CN109476703A - 新型肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供一种用于选择钼的矿物的方法。一种肽，所述肽包含符合下式(1)和/或(2)的氨基酸序列：(1)(ALRKNMDFCPQSETGWHYIV)‑(LIVFA)‑(HPWRK)‑(TSNQ)‑(TSNQ)‑(LIVFA)‑(TSNQ)‑(TSNQ)‑(LIVFA)‑(FYW)‑(LIVFA)‑(HPWRK)；(2)(LIVFA)‑(RHK)‑(TSNQ)‑(LIVFA)‑(LIVFA)‑(TSNQ)‑（LIVFA)‑(LIVFA）‑(LIVFA)‑(RHK)‑(RHK)‑(HPW)，其中一个氨基酸分别选自由成对括号限定的各个组。

Description

新型肽及其用途
技术领域
本发明涉及新型肽及其用途。更具体地，本发明涉及与特定元素特异性结合的新型肽及其用途。
背景技术
钼是一种有价值的化学元素，其被用于诸如特殊钢的合金的成分、用于纯化油的催化剂以及润滑剂。钼通常存在于斑岩铜矿床(Porphyry copper deposit)等，其中硫化铜矿石伴随辉钼矿作为硫化物矿物存在，其作为钼浓缩物回收。从斑岩铜矿床开采的钼浓缩物在浓缩和/或精炼硫化铜矿物的过程中作为泡沫浮选的副产物回收。辉钼矿倾向于漂浮，并且因此其可以容易地通过添加起泡剂(除了捕收剂如煤油和柴油之外)而漂浮。然而，由于伴随有辉钼矿的硫化铜矿物也倾向于漂浮，所以为了抑制硫化铜矿物漂浮，需要添加氰化物和/或硫氢化钠。
然而，这些的缺陷是：氰化物由于其毒性而具有环境污染的风险；并且硫氢化钠的存在导致在矿浆为酸性时产生硫化氢。
专利文献1公开了一种用于精炼钼矿物而不使用或出现有毒物质的方法，其中应用了臭氧的氧化。专利文献2公开了一种用于利用等离子体辐照的方法。专利文献3公开了氨基酸通过载体负载以回收钼化合物。
引用列表
专利文献
PTL1：日本专利号3277532
PTL2：日本专利公开号2014-188428
PTL3：日本专利公开号2015-224225
发明内容
技术问题
在以上公开的方法中，需要专用设备以利用臭氧或辐照等离子体，这两者都是不切实际的，并且因此它们都还没有被实现。本发明的一个目的是提供用于分离含钼物质的新方法。
解决问题的方案
鉴于上述目的，本发明的发明人已进行了广泛研究并且发现某些肽和具有某些肽的噬菌体可以选择性地结合至辉钼矿。此外，这些肽对于精；炼辉钼矿是有价值的。
基于上述发现，在一个方面，本发明包括以下发明。
(发明1)
一种肽，所述肽包含符合(according)下式(1)和/或(2)的氨基酸序列：
(1)(ALRKNMDFCPQSETGWHYIV)-(LIVFA)-(HPWRK)-(TSNQ)-(TSNQ)-(LIVFA)-(TSNQ)-(TSNQ)-(LIVFA)-(FYW)-(LIVFA)-(HPWRK)
(2)(LIVFA)-(RHK)-(TSNQ)-(LIVFA)-(LIVFA)-(TSNQ)-(LIVFA)-(LIVFA)-(LIVFA)-(RHK)-(RHK)-(HPW)
其中一个氨基酸分别选自由成对括号限定的各个组。
(发明2)
一种肽，所述肽至少包含以下序列(A)和(B)中的任一个：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
(发明3)
一种肽，所述肽符合(according to)以下序列(A)和(B)中的任一个：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
(发明4)
一种肽，所述肽包含与以下序列(A)和(B)中的任一个具有至少90％同一性的序列：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
(发明5)
一种肽，所述肽包含与以下序列(A)和(B)中的任一个具有至少95％同一性的序列：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
