CN109641054B - 包含可分解的连接子的光敏剂-肽结合体以及包含该结合体的光动力学诊断或治疗用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肽通过在细胞内可分解的连接而与光敏剂结合的光动力学诊断或者治疗用结合体以及包含该结合体的光动力学诊断或者治疗用组合物。由于本发明的结合体中的光敏剂的荧光信号和反应性氧的生成能力被消光(quenching)，在正常组织或者血液循环期间不会产生荧光信号以及反应性氧，但在被选择性地摄入至标的细胞内后，在细胞内，连接子被分解从而导致包含在肽内的色氨酸和光敏剂之间的距离变大，消光作用消失，因此会产生强荧光信号，且活跃地生成反应性氧。据此，根据本发明的结合体具有组织渗透性高，在正常细胞中非常安全，相反，在标的细胞中具有较高的光动力学治疗效果，从而可以获得对比背景具有更高的标记信号率的诊断影像。

Description

包含可分解的连接子的光敏剂-肽结合体以及包含该结合体 的光动力学诊断或治疗用组合物
技术领域
本发明涉及一种肽通过在细胞内可分解的连接而结合有光敏剂的光动力学诊断或者治疗用结合体以及包含该结合体的光动力学诊断或者治疗用组合物。
背景技术
光动力学治疗法(photodynamic therapy:PDT)是利用光敏物质(photosensitizer，以下称为光敏剂)不经过手术的情况下治疗癌症等顽症或者痤疮等病的技术。这种PDT自20世纪初开始便进行了积极研究，直至目前，在癌症的诊断和治疗、自体骨髓移植、抗生剂、艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome:AIDS)治疗、皮肤移植手术或者关节炎等治疗中用于提高免疫性，其应用范围正在逐渐扩大。
尤其是，用于癌症治疗的PDT就是利用下述原理的治疗方法：如果将作为对光具有敏感反应的物质的光敏剂投入体内，则从外部照射光时，利用体内丰富的氧和外部光引起的化学反应而生成单线态氧(singlet oxygen)或者自由基(free radical)，这种单线态氧或者自由基诱导各种病变部位或者癌细胞的死亡从而进行破坏。
目前，广为人知的用于PDT疗法的光敏剂有卟啉(porphyrin)衍生物、二氢卟酚(chlorin)、菌绿素(bacteriochlorin)、酞菁(phthalocyanine)、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid)衍生物等，作为光敏剂的环四吡咯衍生物不仅选择性地积累在癌细胞，而且从化合物的特征来看，呈现荧光或者磷光，因此具有还可以用于肿瘤的早期诊断试剂的。并且，对于在环四吡咯内部结合有金属的金属卟啉(metalloporphyrin)而言，根据结合的金属的种类而显示出多种特性，因此将金属卟啉作为核磁共振成像(magneticresonance imaging，MRI)时的造影剂(contrasting agent)来使用，从而还应用于癌细胞之类的肿瘤细胞的早期诊断，作为最广为人知的光敏剂的5-氨基乙酰丙酸衍生物具有如下优点：使用方法简单，分子量小，从而较易于渗透进皮肤，并且副作用小，因而安全。
但是，这些以往使用的光动力学诊断或者治疗用光敏剂由于癌细胞的积累率和标记率低，并不能引起荧光干涉，因此在光照射下，在体内对一般细胞，即正常细胞也表现出细胞毒性，从而具有治疗效果低且诱发各种副作用的问题。即，以往用于光动力学治疗的光敏剂由于具有疏水性(hydrophobic)，在经脉注射后对癌组织以外的包括皮肤的正常组织也将非特异性积累。这不仅不利于肿瘤-对比-背景杂信号比率而加大肿瘤部位的影像诊断难度，还具有在光动力学治疗时对周围的重要正常组织也带来损伤的危险性。而且，如果接受了光动力学治疗的患者暴露于太阳光等亮光中，则从积累在皮肤中的光敏剂再次产生反应性氧而引起皮肤光敏性(skin photosensitivity)副作用。由于这种理由，患者会被建议在光动力学治疗后直至积累在皮肤等正常组织的光敏剂消失为止在阴暗的室内停留至少6周，这会给患者带来很多不便。虽然尝试过通过增加光敏剂的亲水性来解决皮肤光敏性问题，但在这种情况下，静脉给予的光敏剂中的很大一部分会通过小便排出，因此为了使对治疗充分的量的光敏剂积累在肿瘤组织中，需要给以高出很多的容量的光敏剂。
作为用于解决这些问题并提高肿瘤选择性的手段，想要开发出一种将能够与在癌细胞表面过表达的受体等特异性结合的肽和光敏剂相结合的肽-光敏剂结合体，以使光敏剂仅特异性地进入作为标的的癌细胞。但是，以往开发过的肽-光敏剂结合体仍然具有无论位于作为标的的细胞外部还是进入细胞内部时均产生荧光信号并且表现光毒性的缺点，非特异性地附着在正常细胞时如果受到光照则对正常细胞也表现出光毒性。因此，具有需要等待血液内循环中或者非特异性地积累在正常细胞的肽-荧光染料或者肽光敏剂结合体通过小便排出或者代谢排出后再获取荧光影像或者进行光动力学治疗的限制。但是，由于患者的药代动力学特性并不相同，因而具有难以得知用于最佳影像或者光动力学治疗的时间的问题，并且在获得肿瘤选择性光动力学治疗效果上具有限制。
发明内容
技术问题
因此，本发明希望解决以往的荧光染料以及光敏剂由于依赖于通常的细胞渗透性而癌细胞的积累率和标记率低，且由自发荧光引起的肿瘤-对比-背景信号比低下，受个体间彼此不同的药代动力特性的影响而滞留时间明显不同，并且在荧光活性影像中产生噪声等问题。为此，通过开发在平时不发出信号，仅在进入标的细胞(例如，癌细胞)时选择性地生成强荧光信号的光敏剂-肽结合体，从而使仅针对作为标的的癌细胞不受时间限制地以高肿瘤-对比-背景信号比检测影像变得可能。
并且，本发明的可分解的光敏剂-肽结合体存在于作为标的的细胞外时不生成反应性氧，仅在吸收而进入至作为标的的细胞内时反应性氧的生成才会被激活，从而获得标的细胞特异性光动力学治疗效果，并可以抑制对正常组织的非特异性损伤。
技术方案
为了达成所述目的，本发明提供一种结合体，包括：光敏剂；肽，包含色氨酸；以及连接子，将所述光敏剂以及所述肽通过共价键连接。
根据本发明的一实施例，可知所述光敏剂和所述肽的色氨酸的距离在2nm以内。如果所述色氨酸与光敏剂靠近而位于2nm以内时，色氨酸和光敏剂之间会发生光诱导电子转移(photoinduced electron transfer)现象，此时光敏剂会被消光(quenching)从而诱导不能产生荧光信号并且不能生成反应性氧。
根据本发明的一实施例，为了使色氨酸和光敏剂之间的距离在2nm以内而使用的连接子是在细胞内可分解的连接子，可以是借助细胞内还原剂而分解，或者借助细胞内的酶而分解，或者在细胞内的pH4至pH5.5环境下分解的连接中选择的任意一个及以上。
根据本发明的一实施例，可分解的连接子、包含色氨酸的肽以及光敏剂的结合体可以附加结合至可以标记特定细胞的抗体、适配体、以及肽配体，这可以进一步提高针对作为标的的细胞的特异性摄入能力。
根据本发明的一实施例，如果能够特异性结合于特定细胞的表面的肽配体内已经包含色氨酸，则可将肽配体和光敏剂利用可分解的连接子进行连接。
根据本发明的一实施例，包含色氨酸的肽可以是从表皮生长因子受体1(epidermal growth factor receptor 1)、表皮生长因子受体2(epidermal growthfactor receptor 2)、表皮生长因子受体3(epidermal growth factor receptor 3)、表皮生长因子受体4(epidermal growth factor receptor 4)中选择的1种以上的表皮生长因子受体特异性地结合。
根据本发明的一实施例，包含所述色氨酸的肽可以是具有序号1的氨基酸序列的肽，可以在肽内连续地存在一个以上至三个以下的色氨酸
根据本发明的一实施例，结合体的所述连接子可以是线型二硫键或者环型二硫键。
根据本发明的一实施例，所述连接子是肽、是精氨酸、赖氨酸或者其组合，所述连接子可以由3个以下的氨基酸序列构成，所述连接子是二硫键以及双精氨酸(di-arginine)以环型的形态位于光敏剂与肽之间的连接子；或者是二硫键以及双赖氨酸(di-lysine)以环型的形态位于光敏剂与肽之间的连接子，所述环型的形态可以通过在双精氨酸以及双赖氨酸的两侧末端结合半胱氨酸来形成。
根据本申请发明的一实施例，可以是由化学式1至化学式7表示的结合体。
[化学式1]
Figure BDA0001942749670000041
[化学式2]
Figure BDA0001942749670000042
[化学式3]
Figure BDA0001942749670000051
[化学式4]
Figure BDA0001942749670000052
[化学式5]
Figure BDA0001942749670000053
[化学式6]
Figure BDA0001942749670000054
[化学式7]
Figure BDA0001942749670000055
发明效果
