CN110831634A - 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3肽试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑3特异性肽试剂、使用所述肽试剂检测肝细胞癌细胞的方法，以及使用所述肽试剂靶向肝细胞癌细胞的方法。

Description

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3肽试剂和方法
本申请要求2017年3月8日提交的美国临时专利申请第62/468,626号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
通过引用并入电子递交的材料
通过引用整体并入的是与本文同时提交并且如下标识的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：在2018年3月6日创建的名为“50687_SeqListing.txt”的1,717字节ASCII(文本)文件。
技术领域
本发明涉及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3特异性肽试剂、使用肽试剂检测肝细胞癌细胞的方法，以及使用肽试剂靶向肝细胞癌细胞的方法。
背景技术
肝细胞癌(HCC)是全球约80万人死亡的原因，代表全球癌症死亡的第二大常见原因。HCC是肝脏的原发性癌症，且主要发生在患有潜在的慢性肝病的患者中，例如肝炎和肝硬化[Cicalese等人，《肝细胞癌(Hepatocellular Cacinoma)》，Medscape(2014年5月20日更新)]。HCC的病理生理学未知且预后较差，具有小于25％的5年生存率。肥胖流行导致越来越多的可以进展为纤维化、肝硬化和最终HCC的非酒精性脂肪肝病患者群体[Cicalese等人，同前文献；Maluccio及Covey，《临床医生的癌症杂志(Cancer J.Clin.)》，62(6):394-399(2012)]。肝切除术是患有可切除(非扩散性)HCC的患者的黄金标准。目前，外科医生利用白光进行边缘大于1cm的HCC切除，以粗略地可视化经切割的肝脏表面。然而，大多数HCC患者存在患病的肝实质，因此保留肝实质对于维持尽可能多的功能性肝组织至关重要。需要更准确的检测肿瘤边缘的方法来降低复发率而不牺牲活组织。化疗目前作为HCC的新辅助疗法提供，但大多数化学治疗剂并不区分恶性细胞和正常细胞，因此会导致严重的不良反应和全身毒性。预期这些药物通过增强的渗透性和滞留(EPR)效应通过渗漏的脉管系统被动地积聚在HCC中。然而，仅10％至20％的患者具有可切除的肝脏，并且其中切除后的复发率在2年后为50％，在5年后为近75％(Maluccio及Covey，同前文献)。
索拉非尼(Nexavar)是一种抑制RAF/MEK/ERK途径和酪氨酸激酶的小分子，并且被FDA批准用于治疗HCC[Wilhelm等人，《癌症研究(Cancer Res)》，64:7099-7109(2004)]。这种药物是不适合手术的晚期HCC患者的标准治疗方法。然而，在临床研究(SHARP)中，索拉非尼仅显示出相对于安慰剂的最小(～3个月)生存优势[Llovet等人，《英格兰医学期刊(NEngl J Med)》，359：378-390(2008)]，并且与白种人患者相比，索拉非尼可能在亚洲人患者中效果更低，发现其中存活时间显著缩短(6.5个月对比7.9个月)[Cheng等人，《肿瘤学(Lancet Oncol)》，10:25-34(2009)]。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(本文中有时缩写为GPC3)是硫酸乙酰肝素膜结合的蛋白多糖，其在正常成人肝脏、肝硬化或良性病变中不存在，但发现锚定在肿瘤肝细胞中的细胞表面。其在高达80％的HCC中过表达。[Capurro等人，《胃肠病学(Gastroenterology)》，125(1):89-97(2003)；Nakatsura等人，《生物化学生我物理研究(Biochem Biophys ResCommun)》，306:16-25(2003)；Shafizadeh等人，《现代病理学(Mod Pathol.)》，21(8):1011-1018(2008)]。GPC3通过刺激Wnt信号传导促进HCC生长并具有反映肿瘤分期的表达水平[Zhu等人，Gut，48：558-564(2001)]。许多免疫化学研究已发现HCC中GPC3的强阳性染色以及低级别和高级别发育不良时的最少染色[Shirakawa等人，《国际肿瘤杂志(Int JOncol)》，34:649-656(2009)；Yamauchi等人，《现代病理学》，18:1591-1598(2005)；Wang等人，《人类病理学(Hum Pathol)》，37:1435-1441(2006)]。已发现GPC3对HCC的敏感性和特异性明显高于α-胎蛋白(AFP)，后者是广泛用于HCC监测的血清生物标记物[Xu等人，《癌症研究临床肿瘤学杂志(J.Cancer Res.Clin Oncol)》，139:1417-1424(2013)]。
用于检测和治疗HCC的新产品和方法是本领域中需要的。新产品和方法对于提高HCC的存活率和降低医疗保健成本具有重要的临床应用。
发明内容
在一个方面，本公开提供一种试剂，其包括肽ALLANHEELFQT(SEQ ID NO:1)、ALLANHEELF(SEQ ID NO:2)、GLHTSATNLYLH(SEQ ID NO:3)、SGVYKVAYDWQH(SEQ ID NO:4)或VGVESCASRCNN(SEQ ID NO:5)，或所述肽的多聚体形式，其中所述试剂特异性地结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3。在一些实施例中，多聚体形式是二聚体。在一些实施例中，肽试剂基本上由肽或肽的多聚体形式组成。
在一些实施例中，所述试剂包括至少一个与肽或所述肽的多聚体形式连接的可检测标记。在一些实施例中，可检测标记可以通过显微镜、光声、超声或磁共振成像来检测。在一些实施例中，通过显微镜可检测的标记是异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy5、Cy5.5或IRdye800。在一些实施例中，可检测标记通过肽连接子连接到肽。在一些实施例中，连接子的末端氨基酸是赖氨酸。在一些实施例中，连接子包括SEQ ID NO:7中所示的序列GGGSK。
在一些实施例中，所述试剂包括至少一个与肽或所述肽的多聚体形式连接的治疗部分。在一些实施例中，治疗部分是化学治疗剂。在一些实施例中，治疗部分是胶束，例如包封化学治疗剂(例如索拉非尼)的聚合物胶束。
在一些实施例中，所述试剂包括至少一个与肽或所述肽的多聚体形式连接的可检测标记和至少一个与肽或所述肽的多聚体形式连接的治疗部分。
在另一方面，本公开提供了一种组合物，其包括本发明的试剂和医药学上可接受的赋形剂。
在又一方面，本公开提供用于检测患者中的HCC的方法，其包括以下步骤：将本发明的试剂给予患者的肝脏以及检测所述试剂与癌细胞的结合。
在又另一方面，本公开提供用于检测患者中的HCC的方法，其包括以下步骤：将本发明的试剂给予患者以及检测试剂结合。在另一方面，本公开提供一种确定患者中肝癌和/或癌症转移或癌症复发的治疗有效性的方法，其包括以下步骤：将本发明的试剂给予患者，使用所述试剂标记的第一量细胞可视化，以及将所述第一量与先前可视化的用所述试剂标记的第二量细胞进行比较，其中第一量标记细胞相对于先前可视化的第二量标记细胞的减少指示有效治疗。在一些实施例中，所述方法还包括获得由试剂标记的细胞的活检体。
在又一方面，本公开提供一种用于将治疗部分递送到患者的HCC细胞的方法，其包括将本发明的试剂给予患者的步骤。
在另一方面，本公开提供一种用于将本发明的组合物给予有需要的患者的试剂盒，其包括所述组合物、所述组合物的使用说明书和将所述组合物给予患者的装置。
在另一方面，本公开提供一种肽，其由氨基酸序列ALLANHEELFQT(SEQ ID NO:1)、ALLANHEELF(SEQ ID NO:2)、GLHTSATNLYLH(SEQ ID NO:3)、SGVYKVAYDWQH(SEQ ID NO:4)或VGVESCASRCNN(SEQ ID NO:5)组成。
附图说明
图1-1A-C显示与非肿瘤相比，GPC3的基因表达在HCC中升高。A)使用标准P值<1×10-40，平均倍数变化>2和细胞表面上的位置对来自数据集GSE14520和GSE44074的基因表达谱进行分类，以识别用于HCC的有希望的靶标。GPC3的结果显示P值＝1×10-70和2×10-5，平均倍数变化分别为29.261和2.558。B)通过GSE14520的配对t-检验，发现来自n＝213个样本对的HBV相关HCC与非肿瘤样本之间的GPC3基因表达的显著差异，P值<0.001。在昂飞(Affymetrix)HT_U133A阵列平台上使用22,268个探针组分析数据。C)GSE14520的ROC曲线显示0.92的曲线下面积(AUC)，其中敏感性为89％且特异性为92％。
图1-2A-C显示与非肿瘤相比，GPC3的基因表达在HCC中升高。A)来自数据集GSE14520的基因表达谱。我们在对数转换数据上使用配对T检验，并获得具有P值<1×10-40的1397个探针组，其中111个具有GO项，从而表明它们出现在质膜中，且在肿瘤中增加。其中，GPC3给出P值＝1.1×10-70(第5个最佳)，且平均倍数变化为29.261(肿瘤中最高)。然后，我们分析了在GEO系列GSE44074中测量的点阵列的8516个转录物的对数转换数据，所述系列由34个HCC样品和71个正常肝脏样品组成。双样本T检验得到具有P<.001的549个基因，其中49个在肿瘤中和质膜上增加。在这些GPC3中，给出了最大的倍数变化和最小的p值(增加4.5倍，P＝3.5×10-15)。B)通过GSE14520的配对t检验，发现来自n＝213个样本对的HCC与非肿瘤样本之间的GPC3基因表达的显著差异，P值<0.001。在昂飞HT_U133A阵列平台上使用22,268个探针组分析数据。通过GSE44074的2-样品t检验，绘制正常和HCC肝脏样品的表达水平，P值<0.001。C)GSE14520的ROC曲线显示AUC为0.92，其中敏感性为87％且特异性为90％。