(发明6)
一种肽，所述肽包含与以下序列(A)和(B)中的任一个具有至少98％同一性的序列：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
(发明7)
一种肽，所述肽包含通过缺失、置换和/或添加1-5个氨基酸而衍生自至少以下序列(A)和(B)中的任一个的序列：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
(发明8)
一种用于选择矿物的组合物，所述组合物包含发明1-7中任一项所述的肽。
(发明9)
一种核酸，所述核酸编码发明1-7中任一项所述的肽。
(发明10)
一种核酸，所述核酸包含与编码发明1-7中任一项所述的肽的核酸序列具有至少90％同一性的序列。
(发明11)
一种核酸，所述核酸能够在严格条件下与这样的序列杂交，所述序列与编码发明1-7中任一项所述的肽的核酸互补。
(发明12)
一种微生物，所述微生物在其表面上包含发明1-7中任一项所述的肽。
(发明13)
一种微生物，所述微生物包含发明9-11中任一项所述的核酸。
(发明14)
一种粒子，所述粒子在其表面上包含发明1-7中任一项所述的肽。
(发明15)
一种纯化柱，所述纯化柱包含发明1-7中任一项所述的肽。
(发明16)
一种用于浮选用途的试剂，所述试剂包含发明1-7中任一项所述的肽。
(发明17)
一种用于分离钼矿物的方法，所述方法包括使用发明1-7中任一项所述的肽。
(发明18)
一种用于选择矿物的方法，所述方法包括使用发明1-7中任一项所述的肽或发明8所述的组合物。
(发明19)
发明18所述的方法，其中所述矿物是辉钼矿。
(发明20)
发明18或19所述的方法，所述方法包括：
将微生物添加到矿物分散体中，其中所述微生物在其表面上包含所述肽；
使所述矿物聚集和沉淀；和
回收聚集和沉淀的矿物。
(发明21)
发明18或19所述的方法，所述方法包括：
将所述肽附着至载体；
将所述载体引入到用于层析的柱中；和
使矿物分散体通过所述柱。
(发明22)
发明18或19所述的方法，所述方法包括：
将所述肽附着至粒子；和
将所述粒子引入到矿物分散体中。
(发明23)
发明18或19所述的方法，所述方法包括利用所述肽进行泡沫浮选。
(发明24)
发明18-23中任一项所述的方法，其中所述矿物分散体的pH为4以上。
(发明25)
发明18-23中任一项所述的方法，其中所述矿物分散体的pH为7以上。
发明的有利效果
在一个方面，本发明利用肽。由此，相比于常规技术，其不需要大规模的设备。此外，其不需要使用有毒化合物或具有产生有毒化合物的风险的任何化合物如氰化物和硫氢化钠。因此，安全分离是可能的。
此外，根据本发明的肽能够有效地进行分离。此外，目标矿物可以被选择性地分离。另外，在一个方面，根据本发明的肽可以在某一pH范围的环境下使用。由此，可以更大地增强与矿物的钼(及其聚集体)的结合。
附图简述
[图1]图1是示出了根据本发明的一个实施方案的肽可以选择性地结合至特定矿物的图。在各组中的五个条以从左至右的顺序分别代表辉钼矿、元素硫、黄铜矿、硫砷铜矿和黄铁矿的OD405。
[图2]图2是示出了根据本发明的一个实施方案在利用50-噬菌体等沉淀辉钼矿时的浊度变化的图。
[图3]图3是示出了根据本发明的一个实施方案在利用50-噬菌体等沉淀辉钼矿时的粒子尺寸的照片。
[图4]图4是示出了根据本发明的一个实施方案在利用50-噬菌体等沉淀辉钼矿时的浊度变化的图。
[图5]图5是示出了根据本发明的一个实施方案在利用50-噬菌体等沉淀辉钼矿时的粒子最大尺寸变化的图。该变化取决于pH。
实施方案描述
现在，为了增强对本发明的理解，下文描述了更具体的实施方案，这些实施方案不旨在限制本发明的范围。
1.可应用的物质
在一个实施方案中，本发明可以适用于用于分离某些物质的方法。所述某些物质可以包括含钼物质。更具体地，在一个实施方案中，本发明可以适用于用于分离含钼矿物的方法。含钼矿物可以包括辉钼矿、钼铅矿、钼钨钙矿、水钼铁矿等。含钼矿物的一个典型实例包括辉钼矿，因为其是通常被开采的。
