WO2022240157A1 - 암 특이적인 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 암 특이적 폴리펩티드에 관한 것이다. 일 양상에 따른 폴리펩티드는 종양 조직이 발현하는 LGR5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 표지 물질(예를 들어, 형광 물질)과 결합됨으로써 LGR5 단백질을 발현하는 암의 진단이 가능하다. 나아가, 상기 폴리펩티드는 동위원소와 결합됨으로써 전이성 종양도 진단할 수 있으며, 일 양상에 따른 폴리펩티드가 광감각제와 결합되어 개체에 투여될 경우, 빛의 조사를 통해 상기 광감각제가 활성화되어 암 세포를 사멸시킴으로써 암의 예방, 개선 또는 치료가 가능하다.

Description

암 특이적인 폴리펩티드 및 이의 용도
암 특이적인 폴리펩티드 및 이의 암 진단, 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
인간의 몸을 구성하고 있는 가장 작은 단위인 세포는 정상적일 때 세포 내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하면서 세포 수 균형을 유지한다. 그러나 여러 가지 이유로 인해 이러한 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 과다하게 증식할 뿐만 아니라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 형성 및 정상 조직의 파괴를 초래하는 상태를 암(cancer)이라 정의한다. 암은 이렇듯 억제가 안 되는 세포의 증식으로, 정상적인 세포와 장기의 구조와 기능을 파괴하기에 그 진단과 치료의 중요성은 매우 크다.
한편, 암 발병환자 개개인의 유전적 차이로 인해 치료 반응성이 달라 환자별 치료 사례가 달라짐에 따라 치료 시 문제점이 있다. 이에 암 환자의 효과적인 치료를 위해 방사선 반응성에 따라 달라지는 암 미세환경 및 그에 따른 바이오마커를 표적할 수 있는 기능성 표적 치료제 개발이 요구되고 있으며, 이를 통하여 환자 개인별 맞춤형 진단 및 치료를 구현할 수 있다.
또한, 약물을 암 세포 및 조직에 선택적으로 전달하는 약물전달체계 또는 표적 치료는 많은 관심을 받아온 기술이다. 왜냐하면 동일 양의 항암제를 사용하더라도 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 있기 때문이다. 또한 유전자 치료에 적용할 경우 바이러스를 암 세포에 선택적으로 전달함으로써 치료 효율을 올리고 심각한 부작용을 줄일 수 있다. 이를 위해 지금까지는 주로 종양세포에 특이한 항원 및 이를 표적하는 항체를 개발하여 왔다. 그러나 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제가 존재한다. 반면 펩티드의 경우는 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내 침투가 용이한 것이 장점이다. 따라서, 암 표적 펩티드를 기존의 항암제와 연결하게 되면 종양에 선택적으로 약물을 전달하는 지능형 약물전달체로 활용될 수 있다(고분자 과학과 기술 제25권 4호 2014년 8월 283p-289p).
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계; 및
상기 개체 내 상기 폴리펩티드의 위치를 확인하는 단계를 포함하는 암의 진단 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 및
상기 개체에게 빛을 조사하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다.
상기 용어 “아미노산(amino acid)”이란, 단백질의 기본 구성 단위로서, 아미노기와 카복실기를 모두 포함하는 유기산을 의미한다.
상기 용어 “폴리펩티드(polypeptide)”란, 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하며, “펩티드(peptide)”와 호환성 있게 사용될 수 있다.
상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 이의 기능적 변이체를 포함할 수 있다. 기능적 변이체란, 일 양상에 따른 폴리펩티드의 생물학적 성질에는 영향을 미치지 않고 아미노산 위치에서 일부 아미노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다.
상기 용어 “상동성(Homology)”은 야생형 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성(반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성(예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 상기 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 상기 폴리펩티드의 개질, 특히 폴리펩티드의 안정성을 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함될 수 있다.
상기 용어 “안정성”은 생체 내 단백질 절단 효소의 공격으로부터 상기 폴리펩티드를 보호하는 인 비보(in vivo) 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미하는 것일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 폴리펩티드는 천연으로부터 유래될 수도 있고, 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 폴리펩티드 합성 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 유전자 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 단백질 합성과 같은 화학적 합성(예를 들어, 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법)을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 또한, 일례로서, 상기 폴리펩티드는 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물 또는 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있다.
상기 폴리펩티드는 암 세포가 발현하는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질에 특이적으로 결합하여 암 세포를 효과적으로 표적이 가능한 바, 암의 진단, 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 폴리펩티드는 파지 디스플레이 기법을 통해 선별될 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리펩티드는 파지 라이브러리 중 LGR5 단백질에 부착된 파지만을 선별하는 과정을 반복하고, 부착능이 높은 파지를 선별함으로써 선별되는 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 파지 디스플레이 기법을 통해 BSA보다 LGR5 단백질에서 450nm의 파장에서 흡광도가 높은 파지를 선별한 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드가 LGR5 단백질에 부착능이 높음을 확인하였다(실시예 1 참조).