在本发明的光敏剂-肽结合体中光敏剂和肽通过可分解的连接，维持2nm以内的距离时，光敏剂的荧光信号以及反应性氧生成能力会被消光(quenching)，因此在正常组织或者血液循环期间不仅不会产生荧光信号，也不会生成反应性氧。本发明的结合体通过与在作为标的的细胞的表面过表达的抗原之间的相互作用被选择性地摄入细胞内之后，在细胞内，连接子被分解从而导致包含在肽内的色氨酸和光敏剂之间的距离变得大于2nm，从而消光作用消失，因此会产生强荧光信号，且活跃地生成反应性氧。因此，根据本发明的包含肽的光动力学诊断或者治疗用结合体的组织渗透性高，在正常细胞中安全，相反，仅在标的细胞(例如，癌细胞)具有较高的光动力学治疗效果，可以获得获得对比背景具有更高的标记信号率的诊断影像。
附图说明
图1a是概略地示出包含可分解的连接子的光敏剂-肽结合体的结构以及特征的模式图。
图1b是示出包含可分解的环型连接子的光敏剂-肽结合体的效能的模式图。
图1c是示出包含可分解的线型连接子的光敏剂-肽结合体的效能的模式图。
图2是示出本发明的色氨酸针对光敏剂的消光效果的实验结果(图2的A：将二氢卟酚e4＝(Chlorin e4:Ce4)的浓度固定为5μM浓度，并逐渐增加色氨酸的浓度，求出未添加色氨酸时的荧光信号F0和添加有色氨酸时的荧光信号F的比率(λEx.400nm,λEm.665nm)；图2的B：将A1(Ⅲ)酞菁氯化四磺酸(A1(Ⅲ)phthalocyanine chloride tetrasulfonic acid(AlPcS4))的浓度固定为5μM浓度，并逐渐增加色氨酸的浓度，求出未添加色氨酸时的荧光信号F0和添加有色氨酸时的荧光信号F的比率(浓度5μM，λEx.660nm,λEm.690nm)。
图3是作为包含本发明的实施例2中合成的环型二硫键连接子的光敏剂-肽结合体的C-表皮生长因子受体(C-EGFR)的质量分析资料。
图4的A是对作为包含本发明的实施例2中合成的环型二硫键连接子的光敏剂-肽结合体的C-EGFR和作为自由染料的紫外/可见光(UV/vis)吸收光谱进行比较的图。
图4的B是分别观察将本发明的实施例2的C-EGFR用PBS水溶液处理的情形、用2μM浓度的作为还原剂的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)进行4小时的处理的情形、用5mM浓度的DTT进行4小时的处理的情形的荧光光谱变化(λEx.400nm)的图。
图4的C是将实施例2的C-EGFR用PBS水溶液、2μM浓度以及5mM浓度的作为还原剂的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)进行处理并分别观察随时间发生的荧光光谱变化(λEx.400nm,λEm.665nm)的图。
图4的D是将实施例2的C-EGFR分别用PBS水溶液、2μM以及5mM的DTT进行处理，并在670nm激光照射下分析单线态氧的生成的图表。
图5是将实施例2中使用的人类正常细胞株(PCA-SMC)以及人类乳腺癌细胞株(HCC70)中的表皮生长因子受体(EGFR)表达量通过流式细胞仪进行分析的结果(已确认PCA-SMC细胞是EGFR阴性细胞株，HCC70细胞是EGFR阳性细胞株)。
图6是用本发明的实施例2的C-EGFR以及自由染料Ce4对HCC70细胞进行处理后，不进行洗涤(washing)过程的情况下按时间段拍摄近红外荧光影像的照片(λEx.640±15nm,λEm.690±25nm)。
图7是用本发明的实施例2的C-EGFR分别对正常细胞株PCA-SMC和人类乳腺癌细胞株HCC70进行4小时处理后，利用用于对溶酶体进行染色的溶酶体荧光探针(Lysotracker)来附加处理，并利用共聚焦激光显微镜(confocal laser scanning microscopy:CLSM)拍摄的荧光照片(λEx.405nm,λEm.625～754nm)。
图8的A是为了对针对实施例2的C-EGFR的细胞毒性进行分析，对人类乳腺癌细胞株HCC70用C-EGFR以各种浓度处理后求出细胞存活率的资料。
图8的B是为了对针对实施例2的C-EGFR的标的细胞特异性光动力学治疗效果进行验证，用不同浓度对PCA-SMC细胞和HCC70细胞进行4小时的处理并洗涤后，照射670nm激光而进行光动力学治疗后分析细胞存活率的资料。
图9是包含本发明的实施例3中合成的线型二硫键连接子的光敏剂-肽结合体L-EGFR的质量分析资料。
图10的A是示出包含实施例3中合成的线型二硫键连接子的光敏剂-肽结合体L-EGFR和自由染料Ce4的UV/vis吸光光谱的资料。
图10的B是将实施例3的L-EGFR结合体用磷酸盐缓冲(PBS)水溶液、2μM以及5mM浓度的DTT分别处理4小时后获得的荧光光谱(λEx.400nm；为了比较，示出了针对相同浓度的自由染料Ce4的荧光光谱)。
图10的C是将实施例3的L-EGFR结合体分别用PBS水溶液、2μM以及5mM浓度的DTT处理后，按时间检测荧光强度变化的资料(λEx.400nm,λEm.665nm)。
图10的D是将实施例3的L-EGFR结合体分别用PBS水溶液，2μM以及5mM浓度的DTT处理4小时后，一边照射670nm激光一边分析单线态氧的生成的图表。
图11是为了观察实施例3的L-EGFR结合体在存在有血清的条件下其荧光消光效果能否稳定维持，将RedoxT溶于包含血清的磷酸盐缓冲水溶液中，并按时间段检测荧光变化的结果。
图12的A是将人类正常细胞株PCA-SMC、人类乳腺癌细胞株MDA-MB-231以及MDA-MB-468中的表皮生长因子受体(EGFR)的表达通过对免疫细胞染色进行分析的资料(核被染色为蓝色，细胞表面的EGFR被染色为绿色)。
图12的B是将实施例3的L-EGFR结合体分别在PCA-SMC、MDA-MB-231以及MDA-MB-468细胞株按时间处理后获得的共聚焦激光显微镜照片(λEx.405nm,λEm.625～754nm)。
图13是将实施例3的L-EGFR结合体与溶酶体荧光探针(LysoTracker)一起对MDA-MB-468细胞进行处理的共聚焦激光显微镜照片。
图14的A是为了对针对实施例3的L-EGFR结合体的细胞毒性进行分析，用不同浓度的RedoxT处理作为人类乳腺癌细胞株的MDA-MB-468后求出细胞存活率的资料。
图14的B是为了验证针对实施例3的L-EGFR结合体的标的细胞特异性光动力学治疗效果，对PCA-SMC细胞和MDA-MB-231以及MDA-MB-468用不同浓度的RedoxT处理4小时并洗涤后，通过照射670nm激光实施光动力学治疗并分析细胞存活率的资料。
图15的A是针对作为本发明的实施例4的光敏剂-肽结合体的Ce4-RRW的质量分析资料。
图15的B是针对作为本发明的实施例4的光敏剂-肽结合体的Ce4-RRWW的质量分析资料。
图15的C是针对作为本发明的实施例4的光敏剂-肽结合体的Ce4-RRWWW的质量分析资料。
图15的D是针对作为本发明的实施例4的光敏剂-肽结合体的Ce4-RWR的质量分析资料。
图16的A是本发明的实施例4的Ce4-RRW、Ce4-RRWW、Ce4-RRWWW、Ce4-RWR以及自由染料Ce4的UV/vis吸收光谱资料。
图16的B是本发明的实施例4的Ce4-RRW、Ce4-RRWW、Ce4-RRWWW、Ce4-RWR以及自由染料Ce4的荧光光谱(λEx.400nm)资料。
图17是对本发明的实施例4的Ce4-RRWW和Ce4-RRWWW分别处理胰蛋白酶后在665nm观察随时间发生的荧光增加的图表(λEx.400nm)。
图18是将作为本发明的实施例4的光敏剂-肽结合体Ce4-RRW溶解于包含有血清的磷酸缓冲液(PBS)后，按时间段测定荧光变化从而检测血清内稳定性的图表。
图19是为了分析本发明的实施例4的光敏剂-肽结合体Ce4-RRW在癌细胞内是否表现荧光活性化，将结合体在KB癌细胞株中分别处理30分钟、1小时、2小时以及4小时后获得的共聚焦激光显微镜照片。
图20是用作为本发明的实施例4的光敏剂-肽结合体的Ce4-RRW处理KB癌细胞株，并用可以对细胞内的溶酶体进行染色的LysoTracker附加进行荧光染色后获得的共聚焦激光显微镜照片(已确认到存在有高浓度还原剂的溶酶体和光敏剂的荧光重叠，这表明结合体被溶酶体内的还原剂分解从而发生了荧光活性化)。
图21是作为本发明的实施例5的光敏剂-肽结合体Ce4-CRRCW的质量分析资料。
图22的A是本发明的实施例5的光敏剂-肽结合体Ce-CRRCW以及自由染料Ce4的UV/vis吸收光谱的资料。
图22的B是本发明的实施例5的光敏剂-肽结合体Ce-CRRCW以及自由染料Ce4的荧光光谱(λEx.400nm)。
图23是将本发明的实施例5的光敏剂-肽结合体Ce-CRRCW用还原剂DTT以及组织蛋白酶单独以及复合处理后获得的荧光光谱资料(λEx.400nm；用组织蛋白酶(组织蛋白酶B、S、L以及用作为抑制剂的E64预处理过的组织蛋白酶B)分别对Ce4-CRRCW处理了6小时，利用2μM以及5mM浓度的作为还原剂的DTT对Ce4-CRRCW单独处理或者利用5mM浓度的DTT以及组织蛋白酶B一并对Ce4-CRRCW处理并分析了荧光光谱)。
