CN103402550A

CN103402550A - 用含有18f的有机硅化合物标记的her2结合肽

Info

Publication number: CN103402550A
Application number: CN2011800681159A
Authority: CN
Inventors: D.希斯科克; B.因德雷沃尔; P.艾弗森; M.E.格拉泽; R.巴拉; A.威尔逊
Original assignee: GE Healthcare Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2031-12-19
Also published as: SG191338A1; AU2011349486A1; CN103402550B; EP2661284A1; MX2013007363A; JP2014503547A; CA2822698A1; RU2013128360A; BR112013015798A2; US20130295010A1; WO2012087912A1; NZ612327A; KR20130132939A

Abstract

包含与放射性核素和螯合剂缀合的分离的多肽的成像剂；其中所述分离的多肽与HER2或其变体特异性结合；和制备和使用这些成像剂的方法。

Description

用含有18F的有机硅化合物标记的HER2结合肽

发明领域

本发明一般性涉及与人表皮生长因子受体类型2 (HER2)结合的成像剂和制备和使用所述剂的方法。

发明背景

人表皮生长因子受体类型2 (HER2)为跨膜蛋白质和受体酪氨酸激酶蛋白质的erbB家族的成员。HER2为在各种各样的癌症中过表达的充分建立的肿瘤生物标记物，所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和口腔癌。因此，HER2作为分子靶标和作为患者生存的诊断或预后指示剂或对抗肿瘤手术的应答的预测性标记物具有很大的价值。

在过去的十年间，使用各种成像形式，广泛研究了HER2表达的非侵入性分子成像。这些形式包括用正电子发射断层显像(PET)和单光子发射断层显像(SPECT)的放射性核素成像。HER2的PET和SPECT成像(分别为HER2-PET和HER2-SPECT)提供高灵敏度，高空间分辨率。HER2的PET成像还提供强的定量能力。HER2-PET和HER2-SPECT可特别用于在患者中整个肿瘤HER2表达的实时测定，鉴定在肿瘤中HER2随时间的表达，选择用于HER-靶向的治疗(例如，基于曲妥单抗的疗法)的患者，预测对疗法的应答，评价药物功效，和许多其它应用。然而，未开发具有化学性并且呈现适于临床应用的体内行为的PET或SPECT-标记的HER2配体。

天然存在的葡萄球菌蛋白质A包含形成与片段结合的三螺旋结构(支架)的结构域、免疫球蛋白同种型G (IgG)的可结晶区域(Fc)。衍生自蛋白质A的Z-结构域的某些多肽含有由三个通过环连接的α-螺旋组成的支架。位于这些螺旋的两个之上的某些氨基酸残基构成用于IgG的Fc区域的结合部位。通过取代位于螺旋1和2上的表面-暴露的氨基酸残基(13个残基)，已制备备选的结合剂分子，以改变这些分子的结合能力。一个这样的实例为HER2结合分子或HER2结合剂。这些HER2结合剂已用PET或SPECT-活性放射性核素标记。这样的PET和SPECT-标记的结合剂提供在患者中测量体内HER2表达模式的能力，因此，有助于临床医生和研究者诊断、预测和治疗与HER2相关的疾病状况。

已评价用PET-活性放射性核素(¹⁸F)放射性标记的HER2结合Affibody?分子作为过表达HER2的恶性肿瘤的成像剂。经由螯合剂例如maGGG (巯基乙酰基三甘氨酰基)、CGG (半胱氨酸-二甘氨酰基)、CGGG (SEQ ID NO: 6) (半胱氨酸-三甘氨酰基)或AA3，与^99mTc缀合的HER2结合Affibody?分子已用于诊断成像。在小鼠中已证明这些分子与表达靶HER2的肿瘤结合。

在大多数情况下，通过硫醇-反应性马来酰亚胺基团将产生信号的¹⁸F基团引入Affibody?。在¹⁸F掺入后，使用多步合成来制备硫醇反应性马来酰亚胺基团。然而，该化学仅提供低放射化学收率。类似地，^99mTc与Affibody?缀合为多步过程。此外，Tc降低和与螯合剂形成络合物需要高pH (例如，pH=11)条件和长的反应时间。

虽然¹⁸F标记的Affibody?分子的体内性能适度良好，但是仍存在显著的改进空间。例如，在一些研究中，在注射成像剂后2小时，发现肿瘤摄取仅为6.36±1.26%ID/g。

因此，需要用于合成放射性标记的多肽的化学和方法，其中放射性部分(例如，¹⁸F)可在最终的阶段引入，进而提供高放射化学收率。此外，需要用于PET或SPECT成像的新的HER2靶向成像剂，具有改进的性质，特别是与肾清除和毒性效应相关的性质。

发明概述

本发明的组合物为一类能与HER2或其变体特异性结合的新的成像剂。

在一个或多个实施方案中，成像剂组合物包含经由二胺二肟螯合剂与^99mTc缀合的包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体的分离的多肽。二胺二肟螯合剂可包含Pn216、cPn216、Pn44，或它们的衍生物。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

在一个或多个实施方案中，成像剂组合物包含经由NOTA螯合剂与⁶⁷Ga或⁶⁸Ga缀合的包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体的分离的多肽。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

在一个或多个实施方案中，成像剂组合物包含与Al¹⁸F-NOTA螯合剂缀合的包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体的分离的多肽。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

在一个或多个实施方案中，成像剂组合物包含经由接头与¹⁸F缀合的包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体的分离的多肽。接头包含衍生自氨基氧基、叠氮基或炔基的基团。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

在一个或多个实施方案中，成像剂组合物包含经由同位素氟交换化学与¹⁸F缀合的包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体的分离的多肽。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

在一个或多个实施方案中，提供了制备本文描述的成像剂组合物的方法。用于制备成像剂组合物的本发明方法的一个实例包括：(i) 提供包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；和(ii) 使二胺二肟螯合剂与多肽反应，以形成螯合剂缀合的多肽。在另一个实例中，所述方法包括：(i) 提供包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与接头反应；和(iii) 使接头与¹⁸F部分反应，以形成¹⁸F缀合的多肽。接头可包含氨基氧基、叠氮基或炔基。

在另一个实例中，所述方法包括：(i) 提供包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与NOTA-螯合剂反应，以形成NOTA-螯合剂缀合的多肽；和(iii) 使NOTA螯合剂缀合的多肽与Al¹⁸F部分反应，以形成Al¹⁸F-NOTA螯合剂缀合的多肽。

在另一个实例中，所述方法包括：(i) 提供包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与含有氟化硅(例如，[¹⁹F]-氟化硅)的部分反应，以形成氟化硅缀合的多肽；和(iii) 使氟化硅缀合的多肽与¹⁸F部分反应，以形成¹⁸F-氟化硅缀合的多肽。

附图简述

参考附图，当阅读以下详细说明时，将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中：

图1A和1B分别为两种抗-HER2多肽(Z477 (SEQ. ID No. 3)和(Z477)₂ (SEQ. ID No. 5))在八种不同的浓度下对人HER2的结合亲和力的表面等离振子共振(SPR)的图。

图2A和图2B分别为C6 (大鼠神经胶质瘤，对照)和人抗-HER2抗体对SKOV3 (人卵巢癌)的定性流式细胞术的图。图2C显示对于SKOV3和C6细胞系，对于每个细胞的Her2受体的柱形图。

图3为关于SKOV3细胞和空白，关于一组肿瘤类型SKOV3 2-1、SKOV3 3-1，SKOV3 3-4，对于Her2的ELISA测定的柱形图。

图4为^99mTc标记的Z00477 (SEQ. ID No. 3)的反相HPLC γ色谱图。

图5A为在pH 9下聚集的^99mTc(CO)₃(His6)Z00477 (SEQ. ID. No. 4) ('His6'公开为SEQ ID NO: 7)的尺寸排阻HPLC γ色谱图。图5B为非聚集的^99mTc(CO)₃(His6)Z00477 ('His6'公开为SEQ ID NO: 7)标记的Affibody?标准物的尺寸排阻HPLC γ色谱图。

图6为在来自携带SKOV3肿瘤的小鼠的血液、肿瘤、肝、肾和脾样品中，Z00477 (SEQ. ID No. 3)的生物分布概况(profile)的图，包括随时间的肿瘤:血液比。

图7为Mal-cPN216接头的化学结构的图。

图8A为电喷雾电离飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)的图，图8B为对于纯化的Z00477 (SEQ. ID No. 3)-cPN216的质量反卷积结果的图。

图9为用^99mTc标记的Z02891-cPN216 (SEQ. ID No. 2)的反相HPLC γ示踪色谱图(trace chromatogram)。

图10为在来自携带SKOV3肿瘤的小鼠的血液、肝、肾、脾和尾部样品中，经由cPN216 (% ID，%注射剂量)用^99mTc标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)的生物分布概况的图。

图11为在来自携带SKOV3肿瘤的小鼠的肿瘤、血液、肝、肾、膀胱/尿、尾部、肠和脾样品中，经由cPN216 (% ID，%注射剂量)用^99mTc标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)的生物分布概况的图。

图12为在携带SKOV3肿瘤的小鼠中Z02891 (SEQ. ID No. 2)的生物分布概况的图，显示肿瘤:血液比。

图13A和图13B为Boc-保护的马来酰亚胺(malimide)-氨基氧基(Mal-AO-Boc)和马来酰亚胺-氨基氧基(Mal-AO)接头的化学结构的图。13A为2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯(Mal-AO-Boc)的化学结构，13B为2-(氨基氧基)-N-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)乙酰胺盐酸盐(Mal-AO.HCl)的化学结构。

图14A为Z00342 (SEQ. ID No. 1)原料的反相HPLC色谱图，14B为纯化的Z00342 (SEQ. ID No. 1)-AO成像剂组合物的反相HPLC色谱图，均在280 nm下分析。

图15为粗反应混合物和¹⁸F-氟苄基-Z00342 (SEQ. ID No. 1)和¹⁸F-氟苄基-Z02891’ (SEQ. ID No. 2)的纯化的最终产物的反相HPLC γ色谱图。

图16为来自具有SKOV3-肿瘤的动物，用¹⁸F标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)多肽的生物分布概况(%ID，%注射剂量)的图。

图17为来自具有SKOV3-肿瘤的动物，用¹⁸F标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)多肽的生物分布概况(% ID，%注射剂量)和肿瘤:血液比的图。

图18为在血液、肿瘤、肝、肾、脾和骨样品中，¹⁸F标记的Z00342 (SEQ. ID No. 1)和¹⁸F标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)的生物分布概况(% ID，%注射剂量)的柱形图。

图19为Mal-NOTA接头的化学结构的图。

图20A为电喷雾电离飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)的图，图20B为Z00477 (SEQ. ID No. 3)-NOTA的ESI-TOF-MS质量反卷积结果的图。

图21为在反应1小时后，⁶⁷Ga-标记的Z00477 (SEQ. ID No. 3)-NOTA的粗反应混合物的反相HPLC γ示踪的图。

图22为纯化的⁶⁷Ga-标记的NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)-NOTA多肽的反相HPLC γ示踪的图。

图23为配制的2的分析型HPLC[上：在280 nm下的UV通道，显示抗坏血酸盐为0.5分钟，肽前体3为4.5分钟；下：放射性通道，显示2为5.1分钟(RCP 95%)，分解产物在4.6分钟]。

图24为使用tC2 SepPak纯化，用于制备2的FASTlab^TM盒布置(cassette layout)。

图25为使用FASTlab^TM制备的配制的2的分析型HPLC [上：放射性通道，显示2 (7.7分钟)，¹⁸F-FBA (10.4分钟)和未知的杂质(12.2分钟)；中：在280 nm下的UV通道，显示对氨基苯甲酸制剂添加物(3分钟)；下：在350 nm下的UV通道，显示二甲基氨基苯甲醛副产物(10.2分钟)和未知的杂质(3.8分钟)]。

图26为使用Sephadex纯化用于制备2的FASTlab^TM盒布置。

图27为用Sephadex纯化使用FASTlab制备的配制的2的分析型HPLC [上：放射性通道，显示2 (7.1分钟)，¹⁸F-FBA (8.8分钟)和未知的杂质(10.2分钟)；中：在280 nm下的UV通道；下：在350 nm下的UV通道，显示二甲基氨基苯甲醛副产物(10.0分钟)]。

图28为配制的5的分析型HPLC[上：放射性通道，显示产物(4.7分钟，92%)和副产物(3.9分钟，8%)；下：在280 nm下的UV通道]。

图29描述5的时间过程研究，显示通过分析放射性HPLC测量的标记效率。

图30为在提高肽/AlCl₃浓度后，5的分析RCY (P：产物，BP：副产物，参见图28)。

图31为5的标记混合物的分析型HPLC概况(顶部迹线(trace)：放射性通道，底部迹线：在280 nm下的UV通道)。

图32为分离的7的分析放射性通道HPLC(红色：放射性通道，蓝色：在280 nm下的UV通道)。

图33描述通过免疫组织化学(HERCEPTEST，DAKO)，在来自NCI-N87和A431异种移植模型中的肿瘤切片中HER2蛋白质表达。左边的图片为2倍放大，右边的图片为突出显示的正方形的10倍放大。

图34显示9、2、5和7的幼稚小鼠生物分布。

图35显示在携带NC87/A431肿瘤的小鼠中，9、2、5和7的生物分布。

图36显示在双肿瘤异种移植模型中，2的生物分布概况。

图37显示使用提高浓度的冷前体，2的NCI-N87异种移植生物分布概况。

图38显示在双肿瘤异种移植模型中2的初步成像(A)，和与Affibody? 9成像研究比较(B)。

发明详述

本发明的成像剂组合物通常包含与放射性同位素(例如，¹⁸F、^99mTc、⁶⁷Ga或⁶⁸Ga、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、⁸⁹Zr或⁶⁴Cu)缀合的SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；和制备和使用所述组合物的方法。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。在一个或多个实施方案中，分离的多肽的序列具有与任何SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体至少90%序列相似性。

分离的多肽可包含天然氨基酸、合成的氨基酸或采用与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸模拟物(mimetics)。天然存在的氨基酸为通过遗传密码来编码的那些以及后来修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、O-磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸。

