CN114555623A - 尿激酶纤溶酶原活性剂受体靶向肽 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种uPAR靶向肽缀合物，其包含通过共价键连接的荧光团、与uPAR结合的肽和连接基基团，其中在外科手术期间，uPAR靶向肽缀合物可用作荧光探针以进行实时光学成像并划定癌症肿瘤或癌细胞转移边界。

Description

尿激酶纤溶酶原活性剂受体靶向肽
技术领域
本发明涉及旨在施用于人或动物体内的具有最佳药动学特征的uPAR靶向肽缀合物。此外，提供了用于疾病的光学成像以及用于疾病的诊断和/或治疗的uPAR靶向肽缀合物和包含该uPAR靶向肽缀合物的组合物。
背景技术
外科手术仍是针对癌症疾病的最常见治疗方法。如果可能，则癌症外科手术的目标是去除所有癌细胞，因为癌症治疗的最佳预后是完全去除癌性组织。为了实现这一点，将不可避免地一并去除肿瘤周围的一定量的健康组织。通过显微镜法仔细检查所去除的全部组织，从而使得病理学家能够判定疾病的扩散程度和特征。因此，划定活性肿瘤边缘边界是一项重要挑战，并且通常在术前利用计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)来标测肿瘤扩散的位置和程度。然而，缺乏实时成像工具、低分辨率和CT的有害电离性将这些技术限制于连续实时术中成像，即，其中当手术正在进行时，无法以便捷的设置来进行正电子发射断层扫描(PET)或CT成像。
相反，荧光成像以高时间分辨率和高空间分辨率实现实时非侵入式体内可视化，且无需让受试者或手术室人员暴露于有害电离辐射中。因此，它可用于对活体生物和组织进行安全、简单、实时且非常高分辨率的可视化。
胶质母细胞瘤(GBM)是一种严重的癌症疾病，基本上无法治愈，并且即使是利用激进的多模态治疗，中位生存期也是令人沮丧的14个月。因此，多学科正努力理解该疾病的复杂性并找到治愈方法。然而，在过去二十年中，GBM治疗方案的进展一直不大并且在延长总体生存期方面陷入停滞。外科手术仍然是治疗关键，但外科手术不是孤立的，术后存活率由切除范围确定。边缘不规则的GBM具有浸润性质，并且卷须和单个细胞延伸到明显健康的组织中，这使得难以清晰识别并完全切除，同时避免切除健康的相邻组织。最近美国食品和药物管理局(FDA)已经批准将5-ALA用于GBM切除，并且其当在肿瘤中被代谢成原卟啉IX时，其发出发射峰在635nm处的荧光。然而，代谢物并不与肿瘤细胞结合而是扩散，由此用5-ALA无法看到肿瘤的清晰边界划定，并且还发现5-ALA改善胶质瘤外科手术的证据少至极少。亚甲蓝、荧光素钠和吲哚菁绿(ICG)已经FDA批准供人使用，但受到可见光谱中的短波长发射的影响(ICG在NIR光谱中)并且无癌症特异性。由于在健康组织中的自体荧光、组织吸光度、散射、光漂白和非特异性摄入，这限制了被表示为肿瘤背景比(TBR)的渗透率、分辨率和对比度。因此，非常需要用于有效划定GBM边界的新型外科手术成像技术。
靶向分子荧光成像即是此类工具。通过将高亲和性靶向分子与荧光染料组合，可以高TBR对癌组织进行实时特异性靶向和可视化，并且为外科医生在术中区分癌性组织与健康组织提供持续指导和帮助。
尿激酶型纤溶酶原活化剂受体(uPAR)是在GBM和若干其它癌症中具有很高表达的众所周知的癌症靶标，其它癌症包括但不限于乳腺癌、头颈部鳞状上皮细胞癌、肾细胞癌和肺癌。受体与侵入和癌细胞转移有关，这是癌症的标志之一，并且表达量与癌症的侵袭性和不良生存预后相关。另外，其通常在侵入前缘处具有高表达，包括激活具有慢性炎症的肿瘤间质微环境，使其成为具有吸引力的靶标，从而实现准确的边缘可视化和肿瘤边界划定。例如，在WO 2016/041558中描述了一种基于与uPAR结合的荧光标记肽的探针。然而，仍然存在改进空间并且需要用于癌症切除的改进方法。
本发明的一个目的是提供一种用于在癌症疗法中在成像应用和/或外科手术之前施用的改进的受体靶向缀合物。
发明内容
上述目的通过尿激酶型纤溶酶原活化剂受体(uPAR)靶向肽缀合物来实现，其包含：
-荧光团；
-与uPAR结合的肽；和
-连接基基团，其中荧光团、与uPAR结合的肽和连接基基团通过共价键连接，其中连接基基团包括低聚乙二醇或其它短低聚物，诸如低聚甘油、低聚乳酸或任选地通过共价键连接到至少一个氨基酸的碳水化合物。连接基基团提供uPAR靶向肽缀合物的增溶特性并且相对于uPAR受体提供增强的结合特性。
关于上述内容，应当强调的是，WO2016/041558中所示的探针并未提供最佳药动学特征或靶标亲和性，这由于较低的受体结合率和较慢的血浆清除率而降低所记录的成像中的最佳对比度和特定对比度。在WO2016/041558中提及了不同另选方案的TBR值，然而，该值在为根据本发明的uPAR靶向肽缀合物提供的水平之内和之外都有存在。总之，根据本发明的受体靶向缀合物提出一种针对某些施用类型和适应症提供最佳药动学特征的新型探针。
附图说明
图1示出了uPAR靶向肽缀合物IRDye800CW-AE344的分子结构。
图2示出了对IRDye800CW-AE344的uPAR亲和性的表面等离子体共振分析，上部线条(1)表示IRDye800CW-AE344：uPARwt，下部线条(2)表示AE105：uPARwt。
图3示出了探针IRDye800CW-AE344在处于777nm的吸收峰(实线)、处于784nm的激发峰(点划线)以及处于794nm的发射峰(短划线)表现出的光谱分析，得到10nm的斯托克斯位移。
图4示出了IRDye800CW-AE344在连续激光暴露之后的光稳定性。
图5示出了IRDye800CW-AE344在原位GBM中的体内成像特异性。上部行显示完整脑(NIR图像，曝光时间500ms)，而下部行显示横切脑(NIR图像，曝光时间333ms)(动物id 029，6nmol，3小时)。
图6示出了经H&E染色、NIR显微镜法、H&E与NIR合并以及uPAR免疫组织化学法染色的脑的组织结构。箭头指向脑底部的小面积软脑膜癌细胞转移，并且在H&E染色和NIR显微镜法两者中可见(12nmol IRDye800CW-AE344，24小时)。
图7示出了GBM在横切脑上的体外动态NIR成像。图片中的箭头指示针对给定剂量的IRDye800CW-AE344的最高TBR(最大)(所有数据均基于333ms曝光时间的图像)。
图8示出了针对不同剂量IRDye800CW-AE344的肿瘤背景比，这些线条分别表示剂量1mmol(●)、3nmol(■)、6nmol(▲)和12nmol
Figure BDA0003470465910000041
。
图9示出了针对不同剂量的IRDye800CW-AE344的肿瘤平均荧光强度(MFI)，不同的条形分别表示剂量1nmol、3nmol、6nmol和12nmol。
图10示出了与TBR相比且IRDye800CW-AE344为6nmol时的肿瘤和背景平均荧光强度，浅灰色(左)条形表示肿瘤，深灰色(右)条形表示背景，并且线条表示TBR。
图11示出了横切脑在注射后1小时的NIR图像(左至右)：3nmol IRDye800CW-AE344(活性)、3nM IRDye800CW-AE344+600nmol AE120(阻断)和3nM IRDye800CW-AE354(突变)。
图12示出了归一化TBR(基准：活性探针)。黑色条形表示IRDye800CW-AE344(活性)，浅灰条形表示AE120(阻断)，并且深灰条形表示IRDye800CW-AE354(突变)。
图13示出了器官的表示3nmol的IRDye800CW-AE344在注射后1小时的荧光强度和生物分布的图像(曝光时间：333毫秒)。小肠处的箭头指示近侧端部。肾过饱和，因此超出色彩校准条的范围。
图14示出了针对IRDye800CW-AE344的荧光信号的量化。左y轴表示平均荧光强度。右y轴表示相对生物分布。此外，黑色条形表示平均信号强度(a.u.)，并且灰色条形表示相对生物分布(由于摄入量最高，数据用皮肤作为基准进行归一化)。
图15示出了图像(白光、NIR和合并)。
图16A显示了横切脑在注射后1小时的NIR图像，其中图16B显示了针对肿瘤和背景的平均荧光强度，并且图16C显示了对应的归一化TBR值。
图17示出了在注射后1小时具有所有数据的生物分布和剧毒性。
具体实施方式
下文提出并进一步讨论了本发明的一些具体实施方案。
