KR20160055252A - 항-lgr5 항체의 사용 방법 - Google Patents

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KR20160055252A
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프레드릭 제이. 드 소바쥬
브라이언 비에스
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본원은 예를 들어 기저 세포 암종을 비롯한 헷지호그-관련 질환을 치료하기 위한 항-LGR5 항체의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-LGR5 항체의 사용 방법 {METHODS OF USING ANTI-LGR5 ANTIBODIES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119 하에 2013년 9월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 61/879,089의 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 제출되고 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2014년 9월 3일자로 생성된 상기 ASCII 카피는 P5706R1-WO_SequenceListing.txt로 명명되며, 크기는 51391 바이트이다.
발명의 분야
본원은 예를 들어 헷지호그-관련 질환을 치료하기 위한 항-LGR5 항체의 사용 방법을 제공한다.
암 생물학에서 대두되고 있는 주제 중 하나는 계속적인 종양 성장을 위한 특정 신호전달 경로에 대한 암 하위유형의 의존성이다. 예를 들어, 헷지호그 (Hh) 신호전달 경로를 활성화시키는 돌연변이는 모든 인간 암 사망의 최대 25%를 차지하는 췌장암, 전립선암 및 소세포 폐암과 더불어 기저 세포 암종 (BCC) 및 수모세포종을 비롯한 다양한 암의 성장을 유도한다 (Epstein, Nat. Rev. Cancer 8:743-754 (2008)). BCC는 세계에서 가장 보편적인 암이고, 모든 미국 인구의 거의 절반에서 은퇴 전에 이러한 암이 발생할 가능성이 있다 (NCI 2010). Hh 경로 성분 및 그의 기능적 역할을 확인한 20년간의 광범위한 연구는 최근에 국부 진행성 또는 전이성 BCC의 치료를 위해 FDA 승인받은 Hh 경로 길항제 비스모데깁으로 결실을 맺었다. 비스모데깁은 효과적이지만, 모든 종양 세포가 상기 약물에 감수성인 것은 아니고, 추가로 저항성이 발생할 수 있다.
인간 LGR5는 907개 아미노산의 단백질로, 그 중 ~540개의 아미노산은 아미노-말단 신호 서열의 절단 후에 세포외 공간에 존재할 것으로 예측된다. LGR5는 엑토도메인 내의 17개의 불완전한 류신-풍부 반복 모티프, 및 류신-풍부 반복부와 제1 막횡단 도메인 사이에 위치한 시스테인-풍부 영역을 포함한다.
본원은 항-LGR5 항체의 사용 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원은 개체에게 본원에 기재된 항-LGR5 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 기저 세포 암종을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 항-LGR5 항체 및 헷지호그 경로의 억제제의 각각의 양은 헷지호그 경로의 억제제 단독에 의한 치료와 비교하여 요법에 대한 반응 기간을 증가시키고/거나 재발 및/또는 저항성의 발생을 지연시키는데 효과적이다.
본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그 경로의 억제제를 포함하는 헷지호그-관련 질환의 치료의 효능을 증가시키는 방법을 제공한다.
추가로 본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 항-LGR5 항체없이 (그의 부재 하에) 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 표준 치료와 비교하여 증가된 효능을 갖는, 개체에서 헷지호그-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또한 본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 헷지호그-관련 질환의 재발 및/또는 저항성의 발생을 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한, 본원은 헷지호그-관련 질환에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 감수성 기간을 연장시키는 방법을 제공한다. 본원은 헷지호그-관련 질환에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 반응 지속기간을 연장시키는 방법을 제공한다.
본원은 헷지호그-관련 질환에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 감수성을 증가시키는 방법을 제공한다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 서열 67의 아미노산 22-323 내 또는 서열 67의 아미노산 22-123 내의 에피토프에 결합하고, LGR5에 ≤ 5 nM의 친화도로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 서열 67의 인간 LGR5에 결합하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 wnt 경로 신호전달을 유의하게 억제하지 않는다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는: a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및 b) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는: a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및 b) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는: a) 서열 6의 VH 서열 및 서열 5의 VL 서열; b) 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열; c) 서열 10의 VH 서열 및 서열 9의 VL 서열; d) 서열 12의 VH 서열 및 서열 11의 VL 서열; e) 서열 14의 VH 서열 및 서열 13의 VL 서열; f) 서열 16의 VH 서열 및 서열 15의 VL 서열; g) 서열 18의 VH 서열 및 서열 17의 VL 서열; h) 서열 20의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열; 또는 i) 서열 26의 VH 서열 및 서열 25의 VL 서열을 포함한다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 세포독성제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 화학식 Ab-(L-D)p를 가지며, 여기서: (a) Ab는 항-LGR5 항체이고; (b) L은 링커이고; (c) D는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀 및 네모루비신 유도체로부터 선택된 약물이고; (d) p는 1-8의 범위이다.
일부 실시양태에서, D는 아우리스타틴이다. 일부 실시양태에서, D는 하기 화학식 DE를 갖고,
<화학식 DE>
Figure pct00001
상기 식에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 H이고, R7은 sec-부틸이고, 각각의 R8은 독립적으로 CH3, O-CH3, OH, 및 H로부터 선택되고; R9는 H이고; R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴이다. 일부 실시양태에서, 약물은 MMAE이다. 일부 실시양태에서, D는 하기 화학식 A의 피롤로벤조디아제핀이고:
<화학식 A>
Figure pct00002
상기 식에서, 점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중 결합의 임의적인 존재를 나타내고; R2는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로로부터 추가로 선택되고, 여기서 RD는 독립적으로 R, CO2R, COR, CHO, CO2H 및 할로로부터 선택되고; R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되고; R7은 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되고; Q는 독립적으로 O, S 및 NH로부터 선택되고; R11은 H 또는 R이거나, 또는 Q가 O인 경우에 SO3M이고, 여기서 M은 금속 양이온이고; R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-8 알킬, C3-8 헤테로시클릴 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 임의로 기 NRR'와 관련하여, R 및 R'는 이들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; R12, R16, R19 및 R17은 각각 R2, R6, R9 및 R7에 대해 정의된 바와 같고; R"는 C3-12 알킬렌 기이고, 상기 쇄에는 1개 이상의 헤테로원자 및/또는 임의로 치환된 방향족 고리가 개재될 수 있고; X 및 X'는 독립적으로 O, S 및 N(H)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, D는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00003
상기 식에서, n은 0 또는 1이다. 일부 실시양태에서, D는 하기로부터 선택된 구조를 갖고:
Figure pct00004
상기 식에서, RE 및 RE"는 각각 독립적으로 H 또는 RD로부터 선택되고, 여기서 RD는 독립적으로 R, CO2R, COR, CHO, CO2H 및 할로로부터 선택되고; 여기서 Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5-20 아릴이고; 여기서 n은 0 또는 1이다. 일부 실시양태에서, D는 하기 화학식 B의 피롤로벤조디아제핀이고:
<화학식 B>
Figure pct00005
상기 식에서, 수평 파상선은 링커에의 공유 부착 부위를 나타내고; RV1 및 RV2는 독립적으로 H, 메틸, 에틸, 페닐, 플루오로-치환된 페닐, 및 C5-6 헤테로시클릴로부터 선택되고; n은 0 또는 1이다. 일부 실시양태에서, D는 네모루비신 유도체이다. 일부 실시양태에서, D는 하기로부터 선택된 구조를 갖는다:
Figure pct00006
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 링커는 프로테아제에 의해 절단가능하다. 일부 실시양태에서, 링커는 val-cit 디펩티드 또는 Phe-Lys 디펩티드를 포함한다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 링커는 산-불안정성이다. 일부 실시양태에서, 링커는 히드라존을 포함한다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 하기 화학식을 갖고:
Figure pct00007
상기 식에서, S는 황 원자이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00008
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식을 갖는다:
Figure pct00009
Figure pct00010
임의의 방법의 일부 실시양태에서, p는 2-5의 범위이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 길항제이다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 시클로파민-경쟁적 길항제이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 비스모데깁이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 기저 세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 기저 세포 암종은 국부 진행성 또는 전이성 기저 세포 암종이다. 일부 실시양태에서, 암은 수모세포종이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 LGR5-양성이다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 항-LGR5 항체와 병용 투여된다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 항-LGR5 항체와 개별적으로, 순차적으로, 또는 동시에 투여된다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 제작된 적어도 1개의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 필요한 요금의 청구 및 납부 시 해당 관청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 K14-CreER; Ptch1 fl/fl; p53 fl/fl 마우스 (C-D)에서 관찰된 광범위한 기저 세포 암종을 대조 마우스 (A-B)와 비교하여 보여준다.
도 2는 GDC-0449 (비스모데깁)로 치료된 K14-CreER; Ptch1 fl/fl; p53 fl/fl 마우스에서의 광범위한 종양 퇴행 (B)을 비치료 대조군 K14-CreER; Ptch1 fl/fl; p53 fl/fl 마우스 (A)와 비교하여 보여준다. 잔류 질환은 (C-D)에 제시된 바와 같이 56일 동안의 75 mg/kg GDC-0449 po BID에 의한 치료 후에 동물 K14-CreER; Ptch1 fl/fl; p53 fl/fl 마우스에서 여전히 관찰된다
도 3은 (A) 비치료 대조군 K14-CreER; Ptch1 fl/fl; p53 fl/fl 마우스에서의 Lgr5의 발현, 및 (B) 28일 동안의 75 mg/kg GDC-0449 po BID 치료 후의 K14-CreER; Ptch1fl/fl; p53 fl/fl 마우스에서의 Lgr5의 발현을 보여준다. (C-D)는 대조군 (5d 염수) (C) 및 DT 치료된 (5d) (D) K14-CreER; Ptch1 fl/fl; p53 fl/ fl;Lgr5DTR . EGFP 마우스에서의 DTR 매개 제거 효과를 보여준다. DAPI는 청색으로, GFP는 녹색으로, 아폽토시스 마커, CC3은 적색으로 표시된다.
도 4. (A-B)는 38일 동안의 75 mg/kg GDC-0449 po BID 치료 후의 K14-CreER; Ptch1 fl/fl; p53 fl/fl; Lgr5DTR . EGFP 마우스에서의 종양 퇴행을 보여준다. (C-F)는 28일 동안의 75 mg/kg GDC-0449 po BID에 이어서 8일 동안의 75 mg/kg GDC-0449 po BID + DT 치료 후의 K14-CreER; Ptch1 fl/fl; p53 fl/fl; Lgr5DTR . EGFP 마우스에서의 증진된 종양 퇴행을 보여준다. (G-H)는 28일 동안의 75 mg/kg GDC-0449 po BID에 이어서 8일 동안의 75 mg/kg GDC-0449 po BID + DT에 의한 치료가 K14-CreER; Ptch1 fl/fl; p53 fl/fl; Lgr5DTR . EGFP에서 잔류 표재성 기저 세포 암종을 현저하게 감소/제거한다는 것을 보여준다. DAPI DNA 염색은 청색으로 표시된다. (G) 케라틴 5 염색은 적색으로 표시된다. (H) 아폽토시스 마커, CC3은 적색으로 표시된다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "헷지호그"는 sonic, indian, desert 및 tiggy winkle을 비롯한 헷지호그 패밀리의 임의의 구성원을 지칭한다. 상기 용어는 단백질 또는 유전자를 나타내는데 사용될 수 있다. 또한, 상기 용어는 상이한 동물 종에서의 상동체/오르토로그 서열을 기재하는데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "헷지호그 (Hh) 신호전달 경로" 및 "헷지호그 (Hh) 신호전달"은 상호교환가능하게 사용되며, 보통 헷지호그, 패치드 (Ptch), 스무슨드 (Smo) 및 Gli와 같은 신호전달 캐스케이드의 다양한 구성원에 의해 정상적으로 매개되는 일련의 사건들을 지칭한다. 헷지호그 경로는 헷지호그 단백질의 부재 하에서도 하류 성분을 활성화시킴으로써 활성화될 수 있다. 단지 예로서, Smo의 과다발현은 헷지호그의 부재 하에 경로를 활성화시킬 것이다. Hh 신호전달 경로의 Hh 신호전달 성분 또는 구성원은 Hh 신호전달 경로에 참여하는 유전자 산물을 지칭한다. Hh 신호전달 성분은 빈번하게 물질적으로 또는 실질적으로 세포/조직에서의 Hh 신호의 전송에 영향을 미쳐, 전형적으로는 하류 유전자 발현 수준의 정도에서의 변화 및/또는 표현형 변화를 발생시킨다. Hh 신호전달 성분은, 하류 유전자 활성화/발현의 최종 결과에 대한 그의 생물학적 기능 및 효과에 따라, 양성 및 음성 조절자로 나뉠 수 있다. 양성 조절자는 Hh 신호의 전송에 양성적으로 영향을 미치는, 즉 Hh가 존재하는 경우에 하류의 생물학적 사건을 자극하는 Hh 신호전달 성분이다. 예는 헷지호그, Smo 및 Gli를 포함한다. 음성 조절자는 Hh 신호의 전송에 음성적으로 영향을 미치는, 즉 Hh가 존재하는 경우에 하류의 생물학적 사건을 억제하는 Hh 신호전달 성분이다. 예는 Ptch 및 SuFu를 포함한다 (이에 제한되지는 않음).
본원에 사용된 용어 "헷지호그 신호전달 길항제(들)", "Hh 신호전달의 길항제" 및 "Hh 신호전달 경로의 억제제"는 상호교환가능하게 사용되고, 양성 Hh 신호전달 성분 (예컨대, 헷지호그, Ptch 또는 Gli)의 생물활성을 억제하거나 Hh 신호전달 성분의 발현을 하향-조절하는 작용제를 지칭한다. 이는 또한 Hh 신호전달 성분의 음성 조절자를 상향-조절하는 작용제를 포함한다. 헷지호그 신호전달 길항제는 sonic, indian 또는 desert 헷지호그, 스무슨드, ptch-1, ptch-2, gli-1, gli-2, gli-3 등을 비롯한 (이에 제한되지는 않음), 헷지호그 경로의 임의의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대해 지시될 수 있다. 예를 들어, Hh 신호전달 경로의 억제제는 Hh에 의해 매개되는 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나 또는 중화시키는 임의의 분자를 지칭할 수 있다. 억제제의 예는 항체; 리간드 항체; 소분자 길항제; 안티센스 및 억제 RNA (예를 들어, shRNA) 분자를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 억제제는 약 1,000 nM 이하의 결합 친화도 (해리 상수)를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 약 100 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 약 50 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다. 특정한 실시양태에서, 억제제는 Hh 신호전달을 1,000 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 Hh 신호전달을 500 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 또 다른 실시양태에서, 억제제는 Hh 신호전달을 50 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 1종 이상의 Hh 경로 성분의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과로 감소 또는 억제한다. 일부 실시양태에서, Hh 신호전달의 억제제는 스무슨드의 길항제이다.
본원에 사용된 용어 "헷지호그-관련 장애(들)" 또는 "헷지호그-관련 질환(들)"은 헷지호그 경로의 방해 또는 이상과 연관된 질환 및 장애, 뿐만 아니라 헷지호그 경로의 활성화와 관련하여 정상이지만 바람직하지는 않은 성장 상태와 연관된 장애를 포함한다. "헷지호그-관련 장애(들)"는 종양 형성, 암, 신생물, 악성 과다증식성 장애 및 비-악성 과다증식성 장애를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "헷지호그-관련 장애(들)"는 또한 양성 전립선 비대증, 건선, 습성 황반 변성, 골화석증 및 원치않는 모발 성장을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 2개의 수치 값 (예를 들어, Kd 값 또는 발현)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 2개의 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주하도록 하는, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서, 예를 들어 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만 및/또는 약 10% 미만이다.
본원에 사용된 어구 "실질적으로 상이한"은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 2개의 수치 값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 2개의 값 사이의 차이를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하도록 하는, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 상기 2개의 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서, 예를 들어 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과 및/또는 약 50% 초과이다.
본원의 목적상 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의되는 바와 같은, 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)에 의해 나타내어질 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도의 측정을 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시양태가 하기 기재된다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도에서의 개선을 생성하는 변경을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "항-LGR5 항체" 및 "LGR5에 결합하는 항체"는 항체가 LGR5를 표적화하는데 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 LGR5에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항-LGR5 항체가 비관련 비-LGR5 단백질에 결합하는 정도는, 예를 들어 방사선면역검정 (RIA)에 의한 측정 시 항체의 LGR5에 대한 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, LGR5에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 5 nM, ≤ 4 nM, ≤ 3 nM, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 상이한 종의 LGR5 사이에 보존된 LGR5의 에피토프에 결합한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은, 무손상 항체의 일부를 포함하며 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "암" 및 "암성"은, 전형적으로 비조절된 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포성암, 위장암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 소장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 다른 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면에, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5개의 주요 항체 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에서 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어 제약 제제의 "유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 목적하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 분자 상의 특정한 부위를 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은, EU 인덱스로도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4로 나타난다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "LGR5의 글리코실화 형태"는 탄수화물 잔기의 부가에 의해 번역후 변형된 LGR5의 자연 발생 형태를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 분명히 배제한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택 시 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 그것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 그것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식에 관여한다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102에서 발생한다. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR 또는 a-CDR로 불리는 CDR 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조.) 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 본원에서 넘버링된다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된 항체"는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의한 결정 시 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된 핵산"은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-LGR5 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "LGR5"는 세포에서 LGR5 전구체 단백질의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 천연 성숙 LGR5를 지칭한다. 상기 용어는 달리 나타내지 않는 한, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 비롯한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 LGR5를 포함한다. 상기 용어는 또한 LGR5의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 신호 서열 (아미노산 1-21)을 갖는 예시적인 인간 LGR5 전구체 단백질의 아미노산 서열이 서열 67에 제시된다. 예시적인 성숙 인간 LGR5의 아미노산 서열.
용어 "LGR5-양성 암"은 그의 표면 상에서 LGR5를 발현하는 세포를 포함하는 암을 지칭한다. 세포가 표면 상에서 LGR5를 발현하는지 여부를 결정하기 위한 목적상, LGR5 mRNA 발현은 세포 표면 상에서의 LGR5 발현과 상관관계가 있는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, LGR5 mRNA의 발현은 계내 혼성화 및 RT-PCR (정량적 RT-PCR 포함)로부터 선택된 방법에 의해 결정된다. 대안적으로, 세포 표면 상에서의 LGR5의 발현은, 예를 들어 면역조직화학, FACS 등과 같은 방법에서 LGR5에 대한 항체를 사용하여 결정될 수 있다.