图2A-C显示在免疫组织化学上对HBV相关HCC中之GPC3过表达的验证。A)在HBV衍生的HCC的代表性样本中，在肿瘤中观察到具有抗GPC3抗体的强染色(箭头)，但在肝硬化的邻近区域中未观察到。B)来自连续切片的组织学(H&E)证实肝硬化背景中的HCC(箭头)。C)在代表性非肿瘤样本(对照)中发现阴性染色。
图3A-B显示本文所述肽试剂的化学结构。A)发现ALLANHEELFQT肽对具有GGGSK裂解子和Cy5.5荧光团，之后为ALL*-Cy5.5的GPC3具有高度特异性。B)乱序对照肽QLELTFHANLEA，之后为QLE*-Cy5.5。
图4A-B显示了经标记靶标和乱序对照肽的3D结构。在A)对GPC3具有特异性的前导候选肽ALL*与B)乱序对照肽QLE*之间观察到结构差异。在每个12聚体肽的C-末端标记近红外荧光团Cy5.5染料，并用箭头标记磺化的苯并稠合的假吲哚环。序列开始的肽的N-末端用箭头起始处表示。两种探针的整体形状和局部化学环境都不同。用UCSF嵌合封包(v.1.10.2，加利福利亚大学旧金山分校)进行肽的分子图形和分析。
图5A-B显示Cy5.5标记的GPC3肽的吸光度和荧光。A)Cy5.5标记的肽的吸光度光谱在λex＝677nm处显示峰。B)对于两种肽，在λem＝708nm处观察到最大荧光发射。
图6-1A-H显示siRNA敲低(knockdown)后对特异性肽与GPC3结合的验证。A)前导候选物GPC3肽和B)抗GPC3抗体强烈地结合Hep3B细胞(siCL)的表面(箭头)。C，F)对照肽显示最小的结合。荧光强度在具有D)肽和E)抗体在GPC3敲低细胞(siGPC3)中显著降低。G)定量荧光强度。通过配对t检验，*P＝4.1×10-6(肽)和*P＝1.2×10-4(抗体)。H)Hep3B细胞的蛋白质印迹。
图6-2A-Q显示了特异性肽与细胞活体外结合的验证。在共聚焦显微镜中，我们观察到来自ALL*-Cy5.5与A)Hep3B和B)HepG2人类HCC细胞的表面(箭头)结合的强荧光强度，以及在C)SK-Hep1细胞下的最小信号。D-F)对于所有细胞，在乱序对照肽QLE*-Cy5.5下观察到最小信号。另外在AF488标记的抗GPC3抗体用作G)Hep3B和H)HepG2的阳性对照下也观察到强结合(箭头)，以及在I)SK-Hep1下的最小信号。J)针对ALL*，Hep3B与SK-Hep1的强度差异显著大于针对QLE*的同一差异(P＝3.8×10-10，大8.2倍)，且HepG2与SK-Hep1的差异也显著更大(P＝4.6×10-5，大3.3倍)。针对抗体，Hep3B与SK-Hep1的差异也大于QLE(P＝2.3×10-8，大6.0倍)。在每个条件重复6次的情况下测量强度，并拟合到ANOVA模型，其中9个平均项表示对数转换数据。K)蛋白质印迹显示细胞质(C)和质膜(M)中HCC细胞的GPC3表达水平。我们使用siRNA敲低进一步验证了特异性肽与GPC3的结合。L)蛋白质印迹显示用靶向siRNA的siGPC3和非靶向siRNA的siCL(对照)转染的Hep3B细胞中的GPC3表达水平。与O、P)siGPC3敲低细胞(分别为14.7±1.5和8.8±2.7)相比，M)ALL*-Cy5.5(54.3±6.0)和N)AF488标记的抗GPC3(37.7±7.5)与siCL处理的Hep3B对照细胞的表面(箭头)结合显著更强。Q)定量荧光强度。通过对对数转换数据进行ANOVA，针对ALL，siCL与siGPC3的差异比QLE的同一差异大7.4倍(P＝7.8×10-5)，且针对抗体的差异比QLE(P＝2.5×10-5)大8.9倍。结果是独立收集的6个图像的平均值。
图7显示了竞争时对特异性肽结合的验证。荧光强度(平均值±SD)显示在添加50μM和更高浓度的未标记ALL*的情况下，ALL*-Cy5.5与Hep3B细胞的结合显著降低。在每个结果上方显示了具有11个平均项的ANOVA模型的P值。添加未标记QLE*(乱序对照)肽显示无变化。每个结果是6次独立测量的平均值。
图8A-B显示GPC3肽结合特性。A)发现ALL*-Cy5.5与Hep3B细胞的结合亲和力(表观解离常数)为kd＝71nM，R2＝0.97。B)发现ALL*-Cy5.5与Hep3B细胞的结合动力学(表观缔合时间常数)为k＝0.11-1(起始9.1分钟)。两个结果都代表3次独立测量。
图9A-H显示在活体内携带HCC异种移植肿瘤的小鼠中经NIR染料标记肽的药物动力学。A)在注射前和注射后0.5到24小时的时间过程中拍摄代表性的全身图像。在静脉内注射ALL*-Cy5.5后2小时观察到GPC3阳性肿瘤(来自Hep3B细胞，箭头起始处)的峰值摄取。B)将相同剂量的乱序肽QLE*-Cy5.5注射到携带GPC3阳性肿瘤的小鼠(箭头起始处)中。C)将ALL*-Cy5.5注射到携带GPC3阴性肿瘤(来自SK-Hep1细胞，箭头)的小鼠中。D)单独注射未标记Cy5.5染料的具有GPC3阳性肿瘤(箭头起始处)的小鼠的全身时间过程图像。E，F)当在GPC3阳性肿瘤(箭头起始处)中注射ALL*-Cy5.5之前分别注射三倍和十倍剂量的标记肽时，未标记的ALL*肽以剂量依赖性方式减少来自肿瘤的信号。G)对数转换数据的定量分析显示在注射后2小时处，来自ALL*-Cy5.5的平均信号显著高于乱序对照肽、在不存在靶表达且仅游离染料情况下的靶向肽的平均信号(分别地P＝4.3×10-9、1.7×10-10和5.6×10-14)。来自游离Cy5.5染料的信号峰值在注射后0.5小时处，且明显比标记肽高(对于ALL、QLE和GPC3-ve，分别地P＝2.7×10-6、1.2×10-5和4.7×10-4)。H)在2小时处ALL*-Cy5.5的平均值±SD靶-背景(T/B)比为3.91±0.58，而对于QLE*-Cy5.5为1.12±0.19，P＝3.8×10-18。用3倍和10倍未标记靶向肽剂量阻断使T/B比率分别降低1.65和3.56倍，P＝1.3×10-7和2.5×10-18。
图10A-B显示GPC3肽的生物分布。A)在携带GPC3阳性肿瘤小鼠中静脉内注射ALL*-Cy5.5、乱序肽QLE*-Cy5.5、游离Cy5.5染料和PBS之后2小时，切除器官的代表性荧光图像。另外，还将ALL*-Cy5.5注射到携带GPC3阴性肿瘤的小鼠中作为对照(第3列)。B)定量每个器官中的荧光信号。通过对每个组织进行ANOVA，在ALL*-Cy5.5注射小鼠中，肿瘤信号显著高于乱序对照探针、针对GPC3阴性肿瘤或游离Cy5.5染料的靶向探针(分别地P＝2.6×10-4、5.5×10-4和7.4×10-5，n＝5)。
图11-1A-L显示HCC异种移植肿瘤的活体内腹腔镜图像。显示在携带Hep3B异种移植物的小鼠中，在静脉内注射GPC3靶向肽(QRH*-Cy5.5)后2小时，用NIR腹腔镜收集代表性的A)荧光B)反射图像。C)通过逐像素地获取相应荧光与反射图像之间的比率来生成整流成像距离的热图数字图像。D)通过大津方法(Otsu's method)对比率图像进行自动成像处理来分割所关注区域。E-H)在不同肿瘤中用乱序肽*-Cy5.5收集相同组的图像。I)注射靶向肽ALL*-Cy5.5和J)乱序肽*-Cy5.5的小鼠的白光图像。K)用抗GPC3抗体对切除的HCC肿瘤异种移植物的免疫组织化学染色。L)对于ALL*-Cy5.5，以40×放大率显示切除的肿瘤切片的代表性共聚焦荧光显微镜检查。注意ALL*-Cy5.5对Hep3B人类HCC细胞表面(箭头起始处)的强烈染色。
图11-2A-L显示了HCC异种移植肿瘤的活体内腹腔镜图像。A)注射ALL*-Cy5.5和D)QLE*-Cy5.5的小鼠的代表性白光图像。B)静脉内注射ALL*-Cy5.5后2小时用NIR腹腔镜收集荧光C)反射图像。G)热图通过获取共同对准荧光与反射图像之间的比率来校正成像距离。H)通过使用比率图像进行成像处理算法来分割所关注区域。I)ALL*-Cy5.5注射后2小时，新鲜切除的HCC肿瘤异种移植物的免疫荧光图像。E-F，J-K)在不同肿瘤中用乱序肽QLE*-Cy5.5收集相同组的图像。L)通过在每组n＝8只小鼠中进行双样本t检验，ALL*-Cy5.5(8.3±1.3)的靶-背景比显著高于(关于对数转换数据P＝3.8×10-8，2.8倍大)QLE*-Cy5.5的靶-背景比(3.0±0.7)。
图12A-H显示HCC异种移植肿瘤的活体内光学成像。A)手持式双轴共焦内窥显微镜用于收集具有亚细胞分辨率的实时活体内图像。B)将仪器的远端尖端与携带活肿瘤小鼠中的病灶接触(插入)。分别在C)水平(1000×1000μm2)和D)垂直(1000×430μm2)平面中收集的光学切片上的肿瘤中观察到ALL*-Cy5.5的强吸收(箭头)。E)将一系列垂直横截面图像重构建为3D MIP体积。F)在水平和G)垂直平面中从对照肽QLE*-Cy5.5的异种移植肿瘤中观察到最小染色。H)与对照肽QLE*-Cy5.5相比，在ALL*-Cy5.5注射的小鼠肿瘤中观察到荧光强度增加2.9倍(47±13对比16±4，P＝2.2×10-6)。
图13A-I显示对特异性肽与小鼠HCC异种移植肿瘤中过表达的GPC3结合的验证。针对Hep3B异种移植肿瘤的切片，进行A)ALL*-Cy5.5相比于B)QLE*-Cy5.5的共聚焦显微镜检测。从具有20×20μm2尺寸的3组盒(白色虚线)中测量荧光强度。C)使用已知抗体，证实GPC3在Hep3B异种移植物的细胞表面上的过表达(箭头)，D-E)用ALL*-Cy5.5或QLE*-Cy5.5观察到对正常肝脏的最小染色，F)用抗GPC3抗体染色观察到低GPC3表达。G)Hep3B异种移植物的组织学(H&E)显示出扩大的细胞核(箭头)和高度侵入性脉管系统(箭头起始处)的特征。H)通过n＝26双样本t检验发现肽与HCC的结合强度高于正常，差异为2.22倍，P＝8.0×10-15。I)相应的ROC曲线显示96.2％的敏感性和92.3％的特异性，以区分HCC与正常肝脏，其中曲线下面积AUC＝0.98。