分离的多肽可使用标准固相合成技术来制备。或者，多肽可使用重组技术来制备。当多肽使用重组技术来制备时，可分离编码多肽或其保守变体的DNA。编码多肽或其保守变体的DNA可插入克隆载体，引入宿主细胞(例如，真核细胞、植物细胞或原核细胞)，并且使用任何本领域公认的表达系统来表达。

多肽可基本上由单一手性形式的氨基酸残基组成。因此，本发明的多肽可基本上由L-氨基酸或D-氨基酸组成；但是也可采用L-氨基酸和D-氨基酸的组合。

由于本文提供的多肽衍生自蛋白质A的Z-结构域，在结合界面上的残基可被非保守地取代或保守地取代，同时保持结合活性。在一些实施方案中，取代的残基可衍生自20种天然存在的氨基酸的任一种或其任何类似物。

多肽可为约49个残基-约130个残基长度。具体的多肽序列在表1中列举。

表1

另外的序列可加入到末端，以赋予所选的官能度。因此，另外的序列可悬垂于一个或两个末端，以促进多肽的纯化或分离，单独地或与结合靶标偶联(例如，通过将His标签悬垂于多肽)。

在表1中列举的多肽可经由接头与¹⁸F缀合；经由二胺二肟螯合剂与^99mTc缀合，经由NOTA螯合剂与⁶⁷Ga或⁶⁸Ga缀合，经由Al¹⁸F-NOTA与¹⁸F缀合，经由SiFA (即，氟化硅接纳体)或氟化硅交换化学与¹⁸F缀合，经由DOTA螯合剂化学与¹¹¹In缀合，使用碘代苯甲醛经由氟代苯甲醛-样化学与¹²³I或¹²⁴I缀合，或者经由NOTA-螯合剂化学与⁶⁴Cu缀合。表2提供这些多肽的等电点(pI)。

表2

在一个或多个实施方案中，包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽可与¹⁸F缀合。¹⁸F可在分离的多肽的C末端、N-末端或内部位置处掺入。

在一个或多个实施方案中，¹⁸F可经由接头与分离的多肽缀合。接头可包含氨基氧基、叠氮基或炔基。接头的氨基氧基可与醛连接，例如氟-取代的醛。接头的叠氮基可与氟取代的炔连接。类似地，接头的炔基可与氟取代的叠氮化物连接。接头还可包含硫醇反应性基团。接头可包含马来酰亚胺基-氨基氧基、马来酰亚胺基-炔或马来酰亚胺基-叠氮基。¹⁸F缀合的多肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ.ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与接头反应，其中接头包含氨基氧基、叠氮基或炔基，以形成接头缀合的多肽；和使接头与¹⁸F部分反应，以形成¹⁸F缀合的多肽。

¹⁸F缀合的多肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ.ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与接头反应，其中接头包含马来酰亚胺基-氨基氧基、马来酰亚胺基-炔或马来酰亚胺基-叠氮基，以形成接头缀合的多肽；和使接头与¹⁸F部分反应，以形成¹⁸F缀合的多肽。

在另一实施方案中，所述方法可包括：(i) 提供包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 提供接头；(iii)使接头与¹⁸F部分反应，以形成¹⁸F标记的接头；和(iv) 使¹⁸F标记的接头与SEQ. ID No 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽反应，以形成¹⁸F缀合的多肽。

使用上述实例，可在多肽上引入氟或放射性氟原子，例如¹⁸F。当氟-取代的醛与接头缀合的多肽的氨基氧基反应时，得到氟-取代多肽。类似地，当氟取代的叠氮化物或炔基与接头缀合的多肽的相应的炔或叠氮基反应时，得到氟取代的多肽。当放射性氟-取代的醛、叠氮化物或炔与接头缀合的多肽的相应的氨基氧基、炔或叠氮基反应时，得到放射性氟-标记的多肽或成像剂组合物。此外，接头可具有放射性氟(¹⁸F)取代基，以制备放射性氟-标记的成像剂组合物。用于在多肽上引入氟的方法也可用于制备具有任何长度的氟化的成像剂组合物。因此，在一些实施方案中，成像剂组合物的多肽可包含例如40-130个氨基酸残基。

用于制备本发明的成像剂或成像剂组合物的接头-缀合的多肽或¹⁸F-缀合的接头可通过比先前已知的方法更有效的本发明方法来制备并且导致较高的收率。所述方法更容易进行，更快速并且在较温和的、更加方便使用者的条件下实施。例如，用¹⁸F-缀合的接头(例如，¹⁸F-氟代苯甲醛)(“¹⁸F-FBA”)标记多肽的方法比本领域已知的程序更简单。通过将¹⁸F直接亲核掺入到三甲基苯胺(trimethylanilinium)前体上，在一步中制备¹⁸F缀合的-接头。¹⁸F-接头(即，¹⁸F-FBA)随后与多肽(例如，Affibody?和本文描述的那些)缀合。接头的制备也比本领域先前已知的方法更容易。此外，放射性标记的基于氨基氧基的接头-缀合的多肽和螯合剂缀合的多肽的cPn家族(例如，Affibody?)显示显著更好的生物分布和更好的肿瘤摄取以及更好的清除，具有较少的肝摄取。

氟-标记的成像剂组合物为在诊断应用中高度期望的材料。使用建立的成像技术(例如PET)可显现¹⁸F标记的成像剂组合物。

在另一实施方案中，多肽可经由式(1)的二胺二肟螯合剂与^99mTc缀合。

其中R'、R''、R'''、R''''独立地为H或C_1-10烷基、C_3-10烷基芳基、C_2-10烷氧基烷基、C_1-10羟基烷基、C_1-10烷基胺、C_1-10氟烷基，或者两个或更多个R基团与它们连接的原子共同形成碳环、杂环、饱和或不饱和的环，其中R可为H、C_1-10烷基、C_3-10烷基芳基、C_2-10烷氧基烷基、C_1-10羟基烷基、C_1-10烷基胺或C_1-10氟烷基。在一个实施方案中，n可在0-5变化。制备二胺二肟螯合剂的方法的实例描述于题为“Methods of radio fluorination of biologically active vector(生物学活性载体的放射性氟化的方法)”的PCT申请国际公布号WO2004080492(A1)和题为“Radio labelled conjugates of RGD-containing peptides and methods for their preparation via click-chemistry(含有RGD的肽的放射性标记的缀合物及其经由点击化学的制备方法)”的PCT申请国际公布号WO2006067376(A2)，它们通过引用结合到本文中。

^99mTc可经由二胺二肟在分离的多肽的N-末端与分离的多肽缀合。螯合剂可为双官能化合物。在一个实施方案中，双官能化合物可为Mal-cPN216。Mal-cPN216包含硫醇-反应性马来酰亚胺基团(用于与SEQ ID No. 1或SEQ ID No 2的多肽的末端半胱氨酸缀合)和双-胺肟基团(二胺二肟螯合剂)(用于与^99mTc螯合)。Mal-cPN216可具有式(II)。

二胺二肟螯合剂缀合的肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽，(ii) 使二胺二肟螯合剂与多肽反应，以形成二胺二肟缀合的多肽。二胺二肟螯合剂还可与^99mTc进一步缀合。

在一个或多个实施方案中，多肽可经由NOTA (1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N''-三乙酸)螯合剂与⁶⁷Ga或⁶⁸Ga缀合。NOTA-螯合剂缀合的多肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽，(ii) 使NOTA螯合剂与多肽反应，以形成NOTA-螯合剂缀合的多肽。NOTA螯合剂还可与⁶⁷Ga或⁶⁸Ga进一步缀合。

在一个实施方案中，Ga(尤其是⁶⁷Ga)可经由NOTA螯合剂与分离的多肽缀合。NOTA螯合剂可被马来酰亚胺基官能化，如在式(III)中描述的。

在一个或多个实施方案中，多肽可经由NOTA (1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N''-三乙酸)螯合剂与Al¹⁸F缀合。NOTA螯合剂缀合的多肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽，(ii) 使NOTA-螯合剂与多肽反应，以形成NOTA-螯合剂缀合的多肽。NOTA-螯合剂缀合的多肽可随后与Al¹⁸F进一步缀合，以形成Al¹⁸F-NOTA-螯合剂缀合的多肽。

在一个或多个实施方案中，多肽可经由NOTA-螯合剂与¹⁸F缀合。NOTA-螯合剂缀合的多肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽，(ii) 使NOTA-螯合剂与¹⁸F的来源(例如，Al¹⁸F)反应，以形成¹⁸F-NOTA-螯合剂；和(iii) 使¹⁸F-NOTA-螯合剂与分离的多肽反应，以形成¹⁸F-NOTA-螯合剂缀合的多肽。

在一个或多个实施方案中，螯合剂可包含单独的螯合剂部分(例如，NOTA、DOTA)或螯合剂部分和接头，各自如本文所描述。通过举例的方式，NOTA-螯合剂可代表单独的NOTA螯合剂部分或与本文描述的接头连接的NOTA螯合剂部分。

在一个或多个实施方案中，多肽可经由SiFA化学与¹⁸F缀合。¹⁸F-SiFA缀合的多肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ.ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与接头反应，其中接头包含氟化硅接纳体(SiFA)基团，以形成SiFA缀合的多肽；和(iii) 使SiFA缀合的多肽与¹⁸F部分或¹⁸F的来源反应。¹⁸F部分或¹⁸F的来源可为能与SiFA基团反应并且经历同位素氟交换化学的任何这样的部分或来源。以下流程I说明使用[¹⁸F]SiF偶联，Z02891 (SEQ. ID No. 2)的放射性标记：

流程I

在一个或多个实施方案中，本文描述的制备本发明的放射性标记的成像剂或成像剂组合物的方法是自动化的。例如，本发明的放射性标记的成像剂或成像剂组合物可借助自动化的放射性合成设备采用自动化的方式来方便地制备。存在若干这样的平台设备的市售可得的实例，包括TRACERlab^TM (例如，TRACERlab^TM MX)和FASTlab^TM (均得自GE Healthcare Ltd.)。这样的设备通常包含“盒”，通常为一次性的，在其中实施放射性化学，将其装配到设备中以实施放射性合成。盒通常包括流体通道、反应容器和用于接受试剂小瓶的端口以及用于放射性合成后的清洁步骤的任何固相萃取柱。任选地，在本发明的其它实施方案中，自动化的放射性合成设备可与高效液相色谱法(HPLC)连接。

因此，本发明提供用于自动化合成本发明的放射性标记的成像剂或成像剂组合物的盒，各自如本文所定义。

本发明还包括使受试者的至少一部分成像的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给予受试者本发明的放射性标记的成像剂或成像剂组合物和使受试者成像。受试者可例如用诊断装置来成像。

在一个或多个实施方案中，成像方法还可包括监测所述剂或组合物向受试者的递送和诊断患有HER2相关疾病状况(例如，乳腺癌)的受试者的步骤。在一个实施方案中，受试者可为哺乳动物，例如，人。在另一实施方案中，受试者可包含细胞或组织。组织可用于活组织检查。诊断装置可采用选自磁共振成像、光学成像、光学相干X射线断层照相、X-射线、单光子发射计算机断层显像(SPECT)、正电子发射断层显像(PET)，或它们的组合的成像方法。

本发明的放射性标记的成像剂或成像剂组合物可作为药物组合物肠胃外给予人和其它动物。本发明的药物组合物包含本文描述的放射性标记的成像剂或成像剂组合物和药学上可接受的载体、赋形剂、溶剂或稀释剂。

例如，用于肠胃外注射的本发明的药物组合物包含药学上-可接受的无菌含水或非含水溶液剂、分散体、混悬剂或乳剂以及用于临用前重构为无菌可注射溶液剂或分散体的无菌散剂。合适的含水和非含水载体、稀释剂、溶剂或溶媒的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯例如油酸乙酯。例如，通过使用涂布材料(例如卵磷脂)、通过调节分散体的粒径和通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。

本发明的药物组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过包括各种抗菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸，等)，可确保防止微生物作用。还可期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠，等。通过包括延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，可引起可注射药物形式的延长的吸收。

本发明的放射性标记的成像剂或成像剂组合物可在生理学上可接受的载体中分散，使得潜在的毒性最小化。因此，成像剂可在pH为约6-约8的生物相容的溶液中分散。在一些实施方案中，所述剂在pH为约7-约7.4的生物相容的溶液中分散。在其它实施方案中，所述剂在pH为约7.4的生物相容的溶液中分散。

可将本发明的成像剂组合物或药物组合物与常用于药物工业以在含水介质中悬浮或溶解化合物的其它添加剂组合，随后悬浮液或溶液可通过本领域已知的技术灭菌。成像剂组合物可采用多种形式给予，并且适于所选的给药途径。例如，成像剂可局部(即，经由组织或粘膜)、静脉内、肌内、皮内或皮下给予。适于注射的形式包括用于制备无菌可注射溶液剂、分散体、脂质体或乳液制剂的无菌含水溶液剂或分散体和无菌散剂。适于吸入使用的形式包括例如在气溶胶中分散的那些剂。适于局部给予的形式包括霜剂、洗剂、软膏等。

可将本发明的成像剂组合物或药物组合物浓缩，以向受试者方便地递送优选量的所述剂并且以期望的形式在容器中包装。所述剂可在容器中分配，其中在生理学上可接受的溶液中分散，以方便促进以0.1 mg-50 mg所述剂/kg受试者体重的浓度给予所述剂。

在一个或多个实施方案中，在给予所述剂后约4小时，可使靶组织成像。在备选的实施方案中，在给予受试者所述剂后约24小时，可使靶组织成像。

实施例

提供以下实施例仅用于说明，并且不应理解为限制本发明。

材料

基于可得到的文献(Bruskin等人，Nucl. Med. Biol. 2004：31：205；Tran等人，Imaging agent composition(成像剂组合物) Chem. 2007：18：1956)选择具有表达HER2的合理可能性的一组肿瘤发生细胞系，如在表3中所描述。