2.肽
为了分离上述物质，在本发明的一个实施方案中，可以使用肽。更具体地，可以使用这样的肽，其包括符合下式(1)和/或(2)的氨基酸序列。另外，在它们的N端和/或C端可以添加一定数量的氨基酸。该一定数量可以落入由选自以下各项的两个数字所限定的数值范围内：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15和20(例如，1至10，或5至20)。
(1)(ALRKNMDFCPQSETGWHYIV)-(LIVFA)-(HPWRK)-(TSNQ)-(TSNQ)-(LIVFA)-(TSNQ)-(TSNQ)-(LIVFA)-(FYW)-(LIVFA)-(HPWRK)
(2)(LIVFA)-(RHK)-(TSNQ)-(LIVFA)-(LIVFA)-(TSNQ)-(LIVFA)-(LIVFA)-(LIVFA)-(RHK)-(RHK)-(HPW)
(其中一个氨基酸分别选自由成对括号限定的各个组)
下文中所述的工作实施例显示使用符合以下氨基酸序列的肽来分离辉钼矿。
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
上述的(1)和(2)的氨基酸序列与上述的(A)和(B)的氨基酸序列对应如下。
[表1]
(A) (1)
1 Gly ALRKNMDFCPQSETGWHYIV
2 Leu LIVFA
3 His HPWRK
4 Thr TSNQ
5 Ser TSNQ
6 Ala LIVFA
7 Thr TSNQ
8 Asn TSNQ
9 Leu LIVFA
10 Tyr FYW
11 Leu LIVFA
12 His HPWRK
[表2]
(B) (2)
1 Ile LIVFA
2 Arg RHK
3 Ser TSNQ
4 Leu LIVFA
5 Ile LIVFA
6 Ser TSNQ
7 Ile LIVFA
8 Val LIVFA
9 Leu LIVFA
10 Arg RHK
11 Arg RHK
12 Trp HPW
如表1所示，序列(A)中的第一个氨基酸是甘氨酸。由于甘氨酸的残基是(-H)，所以残基本身有助于某些功能是不太可能的。因此，即使用其他天然氨基酸置换甘氨酸，该肽仍将保持相同或相似的性质。
序列(A)中的第二个氨基酸是亮氨酸，其是疏水性氨基酸。因此，即使用异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等(它们也是疏水性的)置换，该肽仍将保持相同或相似的性质。
序列(A)中的第三个氨基酸是组氨酸。组氨酸在其残基中具有杂环。因此，即使用色氨酸或脯氨酸(它们在其残基中也具有杂环)置换，该肽仍将保持相同或相似的性质。此外，组氨酸是极性带电(碱性)的氨基酸。因此，即使用精氨酸或赖氨酸(它们也是极性带电(碱性)的氨基酸)置换，该肽仍将保持相同或相似的性质。
序列(A)中的第4个和第5个氨基酸分别是苏氨酸和丝氨酸。这些是极性非带电的氨基酸。因此，即使用苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺(它们也是极性非带电的氨基酸)置换，该肽仍将保持相同或相似的性质。
序列(A)中的第10个氨基酸是酪氨酸，其是芳族氨基酸。因此，即使用色氨酸或苯丙氨酸(它们也是芳族氨基酸)置换，该肽仍将保持相同或相似的性质。
序列(B)中的第二个氨基酸是精氨酸，其具有碱性残基。因此，即使用赖氨酸或组氨酸(它们也是碱性氨基酸)置换，该肽仍将保持相同或相似的性质。
与上述相似的，其他氨基酸可以基于相同或相似的角度(例如，疏水-亲水的，酸性-中性-碱性的，共同官能团等)进行置换。
在一个实施方案中，本发明涵盖至少包括以下序列中的任一个的肽。
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
另外，在它们的N端和/或C端可以添加任意数量的氨基酸。典型地，该任意数量可以落入由选自以下各项的两个数字所限定的数值范围内：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15和20(例如，1至10，或5至20)。