根据本发明的一个实施方案，连接基基团包括低聚乙二醇或其它短低聚物，诸如低聚甘油、低聚乳酸或任选地通过共价键连接到至少一个氨基酸的碳水化合物。在本发明的一个实施方案中，连接基基团包括低聚乙二醇，其通过共价键连接到至少一个氨基酸，其中至少一个氨基酸可共价连接到形成肽键的另一个氨基酸，并且因此可形成低聚肽。因此，在本发明的一个实施方案中，连接基基团包括通过共价键连接到至少一个低聚肽的低聚乙二醇。因此，连接基基团可为亲水性连接基基团。此外，至少一个氨基酸可选自蛋白原氨基酸和非蛋白原氨基酸，其包括天然氨基酸和合成氨基酸。关于此，还可能提及天然氨基酸可包括：C-α烷基化氨基酸，诸如氨基异丁酸(Aib)；N-烷基化氨基酸，诸如肌氨酸；以及天然存在的β-氨基酸，诸如β-丙氨酸。此外，合成氨基酸可包括具有非蛋白原侧链的氨基酸，诸如环己基丙氨酸、γ氨基酸和二肽模拟物。术语“二肽模拟物”可被解释为通过显示两个氨基酸侧链来模拟二肽的有机分子，例如具有将两个残基连接在一起的还原酰胺键。具有非蛋白原侧链的氨基酸也可包括具有chi-空间中的受限运动的侧链的氨基酸。术语“chi空间中的受限运动”可被解释为侧链基团的旋转灵活性受限。低聚肽可由最多五十个氨基酸组成，并且可包括二肽、三肽、四肽和五肽，并且还可由蛋白原氨基酸和非蛋白原氨基酸构成。
根据本发明的一个具体实施方案，连接基基团是-Glu-Glu-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-。本申请全文使用术语O2Oc，其意指化学实体-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-。因此，O2Oc-O2Oc意指-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-。此外，本发明不限于通过酰胺键连接的乙二醇单元，实际上每个乙烯单元可通过醚或酰胺或原则上其它共价键连接。乙二醇链可具有不同长度，即，重复单元的数目可在n＝1-10的范围内，其中n是对应于-(CH2-CH2-O)n-的连接基中的重复单元的数目。此外，连接基中的氨基酸不限于谷氨酸(Glu)，具有酸性侧链的氨基酸即天冬氨酸的其它组合可包括在内，诸如Asp-Asp、Glu-Asp或Asp-Glu。此外，其也可为其它亲水性氨基酸的组合，即，例如丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、组氨酸(His)或赖氨酸(Lys)的组合。
根据本发明的另一个实施方案，荧光团可为近红外I(NIR-I)荧光团或近红外II(NIR-II)荧光团。荧光团可选自以下项：ICG、亚甲蓝、5-ALA、原卟啉IX、IRDye800CW、ZW800-1、Cy5、Cy7、Cy5.5、Cy7.5、IRDye700DX、Alexa fluor488、荧光素异硫氰酸、Flav7、CH1055、Q1、Q4、H1、IR-FEP、IR-BBEP、IR-E1、IR-FGP、IR-FTAP。
此外，根据本发明的另一个具体实施方案，荧光团可为选自以下项的NIR-I荧光团：ICG、亚甲蓝、5-ALA、原卟啉IX、IRDye800CW、ZW800-1、Cy5、Cy7、Cy5.5、Cy7.5、IRDye700DX、Alexa fluor488、荧光素异硫氰酸酯。根据本发明的另一个具体实施方案，荧光团可为选自以下项的NIR-II荧光团：Flav7、CH1055、Q1、Q4、H1、IR-FEP、IR-BBEP、IR-E1、IR-FGP、IR-FTAP。根据本发明的一个具体实施方案，荧光团是IRDye800CW。此外，本发明的荧光团可具有如下NIR光吸收范围：对于NIR-I荧光团，700nm至1200nm、700nm至950nm；或对于NIR-II荧光团，1000nm至1200nm。类似地，荧光团可具有如下NIR光发射范围：对于NIR-I荧光团，700nm至1200nm、700nm至950nm；或对于NIR-II荧光团，1000nm至1200nm。NIR-荧光团具有提供在用于荧光成像时生成深层组织图像的窗口的优点。
在本发明的另一个实施方案中，受体结合肽可选自以下项：
-Asp-Cha-Phe-ser-arg-Tyr-Leu-Trp-Ser；和
-Asp-Cha-Phe-ser-arg-Tyr-Leu-Trp-Ser-NH2。
此外，本发明的共价键可选自以下项：酰胺、氨基甲酸酯、硫脲、酯、醚、胺、三唑或通常用于通过固相合成来偶联化学部分的任何其它共价键。
根据本发明的一个具体实施方案，uPAR靶向肽缀合物具有下式：
Figure BDA0003470465910000071
根据本发明的另一个具体实施方案，uPAR靶向肽缀合物对应于IRDye800CW-Glu-Glu-O2Oc-O2Oc-Asp-Cha-Phe-D-Ser-D-Arg-Tyr-Leu-Trp-Ser-OH。Cha可被解释为β-环己基-L-丙氨酸。
在本发明的另一个实施方案中，uPAR靶向肽缀合物具有小于100nM、优选地小于50nM、优选地小于25nM的uPAR结合亲和性。
如上所提示，根据本发明的uPAR靶向肽缀合物表现出针对某些施用类型和适应症的最佳药动学特征。
参考药动学，根据本发明的一个实施方案，uPAR靶向肽缀合物适于：
-系统性地施用于人或动物体内；
-至少在4,500分钟、优选地1,200分钟、更优选地600分钟、甚至更优选地300分钟内提供受体结合；
-从血浆中去除以使缀合物与受体的结合可见，其被测量为血浆半衰期，即，血浆中的浓度降低50％所花费的时间，并且其中血浆半衰期的最大值为4,500分钟，优选地为1,200分钟，更优选地为600分钟，甚至更优选地为300分钟；
-提供持续至少30分钟的受体结合；
并且其中受体结合亲和性、其达到所需受体结合所花费的时间、受体结合的持续时间以及血浆半衰期转化为至少1.5的TBR(肿瘤背景比)，并且在施用于人或动物体之后于4,500分钟内、优选地1,200分钟内、更优选地600分钟内、甚至更优选地300分钟内达到该水平，并且在已经获得该水平后保持在1.5以上至少30分钟。
根据又一个实施方案，蛋白质(P)-配体(L)复合物发生的速度可被定义为
Figure BDA0003470465910000081
其中Kon是结合反应常数，并且其中Koff是蛋白质-配体复合物的解离常数，并且其中Kon＞1×103M-1s-1和/或Koff＜1×10-1s-1。
根据又一个实施方案，受体亲和性被测量为IC50，这是在3000nM或更小时，配体/受体结合亲和性的测量值。
此外，根据一个具体实施方案，在体外测量时，在30分钟的时间内，即达到该受体结合亲和性。
此外，根据又一个实施方案，使用高于1.5的TBR进行测量时，在施用于人或动物体之后，受体结合持续至少120分钟，优选地至少300分钟。
根据另一方面，本发明涉及一种用于治疗疾病的uPAR靶向肽缀合物。
根据再一方面，本发明涉及一种用于疾病的光学成像或荧光成像(FLI)的uPAR靶向肽缀合物。荧光成像以高时间分辨率和高空间分辨率实现实时非侵入式体内可视化以及体外可视化，且无需让受试者暴露于有害电离辐射中。因此，它可用于对活体生物和组织进行安全、长时间和重复的可视化。因此，可以每人0.1mg至1000mg的剂量向受试者施用本发明的uPAR靶向肽缀合物。
在甚至再一方面，本发明涉及一种包含uPAR靶向肽缀合物以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
本发明也涉及本发明的药物组合物用于疾病治疗的用途。此外，本发明涉及一种用于疾病检测和/或量化的药物组合物。更进一步地，本发明涉及一种用于诊断疾病的药物组合物。本发明也涉及一种用于疾病的光学成像或荧光成像(FLI)的药物组合物。
在本发明的一个实施方案中，疾病可选自癌症和炎性疾病。此外，由于uPAR是在GBM和若干其它癌症中具有很高表达的众所周知的癌症靶标，因此本发明靶向的癌症可以是GBM，包括其它脑癌(包括中心和外周神经系统)、乳腺癌、头颈部鳞状上皮细胞癌和其它头颈部癌(例如，唇癌、口腔癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌、下咽癌)、肾细胞癌、肺癌、肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、甲状腺癌、膀胱癌、食道癌、胰腺癌、肾癌、子宫癌、子宫颈癌、黑素瘤、卵巢癌、胆囊癌、多发性骨髓癌、睾丸癌、外阴癌、唾腺癌、间皮瘤、阴茎癌、卡波西氏肉瘤、阴道癌、神经内分泌肿瘤和神经内分泌癌。
在本发明的一个实施方案中，癌症可选自以下项：胶质瘤、胶质母细胞瘤或其它脑癌、胰腺癌、头颈部癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、神经内分泌肿瘤、神经内分泌癌、前列腺癌。