表3

细胞系	物种	类型	目的
				SKOV3	人	卵巢癌	候选
SKBR3	人	乳腺癌	候选
				C6	大鼠	神经胶质瘤	对照

所有细胞系得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且按照推荐培养。在使用前将细胞培养至> 90%汇合。使用抗-Her2第一抗体(R&D Systems，PN MAB1129)和Dako QIFIKIT (PN K0078)对在表4中列举的细胞系进行流式细胞术(Beckman Coulter Cytomics FC500 MPL)，用于定量分析间接免疫荧光染色。具有5种含有不同数量Mab分子的不同群体的校准珠粒与细胞系结合使用，以确定对于每个细胞表面受体的数量。在所有情况下，适当的同种型对照得自相应的销售商。

使用细胞解离缓冲液(PBS + 10 mM EDTA)而不是胰蛋白酶，将粘着细胞从其烧瓶释放，以避免细胞表面受体的蛋白水解。将细胞在PBS中洗涤两次，并且在冰冷的FC缓冲液(PBS + 0.5% BSA w/v)中再悬浮至5-10×10⁶个细胞/ml的浓度。将100 μL细胞的等分试样与5 μg第一抗体混合，并且在冰上孵育45分钟。细胞随后用1 ml冰冷的流式细胞术(FC)缓冲液(PBS，含有2%牛血清白蛋白)洗涤，在300×g下离心5分钟，并且在0.5 μL FC缓冲液再悬浮。加入100 μL第二抗体片段(F(ab)₂ FITC-缀合的山羊抗-小鼠免疫球蛋白)与PBS的1:50稀释液，并且在冰上和暗处孵育45分钟。细胞随后用1 mL冰冷的FC缓冲液洗涤两次，在300×g下离心5分钟，并且在500 μL的FC缓冲液中再悬浮。在流式细胞术前使所有染色的细胞通过100-微米过滤器，以防止流动池堵塞。

在Beckman Coulter Cytomics FC500 MPL上进行流式细胞术。对于每个管，收集最少5×10⁴个事件。所有分析为单一颜色，在FL1中检测FITC。向前散射(FS)和侧散射(SS)数据证明所有细胞群体紧密成群。

流式细胞术用于评价细胞的体外HER2表达(图2A、2B和2C)，其中SKOV3细胞显示最高水平的HER2表达(图3)。图3中的结果可再现(n=3)。

最高表达细胞系为SKOV3。将这些细胞注入6-12周龄免疫-妥协的(immuno-compromised)小鼠，让其生长肿瘤。肿瘤生长曲线和成功率取决于接种的细胞数量。用3-4,000,000个细胞/小鼠得到优化肿瘤生长。

用年龄在6-15周范围的雌性CD-1裸小鼠(Charles River Labs，Hopkinton，MA)进行体内研究。在通风的架子中饲养小鼠，可随意获取食物和水，标准12小时白天-夜晚照明循环。对于异种移植，用100 μl的细胞/PBS注射动物。在右后腿(hindquarter)皮下植入细胞。在异氟烷麻醉下实施植入。对于SKOV3，在各小鼠中植入3×10⁶-4×10⁶个细胞。在这些条件下，在多于80%的注射的动物中，在3-4周后得到可用的肿瘤(100-300 μg)。

通过解剖自小鼠收集肿瘤，并且整个肿瘤在-20℃下储存，直至处理。在Dounce匀浆器中，将肿瘤在1 ml补充蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA #24948)中在冰上研磨。匀浆随后在冰上孵育30分钟，随后在冷冻的离心机中在10,000×G下离心10分钟。收集上清液，并且在冰上或在4℃下储存，直至进一步处理。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce Biotechnology 23225)测定在裂解液中的蛋白质浓度。将裂解液稀释至标准浓度，以在微量滴定板中得到20 μg蛋白质/孔。根据制造商的使用说明，用市售可得的人HER2试剂盒(R&D Systems，DYC1129)进行ELISA。每一个样品一式三份运行，数据作为pg HER2/μg总蛋白质报告，误差作为标准偏差报告。

通过ELISA测量体内靶标表达。将切除的肿瘤匀浆化，并且使用市售可得的配对试剂盒(R&D Systems，DYC1129，Minneapolis，MN)分析HER2。图3中的结果显示SKOV3细胞系生长高-表达肿瘤。ELISA对照为用于流式细胞术的负对照系的细胞-培养裂解液。这些结果说明SKOV3的肿瘤异种移植适用于靶向人HER2的分子的体内研究。

所有的多肽接受自瑞典的Affibody? AB。多肽根据其数字内部开发编码提及，其加前缀“Z”。表1详述本文所述的多肽。多肽包括多肽Z00342 (SEQ. ID No. 1)；多肽Z02891 (SEQ. ID No. 2)；多肽Z00477 (SEQ. ID No. 3和4)，和Z00477的二聚物，即，(Z00477)₂ (SEQ. ID No. 5)。

在Biacore? 3000仪器(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上，使用表面等离振子共振(SPR)检测体外测量多肽与HER2/neu抗原之间的结合相互作用。得到Her2/neu抗原的细胞外结构域作为与得自R&D Systems (Minneapolis，MN)的人IgG (Fc-Her2)的Fc区域的缀合物，并且与用10 μL/分钟HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005% v/v 表面活性剂 P20)预先平衡的CM-5右旋糖酐-官能化的传感器芯片(GE Healthcare，Piscataway，NJ)共价连接，随后用EDC和NHS激活。在激活的传感器芯片上注射Fc-HER2 (5 μg/ml)/10 mM乙酸钠(pH 5.5)，直至实现(2分钟)期望的固定水平(~3000共振单位)。通过注射乙醇胺(1 M，pH 8.5)，封闭在传感器芯片上的残余的活化基团。通过用2.5 M NaCl、50 mM NaOH重复(5×)洗涤，除去任何非共价结合的缀合物。在相同的传感器芯片上的第二流动池同样处理，只是没有Fc-HER2固定，以用作用于折射指数变化和与传感器芯片的非特异性结合相互作用的对照表面。在动力学研究之前，在两个表面上测试靶标分析物的结合，并且实施表面稳定性实验以确保足够除去结合的分析物，和在用2.5 M NaCl、50 mM NaOH处理后，使传感器芯片再生。使用BIA评价软件(GE Healthcare，Piscataway，NJ)分析SPR传感图。通过评价对于每一个计算的动力学参数的残差和标准误差，“拟合优度” (χ2 < 10)，并且将模型化的传感图与实验数据直接比较，确定动力学模型的稳健性。在8种分析物浓度(0-100 nM蛋白质)下收集SPR测量，并且将所得到的传感图与1:1 Langmuir结合模型拟合。

图1显示当在人HER2-官能化的表面上运行时对于Z00477 (SEQ. ID No. 3)和(Z00477)₂ (SEQ. ID No. 5)得到的实例表面等离振子共振(SPR)数据。该关系对于亲和力已知的所有多肽(表2)均适用，其中二聚物Z(477)₂ (SEQ. ID No. 5)的值为基于亲合力影响的估计值。

使用对先前公布的程序(Waibel，R.；等人，A. Nat. Biotechnol. 1999，17，897.)的改进，用fac-[^99mTc(CO)₃]⁺核实现对带His6 (SEQ ID NO: 7)-标签的多肽的标记。简要地，将Na[^99mTcO₄]/盐水(4 mCi，2 mL)加入到Isolink?硼烷碳酸盐(boranocarbonate)试剂盒(Alberto，R.等人，J. Am. Chem. Soc. 2001，123，3135.)中。将所得到的溶液加热至95℃保持15-20分钟，以得到fac-[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺。除去一部分(2 mCi，1 mL)溶液，并且用1 N HCl中和至pH ~7。移出325 μL等分试样，并且加入到His6-多肽(SEQ ID NO: 7) (40 μg)的溶液中。将所得到的溶液在35-37℃的水浴中加热40分钟。典型的放射化学收率在80-95%范围(通过ITLC-SG测定，Biodex，0.9% NaCl)。在NAP-5柱(GE Healthcare，10 mM PBS)上将粗反应产物层析分离，以得到>99%放射化学纯度的产物。得到的典型比活为3-4 μCi/μg。所得到的溶液随后用10 mM PBS稀释，以得到用于随后的生物分布研究的适当浓度。

在配备Grace-Vydac Peptide/Protein C4 (4.6×250 mm)柱和Raytest GABI放射性检测器的Agilent 1100系列HPLC上进行HPLC。溶剂A为95:5水:MeCN，具有0.1% TFA，溶剂B为5:95水:MeCN，具有0.1% TFA。梯度如下(所有变化是线性的；时间/%B)：0/0、4/20、16/60、20/100、25/100、26/0、31/0。

在纯化前，用三羰基锝核以高收率(>90%)标记每一种多肽。通过NAP-5层析法纯化得到具有>99%放射化学纯度的^99mTc-标记的多肽样品(表4)。

表4

NAP-5纯化的放射性标记的多肽的代表性的HPLC色谱图示于图4。在220 nm UV色谱图中，放射性标记的物类的保留时间实际上与相应的未标记的多肽的保留时间没有变化(除了由于UV和γ检测器的物理分离的时间差异；数据未显示)。

用于研究^99mTc(CO)₃(His6)-多肽('His6'公开为SEQ ID NO: 7)的动物模型。

用年龄在6-15周范围的雌性CD-1裸小鼠(Charles River Labs，Hopkinton，MA)进行体内研究。在通风的架子中饲养小鼠，可自由获取食物和水，标准12小时白天-夜晚照明循环。对于异种移植，用100 μl的细胞/PBS注射动物。在右后腿皮下植入细胞。在异氟烷麻醉下实施植入。对于SKOV3，在各小鼠中植入3×10⁶-4×10⁶个细胞。在这些条件下，在多于80%的注射的动物中，在3-4周后得到可用的肿瘤(100-300 μg)。

生物分布

将~1 μg的^99mTc-标记的多肽(~3 μCi/1 μg)尾静脉注射给予小鼠。将小鼠放置在滤纸衬里的笼子中，直至安乐死。在每个时间点使三只小鼠安乐死，将目的组织解剖，并且在Perkin Elmer Wallac Wizard 1480γ计数器上计数。对血液、肾、肝、脾和注射部位(尾部)收集数据。将来自笼子与膀胱的尿汇集，并且也计数。将其余的组织计数，并且对于每只动物，将所有组织的总和加上尿求总和，以提供总注射剂量。对于每一种器官，基于该总数确定%注射剂量，并且将器官称重，用于确定每克的%注射剂量(%ID/g)。数据报告为所有三只小鼠在时间点的平均值，其中误差条代表该组的标准偏差。

将^99mTc标记的Z00477 (SEQ. ID No. 4)多肽注入SKOV3小鼠。图6显示对于这些实验的肿瘤和血液曲线。Z00477 (SEQ. ID No. 4)多肽在表达靶标的SKOV3肿瘤中显示良好的肿瘤摄取，最大值为在注射后(PI)30分钟约3%的注射剂量/克组织，并且在PI 240分钟时，峰值肿瘤:血液比大于8。

多肽呈现从血液单指数清除，其中半衰期小于2分钟。该清除主要通过肝和肾介导。观察到在脾中多肽摄取适度，并且在肝中适度至高摄取，如在表5中所描述的。

表5. 在携带SKOV3肿瘤的小鼠中，Z00477 (SEQ. ID No. 3) His6 (SEQ ID NO: 7) (带标签)的摄取(%ID/g)

比起相应的单体，二价多肽呈现较高的亲和力，推测是由于亲合力效应。然而，它们较大的尺寸可阻碍肿瘤穿透。对于HER2多肽，可得到四种高亲和力多肽的每一种的二价形式。将Z00477 (SEQ. ID No. 3)二聚物，(Z00477)₂ (SEQ. ID No. 5)放射性标记，并且用于在具有SKOV3-肿瘤的小鼠中的4小时生物分布实验。

一价和二价多肽另外呈现类似的生物分布特性，并且观察到二者的血液半衰期均在1-2分钟范围。结果清楚地表明单体和二价多肽两者可体内靶向HER2。

为了引入^99mTc螯合剂cPN216 (图7)，合成双官能化合物Mal-cPN216，其包含硫醇-反应性马来酰亚胺基团(用于与多肽的末端半胱氨酸缀合)和胺肟基团(用于螯合^99mTc)。

cPN216-胺由GE Healthcare得到。N-?-马来酰亚胺基丙酸购自Pierce Technologies (Rockford，IL)。N-甲基吗啉、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基磷

六氟磷酸盐(PyBoP)、二硫苏糖醇(DTT)、碳酸氢铵和无水DMF购自Aldrich (Milwaukee，WI)。PBS缓冲液(1x，pH 7.4)得自Invitrogen (Carlsbad，CA)。HPLC-级乙腈(CH₃CN)、HPLC-级三氟乙酸(TFA)和Millipore 18 mΩ水用于HPLC纯化。

实施例1

在0℃下，向N-?-马来酰亚胺基丙酸(108 mg，0.64 mmol)、cPN216-胺(200 mg，0.58 mmol)和PyBoP (333 mg，0.64 mmol)在无水DMF中的冰冷溶液中加入0.4 M的N-甲基吗啉/DMF (128 μL，1.16 mmol)。2小时后除去冰浴，将混合物在室温下搅拌过夜，随后进行HPLC纯化。得到白色粉末状的产物Mal-cPN216 (230 mg，80%收率)。¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)：δ 1.35 (m，2 H)，1.43 (s，12 H)，1.56 (m，5 H)，1.85 (s，6 H)，2.33 (dd，J1= 8 Hz，J2=4 Hz，2 H)，2.78 (m，4 H)，3.04 (m，2 H)，3.61 (dd，J1= 8 Hz，J2=4 Hz，2 H)，7.02 (s，2 H)，8.02 (s，1 H)，8.68 (s，4 H)，11.26 (s，2 H)；对于[M+H]⁺，m/z=495.2(C24H43N6O5，计算MW=495.3)。

以约1 mg/mL的浓度，用刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)溶解多肽Z00477 (SEQ ID No. 3)。通过加入DTT在刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)中的溶液，还原多肽中的二硫键。DTT的最终浓度为20 mM。将反应混合物涡旋2小时，经过用脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)预先平衡的Zeba脱盐旋转柱(Pierce Technologies)，以除去过量的DTT试剂。收集洗脱的还原的多肽分子，加入双官能化合物Mal-cPN216(20当量/当量多肽)作为在DMSO中的溶液，将混合物在室温下涡旋3小时，并且用液氮冷冻。将反应混合物储存过夜，随后进行反相HPLC纯化(图8A和8B)。