용어 "LGR5-양성 세포"는 그의 표면 상에서 LGR5를 발현하는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 상기 집단을 구성하는 개개의 항체는, 일반적으로 소량으로 존재하는 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고, 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있고, 이러한 방법 및 다른 예시적인 모노클로날 항체의 제조 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제 중에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드 결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VH), 이어서 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역 (VL), 이어서 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보가 담긴, 이러한 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭하는 것으로 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우에 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성 부분으로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야 내의 다양한 방식으로, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인 (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교될 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로부터 공중 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 구동 시스템에서의 사용을 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있고, 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우에, 주어진 아미노산 서열 B에의, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에의, 주어진 아미노산 서열 B와의, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
X/Y의 분율 x 100
여기서 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 매칭으로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 인지할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 직전 단락에 기재된 바와 같이 수득한다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 그의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 자연적 과정을 변경시키기 위한 시도로의 임상 개입을 지칭하고, 임상 병리상태의 예방을 위해 또는 그 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발을 예방하는 것, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이를 예방하는 것, 질환 진행의 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 완화 또는 개선된 예후를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 질환 발달을 지연시키는데 또는 질환 진행을 늦추는데 사용된다.
용어 "병용"은 개별 치료 효과가 시간상 중첩되도록 2종 이상의 치료제의 투여가 시간상 충분히 근접하여 주어지는 것을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 따라서, 공동 투여는 1종 이상의 작용제(들)의 투여를 1종 이상의 다른 작용제(들)의 투여를 중단한 후에 계속하는 경우의 투여 요법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 병용 투여는 공동으로, 순차적으로, 및/또는 동시에 수행된다.
"감소시키거나 억제하다"는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과의 전반적 감소를 유발하는 능력을 의미한다. 감소시키거나 억제하다는 치료할 장애의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 또는 원발성 종양의 크기를 지칭할 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원에 대한 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는, 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라, 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
"알킬"은 통상, 2급, 3급 또는 시클릭 탄소 원자를 함유하는 C1-C18 탄화수소이다. 예는 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3이다.
본원에 사용된 용어 "C1-C8 알킬"은 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 "C1-C8 알킬" 기는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸, -n-노닐 및 -n-데실을 포함하나, 이에 제한되지는 않고; 한편 분지형 C1-C8 알킬은 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸, 2-메틸부틸을 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 불포화 C1-C8 알킬은 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, -아세틸레닐, -프로피닐, -1-부티닐, -2-부티닐, -1-펜티닐, -2-펜티닐, -3-메틸-1 부티닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. C1-C8 알킬 기는 비치환될 수 있거나, 또는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 기로 치환될 수 있으며; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "C1-C12 알킬"은 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소를 지칭한다. C1-C12 알킬 기는 비치환될 수 있거나, 또는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 기로 치환될 수 있으며; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "C1-C6 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 "C1-C6 알킬" 기는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, 및 -n-헥실을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 한편 분지형 C1-C6 알킬은 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸, 및 2-메틸부틸을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 불포화 C1-C6 알킬은 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, 및 -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, 1-헥실, 2-헥실, 및 3-헥실을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. C1-C6 알킬 기는 비치환될 수 있거나, 또는 C1-C8 알킬 기에 대해 상기 기재된 바와 같은 1개 이상의 기로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "C1-C4 알킬"은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형, 포화 또는 불포화 탄화수소를 지칭한다. 대표적인 "C1-C4 알킬" 기는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 한편 분지형 C1-C4 알킬은 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 불포화 C1-C4 알킬은 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, 및 -이소부틸레닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. C1-C4 알킬 기는 비치환될 수 있거나, 또는 C1-C8 알킬 기에 대해 상기 기재된 바와 같은 1개 이상의 기로 치환될 수 있다.
"알콕시"는 산소에 단일 결합된 알킬 기이다. 예시적인 알콕시 기는 메톡시 (-OCH3) 및 에톡시 (-OCH2CH3)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "C1-C5 알콕시"는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알콕시 기이다. 알콕시 기는 비치환될 수 있거나, 또는 알킬 기에 대해 상기 기재된 바와 같은 1개 이상의 기로 치환될 수 있다.
"알케닐"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는 통상, 2급, 3급 또는 시클릭 탄소 원자를 함유하는 C2-C18 탄화수소이다. 예는 에틸렌 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2), 시클로펜테닐 (-C5H7), 및 5-헥세닐 (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "C2-C8 알케닐"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는 2 내지 8개의 통상, 2급, 3급 또는 시클릭 탄소 원자를 함유하는 탄화수소이다.
"알키닐"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 통상, 2급, 3급 또는 시클릭 탄소 원자를 함유하는 C2-C18 탄화수소이다. 예는 아세틸렌계 (-C≡CH) 및 프로파르길 (-CH2C≡CH)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "C2-C8 알키닐"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는 2 내지 8개의 통상, 2급, 3급 또는 시클릭 탄소 원자를 함유하는 탄화수소이다.
"알킬렌"은 모 알칸의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유래된 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는, 1-18개의 탄소 원자의 포화, 분지형 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알킬렌 라디칼은 메틸렌 (-CH2-), 1,2-에틸 (-CH2CH2-), 1,3-프로필 (-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸 (-CH2CH2CH2CH2-) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"C1-C10 알킬렌"은 화학식 -(CH2)1-10-의 직쇄, 포화 탄화수소 기이다. C1-C10 알킬렌의 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌 및 데칼렌을 포함한다.
"알케닐렌"은 모 알켄의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유래된 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는, 2-18개의 탄소 원자의 불포화, 분지형 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알케닐렌 라디칼은 1,2-에틸렌 (-CH=CH-)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"알키닐렌"은 모 알킬의 동일한 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거하는 것에 의해 유래된 2개의 1가 라디칼 중심을 갖는, 2-18개의 탄소 원자의 불포화, 분지형 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 전형적인 알키닐렌 라디칼은 아세틸렌 (-C≡C-), 프로파르길 (-CH2C≡C-) 및 4-펜티닐 (-CH2CH2CH2C≡C-)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"아릴"은 카르보시클릭 방향족 기를 지칭한다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 카르보시클릭 방향족 기 또는 헤테로시클릭 방향족 기는 비치환될 수 있거나, 또는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 기로 치환될 수 있으며; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
"C5-C20 아릴"은 카르보시클릭 방향족 고리 내에 5 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 아릴 기이다. C5-C20 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. C5-C20 아릴 기는 아릴 기에 대해 상기 기재된 바와 같이 치환 또는 비치환될 수 있다. "C5-C14 아릴"은 카르보시클릭 방향족 고리 내에 5 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 아릴 기이다. C5-C14 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸 및 안트라세닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. C5-C14 아릴 기는 아릴 기에 대해 상기 기재된 바와 같이 치환 또는 비치환될 수 있다.
"아릴렌"은 2개의 공유 결합을 갖는 아릴 기이며, 하기 구조에 제시된 바와 같이 오르토, 메타 또는 파라 배위로 존재할 수 있다:
Figure pct00011
상기 식에서, 페닐 기는 비치환될 수 있거나, 또는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 4개 이하의 기로 치환될 수 있으며; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
"아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 1개가 아릴 라디칼로 대체된 비-시클릭 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적인 아릴알킬 기는 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아릴알킬 기는 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하고, 예를 들어 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 기를 비롯한, 아릴알킬 기의 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자이고, 아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자이다.
"헤테로아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 1개가 헤테로아릴 라디칼로 대체된 비-시클릭 알킬 라디칼을 지칭한다. 전형적인 헤테로아릴알킬 기는 2-벤즈이미다졸릴메틸, 2-푸릴에틸 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 헤테로아릴알킬 기는 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하며, 예를 들어 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 기를 비롯한, 헤테로아릴알킬 기의 알킬 모이어티는 1 내지 6개의 탄소 원자이고, 헤테로아릴 모이어티는 5 내지 14개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자이다. 헤테로아릴알킬 기의 헤테로아릴 모이어티는 3 내지 7개의 고리원 (2 내지 6개의 탄소 원자)을 갖는 모노사이클, 또는 7 내지 10개의 고리원 (4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 비사이클, 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
"치환된 알킬", "치환된 아릴" 및 "치환된 아릴알킬"은 1개 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 치환기로 대체된 알킬, 아릴 및 아릴알킬을 각각 의미한다. 전형적인 치환기는 -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3 -, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐: F, Cl, Br, 또는 I이고; 각각의 R은 독립적으로 -H, C2-C18 알킬, C6-C20 아릴, C3-C14 헤테로사이클, 보호기 또는 전구약물 모이어티이다. 상기 기재된 바와 같은 알킬렌, 알케닐렌, 및 알키닐렌 기는 또한 유사하게 치환될 수 있다.
"헤테로아릴" 및 "헤테로사이클"은 1개 이상의 고리 원자가 헤테로원자, 예를 들어 질소, 산소 및 황인 고리계를 지칭한다. 헤테로사이클 라디칼은 3 내지 20개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함한다. 헤테로사이클은 3 내지 7개의 고리원 (2 내지 6개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 모노사이클 또는 7 내지 10개의 고리원 (4 내지 9개의 탄소 원자 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자)을 갖는 비사이클, 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템일 수 있다.
예시적인 헤테로사이클은 예를 들어 문헌 [Paquette, Leo A., "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), 특히 챕터 1, 3, 4, 6, 7, 및 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), 특히 제13권, 제14권, 제16권, 제19권 및 제28권; 및 J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기재되어 있다.
헤테로사이클의 예는, 예로서 제한 없이, 피리딜, 디히드로피리딜, 테트라히드로피리딜 (피페리딜), 티아졸릴, 테트라히드로티오페닐, 황 산화 테트라히드로티오페닐, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 벤조푸라닐, 티아나프탈레닐, 인돌릴, 인돌레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 피페리디닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 2-피롤리도닐, 피롤리닐, 테트라히드로푸라닐, 비스-테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 비스-테트라히드로피라닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 옥타히드로이소퀴놀리닐, 아조시닐, 트리아지닐, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 티에닐, 티안트레닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 크산테닐, 페녹사티닐, 2H-피롤릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 1H-인다졸릴, 퓨리닐, 4H-퀴놀리지닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 4aH-카르바졸릴, 카르바졸릴, β-카르볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 푸라자닐, 페녹사지닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퀴누클리디닐, 모르폴리닐, 옥사졸리디닐, 벤조트리아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 옥스인돌릴, 벤족사졸리닐, 및 이사티노일을 포함한다.
예로서 제한 없이, 탄소 결합된 헤테로사이클은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5 또는 6, 푸란, 테트라히드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라히드로피롤의 위치 2, 3, 4 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4 또는 5, 이속사졸, 피라졸 또는 이소티아졸의 위치 3, 4 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에 결합된다. 보다 전형적으로, 탄소 결합된 헤테로사이클은 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3-피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴 또는 5-티아졸릴을 포함한다.
예로서 제한 없이, 질소 결합된 헤테로사이클은 아지리딘, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸의 위치 1, 이소인돌 또는 이소인돌린의 위치 2, 모르폴린의 위치 4, 및 카르바졸 또는 β-카르볼린의 위치 9에 결합된다. 보다 전형적으로, 질소 결합된 헤테로사이클은 1-아지리딜, 1-아제테딜, 1-피롤릴, 1-이미다졸릴, 1-피라졸릴 및 1-피페리디닐을 포함한다.
"C3-C8 헤테로사이클"은 고리 탄소 원자 중 1 내지 4개가 독립적으로 O, S 및 N으로 이루어진 군으으로부터의 헤테로원자로 대체된 방향족 또는 비-방향족 C3-C8 카르보사이클을 지칭한다. C3-C8 헤테로사이클의 대표적인 예는 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 쿠마리닐, 이소퀴놀리닐, 피롤릴, 티오페닐, 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴 및 테트라졸릴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. C3-C8 헤테로사이클은 비치환될 수 있거나, 또는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 7개 이하의 기로 치환될 수 있으며; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
"C3-C8 헤테로시클로"는 헤테로사이클 기의 수소 원자 중 1개가 결합으로 대체된 상기 정의된 C3-C8 헤테로사이클 기를 지칭한다. C3-C8 헤테로시클로는 비치환될 수 있거나, 또는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 6개 이하의 기로 치환될 수 있으며; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
"C3-C20 헤테로사이클"은 고리 탄소 원자 중 1 내지 4개가 독립적으로 O, S 및 N으로 이루어진 군으으로부터의 헤테로원자로 대체된 방향족 또는 비-방향족 C3-C8 카르보사이클을 지칭한다. C3-C20 헤테로사이클은 비치환될 수 있거나, 또는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 7개 이하의 기로 치환될 수 있으며; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
"C3-C20 헤테로시클로"는 헤테로사이클 기의 수소 원자 중 1개가 결합으로 대체된 상기 정의된 C3-C20 헤테로사이클 기를 지칭한다.
"카르보사이클"은 모노사이클로서 3 내지 7개의 탄소 원자 또는 비사이클로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 고리를 의미한다. 모노시클릭 카르보사이클은 3 내지 6개의 고리 원자, 보다 전형적으로 5 또는 6개의 고리 원자를 갖는다. 비시클릭 카르보사이클은, 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열되는 7 내지 12개의 고리 원자, 또는 비시클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열되는 9 또는 10개의 고리 원자를 갖는다. 모노시클릭 카르보사이클의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 1-시클로펜트-1-에닐, 1-시클로펜트-2-에닐, 1-시클로펜트-3-에닐, 시클로헥실, 1-시클로헥스-1-에닐, 1-시클로헥스-2-에닐, 1-시클로헥스-3-에닐, 시클로헵틸, 및 시클로옥틸을 포함한다.
"C3-C8 카르보사이클"은 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원 포화 또는 불포화 비-방향족 카르보시클릭 고리이다. 대표적인 C3-C8 카르보사이클은 -시클로프로필, -시클로부틸, -시클로펜틸, -시클로펜타디에닐, -시클로헥실, -시클로헥세닐, -1,3-시클로헥사디에닐, -1,4-시클로헥사디에닐, -시클로헵틸, -1,3-시클로헵타디에닐, -1,3,5-시클로헵타트리에닐, -시클로옥틸, 및 -시클로옥타디에닐을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. C3-C8 카르보사이클 기는 비치환될 수 있거나, 또는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 기로 치환될 수 있으며; 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 선택된다.
"C3-C8 카르보시클로"는 카르보사이클 기의 수소 원자 중 1개가 결합으로 대체된 상기 정의된 C3-C8 카르보사이클 기를 지칭한다.
"링커"는 공유 결합을 포함하는 화학적 모이어티 또는 항체를 약물 모이어티에 공유 부착시키는 원자의 쇄를 지칭한다. 다양한 실시양태에서, 링커는 2가 라디칼, 예컨대 알킬디일, 아릴디일, 헤테로아릴디일, 모이어티, 예컨대: -(CR2)nO(CR2)n-, 알킬옥시의 반복 단위 (예를 들어, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시) 및 알킬아미노 (예를 들어, 폴리에틸렌아미노, 제파민(Jeffamine)™); 및 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트, 및 카프로아미드를 비롯한 이산 에스테르 및 아미드를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 링커는 1개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 발린, 페닐알라닌, 리신 및 호모리신을 포함할 수 있다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너와 비-중첩가능한 특성을 갖는 분자를 지칭하고, 한편 용어 "비키랄"은 그의 거울상 파트너 상에 중첩가능한 분자를 지칭한다.
용어 "입체이성질체"는 동일한 화학적 구성을 갖지만 공간 내 원자 또는 기의 배열이 상이한 화합물을 지칭한다.
"부분입체이성질체"는 2개 이상의 키랄성 중심을 가지며 분자들이 서로의 거울상이 아닌 입체이성질체를 지칭한다. 부분입체이성질체는 상이한 물리적 특성, 예를 들어 융점, 비점, 스펙트럼 특성, 및 반응성을 갖는다. 부분입체이성질체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피와 같은 고해상도 분석 절차 하에 분리될 수 있다.
"거울상이성질체"는 서로 비-중첩가능한 거울상인, 화합물의 2종의 입체이성질체를 지칭한다.
본원에 사용된 입체화학적 정의 및 규정은 일반적으로 문헌 [S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; 및 Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York]에 따른다. 많은 유기 화합물은 광학 활성 형태로 존재하며, 즉 이들은 평면-편광 평면을 회전하는 능력을 갖는다. 광학 활성 화합물을 기재하는데 있어서, 접두어 D 및 L, 또는 R 및 S는 키랄 중심(들)에 대한 분자의 절대 배위를 나타내기 위해 사용된다. 접두어 d 및 l 또는 (+) 및 (-)는 화합물에 의한 평면-평광 회전의 부호를 지정하기 위해 사용되며, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. 접두어 (+) 또는 d를 갖는 화합물은 우선성이다. 주어진 화학 구조에서, 이들 입체이성질체는 이들이 서로 거울상인 것을 제외하고는 동일하다. 특정한 입체이성질체가 또한 거울상이성질체로 지칭될 수 있으며, 이러한 이성질체의 혼합물은 종종 거울상이성질체 혼합물로 불린다. 거울상이성질체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로 지칭되며, 이들은 화학 반응 또는 과정에서 입체선택성 또는 입체특이성이 없는 경우에 생성될 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 2종의 거울상이성질체 종의 등몰 혼합물을 지칭한다.
"이탈기"는 또 다른 관능기에 의해 치환될 수 있는 관능기를 지칭한다. 특정 이탈기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예는 할라이드 (예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드), 메탄술포닐 (메실), p-톨루엔술포닐 (토실), 트리플루오로메틸술포닐 (트리플레이트), 및 트리플루오로메틸술포네이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "보호기"는 화합물상의 다른 관능기가 반응하는 동안에 특정한 관능기를 차단하거나 보호하기 위해 통상적으로 사용되는 치환기를 지칭한다. 예를 들어, "아미노-보호기"는 화합물 내의 아미노 관능기를 차단하거나 보호하는, 아미노 기에 부착된 치환기이다. 적합한 아미노-보호기는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBZ) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보호기 및 그의 용도에 대한 일반적 설명에 대해서는, 문헌 [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991], 또는 후속 판을 참조한다.
II. 치료 방법
A. 치료 방법
본원은 항-LGR5 항체의 사용 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원은 개체에게 본원에 기재된 항-LGR5 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 기저 세포 암종을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 세포독성제에 접합된 항-LGR5 항체이다 (본원에서 면역접합체로도 지칭됨). 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 wnt 경로 신호전달을 유의하게 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 기저 세포 암종 ("BCC")이다. 일부 실시양태에서, 기저 세포 암종은 국부 진행성 BCC 또는 전이성 BCC이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 수모세포종이다.
