JP2022544647A - ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体標的化ペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、共有結合によって連結されたフルオロフォア、ｕＰＡＲに結合するペプチドおよびリンカー基を含むｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートを記述し、該ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、手術中のがん腫瘍または転移のリアルタイム光学イメージングおよび輪郭の描写において蛍光プローブとして使用され得る。

Description

本発明は、ヒトまたは動物の体内への投与を意図した最適な薬物動態プロファイルを有するｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートに関する。さらに、光学的イメージングにおいて使用するための、ならびに疾患の診断および／または処置のための、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートおよびｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートを含む組成物が提供される。
外科手術は、依然としてがん疾患の最も一般的な処置方法である。がん処置の目標予後とはがん組織が完全に除去されていることなので、がん手術の最良の予後は、可能であれば全てのがん細胞を除去することである。この目的を達成するためには、腫瘍周囲の一定量の健康な組織も容赦なく切除されてしまう。除去された全ての組織は、病理学者が疾患の広がりの程度および特徴を判断することを可能にする顕微鏡検査によって慎重に検査される。したがって、活動性腫瘍の周縁部の輪郭を描画することは大きな課題であり、通常、腫瘍の広がりの位置および程度は、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）で術前にマッピングされる。しかしながら、リアルタイム撮像ツールがないこと、解像度が低いこと、またＣＴの場合には、有害なイオン化が起こることにより、連続的なリアルタイム術中撮像、すなわち、手術の進行中に、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）またはＣＴ撮像を都合のよい設定で実行することができず、これらの技術は制限される。
一方、蛍光イメージングによれば、手術室内の対象またはスタッフを有害な電離放射線にさらすことなく、高い時間的および空間的解像度でリアルタイムでの非侵襲的インビボ視覚化が可能になる。したがって、蛍光画像は、生物および組織を、安全で、簡単、かつリアルタイムの非常に高解像度に視覚化することに使用され得る。
神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、基本的に治癒しない重度のがん疾患であり、積極的な多様な処置を行っても、平均生存期間は残念なことに１４ヶ月である。したがって、疾患の複雑さを理解し、治療法を見出すための集学的努力がなされている。しかしながら、ＧＢＭの治療における過去２０年間の進歩は、全生存期間が停滞していることで控えめであった。手術は依然として重要な処置法であり、手術は単独では成り立たないが、術後生存率は切除の程度によって決まる。ＧＢＭは不規則な境界を有し、明らかに健康な組織内に延びる腱および単一細胞を有する浸潤性という性質を有しているため、健康な隣接組織を確保しながら、明確に識別して完全に切除することが困難である。５－ＡＬＡは、最近、ＧＢＭ切除について食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されており、腫瘍内でプロトポルフィリンＩＸに代謝されると、６３５ｎｍに発光ピークを有する蛍光になる。しかし、代謝産物は腫瘍細胞に結合せず、拡散しているため、５－ＡＬＡでは腫瘍の明確な輪郭の描画は見られず、５－ＡＬＡが神経膠腫の手術を改善するという証拠は低いか非常に低いことも分かっている。メチレンブルー、フルオレセインナトリウム、およびインドシアニングリーン（ＩＣＧ）は、ヒトにおける使用がＦＤＡから承認されているが、可視スペクトル（ＮＩＲスペクトルのＩＣＧ）の波長が短く、がん特異性はない。これは、健康な組織における自己蛍光、組織吸光度、散乱、光退色および非特異的取り込みに起因して、腫瘍対バックグラウンド比（ＴＢＲ）として表される透過、解像度およびコントラストを制限する。したがって、効果的なＧＢＭ輪郭の描画のための新しい外科的イメージングは非常に必要とされている。
標的分子蛍光イメージングは、そのようなツールである。高親和性標的化分子を蛍光色素と組み合わせることにより、がん組織を特異的に標的化し、高ＴＢＲでリアルタイムに可視化し得、外科医が術中にがん組織を健康な組織と区別することを継続的に誘導し支援し得る。
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）は、ＧＢＭ、ならびに乳癌、頭頸部扁平上皮癌、腎細胞癌、および肺癌を含むがこれらに限定されないいくつかの他のがんにおいて高発現する、よく知られたがんの標的である。この受容体は、がんの特徴の１つである浸潤および転移に関連し、その発現量はがんの攻撃性および生存予後不良と相関している。さらに、その受容体は一般に、慢性炎症を伴う活性化腫瘍間質微小環境を含む浸潤前面で高発現し、それを正確な辺縁の可視化および腫瘍の輪郭の描画を可能にする魅力的な標的としている。例えば、国際公開第２０１６／０４１５５８号には、ｕＰＡＲに結合する蛍光標識ペプチドに基づくプローブが開示されている。しかしながら、依然として改善の余地があり、がん切除のための改善された方法が必要とされている。
本発明の１つの目的は、がん治療におけるイメージングへの適用および／または手術の前に投与するための改善された受容体標的化コンジュゲートを提供することである。
上述された目的は、
ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）標的化ペプチドコンジュゲートであって、
フルオロフォア、
ｕＰＡＲに結合するペプチド、および
前記フルオロフォア、前記ｕＰＡＲに結合するペプチドおよびリンカー基が共有結合によって連結されたリンカー基を含み、
前記リンカー基が、場合により少なくとも１つのアミノ酸と共有結合によって連結した、オリゴエチレングリコール、またはオリゴ－グリセロール、オリゴ－乳酸もしくは炭水化物などの他の短いオリゴマーを含む、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）標的化ペプチドコンジュゲート
によって達成される。
リンカー基は、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートの可溶化特性をもたらし、ｕＰＡＲ受容体に関して結合特性を高める。
上記に関連して、国際公開第２０１６／０４１５５８号に示されているプローブは、受容体結合が低く血漿クリアランスが遅いために、記録された画像化における最適かつ特異的なコントラストを損なう最適な薬物動態プロファイルまたは標的親和性を提供していないことを強調すべきである。種々の代替物についてのＴＢＲ値が国際公開第２０１６／０４１５５８号に開示されているが、これらは、本発明によるｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートについて提供されるレベルの範囲内および範囲外の両方である。要約すると、本発明による受容体標的化コンジュゲートは、特定の投与タイプおよび適応症に最適な薬物動態プロファイルを提供する新規なプローブを示す。
図１は、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４の分子構造を示す。 図２は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４のｕＰＡＲに対する親和性の表面プラズモン共鳴分析を示し、上の線（１）はＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４：ｕＰＡＲｗｔを表し、下の線（２）はＡＥ１０５：ｕＰＡＲｗｔを表す。 図３は、プローブＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４の７７７ｎｍにおける実証吸収ピーク（実線）、７８４ｎｍにおける励起ピーク（点線）、７９４ｎｍにおける発光ピーク（破線）のスペクトル分析を示し、１０ｎｍのストークスシフトをもたらす。 図４は、連続レーザー露光後のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４の光安定性を示す。 図５は、同所性ＧＢＭにおけるＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４のインビボにおけるイメージング特異性を示す。上段は無処置の脳を示し（ＮＩＲ画像露光時間５００ｍｓ）、下段は断面脳を示す（ＮＩＲ画像露光時間３３３ｍｓ）（動物ｉｄ０２９、６ｎｍｏｌ、３時間）。 図６は、ｕＰＡＲのＨ＆Ｅ染色、ＮＩＲ顕微鏡検査、Ｈ＆ＥおよびＮＩＲを一緒に行ったもの、ならびに免疫組織化学染色を用いた脳の組織検査を示す図である。矢印は、脳の基底部における小さな軟膜転移を示し、Ｈ＆Ｅ染色およびＮＩＲ顕微鏡の両方で可視である（１２ｎｍｏｌ ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４、２４時間）。 図７は、断面脳上のＧＢＭのエクスビボにおける動的ＮＩＲイメージングを示す。写真中の矢印は、所与の用量のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４に対する最高のＴＢＲ（最大）を示す（全てのデータは３３３ｍｓの露光時間の画像に基づく）。 図８は、種々の用量のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４についての腫瘍対バックグラウンド比を示し、線は、それぞれ用量１ｍｍｏｌ（●）、３ｎｍｏｌ（■）、６ｎｍｏｌ（▲）および１２ｎｍｏｌ（▼）を表す。 図９は、種々の用量のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４に対する腫瘍の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、種々のバーは、それぞれ用量１ｎｍｏｌ、３ｎｍｏｌ、６ｎｍｏｌ、および１２ｎｍｏｌを表す。 図１０は、ＴＢＲと比較した６ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４での腫瘍およびバックグラウンド平均蛍光強度を示し、明るい灰色（左）のバーは腫瘍を表し、暗い灰色（右）のバーはバックグラウンドを表し、線はＴＢＲを表す。 図１１は、（左から右へ）３ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４（活性）、３ｎＭのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４＋６００ｎｍｏｌのＡＥ１２０（遮断）および３ｎＭのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３５４（変異）の注射１時間後の断面脳のＮＩＲ画像を示す。 図１２は、標準化されたＴＢＲ（ｒｅｆ：活性プローブ）を示す。黒いバーはＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４（活性）を表し、明るい灰色のバーはＡＥ１２０（遮断）を表し、暗い灰色のバーはＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３５４（変異）を表す。 図１３は、注射１時間後の３ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４の蛍光強度および体内分布を表す臓器の画像を示す（露光時間：３３３ｍｓ）。小腸の矢印は近位端を示す。腎臓が過飽和し、したがって色補正バーの範囲外になった。 図１４は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４に対する蛍光シグナルの定量を示す。左側のｙ軸は平均蛍光強度を表す。右側のｙ軸は相対体内分布を表す。さらに、黒いバーは平均シグナル強度（ａ．ｕ．）を表し、灰色のバーは、相対体内分布を表す（データは、最も高い取り込みのために皮膚を基準として標準化される）。 図１５は、画像（白色光、ＮＩＲ、白色光とＮＩＲの両者）を示す。 図１６Ａは、注入１時間後の断面脳のＮＩＲ画像を示す。 図１６Ｂは、腫瘍およびバックグラウンドの平均強度について示す。 図１６Ｃは、対応する標準化されたＴＲＢ値を示す。 図１７は、注射１時間後の全データを用いた体内分布および急性毒性を示す。