在MiCHROM Magic C18AQ 5 μ 200A柱(MiChrom Bioresources，Auburn，CA)上实施HPLC纯化。溶剂A：H₂O (具有0.1%甲酸)，溶剂B：CH₃CN (具有0.1%甲酸)。梯度：5-100% B，经30分钟。

将含有期望产物的级分合并，用100 mM碳酸氢铵溶液中和，通过冻干除去溶剂，以得到白色固体状的期望的成像剂组合物(收率41%)。

纯化产物的LC-MS分析证实存在期望产物，MW表明仅一种cPN216标记加入到多肽构建体中(Z00477 (SEQ. ID No. 3)-cPN216：计算MW：7429 Da，实测值：7429 Da；Z02891 (SEQ. ID No. 2)-cPN216 计算MW：7524 Da，实测值：7524 Da)。

实施例2

向20 mL小瓶中加入10.00 mL蒸馏的去离子水。在加入NaHCO₃ (450 mg，5.36×10^-3 mol)、Na₂CO₃ (60 mg，5.66×10^-4 mol)和对氨基苯甲酸钠(20 mg，1.26×10^-4 mol)之前，使氮气鼓泡通过该溶液约30分钟。所有试剂独立称重，并且加入到含有水的小瓶中。将氯化锡(1.6 mg，7.09×10^-6 mol)和MDP (2.5 mg，1.42×10^-5 mol)共同称重到1打兰小瓶中，随后通过在约1 mL的碳酸盐缓冲液混合物中快速悬浮而转移(具有1次随后的洗涤)。移出10 μL等分试样，并且在氮气流下转移至硅烷化的小瓶，立即冷冻，并且保持在液氮浴中，直至冻干。每一个小瓶部分加盖橡胶隔膜，并且放置在托盘冻干器中过夜。将小瓶真空密封，从冻干器移出，用铝盖卷曲密封，用无水氮气再次加压，并且在致冷器中储存，直至进一步使用。

实施例3

使用内部生产的一步试剂盒制剂(Chelakit A+)实施放射性标记的多肽的合成，该制剂含有氯化亚锡作为锝的还原剂、亚甲基二膦酸、对氨基苯甲酸盐作为自由基清除剂和碳酸氢钠/碳酸钠(pH 9.2)作为缓冲液的冻干的混合物。按快速连续顺序，将20 μL的2 μg/μL多肽在盐水中的溶液加入到Chelakit中，接着立即加入得自Cardinal Health (Albany，NY)的Na^99mTcO₄ (0.8 mCi，29.6 MBq)在0.080 mL盐水中(0.15M NaCl)。将混合物搅动一次，让其在环境温度下静置20分钟。完成后，通过ITLC测定粗放射化学收率(下表6，根据ITLC-SG，Biodex，0.9% NaCl)。

表6

化合物	粗RCP (%)	纯化的RCP (%)	RCY (%)衰变校正/(未校正)
				Z00477 (SEQ. ID No. 3)	49.2	98.6	53.9 (13.1)
Z02891 (SEQ. ID No. 2)	71.6	97.5	46.9(43.8)

用0.35 mL的150 mM无菌NaCl将反应体积提高至0.45 mL，通过尺寸排阻色谱法(NAP5，GE Healthcare，装载10 mM PBS)纯化最终产物。将粗反应混合物负载于NAP5柱上，让其进入凝胶床，在用0.8 mL的10 mL PBS洗脱后，分离最终的纯化产物。在标准剂量校准器(CRC-15R，Capintec，Ramsey，NJ)中测定最终活性。通过ITLC(>98.5%)、C4 RP-HPLC (图9)和SEC-HPLC分析测定放射化学收率(表6)和纯度。最终产物(10-15μCi/μg，0.2-0.5 μCi/μL (0.37MBq/μg，7.4MBq/mL))立即用于生物分布研究。

用于该实验的HPLC条件如下：C4 RP-HPLC方法1：溶剂A：95/5 H₂O/CH₃CN ((具有0.05% TFA))，溶剂B：95/5 CH₃CN/ddH₂O (蒸馏的去离子水)，(具有0.05% TFA)。梯度洗脱：0分钟0%B，4分钟20%B，16分钟60%B，20分钟100%B，25分钟100%B，26分钟0%B，31分钟0%B。

C4 RP-HPLC方法2：溶剂A：0.06% NH₃在水中，溶剂B：CH₃CN。梯度洗脱：0分钟0%B，4分钟20%B，16分钟60%B，20分钟100%B，25分钟100%B，26分钟0%B，31分钟0%B。

在HP Agilent 1100上实施RP-HPLC分析，其具有G1311A QuatPump、具有100μL注射器和2.0mL座毛细管的G1313A自动注射器、Grace Vydac-蛋白质C4柱(S/N E050929-2-1，4.6 mm×150 mm)、G1316A柱加热器、G1315A DAD和Ramon Star-GABI γ-检测器。

SEC HPLC：溶剂：1× (10 mM) PBS (Gibco，Invitrogen，pH 7.4，含有CaCl₂和MgCl₂)。等度洗脱30分钟。在Perkin Elmer SEC-4 Solvent Environmental对照，Series 410 LC泵，ISS 200 Advanced LC样品处理器和Series 200二极管阵列检测器上实施分析。具有Socket 8103 0111针孔(0.7 mm内径，具有250 μL体积)流动池γ检测器的Raytest GABI通过Perkin Elmer NCI 900 Network Chromatography Interface对接。所用的柱为Superdex 75 10/300 GL High Performance SEC柱(GE Healthcare。编码：17-5174-01，ID号0639059)。

用于将^99mTc掺入cPN216螯合剂(pH=9.2)的Chelakits的操作pH几乎匹配Z00477 (SEQ. ID No. 3)多肽的计算的pI。测定在这些条件下的标记，以引起在最终产物中的聚集(图5A和5B)。通过尺寸排阻HPLC和通过在生物分布研究中观察到的提高的血液停留时间和肝摄取证实聚集。通过改变多肽的等电点，将^99mTc成功地掺入到Z02891 (SEQ. ID No. 2)构建体上。尺寸排阻HPLC证实存在具有适当的分子量的物类，并且生物分布研究显示在肿瘤异种移植物中示踪剂的摄取。

将~1 ug的^99mTc-标记的多肽(~10 μCi/1 μg)尾静脉注射给予小鼠。将小鼠放置在滤纸衬里的笼子中，直至安乐死。在每个时间点使三只小鼠安乐死，将目的组织解剖，并且在Perkin Elmer Wallac Wizard 1480γ计数器上计数。对血液、肾、肝、脾和注射部位(尾部)收集数据。将来自笼子与膀胱的尿汇集，并且也计数。将其余的组织计数，并且对于每一只动物，将所有组织的总和加上尿求总和，以提供总注射剂量。对于每一种器官，基于该总数确定%注射剂量，并且将器官称重，用于确定每克的%注射剂量(%ID/g)。将数据报告为所有4-5只小鼠在时间点的平均值，其中误差条代表该组的标准偏差。在4小时内，取4个时间点(注射后5、30、120和240分钟)。

Z02891 (SEQ. ID No. 2)-cPN216-^99mTc多肽在表达靶标的SKOV3肿瘤中显示强肿瘤摄取，在注射后(PI)30分钟，具有7.11 ± 1.69% (n=5)的注射剂量/克组织的值，在高达PI 240分钟的研究的时间-过程中，其保持相当恒定。在注射后30、120和240分钟，肿瘤:血液比分别为2、5和5。图10、11和12显示对于这些实验的肿瘤、血液和肿瘤:血液曲线。

多肽呈现从血液单指数清除，其中半衰期小于2分钟。该清除主要通过肾介导，在注射后PI 240分钟，具有10.58 ± 2.96 (n=5) ID/器官。活性主要在尿中分泌。在研究过程中，观察到由于可能的聚集，在脾中多肽摄取适度至高，并且在肝中适度摄取，例如，12%ID/器官(值相当于在小鼠中的%ID/g)。

Z02891 (SEQ. ID No. 2)-cPN216-^99mTc的生物分布结果

表7 在携带SKOV3肿瘤的小鼠中，Z02891 (SEQ. ID No. 2) cPN216摄取(%ID/g)

实施例4

经由设计的C-末端半胱氨酸，Z00477 (SEQ. ID. NO. 4)、Z00342 (SEQ. ID No. 1)和Z02891 (SEQ. ID No. 2)-半胱氨酸多肽被氨基氧基官能化。通过高效液相色谱法(HPLC)测定提供的多肽分子的纯度>95%。

实施例5

为了将¹⁸F掺入多肽分子中，合成包含两个垂直的基团的双官能接头Mal-氨基氧基：硫醇-反应性马来酰亚胺基团(用于与设计的半胱氨酸缀合)和醛-反应性氨基氧基(图13A和13B)。使用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)-介导的偶联条件，通过使N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺与2-(叔丁氧基羰基氨基氧基)乙酸反应，来制备该接头，得到接头的Boc-保护的形式。随后通过酸裂解，使Boc保护基团脱保护，以定量收率得到最终的Mal-AO产物。最终产物无需进一步纯化可直接使用。

通用

二氯甲烷、2-(叔丁氧基羰基氨基氧基)乙酸、三乙胺、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸(TFA)盐、水合N-羟基苯并三唑(HOBT)，1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)、二硫苏糖醇(DTT)和所有其它标准合成试剂购自Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis，MO)。所有化学物质无需进一步纯化可使用。PBS缓冲液(1x，pH 7.4)得自Invitrogen (Carlsbad，CA)。HPLC-级乙酸乙酯、己烷、乙腈(CH₃CN)、三氟乙酸(TFA)和Millipore 18 mΩ水用于纯化。

实施例6

向2-(叔丁氧基羰基氨基氧基)乙酸(382 mg，2 mmol)在无水二氯甲烷(20 mL)中的溶液中序贯加入三乙胺(307 μL，2.2 mmol)、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺-TFA盐(508 mg，2 mmol)、HOBT(306 mg，2 mmol)和EDC (420 mg，2.2 mmol)。在室温下搅拌24小时后，反应混合物用乙酸乙酯(50 mL)稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(3×30 mL)、水(30 mL)和盐水(30 mL)洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥，过滤。将滤液浓缩至浅黄色固体，通过柱色谱法纯化(70%乙酸乙酯在己烷中)，以得到白色粉末状的产物(500 mg，80%收率)。¹H-NMR (400MHz，CDCl₃)：δ 1.50 (s，9 H)，3.55 (tt，J1= 6.0 Hz，J2= 6.5 Hz，2 H)，3.77 (dd，J= 7.6 Hz，2 H)，4.30 (s，2 H)，6.3 (s，2 H)。

实施例7

将9.3 mg的Mal-AO-Boc在1 mL的3M HCl在甲醇中的溶液在室温下搅拌18小时。真空除去溶剂，以得到浅黄色固体状的Mal-AO (80%收率)。¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)：δ 3.27 CH₂ (t，J= 4.0 Hz，2H)，3.49 CH₂ (t，J= 4.0 Hz，2H)，4.39 CH₂O (s，2H)，7.00 CH=CH (s，2H)；对于[M+H]⁺，m/z=214.07(C₈H₁₂N₃O₄，计算MW=214.11) )

实施例8

以约1 mg/mL的浓度，用刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)溶解多肽(Z00477(SEQ ID No. 4)、Z00342 (SEQ ID No. 1)或Z02891 (SEQ ID. No. 2))。通过加入二硫苏糖醇(DTT)在刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)中的溶液，还原多肽中的二硫键。DTT的最终浓度为20 mM。将反应混合物涡旋2小时，洗脱经过用脱气的PBS缓冲液预先平衡的Zeba脱盐旋转柱(Pierce Technologies)，以除去过量的DTT试剂。收集还原的多肽，加入双官能Mal-AO化合物(15当量/当量多肽)作为在DMSO中的溶液。在室温下涡旋过夜后，反应混合物用高效液相色谱法(HPLC)纯化(图14A和14B)。

在MiCHROM Magic C18AQ 5μ 200A柱(MiChrom Bioresources，Auburn，CA)上实施HPLC纯化。溶剂A：H₂O (具有0.1%甲酸)，溶剂B：CH₃CN (具有0.1%甲酸)。梯度：5-100% B，经30分钟。将含有期望产物的级分合并，用100 mM碳酸氢铵溶液中和，通过冻干除去溶剂，以得到白色固体状的氨基氧基-修饰的多肽。

ESI-TOF-MS分析证实存在具有预期的分子量的靶标产物，对于Z00477 (SEQ. ID No. 4)-ONH₂、Z00342 (SEQ. ID No. 1)-ONH₂和Z02891 (SEQ. ID No. 2)-ONH₂，分别计算MW为：6964 Da、8531 Da和7243 Da，实测值：6963 Da、8532 Da和7244 Da。

实施例9. 制备18FBA

方法：在氮气气氛下或在使用前用氮气净化的顶部卷曲密封的小瓶中实施所有反应。购买Kryptofix 222 (Aldrich)和K₂CO₃ (EMD Science)并且原样使用。Optima^TM-级乙腈用作HPLC和反应溶剂二者。