또한, 본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 항-LGR5 항체 및 헷지호그 경로의 억제제의 각각의 양은 헷지호그 경로의 억제제 단독에 의한 치료와 비교하여 요법에 대한 반응 기간을 증가시키고/거나 재발 및/또는 저항성의 발생을 지연시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 시클로파민-경쟁적 길항제이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 비스모데깁이다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 세포독성제에 접합된 항-LGR5 항체이다 (본원에서 면역접합체로도 지칭됨). 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 wnt 경로 신호전달을 유의하게 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 기저 세포 암종 ("BCC")이다. 일부 실시양태에서, 기저 세포 암종은 국부 진행성 BCC 또는 전이성 BCC이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 수모세포종이다.
본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그 경로의 억제제를 포함하는 헷지호그-관련 질환의 치료의 효능을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 시클로파민-경쟁적 길항제이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 비스모데깁이다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 세포독성제에 접합된 항-LGR5 항체이다 (본원에서 면역접합체로도 지칭됨). 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 wnt 경로 신호전달을 유의하게 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 기저 세포 암종 ("BCC")이다. 일부 실시양태에서, 기저 세포 암종은 국부 진행성 BCC 또는 전이성 BCC이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 수모세포종이다.
추가로 본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 항-LGR5 항체없이 (그의 부재 하에) 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 표준 치료와 비교하여 증가된 효능을 갖는, 개체에서 헷지호그-관련 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 시클로파민-경쟁적 길항제이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 비스모데깁이다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 세포독성제에 접합된 항-LGR5 항체이다 (본원에서 면역접합체로도 지칭됨). 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 wnt 경로 신호전달을 유의하게 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 기저 세포 암종 ("BCC")이다. 일부 실시양태에서, 기저 세포 암종은 국부 진행성 BCC 또는 전이성 BCC이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 수모세포종이다.
또한, 본원은 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 헷지호그-관련 질환의 재발 및/또는 저항성의 발생을 지연 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한, 본원은 헷지호그-관련 질환에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 감수성 기간을 연장시키는 방법을 제공한다. 본원은 헷지호그-관련 질환에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 반응 지속기간을 연장시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 시클로파민-경쟁적 길항제이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 비스모데깁이다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 세포독성제에 접합된 항-LGR5 항체이다 (본원에서 면역접합체로도 지칭됨). 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 wnt 경로 신호전달을 유의하게 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 기저 세포 암종 ("BCC")이다. 일부 실시양태에서, 기저 세포 암종은 국부 진행성 BCC 또는 전이성 BCC이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 수모세포종이다.
본원은 헷지호그-관련 질환에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 감수성을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 시클로파민-경쟁적 길항제이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 비스모데깁이다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 세포독성제에 접합된 항-LGR5 항체이다 (본원에서 면역접합체로도 지칭됨). 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 wnt 경로 신호전달을 유의하게 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 기저 세포 암종 ("BCC")이다. 일부 실시양태에서, 기저 세포 암종은 국부 진행성 BCC 또는 전이성 BCC이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그-관련 질환은 수모세포종이다.
본원에 사용된 바와 같은 요법에 대한 저항성을 갖는 암은 요법에 대해 반응성이지 않고/거나 요법에 대해 유의한 반응 (예를 들어, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성하는 능력이 감소된 암을 포함한다. 저항성은 치료 방법의 과정 중에 발생하는 후천성 저항성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 후천성 약물 저항성은 일시적 및/또는 가역적 약물 내성이다. 요법에 대한 일시적 및/또는 가역적 약물 저항성은 치료 방법의 중단 후에 요법에 대한 감수성을 회복시킬 수 있는 약물 저항성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 후천성 저항성은 영구적 저항성이다. 요법에 대한 영구적 저항성은 약물 저항성을 부여하는 유전적 변화를 포함한다.
본원에 사용된 요법에 대한 감수성을 갖는 암은 반응성이고/거나 유의한 반응 (예를 들어, 부분 반응 및/또는 완전 반응)을 생성할 수 있는 암을 포함한다.
요법에 대한 저항성의 획득 및/또는 감수성의 유지를 평가하는 결정 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 저항성은 약물 내성 지속자 및/또는 약물 내성 확대된 지속자에서 IC50, EC50에서의 변화 또는 종양 성장에서의 감소에 의해 나타내어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 변화는 약 임의의 50%, 100% 및/또는 200% 초과이다. 또한, 저항성의 획득 및/또는 감수성의 유지에서의 변화는, 예를 들어 요법에 대한 반응, 반응 지속기간 및/또는 진행까지의 시간, 예를 들어 부분 반응 및 완전 반응을 평가함으로써 생체내에서 평가될 수 있다. 저항성의 획득 및/또는 감수성의 유지에서의 변화는 개체의 집단에서 요법에 대한 반응, 반응 지속기간 및/또는 진행까지의 시간에서의 변화, 예를 들어 부분 반응 및 완전 반응의 수를 기반으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 암은 LGR5-양성이다. 샘플 중 다양한 바이오마커의 존재는 면역조직화학 ("IHC"), 웨스턴 블롯 분석, 면역침전, 분자 결합 검정, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 ("FACS"), 매스어레이, 단백질체학, 정량적 혈액 기반 검정 (예를 들어, 혈청 ELISA로서), 생화학적 효소적 활성 검정, 계내 혼성화, 서던 분석, 노던 분석, 전체 게놈 서열분석, 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 ("PCR") ("qRT-PCR")을 비롯한 PCR, 및 다른 증폭 유형 검출 방법, 예컨대 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등, RNA-Seq, FISH, 마이크로어레이 분석, 유전자 발현 프로파일링 및/또는 유전자 발현의 일련 분석 ("SAGE"), 뿐만 아니라 단백질, 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 매우 다양한 검정 중 어느 하나를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다수의 방법론에 의해 분석될 수 있으며, 이들 중 다수는 관련 기술분야에 공지되어 있고 통상의 기술자에 의해 이해된다. 유전자 및 유전자 산물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (노던 블롯팅), 4 (서던 블롯팅), 15 (이뮤노블롯팅) 및 18 (PCR 분석)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 멀티플렉스화 면역검정, 예컨대 룰즈 베이스드 메디신(Rules Based Medicine) 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) ("MSD")로부터 입수가능한 것이 사용될 수 있다.
시험관내 세포 증식의 억제는 프로메가(Promega) (위스콘신주 매디슨)로부터 상업적으로 입수가능한 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)™ 발광 세포 생존율 검정을 사용하여 검정할 수 있다. 상기 검정은 대사적 활성 세포의 지표인 ATP 존재의 정량화를 기반으로 하여 배양물 중 생존 세포의 수를 결정한다. 문헌 [Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88], 미국 특허 번호 6602677을 참조한다. 상기 검정은 자동화된 고처리량 스크리닝 (HTS)에 적용가능하게 하는 96- 또는 384-웰 포맷으로 수행될 수 있다. 문헌 [Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404]을 참조한다. 검정 절차는 단일 시약 (셀타이터-글로® 시약)을 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 수반한다. 이는 세포 용해, 및 루시페라제 반응에 의해 생성된 발광 신호의 생성을 일으킨다. 발광 신호는 배양물 중에 존재하는 생존 세포의 수에 정비례하는 ATP 존재량에 비례한다. 데이터는 발광측정기 또는 CCD 카메라 영상화 장치에 의해 기록될 수 있다. 발광 출력은 상대 광 단위 (RLU)로 표현된다.
추가 측면에서, 본 발명은 LGR5-양성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 이러한 LGR5-양성 암에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체 (면역접합체 포함)의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 상기 방법은 개체에게 하기 기재된 바와 같은 적어도 1종의 추가의 치료제의 유효량을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, LGR5-양성 암은 >90%의 종양 세포에서 염색이 매우 약하거나 또는 전혀 없는 것에 해당하는 "0"을 초과하는 항-LGR5 면역조직화학 (IHC) 또는 계내 혼성화 (ISH) 스코어를 받은 암이다. 또 다른 실시양태에서, LGR5-양성 암은 LGR5를 1+, 2+ 또는 3+ 수준으로 발현한다. 일부 실시양태에서, LGR5-양성 암은 LGR5 mRNA를 검출하는 역전사효소 PCR (RT-PCR) 검정에 따라 LGR5를 발현하는 암이다. 일부 실시양태에서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다.
임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은, 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 임의의 항-LGR5 항체 (본원에 제공된 면역접합체 포함)를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 임의의 항-LGR5 항체 (본원에 제공된 면역접합체 포함) 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 임의의 항-LGR5 항체 (본원에 제공된 면역접합체 포함), 및 예를 들어 하기 기재되는 바와 같은 적어도 1종의 추가의 치료제를 포함한다.
항체 (면역접합체 포함)는 요법에서 단독으로 또는 다른 작용제 (예를 들어, 헷지호그 신호전달의 억제제)와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 (면역접합체 포함)는 적어도 1종의 추가의 치료제 (예를 들어, 헷지호그 신호전달의 억제제)와 공-투여될 수 있다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 개별 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포괄하고, 이러한 경우에 항체 (면역접합체 포함)의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 이루어질 수 있다. 항체 (면역접합체 포함)는 또는 방사선 요법과 조합되어 사용될 수 있다.
항체 (면역접합체 포함) (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 또는 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 이루어질 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투약 스케줄이 본원에서 고려된다.
항체 (면역접합체 포함)는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체 (면역접합체 포함)는 반드시 그럴 필요는 없지만, 해당 장애를 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 1종 이상의 작용제와 함께 임의로 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체 (면역접합체 포함)의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이는 일반적으로 상기 기재된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 항체 (면역접합체 포함)의 적절한 투여량 (단독으로, 또는 1종 이상의 다른 추가의 치료제 (예를 들어, 헷지호그 경로의 억제제)와 조합되어 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체 (면역접합체 포함)의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체 (면역접합체 포함)가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체 (면역접합체 포함)에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체 (면역접합체 포함)는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든 관계없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1mg/kg-10mg/kg)의 항체 (면역접합체 포함)가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체 (면역접합체 포함)의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위 내일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록). 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서, 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 면역접합체 및 항-LGR5 항체 둘 다를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
B. 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 항-LGR5 항체
본원은 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 항-LGR5 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 LGR5에 결합한다. LGR5는 예를 들어 활발하게 순환하는 장 줄기 세포의 표면 상에서 발견되는 7-막횡단 단백질이다.
본원에 기재된 방법에 유용한 항-LGR5 항체는, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 US 2010/0275280, US 2011/017699, US 8158757, US 8158758, WO 2013/067054, WO 2013/067055, WO 2013/067057, WO 2013/067060, 및 PCT/US2013/034629에 기재된 항-LGR5 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
신호 서열 (아미노산 1-21)을 갖는 예시적인 자연 발생 인간 LGR5 전구체 단백질 서열이 서열 67에 제공되고, 상응하는 성숙한 LGR5 단백질 서열 (서열 67의 아미노산 22-907에 상응함)이 제공된다.
특정 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 하기 특징 중 적어도 1개 이상을 임의의 조합으로 갖는다: (a) 서열 67의 아미노산 22-555 내의 에피토프에 결합함; (b) LGR5에 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM, 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 결합함; (c) LGR5에 대한 R-스폰딘 (RSPO)의 결합을 유의하게 방해하지 않음; (d) 베타-카테닌 신호전달을 유의하게 방해하지 않음; (e) LGR5 신호전달의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하지 않음; (f) 카스파제 3 절단을 활성화시킴; (g) 인간 및 설치류 LGR5 둘 다를 인식함; (h) 인간 LGR5를 인식하지만 설치류 LGR5는 인식하지 않음; (i) 비접합 형태로 종양 성장을 유의하게 억제하지 않음; 및 (j) 줄기 세포 분화를 유도하지 않음. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 8E11 및 그의 인간화 변이체, 예컨대 hu8E11.v2; YW353; 2H6; 및 3G12이다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5이다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 및 래트 LGR5로부터 선택된다.
(a) 서열 67의 아미노산 22-555 내의 에피토프에 결합함
항-LGR5 항체가 LGR5의 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체의 LGR5의 에피토프 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 22-555 내)에 대한 결합은 N- 및 C-말단이 결실된LGR5 폴리펩티드를 293 세포에서 발현시키고, 말단절단된 폴리펩티드에 대한 항체의 FACS 결합에 의해 시험함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 293 세포에서 발현된 전장 LGR5에 대한 결합에 비해 말단절단된 폴리펩티드에 대한 항체의 결합의 실질적인 감소 (≥ 70% 감소) 또는 제거는 항체가 말단절단된 폴리펩티드에 결합하지 않음을 나타낸다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5이다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5 또는 시노몰구스 원숭이 LGR5이다.
일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 류신 풍부 N-말단 도메인 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 25-66)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 1개 이상의 류신 풍부 반복부 (LRR) (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 67-446; LGR5의 LRR 1-16)를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 1 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 67-90)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 2 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 91-112)를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 3 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 115-136)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 4 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 139-160)를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 5 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 163-184)를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 6 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 187-208)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 7 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 211-232)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 8 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 235-256)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 9 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 258-279)를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 10 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 282-303)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 11 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 306-328)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 12 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 329-350)를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 13 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 353-374)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 14 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 375-396)를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 15 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 399-420)를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 LGR5의 LRR 16 (예를 들어, 서열 67의 아미노산 잔기 423-446)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 임의의 LRR1 내지 LRR11, LRR2 내지 LRR11, LRR3 내지 LRR11, LLR1 내지 LLR3, LLR2 내지 LLR3, LLR2 내지 LLR8, LLR3 내지 LL7, 또는 LLR4 내지 LLR6을 포함한다.
일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 22-555 내의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 22-424 내의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 22-123 내의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 22-323 내의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 324-555 내의 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5의 에피토프는 서열 67의 아미노산 324-424 내의 에피토프를 포함한다.
본원에 기재된 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태"로 이루어지는 것" 및/또는 "로 본질적으로 이루어지는 것"을 포함하는 것으로 이해된다.
(b) LGR5에 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM, 및 임의로 ≥ 0.0001 nM, 또는 ≥ 0.001 nM, 또는 ≥ 0.01 nM의 친화도로 결합함
결합 친화도를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 비아코어(BIAcore)® 검정에 따라 결정될 수 있다. 특히, 일부 실시양태에서, Kd는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 비아코어™ 연구 등급 CM5 칩은 공급업체의 지침에 따라 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS) 시약에 의해 활성화될 수 있다. 염소 항-인간 Fc IgG는 각각의 유동 세포에서 대략 10,000 반응 단위 (RU)를 달성하도록 칩에 커플링될 수 있다. 미반응 커플링 기는 1M 에탄올아민에 의해 차단될 수 있다. 동역학적 측정을 위해, 항-LGR5 항체는 대략 300 RU를 달성하도록 포획될 수 있다. 인간 LGR5 ECD (예를 들어, 바큘로바이러스 시스템에서 발현된 His-Fc에 융합된 아미노산 22-557 (또는 유사 단편, 예컨대 22-555), 또는 CHO 세포로부터 발현된 Fc에 융합된 아미노산 22-558 (또는 유사 단편, 예컨대 22-555); 125 nM 내지 0.49 nM)의 2-배 연속 희석물은 HBS-P 완충제 (0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 중에서 25℃에서 30 μl/분의 유량으로 주입될 수 있다. 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)은 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어™ 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산될 수 있다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon으로 계산될 수 있다. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M- 1 s-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 설비 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(Aminco)® 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는 바와 같은, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS, pH 7.2 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하는 것에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 약 임의의 ≤ 5 nM, 또는 ≤ 4 nM, 또는 ≤ 3 nM, 또는 ≤ 2 nM, 또는 ≤ 1 nM의 친화도로 LGR5에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 약 ≤ 5의 친화도로 LGR5에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 약 ≤ 4 nM의 친화도로 LGR5에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 약 ≤ 3 nM의 친화도로 LGR5에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 약 ≤2 nM의 친화도로 LGR5에 결합한다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5이다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5 또는 시노몰구스 원숭이 LGR5이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그러한 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
(c) LGR5에 대한 R-스폰딘 (RSPO)의 결합을 유의하게 방해하지 않음
항-LGR5 항체가 LGR5에 대한 RSPO의 결합을 방해하는 능력을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체가 LGR5에 대한 R-스폰돈 (RSPO)의 결합을 유의하게 방해하는 능력은 유동 세포측정법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 LGR5를 발현하는 293 세포를 형광-표지된 RSPO, 예컨대 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4와 항-LGR5 항체의 존재 및 부재 하에 접촉시킬 수 있다. 293 세포에 대한 RSPO의 결합은 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조 항체의 존재 하에서의 RSPO 결합에 비해 항-LGR5 항체의 존재 하에서의 RSPO 결합의 약 25% 미만의 감소는 항-LGR5 항체가 LGR5에 대한 RSPO의 결합을 유의하게 방해하지 않음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체가 LGR5에 대한 R-스폰돈 (RSPO)의 결합을 유의하게 방해하는 능력은 비아코어 검정에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 LGR5 세포외 도메인을 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이 CM5 칩 상에 고정시킬 수 있고, 고정된 LGR5에 대한 RSPO, 예컨대 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4의 결합을 항-LGR5 항체의 존재 및 부재 하에 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조 항체의 존재 하에서의 RSPO 결합에 비해 항-LGR5 항체의 존재 하에서의 RSPO 결합의 약 25% 미만의 감소는 항-LGR5 항체가 LGR5에 대한 RSPO의 결합을 유의하게 방해하지 않음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, RSPO는 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및 RSPO4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 결합을 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만으로 방해한다. 일부 실시양태에서, 항체는 LGR5에 대한 RSPO의 결합을 검출가능하게 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5이다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5 또는 시노몰구스 원숭이 LGR5이다.
(d) wnt/베타-카테닌 신호전달을 유의하게 방해하지 않음
항-LGR5 항체가 wnt/베타-카테닌 신호전달을 방해하는 능력을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체가 wnt/베타-카테닌 신호전달을 유의하게 방해하는 능력은 리포터 유전자 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 wnt/베타-카테닌 반응성 프로모터 (예컨대 예를 들어, 다량체화 TCF/LEF DNA-결합 부위를 포함하는 프로모터)의 제어 하의 리포터 유전자 (예컨대 예를 들어, 루시페라제 유전자)를 포함하는 리포터 구축물로 LGR5를 발현하는 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이어서 세포를 Wnt 리간드, 예컨대 Wnt3a, 및 RSPO, 예컨대 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4와 항-LGR5 항체의 존재 및 부재 하에 접촉시키고, 루시페라제 발현을 측정한다. 일부 실시양태에서, 대조 항체의 존재 하에서의 루시페라제 발현에 비해 항체의 존재 하에서의 루시페라제 발현의 약 25% 미만의 감소는 항-LGR5 항체가 베타-카테닌 신호전달을 유의하게 방해하지 않음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 항체는 베타-카테닌 신호전달을 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만으로 방해한다. 일부 실시양태에서, 항체는 베타-카테닌 신호전달을 검출가능하게 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5이다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5 또는 시노몰구스 원숭이 LGR5이다.