일 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드에 형광물질인 FITC를 결합시키고 위암 세포주 및 정상 세포주에 처리한 뒤 면역화학염색을 진행한 결과, LGR5가 존재하지 않는 정상 세포주에 비해 LGR5가 존재하는 위암 세포주에서 형광 세기가 높게 측정되어 상기 폴리펩티드가 LGR5 단백질에 부착능이 높음을 확인하였다(실시예 2 참조).
다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 “아미노산”, “폴리펩티드”등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 진단용 조성물에는 상기 폴리펩티드 이외에도 펩티드의 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완충액(예를 들어, 인산염, 시트르산염 또는 아세테이트 등)이 포함될 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 진단용 조성물은 형광물질을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 형광물질은 상기 폴리펩티드와 결합된 것일 수 있고, 상기 결합에는 수소 결합, 공유 결합, 이온 결합, 정전기적 인력 등 다양한 결합이 포함될 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 형광물질은 잔틴(Xanthene) 유도체, 사이아닌 유도체(cyanine derivatives), 옥사디아졸(oxadiazole) 유도체, 아크리딘 유도체(acridine derivative), 아릴메틴 유도체(arylmethine derivative), 테트라피롤 유도체(tetrapyrrole derivative), 근적외광 형광체(NIR fluorophore), Ce6(Chlorin e6) 및 GFP(Green Fluorescent Protein)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
구체적으로, 상기 잔틴 유도체는 플루오레세인(fluorescein), 오레곤 그린(Oregon green) 및 텍사스 레드(Texas red)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
상기 사이아닌 유도체는 Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine) 및 메로사이아닌(merocyanine)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
상기 옥사디아졸 유도체는 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole) 및 벤족사디아졸(benzoxadiazole)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
상기 아크리딘 유도체는 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange) 및 아크리딘 옐로우(acridine yellow)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
상기 아릴메틴 유도체는 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet) 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
상기 테트라피롤 유도체는 포르핀(porphin), 프탈로사이아닌(phthalocyanine) 및 빌리루빈(bilirubin)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
상기 근적외광 형광체는 X-SIGHT, Pz 247, DyLight 750, DyLight 800, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 750, IRDye 680, IRDye 800CW, 인도시아닌 그린(indocyanine green) 및 양성이온근적외광 형광체(zwitterionic near-infrared fluorophores)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 형광물질은 FITC, Cy5.5, Ce6 및 GFP로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 용어 “암(cancer)”이란, 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침입하여 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미하며, 종양(tumor), 신생물(neoplasma), 양성종양(benign tumor), 악성종양(malignant tumor), 암종(carcinoma), 육종(sarcoma) 등을 모두 포함한다. 또한 “암”은 “종양”과 호환성 있게 사용된다.
일 양상에 있어서, 상기 암은 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질을 발현하는 것일 수 있다. 상기 “LGR5 단백질”은 GPCR class A 수용체 단백질의 일종으로, LGR5 유전자에 의해 코딩되며, 일반적으로 성체 줄기 세포의 바이오마커로 이해된다.
일 양상에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 암의 LGR5 단백질과 결합하는 것일 수 있고, 상기 결합에는 수소 결합, 공유 결합, 이온 결합, 정전기적 인력 등 다양한 결합이 포함될 수 있다.
일 양상에 따르면, 상기 암은 위암, 대장암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 두경부암, 카르시노이드, 전립선암, 폐암, 방광암, 자궁내막암, 흑색종, 신장암, 고환암, 신경교종, 갑상선암, 피부암 및 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암일 수 있고, 구체적으로 위암, 대장암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 두경부암, 카르시노이드, 전립선암, 폐암, 방광암, 자궁내막암, 흑색종, 신장암 및 고환암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암일 수 있고, 보다 구체적으로 위암, 대장암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 두경부암, 카르시노이드 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암일 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 암은 전이성 종양일 수 있고, 구체적으로는 상기 전이성 종양은 복강 내 전이성 종양일 수 있다. 상기 용어 “전이성 종양”은 원발 종양 세포가 혈류나 림프류를 타고 흘러서 주위 조직 내에 점차 침윤, 이행 및 정착하여 형성되는 새로운 종양을 의미한다.
상기 용어 “진단”은 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 개체의 예후를 판정하는 것을 의미한다.
상기 폴리펩티드는 암 세포가 발현하는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질에 특이적으로 결합할 수 있어 암 세포를 효과적으로 표적할 수 있다. 상기 진단용 조성물에 상기 형광물질이 포함된 경우 표적한 암 세포 조직에서 형광을 발현할 수 있으며, 상기 발현된 형광의 세기를 확인함으로써 LGR5 단백질을 발현하는 모든 암의 진단이 가능하며, 이에는 국소적 종양 및 전이성 종양이 포함된다.