在一个实施方案中，本发明涵盖由以下12-氨基酸序列中的任一个表示的肽。
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
关于上述氨基酸序列(A)和(B)，即使进行轻微修饰(例如，插入、置换和/或添加氨基酸)，修饰的肽仍将保持与氨基酸序列(A)和/或(B)的那些相同或相似的性质。例如，具有或者包含与氨基酸序列(A)和/或(B)具有66％以上、75％以上、83％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上同一性的序列的肽也将保持相同或相似的性质。
序列相似性的数值可以通过本领域已知的技术计算。例如，该值可以基于通过Blastp导出的值进行计算，所述Blastp用于氨基酸(或蛋白质)的同源性检索并且由BLAST(商标)提供。
在一个实施方案中，本发明涵盖包含这样的序列的肽，所述序列通过缺失、置换和/或添加1-5个氨基酸(典型地通过缺失、置换和/或添加4个以下、3个以下或2个以下氨基酸)而衍生自至少以下序列(A)和(B)中的任一个。
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
在一个实施方案中，本发明涵盖含有至少上述肽中的任一个的组合物。换句话说，不仅上述肽，而且含有至少上述肽中的任一个连同其他成分的组合物都可以实现相同或相似的功能。组合物可以含有任意成分(例如，缓冲剂、NaCl、糖等)，条件是它们不劣化上述肽的功能。
4.编码肽的核酸
在一个实施方案中，本发明涵盖编码至少上述肽中的任一个的核酸。核酸可以是DNA或RNA。在一个实施方案中，本发明涵盖具有这样的序列的核酸，所述序列与编码至少上述肽中的任一个的正义链互补。
在一个实施方案中，本发明涵盖包含这样的序列的核酸，所述序列与编码至少上述肽中的任一个的核酸序列具有至少80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或98％以上同一性。如与氨基酸序列的情形相似的，序列相似性的数值可以通过本领域已知的技术计算。例如，该值可以基于从通过Blastn(由BLAST提供)的检索结果导出的值进行计算。
此外，在一个实施方案中，本发明涵盖能够与这样的序列杂交的核酸，所述序列与编码至少上述肽中的任一个的核酸的正义链互补。更具体地，本发明涵盖能够在严格条件下杂交的核酸。严格条件可以是本领域已知的条件。例如，其可以是在日本专利公开号2015-023831中公开的条件。更具体地，其可以通过以下程序判断：使用其中固定有DNA的过滤器；在温度65摄氏度下在0.7-1.0M的NaCl的存在下杂交；和通过0.1-2X SSC(盐水-柠檬酸钠)溶液(1X SSC溶液含有150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)，在65摄氏度的温度下洗涤过滤器。
上述核酸中的任一个可用于通过基因工程技术制备目标肽。例如，上述核酸中的任一个或多个可以被引入到表达载体中以大规模地表达目标肽。备选地，在其表面上具有目标肽的噬菌体可以通过下文所述的噬菌体展示方法制备。
5.肽和/或核酸的用途
上述肽和/或核酸可以以多种方式应用。
5-1.微生物
例如，利用基因工程技术(例如，将至少上述核酸中的任一个引入到微生物的基因组中)，微生物可以大规模地产生目标肽。备选地，在微生物的表面上表达目标肽时，利用该微生物可以分离目标物质。本文中所述的术语“微生物”包括属于五界系统(five-kingdomsystem)的真菌、原核生物或原生生物的生物体。此外，本文中所述的术语“微生物”包括病毒，尽管其不属于严格分类上的生物体。典型地，可以使用真菌、细菌或病毒。优选地，可以使用其中建立了基因工程程序的微生物(例如，酵母、大肠杆菌(E.coli)、乳酸杆菌(lactobacillus)、噬菌体)。在一个实施方案中，本发明涵盖这样的微生物。
