CN109867711A - 靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽及其制备方法和应用，制备方法包括如下步骤：(1)筛选微生物亲和多肽；(2)根据步骤(1)获得的亲和多肽的亲疏水性，设计一段与它的亲疏水性相反的短肽；(3)将短肽连接在亲和多肽的N端或C端。该段多肽属于生物基表面活性剂，对人体的累积毒性小；获得的表面活性剂样多肽可以在合适的水溶液中组装成胶束或者囊泡，具有均一的粒径分布；表面活性剂样多肽的中性水溶液可以有效的去除微生物生物被膜，与传统的化学基表面活性剂相比，在相同浓度下，具有更好的清除效率。这为开发新一代生物基表面活性剂提供了有效途径。
Description
技术领域
本发明属于物理化学领域，更具体地讲，涉及一种多肽类表面活性剂的结构及其应用。
背景技术
食源性疾病的发病率在过去的几年里有所增加，并成为全球主要的公共卫生问题。食源性致病微生物是导致食源性疾病的一个重要的诱因，因此，对食源性致病微生物进行分析检测、并控制其蔓延具有重要意义。大肠杆菌O157：H7是重要的食源性致病微生物，危害广泛，容易出现在蔬菜水果等食品中。大肠杆菌O157：H7难以清除是因为易于在食品及加工器械表面形成微生物的生物被膜，也称菌膜。
微生物(如细菌)能在固体表面结合、散播和生长，最终可形成一个生物被膜(菌膜)。菌膜是细菌在生长过程中为了适应生存环境而吸附于物体后形成的一种特殊的复合体，由细菌和自身分泌的多糖、蛋白质等胞外基质组成，是一个三维立体空间结构的生态系。菌膜常紧紧附着于活性或惰性实体的表面，使菌体免受干燥、UV辐射以及其他环境胁迫，同时也可以防护菌体免受植物的免疫反应和其免疫产物的影响。对食物进行常规清洗和灭菌处理的过程中，菌膜也使得菌体得以存活，对食品安全控制造成极大威胁。
当微生物受到各种压力，如低pH值，高渗透压，抗菌剂和抗生素时，为了抵抗不利的环境，微生物便以同样的方式生长形成生物被膜，这是微生物具有的一种非常重要的环境适应机制。菌体从最初游离状态开始经历了5个发育阶段：细胞可逆性黏附、细胞不可逆聚集、生物被膜的早期发育(微菌落扩增)、生物被膜稳定及生物被膜解离，并最终通过生物被膜裂解释放出浮游菌体启动下一轮生物被膜发育。同时，生物被膜作为一种微生物的主要生长状态，严重影响人类的健康，抵抗抗生素的作用，高达80％的细菌感染是由菌膜引起的。由菌膜导致的腐蚀和生物污损问题，严重降低了工业生产产率，并成为致病微生物传播的主要途径之一。
目前对于生物被膜的去除，最廉价简单的是清洗法，即直接用表面活性剂清洗。目前使用的表面活性剂，均是化学基产品，主要成分是直链烷基苯磺酸钠和脂肪醇醚硫酸钠。目前对化学表面活性剂的危害主要有两方面，一是残留性，有研究表明，使用化学基表面活性剂清洁后，在反复用水冲洗12次的情况下，仍然有0.03％的残留。另一方面是累积性，当人体摄入这种长链烷烃衍生物后，累积多年是否会引发不可逆的健康损害。因此急需一种非化学基的表面活性剂。近年来开发出的非化学基的表面活性剂主要是生物基表面活性剂，包括环肽类，脂肽类和两亲性多肽类。环肽类和脂肽类表面活性剂主要是微生物和昆虫的代谢产物，结构较复杂。两亲性多肽类表面活性剂结构上存在亲水头部和疏水尾部，模拟化学表面活性剂的结构，具有较高的可设计性。
在目前化学基表面活性剂有潜在毒性的情况下，继续开发一种多肽类表面活性剂，两亲性多肽是一种生物基表面活性剂，对人体的生物相容性好，具有很高的应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽。
本发明的第三个目的在于提供靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽在清除微生物中的应用。
为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)筛选微生物亲和多肽，所述亲和多肽包括测序得到的原始亲和多肽，和依据该筛选得到的原始亲和多肽的序列特征和亲和作用原理设计的系列亲和多肽，所述系列亲和多肽是指在筛选得到的原始亲和多肽的基础上删除或添加部分氨基酸残基、将序列中一个或几个氨基酸残基改变为相同性质的氨基酸残基；(2)根据步骤(1)获得的亲和多肽的亲疏水性，设计一段与它的亲疏水性相反的短肽；(3)将短肽连接在亲和多肽的N端或C端。
作为一个优选方案，所述微生物是大肠杆菌。
作为一个优选方案，所述大肠杆菌是O157：H7。