K¹⁸F (40mCi.mL^-1 (1480 MBq.mL^-1)在纯水中)得自IBA Molecular (Albany，NY)和PETNET Solutions (Albany，NY)，并且原样使用。[¹⁸F^-]氟化物首先在Chromafix 30-PS-HCO₃阴离子交换柱(ABX，Radeberg，德国)上固定，随后用1 mL含有Kryptofix K222 (376 g.mol^-1，8 mg，2.13×10^-5 mol)和碳酸钾(138.2 g.mol^-1，2.1 mg，1.52×10^-5 mol)的乙腈:蒸馏的去离子H₂O (ddH₂O)的4:1混合物洗脱到干燥(drydown)容器中。在部分真空和氮气流下，伴随温和加热(~ 45℃) (~15分钟)除去溶剂。来源小瓶和阴离子交换柱随后用0.5mL含有K222 (8 mg)的乙腈洗涤，在部分真空和温和加热(~ 10分钟)下，使反应混合物再次干燥。用氮气使反应容器再次加压，用另外的0.5mL乙腈再次重复共沸干燥。将4-甲酰基-N,N,N-三甲基苯胺三氟甲磺酸酯(313.30 g.mol^-1，3.1 mg，9.89×10^-6 mol)溶解于0.35 mL的无水DMSO (Acros)中，并且直接加入到含有K¹⁸F.K222、K₂CO₃的反应容器中。将反应混合物加热至90℃保持15分钟，立即冷却，用3 mL的ddH₂O淬灭。该混合物随后经过阳离子交换柱(Waters SepPak Light Accell Plus CM)，用ddH₂O稀释至10 mL，并且负载于反相C18 SepPak (Waters SepPak Plus C18)上。SepPak用10 mL的ddH₂O冲洗，随后用30 mL的空气净化。将[¹⁸F]4-氟代苯甲醛(¹⁸FBA)在1.0 mL的甲醇中洗脱。

实施例10

单独地，将高回收小瓶(2mL，National Scientific)装载Z00477-(SEQ. ID No. 3)-ONH₂ (0.35-0.5mg)，Z00342-(SEQ. ID No.1)-ONH₂ (0.35-0.5mg)或Z02891-(SEQ. ID No. 2)-ONH₂ (0.35-0.5mg)。将固体在25 μL的ddH₂O和8 μL的三氟乙酸中悬浮。将25 μL的¹⁸FBA在甲醇中(参见实施例9)转移至反应小瓶。将容器加盖，卷曲，放置在加热块中，并且在60℃下保持15分钟；此时移出小的等分试样(<5 μL)用于分析型HPLC分析。在准备半制备型HPLC纯化中，450 μL的含有0.1% TFA的ddH₂O用于稀释溶液至约500 μL。将¹⁸FB-多肽分离并且通过半制备型HPLC纯化。用ddH₂O将含有产物(0.113 mCi/4.18MBq)的HPLC级分稀释5:1，随后固定在tC18 Plus Sep Pak (Waters)上。SepPak首先用5 mL的ddH₂O，随后用30 mL的空气冲洗。通过首先洗脱空体积(约0.5mL)，接着在单独的烧瓶中收集250-300 μL的洗脱液，在最少量的乙醇中分离¹⁸FB-多肽。对已分离的产物实施RP-HPLC分析，以确定放射化学和化学纯度。通常，注射10 μL的0.1 μCi/μL溶液，用于配制后分析。在表9中指出分离的放射化学收率，并且由向¹⁸FBA中加入多肽而衰变校正，并且放射化学纯度>99%。或者，¹⁸F-标记的多肽通过NAP5尺寸排阻色谱法如下分离：用10mM PBS将反应混合物稀释至约0.5mL，并且在凝胶上负载。通过用0.8 mL的10mM PBS洗脱柱，分离¹⁸F-标记的多肽，并且无需进一步修饰可使用。这些结果在表8和图15中说明。

表8

化合物	分离的收率(衰变校正)(%)	HPLC RCP (%)
			Z00477 (SEQ. ID No. 4)	0.6%/1.2%	95%
Z00342 (SEQ. ID No. 1)	8.2% (10.7%)	>99%
			Z02891 (SEQ. ID No. 2)	6.2% (7.6%)	>99%

所用的分析型HPLC条件如下：在HP Agilent 1100上实施分析，其具有G1311A QuatPump、具有100μL注射器和2.0mL座毛细管的G1313A自动注射器、Phenomenex Gemini C18柱(4.6mm×150mm)，5μ，100? (S/N 420477-10)、G1316A柱加热器、G1315A DAD和Ramon Star-GABI γ-检测器。95:5 ddH₂O:CH₃CN(具有0.05% TFA)，溶剂B：CH₃CN(具有0.05% TFA)。梯度洗脱(1.0 mL.分钟^-1)：0分钟0%B，1分钟15%B，21分钟50%B，22分钟100%B，26分钟100%B，27分钟0%B，32分钟0%B，或梯度洗脱(1.2 mL.分钟^-1)：0分钟0%B，1分钟15%B，10分钟31%B，10.5分钟100%B，13.5分钟100%B，14分钟0%B，17分钟0%B。

所用的半制备型HPLC条件如下：在Jasco LC上实施纯化，其具有DG-2080-54 4-线脱气器、MX-2080-32动态混合器和两个PU-2086 Plus Prep泵、具有安装的大体积注射试剂盒的AS-2055 Plus Intelligent自动注射器、Phenomenex 5μ Luna C18(2) 100?，250 × 10 mm，5 μ保护柱(S/N 295860-1、P/N 00G-4252-N0)、MD-2055 PDA和与固态SiPIN光电二极管γ检测器连接的Carroll & Ramsey Associates Model 105S Analogue Ratemeter。梯度洗脱：0分钟5%B，32分钟20%B，43分钟95%B，46分钟95%B，49分钟5%B，溶剂A：ddH₂O:CH₃CN(具有0.05% TFA)，溶剂B：CH₃CN(具有0.05% TFA)。

实施例11

将~1 ug的¹⁸F-标记的多肽(~4 uCi/1 μg)尾静脉注射给予小鼠。将小鼠放置在滤纸衬里的笼子中，直至安乐死。在每个时间点使三只小鼠安乐死，将目的组织解剖，并且在Perkin Elmer Wallac Wizard 1480 γ计数器上计数。对于血液、肾、肝、脾、骨和注射部位(尾部)，收集数据。将来自笼子与膀胱的尿汇集，并且也计数。将其余的组织计数，并且对于每一只动物，将所有组织的总和加上尿求总和，以提供总注射剂量。基于该总数确定对于每一种器官的注射剂量百分比，并且将器官称重，用于确定每克的注射剂量百分比(%ID/g)。数据报告为所有三只小鼠在时间点的平均值，其中误差条代表该组的标准偏差。

在SKOV3细胞异种移植模型中，多肽经历生物分布研究。在4小时内，取4个时间点(注射后5、30、120和240分钟)。完整的生物分布数据包括在表12 (在携带SKOV3肿瘤的小鼠中，%ID/g Z02891 (SEQ. ID No. 2)-¹⁸F-氟苄基肟)和表13 (在携带SKOV3肿瘤的小鼠中，%ID/g Z00342 (SEQ. ID No. 1) ¹⁸F-氟苄基肟)中。图16、17和18显示对于这些测试的肿瘤、血液、肿瘤:血液和清除曲线。

Z02891 (SEQ. ID No. 2) ¹⁸F-氟苄基肟多肽在表达靶标的SKOV3肿瘤中显示强肿瘤摄取，在注射后(PI)240分钟时，具有17.47 ± 2.89 (n=3)的注射剂量/克组织的值。在注射后30、120和240分钟时，肿瘤:血液比分别为约3、34和128。Z00342 (SEQ. ID No. 1) ¹⁸F-氟苄基肟多肽在表达靶标的SKOV3肿瘤中显示强肿瘤摄取，在PI 240分钟时，具有12.45 ± 2.52 (n=3)的注射剂量/克组织的值。在注射后30、120和240分钟时，肿瘤:血液比分别为约3、32和53。

多肽呈现从血液单指数清除，其中半衰期小于2分钟。Z02891 (SEQ. ID No. 2)的该清除主要通过肾介导，在PI 240分钟时，具有0.95 ± 0.07 (n=3) ID/器官。活性主要在尿中分泌。在研究过程(注射后4小时)期间，观察到在脾中多肽摄取最小化，和在肝中低摄取，约1.8%ID/器官(值相当于在小鼠中的%ID/g)。

表9. 在携带SKOV-3肿瘤的小鼠中，Z02891 (SEQ. ID No. 2) ¹⁸F-氟苄基肟摄取(%ID/g)

表10. 在携带SKOV-3肿瘤的小鼠中，Z00342 (SEQ. ID No. 1) ¹⁸F-氟苄基肟摄取(%ID/g)

通用

所有反应在氮气气氛下或在用氮气净化的顶部卷曲密封的小瓶中实施。Optima^TM-级乙腈用作HPLC和反应溶剂二者。

实施例12

将[¹²³I]4-碘代苯甲醛(¹²³I BA)加入到含有0.35-0.5mg的多肽-ONH₂ (Z02891，SEQ. ID No. 2)的高回收小瓶(2 mL，National Scientific)中。通过在25 μL的ddH₂O中溶解多肽，并且加入8 μL的三氟乙酸，接着加入¹²³IIBA/甲醇，开始反应。将容器加盖，卷曲，放置在加热块中，并且在60℃下保持15分钟；移出小的等分试样(<5 μL)用于分析型HPLC分析，以评价反应状态。在准备半制备型HPLC纯化中，将反应混合物稀释至ddH₂O:含有0.1% TFA的乙腈混合物的最小的1:1混合物。将¹²³IB-多肽分离并且通过半制备型HPLC或NAP5尺寸排阻色谱法纯化。将含有产物的HPLC级分用ddH₂O进一步稀释(5:1)，并且随后固定在tC18 Plus Sep Pak (Waters)上。首先用5 mL的ddH₂O，随后用30 mL的空气冲洗SepPak，得到¹²³IB-多肽/最少量的乙醇，做法是首先洗脱空体积(约0.5mL)，接着在单独的烧瓶中收集250-300 μL的洗脱液。对已分离的产物实施RP-HPLC分析，以确定放射化学和化学纯度。

实施例13. 制备⁶⁷Ga-NOTA-Z00477 (SEQ ID No. 3)

在NOTA (1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N''-三乙酸)螯合剂与多肽缀合后，用Ga(尤其是⁶⁷Ga)标记多肽Z00477 (SEQ. ID 3)。(图19)

如下完成Mal-NOTA与多肽分子的生物缀合。以约1 mg/mL的浓度，用刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)溶解多肽。通过加入DTT在刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)中的溶液，还原多肽中的二硫键。DTT的最终浓度为20 mM。将反应混合物涡旋2小时，通过用脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)预先平衡的Zeba脱盐旋转柱(Pierce Technologies)，以除去过量的DTT试剂。收集洗脱的还原的多肽分子，并且加入双官能化合物mal-NOTA(15当量/当量多肽)作为在DMSO中的溶液，将混合物在室温下涡旋。让反应进行过夜，以确保多肽分子的完全转化。

在MiCHROM Magic C18AQ 5μ 200A柱(MiChrom Bioresources，Auburn，CA)上实施HPLC纯化。溶剂A：H₂O (具有0.1%甲酸)，溶剂B：CH₃CN (具有0.1%甲酸)。梯度：5-100% B，经30分钟。(图20A)

将含有期望产物的级分合并，用100 mM碳酸氢铵溶液中和，通过冻干除去溶剂，以得到白色固体状的缀合的多肽。

纯化产物的LC-MS分析证实存在期望产物，并且MW表明仅一种NOTA螯合剂加入到多肽构建体中(对于Z00477 (SEQ. ID No. 3)-NOTA，计算MW：7504 Da，实测值：7506 Da)。(图20B)

随后如下完成放射性标记：开始时将25μl HEPES溶液(63mM)加入到螺旋顶盖小瓶中，接着加入10μl ⁶⁷GaCl₃ (GE Healthcare)/40.5 MBq的0.04M HCl。随后将30 μg (MW=7506，4.0×10^-9 mol)的NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)/30 μl H₂O加入到反应混合物中，以得到61 μM的最终NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)浓度，pH为3.5-4.0。将反应小瓶密封，反应保持在环境温度下。在室温下2小时后，粗反应混合物的反相HPLC分析测定⁶⁷Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)的放射化学纯度(通过HPLC测定)为95%。(图21)。在1天的反应时间后，通过HPLC纯化⁶⁷Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)。将22MBq的⁶⁷Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)注射到HPLC上，用于纯化。15MBq的⁶⁷Ga标记的产物得自纯化(放射化学收率=68%)。真空除去HPLC溶剂，以得到具有约0.5 mL体积的溶液。随后加入约1.45 mL的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水，以得到在pH 6-6.5下放射性浓度为7.7 MBq/mL的最终溶液。发现纯化的配制的⁶⁷Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)在室温下稳定至少2小时。(RCP=96%，通过HPLC) (图22)。

所用的分析型HPLC条件如下：Grace Vydac C₄蛋白质5微米，300?，4.6×250 mm HPLC柱。溶剂A=95/5 H₂O/MeCN在0.05%三氟乙酸(TFA)中，溶剂B=95/5 CH₃CN/H₂O在0.05% TFA中。HPLC梯度(分钟/%B)：0/0，4/20，16/60，20/100，25/100，26/0。

所用的半制备型HPLC条件如下：柱：Grace Vydac C4蛋白质5微米，300?，4.6×250 mm。溶剂A=95/5 H₂O/MeCN在0.05%三氟乙酸(TFA)中，溶剂B=95/5 CH₃CN/H₂O在0.05% TFA中。HPLC梯度(分钟/%B)：0/0，4/20，16/60，20/100，25/100，26/0。

通用

重组HER2 Z28921-Cys购自Affibody AB，Sweden，Eei-氨基氧基乙酸琥珀酸酯购自IRIS Biotech，二叔丁基二氟硅烷购自Fluorochem。试剂和溶剂购自IRIS Biotech，Merck，Romil和Fluka。

使用以下条件，通过与Thermo Finnigan Surveyor PDA色谱系统偶联的正离子模式操作的电喷雾电离(ESI)的Thermo Finnigan MSQ仪器上记录分析型LC-MS谱：溶剂A=H₂O/0.1% TFA，溶剂B=ACN/0.1% TFA(如果未另外说明)，流速：0.6 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 3 μm C18 (2) 20×2 mm，检测：UV 214/254 nm。

使用以下条件，在Beckman System Gold色谱系统上实施半制备型反相HPLC运行：溶剂A=H₂O/0.1% TFA，溶剂B=ACN/0.1% TFA(如果未另外说明)，流速：10 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 5 μm C18 (2) 250×21.2 mm，检测：UV 214 nm。