5-2.粒子
在一个实施方案中，本发明涵盖在其表面上具有肽的粒子。肽可以是上述肽中的任一个。此外，粒子的一个实例可以包括珠(例如，磁珠、玻璃珠、高分子珠等)和载体等。粒子的尺寸不受限制，并且可以根据其用途进行调节。肽可以通过本领域已知的技术结合至粒子的表面。
在本发明的一个实施方案中，可以利用在其表面上具有至少上述肽中的任一个的粒子来分离目标物质。例如，经由下文中所述的方法，目标物质可以结合至肽并且沉淀以被分离。
5-3.用于纯化的柱
可以经由柱层析法分离目标物质。柱层析法依赖于其中柱(或在柱的内表面上的官能团)选择性地结合至特定物质的性质。在本发明的一个实施方案中，上述肽可以附着至载体，然后可以将载体引入到柱中。利用这样的柱，可以分离目标物质。
5-4.用于泡沫浮选的捕收剂
泡沫浮选是一种用于通过经由气泡(bubble)俘获粒子进行分离的方法。在此方法中，可以使用捕收剂。在本发明的一个实施方案中，如果上述肽易于通过气泡俘获，则肽本身可以用作捕收剂。备选地，肽可以结合至捕收剂或本领域已知的起泡剂，以增强通过气泡的俘获。由此，目标物质可以通过气泡俘获并且因此被分离。
6.用于应用的实施方案(用于分离的方法)
现在，在下文描述用于上述应用的方法。
6-1.待分离的物质
上述用于应用的实施方案涉及分离特定物质。在这些实施方案中，待分离的物质可以是钼。例如，可以分离上述含钼矿物(例如，辉钼矿)。
6-2.利用微生物的方法
在本发明的一个实施方案中，使用微生物，可以分离物质(具体地，含钼矿物，更具体地，辉钼矿)。关于微生物，可以使用上述微生物中的任一种。典型地，可以使用噬菌体。
关于程序，首先，通过本领域中已知的基因工程技术，可以将编码上述肽的核酸序列引入到微生物中，以在微生物的表面上表达它们。然后，可以将微生物引入到矿物分散体(其中分散有矿物粒子的液体)中。
可以通过考虑某些条件如液体中分散的矿物的量适当调整微生物的引入量。例如对于噬菌体，相对于3g/L的矿物粒子，噬菌体的量可以为0.5X10^8pfu/mL-5X10^8pfu/mL，更优选0.6X10^8pfu/mL-1.5X10^8pfu/mL。备选地，相对于10g/L的矿物粒子，噬菌体的量可以为0.5X10^9pfu/mL-5X10^9pfu/mL，更优选0.6X10^9pfu/mL-1.5X10^9pfu/mL。
备选地，噬菌体的量(pfu/mL)/矿物的量(g/L)的比率可以为0.13X10^8-5X10^8，更优选0.33X10^8-1X10^8。
引入微生物，然后将微生物暂时留置，微生物表面上的肽结合至矿物粒子以发生聚集，然后沉淀。在此之后，可以回收底部的沉淀的矿石。
6-3.通过柱层析法的分离方法
在本发明的一个实施方案中，经由柱层析法，可以分离物质(具体地，含钼矿物，更具体地，辉钼矿)。在该程序中，首先，将至少上述肽中的任一个通过本领域已知的技术附着至载体。然后，将载体引入到用于纯化的柱中。在准备该柱之后，使其中分散有物质的液体通过柱。然后，所述物质结合至柱的内部，和/或所述物质的洗脱被延迟。由此，可以分离目标物质。
6-4.通过粒子的分离方法
在本发明的一个实施方案中，使用粒子，可以分离物质(具体地，含钼矿物，更具体地，辉钼矿)。首先，上述肽可以通过本领域已知的技术附着至粒子的表面。然后，可以将粒子引入到矿物分散体(其中分散有矿物粒子的液体)中。引入肽结合的粒子，然后将其暂时留置，粒子的表面上的肽结合至矿物粒子以发生聚集，然后沉淀。在此之后，可以回收在底部的沉淀的矿物。备选地，粒子可以是磁珠，并且无需等待沉淀，可以通过磁力回收矿物粒子。
6-5.用于泡沫浮选的方法
在本发明的一个实施方案中，使用捕收剂和/或起泡剂，可以分离物质(具体地，含钼矿物，更具体地，辉钼矿)。具体地，捕收剂和/或起泡剂通过本领域已知的技术结合至上述肽。然后，将结合的捕收剂和/或起泡剂引入到溶液中以进行搅拌(可以适当地引入其他试剂)，并且形成气泡。此后，将矿物粒子引入以被气泡俘获。由此，可以回收矿物粒子。备选地，肽本身可以用作捕收剂。
7.与矿物结合的选择性