일 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드에 FITC를 결합하여 위암 세포주 및 정상 세포주에 농도별로 처리한 결과, LGR5가 존재하지 않는 정상 세포주에 비해 LGR5가 존재하는 위암 세포주에서 형광 세기가 높게 측정되어 상기 폴리펩티드가 농도 의존적으로 LGR5 단백질에 부착될 수 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
다른 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드에 형광물질인 Cy5.5를 결합하여 위암 세포주 이종이식 마우스에 투여한 결과, 종양 조직에서 다른 조직에 비해 형광 세기가 유의적으로 높게 측정되어 상기 폴리펩티드가 생체 내 종양 조직을 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
또 다른 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드에 형광물질인 Ce6를 결합하여 위암 세포주 이종이식 마우스에 투여한 결과, 종양 조직에서 다른 조직에 비해 형광 세기가 유의적으로 높게 측정되어 상기 폴리펩티드가 생체 내 종양 조직을 진단할 수 있음을 확인하였으며, 개체의 장기를 적출하여 ex vivo에서도 형광 세기를 분석한 결과, 종양 조직에서 다른 조직 대비 형광 세기가 유의적으로 높게 측정됨을 확인하였다(실시예 6 참조).
또 다른 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드에 형광물질인 FITC를 결합하여 음성대조군 펩티드-FITC 결합체와 함께 종양 조직에 처리한 결과, 음성대조군 처리군에서는 어떠한 형광을 확인할 수 없었으나, 상기 폴리펩티드의 처리군의 경우 종양 조직에서 유의적으로 높은 형광 세기가 확인된 바 상기 폴리펩티드가 종양 조직을 표적할 수 있음을 확인하였다 (실시예 8 참조).
일 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드에 Ce6(Chlorin e6)를 결합하여 위암 세포주를 이용한 복강 내 전이 마우스 모델에 투여한 결과, Ce6 단독 처리군에 비하여 종양 내 Ce6 농도가 높게 측정되어 상기 폴리펩티드가 전이성 종양 또한 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 9 참조).
또한, 일 양상에 있어서, 상기 진단용 조성물은 동위원소가 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 동위원소는 11C, 13N, 18F, 68Ga, 61Cu, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P 및 35S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 보다 구체적으로 111In 일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드에 동위원소 111In을 결합하여 상기 복강 내 전이 마우스 모델에 투여한 결과, 정상 동물에 비하여 복강 내에서 더 높은 형광 세기가 측정되어 상기 폴리펩티드가 전이성 종양 또한 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 10 참조).
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계; 및
상기 개체 내 상기 폴리펩티드의 위치를 확인하는 단계를 포함하는 암의 진단 방법을 제공한다.
상기 “아미노산”, “폴리펩티드”, “암”, “진단” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 용어 “개체”란 암의 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 구체적으로, 인간 또는 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말, 돼지, 토끼 및 소 등의 포유류를 의미한다.
상기 용어 “투여”는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 약학적 조성물을 개체에게 물리적으로 도입하는 것을 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 위치를 확인하는 단계는 상기 폴리펩티드가 암 세포가 발현하는 LGR5 단백질에 특이적으로 결합하는 성질을 이용하여 상기 폴리펩티드가 발현하는 신호 또는 상기 폴리펩티드에 표지 물질을 결합한 뒤 표지 물질이 발현하는 신호를 측정함으로써 수행될 수 있다. 상기 표지 물질에는 형광물질 및 동위원소가 포함될 수 있으며, 특정 조직에서 상기 폴리펩티드 또는 상기 표지 물질이 발현하는 신호가 타 조직 대비 유의적으로 높게 나타날 경우 해당 조직을 종양 조직으로 진단할 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 “아미노산”, “폴리펩티드”, “암” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 용어 “예방”이란 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 상기 용어 “치료”란 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 두경부암, 카르시노이드, 전립선암, 폐암, 방광암, 자궁내막암, 흑색종, 신장암, 고환암, 신경교종, 갑상선암, 피부암 및 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암일 수 있고, 구체적으로 위암, 대장암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 두경부암, 카르시노이드, 전립선암, 폐암, 방광암, 자궁내막암, 흑색종, 신장암 및 고환암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암일 수 있고, 보다 구체적으로 위암, 대장암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 두경부암, 카르시노이드 및 전립선암으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 광감각제를 더 포함할 수 있다. 상기 용어 “광감각제”는 특정 파장을 가지는 빛의 에너지를 흡수하여 상기 에너지를 다른 분자로 이송함으로써, 세포 또는 미생물을 사멸할 수 있는 활성 산소 및 기타 물질을 생성하는 화학 물질을 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 광감각제는 상기 폴리펩티드와 결합된 것일 수 있고, 상기 결합에는 수소 결합, 공유 결합, 이온 결합, 정전기적 인력 등 다양한 결합이 포함될 수 있다.
또한 일 양상에 있어서, 상기 광감각제는 헤마토포피린(hematoporphyrin), 5-아미노레불린 산(5-aminolevulinic acid), 클로린(chlorin), 퍼퓨린(purpurin), 벤조포피린(benzoporphyrin), 프탈로사이아닌(phthalocyanine), 텍사피린(texaphyrin) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 클로린(chlorin) 또는 이의 유도체일 수 있고, 보다 구체적으로 Ce6(chlorin e6)일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 광감각제는 빛에 의해 활성화되어 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 상기 용어 “빛”은 X선, 자외선, 가시광선 및 자외선을 모두 포함하는 전자기파를 의미하며, 레이저 장치를 통해 조사될 수 있다. 상기 용어 “활성화”는 광감각제가 특정 파장의 빛 에너지를 흡수하여 세포 또는 미생물을 사멸시킬 수 있는 상태가 된 것을 의미한다.