作为一个优选方案，微生物亲和多肽是筛选获得的原始亲和多肽VVSPDMNLLLTN、VFSSMVHVLNTH、GLHTSATNLYLH或者SGVYKVAYDWQH中的一条，或者依据该筛选得到的原始亲和多肽的序列特征和亲和作用原理设计的系列亲和多肽。
作为一个优选方案，所述短肽是2-4个相同或不同的极性氨基酸，所述极性氨基酸是指天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，组氨酸和精氨酸。
作为一个优选方案，所述短肽是3个相同或不同的极性氨基酸。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：利用上述制备方法制备获得的靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：上述靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽在清除微生物中的应用。
本发明的优点在于：通过筛选微生物亲和多肽，依据该筛选得到的亲和多肽的序列特征和亲和作用原理设计一系列短肽与之结合，本发明通过亲和大肠杆菌O157：H7的亲和肽，在其氨基酸序列N端或C端添加了2-4个极性氨基酸氨酸，获得了一段表面活性剂样多肽；该段多肽属于生物基表面活性剂，对人体的累积毒性小；获得的表面活性剂样多肽可以在合适的水溶液中组装成胶束或者囊泡，具有均一的粒径分布；表面活性剂样多肽的中性水溶液可以有效的去除微生物生物被膜，与传统的化学基表面活性剂相比，在相同浓度下，具有更好的清除效率。这为开发新一代生物基表面活性剂提供了有效途径。
附图说明
图1为多肽P1的结构模拟结果。
图2为多肽P2的结构模拟图。
图3为pH值为7时的临界胶束浓度为91mg/L。
图4为pH值为9时的临界胶束浓度为94mg/L。
图5为多肽P2在pH＝7，125mg/L时的透射电镜图。
图6为动态激光法测得的多肽P2组装体粒径(pH＝7，125mg/L)。
图7为多肽P2在pH＝9，125mg/L时的透射电镜图。
图8为动态激光法测得的多肽P2组装体粒径(pH＝9，125mg/L)。
图9为多肽P2的浓度对菌膜去除效果的影响。
图10为多肽P2不同浓度和不同pH条件下对菌膜清除效果。
图11为多肽P2与市售表面活性剂对菌膜的清除效果。
图12为正序多肽P2，逆序多肽P3和随机序多肽P4在不同浓度下对菌膜的清除效果。
图13为使用序列P7-P14的多肽(C端2-4个相同极性氨基酸)对菌膜进行清除效果的评价。
图14为使用序列P15-P32的多肽(C端3个随机极性氨基酸)对菌膜进行清除效果的评价。
图15为使用序列P33-P48的多肽(其他亲和肽在C端添加2-4个随机极性氨基酸)对菌膜进行清除效果的评价。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.设计表面活性剂样多肽，组装模式探究及对大肠杆菌O157：H7菌膜的清除
材料
酵母粉和蛋白胨购自于OXOID。乙醇购自于上海泰坦科技股份有限公司。结晶紫，磷钨酸购自于国药化学品集团，氯化钠，氯化铵，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，氯化钙，硫酸镁购自于上海凌峰化学试剂有限公司。芘购自于百灵威科技股份有限公司。
其他所有试剂均采用分析纯试剂。所有试剂均溶于超纯水(18.2MΩ@25℃)，来源于Millipore公司的Simplicity超纯水系统。
方法
1.表面活性剂样多肽的设计与合成
课题组前期筛选得到与大肠杆菌O157：H7亲和的多肽P1：SGVYKVAYDWQH，通过对其理化性质的分析，设计了一段表面活性剂样多肽P2：SGVYKVAYDWQHKKK。
多肽P2：SGVYKVAYDWQHKKK，P3：HQWDYAVKYVGSKKK和P4：ADWSYVQHGKVYKKK和FAM标记的多肽P5：FAM-SGVYKVAYDWQHKKK和P6：FAM-ADWSYVQHGKVYKKK交由多肽合成公司合成。多肽结构的预测使用PEP-FOLD server(http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD/#Features)。
2.临界胶束浓度的测定
表面活性剂样多肽组装后的临界胶束浓度通过芘疏水探针法测定，取0.1mL芘的丙酮溶液(6*10-6mol/L)于试管中，将试管置于暗处过夜使得溶剂挥发。随后在试管中加入浓度为0-1000mg/L的多肽P2水溶液，将试管置于37℃摇床轻轻震荡数小时。将试管取出，置于37℃恒温水浴中过夜以达到芘的平衡。取100μL不同浓度的多肽-芘溶液至黑色酶标板中，使用荧光分光光度计测定其荧光强度，激发光波长为334nm，记录范围为340-440nm。以第三个振动峰和第一个振动峰的比值为纵坐标轴，以10位底数的浓度对数为横坐标轴作图，CMC的值通过在低浓度时曲线的横向和纵向斜切的交点得到。