使用以下条件，在Waters Prep 4000系统上实施制备反相HPLC运行：溶剂A=H₂O/0.1% TFA，溶剂B=ACN/0.1% TFA(如果未另外说明)，流速：50 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 10μ C18 (2) 250×50 mm，检测：UV 214/254 nm。

缩写

Ala (A)：	丙氨酸
		Arg (R)：	精氨酸
Asn (N)：	天冬酰胺
		Asp (D)：	天冬氨酸
ACN：	乙腈
		Boc：	叔丁氧基羰基
Cys (C)：	半胱氨酸
		DIPEA：	二异丙基乙胺
DMF：	N,N-二甲基甲酰胺
		DMAB：	4-二甲基氨基-苯甲醛
DOTA：	1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸
		EDT：	1,2-乙烷二硫醇
EMS：	乙基甲基硫化物
		ESI：	电喷雾电离
eq：	当量
		FBA：	4-氟代苯甲醛
Gln (Q)：	谷氨酰胺
		Glu (E)：	谷氨酸
hr：	小时
		HER2：	人表皮生长因子受体
HOAt：	1-羟基-7-氮杂苯并三唑
		HPLC：	高效液相色谱法
Ile (I)：	异亮氨酸
		LC-MS：	液相色谱法-质谱法
Leu (L)：	亮氨酸
		Lys (K)：	赖氨酸
Met (M)：	蛋氨酸
		min：	分钟
μm：	微米
		nm：	纳米
NMP：	1-甲基-2-吡咯烷酮
		NOTA：	1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸
PDA：	光电二极管阵列
		PET：	正电子发射断层显像
Phe (F)：	苯丙氨酸
		Pro (P)：	脯氨酸
PyAOP：	(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基磷六氟磷酸盐
		Ser：	丝氨酸
SiFA：	4-(二叔丁基氟甲硅烷基)苯甲醛
		TFA：	三氟乙酸
Thr (T)：	苏氨酸
		TIS：	三异丙基硅烷
Trp (W)：	色氨酸
		Tyr (Y)：	酪氨酸
Val (V)：	缬氨酸

实施例14. 化合物2的半自动化的放射性合成

FASTlab^TM平台(GE Healthcare)用于制备[¹⁸F]氟代苯甲醛(“[¹⁸F]FBA”)，得到通常7 GBq的[¹⁸F]FBA/乙醇(1.5 mL，非衰变校正收率12-54%)。随后在硅烷化的P6小瓶中，在盐酸苯胺(3.2 mg，25 μmol)/水(138 μL)存在下，使该[¹⁸F]FBA溶液的小部分(92 μL)与氨基氧基前体3 (0.4 mg，55 nmol)手动缀合。使用Peltier加热器，使混合物在70℃下加热20分钟。经由尺寸排阻色谱法(NAP5柱，GE Healthcare)分离2。将用0.25 mL盐水/0.1%抗坏血酸钠的初始洗脱丢弃。收集含有2的随后的0.75 mL盐水/0.1%抗坏血酸钠洗脱，并与pH 5-5.5的相同洗脱混合物配制，以得到期望的放射性浓度。来自缀合步骤的已分离的2的非衰变校正收率为17-38%，并且手动制备的2的放射化学纯度(RCP)值≥ 95%。(TLC系统：Perkin Elmer Instant Imager，使用C18反相片(reversed-phase sheets)，用水/30%乙腈(v/v)作为流动相。标记的肽保持在原点)。使用Gilson 322泵，以及Gilson UV/ViS 156检测器、Bioscan Flow-Count放射性检测器和Luna C18 Phenomenex柱(50×4.6 mm，3 μm)或Luna C18 Phenomenex柱(150×4.6 mm，5 μm)，通过HPLC进一步分析产物。流动相包含溶剂A (0.1 M乙酸铵)和溶剂B (乙腈)，以1 mL/分钟运行，使用线性梯度(5-95% B，在15分钟内)。在280和350 nm下测量UV吸光度。图23显示2的制剂的分析型HPLC迹线的代表性实例。

实施例14a. 化合物3的制备

(i) 制备Eei-氨基氧基乙酰基-马来酰亚胺

将N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺TFA盐(51 mg，0.20 mmol)和Eei-AOAc-OSu (77 mg，0.30 mmol)溶解于NMP (2 mL)中。加入sym.-可力丁(80 μL，0.6 mmol)，将反应混合物搅拌70分钟。反应混合物用水(7 mL)稀释，通过半制备型HPLC纯化产物eei-氨基氧基乙酰基-马来酰亚胺。使用半制备型HPLC纯化(梯度：15-30% B，经40分钟，其中A=水/0.1%乙酸，B=ACN)，得到43 mg (75%)纯的Eei-氨基氧基乙酰基-马来酰亚胺。纯化的物质eei-氨基氧基乙酰基-马来酰亚胺通过LC-MS表征(梯度：10-40% B，经5分钟)：t_R：1.93分钟，实测值m/z：284.1，预期的MH⁺：284.1。

(ii) 制备化合物3

将重组Z02891-Cys (144 mg，0.205 mmol)(购自Affibody AB，Sweden)和eei-氨基氧基乙酰基-马来酰亚胺(17 mg，0.60 mmol)溶解于水(3 mL)中。通过加入乙酸铵，将溶液调节至pH 6，将反应混合物振摇90分钟。反应混合物用水(7 mL)稀释，产物通过半制备型HPLC纯化，得到126 mg冻干的Eei-保护的产物。在氩气气氛下，eei-保护的产物用2.5% TFA/水(16 mL)处理20分钟。溶液用水(144 mL)稀释，在氩气保护(blanket)下用异丙醇/干冰浴冷冻，并且冻干，得到149 mg (100%) Z02891-Cys-马来酰亚胺-氨基氧基乙酰基(3)。通过分析型LC-MS分析冻干的Z02891-Cys-马来酰亚胺-氨基氧基乙酰基(3) (梯度：10-40% B，经5分钟，t_R：3.28分钟，实测值m/z：1811.8，预期的MH₄ ⁴⁺：1811.4。

实施例15. 使用tC2 SepPak纯化，化合物2的自动化的放射性合成

装配FASTlab^TM盒，其含有第一小瓶(8.25 mg/21.9 μmol Kryptofix，1.16 mg/8.4 μmol K₂CO₃，165 μL水，660 μL乙腈)、第二小瓶(1.5 mg/4.8 μmol三氟甲磺酸酯1，1.5 mL无水DMSO)、第三小瓶(5.5 mg/0.76 μmol 3，8.2 mg/63 μmol盐酸苯胺，0.7 mL乙酸铵缓冲液pH 4.5/0.25 M)、第四小瓶(4 mL，4% w/v氨水)、乙醇(25 mL)和磷酸(1% w/w，25 mL)的外部小瓶、预先调节的QMA light SepPak柱、OASIS MCX SepPak柱和两个^tC2 SepPak柱。产物小瓶含有对氨基苯甲酸的水溶液(0.08% w/w，19 mL)。盒布置示于图24。

将所需的程序序列从PC控制上载到合成器模块和安装在机器上的装配的盒。使水袋和产物小瓶连接。将含有[¹⁸F]水(300 MBq，1 mL)的小瓶与FASTlab^TM模块连接，并且开始放射性合成。该过程包括当由QMA柱洗脱时，[¹⁸F]-Kryptofix/碳酸钾复合物的共沸干燥步骤，放射性合成[¹⁸F]FBA，使用MCX柱、氨溶液和乙醇洗脱，纯化[¹⁸F]FBA，缀合步骤，以产生2，和在^tC2柱上使用磷酸/乙醇纯化和配制步骤。总过程耗时1小时，并且以33%非衰变校正放射化学收率产生2，具有94%放射化学纯度。

实施例16. 使用Sephadex纯化，化合物2的自动化的放射性合成

装配FASTlab^TM盒，其含有第一小瓶(8.25 mg/21.9 μmol Kryptofix，1.16 mg/8.4 μmol K₂CO₃，165 μL水，660 μL乙腈)、第二小瓶(1.5 mg/4.8 μmol三氟甲磺酸酯1，1.5 mL无水DMSO)、第三小瓶(5.0 mg/0.69 μmol 3，8.2 mg/63 μmol盐酸苯胺，0.7 mL乙酸铵缓冲液pH 4.5/0.25 M)、第四小瓶(4 mL，4% w/v氨水)、乙醇(25 mL)和盐水(Polyfusor，0.9% w/v，25 mL)的外部小瓶、预先调节的QMA light SepPak柱、OASIS MCX SepPak柱和含有干Sephadex G10 (500 mg，Sigma-Aldrich，目录号G10120)的自定义装填的尺寸排阻柱(2 mL，Supelco，目录号57608-U)。盒布置示于图26。如在实施例15中所描述的实施2的放射性合成。在用盐水(5 mL)使Sephadex柱启动(priming)之后，将粗反应混合物泵送通过Sephadex柱，在产物小瓶中收集纯的2。合成时间为40分钟，非衰变校正放射化学收率为10%。产物的放射化学纯度为95%，DMAB的水平为0.8 μg/mL。图27显示最终产物的HPLC分析。

实施例17. [¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₂-Z02891(SEQ ID No. 2)(5)的放射性合成

在锥形聚丙烯离心小瓶(1.5 mL)中，将NOTA(COOH)₂-Z02891 (4) (746 μg，100 nmol)在乙酸钠缓冲液(50 μL，pH 4.0，0.5 M)中的溶液与AlCl₃ (3 μL，3.33 μg，25 nmol，在乙酸钠缓冲液，pH 4.0，0.5 M中)的溶液混合。在加盖的P6小瓶中，将该混合物加入到小体积的[¹⁸F]氟化物(50 μL)中。将该小瓶在100℃下加热15分钟。用盐水(100 μL)稀释后，将反应溶液转移至NAP5尺寸排阻柱(GE Healthcare)。使用盐水(750 μL)，将最终产物洗脱到P6小瓶中。得到标记的肽5，具有11%非衰变校正放射化学收率。图28显示配制的产物的分析型HPLC。表11汇总各次运行的数据。

表11. 使用NAP5纯化，[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₂-Z02891(SEQ ID No. 2)(5)制备物概述。

实施例17a. 化合物4的制备

(i) 制备NOTA(bis-tBu)

(a) 合成四甲苯磺酰基-N,N`-双(2-羟基乙基)乙二胺

在氮气下，在0℃下，将N,N`-双(2-羟基乙基)-乙二胺(Aldrich，14.8 g，100 mmol)和吡啶(Fluka，200mL)搅拌，同时经75分钟时间，将溶解于吡啶(Fluka，100mL)中的甲苯-4-磺酰氯(Fluka，77 g，400 mmol)的溶液滴入该溶液中。温度缓慢升至室温，继续搅拌4小时。将溶液倒入冰(250 mL)和盐酸(浓盐酸，250 mL)的混合物中，同时搅拌，以得到暗色粘性油。通过倾析除去溶剂，粗产物用水洗涤，倾析，并且再溶解于甲醇(250mL)中。通过过滤分离所得到的浆料，将粗产物再溶解于热甲醇(60℃，600 mL)中，冷却。将固体产物滤除，真空干燥。收率36.36 g (47.5%)。产物通过NMR证实。

(b) 合成1-苄基-4-7-二甲苯磺酰基-1,4,7-三氮杂环壬烷(triazonane)

将四甲苯磺酰基-N,N`-双(2-羟基乙基)乙二胺(参见实施例17a(i)(a)；2.0 g，2.6 mmol)、苄胺(500μl，4.6 mmol)、碳酸钾(Fluka，792 mg，5.7 mmol)和乙腈(Merck，25 mL)加热至100℃，搅拌过夜。通过过滤从固体产物除去溶剂。固体用乙腈(2×10 mL)洗涤，蒸除溶剂。将固体溶解于热乙醇(15 mL)中，并且在室温下保持三天。通过过滤收集晶体，真空干燥过夜。通过LC-MS证实产物(Phenomenex Luna C18(2) 2.0×50 mm，3 μm，溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸；梯度10-80% B，经5分钟；流速0.6 mL/分钟，在214和254 nm下UV检测，ESI-MS) t_R=3.66分钟。收率1 g (72%)。

(c) 合成(4-苄基-7-叔丁氧基羰基甲基-[1,4,7]三氮杂环壬-1-基)-乙酸叔丁基酯

搅拌下，将硫酸(Sigma，浓硫酸，25 mL)加入到1-苄基-4-7-二甲苯磺酰基-1,4,7-三氮杂环壬烷(参见实施例17a(i)(b)；2.5 g，4.7 mmol)中，并且加热至100℃，保持20小时。将反应混合物冷却至室温，并且逐滴加入到乙醚(VWR，500 mL)中。将产物(白色沉淀物)滤除，用乙腈、氯仿和二氯甲烷洗涤。真空除去溶剂。将粗产物(986.3 mg，4.5 mmol)与三乙胺(Fluka，1.4 mL，10 mmol)在乙腈(50 mL)中混合。将溴乙酸叔丁酯(Fluka，1.47 mL，10 mmol)溶解于乙腈(25 mL)中，并且逐滴加入。将反应混合物在室温下搅拌过夜。控制pH，如果需要，加入三乙胺。真空除去溶剂，将粗物质溶解于二氯甲烷(150 mL)中，用水(2×25 mL)、0.1 M盐酸(1x 25mL)和水(1×25mL)洗涤。将有机相过滤，蒸除溶剂。将粗物质溶解于乙腈/水(1:1)中，通过制备型HPLC (Phenomenex Luna C18 (2) 5μm 250×21.2 mm，溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸；梯度10-80% B，经60分钟)纯化，冻干。LC-MS (Phenomenex Luna C18(2) 2.0×50 mm，3 μm，溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸；梯度10-80% B，经5分钟；流速0.6 mL/分钟，在214和254 nm下UV检测，ESI-MS) t_R=3.99分钟，(M1) 447.4。通过NMR证实产物。