图24是将作为本发明的实施例5的光敏剂-肽结合体Ce4-CRRW对SCC7癌细胞株分别处理2小时、4小时、6小时后获得的共聚焦激光显微镜照片。
图25是用作为本发明的实施例5的光敏剂-肽结合体Ce4-CRRCW处理SCC7细胞并利用LysoTracker对溶酶体进行附加染色后获得的共聚焦激光显微镜照片。
优选实施方式
为了达成上述目的，本发明提供一种色氨酸、或者包含色氨酸的肽通过细胞内可分解的连接而与光敏剂结合的光动力学诊断或者治疗用结合体以及包括该结合体的光动力学诊断或者治疗用组合物。
所述“治疗”，如果没有被提及不同含义，则表示使所述术语所适用的疾患或者疾病，或者所述疾患或者疾病的一个以上的症状好转、缓解、抑制其发展或者预防的含义，本申请使用的所述术语“治疗”，在“进行治疗”被定义为如上所述时指代进行治疗的行为。
本发明中色氨酸的主要功能在于，在与结合的光敏剂之间的在三维上的距离为2nm以内时起到消光(quenching)剂的作用，从而使结合体不能生成荧光信号，不仅如此，还能抑制治疗用反应性氧使其不能产生。在结合体被摄入至作为标的的细胞内后，结合体内的连接子在细胞内被分解，从而使色氨酸和光敏剂之间的距离远离至2nm以上，因此由色氨酸引起的消光作用将会消失。从这时开始，产生强荧光信号，从而可以进行标的细胞特异性荧光影像诊断，反应性氧的产生也非常积极地发生，使选择性光动力学诊断变得可能。尤其是，将利用可分解的连接子结合的色氨酸与光敏剂结合体进一步结合至可以结合(binding)到特定细胞的抗体、RNA或者DNA适配体、肽配体、纳米粒子等结合时，可以进一步提高针对作为标的的细胞的特异性。
如果可以和特定细胞进行特异性结合的肽本身包含色氨酸，则通过将这种肽和光敏剂利用可分解的连接子进行结合，从而可以诱导色氨酸和光敏剂之间的距离在2nm以内，此时也可以得到光敏剂的消光现象。这样被消光的荧光染料(或者光敏剂)和肽结合体由于肽与作为标的的癌细胞以及炎症细胞的表面进行特异性结合，从而肽-光敏剂结合体仅被摄入至作为标的的细胞内，并在进入到作为标的的细胞内后，连接子被分解，使得色氨酸和荧光染料(或者光敏剂)之间的距离远离至2nm以上，从而失去由色氨酸引起的消光作用。从这时开始，产生强的荧光信号，因此可以进行标的细胞特异性荧光影像诊断，反应性氧的产生也非常积极地发生，从而使选择性光动力学诊断变得可能。
所述细胞内可分解的连接是指可以借助细胞内的环境，例如酶、信号因子、还原剂、pH等分解的连接，更具体地，可以是在溶酶体内分解的连接。因此，所述细胞内可分解的连接可以是借助细胞内酶分解的连接、借助细胞内还原剂分解的连接或者借助细胞内低pH分解的连接中选择的任意一个以上。
分解包含于本发明的光动力学诊断或者治疗用结合体的连接子的酶可以是从组织蛋白酶(cathepsin)以及脂酶(esterases)中选择的任意一个或者组合，并且所述组织蛋白酶可以是从组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、以及组织蛋白酶S中选择的任意一个以上的酶。例如，可以是由借助存在于溶酶体内的组织蛋白酶B(cathepsin B)分解的精氨酸(arginine)或者赖氨酸(lysine)构成的结合，或者是借助酶脂而分解的酯(ester,-COO-)键或者硫酯(thioester,-COS-)键。
可分解包含于本发明的光动力学诊断或者治疗用结合体的连接子的细胞内还原剂可以是从谷胱甘肽、巯基以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)中选择的一种以上，例如，可以是可以被溶酶体内的谷胱甘肽分解的二硫(di-sulfide)键。如果是谷胱甘肽，周知为在包含血液的细胞外的区域中以大约2μM浓度存在，在癌细胞内则以10mM的高浓度存在。
在图1中示出了针对本发明的作用的模式图。图1A是概略地示出包含可分解的连接子的光敏剂-肽结合体的结构以及特性的模式图。特征在于，光敏剂与色氨酸或者光敏剂与含有色氨酸的肽通过细胞内可分解的连接子相结合，并且为了最大化由色氨酸引起的光敏剂的消光(quenching)效果，使色氨酸和光敏剂之间的距离为2nm以内。更优选地，在三维立体上的距离可以在2nm以内。如果将所述细胞内可分解的连接子在作为标的的细胞中被截断，从而色氨酸和光敏剂之间的距离大于2nm，则由色氨酸引起的消光效果消失，同时从光敏剂产生强的荧光信号，从而可以表现出光动力学治疗效果(图1B以及图1C)。连接子可以借助细胞内的酶或者还原剂的单独或者复合作用而分解。
根据本发明的光动力学诊断或者治疗用结合中使用的光敏感剂可以应用本领域中通常的技术人员能够用到的光敏剂。例如，可以从由如下的卟啉类化合物或者非卟啉类化合物构成的组中使用，其中卟啉类化合物从由卟啉类(porphyrins)、二氢卟酚类(chlorins)、脱镁叶绿酸类(pheophorbides)、菌绿素类(bacteriochlorins)、卟啉烯类(porphycenes)、酞菁类(phthalocyanines)构成的组中选择，非卟啉类化合物从由金丝桃素(hypericin)、罗丹明(rhodamine)、玫瑰红(rose bengal)、补骨脂素(psoralen)、吩噻嗪(phenothiazinum)系列染料以及部花青(merocyanine)构成的组中选择，但并不限于此。更具体地，可以从由卟啉类化合物或非卟啉类化合物构成的组中单独或者复合地选择并使用，其中卟啉类化合物从由游离碱或者金属络合物形态的血卟啉(hematoporphyrins)、卟啉烯类(porphycenes)、脱镁叶绿酸类(pheophorbides)、红紫素类(purpurins)、二氢卟酚类(chlorins)、原卟啉类(protoporphyrins)、酞菁类(phthalocyanines)构成的组中选择，非卟啉类化合物从由金丝桃素(hypericin)、罗丹明(rhodamine)、ATTO、玫瑰红(rosebengal)、补骨脂素(psoralen)、吩噻嗪(phenothiazinum)系染料以及部花青(merocyanine)构成的组中选择。
本发明中如果本发明的结合体在癌细胞中选择性地积累时，借助癌细胞内的还原剂或者酶作用等而荧光干涉会被消除，并且借助激光的照射而使光敏剂仅在癌细胞中呈现荧光发色，因此可以通过是否有这种荧光来诊断癌症。并且，由于被抑制的反应性氧的生成再度被激活，从而可以获得标的细胞特异性光动力学治疗效果。
本发明提供包含所述光动力学诊断或者治疗用结合体的光动力学诊断或者治疗用组合物。
根据本发明的所述光动力学治疗用组合物可以单独包括药学上有效的量的本发明的光动力学诊断或者治疗用结合体，或者可以包括一个以上的药学上允许的载体、赋形剂或者稀释剂。所述药学上有效的量是指对于疾病症状的预防、改善以及治疗充分的量。
根据本发明的光动力学诊断或者治疗用结合体的药学上有效的量是0.5～100mg/天/体重kg，优选地，是0.5～5mg/天/体重kg。但上述药学上有效的量可以根据疾病症状的程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、给药途径以及治疗期间等进行适当变化。
所述药学上所允许的载体、赋形剂或者稀释剂是指生理学上允许，并向人体给药时，通常不产生胃肠障碍、眩晕等过敏反应或者与其类似的反应的组合物。所述载体、赋形剂或者稀释剂的例子可以举出乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸盐、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。并且，还可以额外包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂以及防腐剂等。
并且，本发明的组合物可以利用本领域公知的方法进行剂型化，以使向哺乳动物给药后能够迅速、持续或者延迟地释放活性成分。剂型可以是粉末、颗粒、片剂、乳液、糖浆、气溶胶、软质或者硬质的明胶胶囊、无菌可注射溶液、无菌粉末形态。
根据本发明的光动力学治疗用组合物可以通过包括口服、经皮，皮下，静脉或肌肉的各种途径给药，活性成分的用药量可以根据给药途径、患者的年龄、性别、体重以及患者的严重程度等各种因素适当选择。
并且，如果利用根据本发明的结合体或者包含所述结合体的组成物治疗或者诊断疾病时，可以使用的光源并不限于以下，但可以使用从由用于体外光照射的光源以及光动力学治疗用激光纤维等的用于体内光照射的光源组成的组中选择的一种以上，其中用于体外光照射的光源从由超声波辐照器、发光二极管、激光二极管、染料激光器、卤化金属灯、闪光灯、机械滤波的荧光光源、机械滤波的白炽灯和灯丝光源构成的组中选择，本发明中的所述光敏剂可以在600nm至900nm范围的近红外光线中表现活性。
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明进行更加详细的说明。在此，下述实施例仅仅是为了对本发明进行示例而记载的，本发明的范围不应该被解释为被这些实施例所限。