상기 폴리펩티드는 암 세포가 발현하는 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질에 특이적으로 결합할 수 있어 암 세포를 효과적으로 표적할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 상기 광감각제가 포함된 경우, 빛이 조사됨에 따라 상기 광감각제가 활성화되고, 표적한 암 세포 조직을 효과적으로 사멸시킴으로써 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드에 광감각제인 Ce6를 결합하여 위암 세포주에 처리한 뒤 레이저를 조사한 결과, Ce6 단독 처리군과 달리 세포가 사멸되었고 ROS(Reactive oxygen species)가 검출되어 상기 폴리펩티드가 암 세포를 사멸시킬 수 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).
다른 실시예에 따르면, 상기 폴리펩티드에 Ce6를 결합하여 위암 세포주 이종이식 마우스에 투여한 뒤 레이저를 조사한 결과, 대조군에 비하여 종양의 크기가 유의적으로 감소된 바 상기 폴리펩티드를 통해 생체 내에서 국소적 종양 치료가 가능함을 확인하였다(실시예 7 참조).
상기 “약학적 조성물”은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 동맥내 주사, 골수내 주사, 심장내 주사, 경막내 주사, 경피주사, 비강내 주사, 장관내 주사, 국소주사, 설하 주사, 또는 흉부내 주사 주입방식과 같은 비경구 투여가 가능하며, 그 밖에도 경구 투여, 직장 투여, 흡입 투여, 경비 투여 등이 가능할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다. 예를 들어, 격일로 투여되는 것일 수도 있으며, 일주일에 하루 투여되는 것일 수도 있다.
일 양상에 있어서, 상기 광감각제와 결합된 폴리펩티드는 0.1 내지 10 mg/kg로, 구체적으로, 0.1 내지 10 mg/kg, 0.1 내지 9 mg/kg, 0.1 내지 7 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 1 내지 9 mg/kg, 1 내지 7 mg/kg, 3 내지 10 mg/kg, 3 내지 9 mg/kg 또는 3 내지 7 mg/kg로 투여될 수 있다.
상기 광감각제와 결합된 폴리펩티드가 0.1 mg/kg 미만으로 투여될 경우, 광감각제의 유효량이 부족하여 암 세포 사멸 효과가 감소할 수 있으며, 10 mg/kg을 초과하여 투여될 경우, 광감각제의 과도한 광독성으로 인해 세포 독성이 발생하거나 광감각제가 체내에 과도하게 축적될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 암의 예방 또는 개선용 약학적 조성물 또는 새롭게 개발되는 암의 예방 또는 개선용 약학적 조성물과 혼합되어 제공될 수 있다. 상기 약학적 조성물이 암의 예방 또는 개선용 약학적 조성물을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 단독 투여 또는 다른 항암제와 병용 투여되는 것일 수 있다. 즉, 상기 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 항암제와 병행하여 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 및
상기 개체에게 빛을 조사하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
상기 “아미노산”, “폴리펩티드”, “개체”, “투여”, “빛”, “암”, “예방”, “치료” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
상기 빛을 조사하는 단계는 레이저 장치를 통해 수행될 수 있으며, 개체의 특정 부위에 직접 조사하거나 개체의 전신에 조사할 수 있고, 상기 폴리펩티드가 결합된 암 세포에 상기 빛 에너지가 전달되는 것으로 족하다.
일 양상에 있어서, 상기 폴리펩티드에 상기 광감각제가 결합된 경우, 빛이 조사됨에 따라 상기 광감각제가 활성화되고, 표적한 암 세포 조직을 효과적으로 사멸시킴으로써 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또 다른 양상은 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
상기 “암”, “예방”, “치료”, “아미노산”, “폴리펩티드” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 폴리펩티드에 상기 광감각제가 결합된 경우, 빛이 조사됨에 따라 상기 광감각제가 활성화되고, 표적한 암 세포 조직을 효과적으로 사멸시킴으로써 암의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 “아미노산”, “폴리펩티드”, “암”, “예방” 등은 전술한 범위 내일 수 있다.
용어 “개선”이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 이때, 상기 건강기능식품은 암의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질병의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품에서, 유효성분은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 상기 건강기능식품은 원료에 대하여 구체적으로 약 15 중량% 이하, 보다 구체적으로 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 일 양상에 따른 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에도, 일 양상에 따른 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
상기 건강기능식품은 종래에 알려져 있는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 새롭게 개발되는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 혼합되어 제공될 수 있다. 상기 건강기능식품이 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 단독 섭취 또는 상기 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되는 것일 수 있다. 상기 건강기능식품은 암의 예방 또는 개선 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병행하여 섭취될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 섭취될 수 있으며, 단일 또는 다중 섭취될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 섭취하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 양상에 따른 폴리펩티드는 종양 조직이 발현하는 LGR5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 표지 물질(예를 들어, 형광 물질)과 결합됨으로써 LGR5 단백질을 발현하는 암의 진단이 가능하다. 나아가, 상기 폴리펩티드는 동위원소와 결합됨으로써 전이성 종양도 진단할 수 있으며, 일 양상에 따른 폴리펩티드가 광감각제와 결합되어 개체에 투여될 경우, 빛의 조사를 통해 상기 광감각제가 활성화되어 암 세포를 사멸시킴으로써 암의 예방, 개선 또는 치료가 가능하다.