在本发明的一个实施方案中，癌症选自以下项：胶质瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌、头颈部癌、结肠直肠癌、肺癌和乳腺癌。此外，在本发明的一个具体实施方案中，癌症是胶质瘤或胶质母细胞瘤。在本发明的另一个具体实施方案中，癌症是胰腺癌。在本发明的再一个具体实施方案中，癌症是乳腺癌。
此外，针对癌症组织的选择性也是与本发明相关的关注领域。根据本发明的一个具体实施方案，受体靶向缀合物对癌症组织具有至少60％、优选地高于70％、更优选地高于80％并且最优选地高于90％的选择性。因此，缀合物产物的特征在于对癌症组织具有优选至少60％或70％或80％或90％的选择性。这是由于其特性中的一些或全部所致。选择性被理解为外科医生所去除的组织样本的相对数目，外科医生基于其光强度/对比度相信这些组织样本是癌症，并且此后确认确实是癌症。一个示例是外科医生去除了10个自己相信是癌症的组织样本，其中七个样本经组织学确认是癌症，从而得到7/10的选择性，即70％。如果外科医生相信所去除的组织样本全部是癌症并且经证明是癌症，则选择性为100％。如果外科医生所去除的组织样本中仅一半是癌症而另一半是正常组织，则选择性为50％。
在本发明的另一个实施方案中，炎性疾病选自关节炎和动脉粥样硬化。
在再一方面，提供了一种用于划定癌症肿瘤或癌细胞转移边界的药物组合物。在甚至再一方面，提供了一种用于荧光引导型肿瘤或癌细胞转移切除的药物组合物。在此方面，药物组合物可静脉注射地、局部地或表面地施用。uPAR靶向肽缀合物的浓度为每剂量单位0.1mg至1000mg。通常，根据本发明的uPAR靶向肽缀合物的浓度可另选地在以下范围内：每剂量单位0.001mg至1000mg，每剂量单位0.01mg至1000mg，每剂量单位0.1mg至1000mg，每剂量单位0.0001mg至500mg，每剂量单位0.001mg至500mg，每剂量单位0.01mg至500mg，每剂量单位0.1mg至500mg，每剂量单位0.0001mg至100mg，每剂量单位0.001mg至100mg，每剂量单位0.01mg至100mg，或每剂量单位0.1mg至100mg。
在再一方面，提供了一种光学成像方法，包括以下步骤：
(i)向靶组织施用uPAR靶向肽缀合物，其中uPAR靶向肽缀合物包含荧光团、受体结合肽和将荧光团共价连接到受体结合肽的连接基基团，其中受体结合肽与尿激酶纤溶酶原活化剂受体(uPAR)结合；
(ii)提供时间使uPAR靶向肽缀合物在靶组织中积聚并建立肿瘤/靶组织背景比；
(iii)用荧光团能够吸收的波长的近红外光照射靶组织；
(iv)检测荧光团发射的荧光并形成靶组织的光学图像。
如本文所用，术语“组织”是指分离的体外细胞和离体细胞和/或组织以及体内组织。在本发明的一个实施方案中，光学成像方法包括以下步骤：(i)在体内，向靶组织施用uPAR靶向肽缀合物。在本发明的另一个实施方案中，光学成像方法包括以下步骤：(i)在体外，向靶组织施用uPAR靶向肽缀合物。根据本发明的光学成像方法提供时间使uPAR靶向肽缀合物在靶组织中积聚以获得足够高的TBR，即施用后至多360分钟、180分钟、120分钟、90分钟、60分钟、45分钟、30分钟、15分钟、10分钟或5分钟。在一个具体实施方案中，uPAR靶向肽缀合物在靶组织中积聚的时间是施用后至多60分钟、优选地45分钟、优选地30分钟、优选地15分钟、优选地10分钟或优选地5分钟。此外，肿瘤/靶组织背景比为至少2。
在本发明方法的一个实施方案中，荧光团具有在700nm至800nm范围内的NIR光吸收。此外，荧光团具有在750nm至900nm范围内的NIR光发射。因此，在NIR光谱内，uPAR靶向肽缀合物在癌症中成功地可视化，并且具有更高的亮度和光稳定性。此外，本发明的uPAR靶向肽缀合物提供更高的TBR、药动学、信号强度和增加的水溶性。
在本发明的一个实施方案中，光学成像方法在体内进行。光学成像方法也可在体外进行。
在另一方面，提供了一种用于检测疾病的方法，包括以下步骤：
(i)向靶组织施用根据本发明的uPAR靶向肽缀合物；
(ii)提供时间使uPAR靶向肽缀合物在靶组织中积聚，设定时间范围为施用后1分钟至120分钟；
(iii)用uPAR靶向肽缀合物的荧光团能够吸收的波长的近红外光照射靶组织；
(iv)检测uPAR靶向肽缀合物的荧光团发射的荧光；和
(v)形成靶组织的光学图像或对疾病进行量化或两者的组合。
在甚至再一方面，提供了根据本发明的uPAR靶向肽缀合物或药物组合物用于癌症的光学成像的用途。也存在本发明的以下方面：提供uPAR靶向肽缀合物或药物组合物用于荧光引导型肿瘤或癌细胞转移切除的用途。
在本发明的一个实施方案中，用于检测疾病的方法在体内进行。用于检测疾病的方法也可在体外进行。在本发明的一个实施方案中，用于检测疾病的方法包括以下步骤：(i)在体内，向靶组织施用uPAR靶向肽缀合物。在本发明的另一个实施方案中，用于检测疾病的方法包括以下步骤：(i)在体外，向靶组织施用uPAR靶向肽缀合物。
另外多方面也涉及一种用于制备单位剂量的uPAR靶向肽缀合物制备物的部件套盒，包括：
-单位剂量量的根据本发明的药物组合物；
-任选地单位剂量量的至少一种药理学活性剂；
-任选地单位剂量量的佐剂；
-任选地单位剂量的至少一种药学上可接受的载体或赋形剂，
-用于在分配之前将单位剂量量彼此隔开的装置；和
-用于分配单位剂量量的装置。
在一个实施方案中，根据本发明的部件套盒提供在0.0001mg至1000mg范围内的单位剂量量的药物组合物。通常，根据本发明的单位剂量量的药物组合物可另选地在以下范围内：0.001mg至1000mg、0.01mg至1000mg、0.1mg至1000mg、0.0001mg至500mg、0.001mg至500mg、0.01mg至500mg、0.1mg至500mg、0.0001mg至100mg、0.001mg至100mg、0.01mg至100mg或0.1mg至100mg。此外，单位剂量量可以是0.1mL至10.0mL的总体积范围，优选地在0.1mL至5.0mL的范围内，优选地在0.5mL至5.0mL的范围内，优选地在0.5mL至1.0mL的范围内。
附图说明和示例
虽然单个特征可能包括在不同实施方案中，但这些特征也可以其它可能的方式组合，并且包括在不同实施方案中并不意味着特征的组合是不可行的。另外，单数引用不排除多个的情况。在本发明的上下文中，术语“一个”、“一种”不排除复数形式。
术语“缀合物”意指通过共价键彼此附接的两个或更多个分子，诸如肽和连接基和荧光团。
用于外科引导的最佳荧光探针的关键特征包括：在注射后短时间内(1小时)即实现高灵敏度、高特异性、高TBR；剂量小但荧光信号强；易于合成，产率高；以及其必须具有良好耐受性(无毒)。
SPR实验
通过如下方式对经纯化的人prouPAS356A进行共价固定：将溶解于10mM乙酸钠(pH5.0)中的12.5μg/ml蛋白质注射到CM5芯片上，该芯片已经用NHS/EDC(N-乙基-N′-[3-二乙基氨基)丙基]-碳二亚胺)预激活，从而实现表面密度＞5000共振单位(RU)，其对应于100fmol/mm2。偶联后，用1M的乙醇胺将传感器芯片去激活。以50μl/分钟的流速，使用10mMHEPES、150mM NaCl、包含0.05％(v/v)表面活性剂P20的3mM EDTA(pH7.4)作为运行缓冲液，在20℃下，从4nM至0.25nM测量作为分析物的经纯化的人uPAR的结合。在两次循环之间，通过两次连续的10μl注射0.5MNaCl中的0.1M乙酸/HCl(pH2.5)使传感器芯片再生。在相同运行条件下，测量所考虑的化合物的3倍稀释液对4nMuPAR的抑制作用。所有实验均在BiacoreT200仪器上进行。
结果
对于uPAR与固定uPA结合的每个抑制肽抑制特征，已经绘制出现有标准曲线并且所有计算过程均基于该标准曲线。表1总结了结果。
表1
Figure BDA0003470465910000131
从表1清楚地看出，已经生成第二代uPAR靶向肽，其令人惊讶地优于原始ICG-EE-AE105。与ICG衍生物相比，AE105的IRDye800CW变体(AE353)均靶向具有高亲和性的wtuPAR并且对受限的uPAR变体(阴性对照)显示出低亲和性。通过扩增亲水性连接基区，已经获得具有更好溶解度特性的产物，并且尽管已经将大的报告基团拴系到其N末端(IRDye800CW)，但母体肽(AE105)的原始高亲和性仍然得以维持。
生物化学特性和光学特性