图14A-J显示了肽给药后重要器官的组织学。在注射ALL*-Cy5.5后2小时处死携带人类HCC异种移植肿瘤的小鼠。在A)大脑、B)心脏、C)肺、D)肝脏、E)脾脏、F)肾脏、G)胃、H)肠、I)盲肠或J)结肠中未观察到急性肽毒性的迹象。
图15A-C示出前导候选GPC3肽与人类HBV衍生的HCC的结合。A)在免疫荧光(IF)上，观察到经Cy5.5标记GPC3肽与HCC的代表性切片(箭头)的强结合。B)在免疫组织化学(IHC)上，在连续切片上观察到抗GPC3抗体对HCC(箭头)的强染色。C)相应的组织学(H&E)。
图16A-W显示了离体与人类HCC结合的特异性肽。A)在免疫荧光(IF)上，ALL*-Cy5.5显示来自样本的人类正常肝组织的阴性染色。B)相同组织的抗体染色证实了最小的GPC3表达。C)ALL*-Cy5.5肽与AF488标记的抗GPC3抗体的结合共定位在正常肝脏样本上，皮尔森相关系数(Pearson's correlation coefficient)ρ＝0.62。共染色区域也在D)40×和E)100×(D中的虚线框)放大倍数下成像。F-J)在腺瘤组织中观察到最小染色，皮尔森相关系数ρ＝0.63且K-O)在肝硬化肝组织中观察到中度扩散性染色，皮尔森相关系数ρ＝0.57。P-S)在显示细胞表面染色的HCC组织T)(箭头)中观察到强烈的染色，皮尔森相关系数ρ＝0.66。U)与正常肝、腺瘤和肝硬化组织的人HCC结合的ALL*-Cy5.5的定量比较。我们将一个具有4个条件项和41个患者(针对正常和腺瘤n＝7，针对肝硬化n＝12，且针对HCC，n＝15)的ANOVA模型拟合成对数转换数据，且发现HCC中ALL*-Cy5.5的信号比正常大3.43倍(P＝8.6×10-10)，且自腺瘤增加2.48倍(P＝2.7×10-6)，以及自肝硬化增加2.05倍(P＝2.7×10-6)。V)相应的ROC曲线显示在88％特异性下的93％敏感性，以用于区分HCC与所有非HCC组织，其中曲线下面积AUC＝0.98。W)ROC曲线显示在100％特异性下的87％敏感性，以用于区分HCC与肝硬化，其中曲线下面积AUC＝0.97。
图17A-H显示免疫组织化学(IHC)，其中抗GPC3抗体在A)正常肝脏上阴性染色，在B)腺瘤和C)肝硬化人类组织上中度染色。D)在HCC人类组织中观察到强烈染色。E)正常、F)腺瘤、G)肝硬化和H)HCC的相应代表性组织学(H&E)。
图18A-D显示对GPC3阴性HCC异种移植肿瘤的免疫染色。A-B)针对SK-Hep1异种移植肿瘤的切片未观察到ALL*-Cy5.5和QLE*-Cy5.5的染色。C)使用已知抗体，在SK-Hep1异种移植物中证实GPC3的阴性表达，D)组织学(H&E)显示具有较大的不规则圆形核(箭头起始处)的肿瘤细胞巢且衬有扁平内皮细胞(箭头)的浸润血管可看得见。
图19显示由病理学家针对图16中所使用的样本诊断的41个活捡体的人类组织样品的诊断和患者病史表。
图20-1A-C显示肽标记的聚合物胶束。A)生化结构显示分配在胶束核心中的疏水性药物的包封。B)虚线框的展开图显示了石胆酸十八烷基酯、PEG和肽的组装。PEG用于改善血清稳定性。C)透射电子显微镜(TEM)显示肽标记的聚合物胶束的纳米结构。
图20-2A-C显示GPC3肽标记的聚合物胶束。A)显示通过GGGSK连接子与Cy5.5荧光团连接的前导候选GPC3*肽(ALL肽)的生物化学结构，在图中称为GPC3*-Cy5.5。B)包封索拉非尼的聚合物纳米载体将用优化的GPC3*肽标记以用作靶向配体。C)GPC3*肽通过PEG连接到靶向纳米载体制剂中的D-α生育酚琥珀酸酯。
具体实施方式
靶向针对HCC具有特异性的分子过度表达的图像引导手术有助于在完全肿瘤切除与维持肝功能之间取得平衡。靶向成像还可以帮助最大化“正常”肝实质的剩余体积以优化术后功能。此外，针对HCC具有特异性的成像靶标可作为评估患者预后的重要生物标志物。成像试剂可为疾病检测、预后、引导治疗和监测治疗反应提供生物学基础。抗体是最常用的，但它们尺寸较大、分子量较高并且具有较长的血浆半衰期，所有这些都导致成像背景增加。肽是具有吸引力的成像工具、具有较小的尺寸和较低的分子量，进而导致难以接近抗体的深层组织成像的性质得到改善。肽具有较低的免疫原性，从非目标组织中清除以减少背景，并且可以合成以提高结合亲和力。所有这些都促进深层组织渗透和有效的靶向。
在一方面，本发明提供与在发育不良细胞和/或癌细胞上表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合的肽。肽包含(但不限于)肽ALLANHEELFQT(SEQ ID NO:1)、ALLANHEELF(SEQ IDNO:2)、GLHTSATNLYLH(SEQ ID NO:3)、SGVYKVAYDWQH(SEQ ID NO:4)或VGVESCASRCNN(SEQID NO:5)。
在另一方面，本发明提供包括本发明肽的试剂。本发明的“肽试剂”包括至少两种组分(本发明的肽和与所述肽连接的另一部分)。有助于结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的试剂的唯一组分是本发明的肽。换句话说，试剂“基本上由”本发明的肽组成。在一些实施例中，其它部分包括氨基酸，但本发明的肽不与自然界中的那些氨基酸连接，并且其它氨基酸不影响肽与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的结合。此外，本文中涵盖的试剂中的其它部分不是噬菌体展示库中的噬菌体或任何其它类型的肽展示库的组分。
在一些实施例中，所述试剂包括至少一种可检测标记作为与本发明的肽连接的部分。可检测标记可以例如通过显微镜、超声波、PET、SPECT或磁共振成像检测。在一些实施例中，通过显微镜可检测的标记是异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy5、Cy5.5和IRdye800。
在一些实施例中，可检测标记通过肽连接子与本发明的肽连接。连接子的末端氨基酸可以是赖氨酸，例如在示范性连接子GGGSK(SEQ ID NO:7)中。
在一些实施例中，所述试剂包括至少一个与本发明的肽连接的治疗部分。治疗部分可以是化学预防剂或化学治疗剂。在某些实施例中，化学治疗部分为塞来昔布(celecoxib)、5-氟尿嘧啶和/或苯丁酸氮芥。在一些实施例中，治疗部分是包封治疗部分的胶束。在某些实施例中，胶束包封索拉非尼。
在一些实施例中，所述试剂包括至少一个与肽或所述肽的多聚体形式连接的可检测标记，和至少一个与肽或所述肽的多聚体形式连接的治疗部分。
在又一方面，本发明提供一种组合物，其包括本发明的试剂和医药学上可接受的赋形剂。
在又一方面，本发明提供一种特异性检测患者体内HCC的方法，其包括以下步骤：将与可检测标记连接的本发明试剂给予患者，以及检测所述试剂与HCC细胞的结合。在一些实施例中，可检测的结合在活体内发生。在其它情况下，可检测的结合在活体外发生。在又其它实施例中，可检测的结合原位发生。
短语“特异性检测”是指试剂与一种类型的细胞结合并被检测，并且所述试剂在进行所述方法的敏感性水平上不与另一种类型的细胞结合且未检测到。
在另一方面，本发明提供一种确定患者的HCC和/或癌症转移或癌症复发的治疗有效性的方法，所述方法包括以下步骤：将与可检测标记连接的本发明试剂给予所述患者，使用所述试剂标记的第一量细胞可视化，并将所述第一量与先前可视化的用所述试剂标记的第二量细胞进行比较，其中第一量标记细胞相对于先前可视化的第二量标记细胞的减少指示有效治疗。在一些实施例中，减少5％指示有效治疗。在其它实施例中，减少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更多指示有效治疗。在一些实施例中，所述方法还包括获得由试剂标记的细胞的活检体。
在另一方面，本发明提供一种将治疗部分递送到患者的方法，所述方法包括将与治疗部分连接的本发明试剂给予患者的步骤。
在另一方面，本发明提供一种将治疗部分递送到患者的HCC细胞的方法，所述方法包括将与治疗部分连接的本发明试剂给予患者肝脏的步骤。
在另一方面，本发明提供一种用于将本发明组合物给予有需要的患者的试剂盒，其中所述试剂盒包括本发明的组合物、所述组合物的使用说明和将所述组合物给予患者的装置。
连接子、肽和肽类似物
如本文所使用，“连接子”是位于本公开的肽的C-末端的氨基酸序列。在一些实施例中，连接子序列以赖氨酸残基封端。
在一些实施例中，与不存在连接子的情况下试剂的可检测结合相比，连接子的存在导致本发明的试剂与HCC细胞的可检测结合增加至少1％。在各个方面，可检测结合的增加为至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍、至少约50倍、至少约100倍或更多。
术语“肽”是指具有2-50个氨基酸的分子、具有3-20个氨基酸的分子，和6-15个氨基酸的分子。本发明涵盖的肽和连接子长度可以是5个氨基酸。在各个方面，多肽或连接子长度可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸。
在各个方面，示范性肽是通过本领域中已知的方法随机产生的，在多肽库(例如但不限于，噬菌体展示库)中携带的，通过蛋白质消化衍生的，或化学合成的。本公开中举例说明的肽已经使用噬菌体展示技术开发，所述噬菌体展示技术是一种使用重组DNA技术产生复合多肽库以通过优先结合细胞表面靶标进行选择的强大组合方法[Scott等人，《科学(Science)》，249:386-390(1990)]。噬菌体的蛋白质外壳(例如丝状M13或二十面体T7)经遗传工程改造以表达非常大量(>109)的具有独特序列的不同多肽以实现亲和力结合[Cwirla等人，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，87:6378-6382(1990)]。然后通过将噬菌体库与过表达靶标的培养细胞和组织进行生物淘选来进行选择。然后回收这些候选噬菌体的DNA序列并用于合成多肽[Pasqualini等人，《自然(Nature)》，380:364-366(1996)]。优先与GPC3结合的多肽任选地用荧光染料标记，所述荧光燃料包含(但不限于)FITC、Cy5.5、Cy 7和Li-Cor。.