[实施例1]由色氨酸引起的光敏剂的消光效果分析
进行了确认色氨酸对光敏剂的消光效果的实验。
更具体地，为了确认随着光敏剂和色氨酸之间的距离变小而产生的消光作用，使用具有代表性的作为二氢卟酚类以及花青类光敏剂的Chlorin e4(Ce4)和AIPcS4Al(Ⅲ)(酞菁氯化四磺酸(phthalocyanine chloride tetrasulfonic acid))进行了分析。将Ce4和AIPcS4A的浓度固定为5μM的浓度，然后逐渐增加色氨酸的浓度而求出了没有添加色氨酸时的荧光信号F0对比添加有色氨酸时的荧光信号F的比率(Ce4:λEx.400nm,λEm.665nm；AlPcS4:λEx 660nm,λEm.690nm)。其结果在图2中进行了示出。
根据图2的a以及图2的b，可知随着色氨酸浓度的增加，光敏剂产生的荧光被明显抑制，这表明当光敏剂和色氨酸的距离充分近时，光敏剂会通过色氨酸而被消光。
[实施例2]包含环型二硫键连接子的光敏剂-肽结合体(C-EGFR)的制备以及特性分析
实施例2中，进行了分析能否通过调节肽配体内含有的色氨酸和光敏剂之间的距离来调节光敏剂的消光效果的实验。作为含有色氨酸的肽配体的例子，选择了周知为能够与在癌细胞表面过表达的表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor，EGFR)特异性结合的GE11肽(YHWYGYTPQNVI；序列号1)，作为光敏剂使用了chlorin e4(Ce4)。作为可分解的连接子，选择了借助在细胞内以高浓度存在的还原剂而可分解的二硫键以环型插入的连接子。
2.1包含环型二硫键连接子的光敏剂-肽结合体(C-EGFR)的合成
为了合成C-EGFR，通过利用ASP48S(Peptron Inc,美国)的Fmoc固相多肽合成法(solid phase peptide synthesis，SPPS)制造了肽，其制造过程如下。
将8当量的结合有保护基团(Fmoc)的氨基酸以及8当量的2-(1H-苯并三唑(Benzotriazol)-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯[2(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate，HBTU]/8当量的N-羟基苯并三唑(Hydroxybenzotriazole:HOBt)/16当量的4-甲基吗啉(Methylmorpholine，NMM)溶解于二甲基甲酰胺(Dimethylformaminde，DMF)后添加到H-Ile-2-chloro-Trityl树脂，并在室温下反应2小时，然后按DMF、甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。
为了分离出结合在氨基酸的保护基团Fmoc，向所述反应液中添加含有20％的哌啶(piperidine)的DMF并在室温下5分钟期间内反应2次后，以DMF、甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。通过反复上述过程，合成了在肽基本骨架上结合有树脂的[H-miniPEG2-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(t-Bu)-His(Trt)
-Trp(Boc)-Tyr(t-Bu)-Gly-Tyr(t-Bu)-Thr(t-Bu)-Pro-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Val-Ile-2-chloro-Trityl Resin]结构体。
将4当量的Ce4以及4当量的HBTU/4当量的HOBt/8当量的NMM溶解于二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)后添加到所述树脂-肽基本骨架结合体，然后将所述混合液反应12小时并进行抽滤(suction)后，按DMF、甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。
通过上述过程，形成期望合成的肽骨架后，利用将三氟乙酸(trifluoroaceticacid,TFA)/1,2-乙二硫醇(1,2-ethanedithiol,EDT)/茴香硫醚(thioanisole)/三异丙基硅烷(triisopropylsilane,TIS)/水以90/2.5/2.5/2.5/2.5稀释的溶液进行处理，从而去除上述生成的肽残留基团的保护基团并从树脂分离而生成[Ce4-miniPEG2-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Tyr(t-Bu)-His(Trt)-Trp(Boc)-Tyr(t-Bu)-Gly-Tyr(t-Bu)-Pro-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Val-Ile]。
此后，在反应液中加入10倍的凉的乙醚(diethyl ether)，从而使肽沉淀，并以3000rpm进行离心分离10分钟。将滤液丢弃后反复2次上述操作。将上述制得的结合体通过反相高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)进行了提纯。
为了肽内的环型二硫键，将提纯的肽溶解在0.1％乙酸铵溶液并进行了24小时的强搅拌。利用HPLC和液相色谱质谱联用仪(LC/MS)确认了反应的进行状况。在确认反应结束后通过使用有Vydac C4,5u,300A柱(4.6×50mm)的反相HPLC来进行了提纯。使用利用含有0.1％TFA的30％至60％(v/v)的乙腈溶液的水-乙腈线性梯度进行了溶出。
根据如上所述制造出的C-EGFR结合体的化学结构如下述化学式1。即，光敏剂和作为EGFR标的肽的GE11通过环型二硫键结合，并且借助环型结构形态而使作为光敏剂的Ce4位于与色氨酸相靠近的位置，不仅如此，还因为由环型结合引起的移动性(mobility)的限制，引导Ce4继续位于与色氨酸相靠近的位置。
[化学式1]
Figure BDA0001942749670000161
2.2环型C-EGFR结合体的特性
1)分子量测定以及荧光释放特性分析
使用LC/MS(Agilent Hewlett Packard 1100系列，美国)测定了合成并提纯的C-EGFR的分子量，并使用UV/Vis吸光光谱仪(DU370，美国)测定了吸光度。
评价结果，上述制得的提纯的本发明的结合体，即C-EGFR结合体的分子量是2,423g/mol(图3)，最高吸光峰值出现在282nm、402nm、以及665nm上出现(图4的A)。用402nm进行激发时在661nm下显示出了最高发光峰值(参考图4的B)。
2)由还原剂处理引起的荧光信号以及反应性氧的产生恢复分析
分析了荧光以及反应性氧的产生是否会因还原剂处理而增加。将所述制得的C-EGFR结合体溶解于磷酸盐缓冲食盐水(phosphate-buffered saline，PBS，6.7mM,pH 7.4,154mM NaCl)直至达到2μM，然后放入多功能酶标仪(microplate reader)(Safire 2，Tecan公司，瑞士)得出了荧光光谱(λEx.400nm,λEm.650～850nm)结果。在作为还原剂的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)处理的试料中，在2μM的结合体中分别混合了2μM和5mM的DTT，在缓冲液处理组中混合了等量的磷酸盐缓冲液(PBS)。以30分钟为间隔测定了所述混合液(200μl)的荧光强度(λEx.400nm,λEm.665nm)且历时4小时。
通过以下方法对单线态氧的生成(singlet oxygen generation,SOG)进行了测定。将上述制得的C-EGFR结合体溶解于PBS中直至达到2μM后，在DTT处理试料中分别混合了2μM和5mM的DTT，在缓冲液处理组中混合了等量的PBS。并将所述混合液(200μl)在37℃下培养了4小时。然后，与包含浓缩的单线态氧绿色探针(Singlet Oxygen Sensor Green，SOSG)的饱和氧PBS混合后，将最终的SOSG的浓度调节至5μM。使用670nm连续波长激光装置周期性地测定了所述试料的光照射(光照射量50mW/cm2)期间的SOSG的荧光强度变化。
根据图4，确认了仅存在C-EGFR时并没有出现荧光(OFF状态)，但在进行了5mM的DTT处理时，二硫键分解被分解而呈现出光敏剂固有的荧光(ON状态)(图4的B)。通过5mM浓度的DTT处理，荧光强度足足增加为3.4倍，尤其在反应开始的30分钟内荧光快速恢复，并在两小时后维持了稳定状态(图4的C)。并且，在没有进行DTT处理或者以作为细胞外还原剂浓度的2μM进行DTT处理时，单线态氧的生成被抑制，而在以5mM进行DTT处理时二硫键被分解，从而消光被消除，并且单线态氧的生成增加了5倍(图4的D)。因此可知，本发明的C-EGFR结合体如果被摄入至标的细胞内，则环型二硫键断开，从而使荧光和单线态氧的生成被激活。