上述肽具有这样的选择性特征，即它们能够牢固地结合至特定矿石，但是不结合至其他矿物。更具体地，它们能够牢固地结合至含钼矿物(例如，辉钼矿)，但是不结合至其他矿物如元素硫、黄铜矿、硫砷铜矿、黄铁矿(备选地，相比于含钼矿物的强度，能够以显著更低的强度结合至其他矿物)。因此，即使其是含钼矿物和其他矿物的混合物，也可以通过上述方法分离含钼矿物。
8.pH依赖性
在将上述肽结合至含钼矿物(例如，辉钼矿)的程序中，将液体的pH调节至特定范围可以增强结合(和聚集)。具体地，随着pH升高，液体的粒子分布中的粒子的最大尺寸可以增大。例如，在4至12的pH范围内，优选地在5以上的pH范围内，粒子的最大尺寸可以增大。
9.用于制备肽的方法
上述肽可以以多种方式制备。可以将编码至少上述肽中的任一个的DNA引入到表达载体中，并且可以将载体引入到微生物等中，以大规模地表达待回收的肽。
备选地，在制备在其表面上具有至少上述肽中的任一个的噬菌体(例如，M13-噬菌体)的情况下，可以利用噬菌体展示方法。在其表面上具有目标肽的微生物可以通过本领域已知的基因工程技术制备。
实施例
现在，经由以下工作实施例，更具体地描述本发明的上述实施方案，尽管本发明的范围不限于以下工作实施例。
(实施例1)经由噬菌体展示方法选择吸附辉钼矿的噬菌体
为了筛选能够吸附辉钼矿的肽，进行噬菌体展示方法。具体地，构建M13噬菌体文库，其中具有12个氨基酸的肽随机地结合至噬菌体。利用该文库，使研磨至75微米以下的粒度的辉钼矿与文库接触。然后，仅回收与辉钼矿结合的噬菌体，并且用回收的噬菌体感染大肠杆菌以再次生长噬菌体。此后，使噬菌体与辉钼矿再次接触，并且仅回收吸附的噬菌体。将这些吸附和回收(淘选)操作重复一定次数。分析所选择的噬菌体的DNA序列以鉴别结合至噬菌体的氨基酸序列。
在第一次筛选时，接触的辉钼矿的矿浆密度为300ppm并且将淘选重复5次。在第二次筛选时，辉钼矿的矿浆密度为3000ppm，并且将淘选重复4次。分析所得噬菌体的DNA序列并且鉴别具有符合以下氨基酸序列(A)和(B)的肽的噬菌体：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp
在下文中，将结合至肽(A)的噬菌体称为50-噬菌体，并且将结合至肽(B)的噬菌体称为M48-噬菌体。
(实施例2)用于能够结合至辉钼矿的噬菌体的ELISA分析
利用辉钼矿以及在实施例1中筛选的50-噬菌体和M48-噬菌体，通过ELISA方法(酶联免疫吸附测定)测量结合的量。具体地，将3000mg/L的辉钼矿悬浮，然后等分至96-孔微板的各个孔中。将各个噬菌体添加到各个孔中，并且将未结合的噬菌体洗出。此后，加入与酶(过氧化物酶)缀合的抗M13-噬菌体抗体，然后将未结合的抗-噬菌体抗体洗出。接下来，加入2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)，其是用于所述酶的底物。由ABTS消化导致的蓝色样品利用405nm的波长通过微板读数器进行分析。此外，在用其他矿物(元素硫、黄铜矿、硫砷铜矿和黄铁矿)替换的情况下，进行相同的程序。
图1示出了吸光度的比率。具体地，将在使不具有肽的M13-噬菌体(空-噬菌体)与辉钼矿接触的条件下的ELISA分析的吸光度视为100％(即，参考吸光度)。基于参考吸光度，计算每种矿物和具有各个肽的各个噬菌体的吸光度的量的比率(即，由“具有肽的噬菌体”与每种矿物结合的量与由“空-噬菌体”与辉钼矿结合的量的比率)。如图1所示，相对于其中将空-噬菌体与辉钼矿接触的情形，由50-噬菌体与辉钼矿结合的量更大，其为121％。M48-噬菌体的结合的量为106％。此外，由50-噬菌体和M48-噬菌体与其他矿物(元素硫、黄铜矿、硫砷铜矿和黄铁矿)结合的量显著低于辉钼矿的那些量。相比于由空-噬菌体结合的量，它们的结合量并未显著增大。因此，这表明了这两种噬菌体(更具体地，在这两种噬菌体的表面上表达的肽)特异性地结合至辉钼矿。
(实施例3)在密度为3g/L的辉钼矿的情况下测量沉淀率以及通过显微镜进行观察