3.胶束形成和粒度分布
将多肽P2溶于超纯水或10mmol/L的磷酸缓冲液中得到胶束，表观胶束大小和粒径分布通过动态光散射方法测得，使用英国Malvern公司的Zetasizer Nano ZS仪器。
4.透射电镜观察胶束形态
将多肽P2溶于超纯水中，取200目碳膜铜网，滴加20μL的P2溶液，半干时滴加一滴2％的磷钨酸溶液，于空气中干燥。使用日本电子JEM-1400观察胶束的组装形态，加速电压为120kV。
5.大肠杆菌O157:H7生物被膜的形成
大肠杆菌O157:H7(ATCC 700728)购自于中国工业微生物菌种保藏中心。大肠杆菌的培养使用LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％氯化钠)培养。取菌种于LB-琼脂固体平板划线，挑取单菌落于LB液体培养基中，37℃，230rpm过夜培养。将100μL菌液稀释1000倍，接种于无菌96孔板中，37℃静置培养4小时，随后去除培养基，每孔加入100μL无菌生理盐水清洗，去除生理盐水，加入100μL MM培养基，继续于37℃静置培养24小时以上。
6.表面活性剂样多肽溶液对大肠杆菌O157:H7生物被膜的清除实验
将多肽P2溶于水或10mmol/L的磷酸缓冲液中，制成0-1000mg/L的多肽溶液。生物被膜形成后，去除培养基，使用生理盐水冲洗生物被膜，加入30μL多肽溶液，室温下震荡30分钟，超声清洗30秒。随后使用100μL生理盐水冲洗96孔板，并置于空气中干燥。每孔中加入100μL的0.5％结晶紫溶液，染色20分钟，随后去除过量的结晶紫，最后用100μL的75％乙醇脱色，使用酶标仪测定溶液在595nm处的吸光度。
实验结果：
1.表面活性剂样多肽的设计和结构预测
课题组前期筛选得到亲和大肠杆菌O157:H7的多肽P1：SGVYKVAYDWQH，通过对多肽理化性质的分析，P1具有较强的疏水性，于是便设计了一条表面活性剂样多肽P2：SGVYKVAYDWQHKKK。并用PEP-FOLD server对多肽的结构进行了预测，结果如图1，图2所示。
2.胶束形成和表征
测定了表面活性剂样多肽在pH值为7和pH值为9时的临界胶束浓度，结果如图3和图4所示，pH值为7时的临界胶束浓度为91mg/L，pH值为9时的临界胶束浓度为94mg/L
3.组装体形貌观察和粒径分布
使用透射电镜观察pH值为3,7,9时不同浓度表面活性剂样多肽的组装体形貌，图5是P2浓度为125mg/L，pH值为7时的透射电镜图，组装的胶束大小为70nm，部分囊泡的大小为100nm，组装体分布均匀，图6是用动态光散射法测得的组装体粒径大小为110nm(PDI0.173)。图7是P2浓度为125mg/L，pH值为9时的透射电镜图，组装的胶束大小为100nm，分布不均匀，图8是用动态光散射法测得的组装体粒径大小为122nm(PDI 0.191)。
4.表面活性剂样多肽对大肠杆菌O157：H7生物被膜的清除效果
图9是不同浓度多肽P2对生物被膜清除效率图，在pH＝7的水溶液中，当多肽浓度超过其临界胶束浓度时，清除效率显著提高，在浓度为125mg/L时对菌膜的清除效率最高，达到了约75％，最后随着浓度的增大依次下降。
图10是多肽P2不同浓度下不同pH对生物被膜清除效果的影响，可以看到当浓度为125mg/L时，清除效率随着pH值的增大而变大，在pH＝7的环境下，生物被膜的清除效率最高，随后降低。
图11是市售不同清洗剂和多肽对生物被膜清洗效果的评价，可以看到表面活性剂样多肽在浓度为125mg/L时有最好的清除效果，随着浓度的增加效果降低，SDS也是在125mg/L时有最好的菌膜清除效果，随着浓度的增加效果降低，CDEA和Tween-20没有显示出清除效果对浓度的依赖性
图12是选用了逆序多肽P3和随机序多肽P4，比较其对菌膜的清除效果，可以看到在125mg/L时，正序多肽P2有最好的清除效果，逆序多肽P3有比较好的清除效果，而随机序多肽P4的效果较差。
5.不同极性氨基酸序列的多肽对菌膜的清除效果
序列P7-P14的多肽(C端2-4个相同极性氨基酸)对菌膜清除效果的评价如图13所示，组和组之间不存在明显差异，清除效果大于60％。
序列P15-P32的多肽(C端3个随机极性氨基酸)对菌膜清除效果的评价如图14所示，组和组之间不存在明显差异，清除效果大于60％。