本件発明の特定された実施の形態
以下に、本発明のいくつかの特定の実施形態を提示し、さらに説明する。
本発明の一実施形態によれば、リンカー基は、場合により少なくとも１つのアミノ酸と共有結合によって連結した、オリゴエチレングリコール、またはオリゴ－グリセロール、オリゴ－乳酸もしくは炭水化物などの他の短いオリゴマーを含む。本発明の一実施形態では、リンカー基は、少なくとも１つのアミノ酸と共有結合によって連結されたオリゴエチレングリコールを含み、少なくとも１つのアミノ酸は、ペプチド結合を形成する別のアミノ酸に共有結合し得、したがってオリゴペプチドを形成し得る。したがって、本発明の一実施形態では、リンカー基は、少なくとも１つのオリゴペプチドと共有結合によって連結されたオリゴエチレングリコールを含む。したがって、リンカー基は親水性リンカー基であり得る。さらに、少なくとも１つのアミノ酸は、天然アミノ酸および合成アミノ酸を含む、タンパク質性アミノ酸および非タンパク質性アミノ酸から選択される。これに関連して、天然アミノ酸には、天然アミノ酸が、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）などのＣ－アルファアルキル化アミノ酸、サルコシンなどのＮ－アルキル化アミノ酸およびベータ－アラニンなどの天然に存在するベータ－アミノ酸が含まれ得ることがさらに言及され得る。さらに、合成アミノ酸には、シクロヘキシルアラニン、ガンマ－アミノ酸、およびジペプチド模倣物などの非タンパク質性側鎖を有するアミノ酸が含まれ得る。ジペプチド模倣物という用語は、２つのアミノ酸側鎖を提示することによって、例えば２つの残基を一緒に連結するアミド結合が減少していることによって、ジペプチドを模倣する有機分子として解釈され得る。非タンパク質性側鎖を有するアミノ酸には、ＣＨＩ空間での動きが制限された側鎖を有するアミノ酸も含まれ得る。ＣＨＩ空間において動きが制限されるという用語は、側鎖基の回転における柔軟性が制限されることとして解釈され得る。オリゴペプチドは、最大５０個のアミノ酸からなり得、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、およびペンタペプチドを含み得、さらにタンパク質性アミノ酸および非タンパク質性アミノ酸によって構成され得る。
本発明の１つの具体的な実施形態によれば、リンカー基は、－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－である。Ｏ２Ｏｃという用語が本出願を通して使用される場合、それは化学成分－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－を意味する。したがって、Ｏ２Ｏｃ－Ｏ２Ｏｃは、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－を意味する。さらに、本発明は、アミド結合によって連結されているエチレングリコール単位に限定されず、実際には、各エチレン単位は、エーテルまたはアミドのいずれか、または基本的には他の共有結合によって連結され得る。エチレングリコール鎖は、様々な長さを有し得、すなわち、繰り返し単位の数は、ｎ＝１～１０の範囲であり得、ここで、ｎは、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｎ－に対応するリンカー中の繰り返し単位の数である。さらに、リンカー中のアミノ酸はグルタミン酸（Ｇｌｕ）に限定されず、酸性側鎖を有するアミノ酸、すなわちアスパラギン酸を含む他の組み合わせ、例えば、Ａｓｐ－Ａｓｐ、Ｇｌｕ－ＡｓｐまたはＡｓｐ－Ｇｌｕが含まれ得る。さらに、他の親水性アミノ酸の組み合わせ、すなわち、例えば、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）またはリジン（Ｌｙｓ）の組み合わせであってもよい。
本発明の別の実施形態によれば、フルオロフォアは、近赤外Ｉ（ＮＩＲ－Ｉ）フルオロフォアまたは近赤外ＩＩ（ＮＩＲ－ＩＩ）フルオロフォアであり得る。フルオロフォアは、ＩＣＧ、メチレンブルー、５－ＡＬＡ、プロトポルフィリンＩＸ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＺＷ８００－１、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７．５、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ４８８、フルオレセインイソチオシアネート、Ｆｌａｂ７、ＣＨ１０５５、Ｑ１、Ｑ４、Ｈ１、ＩＲ－ＦＥＰ、ＩＲ－ＢＢＥＰ、ＩＲ－Ｅ１、ＩＲ－ＦＧＰ、ＩＲ－ＦＴＡＰからなる群から選択され得る。
さらに、本発明の別の具体的な実施形態によれば、フルオロフォアは、ＩＣＧ、メチレンブルー、５－ＡＬＡ、プロトポルフィリンＩＸ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＺＷ８００－１、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７．５、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８、フルオレセインイソチオシアネートからなる群から選択されるＮＩＲ－Ｉフルオロフォアであり得る。本発明の別の具体的な実施形態によれば、フルオロフォアは、Ｆｌａｖ７、ＣＨ１０５５、Ｑ１、Ｑ４、Ｈ１、ＩＲ－ＦＥＰ、ＩＲ－ＢＢＥＰ、ＩＲ－Ｅ１、ＩＲ－ＦＧＰ、ＩＲ－ＦＴＡＰからなる群から選択されるＮＩＲ－ＩＩフルオロフォアであり得る。本発明の１つの具体的な実施形態によれば、フルオロフォアは、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷである。さらに、本発明のフルオロフォアは、ＮＩＲ－Ｉフルオロフォアについては７００～１２００ｎｍ、７００～９５０ｎｍ、またはＮＩＲ－ＩＩフルオロフォアについては１０００～１２００ｎｍの範囲のＮＩＲ光吸収を有し得る。同様に、フルオロフォアは、ＮＩＲ－Ｉフルオロフォアについて７００～１２００ｎｍ、は７００～９５０ｎｍ、またはＮＩＲ－ＩＩフルオロフォアについては１０００～１２００ｎｍの範囲のＮＩＲ発光を有し得る。ＮＩＲフルオロフォアは、蛍光イメージングに使用される場合、深部組織画像を生成するためのウィンドウを提供するという利点を提供する。
本発明の別の実施形態では、受容体結合ペプチドは、－Ａｓｐ－Ｃｈａ－Ｐｈｅ－ｓｅｒ－ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ；および－Ａｓｐ－Ｃｈａ－Ｐｈｅ－ｓｅｒ－ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－ＮＨ２からなる群から選択され得る。
さらに、本発明の共有結合は、アミド、カルバメート、チオ尿素、エステル、エーテル、アミン、トリアゾール、または固相合成によって化学部分を結合するために一般的に使用される任意の他の共有結合からなる群から選択され得る。
本発明の１つの具体的な実施形態によれば、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、以下の式のものである。
Figure 2022544647000001
本発明の別の具体的な実施形態によれば、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｏ２Ｏｃ－Ｏ２Ｏｃ－Ａｓｐ－Ｃｈａ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｓｅｒ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－ＯＨに相当する。Ｃｈａは、β－シクロヘキシル－Ｌ－アラニンであると解釈され得る。
本発明の別の実施形態では、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、好ましくは２５ｎＭ未満のｕＰＡＲ結合親和性を有する。
上記で示唆されるように、本発明によるｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、特定の投与タイプおよび適応症に対して最適な薬物動態プロファイルを示す。
薬物動態に関して、本発明の一実施形態によれば、前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、
－ヒトまたは動物の体内に全身投与され；
－少なくとも４，５００分以内、好ましくは１，２００分以内、より好ましくは６００分以内、さらにより好ましくは３００分以内に受容体結合をもたらし；
－血漿から除去して、受容体に結合したコンジュゲートを可視化し、血漿中の濃度が５０％低下するのにかかる時間である血漿半減期として測定され、血漿半減期が最大４，５００分、好ましくは１，２００分、より好ましくは６００分、さらにより好ましくは３００分を有し；
－受容体結合が少なくとも３０分間持続するようになされており；
前記受容体結合親和性、前記所望の受容体結合に達するのにかかる時間、前記受容体結合の持続性および血漿半減期が、少なくとも１．５のＴＢＲ（腫瘍対バックグラウンド比）に換算され、ヒトまたは動物の身体への投与後４，５００分以内、好ましくは１，２００分以内、より好ましくは６００分以内、さらにより好ましくは３００分以内に前記レベルに達し、このレベルが得られた後少なくとも３０分は１．５を超えた状態が継続する。
さらに別の実施形態によれば、前記タンパク質（Ｐ）－リガンド（Ｌ）複合体が生じる速度は、以下のように定義され得る。
Figure 2022544647000002
 （式中、Ｋｏｎは結合反応の定数であり、Ｋｏｆｆはタンパク質－リガンド複合体の解離定数であり、Ｋｏｎ＞１×１０３Ｍ－１ｓ－１および／またはＫｏｆｆ＜１×１０－１ｓ－１である。）
さらに別の実施形態によれば、受容体親和性は、リガンド／受容体結合親和性の測定値であるＩＣ５０として測定され、３０００ｎＭ以下である。
さらに、１つの具体的な実施形態によれば、受容体結合親和性は、インビトロで測定して３０分の時間内に達成される。
さらに、さらなる別の実施形態によれば、１．５を超えるＴＢＲを使用して測定されるヒトまたは動物の体内への投与後、受容体結合は、少なくとも１２０分間、好ましくは少なくとも３００分間続く。
別の態様によれば、本発明は、疾患の処置において使用するためのｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートに関する。
さらなる態様によれば、本発明は、疾患の光学的イメージングまたは蛍光イメージング（ＦＬＩ）に使用するためのｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートに関する。蛍光イメージングにより、対象を有害な電離放射線にさらすことなく、高い時間分解能および空間分解能でリアルタイムに、非侵襲的なインビボ視覚化、ならびにインビトロ視覚化が可能になる。したがって、蛍光イメージングは、生体および組織の安全で長く繰り返される視覚化に使用され得る。したがって、本発明のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、１人当たり０．１～１０００ｍｇの用量で対象に投与され得る。