(e) LGR5 신호전달의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하지 않음
항-LGR5 항체가 LGR5의 RSPO 활성화를 방해하는 능력을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체가 LGR5 신호전달의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하는 능력은 리포터 유전자 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 베타-카테닌 반응성 프로모터 (예컨대 예를 들어, 다량체화 TCF/LEF DNA-결합 부위를 포함하는 프로모터)의 제어 하의 리포터 유전자 (예컨대 예를 들어, 루시페라제 유전자)를 포함하는 리포터 구축물로 LGR5를 발현하는 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이어서 세포를 Wnt 리간드, 예컨대 Wnt3a와 RSPO, 예컨대 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4의 존재 및 부재 하에 접촉시킬 수 있고, LGR5 신호전달의 활성화를 RSPO의 존재 하에서의 루시페라제 발현의 증가로서 측정할 수 있다. LGR5 신호전달의 활성화는 또한 항-LGR5 항체의 존재 및 부재 하에 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포가 항-LGR5 항체 대 대조 항체와 접촉된 경우에 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및/또는 RSPO4의 존재 하에 LGR5 신호전달의 활성화의 약 25% 미만의 감소는 항-LGR5 항체가 LGR5 신호전달의 RSPO 활성화를 유의하게 방해하지 않음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, RSPO는 RSPO1, RSPO2, RSPO3, 및 RSPO4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체는 LGR5 신호전달의 RSPO 활성화를 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만으로 방해한다. 일부 실시양태에서, 항체는 LGR5 신호전달의 RSPO 활성화를 검출가능하게 방해하지 않는다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5이다. 일부 실시양태에서, LGR5는 인간 LGR5 또는 시노몰구스 원숭이 LGR5이다.
(f) 카스파제 3 절단을 활성화시킴
항-LGR5 항체가 카스파제 3 절단을 활성화시키는 능력을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체가 카스파제 3 절단을 활성화시키는 능력은 설치류 이종이식편 모델에서 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단된 카스파제 3의 존재는, 예를 들어 항-LGR5 항체를 투여한 종양발생 모델 마우스로부터 수집한 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 조직에서 종양 면적의 함수로서 측정될 수 있다. 절단된 카스파제 3의 존재는, 일부 실시양태에서, 면역조직화학을 사용하여 결정될 수 있다. 추가로, 일부 실시양태에서, 카스파제 3 절단은 퍼센트 양성 종양 면적으로서 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 카스파제 3 양성 종양 면적의 백분율을 약 임의의 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% (즉, 양성 종양 면적의 백분율이 두 배로 됨) 증가시킨다.
(g) 인간 및 설치류 LGR5 둘 다를 인식함
항-LGR5 항체가 인간 및 설치류 LGR5에 결합하는 능력을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 인간 및 설치류 LGR5 폴리펩티드를 293 세포에서 발현시키고, LGR5-발현 293 세포에 대한 항체의 결합을 FACS에 의해 시험한다. 일부 실시양태에서, 설치류 LGR5는 마우스 또는 래트 LGR5이다. 일부 실시양태에서, 설치류 LGR5는 마우스 LGR5이다.
(h) 인간 LGR5를 인식하지만 설치류 LGR5는 인식하지 않음
항-LGR5 항체가 인간 LGR5에는 결합하지만 설치류 LGR5에는 결합하지 않는 능력을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 인간 및 설치류 LGR5 폴리펩티드를 293 세포에서 발현시키고, LGR5-발현 293 세포에 대한 항체의 결합을 FACS에 의해 시험한다. 일부 실시양태에서, 설치류 LGR5는 마우스 또는 래트 LGR5이다. 일부 실시양태에서, 설치류 LGR5는 마우스 LGR5이다.
(i) 비접합 형태로 종양 성장을 유의하게 억제하지 않음
항-LGR5 항체가 비접합 형태로 종양 성장을 억제하는 능력을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이종이식편 모델 또는 뮤린 1 종양발생 모델에서 종양 성장의 억제는 비히클 대조군 또는 대조 항체에 대비되어 결정된다.
일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 비접합 형태로 종양 성장을 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만 억제한다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 비접합 형태로 종양 성장을 검출가능하게 억제하지 않는다.
(j) 줄기 세포 분화를 유도하지 않음
항-LGR5 항체가 줄기 세포 분화를 유도하는 능력을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 줄기 세포 분화는 항-LGR5 항체의 존재 및 부재 하에 LGR5를 발현하는 소장 내 신속-순환 줄기 세포인 음와 기저 원주 세포 (CBC)의, 예를 들어 장세포, 배상 세포 및/또는 장내분비 세포로 분화하는 능력을 결정하는 것에 의해 검정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조 항체가 또한 약 25% 미만의 CBC 집단에서 줄기 세포 분화를 유도하는 조건 하에, 항-LGR5 항체의 존재 하에서 약 임의의 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 또는 10% 미만의 CBC집단이 분화되는 경우에, 항-LGR5 항체는 줄기 세포 분화를 유도하지 않는 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체 면역접합체는 줄기 세포 분화를 유도하지 않는 1차 메카니즘을 통해 종양 성장을 억제한다. 일부 이러한 실시양태에서, 항-LGR5 항체 면역접합체는 면역접합체 내 항체에 접합된 세포독성제를 통해 매개되는 세포독성 활성을 통해 종양 성장을 억제한다.
예시적인 항-LGR5 항체
일부 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 예시적인, 그러나 비제한적인, 항-LGR5 항체를 제공한다. 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 (a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 (a) (i) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 32로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 서열 40 내지 43으로부터 선택된 중쇄 프레임워크 FR3 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 서열 41의 중쇄 프레임워크 FR3 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 프레임워크는 서열 40 내지 43으로부터 선택된 FR3 서열을 갖는 변형된 인간 VH1 프레임워크이다. 일부 이러한 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 프레임워크는 서열 41의 FR3 서열을 갖는 변형된 인간 VH1 프레임워크이다.
일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 서열 36의 경쇄 프레임워크 FR3 서열을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인 프레임워크는 서열 36의 FR3 서열을 갖는 변형된 VL 카파 IV 컨센서스 (VLKIV) 프레임워크이다.
또 다른 측면에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 6 및 서열 5의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 8 및 서열 7의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 10 및 서열 9의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 12 및 서열 11의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 14 및 서열 13의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 16 및 서열 15의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 18 및 서열 17의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함). 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 20 및 서열 19의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함).
한 측면에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 (a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 (a) (i) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 (a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 59로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-LGR5 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 26 및 서열 25의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함).
일부 실시양태에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 (a) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 50의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 (a) (i) 서열 48의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 49의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 50으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) 서열 45의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 46의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 22 및 서열 21의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함).
일부 실시양태에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 (a) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 56의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 (a) (i) 서열 54의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 55의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 56으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) 서열 51의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 52의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 53의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-LGR5 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열 24 및 서열 23의 VH 및 VL 서열을 포함한다 (그러한 서열의 번역후 변형 포함).
추가 측면에서, 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 본원에 제공된 항-LGR5 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 24의 VH 서열 및 서열 23의 VL 서열을 포함하는 항-LGR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 22의 VH 서열 및 서열 21의 VL 서열을 포함하는 항-LGR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 324-423으로부터의, 그 내의, 또는 그와 중첩되는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 303-402로부터의, 그 내의, 또는 그와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 324-555로부터의, 그 내의, 또는 그와 중첩되는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 303-534로부터의, 그 내의, 또는 그와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 26의 VH 서열 및 서열 25의 VL 서열을 포함하는 항-LGR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 22-123으로부터의, 그 내의, 또는 그와 중첩되는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 1-102로부터의, 그 내의, 또는 그와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열을 포함하는 항-LGR5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 22-323으로부터의, 그 내의, 또는 그와 중첩되는 서열 67의 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 1-312로부터의, 그 내의, 또는 그와 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 인간화된다. 한 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 추가로 인간 수용자 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 수용자 프레임워크는 인간 VL 카파 IV 컨센서스 (VLKIV) 프레임워크 및/또는 VH 프레임워크 VH1이다. 특정 실시양태에서, 인간 수용자 프레임워크는 인간 VL 카파 IV 컨센서스 (VLKIV) 프레임워크 및/또는 중쇄 프레임워크 영역 FR3에서 R71S 돌연변이 및 A78V 돌연변이를 포함하는 VH 프레임워크 VH1이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-LGR5 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 실질적으로 전장 항체, 예를 들어 IgG1 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-LGR5 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특색을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
1. 항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (Kd)를 갖고, 임의로 ≥ 10-13 M이다. (예를 들어 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M).
한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 의해 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시킨 후, 항-Fab 항체-코팅된 플레이트를 사용하여 결합된 항원을 포획함으로써 측정한다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단한다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척한다. 플레이트가 건조된 경우에, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드) 상에서 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁적 결합 검정에 사용한다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 ~10 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)를 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주입한다. 항원의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2-배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주입한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합 및 해리 센소그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M- 1 s-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 설비 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코™ 분광광도계 (써모스펙트로닉)에서 측정되는 바와 같은, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS, pH 7.2 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하는 것에 의해 결정될 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해서는, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 교체된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 보유하면서 인간에 대한 면역원성이 감소되도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; 문헌 [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("재표면화" 기재); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링" 기재); 및 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 접근법 기재)]에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은, "최적-피트" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 챌린지에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하는 것에 의해 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술을 기재하는 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HuMab® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 5,770,429; K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술을 기재하는 미국 특허 번호 7,041,870, 및 벨로시마우스(VelociMouse)® 기술을 기재하는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시키는 것에 의해 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하는 것에 의해 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 목적하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기술은 하기 기재된다.
5. 라이브러리-유래 항체
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 항체는 목적 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 목적하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 마지막으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 비재배열 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도의 가변 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공개는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 LGR5에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 LGR5에 대한 것이고, 다른 것은 CD3에 대한 것이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,821,337을 참조한다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 LGR5의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 LGR5를 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화하는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하는 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다중-특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기적 스티어링 효과를 조작하는 것 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교하는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생성하기 위해 류신 지퍼를 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 "디아바디" 기술을 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조하는 것에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 비롯하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 LGR5 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
7. 항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입하는 것에 의해 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있고, 단 최종 구축물은 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 표 1에서 "바람직한 치환"의 표제 하에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 표 1에서 "예시적인 치환"의 표제 하에 제공되고, 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기에 추가로 기재된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입될 수 있고, 산물은 목적 활성, 예를 들어 보유/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
<표 1>
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에서 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL는 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터 구축 및 재선택하는 것에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 라이브러리를 스크리닝하여 목적 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 수반하며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항체가 항원에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)이 확인되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어 항체와 항원의 상호작용에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성이 입증된 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조가 사용된다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 목적하는 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 효소 (예를 들어 ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형, 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의한 측정 시, Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조물)의 합계에 관하여 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산하는 것에 의해 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 부차적 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 및 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 공개 문헌의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11에서), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되며, 예를 들어 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어, 그에 의해 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 적용에 대해 바람직한 후보가 되게 하는, 모든 이펙터 기능은 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유하는 항체 변이체가 본원에 기재된 방법에서 유용한 것으로서 고려된다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서 ADCC 활성이 결여될 수 있음), FcRn 결합 능력은 보유함을 확실하게 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 Fc(RIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 Fc(RI, Fc(RII 및 Fc(RIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같이 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정은 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는, 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 생성하는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 그 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 생성된다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 그에 의해 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 이것을 사용하여 항체를 본원에 추가로 기재된 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 어느 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
추가의 예시적인 V205C 시스테인 조작된 티오MAb는 서열 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23으로부터 선택된 가변 영역 및 서열 80의 불변 영역을 포함하는 경쇄; 및 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로부터 선택된 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역, 예컨대 IgG1을 포함하는 중쇄를 포함한다. 추가의 예시적인 A118C 시스테인 조작된 티오MAb는 서열 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23으로부터 선택된 가변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역, 예컨대 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄; 및 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및 24로부터 선택된 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다. 추가의 예시적인 S400C 시스테인 조작된 티오MAb는 서열 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23으로부터 선택된 가변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역, 예컨대 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄; 및 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및 24로부터 선택된 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 달라질 수 있고, 1개 초과의 중합체가 부착되는 경우에 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선시킬 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 요법에서 정의된 조건 하에 사용될 것인지 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장의 것일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
C. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-LGR5 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염된다). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 항-LGR5 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는, 상기에 제공된 바와 같은 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-LGR5 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 절차를 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우에, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서 항체 단편의 발현을 기재하는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체가 생산되게 하는 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177; 6,040,498; 6,420,548; 7,125,978; 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합화된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 비롯한 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
D. 검정
본원에 제공된 항-LGR5 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 스크리닝되거나, 또는 특성화될 수 있다.
한 측면에서, 항체는 예를 들어 ELISA, 비아코어®, FACS, 또는 웨스턴 블롯과 같은 공지된 방법에 의해 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 측면에서, LGR5에 대한 결합에 대해 본원에 기재된 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 확인하기 위해 경쟁 검정이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 본원에 기재된 항체가 결합하는 것과 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 LGR5는 LGR5에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 항체) 및 LGR5에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험될 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 LGR5는 제1 표지된 항체를 포함하나 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이션된다. LGR5에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후에, 잉여량의 미결합 항체를 제거하고, 고정된 LGR5와 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 LGR5와 회합된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이는 제2 항체가 LGR5에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
E. 면역접합체
본원은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 접합된 본원의 항-LGR5 항체 ("면역접합체"로도 지칭됨)를 포함하는 본원에서 사용하기 위한 항-LGR5 항체를 제공한다.
비접합 약물의 전신 투여가 정상 세포에 대해 허용되지 않는 수준의 독성을 초래할 수 있는 경우에, 면역접합체는 종양에 대한 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 일부 실시양태에서는 그 안에서의 세포내 축적을 허용한다 (Polakis P. (2005) Current Opinion in Pharmacology 5:382-387).
항체-약물 접합체 (ADC)는 강력한 세포독성 약물을 항원-발현 종양 세포에 표적화시켜 (Teicher, B.A. (2009) Current Cancer Drug Targets 9:982-1004), 효능의 최대화 및 탈표적 독성의 최소화에 의해 치료 지수를 증진시킴으로써 (Carter, P.J. and Senter P.D. (2008) The Cancer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107) 항체 및 세포독성 약물 둘 다의 특성을 합한 표적화된 화학요법제 분자이다.
본원에서 사용하기 위한 ADC 화합물은 항암 활성을 갖는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, ADC 화합물은 약물 모이어티에 접합된, 즉 공유 부착된 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 링커를 통해 약물 모이어티에 공유 부착된다. 항체-약물 접합체 (ADC)는 유효 용량의 약물을 종양 조직에 선택적으로 전달함으로써, 치료 지수 ("치료 범위")를 증가시키면서 보다 큰 선택성, 즉 보다 낮은 효과적인 용량을 달성할 수 있다.
항체-약물 접합체 (ADC)의 약물 모이어티 (D)는 세포독성 또는 세포증식억제 효과를 갖는 임의의 화합물, 모이어티 또는 기를 포함할 수 있다. 약물 모이어티는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 삽입, 및 RNA 폴리머라제, 단백질 합성 및/또는 토포이소머라제의 억제를 포함하나 이에 제한되지는 않은 메카니즘에 의해 그의 세포독성 및 세포증식억제 효과를 부여할 수 있다. 예시적인 약물 모이어티는 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 네모루비신 및 그의 유도체, PNU-159682, 안트라시클린, 두오카르마이신, 빈카 알칼로이드, 탁산, 트리코테센, CC1065, 캄프토테신, 엘리나피드, 및 세포독성 활성을 갖는 그의 입체이성질체, 동배체, 유사체 및 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 면역접합체의 비제한적 예는 하기에 보다 상세하게 논의된다.
1. 예시적인 항체-약물 접합체
항체-약물 접합체 (ADC) 화합물의 예시적인 실시양태는 종양 세포를 표적화하는 항체 (Ab), 약물 모이어티 (D), 및 Ab를 D에 부착시키는 링커 모이어티 (L)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 1개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 리신 및/또는 시스테인을 통해 링커 모이어티 (L)에 부착된다.
예시적인 ADC는 하기 화학식 I을 갖는다.
<화학식 I>
Ab-(L-D)p
상기 식에서, p는 1 내지 약 20이다. 일부 실시양태에서, 항체에 접합될 수 있는 약물 모이어티의 수는 유리 시스테인 잔기의 수에 의해 제한된다. 일부 실시양태에서, 유리 시스테인 잔기는 본원에 기재된 방법에 의해 항체 아미노산 서열 내로 도입된다. 화학식 I의 예시적인 ADC는 1, 2, 3 또는 4개의 조작된 시스테인 아미노산을 갖는 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (Lyon, R. et al. (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). 일부 실시양태에서, 1개 이상의 유리 시스테인 잔기는 조작을 사용하지 않고도 이미 항체에 존재하며, 이러한 경우에 기존의 유리 시스테인 잔기를 사용하여 항체를 약물에 접합시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 1개 이상의 유리 시스테인 잔기를 생성하기 위해 항체의 접합 전에 환원 조건에 노출된다.
a) 예시적인 링커
"링커" (L)는 1개 이상의 약물 모이어티 (D)를 항체 (Ab)에 연결시켜 화학식 I의 항체-약물 접합체 (ADC)를 형성하는데 사용될 수 있는 이관능성 또는 다관능성 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 항체-약물 접합체 (ADC)는 약물 및 항체에 공유 부착시키기 위한 반응성 관능기를 갖는 링커를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 (Ab)의 시스테인 티올은 ADC를 제조하기 위해 링커 또는 약물-링커 중간체의 반응성 관능기와 결합을 형성할 수 있다.
한 측면에서, 링커는 항체 상에 존재하는 유리 시스테인과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기를 갖는다. 비제한적인 예시적인 이러한 반응성 관능기는 말레이미드, 할로아세트아미드, α-할로아세틸, 활성화된 에스테르, 예컨대 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 클로라이드, 술포닐 클로라이드, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773]의 페이지 766의 접합 방법, 및 본원의 실시예를 참조한다.
