕考珠单抗（pascolizumab）、pecfusituzumab、pectuzumab、帕妥珠单抗（pertuzumab）、培克珠单抗（pexelizumab）、ralivizumab、兰尼单抗（ranibizumab）、reslivizumab、瑞利珠单（reslizumab）、resyvizumab、罗维珠单抗（rovelizumab）、鲁利单抗（ruplizumab）、西罗珠单抗（sibrotuzumab）、西利珠单抗（siplizumab）、索土珠单抗（sontuzumab）、他珠单抗钇（tacatuzumab tetraxetan）、他度珠单抗（tadocizumab）、他利珠单抗（talizumab）、替非珠单抗（tefibazumab）、托珠单抗（tocilizumab）、托利珠单抗（toralizumab）、曲妥珠单抗（trastuzumab）、西莫白介素单抗（tucotuzumab celmoleukin）、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗（urtoxazumab）、维西珠单抗（visilizumab）。
根据本发明并用于根据本发明的应用的药物组合物，除活性组分，即结合物化合物，可包括本领域技术人员熟知的药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他材料。这样的材料应是无毒的，并且不应干扰活性组分的有效性。载体或其他材料的确切性质将取决于给药途径，其可以口服或通过注射，例如皮肤的、皮下的或静脉的。
用于口服的药物组合物可以以片剂、胶囊、粉剂或液体形式。片剂可包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包含生理盐溶液、右旋糖或其他糖类溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇等。胶囊可包含固体载体如明胶。对于静脉的、皮肤的或皮下注射，或在痛苦部位的注射，活性组分将是以非肠道用的水溶液形式，这些水溶液无热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域有关的技术人员将能够利用例如，等渗载体，如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液（Lactated Ringer's Injection）来制备适合的溶液。如果需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
制剂
虽然可能单独使用（如给予）结合物化合物，但经常优选提供它作为组合物或制剂。
在一个实施方式中，组合物是包括本文所描述的结合物化合物，以及药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物（例如制剂、制品、药剂）。
在一个实施方式中，组合物是包括至少一种本文所描述的结合物化合物，以及一种或多种本领域技术人员熟知的其他药用成分的药物组合物，这些成分包括但不限于，药用载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂（例如湿润剂）、掩蔽剂、着色剂、调味剂以及甜味剂。
在一个实施方式中，组合物进一步地包括其他活化剂，例如，其他治疗学或预防用药药剂。
合适的载体、稀释剂、赋形剂等可以在标准药物文件中找到。参见，例如，Handbook of Pharmaceutical Additives,2nd Edition (eds.M.Ash and I.Ash),2001(Synapse Information Resources,Inc.,Endicott,New York,USA)，Remington's Pharmaceutical Sciences,20th edition,pub.Lippincott,Williams&Wilkins,2000；和Handbook of Pharmaceutical Excipients,2nd edition,1994。
本发明另外的方面属于制作药物组合物的方法，包括混合至少一种如本文定义的[11C]-放射标记的结合物或结合物样的化合物与一种或多种本领域技术人员熟知的其他药用成分，例如载体、稀释剂、赋形剂等。如果制剂成分离单位（例如片剂等），每个单位包含预定量（剂量）的活性化合物。
作为本文使用的术语“药用的”表示，在合理的医疗判断范围内，适用于与所讨论的对象（如人）的组织接触，没有异常毒性、刺激、过敏反应，或其他问题或并发症，具有适当的利益/风险比率的化合物、成分、材料、组合物、剂型等。每种载体、稀释剂、赋形剂等还必需在与制剂的其他成分相容的意义上是“可接受的”。
制剂可以利用药剂领域中熟知的任何方法来制备。这样的方法包括将活性化合物与构成一种或多种助剂的载体联合的步骤。通常，制剂通过将活性化合物与载体（例如液体载体、细分的固体载体等）均匀并紧密地联合而制备，然后在必要时成型制品。
可制备制剂以提供快速或缓慢释放；立即释放、延时释放或持续释放；或其组合。
适合非消化道给药（例如通过注射）的制剂，包括水或非水的、等渗的、无热原的、消毒的液体（例如溶液、悬浮液），其中，活性组分是溶解的、悬浮或否则提供（例如在脂质体或其他微粒中）。这样的液体可另外包括其他药用成分，如使制剂与预期的接受者血（或其他有关体液）等渗的抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂以及溶质。例如，赋形剂的实例包括水、醇类、多元醇类、甘油、植物油等。供这样的制剂使用的合适的等渗载体的实例，包括氯化钠注射液、林格溶液、乳酸林格注射液。典型地，液体中的活性组分的浓度为约1ng/mL至约10μg/mL，例如约10ng/mL至约1μg/mL。例如，制剂可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器中，如安瓿和小瓶，并且可以存储在仅需要加入无菌液体载体，例如在立即使用之前的注射用水的冷冻干燥（冻干）条件中。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
剂量
本领域技术人员将理解结合物化合物的适当剂量以及包含结合物化合物的组合物在患者之间可以变化。确定最佳剂量将通常涉及治疗益处的水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于各种因素包括但不限于，特定化合物的活性，给药途径，给药时间，化合物的排泄速率，治疗的持续时间，组合使用的其他药物、化合物和/或材料，疾病的严重性以及患者的种族、性别、年龄、重量、条件、健康状况和先前的病史。尽管通常选择剂量以达到作用部位的局部浓度，其在没有引起实质有害的或有毒的副作用的情况下产生预期效果，化合物的量和给药途径最终将由医生、兽医或临床医师判定。
在整个疗程中给药可以以一次剂量实现，连续地或间断地（例如，以适当间隔的分开剂量中）。确定最有效的给药方式和剂量的方法对于本领域的技术人员是熟知的，并将随用于治疗、治疗目的、要治疗的（多种）靶细胞以及要治疗的对象而变化。可以实行单或多给予，而剂量水平和模式由医生、兽医或临床医师选择。
总体上，活性化合物的合适剂量在每天对象的每千克体重约100ng至约25mg的范围内（更典型地约1μg至约10mg）。其中，活性化合物为盐、酯、酰胺、前药等，给予的量基于母体化合物计算，并且因此要使用的实际重量会相应地增加。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案给予人类患者活性化合物：约100mg，每天3次。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案给予人类患者活性化合物：约150mg，每天2次。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案给予人类患者活性化合物：约200mg，每天2次。
然而，在一个实施方式中，根据以下剂量方案给予人类患者结合物化合物：约50或约75mg，每天3或4次。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案给予人类患者结合物化合物：约100或约125mg，每天2次。
上面描述的剂量可适用于结合物（包括PBD部分和与抗体的接头）或所提供的PBD化合物的有效量，例如在接头断裂后可释放的化合物量。
对于疾病的预防或治疗，本发明的ADC的适当剂量将取决于如以上定义的要治疗疾病的类型、严重性和病程、先前治疗、患者的病历和对抗体的应答，以及主治医师的判定，不论给予分子是用于预防性还是治疗性目的。分子适当地以一次或通过一系列治疗来给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1mg/kg至15mg/kg（例如0.1-20mg/kg）的分子为用于给予患者的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次单独的给予，还是通过连续注入。典型的每日剂量可在约1mg/kg至100mg/kg或更高的范围内，这取决于上面提及的因素。要给予患者ADC的示例性剂量在病人重量的约0.1至约10mg/kg的范围内。对几天的用于重复的给予或更长的，取决于条件，处理被保持，直到对疾病症状的期望的镇压发生。示例性给药方案包括给予约4mg/kg的初始负荷剂量，之后每周、两周，或三周的ADC的另外的剂量的过程。可使用其他剂量方案。这种治疗的发展容易通过常规技术和试验来监控。
治疗
如在本文中的治疗疾病的背景下使用的术语“治疗”通常属于治疗和疗法，无论人还是动物（例如兽医的应用），其中，达到一些期望的治疗效果，例如，抑制疾病的进展，并包括疾病的发展速率的减缓、发展速率的停止、回退，疾病的改善，以及疾病的治愈。还包括作为预防措施（即预防、防止）的治疗。
如本文中使用的术语“治疗-有效量”属于活性化合物，或包括活性化合物的材料、组合物或剂型（dosage）的量，其在根据期望的治疗方案给药时有效产生一些期望的治疗效果，与合理的利益/风险比率相称。
同样，如本文中使用的术语“预防-有效量”属于活性化合物，或包括活性化合物的材料、组合物或剂型的量，其在根据期望的治疗方案给药时有效产生一些期望的预防效果，与合理的利益/风险比率相称。
抗体药物结合物的制备
抗体药物结合物可以通过几种路线制备，采用本领域技术人员熟知的那些有机化学反应、条件和试剂，包括：（1）将抗体的亲核基团或亲电基团与二价接头反应物反应，以经由共价键形成抗体-接头中间体Ab-L，接着与活化的药物部分反应物反应；（2）药物部分反应物与接头反应物反应，以经由共价键形成药物-接头反应物D-L，然后与抗体的亲核基团或亲电基团反应。结合方法（1）和（2）可以采用各种抗体和接头以制备本发明的抗体-药物结合物。
抗体上的亲核基团包括，但不限于：（i）N-末端胺组，（ii）侧链胺基团，例如赖氨酸，（iii）侧链巯基，例如半胱氨酸，以及（iv）在抗体糖基化时的糖羟基或氨基。胺、巯基和羟基是亲核的，并能够与接头部分上的亲电基团反应以形成共价键，且接头反应物包括：（i）活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯（haloformates）和酸卤化物（acid halides）；（ii）烷基和苯甲基卤化物，例如卤代乙酰胺（haloacetamides）；（iii）醛、酮、羧基，以及马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。用还原剂如DTT（Cleland's reagent，二硫苏糖醇）或TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐；Getz et al(1999)Anal.Biochem.Vol 273:73-80;SoltecVentures,Beverly,MA）处理可使抗体变得对与接头反应物的结合有反应性。理论上，每个半胱氨酸桥将因此形成两个反应性巯基亲核体。另外的亲核基团可以通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷（2-iminothiolane）（Traut试剂）导致胺转变为巯基的反应而引入抗体。
抗体-药物结合物还可以由以引入能够与接头上的亲核取代基反应的亲电部分的抗体修饰产生。可以氧化糖基化抗体的糖，例如，用高碘酸盐氧化试剂，以形成可与接头反应物或药物部分的胺基反应的醛或酮基。产生的亚胺希夫碱基团可形成稳定的连接，或可以被还原，例如用氢硼化物试剂以形成稳定的胺连接。在一个实施方式中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或者高碘酸钠的反应可在蛋白质中产生能够与药物上的适当基团反应的羰（醛和酮）基（Hermanson,G.T.(1996)BioconjugateTechniques;Academic Press:New York,p 234-242）。在另外的实施方式中，包含N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可以与高碘酸钠反应，引起醛代替第一个氨基酸的生产（Geoghegan & Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3:138-146;US 5362852）。这样的醛可以与药物部分或接头亲核体反应。
同样，药物部分上能够与接头部分上的亲电基团反应以形成共价键的亲核基团包括，但不限于，巯基、胺、酰肼、肟、缩氨基硫脲、肼羧酸酯（hydrazine carboxylate）和芳酰肼（arylhydrazide），且接头反应物包括：（i）活性酯，如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯和酸卤化物；（ii）烷基和苯甲基卤化物，例如卤代乙酰胺；（iii）醛、酮、羧基，以及马来酰亚胺基团。反应性亲核基团可以通过标准官能团互换在anthracycline衍生物化合物上引入。例如，羟基可以利用光延型反应（Mitsunobu-type reaction）转变成巯基，以形成巯基修饰的药物化合物。
对象/患者
对象/患者可以是动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、有袋动物（例如袋鼠、袋熊）、单孔类动物（例如鸭鸭嘴兽）、啮齿类动物（例如，几内亚猪、仓鼠、大鼠、小鼠）、鼠类（例如大鼠）、兔类动物（例如。兔子）、禽类（例如鸟）、犬类（例如狗）、猫科（例如猫）、马科（例如。马）、猪类（例如猪），羊类（例如绵羊）、牛（例如奶牛），灵长类、猿猴（例如。猴子或猿）、猴子（例如绒猴、狒狒）、猿（例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿）或人。
而且，对象/患者可以为其发育的任何形式，例如，胎儿。在一个优选实施方式中，对象/患者是人。
在一个实施方式中，患者是每个患者患有在细胞的表面上具有ανβ6整联蛋白的肿瘤的群体。
合成
在一个实施方式中，式VIII的二聚体结合物可以由化合物I和II制备，如方案1中示出的。
方案1.
Figure BDA00002257755901101
Figure BDA00002257755901111
Figure BDA00002257755901121
通常，非对称二聚体可以通过用一当量的可购买的（或容易制备的）氯甲酸酯试剂处理式IV的二-氨基化合物来制备，以破坏分子的对称。余下的游离胺然后可以独立地官能团化，以引入需要的治疗上不稳定的前基团（progroup）（RL）。进一步的官能团处理以关闭PBD B-环，去除保护和封端基团，并引入抗体-连接官能团，例如G1，提供靶分子。
式IV的化合物典型地通过将适当地官能团化的C环片段（I）与包含式II的二聚体核心的A环结合而制备。C-环片段可以由已知的氨基甲酸酯保护的4-氧代脯氨酸甲酯结构单元（building block）来制备。可以采用在Wittig或Horner-Emmons条件下的烯化作用，以提供内-或外-不饱和烯烃。替换地，可以使用串联式triflation和Suzuki结合反应以获得4-芳基取代的3,4或4,5-不饱和C-环片段。C-环和A-环片段可以利用A-环片段的酰基氯（acid chloride）衍生物在三乙基胺存在的标准条件下结合，以给出式III的分子。类型III的化合物可以用乙酸中的锌还原，而不影响内或外C-环不饱和，以提供式IV的分子。
类型VI的非对称的氨基甲酸酯可以通过用一当量的可购买的（或容易制备的）氯甲酸酯试剂在吡啶或三乙基胺存在的条件下处理类型IV的二-胺类来制备。可以选择氯甲酸酯以提供氨基甲酸酯封端单元（RC），其与在前基团（progroup）（RL）中使用的那些垂直或一致。相同的氨基甲酸酯允许同时去除两个保护基团，节省合成步骤。然而，封端氨基甲酸酯（RC）的去除需要在敏感N10-C11亚胺或甲醇胺部分存在的条件下加入连接抗体的官能度来发生。如果必要，该情形可以通过使用允许加入抗体-连接部分而同时保持N10-C11甲醇胺部分受保护的垂直的氨基甲酸酯保护基团来避免。在该策略中，N10-C11部分必须在抗体-连接部分存在的条件下暴露，并且所使用的试剂必须与该部分相容。例如，如果N10-C11亚胺要在马来酰亚胺基团存在的条件下暴露，Troc和Teoc将是合适的RC基团，因为去保护剂，Cd/Pb对和TBAF，不应当影响马来酰亚胺基团。另一方面，应避免Alloc基团，因为π-烯丙基清除剂，如吡咯烷可能以1，4-形式加入到马来酰亚胺基团。RL氨基甲酸酯可以通过将余下的氨基转化成异氰酸酯并用RL醇淬灭其来引入。替换地，RL醇可以转变成氯甲酸酯或功能等价物（氟甲酸酯、p-硝基碳酸酯、五氟碳酸酯（pentafluorocarbonate）或羟基苯并三唑碳酸酯（hydroxybenzotriazole carbonate）。最终，留下的氨基可以转变成反应性p-硝基氨基甲酸酯、五氟氨基甲酸酯或羟基苯并三唑氨基甲酸酯，其能够用RL醇替换以提供式VI的分子。
式VII的分子可以由式VI的分子通过用含水甲醇中的碳酸钾或在RL中存在Fmoc基团的情况下用三乙基氢化硼锂来除乙酸酯保护基团来制备。用戴斯-马丁高碘试剂（Dess-Martin periodinane，或有机五价碘氧化试剂）（或者替换地，TPAP/NMO、PDC或在Swern条件下）的氧化提供环关闭的产物。
式V的结合物可以由式VII的分子通过去除封端基团RC、加工RL以包括可以在标准条件下与细胞结合剂（如抗体）结合的抗体-连接部分（例如马来酰亚胺乙酰基（maleimidocaproyl）基团）来制备（见Dubowchiket al.Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869）。RL的加工可包括延长基团以包括间隔元件，如基团G1的步骤，间隔元件可能然后被用于与细胞结合剂连接（由此形成A基团）。
单体化合物和对称二聚体可以以与如上所描述非对称二聚体的类似方式制备。
在另外的实施方式中，式XVIII的结合物可以由如方案2所示的化合物IX制备。
化合物II式（II）化合物的合成在申请人的早期申请（WO 2006/111759）中描述，并且也由Gregson等（J.Med.Chem.2001,44,1161-1174）描述。如其中所描述的化合物（II）的制备具体地通过参考并入本文。化合物（IIa）具有三碳接头。化合物（IIb）具有五碳接头。
方案2.
Figure BDA00002257755901141
在该方案中，基团R2是C5-20芳基。式IX的化合物在WO 2004/043963中描述。
式X的化合物可以由式IX的化合物通过氧化合成，例如利用：TCCA和TEMPO；BAIB和TEMPO；TPAP；Dess-Martin条件；或Swern条件。
式IX的化合物可以通过结合适当的式B和C的化合物，或其活化的衍生物来合成：
Figure BDA00002257755901142
式B和C的化合物通常是可购买或可容易合成的。如果化合物B是二聚体，那么这可以按照在WO 00/12508中所描述的合成。
式XI的化合物可以由式X的化合物以包括用适当的酸酐和无水2,6-二甲基吡啶（2,6-lutidine）或无水2,6-tBu-吡啶在-35°C或更低的温度下在有机溶剂中在惰性气氛下处理X的方法来制备。XI基本不含有具有C1-C2双键的化合物。
注意，具有C1-C2双键的化合物的制备由Kang et al.,Chem.Commun.,2003,1680-1689描述。
式XI的化合物可以转化成式XII的化合物。转化（Suzuki结合）通过钯催化XI与适当的芳基硼衍生物的交叉结合而实施。钯催化剂可以是任何合适的催化剂，例如Pd(PPh3)4、Pd(OCOCH3)2、PdCl2、Pd(dba)3。
式XII的化合物可以是经由化合物XIII转化成式XIV的化合物。转化通过首先还原酯，并作为乙酸盐（或以替换方法的甲硅烷基醚）再保护而实现。还原可以通过标准方法实现，例如，用LiAlH4或NaBH4。例如，作为醋酸盐的再保护可以，例如，通过与氯化乙酰（acetyl chloride）反应而实现（作为甲硅烷基醚的再保护可以，例如，通过与适当的氯甲硅烷（silylchloride）反应而实现）。然后硝基的还原利用，例如，乙酸中的锌来实施。
式XIV的化合物可以转化成式XV的化合物。该转化通常通过XIV与三光气（triphosgene）反应以获得异氰酸盐/酯，然后与RL-OH反应。该方法在WO 2005/023814中描述。替换地，简单的氮保护基团还可以作为氯甲酸酯、氟甲酸酯或叠氮基甲酸酯（azidoformate）引入。更复杂的氮保护基团，以及简单的氮保护基团，可以作为O-琥珀酰亚胺碳酸酯（O-succinamide carbonates）、O-五氟苯基碳酸酯（O-pentaflurophenylcarbonates）和O-硝基苯基碳酸酯（O-nitrophenyl carbonates）。
将XV转换为XVII可以通过首先用含水甲醇中的碳酸钾或用三乙基氢化硼锂去除醋酸酯保护基团而实现。用Dess-Martin高碘试剂（或者替换地TPAP/NMO、TFAA/DMSO、SO3.吡啶复合物/DMSO、PDC、PCC、BAIB/TEMPO或在Swern条件下）的氧化提供环关闭的产物。如果使用甲硅烷基醚代替乙酸盐，将XV转化为XVII可以通过首先，例如，利用THF中的TBAF、含水THF中的乙酸、DMF中的吡啶或乙酸中的HF去除甲硅烷基醚保护基团，接着是如上所描述的氧化来实现。
然后化合物XVIII与细胞结合剂连接。步骤或XVII到XVIII的步骤的顺序取决于RL的性质。该基团可以被修饰，然后与细胞结合剂连接以形成本发明的结合物。例如，可以除去保护基帽，以提供适合与细胞结合剂反应的官能度。在其他步骤中，该相同的官能度可用于与进一步的间隔区元件（如基团G1）连接，而该间隔区元件可依次与细胞结合剂连接（由此形成A基团）。
在本发明的一些实施方式中，提供了式A-I的化合物，包括式A-A和A-B的化合物。该类型的化合物可以利用类似于那些在WO 2010/091150中所描述的方法制备。在WO 2010/091150中描述的中间体化合物也可以在上面提到的方法中采用。
例如，在第164段中示出的二聚体化合物（15）可用作在上面的方案I中的化合物（III）。作为化合物（3）、（6）和（9）所示的类型的单体化合物，这个以及进一步的适应对于本领域技术人员将是显然的。
优选合成
在一个实施方式中，结合物为化合物14，并按照方案3中所显示的制备。二肽7a、b和8按照在以下的实验部分所描述的制备。在该方案中，接头部分L1和L2具有以下结构：
Figure BDA00002257755901161
方案3.