도 1은 파지디스플레이 기법을 이용하여 선별한 위암 세포 마커인 LGR5에 부착능이 높은 표적 파지 및 펩티드를 나타낸다.
도 2는 LGR5에 부착능이 높은 표적 파지 및 펩티드에 FITC를 결합하여 면역화학염색을 진행한 결과를 나타낸다.
도 3은 위암 세포주가 아닌 HEK293T 신장 세포에서의 FITC-펩티드 면역화학염색 결과를 나타낸다.
도 4는 FITC-펩티드의 위암 세포주와 정상 세포주에서의 형광 밀도 포화도 측정 결과를 나타낸다.
도 5a 내지 5b는 유세포 분석기를 통한 FITC-펩티드의 위암 세포주와 정상 세포주에서의 형광 밀도 값 측정 결과를 나타낸다.
도 6a 내지 6b는 위암 세포주를 이식한 마우스 장기 내에서 대조군 펩티드 투여군과 개발된 펩티드 투여군이 가지는 형광 밀도 값 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 Ce6-펩티드의 위암 세포주와 정상 세포주에서의 형광 밀도 값 측정 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 8b는 위암 세포주에 Ce6와 Ce6-펩티드를 농도별로 처리한 후 레이저 조사 여부에 따른 세포 독성 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 위암 세포주에 Ce6-펩티드를 처리하고 레이저를 조사한 후 DCF-DA염색을 실시하여 확인한 ROS 검출 결과를 나타낸다.
도 10a 내지 10b는 위암 세포주를 이식한 마우스 종양 내에서 Ce6 단독 투여군과 Ce6-펩티드 투여군이 가지는 형광 값 측정 결과를 나타낸다.
도 11a 내지 11b는 위암 세포주를 이식한 마우스에 Ce6 및 Ce6-펩티드를 투여한 후 장기를 적출하여 측정한 Ce6 단독 투여군과 Ce6-펩티드 투여군의 형광 값 측정 결과를 나타낸다.
도 12a 내지 12b는 위암 세포주를 이식한 마우스를 처리 없음, 레이저 조사, Ce6 투여 후 레이저 조사, Ce6-펩티드 투여 후 레이저 조사의 4가지 그룹으로 나누어 측정한 각 처리에 따른 종양 크기 결과를 나타낸다.
도 13은 합성된 종양에 대조군 펩티드-FITC와 표적 펩티드-FITC를 처리한 후 측정한 형광 값 결과를 나타낸다.
도 14a 내지 14b는 마우스에 GFP로 표지된 위암 세포주를 주입하여 확인한 복강 내 전이 모델을 나타낸다.
도 15a 내지 15b는 복강 내 전이 모델링이 완성된 마우스에 Ce6와 Ce6-펩티드를 각각 처리한 후 종양 표적능을 측정한 결과를 나타낸다.
도 16은 동위원소 111In-펩티드를 위암 세포주 복강 내 전이 모델에 주입한 후 측정한 형광 값 결과를 나타낸다.
도 17은 위암 세포주 복강 내 전이 모델에 동위원소 111In-펩티드를 주입하고 24시간 후 확인한 조직 내 111In-펩티드 분포 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 위암 세포주 표적 파지의 선별
위암 세포주를 표적하는 파지를 선별하기 위해 파지 디스플레이 기법을 이용하여 선별을 진행하였다. 위암 세포 마커인 LGR5 단백질이 코팅된 둥근 바닥 튜브에 파지 라이브러리(Ph.D.TM-7 파지 라이브러리, Cat No. E8100S, New England Biolabs)를 넣은 후 부착된 파지만 분리하고 이를 3회 반복하여 부착능이 높은 파지만 선별하였다. 이 중 무작위로 48개의 파지를 뽑아 LGR5와 BSA가 코팅된 96-웰 플레이트에 각각 처리하였다. 이를 anti-M13-HRP와, TMB, stop solution(H2S04)으로 반응시킨 후 450nm의 파장 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, BSA보다 LGR5에서 흡광도 O.D(Optical Density)값이 더 높은 파지만을 선별하였고, 이에 따라 선별된 11, 17, 23, 24 및 35번 파지 중 가장 O.D값이 높은 24번 파지와 결합한 펩티드의 시퀀싱 결과 친수성이 매우 높은 7 mer의 펩티드 서열 “STCTRSR”(서열번호 1)임을 확인하였다.