일부 실시양태에서, 링커는 항체 상에 존재하는 친전자성 기와 반응할 수 있는 관능기를 갖는다. 예시적인 이러한 친전자성 기는 알데히드 및 케톤 카르보닐 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 링커의 반응성 관능기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체 단위에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 비제한적인 예시적인 이러한 반응성 관능기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
링커는 하나 이상의 링커 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐 ("PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), 및 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트 ("MCC")를 포함한다. 다양한 링커 성분이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 그 중 일부가 하기에 기재되어 있다.
링커는 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 비제한적인 예시적인 절단가능한 링커는 산-불안정성 링커 (예를 들어, 히드라존 포함), 프로테아제-감수성 (예를 들어, 펩티다제-감수성) 링커, 광불안정성 링커, 또는 디술피드-함유 링커를 포함한다 (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); US 5208020).
특정 실시양태에서, 링커는 하기 화학식 II를 갖는다.
<화학식 II>
Figure pct00013
상기 식에서, A는 "스트레쳐 단위"이고, a는 0 내지 1의 정수이고; W는 "아미노산 단위"이고, w는 0 내지 12의 정수이고; Y는 "스페이서 단위"이고, y는 0, 1, 또는 2이다. 화학식 II의 링커를 포함하는 ADC는 화학식 I(A): Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p를 갖고, 상기 식에서 Ab, D 및 p는 상기 화학식 I에서와 같이 정의된다. 이러한 링커의 예시적인 실시양태는 명백하게 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 7,498,298에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 링커 성분은 또 다른 링커 성분에 또는 약물 모이어티에 항체를 연결시키는 "스트레쳐 단위" (A)를 포함한다. 비제한적인 예시적인 스트레쳐 단위가 하기 제시된다 (여기서 파상선은 항체, 약물 또는 추가의 링커 성분에 대한 공유 부착 부위를 나타냄):
Figure pct00014
일부 실시양태에서, 링커 성분은 "아미노산 단위" (W)를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 아미노산 단위는 프로테아제에 의한 링커의 절단을 허용하며, 이로써 세포내 프로테아제, 예컨대 리소솜 효소에 대한 노출 시 면역접합체로부터의 약물 방출을 용이하게 한다 (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). 예시적인 아미노산 단위는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 및 펜타펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 디펩티드는 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe); 페닐알라닌-리신 (fk 또는 phe-lys); 페닐알라닌-호모리신 (phe-homolys); 및 N-메틸-발린-시트룰린 (Me-val-cit)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 트리펩티드는 글리신-발린-시트룰린 (gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아미노산 단위는 자연 발생 아미노산 잔기 및/또는 소수 아미노산 및/또는 비-자연 발생 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함할 수 있다. 아미노산 단위는 특정한 효소, 예를 들어 종양-연관 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소적 절단을 위해 설계 및 최적화될 수 있다.
전형적으로, 펩티드-유형 링커는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 액체 상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [E. Schroeder and K. Luebke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press]).
일부 실시양태에서, 링커 성분은 항체를 약물 모이어티에 직접적으로 또는 스트레쳐 단위 및/또는 아미노산 단위를 통해 연결시키는 "스페이서 단위" (Y)를 포함한다. 스페이서 단위는 "자기-희생적" 또는 "비-자기-희생적"일 수 있다. "비-자기-희생적" 스페이서 단위는 스페이서 단위의 일부 또는 전부가 ADC의 절단 시 약물 모이어티에 결합된 상태로 유지되는 것이다. 비-자기 희생적 스페이서 단위의 예는 글리신 스페이서 단위 및 글리신-글리신 스페이서 단위를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 글리신-글리신 스페이서 단위를 함유하는 ADC를 종양-세포 연관 프로테아제에 의해 효소적 절단시키면 ADC의 나머지로부터 글리신-글리신-약물 모이어티의 방출이 일어난다. 일부 이러한 실시양태에서, 글리신-글리신-약물 모이어티는 종양 세포에서 가수분해 단계를 거쳐, 약물 모이어티로부터 글리신-글리신 스페이서 단위가 절단된다.
"자기-희생적" 스페이서 단위는 약물 모이어티의 방출을 가능하게 한다. 특정 실시양태에서, 링커의 스페이서 단위는 p-아미노벤질 단위를 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, p-아미노벤질 알콜은 아미드 결합을 통해 아미노산 단위에 부착되고, 카르바메이트, 메틸카르바메이트, 또는 카르보네이트가 벤질 알콜과 약물 사이에 만들어진다 (Hamann et al. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). 일부 실시양태에서, 스페이서 단위는 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자기-희생적 링커를 포함하는 ADC는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00015
상기 식에서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로, 또는 -시아노이고; m은 0 내지 4 범위의 정수이고; X는 1개 이상의 추가의 스페이서 단위일 수 있거나 또는 부재할 수 있고; p는 1 내지 약 20 범위이다. 일부 실시양태에서, p는 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4의 범위이다. 비제한적인 예시적인 X 스페이서 단위는 하기를 포함한다:
Figure pct00016
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, R1 및 R2는 각각 -CH3이다.
자기-희생적 스페이서의 다른 예는 PAB 기와 전자적으로 유사한 방향족 화합물, 예컨대 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (미국 특허 번호 7,375,078; 문헌 [Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237]) 및 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 아미드 결합 가수분해 시 고리화를 겪는 스페이서, 예컨대 치환 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 (Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2:223), 적절하게 치환된 비시클로[2.2.1] 및 비시클로[2.2.2] 고리계 (Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (Amsberry, et al. (1990) J. Org. Chem. 55:5867)가 사용될 수 있다. 글리신 잔기의 α-탄소에 대한 약물의 연결은 ADC에서 유용할 수 있는 자기-희생적 스페이서의 또 다른 예이다 (Kingsbury et al. (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
일부 실시양태에서, 링커 L은 1개 초과의 약물 모이어티를 분지화, 다관능성 링커 모이어티를 통해 항체에 공유 부착시키기 위한 수지상 유형의 링커일 수 있다 (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). 수지상 링커는 ADC의 효력과 관련이 있는 약물 대 항체의 몰비, 즉 로딩을 증가시킬 수 있다. 따라서, 항체가 단지 1개의 반응성 시스테인 티올 기를 보유하는 경우에, 다수의 약물 모이어티를 수지상 링커를 통해 부착시킬 수 있다.
화학식 I의 ADC와 관련하여 비제한적인 예시적인 링커가 하기 제시된다:
Figure pct00017
Figure pct00018
(상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, R1 및 R2는 각각 -CH3이다.)
Figure pct00019
(상기 식에서, n은 0 내지 12이다. 일부 실시양태에서, n은 2 내지 10이다. 일부 실시양태에서, n은 4 내지 8이다.)
추가의 비제한적인 예시적인 ADC는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00020
상기 식에서, X는:
Figure pct00021
이고;
Y는:
Figure pct00022
이고;
각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이고; n은 1 내지 12이다.
일부 실시양태에서, 링커는 용해도 및/또는 반응성을 조정하는 기로 치환된다. 비제한적 예로서, 하전된 치환기, 예컨대 술포네이트 (-SO3 -) 또는 암모늄은 링커 시약의 수용해도를 증가시키고, 링커 시약과 항체 및/또는 약물 모이어티의 커플링 반응을 용이하게 하거나, 또는 ADC 제조에 사용되는 합성 경로에 따라 Ab-L (항체-링커 중간체)과 D, 또는 D-L (약물-링커 중간체)과 Ab의 커플링 반응을 용이하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커의 부분은 항체에 커플링되고, 링커의 일부는 약물에 커플링되고, 이어서 Ab-(링커 부분)a는 약물-(링커 부분)b에 커플링되어 화학식 I의 ADC를 형성한다.
화합물은 명백하게 하기 링커 시약으로 제조된 ADC를 고려하나 이에 제한되지는 않는다: 비스-말레이미도-트리옥시에틸렌 글리콜 (BMPEO), N-(β-말레이미도프로필옥시)-N-히드록시 숙신이미드 에스테르 (BMPS), N-(ε-말레이미도카프로일옥시) 숙신이미드 에스테르 (EMCS), N-[γ-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스테르 (GMBS), 1,6-헥산-비스-비닐술폰 (HBVS), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트) (LC-SMCC), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS), 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드 (MPBH), 숙신이미딜 3-(브로모아세트아미도)프로피오네이트 (SBAP), 숙신이미딜 아이오도아세테이트 (SIA), 숙신이미딜 (4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트 (SIAB), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 숙신이미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB), 숙신이미딜 6-[(베타-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트] (SMPH), 이미노티올란 (IT), 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트 (SVSB), 및 예를 들어 비스-말레이미드 시약: 디티오비스말레이미도에탄 (DTME), 1,4-비스말레이미도부탄 (BMB), 1,4 비스말레이미딜-2,3-디히드록시부탄 (BMDB), 비스말레이미도헥산 (BMH), 비스말레이미도에탄 (BMOE), BM(PEG)2 (하기 제시됨), 및 BM(PEG)3 (하기 제시됨); 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠). 일부 실시양태에서, 비스-말레이미드 시약은 항체에서 시스테인의 티올 기의 티올-함유 약물 모이어티, 링커, 또는 링커-약물 중간체에 대한 부착을 가능하게 한다. 티올 기와 반응성인 다른 관능기는 아이오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 디술피드, 피리딜 디술피드, 이소시아네이트, 및 이소티오시아네이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
Figure pct00023
특정의 유용한 링커 시약은 다양한 상업적 공급원, 예컨대 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.) (일리노이주 록포드), 몰레큘라 바이오사이언시스 인크.(Molecular Biosciences Inc.) (콜로라도주 볼더)로부터 입수할 수 있거나, 또는 관련 기술분야에 기재된, 예를 들어 문헌 [Toki et al. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et al. (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186]; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; 및 WO 04/032828에 기재된 절차에 따라 합성할 수 있다.
탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 예를 들어, WO94/11026을 참조한다.
b) 예시적인 약물 모이어티
(1) 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 실시양태에서, 면역접합체는 1개 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체를 포함한다. 메이탄시노이드는 메이탄신의 유도체이고, 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 번호 3896111). 이후에, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것으로 발견되었다 (미국 특허 번호 4,151,042). 합성 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는 (i) 발효 또는 화학적 변형, 또는 발효 산물의 유도체화에 의한 제조에 비교적 이용가능하고, (ii) 비-디술피드 링커를 통해 항체에 접합되기에 적합한 관능기로 유도체화될 수 있고, (iii) 혈장에서 안정하며, (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 효과적이기 때문에, 항체-약물 접합체에서 매력적인 약물 모이어티이다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로서 사용하기에 적합한 특정 메이탄시노이드는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나 유전 공학 기술을 사용하여 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yu et al. (2002) PNAS 99:7968-7973] 참조). 메이탄시노이드는 또한 공지된 방법에 따라 합성적으로 제조될 수 있다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 변형된 방향족 고리를 갖는 것, 예컨대 C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4256746) (예를 들어, 안사미토신 P2의 수소화알루미늄리튬 환원에 의해 제조됨); C-20-히드록시 (또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로 (미국 특허 번호 4361650 및 4307016) (예를 들어, 스트렙토미세스(Streptomyces) 또는 악티노미세스(Actinomyces)를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/-데클로로 (미국 특허 번호 4,294,757) (예를 들어, 아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨), 및 방향족 고리의 다른 위치에 변형을 갖는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티는 또한 변형을 갖는 것, 예컨대 C-9-SH (미국 특허 번호 4424219) (예를 들어, H2S 또는 P2S5와 메이탄시놀의 반응에 의해 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR) (US 4331598); C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (미국 특허 번호 4450254) (예를 들어, 노카르디아(Nocardia)로부터 제조됨); C-15-히드록시/아실옥시 (US 4364866) (예를 들어, 스트렙토미세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); C-15-메톡시 (미국 특허 번호 4313946 및 4315929) (예를 들어, 트레위아 누들플로라(Trewia nudlflora)로부터 단리됨); C-18-N-데메틸 (미국 특허 번호 4362663 및 4322348) (예를 들어, 스트렙토미세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시 (US 4371533) (예를 들어, 메이탄시놀의 티타늄 트리클로라이드/LAH 환원에 의해 제조됨)를 포함한다.
메이탄시노이드 화합물 상의 많은 위치가 연결 위치로서 유용하다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 사용한 히드록실 기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응은 히드록실 기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실 기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 구조를 갖는 것을 포함한다:
Figure pct00024
상기 식에서, 파상선은 ADC의 링커에 대한 메이탄시노이드 약물 모이어티의 황 원자의 공유 부착을 나타낸다. 각각의 R은 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬일 수 있다. 아미드 기를 황 원자에 부착시키는 알킬렌 쇄는 메타닐, 에타닐 또는 프로필일 수 있고, 즉 m은 1, 2 또는 3이다 (US 633410; US 5208020; 문헌 [Chari et al. (1992) Cancer Res. 52:127-131; Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623]).
ADC에 대해 메이탄시노이드 약물 모이어티의 모든 입체이성질체, 즉 키랄 탄소에서 R 및 S 배위의 임의의 조합이 고려된다 (US 7276497; US 6913748; US 6441163; US 633410 (RE39151); US 5208020; 문헌 [Widdison et al. (2006) J. Med. Chem. 49:4392-4408], 이는 그 전문이 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, 메이탄시노이드 약물 모이어티는 하기 입체화학을 갖는다:
Figure pct00025
메이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적인 실시양태는 하기 구조를 갖는 DM1; DM3; 및 DM4를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00026
상기 식에서, 파상선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 약물의 황 원자의 공유 부착을 나타낸다.
다른 예시적인 메이탄시노이드 항체-약물 접합체는 하기 구조 및 약어를 갖는다 (여기서, Ab는 항체이고, p는 1 내지 약 20이다. 일부 실시양태에서, p는 1 내지 10이거나, p는 1 내지 7이거나, p는 1 내지 5이거나, 또는 p는 1 내지 4이다):
Figure pct00027
DM1이 BMPEO 링커를 통해 항체의 티올 기에 연결된 예시적인 항체-약물 접합체는 하기 구조 및 약어를 갖는다:
Figure pct00028
상기 식에서, Ab는 항체이고; n은 0, 1 또는 2이고; p는 1 내지 약 20이다. 일부 실시양태에서, p는 1 내지 10이거나, p는 1 내지 7이거나, p는 1 내지 5이거나, 또는 p는 1 내지 4이다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체, 그의 제조 방법, 및 그의 치료 용도는 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020 및 5,416,064; US 2005/0276812 A1; 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되어 있으며, 이들 개시내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다. 또한, 문헌 [Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996); 및 Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 항체-메이탄시노이드 접합체는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 메이탄시노이드 분자에 항체를 화학적으로 연결시켜 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020 (그의 개시내용은 명백하게 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 항체 분자당 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자가 접합된 ADC는 항체의 기능 또는 용해도에 부정적으로 영향을 미치지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 증진시키는데 있어서 효능을 나타내었다. 일부 경우에, 심지어 독소/항체 중 1개의 분자가 네이키드 항체의 사용에 대해서 세포독성을 증진시킬 것으로 예상된다.
항체-메이탄시노이드 접합체를 제조하기 위한 예시적인 연결기는, 예를 들어 본원에 기재된 것 및 미국 특허 번호 5208020; EP 특허 0 425 235 B1; 문헌 [Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)]; US 2005/0276812 A1; 및 US 2005/016993 A1에 개시된 것을 포함하며, 이들의 개시내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
(2) 아우리스타틴 및 돌라스타틴
약물 모이어티는 돌라스타틴, 아우리스타틴 및 그의 유사체 및 유도체 (US 5635483; US 5780588; US 5767237; US 6124431)를 포함한다. 아우리스타틴은 해양 연체동물 화합물 돌라스타틴-10의 유도체이다. 임의의 특정한 이론에 얽매이는 것을 의도하지는 않지만, 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하고 (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584), 항암 (US 5663149) 및 항진균 활성 (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)을 갖는 것으로 밝혀져있다. 돌라스타틴/아우리스타틴 약물 모이어티는 펩티드성 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Francisco et al. (2003) Blood 102(4):1458-1465).
예시적인 아우리스타틴 실시양태는 US 7498298 및 US 7659241 (이들의 개시내용은 그 전문이 명백하게 참조로 포함됨)에 개시된 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다:
Figure pct00029
상기 식에서, DE 및 DF의 파상선은 항체 또는 항체-링커 성분에 대한 공유 부착 부위를 나타내고, 독립적으로 각각의 위치에서:
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나;
또는 R4 및 R5는 연합되어 카르보시클릭 고리를 형성하고, 화학식 -(CRaRb)n-을 가지며, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보사이클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되고;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
각각의 R8은 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로사이클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH 또는 NR12이고, 여기서 R12는 C1-C8 알킬이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
각 경우의 R15는 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
각 경우의 R16은 독립적으로 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카르보사이클)로부터 선택되고;
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
한 실시양태에서, R3, R4 및 R7은 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이고, R5는 -H 또는 메틸이다. 예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이다.
또 다른 실시양태에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R9는 -H이다.
또 다른 실시양태에서, 각 경우의 R8은 -OCH3이다.
예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이고, 각 경우의 R8은 -OCH3이고, R9는 -H이다.
한 실시양태에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
한 실시양태에서, R10은 아릴이다.
예시적인 실시양태에서, R10은 -페닐이다.
예시적인 실시양태에서, Z가 -O-인 경우에, R11은 -H, 메틸 또는 t-부틸이다.
한 실시양태에서, Z가 -NH인 경우에, R11은 -CH(R15)2이고, 여기서 R15는 -(CH2)n-N(R16)2이고, R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
또 다른 실시양태에서, Z가 -NH인 경우에, R11은 -CH(R15)2이고, 여기서 R15는 -(CH2)n-SO3H이다.
화학식 DE의 예시적인 아우리스타틴 실시양태는 MMAE이고, 여기서 파상선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 공유 부착을 나타낸다:
Figure pct00030
화학식 DF의 예시적인 아우리스타틴 실시양태는 MMAF이고, 여기서 파상선은 항체-약물 접합체의 링커 (L)에 대한 공유 부착을 나타낸다:
Figure pct00031
다른 예시적인 실시양태는 펜타펩티드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에서 페닐알라닌 카르복시 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물 (WO 2007/008848), 및 펜타펩티드 아우리스타틴 약물 모이어티의 C-말단에서 페닐알라닌 측쇄 변형을 갖는 모노메틸발린 화합물 (WO 2007/008603)을 포함한다.
MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 화학식 I의 ADC의 비제한적인 예시적인 실시양태는 하기 구조 및 약어를 갖는다 (여기서, "Ab"는 항체이고; p는 1 내지 약 8이고, "Val-Cit"는 발린-시트룰린 디펩티드이고; "S"는 황 원자임):
Figure pct00032
Figure pct00033
MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 화학식 I의 ADC의 비제한적인 예시적인 실시양태는 Ab-MC-PAB-MMAF 및 Ab-PAB-MMAF를 추가로 포함한다. 단백질분해적으로 절단가능하지 않은 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역접합체는 단백질분해적으로 절단가능한 링커에 의해 항체에 부착된 MMAF를 포함하는 면역접합체와 대등한 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다 (Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124). 일부 이러한 실시양태에서, 약물 방출은 세포에서의 항체 분해에 의해 일어나는 것으로 여겨진다.
전형적으로, 펩티드-기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩티드 단편 사이에 펩티드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어 액체 상 합성 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [E. Schroeder and K. Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조). 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 일부 실시양태에서 US 7498298; US 5635483; US 5780588; 문헌 [Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863; 및 Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784]의 방법에 따라 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 DE, 예컨대 MMAE, 및 DF, 예컨대 MMAF의 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티, 및 그의 약물-링커 중간체 및 유도체, 예컨대 MC-MMAF, MC-MMAE, MC-vc-PAB-MMAF, 및 MC-vc-PAB-MMAE는 US 7498298; 문헌 [Doronina et al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124; 및 Doronina et al. (2003) Nat. Biotech. 21:778-784]에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 이어서 관심 항체에 접합될 수 있다.
(3) 칼리케아미신
일부 실시양태에서, 면역접합체는 1개 이상의 칼리케아미신 분자에 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 패밀리의 항생제 및 그의 유사체는 피코몰 미만의 농도에서 이중-가닥 DNA 절단을 발생시킬 수 있다 (Hinman et al., (1993) Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., (1998) Cancer Research 58:2925-2928). 칼리케아미신은 세포내 작용 부위를 갖지만, 특정 경우에는 형질 막을 용이하게 통과하지 못한다. 따라서, 항체-매개 내재화를 통한 이들 작용제의 세포 흡수는 일부 실시양태에서 그의 세포독성 효과를 크게 증진시킬 수 있다. 칼리케아미신 약물 모이어티를 갖는 항체-약물 접합체를 제조하는 비제한적인 예시적인 방법은 예를 들어 US 5712374; US 5714586; US 5739116; 및 US 5767285에 기재되어 있다.
(4) 피롤로벤조디아제핀
일부 실시양태에서, ADC는 피롤로벤조디아제핀 (PBD)을 포함한다. 일부 실시양태에서, PDB 이량체는 특이적 DNA 서열을 인식하고, 그에 결합한다. 천연 산물 안트라마이신, PBD는 1965년에 처음 보고되었다 (Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5793-5795; Leimgruber, et al., (1965) J. Am. Chem. Soc., 87:5791-5793). 그 이후로, 트리시클릭 PBD 스캐폴드의 이량체 (US 6884799; US 7049311; US 7067511; US 7265105; US 7511032; US 7528126; US 7557099)를 비롯하여 다수의 PBD (자연 발생 및 유사체 둘 다)가 보고되었다 (Thurston, et al., (1994) Chem. Rev. 1994, 433-465). 임의의 특정한 이론에 얽매이는 것을 의도하지는 않지만, 이량체 구조는 B-형태 DNA의 작은 홈과의 이소나선성을 위해 적절한 3차원 형상을 부여함으로써, 결합 부위에서의 스너그 피트를 유도하는 것으로 여겨진다 (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham-VanDevanter, (1986) Acc. Chem. Res., 19:230-237). C2 아릴 치환기를 보유하는 이량체 PBD 화합물은 세포독성제로서 유용한 것으로 밝혀졌다 (Hartley et al. (2010) Cancer Res. 70(17):6849-6858; Antonow (2010) J. Med. Chem. 53(7):2927-2941; Howard et al. (2009) Bioorganic and Med. Chem. Letters 19(22):6463-6466).
PBD 이량체는 항체에 접합되며, 생성된 ADC는 항암 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. PBD 이량체 상의 비제한적인 예시적인 연결 부위는 5-원 피롤로 고리, PBD 단위 사이의 테더, 및 N10-C11 이민 기를 포함한다 (WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598).
ADC의 비제한적인 예시적인 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 A 및 그의 염 및 용매화물을 가지며:
<화학식 A>
Figure pct00034
상기 식에서, 파상선은 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중 결합의 임의적인 존재를 나타내고;
R2는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로로부터 추가로 선택되고, 여기서 RD는 독립적으로 R, CO2R, COR, CHO, CO2H 및 할로로부터 선택되고;
R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되고;
R7은 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되고;
Q는 독립적으로 O, S 및 NH로부터 선택되고;
R11은 H 또는 R이거나, 또는 Q가 O인 경우에 SO3M이고, 여기서 M은 금속 양이온이고;
R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-8 알킬, C1-12 알킬, C3-8 헤테로시클릴, C3-20 헤테로사이클, 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 임의로 기 NRR'와 관련하여, R 및 R'는 이들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R12, R16, R19 및 R17은 각각 R2, R6, R9 및 R7에 대해 정의된 바와 같고;
R"은 C3-12 알킬렌 기이고, 상기 쇄에는 1개 이상의 헤테로원자, 예를 들어 O, S, N(H), NMe 및/또는 임의로 치환된 방향족 고리, 예를 들어 벤젠 또는 피리딘이 개재될 수 있고;
X 및 X'는 독립적으로 O, S 및 N(H)로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-12 알킬, C3-20 헤테로사이클 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 임의로 기 NRR'와 관련하여, R 및 R'는 이들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성한다.
일부 실시양태에서, R9 및 R19는 H이다.
일부 실시양태에서, R6 및 R16은 H이다.
일부 실시양태에서, R7 및 R17은 둘 다 OR7A이고, 여기서 R7A는 임의로 치환된 C1-4 알킬이다. 일부 실시양태에서, R7A는 Me이다. 일부 실시양태에서, R7A는 Ch2Ph이고, 여기서 Ph는 페닐 기이다.
일부 실시양태에서, X는 O이다.
일부 실시양태에서, R11은 H이다.
일부 실시양태에서, 각각의 단량체 단위에서 C2와 C3 사이에 이중 결합이 존재한다.
일부 실시양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 H 및 R로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 R이다. 일부 실시양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 임의로 치환된 C5-20 아릴 또는 C5-7 아릴 또는 C8-10 아릴이다. 일부 실시양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 임의로 치환된 페닐, 티에닐, 나프틸, 피리딜, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다. 일부 실시양태에서, R2 및 R12는 독립적으로 =O, =CH2, =CH-RD, 및 =C(RD)2로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, R2 및 R12는 각각 =CH2이다. 일부 실시양태에서, R2 및 R12는 각각 H이다. 일부 실시양태에서, R2 및 R12는 각각 =O이다. 일부 실시양태에서, R2 및 R12는 각각 =CF2이다. 일부 실시양태에서, R2 및/또는 R12는 독립적으로 =C(RD)2이다. 일부 실시양태에서, R2 및/또는 R12는 독립적으로 =CH-RD이다.
일부 실시양태에서, R2 및/또는 R12가 =CH-RD인 경우에, 각각의 기는 독립적으로 하기 제시된 배위를 가질 수 있다:
Figure pct00035
일부 실시양태에서, =CH-RD는 배위 (I)로 존재한다.
일부 실시양태에서, R"은 C3 알킬렌 기 또는 C5 알킬렌 기이다.
일부 실시양태에서, ADC의 예시적인 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 A(I)의 구조를 갖는다:
<화학식 A(I)>
Figure pct00036
상기 식에서, n은 0 또는 1이다.
일부 실시양태에서, ADC의 예시적인 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 A(II)의 구조를 갖는다:
<화학식 A(II)>
Figure pct00037
상기 식에서, n은 0 또는 1이다.
일부 실시양태에서, ADC의 예시적인 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 A(III)의 구조를 갖는다:
<화학식 A(III)>
Figure pct00038
상기 식에서, RE 및 RE"는 각각 독립적으로 H 또는 RD로부터 선택되고, 여기서 RD는 상기 정의된 바와 같고;
상기 식에서, n은 0 또는 1이다.
일부 실시양태에서, n은 0이다. 일부 실시양태에서, n은 1이다. 일부 실시양태에서, RE 및/또는 RE"는 H이다. 일부 실시양태에서, RE 및 RE"는 H이다. 일부 실시양태에서, RE 및/또는 RE"는 RD이고, 여기서 RD는 임의로 치환된 C1-12 알킬이다. 일부 실시양태에서, RE 및/또는 RE"는 RD이고, 여기서 RD는 메틸이다.
일부 실시양태에서, ADC의 예시적인 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 A(IV)의 구조를 갖는다:
<화학식 A(IV)>
Figure pct00039
상기 식에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5-20 아릴이고; 여기서 Ar1 및 Ar2는 동일하거나 상이할 수 있고;
n은 0 또는 1이다.
일부 실시양태에서, ADC의 예시적인 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 A(V)의 구조를 갖는다:
<화학식 A(V)>
Figure pct00040
상기 식에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5-20 아릴이고; 여기서 Ar1 및 Ar2는 동일하거나 상이할 수 있고;
n은 0 또는 1이다.
일부 실시양태에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 페닐, 푸라닐, 티오페닐 및 피리딜로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 페닐이다. 일부 실시양태에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 티엔-2-일 또는 티엔-3-일이다. 일부 실시양태에서, Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다. 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐 기는 임의의 이용가능한 고리 위치를 통해 PBD 코어에 결합될 수 있다. 예를 들어, 퀴놀리닐은 퀴놀린-2-일, 퀴놀린-3-일, 퀴놀린-4-일, 퀴놀린-5-일, 퀴놀린-6-일, 퀴놀린-7-일 및 퀴놀린-8-일일 수 있다. 일부 실시양태에서, 퀴놀리닐은 퀴놀린-3-일 및 퀴놀린-6-일로부터 선택된다. 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-1-일, 이소퀴놀린-3-일, 이소퀴놀린-4-일, 이소퀴놀린-5-일, 이소퀴놀린-6-일, 이소퀴놀린-7-일 및 이소퀴놀린-8-일일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소퀴놀리닐은 이소퀴놀린-3-일 및 이소퀴놀린-6-일로부터 선택된다.
ADC의 추가의 비제한적인 예시적인 PBD 이량체 성분은 화학식 B 및 그의 염 및 용매화물을 가지며:
<화학식 B>
Figure pct00041
상기 식에서, 파상선은 링커에 대한 공유 부착 부위를 나타내고;
OH에 연결된 파상선은 S 또는 R 배위를 나타내고;
RV1 및 RV2는 독립적으로 H, 메틸, 에틸 및 페닐 (상기 페닐은 특히 4 위치에서 플루오로로 임의로 치환될 수 있음) 및 C5-6 헤테로시클릴로부터 선택되고; 여기서 RV1 및 RV2는 동일하거나 상이할 수 있고;
n은 0 또는 1이다.
일부 실시양태에서, RV1 및 RV2는 독립적으로 H, 페닐, 및 4-플루오로페닐로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 링커는 B 고리의 N10 이민, C 고리의 C-2 엔도/엑소 위치, 또는 A 고리를 연결하는 테터 단위를 비롯하여, PBD 이량체 약물 모이어티의 다양한 부위 중 하나에 부착될 수 있다 (하기 구조 C(I) 및 C(II) 참조).
ADC의 비제한적인 예시적인 PBD 이량체 성분은 하기 화학식 C(I) 및 C(II)를 포함한다:
<화학식 C(I)>
Figure pct00042
<화학식 C(II)>
Figure pct00043
화학식 C(I) 및 C(II)는 그의 N10-C11 이민 형태로 제시된다. 예시적인 PBD 약물 모이어티는 또한 하기 표에 제시된 바와 같은 카르비놀아민 및 보호된 카르비놀아민 형태를 포함한다:
Figure pct00044
상기 식에서,
X는 CH2 (n = 1 내지 5), N 또는 O이고;
Z 및 Z'는 독립적으로 OR 및 NR2로부터 선택되고, 여기서 R은 1 내지 5개의 탄소 원자를 함유하는 1급, 2급 또는 3급 알킬 쇄이고;
R1, R'1, R2 및 R'2는 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-20 아릴 (치환된 아릴 포함), C5-20 헤테로아릴 기, -NH2, -NHMe, -OH 및 -SH로부터 선택되고, 여기서 일부 실시양태에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐 쇄는 5개 이하의 탄소 원자를 포함하고;
R3 및 R'3은 독립적으로 H, OR, NHR 및 NR2로부터 선택되고, 여기서 R은 1 내지 5개의 탄소 원자를 함유하는 1급, 2급 또는 3급 알킬 쇄이고;
R4 및 R'4는 독립적으로 H, Me 및 OMe로부터 선택되고;
R5는 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C5-20 아릴 (할로, 니트로, 시아노, 알콕시, 알킬, 헤테로시클릴에 의해 치환된 아릴 포함) 및 C5-20 헤테로아릴 기로부터 선택되고, 여기서 일부 실시양태에서, 알킬, 알케닐 및 알키닐 쇄는 5개 이하의 탄소 원자를 포함하고;
R11은 H, C1-C8 알킬 또는 보호기 (예컨대, 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBZ), 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc), 또는 자기-희생 단위, 예컨대 발린-시트룰린-PAB를 포함하는 모이어티)이고;
R12는 H, C1-C8 알킬 또는 보호기이고;
여기서, R1, R'1, R2, R'2, R5, 또는 R12 중 하나의 수소, 또는 A 고리 사이의 -OCH2CH2(X)nCH2CH2O- 스페이서의 수소는 ADC의 링커에 연결된 결합으로 대체된다.
ADC의 예시적인 PDB 이량체 부분은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (파상선은 링커에 대한 공유 부착의 부위를 나타냄):
Figure pct00045
PBD 이량체를 포함하는 ADC의 비제한적인 예시적인 실시양태는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00046
상기 식에서, n은 0 내지 12이다. 일부 실시양태에서, n은 2 내지 10이다. 일부 실시양태에서, n은 4 내지 8이다. 일부 실시양태에서, n은 4, 5, 6, 7 및 8로부터 선택된다.
PBD 이량체-val-cit-PAB-Ab 및 PBD 이량체-Phe-Lys-PAB-Ab의 링커는 프로테아제 절단가능하며, PBD 이량체-말레이미드-아세탈의 링커는 산-불안정성이다.
PBD 이량체 및 PBD 이량체를 포함하는 ADC는 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157; WO 2011/130598을 참조한다.
(5) 안트라시클린
일부 실시양태에서, ADC는 안트라시클린을 포함한다. 안트라시클린은 세포독성 활성을 나타내는 항생제 화합물이다. 임의의 특정한 이론에 얽매이는 것을 의도하지는 않지만, 연구는 안트라시클린이 1) 세포의 DNA 내로의 약물 분자의 삽입에 의한 DNA-의존적 핵산 합성의 억제, 2) 약물에 의한 유리 라디칼의 생성 (이는 이어서 세포 거대분자와 반응하여 세포에 손상을 유발함), 및/또는 3) 약물 분자와 세포 막의 상호작용 (예를 들어, 문헌 [C. Peterson et al., "Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia" in Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. at pp.97-102] 참조)을 비롯한 수많은 상이한 메카니즘에 의해 세포를 사멸시키는 작동을 할 수 있음을 보여주었다. 그의 세포독성 잠재성으로 인해, 안트라시클린은 다수의 암, 예컨대 백혈병, 유방 암종, 폐 암종, 난소 선암종 및 육종의 치료에 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [P.H- Wiernik, in Anthracycline: Current Status And New Developments p 11] 참조).
비제한적인 예시적인 안트라시클린은 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 다우노마이신, 네모루비신 및 그의 유도체를 포함한다. 다우노루비신 및 독소루비신의 면역접합체 및 전구약물이 제조되고 연구되었다 (Kratz et al. (2006) Current Med. Chem. 13:477-523; Jeffrey et al. (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov et al. (2005) Bioconj. Chem. 16:717-721; Nagy et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834; Dubowchik et al. (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King et al. (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; EP 0328147; US 6630579). 항체-약물 접합체 BR96-독소루비신은 종양-연관 항원 루이스-Y와 특이적으로 반응하고, 제I상 및 제II상 연구에서 평가된 바 있다 (Saleh et al. (2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292; Ajani et al. (2000) Cancer Jour. 6:78-81; Tolcher et al. (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484).
PNU-159682는 네모루비신의 강력한 대사물 (또는 유도체)이다 (Quintieri, et al. (2005) Clinical Cancer Research 11(4):1608-1617). 네모루비신은 독소루비신의 글리코시드 아미노 상에 2-메톡시모르폴리노 기를 갖는 독소루비신의 반합성 유사체이고, 간세포 암종에 대한 제II/III상 시험 (Sun et al. (2003) Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22, Abs1448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cancer Research, 44:1st Ed, Abs 4649; Pacciarini et al. (2006) Jour. Clin. Oncology 24:14116)을 비롯하여 임상 평가를 받은 바 있다 (Grandi et al. (1990) Cancer Treat. Rev. 17:133; Ripamonti et al. (1992) Brit. J. Cancer 65:703).
네모루비신 또는 네모루비신 유도체를 포함하는 비제한적인 예시적인 ADC는 하기 화학식 Ia 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 제시된다:
<화학식 Ia>
Figure pct00047
상기 식에서, R1은 수소 원자, 히드록시 또는 메톡시 기이고, R2는 C1-C5 알콕시 기이고;
L1 및 Z는 함께 본원에 기재된 바와 같은 링커 (L)이고;
T는 본원에 기재된 바와 같은 항체 (Ab)이고;
m은 1 내지 약 20이다. 일부 실시양태에서, m은 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4이다.
일부 실시양태에서, R1 및 R2는 둘 다 메톡시 (-OMe)이다.
네모루비신 또는 네모루비신 유도체를 포함하는 추가의 비제한적인 예시적인 ADC는 하기 화학식 Ib 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 제시된다:
<화학식 Ib>
Figure pct00048
상기 식에서, R1은 수소 원자, 히드록시 또는 메톡시 기이고, R2는 C1-C5 알콕시 기이고;
L2 및 Z는 함께 본원에 기재된 바와 같은 링커 (L)이고;
T는 본원에 기재된 바와 같은 항체 (Ab)이고;
m은 1 내지 약 20이다. 일부 실시양태에서, m은 1 내지 10, 1 내지 7, 1 내지 5, 또는 1 내지 4이다.