本发明描述了基于具有图1所示的分子结构的uPAR靶向肽缀合物IRDye800CW-AE344的uPAR靶向荧光探针的合成。与uPAR的结合特性被保留，从而在对天然配体尿激酶型纤溶酶原活性剂的结合的竞争中得到IC50＝20nM±1.1nM(SD)(图2)。
vis/NIR光谱特性显示吸收峰处于λ最大吸收＝777nm处(图3)，并且略微向右偏移的激发特征的激发峰处于λ最大激发＝784nm处。荧光发射光谱显示发射峰处于λ最大发射＝794nm处，从而得到10nm的斯托克斯位移。光稳定性显示出在连续激光暴露1小时后，保留的荧光强度为84％，暴露2小时后为62％(图4)。
体内癌症成像特异性
在本发明的一个示例中，提供荧光探针IRDye800CW-AE344用于体内癌症成像。在可见光下，原位GBM在整个完整脑中不可见，但在NIR成像中被清晰地可视化(图5)。另外，在横切脑上，肿瘤范围可见并且相对于健康组织具有明确分界线，从而能够区分肿瘤组织与健康脑组织。组织学评估显示了肿瘤范围在H&E染色、NIR显微镜法和uPAR免疫组织化学染色上的共定位(图6)，从而证明本发明的光学探针凭借高灵敏度(所有肿瘤都发荧光)和高特异性(所有荧光信号都是肿瘤组织)而真正靶向生物标志物/肿瘤。
对于荧光引导型外科手术(FGS)，外科医生依赖于清晰识别(信号强度)和区别(TBR)。12nmol的较高剂量显示出类似的高TBR6.7，但代价是以下两者：峰值时间延迟15小时和肿瘤MFI在6nmol时降低至58％。因此，理想探针和最佳剂量应同时导致高强度和高TBR。
与现有技术相比，uPAR靶向肽结合物提供更好的水溶性、更高的信号强度和增大的TBR。因此，在注射6nmol之后的1小时至12小时，本发明的荧光探针以高于4.5的高TBR安全地可视化GBM，这实现了使用灵活性并且完全符合外科标准工作流程，其中一旦建立静脉通道，即可在外科手术前短时间内例如在准备手术/麻醉诱导时注射探针。当外科手术开始并且持续整个长时间手术时，将达到有用的时间窗口。在注射6nmol后3小时观察到7.0的最大TBR，具有高绝对信号强度。此外，为了让荧光探针有时间从循环中离开并定位在肿瘤中而延长温育时间将非常不切实际，并且不符合现行临床工作流程，并且需要患者在手术前若干天另行来院。同样，临时被告知外科手术推迟或取消并不少见。
动态成像
在另一个示例中，对横切面上的原位GBM进行动态成像显示出所有四种剂量(1nmol、3nmol、6nmol和12nmol)下清晰的肿瘤可视化。在注射6nmol的剂量后3小时观察到最大TBR(7.0)(图7)。其它所测试的剂量分别于0.5小时、1小时和15小时显示出最大TBR为4.4(1nmol)、6.6(3nmol)和6.7(12nmol)(图8)。针对1nmol、3nmol、6nmol和12nmol的剂量，对应的肿瘤平均荧光强度(MFI)分别为29、77、82和48(a.u.)(曝光时间333ms)。因此，观察到荧光强度和剂量之间的相关性，强度(肿瘤和背景两者)随着剂量增大而增大(图9)。肿瘤和背景两者中的MFI在注射之时最高，并且随着时间推移而持续减小。有趣的是，在6nmol下，TBR从1小时处的4.7初始增加至3小时处的7.0，然后分别在6小时处和12小时处降低至6.1和4.5。同时，肿瘤MFI持续降低，从1小时处的108(a.u.)降低至3小时处的82(a.u.)，这对应于24％的降低(图10)。在同一时间点，背景MFI从24(a.u.)降低至11(a.u.)，这对应于54％的降低，因此TBR的增大是由于与1小时至3小时之间的肿瘤清除率相比更高的背景清除率。
体内结合特异性
对于患有原位GBM的动物，竞争性地阻断以及施用对照配体(IRDye800CW-AE354；未结合，乱序重排肽)显示出相比于活性探针更低的信号强度(图11)。针对接受活性探针、阻断探针或乱序重排探针的基团的归一化TBR值分别是1.00(基准值)、0.70(p＝0.006)和0.52(p＝0.001)(图12)。
药动学和毒理学
在1小时处，肾表现出1,236(a.u.)的最高MFI，然后肺、皮肤和肝分别表现出101(a.u.)、99(a.u.)和88(a.u.)的最高MFI。相比之下，肿瘤表现出65(a.u.)的信号，并且脑表现出19(a.u.)的信号(图14)。生物分布显示主要积聚在皮肤和肾中，并且主要器官的归一化摄入量为：皮肤＝100(基准)，肾＝38.8，肺＝4.2，心脏＝0.4，脾＝0.4，肝＝12.2，胰腺＝3.4，结肠＝4.0，小肠＝11.2，心室0.9，脑＝0.7，肿瘤＝0.1。小肠中的信号仅限于近侧小肠/肠内容物，并且在远侧部分中仅见到适度的信号(图13，并且也在图17A中示出)。
在图17中，示出了生物分布和剧毒性。所有数据均为注射后1小时。在17A中，如图13所示，示出了器官的图像，其表示3nmolIRDye800CW-AE344的荧光强度和生物分布(曝光时间：333毫秒)。小肠处的箭头指示近侧端部。肾饱和，因此超出色彩校准条的范围。在17B中，示出了肝组织结构(H&E染色)。此外，在17C中，示出了肾组织结构(H&E染色)。在组织学上，肝组织的小叶构造正常，没有炎症、纤维化、胆汁淤积或沉积物。肾组织的保留肾小球和肾小管正常，没有萎缩、炎症或纤维化。
荧光信号的量化(数据用皮肤进行归一化并作为基准)示于17D中。在17E中，显示了血浆稳定性，其通过HPLC量化为曲线下面积(AUC)，归一化至0小时。探针在相关时间窗口内是稳定的，其中：在小鼠血浆中，在6小时和12小时之后，归一化曲线下面积(AUC)值分别为73％和67％完整探针；在人血浆中，在6小时和12小时之后，AUC值分别为61％和43％完整探针。
血浆稳定性
在黑暗中，于37℃下，将1,600ul的人血浆和小鼠血浆分别在2.4nmol IRDye800-AE344的10ul PBS中温育。于0小时、0.5小时、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时和24小时处收集200ul样本。通过添加200ul乙腈来沉淀血浆蛋白质，并将样本在10,000G下离心10分钟。收集上清液用于分析。分析来自人血清和小鼠血清两者的零时间上清液，在联接到QTOFImpact HD的RSLC Dionex Ultimate 3000(Thermo)仪器上，通过HPLC-MS建立完整IRDye800CW-AE344的保留时间。色谱柱是Aeris大孔径3.6μm C4色谱柱(150mm×4.6mm，Phenomenex)，并且溶剂体系是溶剂A：含0.1％甲酸的水；溶剂B：含0.1％甲酸的乙腈。方法：0分钟至1分钟5％溶剂B，1分钟至18分钟5％至50％溶剂B，流速为1mL/分钟。这显示完整分子在14分钟后洗脱。然后将方法、色谱柱和溶剂转移到另一Dionex Ultimate3000(Thermo)，其具有3100-FLD荧光检测器，该荧光检测器采用774nm作为激发波长并测量798nm处的发射。然后使用上述设置运行所有样本，并且使用14分钟峰处的AUC来计算小鼠血浆和人血浆两者在0小时处的降解度作为基准。
荧光引导型切除
在术前，肿瘤在WL图像和NIR图像上可见(图15的上排小图)。外科医生仅通过WL来辅助进行切除，直到外科医生认为所有肿瘤组织都被去除。然后通过FLI评估手术床，并且NIR信号显示出WL中未识别且未去除的残留肿瘤组织(图15的中排小图)。通过NIR辅助，外科医生识别出另外的肿瘤组织并将其切除，直到没有或非常少的NIR信号可见，这指示完全切除肿瘤(图15的下排小图)。也可于在线补充材料中取得荧光引导型外科手术的视频。
如从上文应当理解的，在图15中，示出了用EleVisionTM IR系统来进行荧光引导型外科手术(6nmol IRDye800CW-AE344，3小时)。上排小图：在外科手术之前采集的图像。中排小图：在白光手术之后采集的图片，并且将剩余的肿瘤组织清晰可见地可视化。与上排小图相比，信号更强烈，这是由于剩余肿瘤的暴露度现在更高的事实。下排小图：在荧光引导型外科手术结束时采集图像，荧光组织被完全去除，这指示完全切除肿瘤。
体内结合特异性
在原位GBM中，竞争性地阻断IRDye800CW-AE344与AE120(AE105的二聚体版本)的结合以及施用非活性非靶向版本的IRDye800CW-AE354显示出相比于活性探针更低的信号强度(参见图16A和图16B)。在图16A中，示出了横切脑在注射以下项之后1小时处的NIR图像(从左至右)：3nmol IRDye800CW-AE344(活性)、3nmol IRDye800CW-AE344+1.7mg AE120(AE105的二聚体版本)(阻断)和3nmol IRDye800CW-AE354(非活性结合)。图像的对比度同等增强，其中比例尺表示真实值。在图16B中，示出了针对肿瘤和背景的平均荧光强度。