序列P33-P48的多肽(其他亲和肽在C端添加2-4个随机极性氨基酸)对菌膜清除效果的评价如图15所示，组和组之间不存在明显差异，清除效果大于50％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽及其制备方法和应用
<130> /
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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1 5 10
<210> 44
<211> 14
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 44
Val Val Ser Pro Asp Met Asn Leu Leu Leu Thr Asn His Arg
1 5 10
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 45
Val Val Ser Pro Asp Met Asn Leu Leu Leu Thr Asn Arg Arg Lys Lys
1 5 10 15
<210> 46
<211> 16
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 46
Val Val Ser Pro Asp Met Asn Leu Leu Leu Thr Asn His His Arg Arg
1 5 10 15
<210> 47
<211> 16
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 47
Val Val Ser Pro Asp Met Asn Leu Leu Leu Thr Asn His Arg Lys Arg
1 5 10 15
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 48
Val Val Ser Pro Asp Met Asn Leu Leu Leu Thr Asn Lys Arg His Arg
1 5 10 15
Claims (8)
1.靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)筛选微生物亲和多肽，所述亲和多肽包括测序得到的原始亲和多肽，和依据该筛选得到的原始亲和多肽的序列特征和亲和作用原理设计的系列亲和多肽，所述系列亲和多肽是指在筛选得到的原始亲和多肽的基础上删除或添加部分氨基酸残基、将序列中一个或几个氨基酸残基改变为相同性质的氨基酸残基；(2)根据步骤(1)获得的亲和多肽的亲疏水性，设计一段与它的亲疏水性相反的短肽；(3)将短肽连接在亲和多肽的N端或C端。
2.根据权利要求1所述的靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽的制备方法，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌是O157：H7。
4.根据权利要求3所述的靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽的制备方法，其特征在于，微生物亲和多肽是筛选获得的原始亲和多肽VVSPDMNLLLTN、VFSSMVHVLNTH、GLHTSATNLYLH或者SGVYKVAYDWQH中的一条，或者依据该筛选得到的原始亲和多肽的序列特征和亲和作用原理设计的系列亲和多肽。
5.根据权利要求1所述的靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽的制备方法，其特征在于，所述短肽是2-4个相同或不同的极性氨基酸，所述极性氨基酸是指天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，组氨酸和精氨酸。
6.根据权利要求1所述的靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽的制备方法，其特征在于，所述短肽是3个相同或不同的极性氨基酸。
7.利用权利要求1—6任一所述制备方法制备获得的靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽。
8.权利要求7所述靶向微生物生物被膜的表面活性剂样多肽在清除微生物中的应用。
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