일부 실시양태에서, R1 및 R2는 둘 다 메톡시 (-OMe)이다.
일부 실시양태에서, 네모루비신-함유 ADC의 네모루비신 성분은 PNU-159682이다. 일부 이러한 실시양태에서, ADC의 약물 부분은 하기 구조 중 하나를 가질 수 있다:
Figure pct00049
상기 식에서, 파상선은 링커 (L)에 대한 부착을 나타낸다.
PNU-159682를 비롯한 안트라시클린은 여러 연결 부위, 및 본원에 기재된 링커를 비롯한 다양한 링커 (US 2011/0076287; WO2009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124)를 통해 항체에 접합될 수 있다.
네모루비신 및 링커를 포함하는 예시적인 ADC는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00050
Figure pct00051
(상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 H 및 C1-C6 알킬로부터 선택됨); 및
Figure pct00052
PNU-159682 말레이미드 아세탈-Ab의 링커는 산-불안정성이며, PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서-Ab, 및 PNU-159682-val-cit-PAB-스페이서(R1R2)-Ab의 링커는 프로테아제 절단가능하다.
(6) 다른 약물 모이어티
약물 모이어티는 또한 겔다나마이신 (Mandler et al. (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791); 및 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않는 그의 효소적 활성 독소 및 단편을 포함한다. 예를 들어, WO 93/21232를 참조한다.
약물 모이어티는 또한 핵산분해 활성 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제)을 갖는 화합물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역접합체는 고도의 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합된 항체의 생산을 위해 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역접합체가 검출용으로 사용되는 경우에, 이는 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 Tc99 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 지르코늄-89, 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다. 지르코늄-89는 예를 들어 PET 영상화를 위해, 다양한 금속 킬레이트화제에 복합체화될 수 있고, 항체에 접합될 수 있다 (WO 2011/056983).
방사성- 또는 다른 표지는 공지된 방식으로 면역접합체에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수 있거나, 또는 예를 들어 1개 이상의 수소 대신에 1개 이상의 플루오린-19원자를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표지, 예컨대 Tc99, I123, Re186, Re188 및 In111은 항체에서 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이트륨-90은 항체의 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아이오도겐(IODOGEN) 방법 (Fraker et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)을 사용하여 아이오딘-123을 혼입시킬 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]은 특정의 다른 방법을 기재한다.
특정 실시양태에서, 면역접합체는 전구약물-활성화 효소에 접합된 항체를 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 전구약물-활성화 효소는 전구약물 (예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 참조)을 활성 약물, 예컨대 항암 약물로 전환시킨다. 이러한 면역접합체는 일부 실시양태에서 항체-의존성 효소-매개 전구약물 요법 ("ADEPT")에 유용하다. 항체에 접합될 수 있는 효소는 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예컨대, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환기를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 그의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 효소는 관련 기술분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 항체에 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)]을 참조한다.
c) 약물 로딩
약물 로딩은 화학식 I의 분자에서의 항체당 약물 모이어티의 평균 수인 p로 나타내어진다. 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개의 약물 모이어티 (D) 범위일 수 있다. 화학식 I의 ADC는 1 내지 20개 범위의 약물 모이어티와 접합된 항체의 집합을 포함한다. 접합 반응으로부터의 ADC의 제조에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수는 통상적인 수단, 예컨대 질량 분광분석법, ELISA 검정 및 HPLC에 의해 특성화될 수 있다. 또한, ADC의 정략적 분포가 p와 관련하여 결정될 수 있다. 일부 경우에, p가 다른 약물 로딩을 갖는 ADC로부터의 특정 값인 균질 ADC의 분리, 정제 및 특성화는 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 항체-약물 접합체의 경우에, p는 항체 상의 부착 부위의 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 상기 특정의 예시적인 실시양태에서와 같이 부착이 시스테인 티올인 경우에, 항체는 시스테인 티올 기를 단지 1개 또는 여러개 가질 수 있거나, 또는 링커가 부착될 수 있는 충분히 반응성인 티올 기를 단지 1개 또는 여러개 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 보다 높은 약물 로딩, 예를 들어 p >5는 특정 항체-약물 접합체의 응집, 불용성, 독성, 또는 세포 투과성 상실을 유발할 수 있다. 특정 실시양태에서, ADC에 대한 평균 약물 로딩은 1 내지 약 8; 약 2 내지 약 6; 또는 약 3 내지 약 5의 범위이다. 실제로, 특정 ADC의 경우에, 항체당 약물 모이어티의 최적 비는 8 미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있는 것으로 밝혀졌다 (US 7498298).
특정 실시양태에서, 이론적 최대치 미만의 약물 모이어티가 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는 예를 들어 하기 논의되는 바와 같이 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 리신 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로, 항체는 약물 모이어티에 연결될 수 있는 많은 유리 및 반응성 시스테인 티올 기를 함유하지 않고; 실제로 항체 내의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 디술피드 가교로서 존재한다. 특정 실시양태에서, 항체를 부분 또는 전체 환원 조건 하에 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 환원시켜 반응성 시스테인 티올 기를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 변성 조건에 적용되어 반응성 친핵성 기, 예컨대 리신 또는 시스테인을 제시한다.
ADC의 로딩 (약물/항체 비)은 상이한 방식으로, 예를 들어 (i) 항체와 관련하여 몰 과량의 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 제한, (ii) 접합 반응 시간 또는 온도의 제한, 및 (iii) 시스테인 티올 변형에 대한 부분적 또는 제한적 환원 조건에 의해 제어될 수 있다.
1개 초과의 친핵성 기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하는 경우에, 생성되는 산물은 항체에 부착된 1개 이상의 약물 모이어티의 분포를 갖는 ADC 화합물의 혼합물인 것으로 이해하여야 한다. 항체당 약물의 평균 수는 항체에 특이적이고 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 검정에 의해 혼합물로부터 계산될 수 있다. 개개의 ADC 분자는 질량 분광분석법에 의해 혼합물 중에서 확인될 수 있고, HPLC, 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [McDonagh et al. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004] 참조). 특정 실시양태에서, 단일 로딩 값을 갖는 균질 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리될 수 있다.
d) 면역접합체를 제조하는 특정 방법
화학식 I의 ADC는 하기를 비롯한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용한 몇몇 경로에 의해 제조될 수 있다: (1) 항체의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜 공유 결합을 통해 Ab-L을 형성한 다음, 이를 약물 모이어티 D와 반응시키는 것; 및 (2) 약물 모이어티의 친핵성 기를 2가 링커 시약과 반응시켜 공유 결합을 통해 D-L을 형성한 다음, 이를 항체의 친핵성 기와 반응시키는 것. 후자의 경로를 통해 화학식 I의 ADC를 제조하는 예시적인 방법은 US 7498298에 기재되어 있으며, 이는 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
항체 상의 친핵성 기는 (i) N-말단 아민 기; (ii) 측쇄 아민 기, 예를 들어 리신; (iii) 측쇄 티올 기, 예를 들어 시스테인; 및 (iv) 항체가 글리코실화되는 당 히드록실 또는 아미노 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아민, 티올 및 히드록실 기는 친핵성이고, (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기를 비롯한 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다. 특정 항체는 환원가능한 쇄간 디술피드, 즉 시스테인 가교를 갖는다. 항체가 완전히 또는 부분적으로 환원되도록, 환원제, 예컨대 DTT (디티오트레이톨) 또는 트리카르보닐에틸포스핀 (TCEP)으로 처리함으로써 항체를 링커 시약과의 접합을 위해 반응성이 되도록 할 수 있다. 따라서, 각각의 시스테인 가교는 이론적으로 2개의 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 리신 잔기의 변형을 통해, 예를 들어 리신 잔기를 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약)과 반응시켜 아민의 티올로의 전환을 유발함으로써 추가의 친핵성 기를 항체 내로 도입할 수 있다. 반응성 티올 기는 또한 1, 2, 3, 4개, 또는 그 초과의 시스테인 잔기를 도입함으로써 (예를 들어, 1개 이상의 비천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함하는 변이체 항체를 제조함으로써) 항체 내로 도입할 수 있다.
항체-약물 접합체는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 기와 항체 상의 친전자성 기, 예컨대 알데히드 또는 케톤 카르보닐 기 사이의 반응에 의해 생성될 수 있다. 링커 시약 상의 유용한 친핵성 기는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 항체를 변형시켜 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환기와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입한다. 또 다른 실시양태에서, 글리코실화 항체의 당을, 예를 들어 퍼아이오데이트 산화 시약으로 산화시켜 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민 기와 반응할 수 있는 알데히드 또는 케톤 기를 형성할 수 있다. 생성된 이민 쉬프 염기 기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 또는 예를 들어 보로히드라이드 시약에 의해 환원되어 안정한 아민 연결을 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 글리코실화 항체의 탄수화물 부분을 갈락토스 옥시다제 또는 소듐 메타-퍼아이오데이트와 반응시켜, 약물 상의 적절한 기와 반응할 수 있는 카르보닐 (알데히드 및 케톤) 기를 항체 내에 생성할 수 있다 (Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또 다른 실시양태에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유하는 항체를 소듐 메타-퍼아이오데이트와 반응시켜, 제1 아미노산 대신 알데히드를 생성할 수 있다 (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). 이러한 알데히드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응할 수 있다.
약물 모이어티 상의 예시적인 친핵성 기는, (i) 활성 에스테르, 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할라이드, (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예컨대 할로아세트아미드, (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 기를 비롯한 링커 모이어티 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
ADC를 제조하는데 사용될 수 있는 비제한적인 예시적인 교차-링커 시약은 본원의 "예시적인 링커" 표제의 섹션에서 기재된다. 단백질성 모이어티 및 화학적 모이어티를 비롯한 2개의 모이어티를 연결하기 위해 이러한 교차-링커 시약을 사용하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 재조합 DNA 분자는, 서로 인접해 있거나 또는 접합체의 목적하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되어 있는, 접합체의 항체 및 세포독성 부분을 코딩하는 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체를 종양 사전-표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있고, 여기서 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후에 제거제를 사용하여 순환계로부터 미결합 접합제를 제거하고, 이어서 세포독성제 (예를 들어, 약물 또는 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
F. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-LGR5 항체는 생물학적 샘플에서 LGR5의 존재를 검출하기 위한 본원에 기재된 임의의 방법에 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. "생물학적 샘플"은, 예를 들어 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적 암성 기저 세포 암종을 비롯한 생검 물질)을 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-LGR5 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플에서 LGR5의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 항-LGR5 항체의 LGR5에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 항-LGR5 항체와 접촉시키는 단계, 및 항-LGR5 항체와 생물학적 샘플 내의 LGR5 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 항-LGR5 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하기 위해 사용되고, 예를 들어 여기서 LGR5는 환자의 선택을 위한 바이오마커이다. 추가 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적 암성 기저 세포 암종 조직을 비롯한 생검 물질)이다.
추가 실시양태에서, 항-LGR5 항체는 예를 들어 생체내 영상화에 의해 대상체에서 LGR5-양성 암을 검출하기 위해, 예를 들어 암을 진단하거나, 예측하거나 또는 병기결정하거나, 요법의 적절한 과정을 결정하거나, 또는 요법에 대한 암의 반응을 모니터링하는 목적을 위해 생체내에서 사용된다. 생체내 검출을 위해 관련 기술분야에 공지된 한 방법은, 예를 들어 문헌 [van Dongen et al., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) 및 Verel et al., J. Nucl. Med. 44:1271-1281 (2003)]에 기재된 바와 같은 면역-양전자 방사 단층촬영 (면역-PET)이다. 이러한 실시양태에서, LGR5-양성 암을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 표지된 항-LGR5 항체를 투여하는 단계, 및 대상체에서 표지된 항-LGR5 항체를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 표지된 항-LGR5 항체의 검출은 대상체 내의 LGR5-양성 암을 나타내는 것인, 대상체에서 LGR5-양성 암을 검출하는 방법이 제공된다. 특정의 이러한 실시양태에서, 표지된 항-LGR5 항체는 양전자 방출체, 예컨대 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I에 접합된 항-LGR5 항체를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다.
추가 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법은 기질에 고정된 제1 항-LGR5 항체를 LGR5의 존재에 대해 시험할 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계, 기질을 제2 항-LGR5 항체에 노출시키는 단계, 및 제2 항-LGR5가 생물학적 샘플에서 제1 항-LGR5 항체 및 LGR5 사이의 복합체에 결합하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 기질은 임의의 지지체 매질, 예를 들어 유리, 금속, 세라믹, 중합체 비드, 슬라이드, 칩, 및 다른 기질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직 (예를 들어, 암성 또는 잠재적 암성 기저 세포 암종 조직을 비롯한 생검 물질)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 또는 제2 항-LGR5 항체는 본원에 기재된 임의의 항체이다. 일부 이러한 실시양태에서, 제2 항-LGR5 항체는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 8E11 또는 8E11로부터 유래된 항체일 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 제2 항-LGR5 항체는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 YW353 또는 YW353으로부터 유래된 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 또는 제2 항-LGR5 항체는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 3G12 및 2H6, 및 3G12 및/또는 2H6으로부터 유래된 항체로부터 선택된다.
임의의 상기 실시양태에 따라 진단 또는 검출될 수 있는 예시적인 장애는 LGR5-양성 암을 포함한다. 일부 실시양태에서, LGR5-양성 암은 본원의 실시예 B에 기재된 조건 하에 >90%의 종양 세포에서 염색이 매우 약하거나 또는 전혀 없는 것에 해당하는 "0"을 초과하는 항-LGR5 면역조직화학 (IHC) 또는 계내 혼성화 (ISH) 스코어를 받은 암이다. 또 다른 실시양태에서, LGR5-양성 암은 본원의 실시예 B에 기재된 조건 하에 정의된 바와 같은 1+, 2+ 또는 3+ 수준으로 LGR5를 발현한다. 일부 실시양태에서, LGR5-양성 암은 LGR5 mRNA를 검출하는 역전사효소 PCR (RT-PCR) 검정에 따라 LGR5를 발현하는 암이다. 일부 실시양태에서, RT-PCR은 정량적 RT-PCR이다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-LGR5 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대, 형광, 발색, 전자-고밀도, 화학발광, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 실시양태에서, 표지는 양전자 방출체이다. 양전자 방출체는 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr, 및 124I를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정한 실시양태에서, 양전자 방출체는 89Zr이다.
G. 제약 제제
항-LGR5 항체 (본원에 기재된 바와 같은 면역접합체 포함)의 제약 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 이러한 항체 (면역접합체 포함)를 1종 이상의 임의적인 제약상 허용되는 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하는 것에 의해 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조된다. 제약상 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 추가로 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 포함한다. rHuPH20을 비롯한 특정의 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 1종 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
면역접합체 제제를 비롯한 예시적인 동결건조 항체는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 면역접합체 제제를 비롯한 수성 항체는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하며, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
또한, 본원의 제제는 치료할 특정한 적응증에 필요한 1종 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다.
활성 성분은, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체 (면역접합체 포함)를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
H. 제조 물품
또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 위에 있거나 용기에 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 조성물 그 자체를 수용하거나 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 항체 (면역접합체 포함)이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 상태의 치료를 위해 사용됨을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 내부에 항체 (면역접합체 포함)를 포함하는 조성물이 수용된 제1 용기; 및 (b) 내부에 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 수용된 제2 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 용기는 내부에 헷지호그 경로의 억제제를 포함하는 조성물이 수용된다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 길항제이다. 일부 실시양태에서, 헷지호그 경로의 억제제는 스무슨드의 시클로파민-경쟁적 길항제이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드 또는 그의 염이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드이다. 일부 실시양태에서, 스무슨드의 길항제는 비스모데깁이다.
이러한 실시양태에서 제조 물품은, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 물품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
III. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 설명을 고려하여 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있음이 이해된다.
실시예 1
LGR5DTReGFP 구축
LGR5를 위해, C57BL/6 BAC (RP23 라이브러리)로부터의 7,213bp 단편 (어셈블리 NCBI37/mm9, chr10:115,020,315-115,027,527)을 플라스미드 pBlight-TK25 내로 클로닝하였다. LGR5를 위한 DTR-EGFP KI 벡터를 생성하기 위해, DTR-EGFP-pA-loxP-Neo-loxP 카세트를 합성하고 (블루 헤론(Blue Heron)/오리진(Origene), DTR-EGFP 서열은 이전에 기재된 것을 기반으로 함27), LGR5의 ATG 바로 다음에 삽입하여 (chr10:115,024,547, 반대 가닥), 엑손 1의 나머지 및 인트론 1의 스플라이스 공여자를 결실시켰다 (212bp 결실). CreERT2 KI 벡터를 생성하기 위해, dsRed2-IRES-CreERT2-pA-Frt-neo-Frt 카세트를 합성하고 (블루 헤론/오리진), DTR-EGFP 카세트와 동일한 위치에 삽입하였다. 최종 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
LGR5 KI 벡터를 NotI로 선형화하고, 표준 방법 (G418-양성 및 간시클로비르-음성 선택)을 사용하여 C57BL/6 C2 배아 줄기 세포를 표적화하였다. PCR 및 택맨 분석을 사용하여 양성 클론을 확인하고, 서열분석에 의해 변형된 유전자좌를 확인하였다. 정확하게 표적화된 배아 줄기 세포를 각각 Cre 또는 Flpe 플라스미드로 형질감염시켜 Neo 카세트를 제거하였다. 이어서 변형된 배아 줄기 세포를 표준 기술을 사용하여 배반포 내로 주사하고, 생성된 키메라를 C57BL/6N 암컷과 교배시킨 후에 배선 전이를 수득하였다.
표재성 기저 세포 암종 (BCC)에서의 DT 세포 제거
p53loxP / loxP;PtchloxP / loxP;LGR5DTReGFP /+ 마우스를 p53loxP / loxP;PtchloxP /+;K14CreER /+와 함께 번식시켜 K14CreER /+;p53loxP / loxP;PtchloxP / loxP;LGR5DTReGFP /+ 마우스를 생성하였다. 표재성 BCC 질환의 명백한 징후, 예컨대 털의 손실, 지저분한 코트, 귀 또는 꼬리 피부의 비후를 나타내는 동물을 연구 대상으로 하였다. 동물은 전형적으로 7주령에 연구 수행되었다. K14CreER /+;p53loxP / loxP;PtchloxP / loxP;LGR5DTReGFP /+ 마우스를 다음과 같은 요법으로 치료하였다. 잔류 표재성 BCC에 대한 DT 치료의 효과를 시험하기 위해, 마우스를 38일 동안 75 mg/kg의 비스모데깁 (GDC-0449) po bid로 치료하면서 디프테리아 독소 (DT)를 병용하여 제29일에 시작하여 최종 8일 동안 격일로 50 ug/kg으로 치료하였다. 대조 마우스를 38일 동안 75 mg/kg의 비스모데깁 (GDC-0449) po bid로 치료하면서 200 uL IP 염수를 병용하여 치료의 최종 8일 동안 치료하였다. 또한, 단일 DT 치료의 효과를 시험하기 위해 질환의 징후 (상기 열거됨)를 나타내는 동물을 5일 동안 격일로 염수 또는 DT 단독으로 50ug/kg으로 치료하였다.