将产物与Pd/C (10%，235 mg)和甲醇(25 mL)混合，并且在氩气下搅拌。随后真空除去氩气，开始供应氢气。搅拌下让反应混合物保持3小时，并且持续供应氢气。通过离心除去催化剂，蒸除溶剂。粗产物用制备型HPLC (Phenomenex Luna C18 (2) 5μm 250×21.2 mm，溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸；梯度2-80% B，经60分钟)纯化。LC-MS (Phenomenex Luna C18(2) 2.0×50 mm，3 μm，溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸；梯度10-80% B，经5分钟；流速0.6 mL/分钟，在214和254 nm下UV检测，ESI-MS) t_R=2.55分钟，(M1) 357.9。收率150 mg。通过NMR证实产物。

(d) 合成(4,7-双-叔丁氧基羰基甲基-[1,4,7]三氮杂环壬-1-基)-乙酸[NOTA(bis-tBu)]

将(4-叔丁氧基羰基甲基-[1,4,7]三氮杂环壬-1-基)-乙酸叔丁基酯(参见实施例17a(i)(d)；280 μmol，100 mg)和溴乙酸(Fluka，1mmol，138.21 mg)溶解于甲醇(1 mL)中。搅拌下加入溶解于水(1 mL)中的碳酸钾。将反应混合物在室温下搅拌过夜，真空浓缩。将残余物溶解于水(2.5 mL)中，用盐酸(1 M)将pH调节至4。粗产物通过制备型HPLC (Phenomenex Luna C18 (2) 5μm 250×21.2 mm，溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸；梯度10-80% B，经60分钟)纯化。LC-MS (Phenomenex Luna C18(2) 2.0×50 mm，3 μm，溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸；梯度10-80% B，经5分钟；流速0.6 mL/分钟，在214和254 nm下UV检测，ESI-MS) t_R=2.40分钟。收率117.7 mg。通过NMR证实产物。

NOTA(bis-tBu)通过制备型HPLC (梯度：20-40% B，经40分钟)纯化，得到72 mg纯的NOTA(bis-tBu)。纯化的物质通过LC-MS表征(梯度：10-40% B，经5分钟)：t_R：3.75分钟，实测值m/z：416.2，预期的MH⁺：416.3。

(ii) 制备NOTA(bis-tBu)-马来酰亚胺

将N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(23 mg，0.090 mmol)、NOTA(bis-tBu) (30 mg，0.072 mmol)和PyAOP (51 mg，0.10 mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF) (2 mL)中。加入Sym.-可力丁(29 μL，0.40 mmol)，将反应混合物振摇1小时。混合物用水/0.1%三氟乙酸(TFA) (6 mL)稀释，产物通过半制备型HPLC纯化。使用半制备型HPLC (梯度：20-50% B，经60分钟)纯化，得到33 mg (87%)纯的NOTA(bis-tBu)-马来酰亚胺。纯化的物质通过LC-MS表征(梯度：10-40% B，经5分钟)，t_R：4.09分钟，实测值m/z：538.2，预期的MH⁺：538.3。

(iii) 制备NOTA(双-酸)-马来酰亚胺

NOTA(bis-tBu)-马来酰亚胺(33 mg，61 μmol)用2.5%三异丙基硅烷(TIS)和2.5%水在TFA (10 mL)中的溶液处理4小时30分钟。真空蒸发TFA，将残余物溶解于水/0.1% TFA (8 mL)中，产物通过半制备型HPLC纯化。使用半制备型HPLC (梯度：0-20% B，经40分钟)纯化，得到15 mg (58%)纯的NOTA(双-酸)-马来酰亚胺。纯化的物质通过LC-MS表征(梯度：0-30% B，经5分钟)：t_R：1.34分钟，实测值m/z：426.0，预期的MH⁺：426.2。

(iv) 制备4

将重组Z02891-Cys (40 mg，5.7 μmol) (购自Affibody AB，Sweden)和NOTA(双-酸)-马来酰亚胺(6.1 mg，14 μmol)溶解于水(1.5 mL)中。通过加入乙酸铵，将溶液调节至pH 6，将混合物振摇1小时。反应混合物用水/0.1% TFA (6 mL)稀释，产物使用半制备型HPLC纯化。使用半制备型HPLC (梯度：20-30% B，经40分钟)纯化，得到38 mg (90%)纯的化合物4。纯化的4通过分析型LC-MS (梯度：10-40% B，经5分钟)分析：t_R：3.31分钟，实测值m/z：1864.5，预期的MH₄ ⁴⁺：1864.5。

实施例18

放射性合成[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₃-Z02891(SEQ ID No. 2)(5a)的时间过程研究

使用QMA柱纯化氟-18，并且用盐水洗脱，如W. J. McBride等人(Bioconj. Chem. 2010，21，1331)所描述。将¹⁸F-水(25 μL，12 MBq)的溶液与AlCl₃ (1.667 μg，12.5 nmol)/乙酸钠缓冲液(1.5 μL，pH 4.0，0.5 M)和溶解于乙酸钠缓冲液(25 μL，pH 4.0，0.5 M)中的化合物6 (380 μg，50 nmol)混合。

将混合物在100℃下加热，通过HPLC分析等分试样。分析数据在图29中给出。

实施例18a. 制备化合物6

(i) 制备NOTA(tris-tBu)

(a) 合成α-溴戊二酸5-苄基酯

向冷却至0?C的L-谷氨酸-5-苄基酯(Fluka，3.0 g，0.013 mol)和溴化钠(Fisher，4.6 g，0.044 mol)在含水氢溴酸(Fluka，1 M，22.5 mL)中的溶液中分批加入亚硝酸钠(Fluka，1.6 g，0.023 mol)。于0?C下搅拌2小时后，加入浓硫酸(Merck，1.2 mL)，接着加入乙醚(Eternell)。水相用乙醚萃取三次。合并的有机相用盐水洗涤四次，经硫酸钠干燥，减压蒸发。粗产物使用正相色谱法纯化(二氧化硅柱(40 g)，溶剂：A=己烷，B=乙酸乙酯，梯度：10-35% B，经20分钟，流速40mL/分钟，在214和254 nm下UV检测)，得到1.81 g纯的产物。收率46%。通过NMR证实结构。

(b) 合成α-溴戊二酸5-苄基酯1-叔丁基酯

(Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000 10, 2133-2135)

在5分钟内，向α-溴戊二酸-5-苄基酯(参见实施例18a(i)(a)；1.2 g，4.0 mmol)在氯仿(Merck，5 mL)中的溶液中逐滴加入2,2,2-三氯乙酰亚胺酸叔丁酯(tert-butyl 2,2,2-trichloroacetimidate) (Fluka，1.57 mL，8.52 mmol)在环己烷(Merck，5 mL)中的溶液。加入N,N-二甲基乙酰胺(Fluka，0.88 mL)，接着加入三氟化硼乙基醚合物(Aldrich，80 μL)作为催化剂。将反应混合物在室温下搅拌5天。加入己烷，有机相用盐水洗涤三次，经硫酸钠干燥，减压蒸发。粗产物使用正相色谱法(二氧化硅柱(40 g)，溶剂：A=己烷，B=乙酸乙酯，梯度：10-35% B，经15分钟，流速40mL/分钟，在214和254 nm下UV检测)纯化，得到1.13 g (79%)的纯产物。通过NMR证实结构。

(c) 合成2-[1,4,7]三氮杂环壬-1-基-戊二酸5-苄基酯1-叔丁基酯

在3小时时间内，将α-溴戊二酸-5-苄基酯1-叔丁基酯(参见实施例18a(i)(a)；513 mg，1.44 mmol)在氯仿(Merck，20 mL)中的溶液加入到1,4,7三氮杂环壬烷(Fluka，557 mg，4.31 mmol) 在氯仿(Merck，20 mL)中的溶液中。将混合物在室温下搅拌3天，真空浓缩至浅黄色油。使用正相色谱法纯化粗产物(二氧化硅柱(40 g)，溶剂：A=乙醇:氨(水溶液) 95:5，B= 氯仿:乙醇:氨(水溶液) 385:175:20，梯度：0% B经6分钟，100% B经12分钟，流速40mL/分钟，在214和254 nm下UV检测)，得到半纯的产物(289 mg)。收率49%。通过LC-MS证实产物(柱Phenomenex Luna C18(2) 2.0×50 mm，3 μm，溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸；梯度10-50% B，经5分钟；流速0.6 mL/分钟，在214和254 nm下UV检测，ESI-MS) t_R=2.5分钟，m/z (MH⁺)，406.3。

(d) 合成2-(4,7-双-叔丁氧基羰基甲基-[1,4,7]三氮杂环壬-1-基-戊二酸5-苄基酯1-叔丁基酯

将2-[1,4,7]三氮杂环壬-1-基-戊二酸5-苄基酯1-叔丁基酯(参见实施例18a(i)(b)；600 mg，1.48 mmol)/无水乙腈(40 mL)冷却至0度，随后在15分钟的时间内逐滴加入溴乙酸叔丁酯(Fluka，548 mg，414 μL，2.81 mmol)/无水乙腈(10 mL)。将反应混合物再搅拌15分钟，随后加入无水碳酸钾(Fluka，1.13 g，814 mmol)，在4小时内，让反应混合物缓慢温热至室温。混合物经硅藻土(Celite)过滤，蒸发至干，以得到粗产物。通过LC-MS证实产物(柱Phenomenex Luna C18(2) 2.0×50 mm，3 μm，溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸；梯度10-80% B，经5分钟；流速0.6 mL/分钟，在214和254 nm下UV检测，ESI-MS) t_R=3.9分钟，m/z (MH⁺)，634.4。

(e) 合成2-(4,7-双-叔丁氧基羰基甲基-[1,4,7]三氮杂环壬-1-基-戊二酸1-叔丁基酯[NOTA(tris-tBu)]

将2-(4,7-双-叔丁氧基羰基甲基-[1,4,7]三氮杂环壬-1-基-戊二酸5-苄基酯1-叔丁基酯(参见实施例18a(i)(c)；938 mg，1.48 mmol)溶解于2-丙醇(Arcus，115 mL)中，加入悬浮于水(3 mL)中的10% Pd/C (Koch-Light，315 mg)。混合物用氢气(4大气压)处理3小时，经硅藻土过滤，蒸发至干。将残余物在硅胶上层析分离(二氧化硅柱(4g)，溶剂：2-丙醇:氨95:5，流速40mL/分钟，在214和254 nm下UV检测)，得到半纯的产物(225 mg)。通过LCMS证实产物(Phenomenex Luna C18 (2)，2.0×50mm，3μm；溶剂：A=水/0.1%三氟乙酸，B=乙腈/0.1%三氟乙酸，梯度10-80% B，经5分钟，流速0.6 mL/分钟，在214和254 nm下UV检测，ESI-MS) t_R 2.4分钟，MH⁺ 544.5。

纯化的NOTA(tris-tBu)通过LC-MS表征(梯度：10-80% B，经5分钟)：t_R：2.4分钟，实测值m/z：544.5，预期的MH⁺：544.4。

(ii) 制备NOTA(tris-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH₂

将溶解于NMP (1 mL)中的PyAOP (96 mg，0.18 mmol)加入到NOTA(tris-tBu) (100 mg，0.18 mmol)和乙二胺(1.2 mL，18 mmol)在NMP (1 mL)中的溶液中。将反应混合物振摇1小时，随后加入PyAOP的第二等分试样(38 mg，0.073 mmol)。继续振摇30分钟。加入20% ACN/水(5 mL)，产物通过半制备型HPLC纯化。使用半制备型HPLC (梯度：20-50% B，经40分钟)纯化，得到123 mg (98%)纯的NOTA(tris-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH₂。纯化的物质通过LC-MS表征(梯度：20-50% B，经5分钟)：t_R：1.95分钟，实测值m/z：586.4，预期的MH⁺：586.4。

(iii) NOTA(tris-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH-马来酰亚胺

将NOTA(tris-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH₂ (123 mg，0.176 mmol)、3-马来酰亚胺基-丙酸NHS酯(70 mg，0.26 mmol)和sym.-可力丁(346 μL，2.60 mmol)溶解于NMP (2 mL)中。将反应混合物搅拌6小时。加入水(6 mL)，产物通过半制备型HPLC纯化。使用半制备型HPLC (梯度：20-50% B，经40分钟)纯化，得到115 mg (87%)纯的NOTA(tris-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH-马来酰亚胺。纯化的物质通过LC-MS表征(梯度：10-60% B，经5分钟)：t_R：3.36分钟，实测值m/z：737.4，预期的MH⁺：737.4。

(iv) 制备NOTA(三-酸)-NH-CH₂CH₂-NH-马来酰亚胺

NOTA(tris-tBu)-NH-CH₂CH₂-NH-马来酰亚胺(115 mg，0.150 mmol)用2.5% TIS和2.5%水在TFA (10 mL)中的溶液处理4小时。真空蒸发溶剂，将残余物再溶解于水(8 mL)中，产物通过半制备型HPLC纯化。使用半制备型HPLC (梯度：0-20% B，经40分钟)纯化，得到80 mg (90%)纯的NOTA(三-酸)-NH-CH₂CH₂-NH-马来酰亚胺。纯化的物质通过LC-MS表征(梯度：0-30% B，经5分钟)：t_R：2.74分钟，实测值m/z：569.5，预期的MH⁺：569.2。

(v) 制备化合物6

(a) 制备合成的Z02891-Cys

由0.05 mmol NovaPEG Rink Amide树脂起始，使用Fmoc化学，在CEM Liberty微波肽合成仪上装配序列：

。

在每一个偶联步骤(5分钟，75℃)施用0.5 mmol氨基酸，使用0.45 mmol HBTU/0.45 mmol HOAt/1.0 mmol DIPEA用于原位激活。通过5%哌嗪/DMF除去Fmoc。施用两个Arg的双偶联。将Asp-Ser和Leu-Ser假脯氨酸二肽(0.5 mmol)掺入序列中。

在含有2.5% TIS、2.5% EDT、2.5% EMS和2.5%水的TFA (40 mL)中，进行同时除去侧链保护基团和由树脂裂解肽1小时。通过过滤除去树脂，用TFA洗涤，将合并的滤液真空蒸发。将乙醚加入到残余物中，形成的沉淀物用乙醚洗涤，干燥。再次重复裂解程序。将干燥的沉淀物溶解于20% ACN/水中，保持过夜，以除去剩余的Trp保护基团。将溶液冻干，得到148 mg (42%)粗Z02891-Cys。148 mg粗Z02891-Cys通过半制备型HPLC纯化(4次运行，梯度：25-30% B，经40分钟)，得到33 mg (9%)纯的Z02891-Cys。纯化的物质通过LC-MS表征(梯度：10-40% B，经5分钟)：t_R：3.40分钟，实测值m/z：1758.3，预期的MH₄ ⁴⁺：1758.4。