2. 파지 및 펩티드의 위암 세포주 부착능 확인
상기 24번 파지와 상기 펩티드의 위암 세포주 부착능을 확인하기 위해 각각 FITC를 결합하여 면역화학염색을 진행하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 위암 세포주인 AGS, MKN45, MKN28이 정상 세포주인 결장 상피 세포주 CCD841에 비하여 파지 및 펩티드에 대한 부착능이 더 높은 것을 확인할 수 있었고, 특히 MKN45 세포주에서 부착능이 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다. 그러나, LGR5 수용체가 없는 HEK293T 신장(kidney) 세포에서는 도 3에 나타난 바와 같이, 부착능을 확인할 수 없었다.
3. FITC-펩티드의 형광 밀도 포화도 확인
FITC-펩티드의 형광 최대 흡수 용량을 확인하기 위하여 8 웰 챔버에 CCD841과 MKN45 세포를 부착시킨 후 펩티드를 농도 1, 10, 25, 50, 100, 200, 400 및 800 μM 로 처리하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 25 μM 농도에서 CCD841과 MKN45 세포의 펩티드 부착능에 의한 형광 밀도 값의 차이가 가장 컸으며 100 μM부터 모든 세포에서 형광 밀도가 포화됨을 확인할 수 있었다.
또한, CCD841과 MKN45 세포에 FITC-펩티드를 25, 50, 100 μM로 각각 1시간 동안 처리한 후 유세포 분석기를 통해 FITC 형광 밀도를 측정하였다. 그 결과, 도 5a 내지 5b에 나타난 바와 같이, 정상 세포인 CCD841보다 위암 세포인 MKN45에서 농도 의존적으로 형광 밀도 값이 증가함을 확인할 수 있었다.
4. 펩티드의 생체 내 표적능 확인
상기 실시예 1 내지 3을 통해 세포 수준에서 위암으로의 펩티드 표적능을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 생체 내 표적능 확인을 위해 5 주령의 면역부전마우스에 MKN45로 이종이식 모델을 만든 후 Cy5.5가 붙은 펩티드 50 nM을 꼬리 정맥을 통해 주입하였다.
그 결과, 도 6a 내지 6b에 나타난 바와 같이, 심장, 폐, 간, 비장, 신장 등 다른 장기에서는 형광이 잘 감지되지 않았으나, 종양 조직에서는 유의적으로 형광 밀도가 높게 감지되었다. 또한, 대조군 펩티드 그룹과 비교하였을 때, 개발된 표적 펩티드 그룹이 더 높은 종양 표적능을 보여주었다.
5. 펩티드의 광역학 치료 효능 확인
(1) Chlorin E6의 세포 흡수도 확인
펩티드의 종양 표적 및 치료 효능을 확인하기 위하여 광감각제인 chlorin e6(Ce6)를 이용한 광역학 치료를 진행하였다. 우선, Ce6가 부착된 펩티드의 세포 흡수 정도를 확인하기 위해 위암 세포주인 AGS, MKN45, MKN28과 정상 세포인 CCD841 세포에 Ce6-펩티드를 각각 10 μM 농도로 처리하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 정상 세포주보다 위암 세포주에서 형광 밀도가 더 높게 측정되었으며, 이는 최대 11배 이상의 흡수도 차이를 보여주었다.
(2) 광역학 치료를 통한 세포 독성 분석
광역학 치료를 통한 세포 독성을 분석하기 위해 MKN45 세포에 Ce6와 Ce6-펩티드를 농도 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100 nM 및 1 μM로 처리한 후 10 J, 500 mW, 3 cm 기준의 레이저를 2분 35초간 조사하였다.
그 결과, 도 8a 내지 8b에 나타난 바와 같이, 레이저를 조사하지 않은 암 독성(dark toxicity) 실험에서는 Ce6 그룹 및 Ce6-펩티드 그룹 모두에서 큰 독성이 유발되지 않았으나, 1 μM 농도로 처리하였을 때 Ce6-펩티드 그룹의 경우 전체 세포의 60%가 사멸되었다.
레이저를 조사한 광역학 치료(photodynamic therapy) 실험에서는 50 nM 농도부터 Ce6-펩티드 그룹의 경우 급격히 세포가 사멸되었으나, Ce6 단독 처리군에서는 세포가 사멸되지 않았다. 이를 통하여 펩티드의 암 세포 특이적인 부착능에 의한 세포 사멸임을 확인하였다.
(3) ROS에 의한 세포사멸 여부 확인
세포가 광역학 치료로 사멸되었는지 확인하기 위하여, 해당 치료의 기전인 Reactive oxygen species(ROS)에 의한 세포사멸 여부를 확인하고자 DCF-DA 염색을 실시하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 양성대조군 그룹인 과산화수소를 처리한 MKN45 세포에서 ROS가 검출되었고 아무 처치를 하지 않은 경우 ROS가 검출되지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, Ce6-펩티드를 처리하고 레이저를 조사한 그룹에서 Ce6-펩티드 농도 의존적으로 ROS가 검출됨을 확인하였다. 이는 광감각제-펩티드 합성체에 레이저 조사를 통한 광역학 작용으로 암 세포가 효과적으로 사멸되었다는 것을 의미한다.