3)细胞培养
将表皮生长因子受体(EGFR)过表达的人类乳腺癌细胞株HCC70和将EGFR不表达的人类正常细胞株(原发性冠状动脉平滑肌细胞,Primary Coronary Artery Smooth MuscleCells,PCA-SMC)均是从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC，美国)获取的。
所述HCC70细胞在包含10％的胎牛血清以及1％的青霉素/链霉素(美国生命技术公司(Life Technologies))的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640培养基中在37℃、5％二氧化碳以及标准湿度条件下进行了培养。PCA-SMC细胞则在包含重组人类胰岛素、抗坏血酸、谷氨酰胺、重组人类上皮生长因子、10％的胎牛血清的血管细胞基础培养基中在37℃、5％二氧化碳以及标准湿度条件下进行了培养。
4)利用流式细胞仪的EGFR表达量测定
利用流式细胞仪测定了作为标的蛋白质的EGFR在各个细胞中的表达量。放入PCA-SMC和HCC70细胞各3×105个后利用包含4％多聚甲醛(paraformaldehyde)的磷酸盐缓冲液进行固定，并洗涤3次。固定的细胞与EGFR抗体(4μg/1mL的1％牛血清蛋白(BSA)/0.25％Tween20/PBS)反应30分钟后用凉的磷酸盐缓冲液进行洗涤。然后，与结合有作为荧光染料的FITC的2次抗体(1:100稀释)反应30分钟后，用凉的磷酸盐缓冲液再次洗涤并利用流式细胞仪进行分析，据此验证了细胞表面表达的EGFR的程度(图5)。
5)荧光消光以及荧光恢复的实时观察
欲要验证如下情况：在标的细胞外荧光信号的产生被消光的本发明的C-EGFR结合体在被摄入标的细胞内后是否会产生强荧光。将EGFR过表达HCC70细胞用所述C-EGFR结合体以及自由光敏剂(Ce4)进行处理后不进行洗涤并按预定时间间隔获取了荧光照片。具体方法如下。
在12-孔板(well plate)(BD biosciences，美国)中，每个well内放入1×106个HCC70细胞并培养24小时以使细胞良好地吸附后，将C-EGFR结合体以及自由光敏剂混合而进行了稀释。此后将原培养基替换为0.5ml的包含结合体以及自由光敏剂的新鲜的培养基。此后，不洗涤细胞，并使用活细胞工作站技术(Live Cell Imaging System)(AxioObserver Z1，Carl Zeiss公司，德国)以15分钟为间隔获取了各自的近红外荧光影像(λEx.640±15nm,λEm.690±25nm)且历时4小时。
根据图6可知，当对C-EGFR进行了处理时，荧光信号的产生在细胞外会被抑制，但是在与存在于细胞表面的EGFR结合体结合并被摄入至细胞内之后，则会产生较强的荧光信号，从而可以从荧光影像确认各个细胞的位置。这表示在细胞外处于消光的结合体在细胞内时，二硫键被分解，使得小光效果小时，从此时开始产生较亮的荧光信号。相反，可知在进行自由光敏剂处理的情况下，荧光信号的产生一直处于激活，因此，由于因细胞外产生的较强的荧光信号导致的较高的背景信号，难以将癌细胞的位置从荧光影像中区分。
6)结合体的特异性细胞摄入以及基于此的荧光活性
将PCA-SMC细胞以及HCC70细胞在8-孔腔室盖玻片(8-well Lab-Tek)腔中，每个孔(well)内分别放入5×103个PCA-SMC细胞，5×104个HCC70细胞并培养24小时以使细胞良好地吸附。此后将原培养基替换成200μl的溶有C-EGFR结合体(2μM)的新鲜的培养基后，将上述细胞培养了4小时。
最后，将细胞用培养基洗涤3次，并使用共聚焦激光显微镜(CLSM.ZEISS LSM510META，德国)获得了近红外荧光图像(λEx.405nm,λEm.625～754nm)。
进行了用于掌握本发明的C-EGFR结合体的细胞内位置的实验。在8-wellLab-Tek腔的每个well上分别放入5×103个PCA-SMC细胞，5×104个HCC70细胞并培养24小时以使细胞良好地吸附后，加入2μM的C-EGFR并培养了4小时，然后进行了3次洗涤。此后将原培养基替换为包含100nM的LysoTracker Blue DND-22染料的新鲜的培养基，并将上述细胞培养了45分钟。对所述试料，使用共聚焦激光显微镜获得了针对C-EGFR结合体(λEx.405nm,λEm.625～754nm)以及溶酶体荧光探针(LysoTracker)(λEx.405nm,λEm.411～497nm)的荧光影像。
根据图7，可以确认当将C-EFGR结合体处理于HCC70细胞时，在被摄入细胞内后显示出了较强的荧光信号，当将C-EFGR结合体在PCA-SMC细胞中处理时则几乎不显示荧光信号。该结果支持C-EGFR结合体与作为EGFR过表达细胞的HCC70细胞表面的EGFR进行特异性相互作用而被摄入到了细胞内的结论。并且，已确认当把特异性染色细胞内的溶酶体的溶酶体荧光探针(Lysotracker)和结合体一并处理时，存在共同被染色的部位，并且从将荧光照片重叠后观察时其位置也准确地重叠来看，可以确认C-EGFR结合体移动到了细胞内部的谷胱甘肽浓度高的溶酶体内，并在该处发生了荧光激活。
7)细胞毒性以及光动力学治疗效能实验
在没有光的黑暗状态下将本发明的C-EGFR结合体在HCC70细胞以0～10μM浓度处理后评价了细胞毒性。其结果如图8的A所示，可以确认在没有光照射的情况下，在相应浓度范围内不表现出出细胞毒性。
为了对标的光动力学治疗效果进行评价，在96-孔板分别放入1×103个/well的PCA-SMC细胞，1×104个/well的HCC70后培养了24小时以使细胞良好地附着。将C-EGFR结合体分别按照0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM的浓度进行准备并对细胞进行处理后，培养了4小时。此后将没有被引入到细胞的C-EGFR结合体通过洗涤方式去除后利用670nm激光以50mW/cm2的照射量密度照射了6分40秒。此后为了稳定化，整夜(overnight)期间在培养器内培养后用CCK-8化验(CCK-8assay)判断了细胞是否有毒。
其结果由图8的B可以确认，在HCC70细胞中C-EGFR结合体的IC50值被计算为0.28μM，在PCA-SMC细胞中，就算在10μM的高浓度中也有70％以上的细胞存活。据此可知，C-EGFR结合体以EGFR为媒介被摄入至癌细胞内，从而使荧光以及光动力学治疗效果活性化，尤其在低浓度下也可以诱导高的癌症治疗效果。
[实施例3]包含线型二硫键连接子的光敏剂-肽结合体(L-EGFR)的制造以及特性分析
实施例3中验证了在光敏剂和色氨酸之间的连接子以线型构成的情况下，线型连接子在细胞内分解时被消光的荧光以反应性氧的生成能否被激活。为此，选用了Ce4作为光敏剂，且合成了由线型二硫键连接包含色氨酸的GE11肽(YHWYGYTPQNVI)和光敏剂而成的结合体，并分析了其效果。
3.1.包含线型二硫键连接子的光敏剂-肽结合体(L-EGFR)的合成
通过利用了ASP48S的Fmoc固相多肽合成法制造了肽，其制造过程如下。
将8当量的Fmoc-miniPEG2-OH以及8当量的HBTU/8当量的HOBt/16当量的N-甲基吗啉(NMM)溶解于DMF后添加到H-Cys(Trt)-2-chloro-Trityl树脂(Anaspec，美国)中，并在室温下反应2小时，然后按DMF、甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。
为了分离出结合在氨基酸的保护基团Fmoc，向所述反应液中添加含有20％的哌啶(piperidine)的DMF并在室温中5分钟期间内反应2次后，以DMF、甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。
将4当量的chlorin e4(Ce4)以及4当量的HBTU/4当量的HOBt/8当量的NMM溶解于DMSO添加到肽树脂，然后反应12小时并进行抽滤，并将生成的Ce4-miniPEG2-Cys(Trt)-2-chloro-Trityl树脂按甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。
生成的肽树脂通过利用将TFA/EDT/茴香硫醚(thioanisole)/TIS/水以90/2.5/2.5/2.5/2.5稀释的溶液进行处理，从而去除肽残留基团的保护基团并将肽从树脂分离从而获得Ce4-miniPEG2-Cys。
此后，在反应液中加入10倍的凉的乙醚(diethyl ether)，从而使肽沉淀，并以3000rpm进行离心分离10分钟。将滤液丢弃后反复2次上述操作。将所述制得的结合体通过反相HPLC进行了提纯。