将合成的Z02891-Cys (13.7 mg，1.95 μmol)和NOTA(三-酸)-NH-CH₂CH₂-NH-马来酰亚胺(11 mg，19.3 μmol)溶解于水(1 mL)中。通过加入乙酸铵将溶液调节至pH 6，并且将混合物振摇3小时。反应混合物用水/0.1% TFA (6.5 mL)稀释，产物使用半制备型HPLC纯化。使用半制备型HPLC纯化(梯度：15-35% B，经40分钟)，得到8.4 mg (57%)纯的6。通过分析型LC-MS分析化合物6(梯度：10-40% B，经5分钟)：t_R：3.31分钟，实测值m/z：1900.7，预期的MH₄ ⁴⁺：1900.2。

实施例19. AlCl₃/肽比率对[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₂-Z02891(SEQ ID No. 2)(5)的放射化学收率的影响

在锥形聚丙烯离心小瓶(1.5 mL)中，将4 (149 μg，20 nmol)在乙酸钠缓冲液(10 μL，pH 4.0，0.5 M)中的三种溶液与AlCl₃ (分别为0.33 μg，2.49 nmol；0.66 μg，4.98 nmol；和1.33 μg，9.96 nmol)在乙酸钠缓冲液(1 μL，pH 4.0，0.5 M)中的溶液混合。向这些小瓶中加入小体积的[¹⁸F]氟化物(10 μL)。将小瓶在100℃下加热15分钟，随后通过HPLC分析。掺入收率在表12中给出。

表12. AlCl₃/肽比率对[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₂-Z02891(SEQ ID No. 2)(5)的分析RCY的影响。

实验	AlCl₃/肽	产物(5)	前锋
				1	1/8	23%	2%
2	1/4	29%	2%
				3	1/2	28%	3%

实施例20. 试剂稀释对[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₂-Z02891(SEQ ID No. 2)(5)的放射化学收率的影响

在锥形聚丙烯离心小瓶(1.5 mL)中，将4 (373 μg，50 nmol)在乙酸钠缓冲液(25 μL，pH 4.0，0.5 M)中的溶液与AlCl₃ (1.66 μg，12.5 nmol)在乙酸钠缓冲液(1.5 μL，pH 4.0，0.5 M)中的溶液混合。加入小体积的[¹⁸F]氟化物(10 μL，80 MBq)。用乙酸钠缓冲液(1.5 μL，pH 4.0，0.5 M)制备该混合物的两个系列稀释液(50%和25% v/v)。随后将三个小瓶在100℃下加热15分钟，随后通过HPLC分析。数据示于表13。

表13. 试剂浓度对[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₂-Z02891(SEQ ID No. 2)(5)的分析RCY的影响。试剂的比率保持恒定。

实验	肽浓度(μg/μL)	产物(5)	前锋
				1	7	30%	5%
2	3.5	16%	3%
				3	1.75	8%	1%

实施例21. 肽/AlCl₃浓度对[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₂-Z02891(SEQ ID No. 2)(5)的放射化学收率的影响

将含有[¹⁸F]氟化物(25 μL，23-25 MBq)、AlCl₃ (?当量的肽4/1.5 μL乙酸钠缓冲液(pH 4.0，0.5 M)和4 (50，100，150 nmol)/乙酸钠缓冲液(25 μL，pH 4.0，0.5 M)的三个小瓶在100℃下加热30分钟。图30显示在15和30分钟后的掺入数据。

实施例22. 微波加热对[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₂-Z02891(SEQ ID No. 2)(5)的放射化学收率的影响

使用微波装置(Resonance Instruments型号521，设定温度80℃，50 W)，将含有[¹⁸F]氟化物(25 μL，29 MBq)、AlCl₃ (1.66 μg，12.5 nmol)/1.5 μL乙酸钠缓冲液(pH 4.0，0.5 M)，和4 (373 μg，50 nmol)/乙酸钠缓冲液(25 μL，pH 4.0，0.5 M)的Wheaton小瓶(3 mL)加热5、10和15秒。表14给出在这些时间点后HPLC分析的概述。

表14. 使用微波加热制备[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₂-Z02891(SEQ ID No. 2)(5)的分析RCY。

时间(秒)	产物(5)	前锋
			5	17%	-
10	21%	-
			15	35%	1%

实施例23. 制备[¹⁸F]AlF-NOTA(COOH)₃-Z02891(SEQ ID No. 2)(5a)

将含有[¹⁸F]氟化物(25 μL，29 MBq)、AlCl₃ (1.66 μg，12.5 nmol)/1.5 μL乙酸钠缓冲液(pH 4.0，0.5 M)和6 (380 μg，50 nmol)/乙酸钠缓冲液(25 μL，pH 4.0，0.5 M)的PP离心小瓶(1.5 mL)在100℃下加热15分钟。5a的分析RCY为15-20%。图31显示反应混合物的HPLC概况。

实施例24. 制备[¹⁸F]SiFA-Z02891(SEQ ID No. 2)(7)

在聚丙烯离心小瓶(1.5 mL)中，将肽前体8 (750 μg，100 nmol)在乙酸钠缓冲液(50 μL，pH 4.0，0.5 M)中的溶液加入到[¹⁸F]氟化物在水(50 μL)中的溶液中，并且在95℃下加热15分钟。加入盐水(100 μL，0.9% w/v)后，混合物使用盐水调节的NAP5柱(GE Healthcare)纯化。得到产物7，具有18%非衰变校正放射化学收率和87%放射化学纯度(26分钟后)。图32显示最终产物的HPLC分析。

实施例24a. 制备化合物8

(i) 合成SiFa

在氩气下，将正丁基锂/己烷(2.5 M，3.2 mL，7.9 mmol)逐滴加入到2-(4-溴苯基)-1,3-二氧杂环戊烷(1.8 g，7.9 mmol)在无水四氢呋喃(THF) (6 mL)中的冷却(-78℃)溶液中。在-78℃下搅拌2小时后，将所得到的黄色悬浮液收集在注射器中，并且在20分钟的时间内逐滴加入到二叔丁基二氟硅烷(1.5 mL，8.33 mmol)在THF (15 mL)中的冷却溶液(-70℃)中。将反应混合物在-70℃下搅拌1小时，随后让其温热至环境温度。在2小时30分钟后，从反应混合物中取出样品(3 mL)，并且用水/0.1% TFA淬灭，导致除去二氧杂环戊烷保护基团。通过制备型HPLC纯化脱保护的产物。使用制备型HPLC纯化(梯度：40-95% B，经60分钟)，得到纯的SiFA。纯化的物质通过LC-MS表征(梯度：50-95% B，经5分钟)：t_R：2.05分钟，实测值m/z：未检测，预期的MH⁺：267.2。

(ii) 制备SiFA-氨基氧基乙酰基-马来酰亚胺

将Eei-氨基氧基乙酰基-马来酰亚胺(20 mg，71 μmol)加入到水/ACN/0.1% TFA (来自HPLC制备级分)中的SiFA。加入1M HCl (1 mL)，将反应混合物搅拌过夜。产物通过半制备型HPLC纯化。使用半制备型HPLC纯化(梯度：40-80% B，经40分钟)，得到15 mg (45%)纯的SiFA-氨基氧基乙酰基-马来酰亚胺。纯化的物质通过LC-MS表征(梯度：40-70% B，经5分钟)：t_R：3.00分钟，实测值m/z：462.1，预期的MH⁺：462.2。

(iii) 制备化合物8

将重组Z02891-Cys Affibody (24 mg，3.4 μmol)和SiFA-氨基氧基乙酰基-马来酰亚胺(4.7 mg，10 μmol)溶解于50% ACN/水(1 mL)中。通过加入乙酸铵将溶液调节至pH 6，将混合物振摇1小时。反应混合物用10% ACN/水/0.1% TFA (8 mL)稀释，使用半制备型HPLC纯化产物。使用半制备型HPLC纯化(梯度：20-40% B，经40分钟)，得到26 mg (100%)纯的Z02891-Cys-马来酰亚胺-氨基氧基乙酰基-SiFA (8)。纯化的Z02891-Cys-马来酰亚胺-氨基氧基乙酰基-SiFA (8)通过分析LC-MS分析(梯度：10-40% B，经5分钟)：t_R：3.87分钟，实测值m/z：1873.6，预期的MH₄ ⁴⁺：1873.5。

实施例25. 肿瘤模型确认

确认A431和NCI-N87异种移植模型的肿瘤生长和HER2表达。动物模型建立包括在右侧皮下接种2×10⁶ NCI-N87或10⁷ A431细胞/动物(在100μl的50%PBS/50%基质胶中)，接着是30天的接种时间。使用FDA-确认的HercepTest (Dako，K5204)，通过免疫组织化学评价在这些肿瘤中的HER2表达。

图33描述用推荐的强度量表(0 → +3)，NCI-N87肿瘤强染色(+3)，而A431细胞显示显著较弱的染色强度(+1)。这些数据表明肿瘤模型具有显著不同的HER2表达，因此适用于比较HER2靶向的Affibody分子的摄取。基于IHC分数的足够的分离，认为不需要进一步定量评定。

实施例26. 在正常小鼠中化合物2、5和7的生物分布

使用幼稚CD1小鼠评价盐水配制的示踪剂化合物2、5和7。在静脉内注射3 MBq的活性(对于2分钟时间点，2.5 MBq)后，在注射后2、90、120和180分钟时，处死动物，评价在关键器官中放射性的保留。在生物分布测量中，5显示显著的肾保留(70.3% ID，在p.i.90分钟)，而对于2或7 (分别为4.8% ID和10% ID，在p.i.90分钟)未观察到显著的肾保留。观察到7的脱氟化(骨摄取5.3% ID/g，在p.i.90分钟)。图34比较生物分布数据与相应的[¹¹¹In]DOTA-Z02891(SEQ ID No. 2)(9)化合物:

。

实施例27. 化合物2、5和7的肿瘤摄取

在具有表达高和低HER2水平的肿瘤细胞(分别为NC87和A431)的肿瘤小鼠模型中，如所预期的，观察到化合物2、5和7差异摄取。图35、表15和16比较生物分布数据与相应的[¹¹¹In]DOTA-Z02891(SEQ ID No. 2)(9)化合物。

表15. 来自化合物9、2、5和7的NCI-N87异种移植生物分布的关键比率

表15. 化合物9、2、5和7的A431异种移植生物分布的关键比率

实施例28. 在双肿瘤异种移植模型中2的成像

通过在两侧的每一侧中植入A431和NCI-N87，产生双肿瘤异种移植小鼠。这些小鼠用于评价2的生物分布，使得能够对表达低和高HER2 (二者)的肿瘤中的摄取进行相同动物的评价。时间点包括p.i.30和60。

图36显示，2的性能与在单一肿瘤动物研究中观察到的可比，在A431和NCI-N87肿瘤之间在结合剂摄取方面具有良好的分离，从早至p.i.30分钟开始。关于背景组织清除(参见表7的关键组织比率)，在p.i.60分钟血液水平已显著下降，提供NCI-N87肿瘤:血液比为4.52，而在30分钟，部分血液清除给出2.39比率，伴随阳性肿瘤:肝比率为1.39。这些性质表明2的药代动力学足以在合适的成像窗口内使人受试者成像。

表17. 来自2的双肿瘤异种移植生物分布的关键比率

实施例29. 在具有NCI-N87肿瘤的小鼠中，化合物2的加回研究

为了在NCI-N87肿瘤模型中实施加回研究(add-back studies)，以评价过量的冷配体在结合剂功效中的影响，在p.i.90分钟时评价以下四种不同的制备物：

1. 标准化合物2制备物

2. 标准制备物加上100μg/kg/小鼠冷前体

3. 标准制备物加上500μg/kg/小鼠冷前体

4. 标准制备物加上1000μg/kg/小鼠冷前体

在标准制备物中冷前体的浓度为120μg/kg/小鼠，因此该研究检查在10倍所用的初始浓度(在小鼠中)下冷前体的影响。图37显示对肿瘤摄取的影响不显著，并且也不显著影响从其它组织的清除。

实施例30. 在双侧具有A431/NCI-N87肿瘤的小鼠中，化合物2体内成像研究

在实施例28中描述的双-肿瘤小鼠模型用于实施初步成像研究。对每只动物i.v.注射10 MBq的2，在p.i.120分钟时开始使小鼠成像30分钟。在图38中的图像显示通过肾和膀胱清除，如先前通过生物分布研究证明的。横向成像显示在2肿瘤中的摄取，其中NCI-N87肿瘤显示比A431肿瘤显著较高的信号强度，与在实施例28中的双肿瘤生物分布研究一致。

当前的2成像研究与Affibody? 9成像研究(图38)的比较显示在表达高和低HER2的肿瘤之间摄取的类似差异。然而，由于在生物分布中也看到最少的肾保留，2具有来自肾的显著改进的背景。

以上讨论和/或引用的所有专利、杂志文章、出版物和其它文件通过引用结合到本文中。

Claims

1. 成像剂组合物，所述组合物包含分离的多肽，所述多肽包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体，经由同位素氟交换化学与¹⁸F缀合，其中所述分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

2. 制备权利要求1的成像剂组合物的方法，所述方法包括：(i) 提供包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与含有氟化硅的部分反应，以形成氟化硅缀合的多肽；和(iii) 使氟化硅缀合的多肽与¹⁸F部分或¹⁸F的来源反应，以形成¹⁸F-氟化硅缀合的多肽。

3. 制备权利要求1的成像剂组合物的方法，所述方法包括：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ.ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与接头反应，其中所述接头包含SiFA基团，以形成SiFA缀合的多肽；和(iii) 使SiFA缀合的多肽与¹⁸F部分或¹⁸F的来源反应。

4. 一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1的成像剂组合物和药学上可接受的载体。