针对接受活性探针、阻断探针或非活性探针的基团的对应归一化TBR值分别为6.6、4.6(p＝0.012)和3.4(p＝0.0025)(参见图16C)。
实验
生物化学性、光学特性和结合特异性
通过将
Figure BDA0003470465910000181
荧光团(LI-COR)与少量uPAR靶向肽AE105缀合开发出靶向肿瘤的NIR探针。
使用Fmoc Ser(t-Bu)TentaGel S PHB 0.25mmol/g树脂，在自动化肽合成器(
Figure BDA0003470465910000182
Syro Wave)上，通过Fmoc固相肽合成来产生肽。随后，通过HATU/HOAT偶联，将5mg
Figure BDA0003470465910000183
与肽缀合。
在RP-HPLC上(在具有级分收集器的DionexUltimate 3000系统上)，通过3步法将粗探针纯化。步骤1：制备型C18色谱柱(Phenomenex Gemini，
Figure BDA0003470465910000184
C18颗粒，21mm×100mm)；溶剂A：水+0.1％TFA；溶剂B：乙腈+0.1％TFA。梯度洗脱(0分钟至5分钟：5％；5％至60％，5分钟至32分钟)，流速15mL/分钟。将含有荧光探针的级分冷冻干燥。步骤2：制备型C4色谱柱(Phenomenex Jupiter，
Figure BDA0003470465910000185
5μm C18颗粒，21mm×100mm)；溶剂A：水+0.1％TFA；溶剂B：甲醇+0.1％TFA。梯度洗脱(0分钟至5分钟：5％；5％至60％，5分钟至32分钟)，流速15mL/分钟。将含有荧光探针的级分冷冻干燥。步骤3：制备型C18色谱柱(PhenomenexGemini，
Figure BDA0003470465910000186
5μmC18颗粒，21mm×100mm)；溶剂A：水+0.1％TFA；溶剂B：乙腈+0.1％TFA。梯度洗脱(0分钟至5分钟：5％至30％；30％至40％，5分钟至40分钟)，流速为15mL/分钟。将含有荧光探针的级分冷冻干燥。通过质谱法来验证产物，并且通过2步分析RP-HPLC来评估纯度。
用PTI QuantaMaster 400(Horiba Ltd.，Japan)获得荧光团激发和发射特征。在λ发射＝850nm处测量激发特征，并且在λ激发＝740nm处测量发射特征，其中将氙弧灯作为激发源。采用Cary 300UV-Vis(Agilent，Santa Clara，CA，USA)测量吸收率。
由因子2稀释系列来评估光稳定性，其中由0.23nM至1.8nM IRDye800-AE344的100μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液得到的四个样本放置在黑色96孔板中。将孔放置在黑盒中，其中Fluobeam安装在顶部，距离孔板23em。在0分钟、10分钟、15分钟、20分钟、0.5小时、1小时、2小时、3小时、6小时、10小时、15小时、24小时处进行图像采集。将每个稀释样本归一化至时间点0，并且汇集由所有四个样本得到的数据。
应用表面等离子体共振(SPR)，使用Biacore 3000仪器确定溶液中IRDye800-AE344对uPAR·uPA的相互作用的IC50值，基本上如所述。简言之，pro-uPAS356A，其为uPAR的天然配体。它由于活性位点S356A突变而重组产生，使得其没有酶活性(因此，在S356A中，活性位点Ser被非活性Ala替代)，因而被固定在CM5传感器芯片上(固定化＞5000RU，约0.1pmol pro-uPA/mm2)，从而提供非常高的pro-uPA表面密度。这造成物质传递反应严重受限，从而导致观察到缔合速率(vobs)与溶液中的结合活性uPAR的浓度成正比，假设仅对低浓度uPAR进行测试(此处为0.06nM至2nM)。通过如下方式进行分析：测量固定uPAR浓度(2nM)的vobs，其以50μL/分钟的流速，在20℃下用3倍稀释系列的IRDye800-AE344(范围从0.076nM至1.5μM)温育300秒。平行测量标准曲线(uPAR的2倍稀释，涵盖0.06nM至2nM)，标准曲线在末端包括一个重复浓度点以证实传感器芯片的生物完整性。运行缓冲液含有10mMHEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％(v/v)表面活性剂P20，pH 7.4。通过两次注射0.1M乙酸、0.5M NaCl使传感器芯片再生。平行分析母体九聚体肽拮抗剂AE105(Asp-Cha-Phe-D-Ser-D-Arg-Tyr-Leu-Trp-Ser-OH)作为阳性对照，并且将闭合型uPARH47C-N259C用作阴性对照，因为其uPA结合腔无法容纳AE105。
细胞系和培养。
将U-87MG-luc2细胞(Caliper，Hopkinton，MA，USA)在杜尔贝科改良型伊格尔氏培养基(DMEM)+GlutaMAX中进行培养，并于潮湿的5％CO2气体中在37℃下加入10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素。当达到80％至90％汇合度时，进行细胞传代或收获。
动物模型
针对动物的所有实验程序均根据“The Animal Experiments Inspectorate，Denmark”的批准来进行。用U-87MG-luc2细胞对7至10周龄雌性裸鼠(菌株：Rj：NMRI-Foxn1nu/nu，JANVIER LABS，France)进行原位异种移植。
在任何外科规程之前，通过皮下注射0.01ml/g体重的溶液，用1∶1∶2比率的Hyprons(0.315mg/ml芬太尼、10mg/ml氟阿尼酮)+Midazolam(5mg/ml)+无菌水将动物麻醉。
通过如下方式建立原位GBM肿瘤模型：使用带自动微量注射泵UMP3(WPI，Sarasota，FL，USA)的立体定位架(KOPF INSTRUMENTS，Tujunga，CA，USA)，在右侧半脑(在前囟2mm的深度处，侧向1.5mm并且后向0.5mm)中接种10μl冰冷PBS液体的500,000个细胞。在5分钟内对细胞进行注射，将注射器保持在适当位置3分钟，之后再抽回。随后用BioSpec7T(Bruker，Billerica，MA，USA)，在MRI上监测肿瘤生长情况，采用轴向和冠状T2加权序列。当肿瘤尺寸达到2mm3至17mm3时，将这些动物纳入荧光成像方案中。
荧光成像
所有图像采集均采用Fluobeam系统进行(Fluosoft版本：2.2.1)(Fluoptics，Grenoble，France)。为了表征体内生物分布和肿瘤成像特性，采用四种不同剂量：1nmol、3nmol、6nmol和12nmol，通过尾部静脉注射，将IRDye800-AE344施用于所有携带GBM的小鼠(n＝35)。在每个时间点处死两只小鼠，取出脑并横切过肿瘤进行成像。初步测试显示出较慢的背景清除率，这是因为较高剂量延长了时间窗口。因此，在注射后的以下时间点进行图像采集：
·1nmol：0.5小时、1小时和2小时
·3nmol：1小时、2小时、3小时和5小时
·6nmol：1小时、3小时、6小时和12小时
·12nmol：1小时、3小时、5小时、10小时、15小时和24小时
通过两种不同方法评估针对uPAR的靶标特异性：用uPAR靶向肽AE120((DChaFsrYLWSG)2-βAK)和缀合到乱序重排肽AE354的IRDye800(IRDye800CW-Glu-Glu-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-Asp-Cha-Glu-(D)Ser-(D)Arg-Tyr-Leu-Glu-Ser-OH)进行竞争性阻断，后者具有与活性肽类似的肽长度。腹膜内注射竞争性阻断剂量1.4mg至2.8mg的AE120，之后15分钟至30分钟静脉内注射3nmolIRDye800CW-AE344，并且于1小时处进行成像(n＝5)。施用3nmol的乱序重排肽，并且在1小时后对动物进行成像(n＝4)。
对接受3nmol IRDye800-AE344的动物(n＝2)进行生物分布，并且在1小时后安乐死以用于器官解剖和成像(曝光时间：333毫秒)。由于肾排泄，肾中的荧光信号与所有其它器官相比不相称。因此，以40ms的较短曝光时间采集图像，并且随后外推出与其它器官相当的信号强度。对皮肤进行部分成像(1.25g)，并且外推出关于皮肤全部重量(4.9g)的生物分布。