在温度为30摄氏度的条件下，将粒度为75微米以下的辉钼矿悬浮于水中，使得矿浆密度为3g/L。将50-噬菌体和空-噬菌体各自添加到悬浮液中，使得各自密度为10^7-10^9pfu/ml。然后，在添加噬菌体后，利用分光光度计(波长660nm)每5秒测量悬浮液上部中的浊度一次。图2示出了浊度的变化(将添加噬菌体时(0秒)的浊度视为100％)。作为结果，当50-噬菌体以10^8pfu/ml的密度添加时，浊度快速下降，这表明辉钼矿的粒子快速沉淀。此外，在相同条件下通过光学显微镜观察辉钼矿的粒子(图3)，其证实当将50-噬菌体添加至辉钼矿时，辉钼矿的粒子更显著地发生聚集。这些结果表明可以通过以适当密度将50-噬菌体添加至辉钼矿的悬浮液来选择性地分离和回收辉钼矿的可能性。
(实施例4)在添加50-噬菌体时沉淀速度的测量以及通过显微镜的观察
除了辉钼矿的矿浆密度为10g/L以外，以与实施例3的那些相同的方式测量添加50-噬菌体之后的沉淀率。结果示于图4。在辉钼矿的矿浆密度为10g/L并且50-噬菌体的密度为10^9pfu/ml的条件下，显示出辉钼矿显著沉淀。
(实施例5)在添加50-噬菌体时的最大粒度的变化及其pH依赖性
在温度为30摄氏度的条件下，将粒度为75微米以下的辉钼矿悬浮于水中，使得矿浆密度为10g/L。向悬浮液添加50-噬菌体，使得50-噬菌体的密度为10^9pfu/ml。然后，利用NaOH和HCl将悬浮液的pH调节至预定值。通过仪器AcoustoSizerIIx(Kyowa InterfaceScience Co.,Ltd.)测量粒度。结果示于图5中。其示出了随着pH升高，最大粒度也增大。尤其是在pH为4以上的情况下，相比于其中仅含有辉钼矿的情形，添加50-噬菌体显著地增大了最大粒度。

Claims (8)

1.一种肽，所述肽包含符合下式(1)和/或(2)的氨基酸序列：
(1)(ALRKNMDFCPQSETGWHYIV)-(LIVFA)-(HPWRK)-(TSNQ)-(TSNQ)-(LIVFA)-(TSNQ)-(TSNQ)-(LIVFA)-(FYW)-(LIVFA)-(HPWRK)
(2)(LIVFA)-(RHK)-(TSNQ)-(LIVFA)-(LIVFA)-(TSNQ)-(LIVFA)-(LIVFA)-(LIVFA)-(RHK)-(RHK)-(HPW)
其中一个氨基酸分别选自由成对括号限定的各个组。
2.一种肽，所述肽至少包含以下序列(A)和(B)中的任一个：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp。
3.一种肽，所述肽符合以下序列(A)和(B)中的任一个：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp。
4.一种肽，所述肽包含与以下序列(A)和(B)中的任一个具有至少90％同一性的序列：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp。
5.一种肽，所述肽包含与以下序列(A)和(B)中的任一个具有至少95％同一性的序列：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp。
6.一种肽，所述肽包含与以下序列(A)和(B)中的任一个具有至少98％同一性的序列：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp。
7.一种肽，所述肽包含通过缺失、置换和/或添加1-5个氨基酸而衍生自至少以下序列(A)和(B)中的任一个的序列：
(A)Gly-Leu-His-Thr-Ser-Ala-Thr-Asn-Leu-Tyr-Leu-His
(B)Ile-Arg-Ser-Leu-Ile-Ser-Ile-Val-Leu-Arg-Arg-Trp。
8.一种用于选择矿物的组合物，所述组合物包含权利要求1-7中任一项所述的肽。
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