なおさらなる態様では、本発明は、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートを少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体または賦形剤と一緒に含む医薬組成物に関する。本発明はまた、疾患の処置に使用するための本発明の医薬組成物に関する。さらに、本発明は、疾患の検出および／または定量に使用するための医薬組成物に関する。さらに、本発明は、疾患の診断に使用するための医薬組成物に関する。本発明はまた、疾患の光学的イメージングまたは蛍光イメージング（ＦＬＩ）に使用するための医薬組成物に関する。
本発明の一実施形態では、疾患は、がんおよび炎症性疾患からなる群から選択され得る。さらに、ｕＰＡＲはＧＢＭおよびいくつかの他のがんで高度に発現される周知のがん標的であるため、本発明により標的となるがんは、他の脳癌（中枢および末梢神経系を含む）、乳癌、頭頸部扁平上皮癌および他の頭頸部癌（例えば、口唇癌、口腔癌、喉頭癌、鼻咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌）、腎細胞癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、肝臓癌、甲状腺癌、膀胱癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮体部癌、子宮頸部癌、黒色腫、卵巣癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、精巣癌、外陰癌、唾液腺癌、中皮腫、陰茎癌、カポジ肉腫、膣癌、神経内分泌腫瘍および神経内分泌癌を含むＧＢＭであり得る。
本発明の一実施形態では、がんは、神経膠腫、神経膠芽腫または他の脳腫瘍、膵臓癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、神経内分泌腫瘍、神経内分泌癌、前立腺癌からなる群から選択され得る。
本発明の一実施形態では、がんは、神経膠腫、神経膠芽腫、膵臓癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、肺癌および乳癌からなる群から選択される。さらに、本発明の１つの具体的な実施形態では、がんは神経膠腫または神経膠芽腫である。本発明の別の具体的な実施形態において、がんは膵臓癌である。本発明のなおさらなる特定の実施形態では、がんは乳癌である。
さらに、がん組織に対する選択性も本発明に関連して興味深い。本発明の１つの具体的な実施形態によれば、受容体標的化コンジュゲートは、がん組織に対して少なくとも６０％、好ましくは７０％超、より好ましくは８０％超、最も好ましくは９０％超の選択性を有する。したがって、コンジュゲート生成物は、好ましくは少なくとも６０％、または７０％、または８０％、または９０％のがん組織に対する選択性を有することを特徴とする。その特性の一部または全部に起因する。選択性により、外科医がその光強度／コントラストに基づいてがんであると考え除去し、その後実際にがんであることが確認された組織サンプルの相対数が確認される。一例は、外科医ががんであると考える１０個の組織サンプルを除去し、そのうちの７個が組織学的にがんであることが確認され、７／１０～７０％の選択性が示されることである。外科医ががんであると考えて除去した組織サンプルの１００％ががんであると証明された場合、選択性は１００％である。外科医によって除去された組織サンプルの半分のみががんであり、残りの半分が正常組織である場合、選択性は５０％である。
本発明の別の実施形態では、炎症性疾患は、関節炎およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
さらなる態様では、癌腫瘍または転移の輪郭の描写に使用するための医薬組成物が提供される。なおさらなる態様では、蛍光誘導腫瘍切除術または転移切除術に使用するための医薬組成物が提供される。この点において、医薬組成物は、静脈内、局所または局所投与され得る。ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートの濃度は、投与単位当たり０．１～１０００ｍｇである。典型的には、本発明によるｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートの濃度は、投与単位当たり０．００１～１０００ｍｇ、投与単位当たり０．０１～１０００ｍｇ、投与単位当たり０．１～１０００ｍｇ、投与単位当たり０．０００１～５００ｍｇ、投与単位当たり０．００１～５００ｍｇ、投与単位当たり０．０１～５００ｍｇ、投与単位当たり０．１～５００ｍｇ、投与単位当たり０．０００１～１００ｍｇ、投与単位当たり０．００１～１００ｍｇ、投与単位当たり０．０１～１００ｍｇ、または投与単位当たり０．１～１００ｍｇの範囲であり得る。
さらなる態様では、
（ｉ）フルオロフォアと、受容体結合ペプチドと、前記フルオロフォアを前記受容体結合ペプチドに共有結合させるリンカー基とを含み、前記受容体結合ペプチドがウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に結合している、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートを標的組織に投与する工程、
（ｉｉ）前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートが前記標的組織内に蓄積する時間を許容し、腫瘍／標的組織対バックグラウンド比を確立する工程、
（ｉｉｉ）前記フルオロフォアによって吸収可能な波長の近赤外光を前記標的組織に照射する工程、
（ｉｖ）前記フルオロフォアによって放出した蛍光を検出し、前記標的組織の光学画像を形成する工程
を含む、光学的イメージング方法が提供される。
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、単離されたインビトロおよびエクスビボの細胞および／または組織ならびにインビボの組織を指す。本発明の一実施形態では、光学的イメージング方法は、（ｉ）ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートをインビボで標的組織に投与する工程を含む。本発明の別の実施形態では、光学的イメージング方法は、（ｉ）ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートをインビトロで標的組織に投与する工程を含む。本発明による光学的イメージング方法は、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートが標的組織に蓄積して、投与後最大３６０分、１８０分、１２０分、９０分、６０分、４５分、３０分、１５分、１０分または５分である十分に高いＴＢＲを得るための時間を提供する。特定の実施形態では、標的組織におけるｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートの蓄積時間は、投与後最大６０分、好ましくは４５分、好ましくは３０分、好ましくは１５分、好ましくは１０分、または好ましくは５分である。さらに、腫瘍／標的組織対バックグラウンド比は少なくとも２である。
本発明の方法の一実施形態では、フルオロフォアは、７００～８００ｎｍの範囲のＮＩＲ光吸収を有する。さらに、フルオロフォアは、７５０～９００ｎｍの範囲のＮＩＲ発光を有する。したがって、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、ＮＩＲスペクトル内のがんにおいて首尾よく可視化され、輝度および光安定性が改善されている。さらに、本発明のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、ＴＢＲ、薬物動態、シグナル強度が改善され、水溶性が増加している。
本発明の一実施形態では、光学的イメージング方法はインビボで実施される。光学的イメージング方法は、インビトロでも実施され得る。
別の態様では、
（ｉ）本発明のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートを標的組織に投与する工程、
（ｉｉ）投与後１～１２０分の範囲内の設定時間で、前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートが前記標的組織に蓄積する時間を許容する工程、
（ｉｉｉ）前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートの前記フルオロフォアによって吸収可能な波長の近赤外光で前記標的組織を照射する工程、
（ｉｖ）前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートの前記フルオロフォアによって放出した蛍光を検出する工程、および
（ｖ）前記標的組織の光学画像を形成し、もしくは疾患を定量するか、または光学画像を形成し、かつ疾患を定量する工程
を含む、疾患を検出する方法が提供される。
なおさらなる態様では、がんの光学的イメージングのための本発明によるｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートまたは医薬組成物の使用が提供される。蛍光誘導腫瘍切除術もしくは転移切除術のためのｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートまたは医薬組成物の使用を提供する本発明の態様も存在する。
本発明の一実施形態では、疾患を検出するための方法はインビボで実施される。疾患を検出するための方法は、インビトロでも実施され得る。本発明の一実施形態では、疾患を検出するための方法は、（ｉ）ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートをインビボで標的組織に投与する工程を含む。本発明の別の実施形態では、疾患を検出するための方法は、（ｉ）ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートをインビトロで標的組織に投与する工程を含む。
さらなる態様は、また、
－単位投与量の本発明の医薬組成物、
－場合により、単位投与量の少なくとも１種の薬理活性物質、
－場合により、単位投与量のアジュバント、
－場合により、単位投与量の少なくとも１種の薬学的に許容され得る担体または賦形剤、
－投与前に単位投与量を互いに分離するための手段、および
－単位投与量を投与するための手段
を含有する、単位投与量のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート製剤を調製するための部品のキットに関する。
一実施形態では、本発明による部品のキットは、０．０００１～１０００ｍｇの範囲の医薬組成物の単位投与量を提供する。典型的には、本発明による医薬組成物の単位投与量は代替的に、０．００１～１０００ｍｇ、０．０１～１０００ｍｇ、０．１～１０００ｍｇ、０．０００１～５００ｍｇ、０．００１～５００ｍｇ、０．０１～５００ｍｇ、０．１～５００ｍｇ、０．０００１～１００ｍｇ、０．００１～１００ｍｇ、０．０１～１００ｍｇ、または０．１～１００ｍｇの範囲であり得る。さらに、単位投与量は、０．１～１０．０ｍＬの総体積範囲、好ましくは０．１～５．０ｍＬの範囲、好ましくは０．５～５．０ｍＬの範囲、好ましくは０．５～１．０ｍＬの範囲であり得る。
図面および実施例の詳細な説明
個々の特徴は、種々の実施形態に含まれ得るが、これらは、場合により他の形に組み合わされ得、種々の実施形態に含まれることは、複数の特徴の組み合わせが実行可能でないことを含意しない．さらに、単数による言及は、複数を除外するものではない。本発明の文脈において、「ａ」、「ａｎ」という用語は、複数を排除するものではない。
「コンジュゲート」という用語は、共有結合によって互いに結合した２つ以上の分子、例えばペプチドおよびリンカーならびにフルオロフォアを意味する。
外科的誘導のための最適な蛍光プローブの重要な特徴としては、高感度、高特異性、注射直後（１時間）に達成される高ＴＢＲ、低用量およびそれにもかかわらず高い蛍光シグナル、高収率での容易な合成が挙げられ、忍容性が高くなければならない（非毒性）。