Figure BDA00002257755901171
Figure BDA00002257755901181
Figure BDA00002257755901191
化合物13c，其中二肽对应L2，可以由12c通过类似的方法制备。
在一个实施方式中，结合物是化合物16a或16b，且该化合物按照以下在方案4中所示的制备，其中化合物12a可按照以上所描述的制备：
方案4.
Figure BDA00002257755901201
方案5.
Figure BDA00002257755901211
方案6.
Figure BDA00002257755901221
方案7.
Figure BDA00002257755901222
方案8.
Figure BDA00002257755901231
方案9.
Figure BDA00002257755901241
Figure BDA00002257755901251
Figure BDA00002257755901261
方案10.
Figure BDA00002257755901262
Figure BDA00002257755901271
方案11.
Figure BDA00002257755901272
Figure BDA00002257755901281
Figure BDA00002257755901291
方案15
Figure BDA00002257755901301
Figure BDA00002257755901311
本发明现在将参考以下非限制性实施例来进一步描述。根据这些本领域技术人员会想到本发明的其他实施方式。
本文所引用的所有参考的公开具体地通过相关引用并入本文，因为它可由本领域的技术人员使用来实施本发明。
实验
基本信息
反应进程由利用Merck Kieselgel 60F254硅胶、在铝板上带有荧光指示剂的薄层色谱（TLC）监控。除非另有说明，TLC的可视化利用UV光或碘蒸汽实现。快速色谱法（Flash chromatography）使用Merck Kieselgel60 F254硅胶进行。萃取和色谱溶剂是购自Fisher Scientific,U.K.，且使用时没有进一步纯化。所有化学制品购自Aldrich、Lancaster或BDH。
LC/MS条件如下：HPLC（Waters Alliance 2695）使用流动水相（A）（甲酸0.1%）和乙腈（B）（甲酸0.1%）运行。梯度：初始组合物5%B 1.0min，然后3min内5%B至95%B。组合物在95%B保持0.5min，然后在0.3分钟内回到5%B。总梯度运行时间等于5min。流速3.0mL/min，经由进入质谱仪的零死体积T管分开400μL。波长检测范围：220至400nm。功能类型：二极管阵列（535扫描）。色谱柱：
Figure BDA00002257755901312
OnyxMonolithic C1850x4.60mm。
使用下列半制备（semi-preparative）的HPLC方法：反相高效液相色谱（HPLC）在以下直径的Zorbax Eclipse XDB C-18柱上实施：150x4.6mm用于分析，和250x9.4mm用于制备工作（preparative work）。所有的HPLC实验利用梯度条件实施：首先固定组合物5%B至50%B 20min，在50%B保持5min，然后2min内50%B至100%B，在100%B保持3min，在2min中内回到5%B并且保持3min。总的梯度运行时间是35min。使用的洗脱液为溶剂A（含有0.02%TFA的H2O）和溶剂B（含有0.02%TFA的CH3CN）。使用的流速是1.20mL/min用于分析和5.00mL/min用于制备HPLC（preparative HPLC）。
化合物2-(S)-2-(甲氧羰基)-4-亚甲基吡咯烷盐酸盐
化合物2还在WO 2007/085930中描述，用于制备PBD化合物。
化合物2可由如在WO 2007/085930（其通过参考并入本文）中所描述的反式-4-羟基-脯氨酸制备。尤其是实施例13，描述化合物2的TFA盐的制备，是尤其相关的。
替换地，化合物2可由化合物1按照如下所描述的制备。
(S)-1-叔丁基-2-甲基4-亚甲基吡咯烷-1,2-二羧酸酯
将碳酸钾（19.92g，14mmol，3eq.）加入到化合物1（10.92g，48mmol，1eq.）在DMF（270mL）中的搅拌溶液中。得到的白色悬浮液在室温搅拌30min，在30min时加入碘代甲烷（21.48g/9.5mL，151mmol，3.15eq.）允许反应混合物在室温搅拌3天。通过在减压下旋转蒸发去除DMF，以提供介于乙酸乙酯和水之间的黄色残余物。分离有机层，并且将水相用乙酸乙酯萃取。将复合的有机层用水、盐水洗涤，并用硫酸镁干燥。乙酸乙酯通过在减压下旋转蒸发去除以提供为黄色油状的粗产物。将粗产物利用快速色谱法[85%n-己烷/15%乙酸乙酯]纯化以提供为无色油状的产物（FManfréet al.,J.Org.Chem.1992,57,2060-2065）。
(S)-2-(甲氧羰基)-4-亚甲基吡咯烷盐酸盐
在室温将在二噁烷中的盐酸溶液（4M，63mL，254.4mmol，4.5eq.）加入到(S)-4-亚甲基吡咯烷-1,2-二羧酸1-叔丁基2-甲基酯（13.67g，56.6mmol，1eq.）观察到起泡表明CO2的释放和Boc基团的去除。产物作为白色固体析出，并且加入另外的二噁烷以促进搅拌，然后允许将反应混合物搅拌一个小时，接着用醚稀释。通过真空过滤收集析出的产物并用另外的醚洗涤。风干提供期望的为白色粉末的产物2（9.42g，94%）（另见PHerdwijn et al.,Canadian Journal of Chemistry.1982,60,2903-7）。
化合物3
化合物3可以制备正如在WO中所描述2006/111759和Gregson等人中所描述
化合物4
化合物4可以由化合物3和化合物2制备。
在室温将催化剂量的无水DMF（0.5mL）加入到在无水DCM（180mL）的草酰氯（9.1g，6.25mL，71.7mmol，3eq.）和化合物3（11.82g，23.9mmol，1eq.）的搅拌悬浮液中。在加入DMF后观察到剧烈的起泡，然后允许反应混合物在安装有氯化钙干燥管的一圆底烧瓶中搅拌18h。得到的澄清溶液在减压下蒸发并将固体用醚研磨。通过真空过滤收集固体产物，用另外的醚洗涤，并且在真空中在40°C干燥1.5小时。然后将此固体分份加入到化合物2（9.35g，52.6mmol，2.2eq.）在TEA（12.08g，119.6mmol，5eq.）和干燥的DCM（110mL）中的悬浮液中，借助于干冰/乙腈浴将温度维持在-40至-50°C之间。允许将反应混合物在-40°C搅拌1小时，然后允许升温到室温，在此时LCMS表明起始材料的完全消耗。将反应混合物用另外的DCM稀释并依次用含水盐酸（1M，2x200mL）、饱和含水碳酸氢钠（2x250mL）、水（250mL）、盐水（250mL）洗涤，接着用硫酸镁干燥。通过旋转蒸发在减压下去除DCM以提供为黄色泡沫状的产物（13.94g，79%）。分析数据：RT 3.95min；MS（ES+）m/z（相对强度）741（[M+1]+，100）。
化合物5
化合物5可以由化合物4以三步骤经由二醇和二乙酸酯制备。
二醇
在氮气氛下在0°C（冰浴）将固体氢硼化锂（0.093g，4.3mmol，3eq.）以一部分加入到酯4（1.05g，142mmol，1eq.）在干燥THF（10mL）中的溶液中。允许将反应混合物在0°C搅拌30min，然后允许升温到室温，此时观察到析出橙色胶。允许将反应混合物在室温搅拌另外的2个小时，然后在冰浴中冷却并且用水（20mL）处理以提供黄色悬浮液。仔细加入盐酸（1M）（剧烈起泡！），直到停止起泡。将反应混合物用乙酸乙酯（4个x50mL）萃取，然后将复合的有机层用水（100mL）、盐水（100mL）洗涤，并用硫酸镁干燥。通过在减压下旋转蒸发去除乙酸乙酯以产生为黄色泡沫状的二-醇（0.96g，99%）。以12.4g的比例重复反应以产生11.06g的产物（96%）。分析数据：RT 3.37min；MS（ES+）m/z（相对强度）685（[M+1]+，100）。
二乙酸酯
在氮气氛下在0°C将乙酰氯在无水DCM（100mL）中的溶液（3.4g/3.1mL，43.5mmol，2.6eq.）滴加到二醇（11.46g，16.73mmol，1eq.）和三乙基胺（5.07g，6.98mL，50.2mmol，3eq.）在无水DCM（200mL）中的搅拌溶液中。允许将反应混合物升温至室温并继续搅拌一小时。TLC和LCMS指示反应完成。将反应混合物用盐水（200mL）洗涤并且用硫酸镁干燥。在减压下旋转蒸发去除DCM提供粗产物。快速色谱[梯度洗脱20%n-己烷/80%乙酸乙酯至10%n-己烷/90%乙酸乙酯]提供纯的为黄色泡沫状的二醋酸酯（10.8g，84%）。分析数据：RT 3.35min；MS（ES+）m/z（相对强度）769（[M+1]+，100）。
化合物5
将锌粉（14.2g，2.17mmol，30eq.）加入到二醋酸酯（5.56g，7.24mmol，1eq.）在乙醇（250mL）和醋酸（65mL）中的溶液中。将搅拌的反应混合物加热回流，黄色溶液变为无色（还观察到锌聚集，使得难以搅拌反应）。允许反应继续一小时，此时LCMS指示反应完成。允许将反应混合物冷却，用celite过滤，且用DCM洗涤滤器垫。滤液用水（3x500mL）洗涤涤，充满水的碳酸氢钠（2x250mL），盐水（500mL）以及用硫酸镁干燥。在减压下旋转蒸发产生为灰白色泡沫的产物5（4.71g，92%）。分析数据：RT 3.33min；MS（ES+）m/z（相对强度）709（[M+1]+，100）。
化合物6
化合物6可由化合物5以三步骤制备。
单Alloc（Mono-Alloc）产物
在-78°C（干冰/丙酮浴）将烯丙基氯甲酸酯（allyl chloroformate）（0.634g/0.56mL，5.6mmol，0.9eq.）在无水DCM（150mL）中的溶液滴加到化合物5（4.145g，5.8mmol，1eq.）和吡啶（0.106g/0.11mL，11.1mmol，1.9eq.）在无水DCM（500mL）中的溶液中。将反应混合物在-78°C搅拌1小时，然后允许到达室温。将反应混合物用饱和硫酸铜水溶液（2x300mL）、水（400mL）、盐水（400mL）洗涤，并用硫酸镁干燥。在减压下旋转蒸发提供黑色泡沫状的粗产物。通过快速色谱[40%n-己烷/60%乙酸乙酯至5%甲醇/95%乙酸乙酯]纯化，提供二-alloc产物（0.84g）、期望的单-alloc产物（1.94g，44%）和回收的二-苯胺（0.81g）。
分析数据：RT 3.32min；MS（ES+）m/z（相对强度）793（[M+1]+，100）；MS（ES-）m/z（相对强度）791（[M-1]）-，100）。
异氰酸酯
在氮气氛下在-10°C将三乙基胺（0.018g/25mL，0.18mmol，1.35eq.）加入到单-alloc产物（0.106g，0.134mmol，1eq.）和三光气（triphosgene）（0.015g，4.8x10-2mmol，0.36eq.）在无水甲苯（5mL）中的搅拌溶液中。1小时后，IR光谱指示异氰酸酯在2268cm-1伸展，并使反应混合物到达室温。
化合物6
将醇6a（0.106g，0.15mmol，1.1eq.）和三乙基胺（0.018g，25mL，0.18mmol，1.35eq.）在无水THF（5mL）中的溶液滴加到新制备的异氰酸酯中。将反应混合物加热回流4小时，此时TLC指示新产物形成。将反应混合物蒸发至干燥并且DCM和水之间分层。分离水层，并且将有机相用盐水（100mL）洗涤，然后用硫酸镁干燥。在减压下旋转蒸发提供为黄色油状的粗产物，其通过快速色谱[梯度洗脱40%n-己烷/60%乙酸乙酯至20%n-己烷/80%乙酸乙酯，以乙酸乙酯5%增加]纯化以提供期望的为白色泡沫状的产物（0.092g，45%产率）。
分析数据：RT 4.05min；MS（ES+）m/z（相对强度）1540（[M+2]+，30）；1557([M+18])+。50）；MS（ES-）m/z（相对强度）1585([M-+2Na])-，50）。.
化合物7
化合物7可由化合物6以两步骤制备。
二去乙酰化产物
在-78°C（干冰/丙酮）将superhydrideTM（1M，0.35mL，0.35mmol，4eq.）在THF中的溶液经注射器滴加到醋酸酯6（0.135g，8.8x10-2mmol，1eq.）在无水THF（7mL）中的搅拌溶液中。允许将反应混合物在-78°C搅拌一小时，此时LCMS指示缺少起始材料并形成对应单和二去乙酰化产物的两种新化合物。将进一步等分的superhydrideTM（1M，0.35mL，0.35mmol，4eq.）入到该反应混合物中并继续搅拌另外的一小时。此时的LCMS指示完全转化成二去乙酰化产物。将柠檬酸（1M，1mL）加入到反应混合物（剧烈起泡！），然后允许其到达室温，此时加入另外的等分柠檬酸（1M，1mL）。在减压下旋转蒸发去除溶剂，并且所得的残余物在乙酸乙酯（25mL）和水（25mL）之间分层。分离水相，且乙酸乙酯层用水（25mL）、盐水（25mL）洗涤，然后用硫酸镁干燥。通过在减压下旋转蒸发去除溶剂提供为黄色油状的粗产物，其经快速色谱[梯度洗脱乙酸乙酯→1%甲醇/99%乙酸乙酯至2%甲醇98%乙酸乙酯]以提供纯的为无色玻璃状的产物（0.056g，44%）。分析数据：RT 3.78min；MS（ES+）m/z（相对强度）1456（[M+1]+，75）。
化合物7
在氮气氛下将Dess-Martin高碘试剂（0.026g，6.1x10-5mol，2.1eq）以一份加入到二deacetylated产物（0.042g，2.9x10-5mol，1eq）在无水DCM（5mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌4h，此时LCMS指示反应完成。将混浊的悬浮液过滤，用DCM（20mL）洗涤。滤液用饱和碳酸氢钠水溶液（25mL）水（25mL）、盐水（25mL）洗涤，并用硫酸镁干燥。通过减压下旋转蒸发去除溶剂以提供为灰白色泡沫状的产物7（0.035g，84%）。分析数据：RT 3.70min；MS（ES+）m/z（相对强度）1451（[M+1]+，30）。
化合物14
化合物14a或14b可以经由化合物8由化合物7制备。在化合物7中的Alloc保护基团可以在适当条件下去除，例如在吡咯烷存在的情况下的四(三苯基膦)钯(0)。在这些条件下，还会去除Fmoc保护基团。替换地，在去除Alloc基团之前或之后，利用在DMF中的哌啶，可以以单独的步骤去除Fmoc基团。去保护步骤的产物为亚胺甲醇胺产物，其在一个PBD单体的N10-C11位置具有亚胺官能度，以及在其他单体的N10-C11位置具有甲醇胺官能度，其中甲醇胺在N10位置具有接头C(＝O)-L1-NH2。
亚胺甲醇胺在碱存在的条件下可以与MC-OSu反应以产生化合物8。参见，例如，Dubowchik et al.,Bioconjugate Chem.2002,13,855-869。
氨基酸侧链保护基团可能然后被移出化合物8，例如，在酸的条件下。然后得到的产物可以与含有巯基官能度的适当抗体连接以提供化合物9。
在一个实例中，可以用DTT处理抗体以减少链间二硫键。所得的含有游离巯基的抗体，然后可与源于化合物8的包含马来酰亚胺的化合物反应以产生化合物9。化合物9可以例如，通过透析过滤纯化。参见，例如，Dubowchik et al.,Bioconjugate Chem.2002,13,855-869。
化合物18
在0°C将二环己基碳二亚胺（2.46g，11.92mmol，1.05eq.）加入到N-羟琥珀酰亚胺（1.44g，12.5mmol，1.1eq.）和N-Alloc苯丙氨酸（17）（2.83g，11.35mmol，1eq.）在无水DCM（120mL）中的悬浮液中。将混合物在0°C搅拌30min，然后在室温搅拌16h。过滤反应混合物被并且将滤液在减压下蒸发。将残余物重溶于DCM（50mL）中，允许放置1h，然后过滤以去除析出的二环己脲。在减压下蒸发提供为白色固体的产物（3.91g，99%）。分析数据：RT 2.93min；MS（ES+）m/z（相对强度）369（[M+钠]+，50)。.
化合物20
将琥珀酰亚胺（18）（3.91g，11.29mmoL，1eq.）在THF（50mL）中的溶液加入到H-Lys(Boc)-OH(19)（2.92g，11.85mmoL，1.05eq.）和NaHCO3（1.04g，12.42mmoL，1.1eq.）在THF（50mL）和H2O（100mL）中的溶液中。将混合物在室温搅拌72h，并且在减压下将THF蒸发。用柠檬酸将pH调至pH 3-4，以析出白色胶。将其用乙酸乙酯（2x250mL）萃取，并将复合的萃取物用H2O（200mL）、盐水（200mL）洗涤，干燥（MgSO4），并在减压下蒸发以提供为白色泡沫的产物（4.89g，91%）。分析数据：RT 3.03min；MS（ES+）m/z（相对强度）478([M+1])+，80）。
化合物7b
将EEDQ（2.66g，10.75mmol，1.05eq.）加入到p-氨基苯甲醇（21）（1.32g，10.75mmoL，1.05eq.）和Alloc-Phe-Lys(Boc)-OH（4.89g，10.24mmol，1.0eq.）在无水THF中（75mL）中的溶液中。将混合物在室温搅拌18h。将溶剂在减压下蒸发以提供淡褐色固体。将固体用二乙醚研磨，然后过滤，并用过量的二乙醚洗涤。这提供为白色固体的产物（4.54g，76%）。分析数据：RT 3.08min；MS（ES+）m/z（相对强度）583.8（[M+1]+，100）。
7b的合成在下面的方案12中描述。
方案12.
Figure BDA00002257755901381
化合物9b
-10°C在氮气氛下将三乙基胺（0.18g，0.25mL，1.79mmol，2.3eq.）加入到单-alloc保护的二-苯胺（6）（0.608g，0.77mmol，1.06eq.）和三光气（0.088g，0.3mmol，0.39eq.）在无水THF（5mL）中的搅拌溶液中。允许反应混合物到达室温，样品用甲醇处理，并由LCMS分析为氨基甲酸甲酯。
将苯甲醇（7b）（0.422g，0.72mmol，1.0eq.）和三乙基胺（0.18g，0.25mL，1.79mmol，2.3eq.）在无水THF（20mL）中的溶液滴加入到新制备的异氰酸酯中。将反应混合物在60-65°C加热回流4小时，然后在室温搅拌18小时，此时LCMS指示新产物形成。将反应混合物蒸发至干燥，以提供为黄色油状物的粗产物，其通过快速色谱[梯度洗脱50%n-己烷/50%乙酸乙酯至10%n-己烷/90%乙酸乙酯，以10%增加]纯化，以提供期望的为白色泡沫的产物（0.385g，38%）。分析数据：RT 3.78min；MS（ES+）m/z（相对强度）1402.8（[M+1]+，15）。
化合物10b
将K2CO3（0.158g，1.15mmoL，5eq.）在H2O（1mL）中的溶液加入到醋酸酯（9b）（0.32g，0.23mmoL，1eq.）在甲醇（6mL）中的溶液中。允许反应混合物在室温搅拌30min。减压下蒸发甲醇，残余物用H2O（50mL）稀释并用乙酸乙酯萃取（3x75mL）。复合的乙酸乙酯萃取物用H2O（100mL）、盐水（100mL）洗涤，干燥（MgSO4），并在减压下蒸发以提供为白色泡沫的产物（0.292g，97%）。分析数据：RT 3.52min；MS（ES+）m/z（相对强度）1318.6（[M+1]+，15）。
化合物11b
氮气氛下将Dess-Martin高碘试剂（0.197g，0.465mmol，2.1eq.）以一份加入到二去乙酰化产物（10b）（0.292g，0.22mmol，1eq.）在无水DCM（15mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌3.5h，此时LCMS指示反应完成。将反应混合物用DCM（50mL）稀释，然后用饱和碳酸氢钠水溶液（3x 100mL）、水（100mL）、盐水（100mL）洗涤，并用硫酸镁干燥。通过在减压下旋转蒸发去除溶剂以提供粗产物。通过快速柱色谱法[梯度洗脱80%乙酸乙酯/20%正己烷到100%乙酸乙酯，以5%增加]的纯化提供为黄色泡沫的产物11b（0.235g，81%）。分析数据：RT 3.42min；MS（ES+）m/z（相对强度）1314.8（[M+1]+，8）。
化合物12a
氮气氛下将钯(PPh3)4（4mg，3.5x10-6mol，0.02eq.）加入到二-alloc化合物（11b）（0.230g，0.175mmol，1eq.）和吡咯烷（31mg，36μL，0.44mmol，2.5eq.）在无水DCM（10mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌3h，此时LCMS指示残余未反应的（11b）。加入另外当量等价的吡咯烷（31mg，36μL，0.44mmoL，2.5eq.）和(PPh3)4合钯（4mg，3.5x10-6mol，0.02eq.），并将反应在室温搅拌另外的18h。LCMS指示反应完成。将反应混合物用DCM（40mL）稀释并用饱和氯化铵水溶液（100mL）、水（100mL）、盐水（100mL）洗涤，干燥（MgSO4），并在减压下蒸发以提供黄色泡沫。其用二乙醚研磨，以提供不用进一步的纯化的产物（0.187g，95%）。分析数据：RT 2.80min；MS（ES+）m/z（相对强度）1128.5（[M+1]+，20）。
化合物23
将Alloc-Val-OSu（22）（（RT 2.67min；MS（ES+）m/z（相对强度）321.4（[M+钠]+，57），根据用于制备化合物（16））（11.67g，39.0mmoL，1eq.）的方法制备）在THF（50mL）中的溶液加入到H-Ala-OH（3.66g，41.08mmoL，1.05eq.）和NaHCO3（3.61g，43.03mmol，1.1eq.）在THF（100mL）和H2O（100mL）中的溶液中。将混合物在室温搅拌72小时，并在减压下蒸发THF。将pH用柠檬酸调至pH3-4，以析出白色胶。其用乙酸乙酯（6x150mL）萃取，且复合的萃取物用H2O（200mL）、盐水（200mL）洗涤，干燥（MgSO4），并在减压下蒸发以提供白色固体。用二乙醚（过量）研磨提供纯的为白色粉末的产物23（7.93g，74%）。
分析数据：RT 2.17min；MS（ES+）m/z（相对强度）295（[M+钠]+，63），273（[M+1]+，60）。
化合物8
将EEDQ（4.79g，19.3mmol，1.05eq.）加入到p-氨基苯甲醇（21）（2.38g，19.3mmoL，1.05eq.）和Alloc-Val-Ala-OH（5.02g，18.4mmol，1.0eq.）在无水THF（100mL）中的溶液中。将混合物在室温搅拌72小时。减压下蒸发溶剂以提供浅褐色固体。将该固体用二乙醚研磨，并过滤，用过量的二乙醚洗涤。这提供为白色固体的产物（6.2g，89%）。分析数据：RT 2.50min；MS（ES+）m/z（相对强度）400.6（[M+钠]+，50)。378.6（[M+1]+，60）。
8的合成在下面的方案13中示出。
方案13.