肽包含D和L形式，可以是纯化的，也可以是两种形式的混合物。本公开还涵盖与本发明的肽竞争以结合HCC细胞的肽。
在一些实施例中，本发明试剂的肽以多聚体形式存在。本领域中已知其上可以呈现多种肽的多种支架。在一些实施例中，肽以三聚体形式存在于三赖氨酸树枝状楔上。在一些实施例中，肽以使用氨基己酸连接子的二聚体形式存在。本领域中已知的其它支架包含(但不限于)其它树枝状聚合物和聚合物(例如PEG)支架。
应当理解，本发明的肽和连接子任选地并入本领域中已知的修饰，并且改变这些修饰的位置和数目以在肽和/或连接子类似物中实现最佳效果。
在一些实施例中，化合物是具有基于本文公开的肽中的一种(“亲本肽”)的结构但在一个或多个方面不同于亲本肽的肽类似物。因此，如本领域普通技术人员所理解的，关于本文提供的亲本肽的教示也可适用于肽类似物。
在一些实施例中，肽类似物包括亲本肽的结构，但肽类似物包括一个或多个非肽键代替肽键。在一些实施例中，肽类似物包括酯键、醚键、硫醚键、酰胺键等代替肽键。在一些实施例中，肽类似物是包括酯键代替肽键的缩酚酸肽。
在一些实施例中，肽类似物包括本文所述的亲本肽的结构，但肽类似物包括一个或多个氨基酸取代，例如，一个或多个保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域中已知的，并且包含氨基酸取代，其中具有某些物理和/或化学性质的一种氨基酸被交换为具有相同化学或物理性质的另一种氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是取代另一种酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)的酸性氨基酸、取代另一种具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)的具有非极性侧链的氨基酸、取代另一种碱性氨基酸(Lys，Arg等)的碱性氨基酸、取得另一种具有极性侧链的氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)的具有极性侧链的氨基酸等。
在一些方面，肽类似物包括一种或多种合成氨基酸，例如对于哺乳动物非天然的氨基酸。合成氨基酸包含β-丙氨酸(β-Ala)、N-α-甲基丙氨酸(Me-Ala)、氨基丁酸(Abu)、γ-氨基丁酸(γ-Abu)、氨基己酸(ε-Ahx)、氨基异丁酸(Aib)、氨基甲基吡咯羧酸、氨基哌啶羧酸、氨基丝氨酸(Ams)、氨基四氢吡喃-4-羧酸、精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、β-天冬氨酸(β-Asp)、氮杂环丁烷羧酸、3-(2-苯并噻唑基)丙氨酸、α-叔丁基甘氨酸、2-氨基-5-脲基-正戊酸(瓜氨酸，Cit)，β-环己基丙氨酸(Cha)、乙酰胺基甲基-半胱氨酸、二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dpr)、二羟基苯丙氨酸(DOPA)、二甲基噻唑烷(DMTA)、γ-谷氨酸(γ-Glu)、高丝氨酸(Hse)、羟脯氨酸(Hyp)、异亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺、甲基异亮氨酸(MeIle)、异哌啶甲酸(Isn)、甲基亮氨酸(MeLeu)、甲基-赖氨酸、二甲基-赖氨酸、三甲基-赖氨酸、甲醇脯氨酸、甲硫氨酸-亚砜(Met(O))、甲硫氨酸-砜(Met(O2))、正亮氨酸(Nle)、甲基-正亮氨酸(Me-Nle)、正缬氨酸(Nva)、鸟氨酸(Orn)、对氨基苯甲酸(PABA)、青霉胺(Pen)、甲基苯丙氨酸(MePhe)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、4-硝基苯丙氨酸(Phe(4-NO2))、4-氰基苯丙氨酸(Phe(4-CN))、苯基甘氨酸(Phg)、哌啶基丙氨酸、哌啶基甘氨酸、3,4-脱氢脯氨酸、吡咯烷基丙氨酸、肌氨酸(Sar)、硒代半胱氨酸(Sec)、O-苄基-磷酸丝氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸(Sta)、4-氨基-5-环己基-3-羟基戊酸(ACHPA)、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸(AHPPA)、1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-羧酸(Tic)、四氢吡喃甘氨酸、噻吩丙氨酸(Thi)、O-苄基-磷酸酪氨酸、O-磷酸酪氨酸、甲氧基酪氨酸、乙氧基酪氨酸、O-(双-二甲基氨基-膦酰基)-酪氨酸、酪氨酸硫酸四丁胺、甲基-缬氨酸(MeVal)，和烷基化3-巯基丙酸。
在一些实施例中，肽类似物包括一个或多个非保守氨基酸取代，并且肽类似物仍然以与亲本肽相似的程度、相同的程度或改善的程度起作用。在某些实施例中，与亲本肽相比，包括一个或多个非保守氨基酸取代的肽类似物表现出与HCC细胞大约相同或更高的结合。
在一些实施例中，与本文所述的亲本肽相比，肽类似物包括一个或多个氨基酸插入或缺失。在一些实施例中，与亲本肽相比，肽类似物包括一个或多个氨基酸的插入。在一些实施例中，与亲本肽相比，肽类似物包括一个或多个氨基酸的缺失。在一些实施例中，与亲本肽相比，肽类似物包括在N-或C-末端插入一个或多个氨基酸。在一些实施例中，与亲本肽相比，肽类似物包括在N-或C-末端缺失一个或多个氨基酸。在这些实施例中，与亲本肽相比，肽类似物仍表现出大约相同或更高的与HCC细胞的结合。
可检测的标记物
如本文所使用，“可检测标记物”是可用于识别本公开组合物与HCC细胞的结合的任何标记。可检测标记物的非限制性实例是能够使多肽可视化的荧光团、化学或蛋白质标签。某些方面的可视化用肉眼或装置(例如但不限于内窥镜)进行，并且还可以包括替代的光或能量源。作为另一实例，考虑了例如PET/SPECT的核成像模态。
预期用于本发明的荧光团、化学和蛋白质标签包含(但不限于)FITC、Cy 5.5、Cy7、Li-Cor、放射性标记、生物素、荧光素酶、1,8-ANS(1-苯胺萘-8-磺酸)、1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)、5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素pH 9.0、5-FAM pH 9.0、5-ROX(5-羧基-X-罗丹明(rhodamine)、三乙基铵盐)、5-ROX pH 7.0、5-TAMRA、5-TAMRA pH 7.0、5-TAMRA-MeOH、6JOE、6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0、6-羧基罗丹明6G pH 7.0、6-羧基罗丹明6G、盐酸盐、6-HEX、SE pH 9.0、6-TET、SE pH 9.0、7-氨基-4-甲基香豆素pH7.0、7-羟基-4-甲基香豆素、7-羟基-4-甲基香豆素pH 9.0、Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 647、Alexa 660、Alexa 680、Alexa 700、Alexa Fluor 430抗体结合物pH 7.2、Alexa Fluor 488抗体结合物pH 8.0、Alexa Fluor 488酰肼-水、Alexa Fluor 532抗体结合pH 7.2、Alexa Fluor 555抗体结合物pH 7.2、Alexa Fluor 568抗体结合物pH 7.2、Alexa Fluor 610R-藻红蛋白链霉抗生物素蛋白pH 7.2、Alexa Fluor 647抗体结合物pH 7.2、Alexa Fluor 647R-藻红蛋白链霉抗生物素蛋白pH 7.2、Alexa Fluor 660抗体结合物pH7.2、Alexa Fluor 680抗体结合物pH 7.2、Alexa Fluor 700抗体结合物pH 7.2、别藻蓝蛋白pH 7.5、AMCA结合物、氨基香豆素、APC(别藻蓝蛋白)、Atto 647、BCECF pH 5.5、BCECF pH 9.0、BFP(蓝色荧光蛋白)、钙黄绿素、钙黄绿素pH 9.0、钙红色、钙红色Ca2+、钙绿色、钙绿色-1Ca2+、钙橙色、钙橙色Ca2+、羧基萘并荧光素pH 10.0、级联蓝、级联蓝BSApH 7.0、级联黄、级联黄色抗体结合物pH 8.0、CFDA、CFP(青色荧光蛋白)、CI-NERF pH 2.5、CI-NERF pH 6.0、黄水晶、香豆素、Cy 2、Cy 3、Cy 3.5、Cy 5、C5.5、CyQUANT GR-DNA、丹磺酰尸胺(Dansyl Cadaverine)、丹磺酰尸胺、MeOH、DAPI、DAPI-DNA、Dapoxyl(2-氨基乙基)磺酰胺、DDAO pH 9.0、Di-8 ANEPPS、Di-8-ANEPPS-脂质、DiI、DiO、DM-NERF pH 4.0、DM-NERF pH 7.0、DsRed、DTAF、dTomato、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、曙红、曙红抗体结合物pH 8.0、赤藓红-5-异硫氰酸酯pH 9.0、eYFP(增强型黄色荧光蛋白)、FDA、FITC抗体结合物pH 8.0、FlAsH、Fluo-3、Fluo-3 Ca2+、Fluo-4、Fluor-Ruby、荧光素、荧光素0.1M NaOH、荧光素抗体结合物pH 8.0、荧光素葡聚糖pH 8.0、荧光素pH 9.0、Fluoro-Emerald、FM 1-43、FM 1-43脂质、FM4-64、FM 4-64、2％CHAPS、Fura Red Ca2+、Fura Red、高Ca、Fura Red、低Ca、Fura-2 Ca2+、Fura-2、Fura-2、GFP(S65T)、HcRed、Indo-1 Ca2+、Indo-1、无Ca、Indo-1、Ca饱和、JC-1、JC-1pH 8.2、丽丝胺罗丹明、荧光黄、CH、镁绿、镁绿Mg2+、镁橙、Marina Blue、mBanana、mCherry、mHoneydew、mOrange、mPlum、mRFP、mStrawberry、mTangerine、NBD-X、NBD-X、MeOH、NeuroTrace 500/525、绿色荧光尼氏染色RNA、尼罗(Nile)蓝、尼罗红、尼罗红脂、Nissl、俄勒冈(Oregon)绿488、俄勒冈绿488抗体结合物pH 8.0、俄勒冈绿514、俄勒冈绿514抗体结合物pH 8.0、太平洋(Pacific)蓝、太平洋蓝抗体结合物pH 8.0、藻红蛋白、R-藻红蛋白pH7.5、ReAsH、试卤灵(Resorufin)、试卤灵pH 9.0、Rhod-2、Rhod-2 Ca2+、罗丹明、罗丹明110、罗丹明110pH 7.0、罗丹明123、MeOH、罗丹明绿、罗丹明鬼笔环肽(phalloidin)pH 7.0、罗丹明红-X抗体结合物pH 8.0、罗丹明绿色pH 7.0、Rhodol Green抗体结合物pH 8.0、蓝宝石、SBFI-Na+、绿钠Na+、磺酰罗丹明101、四甲基罗丹明抗体结合物pH 8.0、四甲基罗丹明葡聚糖pH 7.0，和Texas Red-X抗体结合物物pH 7.2。
本发明涵盖的化学标签的非限制性实例包含放射性标记。举例来说但不限于，本公开的组合物和方法中涵盖的放射性标记包含11C、13N、15O、18F、32P、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、90Y、94mTc、94Tc、95Tc、99mTc、103Pd、105Rh、109Pd、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、140La、149Pm、153Sm、154-159Gd、165Dy、166Dy、166Ho、169Yb、175Yb、175Lu、177Lu、186Re、188Re、192Ir、198Au、199Au，和212Bi。
