KR20130132939A - １８ｆ - 함유 유기실리콘 화합물로 표지된 ｈｅｒ２ 결합 펩티드 - Google Patents

Abstract

방사성핵종 및 킬레이트화제와 접합된 단리 폴리펩티드를 포함하고, 상기 단리 폴리펩티드는 HER2 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합하는 영상화제; 및 이들 영상화제를 제조 및 사용하는 방법.

Description

１８Ｆ - 함유 유기실리콘 화합물로 표지된 ＨＥＲ２ 결합 펩티드{HER2 BINDING PEPTIDES LABELLED WITH A 18F - CONTAINING ORGANOSILICON COMPOUND}

본 발명은 일반적으로 인간 상피세포 성장인자 수용체 타입 2(HER2)에 결합하는 영상화제와 그러한 제제의 제조 및 사용방법에 관한 것이다.

인간 상피세포 성장인자 수용체 타입 2(HER2)는 막관통 단백질이고 수용체 타이로신 키나제 단백질의 erbB 일족의 멤버이다. HER2는 유방암, 난소암, 폐암, 위암 및 구강암을 포함한 다종다양한 암에서 과발현되는 확고한 종양 생체지표이다. 따라서, HER2는 분자 표적으로서 및 환자 생존의 진단 또는 예후 지표, 또는 항종양수술(antineoplastic surgery)에 대한 반응의 예측 마커로서 가치가 크다.

지난 10년에 걸쳐서, 다양한 영상화 양식을 이용한 HER2 발현의 비-침습성 분자 영상화가 광범위하게 연구되어 왔다. 이러한 양식으로는 양전자 방출 단층촬영(PET) 및 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT)으로의 방사성핵종 영상화가 포함된다. HER2의 PET 및 SPECT 영상화(각각 HER2-PET 및 HER2-SPECT)는 고-감도 고-공간 분해능을 제공한다. HER2의 PET 영상화는 또한 강력한 정량화능을 제공한다. HER2-PET 및 HER2-SPECT는 환자에서 전반적인 종양 HER2 발현의 실시간 검정, 종양에서 시간 경과에 따른 HER2 발현의 확인, HER-표적화 치료(예를 들어, 트라스투주마브(trastuzumab)-기반 요법)를 위한 환자의 선발, 요법에 대한 반응의 예측, 약효의 평가, 및 다수의 기타 적용에 특히 유용하다. 그러나, 화학작용을 가지며 임상 적용에 적합한 생체내 거동을 보이는 어떠한 PET 또는 SPECT-표지 HER2 리간드도 개발되지 않았다.

자연발생 포도상구균 단백질 A는 면역글로불린 이소형 G(IgG)의 단편인 결정성 영역(Fc)에 결합하는 삼중나선 구조(골격)를 형성하는 도메인을 포함한다. 단백질 A의 Z-도메인으로부터 유래하는 특정 폴리펩티드는 루프로 연결된 3개의 α 나선으로 이루어진 골격을 함유한다. 이들 나선중 두 개에 위치한 특정 아미노산 잔기는 IgG의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 구성한다. 나선 1 및 2에 위치한 표면-노출 아미노산 잔기(13개 잔기)를 치환시켜 이들 분자의 결합능을 개변시킴으로써 대체 바인더 분자가 제조되었다. 하나의 그러한 예가 HER2 결합 분자 또는 HER2 바인더이다. 이들 HER2 바인더를 PET 또는 SPECT-활성 방사성핵종으로 표지하였다. 그러한 PET 및 SPECT-표지 바인더는 환자에서의 생체내 HER2 발현 패턴 측정능을 제공하며, 따라서 HER2-관련 병증의 진단, 예후, 및 치료시에 임상의와 연구자에 도움이 될 것이다.

HER2 결합 애피바디(Affibody)^® 분자를, PET-활성 방사성핵종 ¹⁸F으로 방사성표지하여, HER2를 과발현하는 악성 종양에 대한 영상화제로서 평가하였다. HER2 결합 애피바디^® 분자를, 킬레이트화제, 예컨대 maGGG(머캅토아세틸트리글리실), CGG(시스테인-디글리실), CGGG(서열 6)(시스테인-트리글리실) 또는 AA3을 통해 ^99mTc와 접합시켜, 또한 진단 영상화에 사용하였다. 표적 HER2-발현 종양에의 이들 분자의 결합이 마우스에서 입증되었다.

대부분의 경우에, 티올-반응성 말레이미드기를 통해 애피바디^®에 신호-발생 ¹⁸F기를 도입시킨다. 티올-반응성 말레이미드기는 ¹⁸F 혼입 후에 다단계 합성을 이용하여 제조한다. 그러나, 이러한 화학반응은 낮은 방사화학적 수율을 제공할 뿐이다. 유사하게, ^{99 m}Tc와 애피바디^®의 접합은 다단계 공정이다. 또한, Tc 환원 및 킬레이트와의 복합체 형성은 높은 pH(예를 들어, pH=11) 조건과 장기간의 반응시간을 요한다.

비록 ¹⁸F-표지 애피바디^® 분자의 생체내 성능은 적당히 양호하였지만, 현저한 개선의 여지가 있다. 예를 들어, 일부 연구에서는, 종양 흡수(tumor uptake)가 영상화제의 주사 2시간 후 6.36±1.26%ID/g에 불과한 것으로 나타났다.

따라서, 예를 들어 ¹⁸F와 같은 방사성 모이어티가 최종 단계에서 도입될 수 있고 그에 따라 높은 방사화학적 수율을 제공하게 될, 방사성표지 폴리펩티드를 합성하는 화학 및 방법이 필요하다. 또한, 특히 신클리어런스(renal clearance) 및 독성 효과에 관계된 개선된 특성을 지닌 PET 또는 SPECT 영상화용의 새로운 HER2-표적화 영상화제가 필요하다.

본 발명의 조성물은 HER2 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합할 수 있는 새로운 부류의 영상화제이다.

하나 이상의 실시양태에서, 영상화제 조성물은 디아민디옥심 킬레이트화제를 통해 ^{99 m}Tc와 접합된 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 포함한다. 디아민디옥심 킬레이트화제는 Pn216, cPn216, Pn44, 또는 그들의 유도체를 포함할 수 있다. 단리 폴리펩티드는 HER2 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합한다.

하나 이상의 실시양태에서, 영상화제 조성물은 노타(NOTA) 킬레이트화제를 통해 ⁶⁷Ga 또는 ⁶⁸Ga와 접합된 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 포함한다. 단리 폴리펩티드는 HER2 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합한다.

하나 이상의 실시양태에서, 영상화제 조성물은 Al¹⁸F-노타 킬레이트와 접합된 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 포함한다. 단리 폴리펩티드는 HER2 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합한다.

하나 이상의 실시양태에서, 영상화제 조성물은 링커를 통해 ¹⁸F와 접합된 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 포함한다. 링커는 아미녹시기, 아지도기, 또는 알킨기로부터 유래하는 기를 포함한다. 단리 폴리펩티드는 HER2 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합한다.

하나 이상의 실시양태에서, 영상화제 조성물은 동위원소 불소 교환 화학반응을 통해 ¹⁸F와 접합된 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 포함한다. 단리 폴리펩티드는 HER2 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합한다.

하나 이상의 실시양태에서, 본원 기재의 영상화제 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 영상화제 조성물을 제조하기 위한 본 발명 방법의 일례는 (i) 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하는 단계; 및 (ii) 디아민디옥심 킬레이트화제를 폴리펩티드와 반응시켜 킬레이트화제-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계를 포함한다. 또 다른 예에서, 방법은 (i) 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하는 단계; (ii) 폴리펩티드를 링커와 반응시키는 단계; 및 (iii) 링커를 ¹⁸F 모이어티와 반응시켜 ¹⁸F-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계를 포함한다. 링커는 아미녹시기, 아지도기, 또는 알킨기를 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 방법은 (i) 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하는 단계; (ii) 폴리펩티드를 노타 킬레이트화제와 반응시켜 노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계; 및 (iii) 노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드를 Al¹⁸F 모이어티와 반응시켜 Al¹⁸F-노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계를 포함한다.

또 다른 예에서, 방법은 (i) 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하는 단계; (ii) 폴리펩티드를 실리콘 플루오라이드(예를 들어, [¹⁹F]-실리콘 플루오라이드)-함유 모이어티와 반응시켜 실리콘 플루오라이드-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계; 및 (iii) 실리콘 플루오라이드-접합 폴리펩티드를 ¹⁸F 모이어티와 반응시켜 ¹⁸F-실리콘 플루오라이드-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 이들 및 기타 특질, 측면, 및 이점은 하기 상세한 설명을 첨부 도면을 참조로 하여 정독할 때 좀더 잘 이해될 것이다.
도 1a 및 1b는 각각, 8가지 상이한 농도에서 두 종류 항-HER2 폴리펩티드 Z477(서열 3) 및 (Z477)₂(서열 5)의 인간 HER2에의 결합 친화도의 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 C6(래트 신경교종, 대조군) 및 SKOV3(인간 난소암)에 대한 인간 항-HER2 항체의 정성적 유동세포계측법의 그래프이다. 도 2c는 SKOV3 및 C6 세포주에 대하여 세포당 Her2 수용체에 대한 막대 도표를 도시한다.
도 3은 SKOV3 세포와 관련하여 종양 타입 SKOV3 2-1, SKOV3 3-1, SKOV3 3-4, 및 블랭크의 패널에 대한 Her2에 대한 ELISA 검정의 막대 그래프이다.
도 4는 ^{99 m}Tc-표지 Z00477(서열 3)의 역상 HPLC 감마 크로마토그램이다.
도 5a는 pH 9에서의 응집 ^{99 m}Tc(CO)₃(His6)Z00477(서열 4)(서열 7로서 개시된 'His6')의 크기 배제 HPLC 감마 크로마토그램이다. 도 5b는 비-응집 ^99mTc(CO)₃(His6)Z00477(서열 7로서 개시된 'His6')-표지 애피바디^® 표준의 크기 배제 HPLC 감마 크로마토그램이다.
도 6은 시간 경과에 따른 종양:혈액 비율을 포함하여, SKOV3 종양-담지 마우스로부터의 혈액, 종양, 간, 신장 및 비장 샘플에서 Z00477(서열 3)의 생체내분포 프로파일의 그래프이다.
도 7은 Mal-cPN216 링커에 대한 화학 구조의 다이어그램이다.
도 8a는 일렉트로스프레이 이온화 비행시간형 질량 스펙트럼(ESI-TOF-MS)의 그래프이고 도 8b는 정제 Z00477(서열 3)-cPN216에 대한 질량 디컨볼루션(mass deconvolution) 결과의 그래프이다.
도 9는 ^{99 m}Tc로 표지한 Z02891-cPN216(서열 2)에 대한 역상 HPLC 감마 트레이스 크로마토그램이다.
도 10은 SKOV3 종양-담지 마우스로부터의 혈액, 간, 신장, 비장, 및 꼬리 샘플에서, cPN216를 통해 ^{99 m}Tc로 표지한 Z02891(서열 2)의 생체내분포 프로파일(%ID, %주입량)의 그래프이다.
도 11은 SKOV3 종양-담지 마우스로부터의 종양, 혈액, 간, 신장, 방광/소변, 꼬리, 장 및 비장 샘플에서, cPN216을 통해 ^{99 m}Tc로 표지한 Z02891(서열 2)의 생체내분포 프로파일(%ID, %주입량)의 그래프이다.
도 12는 종양:혈액 비율을 나타내는, SKOV3 종양-담지 마우스에서의 Z02891(서열 2)에 대한 생체내분포 프로파일의 그래프이다.
도 13a 및 13b는 Boc-보호 말레이미드-아미녹시(Mal-AO-Boc) 및 말레이미드-아미녹시(Mal-AO) 링커에 대한 화학 구조의 다이어그램이다. 도 13a는 tert-부틸 2-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸아미노)-2-옥소에톡시카르바메이트(Mal-AO-Boc)에 대한 화학 구조이고 도 13b는 2-(아미노옥시)-N-(2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸)아세트아미드 히드로클로라이드(Mal-AO.HCl)에 대한 화학 구조이다.
도 14a는 Z00342(서열 1) 출발물질의 역상 HPLC 크로마토그램이고 도 14b는 정제 Z00342(서열 1)-AO 영상화제 조성물의 역상 HPLC 크로마토그램이며, 둘 모두 280 nm에서 분석되었다.
도 15는 ¹⁸F-플루오로벤질-Z00342(서열 1)와 ¹⁸F-플루오로벤질-Z02891(서열 2)의 조(粗) 반응 혼합물 및 정제된 최종 산물에 대한 역상 HPLC 감마 크로마토그램이다.
도 16은 SKOV3-종양형성 동물로부터의 ¹⁸F로 표지한 Z02891(서열 2) 폴리펩티드의 생체내분포 프로파일(%ID, %주입량)의 그래프이다.
도 17은 SKOV3-종양형성 동물로부터의 ¹⁸F로 표지한 Z02891(서열 2) 폴리펩티드의 생체내분포 프로파일(%ID, %주입량) 및 종양:혈액 비율의 그래프이다.
도 18은 혈액, 종양, 간, 신장, 비장 및 뼈 샘플에서 ¹⁸F-표지 Z00342(서열 1) 및 ¹⁸F-표지 Z02891(서열 2)의 생체내분포 프로파일(%ID, %주입량)의 막대 그래프이다.
도 19는 Mal-노타 링커의 화학 구조의 다이어그램이다.
도 20a는 일렉트로스프레이 이온화 비행시간형 질량 스펙트럼의 그래프이고, 20B는 Z00477(서열 3)-노타에 대한 ESI-TOF-MS 질량 디컨볼루션 결과의 그래프이다.
도 21은 반응 1시간 후 ⁶⁷Ga-표지 Z00477(서열 3)-노타의 조 반응 혼합물에 대한 역상 HPLC 감마 트레이스의 그래프이다.
도 22는 정제 ⁶⁷Ga-표지 노타 Z00477(서열 3)-노타 폴리펩티드에 대한 역상 HPLC 감마 트레이스의 그래프이다.
도 23은 제제 2의 분석용 HPLC이다[상부: 아스코르베이트, 0.5 min 및 펩티드 전구체 3, 4.5 min을 나타내는 280 nm에서의 UV 채널; 하부: 2, 5.1 min(RCP 95%) 및 분해산물, 4.6 min을 나타내는 방사능 채널].
도 24는 tC2 셉팩(SepPak) 정제를 이용한 2의 제조에 대한 패스트랩(FASTlab)^TM 카세트 레이아웃이다.
도 25는 패스트랩^TM을 사용하여 제조한 제제 2의 분석용 HPLC이다[상부: 2(7.7 min), ¹⁸F-FBA(10.4 min) 및 미지의 불순물(12.2 min)을 나타내는 방사능 채널; 중앙: p-아미노벤조산 제제 첨가제(3 min)를 나타내는 280 nm에서의 UV 채널; 하부: 디메틸아미노벤즈알데히드 부산물(10.2 min) 및 미지의 불순물(3.8 min)을 나타내는 350 nm에서의 UV 채널].
도 26은 세파덱스(Sephadex) 정제를 이용한 2의 제조에 대한 패스트랩^TM 카세트 레이아웃이다.
도 27은 세파덱스 정제와 더불어 패스트랩^TM을 사용하여 제조한 제제 2의 분석용 HPLC이다[상부: 2(7.1 min), ¹⁸F-FBA(8.8 min) 및 미지의 불순물(10.2 min)을 나타내는 방사능 채널; 중앙: 280 nm에서의 UV 채널; 하부: 디메틸아미노벤즈알데히드 부산물(10.0 min)을 나타내는 350 nm에서의 UV 채널].
도 28은 제제 5의 분석용 HPLC이다[상부: 산물(4.7 min, 92%) 및 부산물(3.9 min, 8%)을 나타내는 방사능 채널; 하부: 280 nm에서의 UV 채널].
도 29는 분석용 방사성 HPLC로 측정한 표지 효율을 나타내는 5의 경시적 연구를 도시한다.
도 30은 펩티드/AlCl₃ 농도를 증가시킨 후 5의 분석용 RCY이다(P: 산물, BP: 부산물, 도 28 참조).
도 31은 5의 표지 혼합물의 분석용 HPLC 프로파일이다(상부 트레이스: 방사능 채널, 하부 트레이스: 280 nm에서의 UV 채널).
도 32는 단리된 7의 분석용 방사능 채널 HPLC이다(적색: 방사능 채널, 청색: 280 nm에서의 UV 채널).
도 33은 면역조직화학, 즉 다코(DAKO)사의 헤르셉테스트(HERCEPTEST)에 의한, NCI-N87 및 A431 이종이식 모델로부터의 종양 절편에서의 HER2 단백질 발현을 도시한다. 좌측의 사진은 2배 확대도이고, 우측의 사진은 하이라이트를 준 사각형의 10배 확대도이다.
도 34는 9, 2, 5, 및 7의 나이브(naive) 마우스 생체내분포를 도시한다.
도 35는 NC87/A431 종양-담지 마우스에서 9, 2, 5, 및 7의 생체내분포를 도시한다.
도 36은 이중 종양 이종이식 모델에서 2의 생체내분포 프로파일을 도시한다.
도 37은 증가하는 농도의 콜드 전구체(cold precursor)를 사용한 2의 NCI-N87 이종이식 생체내분포 프로파일을 도시한다.
도 38은 이중 종양 이종이식 모델에서 2로의 예비 영상화(A) 및 애피바디^® 9 영상화 연구와의 비교(B)를 도시한다.

본 발명의 영상화제 조성물은 일반적으로, 방사성 동위원소 예컨대, 예를 들어, ¹⁸F, ^{99 m}Tc, ⁶⁷Ga 또는 ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²⁴I, ⁸⁹Zr, 또는 ⁶⁴Cu와 접합된 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체의 단리 폴리펩티드를 포함한다; 및 상기 조성물을 제조 및 사용하는 방법. 단리 폴리펩티드는 HER2 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합한다. 하나 이상의 실시양태에서, 단리 폴리펩티드의 서열은 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체중 어느 것과 적어도 90% 서열 유사성을 갖는다.

단리 폴리펩티드는 천연 아미노산, 합성 아미노산, 또는 자연발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 모방체를 포함할 수 있다. 자연발생 아미노산은 유전암호로 코딩된 아미노산, 및 추후에 변형되는 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, O-포스포세린, 포스포트레오닌, 및 포스포타이로신이다.