Figure BDA00002257755901411
化合物9c
室温在氮气氛下将三乙基胺（0.16g，0.22mL 1.59mmol，2.2eq.）加入到单-alloc保护的二-苯胺（6）（0.572g，0.72mmol，1eq.）和三光气（0.077g，0.26mmol，0.36eq.）在无水THF（20mL）中的搅拌溶液中。将反应混合物加热到40°C，样品用甲醇处理并由LCMS分析为氨基甲酸甲酯。
将苯甲醇（8）（0.4g，1.06mmol，1.5eq.）和三乙基胺（0.109g，0.15mL，1.08mmol，1.5eq.）在无水THF（20mL）中的溶液滴加入到新制备的异氰酸酯中。由LCMS以30min间隔监控反应混合物。3h后，LCMS显示转化为产物，存在氨基甲酸甲酯和单-alloc保护的二-苯胺（6）。加入另外的三光气（0.038g，0.128mmol，0.18eq.），并将反应在40°C继续18h。蒸发反应混合物至干燥以提供为黄色油状物的粗产物，其通过快速色谱法[梯度洗脱100%氯仿至97%氯仿/甲醇3%，以0.5%增加]纯化以提供期望的为白色泡沫的产物（0.59g，69%）。分析数据：RT 3.58min；MS（ES+）m/z（相对强度）1197（[M+1]+，60）。
化合物10c
将K2CO3（0.195g，1.41mmoL，5eq.）在H2O（1.4mL）中的溶液加入到醋酸酯（9c）（0.338g，0.282mmoL，1eq.）在甲醇（8.5mL）中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌30min。减压下蒸发甲醇，将残余物用H2O（50mL）稀释并用乙酸乙酯萃取（3x75mL）。复合的乙酸乙酯萃取物用H2O（100mL）、盐水（100mL）洗涤，干燥（MgSO4），并在减压下蒸发以提供为白色泡沫的产物（0.298g，95%）。分析数据：RT 3.28min；MS（ES+）m/z（相对强度）1113（[M+1]+，40）。
化合物11c
氮气氛下将Dess-Martin高碘试剂（0.312g，0.74mmol，2.1eq.）以一份加入到二去乙酰化产物（10c）（0.39g，0.35mmol，1eq.）在无水DCM（20mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌3.5h，此时LCMS指示反应完成。将反应混合物用DCM（50mL）稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液（3x100mL）、水（100mL）、盐水（100mL）洗涤，并干燥（MgSO4）。通过在减压下旋转蒸发去除溶剂以提供粗产物。通过快速柱色谱法[梯度洗脱100%氯仿至97%氯仿/3%甲醇，以1%增加]的纯化提供白色固体的产物（0.201g，52%）。分析数据：RT 3.15min；MS（ES+）m/z（相对强度）1109（[M+1]+，30），MS（ES-）m/z（相对强度）1107（[M-1]-，100）。
化合物12c
氮气氛下将钯(PPh3)4（8mg，7x10-6mol，0.04eq.）加入到二-alloc化合物（11c）（0.190g，0.17mmoL，1.0eq.）和吡咯烷（61mg，71μL，0.86mmoL，5.0eq.）无水DCM（5mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌3h以提供混浊的悬浮液。减压下蒸发溶剂，并将残余物用乙酸乙酯研磨，以提供通过过滤收集的灰白色固体，以提供不用进一步纯化使用的产物（0.13g，82%）。分析数据：RT 2.55min；MS（ES+）m/z（相对强度）922（[M+1]+，52）。
化合物13a
将EEDQ（18.4mg，7.45x10-5mol，2.2eq.）加入到胺二肽（12a）（40mg 3.5x10-5mol，1.0eq.）和马来酰亚胺已酸（8.2mg，3.9x10-5mol1.1eq.）在DCM（2mL）和甲醇（1mL）中的溶液中。将溶液在40°C搅拌72h。在减压下蒸发溶剂。将残余物溶于DCM（50mL）中并用饱和NaHCO3水溶液（2x 50mL）。H2O（50mL）。盐水（50mL）洗涤，干燥（MgSO4），并在减压下蒸发以提供白色泡沫。其用二乙醚研磨并过滤，用过量的二乙醚洗涤以提供为白色固体的产物（36mg，78%）。分析数据：RT 3.27min；MS（ES+）m/z（相对强度）1320（[M+1]+，75）。
化合物13b
0°C将冷的三氟乙酸（13mL）加入到马来酰亚胺衍生物（13a）（65mg，4.9x10-5mol）中。该溶液在此温度下搅拌30min，并在减压下蒸发三氟乙酸。将残余物重溶于无水DCM（5mL）中。蒸发溶剂，并用二乙醚研磨残余物，然后通过过滤并在真空下干燥收集所得物黄色固体（64mg，97%）。分析数据：RT 2.83min；MS（ES+）m/z（相对强度）1222（[M+2]+，5）。
马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺反应物与12a或12b的结合提供PBD药物-接头15。图1a显示PBD药物-接头MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD15ba、MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 15bb和MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD15d的结构，其中PEG是乙烯氧基（ethyleneoxy），而PAB是对-氨基苯甲氧基羰基。
化合物15aa
将胺二肽（12a）（83mg，7.4x10-5mol，1eq.）溶于无水10%DMF/DCM（2mL）的混合物中，然后加入马来酰亚胺-4Peg-琥珀酰亚胺（353μL在无水DCM中的250mmol溶液），接着是N,N-二异丙基乙胺（8.2mg，11μL，8.1x10-5mol，1.1eq.）。氮气氛下将溶液在室温搅拌72h。减压下蒸发溶剂。通过快速柱色谱法[梯度洗脱100%氯仿至92%氯仿/8%甲醇，以1%增加]的纯化提供为黄色泡沫的产物（85mg，76%）。分析数据：RT 3.13min；MS（ES+）m/z（相对强度）1526（[M+1]+，5）。
化合物15ab
将胺二肽（12a）（70mg，76.2x10-5mol，1eq.）溶于无水10%DMF/DCM（2mL）的混合物中，然后加入马来酰亚胺-8Peg-琥珀酰亚胺（263μL在无水DCM中的250mmol溶液），接着是NN-二异丙基乙胺（6.9mg，9.5μL，6.6x10-5mol，1.06eq.）。氮气氛下将溶液在室温搅拌72h。减压下蒸发溶剂。通过快速柱色谱法[梯度洗脱100%氯仿至92%氯仿/8%甲醇，以1%增加]的纯化提供为褐色泡沫的产物（44mg，41.5%）。分析数据：RT 3.20min；MS（ES+）m/z（相对强度）1703（[M+2]+，5）。
化合物15ba(MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD；(11S，11aS)-4-((2S，5S)-2-(4-氨丁基)-5-苄基-25-(2，5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,7，23-三氧代-10,13,16,19-四氧杂-3,6,22-三氮杂二十五烷酰胺基(triazapentacosanamido）)苄基11-羟基-7-甲氧基-8-(5-((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901431
(benzodiazepin)-8-基氧基)戊氧基)-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901432
-10(5H)-羧酸酯)
0°C将冷的三氟乙酸（17mL）加入到马来酰亚胺衍生物（15aa）（85mg，5.6x10-5mol）中。将该溶液在此温度搅拌30min，并在减压下蒸发三氟乙酸。将残余物重溶于无水DCM中（5mL）。蒸发溶剂，并用二乙醚研磨残余物，然后通过过滤并在真空下干燥收集所得物黄色固体（70mg，81%）。分析数据：RT 2.78min；MS（ES+）m/z（相对强度）1444（[M+2]+，1）。
化合物15bb(MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD；(11S，11aS)-4-((2S，5S)-2-(5-氨丁基)-5-苄基-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,7，35-三氧代-10，13,16，19，22,25,28,31-八氧杂-3,6，34-三氮杂三十七烷酰胺基(triazaheptatriacontanamido))苄基11-羟基-7-甲氧基-8-(5-((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901441
-8-基氧基)戊氧基)-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901442
-10(5H)-羧酸酯)
0°C将冷的三氟乙酸（9mL）加入到马来酰亚胺衍生物（15ab）（44mg，2.6x10-5mol）中。将该溶液在此温度搅拌30min，并在减压下蒸发三氟乙酸。将残余物重溶于无水DCM中（5mL）。蒸发溶剂，并用二乙醚研磨残余物，然后通过过滤并在真空下干燥收集所得物黄色固体（40mg，91%）。
分析数据：RT 2.80min；MS（ES+）m/z（相对强度）1603（[M+2]+，1）。
化合物15d（MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD；(11S，11aS)-4-((2S，5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6，34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄基11-羟基-7-甲氧基-8-(5-((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901443
-8-基氧基)戊氧基)-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901444
-10(5H)-羧酸酯)
将EEDQ（12mg，4.8x10-5mol，1.1eq.）加入到将胺二肽（12c）（40.3mg 4.4x10-5mol，1.0eq.）和马来酰亚胺-8Peg-酸（28mg，4.8x10-5mol，1.1eq.）在无水DCM（5mL）中的悬浮液中。加入无水二甲基乙酰胺（0.05mL）以提供在室温搅拌18h的浅黄溶液。减压下蒸发溶剂，并将得到的残余物用二乙醚研磨。通过快速柱色谱法纯化得到的固体产物。分析数据：RT 2.90min；MS（ES+）m/z（相对强度）1496（[M+H]+，40)。
化合物15e
将N,N-二异丙基二乙基胺（10.8μL，8mg，7.6x10-5mol，2.2eq.）加入到胺二肽（12c）（32mg，3.5x10-5mol，1.0eq.）和马来酰亚胺-
Figure BDA00002257755901445
24-NHS酯（58mg，4.16x10-5mol，1.2eq.）在无水DCM（5mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌96h。反应混合物用DCM（15mL）稀释并用饱和NaHCO3（25mL）、盐水（25mL）洗涤，干燥（MgSO4），然后在减压下蒸发以提供浅黄色玻璃物。通过快速柱色谱法[梯度洗脱100%氯仿至91%氯仿/9%甲醇，以1%增加]的纯化提供产物为粘稠的黄色胶的产物（17mg，22%）。
化合物16d
选择对整联蛋白ανβ6有高度选择性的肽生物素-A20FMDV-Cys（59），其由多种癌症显著上调，用于与PBD接头衍生物结合。
将肽（59）（11.3mg，4.35μmol，0.98eq.）在1/1乙腈/水（2mL）中的溶液加入到（15d）（6.91mg，4.62μmol，1.0eq.）在1/1乙腈/水（3mL）中的溶液中。将该溶液在室温搅拌96h。在减压下蒸发乙腈，并通过冻干去除水以提供白色泡沫。通过半制备的HPLC的纯化和之后的冻干提供为白色泡沫的产物（3.8mg，21%）。分析数据：MS（MaldiTOF）m/z（相对强度）3991.1（[M+H]+，100）。
化合物24a
化合物24a公开为WO 2004/043963的化合物3。
化合物24b
0°C将固体TCCA（18g，77.4mmol，1.1eq.）分份加入到TEMPO（730mg，4.67mmol，0.07eq.）和醇24a（25g，70.5mmol，1eq.）在DCM（500mL）中的溶液中。观察到轻微的温升。30分钟后，由TLC（乙酸乙酯）和LC/MS（2.38min（ES+）m/z（相对强度）353.34（[M+H]+，100））认为反应完成。将悬浮液通过celite过滤并用DCM洗涤。滤液用亚硫酸氢钠水溶液，接着是饱和NaHCO3（警告，剧烈起泡）、盐水（100mL）洗涤，并干燥（MgSO4）。真空中过滤和蒸发溶剂提供粗产物，其通过快速柱色谱法（洗脱：20:80v/v n-己烷/EtOAc）纯化，以提供为白色固体的酮24b（20g，80%）。分析数据：[a]26D=15°（c=0.2，CHCl3）；MS（ES+）m/z（相对强度）353.34（[M+H]+，100）；IR（ATR，CHCl3）1748，1642，1518，1425，1335，1222，1176，1063，1032，986，857，785，756cm-1。
化合物25
在氮气氛下在-45°C（干冰/乙腈凉浴）将无水2,6-二甲基吡啶（0.395mL，365mg，3.40mmol）以一部分注入酮24b在无水DCM（10mL）中的剧烈搅拌的溶液（200mg，0.57mmol）中。将快速滴加注入从新打开的安瓿中取出的无水三氟甲磺酸酐（triflic anhydride）（477mL，800mg，2.83mmol），并将温度维持在-40°C或以下。允许反应混合物在-45°C搅拌1小时，此时TLC（50/50v/v n-己烷/EtOAc）指示起始材料的完全消耗。将冷的反应混合物立即用DCM（20mL）稀释，并伴随剧烈摇动，用水（1x50mL）、5%柠檬酸溶液（1x50mL）。饱和NaHCO3（50mL）、盐水（30mL）洗涤，并干燥（MgSO4）。真空中过滤和蒸发溶剂提供粗产物，其通过快速柱色谱法（梯度洗脱：60:40v/v n-己烷/EtOAc至50:50v/v n-己烷/EtOAc）纯化，以提供为黄色泡沫的三氟甲磺酸酯25（151mg，55%）。
没有相应的1,2-不饱和化合物通过NMR可见。分析数据：[α]28 D=-55°（c=0.2，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ7.75（s，1H），6.92（s，1H），6.25（t，1H，J=1.84Hz），5.19（dd，1H，J=5.05，11.93Hz），4.03（s，6H），3.90（s，3H），3.50（ddd，1H，J=2.29，11.96，16.59Hz），3.02（ddd，1H，J=1.60，5.05，16.58Hz）；IR（ATR，CHCl3）1748，1653，1577，1522，1415，1335，1276，1205，1130，1061，1024，933，908，820，783，757，663，cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）485.45（[M+H]+.，100）。
化合物26
将(PPh3)4合钯（860mg，744μmol，0.04eq.）加入到烯醇三氟甲磺酸酯25（9.029g，18.6mmol，1eq.）、4-甲氧基苯硼酸（3.67g，24.1mmol，1.3eq.）、Na2CO3（5.13g，48.3mmol，2.6eq.）、EtOH（45mL）、甲苯（90mL）和水（45mL）的搅拌混合物中。允许反应混合物在氮气氛下搅拌过夜，其后由TLC（60/40EtOAc/己烷）和LC/MS（3.10min（ES+）m/z（相对强度）443.38（[M+H]+，100））观察起始材料的完全消耗。将反应混合物用EtOAc（400mL）稀释并用H2O（2x300mL）、盐水（200mL）洗涤，干燥（MgSO4），过滤，并在减压下蒸发以提供粗产物。通过快速色谱（梯度洗脱：60:40v/v己烷/EtOAc至40:60v/v己烷/EtOAc）的纯化提供为橙色固体的C2-芳基化合物26（7.0g，85%）。分析数据：[α]25 D=-122°（c=0.2，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ7.78（s，1H），7.30（d，2H，J=8.81Hz），6.95（s，1H），6.87（s，1H），6.83（d，2H，J=8.88Hz），5.03（dd，1H，J=11.71，5.28Hz），3.95（s，3H），3.93（s，3H），3.76（s，3H），3.73（s，3H），3.48-3.43（m，1H），2.99-2.93（m，1H），13C NMR（100MHz，CDCl3）δ170.7，162.5，158.4，153.9，149.1，137.9，126.3，125.6，125.3，122.9，122.3，113.8，110.03，107.6，59.7，57.9，56.5，56.2，55.1，54.9，52.2，33.9，20.7，14..0；IR（ATR，CHCl3）1736，1624，1575，1516，1424，1326，1253，1178，1069，1031，863，820，803，786，757，653，617cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）443.38（[M+H]+.，100。
化合物27
将LiBH4（464mg，21.3mmol，1.5eq.）分份加入到酯26（6.28g，14.2mmol，1eq.）在无水THF（100mL）和EtOH（120mL）中的搅拌溶液中。观察到伴随剧烈起泡沫的温升，且温度借助于冷浴（冰/水）维持在15°C和25°C之间。允许反应混合物搅拌1小时，其后通过TLC（乙酸乙酯）观察起始材料的完全转化。将反应混合物仔细用乙酸乙酯（500mL）和过量的用冷水柠檬酸水溶液破坏的氢硼化物稀释。有机层用1NHCL水溶液（100mL）洗涤，接着是饱和NaHCO3水溶液（100mL）、盐水（100mL），用MgSO4干燥，过滤并在35°C在减压下蒸发，以提供立即重溶于无水DCM中（200mL）的中间体醇（4.50g，10.8mmol，76%中间体收率）。将溶液冷却至0°C并加入TEA（2.26mL，0.162mmol，1.5eq.），接着是乙酰氯（1mL，14.0mmol，1.3eq.）在无水DCM（30mL）中的溶液。允许将反应混合物升温至室温并反应1小时。通过TLC（EtOAc）观察完全反应。溶液用2N柠檬酸水溶液（50mL）、饱和NaHCO3水溶液（50mL）、盐水（50mL）洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物通过快速色谱（从50/50至60/40EtOAc/己烷的梯度）纯化以产生为橙色固体的纯产物2.65g（41%，通过两步骤）。分析数据：[α]24 D=-130°（c=0.28，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ7.74（s，1H），7.12（d，2H，J=8.84Hz），6.91（br s，1H），6.80（d，2H，J=8.88Hz），6.15（s，1H），5.04-5.00（m，1H），4.61-4.42（m，2H），4.01（s，6H），3.78（s，3H），3.35-3.25（m，1H），2.85-2.79（m，1H），2.06（s，3H）。13C NMR（100MHz，CDCl3）δ171.1，159.1，149.5，126.1，126.0，114.1，107.2，56.8，56.6，55.3，33.5，20.9；IR（ATR，CHCl3）1731，1643，1623，1577，1517，1421，1333，1278，1248，1222，1183，1076，1059，1032，864，821，802，787，756，644，619cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）456.81（[M+H]+.，100。
化合物28