ＳＰＲ実験
ＮＨＳ／ＥＤＣ（Ｎ－エチル－Ｎ’－［３－ジエチルアミノ）プロピル］カルボジイミド）で予め活性化したＣＭ５チップ上に、１００ｆｍｏｌ／ｍｍ２に相当する＞５０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を目標として１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に溶解した１２．５μｇ／ｍｌタンパク質を注入することによって、ヒト精製ｐｒｏｕＰＡＳ３５６Ａ－の共有結合固定化を達成した。カップリング後、センサーチップを１Ｍエタノールアミンで不活性化した。分析物としてのヒト精製ｕＰＡＲの結合を、ランニング緩衝液として０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を流速５０μｌ／分で使用して、２０°Ｃで４ｎＭ～０．２５ｎＭで測定した。サイクルの間に、センサーチップを、０．５ＭＮａＣｌ中の０．１Ｍ酢酸／ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を２回連続して１０μｌ注入することによって再生した。問題の化合物の３倍希釈物の阻害を、同一のランニング条件で４ｎＭのｕＰＡＲについて測定した。全ての実験は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００装置で実施した。
結果
固定化されたｕＰＡへのｕＰＡＲ結合の各阻害ペプチド阻害プロファイルについて、先行する標準曲線が作成されており、全ての計算はその標準曲線に基づく。結果を表１に要約する。
Figure 2022544647000003
表１から、元のＩＣＧ－ＥＥ－ＡＥ１０５よりも意外なほど良好な第２世代のｕＰＡＲ標的化ペプチドが作製されたことが明らかである。ＩＣＧ誘導体とは対照的に、ＡＥ１０５のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ変異体（ＡＥ３５３）は両方とも、ｗｔｕＰＡＲを高い親和性で標的とし、制限されたｕＰＡＲ変異体（陰性対照）に対して低い親和性を示す。親水性リンカー領域を拡大することによって、はるかに良好な溶解特性を有する生成物が得られ、そのＮ末端に大きなレポーター基を繋いだにもかかわらず、親ペプチド（ＡＥ１０５）の元の高親和性は維持されている（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ）。
生化学および光学特性
本発明は、図１に示す分子構造を有する、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４に基づくｕＰＡＲ標的化蛍光プローブの合成を記述する。ｕＰＡＲに対する結合特性が保存され、天然リガンドウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の結合に対する競合についてＩＣ５０＝２０ｎＭ±１．１ｎＭ（ＳＤ）が得られた（図２）。
ｖｉｓ／ＮＩＲスペクトル特性は、λａｂｓ，ｍａｘ＝７７７ｎｍでの発育不全ピーク（図３）およびλｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，ｍａｘ＝７８４ｎｍでの励起ピークを有するわずかに右にシフトした励起プロファイルを示した。蛍光発光スペクトルは、λｅｍｉｓｓｉｏｎ，ｍａｘ＝７９４ｎｍでピーク発光を示し、１０ｎｍのストークスシフトをもたらした。光安定性により、１時間の連続レーザー曝露後に８４％、２時間後に６２％の蛍光強度が保存されることが示された（図４）。
インビボでのがんイメージング特異性
本発明の一実施例では、蛍光プローブＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４をインビボでのがんイメージングに供した。可視光では、同所性ＧＢＭは無処置の脳を通して可視化されなかったが、ＮＩＲイメージングで明確に可視化された（図５）。さらに、断面化された脳では、腫瘍の範囲が健康な組織と明確に区別されて見え、腫瘍組織と健康な脳組織との区別が可能であった。組織学的評価により、Ｈ＆Ｅ染色、ＮＩＲ顕微鏡法、およびｕＰＡＲ染色免疫組織化学（図６）で腫瘍の程度の共局在化が明らかになり、本発明の光学プローブにより、バイオマーカー／腫瘍が高感度（全ての腫瘍が蛍光性である）かつ高特異的（全ての蛍光シグナルが腫瘍組織である）に正確に標的化されることが実証された。
蛍光誘導手術（ＦＧＳ）の場合、外科医は明確な識別（シグナル強度）および区別（ＴＢＲ）に頼っている。１２ｎｍｏｌの高用量では、同様に６．７の高いＴＢＲが明らかになったが、ピーク時間が１５時間遅延し、６ｎｍｏｌで腫瘍ＭＦＩが５８％減少することの両方の危険にさらされることになったしたがって、理想的なプローブおよび最適な用量は、高強度および高ＴＢＲの両方をもたらすはずである。
先行技術と比較して、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートは、水溶性が改善され、シグナル強度がより高く、ＴＢＲが上昇している。したがって、本発明の蛍光プローブは、６ｎｍｏｌの注射の１時間後から１２時間後まで４．５を超える高いＴＢＲでＧＢＭを安全に可視化し、これは柔軟をもった使用を可能にし、外科部門での標準的なワークフローに完全に準拠し、例えば手術／麻酔の準備において静脈アクセスが確立されるとすぐに、手術の直前にプローブを注射し得る。手術が開始され、長時間の手術全体にわたってでも持続する場合、有用な時間枠に到達する。最も高いＴＢＲである７．０は、６ｎｍｏｌの注射３時間後に観察され、高い絶対シグナル強度を示した。さらに、蛍光プローブに循環から離れて腫瘍内に局在するまでの時間を与えることを意図した長時間のインキュベーション時間は、非常に非実用的であり、確立された臨床ワークフローに適合せず、患者は手術の数日前に追加の診察を受ける必要がある。また、手術が直前に延期または中止されることも珍しくない。
動的イメージング
別の例では、断面での同所性ＧＢＭの動的イメージングにより、４つの用量全てで明確に腫瘍が視覚化されることが明らかになった（１、３、６および１２ ｎｍｏｌ）。６ｎｍｏｌの用量の注射３時間後に最も高いＴＢＲ（７．０）が観察された（図７）。試験した他の用量は、０．５時間、１時間および１５時間でそれぞれ４．４（１ｎｍｏｌ）、６．６（３ｎｍｏｌ）および６．７（１２ｎｍｏｌ）の最大ＴＢＲを示した（図８）。対応する腫瘍平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、それぞれ１、３、６および１２ｎｍｏｌ用量（３３３ｍｓの曝露時間）について、それぞれ２９、７７、８２および４８（ａ．ｕ．）であった。したがって、蛍光強度と用量との間の相関が、用量の増加に伴う強度の増加（腫瘍およびバックグラウンドの両方）と共に観察された（図９）。腫瘍およびバックグラウンドの両者におけるＭＦＩは、注射時に最も高く、経時的に連続的に減少した。興味深いことに、６ｎｍｏｌでは、ＴＢＲは最初に１時間での４．７から３時間での７．０に増加し、続いて６時間および１２時間でそれぞれ６．１および４．５に減少した。同時に、腫瘍ＭＦＩは１時間での１０８（ａ．ｕ．）から３時間での８２（ａ．ｕ．）に連続的に減少し、これは２４％の減少に相当する（図１０）。同じ時点でのバックグラウンドＭＦＩは２４（ａ．ｕ．）から１１に（ａ．ｕ．）に減少し、これは５４％の減少に相当し、したがって、ＴＢＲの増加は、１時間～３時間の腫瘍クリアランス率と比較して高いバックグラウンドクリアランス率を示すという結果であった。
インビボにおける結合特異性
同所性ＧＢＭを有する動物における対照リガンド（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３５４；非結合性スクランブルペプチド）の競合的遮断および投与は、活性プローブと比較して、シグナル強度は、より低かった（図１１）。活性プローブ、ブロックプローブまたはスクランブルプローブを投与された群の標準化ＴＢＲ値は、それぞれ１．００（基準値）、０．７０（ｐ＝０．００６）および０．５２（ｐ＝０．００１）であった（図１２）。
薬物動態および毒性
１時間で、腎臓は、１，２３６（ａ．ｕ．）と最も高いＭＦＩを示し、次いで、肺、皮膚および肝臓が、それぞれ１０１（ａ．ｕ．）、９９（ａ．ｕ．）、および８８（ａ．ｕ．）を示した。比較すると、腫瘍は６５（ａ．ｕ．）のシグナルを示し、脳は１９（ａ．ｕ．）のシグナルを示した（図１４）。体内分布は、主に皮膚および腎臓への蓄積を示し、主要臓器への取り込みを標準化すると、皮膚＝１００（基準）、腎臓＝３８．８、肺＝４．２、心臓＝０．４、脾臓＝０．４、肝臓＝１２．２、膵臓＝３．４、結腸＝４．０、小腸＝１１．２、心室０．９、脳＝０．７、腫瘍＝０．１であった。小腸内のシグナルは腸管近位部／腸内容物に限定され、遠位部には中程度のシグナルしか見られなかった（図１３および図１７Ａにも示す）。
図１７では、体内分布および急性毒性が示されている。全てのデータは注射１時間後のデータである。図１３と同様に、図１７Ａには、３ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４の蛍光強度および体内分布を表す臓器の画像が示されている（露光時間：３３３ｍｓ）。小腸の矢印は近位端を示す。腎臓は飽和しており、したがって色較正バーでは範囲外である。図１７Ｂでは、肝臓の組織像（Ｈ＆Ｅ染色）が示されている。さらに、図１７Ｃでは、腎臓組織が示されている（Ｈ＆Ｅ染色）。肝臓組織は、組織学的には、炎症、線維化、胆汁うっ滞または沈着物を伴わずに小葉の形態で正常であった。腎組織は正常であり、糸球体および尿細管は保護されており、萎縮、炎症または線維化はなかった。
蛍光シグナルの定量（データは皮膚を基準として標準化されている）を１７Ｄに示す。図１７Ｅでは、０時間に標準化されたＨＰＬＣでの曲線下面積（ＡＵＣ）として定量化された血漿安定性が示されている。プローブは、関連する時間枠内で安定であり、標準化された曲線下面積（ＡＵＣ）値は、マウス血漿中で６時間後および１２時間後にそれぞれ無傷のプローブの７３％および６７％あり、ヒト血漿中で６時間および１２時間後にそれぞれ無傷のプローブの６１％および４３％であった。
血漿安定性
１，６００ｕｌのヒト血漿およびマウス血漿を、１０μｌのＰＢＳ中の２．４ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００－ＡＥ３４４と共に３７℃の暗所で別々にインキュベートした。０、０．５、１、２、３、６、１２および２４時間で、２００μｌのサンプルを収集した。２００μｌのアセトニトリルを添加することによって血漿タンパク質を沈殿させ、サンプルを１０，０００Ｇで１０分間遠心分離した。上清を分析のために収集した。ヒト血清およびマウス血清の両者からの時間０からの上清を分析して、ＱＴＯＦ Ｉｍｐａｃｔ ＨＤに連結したＲＳＬＣ Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）装置でのＨＰＬＣ－ＭＳでの無傷のＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４の保持時間を確認した。カラムは、Ａｅｒｉｓ ｗｉｄｅｐｏｒｅ ３．６μｍ Ｃ４カラム（１５０×４．６ ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）であり、溶媒系は、溶媒Ａ：０．１％ギ酸を含有する水；溶媒Ｂ：０．１％ギ酸を含むアセトニトリルであった。方法：０～１分に５％の溶媒Ｂで、１～１８分に５％～５０％の溶媒Ｂ、流速１ｍＬ／分。これにより、１４分後に無傷の分子が溶出したことが示された。次いで、この方法、カラムおよび溶媒を、励起波長として７７４ｎｍを使用し、７９８ｎｍでの発光を測定する３１００－ＦＬＤ蛍光検出器を有する別のＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）に移した。次いで、上記の設定を使用して全てのサンプルについて実行し、１４分のピークのＡＵＣを使用して、これを基準としてマウス血漿およびヒト血漿の両者について０時間での分解を計算した。