图像处理和分析
采用美国国立卫生研究院的ImageJ1.52a进行图像分析和处理。对Fluoptics系统所生成的原图像进行信号测量。肿瘤信号被测量为整个肿瘤的平均荧光强度，并且背景信号被测量为对侧半脑上没有肿瘤的代表性区域的平均值。在ImageJ中，用对比度增强功能(饱和像素：0.3％)来增强所示图片的对比度。
病理学评估
病理学评估用于评估荧光信号和癌细胞的共定位过程(灵敏度+特异性)。来自荧光成像的横切脑样本经石蜡包埋以进行H&E和IHC染色，或经恒冷箱切片以用于荧光显微镜法。
通过如下方式进行石蜡包埋：在乙醇中悬浮之后，在4％福尔马林中固定24小时，随后进行石蜡包埋。将包埋组织轴向切片成xxμm厚的切片并染色。IHC染色用内部抗体(多克隆兔抗人uPAR，由Rigshospitalet医院的Finsen实验室(Copenhagen，Denmark)生产)执行，并且H&E染色按常见标准程序执行。用ZEISS Axio Scan.Z1载玻片扫描仪(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)对染色载玻片进行成像。
通过在干冰上将样本固定于Tissue-Tek O.C.T.中，执行恒冷箱切片。将固定组织进行轴向切片并安装在载玻片上以用于立即荧光成像。
肝和肾：组织是福尔马林固定且石蜡包埋的。切成2μm至4μm厚的切片，并且所应用的常规染色组包括：针对两者的H&E、改良天狼星红、PAS和Masson三色染色，并且另外用银色对肾进行PAS染色，以及用淀粉酶、铁、石蜡切片网硬蛋白染色试剂盒(reticulin)、artisan染色试剂盒和氧化地衣红对肝进行PAS染色。对肝进行免疫组织化学染色，并且遵循制造商的使用说明，使用得自Dako/Agilent，GA619(克隆号：OV-TL12/30)的CK7抗体对3μm厚的切片进行免疫组织化学评估。使用EnVision Flex+检测试剂盒(GV800)在得自Agilent的Omnis上进行染色。一抗用抗体稀释剂(Dako DM830)进行稀释并温育20分钟。用苏木精对切片进行复染。
肽合成的材料和程序
材料
IRDye800-Glu-Glu-O2Oc-O2Oc-Asp-Cha-Phe-D-ser-D-arg-Tyr-Leu-Irp-Ser-OH。所有其它材料均得自商业供应商；Fmoc Ser(t-Bu)TentaGel S PHB0.25mmol/g得自Rapp Polymere GmbH。所有氨基酸都是Fmoc Nα-氨基保护和携带的侧链保护基团：叔丁基(Ser、Asp、Glu和Tyr)、叔丁氧基羰基(Boc，用于Trp)、2，2，4，6，7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-硫酰(Pbf，用于Arg)。Fmoc-O2Oc-OH Fmoc-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酸、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-[(1H-苯并三唑-1-基)(二甲基氨基)亚甲基]-N-甲烷亚胺六氟磷酸盐N-氧化物(HBTU)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)、三氟乙酸(TFA)、哌啶和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)得自Iris Biotech GmbH；而甲醇、乙腈、甲酸、三乙基硅烷(TES)、二氯甲烷(DCM)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐、N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑-[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲烷亚胺六氟磷酸盐N-氧化物(HATU)得自Sigma-Aldrich。
Figure BDA0003470465910000221
羧酸盐得自LI-COR。
肽合成
在自动化肽合成仪
Figure BDA0003470465910000222
Syro Wave上，通过Fmoc固相肽合成来产生肽。使用0.1mmol的规模，在Fmoc Ser(t-Bu)TentaGel S PHB 0.25mmol/g树脂上进行合成。
通过如下方式分两阶段在室温(RT)下进行NαFmoc脱保护：用哌啶/DMF(2∶3)溶液处理树脂3分钟，然后用哌啶/DMF(1：4)溶液处理树脂15分钟。然后用NMP(3次)、DCM(1次)、然后是NMP(2次)来洗涤树脂。氨基酸的所有偶联使用4当量的氨基酸和O2Oc间隔基、4当量的HOAt、3.9当量的HBTU以及7.4当量的DIEA的NMP溶液。室温下的偶联时间为60分钟。重复所有偶联以确保最大掺合度，并且在第二次偶联后，用NMP(4次)来洗涤树脂。
当附接了所有氨基酸和O2Oc间隔基并且去除了最后一个Fmoc基团后，执行测试裂解，该测试显示LC-MS色谱图计算出的纯度高于80％。
为了将荧光团附接到合成肽，将5mg
Figure BDA0003470465910000231
羧酸盐溶解于1ml DMF中。向这2mg HATU中加入1mg HOAT和1.7μl DIEA。将溶液振荡5分钟，然后转移至含合成肽的100mg树脂并置于黑暗中反应12小时。最终反应后，用DMF(5次)和DCM(6次)来洗涤树脂。然后使用95％的TFA和5％的水从树脂中裂解出肽，反应时间为2小时。用氮气流来去除TFA。然后将肽在冷的二乙醚中沉淀。
纯化
在RP-HPLC上(在具有级分收集器的DionexUltimate3000系统上)，通过3步法将粗肽纯化。首先，在制备型C18色谱柱(PhenomenexGemini，
Figure BDA0003470465910000232
5μm C18颗粒，21mm×100mm)上将肽纯化，使用如下溶剂体系：溶剂A，含0.1％TFA的水；溶剂B，含0.1％TFA的乙腈。梯度洗脱(0分钟至5分钟：5％；5％至60％，5分钟至32分钟)以15mL分钟1的流速应用。将含有荧光肽的级分冷冻干燥。在步骤2中使用以下条件将它们纯化：制备型C4色谱柱(Phenomenexjupiter，
Figure BDA0003470465910000233
5μm C18颗粒，21mm×100mm)，使用如下溶剂体系：溶剂A，含0.1％TFA的水；溶剂B，含0.1％TFA的甲醇。梯度洗脱(0分钟至5分钟：5％；5％至60％，5分钟至32分钟)以15mL分钟1的流速应用。将含有荧光肽的级分冷冻干燥。然后在制备型C18色谱柱(Phenomenex Gemini，
Figure BDA0003470465910000234
5μmC18颗粒，21mm×100mm)上进行最终纯化步骤，使用如下溶剂体系：溶剂A，含0.1％TFA的水；溶剂B，含0.1％TFA的乙腈。梯度洗脱(0分钟至5分钟：5％至30％；30％至40％，5分钟至40分钟)以15mL分钟1的流速应用。
分析
使用2种不同的分析方法来建立肽纯度，在联接到QTOF Impact HD的RSLC DionexUltimate3000(Thermo)仪器上，通过UHPLC-MS执行这些方法。在第一种方法期间，将流速为0.5mL/分钟的Aeris3.6μm大孔径C4色谱柱(50mm×2.1mm，Phenomenex)与以下溶剂体系一起使用：溶剂A，含0.1％甲酸的水；溶剂B，含0.1％甲酸的甲醇。使用从5％至75％的溶剂B的线性梯度来洗脱色谱柱。
第二种方法涉及kinetex2.6μmEVO
Figure BDA0003470465910000235
C18色谱柱(50mm×2.1mm，Phenomenex)，流速为0.5mL/分钟。使用如下溶剂体系：溶剂A，含0.1％甲酸的水；溶剂B，含0.1％甲酸的乙腈。使用5％至100％的溶剂B的线性梯度来洗脱色谱柱。该合成得到2mg的98％纯肽。化学式：C129H173N18O41S4。质量计算值：2758.0888；实测值：[M+2H]2+1380.0523；[M+3H]3+920.3723；[M+4H]4+690.5289
讨论