6. Ce6-펩티드의 종양 표적능 확인
Ce6-펩티드의 종양 표적능을 확인하기 위하여 MKN45 이종이식(xenograft) 마우스 모델에서 in vivo 표적능 실험을 진행하였다. 약 8 mm 지름의 종양이 생성된 마우스 꼬리정맥으로 5 mg/kg 농도로 Ce6 및 Ce6-펩티드를 주입한 뒤 4시간 후 종양 내 Ce6 농도를 in vivo imaging system(IVIS)을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 10a 내지 10b에 나타난 바와 같이, Ce6 단독 처리군 보다 Ce6-펩티드 처리군에서 1.5배에서 2배 가까이 더 높은 형광 세기를 확인할 수 있었다.
또한, 주입 4시간 후 각 개체 별로 장기를 적출하여 ex vivo로 종양 표적능을 IVIS를 통해 분석하였다.
그 결과, 도 11a 내지 11b에 나타난 바와 같이, 심장, 폐, 간, 비장, 신장 등 다른 장기에 비하여 종양으로의 Ce6 침투가 높았으며, 특히 Ce6 단독 처리군에 비하여 Ce6-펩티드 처리군에서 종양의 표적능이 유의적으로 높게 확인되었다.
상기 결과를 통하여 펩티드의 종양 표적능으로 인해 Ce6-펩티드 합성체의 종양 침투능이 더욱 향상되었음을 알 수 있고, 이는 특이적 시퀀스를 이용한 종양 진단뿐만 아니라 치료 가능성을 제시한다.
7. 펩티드와 레이저 조사를 통한 국소적 종양 치료 효능 확인
펩티드를 이용한 국소적 종양 치료 효능을 확인하기 위하여 상기 실시예 6에서의 마우스를 처리 없음, 레이저 조사, Ce6 투여 후 레이저 조사, Ce6-펩티드 투여 후 레이저 조사의 총 4그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. 꼬리정맥으로 5 mg/kg의 농도로 Ce6 및 Ce6-펩티드를 투여한 후 4시간이 경과한 뒤 종양 부위에 레이저를 200 J, 300 mW 조건으로 9분간 조사하였고, 약 3일 간격으로 종양 크기, 체중 및 종양의 괴사 등을 관찰하였다. 치료 기간 중 관찰된 체중의 변화는 없었다.
그 결과, 도 12a 내지 12b에 나타난 바와 같이, 치료 2일 후 Ce6-펩티드 치료 그룹에서 종양 괴사가 관찰되었으며, 치료 7일 차에 Ce6-펩티드 치료 그룹에서 종양의 크기가 다른 그룹에 비하여 유의적으로 감소되었음을 확인하였다. 이를 통해 펩티드를 이용한 종양 표적과 광감각제 및 레이저 조사를 통한 광역학 반응으로 국소적 종양 치료가 가능함을 확인할 수 있었다.
8. 표적 펩티드와 음성대조군 펩티드의 종양 표적능 비교
표적 펩티드의 종양 표적능을 확인하기 위해 종양에 부착능이 없는 음성대조군 펩티드를 FITC와 결합하여, 표적 펩티드와 함께 종양 조직에 처리하였다. 상기 음성대조군 펩티드는 비특이적 결합 펩티드 서열 “QLMRPPV”(서열번호 2)의 아미노산 위치를 무작위로 섞어 만든 펩티드이다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 음성대조군 펩티드 처리 시에는 FITC 부착에 의한 어떠한 형광도 확인할 수 없었으나, 표적 펩티드 처리 시에는 유의적으로 높은 형광 세기를 확인할 수 있었다.
9. 복강 내 전이 모델에서의 펩티드 표적능 검증
상기 실시예 6을 통해 위암 세포주 MKN45를 이용한 이종이식 모델에서 펩티드의 in vivo에서의 표적능을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 추가적으로 복강 내 전이 모델에서의 표적능 검증을 위하여 동일한 MKN45 세포주를 복강 내 주입하여 펩티드의 표적능을 추가 검증하였다.
5주령 Balb/c nude 마우스에 1 x 107 의 GFP tagged MKN45 세포주를 주입하여 2주 이내 복강 내 전이를 확인하였으며, 그 결과, 도 14a 내지 14b에 나타난 바와 같이, 간, 신장, 비장 조직에서 세포의 추가적인 침윤 및 2 cm 가량의 큰 종양을 관찰할 수 있었다.
펩티드의 표적능을 확인하기 위해 상기 복강 내 전이 모델링이 완성된 마우스에 5 mg/kg의 농도로 Ce6 및 Ce6-펩티드를 처리하였으며 처리 4시간 후 부검하여 조직 내 물질 농도를 IVIS를 통해 확인하였다.
그 결과, 도 15a 내지 15b에 나타난 바와 같이, Ce6 그룹에 비하여 Ce6-펩티드를 처리한 그룹에서의 종양 표적능이 높은 것을 확인하였다. Ce6-펩티드의 경우 신장 내 농도가 높은 것으로 보아 단일 Ce6에 비하여 다른 장기로의 비특이적 결합 가능성이 낮으며 체내 빠른 순환으로 인해 대부분 체외로 배출될 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 해당 펩티드가 이종이식 모델 뿐만 아니라 복강 전이성 모델에서도 표적능을 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 국소적 종양 뿐만 아니라 전이성 종양 또한 진단이 가능함을 시사한다.