蛍光誘導切除術
術前に、腫瘍はＷＬ（白色光）およびＮＩＲの画像上で可視であった（図１５上段のパネル）。外科医は、全ての腫瘍組織が除去されたとみなされるまでは、ＷＬの支援によってのみ切除を行った。次いで、手術台をＦＬＩによって評価し、ＮＩＲシグナルは、ＷＬにおいて同定および除去されなかった残存腫瘍組織が明らかになった（図１５中段のパネル）。ＮＩＲによる支援により、外科医はさらなる腫瘍組織を同定し、ＮＩＲシグナルが全くまたはほとんど見えなくなるまでそれを切除し、腫瘍が完全に切除されたことを示している（図１５の下段のパネル）。蛍光誘導手術のビデオもオンライン補足資料で利用可能である。
上述のことから理解されるように、図１５には、ＥｌｅＶｉｓｉｏｎ（商標）ＩＲシステムを用いて実施された蛍光誘導手術（３時間で６ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４）が示されている。上段パネル：画像を手術前に取得した。中断パネル：手術後に白色光で写真を取得し、残存腫瘍組織を明確に可視化した。このシグナルは、上段のパネルと比較してより強く、残りの腫瘍が現在より露出しているという事実に起因する。下段パネル：蛍光誘導手術の最後に画像を取得し、蛍光組織が完全に除去され、腫瘍が完全に切除されたことを示している。
インビボにおける結合特異性
ＡＥ１２０（ＡＥ１０５の二量体バージョン）とのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４結合の競合的遮断および同所性ＧＢＭにおける不活性非標的化バージョンのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３５４の投与によれば、活性プローブと比較してシグナル強度が低いことが示された（図１６Ａおよび１６Ｂを参照のこと）。図１６Ａでは、（左から右へ）：３ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４（活性）、３ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４＋１．７ｍｇのＡＥ１２０（ＡＥ１０５の二量体バージョン）（遮断）、および３ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３５４（結合不活性）の注射１時間後の断面脳のＮＩＲ画像が示されている。画像は、真の値を表すスケールバーと同様にコントラストが強調される。図１６Ｂでは、腫瘍およびバックグラウンドの平均蛍光強度が示されている。
活性プローブ、遮断プローブまたは不活性プローブを投与された群に相当する標準化ＴＢＲ値は、それぞれ６．６、４．６（ｐ＝０．０１２）および３．４（ｐ＝０．００２５）であった（図１６Ｃを参照のこと）。
実験
生化学、光学特性および結合特異性
ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷフルオロフォア（ＬＩ－ＣＯＲ）を小さなｕＰＡＲ標的化ペプチドＡＥ１０５とコンジュゲートさせることによって、腫瘍標的化ＮＩＲプローブを開発した。
ペプチドは、自動ペプチド合成装置（Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｙｒｏ Ｗａｖｅ）によるＦｍｏｃＳｅｒ（ｔ－Ｂｕ）ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＰＨＢ０．２５ｍｍｏｌ／ｇ樹脂を用いたＦｍｏｃ固相ペプチド合成によって製造した。その後、ＨＡＴＵ／ＨＯＡＴカップリングによって、５ｍｇのＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷをペプチドにコンジュゲートさせた。
未精製のプローブをＲＰ－ＨＰＬＣ（フラクションコレクタを備えたＤｉｏｎｅｘＵｌｔｉｍａｔｅ３０００システム）での３工程プロセスによって精製した。工程１：分取Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ、１１０Å５μｍ Ｃ１８粒子、２１×１００ ｍｍ）、溶媒Ａ、水＋０．１％ ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ ＴＦＡ。流速１５ｍＬ／分での勾配溶出（０～５分：５％；５％～６０％ ５～３２分）。蛍光プローブを含む画分を凍結乾燥した。工程２：分取Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ、３００Å５μｍ Ｃ１８粒子、２１×１００ｍｍ）、溶媒Ａ：水＋０．１％ ＴＦＡ、溶媒Ｂ：メタノール＋０．１％ ＴＦＡ。流速１５ｍＬ／分での勾配溶出（０～５分：５％；５％～６０％ ５～３２分）。蛍光プローブを含む画分を凍結乾燥した。工程３：分取Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ、１１０Å５μｍ Ｃ１８粒子、２１×１００ｍｍ）、溶媒Ａ：水＋０．１％ ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ ＴＦＡ。流速１５ｍＬ／分での勾配溶出（０～５分：５％～３０；３０％～４０％ ５～４０分）。蛍光プローブを含む画分を凍結乾燥した。生成物を質量分析によって検証し、純度を２段階分析ＲＰ－ＨＰＬＣによって評価した。
ＰＴＩ ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ ４００（株式会社堀場製作所、日本）を用いて、フルオロフォア励起および発光プロファイルを得た。励起源としてキセノンアークランプを用い、λｅｍｉｓｓｉｏｎ＝８５０ｎｍで励起プロファイルを測定し、λｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ＝７４０ｎｍで発光プロファイルを測定した。吸収は、Ｃａｒｙ ３００ ＵＶ－Ｖｉｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、米国カリフォルニア州）で測定した。
光安定性は、黒色９６ウェルプレートに入れた１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．２３～１．８ｎＭのＩＲＤｙｅ８００－ＡＥ３４４からの４つのサンプルを用いた２倍希釈系列によって評価した。ウェルを、Ｆｌｕｏｂｅａｍをウェルプレートから２３ｃｍの距離で上部に取り付けた暗箱に入れた。画像取得は、０分、１０分、１５分、２０分、０．５時間、１時間、２時間、３時間、６時間、１０時間、１５時間、２４時間で行った。各希釈サンプルを時点０に対して標準化し、４つ全てのサンプルからのデータをプールした。
基本的に説明されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を適用し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置を使用して、溶液中のｕＰＡＲ・ｕＰＡ相互作用に対するＩＲＤｙｅ８００－ＡＥ３４４のＩＣ５０値を測定した。簡単に説明すると；ｕＰＡＲの天然リガンドであるｐｒｏ－ｕＰＡＳ３５６Ａ。それを、活性部位Ｓ３５６Ａを、それが酵素活性を有しないように変異させて（したがって、Ｓ３５６Ａにおいて、活性部位Ｓｅｒを不活性Ａｌａに置換する。）組換え生産し、非常に高い表面密度のｐｒｏ－ｕＰＡを提供するＣＭ５センサーチップ上に固定化した（＞５０００ＲＵ～０．１ｐｍｏｌ ｐｒｏ－ｕＰＡ／ｍｍ２を固定化）。これは、低濃度のｕＰＡＲのみを試験した場合（ここでは０．０６ｎＭ～２ｎＭ）、観察された会合速度（ｖｏｂｓ）が溶液中の結合活性ｕＰＡＲの濃度に正比例するように、質量輸送が大幅に制限された反応をもたらす。分析は、ＩＲＤｙｅ８００－ＡＥ３４４の３倍希釈系列（０．０７６ｎＭ～１．５μＭの範囲）と共に２０℃で３００秒間、５０μＬ／分の流速でインキュベートした固定ｕＰＡＲ濃度（２ｎＭ）のνｏｂｓを測定することによって行った。センサーチップの生物学的完全性を検証するために、最後に１つの反復濃縮点を含む標準曲線を並行して測定した（０．０６ｎＭ～２ｎＭをカバーするｕＰＡＲの２倍希釈）。泳動緩衝液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４を含有していた。０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌを２回注入してセンサーチップを再生した。親の九量体ペプチドアンタゴニストＡＥ１０５（Ａｓｐ－Ｃｈａ－Ｐｈｅ－Ｄ－Ｓｅｒ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－ＯＨ）を陽性対照として並行して分析し、閉鎖型のｕＰＡＲＨ４７Ｃ－Ｎ２５９Ｃを、そのｕＰＡ結合空洞がＡＥ１０５を収容できないので陰性対照として使用した。
細胞株および培養。
Ｕ－８７ ＭＧ－ｌｕｃ２細胞（Ｃａｌｉｐｅｒ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＧｌｕｔａＭＡＸ中、湿潤５％ＣＯ２空気中３７℃で培養した。８０～９０％の細胞密集度に達したら、細胞を継代または回収した。
動物モデル
動物における全ての実験手順は、Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒａｔｅ，Ｄｅｎｍａｒｋによる承認に従って実施した。７～１０週齢の雌ヌードマウス（株：Ｒｊ：ＮＭＲＩ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ｎｕ、ＪＡＮＶＩＥＲ ＬＡＢＳ、フランス）に、Ｕ－８７ ＭＧ－ｌｕｃ２細胞を同所移植した。任意の外科的処置の前に、０．０１ｍｌ／ｇ体重の溶液の皮下注射によって、１：１：２の比率のＨｙｐｎｏｒｍ（０．３１５ｍｇ／ｍｌのフェンタニル、１０ｍｇ／ｍｌのフルアニソン）＋ミダゾラム（５ｍｇ／ｍｌ）＋滅菌水で動物を麻酔した。
同所性ＧＢＭ腫瘍モデルは、自動マイクロインジェクションポンプＵＭＰ３（ＷＰＩ，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ，ＵＳＡ）を用いた定位固定フレーム（ＫＯＰＦＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ，Ｔｕｊｕｎｇａ，米国カリフォルニア州）を使用して、右半球（２ｍｍの深さでブレグマの１．５ｍｍ外側および０．５ｍｍ後方）で１０μＬの氷冷ＰＢＳ中に５００．０００個の細胞を接種することによって確立された。細胞に５分間かけて注射し、シリンジを所定の位置にさらに３分間維持した後、取り除いた。その後、腫瘍の成長を、軸方向および冠状のＴ２強調配列を有するＢｉｏＳｐｅｃ７Ｔ（Ｂｒｕｋｅｒ，米国マサチューセッツ州ビルリカ）を用いてＭＲＩでモニタリングした。腫瘍サイズが２～１７ｍｍ３に達したら、動物を蛍光イメージングプロトコルに含めた。
蛍光イメージング
全ての画像取得は、（Ｆｌｕｏｓｏｆｔバージョン：２．２．１）（Ｆｌｕｏｐｔｉｃｓ，フランス、グルノーブル）を用いた蛍光ビームシステムを用いて行った。インビボでの生体内分布および腫瘍イメージング特性を特徴付けるために、ＩＲＤｙｅ８００－ＡＥ３４４を、４つの異なる用量：１ｎｍｏｌ、３ｎｍｏｌ、６ｎｍｏｌおよび１２ｎｍｏｌで全てのＧＢＭ保有マウス（ｎ＝３５）に尾静脈注射によって投与した。各時点について２匹のマウスを屠殺し、脳を取り出し、イメージングのために腫瘍を横断切片を作製した。予備試験により、高用量ではバックグラウンドのクリアランスが遅く、時間枠が延長されることが明らかになった。したがって、画像取得は、注入後の以下の時点で行った：
・１ｎｍｏｌ：０．５時間、１時間および２時間
・３ｎｍｏｌ：１時間、２時間、３時間および５時間
・６ｎｍｏｌ：１時間、３時間、６時間および１２時間
・１２ｎｍｏｌ：１時間、３時間、５時間、１０時間、１５時間および２４時間