将锌粉（365mg，5.58mmol，15eq.）加入到化合物27（170mg，0.372mmol，1eq.）在乙醇（7.6mL）和醋酸（1.97mL）中的溶液中。将混合物剧烈搅拌并加热回流。TLC监控（乙酸乙酯）和LC/MS（2.97min（ES+）m/z（相对强度）427.57（[M+H]+，100））显示反应在5min后完成。允许将反应混合物冷却，用celite过滤，且用DCM（50mL）洗涤滤器垫。滤液用水（3x30mL）、饱和NaHCO3（2x30mL）、盐水（30mL）洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物通过快速色谱（从60/40至80/20EtOAc/己烷的梯度）纯化以产生为白色泡沫的产物140mg（88%）。分析数据：[α]24 D=-108°（c=0.20，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ7.22（d，2H，J=8.80Hz），6.89（br s，1H），6.86（d，2H，J=8.82Hz），6.80（s，1H），6.29（s，1H），5.02-4.96（m，1H），4.50-4.40（m，4H），3.89（s，3H），3.82（s，3H），3.81（s，1H），3.30-3.25（m，1H），2.85-2.79（m，1H），2.06（s，3H）。13C NMR（100MHz，CDCl3）δ194.6，171.1，171.0，170.4，164.0，160.8，155.1，149.5，146.2，143.6，130.5，129.2，125.8，115.5，114.1，107.6，105.4，100.9，63.5，60.4，56.9，56.3，37.4，21.0，20.6，14.2；IR（ATR，CHCl3）1733，1589，1512，1396，1209，1176，1113，1031，823，791，762cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）427.57（[M+H]+，100）。
化合物29
在0°C将胺28（400mg，0.93mmol，1eq.）和TEA（350mL，2.5mmol，2.6eq.）在无水THF中的的溶液滴加入到新制备的三光气（125mg，0.42mmol，0.45eq.）在无水THF（4mL）的溶液中。允许白色悬浮液在0oC搅拌10min。快速加入醇7b（Alloc-Phe-Lys(Boc)-PABOH，546mg，0.93mmol，1eq.）和TEA（350mL，2.5mmol，2.6eq.）在无水THF（40mL）中的溶液。允许白色悬浮液在室温搅拌15分钟，然后在65°C加热2小时，接着允许在室温搅拌过夜。白色的TEA盐通过脱脂棉过滤去除。将滤液通过快速色谱（梯度，氯仿中1%MeOH至氯仿中3%MeOH）浓缩和纯化，以产生700mg期望的氨基甲酸酯（72%）。分析数据：[α]24 D=-30.2°（c=0.18，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ8.54（s，1H），8.43（s，1H），7.74（s，1H），7.45（d，2H，J=8.43Hz），7.23（d，2H，J=8.52Hz），7.16-7.06（m，7H），6.78-6.72（m，4H），6.46（d，1H，J=7.84Hz），5.82-5.73（m，1H），5.30（s，1H），5.19-5.06（m，2H），5.03（d，1H，J=1.29Hz），4.93-4.87（m，1H），4.63（m，1H），4.47-4.28（m，6H），3.87（s，3H），3.76（s，3H），3.72（s，1H），3.16-3.09（m，1H），3.07-2.95（m，4H），2.72-2.67（m，1H），1.95-1.83（m，1H），1.60-1.51（m，1H），1.43-1.39（m，2H），1.35（s，9H），1.28-1.19（m，2H）。13C NMR（100MHz，CDCl3）δ171.5，171.1，169.2，165.8，159.1，156.2，153.8，151.6，144.1，137.8，135.8，132.2，131.9，129.1，129.0，128.9，127.3，126.2，125.9，123.5，123.4，119.9，118.2，114.2，111.3，66.5，66.2，64.0，56.5，56.1，55.3，53.8，33.1，30.9，29.4，28.4，22.6，20.8；IR（ATR，CHCl3）1697，1652，1604，1516，1456，1418，1245，1225，1177，1115，1033，824，750cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）1036.25（[M+H]+，100）。
化合物30
将碳酸钾（600mg，4.34mmol，5eq.）的水溶液（3.3mL）加入到醋酸酯29（920mg，0.89mmol，1eq.）在甲醇（20mL）中的溶液。允许反应混合物在室温搅拌50min，此时TLC（氯仿/甲醇，90/10）显示完成。将混合物在水（150mL）和二氯甲烷（200mL）之间分层。将有机相用1N柠檬酸（50mL），接着是盐水（50mL）洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发以产生期望的醇30（700mg，79%）。[α]24D =-61°（c=0.18，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ8.60（s，1H），8.51（s，1H），7.64（s，1H），7.42（d，2H，J=838Hz），7.24-718（m，2H），7.1-705（m，7H），6.83-6.66（m，5H），5.81-5.71（m，1H），5.43（s，1H），5.18-5.08（m，2H），4.99（s，2H），4.75-4.69（m，2H），4.48-4.25（m，5H），3.86（s，3H），3.82-3.76（m，2H），3.74（s，3H），3.72（s，3H），3.19-3.12（m，1H），3.05-2.92（m，4H），2.62-2.57（m，1H），1.85-1.75（m，2H），1.59-1.51（m，1H），1.38-1.34（m，11H），1.28-1.18（m，2H）。13C NMR（100MHz，CDCl3）δ171.7，169.5，167.0，159.2，156.3，153.9，151.6，144.4，137.8，135.9，132.3，131.9，129.2，128.8，127.2，126.0，124.5，123.3，120.1，118.1，114.2，111.3，66.6，66.1，61.6，56.5，56.1，55.3，53.8，39.9，33.6，31.1，29.4，28.4，22.6；MS（ES+）m/z（相对强度）994.7（[M+H]+，100）。
化合物31
在室温将醇30（500mg，0.503mmol，1eq.）溶解于无水DCM中（50mL）。将固体Dess-Martin高碘试剂（或Dess-Martin高碘烷）（300mg，0.707mmol，1.4eq.）加入到该混合物，接着在1h时加入另外的75mg，然后在2h时加入另外的57mg，以及在5h时加入31mg，使得Dess-Martin高碘试剂的总质量达到463mg（1.09mmol，2.17eq.）。反应通过TLC连续监控（氯仿/甲醇，95/5，两个洗脱）。6.5小时后，通过在DCM和饱和NaHSO3水溶液之间分配反应混合物而逐步引起反应。然后将有机层用饱和NaHCO3水溶液，接着是盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物通过快速色谱（从0/100至2/98甲醇/氯仿的梯度）纯化以产生259mg（52%）的纯产物31。分析数据：[α]24 D=+106°（c=0.16，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ8.68（s，1H），7.54-7.46（m，2H），7.36（s，1H），7.31-7.16（m，8H），6.89（d，2H，J=8.70Hz），6.75（bs，1H），6.61（s，1H），5.89-5.84（m，2H），5.45（d，1H，J=4.80Hz），5.28-5.08（m，3H），4.84-4.76（m，2H），4.58-4.47（m，4H），4.28（bs，1H），4.02-3.95（m，1H），3.92（s，3H），3.83（s，3H），3.74（s，2H），3.41-3.32（m，1H），3.16-3.02（m，5H），2.03-1.83（m，1H），1.68-1.61（m，1H），1.55-1.39（m，11H），1.36-1.28（m，2H）。13C NMR（100MHz，CDCl3）δ171.7，169.5，163.2，159.1，156.3，151.1，148.6，138.0，135.9，132.3，129.2，128.8，127.2，126.3，126.2，121.7，120.0，118.2，114.2，112.7，110.7，86.2，79.3，67.6，66.2，59.5，56.4，56.15，56.1，55.3，53.8，39.9，38.1，35.1，31.0，29.4，28.4，22.7；IR（ATR，CHCl3）3313，2935，2356，1691，1603，1512，1431，1253，1177，1119，1033，824，750，698cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）992.41（[M+H]+，100）。
化合物32
在惰性气氛下在室温将固体钯(PPh3)4（8mg，6.9mmol，0.02eq.）加入到起始材料31（346mg，0.349mmol，1eq.）和吡咯烷（43.3mL，0.523mmol，1.5eq.）在无水DCM（10mL）中的新制备溶液中。反应在45min后完成，其通过TLC（90/10v/v氯仿/甲醇）和LC/MS（2.93min（ES+）m/z（相对强度）908.09（[M+H]+，100））指示。通过在减压下蒸发去除挥发物。将残余物通过快速色谱（从2/98至5/95甲醇/氯仿的梯度）纯化以产生298mg（94%）的纯产物32。分析数据：1H NMR（400MHz，CDCl3）δ8.87（s，1H），7.86（d，1H，J=8.06Hz），7.51（d，2H，J=8.42Hz），7.36-7.11（m，9H），6.89（d，2H，J=8.73Hz），6.58（bs，1H），5.85（d，1H，J=9.47Hz），5.32（m，1H），4.83（d，1H，J=11.68Hz），4.65（m，1H），4.47（q，1H，J=6.14Hz），4.03-3.97（m，1H），3.94（s，3H），3.84（s，3H），3.74-3.69（m，4H），3.39-3.33（m，1H），3.26（dd，1H，J=13.73Hz，J=4.00Hz），3.16-3.03（m，3H），3.26（dd，1H，J=8.91Hz，J=13.74Hz），2.05-1.96（m，1H），1.78-1.49（m，3H），1.48-1.42（m，9H），1.42-1.24（m，2H）。13C NMR（100MHz，CDCl3）δ175.45，163.2，159.1，156.2，148.6，137.3，129.3，128.8，127.0，126.2，126.2，121.7，119.8，114.2，112.6，56.2，55.3，40.7，35.1，30.5，28.4，22.8；MS（ES+）m/z（相对强度）908.09（[M+H]+，100）。
化合物33
将固体EEDQ（108mg，0.436mmol，2eq.）加入到胺32（199mg，0.219mmol，1eq.）和马来酰亚胺基己酸（57mg，0.269，1.23eq.）在DCM（6mL）和甲醇（3mL）的混合物中的溶液中。允许该溶液在室温搅拌24小时。通过LC/MS（3.45min（ES+）m/z（相对强度）1101.78（[M+H]+，100））发现反应完成。通过在减压下蒸发去除挥发物。将残余物在DCM和饱和NaHSO3水溶液之间分层，用盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物通过快速色谱（从1/99至2.5/97.5甲醇/氯仿的梯度）纯化以产生165mg（68%）的纯产物33。分析数据：[α]24 D=+94°（c=0.09，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ8.62（s，1H），7.46-7.39（m，2H），7.27（s，1H），.22-7.06（m，9H），6.79（d，2H，J=8.65Hz），6.75（bs，1H），6.57（s，2H），6.52（s，1H），6.28（s，1H），5.77（bs，1H），5.21（s，1H），4.75-4.60（m，2H），4.40（q，1H，J=5.54Hz），3.93-3.86（m，1H），3.83（s，3H），3.73（s，3H），3.65（s，2H），3.36（t，2H，J=7.16Hz），3.30-3.23（m，1H），3.08-2.90（m，5H），2.09（t，2H，J=7.14Hz），1.93-1.75（m，1H），1.62-1.31（m，17H），1.30-1.04（m，6H）。13C NMR（100MHz，CDCl3）δ173.5，170.9，170.3，169.6，163.2，159.1，156.3，151.1，148.6，136.1，134.0，129.1，128.7，127.2，126.3，126.2，124.9，123.3，121.7，120.0，114.2，112.7，110.7，86.1，79.3，67.6，59.5，56.2，56.1，55.3，54.6，53.9，53.4，37.8，37.5，36.7，35.2，31.0，29.4，28.5，28.2，26.2，24.8，22.7；MS（ES+）m/z（相对强度）1101.78（[M+H]+，100）。
化合物34
将10%TFA在DCM（12mL）中的冷冻溶液加入到33（75mg，0.068mmol，1eq.）的冷冻（-20°C）样品中。通过LC/MS（2.87min（ES+）m/z（相对强度）1001.13（[M+H]+，100））监控反应。温度在没有副作用的情况下到达-10°C的高度。反应在4小时后完成。将反应混合物倒入去离子水（50mL）中，并且冷冻干燥过夜（液氮浴，允许在没有补充的情况下蒸发）以产生纯TFA盐34（75mg，99%）。分析数据：1H NMR（400MHz，CDCl3）δ9.05（s，1H），7.87-7.62（m，4H），7.35（m，2H），7.24（s，1H），7.16-7.11（m，2H），7.10-6.96（m，8H），6.92（s，1H），6.82-6.66（m，3H），6.63-6.42（m，3H），5.75（d，1H，J=9.54Hz），5.15-5.03（m，1H），4.77-4.74（m，1H），4.68-4.56（m，1H），4.39（s，1H），3.97-3.84（m，1H），3.80（s，3H），3.72（s，3H），3.65（s，2H），3.33-3.21（m，3H），3.04-2.69（m，5H），2.04（m，2H），1.979-1.64（m，1H），1.63-1.45（m，3H），1.44-1.12（m，6H），1.07-0.95（m，2H）。MS（ES+）m/z（相对强度）1001.13（[M+H]+.，100）。
化合物35
将胺32（99mg，0.109mmol，1eq.）加入到NHS-PEG4-马来酰亚胺（Thermo Scientific，61.6mg，0.120mmol，1.1eq.）和TEA（18.2μL，0.130mmol，1.2eq.）在无水DCM（5mL）和DMF（1mL）的混合物中的溶液中。允许反应在室温搅拌过夜，此时通过LC/MS（3.27min（ES+）m/z（相对强度）1307.55（[M+H]+100））发现其几乎将完成。.通过在减压下蒸发去除挥发物。将残余物通过快速色谱（从3/97至5/95甲醇/氯仿的梯度）纯化以产生71mg（50%）的纯产物35。分析数据：1H NMR（400MHz，CDCl3）δ8.58（s，1H），7.50（d，2H，J=8.47Hz），7.28（s，1H），7.25-7.20（m，2H），7.18-7.01（m，9H），6.89（d，1H，J=7.58Hz），6.79（d，2H，J=8.68Hz），6.59（s，2H），6.51（s，1H），5.77（d，1H，J=6.42Hz），5.25（d，1H，J=11.43Hz），4.83-4.64（m，2H），4.63-4.49（m，1H），4.43-4.38（m，1H），4.18（s，1H），3.96-3.85（m，1H），3.84（s，3H），3.76-3.56（m，9H），3.57-3.34（m，15H），3.34-3.20（m，3H），3.15（dd，1H，J=14.22Hz，J=5.60Hz），3.07-2.89（m，4H），2.48-2.29（m，4H），1.97-1.90（m，1H），1.61-1.39（m，3H），1.35（s，9H），1.29-1.12（m，4H）。MS（ES+）m/z（相对强度）1307.55（[M+H]+.，100）。
化合物36
将10%TFA在DCM（10mL）中的冷冻溶液加入到35（75mg，0.054mmol，1eq.）的冷冻（-20°C）样品中。由LC/MS（2.77min（ES+）m/z（相对强度）1206.94（[M+H]+100））监控反应。反应在-25°C在18小时后完成。将反应混合物倒入去离子水（50mL）中，并且冷冻干燥过夜（液氮浴，允许在没有补充的情况下蒸发）以产生纯TFA盐36（75mg，99%）。
化合物37
将33（9.5mg，8.6μmol，1eq.）在甲醇（1.5mL）中的溶液加入到cyclic thiopeptide c(RGDfC)（5mg，8.6μmol，1eq.，来自pepnet.com）在甲醇（2mL）和水（1mL）的混合物中的溶液中。允许该反应混合物搅拌1小时。得到的沉淀物经过滤收集，并用甲醇和水（0.6mL/0.4mL）的混合物漂洗并在真空下干燥，以提供由LC/MS（3.03min（ES+）m/z（相对强度）1681.19（[M+H]+，10），790.85（100））所显示的8mg（55%）的纯产物。
化合物38
在0°C（冰浴）将化合物37（7mg）用在DCM（1mL）中的10%TFA处理2小时。通过LC/MS（2.70min（ES+）m/z（相对强度）791.44（[（M+2H）/2]+，100））发现反应完成。将反应混合物倒入去离子水（10mL）中，并且冷冻干燥过夜（液氮浴，允许在没有补充的情况下蒸发）以产生纯TFA盐38（75mg，定量产生）。
化合物39a
化合物39a及其合成在WO 00/012508和WO 2006/111759中公开。
化合物39b
方法I：将催化剂量（2滴）的DMF（起泡！）加入到硝基-酸39a（1.0g，2.15mmol）和草酰氯（0.95mL，1.36g，10.7mmol）在无水THF（20mL）中的搅拌溶液中。允许反应混合物在室温搅拌16小时，并通过在真空中蒸发去除溶剂。在氮气氛下在-30°C（干冰/乙二醇）将得到的残余物重溶于无水THF（20mL）中，并将酰基氯（acid chloride）溶液滴加入到(2S,4R)-甲基-4-羟基吡咯烷-2-羧酸酯盐酸盐(carboxylate hydrochloride)（859mg，4.73mmol）和TEA（6.6mL，4.79g，47.3mmol）在THF（10mL）中的搅拌混合物中。允许反应混合物升温至室温并在TLC（95:5v/vCHCl3/MeOH）和LC/MS（2.45min（ES+）m/z（相对强度）721（[M+H]+，20））指示产物形成时搅拌另外的3小时。将过量的THF通过旋转蒸发去除，而得到的残余物溶解在DCM（50mL）中。将有机层用1N HCl（2x15mL）、饱和NaHCO3（2x15mL）、H2O（20mL）、盐水（30mL）洗涤并干燥（MgSO4）。过滤并蒸发溶剂以提供为深色油状物的粗产物。，通过快速色谱（梯度洗脱：100%CHCl3至96:4v/v CHCl3/MeOH）的纯化分离为橙色玻璃的纯酰胺39b（840mg，54%）。