단리 폴리펩티드는 표준 고체상 합성 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 이와 달리, 폴리펩티드는 재조합 기술을 이용하여 제조될 수도 있다. 폴리펩티드가 재조합 기술을 이용하여 제조될 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 그의 보존적 변이체를 단리할 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 그의 보존적 변이체는 클로닝 벡터에 삽입, 숙주 세포(예를 들어, 진핵생물 세포, 식물 세포, 또는 원핵생물 세포)에 도입한 다음, 당업계에서 인정되는 임의의 발현 시스템을 이용하여 발현시킬 수 있다.

폴리펩티드는 실질적으로 아미노산 잔기의 단일 키랄 형태를 포함하여 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 L-아미노산 또는 D-아미노산중 어느 하나를 포함하여 이루어질 수 있지만; L-아미노산과 D-아미노산의 조합 역시도 채용될 수 있다.

본원에서 제공되는 폴리펩티드는 단백질 A의 Z-도메인으로부터 유래함에 따라, 결합 계면상의 잔기는 비-보존적으로 치환될 수 있거나 또는 결합 활성을 보존하면서 보존적으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환된 잔기는 20종의 자연발생 아미노산 또는 그들의 임의 유사체중 어느 것으로부터 유래될 수 있다.

폴리펩티드는 약 49개 잔기 내지 약 130개 잔기 길이일 수 있다. 구체적인 폴리펩티드 서열을 표 1에 수록한다.

선택된 기능성을 부여하기 위하여 말단에 부가 서열이 첨가될 수 있다. 따라서, 단독 또는 결합 표적에 커플링된 폴리펩티드의 정제 또는 단리를 수월하게 하기 위하여 (예를 들어, His 태그를 폴리펩티드에 첨부함으로써) 하나의 말단 또는 두 말단 모두에 부가 서열이 첨부될 수 있다.

표 1에 수록된 폴리펩티드는 링커를 통해 ¹⁸F와; 디아민디옥심 킬레이트화제를 통해 ^{99 m}Tc와, 노타 킬레이트화제를 통해 ⁶⁷Ga 또는 ⁶⁸Ga와, Al¹⁸F-노타를 통해 ¹⁸F와, SiFA(즉, 실리콘 플루오라이드 억셉터) 또는 실리콘 플루오라이드 교환 화학반응을 통해 ¹⁸F와, 도타 킬레이트화제 화학반응을 통해 ¹¹¹In와, 아이오도벤즈알데히드를 사용하는 플루오로벤즈알데히드-유사 화학반응을 통해 ¹²³I 또는 ¹²⁴I와, 또는 노타 킬레이트화제 화학반응을 통해 ⁶⁴Cu와 접합시킬 수 있다. 표 2는 이들 폴리펩티드의 등전점(pI)을 제공한다.

하나 이상의 실시양태에서, 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 ¹⁸F와 접합시킬 수 있다. ¹⁸F는 단리 폴리펩티드의 C 말단, N-말단, 또는 내부 위치에 혼입될 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, ¹⁸F는 링커를 통해 단리 폴리펩티드와 접합시킬 수 있다. 링커는 아미녹시기, 아지도기, 또는 알킨기를 포함할 수 있다. 링커의 아미녹시기는 알데히드, 예컨대 불소-치환 알데히드로 부착시킬 수 있다. 링커의 아지드기는 불소-치환 알킨으로 부착시킬 수 있다. 유사하게, 링커의 알킨기는 불소-치환 아지드로 부착시킬 수 있다. 링커는 또한 티올-반응성기를 포함할 수 있다. 링커는 말레이미도-아미녹시, 말레이미도-알킨 또는 말레이미도-아지드기를 포함하여 이루어질 수 있다. ¹⁸F-접합 폴리펩티드는 (i) 서열 1, 서열 2, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하고; (ii) 폴리펩티드를 링커(여기에서, 링커는 아미녹시기, 아지도기, 또는 알킨기를 포함한다)와 반응시켜 링커-접합 폴리펩티드를 형성한 다음; 링커를 ¹⁸F 모이어티와 반응시켜 ¹⁸F-접합 폴리펩티드를 형성함으로써 제조될 수 있다.

¹⁸F-접합 폴리펩티드는 (i) 서열 1, 서열 2, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하고; (ii) 폴리펩티드를 링커(여기에서, 링커는 말레이미도-아미녹시, 말레이미도-알킨 또는 말레이미도-아지드기를 포함한다)와 반응시켜 링커-접합 폴리펩티드를 형성한 다음; 링커를 ¹⁸F 모이어티와 반응시켜 ¹⁸F-접합 폴리펩티드를 형성함으로써 제조될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 (i) 서열 1, 서열 2, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하는 단계; (ii) 링커를 제공하는 단계; (iii) 링커를 ¹⁸F 모이어티와 반응시켜 ¹⁸F-표지 링커를 형성하는 단계; 및 (iv) ¹⁸F-표지 링커를 서열 1, 서열 2, 또는 그의 보존적 변이체의 단리 폴리펩티드와 반응시켜 ¹⁸F-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.

전술한 예를 이용하여, 불소 또는 방사성불소 원자(들), 예컨대 ¹⁸F을 폴리펩티드에 도입시킬 수 있다. 불소-치환 알데히드를 링커-접합 폴리펩티드의 아미녹시기와 반응시키면 불소-치환 폴리펩티드가 생성된다. 유사하게, 불소-치환 아지드 또는 알킨기를 링커-접합 폴리펩티드의 개개의 알킨 또는 아지드기와 반응시키면 불소-치환 폴리펩티드가 생성된다. 방사성불소-치환 알데히드, 아지드 또는 알킨을 링커-접합 폴리펩티드의 개개의 아미녹시, 알킨 또는 아지드기와 반응시키면 방사성불소-표지 폴리펩티드 또는 영상화제 조성물이 생성된다. 또한, 방사성불소-표지 영상화제 조성물을 제조하기 위해서는, 링커는 방사성불소(¹⁸F) 치환기를 가질 수 있다. 임의 길이의 플루오르화 영상화제 조성물을 제조하기 위하여 불소를 폴리펩티드에 도입하는 방법이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 영상화제 조성물의 폴리펩티드는 예를 들어 40 내지 130개 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명의 영상화제 또는 영상화제 조성물의 제조에 사용하기 위한 링커-접합 폴리펩티드 또는 ¹⁸F-접합 링커는 이전에 공지된 방법보다 더 효율적이고 좀더 높은 수율을 도출하는 본 발명의 방법으로 제조될 수 있다. 방법은 수행하기가 더 수월하고, 더 신속하며, 좀더 온화하고 좀더 사용자-친화적인 조건하에서 수행된다. 예를 들어, 폴리펩티드를 ¹⁸F-접합 링커(예를 들어, ¹⁸F-플루오로벤즈알데히드)("¹⁸F-FBA")로 표지하는 방법은 당업계에 공지된 절차보다 간편하다. ¹⁸F-접합-링커는 트리메틸아닐리늄 전구체에 ¹⁸F의 직접 친핵성 혼입에 의하여 1단계로 제조된다. ¹⁸F-링커(즉, ¹⁸F-FBA)를 이어서 예를 들어 애피바디^® 및 본원에 기재된 것들과 같은 폴리펩티드에 접합시킨다. 링커의 제조 또한 당업계에 이전에 공지된 방법보다 용이하다. 더욱이, 방사성표지 아미녹시-기재 링커-접합 폴리펩티드, 및 cPn 일족의 킬레이트화제-접합 폴리펩티드(예를 들어, 애피바디^®)는 현저히 더 양호한 생체내분포와 더 양호한 종양 흡수, 및 간 흡수는 더 적으면서 더 양호한 클리어런스를 보인다.

불소-표지 영상화제 조성물은 진단 적용에서 매우 바람직한 물질이다. ¹⁸F-표지 영상화제 조성물은 PET와 같은 확립된 영상화 기술을 이용하여 가시화할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 화학식 1의 디아민디옥심 킬레이트화제를 통해 ^{99 m}Tc와 접합시킬 수 있다.

상기 식에서,

R^/, R^//, R^///, R^////는 독립적으로 H 또는 C_{1 -10} 알킬, C_{3 -10} 알킬아릴, C_{2 -10} 알콕시알킬, C_{1 -10} 히드록시알킬, C_{1 -10} 알킬아민, C_{1 -10} 플루오로알킬이거나, 또는 2개 이상의 R기는 그들이 부착되는 원자와 함께 카보시클릭, 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화 고리를 형성하며, 여기에서 R은 H, C_{1 -10} 알킬, C_{3 -10} 알킬아릴, C_{2 -10} 알콕시알킬, C_{1 -10} 히드록시알킬, C_{1 -10} 알킬아민, 또는 C_{1 -10} 플루오로알킬일 수 있다. 일 실시양태에서, n은 0 내지 5일 수 있다. 디아민디옥심 킬레이트화제를 제조하는 방법의 예는 본원에 참고로 포함되는 PCT 출원 국제공개 WO2004080492(A1), 발명의 명칭 "생물학적 활성 벡터의 방사성 플루오르화 방법(Methods of radio fluorination of biologically active vector" 및 PCT 출원 국제공개 WO2006067376(A2), 발명의 명칭 "RGD-함유 펩티드의 방사성표지 접합체 및 클릭-화학반응을 통한 그의 제조방법(Radio labelled conjugates of RGD-containing peptides and methods for their preparation via click-chemistry)"에 기재되어 있다.

^{99 m}Tc는 단리 폴리펩티드의 N-말단에서 디아민디옥심을 통해 단리 폴리펩티드에 접합시킬 수 있다. 킬레이트화제는 2관능성 화합물일 수 있다. 일 실시양태에서, 2관능성 화합물은 Mal-cPN216일 수 있다. Mal-cPN216은 서열 1 또는 서열 2의 폴리펩티드의 말단 시스테인에의 접합을 위한 티올-반응성 말레이미드기 및 ^{99 m}Tc와의 킬레이트화를 위한 비스-아민옥심기(디아민디옥심 킬레이트화제)를 포함한다. Mal-cPN216은 화학식 II로 표시될 수 있다.

<화학식 II>

디아민디옥심 킬레이트화제-접합 펩티드는 (i) 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공한 다음, (ii) 디아민디옥심 킬레이트화제를 폴리펩티드와 반응시켜 디아민디옥심-접합 폴리펩티드를 형성함으로써 제조될 수 있다. 디아민디옥심 킬레이트화제는 ^{99 m}Tc와 추가로 접합시킬 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 폴리펩티드는 노타(1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N''-트리아세트산) 킬레이트화제를 통해 ⁶⁷Ga, 또는 ⁶⁸Ga와 접합시킬 수 있다. 노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드는 (i) 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공한 다음, (ii) 노타 킬레이트화제를 폴리펩티드와 반응시켜 노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드를 형성함으로써 제조될 수 있다. 노타 킬레이트화제는 ⁶⁷Ga 또는 ⁶⁸Ga와 추가로 접합시킬 수 있다.

일 실시양태에서, Ga, 구체적으로 ⁶⁷Ga는 노타 킬레이트화제를 통해 단리 폴리펩티드에 접합시킬 수 있다. 노타 킬레이트화제는 화학식 III에 기재된 바와 같이 말레이미도기로 관능화시킬 수 있다.

<화학식 III>

하나 이상의 실시양태에서, 폴리펩티드는 노타 (1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N''-트리아세트산) 킬레이트화제를 통해 Al¹⁸F와 접합시킬 수 있다. 노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드는 (i) 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공한 다음, (ii) 노타 킬레이트화제를 폴리펩티드와 반응시켜 노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드를 형성함으로써 제조될 수 있다. 노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드를 이어서 Al¹⁸F와 추가로 접합시켜 Al¹⁸F-노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드를 형성할 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 폴리펩티드는 노타 킬레이트화제를 통해 ¹⁸F와 접합시킬 수 있다. 노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드는 (i) 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하고, (ii) 노타 킬레이트화제를 ¹⁸F의 공급원(예를 들어, Al¹⁸F)과 반응시켜 ¹⁸F-노타 킬레이트화제를 형성한 다음; (iii) ¹⁸F-노타 킬레이트화제를 단리 폴리펩티드와 반응시켜 ¹⁸F-노타 킬레이트화제-접합 폴리펩티드를 형성함으로써 제조될 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 킬레이트화제는 각각 본원 기재의 킬레이트 모이어티(예를 들어, 노타, 도타) 단독 또는 킬레이트 모이어티와 링커를 포함할 수 있다. 한 예로서, 노타 킬레이트화제는 노타 킬레이트 모이어티 단독 또는 본원 기재의 링커에 부착된 노타 킬레이트 모이어티를 나타낼 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 폴리펩티드는 SiFA 화학반응을 통해 ¹⁸F와 접합시킬 수 있다. ¹⁸F-SiFA-접합 폴리펩티드는 (i) 서열 1, 서열 2, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하고; (ii) 폴리펩티드를 링커(여기에서, 링커는 실리콘 플루오라이드 억셉터(SiFA)기를 포함한다)와 반응시켜 SiFA-접합 폴리펩티드를 형성한 다음; (iii) SiFA-접합 폴리펩티드를 ¹⁸F 모이어티 또는 ¹⁸F의 공급원과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. ¹⁸F 모이어티 또는 ¹⁸F의 공급원은 SiFA기와 반응할 수 있는 임의의 그러한 모이어티 또는 공급원일 수 있고, 동위원소 불소 교환 화학반응을 거칠 수 있다. 하기 반응식 I은 [¹⁸F]SiF 커플링을 이용하는 Z02891(서열 2)의 방사성표지를 설명한다:

<반응식 I>

하나 이상의 실시양태에서, 본원 기재의 본 발명의 방사성표지 영상화제 또는 영상화제 조성물을 제조하는 방법은 자동화된다. 예를 들어, 본 발명의 방사성표지 영상화제 또는 영상화제 조성물은 자동 방사선합성 장치에 의해 자동화 방식으로 편리하게 제조될 수 있다. 트레이서랩(TRACERlab)^TM(예를 들어, 트레이서랩^TM MX) 및 패스트랩^TM(둘 모두 지이 헬스케어 리미티드(GE Healthcare Ltd.)로부터 입수)을 포함하여 그러한 플랫폼 장치의 몇몇 시판례가 존재한다. 그러한 장치는 통상적으로, 방사화학반응이 안에서 수행되고, 방사선합성을 수행하도록 그 장치에 맞게 설치되는, 종종 1회 용품인 "카세트"를 포함한다. 카세트는 보통 유로, 반응용기와, 시약 바이얼을 수용하는 포트 및 방사선합성후 청소 단계에 사용되는 임의의 고체상 추출 카트리지를 구비한다. 임의로는, 본 발명의 추가 실시양태에서, 자동 방사선합성 장치는 고성능 액체 크로마토그래프(HPLC)에 연결시킬 수 있다.

본 발명은 따라서 각각이 본원에서 정의되는 본 발명의 방사성표지 영상화제 또는 영상화제 조성물의 자동 합성을 위한 카세트를 제공한다.

본 발명은 또한 적어도 대상체의 일부를 영상화하는 방법을 포함한다. 일 실시양태에서, 방법은 본 발명의 방사성표지 영상화제 또는 영상화제 조성물을 대상체에 투여하고 대상체를 영상화하는 단계를 포함한다. 대상체는 예를 들어 진단 장치로 영상화할 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 영상화하는 방법은 대상체에로의 작용제 또는 조성물의 전달을 모니터링하는 단계 및 HER2-관련 병증(예를 들어, 유방암)이 있는 대상체를 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 세포 또는 조직을 포함할 수 있다. 조직은 생검에 사용될 수 있다. 진단 장치는 자기 공명 영상화, 광학적 영상화, 광학적 코히어런스(optical coherence) 단층촬영, X선, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT), 양전자 방출 단층촬영(PET), 또는 그들의 조합중에서 선택된 영상화 방법을 채용할 수 있다.

본 발명의 방사성표지 영상화제 또는 영상화제 조성물은 인간 및 기타 동물에 제약 조성물로서 비경구 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 본원 기재의 방사성표지 영상화제 또는 영상화제 조성물, 및 제약상 허용되는 담체, 부형제, 용매 또는 희석제를 포함한다.

예를 들어, 비경구 주사용 본 발명의 제약 조성물은 제약상 허용되는 멸균 수용액 또는 비-수용액, 분산액, 현탁액 또는 유상액, 및 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로의 재구성을 위한 멸균 분말을 포함한다. 적합한 수성 및 비-수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 그들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브 오일), 및 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르가 포함된다. 적정 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액중 입자 크기를 조정함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제, 및 분산제를 함유할 수 있다. 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시킴으로써 미생물 작용의 예방이 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당류, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 작용제를 포함시킴으로써 주사가능한 제약 형태의 장기간 흡수가 달성될 수 있다.

본 발명의 방사성표지 영상화제 또는 영상화제 조성물은 잠재적 독성을 최소화하기 위하여 생리학상 허용되는 담체에 분산시킬 수 있다. 따라서, 영상화제는 pH 약 6 내지 약 8의 생체적합성 용액에 분산시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 pH 약 7 내지 약 7.4의 생체적합성 용액에 분산시킨다. 다른 실시양태에서, 작용제는 pH 약 7.4의 생체적합성 용액에 분산시킨다.

본 발명의 영상화제 조성물 또는 제약 조성물은 화합물을 수성 매질에 현탁 또는 용해시키기 위하여 제약업계에서 통용되는 다른 첨가제와 병합될 수 있으며, 이어서 현탁액 또는 용액은 당업계 공지의 기술로 멸균시킬 수 있다. 영상화제 조성물은 다양한 형태로 투여될 수 있고 선택된 투여 경로에 적합시킬 수 있다. 예를 들어, 작용제는 국소(즉, 조직 또는 점막을 통해), 정맥내, 근육내, 피내, 또는 피하 투여될 수 있다. 주사용으로 적합한 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액, 분산액, 리포좀, 또는 유상액 제제의 제조용 멸균 분말을 포함한다. 흡입용으로 적합한 형태는 에어로졸에 분산시킨 것들과 같은 작용제를 포함한다. 국소 투여용으로 적합한 형태는 크림, 로션, 연고 등을 포함한다.

본 발명의 영상화제 조성물 또는 제약 조성물은 바람직한 양의 작용제를 대상체에 편리하게 전달하기 위하여 농축될 수 있으며 용기에 목적하는 형태로 포장될 수 있다. 작용제는 그 작용제를 대상체의 체중 kg당 0.1 mg 내지 50 mg 작용제 농도로 투여하는 것을 편리하게 돕는 생리학상 허용되는 용액에 작용제가 분산되는 용기에 분배될 수 있다.