ｕＰＡＲに対する標的特異性を、２つの異なる方法：活性ペプチドと同様のペプチド長を有するｕＰＡＲ標的化ペプチドＡＥ１２０（（ＤＣｈａＦｓｒＹＬＷＳＧ）２－βＡＫ）、およびスクランブルペプチドＡＥ３５４にコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ８００（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－Ａｓｐ－Ｃｈａ－Ｇｌｕ－（Ｄ）Ｓｅｒ－（Ｄ）Ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｓｅｒ－ＯＨ）による競合的ブロッキングによって評価した。３ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４の静脈内注射の１５～３０分前に、１．４～２．８ｍｇのＡＥ１２０の競合的ブロッキング用量を腹腔内注射し、１時間で画像化した（ｎ＝５）。スクランブルペプチドを３ｎｍｏｌで投与し、１時間後に動物を画像化した（ｎ＝４）。
生体内分布を、３ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００－ＡＥ３４４を投与された動物（ｎ＝２）において評価し、器官切開および画像化（露光時間：３３３ｍｓ）のために１時間後に安楽死させた。腎排泄のために、腎臓における蛍光シグナルは、他の全ての器官と比較してスケールアウトしていた。したがって、４０ｍｓという低い露光時間で画像を取得し、その後、シグナル強度を他の器官に匹敵するように外挿した。皮膚を部分的に画像化し（１．２５ｇ）、生体内分布を皮膚の全重量（４．９ｇ）に対して外挿した。
画像処理および解析
画像をＩｍａｇｅＪ１．５２ａ（ＮＩＨ，米国）で分析し、処理した。Ｆｌｕｏｐｔｉｃｓシステムによって生成された生画像に対してシグナル測定を行った。腫瘍シグナルは、腫瘍全体の平均蛍光強度として測定し、バックグラウンドシグナルは、対側半球に腫瘍がない代表的な領域の平均として測定した。示された画像は、コントラスト強調（飽和画素：０．３％）を用いてＩｍａｇｅＪでコントラスト強調される。
病理学的評価
病理学的評価を使用して、蛍光シグナルとがん細胞（ｓｅｎｓ＋ｓｐｅｃ）の共局在化を評価した。蛍光イメージングからの断面化された脳標本を、Ｈ＆ＥおよびＩＨＣ染色のためにパラフィン包埋し、または蛍光顕微鏡法のためにクライオスタット切片化した。エタノール中に懸濁した後、４％ホルマリン中で２４時間固定し、その後パラフィン包埋することによって、パラフィン包埋を行った。包埋した組織を軸方向に厚さｘｘμｍの切片に切断し、染色した。ＩＨＣ染色を、Ｆｉｎｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｒｉｇｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔ（コペンハーゲン、デンマーク）によって製造された社内抗体、ポリ－ウサギ－抗－ヒト－ｕＰＡＲを用いて行い、Ｈ＆Ｅ染色を一般的な標準的手順によって行った。染色したスライドをＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１スライドスキャナ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）で画像化した。
クライオスタット切片化は、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．中の検体をドライアイス上で固定することによって行った。固定した組織を軸方向にスライスし、即時蛍光イメージングのためにスライド上に載せた。
肝臓および腎臓：組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋した。厚さ２～４μｍの切片を切断し、腎臓および肝臓の両者について、Ｈ＆Ｅ、修正シリウス、ＰＡＳおよびＭａｓｓｏｎトリクローム、腎臓について銀を含む追加のＰＡＳ、肝臓についてジアスターゼ、鉄、レティキュリンアーティサンおよび酸化オルセインを含むＰＡＳを含む日常的な染色パネルを適用した。肝臓を免疫組織化学的に染色し、Ｄａｋｏ／Ａｇｉｌｅｎｔ製のＣＫ７抗体、ＧＡ６１９（クローンＯＶ－ＴＬ１２／３０）を製造者の説明書に従って使用して、厚さ３μｍの切片に対する免疫組織化学的評価を行った。染色は、ＥｎＶｉｓｉｏｎＦｌｅｘ＋検出キット（ＧＶ８００）を利用してＡｇｉｌｅｎｔのＯｍｎｉｓで行った。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ ＤＭ８３０）により一次抗体を希釈し、２０分間インキュベートした。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
ペプチド合成のための材料および手順
材料
ＩＲＤｙｅ８００－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｏ２Ｏｃ－Ｏ２Ｏｃ－Ａｓｐ－Ｃｈａ－Ｐｈｅ－Ｄ－ｓｅｒ－Ｄ－ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－ＯＨ他の全ての材料は、商業的供給業者から入手した。Ｆｍｏｃ Ｓｅｒ（ｔ－Ｂｕ）ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ ＰＨＢ ０．２５ｍｍｏｌ／ｇはＲａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ製であった。全てのアミノ酸は、ＦｍｏｃＮα－アミノ保護され、側鎖保護基を担持していた：ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＴｙｒ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ、Ｔｒｐ用）、２，２，４，６，７ペンタメチル－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ、Ａｒｇ用）。Ｆｍｏｃ－Ｏ２Ｏｃ－ＯＨ Ｆｍｏｃ－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］酢酸Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－［（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）（ジメチルアミノ）メチレン］－Ｎ－メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ－オキシド（ＨＢＴＵ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピペリジン、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ製であったが、メタノール、アセトニトリル、ギ酸、トリエチルシラン（ＴＥＳ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート、Ｎ－［（ジメチルアミノ）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ－［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン］－Ｎ－メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ－オキシド（ＨＡＴＵ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷカルボキシレートはＬＩ－ＣＯＲから入手した。
ペプチド合成
ペプチドは、自動ペプチド合成装置：Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）Ｓｙｒｏ ＷａｖｅでのＦｍｏｃ固相ペプチド合成によって製造した。０．１ｍｍｏｌのスケールを使用して、ＦｍｏｃＳｅｒ（ｔ－Ｂｕ）ＴｅｎｔａＧｅｌＳＰＨＢ０．２５ｍｍｏｌ／ｇ樹脂で合成を行った。
ＮαＦｍｏｃ脱保護は、樹脂をピペリジン／ＤＭＦ（２：３）溶液で３分間処理し、続いてピペリジン／ＤＭＦ（１：４）溶液で１５分間処理することによって、室温（ＲＴ）で２段階で行った。次いで、樹脂をＮＭＰ（３回）、ＤＣＭ（１回）、次いでＮＭＰ（２回）で洗浄した。全てのアミノ酸のカップリングには、ＮＭＰ中で４当量のアミノ酸およびＯ２Ｏｃスペーサー、４当量のＨＯＡｔ、３．９当量のＨＢＴＵ、および７．４当量のＤＩＥＡを使用した。カップリング時間は室温で６０分であった。全てのカップリングを繰り返して最大の組み込みを確実にし、２回目のカップリング後に樹脂をＮＭＰで洗浄した（４回）。
全てのアミノ酸およびＯ２Ｏｃスペーサーが結合し、最後のＦｍｏｃ基が除去されると、試験開裂が実施され、これは、ＬＣ－ＭＳクロマトグラムから計算される純度が８０％を超えていることを示した。合成したペプチドにフルオロフォアを結合させるために、５ｍｇのＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷカルボキシレートを１ｍｌのＤＭＦに溶解した。これに、２ｍｇのＨＡＴＵ、１ｍｇのＨＯＡＴおよび１．７μｌのＤＩＥＡを添加した。溶液を５分間振盪し、次いで、合成ペプチドを含む１００ｍｇの樹脂に移し、暗所で１２時間反応させた。最終反応後、樹脂をＤＭＦ（５回）およびＤＣＭ（６回）で洗浄した。次いで、９５％ ＴＦＡ；５％の水を用い、２時間の反応時間により、樹脂からペプチドを切断した。ＴＦＡを窒素流で除去した。次いで、ペプチドを冷ジエチルエーテル中で沈殿させた。
精製
未精製のペプチドをＲＰ－ＨＰＬＣ（フラクションコレクタを備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００システム）での３工程プロセスによって精製した。最初に、以下の溶媒系：溶媒Ａ、０．１％のＴＦＡを含有する水；溶媒Ｂ、０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリルを使用して、分取Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ、１１０Å ５μｍ Ｃ１８粒子、２１×１００ｍｍ）でペプチドを精製した。勾配溶出（０～５分：５％；５％～６０％ ５～３２分）を１５ｍＬ／分の流量で適用した。蛍光ペプチドを含む画分を凍結乾燥した。それらを、工程２で以下の条件（溶媒系：溶媒Ａ、０．１％のＴＦＡを含有する水；溶媒Ｂ，０．１％のＴＦＡを含有するメタノールを使用して、分取Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｊｕｐｉｔｅｒ、３００Å ５μｍ Ｃ１８粒子、２１×１００ｍｍ））を使用して精製した。勾配溶出（０～５分：５％；５％～６０％ ５～３２分）を１５ｍＬ／分の流量で適用した。蛍光ペプチドを含む画分を凍結乾燥した。次いで、精製の最後の工程を、以下の溶媒系：溶媒Ａ、０．１％のＴＦＡを含有する水；溶媒、０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリルを使用して、分取Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ、１１０Å ５μｍ Ｃ１８粒子、２１×１００ ｍｍ）で実施した。勾配溶出（０～５分：５％～３０；３０％～４０％ ５～４０分）を１５ｍＬ／分の流量で適用した。
分析
ペプチド純度は、ＱＴＯＦ Ｉｍｐａｃｔ ＨＤに連結されたＲＳＬＣ Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）装置でＵＨＰＬＣ－ＭＳに対して実施された２つの異なる分析方法を使用して確認した。第一の方法では、０．５ ｍＬ／分の流速を有するＡｅｒｉｓ ３．６μｍワイドポアＣ４カラム（５０×２．１ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を以下の溶媒系：溶媒Ａ、０．１％のギ酸を含有する水；溶媒Ｂ、０．１％のギ酸を含有するメタノールで使用した。５％～７５％の溶媒Ｂから直線勾配を用いてカラムを溶出した。