方法II：将草酰氯（9.75mL，14.2g，111mmol）加入到硝基-酸39a（17.3g，37.1mmol）和DMF（2mL）在无水DCM（200mL）中的搅拌悬浮液中。在开始起泡后，反应悬浮液变成溶液，并且允许该混合物在室温搅拌16小时。将通过用MeOH处理反应混合物的样品来确认酰基氯的转化，且得到的二-甲基酯由LC/MS观察。通过真空中蒸发去除大部分溶剂，得到的浓缩溶液重溶于极少量的无水DCM中并用二乙醚研磨。将得到的黄沉淀过滤收集，用冷的二乙醚洗涤并在真空干燥箱中在40°C干燥1小时。在-40°C（干冰/CH3CN）将固体酰基氯以25分钟的时间分份加入到(2S,4R)-甲基-4-羟基吡咯烷-2-羧酸酯盐酸盐（15.2g，84.0mmol）和TEA（25.7mL，18.7g，185mmol）在DCM（150mL）中的搅拌悬浮液中。立即，由LC/MS（2.47min（ES+）m/z（相对强度）721（[M+H]+，100））判断反应完成。将混合物用DCM（150mL）稀释并用1N HCl（300mL）、饱和NaHCO3（300mL）、盐水（300mL）洗涤，过滤（经相分离器），并在真空中蒸发溶剂，以提供为橙色固体的纯产物39b（21.8g，82%）。分析数据：[α]22 D=-46.1°（c=0.47，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）（rotamers）δ7.63（s，2H），6.82（s，2H），4.79-4.72（m，2H），4.49-4.28（m，6H），3.96（s，6H），3.79（s，6H），3.46-3.38（m，2H），3.02（d，2H，J=11.1Hz），2.48-2.30（m，4H），2.29-2.04（m，4H）；13CNMR（100MHz，CDCl3）（rotamers）δ172.4，166.7，154.6，148.4，137.2，127.0，109.7，108.2，69.7，65.1，57.4，57.0，56.7，52.4，37.8，29.0；IR（ATR，CHCl3）3410（br），3010，2953，1741，1622，1577，1519，1455，1429，1334，1274，1211，1177，1072，1050，1008，871cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）721（[M+H]+.，47），388（80）；HRMS[M+H]+.theoretical C31H36N4O16m/z 721.2199，found（ES+）m/z 721.2227。
化合物39c
在0°C将固体TCCA（32g，137mmol，2.2eq.）分份加入到TEMPO（1g，6.4mmol，0。1eq.）和二-醇18（45g，62.5mmol，1eq.）在普通DCM（500mL）中的溶液中。观察到轻微的温升。30分钟后通过TLC（乙酸乙酯）和LC/MS（2.95min（ES+）m/z（相对强度）718.10（[M+H]+，100)）认定反应完成。将悬浮液经celiete过滤并用DCM洗涤。将滤液用亚硫酸氢钠水溶液，接着是饱和NaHCO3（注意，剧烈起泡）、盐水（200mL）洗涤并干燥（MgSO4）。将溶剂过滤并在真空中蒸发提供粗产物，其通过快速柱色谱法（洗涤脱：20:80v/v n-己烷/EtOAc）纯化，以提供为白色固体的酮39c（28.23g，63%）。分析数据：[α]21 D=+18°（c=0.2，CHCl3）；MS（ES+）m/z（相对强度）718.10（[M+H]+.，100）；1H NMR（400MHz，CDCl3）mixture ofrotamers δ7.70（m，2H），6.79（m，2H），5.27（m，1H），4.44（m，1H），4.30（m，4H），3.93（m，6H），3.81（s，3H），3.75（m，1H），3.63（s，2H），3.58（m，1H），3.09-2.89（m，2H），2.74-2.53（m，2H），2.40（p，2H，J=5.73Hz）；13C NMR（100MHz，CDCl3）mixture ofrotamers δ206.5，206.4，206.0，205.9，171.2，171.1，170.6，167.0，166.7，155.0，154.5，148.8，137.7，137.3，126.4，125.4，109.8，109.1，108.6，108.4，108.4，65.7，65.6，65.5，60.4，57.9，56.7，56.7，55.1，53.6，52.9，52.9，51.6，41.2，40.1，28.7，28.6，21.0，14.1；IR（ATR，CHCl3）1764，1650，1578，1518，1415，1333，1274，1217，1060，870，824759cm-1。
化合物40
在氮气氛下在-45°C（干冰/乙腈凉浴）将无水2,6-二甲基吡啶（4.26mL，3.92g，36.6mmol）以一份注入在无水DCM（100mL）中的二-酮39c（4.23g，5.90mmol）的剧烈搅拌溶液中。快速滴注取自新打开的安瓿的无水三氟甲磺酸酐（5.96mL，10g，35.4mmol），同时将温度维持在-40°C或以下。允许反应混合物在-45°C搅拌1小时，此时TLC（50/50v/v n-己烷/EtOAc）指示起始材料的完全消耗。将冷的反应混合物立即用DCM（200mL）稀释，并伴随剧烈晃动，用水（1x300mL）、5%柠檬酸溶液（1x200mL）、饱和NaHCO3（200mL）、盐水（150mL）洗涤并干燥（MgSO4）。过滤并真空中蒸发溶剂提供粗产物，其通过快速柱色谱法（梯度洗涤脱：70:30v/v n-己烷/EtOAc至40:60v/v n-己烷/EtOAc）纯化，以提供为黄色泡沫的二-三氟甲磺酸酯40（1.32g，23%）。分析数据：[α]25 D=-68°（c=0.2，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ7.73（s，2H），6.85（s，2H），6.20（t，2H，J=1.81Hz），5.13（dd，2H，J=5.05，11.93Hz），4.33（t，4H，J=5.91Hz），3.95（s，6H），3.84（s，6H），3.43（ddd，2H，J=2.28，11.92，16.59Hz），2.96（ddd，2H，J=1.60，5.05，16.58Hz），2.44（p，2H，J=5.79Hz）；13C NMR（100MHz，CDCl3）δ169.4，164.1，154.7，149.2，138.0，135.2，124.4，121.1，120.0，116.8，110.0，108.4，65.7，65.6，57.0，56.8，53.1，33.3，28.6；IR（ATR，CHCl3）1749，1654，1576，1522，1418，1337，1277，1207，1131，1061，1023，910，821，757cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）981.86（[M+H]+.，100）。
化合物41
将钯(PPh3)4（660mg，571μmol，0.08eq.）加入到二-烯醇三氟甲磺酸酯40（7g，7.13mmol，1eq.）、4-氟苯硼酸（2.6g，18.5mmol，2.6eq.）、Na2CO3（3.93g，37.0mmol，5.2eq.）、EtOH（25mL）、甲苯（50mL）和水（25mL）的搅拌混合物中。允许反应混合物在氮气氛下搅拌过夜，此后通过TLC（60/40EtOAc/己烷）和LC/MS（3.68min（ES+）m/z（相对强度）873.90（[M+H]+，100））观察起始材料的完全消耗。将反应混合物用EtOAc（300mL）稀释并用H2O（2x200mL）、盐水（100mL）洗涤，干燥（MgSO4），过滤并在减压下蒸发以提供粗产物。通过快速色谱（梯度洗涤脱：50:50v/v己烷/EtOAc至80:20v/v己烷/EtOAc）的纯化提供为橙色固体的二-C2-芳基化合物41（5.46g，88%）。分析数据：[α]22 D=-107°（c=0.2，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ7.76（s，2H），7.14-7.04（m，4H），6.97-6.87（m，6H），6.31（s，2H），5.18（dd，2H，J=11.68，5.03Hz），4.36（t，4H，J=5.87Hz），3.97（s，6H），3.84（s，6H），3.53-3.39（m，2H），3.00（ddd，2H，J=1.22，5.01，16.28Hz），2.46（p，2H，J=5.98Hz）；13C NMR（100MHz，CDCl3）δ171.0，163.3，148.9，138.0，128.1，126.3，126.2，125.8，123.1，122.6，115.7，115.5，110.3，108.5，65.7，58.3，56.8，34.7，28.7；IR（ATR，CHCl3）1738，1650，1578，1512，1416，1333，1275，1212，1064，1023，869，808，758，654，613cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）873.90（[M+H]+.，100））。
化合物42
在0°C将LiBH4（132mg，21.3mmol，3eq.）以一份加入到酯41（5.30g，6.07mmol，1eq.）在无水THF（100mL）中的搅拌溶液中。允许反应混合物升温到室温并搅拌1小时，此后直接通过LC/MS观察（3.42min（ES+）m/z（相对强度）818.35（[M+H]+，100））起始材料的完全转化。将反应混合物仔细用乙酸乙酯（500mL）和过量的用冷的柠檬酸水溶液破坏的氢硼化物稀释。将有机层用1NHCL水溶液（100mL），接着是饱和NaHCO3水溶液（100mL）、盐水（100mL）洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在35°C在减压下蒸发，以提供立即在无水DCM（200mL）中重溶解的中间体醇。将溶液冷却到0°C，并加入咪唑（3.97g，58.0mmol，9.6eq.），接着加入TBDMS-氯（4.390g，29.1mmol，4.8eq.）。允许反应混合物升温到RT并且反应2小时。通过TLC（EtOAc/己烷，50/50）和LC/MS（4.23min（ES+）m/z（相对强度）1045.99（[M+H]+，100））观察反应完全。.将溶液用2N柠檬酸水溶液（50mL）、饱和NaHCO3水溶液（50mL）、盐水（50mL）洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物通过快速色谱（从80/20至60/40己烷/EtOAc的梯度）纯化以产生2.45g（38.6%，经二步骤）为橙色固体的纯产物。分析数据：[α]22 D=-123°（c=0.18，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ7.76（s，2H），7.17-7.06（m，4H），6.96-6.87（m，4H），6.81（s，2H），6.17（s，2H），4.84-4.72（m，2H），4.35（t，4H，J=5.87Hz），3.93（s，6H），3.25-3.07（m，2H），3.03-2.91（m，2H）2.45（p，2H，J=5.92Hz），0.84（s，18H），0.07（s，12H）；13C NMR（100MHz，CDCl3）δ163.2，160.7，154.5，148.6，137.9，130.1，130.0，126.7，126.3，126.2，124.3，123.0，115.6，115.4，110.0，108.5，65.7，60.4，59.2，56.7，33.2，28.7，25.8，25.7，21.0，18.2，14.2，-5.3；IR（ATR，CHCl3）2953，1742，1650，1576，1512，1417，1334，1274，1214，1063，1023，869，808，759，654，612cm-1；MS（ES+）m/z （相对强度）1045.99（[M+H]+.，100）。
化合物43
将甲酸（5%v/v，100mL）在乙醇中的溶液加入到二-硝基化合物42（2.35g，2.25mmol，1eq.）和锌粉（8.82g，0.135mmol，60eq.）在乙醇（35mL）中的悬浮液中。允许反应混合物在室温搅拌25min，此时TLC（甲醇/氯仿，2/98）和LC/MS（4.23min（ES+）m/z（相对强度）986.3（[M+H]+10），493.9（[(M+2H)/2]+，100））指示反应完全。将悬浮液过滤，并将滤液在乙酸乙酯（400mL）和饱和NaHCO3（200mL）水溶液之间分层。将有机物用盐水（100mL）洗涤，用MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发，以产生直接在下一步中使用的纯二-胺（2.20g，98%）。
化合物44
在-78°C（干冰/丙酮浴）将烯丙基氯甲酸酯（allyl chloroformate）（0.209mL，1.97mmol，0.9eq..）在无水DCM（50mL）中的溶液滴加到二-本胺基化合物43（2.15g，2.18mmol，1eq..）和吡啶（0.335mL，4.14mmol，1.9eq..）在无水DCM（250mL）中的溶液中。将反应混合物在-78°C搅拌2小时，然后允许到达室温。将反应混合物用饱和硫酸铜水溶液（2x50mL）、水（250mL）、盐水（100mL）洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并在减压下蒸发。将残余物通过快速色谱（从70/30至30/70己烷/EtOAc的梯度）纯化，以产生668mg（26.5%）由LC/MS（4.45min（ES+）m/z（相对强度）1154.32（[M+H]+，100））指示的二-alloc的保护的化合物和800mg期望的单-alloc保护的轻微污染的化合物（4.32min（ES+）m/z（相对强度）1070.58（[M+H]+，100））。将该化合物进一步通过快速色谱（从40/60至20/80己烷/二乙醚的梯度）纯化，以提供700mg（30%）期望的纯单-alloc化合物。分析数据：[α]22 D=-41°（c=0.16，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ8.72（bs，1H），7.88（s，2H），7.25-7.18（m，4H），7.02-6.93（m，4H），6.93-6.83（m，3H），6.80（s，1H），6.36（s，1H），6.00-5.84（m，1H），5.32（dd，1H，J=1.37，J=17.21Hz），5.21（dd，1H，J=0.90，J=10.40Hz），4.85-4.71（m，2H），4.60（dd，2H，J=1.02，J=5.62Hz），4.46（s，2H），4.31（t，2H，J=5.96Hz），4.25（t，2H，J=6.31Hz），3.98（m，2H），3.86（m，2H），3.81（s，3H），3.76（s，3H），3.19-3.05（m，2H），3.05-2.93（m，2H），2.41（p，2H，J=6.16Hz），0.84（m，18H），0.05（m，12H）；IR（ATR，CHCl3）2952，2359，1732，1652，1601，1507，1472，1406，1225，1119，836，777，668cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）1070.58（[M+H]+.，100）。
化合物45
在0°C将胺44（650mg，0.607mmol，1eq.）和TEA（220μL，1.58mmol，2.6eq.）在无水THF中的溶液滴加到三光气（81mg，0.273mmol，0.45eq.）在无水THF中（4mL）新制备的溶液中。允许该白色悬浮液在0°C搅拌10min。快速加入醇（Alloc-Val-Ala-PABOH，229mg，0.607mmol，1eq.）和TEA（220μL，1.58mmol，2.6eq.）在无水THF（30mL）中的溶液。允许白色悬浮液在室温搅拌15分钟，然后在65°C加热2小时，接着允许在室温搅拌过夜。白色的TEA盐通过经药棉过滤而去除。将滤液通过快速色谱（梯度，在氯仿中0%MeOH到在氯仿中3%MeOH）浓缩并洗涤以产生220mg期望的氨基甲酸酯（25%）。分析数据：[α]24 D=-46.1°（c=0.13，CHCl3）；1H NMR（400MHz，CDCl3）δ8.70（bs，2H），8.46（s，1H），7.83（s，2H），7.50（m，2H），7.31（d，2H，J=8.50Hz）7.25-7.15（m，4H），7.03-6.93（m，4H），6.92-6.77（m，4H），6.51（d，1H，J=7.48Hz），5.99-5.81（m，1H），5.38-5.15（m，5H），5.13-5.03（m，2H），4.77（bs，2H），4.66-4.53（m，5H），4.38-4.22（m，4H），4.08-3.94（m，3H），3.93-3.81（m，2H），3.79（s，6H），3.20-3.05（m，2H），3.05-2.94（m，2H），2.41（p，2H，J=5.95Hz），2.22-2.08（m，1H），1.45（d，3H，J=7.03Hz），0.94（dd，6H，J=6.81，14.78Hz），0.84（m，18H），0.14-0.02（m，12H）；13C NMR（100MHz，CDCl3）δ171.7，169.8，165.9，163.1，153.6，151.0，144.3，137.8，132.4，132.3，132.0，130.2，129.2，126.2，126.1，125.3，123.3，123.2，119.8，118.2，118.0，115.7，115.5，112.0，106.0，66.5，66.2，65.8，65.4，62.5，60.4，59.5，56.6，49.6，30.8，28.9，25.7，19.2，18.2，18.1，17.7，17.3，14.2，-5.4；IR（ATR，CHCl3）2950，2356，1725，1691，1602，1512，1408，1201，1109，1023，832，774，668cm-1；MS（ES+）m/z（相对强度）1473.43（[M+H]+.，100）。
化合物I2
将在干燥乙酸乙酯（15mL）中的1-苯甲基19-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)4,7,10,13,16-五氧杂十九碳烷-1,19-二酸酯（I1）（100mg，0.19mmol，1eq.）以30psi用碳钯（10mg，10wt%）氢化45分钟。将反应混合物用celite过滤，用无水乙酸乙酯洗涤。在减压下蒸发提供为无色油状物的产物I2（74mg，89%）。分析数据：RT(在LC上不可见)MS(ES+)m/z（相对强度）458([M+Na]+,55),436([M+H]+.,12)。
化合物I3
将N,N-二异丙基二乙基胺（8.4μL，6mg，5.97x10-5mol，1.1eq.）加入到胺二肽（12c）（50mg，5.42x10-5mol，1.0eq.）和酸-
Figure BDA00002257755901581
5-NHS酯（I2）（28mg，6.5x10-5mol，1.2eq.）在无水DCM（5mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌24小时。在减压下蒸发反应混合物以提供浅黄色油状物。通过快速柱色谱法[梯度洗涤脱96%氯仿/4%甲醇至92%氯仿/8%甲醇，以0.5%增加]的纯化提供为黄色玻璃的产物I3（42mg，64%）。分析数据：RT 2.78min;MS(ES+)m/z（相对强度）1242([M+H]+.，40)。
化合物49
在氮气氛下将1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（9.1mg，4.76x10-5mol，1.6eq.）加入到N-羟琥珀酰亚胺（5.8mg，5.06x 10-5mol，1.7eq.）和酸（I3）无水DCM（6mL）中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌48小时。将悬浮液过滤，用DCM（10mL）洗涤。将此DCM溶液用水（20mL）、盐水（20mL）洗涤，干燥（MgSO4）并且在减压下蒸发。产物49（32mg，80%）在没有进一步的纯化的情况下使用。分析数据：RT 2.88min;MS(ES+)m/z（相对强度）1339([M+H]+.，100)。
化合物50
在氮气氛下将钯(PPh3)4（61mg，0.053mmol，0.01eq.），加入到alloc化合物（8）（2.0g，5.3mmol，1.0eq.）和吡咯烷（0.47g，0.55mL，6.63mmol，1.25eq.）在无水DCM中的溶液中。将该溶液在室温搅拌16小时。LCMS指示未反应的alloc化合物的存在。加入另外部分的吡咯烷（0.38g，0.44mL，5.3mmol，1.0eq.）和钯(PPh3)4（61mg，0.053mmol，0.01eq.），并将反应继续另外的30分钟。将溶剂在减压下蒸发。通过快速柱色谱法[梯度洗涤脱100%氯仿然后98%氯仿/2%甲醇至90%氯仿/10%甲醇，以1%增加]的纯化提供为白色粉末的产物50（1.37g，88%）。分析数据：RT 0.33min；MS（ES+）m/z（相对强度）294（[M+H]+.60），MS（ES-）m/z（相对强度）292（[M-H]-，100）。.
化合物51
将EEDQ（1.22g，4.93mmol，1.05eq.）加入到胺二肽（50）（1.37g，4.69mmol，1eq.）和m-
Figure BDA00002257755901582
2酸（0.73g，4.93mmol，1.05eq.）在无水THF（60mL）中的溶液中。将该溶液在室温搅拌5天。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过快速柱色谱法[100%氯仿到95%氯仿/5%甲醇，以1%增加]纯化，以提供为白色固体的产物51（1.46g，74%）。分析数据：RT 2.22min；MS（ES+）m/z（相对强度）446（[M+钠]+80），424（[M+H]+70），MS（ES-）m/z（相对强度）422（[M-H]-，100）。
51的合成在下面的方案14中显示。
方案14.