하나 이상의 실시양태에서, 표적 조직은 작용제 투여 약 4시간 후에 영상화될 수 있다. 대체 실시양태에서, 표적 조직은 작용제를 대상체에 투여한 지 약 24시간 후에 영상화될 수 있다.

실시예

하기 실시예는 설명의 목적으로 제공될 뿐이며 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

재료

HER2을 발현하는 합리적 가능성이 있는 발암성 세포주의 패널을 표 3에 기재한 바와 같이 이용가능한 문헌("Bruskin, et al., Nucl. Med. Biol. 2004: 31: 205"; "Tran, et al., Imaging agent composition Chem. 2007: 18: 1956")에 기초하여 선택하였다.

모든 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 입수하였으며 권장하는 바대로 배양하였다. 세포를 사용에 앞서 > 90% 융합도(confluence)로 배양하였다. 간접 면역형광 염색의 정량분석을 위해 항-Her2 1차 항체(알 앤드 디 시스템즈(R&D Systems), PN MAB1129) 및 다코 카이파이키트(Dako QIFIKIT, PN K0078)를 사용하여 표 4에 수록된 세포주에 대하여 유동세포계측법(베크만 쿨터 사이토믹스(Beckman Coulter Cytomics) FC500 MPL)을 수행하였다. 상이한 개수의 Mab 분자를 보유한 5개 상이한 집단을 갖춘 캘리브레이션 비드를 세포주와 함께 사용하여 세포당 표면 수용체의 개수를 측정하였다. 모든 경우에서, 적당한 이소형 대조군은 상응하는 판매처로부터 입수하였다.

부착성 세포를 세포 표면 수용체의 단백질분해를 피하기 위하여 트립신보다는 세포 해리 완충제(PBS + 10 mM EDTA)를 사용하여 그들의 플라스크로부터 방출시켰다. 세포를 PBS에서 2회 세척하고 빙냉 FC 완충제(PBS + 0.5% BSA w/v)에서 5-10 x 10⁶ 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 100 ㎕ 분취량의 세포를 5 ㎍의 1차 항체와 혼합한 다음 얼음 위에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 이어서 1 mL의 빙냉 유동세포계측법(FC) 완충제(PBS + 2% 소 혈청 알부민)로 세척하고, 300 x g로 5 min 동안 원심분리한 다음, 0.5 ㎕의 FC 완충제에 재현탁시켰다. 2차 항체 단편(F(ab)₂ FITC-접합 염소 항-마우스 면역글로불린)의 PBS로의 1:50 희석액 100 ㎕를 가하고, 얼음 위에서 및 암실에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 이어서 1 mL의 빙냉 FC 완충제로 2회 세척하고, 300 x g에서 5 min 동안 원심분리한 다음, 500 ㎕의 FC 완충제에 재현탁시켰다. 모든 염색 세포를 유동세포계측법에 투입하기에 앞서 100-마이크로미터 필터에 통과시켜 유동 세포의 막힘을 방지하였다.

유동세포계측법은 베크만 쿨터 사이토믹스 FC500 MPL상에서 수행하였다. 각각의 튜브에 대하여 최소 5 x 10⁴ 이벤트를 수집하였다. 모든 분석은 단일 색상이었으며, FL1에서 FITC가 검출되었다. 전방 산란(FS) 및 측방 산란(SS) 데이터는 모든 세포 집단이 긴밀하게 군을 이루었음을 보여주었다.

유동세포계측법을 이용하여 세포를 시험관내에서의 그들의 HER2 발현에 대하여 평가하였으며(도 2a, 2b, 및 2c), SKOV3 세포가 최고 수준의 HER2 발현을 나타내었다(도 3). 도 3에서의 결과는 재현가능하였다(n=3).

최고 발현 세포주는 SKOV3이었다. 이들 세포를 6 내지 12주령 면역부전(immuno-compromised) 마우스에 주입하여 종양이 증식하도록 하였다. 종양 성장 곡선 및 성공률은 접종된 세포의 수에 좌우되었다. 최적 종양 성장은 3-4x10⁶ 세포/마우스로 달성되었다.

6 내지 15주령 범위의 암컷 CD-1 누드 마우스(찰스 리버 랩스(Charles River Labs), 미국 매사추세츠주 홉킨턴)로 생체내 연구를 수행하였다. 마우스를 환기가동한 래크에 먹이와 물의 자유 급식 및 표준 12시간 주야 조명 사이클하에 수용하였다. 이종이식의 경우, 동물에 PBS중 100 ㎕의 세포를 주입하였다. 세포를 우측 후반신(hindquarter)에 피하이식하였다. 이식은 이소플루란 마취하에서 수행하였다. SKOV3의 경우, 3 x 10⁶ 내지 4 x 10⁶ 세포를 각각의 마우스에 이식하였다. 이들 조건하에서, 사용할 수 있는 종양(100 내지 300 ㎍)은 3 내지 4주 안에 80%가 넘는 주입 동물에서 수득되었다.

해부하여 마우스로부터 종양을 수집하고, 전체 종양을 처리시까지 -20℃에서 저장하였다. 종양을 얼음 위에서 다운스(Dounce) 균질화기중 프로테아제 억제제 칵테일로 보충한 1 mL의 RIPA 완충제(산타 크루즈 바이오테크(Santa Cruz Biotech), 미국 캘리포니아주(우편번호: 24948) 산타 크루즈)에서 분쇄하였다. 균질화물을 이어서 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 냉장한 원심분리기에서 10,000 x G로 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 수집하여 추가 처리시까지 얼음 위에서 또는 4℃에서 저장하였다. 용해물중 단백질 농도는 BCA 단백질 검정 키트(피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology) 23225)를 사용하여 측정하였다. 용해물을 표준 농도로 희석하여 마이크로역가 플레이트에서 20 ㎍ 단백질/웰로 수득하였다. ELISA를 시판 인간 HER2 키트(알 앤드 디 시스템즈, DYC1129)로 제조업자의 지시에 따라 실행하였다. 각각의 샘플을 삼중(triplicate)으로 실행하였으며, 데이터는 pg HER2/㎍ 총 단백질로서 보고하고, 오차는 표준 편차로서 보고한다.

생체내에서의 표적 발현을 ELISA로 측정하였다. 절개한 종양을 균질화한 다음 시판 매칭 페어(matched pair) 키트(알 앤드 디 시스템즈, DYC1129, 미국 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 HER2에 대하여 분석하였다. 결과는 도 3에서 SKOV3 세포주가 고-발현 종양을 증식시킴을 보여준다. ELISA 대조군은 유동세포계측법에 사용된 음성 대조군 계통의 세포 배양 용해물이었다. 이들 결과는 SKOV3의 종양 이종이식이 인간 HER2을 표적화하는 분자의 생체내 연구에 적합하다는 것을 나타낸다.

모든 폴리펩티드는 애피바디® 에이비(Affibody® AB, 스웨덴)로부터 입수하였다. 폴리펩티드는 "Z"를 접두사로서 붙인 그들의 숫자 내부 개발 코드로 호칭된다. 표 1에 본원 기재의 폴리펩티드를 열거한다. 폴리펩티드는 폴리펩티드 Z00342(서열 1); 폴리펩티드 Z02891(서열 2); 폴리펩티드 Z00477(서열 3 및 4), 및 Z00477의 이량체, 즉 (Z00477)₂(서열 5)을 포함한다.

폴리펩티드와 HER2/neu 항원간의 결합 상호작용은 비아코어(Biacore)^TM 3000 기구(지이 헬스케어, 미국 뉴저지주 피스캣어웨이)상에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검출을 이용하여 시험관내에서 측정하였다. Her2/neu 항원의 세포외 도메인을 알 앤드 디 시스템즈(미국 미네소타주 미네아폴리스)로부터의 인간 IgG의 Fc 영역과의 접합체(Fc-Her2)로서 수득하여 10 ㎕/min로 HBS-EP 완충제(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20)로 미리 평형시킨 CM-5 덱스트란-관능화 센서 칩(지이 헬스케어, 미국 뉴저지주 피스캣어웨이)에 공유결합시키고 후속하여 EDC 및 NHS로 활성화하였다. 목적하는 고정화 수준(대략 3000 공명 단위)이 성취될 때까지(2 min) 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.5)중의 Fc-HER2(5 ㎍/mL)을 활성화된 센서 칩에 주입하였다. 센서 칩상의 잔여 활성화기를 에탄올아민(1M, pH 8.5)의 주입으로 봉쇄하였다. 2.5M NaCl, 50mM NaOH로의 반복(5x) 세척에 의해 임의의 비-공유결합 접합체를 제거하였다. 동일 센서 칩상의 제2 유동 셀을 Fc-HER2 고정화를 행하지 않은 것을 제외하고는 동일하게 처리하여 굴절률 변화 및 센서 칩과의 비-특이적 결합 상호작용에 대한 대조군 표면으로 작용하도록 하였다. 동적 연구에 앞서, 표적 검체의 결합을 양 표면에서 시험하였으며, 2.5M NaCl, 50mM NaOH로의 처리 뒤에 결합 검체의 충분한 제거 및 센서 칩의 재생을 확실히 하기 위하여 표면 안정성 실험을 수행하였다. 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어(지이 헬스케어, 미국 뉴저지주 피스캣어웨이)를 이용하여 SPR 센서그램을 분석하였다. 동적 모델의 견고성은 나머지의 평가와 계산된 동적 파라미터의 각각에 대한 표준 오차, "적합도(goodness of the fit)"(χ² < 10), 및 모델 센서그램과 실험 데이터의 직접 비교에 의하여 측정하였다. SPR 측정치를 8가지 검체 농도(0-100 nM 단백질)에서 수집하고 생성되는 센서그램을 1:1 랑뮈어(Langmuir) 결합 모델에 핏팅시켰다.

도 1은 인간 HER2-관능화 표면상에서 실행시 Z00477(서열 3) 및 (Z00477)₂(서열 5)에 대해 수득한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 데이터의 예를 도시한다. 이러한 관계는 친화도를 알고 있는 모든 폴리펩티드에 대해 들어맞으며(표 2), 여기에서 이량체 Z(477)2(서열 5)에 대한 값은 친화력(avidity) 효과에 기초한 개산(estimate)이다.

fac-[^99mTc(CO)₃]⁺ 코어를 이용한 His6(서열 7)-태그 폴리펩티드의 표지는 이전에 발표된 절차에 변경을 가하여 달성하였다(Waibel, R.; et al., A. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 897.). 간략하게, 염수(4 mCi, 2 mL)중의 Na[^{99 m}TcO₄]을 아이소링크(Isolink)^® 보라노카르보네이트 키트(Alberto, R. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 3135.)에 가하였다. 생성되는 용액을 95℃로 15 내지 20분 동안 가열하여 fac-[^{99 m}Tc(CO)₃(H₂O)₃]⁺을 수득하였다. 용액의 일부(2 mCi, 1 mL)를 제거한 다음 1N HCl로 pH 약 7이 되도록 중화시켰다. 325 ㎕ 분취량을 제거하여 His6-폴리펩티드(서열 7)의 용액(40 ㎍)에 가하였다. 생성되는 용액을 수조에서 35 내지 37℃로 40분 동안 가열하였다. 대표적인 방사화학적 수율은 80 내지 95%(ITLC-SG로 측정, 바이오덱스(Biodex), 0.9% NaCl) 범위였다. 조 반응산물을 NAP-5 칼럼(지이 헬스케어, 10mM PBS)상에서 크로마토그래피하여 >99% 방사화학적 순도의 산물을 수득하였다. 수득된 대표적인 비활성은 3 내지 4 μCi/㎍이었다. 생성되는 용액을 이어서 10 mM PBS로 희석하여 후속 생체내분포 연구를 위한 적정 농도를 수득하였다.

HPLC는 그레이스-바이댁 펩티드/프로테인(Grace-Vydac Peptide/Protein) C4(4.6 x 250 mm) 칼럼 및 레이테스트 가비(Raytest GABI) 방사능 검출기를 구비한 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC상에서 수행하였다. 용매 A는 95:5 물:MeCN + 0.1% TFA이었고, 용매 B는 5:95 물:MeCN + 0.1% TFA이었다. 구배는 다음과 같았다(모든 변화는 선형; 시간/%B): 0/0, 4/20, 16/60, 20/100, 25/100, 26/0, 31/0.

각각의 폴리펩티드를 정제 전에 고수율(>90%)로 트리카르보닐테크네슘 코어로 표지하였다. NAP-5 크로마토그래피로 정제하여 ^{99 m}Tc-표지 폴리펩티드의 샘플을 >99% 방사화학적 순도로 수득하였다(표 4).

NAP-5 정제된 방사성표지 폴리펩티드의 대표적인 HPLC 크로마토그램을 도 4에 도시하였다. 방사성표지 종의 체류시간은 220 nm UV 크로마토그램에서 상응하는 비-표지 폴리펩티드의 체류시간으로부터 (UV 및 감마 검출기의 물리적 분리에 기인한 시차를 제외하고는; 데이터 제시하지 않음) 사실상 불변하였다.

^{99 m}Tc(CO)₃(His₆)-폴리펩티드(서열 7로서 개시된 'His₆')의 연구에 사용된 동물 모델

6 내지 15주령 범위의 암컷 CD-1 누드 마우스(찰스 리버 랩스, 미국 매사추세츠주 홉킨턴)로 생체내 연구를 수행하였다. 마우스를 환기가동한 래크에 먹이와 물의 자유 급식 및 표준 12시간 주야 조명 사이클하에서 수용하였다. 이종이식의 경우, 동물에 PBS중 100 ㎕의 세포를 주입하였다. 세포를 우측 후반신에 피하이식하였다. 이식은 이소플루란 마취하에서 수행하였다. SKOV3의 경우, 3 x 10⁶ 내지 4 x 10⁶ 세포를 각각의 마우스에 이식하였다. 이들 조건하에서, 사용할 수 있는 종양(100 내지 300 ㎍)은 3 내지 4주 안에 80%가 넘는 주입 동물에서 수득되었다.

생체내분포

마우스에 약 1 ㎍의 ^{99 m}Tc-표지 폴리펩티드(약 3 μCi/1 ㎍)를 미정맥 주사하였다. 마우스를 안락사시킬 때까지 여과지-라이닝한 케이지에 두었다. 3마리 마우스를 각각의 시점에서 안락사시키고 관심의 대상이 되는 조직을 해부하여 퍼킨 엘머 월락 위저드 1480 감마 카운터(Perkin Elmer Wallac Wizard 1480 Gamma Counter)상에서 카운팅하였다. 혈액, 신장, 간, 비장, 및 주사 부위(꼬리)에 대하여 데이터를 수집하였다. 케이지로부터의 소변을 주머니로 모아 카운팅하였다. 나머지 조직을 카운팅하고, 각각의 동물에 대한 모든 조직 + 소변의 총량을 합산하여 총 주입량을 제공하였다. 이 총계에 기초하여 각각의 장기에 대한 %주입량을 측정하였으며, 그램당 %주입량(%ID/g)의 측정을 위해 장기를 칭량하였다. 데이터는 그 시점에서의 모든 3마리 마우스에 대한 평균치로서 보고되며, 오차 막대는 군의 표준 편차를 나타낸다.

^{99 m}Tc-표지 Z00477(서열 4) 폴리펩티드를 SKOV3 마우스에 주입하였다. 도 6은 이들 실험에 대한 종양 및 혈액 곡선을 도시한다. Z00477(서열 4) 폴리펩티드는 표적-발현 SKOV3 종양에서 양호한 종양 흡수를 보이며, 주사후(PI) 30분에서 조직의 그램당 주입량의 최대치는 대략 3%이고, 피크 종양:혈액 비율은 PI 240분에서 8보다 크다.

폴리펩티드는 혈액으로부터 단일지수(monoexponential) 클리어런스를 보이고 반감기는 2분 미만이다. 이러한 클리어런스는 주로 간 및 신장에 의해 매개된다. 표 5에 기재된 바와 같이, 비장에서의 폴리펩티드 흡수는 보통 정도였고, 간에서는 보통 내지는 높은 흡수가 관찰되었다.

2가 폴리펩티드는 상응하는 단량체보다는 좀더 높은 친화도를 보이는데, 추측컨대 친화력 효과에 기인한 듯하다. 그러나 그들의 좀더 큰 크기는 종양 침투를 방해할 수도 있다. HER2 폴리펩티드의 경우, 4종의 고-친화도 폴리펩티드 각각의 2가 형태가 이용가능하였다. Z00477(서열 3) 이량체인 (Z00477)₂(서열 5)을 방사성표지하여 SKOV3-종양형성 마우스에서의 4시간 생체내분포 실험용으로 사용하였다.

1가 및 2가 폴리펩티드는 유사한 생체내분포 특징을 보이며, 둘 모두에 대해 1 내지 2분 범위의 혈액 반감기가 관찰된다. 결과는 단량체성 및 2가 폴리펩티드 둘 모두가 생체내에서 HER2에게로 표적화될 수 있음을 명백히 나타낸다.

^{99 m}Tc 킬레이트화제 cPN216(도 7)을 도입하기 위하여, 폴리펩티드의 말단 시스테인과의 접합을 위한 티올-반응성 말레이미드기 및 ^{99 m}Tc를 킬레이트화하기 위한 아민 옥심기를 포함하여 이루어지는 2관능성 화합물 Mal-cPN216을 합성하였다.

cPN216-아민은 지이 헬스케어로부터 입수하였다. N-β-말레이미도프로피온산은 피어스 테크놀로지스(Pierce Technologies, 미국 일리노이주 록포드)로부터 구매하였다. N-메틸모르폴린, (벤조트리아졸-1-일옥시) 트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBoP), 디티오트레이톨(DTT), 중탄산암모늄, 및 무수 DMF은 알드리치(Aldrich, 미국 위스콘신주 밀워키)로부터 구매하였다. PBS 완충제(1x, pH 7.4)는 인비트로젠(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드)으로부터 입수하였다. HPLC-그레이드 아세토니트릴(CH₃CN), HPLC-그레이드 트리플루오로아세트산(TFA), 및 밀리포어(Millipore) 18 mΩ 물을 HPLC 정제에 사용하였다.