第二の方法は、０．５ｍＬ／分の流速を有するｋｉｎｅｔｅｘ２．６μｍＥＶＯ １００Å Ｃ１８カラム（５０×２．１ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を含んでいた。以下の溶媒系を使用した：溶媒Ａ、０．１％のギ酸を含有する水；溶媒Ｂ、０．１％のギ酸を含有するアセトニトリル。５％～１００％の溶媒Ｂからの直線勾配を用いてカラムを溶出した。合成により、２ｍｇの９８％純粋なペプチドを得た。化学式：Ｃ１２９Ｈ１７３Ｎ１８Ｏ４１Ｓ４。推定質量２７５８．０８８８；実測値：［Ｍ＋２Ｈ］２＋１３８０．０５２３；［Ｍ＋３Ｈ］３＋９２０．３７２３；［Ｍ＋４Ｈ］４＋６９０．５２８９
考察
外科的誘導に十分に適した最適な蛍光プローブの重要な特徴は、１）高い感度および特異性、２）数時間以内に達成される高いＴＢＲ、３）高い蛍光シグナルを得るために必要な用量が低いこと、および４）好ましい安全性プロファイルである。本研究において、本発明者らは、６ｎｍｏｌの用量を注射後１～１２時間の間に４．５を超えるＴＢＲでインビボにおいてＧＢＭを効果的に可視化する新しいペプチドをベースとする蛍光プローブの合成に成功した。これは、柔軟な使用を可能にし、手術の直前、例えば手術の準備または麻酔の導入時にプローブを注入し得る外科部門における標準的なワークフローに準拠する。有用な時間枠は、手術が開始されるときに開始し、長い処置全体にわたって持続する。したがって、小さなペプチドベースのプローブの使用は、臨床的な術中イメージングに特に適用可能であると思われる。したがって、本発明者らは、ヒト同所性ＧＢＭ異種移植片の蛍光誘導切除術が、６ｎｍｏｌのＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－ＡＥ３４４の投与の３時間後という早期にマウスにおいて実施され得ることを示した。
対照的に、抗体ベースのプローブは、分子サイズが大きいために、血液中を長時間（数日間）循環し、高いバックグラウンドシグナルが数日間持続するために初期時点で高いＴＢＲを損なう。注射後数日待つだけで、十分に高いＴＢＲを得ることができる。約２４時間と報告された血中半減期を有する抗体ベースの蛍光プローブであるＩＲＤｙｅ８００ＣＷ－セツキシマブは、ＧＢＭを有するヒトで試験されており、手術の３日前に注入する必要があった（２８，２９）。本発明者らの観点では、これは非現実的であり得、確立された臨床ワークフローに適合せず、患者は手術の数日前に追加の診察を受けるために来院する必要がある。また、手術が直前に延期または中止されることも珍しくなく、このような場合、抗体ベースのプローブは既に注入されており、したがって無駄になってしまう。注射された抗体は、一般に、副作用、特に免疫関連有害事象のよく知られているリスクを伴う。したがって、蛍光誘導手術のための抗体ベースのプローブの使用は、それらの適用性を制限する臨床的観点から非常に不便であるようであり、最も明白なアプローチではない可能性がある。サイズを小さくすると同時に、抗体の高い結合親和性特性を維持して薬物動態プロファイルを改善するために、様々な戦略が追求されてきた。これにより、結合親和性が高く、循環時間がある程度短縮された、種々のより小さな抗体断片、例えばナノボディおよびアフィボディが得られた。
本発明による新しいプローブは、ヒトにおいても耐容性が良好で安全であると予想される。これは、その構成要素が安全上の問題なく以前よりヒトに使用されているという事実に基づいている。第一に、本発明の結合部分は、ＧＢＭ患者における進行中の第ＩＩ相試験（ＮＣＴ０２９４５８２６）を含む複数のがん型（１４，３４）（ＮＣＴ０３２７８２７５、ＮＣＴ０２７５５６７５、ＮＣＴ０３３０７４６０、ＮＣＴ０２９６０７２４、ＮＣＴ０２８０５６０８、ＮＣＴ０２９６４９８８、ＮＣＴ０２６８１６４０、ＮＣＴ０２９６５００１）においてｕＰＡＲ標的化ＰＥＴプローブ（６８Ｇａ－ＮＯＴＡ－ＡＥ１０５）として以前より試験が行われている。全体で、４００名を超える患者がこれまでに調査されており、有害事象または毒性は観察されておらず、的確な毒性も的外れな毒性も観察されず、好ましい安全性プロファイルを示唆している。第２に、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷは、大規模で安全であることが証明されている従来のフルオロフォアＩＣＧほど広範囲ではないが、ヒトにおいて安全であることが試験されている新規なフルオロフォアである。しかしながら、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷは、輝度が増加し、退色が少なく、迅速な腎クリアランスを伴う優れた光学特性および薬物動態特性を有する。現在、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識プローブを用いて、少なくとも１０の臨床試験が行われている。これらの研究のほとんどは、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ標識抗体を用いたものであり、標識小ペプチドを用いた研究は１つのみであった。重度の有害事象に関する報告はなく、報告された軽度の副作用は抗体反応に類似している可能性が最も高い。したがって、これらを基に、ｕＰＡＲ標的化ペプチドおよびＩＲＤｙｅ８００ＣＷの安全性プロファイルに基づいて、別々に、組み合わせた２つの化合物の安全性プロファイルもヒト使用にとって安全であると合理的に仮定し得る。これの裏付けとして、本発明者らによる腎臓および肝臓の病理学的評価では、これらの器官、特にプローブが蓄積して除去される腎臓において毒性が示されないことを示す病理学的所見は示されなかった。さらに、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷは、ＩＣＧと同様のスペクトル特性を有し、ＩＣＧ用に設計された既存の撮像装置との互換性が可能になり、これは移転および臨床実施を成功させるための鍵である。

Claims (54)

  1. ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）標的化ペプチドコンジュゲートであって、
    フルオロフォア、
    ｕＰＡＲに結合するペプチド、および
    前記フルオロフォア、前記ｕＰＡＲに結合するペプチドおよびリンカー基が共有結合によって連結されたリンカー基を含み、
    前記リンカー基が、場合により少なくとも１つのアミノ酸と共有結合によって連結した、オリゴエチレングリコール、またはオリゴ－グリセロール、オリゴ－乳酸もしくは炭水化物などの他の短いオリゴマーを含む、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）標的化ペプチドコンジュゲート。
  2. 前記リンカー基が、少なくとも１つのアミノ酸と共有結合によって連結したオリゴエチレングリコールを含む、請求項１に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  3. 前記少なくとも１つのアミノ酸が、天然アミノ酸および合成アミノ酸を含む、タンパク質性アミノ酸および非タンパク質性アミノ酸から選択される、請求項１または２に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  4. 前記天然アミノ酸が、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）などのＣ－アルファアルキル化アミノ酸、サルコシンなどのＮ－アルキル化アミノ酸およびベータ－アラニンなどの天然に存在するベータ－アミノ酸を含む、請求項３に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  5. 前記合成アミノ酸が、シクロヘキシルアラニン、ガンマ－アミノ酸およびジペプチド模倣物などの非タンパク質性側鎖を有するアミノ酸を含む、請求項３に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  6. 前記リンカー基が－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－である、請求項１～５のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  7. 前記フルオロフォアが近赤外Ｉフルオロフォアまたは近赤外ＩＩフルオロフォアである、請求項１～６のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  8. 前記フルオロフォアが、ＩＣＧ、メチレンブルー、５－ＡＬＡ、プロトポルフィリンＩＸ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＺＷ８００－１、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７．５、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８、フルオレセインイソチオシアネート、Ｆｌａｖ７、ＣＨ１０５５、Ｑ１、Ｑ４、Ｈ１、ＩＲ－ＦＥＰ、ＩＲ－ＢＢＥＰ、ＩＲ－Ｅ１、ＩＲ－ＦＧＰ、ＩＲ－ＦＴＡＰからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  9. 前記フルオロフォアが、ＩＣＧ、メチレンブルー、５－ＡＬＡ、プロトポルフィリンＩＸ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＺＷ８００－１、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７．５、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８、フルオレセインイソチオシアネートからなる群から選択される近赤外Ｉフルオロフォアである、請求項１～７のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  10. 前記フルオロフォアが、Ｆｌａｖ７、ＣＨ１０５５、Ｑ１、Ｑ４、Ｈ１、ＩＲ－ＦＥＰ、ＩＲ－ＢＢＥＰ、ＩＲ－Ｅ１、ＩＲ－ＦＧＰ、ＩＲ－ＦＴＡＰからなる群から選択される近赤外ＩＩフルオロフォアである、請求項１～７のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  11. 前記フルオロフォアがＩＲＤｙｅ８００ＣＷである、請求項１～９のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  12. 受容体結合ペプチドが、－Ａｓｐ－Ｃｈａ－Ｐｈｅ－ｓｅｒ－ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ；および－Ａｓｐ－Ｃｈａ－Ｐｈｅ－ｓｅｒ－ａｒｇ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－ＮＨ２からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  13. 前記共有結合が、アミド、カルバメート、チオ尿素、エステル、エーテル、アミン、トリアゾール、または固相合成によって化学部分を結合するために一般的に使用される任意の他の共有結合からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  14. 以下の式：
    Figure 2022544647000004
     を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  15. フルオロフォアは、７００～１２００ｎｍ、７００～９５０ｎｍ（ＮＩＲ－Ｉ）、または１０００～１２００ｎｍ（ＮＩＲ－ＩＩ）の範囲のＮＩＲ発光を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  16. フルオロフォアは、７００～１２００ｎｍ、７００～９５０ｎｍ（ＮＩＲ－Ｉ）、または１０００～１２００ｎｍ（ＮＩＲ－ＩＩ）の範囲のＮＩＲ光吸収を有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  17. 前記ｕＰＡＲ結合親和性が１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、好ましくは２５ｎＭ未満である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  18. 前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートが、