本领域普通技术人员将理解，存在许多这样的可用于活体外、活体内或离体观察细胞的可检测标记物。
治疗部分
本发明涵盖的治疗部分包含(但不限于)多肽(包含蛋白质治疗剂)或肽、小分子、化学治疗剂或其组合。
如本文所使用，术语“小分子”是指化学化合物，例如可任选地衍生的肽基或寡核苷酸，或天然或合成的任何其它低分子量有机化合物。
“低分子量”是指分子量小于1000道尔顿，通常在300与700道尔顿之间的化合物。在各个方面，低分子量化合物为约100、约150、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约1000或更多道尔顿。
在一些实施例中，治疗部分是蛋白质治疗剂。蛋白质治疗剂包含(但不限于)细胞或循环蛋白质以及其片段和衍生物。其它治疗部分还包含多核苷酸，包含(但不限于)蛋白质编码多核苷酸、编码调节多核苷酸的多核苷酸，和/或本身具有调节性的多核苷酸。任选地，组合物包括本文所述化合物的组合。
在一些实施例中，蛋白质治疗剂包含细胞因子或造血因子，包含(但不限于)IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-11、集落刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、EPO、干扰素-α(IFN-α)、共有序列干扰素、IFN-β、IFN-γ、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、血小板生成素(TPO)、血管生成素，例如Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y，人类血管生成素样多肽、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、表皮生长因子、上皮衍生的中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子8b、成纤维细胞生长因子8c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子酸性、成纤维细胞生长因子碱性、胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质形成细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经营养因子-3、神经营养因子-4、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板衍生内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子A链、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子AB、血小板衍生生长因子B链、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子受体α、血小板衍生生长因子受体β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子受体、TNF(包含TNF0、TNF1、TNF2)、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜在转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白I、转化生长因子β结合蛋白II、转化生长因子β结合蛋白III、肿瘤坏死因子受体I型、肿瘤坏死因子受体II型、尿激酶类纤维蛋白溶酶原活化子受体、血管内皮生长因子，和嵌合蛋白以及其生物学上或免疫学上的活性片段。
在一些实施例中，治疗部分还包含化学治疗剂。预期用于本发明试剂的化学治疗剂包含(但不限于)烷化剂，包含：氮芥，例如甲基-乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)和苯丁酸氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(甲基-CCNU)；乙烯亚胺/甲基三聚氰胺，例如四亚乙基三聚氰胺(TEM)、三乙烯、硫代磷酰胺(thiotepa)、六甲基三聚氰胺(HMM，六甲嘧胺(altretamine))；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)；三嗪，例如(达卡巴嗪(DTIC))；抗代谢物，包含叶酸类似物(例如甲氨蝶呤和三甲氧喋呤)、嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、吉西他滨(gemcitabine)、阿糖胞苷(AraC，阿糖胞苷)、5-氮杂胞苷、2,2'-二氟脱氧胞苷)、嘌呤类似物(例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、2'-脱氧同型霉素(喷司他丁)、红色羟基腺嘌呤(EHNA)、氟达拉滨磷酸盐和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨(cladribine)，2-CdA)；天然产物，包含抗有丝分裂药物(例如紫杉醇)；长春花生物碱，包含长春碱(vinblastine；VLB)、长春新碱(vincristine)和长春瑞滨(vinorelbine)、泰索帝(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)和雌莫司汀磷酸盐；表鬼臼毒素(epipodophylotoxin)，例如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)；抗生素，例如阿替莫霉素(actimomycin)D、道诺霉素(rubidomycin)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、博莱霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin)、丝裂霉素C和放线菌素；例如L-天冬酰胺酶的酶；生物反应调节剂，例如干扰素-α、IL-2、G-CSF和GM-CSF；杂类药剂，包含如顺铂和卡铂的铂配位络合物、例如米托蒽醌的蒽二酮类、例如羟基脲的取代脲、包含N-甲基肼(MIH)和丙卡巴肼的甲基肼衍生物、例如米托那(o,p'-DDD)和氨基乙酰亚胺的肾上腺皮质抑制剂；激素和拮抗剂，包含肾上腺皮质类固醇拮抗剂(例如泼尼松(prednisone)和等效物、地塞米松(dexamethasone)和氨基乙酰亚胺)；孕激素，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素，例如己烯雌酚和乙炔雌二醇等效物；抗雌激素，例如他莫昔芬；雄激素，包含丙酸睾酮和氟甲睾酮/等效物；抗雄激素，例如氟他胺、促性腺激素释放激素类似物和亮丙瑞林；以及非甾体抗雄激素，例如氟他胺。还特别涵盖化学治疗剂，例如吉非替尼、索拉非尼和厄洛替尼。
治疗部分还包含胶束，所述胶束又包封另一种治疗部分。在一些实施例中，胶束是聚合物胶束，例如石胆酸十八烷基酯胶束。本文所述的肽与聚合物胶束连接，例如Khondee等人，《控制释放杂志(J.Controlled Release)》，199:114-121(2015)和美国临时专利申请第62/262,195号中所描述的石胆酸十八烷基酯胶束。在一些实施例中，胶束包封索拉非尼。在一些实施例中，胶束是D-α生育酚琥珀酸酯胶束。
所提供的治疗部分的剂量以例如mg/kg测量的剂量给药。所公开的治疗剂的预期mg/kg剂量包含约1mg/kg到约60mg/kg。以mg/kg计的具体剂量范围包含约1mg/kg到约20mg/kg，约5mg/kg到约20mg/kg，约10mg/kg到约20mg/kg，约25mg/kg到约50mg/kg，和约30mg/kg到约60mg/kg。对于个体的精确有效量可取决于个体的体重、体型和健康；病况的性质和程度；和选择用于给药的治疗剂或治疗剂组合。对于给定情况的治疗有效量可以通过临床医生的技能和判断范围内的常规实验来确定。
如本文所使用的“有效量”是指足以使所鉴定的疾病或病症可视化，或表现出可检测的治疗或抑制作用的本发明试剂的量。通过例如临床状况的改善或症状的减轻来检测效果。对于个体的精确有效量可取决于个体的体重、体型和健康；病况的性质和程度；和选择用于给药的治疗剂或治疗剂组合。对于给定情况的治疗有效量可以通过临床医生的技能和判断范围内的常规实验来确定。
试剂的可视化
通过本领域普通技术人员已知的任何方法可视化与HCC细胞的结合。如本文所讨论，可视化为例如(但不限于)活体内、活体外或原位可视化。
在可检测标记是放射性标记的一些实施例中，通过核成像检测放射性标记。
在可检测标记是荧光团的一些实施例中，通过近红外(NIR)荧光成像检测荧光团。
本发明方法的一些实施例涉及从患者中获取组织样品。组织样品选自由所述患者的组织或器官组成的组。
调配物
根据具体的给药模式和剂型，将本发明的组合物与医药学上可接受的赋形剂(例如载剂、溶剂、稳定剂、佐剂、稀释剂等)一起配制。通常将组合物配制以达到生理学上相容的pH，并且pH范围为约3到约pH 11、约pH 3到约pH7，这取决于调配物和给药途径。在替代实施例中，将pH调节成约pH 5.0到约pH 8的范围。在各个方面，组合物包括治疗有效量的至少一种如本文所述的化合物，以及一种或多种医药学上可接受的赋形剂。任选地，组合物包括本文所述化合物的组合，或可包含可用于治疗或预防细菌生长的第二活性成分(例如但不限于抗细菌或抗微生物剂)，或可包含本发明试剂的组合。
合适的赋形剂包含例如，载体分子，其包含较大的缓慢代谢的大分子(例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒)。其它示范性赋形剂包含抗氧化剂(例如但不限于抗坏血酸)、螯合剂(例如但不限于EDTA)、碳水化合物(例如但不限于糊精、羟烷基纤维素和羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(用于例如但不限于油、水、盐水、甘油和乙醇)润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
实例
通过参考详述本发明的示范性实施例的以下实施例，将更全面地理解本发明。
实例1
GPC3的表达
我们使用数据集GSE14520[Roessler等人，《癌症研究(Cancer Res)》，70:10202-10212(2010)]和GSE44074[Ueda等人，《基因组学(Genomics)》，101:238-248(2013)]将GPC3鉴定为用于检测和治疗HCC的有希望的靶标。与非肿瘤相比，GPC3的表达水平显示出P值和平均倍数变化的巨大差异，图1-1A。差异通过以log2显示的基因表达水平的分布来反映，如图1-1B中的数据集GSE14520所示。图1-2B显示与图1-1B中所示相同的数据集GSE14520，并且显示附加数据集GSE44074(即显示两个数据集)。这种数据的ROC曲线显示89％的敏感性和92％的特异性，其中曲线下面积(AUC)为0.92，图1-1C。这些结果表明GPC3是用于HCC的有希望的靶标。图1-2A显示在附加分析下与图1-1A所示相同的数据。图1-2C类似于图1-1C中所示的数据，但表示来自两个不同数据集(GSE14520和GSE44074)的数据分析。