실시예 1

0℃의 무수 DMF중 N-β-말레이미도프로피온산(108 mg, 0.64 mmol), cPN216-아민(200 mg, 0.58 mmol)과 PyBoP(333 mg, 0.64 mmol)의 빙냉 용액에 DMF(128 ㎕, 1.16 mmol)중 0.4M의 N-메틸모르폴린을 가하였다. 2 hr 후 빙욕을 제거하고, 혼합물을 HPLC 정제에 투입하기 전에 실온에서 밤새 교반하였다. 산물 Mal-cPN216을 백색 분말(230 mg, 80% 수율)로서 수득하였다. 1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 1.35 (m, 2 H), 1.43 (s, 12 H), 1.56 (m, 5 H), 1.85 (s, 6 H), 2.33 (dd, J1 = 8 Hz, J2 = 4 Hz, 2 H), 2.78 (m, 4 H), 3.04 (m, 2 H), 3.61 (dd, J1 = 8 Hz, J2 = 4 Hz, 2 H), 7.02 (s, 2 H), 8.02 (s, 1 H), 8.68 (s, 4 H), 11.26 (s, 2 H); [M+H]⁺에 대하여 m/z = 495.2 (C24H43N6O5, MW 계산치 = 495.3).

폴리펩티드 Z00477(서열 3)을 새로 탈기한 PBS 완충제(1x, pH 7.4)로 대략 1 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 새로 탈기한 PBS 완충제(1x, pH 7.4)중의 DTT 용액을 가하여 폴리펩티드중의 디술파이드 결합을 환원시켰다. DTT의 최종 농도는 20 mM이었다. 반응 혼합물을 2시간 동안 와동시키고, 탈기 PBS 완충제(1x, pH 7.4)로 미리 평형시킨 제바(Zeba) 탈염 스핀 칼럼(피어스 테크놀로지스)에 통과시켜 과량의 DTT 시약을 제거하였다. 용출된 환원 폴리펩티드 분자를 수집하고, 2관능성 화합물 Mal-cPN216을 DMSO중의 용액으로서 (폴리펩티드의 당량당 20 당량으로) 가한 다음, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 와동시키고 액체 질소로 동결시켰다. 반응 혼합물을 역상 HPLC 정제에 투입하기에 앞서 밤새 저장하였다(도 8a 및 8b).

HPLC 정제는 마이크롬 매직(MiCHROM Magic) C18AQ 5　μ 200A 칼럼(마이크롬 바이오리소시즈(MiChrom Bioresources), 미국 캘리포니아주 오번)상에서 수행하였다. 용매 A: H₂O(+ 0.1% 포름산), 용매 B: CH₃CN(+ 0.1% 포름산). 구배: 30 min에 걸쳐서 5-100% B.

목적 산물을 함유하는 분획을 병합하여 100 mM 중탄산암모늄 용액으로 중화시킨 다음, 용매를 동결건조에 의해 제거하여 목적하는 영상화제 조성물을 백색 고체(수율 41%)로서 수득하였다.

정제 산물의 LC-MS 분석은 목적 산물의 존재를 확인시켜주었고, MW는 단 1종의 cPN216 표지물만이 폴리펩티드 구축물에 부가되었음을 시사하였다(Z00477(서열 3)-cPN216: MW 계산치: 7429 Da, 실측치: 7429 Da; Z02891(서열 2)-cPN216 MW 계산치: 7524 Da, 실측치: 7524 Da).

실시예 2

20 mL 바이얼에 10.00 mL의 증류 탈이온수를 가하였다. NaHCO₃(450 mg, 5.36x10^-3 mol), Na₂CO₃(60 mg, 5.66x10^-4 mol) 및 나트륨 파라-아미노벤조에이트(20 mg, 1.26x10^-4 mol)의 첨가에 앞서 이 용액에 대략 30분 동안 질소 가스를 통과시켜 버블링시켰다. 모든 시약은 독립적으로 칭량하고 물이 들어있는 바이얼에 가하였다. 염화주석(1.6 mg, 7.09x10^-6 mol)과 MDP(2.5 mg, 1.42x10^-5 mol)을 1 드램 바이얼에 함께 칭량해 넣고 후속하여 대략 1 mL의 카르보네이트 완충제 혼합물에 고속 현탁시켜 (1회 후속 세척으로) 이송하였다. 10 ㎕ 분취량을 제거하여 질소 스트림하에서 실란처리한(silanized) 바이얼로 이송하고, 즉시 동결시킨 다음, 동결건조시까지 액체 질소욕에서 유지시켰다. 각각의 바이얼을 고무 격막으로 부분적으로 마개를 한 다음 트레이 동결건조기에 밤새 넣어두었다. 바이얼을 진공하에서 밀봉하여 동결건조기에서 꺼내고, 알루미늄 마개로 크림프-밀봉(crimp-sealed)한 다음, 무수 질소로 재-가압하고, 장래 사용시까지 냉동기에 저장하였다.

실시예 3

테크네슘에 대한 환원제로서 염화주석, 메틸렌 디포스폰산, 유리 라디칼 포착제로서 p-아미노벤조에이트와 완충제로서 중탄산나트륨/탄산나트륨(pH 9.2)의 동결건조 혼합물을 함유하는 가내 제작한 1단계 키트 제제(켈라키트(Chelakit) A+)를 사용하여 방사성표지 폴리펩티드 합성을 수행하였다. 바로 잇따라, 염수중 폴리펩티드의 2 ㎍/mL 용액 20 ㎕를 켈라키트에 가하고, 이어서 카디널 헬스(Cardinal Health, 미국 뉴욕주 알바니)로부터 입수한 0.080 mL의 염수(0.15M NaCl)중의 Na^99mTcO₄(0.8 mCi, 29.6 MBq)을 즉시 가하였다. 혼합물을 1회 교반하고 주위온도에서 20 min 동안 방치하였다. 완료시, 조 방사화학적 수율을 ITLC로 측정하였다(하기 표 6, ITLC-SG에 따라, 바이오덱스, 0.9% NaCl).

0.35 mL의 150mM 멸균 NaCl로 반응 용적을 0.45 mL가 되도록 증가시키고, 최종 산물을 크기 배제 크로마토그래피(NAP5, 지이 헬스케어, 10mM PBS 충전)로 정제하였다. 조 반응 혼합물을 NAP5 칼럼에 로딩하고, 겔 베드에 유입시킨 다음, 최종 정제 산물을 0.8 mL의 10mM PBS로의 용출 후 단리하였다. 최종 활성을 표준 검량계(CRC-15R, 캡인텍(Capintec), 미국 뉴저지주 램지)에서 검정하였다. 방사화학적 수율(표 6) 및 순도를 ITLC(>98.5%), C4 RP-HPLC(도 9) 및 SEC-HPLC 분석에 의하여 측정하였다. 최종 산물(10-15μCi/mg, 0.2-0.5 μCi/㎕(0.37MBq/㎍, 7.4MBq/mL))을 생체내분포 연구에 바로 사용하였다.

당해 실험에 사용된 HPLC 조건은 다음과 같았다: C4 RP-HPLC 방법 1: 용매 A: 95/5 H₂O/CH₃CN (+ 0.05% TFA), 용매 B: 95/5 CH₃CN/ddH₂O(증류 탈이온수) + 0.05% TFA. 구배 용출: 0 min. 0%B, 4 min. 20%B, 16 min. 60%B, 20 min. 100%B, 25 min. 100%B, 26 min. 0%B, 31 min. 0%B.

C4 RP-HPLC 방법 2: 용매 A: 수중 0.06% NH₃, 용매 B: CH₃CN. 구배 용출: 0 min. 0%B, 4 min. 20%B, 16 min. 60%B, 20 min. 100%B, 25 min. 100%B, 26 min. 0%B, 31 min. 0%B.

G1311A 쿼트펌프(QuatPump), 100 ㎕ 시린지와 2.0 mL 시트 모세관이 달린 G1313A 자동주입기, 그레이스 바이댁 - 단백질 C4 칼럼(S/N E050929-2-1, 4.6 mm x 150 mm), G1316A 칼럼 히터, G1315A DAD 및 레이먼 스타(Ramon Star) - 가비 감마-검출기를 구비한 HP 애질런트 1100상에서 RP-HPLC 분석을 수행하였다.

SEC HPLC: 용매: 1x(10 mM) PBS(기브코(Gibco), 인비트로젠, pH 7.4, CaCl₂ 및 MgCl₂ 함유). 30 min 동안 등용매 용출. 분석은 다음에서 수행하였다: 퍼킨 엘머 SEC-4 솔벤트 인바이런멘털 컨트롤(Perkin Elmer SEC-4 Solvent Environmental control), 시리즈 410 LC 펌프, ISS 200 어드밴스트 LC 샘플 프로세서 및 시리즈 200 다이오드 어레이 검출기(Series 200 Diode Array Detector). 소켓 8103 0111 핀홀(0.7 mm 내경, 250　㎕ 용적) 유동 세포 감마 검출기를 구비한 레이테스트 가비를 퍼킨 엘머 NCI 900 네트워크 크로마토그래피 인터페이스(Perkin Elmer NCI 900 Network Chromatography Interface)를 통해 접속시켰다. 사용된 칼럼은 수퍼덱스 75 10/300 GL 고성능 SEC 칼럼(Superdex 75 10/300 GL High Performance SEC column, 지이 헬스케어. 코드번호: 17-5174-01, ID no. 0639059)이었다.

^{99 m}Tc를 cPN216 킬레이트(pH = 9.2)중으로 혼입시키기 위해 사용된 켈라키트의 작동 pH는 Z00477(서열 3) 폴리펩티드의 계산된 pI와 거의 매치되었다. 이들 조건하에서의 표지를 측정하여 최종 산물에서 응집을 유발하였다(도 5a 및 5b). 응집은 크기 배제 HPLC에 의해 및 생체내분포 연구에서 관찰된 증가된 혈액 체류시간 및 간 흡수를 통해 확인되었다. 폴리펩티드의 등전점을 변경시킴으로써, ^{99 m}Tc을 Z02891(서열 2) 구축물에 성공적으로 혼입시켰다. 크기 배제 HPLC은 적정 분자량을 갖는 종의 존재를 확인시켜주었고 생체내분포 연구는 종양 이종이식편중으로의 트레이서의 흡수를 보여주었다.

생체내 연구는 6 내지 15주령 범위의 암컷 CD-1 누드 마우스(찰스 리버 랩스, 미국 매사추세츠주 홉킨턴)로 수행하였다. 마우스를 환기가동한 래크에 먹이와 물의 자유 급식 및 표준 12시간 주야 조명 사이클하에 수용하였다. 이종이식의 경우, 동물에 PBS중 100 ㎕의 세포를 주입하였다. 세포를 우측 후반신에 피하이식하였다. 이식은 이소플루란 마취하에서 수행하였다. SKOV3의 경우, 3 x 10⁶ 내지 4 x 10⁶ 세포를 각각의 마우스에 이식하였다. 이들 조건하에서, 사용할 수 있는 종양(100 내지 300 ㎍)은 3 내지 4주 안에 80%가 넘는 주입 동물에서 수득되었다.

마우스에 약 1 ㎍의 ^{99 m}Tc-표지 폴리펩티드(약 10 μCi/1 ㎍)를 미정맥 주사하였다. 마우스를 안락사시킬 때까지 여과지-라이닝한 케이지에 두었다. 3마리 마우스를 각각의 시점에서 안락사시키고 관심의 대상이 되는 조직을 해부하여 퍼킨 엘머 월락 위저드 1480 감마 카운터상에서 카운팅하였다. 혈액, 신장, 간, 비장, 및 주사 부위(꼬리)에 대하여 데이터를 수집하였다. 케이지로부터의 소변을 주머니로 모아 카운팅하였다. 나머지 조직을 카운팅하고, 각각의 동물에 대한 모든 조직 + 소변의 총량을 합산하여 총 주입량을 제공하였다. 이 총계에 기초하여 각각의 장기에 대한 %주입량을 측정하였으며, 그램당 %주입량(%ID/g)의 측정을 위해 장기를 칭량하였다. 데이터는 그 시점에서의 모든 4 내지 5마리 마우스에 대한 평균치로서 보고되며, 오차 막대는 군의 표준 편차를 나타낸다. 4시간에 걸쳐서 4개 시점을 취하였다(주사후 5, 30, 120, 및 240분).

Z02891(서열 2)-cPN216-^{99 m}Tc 폴리펩티드는 표적-발현 SKOV3 종양에서 강력한 종양 흡수를 보이며, 주사후(PI) 30분에서 조직의 그램당 주입량은 7.11±1.69%(n=5)의 값을 가지며, 이 값은 주사후 240 min까지의 연구의 시간적 경과에 걸쳐서 상당히 일정하게 존속한다. 종양:혈액 비율은 주사후 30, 120, 및 240 min에서 각각 2, 5, 및 5이었다. 도 10, 11 및 12는 이들 실험에 대한 종양, 혈액 및 종양:혈액 곡선을 도시한다.

폴리펩티드는 혈액으로부터 단일지수 클리어런스를 보이고 반감기는 2분 미만이다. 이러한 클리어런스는 주로 신장에 의해 매개되며, 주사후 240 min에서 10.58±2.96(n=5) ID/장기의 값을 갖는다. 활성은 주로 소변에 분비된다. 비장에서의 폴리펩티드 흡수는 일어날 수 있는 응집에 기인하여 보통 내지는 높았고, 간에서는 보통 정도의 흡수가 관찰되었으며, 예를 들어 연구과정 전반에 걸쳐서 12%ID/장기(마우스에서의 값으로는 %ID/g에 상당)의 값이었다.

Z02891 (서열 2)- cPN216 - ^{99 m} Tc 에 대한 생체내분포 결과

실시예 4

Z00477(서열 4), Z00342(서열 1) 및 Z02891(서열 2)-시스테인 폴리펩티드를 조작된 C-말단 시스테인을 통해 아미녹시기로 관능화하였다. 제공된 폴리펩티드 분자의 순도는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 >95%인 것으로 측정되었다.

실시예 5

¹⁸F을 폴리펩티드 분자중으로 혼입시키기 위하여, 두 직교기: 조작된 시스테인과의 접합을 위한 티올-반응성 말레이미드기 및 알데히드-반응성 아미녹시기(도 13a 및 13b)를 포함하여 이루어지는 2관능성 링커 Mal-아미노옥시를 합성하였다. 당해 링커는 링커의 Boc-보호 형태를 산출하는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이미드(EDC)-매개 커플링 조건을 사용하여 N-(2-아미노에틸) 말레이미드를 2-(tert-부톡시카르보닐아미노옥시) 아세트산과 반응시킴으로써 제조하였다. Boc 보호기를 이어서 산 절단에 의해 탈보호시켜 최종 Mal-AO 산물을 정량적 수율로 수득하였다. 최종 산물은 추가 정제없이 직접 사용하였다.

일반

디클로로메탄, 2-(tert-부톡시카르보닐아미노옥시) 아세트산, 트리에틸아민, N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세트산(TFA) 염, N-히드록시벤조트리아졸 수화물(HOBT), 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드(EDC), 디티오트레이톨(DTT), 및 그 밖의 모든 표준 합성 시약은 시그마-알드리치 케미컬 컴퍼니(Sigma-Aldrich Chemical Co., 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구매하였다. 모든 화학약품은 추가 정제없이 사용하였다. PBS 완충제(1x, pH 7.4)는 인비트로젠(미국 캘리포니아주 칼스배드)으로부터 입수하였다. HPLC-그레이드 에틸 아세테이트, 헥산, 아세토니트릴(CH₃CN), 트리플루오로아세트산(TFA), 및 밀리포어 18 mΩ 물을 정제에 사용하였다.

실시예 6

무수 디클로로메탄(20 mL)중 2-(tert-부톡시카르보닐아미노옥시)아세트산(382 mg, 2 mmol)의 용액에 트리에틸아민(307 ㎕, 2.2 mmol), N-(2-아미노에틸)말레이미드-TFA 염(508 mg, 2 mmol), HOBT(306 mg, 2 mmol), 및 EDC(420 mg, 2.2 mmol)을 순차적으로 가하였다. 실온에서 24 hr 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(50 mL)로 희석하고 포화 중탄산나트륨 용액(3 x 30 mL), 물(30 mL), 및 염수(30 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘상에서 건조시키고 여과하였다. 여액을 담황색 고체로 농축한 다음, 이를 칼럼 크로마토그래피(헥산중 70% 에틸 아세테이트)로 정제하여 산물을 백색 분말(500 mg, 80% 수율)로서 수득하였다. ¹H-NMR (400MHz, CDCl₃): δ 1.50 (s, 9 H), 3.55 (tt, J1= 6.0 Hz, J2= 6.5 Hz, 2 H), 3.77 (dd, J= 7.6 Hz, 2 H), 4.30 (s, 2 H), 6.3 (s, 2 H).

실시예 7

메탄올중의 1 mL의 3M HCl중 Mal-AO-Boc 9.3 mg의 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에서 제거하여 Mal-AO을 담황색 고체로서 수득하였다. (80% 수율). ¹H-NMR (400MHz, DMSO-d₆): δ 3.27 CH₂ (t, J= 4.0 Hz, 2H), 3.49 CH₂ (t, J= 4.0 Hz, 2H), 4.39 CH₂O (s, 2H), 7.00 CH=CH (s, 2H); [M+H]⁺에 대하여 m/z = 214.07 (C₈H₁₂N₃O₄, MW 계산치 = 214.11))

실시예 8

폴리펩티드(Z00477(서열 4), Z00342(서열 1) 또는 Z02891(서열 2))을 새로 탈기한 PBS 완충제(1x, pH 7.4)로 대략 1 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 폴리펩티드중의 디술파이드 결합을 새로 탈기한 PBS 완충제(1x, pH 7.4)중의 디티오트레이톨(DTT) 용액을 첨가함으로써 환원시켰다. DTT의 최종 농도는 20 mM이었다. 반응 혼합물을 2시간 동안 와동시킨 다음 탈기 PBS 완충제로 미리 평형시킨 제바 탈염 스핀 칼럼(피어스 테크놀로지스)을 통해 용출시켜 과량의 DTT 시약을 제거하였다. 환원 폴리펩티드를 수집하고, 2관능성 Mal-AO 화합물을 DMSO중의 용액으로서 (폴리펩티드의 당량당 15 당량으로) 가하였다. 실온에서 밤새 와동시킨 후, 반응 혼합물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다(도 14a 및 14b).

HPLC 정제는 마이크롬 매직 C18AQ 5μ 200A 칼럼(마이크롬 바이오리소시즈, 미국 캘리포니아주 오번)상에서 수행하였다. 용매 A: H₂O (+ 0.1% 포름산), 용매 B: CH₃CN (+ 0.1% 포름산). 구배: 30 min에 걸쳐서 5-100% B. 목적 산물을 함유하는 분획을 병합하여 100 mM 중탄산암모늄 용액으로 중화시키고, 용매를 동결건조에 의하여 제거하여 아미녹시-변형 폴리펩티드를 백색 고체로서 수득하였다.