    ヒトまたは動物の体内に全身投与され、
    少なくとも４，５００分以内、好ましくは１，２００分以内、より好ましくは６００分以内、さらにより好ましくは３００分以内に受容体結合をもたらし、
    血漿から除去して、受容体に結合したコンジュゲートを可視化し、血漿中の濃度が５０％低下するのにかかる時間である血漿半減期として測定され、血漿半減期が最大４，５００分、好ましくは１，２００分、より好ましくは６００分、さらにより好ましくは３００分を有し、
    受容体結合が少なくとも３０分間持続するようになされており、
    前記受容体結合親和性、前記所望の受容体結合に達するのにかかる時間、前記受容体結合の持続性および血漿半減期が、少なくとも１．５のＴＢＲ（腫瘍対バックグラウンド比）に換算され、ヒトまたは動物の身体への投与後４，５００分以内、好ましくは１，２００分以内、より好ましくは６００分以内、さらにより好ましくは３００分以内に前記レベルに達し、このレベルが得られた後少なくとも３０分は１．５を超えた状態が継続する、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  19. 前記タンパク質（Ｐ）－リガンド（Ｌ）複合体が生じる速度が、以下のように定義され得、
    Figure 2022544647000005
     式中、Ｋｏｎは結合反応の定数であり、Ｋｏｆｆはタンパク質－リガンド複合体の解離定数であり、Ｋｏｎ＞１×１０３Ｍ－１ｓ－１および／またはＫｏｆｆ＜１×１０－１ｓ－１である、
    請求項１８に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  20. 受容体親和性が、リガンド／受容体結合親和性の測定値であるＩＣ５０として測定され、３０００ｎＭ以下である、請求項１８または１９に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  21. 前記受容体結合親和性が、インビトロで測定して３０分の時間内に達成される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  22. １．５を超えるＴＢＲを使用して測定されるヒトまたは動物の体内への投与後、受容体結合が、少なくとも１２０分間、好ましくは少なくとも３００分間続く、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  23. 疾患の治療に使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  24. 疾患の診断に使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  25. 疾患の光学的イメージングまたは蛍光イメージング（ＦＬＩ）に使用するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  26. 前記疾患が、がんおよび炎症性疾患からなる群から選択される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の使用のためのｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  27. 前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートが、１人当たり０．１～１０００ｍｇの用量で対象に投与される、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の使用のためのｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート。
  28. 請求項１～２２のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートを、少なくとも１つの薬学的に許容され得る担体または賦形剤と一緒に含む医薬組成物。
  29. 疾患の処置に使用するための、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 疾患の検出および／または定量化に使用するための、請求項２８に記載の医薬組成物。
  31. 疾患の診断に使用するための、請求項２８に記載の医薬組成物。
  32. 疾患の光学的イメージングまたは蛍光イメージング（ＦＬＩ）に使用するための、請求項２８に記載の医薬組成物。
  33. 前記疾患が、がんおよび炎症性疾患からなる群から選択される、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
  34. 前記がんが、神経膠腫、神経膠芽腫または他の脳腫瘍、膵臓癌、中咽頭癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、神経内分泌腫瘍、神経内分泌癌腫、前立腺癌からなる群から選択される、請求項３３に記載の使用のための医薬組成物。
  35. 前記がんが、神経膠腫、神経膠芽腫、膵臓癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、肺癌および乳癌からなる群から選択される、請求項３３または３４に記載の使用のための医薬組成物。
  36. 前記がんが神経膠腫、神経膠芽腫または乳癌である、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
  37. 前記炎症性疾患が、関節炎およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項３３に記載の使用のための医薬組成物。
  38. 癌腫瘍または転移の輪郭の描画に使用するための、請求項２９に記載の医薬組成物。
  39. 蛍光誘導腫瘍切除術または転移切除術に使用するための、請求項２９に記載の医薬組成物。
  40. 静脈内、局所的または局所的に投与される、請求項２９～３９のいずれかに記載の使用のための医薬組成物。
  41. 前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートの濃度が、投与単位当たり０．１～１０００ｍｇ、典型的には、投与単位当たり０．００１～１０００ｍｇ、投与単位当たり０．０１～１０００ｍｇ、投与単位当たり０．１～１０００ｍｇ、投与単位当たり０．０００１～５００ｍｇ、投与単位当たり０．００１～５００ｍｇ、投与単位当たり０．０１～５００ｍｇ、投与単位当たり０．１～５００ｍｇ、投与単位当たり０．０００１～１００ｍｇ、投与単位当たり０．００１～１００ｍｇ、投与単位当たり０．０１～１００ｍｇ、または投与単位当たり０．１～１００ｍｇの範囲である、請求項２９～４０のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
  42. 光学的イメージング方法であって、
    （ｉ）フルオロフォアと、受容体結合ペプチドと、前記フルオロフォアを前記受容体結合ペプチドに共有結合させるリンカー基とを含み、前記受容体結合ペプチドがウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に結合している、ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートを標的組織に投与する工程、
    （ｉｉ）前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートが前記標的組織内に蓄積する時間を許容し、腫瘍／標的組織対バックグラウンド比を確立する工程、
    （ｉｉｉ）前記フルオロフォアによって吸収可能な波長の近赤外光を前記標的組織に照射する工程、
    （ｉｖ）前記フルオロフォアによって放出した蛍光を検出し、前記標的組織の光学画像を形成する工程、
    を含む、光学的イメージング方法。
  43. ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートが標的組織に蓄積して、十分に高いＴＢＲを得るための時間は、投与後最大３６０分、１８０分、１２０分、９０分、６０分、４５分、３０分、１５分、１０分または５分である、請求項４２に記載の光学的イメージング方法。
  44. 前記腫瘍／標的組織対バックグラウンド比が少なくとも２である、請求項４２または４３に記載の光学的イメージング方法。
  45. フルオロフォアは、７００～８００ｎｍの範囲のＮＩＲ光吸収を有する、請求項４２～４４に記載の光学的イメージング方法。
  46. フルオロフォアは、７５０～９００ｎｍの範囲のＮＩＲ発光を有する、請求項４２～４５に記載の光学的イメージング方法。
  47. 前記方法がインビボで実施される、請求項４２～４６のいずれかに記載の光学イメージング方法。
  48. 前記方法がインビトロで実施される、請求項４２～４７のいずれかに記載の光学イメージング方法。
  49. 疾患を検出する方法であって、
    （ｉ）請求項１～２２に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートを標的組織に投与する工程、
    （ｉｉ）投与後１～１２０分の範囲内の設定時間で、前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートが前記標的組織に蓄積する時間を許容する工程、
    （ｉｉｉ）前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートの前記フルオロフォアによって吸収可能な波長の近赤外光で前記標的組織を照射する工程、
    （ｉｖ）前記ｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートの前記フルオロフォアによって放出した蛍光を検出する工程、および
    （ｖ）前記標的組織の光学画像を形成し、もしくは疾患を定量するか、または光学画像を形成し、かつ疾患を定量する工程を含む、方法。
  50. がんの光学的イメージングのための、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートまたは請求項２８に記載の医薬組成物の使用。
  51. 蛍光誘導腫瘍切除術または転移切除術のための、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲートまたは請求項２８に記載の医薬組成物の使用。
  52. 単位投与量のｕＰＡＲ標的化ペプチドコンジュゲート製剤を調製するための部品のキットであって、
    単位投与量の請求項２８に記載の医薬組成物、
    場合により、単位投与量の少なくとも１種の薬理活性物質、
    場合により、単位投与量のアジュバント、
    場合により、単位投与量の少なくとも１種の薬学的に許容され得る担体または賦形剤、
    投与前に単位投与量を互いに分離するための手段、および
    単位投与量を投与するための手段、
    を含有する、キット。
  53. 請求項２８に記載の医薬組成物の単位投与量が、０．１～１０００ｍｇ、典型的には０．００１～１０００ｍｇ、０．０１～１０００ｍｇ、０．１～１０００ｍｇ、０．０００１～５００ｍｇ、０．００１～５００ｍｇ、０．０１～５００ｍｇ、０．１～５００ｍｇ、０．０００１～１００ｍｇ、０．００１～１００ｍｇ、０．０１～１００ｍｇ又は０．１～１００ｍｇの範囲にある、請求項５２に記載の部品のキット。
  54. 前記単位投与量が総体積範囲で、０．１～１０．０ｍＬ、好ましくは０．１～５．０ｍＬの範囲、好ましくは０．５～５．０ｍＬの範囲、好ましくは０．５～１．０ｍＬの範囲である、請求項５２または５３に記載の部品のキット。
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