GPC3过表达在来自北京大学人民医院生物库的HBV衍生HCC样本中得到验证。评估n＝25个经福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤，包含n＝23个HBV相关的HCC，n＝1个肝转移(乳腺癌)和n＝1个局灶性结节性增生。使用标准方法，包含脱石蜡、再水合和抗原暴露来处理切片。发现在肿瘤区域使用抗GPC3抗体对GPC3的染色对于n＝16个样本是强的，对于n＝6个样本是中等的。代表性样本显示在肝硬化的相对未染色的邻近区域包围的HCC肿瘤区域(箭头)中的强染色斑块，图2A。连续切片的组织学(H&E)显示HCC，图2B。在非肿瘤(对照)中发现阴性染色，图2C。
实例2
针对GPC3具有特异性的肽
使用噬菌体展示技术识别一组对于GPC3具有特异性的候选肽。使用M13噬菌体库进行肽选择，所述M13噬菌体库表达每个单独序列的约109个独特克隆体[Zhou等人，《临床和转化胃肠病学(Clin Transl Gastroenterol)》，6:e101(2015)；Joshi等人，《生物结合化学(Bioconjug Chem)》，27:481-494(2016)；Rabinsky等人，《细胞和分子胃肠病学和肝病(Cell Mol Gastroenterol Hepatol)》，2:222-237(2016)]。针对固定在6孔板中的纯化的重组GPC3核心蛋白进行文库的生物淘选。在连续轮次中使用减少量(100、80、60和40μg)的GPC3核心蛋白进行四轮生物淘选以增加结合特异性。使用标准方案洗脱、扩增、沉淀并滴定结合的噬菌体，并对来自候选库的富集克隆体进行测序以识别前导候选序列：ALLANHEELF(SEQ ID NO:2)、GLHTSATNLYLH(SEQ ID NO:3)、SGVYKVAYDWQH(SEQ ID NO:4)和VGVESCASRCNN(SEQ ID NO:5)。肽ALLANHEELF(SEQ ID NO:2)显示出最高的富集水平，并且使用标准的Fmoc介导的固相合成通过GGGSK(SEQ ID NO:7)连接子用水溶性染料磺基-Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Lumiprobe LLC)标记。
使用结构模型来优化ALL肽的序列以获得对GPC3的最大结合亲和力。参见Macindoe等人，《核酸研究(Nucleic Acids Research)》，38(S2):W445-W449(2010)。通过在整个分子间距离和旋转角度范围内围绕它们的质心旋转受体和配体来评估肽与靶标的对准[Svensson等人，《生物化学杂志(J Biol Chem)》，287:14040-14051(2012)]。比较前导肽序列的几个突变以实现最低的对接能，旨在实现Et<-600的值。还使用结构模型开发了乱序肽用作对照。
优化的GPC3和乱序(对照)肽通过C末端上的GGGSK(SEQ ID NO:7)连接子与Cy5.5连接，以防止空间位阻。图3A和B分别显示通过GGGSK(SEQ ID NO:7)连接子各自用磺基-Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Lumiprobe LLC)标记的优化前导候选肽ALLANHEELFQT(SEQID NO:1)(本文中称为ALL*肽)和乱序(对照)肽QLELTFHANLEA(SEQ ID NO:6)(本文中称为QLE*肽)的生物化学构型。标记的前导候选肽试剂命名为ALL*-Cy5.5。
针对GPC3具有特异性的前导候选肽试剂与乱序对照肽之间的结构差异可分别见于图4A和B中。磺化苯并稠合的假吲哚环用箭头标记。肽的N-末端用箭头起始处表示。两种肽的整体形状和局部化学环境都不同。PBS中10μM的任一肽的吸收光谱在λex＝677nm处显示最大值，图5A。具有λex＝671nm激发的任一肽的荧光发射光谱(使用具有671nm输出波长的二极管泵浦固态激光器)显示在λem＝708nm处的峰值发射，图5B。
实例3
GPC3的siRNA敲低
通过人类HCC细胞中GPC3的siRNA敲低验证了前导候选肽试剂结合的特异性。用siRNA转染细胞以敲低GPC3的细胞表面表达。在共聚焦显微镜检查中，图6-1A显示ALL*-Cy5.5肽试剂，且图6-1B显示AF488标记的抗GPC3抗体与Hep3B细胞的细胞表面(箭头)具有强结合。用非靶向siRNA(siCL)转染这些细胞以用作对照。图6-1C、F显示乱序(对照)肽QLE*-Cy5.5与相同细胞的最小结合。图6-1D、E显示，对于用siRNA(siGPC3)转染以敲低GPC3表达的Hep3B细胞，肽试剂和抗GPC3抗体的荧光强度分别降低约4倍。图6-1G显示重复三次收集的图像的荧光强度的测量结果。图6-1H显示Hep3B细胞中GPC3表达的蛋白质印迹。图6-2L显示与原始图6-1H相同的结果。图6-2M、N、O和P显示与原始图6-1A、B、D和E相同的结果。
在共聚焦显微镜检查中，显示ALL*-Cy5.5与具有不同GPC3表达水平的细胞表面(箭头)结合。通过ALL*-Cy5.5与Hep3B细胞表面(箭头)结合观察到强烈的荧光强度，并且与HepG2细胞的信号略微减少，图6-2A、B。对于SK-Hep1细胞，观察到很少的信号，图6-2C。对于所有细胞，用乱序对照QLE*-Cy5.5观察到最小信号，图6-2D-F。我们使用AF488标记的抗GPC3抗体作为阳性对照，并且观察到ALL*-Cy5.5对3种细胞的强度稳定下降，图6-2G-I。图6-2J显示量化结果。蛋白质印迹显示所研究细胞的细胞质(C)和膜(M)中GPC3的表达水平不同，图6-2K。GPC3在Hep3B细胞胞质和膜中高度过表达，而在HepG2细胞中适度表达。在SK-Hep1细胞中未观察到GPC3表达。微管蛋白用作所负载胞质或膜部分的上样对照(loadingcontrol)。发现GPC3敲低细胞中肽的荧光强度降低27％，且抗体降低23％，图6-2Q。
实例4
竞争肽结合
肽试剂结合的特异性也通过竞争测定来验证。使Hep3B细胞在盖玻片上生长，并且首先在浓度范围(0-500μM)内与未标记肽一起培育，然后与ALL*-Cy5.5肽一起培育。使用共聚焦显微镜测量荧光强度。图7显示荧光强度的剂量依赖性降低，这是因为添加递增浓度的未标记ALL*肽以与ALL*-Cy5.5肽试剂竞争结合Hep3B细胞。在50μM和更高的浓度下，ALL*-Cy5.5肽试剂与对照之间的荧光强度的差异是显著的。
实例5
肽结合亲和力的表征
测量优化GPC3肽对Hep3B细胞的表观解离常数(kd)，以提供肽结合亲和力的评估。将ALL*-Cy5.5肽试剂在PBS中以25nM的增量从0到200nM的浓度范围连续稀释，并与Hep3B细胞一起培育。以流式细胞术测量平均荧光强度。通过对非线性方程式I＝(I0+Imax ka[X])/(I0+ka[X])进行数据的最小平方拟合来计算平衡解离常数kd＝1/ka。I0和Imax分别为对应于无肽和饱和的初始和最大荧光强度，并且[X]表示结合肽的浓度。图8A显示对于ALL*-Cy5.5，kd＝71nM。
还测量了优化GPC3肽的表观缔合时间常数(k)，以提供对肽如何快速结合的评估。将ALL*-Cy5.5肽试剂与Hep3B细胞一起培育0到40分钟的时间间隔范围。以流式细胞术测量荧光强度。在不添加肽试剂的情况下，在不同时间点(t)，将中值荧光强度(y)与Hep3B细胞的荧光强度进行比例比较。通过将数据拟合到一级动力学模型来计算速率常数k，y(t)＝Imax[1-exp(-kt)]，其中Imax＝最大值。46图8B显示对于ALL*-Cy5.5肽试剂，k＝0.11min-1。
实例6
活体内全身荧光成像
将携带HCC异种移植肿瘤(箭头起始处)的小鼠静脉内注射250μL的300μM近NIRGPC3靶向肽ALL*-Cy5.5、乱序对照肽QLE*-Cy5.5和单独的未标记Cy5.5游离染料。另外将ALL*-Cy5.5注射到携带GPC3阴性肿瘤(来自SK Hep-1细胞，箭头)的小鼠中作为EPR效应的对照。注射前成像证实不存在自发荧光。在注射后0.5到24小时的时间过程中拍摄NIR图像，图9A-D。在GPC3阳性肿瘤(箭头起始处)中，在ALL*-Cy5.5注射之前，当未标记ALL*肽以标记肽的三倍和十倍剂量分别注射时，观测到肿瘤的信号以剂量依赖方式减少，图9E-F。对数转换数据的定量分析显示，在注射后2小时，来自ALL*-Cy5.5的平均信号显著高于乱序对照肽、在不存在靶表达且仅游离染料情况下的靶向肽的平均信号(分别地P＝4.3×10-9、1.7×10-10和5.6×10-14)。来自仅游离Cy5.5染料的信号对肿瘤部位为非特异性的，其在注射后0.5小时达到峰值并且显著高于标记肽(对于ALL、QLE和GPC3-ve分别为P＝2.7×10-6、1.2×10-5和4.7×10-4)。图9G。在2小时处ALL*-Cy5.5的平均值±SD靶-背景(T/B)比为3.91±0.58，而对于QLE*-Cy5.5为1.12±0.19，P＝3.8×10-18。用3倍和10倍未标记靶向肽剂量阻断使T/B比分别降低1.65和3.56倍，P＝1.3×10-7和2.5×10-18，图9H。
实例7
肽在器官中的生物分布
为了评估肽探针的生物分布，在使用荧光成像系统(IVIS光谱，马塞诸塞州的珀金埃默尔(PerkinElmer，MA))注射250μL的300μM ALL*-Cy5.5后2小时处死小鼠(n＝5)。获得器官并且离体成像。注射乱序对照肽、QLE*-Cy5.5和游离染料Cy5.5的小鼠用相同的滤光片和曝光时间成像。在注射PBS的小鼠中证实不存在自发荧光。将每个器官中的荧光信号量定量为每只小鼠中总荧光信号的百分比(p/s)。图10A中显示在注射探针后2小时，内部器官以及切除肿瘤的离体荧光图像。游离Cy5.5染料和Cy5.5标记的靶向肽和乱序肽在小鼠的肝脏和肾脏中积累最多，其次是胃肠道和脾脏。在肿瘤中观察到比其它所有组更高的靶向肽积累。在脑、心脏和胃中观察到最小的积累。在注射相同体积PBS的阴性对照组中未观察到荧光信号。通过对每个组织进行ANOVA，在ALL*-Cy5.5注射小鼠中，肿瘤中的信号显著高于乱序对照探针、GPC3阴性肿瘤靶向探针或游离Cy5.5染料(分别地P＝2.6×10-4、5.5×10-4和7.4×10-5，n＝5)，图10B。
实例8
肽与HCC异种移植肿瘤细胞结合
将人类HCC细胞Hep3B和SK-Hep1培养在于37℃，5％CO2下且补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的伊格尔式基本培养基(Eagle's Minimum Essential Medium；EMEM)中。执行蛋白质印迹以验证GPC3的表达水平。将细胞稀释于生长因子减少(GFR)的基质胶(康宁(Corning))中，并在4到6周龄时注射到体重在20到25克之间的雌性(以避笼内的雄性优势)裸体无胸腺小鼠(nu/nu，杰克逊实验室(Jackson Laboratory))的一侧腹。每只小鼠植入约5×106个细胞。
将直径为约10mm且具有31cm长的刚性护套的标准外科腹腔镜(#49003AA，
Figure BDA0002200966310000291
II Straight Forward Telescope 0°，Karl Storz)用于同时收集反射光和荧光。植入后2周具有人类HCC异种移植物的裸体小鼠在尾部静脉注射200μL 300μM GPC3肽ALL*-Cy5.5。在成像期间，用吸入的异氟烷使小鼠麻醉。我们首先使用带有白光照明的腹腔镜来检查异种移植物。注射后两小时以同时使用激光固态二极管激光器(660-S，TopticaPhotonics)以将λex＝660nm的激发传递到光纤光导中的荧光和反射模式拍摄腹腔镜图像。在1.2mW激光功率下以5帧/秒收集图像。通过尾部静脉注射经静脉内递送以10mg/kg剂量稀释于200μL的PBS中的Hoechst 33342(H1399，生命技术(Life Technologies))，进而在处死小鼠前30分钟染色细胞核。切除异种移植肿瘤，并且使用共聚焦显微镜(Leica SP5XUpright 2-Photon共聚焦显微镜)，用表面下50μm的Cy5.5和DAPI滤光片收集共聚焦荧光图像。成像后，固定切除的异种移植物并且被福尔马林包埋以用于如前文所述的免疫组织化学和H&E染色。