非常适于外科手术引导的最佳荧光探针的关键特征为：1)高灵敏度和高特异性，2)在几小时内实现很高的TBR，3)以低剂量产生高荧光信号，以及4)有利的安全特征。在本研究中，我们成功地合成了一种新型肽基荧光探针，该探针将GBM在体内进行有效可视化，其中在注射6nmol剂量后1小时至12小时之间，TBR高于4.5。这实现了使用灵活性并且符合外科标准工作流程，其中探针可在手术前短时间内例如在准备手术或麻醉诱导时进行注射。当外科手术开始并且持续整个长时间手术时，将开始有用的时间窗口。因此，使用小的肽基探针似乎特别适用于临床术中成像。因此，本发明人已经证明，最早在施用6nmolIRDye800CW-AE344后的3小时，可在小鼠体内进行人原位GBM异种移植物的荧光引导型切除。
相反，基于抗体的探针在血液中循环很长时间(数天)，原因是大分子尺寸导致不利于在早期时间点得到高TBR，因为高背景信号持续数天。注射后仅等待数天，即可获得足够高的TBR。基于抗体的荧光探针IRDye800CW-Cetuximab具有约24小时的报告血液半衰期，其已在患有GBM的人体中进行测试，并且其需要在手术前3天进行输注(28、29)。根据本发明人的观点，这可能不切实际，并且不符合现行临床工作流程，并且需要患者在手术前若干天另行来院。同样，临时被告知手术推迟或取消并不少见，在这些情况下，基于抗体的探针已进行注射并且因此失去效用。所注射的抗体一般来讲也携带众所周知的副作用风险，尤其是免疫相关不良事件。因此，从临床角度而言，对荧光引导型外科手术使用基于抗体的探针似乎相当不方便，从而限制了其适用性，并且可能并不是最显而易见的方案。已经寻求不同策略来减小尺寸，同时保持抗体的高结合亲和性特性以改进药动学特征。这已经得到不同的小抗体片段，例如纳米抗体和亲和体，它们具有高结合亲和性并且在一定程度上缩短循环时间。
预期根据本发明的新型探针在人体内也具有良好的耐受性和安全性。这基于以下事实：其组分先前已用于人体，且没有发生安全问题。首先，我们的结合部分先前已被测试为多种癌症类型(14、34)(NCT03278275、NCT02755675、NCT03307460、NCT02960724、NCT02805608、NCT02964988、NCT02681640、NCT02965001)中的uPAR靶向PET探针(68Ga-NOTA-AE105)，包括对患有GBM(NCT02945826)的患者正在进行的II期试验。总之，迄今为止，已经对超过400名患者进行扫描并且未观察到不良事件或毒性，未观察到中靶毒性或脱靶毒性说明这是有利的安全性特征。其次，IRDye800CW是新型荧光团，尽管未像传统荧光团ICG一样广泛被证明较大规模使用是安全的，但已在人体中被测试为是安全的。然而，IRDye800CW具有优异的光学特性和药动学特性，实现增加的亮度、更少的漂白和较快的肾清除。目前，已使用IRDye800CW标记的探针进行了至少10次临床试验。这些研究中的大部分是利用IRDye800CW标记的抗体，只有一项研究利用标记的小型肽。没有关于严重不良事件的报告，并且所报告的轻度副作用极可能与抗体反应相似。因此，将uPAR靶向肽和IRDye800CW的安全性特征一起考虑以及分别基于它们的安全性特征，可以合理地假设两种化合物组合后的安全性特征对于人使用也是安全的。这一点的支持依据是我们对肾和肝的病理学评估并未显示出任何病理性发现，从而指示这些器官中没有毒性，尤其是在探针积聚并被清除的肾中。此外，IRDye800CW具有类似于ICG的光谱特性，从而能够兼容被设计用于ICG的现有成像设备，这是成功转化和临床实施的关键所在。

Claims (54)

1.一种尿激酶纤溶酶原活化剂受体(uPAR)靶向肽缀合物，包含：
-荧光团；
-与uPAR结合的肽；和
-连接基基团，其中所述荧光团、与uPAR结合的所述肽和所述连接基基团通过共价键连接，其中所述连接基基团包括低聚乙二醇或其它短低聚物，诸如低聚甘油、低聚乳酸或任选地通过共价键连接到至少一个氨基酸的碳水化合物。
2.根据权利要求1所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述连接基基团包括通过共价键连接到至少一个氨基酸的低聚乙二醇。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述至少一个氨基酸选自蛋白原氨基酸和非蛋白原氨基酸，其包括天然氨基酸和合成氨基酸。
4.根据权利要求3中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述天然氨基酸包括：C-α烷基化氨基酸，诸如氨基异丁酸(Aib)；N-烷基化氨基酸，诸如肌氨酸；以及天然存在的β-氨基酸，诸如β-丙氨酸。
5.根据权利要求3中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述合成氨基酸包括具有非蛋白原侧链的氨基酸，诸如环己基丙氨酸、γ氨基酸和二肽模拟物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述连接基基团是-Glu-Glu-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-NH-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CO-。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述荧光团是近红外I荧光团或近红外II荧光团。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述荧光团选自以下项：ICG、亚甲蓝、5-ALA、原卟啉IX、IRDye800CW、ZW800-1、Cy5、Cy7、Cy5.5、Cy7.5、IRDye700DX、Alexa fluor 488、荧光素异硫氰酸、Flav7、CH1055、Q1、Q4、H1、IR-FEP、IR-BBEP、IR-E1、IR-FGP、IR-FTAP。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述荧光团是选自以下项的近红外I荧光团：ICG、亚甲蓝、5-ALA、原卟啉IX、IRDye800CW、ZW800-1、Cy5、Cy7、Cy5.5、Cy7.5、IRDye700DX、Alexa fluor 488、荧光素异硫氰酸酯。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述荧光团是选自以下项的近红外II荧光团：Flav7、CH1055、Q1、Q4、H1、IR-FEP、IR-BBEP、IR-E1、IR-FGP、IR-FTAP。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述荧光团是IRDye800CW。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述受体结合肽选自以下项：
-Asp-Cha-Phe-ser-arg-Tyr-Leu-Trp-Ser；和
-Asp-Cha-Phe-ser-arg-Tyr-Leu-Trp-Ser-NH2。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述共价键选自以下项：酰胺、氨基甲酸酯、硫脲、酯、醚、胺、三唑或通常用于通过固相合成来偶联化学部分的任何其它共价键。
14.根据权利要求1至4中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，具有下式：
Figure FDA0003470465900000031
15.根据权利要求1至14中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述荧光团具有在700nm至1200nm、700nm至950nm(NIR-I)或1000nm至1200nm(NIR-II)范围内的NIR光吸收。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述荧光团具有在700nm至1200nm、700nm至950nm(NIR-I)或1000nm至1200nm(NIR-II)范围内的NIR光发射。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述uPAR结合亲和性小于100nM，优选地小于50nM，优选地小于25nM。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中所述uPAR靶向肽缀合物适于：