ESI-TOF-MS 분석은 기대 분자량을 갖는 표적 산물의 존재를 확인시켜주었다(Z00477(서열 4)-ONH₂, Z00342(서열 1)-ONH₂, 및 Z02891(서열 2)-ONH₂ 대하여 각각, MW 계산치: 6964 Da, 8531 Da, 및 7243 Da, 실측치: 6963 Da, 8532 Da, 및 7244 Da).

실시예 9: ¹⁸ FBA 의 제조

방법: 모든 반응은 질소 분위기하에서 또는 사용에 앞서 질소로 퍼지한 크림프-탑 밀봉 바이얼에서 수행하였다. 크립토픽스 222(Kryptofix 222, 알드리치) 및 K₂CO₃(이엠디 사이언스, EMD Science)는 구매하여 수령한 그대로 사용하였다. 옵티마(Optima)^TM-그레이드 아세토니트릴이 HPLC 및 반응 용매 둘 모두로서 사용되었다.

K¹⁸F(정제수중 40mCi^.mL^-1(1480 MBq^.mL^-1))은 아이비에이 몰리큘라(IBA Molecular, 미국 뉴욕주 알바니) 및 펫넷 솔루션즈(PETNET Solutions, 미국 뉴욕주 알바니)로부터 입수하여 수령한 그대로 사용하였다. [¹⁸F^-] 플루오라이드를 먼저 크로마픽스(Chromafix) 30-PS-HCO3 음이온 교환 카트리지(에이비엑스(ABX), 독일 라데베르크)상에 고정화하고, 이어서 크립토픽스 K222(376 g.mol^-1, 8 mg, 2.13x10^-5 mol)와 탄산칼륨(138.2 g.mol^-1, 2.1 mg, 1.52x10^-5 mol)을 함유하는 아세토니트릴:증류 탈이온 H₂O(ddH₂O)의 4:1 혼합물 1 mL로 건조 용기에 용출시켰다. 부분 진공 및 질소 유동하에서 완만한 가열(약 45℃)(약 15 min)로 용매를 제거하였다. 소스 바이얼 및 음이온 교환 카트리지를 이어서 K222(8 mg)을 함유하는 0.5 mL의 아세토니트릴로 세척하고 반응 혼합물을 부분 진공 및 완만한 가열(약 10 min)하에서 재차 건고시켰다. 반응용기를 질소로 재-가압하고 가외의 0.5 mL 아세토니트릴로 공비 건조를 1회 반복하였다. 4-포르밀-N,N,N-트리메틸아닐리늄 트리플레이트(313.30 g^.mol^-1, 3.1 mg, 9.89x10^-6 mol)를 0.35 mL의 무수 DMSO(아크로스, Acros)에 용해시킨 다음, K¹⁸F^.K222, K₂CO₃를 함유하는 반응용기에 직접 가하였다. 반응 혼합물을 90℃로 15 min 동안 가열하고 3 mL의 ddH₂O로 즉시 냉각 및 급랭하였다. 당해 혼합물을 후속하여 양이온 교환 카트리지(워터스 셉팩 라이트 액셀 플러스 시엠, Waters SepPak Light Accell Plus CM)에 통과시키고, ddH₂O로 10 mL이 되도록 희석한 다음, 역상 C18 셉팩(워터스 셉팩 플러스 C18)에 로딩하였다. 셉팩을 10 mL의 ddH₂O로 플러시하고 이어서 30 mL의 공기로 퍼지하였다. [¹⁸F]4-플루오로벤즈알데히드(¹⁸FBA)를 1.0 mL의 메탄올 중에 용출시켰다.

실시예 10

별도로, 고-회수 바이얼(2 mL, 내셔널 사이언티픽, National Scientific)에 Z00477-(서열 3)-ONH₂(0.35-0.5 mg), Z00342-(서열 1)-ONH₂(0.35-0.5 mg) 또는 Z02891-(서열 2)-ONH₂(0.35-0.5 mg)을 장입하였다. 고체를 25 ㎕의 ddH₂O와 8 ㎕의 트리플루오로아세트산에 현탁시켰다. 메탄올중 25 ㎕의 ¹⁸FBA(실시예 9 참조)을 반응 바이얼로 이송하였다. 용기를 뚜껑을 덮고, 크림핑하여 가열 블록에 넣은 다음 60℃에서 15분 동안 유지시켰다; 그 시점에서 적은 분취량(<5 ㎕)을 분석용 HPLC 분석을 위해 제거하였다. 반-정제용 HPLC 정제를 위한 준비에서 450 ㎕의 ddH₂O+0.1% TFA를 사용하여 용액을 대략 500 ㎕가 되도록 희석하였다. ¹⁸FB-폴리펩티드를 단리하여 반-정제용 HPLC로 정제하였다. 산물(0.113 mCi/4.18MBq)을 함유하는 HPLC 분획을 ddH₂O로 5:1 희석하고 후속하여 tC18 플러스 셉팩(워터스)상에 고정화하였다. 셉팩을 먼저 5 mL의 ddH₂O, 이어서 30 mL의 공기로 플러시하였다. 먼저 공극 용적(대략 0.5 mL)을 용출시키고 이어서 250 내지 300 ㎕의 용리액을 별도의 플라스크에 수집함으로써 최소량의 에탄올로 ¹⁸FB-폴리펩티드를 단리하였다. RP-HPLC 분석을 단리 산물에 대하여 수행하여 방사화학적 및 화학적 순도를 확정하였다. 전형적으로, 10 ㎕의 0.1 μCi/㎕ 용액을 조제후 분석을 위해 주입하였다. 단리 방사화학적 수율을 표 9에 나타내었으며, ¹⁸FBA에로 폴리펩티드의 첨가 및 >99%의 방사화학적 순도로부터 붕괴보정하였다. 이와 달리, ¹⁸F-표지 폴리펩티드는 반응 혼합물을 10mM PBS로 대략 0.5 mL이 되도록 희석한 다음 겔에 로딩함으로써 NAP5 크기 배제 크로마토그래피로 단리하였다. ¹⁸F-표지 폴리펩티드는 칼럼을 0.8 mL의 10mM PBS로 용출시킴으로써 단리하고 추가 변형없이 사용하였다. 이들 결과를 표 8 및 도 15에 나타내었다.

사용된 분석용 HPLC 조건은 다음과 같다: 분석은 G1311A 쿼트펌프, 100 ㎕ 시린지와 2.0 mL 시트 모세관이 달린 G1313A 자동주입기, 페노메넥스 제미니(Phenomenex Gemini) C18 칼럼(4.6mm x 150mm), 5μ, 100Å(S/N 420477-10), G1316A 칼럼 히터, G1315A DAD 및 레이먼 스타 -가비 감마-검출기를 구비한 HP 애질런트 1100상에서 수행하였다. 95:5 ddH₂O:CH₃CN + 0.05% TFA, 용매 B: CH₃CN + 0.05% TFA. 구배 용출 (1.0 mL^.min^-1): 0 min. 0%B, 1 min. 15%B, 21 min. 50%B, 22 min. 100%B, 26 min. 100%B, 27 min. 0%B, 32 min. 0%B. 또는 구배 용출 (1.2 mL^.min^-1): 0 min. 0%B, 1 min. 15%B, 10 min. 31%B, 10.5 min. 100%B, 13.5 min. 100%B, 14 min. 0%B, 17 min. 0%B.

사용된 반-정제용 HPLC 조건은 다음과 같다: 정제는 DG-2080-54 4-라인 디개서(Degasser), MX-2080-32 다이내믹 믹서 및 두 개의 PU-2086 플러스 프렙(Plus Prep) 펌프, 대용적 주입 키트가 설치된 AS-2055 플러스 인텔리전트(Plus Intelligent) 자동주입기, 페노메넥스 5μ 루나(Luna) C18(2) 100Å, 250 x 10 mm, 가드가 달린 5μ 칼럼(S/N 295860-1, P/N 00G-4252-N0), MD-2055 PDA 및 고체 상태 SiPIN 광다이오드 감마 검출기에 부착된 캐롤 앤드 램지 어소시에이츠 모델 105S 아날로그 레이트미터(Carroll & Ramsey Associates Model 105S Analogue Ratemeter)를 구비한 자스코 LC(Jasco LC)상에서 수행하였다. 구배 용출: 0 min. 5%B, 32 min. 20%B, 43 min. 95%B, 46 min. 95%B, 49 min. 5%B, 용매 A: ddH₂O:CH₃CN + 0.05% TFA, 용매 B: CH₃CN + 0.05% TFA.

실시예 11

생체내 연구를 6 내지 15주령 범위의 암컷 CD-1 누드 마우스(찰스 리버 랩스, 미국 매사추세츠주 홉킨턴)로 수행하였다. 마우스를 환기가동한 래크에 먹이와 물의 자유 급식 및 표준 12시간 주야 조명 사이클하에 수용하였다. 이종이식의 경우, 동물에 PBS중 100 ㎕의 세포를 주입하였다. 세포를 우측 후반신에 피하이식하였다. 이식은 이소플루란 마취하에서 수행하였다. SKOV3의 경우, 3 x 10⁶ 내지 4 x 10⁶ 세포를 각각의 마우스에 이식하였다. 이들 조건하에서, 사용할 수 있는 종양(100 내지 300 ㎍)은 3 내지 4주 안에 80%가 넘는 주입 동물에서 수득되었다.

마우스에 약 1 ㎍의 ¹⁸F-표지 폴리펩티드(약 4 μCi/1 ㎍)를 미정맥 주사하였다. 마우스를 안락사시킬 때까지 여과지-라이닝한 케이지에 두었다. 3마리 마우스를 각각의 시점에서 안락사시키고 관심의 대상이 되는 조직을 해부하여 퍼킨 엘머 월락 위저드 1480 감마 카운터상에서 카운팅하였다. 혈액, 신장, 간, 비장, 뼈 및 주사 부위(꼬리)에 대하여 데이터를 수집하였다. 케이지로부터의 소변을 주머니로 모아 카운팅하였다. 나머지 조직을 카운팅하고, 각각의 동물에 대한 모든 조직 + 소변의 총량을 합산하여 총 주입량을 제공하였다. 이 총계에 기초하여 각각의 장기에 대한 %주입량을 측정하였으며, 그램당 %주입량(%ID/g)의 측정을 위해 장기를 칭량하였다. 데이터는 그 시점에서의 모든 3마리 마우스에 대한 평균치로서 보고되며, 오차 막대는 군의 표준 편차를 나타낸다.

폴리펩티드는 SKOV3 세포 이종이식 모델에서 생체내분포 연구를 거쳤다. 4시간에 걸쳐서 4개 시점을 취하였다(주사후 5, 30, 120, 및 240분). 완전한 생체내분포 데이터를 표 12(SKOV3 종양-담지 마우스에서의 %ID/g Z02891(서열 2)- ¹⁸F-플루오로벤질 옥심) 및 표 13(SKOV3 종양-담지 마우스에서의 %ID/g Z00342(서열 1) ¹⁸F-플루오로벤질 옥심)에 실었다. 도 16, 17 및 18은 이들 시험에 대한 종양, 혈액, 종양:혈액, 및 클리어런스 곡선을 도시한다.

Z02891(서열 2) ¹⁸F-플루오로벤질 옥심 폴리펩티드는 표적-발현 SKOV3 종양에서 강력한 종양 흡수를 보이며, 주사후(PI) 240분에서 조직의 그램당 주입량은 17.47±2.89(n=3)의 값을 갖는다. 종양:혈액 비율은 각각 주사후 30, 120, 및 240 min에서 대략 3, 34, 및 128이었다. Z00342(서열 1) ¹⁸F-플루오로벤질 옥심 폴리펩티드는 표적-발현 SKOV3 종양에서 강력한 종양 흡수를 보이며, 주사후 240분에서 조직의 그램당 주입량은 12.45±2.52(n=3)의 값을 갖는다. 종양:혈액 비율은 주사후 30, 120, 및 240 min에서 각각 대략 3, 32 및 53이었다.

폴리펩티드는 혈액으로부터 단일지수 클리어런스를 보이고 반감기는 2분 미만이다. Z02891(서열 2)의 이러한 클리어런스는 주로 신장에 의해 매개되며, 주사후 240 min에서 0.95±0.07(n=3) ID/장기의 값을 갖는다. 활성은 주로 소변에 분비된다. 비장에서의 폴리펩티드 흡수가 최소였고, 간에서는 낮은 흡수가 관찰되었으며, 연구과정(주사후 4시간) 전반에 걸쳐서 약 1.8%ID/장기(마우스에서의 값으로는 %ID/g에 상당)의 값이었다.

일반

모든 반응은 질소 분위기하에서 또는 질소로 퍼지한 크림프-탑 밀봉 바이얼에서 수행하였다. 옵티마^TM-그레이드 아세토니트릴이 HPLC 및 반응 용매 둘 모두로서 사용되었다.

실시예 12

[¹²³I]4-아이오도벤즈알데히드(¹²³IBA)를 폴리펩티드-ONH₂(Z02891, 서열 2, 0.35-0.5 mg)을 함유하는 고-회수 바이얼(2 mL, 내셔널 사이언티픽)에 가하였다. 폴리펩티드를 25　㎕의 ddH₂O에 용해시키고 8 ㎕의 트리플루오로아세트산을 가한 다음 이어서 메탄올중의 ¹²³IIBA를 가함으로써 반응을 개시하였다. 용기를 뚜껑을 덮고, 크림핑하여 가열 블록에 넣은 다음 60℃에서 15분 동안 유지시키고; 분석용 HPLC 분석을 위한 적은 분취량(<5 ㎕)의 제거를 행하여 반응의 상태를 평가하였다. 반응 혼합물을 반-정제용 HPLC 정제를 위한 준비에서 0.1% TFA을 함유하는 ddH₂O:아세토니트릴 혼합물의 최소 1:1 혼합물이 되도록 희석하였다. ¹²³IB-폴리펩티드를 단리하여 반-정제용 HPLC 또는 NAP5 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 산물을 함유하는 HPLC 분획을 ddH₂O로 추가 희석하고(5:1) 후속하여 tC18 플러스 셉팩(워터스)상에 고정화하였다. 먼저 공극 용적(대략 0.5 mL)을 용출시킨 다음 이어서 250 내지 300 ㎕의 용리액을 별도의 플라스크에 수집함으로써, 셉팩을 먼저 5 mL의 ddH₂O로, 이어서 30 mL의 공기로 플러시하여 최소량의 에탄올로 ¹²³IB-폴리펩티드를 수득하였다. RP-HPLC 분석을 단리 산물에 대하여 수행하여 방사화학적 및 화학적 순도를 확정하였다.

실시예 13: 67 Ga - 노타 - Z00477 (서열 3)의 제조

폴리펩티드 Z00477(서열 3)을, 노타(1,4,7-트리아자시클로노난-N,N',N''-트리아세트산) 킬레이트화제를 상기 폴리펩티드와 접합시킨 후, Ga, 구체적으로는 ⁶⁷Ga로 표지하였다. (도 19)

폴리펩티드 분자에로의 Mal-노타의 생접합을 다음과 같이 달성하였다. 폴리펩티드를 새로 탈기한 PBS 완충제(1x, pH 7.4)로 대략 1 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 폴리펩티드중의 디술파이드 결합을 새로 탈기한 PBS 완충제(1x, pH 7.4)중의 DTT 용액을 첨가함으로써 환원시켰다. DTT의 최종 농도는 20 mM이었다. 반응 혼합물을 2시간 동안 와동시킨 다음 탈기 PBS 완충제(1x, pH 7.4)로 미리 평형시킨 제바 탈염 스핀 칼럼(피어스 테크놀로지스)에 통과시켜 과량의 DTT 시약을 제거하였다. 용출된 환원 폴리펩티드 분자를 수집하고, 2관능성 화합물 Mal-노타를 DMSO중의 용액으로서 (폴리펩티드의 당량당 15 당량으로) 가하고, 혼합물을 실온에서 와동시켰다. 반응을 밤새 진행시켜 폴리펩티드 분자의 완전 전환을 확보하였다.

HPLC 정제는 마이크롬 매직 C18AQ 5μ 200A 칼럼(마이크롬 바이오리소시즈, 미국 캘리포니아주 오번)상에서 수행하였다. 용매 A: H₂O (+ 0.1% 포름산), 용매 B: CH₃CN (+ 0.1% 포름산). 구배: 30 min에 걸쳐서 5-100% B. (도 20a)

목적 산물을 함유하는 분획을 병합하여 100 mM 중탄산암모늄 용액으로 중화시키고, 용매를 동결건조에 의하여 제거하여 접합된 폴리펩티드를 백색 고체로서 수득하였다.

정제 산물의 LC-MS 분석은 목적 산물의 존재를 확인시켜주었고, MW는 단 1종의 노타 킬레이트화제만이 폴리펩티드 구축물에 부가되었음을 시사하였다(Z00477(서열 3)-노타에 대한 MW 계산치: 7504 Da, 실측치: 7506 Da). (도 20b)

방사성표지를 후속하여 다음과 같이 달성하였다: 처음에 25 ㎕ HEPES 용액(63mM)을 나사마개 바이얼에 가하고 이어서 40.5 MBq의 0.04M HCl중 10 ㎕ ⁶⁷GaCl₃(지이 헬스케어)을 가하였다. 30 ㎕ H₂O중 30 ㎍(MW = 7506, 4.0x10^-9 mol)의 노타 Z00477(서열 3)을 이어서 반응 혼합물에 가하여 pH 3.5-4.0으로 61 μM의 최종 노타 Z00477(서열 3) 농도를 수득하였다. 반응 바이얼을 밀봉하고 반응을 주위온도에서 유지시켰다. 조 반응 혼합물의 역상 HPLC 분석으로 ⁶⁷Ga-노타 Z00477(서열 3)의 방사화학적 순도를 측정하였으며, 실온에서 2시간 후 HPLC에 의해 95%인 것으로 측정되었다. (도 21) ⁶⁷Ga-노타 Z00477(서열 3)을 1일의 반응시간 후 HPLC로 정제하였다. 22MBq의 ⁶⁷Ga-노타 Z00477(서열 3)을 정제를 위해 HPLC에 주입하였다. 15MBq의 ⁶⁷Ga-표지 산물이 정제로부터 수득되었다(방사화학적 수율 = 68%). HPLC 용매를 진공하에서 제거하여 용액을 대략 0.5 mL의 용적으로 수득하였다. 이어서 대략 1.45 mL의 둘베코 포스페이트-완충 염수를 가하여 pH 6-6.5, 방사능 농도 7.7 MBq/mL의 최종 용액을 수득하였다. 정제된 제제 ⁶⁷Ga-노타 Z00477(서열 3)는 적어도 2 hr 동안 실온에서 안정한 것으로 밝혀졌다. (RCP = 96%, HPLC로 측정) (도 22).