在肽注射后2小时拍摄的小鼠HCC异种移植物的荧光图像记录有同时拍摄的相应反射图像。将图像中每个像素的荧光强度除以反射率图像中对应像素的强度，以便考虑每个像素与激光源之间的距离差异。从每个像素处的所得比率中生成热图图像。通过使用大津方法[Otsu,《自动化(Automatica)》,11(285-296):23-27(1975)]的自定义Matlab(Mathwork)软件程序自动执行图像分割。通过将分割的肿瘤内的像素平均强度除以分割轮廓外的30个像素内的像素平均强度来计算每个处理图像的靶-背景比。
在携带Hep3B异种移植物的小鼠中静脉注射GPC3-靶向肽QRH*-Cy5.5后2小时，用NIR腹腔镜收集荧光反射图像，图11-1A、B。通过逐像素地获取相应的荧光和反射图像之间的比率来生成整形成像距离的热图数字图像，图11-1C。所关注区域(ROI)通过根据大津方法自动成像处理比率图像来进行分割，图11-1E。在不同的肿瘤携带小鼠中用乱序肽PEH*-Cy5.5收集相同组的图像，图11-1E-H。对于注射靶向肽ALL*-Cy5.5，图11-1I和乱序肽PEH*-Cy5.5，图11-1J的小鼠，收集白光图像。在免疫组织化学上，抗GPC3抗体在切除的HCC肿瘤异种移植物中的浸润血管(箭头起始处)周围的肿瘤细胞的细胞膜(箭头)上强烈染色，图11-1K。在共聚焦荧光显微镜检查中，切除的肿瘤异种移植物上的ALL*-Cy5.5对Hep3B人类HCC细胞(箭头起始处)表面的强烈染色以40×放大倍数显示，图11-1L。从n＝8个肿瘤小鼠中的n＝8个肿瘤中发现：与QRH*-Cy5.5(3.0±0.7)相比，ALL*-Cy5.5的T/B比(8.3±1.3)的显著更大(通过双样本t检验，P＝3.8×10-8)，图11-2L。图11-2A-K显示来自原始实验的数据，进而显示了与图11-1A-J相同的结果。
在目前的研究中，ALL*-Cy5.5肽的亲和力为71.28nM，并且活体内成像峰值时间为注射后2小时。这种较短的探针递送时间对于人类临床转化应用是有利的。在不希望受理论束缚的情况下，预期较短的递送时间可归因于在靶向肽序列与近红外染料Cy5.5之间添加了氨基酸连接子序列GGGSK，从而减少在靶标结合时染料部分的空间位阻。此外，ALL*-Cy5.5探针具有1+ve总电荷(包含连接子序列)，9个(在17个中，53％)疏水性氨基酸和4个极性不带电氨基酸。在不希望受理论束缚的情况下，还可以考虑探针的电荷和极性可以帮助氢键形成，以提高探针的溶解度和分布时间。
实例9
活体内手持式双轴共聚焦显微成像
通过使用手持式5.5mm直径双轴共聚焦内窥镜活体内收集光学切片来实时评估人类HCC异种移植肿瘤的GPC3表达[64]。固态二极管激光器(300mW，CNI激光公司)提供λex＝671nm的照明。抛物面镜将照明和收集光束聚焦在组织表面下方重叠，其中横向和轴向分辨率分别为2μm和5μm。位于远侧尖端的紧凑3D单片扫描器提供较大的垂直位移和较宽的角度偏转以在垂直(XZ)和水平(XY)平面分别产生具有1000×430和1000×1000μm2的FOV的图像。收集NIR荧光，并且通过具有>93％效率的发射696-736nm的带通滤光片(FF01-716/40-25，Semrock)以用光电倍增管(PMT，H7422PA-40，滨松公司(Hamamatsu))检测器来检测。通过尾部静脉注射肽，并且切除覆盖肿瘤的皮肤以获得进入。使用一滴盐水将内窥镜的远端尖端与肿瘤接触以耦合光。在组织上使用激光功率<2mW以避免光漂白。以5帧/秒收集NIR荧光图像。使用阿米拉(Amira)软件(版本5.4.3，FEI公司)从在垂直平面中收集的一系列图像重构3D体积图像。
探针足够小以在手术期间舒适地握在外科医生的手中，图12A，以用于生物标记物表达的活体内成像。其直径为5.5mm，且以2mW输送671nm近红外激光。首先用250μL 300μMALL*-Cy5.5肽静脉内注射携带过表达GPC3的HCC异种移植肿瘤的小鼠，并在2小时后使探针与暴露的皮下肿瘤接触以获得活体内肽结合图像，图12B。以5帧/秒将图像分别收集在具有430μm或1000×1000μm2面积的垂直或水平平面中。测得的横向分辨率为2.49μm，轴向分辨率为4.98μm，可以清楚地看到每个肽染色的细胞(箭头)。重构建的3D MIP图像显示肿瘤中的所有染色细胞。在分别在水平(1000×1000μm2，影像1)图12C和垂直(1000×430μm2，影像2)图12D平面中收集的光学切片上捕获肿瘤中ALL*-Cy5.5的强摄取(箭头)。将一系列垂直横截面图像重构建成3D MIP体积(影像3)，图12E。在水平和垂直平面中在对照肽QLE*-Cy5.5的异种移植肿瘤中观察到最小染色，图12F-G。通过每组n＝8只小鼠的双样本t检验，ALL*-Cy5.5的荧光信号显著高于(关于对数转换数据，P＝2.2×10-6，2.9倍大)QLE*-Cy5.5的荧光信号，图12H。
实例10
在小鼠异种移植物中过表达的GPC3的离体显微镜验证
还对样本进行切片以收集共聚焦图像以进行离体肽结合的微观验证。我们发现与QLE*-Cy5.5相比较，ALL*-Cy5.5对Hep3B异种移植物(箭头)的细胞表面染色增加，图13A、B。用已知抗体证实GPC3在Hep3B异种移植物的细胞表面上的过表达，图13C。在正常小鼠肝脏上用ALL*-Cy5.5、QLE*-Cy5.5和抗GPC3抗体观察到最小染色，图13D-F。Hep3B异种移植物的组织学(H&E)在Hep3B异种移植肿瘤切片中显示出扩大的细胞核(箭头)和高度侵袭性脉管系统(箭头起始处)的特征，图13G。通过对26只小鼠的n＝26个肿瘤进行配对t检验，发现肽结合HCC比正常更强的强度为2.22倍差异，P＝8.0×10-15图13H。相应的ROC曲线显示96.2％的敏感性和92.3％的特异性以区分HCC与正常肝脏，其中曲线下面积AUC＝0.98，图13I。对于具有SK-Hep1异种移植物的肽，没有观察到染色，图18A-B，其不具有GPC3表达，图18C。组织学(H&E)显示肿瘤细胞巢具有较大的不规则圆形核(箭头)，并且可以看到衬有扁平内皮细胞(箭头起始处)的浸润血管，图18D。
在小鼠给予肽后获得生命器官以用组织学观察评估肽探针的急性毒性。在注射ALL*-Cy5.5后2小时处死携带人类HCC异种移植肿瘤的小鼠。在脑、心脏、肺、肝、脾、肾、胃、肠、盲肠、结肠中未观察到急性肽毒性的迹象，图14A-J。
实例11
美国专利肝脏活捡体的微观验证
在来自密歇根大学医院的离体患者活捡体(n＝41)中证实了与人类HCC结合的特异性肽。在免疫荧光分析中，ALL*-Cy5.5显示来自样本的人类正常肝组织的阴性染色，图15A。相同组织的抗体染色证实了最小的GPC3表达，图15B。通过ALL*-Cy5.5肽和AF488标记的抗GPC3抗体结合共定位在正常肝脏样本上，皮尔森相关系数ρ＝0.62，图15C。共染色区域也以40×，图15D和100×(图D中的虚线框)放大倍数成像，图15E。在腺瘤组织中观察到最小染色，其中皮尔森相关系数ρ＝0.63，图15F-J，并且在肝硬化肝组织中观察到中度扩散性染色，其中皮尔森相关系数ρ＝0.57，图15K-O。在HCC组织中观察到皮尔森相关系数ρ＝0.66的强烈染色，图15P-S。细胞表面染色(箭头)显示在图15T中。
图15U总结与人类HCC结合的ALL*-Cy5.5与与正常肝脏、腺瘤和肝硬化组织的定量比较。ANOVA模型应用4个条件项和41个患者(n＝7为正常和腺瘤，n＝12为肝硬化，且n＝15为HCC)的对数转换数据，发现在HCC中ALL*-Cy5.5的信号比正常大3.43倍(P＝8.6×10-10)，并且腺瘤增加2.48倍(P＝2.7×10-6)，肝硬化增加2.05倍(P＝2.7×10-6)。相应的ROC曲线显示88％特异性下的93％敏感性、，用于区分HCC与所有非HCC组织，其中曲线下面积AUC＝0.98，图15V。ROC曲线显示在100％特异性下的87％敏感性，用于区分HCC与肝硬化，其中曲线下面积AUC＝0.97，图15W。
用抗GPC3抗体的免疫组织化学(IHC)在正常肝脏上阴性染色，在腺瘤和肝硬化人类组织上中度染色，图16A-C。在HCC人类组织中观察到强烈染色，图16D。图16E-H显示正常、腺瘤、肝硬化和HCC的相应代表性组织学(H&E)。所有41个活捡体均由病理学家诊断，并且患者的病史和组织学注释记录在图19中。
实例12
GPC3肽与HBV衍生的HCC的活体外特异性结合的结合
使用免疫荧光证实优化GPC3肽试剂与HBV相关HCC的人类样本的特异性结合。
使用来自北京大学人民医院生物库的经福尔马林固定的HBV衍生HCC样本。将样本脱石蜡，并使用标准方法进行抗原检索。将HCC和非肿瘤肝样本切成10μm的切片，并与以5μM浓度于1×PBS中的ALL*-Cy5.5肽试剂一起培育在室温下15分钟。将切片用PBS洗涤3次，并在4℃下与1:1000稀释的初级抗GPC3抗体(Santa Cruz Biotechnology，1G12，sc-65443)一起培育整夜在4℃整夜夜。将切片用PBS洗涤3次，并与1:500稀释的Alexa Fluor 488标记的第二山羊抗兔抗体(Invitrogen)在室温下一起培育1小时。将切片用4％PFA固定10min。然后用含有DAPI的ProLong Gold试剂(英杰(Invitrogen))安放切片。用DAPI、FITC和Cy5.5滤光片收集共聚焦荧光图像。将测量皮尔森相关系数以评估肽和抗体结合的共定位。
在共聚焦显微镜检查中，与免疫荧光(IF)上的相邻非肿瘤区域相比，从肿瘤(箭头)中观察到增加的信号，图17A。使用抗GPC3抗体在连续切片上进行的免疫组织化学(IHC)支持所述结果，图17B。相应的组织学显示HCC(H&E)，图17C。
实例13
包封索拉非尼的GPC3肽标记的聚合物胶束
具有通过赖氨酸残基侧链上的GGSK连接子在C-末端结合的马来酰亚胺官能团的GPC3肽与石胆酸十八烷基酯结合并与聚乙二醇(PEG)组装(图20-1A、B)以形成如下的石胆酸十八烷基酯聚合物胶束。
石胆酸十八烷基酯胶束
将石胆酸(1.5g，4mmol)和HOBt(1.5g，10mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(12mL)中。将添加DIC(1.5mL，10mmol)。活化10分钟后，将添加十八烷基胺(0.9g，3.3mmol)以及二氯甲烷(DCM)4mL。将反应在室温(RT)下搅拌整夜。将所得产物过滤并真空干燥。将石胆酸十八烷基酯(573mg，0.91mmol)溶解在无水DCM(15mL)中。将添加催化量的DMAP。将添加琥珀酸酐(90.9mg，0.91mmol)和DIEA(950μL，5.45mmol)，使反应在室温下进行整夜。在N2下蒸发溶剂，并将所得产物真空干燥。
聚乙二醇化：将通过将琥珀酰石胆酸十八烷基酯(64.2mg，0.09mmol)溶解于2.5mLDCM和1mL DMF中来进行聚乙二醇化。将添加HOBt(41.3mg，0.27mmol)，然后添加DIC(50μL，0.27mmol)。将在活化10分钟后添加甲氧基PEG胺(143mg，0.05mmol)。将反应在40℃下搅拌整夜。在N2下部分地移除溶剂，并且将所得产物在冷二乙醚中沉淀，离心并真空干燥。琥珀酰石胆酸十八烷基酯将以相同方式与硫醇PEG胺结合。
肽标记：将硫醇聚乙二醇化石胆酸十八烷基酯(74.8mg，0.02mmol)和TCEP(9.68mg，0.03mmol)溶解于磷酸盐缓冲液pH 8.0(15mL)中。添加马来酰亚胺GPC3肽(0.02mmol)，并使反应在室温下进行整夜。将所得产物针对3次更换的水进行透析并冻干。
药物包封：当达到临界胶束浓度(CMC)时，通过自组装形成聚合物胶束，这是因为分子间力聚集了各种聚合物。将索拉非尼添加到聚合物溶液中以在聚集之前分配在核心中。将聚合物超声处理直至完全分散。然后将聚合物胶束溶液离心以除去不溶物质，并分离在上清液中包封索拉非尼的GPC3标记的聚合物胶束。透射电子显微镜(TEM)用于显示肽标记的聚合物胶束的纳米结构(图20-1C)。