-系统性地施用于人或动物体内；
-至少在4,500分钟、优选地1,200分钟、更优选地600分钟、甚至更优选地300分钟内提供受体结合；
-从血浆中去除以使所述缀合物与所述受体的结合可见，其被测量为血浆半衰期，即，血浆中的浓度降低50％所花费的时间，并且其中所述血浆半衰期的最大值为4,500分钟，优选地为1,200分钟，更优选地为600分钟，甚至更优选地为300分钟；
-提供持续至少30分钟的受体结合；
并且其中所述受体结合亲和性、其达到所需受体结合所花费的时间、所述受体结合的持续时间以及血浆半衰期转化为至少1.5的TBR(肿瘤背景比)，并且在施用于所述人或动物体之后于4,500分钟内、优选地1,200分钟内、更优选地600分钟内、甚至更优选地300分钟内达到该水平，并且在已经获得该水平后保持在1.5以上至少30分钟。
19.根据权利要求18所述的uPAR靶向肽缀合物，其中蛋白质(P)-配体(L)复合物发生的速度能够被定义为：
Figure FDA0003470465900000041
其中Kon是结合反应常数，并且其中Koff是所述蛋白质-配体复合物的解离常数，并且其中Kon＞1×103M-1s-1和/或Koff＜1×10-1s-1。
20.根据权利要求18或19所述的uPAR靶向肽缀合物，其中受体亲和性被测量为IC50，这是在3000nM或更小时，所述配体/受体结合亲和性的测量值。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中在体外测量时，在30分钟时间内达到所述受体结合亲和性。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物，其中使用高于1.5的TBR进行测量时，在施用于所述人或动物体之后，受体结合持续至少120分钟，优选地至少300分钟。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物用于疾病治疗的用途。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物用于疾病诊断的用途。
25.根据权利要求1至22中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物用于疾病的光学成像或荧光成像(FLI)的用途。
26.根据权利要求23至25中任一项所述使用的uPAR靶向肽缀合物，其中所述疾病选自癌症和炎性疾病。
27.根据权利要求23至25中任一项所述使用的uPAR靶向肽缀合物，其中所述uPAR靶向肽缀合物以每人0.1mg至1000mg的剂量施用于受试者。
28.一种包含根据权利要求1至22中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
29.根据权利要求28所述的药物组合物用于疾病治疗的用途。
30.根据权利要求28所述的药物组合物用于疾病检测和/或量化的用途。
31.根据权利要求28所述的药物组合物用于疾病诊断的用途。
32.根据权利要求28所述的药物组合物用于疾病的光学成像或荧光成像(FLI)的用途。
33.根据权利要求29至32中任一项所述使用的药物组合物，其中所述疾病选自癌症和炎性疾病。
34.根据权利要求33所述使用的药物组合物，其中所述癌症选自以下项：胶质瘤、胶质母细胞瘤或其它脑癌、胰腺癌、口腔癌、头颈部癌、乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、神经内分泌肿瘤、神经内分泌癌、前列腺癌。
35.根据权利要求33或34所述使用的药物组合物，其中所述癌症选自以下项：胶质瘤、胶质母细胞瘤、胰腺癌、头颈部癌、结肠直肠癌、肺癌和乳腺癌。
36.根据权利要求33至35中任一项所述使用的药物组合物，其中所述癌症为胶质瘤、胶质母细胞瘤或乳腺癌。
37.根据权利要求33所述使用的药物组合物，其中所述炎性疾病选自关节炎和动脉粥样硬化。
38.根据权利要求29所述的药物组合物用于划定癌症肿瘤或癌细胞转移边界的用途。
39.根据权利要求29所述的药物组合物用于荧光引导型肿瘤或癌细胞转移切除的用途。
40.根据权利要求29至39中任一项所述使用的药物组合物，其中所述药物组合物静脉注射地、局部地或表面地施用。
41.根据权利要求29至40中任一项所述使用的药物组合物，其中所述uPAR靶向肽缀合物的浓度为每剂量单位0.1mg至1000mg，通常在以下范围内：每剂量单位0.001mg至1000mg，每剂量单位0.01mg至1000mg，每剂量单位0.1mg至1000mg，每剂量单位0.0001mg至500mg，每剂量单位0.001mg至500mg，每剂量单位0.01mg至500mg，每剂量单位0.1mg至500mg，每剂量单位0.0001mg至100mg，每剂量单位0.001mg至100mg，每剂量单位0.01mg至100mg，或每剂量单位0.1mg至100mg。
42.一种光学成像方法，包括以下步骤：
(i)向靶组织施用uPAR靶向肽缀合物，其中所述uPAR靶向肽缀合物包含荧光团、受体结合肽和将所述荧光团共价连接到所述受体结合肽的连接基基团，其中所述受体结合肽与尿激酶纤溶酶原活化剂受体(uPAR)结合；
(ii)提供时间使所述uPAR靶向肽缀合物在所述靶组织中积聚并建立肿瘤/靶组织背景比；
(iii)用所述荧光团能够吸收的波长的近红外光照射所述靶组织；
(iv)检测所述荧光团发射的荧光并形成所述靶组织的光学图像。
43.根据权利要求42所述的光学成像方法，其中使所述uPAR靶向肽缀合物在所述靶组织中积聚以获得足够高的TBR的时间为：施用后至多360分钟、180分钟、120分钟、90分钟、60分钟、45分钟、30分钟、15分钟、10分钟或5分钟。
44.根据权利要求42或43所述的光学成像方法，其中所述肿瘤/靶组织背景比为至少2。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的光学成像方法，其中所述荧光团具有700nm至800nm范围内的NIR光吸收。
46.根据权利要求42至45中任一项所述的光学成像方法，其中所述荧光团具有750nm至900nm范围内的NIR光发射。
47.根据权利要求42至46中任一项所述的光学成像方法，其中所述方法在体内进行。
48.根据权利要求42至47中任一项所述的光学成像方法，其中所述方法在体外进行。
49.一种用于检测疾病的方法，包括以下步骤：
(i)向靶组织施用根据权利要求1至22所述的uPAR靶向肽缀合物；
(ii)提供时间使所述uPAR靶向肽缀合物在所述靶组织中积聚，设定时间范围为施用后1分钟至120分钟；
(iii)用所述uPAR靶向肽缀合物的所述荧光团能够吸收的波长的近红外光照射所述靶组织；
(iv)检测所述uPAR靶向肽缀合物的所述荧光团发射的荧光；以及
(v)形成所述靶组织的光学图像或对疾病进行量化或两者的组合。
50.根据权利要求1至22中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物或根据权利要求28所述的药物组合物用于癌症光学成像的用途。
51.根据权利要求1至22中任一项所述的uPAR靶向肽缀合物或根据权利要求28所述的药物组合物用于荧光引导型肿瘤或癌细胞转移切除的用途。
52.一种用于制备单位剂量的uPAR靶向肽缀合物制备物的部件套盒，包括：
-单位剂量量的根据权利要求28所述的药物组合物；
-任选地单位剂量量的至少一种药理学活性剂；
-任选地单位剂量量的佐剂；
-任选地单位剂量的至少一种药学上可接受的载体或赋形剂，
-用于在分配之前将所述单位剂量量彼此隔开的装置；和
-用于分配所述单位剂量量的装置。
53.根据权利要求52所述的部件套盒，其中根据权利要求28所述的药物组合物的单位剂量量在0.1mg至1000mg范围内，通常在以下范围内：0.001mg至1000mg，0.01mg至1000mg，0.1mg至1000mg，0.0001mg至500mg，0.001mg至500mg，0.01mg至500mg，0.1mg至500mg，0.0001mg至100mg，0.001mg至100mg，0.01mg至100mg，或0.1mg至100mg。
54.根据权利要求52或53所述的部件套盒，其中所述单位剂量量在0.1mL至10.0mL的总体积范围内，优选地在0.1mL至5.0mL的范围内，优选地在0.5mL至5.0mL的范围内，优选地在0.5mL至1.0mL的范围内。
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