사용된 분석용 HPLC 조건은 다음과 같다: 그레이스 바이댁 C₄ 단백질 5 마이크로미터, 300Å, 4.6 x 250 mm HPLC 칼럼. 용매 A = 0.05% 트리플루오로아세트산(TFA)중 95/5 H₂O/MeCN, 용매 B = 0.05% TFA중 95/5 CH₃CN/H₂O. HPLC 구배(Min/%B): 0/0, 4/20, 16/60, 20/100, 25/100, 26/0.

사용된 반-정제용 HPLC 조건은 다음과 같다: 칼럼: 그레이스 바이댁 C4 단백질 5 마이크로미터, 300Å, 4.6 x 250 mm. 용매 A = 0.05% 트리플루오로아세트산(TFA)중 95/5 H₂O/MeCN, 용매 B = 0.05% TFA중 95/5 CH₃CN/H₂O. HPLC 구배(Min/%B): 0/0, 4/20, 16/60, 20/100, 25/100, 26/0.

일반

재조합 HER2 Z28921-Cys는 애피바디 에이비(스웨덴)로부터 구매하였고, Eei-아미노옥시아세트산 숙신산 에스테르는 아이리스 바이오테크(IRIS Biotech)로부터 구매하였으며, 디-tert-부틸디플루오로실란은 플루오로켐(Fluorochem)으로부터 구매하였다. 시약 및 용매는 아이리스 바이오테크, 머크(Merck), 로밀(Romil) 및 플루카(Fluka)로부터 구매하였다.

분석용 LC-MS 스펙트럼은 하기 조건을 사용하여 서모 피니간 서베이어 피디에이(Thermo Finnigan Surveyor PDA) 크로마토그래피 시스템에 커플링된 양성 모드로 작동한 일렉트로스프레이 이온화(ESI)에 의하여 서모 피니간 엠에스큐(Thermo Finnigan MSQ) 계기상에서 기록하였다: 용매 A = H₂O/0.1% TFA 및 용매 B = ACN/0.1% TFA(별도의 언급이 없는 경우), 유량: 0.6 mL/min, 칼럼: 페노메넥스 루나 3 ㎛ C18 (2) 20 x 2 mm, 검출: UV 214/254 nm.

반-정제용 역상 HPLC 실행은 하기 조건을 사용하여 베크만 시스템 골드(Beckman System Gold) 크로마토그래피 시스템상에서 수행하였다: 용매 A = H₂O/0.1% TFA 및 용매 B = ACN/0.1% TFA(별도의 언급이 없는 경우), 유량: 10 mL/min, 칼럼: 페노메넥스 루나 5 ㎛ C18 (2) 250 x 21.2 mm, 검출: UV 214 nm.

정제용 역상 HPLC 실행은 하기 조건을 사용하여 워터스 프렙 4000 시스템상에서 수행하였다: 용매 A = H₂O/0.1% TFA 및 용매 B = ACN/0.1% TFA(별도의 언급이 없는 경우), 유량: 50 mL/min, 칼럼: 페노메넥스 루나 10μ C18 (2) 250 x 50 mm, 검출: UV 214/254 nm.

약어:

Ala (A): 알라닌

Arg (R): 아르기닌

Asn (N): 아스파라긴

Asp (D): 아스파르트산

ACN: 아세토니트릴

Boc: tert-부틸옥시카르보닐

Cys (C): 시스테인

DIPEA: 디이소프로필에틸아민

DMF: N,N-디메틸포름아미드

DMAB: 4-디메틸아미노-벤즈알데히드

도타: 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산

EDT: 1,2-에탄디티올

EMS: 에틸 메틸 술피드

ESI: 일렉트로스프레이 이온화

eq: 당량

FBA: 4-플루오로벤즈알데히드

Gln (Q): 글루타민

Glu (E): 글루탐산

hr(s): 시간

HER2: 인간 상피세포 성장인자 수용체

HOAt: 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피

Ile (I): 이소루이신

LC-MS: 액체 크로마토그래피-질량 분석

Leu (L): 루이신

Lys (K): 라이신

Met (M): 메티오닌

min: 분

㎛: 마이크로미터

nm: 나노미터

NMP: 1-메틸-2-피롤리디논

노타: 1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산

PDA: 광다이오드 어레이

PET: 양전자 방출 단층촬영

Phe (F): 페닐알라닌

Pro (P): 프롤린

PyAOP: (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트

Ser (S): 세린

SiFA: 4-(디-tert-부틸플루오로실릴)벤즈알데히드

TFA: 트리플루오로아세트산

Thr (T): 트레오닌

TIS: 트리이소프로필실란

Trp (W): 트립토판

Tyr (Y): 타이로신

Val (V): 발린

실시예 14: 화합물 2의 반자동 방사선합성

패스트랩^TM 플랫폼(지이 헬스케어)을 사용하여 [¹⁸F]플루오로벤즈알데히드("[¹⁸F]FBA")를 제조하였으며, 전형적으로 에탄올중 7 GBq의 [¹⁸F]FBA을 수득하였다(1.5 mL, 비-붕괴보정 수율 12-54%). 당해 [¹⁸F]FBA 용액의 작은 분획(92 ㎕)을 이어서 실란처리한 P6 바이얼에서 물(138 ㎕)중 아닐린 히드로클로라이드(3.2 mg, 25 μmol)의 존재하에서 아미녹시 전구체 3(0.4 mg, 55 nmol)에 수작업으로 접합시켰다. 펠티어(Peltier) 히터를 이용하여 혼합물을 70℃에서 20분 동안 가열하였다. 2를 크기 배제 크로마토그래피(NAP5 카트리지, 지이 헬스케어)를 통해 단리하였다. 0.25 mL 염수/0.1% 나트륨 아스코르베이트로의 초기 용출액은 버렸다. 2를 함유하는 후속 0.75 mL 염수/0.1% 나트륨 아스코르베이트 용출액을 수집하여 pH 5-5.5의 동일 용출 혼합물로 조제하여 목적하는 방사성 농도를 수득하였다. 접합 단계로부터의 단리체 2의 비-붕괴보정 수율은 17-38%이었고, 수작업 제조한 2에 대한 방사화학적 순도(RCP) 값은 ≥95%이었다. (TLC 시스템: C18 역상 시트를 사용하고 물/30% 아세토니트릴(v/v)을 이동상으로 하는 퍼킨 엘머 인스턴트 이메이저(Perkin Elmer Instant Imager). 표지 펩티드는 원점에 잔존하였다). 산물은 질슨(Gilson) UV/ViS 156 검출기, 바이오스캔 플로우-카운트(Bioscan Flow-Count) 방사능 검출기, 및 루나 C18 페노메넥스 칼럼(50 x 4.6 mm, 3　㎛) 또는 루나 C18 페노메넥스 칼럼(150 x 4.6 mm, 5 ㎛)을 구비한 질슨 322 펌프를 사용하여 HPLC로 추가 분석하였다. 이동상은 선형 구배(5-95% B, 15 min)로 1 mL/min로 유동하는 용매 A(0.1M 암모늄 아세테이트) 및 B(아세토니트릴)를 포함하여 이루어졌다. UV 흡광도를 280 및 350 nm에서 측정하였다. 도 23은 2의 제제의 분석용 HPLC 트레이스의 대표적인 예를 도시한다.

실시예 14a: 화합물 3의 제조

(i) Eei - 아미노옥시아세틸 - 말레이미드의 제조

N-(2-아미노에틸)말레이미드 TFA 염(51 mg, 0.20 mmol) 및 Eei-AOAc-OSu(77 mg, 0.30 mmol)을 NMP(2 mL)에 용해시켰다. 심-콜리딘(sym.-collidine, 80 ㎕, 0.6 mmol)을 가하고 반응 혼합물을 70 min 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(7 mL)로 희석하고, 산물 eei-아미노옥시아세틸-말레이미드를 반-정제용 HPLC로 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 15-30% B, 여기에서 A = 물/0.1% 아세트산 및 B = ACN)을 이용하여 정제함으로써 43 mg(75%)의 순수한 Eei-아미노옥시아세틸-말레이미드를 수득하였다. 정제 물질 eei-아미노옥시아세틸-말레이미드를 LC-MS(구배: 5 min에 걸쳐서 10-40% B)로 특성해석하였다: t _R: 1.93 min, 실측 m/z: 284.1, 기대 MH⁺: 284.1

( ii ) 화합물 3의 제조

재조합 Z02891-Cys(144 mg, 0.205 mmol)(애피바디 에이비(스웨덴)로부터 구매) 및 eei-아미노옥시아세틸-말레이미드(17 mg, 0.60 mmol)를 물(3 mL)에 용해시켰다. 암모늄 아세테이트를 첨가하여 용액을 pH 6이 되도록 조정하고 반응 혼합물을 90 min 동안 진탕하였다. 반응 혼합물을 물(7 mL)로 희석하고, 산물을 반-정제용 HPLC로 정제하여 126 mg의 동결건조된 Eei-보호 산물을 수득하였다. eei-보호 산물을 아르곤 블랭킷하에 20 min 동안 2.5% TFA/물(16 mL)로 처리하였다. 용액을 물(144 mL)로 희석하고, 이소프로판올/드라이아이스욕을 사용하여 아르곤 블랭킷하에서 동결시킨 다음 동결건조하여 149 mg(100%)의 Z02891-Cys-말레이미드-아미노옥시아세틸(3)을 수득하였다. 동결건조 Z02891-Cys-말레이미드-아미노옥시아세틸(3)을 분석용 LC-MS로 분석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 10-40% B, t _R: 3.28 min, 실측 m/z: 1811.8, 기대 MH₄ ^{4 +}: 1811.4).

실시예 15: tC2 셉팩 정제를 이용한 화합물 2의 자동 방사선합성

제1 바이얼(8.25 mg/21.9 μmol 크립토픽스, 1.16 mg/8.4 μmol K₂CO₃, 165 ㎕ 물, 660 ㎕ 아세토니트릴), 제2 바이얼(1.5 mg/4.8 μmol 트리플레이트 1, 1.5 mL 무수 DMSO), 제3 바이얼(5.5 mg/0.76 μmol 3, 8.2 mg/63 μmol 아닐린 히드로클로라이드, 0.7 mL 암모늄 아세테이트 완충제 pH 4.5/0.25 M), 제4 바이얼(4 mL, 4% w/v 수성 암모니아), 에탄올(25 mL)과 인산(1% w/w, 25 mL)의 외부 바이얼, 미리 조건화한(pre-conditioned) QMA 라이트 셉팩 카트리지, 오아시스 엠시엑스 셉팩(OASIS MCX SepPak) 카트리지, 및 두 ^tC2 셉팩 카트리지를 함유하는 패스트랩^TM 카세트를 조립하였다. 산물 바이얼은 p-아미노벤조산(0.08% w/w, 19 mL)의 수용액을 함유하였다. 카세트 레이아웃을 도 24에 도시하였다.

필수 프로그램 시퀀스를 PC 제어부로부터 합성기 모듈로 업로드하고, 조립된 카세트를 기계 장치에 장착하였다. 물주머니 및 산물 바이얼을 부착하였다. [¹⁸F]물(300 MBq, 1 mL)이 들어있는 바이얼을 패스트랩^TM 모듈에 부착하고 방사선합성을 개시하였다. 공정은 QMA 카트리지로부터 용출된 [¹⁸F]-크립토픽스/탄산칼륨 복합체의 공비 건조 단계, [¹⁸F]FBA의 방사선합성, MCX 카트리지를 이용한 [¹⁸F]FBA의 정제, 암모니아 용액 및 에탄올로의 용출, 2를 생성하기 위한 접합 단계, 및 ^tC2 카트리지상에서 인산/에탄올을 사용한 정제 및 제제화 단계를 포함하였다. 전체 공정에는 1시간이 소요되었고, 2를 33% 비-붕괴보정 방사화학적 수율, 94% 방사화학적 순도로 생성하였다.

실시예 16: 세파덱스 정제를 이용한 화합물 2의 자동 방사선합성

제1 바이얼(8.25 mg/21.9 μmol 크립토픽스, 1.16 mg/8.4 μmol K₂CO₃, 165 ㎕ 물, 660 ㎕ 아세토니트릴), 제2 바이얼(1.5 mg/4.8 μmol 트리플레이트 1, 1.5 mL 무수 DMSO), 제3 바이얼(5.0 mg/0.69 μmol 3, 8.2 mg/63 μmol 아닐린 히드로클로라이드, 0.7 mL 암모늄 아세테이트 완충제 pH 4.5/0.25 M), 제4 바이얼(4 mL, 4% w/v 수성 암모니아), 에탄올(25 mL)과 염수(폴리퓨저(Polyfusor), 0.9% w/v, 25 mL)의 외부 바이얼, 미리 조건화한 QMA 라이트 셉팩 카트리지, 오아시스 엠시엑스 셉팩 카트리지, 및 건조 세파덱스 G10(500 mg, 시그마-알드리치, Cat. #G10120)을 함유하는 주문-충진(custom packed) 크기 배제 카트리지(2 mL, 수펠코(Supelco), Cat. #57608-U)를 함유하는 패스트랩^TM 카세트를 조립하였다. 카세트 레이아웃을 도 26에 도시하였다. 2의 방사선합성은 실시예 15에서 기재한 바와 같이 수행하였다. 세파덱스 카트리지를 염수(5 mL)로 프라이밍한 후, 조 반응 혼합물을 세파덱스 카트리지를 통해 펌프질하여 퍼내어 순수한 2를 산물 바이얼에 수집하였다. 합성 시간은 40분이었고 비-붕괴보정 방사화학적 수율은 10%이었다. 산물의 방사화학적 순도는 95%이었고 DMAB의 수준은 0.8 ㎍/mL이었다. 도 27은 최종 산물의 HPLC 분석을 도시한다.

실시예 17: [ ¹⁸ F] AlF - 노타(COOH) ₂ - Z02891 (서열 2)(5)의 방사선합성

나트륨 아세테이트 완충제(50 ㎕, pH 4.0, 0.5M)중 노타(COOH)₂-Z02891(4)(746 ㎍, 100 nmol)의 용액을 원추형 폴리프로필렌 원심분리 바이얼(1.5 mL)에서 AlCl₃(3　㎕, 3.33 ㎍, 나트륨 아세테이트 완충제중 25 nmol, pH 4.0, 0.5M)의 용액과 혼합하였다. 당해 혼합물을 마개를 한 P6 바이얼에서 작은 용적의 [¹⁸F]플루오라이드(50 ㎕)에 가하였다. 당해 바이얼을 15 min 동안 100℃에서 가열하였다. 염수(100 ㎕)로 희석 후, 반응 용액을 NAP5 크기 배제 카트리지(지이 헬스케어)로 이송하였다. 최종 산물은 염수(750 ㎕)를 사용하여 P6 바이얼에 용출시켰다. 표지된 펩티드 5를 11% 비-붕괴보정 방사화학적 수율로 수득하였다. 도 28은 제제화 산물의 분석용 HPLC을 도시한다. 표 11에 개별 실행의 데이터를 요약하였다.

실시예 17a: 화합물 4의 제조

(i) 노타(비스-tBu)의 제조

(a) 테트라토실 -N, N` - 비스(2-히드록시에틸)에틸렌 디아민의 합성

N,N`-비스(2-히드록시에틸)-에틸렌디아민(알드리치, 14.8 g, 100 mmol) 및 피리딘(플루카, 200 mL)을 질소하에 0℃에서 교반하면서 그 용액에 피리딘(플루카, 100 mL)에 용해시킨 톨루엔-4-술포닐 클로라이드(플루카, 77 g, 400 mmol)의 용액을 75분의 기간에 걸쳐서 적가하였다. 온도는 실온으로 서서히 상승시키고 4시간 동안 교반을 계속하였다. 용액을 교반하에 얼음(250 mL)과 염산(농염산, 250 mL)의 혼합물에 부어 흑색 점착성 오일을 수득하였다. 용매를 경사분리하고, 조 산물을 수세, 경사분리시킨 다음 메탄올(250 mL)에 재용해시켰다. 생성되는 슬러리를 여과로 단리하고 조 산물을 고온 메탄올(60℃, 600 mL)에 재용해시킨 다음 냉각시켰다. 고체 산물을 여과하여 진공에서 건조시켰다. 수율 36.36 g(47.5%). 산물은 NMR로 확인하였다.

(b) 1-벤질-4-7- 디토실 -1,4,7- 트리아조난의 합성

테트라토실-N,N`-비스(2-히드록시에틸)에틸렌 디아민(실시예 17a(i)(a) 참조; 2.0 g, 2.6 mmol), 벤질 아민(500 ㎕, 4.6 mmol), 탄산칼륨(플루카, 792 mg, 5.7 mmol) 및 아세토니트릴(머크, 25 mL)을 100℃로 가열하고 밤새 교반하였다. 용매를 고체 산물로부터 여과제거하였다. 고체를 아세토니트릴(2x 10 mL)로 세척하고 용매를 증발시켰다. 고체를 고온 에탄올(15 mL)에 용해시킨 다음 3일 동안 실온에서 방치하였다. 결정을 여과수집하고 진공에서 밤새 건조시켰다. 산물은 LC-MS로 확인하였다(페노메넥스 루나 C18(2) 2.0x50 mm, 3 ㎛, 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산; 구배 5 min에 걸쳐서 10-80% B; 유량 0.6 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출, ESI-MS) t _R = 3.66 min. 수율 1 g(72%).