D-α生育酚琥珀酸酯胶束
替代地，GPC3肽通过C末端上的GGGSK连接子与Cy5.5荧光团连接以防止空间位阻，此后为GPC3*-Cy5.5(图20-2A)并用于产生如下的D-α生育酚琥珀酸酯聚合物胶束(图20-2B)。选择Cy5.5是因为它具有高量子产率、光稳定性和与共聚焦显微镜一起使用的兼容性。通过HPLC合成具有>95％纯度的肽，并且通过质谱确认实验质荷(m/z)比。将肽冻干以用于存储，并且通过HPLC和质谱每3个月监测随时间的稳定性。
聚乙二醇化-通过将D-α生育酚琥珀酸酯(47.8mg，0.09mmol)溶解在2.5mL二氯甲烷(DCM)和1mL二甲基甲酰胺(DMF)中来进行聚乙二醇化。添加1-羟基苯并三唑(HOBt)(41.3mg，0.27mmol)，然后添加N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)(50μL，0.27mmol)。将在活化10分钟后添加硫醇PEG胺(177mg，0.05mmol)。将反应在40℃下搅拌整夜。在N2下部分地移除溶剂，并将所得产物在冷二乙醚中沉淀，离心并真空干燥。
肽标记-将硫醇D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(83.4mg，0.02mmol)和TCEP(9.68mg，0.03mmol)和三(2-羧乙基)膦HCl(TCEP)(9.68mg，0.03mmol)溶解在磷酸盐缓冲液pH 8.0(15mL)中。添加马来酰亚胺GPC3肽(0.02mmol)，并使反应在室温下进行整夜。将所得产物针对3次更换的水进行透析并冻干，图20-2C。
纳米载体的制备-通过单步自组装形成聚合物纳米颗粒。将索拉非尼或Cy5.5添加到含PLGA(聚(乳酸-共-羟基乙酸))和DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)的乙腈油相中，用于在聚合之前分配于纳米载体核心中。Cy5.5将用作体内药代动力学研究的光学报道分子。通过将油相缓慢添加到含有PEG和/或优化的GPC3标记的PEG的水相中来形成纳米载体。将所述系统进行超声处理直至完全分散。通过氮气吹扫除去有机溶剂。然后将聚合物纳米载体溶液离心以除去任何不溶性物质，并分离上清液中包封索拉非尼或Cy5.5的GPC3标记的聚合物纳米载体。
实例14
在HCC的临床前异种移植模型中诱导异种移植肿瘤的消退
研发HCC异种移植肿瘤：我们首先将使用培养的人类HCC细胞评估GPC3-肽标记的聚合物胶束的功效。将约5×106个人类Hep3B(GPC3+)和SK-Hep1(对照)细胞培养并稀释在生长因子减少的基质胶中。在裸小鼠皮下接种后，两种细胞系都变成致瘤的。将细胞注射到4-6周龄的体重在20到25克之间的裸体无胸腺小鼠(nu/nu，杰克逊实验室)的任一侧腹。
验证GPC3肽的特异性结合：我们将使用适合收集荧光图像的小型动物腹腔镜。在手术暴露HCC异种移植肿瘤上方的皮肤后进行成像。在使用671nm激发静脉内注射Cy5.5标记的GPC3肽试剂或乱序(对照)肽(150mM，200μL)后，收集荧光。
测量HCC肿瘤的靶-背景比：使用自定义Matlab软件绘制HCC肿瘤和邻近的正常(背景)组织上的所关注区域(ROI)。将从区域边界内的像素计算平均值和标准偏差。将从这些处理区域计算靶-背景比(来自肿瘤ROI的平均信号除以来自背景ROI的平均信号)。
实例15
GPC3肽标记的聚合物胶束疗法
我们将在n＝4个治疗组中研究n＝8只动物(总n＝32)：包封索拉非尼的1)GPC3肽标记的聚合物胶束和2)未标记聚合物胶束，3)游离索拉非尼和4)对照(NSS)。当HCC肿瘤大小为约1cm时，我们将在接种细胞后6周开始通过腹膜内(i.p.)注射以5mg/kg剂量每天对每组动物给予治疗持续35天。在治疗期间每天称重小鼠。
监测肿瘤消退：每天用超声测量肿瘤尺寸。换能器(40MHz)将以B模式使用，并沿肿瘤的长度和宽度平移。将在每个方向上拍摄多个图像以计算肿瘤体积。如果肿瘤太小而不能通过超声波观察，则可以使用T1加权MRI。我们将使用线性混合效应回归模型来评估包封索拉非尼的GPC3肽标记的聚合物胶束诱导HCC肿瘤大小消退的功效。治疗组之间的相互作用以及随着时间的推移将在所述模型中估计肿瘤消退率。
评估聚合物胶束的毒性：治疗完成后，将对所有动物实施安乐死。使用标准实验室组评估全血，包括血液学、化学和凝血因子。组织将通过尸检进行显微镜检查，包括具有骨髓的骨骼(股骨、胸骨)、脑(大脑、中脑、小脑、髓质、脑桥)、食道、心脏、肾脏、肝脏、支气管肺、淋巴结(肠系膜)、小肠(十二指肠、回肠、空肠)、脾脏、胃(腺体、非腺体)和胸腺。
来自患者的HCC的异种移植模型：我们将评估包封索拉非尼的优化的GPC3-肽标记的聚合物胶束诱导异质性肿瘤消退的功效，在广泛患者群体中发现其具有临床相关的GPC3表达水平。将从n＝10名接受肝切除术的HBV衍生的HCC患者中获得新的手术样本。将样本在PBS中漂洗以除去血液，然后置于冰上的RPMI 1640组织培养基中。将样本在30分钟内送到实验动物中心(Experimental Animal Center)。将肿瘤切成大小在1到2mm3之间的小块。将样本切碎成细小的碎片，小到足以穿过18号针头。将从北京维塔尔河公司(Beijing VitalRiver Company)(相当于查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))获得6至8周龄，体重在15到25克之间的雄性无胸腺BALB/c nu/nu小鼠。使用腹膜内注射0.43mg/kg的水合氯醛给小鼠施用麻醉。将均质化HCC组织与基质胶以1:1(v/v)混合，以提供每次注射0.2mL的总体积。将组织混合物皮下注射到小鼠的两侧腹。将针在10秒内缓慢抽出。对于每个肿瘤，将注射n＝6到8只小鼠。对照组将注射PBS和基质胶的混合物。每天用游标卡尺和超声监测患者来源的异种移植物的大小，并如上所述计算肿瘤体积。如上所述将治疗施用于n＝4个治疗组：包封索拉非尼的1)GPC3标记的聚合物胶束和2)未标记聚合物胶束，3)游离索拉非尼和4)对照(NSS)。我们将使用线性混合效应回归模型来评估HCC肿瘤的消退差异，并且如上所述进行毒性评估。
执行生物统计学分析：首先测试收集的所有数据的正常性。将使用单因子配对(或非配对)t检验以比较2个组之间的数据。将使用单因子ANOVA或非参数克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)以比较大于2个组的数据。如果P<0.01则认为比较是显著的，以适用多重比较。如果治疗组之间存在至少一个差异，则将使用多重比较来搜索成对差异。在ANOVA分析后，将使用图基多重比较检验(Tukey's multiple comparison test)以寻找成对差异。在克鲁斯卡尔-沃利斯之后，将使用邓恩多重比较检验(Dunn's multiple comparisontest)以寻找成对差异。对于动物体重，将使用一种随机效应来确定来自相同动物的数据之间的相关性。所有统计计算都将使用Graphpad Prism或自定义Matlab软件进行处理。
虽然本发明关于具体实施例进行了描述，但应理解，本领域中的普通技术人员将想到变化及修改。因此，仅申请专利范围中出现的这些限制才能适用于本发明。
本申请中引用的所有文献均通过全文引用并入本文中，特别注意引用它们的公开内容。
Figure IDA0002200966380000011
Figure IDA0002200966380000021
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Claims (24)

1.一种试剂，其包括磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3特异性肽ALLANHEELFQT(SEQ ID NO:1)、ALLANHEELF(SEQ ID NO:2)、GLHTSATNLYLH(SEQ ID NO:3)、SGVYKVAYDWQH(SEQ ID NO:4)或VGVESCASRCNN(SEQ ID NO:5)，或所述肽的多聚体形式，
其中所述肽特异性地结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3且
其中至少一个可检测标记、至少一个治疗部分或这两种与所述肽或所述肽的多聚体形式连接。
2.根据权利要求1所述的试剂，其包括至少一个与所述肽连接的可检测标记。
3.根据权利要求2所述的试剂，其中所述可检测标记能够通过显微镜、光声、超声、PET、SPECT或磁共振成像检测。
4.根据权利要求3所述的试剂，其中通过显微镜可检测的所述标记是异硫氰酸荧光素(FITC)。
5.根据权利要求3所述的试剂，其中通过显微镜可检测的所述标记是Cy5。
6.根据权利要求3所述的试剂，其中通过显微镜可检测的所述标记是Cy5.5。
7.根据权利要求3所述的试剂，其中通过显微镜可检测的所述标记是IRdye800。
8.根据权利要求1所述的试剂，其中所述肽的所述多聚体形式是与氨基己酸连接子形成的二聚体。
9.根据权利要求2所述的试剂，其中所述可检测标记通过肽连接子与所述肽连接。
10.根据权利要求9所述的试剂，其中所述连接子的末端氨基酸是赖氨酸。
11.根据权利要求10所述的试剂，其中所述连接子包括SEQ ID NO:7中所示的序列GGGSK。
12.根据1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的试剂，其包括至少一个与所述肽连接的治疗部分。
13.根据权利要求12所述的试剂，其中所述治疗部分是化学治疗剂。
14.根据权利要求12所述的试剂，其中所述治疗部分是胶束。
15.根据权利要求13所述的试剂，其中所述胶束是石胆酸十八烷基酯胶束。
16.根据权利要求15所述的试剂，其中所述胶束是聚乙二醇化的。
17.根据权利要求13所述的试剂，其中所述胶束包封索拉非尼(sorafenib)。
18.一种组合物，其包括根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17所述的试剂和医药学上可接受的赋形剂。
19.一种检测患者中肝细胞癌的方法，其包括以下步骤：将根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的试剂给予所述患者的肝脏，以及检测所述试剂与肝细胞癌细胞的结合。
20.一种确定患者肝细胞癌的治疗有效性的方法，其包括以下步骤：将根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的试剂给予所述患者，使用所述试剂标记的第一量细胞可视化，以及将所述第一量与先前可视化的用所述试剂标记的第二量细胞进行比较，
其中所述第一量标记细胞相对于所述先前可视化的第二量标记细胞的减少指示有效治疗。
21.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括获得由所述试剂标记的所述细胞的活检体。
22.一种将治疗部分递送到患者的肝细胞癌细胞的方法，其包括将根据权利要求12所述的试剂给予所述患者的步骤。
23.一种用于将根据权利要求18所述的组合物给予有需要患者的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求18所述的组合物、所述组合物的使用说明书和将所述组合物给予所述患者的装置。
24.一种肽，其由氨基酸序列ALLANHEELFQT(SEQ ID NO:1)、ALLANHEELF(SEQ ID NO:2)、GLHTSATNLYLH(SEQ ID NO:3)、SGVYKVAYDWQH(SEQ ID NO:4)或VGVESCASRCNN(SEQ IDNO:5)组成。
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