将上述制得的Ce4-miniPEG2-Cys和Aldrithiol-2溶解于乙酸后在室温下反应4小时。并利用HPLC和液相色谱质谱联用仪(LC/MS)确认反应的进行状况。反应结束后进行离心分离并提纯，然后通过冻结干燥获得Ce4-miniPEG2-Cys(Pys)。
另外，为了合成肽骨架，将8当量的Fmoc-氨基酸以及8当量的HBTU/8当量的HOBt/16当量的NMM溶解于DMF而添加到H-Ile-2-chloro-Trityl树脂(Anaspec，美国)后在室温下反应2小时，然后按DMF、甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。
为了分离出结合在氨基酸的保护基团Fmoc，向所述反应液中添加含有20％的哌啶(piperidine)的DMF并在室温中5分钟期间内反应2次后，以DMF、甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。
反复上述过程而合成了在肽基本骨架上结合有树脂的[H-Cys(Trt)-Tyr(t-Bu)-His(Trt)-Trp(Boc)-Tyr(t-Bu)-Gly-Tyr(t-Bu)-Thr(t-Bu)-Pro-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Val-Ile-2-chloro-Trityl Resin]结构体。
生成的肽树脂通过利用将TFA/EDT/茴香硫醚(thioanisole)/TIS/水以90/2.5/2.5/2.5/2.5稀释的溶液进行处理，从而去除肽残留基团的保护基团并将肽从树脂分离。
此后，在反应液中加入10倍的凉的乙醚(diethyl ether)，从而使肽沉淀，并以3000rpm进行离心分离10分钟。将滤液丢弃后反复2次上述操作。将上述制得的结合体通过反相HPLC进行了提纯。
将提纯的肽骨架和Ce4-miniPEG2-Cys(Pys)溶解在水和乙腈1:1溶液，并使其在室温下反应12小时。利用HPLC和LC/MS确认了反应的进行状况。在确认反应结束后使用反相HPLC来进行提纯。使用利用含有0.1％TFA的40％至70％(v/v)的乙腈溶液的水-乙腈线性梯度进行了溶出。
根据如上所述制造出的L-EGFR结合体的化学结构如下述化学式2。即，光敏剂和EGFR标的肽通过线型二硫键结合。
[化学式2]
Figure BDA0001942749670000211
3.2.线型L-EGFR结合体的特性
1)分子量以及吸光光谱
使用LC/MSD测定了分子量，并使用UV/Vis光谱仪测定了吸光度。
评价结果，上述制得的提纯的本发明的结合体，化学式2的分子量是2,441g/mol(图9)，从吸光光谱上来看在282nm、404nm、505nm以及660nm(参照图10的A)下分别出现了最高吸收峰值。
2)由还原剂作用引起的荧光以及反应性氧的产生恢复分析
对于与在癌细胞内以高浓度存在的还原剂进行反应而在上面获得的结合体的荧光恢复，利用与所述实施例2中执行的方法相同的方法执行并进行了分析。并且将稀释之后准备的试料放入多功能酶标仪得出了荧光光谱(λEx.400nm,λEm.650～850nm)结果。
并且，为了确认单线态氧的生成(SOG)，通过与实施例2中执行的方法相同的方法进行了分析。
根据图10，确认了仅存在L-EGFR结合体时并没有出现荧光(OFF状态)，但用5mM的DTT处理时则可以观察到随着线型二硫键连接子的分解而呈现出光敏剂固有的荧光(ON状态)(图10的B)。可以确认荧光表达状态(ON)的荧光强度与消光(OFF)状态相比增加为2.5倍，并且几乎恢复了自由光敏剂的荧光。可以知道，尤其在反应仅开始5分钟就有90％以上的荧光快速恢复(图10的C)。
并且，在消光状态时单线态氧的生成被抑制，而在以5mM的DTT处理时由于消光被消除，单线态氧的生成增加为2倍。因此可知本发明的实施例3的L-EGFR结合体被摄入至标的细胞内时，线型二硫键被断开，从而荧光和单线态氧的生成被激活。
3)血清内稳定性
将本发明的L-EGFR结合体分别与PBS以及包含10％的胎牛血清(Fetal bovineserum，FBS，Gibco，美国)的PBS混合并进行培养据此对血清内稳定性进行了评价。溶液内所述结合体的最终浓度被调节为2μM。将所述溶液在室温下反应4小时后，放入多功能酶标仪(Safire 2，Tecan公司，瑞士)得出荧光光谱(λEx.400nm)结果。
根据图11，可以确认血清蛋白质并不受结合体的荧光强度的影响。
4)细胞培养
过表达表皮生长因子受体(EGFR)的人类乳腺癌细胞株MDA-MB-468、中等程度表达的MDA-MB-231、以及不表达EGFR的人类正常细胞株PCA-SMC均是从美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC，美国)获取的。
所述MDA-MB-231细胞在包含10％的FBS以及1％的青霉素/链霉素(LifeTechnologies)的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)1640培养基中在37℃、5％二氧化碳以及标准湿度条件下进行了培养。MDA-MB-461细胞在包含10％的FBS以及1％的青霉素/链霉素(Life Technologies)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)培养基中在37℃、5％二氧化碳以及标准湿度条件下进行了培养。PCA-SMC细胞则在包含重组人类胰岛素、抗坏血酸、谷氨酰胺、重组人类上皮生长因子、10％的FBS的血管细胞基础培养基中在37℃、5％二氧化碳以及标准湿度条件下进行了培养。
5)免疫细胞化学分析
通过免疫细胞化学分析法对作为标的蛋白质的EGFR在各个细胞中的表达量进行了测定。将PCA-SMC和MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞附着到盖片(cover glass)后利用包含4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS在常温下固定15分钟，并进行了2次洗涤。使固定的细胞和0.25％的tritonX-100反应10分钟后用PBS在五分钟期间洗涤了3次。此后用含有1％的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)的PBST缓冲液处理细胞30分钟，然后和EGFR抗体(1:500稀释)反应1小时，再用PBS在5分钟期间进行了3次洗涤，此后在黑暗条件下与2次抗体(1：500)稀释反应1小时后再用PBS在5分钟期间进行了3次洗涤。用DAPI将细胞核染色1分钟后再用PBS洗涤，然后进行了封片(mounting)。
根据图12的A，可以确认MDA-MB-468细胞株的EGFR表达较高，MDA-MB-231细胞株的EGFR表达是中等程度，PCA-SMC的EGFR表达则非常低。
6)结合体的细胞内摄入及基于此的荧光活性
将PCA-SMC细胞、MDA-MB-231细胞以及MDA-MB-468细胞在8-wellLab-Tek腔中，每个well内分别放入5×103个PCA-SMC细胞，5×104个MDA-MB-231细胞以及5×104个MDA-MB-468细胞并培养24小时以使细胞良好地附着。此后将原培养基替换成200μl的溶有2μM的结合体的新鲜的培养基后，将上述细胞分别培养了30分钟、1小时、4小时。
最后，将细胞用新鲜的培养基洗涤3次，以将存在于细胞外的结合体去除之后，使用共聚焦激光显微镜获得了近红外荧光图像(λEx.405nm,λEm.625～754nm)。
进行了用于掌握本发明的L-EGFR结合体的细胞内位置的实验。在8-wellLab-Tek腔中每个well上分别放入1×105个细胞并培养24小时以使细胞良好地吸附。然后将L-EGFR结合体浓度处理至2μM后培养4小时，然后进行了3次洗涤。此后为了对溶酶体进行染色，将原培养基替换为包含100nM的LysoTracker Blue DND-22染料的新鲜的培养基，并将上述细胞培养了45分钟。对所述试料，使用共聚焦激光显微镜获得了针对结合体(λEx.405nm,λEm.625～754nm)以及溶酶体荧光探针(LysoTracker)(λEx.405nm,λEm.411～497nm)的荧光影像。
根据图12的B，可以确认当把L-EFGR结合体处理于PCA-SMC细胞时，尽管培养了4小时，也没有进入细胞内，并且如果在癌细胞表面上EGFR的表达量较高则细胞摄入增加。在MDA-MB-231细胞，开始培养的30分钟内几乎没有呈现荧光，但随着培养时间的增加，荧光强度也随之增加。相反，在MDA-MB-468细胞，就算30分钟短期培养，在细胞表面也呈现强荧光信号，并且随着培养时间的增加，被摄入至细胞内部。该结果支持实施例3的L-EGFR结合体通过与细胞表面的EGFR之间的特异性相互作用而被摄入至细胞内的结论。