(c) (4-벤질-7- tert - 부톡시카르보닐메틸 -[1,4,7] 트리아조난 -1-일)-아세트산 tert-부틸 에스테르의 합성

교반하에 황산(시그마, 농황산, 25 mL)을 1-벤질-4-7-디토실-1,4,7-트리아조난(실시예 17a(i)(b) 참조; 2.5 g, 4.7 mmol)에 가하고 100℃로 가열한 다음 20시간 동안 방치하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고 디에틸 에테르(VWR, 500 mL)에 적가하였다. 산물(백색 침전물)을 여과하여 아세토니트릴, 클로로포름 및 디클로로메탄으로 세척하였다. 용매를 진공에서 제거하였다.　 조 산물(986.3 mg, 4.5 mmol)을 아세토니트릴(50 mL)중의 트리에틸아민(플루카, 1.4 mL, 10 mmol)과 혼합하였다.　 tert-부틸 브로모아세테이트(플루카, 1.47 mL, 10 mmol)를 아세토니트릴(25 mL)에 용해시킨 다음 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. pH를 조정하고 필요하다면 트리에틸아민을 가하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 조 물질을 디클로로메탄(150 mL)에 용해시킨 다음 물(2x 25 mL), 0.1M 염산(1x 25 mL) 및 물(1x 25 mL)로 세척하였다. 유기상을 여과하고 용매를 증발시켰다. 조 물질을 아세토니트릴/물(1:1)에 용해시키고 정제용 HPLC로 정제하고(페노메넥스 루나 C18 (2) 5㎛ 250x 21.2 mm, 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산; 구배 60 min에 걸쳐서 10-80% B), 동결건조하였다. LC-MS(페노메넥스 루나 C18(2) 2.0x50 mm, 3 ㎛, 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산; 구배 5 min에 걸쳐서 10-80% B; 유량 0.6 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출, ESI-MS) t _R = 3.99 min, (M1) 447.4. 산물은 NMR로 확인하였다.

산물을 Pd/C(10%, 235 mg) 및 메탄올(25 mL)과 혼합하고 아르곤하에서 교반하였다. 아르곤을 이어서 진공제거하고, 수소 가스 공급을 개시하였다. 반응 혼합물을 교반하에 및 수소 가스를 연속 공급하면서 3시간 동안 방치하였다. 촉매를 원심분리로 제거하고 용매를 증발시켰다.　 조 산물을 정제용 HPLC로 정제하였다(페노메넥스 루나 C18 (2) 5 ㎛ 250x 21.2 mm, 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산; 구배 60 min에 걸쳐서 2-80% B). LC-MS(페노메넥스 루나 C18(2) 2.0x50 mm, 3 ㎛, 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산; 구배 5 min에 걸쳐서 10-80% B; 유량 0.6 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출, ESI-MS) t _R = 2.55 min, (M1) 357.9. 수율 150 mg. 산물은 NMR로 확인하였다.

(d) (4,7- 비스 - tert - 부톡시카르보닐메틸 -[1,4,7] 트리아조난 -1-일)-아세트산 [노타( 비스 - tBu )]의 합성

(4-tert-부톡시카르보닐메틸-[1,4,7]트리아조난-1-일)-아세트산 tert-부틸 에스테르(실시예 17a(i)(d) 참조; 280 ㎛ol, 100 mg) 및 브로모아세트산(플루카, 1 mmol, 138.21 mg)을 메탄올(1 mL)에 용해시켰다. 물(1 mL)에 용해시킨 탄산칼륨을 교반하면서 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 진공에서 농축하였다. 잔사를 물(2.5 mL)에 용해시키고, pH를 염산(1M)으로 4가 되도록 조정하였다. 조 산물을 정제용 HPLC로 정제하였다(페노메넥스 루나 C18 (2) 5 ㎛ 250x 21.2 mm, 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산; 구배 60 min에 걸쳐서 10-80% B). LC-MS(페노메넥스 루나 C18(2) 2.0x50 mm, 3 ㎛, 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산; 구배 5 min에 걸쳐서 10-80% B; 유량 0.6 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출, ESI-MS) t _R = 2.40 min. 수율 117.7 mg. 산물은 NMR로 확인하였다.

노타(비스-tBu)를 정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 20-40% B)로 정제하여 72 mg의 순수한 노타(비스-tBu)를 수득하였다. 정제 물질을 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 10-40% B): t _R: 3.75 min, 실측 m/z: 416.2, 기대 MH⁺: 416.3.

( ii ) 노타 ( 비스 - tBu )- 말레이미드의 제조

N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세트산 염(23 mg, 0.090 mmol), 노타(비스-tBu)(30 mg, 0.072 mmol) 및 PyAOP(51 mg, 0.10 mmol)을 N,N-디메틸포름아미드(DMF)(2 mL)에 용해시켰다. 심-콜리딘(29 ㎕, 0.40 mmol)을 가하고 반응 혼합물을 1 hr 동안 진탕하였다. 혼합물을 물/0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)(6 mL)으로 희석하고, 산물을 반-정제용 HPLC로 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 60 min에 걸쳐서 20-50% B)을 이용하여 정제하여 33 mg(87%)의 순수한 노타(비스-tBu)-말레이미드를 수득하였다. 정제 물질을 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 10-40% B, t _R: 4.09 min, 실측 m/z: 538.2, 기대 MH⁺: 538.3

( iii ) 노타 ( 비스 -산)- 말레이미드의 제조

노타(비스-tBu)-말레이미드(33 mg, 61 ㎛ol)를 TFA(10 mL)중 2.5% 트리이소프로필실란(TIS)과 2.5% 물의 용액으로 4.5 hr 동안 처리하였다. TFA를 진공에서 제거하고, 잔사를 물/0.1% TFA(8 mL)에 용해시킨 다음, 산물을 반-정제용 HPLC로 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 0-20% B)을 이용하여 정제하여 15 mg(58%)의 순수한 노타(비스-산)-말레이미드를 수득하였다. 정제 물질을 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 0-30% B): t _R: 1.34 min, 실측 m/z: 426.0, 기대 MH⁺: 426.2

( iv ) 4의 제조

재조합 Z02891-Cys(40 mg, 5.7 ㎛ol)(애피바디 에이비(스웨덴)로부터 구매) 및 노타(비스-산)-말레이미드(6.1 mg, 14 ㎛ol)를 물(1.5 mL)에 용해시켰다. 암모늄 아세테이트를 가하여 용액을 pH 6이 되도록 조정하고, 혼합물을 1 hr 동안 진탕하였다. 반응 혼합물을 물/0.1% TFA(6 mL)로 희석하고 산물을 반-정제용 HPLC을 이용하여 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 20-30% B)을 이용하여 정제하여 38 mg(90%)의 순수한 화합물 4를 수득하였다. 정제된 4를 분석용 LC-MS로 분석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 10-40% B): t _R: 3.31 min, 실측 m/z: 1864.5, 기대 MH₄ ^{4 +}: 1864.5

실시예 18

[ ¹⁸ F] AlF - 노타(COOH) ₃ - Z02891 (서열 2)(5a)의 방사선합성에 대한 경시적 연구

문헌[W. J. McBride et al. (Bioconj . Chem. 2010, 21, 1331)]에서 기재한 바와 같이 불소-18을 QMA 카트리지를 사용하여 정제하고 염수로 용출시켰다. ¹⁸F-물(25 ㎕, 12 MBq)의 용액을 나트륨 아세테이트 완충제(1.5 ㎕, pH 4.0, 0.5 M)중의 AlCl₃(1.667 ㎍, 12.5 nmol) 및 나트륨 아세테이트 완충제(25 ㎕, pH 4.0, 0.5M)에 용해된 화합물 6(380 ㎍, 50 nmol):

과 혼합하였다. 혼합물을 100℃에서 가열하고 분취량을 HPLC로 분석하였다. 분석 데이터를 도 29에 나타내었다.

실시예 18a: 화합물 6의 제조

(i) 노타(트리스-tBu)의 제조

(a) α- 브로모글루타르산 5-벤질 에스테르의 합성

0℃로 냉각한 수성 브롬화수소산(플루카, 1M, 22.5 mL)중 L-글루탐산-5-벤질에스테르(플루카, 3.0 g, 0.013 mol)와 브롬화나트륨(피셔(Fisher), 4.6 g, 0.044 mol)의 용액에 아질산나트륨(플루카, 1.6 g, 0.023 mol)을 조금씩 나누어 가하였다. 2h 동안 0℃에서 교반한 후, 농황산(머크, 1.2 mL)을 가한 다음 디에틸 에테르(이터넬, Eternell)를 가하였다. 수상을 디에틸 에테르로 3회 추출하였다. 병합 유기상을 염수로 4회 세척하고, 황산나트륨상에서 건조시킨 다음 감압하에 증발시켰다. 조 산물을 순상 크로마토그래피(실리카 칼럼(40 g), 용매: A= 헥산, B= 에틸 아세테이트, 구배: 20 min에 걸쳐서 10-35% B, 유량 40 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출)를 이용하여 정제하여 1.81 g의 순수한 산물을 수득하였다. 수율 46%. 구조는 NMR로 확인하였다.

(b) α- 브로모글루타르산 5-벤질 에스테르 1- tert -부틸 에스테르의 합성

(Bioorg . Med . Chem . Lett . 2000 10, 2133-2135)

클로로포름(머크, 5 mL)중 α-브로모글루타르산-5-벤질에스테르(실시예 18a(i)(a) 참조; 1.2 g, 4.0 mmol)의 용액에 시클로헥산(머크, 5 mL)중 tert-부틸 2,2,2-트리클로로아세트이미데이트(플루카, 1.57 mL, 8.52 mmol)의 용액을 5분에 걸쳐서 적가하였다. N,N-디메틸아세트아미드(플루카, 0.88 mL)를 가하고, 이어서 삼불화붕소 에틸 에테레이트(알드리치, 80 ㎕)를 촉매로서 가하였다. 반응 혼합물을 5일 동안 실온에서 교반하였다. 헥산을 가하고 유기상을 염수로 3회 세척, 황산나트륨상에서 건조 및 감압하에 증발시켰다. 조 산물을 순상 크로마토그래피(실리카 칼럼 (40 g), 용매: A= 헥산, B= 에틸 아세테이트, 구배: 15 min에 걸쳐서 10-35% B, 유량 40 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출)를 이용하여 정제하여 1.13 g(79%)의 순수한 산물을 수득하였다. 구조를 NMR로 확인하였다.

(c) 2-[1,4,7] 트리아조난 -1-일- 펜탄디오산 5-벤질 에스테르 1- tert -부틸 에스테르의 합성

클로로포름(머크, 20 mL)중 α-브로모글루타르산-5-벤질에스테르 1-tert-부틸 에스테르(실시예 18a(i)(a) 참조; 513 mg, 1.44 mmol)의 용액을 3시간의 기간에 걸쳐서 클로로포름(머크, 20 mL)중 1,4,7 트리아자시클로노난(플루카, 557 mg, 4.31 mmol)의 용액에 가하였다. 혼합물을 3일 동안 실온에서 교반하고 진공에서 농축하여 담황색 오일을 수득하였다. 조 산물을 순상 크로마토그래피(실리카 칼럼 (40 g), 용매: A= 에탄올:암모니아(aq) 95:5, B= 클로로포름:에탄올:암모니아(aq) 385:175:20, 구배: 6 min에 걸쳐서 0% B, 12 min에 걸쳐서 100% B, 유량 40 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출)를 이용하여 정제하여 반-순수한 산물(289 mg)을 수득하였다. 수율 49%. 산물은 LC-MS로 확인하였다(칼럼 페노메넥스 루나 C18(2) 2.0x50 mm, 3 ㎛, 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산; 구배 5 min에 걸쳐서 10-50% B; 유량 0.6 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출, ESI-MS) t _R = 2.5 min, m/z (MH⁺), 406.3.

(d) 2-(4,7- 비스 - tert - 부톡시카르보닐메틸 -[1,4,7] 트리아조난 -1-일- 펜탄디오산 5-벤질 에스테르 1- tert -부틸 에스테르의 합성

건조 아세토니트릴(40 mL)중의 2-[1,4,7]트리아조난-1-일-펜탄디오산 5-벤질 에스테르 1-tert-부틸 에스테르(실시예 18a(i)(b) 참조; 600 mg, 1.48 mmol)을 0℃로 냉각한 후 건조 아세토니트릴(10 mL)중의 tert-부틸 브로모아세테이트(플루카, 548 mg, 414 ㎕, 2.81 mmol)를 15분의 기간에 걸쳐서 적가하였다. 반응 혼합물을 추가로 15분 동안 교반한 다음 건조 탄산칼륨(플루카, 1.13 g, 814 mmol)을 가하고, 반응 혼합물을 실온으로 4시간에 걸쳐서 서서히 가온하였다. 혼합물을 셀라이트상에서 여과한 다음 증발건고시켜 조 산물을 수득하였다. 산물을 LC-MS로 확인하였다(칼럼 페노메넥스 루나 C18(2) 2.0x50 mm, 3 ㎛, 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산; 구배 5 min에 걸쳐서 10-80% B; 유량 0.6 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출, ESI-MS) t _R = 3.9 min, m/z (MH⁺), 634.4.

(e) 2-(4,7- 비스 - tert - 부톡시카르보닐메틸 -[1,4,7] 트리아조난 -1-일- 펜탄디오 산 1- tert -부틸 에스테르[노타( 트리스 - tBu )]의 합성

2-(4,7-비스-tert-부톡시카르보닐메틸-[1,4,7]트리아조난-1-일-펜탄디오산 5-벤질 에스테르 1-tert-부틸 에스테르(실시예 18a(i)(c) 참조; 938 mg, 1.48 mmol)를 2-프로판올(아쿠스(Arcus), 115 mL)에 용해시키고, 물(3 mL)에 현탁된 10% Pd/C(코흐-라이트(Koch-Light), 315 mg)을 가하였다. 혼합물을 수소(4 atm)로 3시간 동안 처리하고, 셀라이트상에서 여과한 다음 증발건고시켰다. 잔사를 실리카 겔상에서 크로마토그래피하여(실리카 칼럼 (4 g), 용매: 2-프로판올:암모니아 95:5, 유량 40 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출) 반-순수한 산물(225 mg)을 수득하였다. 산물은 LC-MS로 확인하였다(페노메넥스 루나 C18 (2), 2.0x50mm, 3 ㎛; 용매: A = 물/0.1% 트리플루오로아세트산 및 B = 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산, 구배 5 min에 걸쳐서 10-80% B, 유량 0.6 mL/min, 214 및 254 nm에서 UV 검출, ESI-MS) t_R 2.4 min, MH⁺ 544.5.

정제된 노타(트리스-tBu)를 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 10-80% B): t _R: 2.4 min, 실측 m/z: 544.5, 기대 MH⁺: 544.4

( ii ) 노타 ( 트리스 - tBu )- NH - CH ₂ CH ₂ - NH ₂ 의 제조

NMP(1 mL)에 용해시킨 PyAOP(96 mg, 0.18 mmol)을 NMP(1 mL)중 노타(트리스-tBu)(100 mg, 0.18 mmol)와 에틸렌디아민(1.2 mL, 18 mmol)의 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 1 hr 동안 진탕하고, 이어서 제2 분취량의 PyAOP(38 mg, 0.073 mmol)을 가하였다. 30 min 동안 진탕을 계속하였다. 20% ACN/물(5 mL)을 가하고 산물을 반-정제용 HPLC로 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 20-50% B)을 이용하여 정제하여 123 mg(98%)의 순수한 노타(트리스-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH₂을 수득하였다. 정제 물질을 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 20-50% B): t _R: 1.95 min, 실측 m/z: 586.4, 기대 MH⁺: 586.4

( iii ) 노타 ( 트리스 - tBu )- NH - CH ₂ CH ₂ - NH - 말레이미드

노타(트리스-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH₂(123 mg, 0.176 mmol), 3-말레이미도-프로피온산 NHS 에스테르(70 mg, 0.26 mmol) 및 심-콜리딘(346 ㎕, 2.60 mmol)을 NMP(2 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 6 hr 동안 교반하였다. 물(6 mL)을 가하고 산물을 반-정제용 HPLC로 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 20-50% B)을 이용하여 정제하여 115 mg(87%)의 순수한 노타(트리스-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH-말레이미드를 수득하였다. 정제 물질을 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 10-60% B): t _R: 3.36 min, 실측 m/z: 737.4, 기대 MH⁺: 737.4

( iv ) 노타 ( 트리스 -산)- NH - CH ₂ CH ₂ - NH - 말레이미드의 제조

노타(트리스-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH-말레이미드(115 mg, 0.150 mmol)를 TFA(10 mL)중 2.5% TIS와 2.5% 물의 용액으로 4 hr 동안 처리하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔사를 물(8 mL)에 재용해시킨 다음, 산물을 반-정제용 HPLC로 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 0-20% B)를 이용하여 정제하여 80 mg(90%)의 순수한 노타(트리스-산)-NH-CH₂CH₂-NH-말레이미드를 수득하였다. 정제 물질을 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 0-30% B): t _R: 2.74 min, 실측 m/z: 569.5, 기대 MH⁺: 569.2

(v) 화합물 6의 제조

(a) 합성 Z02891 - Cys 의 제조

서열: EAKYAKEMRNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPKVDC을 0.05 mmol 노바펙 링크 아미드(NovaPEG Rink Amide) 수지를 출발물질로 하는 Fmoc 화학반응을 이용하여 셈 리버티(CEM Liberty) 마이크로파 펩티드 합성기상에서 조립하였다. 0.5 mmol 아미노산을 동일계내 활성화를 위하여 0.45 mmol HBTU/0.45 mmol HOAt/1.0 mmol DIPEA을 사용하여 각각의 커플링 단계(5 min, 75℃)에 적용하였다. Fmoc을 DMF중의 5% 피페라진으로 제거하였다. 두 Arg 모두의 이중 커플링을 적용하였다. Asp-Ser 및 Leu-Ser 슈도프롤린 디펩티드(0.5 mmol)를 서열에 혼입시켰다.

측쇄 보호기의 동시 제거 및 수지로부터 펩티드의 절단을 2.5% TIS, 2.5% EDT, 2.5% EMS 및 2.5% 물을 함유하는 TFA(40 mL)에서 1 hr 동안 수행하였다. 수지를 여과제거하고, TFA로 세척한 다음, 병합한 여액을 진공에서 증발시켰다. 디에틸 에테르를 잔사에 가하고, 형성된 침전물을 디에틸 에테르로 세척하고 건조시켰다. 절단 절차를 1회 더 반복하였다. 건조된 침전물을 20% ACN/물에 용해시킨 다음 밤새 방치하여 잔류 Trp 보호기를 제거하였다. 용액을 동결건조하여 148 mg(42%)의 조 Z02891-Cys을 수득하였다. 148 mg의 조 Z02891-Cys을 반-정제용 HPLC(4회 실행, 구배: 40 min에 걸쳐서 25-30% B)로 정제하여 33 mg(9%)의 순수한 Z02891-Cys을 수득하였다. 정제 물질을 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 10-40% B): t_R: 3.40 min, 실측 m/z: 1758.3, 기대 MH₄ ^{4 +}: 1758.4.