化合物52
在室温在氮气氛下将三乙基胺（0.47g，0.65mL 4.66mmol，2.2eq.）加入到单-alloc保护的二-苯胺（6）（1.68g，2.12mmol，1eq.）和三光气（0.226g，0.76mmol，0.36eq.）在无水THF（40mL）中的搅拌溶液中。将反应混合物加热到40°C，样品用甲醇处理并经LCMS分析为氨基甲酸甲酯。
将
Figure BDA00002257755901592
2-苯甲基-醇（51）（1.35g，3.18mmol，1.5eq.）和三乙基胺（0.32g，0.44mL，3.18mmol，1.5eq.）在无水THF（60mL）中的溶液滴加到新制备异氰酸酯中。将反应混合物以30分钟的间隔由LCMS监控。3小时后，LC-MS显示转化成产物，存在氨基甲酸甲酯和单-alloc保护的二-苯胺（9）。加入另外部分的三光气（0.056g，0.19mmol，0.09eq.），并将反应在40°C继续3小时。将反应混合物蒸发至干燥，以提供为黄色油状物的粗产物，其通过快速色谱[梯度洗涤脱100%氯仿到95%氯仿/5%甲醇，以1%增加]纯化，以提供期望的为黄色泡沫的产物52（1.91g，73%）。分析数据：RT min 3.42min MS(ES+)m/z（相对强度）1243([M+H]+,50),MS(ES-)m/z（相对强度）1241([M-H])-,100)。
化合物53
在氮气氛下将钯(PPh3)4（35mg，3.0x10-5mol，0.02eq.）加入到alloc化合物（52）（1.87g，1.5mmol，1.0eq.）和吡咯烷（0.27mg，310μL，3.8mmol，2.5eq.）在无水DCM（30mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌4小时。将溶剂在减压下蒸发，并将产物通过快速柱色谱法[梯度洗涤脱100%氯仿到95%氯仿/5%甲醇，以1%增加]纯化以提供产物53黄色泡沫（1.57g，90%）。分析数据：RT min 3.17min MS(ES+)m/z（相对强度）1159([M+H]+.,65)。
化合物54
在室温在氮气氛下将三乙基胺（0.26g，0.36mL 2.6mmol，2.2eq.）加入到单-保护的二-苯胺（53）（1.37g，1.18mmol，1eq.）和三光气（0.126g，0.43mmol，0.36eq.）在无水THF（40mL）中的搅拌溶液中。将反应混合物加热到40°C，样品用甲醇处理并LC-MS分析为氨基甲酸甲酯，表明完全形成异氰酸酯。
将苯甲醇（8）（0.67g，1.8mmol，1.5eq.）和三乙基胺（0.18g，0.25mL，1.8mmol，1.5eq.）在无水THF（50mL）中的溶液滴加到新制备的异氰酸酯中。在40°C将反应混合物由LCMS监控并在18小时后完成。将反应混合物蒸发至干燥以提供黄色油状物，其通过快速色谱[梯度洗涤脱95%乙酸乙酯/5%甲醇到93%乙酸乙酯/7%甲醇，以1%增加]纯化以提供期望的为白色泡沫的产物54（1.21g，66%）。分析数据：RT min 3.42min MS（ES+）m/z （相对强度）1562（[M+H]+，15）。
化合物55
将K2CO3（0.522g，3.78mmol，5eq.）在H2O（5.0mL）中的溶液加入到醋酸酯（54）（1.18g，0.756mmol，1eq.）在甲醇（29mL）中的溶液中。允许该反应混合物在室温搅拌2小时。在减压下蒸发甲醇，残余物用H2O（50mL）稀释并用乙酸乙酯萃取（3x100mL）。复合的乙酸乙酯萃取物用H2O（200mL）、盐水（200mL）洗涤，干燥（MgSO4），并且减压下蒸发以提供为白色泡沫的产物55（1.052g，94%）。分析数据：RT min3.15min MS（ES+）m/z（相对强度）1478（[M+H]+，5），MS（ES-）m/z（相对强度）14779[M-H])-，100）。
化合物56
在氮气氛下将Dess-Martin高碘试剂（0.152g，0.36mol，2.1eq.）以一份加入到二去乙酰化产物（55）（0.252g，0.17mol，1eq.）在无水DCM（5mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌2h，此时LCMS指示反应完成。将反应混合物用DCM（50mL）稀释，然后用饱和碳酸氢钠溶液（3x100mL）、水（100mL）、盐水（100mL）洗涤，并干燥（MgSO4）。通过在减压下旋转蒸发去除溶剂以提供粗产物。通过快速柱色谱法[梯度洗涤脱100%氯仿到92%氯仿/8%甲醇，以1%增加]的纯化提供为白色泡沫的产物56（0.17g，68%）。分析数据：RT min 6.17min MS(ES+)m/z（相对强度）1474([M+H]+.,5),MS(ES-)m/z（相对强度）1472([M-H])-.,100)。
化合物57
在氮气氛下将钯(PPh3)4（8mg，6.9μmol，6.0eq.）加入到alloc化合物（56）（160mg，0.108mmol，1.0eq.）和在DCM中的0.5M吡咯烷（0.27mL，0.135mmol，1.25eq.）溶液在无水DCM（18mL）中的溶液中。将该溶液在室温搅拌30min。在减压下蒸发溶剂。通过快速柱色谱法[梯度洗涤脱100%氯仿到91%氯仿/9%甲醇，以1%增加]的纯化提供为白色粉末的产物57（0.114g，74%）。分析数据：RT min 2.60min MS（ES+）m/z（相对强度）1390（[M+H]+，5）。
马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺反应物与57的结合提供PBD药物-接头58。图1b示出PBD药物接头MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 58的结构，其中MP是马来酰亚胺基丙酰胺，PEG是乙烯氧基（ethyleneoxy），而PAB为对-氨基苄氧羰基，且imp是N-10亚胺保护基团：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸酯-Val-Ala-PAB。
化合物58（MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD；(11S，11aS)-4-((2S，5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7，35-三氧代-10，13,16，19，22,25,28,31-八氧杂-3,6，34-三氮杂三十七烷酰胺基)苄基11-羟基-8-(5-((11S，11aS)-11-羟基-10-((4-((10S，13S)-10-异丙基-13-甲基-8,11-二氧代-2,5-二氧杂-9,12-二氮杂十四烷酰胺基)苯甲氧基)羰基)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,10,11,11a-六氢-吡咯并苯并[2,1-c][1,4]二氮杂
Figure BDA00002257755901611
-8-基氧基)戊氧基)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-吡咯并苯并[2,1-c][1,4]二氮杂
Figure BDA00002257755901612
-10(5H)-羧酸酯)
将N,N-二异丙基二乙胺（176μL，8.8x10-5mol，2.2eq.）在无水DCM中的0.5M溶液加入到胺二肽（57）（55mg，3.96x10-5mol，1.0eq.）和马来酰亚胺-
Figure BDA00002257755901613
8-NHS酯（33mg，4.75x10-5mol，1.2eq.）在无水DCM中（6mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌24小时。将反应混合物在减压下蒸发，并将残余物重溶于DCM（50mL）中。将此DCM溶液用饱和碳酸氢钠（2x100mL）、水（100mL）、盐水（100mL）萃取，干燥（MgSO4），并且在减压下蒸发以提供黄色胶。通过快速柱色谱法[梯度洗涤脱氯仿到91%氯仿/9%甲醇，以1%增加]的纯化提供为白色泡沫的产物58（41mg，52%）。分析数据：RT min 5.8min.MS（MaldiTOF）m/z（相对强度）1987.9（[M+Na]+，100）。
结合物60
选择对整联蛋白ανβ6有高度选择性的肽生物素-A20FMDV-Cys（59），（其由多种癌症显著上调），用于与PBD接头衍生物结合。将肽（59）（7.7mg，3.08μmol，1.2eq.）在1/1乙腈/水（1mL）中的溶液加入到（58）（5.05mg，2.57μmol，1.0eq.）在1/1乙腈/水（2mL）中的溶液中。将该溶液在室温搅拌24小时。减压下蒸发乙腈，并通过冻干去除水以提供产物60白色泡沫。通过半制备的HPLC的纯化和之后的冻干提供作为白色泡沫的产物（3.4mg，29%）。分析数据：MS (MaldiTOF)m/z（相对强度）4458.3([M+H]+.,100)。
化合物61（MP-PEG24-Val-Ala-PAB-(imp)PBD；(11S.11aS)-4-((2S，5S)-16-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,14-三氧代-10-氧杂-3,6，13-三氮杂十六烷酰胺基)苄基11-羟基-8-((5-(((11S，11aS)-11-羟基-10-(((4-((10S，13S)-10-异丙基-13-甲基-8,11-二氧代-2,5-氧杂-9,12-二氮杂十四烷酰胺基)苄基)氧基)羰基)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,10，11,11a-六氢1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901621
-8-基)氧)戊基)氧)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-羧酸酯)
将N,N-二异丙基二乙胺（6μL，4.3x10-5mol，2.2eq）加入到胺二肽（57）（27mg，1.94x 10-5mol，1eq）和马来酰亚胺-
Figure BDA00002257755901623
24-NHS酯（30mg，2.13x 10-5mol，1.1eq）在无水DCM（5mL）中的溶液中。将此溶液在室温搅拌24小时。将反应混合物在减压下蒸发，并将残余物重溶于DCM（25mL）中。将此DCM溶液用饱和碳酸氢钠（2x50mL）、水（50mL）、盐水（50mL）萃取，干燥（MgSO4），并且在减压下蒸发以提供黄色胶。通过快速柱色谱法[梯度洗脱5氯仿至91%氯仿/9%甲醇，以1%增加]的纯化提供产物为无色胶的产物（22mg，42%）。分析数据：MS（MaldiTOF）m/z（相对强度）2691.8（[M+H]+，100）。
(2S.2’S，E)-二甲基1,1’-(4,4’-(丙烷-1,3-二基二(氧))二(5-甲氧基-2-硝基苯甲酰基))二(4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氢-1H-吡咯-2-羧酸酯)(71）
将四(三苯基膦)合钯(0)（21.6mg）加入到在甲苯（5mL）、乙醇（2.5mL）和水（2.5mL）的混合物中的三氟甲磺酸酯（triflate）40（230mg）、顺-丙烯基硼酸（52.3mg）、以及碳酸钠（129mg）中。氩气氛之下在32°C允许反应混合物搅拌3小时。将此反应混合物用乙酸乙酯稀释并用水、盐水洗涤，然后用硫酸镁干燥。过滤之后，通过在减压下的旋转蒸发去除过量的乙酸乙酯。将粗结合产物通过快速柱层析法（硅胶；梯度50%/50%乙酸乙酯/己烷到80%/20%乙酸乙酯/己烷）纯化。复合纯的部分，并且去除过量的洗脱液提供为橙色固体的纯产物71（110mg，61.4%收率，LC/MS3.52min，m/z ES+764.92）。以较大的比例重复反应以产生7.21g的Suzuki结合产物。1H NMR（400MHz，CD3OD）。δ7.78（s，2H）6.92（s，2H），5.98（d，2H），5.89（s，2H），5.46-5.55（m，2H），5.10（dd，2H），4.37（t，4H），3.93-4.00（m，6H），3.86（s，6H），3.19-3.26（m,2H），2.80（dd，2H），2.45-2.51（m，2H），1.77（d，6H OCH3）。
(S，E)-((丙烷-1,3-二基二(氧))二(5-甲氧基-2-硝基-4,1-苯撑))二(((S)-2-(羧甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮)(72）
0°C（冰浴）将二-酯71（7.21g）作为固体以一份加入到硼氢化锂（622mg）在无水四氢呋喃（300mL）中的溶液中。去除冰浴，并允许反应混合物达到室温。1小时后，TLC（在用乙酸乙酯水逐渐达到小型后）指示反应未完成，并因此加入另外的硼氢化锂（0.75当量）。允许反应混合物搅拌另外的2.5小时，此时TLC（逐渐达到小型后）指示反应完成。将剩余的氢硼化锂用大量过量的乙酸乙酯（冰浴）淬灭，并且允许将反应混合物搅拌50min。将复合的有机层用水、盐水洗涤，并用硫酸镁干燥。通过真空过滤去除硫酸镁，并通过在减压下的旋转蒸发去除乙酸乙酯将，以提供二醇72（5.46g，82%收率），其用于接下来的反应，不用进一步纯化（LC/MS 3.17min，m/z ES+708.84）。1H NMR（400MHz，CD3OD）。δ7.78（s，2H）6.85（s，2H），5.97（d，2H），5.77（s，2H），5.61-5.53（m，2H），4.75-4.82（m，2H），4.38（t，4H），3.89-4.00（m，12H），3.01-3.08（m，2H）2.46-2.51（m，4H），1.77（d，6H OCH3）。
((2S，2’S，E)-1,1’-(4,4’-(丙烷-1,3-二基二(氧))二(5-甲氧基-2-硝基苯甲酰基))二(4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氢-1H-吡咯-2,1-二基))二(亚甲基)二乙酸酯(73）
0°C在三乙基胺（3.68mL）存在的条件下将乙酰氯（1.64mL）在无水二氯甲烷（40mL）中的溶液滴加入到二醇72（6.2g）在二氯甲烷（200mL）中的溶液中。允许将反应混合物升温至室温，并由TLC和LC/MS监控反应。一旦反应完全，将有机相顺序地用水、柠檬酸（0.5N）、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将有机层用硫酸镁干燥，过滤并通过在减压下旋转蒸发去除过量的二氯甲烷。残余物经柱色谱法（硅胶；梯度，60%乙酸乙酯/40%己烷到70%乙酸乙酯/30%己烷）。合并纯的部分，并且去除过量的洗脱液提供二-醋酸酯73（2.50g，36%收率，LC/MS 3.60min，m/z ES+792.63）。1H NMR（400MHz，CDCl3）δ7.77（d，J=3.4Hz，2H），6.89（s，2H），5.99（d，J=15.2Hz，2H），5.78（s，2H），5.65-5.45（m，J=15.4，6.8Hz，2H），5.02-4.86（m，J=9.7，5.5Hz，2H），4.57（s，2H），4.37（t，J=5.9Hz，4H），4.00（s，6H），3.10-2.92（m，J=10.7Hz，2H），2.60（dd，J=16.3，3.1Hz，2H），2.52-2.43（m，2H），2.10（s，6H），1.78（d，J=6.7Hz，4H）。
((2S，2’S，E)-1,1’-(4,4’-(丙烷-1,3-二基二(氧)二(2-氨基-5-甲氧苯甲酰))二(4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氧-1H-吡咯-2,1-二基))二(亚甲基)二醋酸酯(74）
将锌粉（10g）加入到二硝基化合物73（2.5g）在乙醇（20mL）和乙酸乙酯（20mL）中的溶液中，接着加入甲酸在乙醇中的溶液（5%v/v；100mL）。反应是放热的，伴随温度上升到33°C，将温度用冰浴下调到15°C，并且允许将反应混合物搅拌，同时通过TLC和LC/MS密切监控。30min后，认为反应完成，因为检测不到起始材料或者中间体的痕迹。将混合物轻轻倒出并通过脱脂棉过滤。将滤液在乙酸乙酯（300mL）和饱和NaHCO3水溶液（300mL）之间分层。将有机相进一步用盐水（200mL）洗涤并用硫酸镁干燥。通过减压下的旋转蒸发去除过量的溶剂以提供产物74（2.09g；90%收率，LC/MS 3.35min，m/z ES+732.06）。1H NMR（400MHz，CDCl3）δ6.76（s，2H），6.45（s，2H），6.33（s，2H），6.12（d，J=15.3Hz，2H），5.54（dq，J=13.2，6.6Hz，2H），4.90（td，J=9.6，4.5Hz，2H），4.48（s，4H），4.42–4.33（m，4H），4.23（t，J=6.1Hz，4H），3.79（s，6H），2.95（dd，J=16.0，10.4Hz，2H），2.55（dd，J=16.2，3.5Hz，2H），2.42–2.32（m，2H），2.07（s，6H），1.81（d，J=6.6Hz，6H）。
((S)-1-(4-(3-(4-((S)-2-(乙酰氧甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氢1H-吡咯-1-羰基)-5-(((烯丙氧基)羰基氨基)-2-甲氧基苯氧基)丙氧基)-2-氨基-5-甲氧苯甲酰)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2,3-二氢-1H-吡咯-2-基)甲基(75）
在-78°C将烯丙基氯甲酸酯在无水二氯甲烷中的溶液滴加入到二-苯胺74和吡啶在无水二氯甲烷中的溶液中。允许将反应混合物在-78°C搅拌2小时，然后允许回到室温。将反应混合物顺序地用硫酸铜II水溶液、水、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将有机层用硫酸镁干燥，在真空下过滤，并通过在减压下的旋转蒸发去除过量的二氯甲烷。TLC和LC/MS指示均存在期望的单Alloc产物75和二-Alloc产物。将产物混合物经受柱色谱法（硅胶；梯度40%乙酸乙酯/60%己烷到70%乙酸乙酯/40%己烷）。收集并复合包含期望的单Alloc产物75的纯部分，通过旋转蒸发去除过量的洗脱液以提供该产物（580mL，25%收率）。LC/MS 3.58mins，ES+817.021H NMR（400MHz，CDCl3）δ8.60（s，1H），7.85（s，1H），6.80（s，1H），6.72（s，1H），6.42（s，1H），6.37（s，1H），6.33（s，1H），6.08（dd，J=15.4，6.1Hz，2H），6.00-5.87（m，1H），5.62-5.44（m，2H），5.34（dd，J=17.2，1.4Hz，1H），5.23（dd，J=10.4，1.2Hz，1H），4.88（qd，J=9.5，4.5Hz，2H），4.67-4.57（m，2H），4.50-4.25（m，8H），4.22（t，J=6.3Hz，2H），3.82（s，3H），3.76（s，3H），3.00-2.85（m，2H），2.58-2.47（m，2H），2.37（p，J=6.1Hz，2H），2.06（s，6H），1.81-1.73（m，6H）。
((2S)-1-(4-(3-(4-((S)-2-(乙酰氧甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2，3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-5-((((4-(2-(2-(烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)-2-甲氧基苯氧基)丙氧基)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-5-甲氧基苯甲酰基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2，3-二氢-1H-吡咯-2-基)甲基醋酸酯(76）
在惰性气氛下将无水三乙基胺（0.206mL）加入到单-alloc保护的二-苯胺75（560mg）和三光气（72mg）在无水四氢呋喃（20mL）中的搅拌溶液中。将反应混合物在40°C加热，且移取样品并用甲醇处理。LC/MS指示完全转化成氨基甲酸甲酯，表明游离胺基已经成功地转变为反应性异氰酸酯中间体。在40°C将alloc-val-PABOH（381mg）和三乙基胺（0.14mL）在无水四氢呋喃（20mL）中的溶液快速注入反应器。允许将反应混合物在室温搅拌过夜，此后移取样品并用甲醇处理。LC/MS指示没有氨基甲酸甲酯的痕迹，表明已消耗所有异氰酸酯。将反应混合物蒸发至干燥以提供粗产物，其通过柱色谱法纯化（硅胶；梯度氯仿到2%甲醇/98%氯仿）纯化。收集并复合纯部分，然后通过在减压下的旋转蒸发去除过量的洗脱液提供纯产物76（691mg，84%收率）。LC/MS 3.73min，ES+1220.21。
烯丙基4-(2-(2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基((S，E)-(丙烷-1,3-二基(氧))二(2-((S)-2-(羟甲基)-4-((E)-丙-1-烯-1-基)-2，3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5,1-苯撑))二羧酸酯(77）
在室温将碳酸钾水溶液（770mg在4.8mL水中）加入到二-醋酸酯76（680mg）在甲醇（29mL）中的溶液中。去乙酰作用在30min内完成，如由LC/MS所监控的。将反应混合物用二氯甲烷（200mL）稀释，并且将有机相顺序地用柠檬酸（0.5N，100mL）、水（200mL）和盐水（100mL）洗涤。用硫酸镁干燥有机相，将悬浮液过滤（真空过滤），并在减压下的旋转蒸发去除过量的溶剂。残余物经受柱色谱法（硅胶；梯度1.5%甲醇/98.5%氯仿到3.5%甲醇/96.5%氯仿）。复合纯部分，并且通过在减压下的旋转蒸发去除过量的洗脱液提供二醇77（530mg，84%收率）。LC/MS 3.40min，ES+1136.49。
(11S，11aS)-烯丙基8-(3-(((11S，11aS)-10-(((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基)氧基)羰基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-5,10,11,11a-四氢-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901651
-8-基)氧)丙氧基)-11-羟基-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-11,11a-二氢-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901652
-10(5H)-羧酸酯(78）
在室温将Dess-Martin高碘试剂（373mg，4eq.）加入到77（250mg）和吡啶（0.36mL，20eq.）在无水二氯甲烷（10mL）中的溶液中。通过TLC（5%甲醇/氯仿）的密切监测指示起始材料在30分钟之后消失。用焦亚硫酸钠和碳酸氢钠的溶液，接着是盐水逐步引起反应。二氯甲烷层是用硫酸镁干燥，并真空过滤。将该二氯甲烷溶液用催化剂量的DMAP处理（c.10mg），引起主产物斑融合成一个，如由TLC/LC/MS所观察到的。将此溶液过滤并通过在减压下旋转蒸发去除二氯甲烷。产生的残余物经受柱色谱法（硅胶；梯度1.5%甲醇/98.5%氯仿到3%甲醇/97%氯仿）。收集纯部分，并且通过在减压下的旋转蒸发去除洗脱液提供期望的环化产物78（62mg，25%收率）。LC/MS 3.35min，ES+1132.19，ES-1130.25。
(11S，11aS)-4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基11-羟基-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-5,11a-二氢-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901661
(dbenzoiazepin）-8-基)氧)丙氧基)-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-11,11a-二氧吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901662
-10(5H)-羧酸酯(79)
在氩气氛下将钯(PPh3)4（1.9mg）加入到alloc化合物（78）（62mg）和毗咯烷（22.6μL）在无水DCM（3mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌1.5小时。在减压下蒸发溶剂。通过快速柱色谱法[梯度洗脱3%甲醇/97%氯仿到90%氯仿/10%甲醇]的纯化提供为白色粉末的产物（26mg，50%）。LC/MS：RT 2.70min MS（ES+）946.17。
(11S，11aS)-4-((2S，5S)-25-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,23-三氧代-10,13,16,19-四氧杂-3,6,22-三氮杂二十五烷酰胺基(riazapentacosanamido)苄基11-羟基-7-甲氧基-8-(3-(((S)-7-甲氧基-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-5,11a-二氢-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901663
-8-基)氧)丙氧基)-5-氧代-2-((E)-丙-1-烯-1-基)-11,11a-二氢-吡咯并苯并[2,1-c][1,4]二氮杂
Figure BDA00002257755901664
-10(5H)-羧酸酯(80）
将N,N-二异丙基二乙胺i的溶液（2.6μL）加入到胺二肽79（13mg）和马来酰亚胺-
Figure BDA00002257755901665
4-NHS酯（8.5mg）在无水DCM（4mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌24h。在减压下蒸发反应混合物并将残余物经受半制备的TLC（10%甲醇/90%氯仿）以提供期望的马来酰亚胺14的纯的样品。LC-MS保留时间2.87min ES+1344.29。
Boc-Val-Cit-PABOH (82）
将Boc-Val-OSu在THF（50mL）中的溶液（10.0g，31.8mmol，1eq.）加入到H-Cit-OH（5.85g，33.4mmol，1.05eq.）和NaHCO3（2.94g，34.9mmoL，1.1eq.）在THF（50mL）和H2O（100mL）中的溶液中。将混合物在室温搅拌72小时，并在减压下蒸发THF。用柠檬酸将pH调至3，以析出白色胶。将此用10%IPA/乙酸乙酯（8x 150mL）将萃取，将复合的萃取物用盐水（300mL）洗涤并且干燥（MgSO4）。在减压下蒸发提供白色泡沫，其在减压下干燥18小时。将泡沫用超声处理悬浮在醚中，接着过滤以提供为细微白色粉末的产物（10.6g，89%）。在室温将该材料的一部分（7.2g，19.2mmol，1eq）、对-氨基苯甲醇（2.6g，21.15mmol，1.1eq.）、和EEDQ（9.5g，38.5mmol，2.0eq.）在DCM/MeOH（100mL/50mL）中搅拌24小时。在减压下蒸发溶剂，并且将剩余的胶伴随超声用醚研磨，通过过滤收集得到的产物并在减压下干燥以提供为白色固体的产物82（6.6g，71%）。分析数据：RT 2.42min;MS(ES+)m/z（相对强度）479.8([M+1]+,60),MS(ES-)m/z（相对强度）477.6([M-H])-,90)。