10. 복강 내 전이성 종양에 대한 동위원소 표적
위암은 복강 전이가 용이한 종양으로 알려져 있으나, 위암 복강 전이의 민감한 진단은 여전히 해결되지 않고 있다. 이러한 임상적 딜레마를 해결하고자 동위원소와 위암 특이적 펩티드의 합성체를 통한 위암 표적 연구를 추가적으로 수행하였다.
펩티드의 친수성 성질로 인해 동위원소 111In-펩티드 합성체를 위암 동물모델에 주입 시 대부분 신장 및 방광을 통해 배출되는 것을 확인하였으며, 도 16에 나타난 바와 같이, 정상 동물에 비하여 MKN45 복강 전이 모델에서 복강 내 더 높은 형광이 관찰되었는데 이는 복강 내 전이성 종양에 대한 동위원소 표적이 가능함을 시사한다.
주사 24시간 후 확인한 조직 내 동위원소-펩티드 분포는 도 17에 나타난 바와 같이, 간과 신장에서 높고 종양에서는 크게 높게 관찰되지 않았으나 이는 펩티드 친수성 성질로 빠른 시간 내에 배출된 것으로 판단된다.

Claims (23)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드.
  2. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 암 진단용 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 형광물질을 더 포함하는, 암 진단용 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 형광물질은 상기 폴리펩티드와 결합된 것인, 암 진단용 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 형광물질은 잔틴(Xanthene) 유도체, 사이아닌 유도체(cyanine derivatives), 옥사디아졸(oxadiazole) 유도체, 아크리딘 유도체(acridine derivative), 아릴메틴 유도체(arylmethine derivative), 테트라피롤 유도체(tetrapyrrole derivative), 근적외광 형광체(NIR fluorophore), Ce6(Chlorin e6) 및 GFP(Green Fluorescent Protein)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 암 진단용 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 잔틴 유도체는 플루오레세인(fluorescein), 오레곤 그린(Oregon green) 및 텍사스 레드(Texas red)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
    상기 사이아닌 유도체는 Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine) 및 메로사이아닌(merocyanine)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
    상기 옥사디아졸 유도체는 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole) 및 벤족사디아졸(benzoxadiazole)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
    상기 아크리딘 유도체는 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 및 아크리딘 옐로우(acridine yellow)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
    상기 아릴메틴 유도체는 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
    상기 테트라피롤 유도체는 포르핀(porphin), 프탈로사이아닌(phthalocyanine) 및 빌리루빈(bilirubin)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고;
    상기 근적외광 형광체는 X-SIGHT, Pz 247, DyLight 750, DyLight 800, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 750, IRDye 680, IRDye 800CW, 인도시아닌 그린(indocyanine green) 및 양성이온근적외광 형광체(zwitterionic near-infrared fluorophores)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 암 진단용 조성물.
  7. 청구항 2에 있어서, 상기 암은 LGR5(Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5) 단백질을 발현하는 것인, 암 진단용 조성물.
  8. 청구항 2에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 암의 LGR5 단백질과 결합하는 것인, 암 진단용 조성물.
  9. 청구항 2에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 두경부암, 카르시노이드, 전립선암, 폐암, 방광암, 자궁내막암, 흑색종, 신장암, 고환암, 신경교종, 갑상선암, 피부암 및 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암인, 암 진단용 조성물.
  10. 청구항 2에 있어서, 상기 암은 전이성 종양인 것인, 암 진단용 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 폴리펩티드는 동위원소가 결합된 것인, 암 진단용 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 동위원소는 11C, 13N, 18F, 68Ga, 61Cu, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P 및 35S로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 암 진단용 조성물.
  13. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계; 및
    상기 개체 내 상기 폴리펩티드의 위치를 확인하는 단계를 포함하는 암의 진단 방법.
  14. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 유방암, 난소암, 두경부암, 카르시노이드, 전립선암, 폐암, 방광암, 자궁내막암, 흑색종, 신장암, 고환암, 신경교종, 갑상선암, 피부암 및 림프종으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 암인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 청구항 14에 있어서, 광감각제를 더 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 광감각제는 상기 폴리펩티드와 결합된 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 광감각제와 결합된 폴리펩티드는 0.1 내지 10 mg/kg의 농도로 투여되는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 광감각제는 헤마토포피린(hematoporphyrin), 5-아미노레불린 산(5-aminolevulinic acid), 클로린(chlorin), 퍼퓨린(purpurin), 벤조포피린(benzoporphyrin), 프탈로사이아닌(phthalocyanine), 텍사피린(texaphyrin) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 청구항 16에 있어서, 상기 광감각제는 빛에 의해 활성화되어 암 세포를 사멸시키는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계; 및
    상기 개체에게 빛을 조사하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법.
  22. 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드의 용도.
  23. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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