根据图13，已确认当把特异性染色细胞内的溶酶体的溶酶体荧光探针(Lysotracker)和结合体一并处理时，存在共同被染色的部位，并且从将荧光照片重叠后观察时其位置也准确地重叠来看，可以确认L-EGFR结合体位于作为还原剂的谷胱甘肽的浓度较高的细胞内的溶酶体内，并在所述溶酶体内被激活。
7)细胞毒性以及光动力学治疗效能实验
在没有光的黑暗状态下通过将本发明的L-EGFR结合体向MDA-MB-468细胞以0～10μM浓度添加，以此评价了细胞毒性。其结果如图14的A所示，可以确认在没有光照射的情况下，在相应浓度范围内不表现出细胞毒性。
为了对光动力学治疗效能进行评价，在96-孔板(well plate)分别放入1×103个/well的PCA-SMC细胞，1×104个/well的MDA-MB-231细胞以及1×104个/well的MDA-MB-468细胞后培养了24小时以使细胞良好地吸附。此后将L-EGFR结合体分别按照0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM浓度进行准备并处理至细胞后培养了4个小时。然后将没有被摄入细胞的结合体通过洗涤方式去除后利用670nm激光以50mW/cm2的照射量密度照射了6分40秒。并在培养器内额外培养至第二天后，用CCK-8assay判断了是否有毒。
其结果，根据图14的B，在MDA-MB-468细胞中结合体的IC50值被计算为0.66μM，在MDA-MB-231细胞中则被计算为1.81μM。并且确认到，在PCA-SMC细胞中，就算在10μM的高浓度中也有70％以上的细胞存活。据此可知，L-EGFR结合体以EGFR为媒介被摄入至癌细胞内，并且这样被摄入的结合体在低浓度中也可以诱导较高的癌症治疗效果。
[实施例4]包含光敏剂-精氨酸以及色氨酸的肽结合体的制造以及特性分析
4.1.包含光敏剂、精氨酸、色氨酸的结合体的制备
通过利用ASP48S的Fmoc固相多肽合成法(solid phase peptide synthesis，SPPS)制造了肽，其制造过程如下。
在Trt-Cl树脂(GL Biochem，中国)中将结合有保护基团(Fmoc)的氨基酸与含有20％哌啶(piperidine)的DMF强力混合并在室温下10分钟期间反应2次，然后用DMF以及甲醇进行了2次洗涤。此后将8当量的氨基酸以及8当量的HBTU/8当量的HOBt/16当量的二异丙基乙胺(N,N-Diisopropylethylamine，DIPEA)溶解于DMF并添加，在室温下反应2小时后，用DMF及甲醇进行了2次洗涤。通过反复上述过程分别制备了RRW-树脂、RRWW-树脂、RRWWW-树脂以及RWR-树脂。
在上述树脂-肽基本骨架结合体中加入溶解于DMF的光敏剂Ce4以及HBTU/HOBt/DIPEA后，将所述混合液反应12小时并进行抽滤，然后按DMF、甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。
通过上述过程，形成期望合成的肽骨架后，利用将TFA/EDT/茴香硫醚(thioanisole)/TIS/水以90/2.5/2.5/2.5/2.5稀释的溶液进行2小时处理，从而去除上述生成的肽残留基团的保护基团并将肽从树脂分离。此后，在反应液中加入凉的乙醚(diethyl ether)，从而使肽沉淀，并进行离心，然后对制得的生成物进行了干燥。
将最终制得的生成物溶解在DMSO并通过执行使用了Vydac Everest C18柱(250mm×22mm×10μm，美国)的反相HPLC进行了提纯。使用利用含有0.1％TFA的10％至75％(v/v)的乙腈溶液的水-乙腈线性梯度进行了溶出，并将提纯的生成物进行了冻结干燥。
根据如上所述制造出的结合体(实施例4)的化学结构如下述化学式3～6，光敏剂和色氨酸通过精氨酸被连接。
[化学式3]
Figure BDA0001942749670000261
[化学式4]
Figure BDA0001942749670000262
[化学式5]
Figure BDA0001942749670000263
[化学式6]
Figure BDA0001942749670000264
4.2.包含光敏剂、精氨酸、色氨酸的结合体的特性
1)分子量以及荧光释放
使用LC/MSD测定了分子量，使用UV/Vis光谱仪测定了吸光度。
评价结果，上述制得的提纯的本发明的结合体的分子量分别测定为：Ce4-RRW是1,051g/mol；Ce4-RRWW是1,237g/mol；Ce4-RRWWW是1,423g/mol；Ce4-RWR是1,051g/mol(参照图15)，分别在403nm～404nm、666～668nm下表现出了最大吸收和最大发光(参照图16的A以及图16的B)。
2)由酶活性引起的荧光信号的增加
将上述制得的Ce4-RRWW、Ce4-RRWWW分别准备1nmol并溶解于PBS溶液。将50nmol的胰蛋白酶分别与各结合体混合，并在37℃下观察了随时间流逝时荧光变化。
根据图17所示，可以观察到进行胰蛋白酶处理后两个结合体全部都恢复了荧光，在经过4小时后，与初始荧光相比，Ce4-RRWW的荧光增加了约1.6倍，Ce4-RRWWW的荧光增加了4.3倍。
将上述制得的Ce4-RRW在93.5μl醋酸钠缓冲液(20mM sodium acetatebuffer，1mMEDTA，pH 5.0)中稀释后，在酶处理试料中混合了97pmol的组织蛋白酶B(cathepsin B,Calbiochem,美国)，在缓冲液处理组中混合了等量的醋酸钠缓冲液。并将所述混合液(100μl)在37℃下培养了2小时。
3)血清内稳定性
将本发明的结合体Ce4-RRW与含有10％的FBS的PBS混合并进行培养，从而对血清内稳定性进行了评价。溶液内所述结合体的最终浓度调节为2μM。将所述溶液在室温下反应4小时，然后放入多功能酶标仪得出了荧光光谱(λEx.610nm,λEm.620～850nm)结果。
根据图18，可以确认血清蛋白质对于Ce4-RRW的荧光不产生影响。
4)细胞培养
从ATCC获取了人类癌KB细胞株，将所述KB细胞在包含10％的FBS以及1％的青霉素/链霉素的最小必需(Minimum Essential Media，MEM)培养基(Gibco)在37℃、5％二氧化碳条件下进行了培养。
5)结合体的特异性细胞摄入及基于此的荧光活性
将KB细胞在4-well Lab-Tek腔的各个well内分别放入2×105个并培养24小时以使细胞良好地吸附，此后将原培养基替换成500μl的溶有Ce4-RRW结合体(2μM)的新鲜的培养基，并将上述细胞分别培养了4小时。
最后，将细胞用培养基洗涤3次后，使用共聚焦激光显微镜获得了近红外荧光图像(λEx.405nm,λEm.625～754nm)。
进行了用于掌握本发明的Ce4-RRW结合体的细胞内位置的实验。在8-well Lab-Tek腔中每个每个well上分别放入5×104个KB细胞并培养24小时以使细胞良好地吸附后，加入2μM的Ce4-RRW培养4小时，然后进行了3次洗涤。此后将原培养基替换为包含100nM的LysoTracker Blue DND-22染料的新鲜的培养基，并将上述细胞培养了45分钟。对所述试料，利用共聚焦激光显微镜在Ce4-RRW结合体(λEx.405nm,λEm.625～754nm)以及溶酶体荧光探针(LysoTracker)(λEx.405nm,λEm.411～497nm)中获得了荧光影像。
根据图19，可知用Ce4-RRW对KB细胞进行处理时，会被引入细胞内从而呈现出强荧光信号，尤其当将本发明的Ce4-RRW进行处理时，随着培养时间的流逝，细胞内的荧光强度进一步增加，并且在标的细胞内，荧光产生得到了激活。
根据图20，已确认当把特异性染色细胞内的溶酶体的溶酶体荧光探针(Lysotracker)和Ce4-RRW结合体一并培养时，存在共同被染色的部位，并且从将荧光照片重叠后观察时其位置也准确地重叠来看，可以确认Ce4-RRW结合体被摄入至细胞内部后位于溶酶体，并借助酶而被激活。
[实施例5]包括二硫键以及精氨酸的光敏剂-肽结合体的制造
在实施例5中，制造了借助色氨酸而被消光的光敏剂通过细胞内的还原剂和酶的复合作用而分解时，消光效果被解除的同时可以产生强荧光信号，同时光动力学治疗效能也被恢复的结合体。
5.1.还原剂/酶复合反应型结合体的合成
结合体作为同时具有借助还原剂而分解的二硫键以及包含借助酶而分解的精氨酸(arginine)的结合的结合体的模型，合成了Ce4-CRRCW结合体。
通过利用了ASP48S的Fmoc固状肽合成法(solid phase peptide synthesis,SPPS)制造了肽，其制造过程如下。
在Trt-Cl树脂(GL Biochem，中国)中将结合有保护基团(Fmoc)的氨基酸与含有20％哌啶(piperidine)的DMF强力混合并在室温下10分钟期间反应2次后，用DMF和甲醇进行了2次洗涤。此后加入溶解于DMF的8当量的氨基酸以及8当量的HBTU/8当量的HOBt/16当量的二异丙基乙胺(N,N-Diisopropylethylamine，DIPEA)并在室温下反应2小时后，用DMF及甲醇进行了2次洗涤。通过反复上述过程制备了CRRCW-树脂。