化合物82的合成在下面的方案16中显示。
方案16
Figure BDA00002257755901671
((S-1-(4-((5-(4-((S-2-(乙酰氧甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰)-5-((((4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊烷酰胺基(ureidopentanamido))苄基)氧基)羰基)氨基)-2-甲氧基苯氧基)戊基)氧基)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-5-甲氧苯甲酰)-4-亚甲基吡咯烷-2-基)甲基醋酸酯(83）
在室温在氩气氛下将三乙基胺（0.14g，0.19mL 1.4mmol，2.2eq.）加入到单-alloc保护二-苯胺（6）（0.505g，0.64mmol，1eq.）和三光气（0.068g，0.23mmol，0.36eq.）在无水THF（10mL）中的搅拌溶液中。将反应混合物加热到40°C，样品用甲醇处理并经LCMS分析为氨基甲酸甲酯。
将苯甲醇（82）（0.46g，0.96mmol，1.5eq.）和三乙基胺（0.096g，0.13mL，0.96mmol，1.5eq.）在无水THF/DMF（20mL/1mL）中的溶液滴加到新制备的异氰酸酯中。在40°C由LC-MS监控反应混合物，并在2小时完成。将反应混合物蒸发至干燥，并将残余物在10%IPA/DCM和水之间分层。分离有机部分，并用水（100mL）、盐水（100mL）洗涤，干燥（MgSO4），并在减压下蒸发以提供为褐色泡沫。通过快速柱色谱法[梯度洗脱氯仿至93%氯仿/7%甲醇，以1%增加]的纯化提供为白色固体的产物（0.5g，60%）。分析数据：RT 3.42min；MS（ES+）m/z（相对强度）1298（[M+1]+，100）。
烯丙基4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊烷酰氨基)苄基((S)-(戊烷-1,5-二基二(氧))二(2-((S)-2-(羟甲基)-4-亚甲基吡咯烷-1-羰基)-4-甲氧基-5,1-苯撑))二氨基甲酸酯（84）
将K2CO3（0.28g，2.0mmol，5.4eq.）在H2O（2mL）中的溶液加入到醋酸酯（83）（0.49g，0.4mmol，1eq.）在甲醇（10mL）中的溶液中。允许该反应混合物在室温搅拌2小时。在减压下蒸发甲醇，将残余物用H2O（10mL）稀释并用1M柠檬酸酸化至pH3。将混合物用DCM（4x50mL）萃取，复合的萃取物用盐水（100mL）洗涤，干燥（MgSO4），并在减压下蒸发以提供为白色泡沫的产物（0.43g，94%）。分析数据：RT 3.12min;MS(ES+)m/z（相对强度）1214([M+H]+.，100),MS(ES-)m/z（相对强度）1212([M-H])-,100)。
11S，11aS）--烯丙基8-((5-(((11S，11aS)-10-(3-(4-((S)-2-((S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊烷酰胺基)苯基)丙酰基)-11-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,10，11，11a-六氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂-8-基)氧)戊基)氧基)-11-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901682
-10(5H)-羧酸酯(85）
在氮气氛下将稳定的45wt%2-碘酰基苯甲酸（2-iodoxybenzoic acid）（IBX）（0.18g，0.29mmol，2.4eq）以一份加入到二去乙酰化的产物（55）（0.147g，0.12mmol，1eq）在无水DMSO（4mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌26小时。加入另外部分的IBX（15mg，2.4x10-5，0.2eq），并将反应继续另外的18小时。将反应混合物用H2O（10mL）稀释，用10%MeOH/DCM（4x25mL）萃取，且将复合的萃取物用饱和碳酸氢钠溶液（2x100mL）、水（100mL）、盐水（100mL）洗涤，并干燥（MgSO4）。通过在减压下旋转蒸发去除溶剂以提供粗产物。通过快速柱色谱法[梯度洗脱100%二氯甲烷至94%二氯甲烷/6%甲醇，以1%增加]的纯化提供为白色固体的产物85（77mg，53%）。分析数据：RT 2.98min;MS（ES+）m/z（相对强度）1210（[M+H]+.，100），MS（ES-）m/z（相对强度）1208（[M-H]）-，100）。
(11S，11aS）-烯丙基8-((5-(((11S，11aS)-10-(((4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊烷酰氨基)苄基)氧基)羰基)-11-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,10，11,11a-六氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901683
-8-基)氧)戊基)氧)-11-羟基-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11，11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901684
-10(5H)-羧酸酯(86）
在0°C将冷的三氟乙酸（3mL）加入到Boc保护的化合物（85）（72mg，6.0x 10-5mol）中。将此溶液在该温度搅拌15分钟。将反应混合物倒在冰上，并且pH用饱和NaHCO3溶液调至pH 8。将反应混合物DCM（4x25mL）萃取，且将复合的萃取物用饱和盐水（100mL）洗涤，干燥（MgSO4），并在减压下蒸发以提供为白色固体的产物（55mg，83%）。分析数据：RT 2.53min;MS(ES+)m/z（相对强度）1110([M+H]+.,100),MS(ES-)m/z（相对强度）1108([M-H])-.,100)。
(11S，11aS)-4-((S)-2-((S，-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊烷酰胺基)苄基11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901691
-8-基)氧)戊基)氧)-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901692
-10(5H)-羧酸酯(86）
在氮气氛下将钯(PPh3)4（2.7mg，2.3μmol，0.03eq.）加入到alloc化合物（85）（80mg，72μmol，1.0eq.）和吡咯烷（30μL，26mg，0.36mmol，5eq.）在无水DCM（3mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌2小时。在减压下蒸发溶剂。通过快速柱色谱法[梯度洗脱90%氯仿/10%甲醇到76%氯仿/24%甲醇]的纯化提供为白色粉末的产物（0.114g，74%）。分析数据：RT 2.45min MS（ES+）m/z（相对强度）1008（[M+H]+，80)。
(11S，11aS)-4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊烷酰胺基)苄基11-羟基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亚甲基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901693
-8-基)氧)戊基)氧)-2-亚甲基-5-氧代-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA00002257755901694
-10(5H)-羧酸酯(87）
在氩气氛下将N,N-二异丙基二乙胺（12μL，7.1x10-5mol，5.0eq）加入到胺二肽（86）（14.2mg，1.4x10-5mol，1eq）和6-马来酰亚胺-己酸-NHS酯（4.8mg，1.55x10-5mol，1.1eq）在无水DCM/DMA（2mL/0.2mL）中的溶液中。将溶液在室温搅拌72小时。在减压下蒸发反应混合物，并将残余物通过快速柱色谱法[梯度洗脱氯仿到93%氯仿/7%甲醇，以1%增加]纯化以提供为灰白色泡沫的产物（5mg，29%）。分析数据：RT 2.83min MS（ES+）m/z（相对强度）1390（[M+H]+，100)。
用于结合的ThioMabs的还原/氧化
将在CHO细胞中表达的全长、半胱氨酸改造的单克隆抗体（ThioMabs）用在含有2mM EDTA pH 7.5的50mM Tris（三氨基甲烷盐酸缓冲液）中的约20-40倍过量的TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）或DTT（二硫苏糖醇）在37°C还原3hr或在室温还原过夜（Getz et al(1999)Anal.Biochem.Vol 273:73-80;Soltec Ventures,Beverly,MA）。将还原的ThioMab稀释并加载到在10mm醋酸钠（pH 5）中的HiTrap S柱上，，并用含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。替换地，通过加入1/20th体积的10%醋酸酸化抗体，用10mm琥珀酸（pH 5）稀释，加载到柱上，然后用10柱体积的琥珀酸缓冲液洗涤。将柱用50mM Tris（pH7.5）、2mm EDTA洗脱。
将洗脱的还原的ThioMab用200nM硫酸铜（CuSO4）水溶液或者15倍摩尔过量的DHAA（去氢抗坏血酸）处理。链间二硫键的氧化在约三小时或更长时间内完成。环境空气氧化也是有效的。将再氧化的抗体透析到20mm琥珀酸钠（pH 5）、150mM NaCl、2mm EDTA中并冻存在-20°C。
结合ThioMabs与药物-接头化合物以制备抗体-药物结合物
将如上所描述的再氧化的ThioMabs与混合的2.5到10倍过量的混合的药物接头中间体（15ba，15bb，15d，58）结合，并在室温放置约小时，以实现结合并形成在表1中的ThioMab抗体-药物结合物101-115。通过凝胶过滤、阳离子交换层析或透析纯化该结合混合物，以去除过量的药物接头中间体和其他杂质。
表1
Figure BDA00002257755901701
Figure BDA00002257755901711
Tr=硫代曲妥珠单抗、抗HER2、4D5HC A118C（序列编号），A114C（Kabat编号）
imp=N-10亚胺受保护的：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸酯-Val-Ala-PAB-
尤其是，药物接头中间体15d（MW 1496.65）在DMA（二甲基乙酰胺）中溶解到20mm的浓度。解冻再氧化、半胱氨酸改造的H118C曲妥珠单抗抗体（Tr）并加入3倍摩尔过量的15d。在实验显示在更高的pH增加抗体聚集后，反应在pH 5进行。LC-MS分析监控药物结合的程度。3hr后加入另外的1-倍当量的15d并允许反应在4°C过夜进行以提供粗制ADC 114。
然后将抗体药物结合物，曲妥珠单抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD114在用琥珀酸稀释后施加到阳离子交换柱上，用至少10个柱体积的琥珀酸洗涤并且用PBS洗脱。利用凝胶过滤柱将抗体药物结合物114配制到20mM His/醋酸盐，pH 5，240mM蔗糖中。抗体-药物结合物114以紫外光谱学为特征以测定蛋白浓度，以分析SEC（分子排阻色谱）为特征用于聚集分析，以及以还原前后的LC-MS为特征以测定药物加载。
分子排阻色谱利用在以0.75mL/min的流速含有0.25mM氯化钾和15%IPA的0.2M磷酸钾（pH 6.2）中的Shodex KW802.5色谱柱来实施。结合物的聚集状态由在280nm的洗脱的峰面积吸光度的整合确定。SEC分析显示4.1%的在8.08min的聚集的ADC的整合面积和95.9%在8.99min的单体ADC 114。
LC-MS分析利用Agilent QTOF 6520 ESI仪器来实施。例如，将114曲妥珠单抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD用DTT（二硫苏糖醇）还原并加载到
Figure BDA00002257755901712
8μm PLRP-S色谱柱（Varian）加热到80°C，并在5分钟内以30%B至40%B的梯度洗脱。移动相A为含有0.05%TFA的H2O，移动相B是含有0.04%TFA的乙腈。流速为0.5mL/min。在电喷射离子化和TOF分析之前由在A 280nm的UV吸光度检测监测蛋白洗脱。实现裸露的轻链、剩余的裸露的重链以及药物连接（drugged）重链的基线色谱分离。获得的m/z谱利用Agilent Mass Hunter（TM）软件去卷积，以计算还原的抗体片段的质量。
MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 58（图1）的分子量=1964道尔顿
观察到的去卷积质量（masses）：
23440道尔顿，对应裸露的LC的MW
50627道尔顿，对应裸露的HC的MW
52591道尔顿，对应药物连接的HC的MW
因此，在52591道尔顿所观察到的峰值对应期望的重链（HC）片段（50627道尔顿），其含有一个药物部分、药物-接头中间体58（1964道尔顿）。
在用于与PBD药物接头中间体结合的抗体不是半胱氨酸改造的抗体时，通过在37°C加入约在磷酸盐（pH 7.5）中2.2摩尔过量的TCEP 2小时来部分还原链间二硫键。每当量的TCEP理论上产生2当量的反应性半胱氨酸。加入典型地用于靶药物/抗体比率（DAR）的约3.5，1.8-2摩尔过量的TCEP。在还原后一般不需要纯化步骤。加入轻微过量的（1.2-1.5X)对于反应性半胱氨酸的药物-接头中间体，约8摩尔当量对于抗体的药物接头中间体并姜反应在室温进行约1小时。可通过透析过滤、离子交换或凝胶过滤进行纯化。DAR可由还原的结合物的疏水作用层析（HIC）、或LC-MS，利用UVA280面积整合测定。
体外细胞增殖试验
ADC的效能通过细胞增殖试验采用以下方案来测定（CellTiter GloLuminescent Cell Viability Assay,Promega Corp.Technical Bulletin TB288;Mendoza et al (2002)Cancer Res.62:5485-5488）：1.将在培养基中包括约104个细胞的细胞培养的100μL的等分部分（例如，KPL-4、人乳腺癌细胞系（Kurebayashi et al(1999)Brit.Jour.Cancer 79(5-6):707-717）、SKBR-3、BT474、MCF7或MDA-MB-468）置于96孔壁不透明板（opaque-walledplate）中的每个孔中。
2.制备包含培养基而没有细胞的对照。
3.将ADC加入到实验孔中并孵育3-5天。
4.将平板平衡到室温约30分钟。
5.加入等于存在于每孔中的细胞培养基的体积的CellTiter-GloReagent。
6.在定轨振荡器上混合内含物2分钟以诱导细胞裂解。
7.将平板在室温孵育10分钟以稳定发光信号。
8.在图表中将发光记录并报告为RLU=相对发光单位。
在96-孔板中以1000-2000/孔或2000-3000/孔，50uL/孔接种特定细胞，。在一两天后，加入50μL的ADC至终浓度为9000、3000、1000、333、111、37、12.4、4.1，或1.4ng/mL，以及“没有ADC”的对照孔只接收培养基。条件是以两份或三份。在3-5天后，加入100μL/孔的Cell TiterGloII（基于萤光素酶的试验；由ATP水平测定增殖），并使用发光计来测定细胞计数。对于每组重复将数据描绘为平均发光，带有标准差误差棒。该方案是CellTiter Glo Luminescent Cell Viability Assay（Promega）的修改：
1.平板1000细胞/孔，在50μL/孔的FBS/谷氨酰胺培养基中。允许细胞附着过夜。
2.将在培养基中以18μg/mL的使用浓度起始连续稀释1:3（这产生9μg/mL的最终浓度）。将50μL稀释的ADC加入到50μL的细胞中而培养基已经在孔中。
3.孵育72-96hr（标准为72小时，但是在细胞85-95%连生的时候，注意0ug/mL浓度以停止试验）。
4.加入100μL/孔的Promega Cell Titer Glo试剂，振动3min。在发光计上读数
结果
图2显示在5天时SK-BR-3体外细胞活力相对于以下物质的浓度的绘图：Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101（●）、抗CD22-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 102（▲）、Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103（◆），以及抗CD22-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 104，其中Tr为抗HER2硫代曲妥珠单抗4D5HC A118C，重链半胱氨酸改造抗体突变型由顺序编号方案（Sequennial numbering scheme）编号。
表达HER2的SK-BR-3细胞的增殖选择地被抗HER2抗体-药物结合物101和103抑制，但不被抗CD22抗体药物结合物102和104抑制。这些结果确认PBD抗体-药物结合物在体外的靶依赖性、选择性杀伤效应。
图3显示在5天时KPL-4体外细胞活力相对于以下物质浓度的绘图：Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101（●），抗CD22-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 102（▲），Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103（◆），以及抗CD22-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 104
Figure BDA00002257755901731
其中Tr为抗HER2硫代曲妥珠单抗4D5HC A118C，重链半胱氨酸改造抗体突变型由顺序编号方案（Sequential numbering scheme）编号。
在五天的研究中针对SK-BR-3、KPL-4，和MCF-7细胞测试抗体-药物结合物，曲妥珠单抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD 114和曲妥珠单抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 115（Levenson et al(1997)Cancer Res.57(15):3071-3078）以测定内体外细胞活力。对于114针对SK-BR-3的IC50（μg/mL）值为17.2，而针对KPL-4的为68.1。对于115针对SK-BR-3的IC50值为12.3，而针对KPL-4的为50.7。114和115针对MCF-7均事实上无活性的，MCF-7是不表达HER2的人乳腺癌细胞系。因此，结合物114和115表明靶向杀伤细胞的能力。
在高表达HER2的转基因的外植体小鼠中的体内效能的肿瘤生长抑制
适合转基因实验的动物可以从标准商业来源如Taconic（Germantown，纽约）获得。许多品系是合适的，但优选FVB雌小鼠，因为它们更易于肿瘤形成。FVB雄性用于交配并切除输精管。使用CD.1大头针用于刺激假孕。切除输精管的小鼠可以从任何商业供应商获得。创立者（founder）与FVB小鼠或与129/BL6xFVB p53杂合的小鼠繁殖。在p53等位基因具有杂合性的小鼠用于潜在增加肿瘤形成。然而，已证明这是不必要的。因此，一些F1肿瘤是混合品系。创立者肿瘤仅为FVB。六个创立者由一些发展肿瘤而没有产仔的获得。
有肿瘤的动物（由Fo5 mmtv转基因小鼠同种异体移植繁殖）通过IV注射ADC用单或多剂量处理。在注射后的各时间点评估肿瘤体积。
肿瘤在表达变异地活化的神经鞘（HER2的大鼠同系物）的转基因小鼠中迅速出现，而在人乳腺癌中过表达的HER2没有变异，且肿瘤形成在过表达非突变HER2的转基因小鼠中是较不稳健的（robust）（Webster et al(1994)Semin.Cancer Biol.5:69-76）。
为了提高有非变异的HER2的肿瘤形成，利用删除上游ATG以防止在该上游ATG密码子处起始翻译的HER2 cDNA质粒（其不然将减少从HER2的下游的真正起始密码子处起始的翻译频率），产生转基因小鼠，（例如，见Child et al(1999)J.Biol.Chem.274:24335-24341）另外，如较早报道的，将嵌合内含子加入到5’末端，其也应增强表达水平（Neubergerand Williams(1988)Nucleic Acids Res.16:6713；Buchman and Berg(1988)Mol.Cell.Biol.8:4395;Brinster et al(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:836）。嵌合内含子源于Promega载体、Pci-新哺乳动物表达载体（bp890-1022）。cDNA 3’末端由人体生长激素外显子4和5以及多聚腺苷化序列侧面包围。此外，使用FVB小鼠，因为该品系更易于肿瘤发展。使用来自MMTV-LTR的启动子以确保在乳腺中的组织特异性HER2表达。将动物用AIN 76A食物喂养，以增加肿瘤形成的易感性（Rao et al(1997)Breast Cancer Res.and Treatment 45:149-158）。
Fo5鼠乳腺肿瘤模型
Fo5模型是转基因鼠模型，其中人HER2基因，在鼠乳房肿瘤病毒启动子（MMTV-HER2）的转录调节下，在乳房的上皮细胞中过表达。过表达引起乳腺肿瘤的自发发展，其过表达人HER2受体。创立者动物（创立者#5[Fo5]）之一的乳腺肿瘤通过肿瘤碎片移植已经在FVB小鼠的后代中增殖。在用于体内效能研究之前，MMTV-HER2Fo5转基因乳腺肿瘤以测量大约2x2mm的碎片手术移植到入裸小鼠（来自Charles RiverLaboratories）的No.2/3乳房的脂垫中。在肿瘤到达期望的体积时，将荷瘤小鼠随机分组并通过IV注射ADC给予单剂量。
结果
图4示出在乳腺癌模型MMTV-HER2Fo5中，接种到CRL裸/裸小鼠中的乳房同种异体移植肿瘤在第0天单一静脉内（iv）给予以下物质之后体内平均肿瘤体积随时间变化的绘图：（1）载体20mM组氨酸醋酸盐，pH 5.5，240mM 蔗糖，（2）以10/mg/kg的抗Steap1-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 107，（3）以10mg/kg的抗Steap1-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 108，（4）以10mg/kg的Tr-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 101，以及（5）以10mg/kg的Tr-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD 103。图中的线用下列符号指示：
Figure BDA00002257755901751
载体
Figure BDA00002257755901752
107
Figure BDA00002257755901753
108
Figure BDA00002257755901754
101
Figure BDA00002257755901755
103
抗HER2结合物101和103显示靶向-特异性肿瘤生长抑制。从用结合物101处理的10个动物中，两个显示部分响应。从用结合物103处理的10个动物中，三个显示部分响应。非靶向对照ADC 107和108对肿瘤生长没有影响。
在另外的示例性研究中，在乳腺癌模型MMTV-HER2Fo5中，接种到CRL裸/裸小鼠中的乳房同种异体移植肿瘤在第0天单iv给予以下物质之后体内平均肿瘤体积随时间的变化：（1）载体20mM组氨酸醋酸盐，pH 5.5，240mM蔗糖；（2）以5mg/kg（ADC剂量），300μg/m2（PBD药物暴露）的112gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD；（3）以10mg/kg，600μg/m2的112gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD；（5）以5mg/kg，284μg/m2的114曲妥珠单抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD；（5）以10mg/kg，569μg/m2的114曲妥珠单抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD；（6）以10mg/kg，807μg/m2的113gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD；（7）以10mg/kg，790μg/m2的115曲妥珠单抗-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD。在第0、3、7、和10天时测量肿瘤大小。在10天之后，给予（1）载体的动物显示在10动物组中增加的肿瘤大小且没有肿瘤抑制作用；给予（2）112的动物显示在10动物组中部分或完全的响应；给予（3）112的动物显示在10动物组中没有部分或完全的响应；给予（4）114的动物显示在10动物组中九个部分响应；给予（5）114的动物显示在10动物组中十个部分响应；给予（6）113的动物显示在10动物组中没有部分或完全的响应；给予（7）115的动物显示在10动物组中十个部分响应。因此，抗HER2靶向的ADC 114和115显示靶向肿瘤抑制，而阴性对照载体和非靶向的ADC 112和113则没有（靶向肿瘤抑制）。
LuCap35V人前列腺肿瘤模型
从华盛顿大学（西雅图，WA）获得的LuCap35V是LuCap35人类前列腺移植肿瘤模型的雄激素独立的变体（Corey E,Quinn JE,Buhler KR,et al.LuCap35:a new model of prostate cancer progression to androgenindependence.The Prostate 2003;55:239-46）。用来建立LuCap35的组织从含有转移前列腺癌的腹股沟淋巴结的活组织解剖中分离，随后移植入小鼠的胁腹（Corey et al.2003）。LuCap35V移植模型在华盛顿大学通过在阉割的雄性C.B-17Fox Chase SCID小鼠中连续移植38个传代，其后由CharlesRiver Laboratories在Genentech在阉割的雄性C.B-17SCID-浅褐色小鼠中继续传代来保持。在用于体内效能研究之前，将LuCap35V肿瘤块（约20-30mm3）皮下植入到阉割的雄性C.B-17SCID-浅褐色小鼠的右胁腹里。在肿瘤移植之前的2周将动物阉割以允许剩余的睾酮水平到达零的时间。在肿瘤到达期望的体积时，将荷瘤小鼠随机分组并通过静脉（IV）注射ADC给予单剂量。