조직학 및 면역형광 염색
치료된 동물로부터 수거한 피부에 대해 확립된 프로토콜을 사용하여 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 수행하였다. 대안적으로, 치료된 동물로부터의 등 피부를 4% 파라포름알데히드/PBS 용액 중에서 밤새 고정시키고, 세척하고, 30% 수크로스/PBS 용액 중에서 밤새 인큐베이션시키고, 동결 OCT 중에 포매시켰다. 이어서 동결된 블록으로부터 8 um로 절편을 잘라내고, 아폽토시스 마커 절단 카스파제 3 (1:1000), GFP (1:1000), 또는 케라틴 5 (1:1000)에 대해 염색하였다. 절편을 DAPI로 대조염색하였다.
결과
강력한 GFP 발현이 염수 단독으로 치료된 동물의 표재성 BCC 종양에서 관찰되었다. 이러한 결과는 LGR5가 표재성 BCC에서 발현된다는 것을 밝혀낸 계내 혼성화 실험으로부터의 관찰과 일치한다. 이들 대조 마우스에서, CC3 염색에 의해 표시되는 아폽토시스 세포는 드물었고, 모낭으로 한정되었다. 총 5일 동안 DT로 치료된 마우스에서, 유의한 CC3 염색은 종양에서 뿐만 아니라 모낭에서도 관찰되었다. 표피의 기저 세포에서는 유의한 아폽토시스가 전혀 관찰되지 않았고, 이는 DT 치료가 종양 및 모낭을 특이적으로 표적화한다는 것을 시사한다.
DT 치료가 잔류 BCC를 표적화할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 마우스를 28일 동안 비스모데깁으로 치료한 다음, 비스모데깁 및 DT로 추가 8일 동안 공동-치료하였다. 적어도 1마리의 동물에서, 케라틴 5 염색에 의해 밝혀진 바와 같이, 잔류 질환은 드물었다. 최소 CC3 염색은 잔류 질환이 이러한 동물에서 거의 제거되었음을 시사하였다. 다른 마우스에서, 본 발명자들은 잔류 종양에서 발생한 표적화된 아폽토시스가 스무슨드 길항제 비스모데깁에 의해 피부로부터 원래 제거되지 않았음을 관찰하였다.
치료 및 대조 마우스로부터의 다양한 조직에 대해 H&E 염색을 수행하였다. 비스모데깁 단독을 사용한 치료와 비교하여 비스모데깁 플러스 DT로 치료된 귀 조직의 비후에서 현저한 감소가 관찰되었고, 이는 DT 치료에 의한 LGR5 양성 세포의 추가의 제거가 잔류 질환을 제거하는데 유익하다는 것을 시사한다.
상기 본 발명은 이해의 명확성의 목적을 위해 예시 및 예의 방식으로 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
<서열 표>
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> METHODS OF USING ANTI-LGR5 ANTIBODIES <130> P5706R1-WO <140> Frederic J. 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Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 67 <211> 907 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Met Asp Thr Ser Arg Leu Gly Val Leu Leu Ser Leu Pro Val Leu Leu 1 5 10 15 Gln Leu Ala Thr Gly Gly Ser Ser Pro Arg Ser Gly Val Leu Leu Arg 20 25 30 Gly Cys Pro Thr His Cys His Cys Glu Pro Asp Gly Arg Met Leu Leu 35 40 45 Arg Val Asp Cys Ser Asp Leu Gly Leu Ser Glu Leu Pro Ser Asn Leu 50 55 60 Ser Val Phe Thr Ser Tyr Leu Asp Leu Ser Met Asn Asn Ile Ser Gln 65 70 75 80 Leu Leu Pro Asn Pro Leu Pro Ser Leu Arg Phe Leu Glu Glu Leu Arg 85 90 95 Leu Ala Gly Asn Ala Leu Thr Tyr Ile Pro Lys Gly Ala Phe Thr Gly 100 105 110 Leu Tyr Ser Leu Lys Val Leu Met Leu Gln Asn Asn Gln Leu Arg His 115 120 125 Val Pro Thr Glu Ala Leu Gln Asn Leu Arg Ser Leu Gln Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Asp Ala Asn His Ile Ser Tyr Val Pro Pro Ser Cys Phe Ser Gly 145 150 155 160 Leu His Ser Leu Arg His Leu Trp Leu Asp Asp Asn Ala Leu Thr Glu 165 170 175 Ile Pro Val Gln Ala Phe Arg Ser Leu Ser Ala Leu Gln Ala Met Thr 180 185 190 Leu Ala Leu Asn Lys Ile His His Ile Pro Asp Tyr Ala Phe Gly Asn 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Val Val Leu His Leu His Asn Asn Arg Ile His Ser 210 215 220 Leu Gly Lys Lys Cys Phe Asp Gly Leu His Ser Leu Glu Thr Leu Asp 225 230 235 240 Leu Asn Tyr Asn Asn Leu Asp Glu Phe Pro Thr Ala Ile Arg Thr Leu 245 250 255 Ser Asn Leu Lys Glu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Ile Arg Ser Ile 260 265 270 Pro Glu Lys Ala Phe Val Gly Asn Pro Ser Leu Ile Thr Ile His Phe 275 280 285 Tyr Asp Asn Pro Ile Gln Phe Val Gly Arg Ser Ala Phe Gln His Leu 290 295 300 Pro Glu Leu Arg Thr Leu Thr Leu Asn Gly Ala Ser Gln Ile Thr Glu 305 310 315 320 Phe Pro Asp Leu Thr Gly Thr Ala Asn Leu Glu Ser Leu Thr Leu Thr 325 330 335 Gly Ala Gln Ile Ser Ser Leu Pro Gln Thr Val Cys Asn Gln Leu Pro 340 345 350 Asn Leu Gln Val Leu Asp Leu Ser Tyr Asn Leu Leu Glu Asp Leu Pro 355 360 365 Ser Phe Ser Val Cys Gln Lys Leu Gln Lys Ile Asp Leu Arg His Asn 370 375 380 Glu Ile Tyr Glu Ile Lys Val Asp Thr Phe Gln Gln Leu Leu Ser Leu 385 390 395 400 Arg Ser Leu Asn Leu Ala Trp Asn Lys Ile Ala Ile Ile His Pro Asn 405 410 415 Ala Phe Ser Thr Leu Pro Ser Leu Ile Lys Leu Asp Leu Ser Ser Asn 420 425 430 Leu Leu Ser Ser Phe Pro Ile Thr Gly Leu His Gly Leu Thr His Leu 435 440 445 Lys Leu Thr Gly Asn His Ala Leu Gln Ser Leu Ile Ser Ser Glu Asn 450 455 460 Phe Pro Glu Leu Lys Val Ile Glu Met Pro Tyr Ala Tyr Gln Cys Cys 465 470 475 480 Ala Phe Gly Val Cys Glu Asn Ala Tyr Lys Ile Ser Asn Gln Trp Asn 485 490 495 Lys Gly Asp Asn Ser Ser Met Asp Asp Leu His Lys Lys Asp Ala Gly 500 505 510 Met Phe Gln Ala Gln Asp Glu Arg Asp Leu Glu Asp Phe Leu Leu Asp 515 520 525 Phe Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu His Ser Val Gln Cys Ser Pro Ser 530 535 540 Pro Gly Pro Phe Lys Pro Cys Glu His Leu Leu Asp Gly Trp Leu Ile 545 550 555 560 Arg Ile Gly Val Trp Thr Ile Ala Val Leu Ala Leu Thr Cys Asn Ala 565 570 575 Leu Val Thr Ser Thr Val Phe Arg Ser Pro Leu Tyr Ile Ser Pro Ile 580 585 590 Lys Leu Leu Ile Gly Val Ile Ala Ala Val Asn Met Leu Thr Gly Val 595 600 605 Ser Ser Ala Val Leu Ala Gly Val Asp Ala Phe Thr Phe Gly Ser Phe 610 615 620 Ala Arg His Gly Ala Trp Trp Glu Asn Gly Val Gly Cys His Val Ile 625 630 635 640 Gly Phe Leu Ser Ile Phe Ala Ser Glu Ser Ser Val Phe Leu Leu Thr 645 650 655 Leu Ala Ala Leu Glu Arg Gly Phe Ser Val Lys Tyr Ser Ala Lys Phe 660 665 670 Glu Thr Lys Ala Pro Phe Ser Ser Leu Lys Val Ile Ile Leu Leu Cys 675 680 685 Ala Leu Leu Ala Leu Thr Met Ala Ala Val Pro Leu Leu Gly Gly Ser 690 695 700 Lys Tyr Gly Ala Ser Pro Leu Cys Leu Pro Leu Pro Phe Gly Glu Pro 705 710 715 720 Ser Thr Met Gly Tyr Met Val Ala Leu Ile Leu Leu Asn Ser Leu Cys 725 730 735 Phe Leu Met Met Thr Ile Ala Tyr Thr Lys Leu Tyr Cys Asn Leu Asp 740 745 750 Lys Gly Asp Leu Glu Asn Ile Trp Asp Cys Ser Met Val Lys His Ile 755 760 765 Ala Leu Leu Leu Phe Thr Asn Cys Ile Leu Asn Cys Pro Val Ala Phe 770 775 780 Leu Ser Phe Ser Ser Leu Ile Asn Leu Thr Phe Ile Ser Pro Glu Val 785 790 795 800 Ile Lys Phe Ile Leu Leu Val Val Val Pro Leu Pro Ala Cys Leu Asn 805 810 815 Pro Leu Leu Tyr Ile Leu Phe Asn Pro His Phe Lys Glu Asp Leu Val 820 825 830 Ser Leu Arg Lys Gln Thr Tyr Val Trp Thr Arg Ser Lys His Pro Ser 835 840 845 Leu Met Ser Ile Asn Ser Asp Asp Val Glu Lys Gln Ser Cys Asp Ser 850 855 860 Thr Gln Ala Leu Val Thr Phe Thr Ser Ser Ser Ile Thr Tyr Asp Leu 865 870 875 880 Pro Pro Ser Ser Val Pro Ser Pro Ala Tyr Pro Val Thr Glu Ser Cys 885 890 895 His Leu Ser Ser Val Ala Phe Val Pro Cys Leu 900 905

Claims (46)

  1. 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그-관련 질환을 치료하는 방법.
  2. 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그-관련 질환을 치료하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항-LGR5 항체 및 헷지호그 경로의 억제제의 각각의 양이 헷지호그 경로의 억제제 단독에 의한 치료와 비교하여 요법에 대한 반응 기간을 증가시키고/거나 재발 및/또는 저항성의 발생을 지연시키는데 효과적인 것인 방법.
  4. 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그 경로의 억제제를 포함하는 헷지호그-관련 질환의 치료의 효능을 증가시키는 방법.
  5. 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 항-LGR5 항체없이 (그의 부재 하에) 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 표준 치료와 비교하여 증가된 효능을 갖는, 개체에서 헷지호그-관련 질환을 치료하는 방법.
  6. 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 헷지호그-관련 질환의 재발 및/또는 저항성의 발생을 지연 및/또는 예방하는 방법.
  7. 헷지호그-관련 질환에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 감수성을 증가시키는 방법.
  8. 헷지호그-관련 질환에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 감수성 기간을 연장시키는 방법.
  9. 헷지호그-관련 질환에 걸린 개체에게 항-LGR5 항체의 유효량 및 헷지호그 경로의 억제제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 헷지호그 경로의 억제제에 대한 반응 지속기간을 연장시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LGR5 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LGR5 항체가 서열 67의 아미노산 22-323 내 또는 서열 67의 아미노산 22-123 내의 에피토프에 결합하고, LGR5에 ≤ 5 nM의 친화도로 결합하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LGR5 항체가 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LGR5 항체가 서열 67의 인간 LGR5에 결합하는 항체 단편인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LGR5 항체가
    a) 서열 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 32의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
    b) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LGR5 항체가
    a) 서열 60의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 61의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
    b) 서열 57의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 58의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LGR5 항체가
    a) 서열 6의 VH 서열 및 서열 5의 VL 서열;
    b) 서열 8의 VH 서열 및 서열 7의 VL 서열;
    c) 서열 10의 VH 서열 및 서열 9의 VL 서열;
    d) 서열 12의 VH 서열 및 서열 11의 VL 서열;
    e) 서열 14의 VH 서열 및 서열 13의 VL 서열;
    f) 서열 16의 VH 서열 및 서열 15의 VL 서열;
    g) 서열 18의 VH 서열 및 서열 17의 VL 서열;
    h) 서열 20의 VH 서열 및 서열 19의 VL 서열; 또는
    i) 서열 26의 VH 서열 및 서열 25의 VL 서열
    을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LGR5 항체가 세포독성제에 접합된 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항-LGR5 항체가 하기 화학식을 갖는 것인 방법.
    Ab-(L-D)p
    상기 식에서,
    (a) Ab는 항-LGR5 항체이고;
    (b) L은 링커이고;
    (c) D는 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 칼리케아미신, 피롤로벤조디아제핀 및 네모루비신 유도체로부터 선택된 약물이고;
    (d) p는 1-8의 범위이다.
  19. 제18항에 있어서, D가 아우리스타틴인 방법.
  20. 제18항에 있어서, D가 하기 화학식 DE를 갖는 것인 방법.
    <화학식 DE>
    Figure pct00057

    상기 식에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 H이고, R7은 sec-부틸이고, 각각의 R8은 독립적으로 CH3, O-CH3, OH, 및 H로부터 선택되고; R9는 H이고; R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴이다.
  21. 제18항에 있어서, 약물이 MMAE인 방법.
  22. 제18항에 있어서, D가 하기 화학식 A의 피롤로벤조디아제핀인 방법.
    <화학식 A>
    Figure pct00058

    상기 식에서, 점선은 C1과 C2 또는 C2와 C3 사이의 이중 결합의 임의적인 존재를 나타내고;
    R2는 독립적으로 H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R 및 COR로부터 선택되고, 임의로 할로 또는 디할로로부터 추가로 선택되고, 여기서 RD는 독립적으로 R, CO2R, COR, CHO, CO2H 및 할로로부터 선택되고;
    R6 및 R9는 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되고;
    R7은 독립적으로 H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn 및 할로로부터 선택되고;
    Q는 독립적으로 O, S 및 NH로부터 선택되고;
    R11은 H 또는 R이거나, 또는 Q가 O인 경우에 SO3M이고, 여기서 M은 금속 양이온이고;
    R 및 R'는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C1-8 알킬, C3-8 헤테로시클릴 및 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 임의로 기 NRR'와 관련하여, R 및 R'는 이들이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 임의로 치환된 4-, 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
    R12, R16, R19 및 R17은 각각 R2, R6, R9 및 R7에 대해 정의된 바와 같고;
    R"는 C3-12 알킬렌 기이고, 상기 쇄에는 1개 이상의 헤테로원자 및/또는 임의로 치환된 방향족 고리가 개재될 수 있고;
    X 및 X'는 독립적으로 O, S 및 N(H)로부터 선택된다.
  23. 제18항에 있어서, D가 하기 구조를 갖는 것인 방법.
    Figure pct00059

    상기 식에서, n은 0 또는 1이다.
  24. 제18항에 있어서, D가 하기로부터 선택된 구조를 갖는 것인 방법.
    Figure pct00060

    상기 식에서, RE 및 RE"는 각각 독립적으로 H 또는 RD로부터 선택되고, 여기서 RD는 독립적으로 R, CO2R, COR, CHO, CO2H 및 할로로부터 선택되고;
    Ar1 및 Ar2는 각각 독립적으로 임의로 치환된 C5-20 아릴이고;
    n은 0 또는 1이다.
  25. 제18항에 있어서, D가 하기 화학식 B의 피롤로벤조디아제핀인 방법.
    <화학식 B>
    Figure pct00061

    상기 식에서, 수평 파상선은 링커에의 공유 부착 부위를 나타내고;
    RV1 및 RV2는 독립적으로 H, 메틸, 에틸, 페닐, 플루오로-치환된 페닐, 및 C5-6 헤테로시클릴로부터 선택되고;
    n은 0 또는 1이다.
  26. 제18항에 있어서, D가 네모루비신 유도체인 방법.
  27. 제18항에 있어서, D가 하기로부터 선택된 구조를 갖는 것인 방법.
    Figure pct00062
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 프로테아제에 의해 절단가능한 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 링커가 val-cit 디펩티드 또는 Phe-Lys 디펩티드를 포함하는 것인 방법.
  30. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 산-불안정성인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 링커가 히드라존을 포함하는 것인 방법.
  32. 제18항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 것인 방법.
    Figure pct00063

    상기 식에서, S는 황 원자이다.
  33. 제18항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 것인 방법.
    Figure pct00064
  34. 제18항에 있어서, 하기로부터 선택된 화학식을 갖는 것인 방법.
    Figure pct00065

    Figure pct00066

    Figure pct00067
  35. 제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, p가 2-5 범위인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 헷지호그 경로의 억제제가 스무슨드 수용체의 길항제인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 스무슨드 수용체의 길항제가 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드 또는 그의 염인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 스무슨드 수용체의 길항제가 2-클로로-N-[4-클로로-3-(피리딘-2-일)페닐]-4-(메틸술포닐)벤즈아미드인 방법.
  39. 제36항에 있어서, 스무슨드 수용체의 길항제가 비스모데깁인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 헷지호그-관련 질환이 암인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 암이 기저 세포 암종인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 기저 세포 암종이 국부 진행성 또는 전이성 기저 세포 암종인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 암이 수모세포종인 방법.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 헷지호그-관련 질환이 LGR5-양성인 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 헷지호그 경로의 억제제를 항-LGR5 항체와 병용 투여하는 방법.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 헷지호그 경로의 억제제를 항-LGR5 항체와 개별적으로, 순차적으로, 또는 동시에 투여하는 방법.
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