在上述树脂-肽基本骨架结合体中加入溶解于DMF的光敏剂Ce4以及HBTU/HOBt/DIPEA后将所述混合液反应12小时并进行抽滤后，按DMF、甲醇以及DMF的顺序进行了洗涤。
通过上述过程，形成期望合成的肽骨架后，利用将TFA/EDT/茴香硫醚(thioanisole)/TIS/水以90/2.5/2.5/2.5/2.5稀释的溶液处理2小时，从而去除上述生成的肽残留基团的保护基团并从肽树脂进行了分离。此后，在反应液中加入凉的乙醚(diethyl ether)，从而使肽沉淀，并进行离心，然后对制得的生成物进行了干燥。
为了生成环型二硫键，将制得的生成物以0.5mg/mL的浓度溶解于水/乙腈(9:1，v/v)后放入醋酸铵溶液(ammonium acetate)并搅拌(肽溶液：醋酸铵＝9:1，v/v)。并用埃尔曼(Elman)试剂确认了反应的进行程度。
将最终制得的生成物溶解在DMSO并通过执行使用了Vydac Everest C18柱(250mm×22mm×10μm，美国)的反相HPLC来进行了提纯。使用利用含有0.1％TFA的10％至75％(v/v)的乙腈溶液的水-乙腈线性梯度进行了溶出。提纯的生成物则进行了冻结干燥。
根据如上所述制造出的结合体Ce4-CRRCW的化学结构如下述化学式7。
[化学式7]
Figure BDA0001942749670000291
5.2.包含光敏剂、精氨酸、色氨酸的结合体的特性分析
1)分子量以及荧光释放
使用LC/MSD测定了所合成的Ce4-CRRCW的分子量，使用UV/Vis光谱仪测定了吸光度。在402nm、508nm以及665nm测定出了最高吸光峰值。
评价结果，上述制得的提纯的本发明的结合体的分子量为1,255g/mol(参照图21)，最大吸收和最大发光分别出现在402nm、665nm(参照图22)。
2)由还原剂以及酶作用引起的荧光信号的增加
另外，为了分析还原剂/酶复合反应型Ce4-CRRCW结合体对还原剂的反应性，将结合体用2μM以及5mM的作为还原剂的DTT处理6小时后放入多功能酶标仪得出了荧光光谱(λEx.400nm,λEm.650～850nm)结果。为了分析对酶的反应性，将结合体用组织蛋白酶B、S、L、S处理，或者用将作为组织蛋白酶抑制剂的E64预处理过的组织蛋白酶B处理6小时，并放入多功能酶标仪得出了荧光光谱(λEx.400nm,λEm.620～850nm)结果。为了分析还原剂/酶复合反应，将5mM的DTT和组织蛋白酶B一起处理6小时，并放入多功能酶标仪得出了荧光光谱(λEx.400nm,λEm.620～850nm)结果
根据图23，可以观察到当对结合体用5mM的DTT或者组织蛋白酶B单独处理时各自的荧光产生得到了增加，并且用5mM的DTT和组织蛋白酶B一并处理时，可以确认相比对照组，荧光强度足足高出26倍。仅用5mM的DTT处理时表现出10.6倍的荧光强度的增加。利用作为细胞外还原剂浓度的2μM浓度的DTT处理时，荧光强度没有任何增加，这表示当结合体进入细胞内时，由于细胞内还原剂以及酶的单独以及复合作用，结合体的荧光以及反应性氧的生成特性被激活。
3)细胞培养
将SCC7癌细胞株在包含10％的FBS以及1％的青霉素/链霉素的Dulbecco’smodified Eagle’s medium(DMEM)培养基(Gibco)中在37℃、5％二氧化碳条件下进行了培养。
4)结合体的癌细胞内摄入以及基于此的荧光活性分析
将SCC7癌细胞在4-well Lab-Tek腔中每个well内分别放入2×105个并培养24小时以使细胞良好地吸附，此后将原培养基替换成500μl的溶有2μM的Ce4-CRRCW结合体的新鲜的培养基，并将上述细胞分别培养了2小时至6小时。最后，将细胞用培养基洗涤3次后，使用共聚焦激光显微镜获得了近红外荧光图像(λEx.633nm,λEm.646～753nm)。
并且，进行了用于分析结合体是否移动至细胞内还原剂的浓度高的溶酶体的实验。在8-well Lab-Tek腔中每个well上分别放入5×104个SCC7细胞并培养24小时以使细胞良好地吸附后，加入2μM的结合体并进行培养6小时，且进行了3次洗涤。此后将原培养基替换为包含100nM的LysoTracker Blue DND-22染料的新鲜的培养基，并将上述细胞培养了45分钟。对所述试料，利用共聚焦激光显微镜获得了针对结合体(λEx.405nm,λEm.625～754nm)以及溶酶体荧光探针(LysoTracker)(λEx.405nm,λEm.411～497nm)的荧光影像。
根据图24可知，将作为结合体的Ce4-CRRCW处理至SCC7时，在被摄入至细胞内后呈现出了强荧光信号，尤其是随着培养时间的增加，细胞内的荧光强度进一步增加，由此可知在癌细胞内部荧光的发生得到了激活。
根据图25，已确认当把特异性染色细胞内的溶酶体的溶酶体荧光探针(Lysotracker)和结合体的荧光一并培养时，存在共同被染色的部位，并且从将荧光照片重叠后观察时其位置也准确地重叠来看，结合体位于细胞内部的溶酶体内，并在其内部得到激活。
以上对本发明内容的特定部分进行了详细叙述，对于本领域的具有基本知识的人员而言，想必了解这种具体说明仅为优选地实施形态，本发明的范围不局限于此。因此本发明的实质的范围应当由权利要求及其等同物来定义。
Figure IDA0001970052840000011

Claims (15)

1.一种结合体，包括：
光敏剂；
肽，包含色氨酸；以及
可分解的连接子，将所述光敏剂以及所述肽通过共价键连接，
其中，所述光敏剂和所述肽的所述色氨酸的距离在2nm以内，所述可分解的连接子是从借助细胞内还原剂而分解的连接子、借助细胞内的酶而分解的连接子和在细胞内的pH4至pH5.5环境下分解的连接子中选择的任意一个。
2.如权利要求1所述的结合体，其中，
包含所述色氨酸的肽能够与从表皮生长因子受体1、表皮生长因子受体2、表皮生长因子受体3、表皮生长因子受体4中选择的1种以上的表皮生长因子受体特异性地结合。
3.如权利要求1所述的结合体，其中，
包含所述色氨酸的肽是具有序列号1的氨基酸序列的肽。
4.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述连接子是线型二硫键或者环型二硫键。
5.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述连接子是肽，是精氨酸、赖氨酸或者其组合，所述连接子由3个以下的氨基酸序列构成。
6.如权利要求1所述的结合体，其中，
包含所述色氨酸的肽，在肽内连续地存在一个以上至三个以下的色氨酸。
7.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述连接子是二硫键以及双精氨酸以环型的形态位于光敏剂与肽之间的连接子；或者是二硫键以及双赖氨酸以环型的形态位于光敏剂与肽之间的连接子。
8.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述结合体由化学式1表示，
[化学式1]
Figure FDA0002977778100000021
9.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述结合体由化学式2表示，
[化学式2]
Figure FDA0002977778100000022
10.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述结合体由化学式3表示，
[化学式3]
Figure FDA0002977778100000023
11.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述结合体由化学式4表示，
[化学式4]
Figure FDA0002977778100000024
12.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述结合体由化学式5表示，
[化学式5]
Figure FDA0002977778100000031
13.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述结合体由化学式6表示，
[化学式6]
Figure FDA0002977778100000032
14.如权利要求1所述的结合体，其中，
所述结合体由化学式7表示，
[化学式7]
Figure FDA0002977778100000033
15.一种将结合体作为有效成分而包含的光动力学诊断或者治疗用组合物，其中，所述结合体为如权利要求1至14中任意一项所述的结合体。
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