합성 Z02891-Cys(13.7 mg, 1.95 ㎛ol) 및 노타(트리스-산)-NH-CH₂CH₂-NH-말레이미드(11 mg, 19.3 ㎛ol)를 물(1 mL)에 용해시켰다. 암모늄 아세테이트를 가하여 용액을 pH 6이 되도록 조정하고, 혼합물을 3 hr 동안 진탕하였다. 반응 혼합물을 물/0.1% TFA(6.5 mL)으로 희석하고, 산물을 반-정제용 HPLC을 이용하여 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 15-35% B)을 이용하여 정제하여 8.4 mg(57%)의 순수한 6을 수득하였다. 화합물 6을 분석용 LC-MS로 분석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 10-40% B): tR: 3.31 min, 실측 m/z: 1900.7, 기대 MH44+: 1900.2

실시예 19: AlCl ₃ /펩티드 비율이 [ ¹⁸ F] AlF - 노타(COOH) ₂ - Z02891 (서열 2)(5)의 방사화학적 수율에 미치는 영향

나트륨 아세테이트 완충제(10 ㎕, pH 4.0, 0.5M)중 4(149 ㎍, 20 nmol)의 3개 용액을 원추형 폴리프로필렌 원심분리 바이얼(1.5 mL)에서 나트륨 아세테이트 완충제(1 ㎕, pH 4.0, 0.5M)중 AlCl₃(각각 0.33 ㎍, 2.49 nmol; 0.66 ㎍, 4.98 nmol; 및 1.33 ㎍, 9.96 nmol)의 용액과 혼합하였다. 이들 바이얼에 작은 용적의 [¹⁸F]플루오라이드(10 ㎕)를 가하였다. 바이얼을 15 min 동안 100℃에서 가열하고 후속하여 HPLC로 분석하였다. 혼입 수율을 표 12에 나타내었다.

실시예 20: 시약 희석이 [ ¹⁸ F] AlF - 노타(COOH) ₂ - Z02891 (서열 2)(5)의 방사화학적 수율에 미치는 영향

나트륨 아세테이트 완충제(25 ㎕, pH 4.0, 0.5M)중 4(373 ㎍, 50 nmol)의 용액을 원추형 폴리프로필렌 원심분리 바이얼(1.5 mL)에서 나트륨 아세테이트 완충제(1.5 ㎕, pH 4.0, 0.5M)중 AlCl₃(1.66 ㎍, 12.5 nmol)의 용액과 혼합하였다. 작은 용적의 [¹⁸F]플루오라이드(10 ㎕, 80 MBq)를 가하였다. 나트륨 아세테이트 완충제(1.5 ㎕, pH 4.0, 0.5M)로 당해 혼합물의 2개 연속 희석액(50% 및 25% v/v)을 제조하였다. 3개 바이얼을 이어서 100℃에서 15분 동안 가열하고 후속하여 HPLC로 분석하였다. 데이터를 표 13에 나타내었다.

실시예 21: 펩티드/ AlCl ₃ 농도가 [ ¹⁸ F] AlF - 노타(COOH) ₂ - Z02891 (서열 2)(5)의 방사화학적 수율에 미치는 영향

[¹⁸F]플루오라이드(25 ㎕, 23-25 MBq), AlCl₃(1.5 ㎕ 나트륨 아세테이트 완충제중 1/4 당량의 펩티드 4, pH 4.0, 0.5M), 및 나트륨 아세테이트 완충제(25 ㎕, pH 4.0, 0.5M)중의 4(50, 100, 150 nmol)을 함유하는 3개 바이얼을 100℃에서 30분 동안 가열하였다. 도 30은 15분 및 30분 후의 혼입 데이터를 도시한다.

실시예 22: 마이크로파 가열이 [ ¹⁸ F] AlF - 노타(COOH) ₂ - Z02891 (서열 2)(5)의 방사화학적 수율에 미치는 영향

[¹⁸F]플루오라이드(25 ㎕, 29 MBq), 1.5 ㎕ 나트륨 아세테이트 완충제(pH 4.0, 0.5M)중의 AlCl₃(1.66 ㎍, 12.5 nmol), 및 나트륨 아세테이트 완충제(25 ㎕, pH 4.0, 0.5M)중의 4(373 ㎍, 50 nmol)을 함유하는 휘튼(Wheaton) 바이얼(3 mL)을 마이크로파 장치(레저넌스 인스트루먼츠(Resonance Instruments) 모델 521, 설정온도 80℃, 50 W)를 사용하여 5, 10, 및 15 s 동안 가열하였다. 표 14에 이들 시점 후의 HPLC 분석을 요약하였다.

실시예 23: [ ¹⁸ F] AlF - 노타(COOH) ₃ - Z02891 (서열 2)(5a)의 제조

[¹⁸F]플루오라이드(25 ㎕, 29 MBq), 1.5 ㎕ 나트륨 아세테이트 완충제(pH 4.0, 0.5M)중의 AlCl₃(1.66 ㎍, 12.5 nmol), 및 나트륨 아세테이트 완충제(25 ㎕, pH 4.0, 0.5M)중의 6(380 ㎍, 50 nmol)을 함유하는 PP 원심분리 바이얼(1.5 mL)을 100℃에서 15분 동안 가열하였다. 5a의 분석용 RCY는 15 내지 20%이었다. 도 31은 반응 혼합물의 HPLC 프로파일을 도시한다.

실시예 24: [ ¹⁸ F] SiFA - Z02891 (서열 2)(7)의 제조

나트륨 아세테이트 완충제(50 ㎕, pH 4.0, 0.5M)중 펩티드 전구체 8(750 ㎍, 100 nmol)의 용액을 폴리프로필렌 원심분리 바이얼(1.5 mL)에서 물(50 ㎕)중 [¹⁸F]플루오라이드의 용액에 가하고 15분 동안 95℃에서 가열하였다. 염수(100 ㎕, 0.9% w/v)를 가한 후, 혼합물을 염수-조건화한 NAP5 칼럼(지이 헬스케어)을 이용하여 정제하였다. 산물 7을 26분 후에 18% 비-붕괴보정 방사화학적 수율 및 87% 방사화학적 순도로 수득하였다. 도 32는 최종 산물의 HPLC 분석을 도시한다.

실시예 24a: 화합물 8의 제조

(i) SiFa 의 합성

헥산 중의 n-부틸리튬(2.5M, 3.2 mL, 7.9 mmol)을 아르곤하에서 건조 테트라히드로푸란(THF)(6 mL)중 2-(4-브로모페닐)-1,3-디옥솔란(1.8 g, 7.9 mmol)의 냉각(-78℃) 용액에 적가하였다. 2 hr 동안 -78℃에서 교반한 후, 생성되는 황색 현탁액을 시린지에 취하고 20 min의 기간에 걸쳐서 THF(15 mL)중 디-tert-부틸디플루오로실란(1.5 mL, 8.33 mmol)의 냉각 용액(-70℃)에 적가하였다. 반응 혼합물을 1 hr 동안 -70℃에서 교반하고, 이어서 주위온도로 가온시켰다. 2.5 hr 후에 반응 혼합물로부터 샘플(3 mL)을 취출하여 물/0.1% TFA로 급랭시켰으며, 이에 따라 디옥솔란 보호기의 제거가 초래되었다. 탈보호된 산물을 정제용 HPLC로 정제하였다. 정제용 HPLC(구배: 60 min에 걸쳐서 40-95% B)을 이용하여 정제하여 순수한 SiFA을 수득하였다. 정제 물질을 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 50-95% B): t _R: 2.05 min, 실측 m/z: 비-검출, 기대 MH⁺: 267.2

( ii ) SiFA - 아미노옥시아세틸 - 말레이미드의 제조

Eei-아미노옥시아세틸-말레이미드(20 mg, 71 ㎛ol)를 물/ACN/0.1% TFA중의 SiFA(HPLC 프렙 분획으로부터)에 가하였다. 1M HCl(1 mL)을 가하고 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 산물을 반-정제용 HPLC로 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 40-80% B)을 이용하여 정제하여 15 mg(45%)의 순수한 SiFA-아미노옥시아세틸-말레이미드를 수득하였다. 정제 물질을 LC-MS로 특성해석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 40-70% B): t _R: 3.00 min, 실측 m/z: 462.1, 기대 MH⁺: 462.2

( iii ) 화합물 8의 제조

재조합 Z02891-Cys 애피바디(24 mg, 3.4 ㎛ol) 및 SiFA - 아미노옥시아세틸 -말레이미드(4.7 mg, 10 ㎛ol)를 50% ACN/물(1 mL)에 용해시켰다. 용액을 암모늄 아세테이트를 가하여 pH 6이 되도록 조정하고 혼합물을 1 hr 동안 진탕하였다. 반응 혼합물을 10% ACN/물/0.1% TFA(8 mL)로 희석하고, 산물은 반-정제용 HPLC을 이용하여 정제하였다. 반-정제용 HPLC(구배: 40 min에 걸쳐서 20-40% B)을 이용하여 정제하여 26 mg(100%)의 순수한 Z02891-Cys-말레이미드-아미노옥시아세틸-SiFA(8)을 수득하였다. 정제된 Z02891-Cys-말레이미드-아미노옥시아세틸-SiFA(8)을 분석용 LC-MS로 분석하였다(구배: 5 min에 걸쳐서 10-40% B): t _R: 3.87 min, 실측 m/z: 1873.6, 기대 MH₄ ^{4 +}: 1873.5

실시예 25: 종양 모델 검증

A431 및 NCI-N87 이종이식 모델을 종양 성장 및 HER2 발현에 대하여 검증하였다. 동물 모델 셋업에서는 동물당 2x10⁶ NCI-N87 또는 10⁷ A431 세포(100 ㎕의 50%PBS/50%매트리겔(Matrigel)중)를 우측부에 피하 접종한 다음 30일의 접종 기간을 두었다. 이들 종양에서의 HER2 발현은 FDA-인증 헤르셉테스트(다코, K5204)를 이용하여 면역조직화학에 의해 평가하였다.

도 33은 권장 강도 스케일(0 → +3)로, NCI-N87 종양은 강하게 염색되고(+3), 반면에 A431 세포는 상당히 더 약한 염색 강도(+1)를 나타냄을 도시한다. 이들 데이터는 그 종양 모델이 현저히 상이한 HER2 발현을 보이고 따라서 HER2-표적화 애피바디 분자의 흡수를 비교하는 데 적합함을 시사한다. IHC 스코어의 충분한 분리를 토대로, 더 이상의 정량적 평가는 필요하지 않은 것으로 생각되었다.

실시예 26: 정상 마우스에서 화합물 2, 5, 및 7의 생체내분포

염수-제제화 트레이서 화합물 2, 5, 및 7을 나이브 CD1 마우스를 사용하여 평가하였다. 3 MBq의 활성(2 min 시점에 대해 2.5 MBq)을 정맥내 주사한 뒤, 동물을 주사후 2, 90, 120 및 180 min에서 참수하고, 방사능의 보유를 주요 장기에서 평가하였다. 생체내분포 측정시에, 5는 현저한 신장 보유(주사후 90분에서 70.3%ID)를 나타내었는데, 이러한 결과는 2 또는 7(주사후 90 min에서 각각 4.8%ID 및 10%ID)에서는 관찰되지 않은 것이다. 7의 탈플루오르화가 관찰되었다(주사후 90 min에서 뼈 흡수 5.3%ID/g). 도 34는 생체내분포 데이터를 상응하는 [¹¹¹In]도타-Z02891(서열 2)(9) 화합물과 비교한다:

실시예 27: 화합물 2, 5, 및 7의 종양 흡수

고- 및 저-HER2 수준 발현 종양 세포(각각 NC87 및 A431)를 보유한 종양 마우스 모델에서, 예상한 대로 화합물 2, 5, 및 7의 차등 흡수가 관찰되었다. 도 35, 표 15와 16은 생체내분포 데이터를 상응하는 [¹¹¹In]도타-Z02891(서열 2)(9) 화합물과 비교한다.

실시예 28: 이중 종양 이종이식 모델에서 2의 영상화

A431 및 NCI-N87을 양 측부 각각에 이식하여 이중 종양 이종이식 마우스를 생성하였다. 이들 마우스를 이용하여 2의 생체내분포를 평가하였으며, 이로써 저- 및 고-HER2 발현 종양 둘 모두에서의 흡수의 동일-동물 평가가 가능하였다. 시점은 30 및 60 p.i.를 포함하였다.

도 36은 2의 성능이 단일 종양 동물 연구에서 관찰된 것에 동등하였으며, A431 및 NCI-N87 종양간에는 바인더 흡수에 있어서 양호하게 분리되었으며, 30min p.i정도로 조기에 개시함을 보여준다. 백그라운드 조직 클리어런스(주요 조직 비율에 대해서는 표 7 참조)에 관하여, 60min p.i.에서의 혈액 수준은 현저히 감소하여, 4.52의 NCI-N87 종양:혈액 비율을 제공하는데 반하여, 30 min에서는 부분적인 혈액 클리어런스는 2.39 비율을 제공하며, 1.39의 양성 종양:간 비율을 수반한다. 이들 특성은 2의 약물동태학이 적합한 영상화 윈도우 내에서 인간 대상체를 영상화하는 데에 충분함을 시사한다.

실시예 29: NCI - N87 - 종양형성 마우스에서의 화합물 2 보충 연구

바인더 효능에 있어서 과량의 콜드 리간드의 효과를 평가하기 위하여 NCI-N87 종양 모델에서 수행된 보충(add-back) 연구를 위하여, 하기 4종의 상이한 제제를 90min p.i.에서 평가하였다:

1. 표준 화합물 2 제제

2. 표준 제제 + 100㎍/kg/마우스 콜드 전구체

3. 표준 제제 + 500㎍/kg/마우스 콜드 전구체

4. 표준 제제 + 1000㎍/kg/마우스 콜드 전구체

표준 제제중 콜드 전구체의 농도는 120㎍/kg/마우스이었고, 따라서 당해 연구는 사용된 최초 농도의 10배 농도에서 콜드 전구체의 효과를 검사하였다 (마우스에서). 도 37은 종양 흡수에 미치는 효과는 유의미하지 않았고 다른 조직으로부터의 클리어런스는 어느 쪽도 유의미하게 영향을 받지 않았음을 보여준다.

실시예 30: 이중 측부 A431/ NCI - N87 - 종양형성 마우스에서의 화합물 2 생체내 영상화 연구

실시예 28에서 기술한 이중-종양 마우스 모델을 사용하여 예비 영상화 연구를 수행하였다. 동물당 10 MBq의 2를 i.v. 주사하고, 마우스를 120 min p.i에서 시작하여 30분 동안 영상화하였다. 도 38에서의 영상은 생체내분포 연구를 통해 앞서 분명하게 보여진 바와 같이, 클리어런스가 신장 및 방광에서 두루 일어났음을 보여준다. 횡방향 영상화는 2개 종양에서의 흡수를 나타내는데, NCI-N87 종양이 A431 종양보다 상당히 더 높은 신호 강도를 보이고 있으며, 이러한 결과는 실시예 28에서의 이중 종양 생체내분포 연구와 일치하는 것이다.

당해 2 영상화 연구를 애피바디^® 9 영상화 연구와 비교한 결과(도 38)는 고- 및 저-HER2 발현 종양간에 흡수에 있어서의 유사한 차이를 보여준다. 그러나, 2는 또한 생체내분포에서 최소 신장 체류를 보였기 때문에 신장으로부터 상당히 개선된 백그라운드를 갖는다.

상기에서 논의 및/또는 인용된 모든 특허, 학술논문, 출판물 및 기타 문서는 본원에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> GE HEALTHCARE LIMITED HISCOCK, DUNCAN INDREVOLL, BARD IVESON, PETER GLASER, MATTHIAS BHALLA, RAJIV WILSON, ANTHONY <120> HER2 BINDERS <130> PZ1189 <140> PCT/US2011/ TO BE ASSIGNED <141> 2011-12-19 <150> US 61/541314 <151> 2011-09-30 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC POLYPEPTIDE <400> 1 Val Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC POLYPEPTIDE <400> 2 Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Val Asp Cys 50 55 60 <210> 3 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC POLYPEPTIDE <400> 3 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Asn Leu Asn Val Ala Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg 20 25 30 Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Cys 50 55 60 <210> 4 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC POLYPEPTIDE <400> 4 Gly Ser Ser His His His His His His Leu Gln Val Asp Asn Lys Phe 1 5 10 15 Asn Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn 20 25 30 Leu Asn Val Ala Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp 35 40 45 Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp 50 55 60 Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Cys 65 70 <210> 5 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC POLYPEPTIDE <400> 5 Gly Ser Ser His His His His His His Leu Gln Val Asp Asn Lys Phe 1 5 10 15 Asn Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn 20 25 30 Leu Asn Val Ala Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp 35 40 45 Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp 50 55 60 Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn 65 70 75 80 Ala Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Asn Val Ala Gln Lys 85 90 95 Arg Ala Phe Ile Arg Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn 100 105 110 Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val 115 120 125 Asp Cys 130 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC POLYPEPTIDE <400> 6 Cys Gly Gly Gly 1 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 6xHis Tag <400> 7 His His His His His His 1 5

Claims (4)

1. 동위원소 불소 교환 화학반응을 통해 ¹⁸F와 접합된 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 포함하고, 상기 단리 폴리펩티드는 HER2 또는 그의 변이체에 특이적으로 결합하는 영상화제 조성물.
2. (i) 서열 1, 서열 2 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하는 단계;
   (ii) 폴리펩티드를 실리콘 플루오라이드-함유 모이어티와 반응시켜 실리콘 플루오라이드-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계; 및
   (iii) 실리콘 플루오라이드-접합 폴리펩티드를 ¹⁸F 모이어티 또는 ¹⁸F의 공급원과 반응시켜 ¹⁸F-실리콘 플루오라이드-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 영상화제 조성물을 제조하는 방법.
3. (i) 서열 1, 서열 2, 또는 그의 보존적 변이체를 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하는 단계;
   (ii) 폴리펩티드를, SiFA기를 포함하는 링커와 반응시켜 SiFA-접합 폴리펩티드를 형성하는 단계; 및
   (iii) SiFA-접합 폴리펩티드를 ¹⁸F 모이어티 또는 ¹⁸F의 공급원과 반응시키는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 영상화제 조성물을 제조하는 방법.
4. 제1항에 따른 영상화제 조성물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.

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