结果
图5示出在前列腺癌-模型LuCap35V中在阉割的雄性SCID浅褐色小鼠中的异种肿瘤在第0天单iv给予以下物质之后体内平均肿瘤体积随时间变化的绘图：（1）载体20mM组氨酸醋酸盐，pH 5.5，240mM蔗糖（▲），（2）以5mg/kg的抗CD22-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 110（●），以及（3）以5mg/kg的抗Steap 1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD 109（■）。
图6示出在前列腺癌-模型LuCap35V中在阉割的雄性SCID浅褐色小鼠中的异种肿瘤在第0天单iv给予以下物质之后体内平均肿瘤体积随时间变化的绘图：（1）载体20mM组氨酸醋酸盐，pH 5.5，240mM蔗糖（▲）（2）107抗Steap 1-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD，9.8mg/kg，60μg/m2（■），（3）107抗Steap 1-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD，19.5mg/kg，120μg/m2（●），（4）108抗Steap1-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD，3.3mg/kg，60μg/m2（□），（5）108抗Steap1-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD，6.5mg/kg，120μg/m2（○），（6）105曲妥珠单抗-MP-PEG8-Phe-Lys-PAB-PBD 9.4mg/kg，120μg/m2（◆）以及（7）106曲妥珠单抗-MP-PEG4-Phe-Lys-PAB-PBD，8.6mg/kg（ADC剂量），120μg/m2（PBD药物暴露）（X）。
在另外的示例性研究中，在前列腺癌-模型LuCap35V中在阉割的雄性SCID浅褐色小鼠中的异种肿瘤在第0天单iv给予以下物质之后体内平均肿瘤体积随时间的变化：（1）载体20mM组氨酸醋酸盐，pH 5.5，240mM蔗糖，（2）112gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，3mg/kg（ADC剂量），68.3μg/m2（PBD药物暴露），（3）111抗Steap 1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，1mg/kg，22.15μg/m2，（4）111抗Steap 1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-PBD，3mg/kg，66.4μg/m2，（5）113gD5B60-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD，3mg/kg，70.1μg/m2，以及（6）109抗Steap 1-MP-PEG8-Val-Ala-PAB-(imp)PBD，3mg/kg，64.6μg/m2。每4天测量肿瘤大小。27天之后，给予（1）载体的动物显示在8动物组中增加肿瘤大小且没有肿瘤抑制；给予（2）112的动物显示在8动物组中的一个部分响应；给予（3）111的动物显示在6动物组中四个部分响应和四个完全响应；给予（4）111的动物显示在5动物组中五个部分响应和三个完全的响应；给予（5）113的动物显示在8动物组中没有部分或完全响应；给予（6）的动物109显示在7动物组中七个部分响应和一个完全响应。抗Steap1靶向的ADC 109和111显示靶向的肿瘤抑制，而阴性对照载体和非靶向的ADC 112和113没有（靶向的肿瘤抑制）。
缩写
Ac      乙酰基
Acm     乙酰胺基甲基
Alloc   烯丙氧基羰基
Boc     二-叔丁基二碳酸酯
t-Bu    叔丁基
Bzl     苄基，其中Bzl-OMe为甲氧苄基而Bzl-Me为甲苯
Cbz或Z  苄氧基-羰基，其中Z-Cl和Z-Br分别为氯-苄氧基羰基和溴苄氧基羰基
DMF    N，N-二甲基甲酰胺
Dnp    二硝基苯基
DTT    二硫苏糖醇
Fmoc    9H-芴-9-基甲氧基羰基
imp     N-10亚胺保护基团：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸酯-Val-Ala-PAB
MC-OSu   马来酰亚胺己酰基-O-N-琥珀酰亚胺（maleimidocaproyl-O-N-succinimide）
Moc    甲氧羰基
MP     马来酰亚胺丙酰胺（maleimidopropanamide）
Mtr    4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基
PAB    对-氨基苄氧羰基
PEG    乙烯氧基（ethyleneoxy）
PNZ    氨基甲酸p-硝基苄基酯
Psec   2-(苯磺酰基)乙氧羰基
TBDMS  叔-丁基二甲基甲硅烷基
TBDPS  叔-丁基二苯基甲硅烷基
Teoc   2-(三甲基硅烷基)乙氧羰基
Tos    甲苯磺酰基（tosyl）
Troc   2,2,2-三氯乙氧基羰基氯（2,2,2-trichlorethoxycarbonylchloride）
Trt    三苯甲基（trityl）
Xan    氯蒽基（xanthyl）
参考文献
以下参考文献通过引入以其全部内容并入：
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Claims (77)

1.一种式（A）的结合物：
Figure FDA00002257755800011
以及其盐和溶剂合物，其中：
所述虚线表明在C1和C2之间或在C2和C3之间的双键可选存在；
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且可选地进一步选自卤素或二卤素；
其中，RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤素；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R10是连接到细胞结合剂的接头；
Q独立地选自O、S和NH；
R11是H或R或者，其中Q是O、SO3M，其中M是金属阳离子；
R和R’各自独立地选自可选地取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基，并可选地与基团NRR’相关，R和R’与它们所连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环；
或从R6到R9的任何一对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，
或所述化合物为每个单体是式（A）或一个单体是式（A）而另一个是式（B）的二聚体：
Figure FDA00002257755800021
其中，R2、R6、R9、R7、和R8根据所述式（A）化合物来定义，且每个单体的所述R7基团或R8基团一起形成具有连接所述单体的式-X-R”-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被以下所中断：一个或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环，例如苯或吡啶，其环可选地被NH2取代；
并且每个X是O、S或N(H)；
或其中所述化合物为每个单体是式（A）的二聚体，每个所述单体中的R10为封端基团，RC，或是连接到细胞结合剂的接头。
2.根据权利要求1所述的结合物，其中，R10可从所述N10位置去除以留下N10-C11亚胺键。
3.根据权利要求1或权利要求2中任一项所述的结合物，其中R10是基团：
其中，所述星号表示与所述N10位置的连接点，CBA是细胞结合剂，L1是可断裂的接头，A是将L1与所述细胞结合剂连接的连接基团，L2是共价键或与-OC(=O)-一起形成自脱落接头。
4.根据权利要求5所述的结合物，其中，L1是酶可断裂的。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的结合物，其中L1包括氨基酸的连续序列。
6.根据权利要求5所述的结合物，其中，L1包括二肽，且在二肽-NH-X1-X2-CO-中的所述基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-、
-Val-Cit-、
-Phe-Cit-、
-Leu-Cit-、
-Ile-Cit-、
-Phe-Arg-、
-Trp-Cit-。
7.根据权利要求6所述的结合物，其中，在二肽-NH-X1-X2-CO-中的所述基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-、
-Val-Cit-。
8.根据权利要求7所述的结合物，其中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的所述基团-X1-X2-是-Phe-Lys-、-Val-Ala-或-Val-Cit-。
9.根据权利要求6至8中的任一项所述的结合物，其中，所述基团X2-CO-与L2连接。
10.根据权利要求6至9中的任一项所述的结合物，其中，所述基团NH-X1-与A连接。
11.根据权利要求6至9中的任一项所述的结合物，其中，L2与OC(=O)一起形成自脱落接头。
12.根据权利要求11所述的结合物，其中，C(=O)O与L2一起形成基团：
Figure FDA00002257755800041
其中所述星号表示与所述N10位置的连接点，所述波形线表示与所述接头L1的连接点，Y是NH、O、C(=O)NH或C(=O)O，以及n为0至3。
13.根据权利要求12所述的结合物，其中，Y是NH。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的结合物，其中n是0。
15.根据权利要求3所述的结合物，其中，L1和L2与-OC(=O)-一起包括选自以下的基团：
Figure FDA00002257755800051
其中，所述星号表示与所述N10位置的连接点，所述波形线表示与所述接头L1的剩余部分的连接点或与A的连接点。
16.根据权利要求15所述的结合物，其中，所述波形线表示与A的连接点。
17.根据权利要求3至16中任一项所述的结合物，其中A是：
（i）
其中，所述星号表示与L1的连接点，所述波形线表示与所述细胞结合剂的连接点，而n为0至6；或
（ii）
Figure FDA00002257755800061
其中，所述星号表示与L1的连接点，所述波形线表示与所述细胞结合剂的连接点，n为0或1，而m是0至30。
18.根据权利要求3至17中任一项所述的结合物，其中，所述细胞结合剂通过由所述细胞结合剂的半胱氨酸硫醇残基与A的马来酰亚胺基团所形成的硫醚键而与A连接。
19.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，其中R10的细胞结合剂是抗体或其活性片段。
20.根据权利要求19所述的结合物，其中，所述抗体或抗体片段是肿瘤相关抗原的抗体或者抗体片段。
21.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，其中，R9独立地是H。
22.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，其中R6独立地是H。
23.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，其中R7独立地是OR7A，其中R7A独立地是可选取代的C1-4烷基。
24.根据权利要求23所述的结合物，其中，R7A是Me。
25.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，其中X是O。
26.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，其中R11是H。
27.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，所述虚线表示C2和C3之间的双键可选存在。
28.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，其中R2独立地选自H、=O、=CH2、R、=CH-RD和=C(RD)2。
29.根据前述权利要求28中任一项所述的结合物，其中，R2独立地是=CH2。
30.根据前述权利要求28中任一项所述的结合物，其中，R2独立地是R。
31.根据前述权利要求30中任一项所述的结合物，其中，R2独立地是可选取代的C5-20芳基。
32.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，其中，所述结合物为二聚体，并且每个单体的R8基团一起形成二聚体桥。
33.根据权利要求32所述的结合物，其中，R”为C3亚烃基或C5亚烃基。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的结合物，其中，所述结合物是一个单体为式（A）而另一个单体为式（B）的二聚体，且所述化合物具有如下所示的结构：
Figure FDA00002257755800071
其中，R2”、R6”、R7”、R9”、X”和R11”分别根据R2、R6、R7、R9、X和R11来定义。
35.根据权利要求32或权利要求33所述的结合物，其中所述结合物是每个单体为式（A）的二聚体，且所述化合物具有如下所示的结构：
Figure FDA00002257755800081
其中，R2”、R6”、R7”、R9”、R10”、X”、Q’’和R11”分别根据R2、R6、R7、R9、R10、X、和R11来定义。
36.根据权利要求32或权利要求33所述的结合物，其中所述结合物是每个单体为式（A）的二聚体，且所述化合物具有如下所示的结构：
Figure FDA00002257755800082
其中，R2”、R6”、R7”、R9”、X”、Q”和R11”分别根据R2、R6、R7、R9、X、和R11来定义，以及RC是封端基团。
37.根据权利要求36所述的结合物，其中，RC可从所述N10位置去除以留下N10-C11胺键。
38.根据权利要求37所述的结合物，其中，RC是选自以下的氨基甲酸酯保护基团：
Alloc
Fmoc
Boc
Troc
Teoc
Psec
Cbz
PNZ。
39.根据权利要求37所述的结合物，其中，RC为基团：
其中，所述星号表示与N10位置的连接点，G2是末端基团，L3是共价键或可断裂的接头L1，L2是共价键或者与OC(=O)一起形成自脱落接头。
40.根据权利要求39所述的结合物，其中，L3是可断裂的接头L1，并且被定义在权利要求4至9中的任一项中。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的结合物，其中，L2与OC(=O)一起形成自脱落接头，并且所述自脱落接头被定义在权利要求12至14中的任一项中。
42.根据前述权利要求39-41中任一项所述的结合物，其中G2是Ac或Moc，或是选自以下的氨基甲酸酯保护基团：
Alloc
Fmoc
Boc
Troc
Teoc
Psec
Cbz
PNZ。
43.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，用于在治疗中的应用。
44.根据前述权利要求1-42中任一项所述的结合物，用于在治疗对象的增殖性疾病中的应用。
45.根据权利要求44所述的结合物，其中，所述疾病是癌症。
46.根据前述权利要求中任一项所述的结合物，具有下式：
Ab-(L-D)p
其中，Ab是通过接头部分（L）与式（A）PBD药物部分（D）连接的抗体，而p是从1到约8的整数。
47.根据权利要求46所述的结合物，其中，Ab是与选自以下（1）-（36）的一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体：
（1）BMPR1B（骨形态生成蛋白受体-类型IB）；
（2）E16（LAT1，SLC7A5）；
（3）STEAP1（前列腺六次跨膜上皮抗原）；
（4）0772P（CA125，MUC16）；
（5）MPF（MPF、MSLN、SMR、巨核细胞促进因子、间皮素）；
（6）Napi3b（NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34（磷酸钠）、成员2、II型钠依赖的磷酸转运体3b）；
（7）Sema 5b（FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、、臂板蛋白5b Hlog、sema域、七凝血酶敏感蛋白重复（类型1和类型-1样）、跨膜区（TM）和短胞质域、（臂板蛋白）5B）；
（8）PSCA hlg（2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因）；
（9）ETBR（内皮素B型受体）；
（10）MSG783（RNF124、假定蛋白FLJ20315）；
（11）STEAP2（HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺六次跨膜上皮抗原2、六次跨膜前列腺蛋白质）；
（12）TrpM4（BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道、亚家族M、成员4）；
（13）CRIPTO（CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎瘤衍生生长因子）；
（14）CD21（CR2（补体受体2）或C3DR（C3d/爱泼斯坦-巴尔病毒受体）或Hs 73792）；
（15）CD79b（CD79B、CD79b、IGb（免疫球蛋白相关的β），B29）；
（16）FcRH2（IFGP4、IRTA4、SPAP1A（包括磷酸酶锚定蛋白1a的SH2域）、SPAP1B、SPAP1C）；
（17）HER2；
（18）NCA；
（19）MDP；
（20）IL20Ra；
（21）短蛋白聚糖；
（22）EphB2R；
（23）ASLG659；
（24）PSCA；
（25）GEDA；
（26）BAFF-R（B细胞-激活因子受体、BLyS受体3、BR3）；
（26）CD22（B-细胞受体CD22-B亚型）；
（28）CD79a（CD79A、CD79a、免疫球蛋白关联α）；
（29）CXCR5（伯基特淋巴瘤受体1）；
（30）HLA-DOB（MHCII类分子的β-亚基（Ia抗原））；
（31）P2X5（嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5）；
（32）CD72（B细胞分化抗原CD72，Lyb-2）；
（33）LY64（淋巴细胞抗原64（RP105），富含亮氨酸的重复（LRR）家族的I型膜蛋白））；
（34）FcRH1（Fc受体样蛋白1）；
（35）IRTA2（免疫球蛋白超家族受体易位相关2）；以及
（36）TENB2（假定的跨膜蛋白聚糖）。
48.根据权利要求46所述的结合物，其中，Ab是半胱氨酸工程抗体。
49.根据权利要求46或者权利要求47所述的结合物，其中Ab是与ErbB受体结合的抗体。
50.根据权利要求49所述的结合物，其中，Ab是曲妥珠单抗。
51.根据权利要求46或者权利要求47所述的结合物，其中Ab是抗-HER2、抗-Steap 1或抗-CD22抗体。
52.根据权利要求46至51中任一项所述的结合物，其中p是1、2、3、或4。
53.根据权利要求46至52中任一项所述的结合物，包括抗体-药物结合物化合物的混合物，其中在所述抗体-药物结合物化合物的混合物中，每抗体平均载药量为约2至约5。
54.根据权利要求46至53中任一项所述的结合物具有选自以下的通式：
Figure FDA00002257755800131
Figure FDA00002257755800141
其中，n为从1到24的整数。
55.根据权利要求54所述的结合物，其中，n为从1到12的整数。
56.根据权利要求55所述的结合物，其中，n为4或8。
57.一种药物组合物，包括权利要求1至56中任一项所述的结合物、药用稀释剂、载体或赋形剂。
58.根据权利要求57所述的药物组合物，进一步包括治疗有效量的化疗剂。
59.根据权利要求1至56中任一项所述的结合物在制备用于治疗对象的增殖性疾病的药剂中的应用。
60.一种治疗癌症的方法，包括给予患者权利要求57所述的药物组合物。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，将化疗剂联合所述结合物给予所述患者。
62.根据权利要求1至56中任一项所述的结合物用于在靶位置提供式（C）的化合物以及其盐和溶剂合物的应用：
Figure FDA00002257755800151
其中：
所述虚线表示在C1和C2之间或在C2和C3之间的双键可选存在；
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且可选地进一步选自卤素或二卤素；
其中，RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤素；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R和R’各自独立地选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基，并可选地与NRR’相关，R和R’与它们所连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环；
或从R6到R9的任何对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，
或所述化合物为每个单体为式（C）的二聚体，且每个单体的所述R7基团或R8基团一起形成连接所述单体的具有式-X-R”-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被以下中断：一个或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环例如苯或吡啶，所述芳环可选地被NH2取代；
并且每个X是O、S或N(H)。
63.根据权利要求62所述的应用，其中，所述靶位置是增殖性细胞群。
64.根据权利要求1至56中任一项所述的结合物用于在靶位置提供式（D）的化合物以及其盐和溶剂合物的应用：
Figure FDA00002257755800161
其中：
所述虚线表示在C1和C2之间或在C2和C3之间的双键可选存在；
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且可选地进一步选自卤素或二卤素；
其中，RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤素；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
Q独立地选自O、S和NH；
R11是H或R或，其中Q是O，R11是SO3M，其中M是金属阳离子；
R和R’各自独立地选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基，并可选地与NRR’相关，R和R’与它们所连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环；
或所述化合物为每个单体是式（D）的二聚体或一个单体是式（D）而另一个单体是式（C）的二聚体；
且每个单体的所述R7基团或R8基团一起形成连接所述单体的具有式-X-R”-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被以下中断：一个或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环例如苯或吡啶，所述芳环可选地被NH2取代；
每个X是O、S或N(H)；
或从R6到R9的任何一对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2；
其中，式（C）的单体单元如在权利要求58中定义。
65.一种式（E）的化合物：
以及其盐和溶剂合物，其中
所述虚线表示在C1和C2之间或在C2和C3之间的双键可选存在；
R2独立地选自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且可选地进一步选自卤素或二卤素；
其中，RD独立地选自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和卤素；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R8独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
RL是连接到细胞结合剂的接头；
Q独立地选自O、S和NH；
R11是H或R或，其中Q是O，R11是SO3M，其中M是金属阳离子；
R和R’各自独立地选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基，并可选地与NRR’相关，R和R’与它们所连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环；
或从R6到R9的任何一对的邻近基团一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p是1或2，；
或所述化合物为每个单体是式（E）的二聚体或一个单体是式（E）而另一个单体是式（B）的二聚体：
Figure FDA00002257755800191
其中，R2、R6、R9、R7、和R8根据所述式（A）化合物来定义，且每个单体的所述R7基团或R8基团一起形成连接所述单体的具有式-X-R''-X-的二聚体桥；
其中，R”是C3-12亚烃基，其链可被以下中断：一个或多个杂原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳环例如苯或吡啶，所述芳环可选地被NH2取代；
每个X是O、S或N(H)；
并且其中所述化合物为每个单体是式（E）的二聚体，在所述单体之一中的RL基团为封端基团，RC，或是用于与细胞结合剂连接的接头。
66.根据权利要求65所述的化合物，具有以下结构：
Figure FDA00002257755800201
其中，n为从1到24的整数。
67.根据权利要求66所述的化合物，其中，n为从1到12的整数。
68.根据权利要求67所述的化合物，其中n为4或8。
69.根据权利要求65所述的化合物，具有以下结构：
Figure FDA00002257755800202
其中，n为从1到24的整数。
70.根据权利要求69所述的化合物，n为从1到12的整数。
71.根据权利要求70所述的化合物，其中n为4或8。
72.根据权利要求65所述的化合物，具有以下结构：
其中，n为从1到24的整数。
73.根据权利要求72所述的化合物，n为从1到12的整数。
74.根据权利要求73所述的化合物，其中n为4或8。
75.根据权利要求65所述的化合物，其选自：
Figure FDA00002257755800212
以及
Figure FDA00002257755800221
76.一种制备权利要求1至56中任一项的结合物的方法，所述方法包括将细胞结合剂与在权利要求65至75中任一项所定义的化合物（E）进行反应的步骤。
77.一种制品，包括权利要求57的药物组合物；容器；以及指示所述药物组合物能够用于治疗癌症的包装说明书或标签。
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