JP2015023831A - アスコルビン酸トランスポーター - Google Patents

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Yoshinori Moriyama
芳則 森山
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Takaaki Miyachi
孝明 宮地
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Hiroshi Omote
弘志 表
崇 黒森
Takashi Kuromori
崇 黒森
篠崎　一雄
Kazuo Shinozaki
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Abstract

【課題】植物にストレス耐性、特に光ストレス耐性および酸化ストレス耐性を付与する新たな手法を提供する。
【解決手段】アスコルビン酸を葉緑体に輸送するトランスポーターを同定し、植物への耐性付与におけるその役割を明らかにした。アスコルビン酸トランスポーターおよびアスコルビン酸トランスポーターをコードする遺伝子を利用する本発明によって、植物にストレス耐性、特に光ストレス耐性および酸化ストレス耐性を付与する組成物および方法が提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、アスコルビン酸トランスポータータンパク質およびアスコルビン酸トランスポーターをコードする遺伝子に関連する。本発明はさらに、植物にストレス耐性（特に、光ストレスおよび／または酸化ストレスに対する耐性）を付与するための組成物および方法に関連する。
植物はアスコルビン酸を生合成し、目的の場所（葉緑体）に運び、さまざまな生理作用を発揮する。特に、葉緑体における酵素反応の補酵素や抗酸化作用（活性酸素の除去）としての役割はその典型例である。
アスコルビン酸を利用する酵素および／または変異酵素として、変異型アスコルビン酸パーオキシダーゼ（特許文献１）、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ（特許文献２）、および、ビオラキサンチンデエポキシダーゼ（特許文献３）が知られている。これら酵素および／または変異酵素を用いて植物にストレス耐性を付与することが試みられている。しかしながら、その効果は十分ではなく、また、植物のストレス耐性のメカニズムには不明な点が多い。
特開２００６−２９６２０９ 特開２００８−２５３２４８ 特表２０００−５０００１６
植物にストレス耐性、特に光ストレス耐性および酸化ストレス耐性を付与する新たな手法を提供することを、本発明の課題とする。
上記課題は、アスコルビン酸を葉緑体に輸送するトランスポーターを同定し、植物への耐性付与におけるその役割を明らかにしたことによって、解決された。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１） 植物にストレス耐性を付与するための組成物であって、以下：
（ａ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）配列番号１に記載の核酸配列からなる核酸、
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
からなる群から選択される、核酸を含む、組成物。
（項目２） 項目１に記載の組成物であって、配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸を含む、組成物。
（項目３） 植物にストレス耐性を付与するための方法であって、以下：
（１）
（ａ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）配列番号１に記載の核酸配列からなる核酸、
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
からなる群から選択される、核酸を植物に導入する工程、
を包含する、方法。
（項目４） 項目３に記載の方法であって、前記植物に導入される核酸が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸である、方法。
（項目５） 植物体にストレス耐性を付与するための方法であって、以下：
（１）
（ａ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）配列番号１に記載の核酸配列からなる核酸、
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
からなる群から選択される、核酸を植物細胞に導入する工程、ならびに、
（２）
工程（１）で得られた植物細胞から植物体を再生する工程、
を包含する、方法。
（項目６） 項目５に記載の方法であって、前記植物細胞に導入される核酸が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸である、方法。
（項目７） 発現ベクターであって、
以下：
（１）
（ａ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）配列番号１に記載の核酸配列からなる核酸、
（ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
からなる群から選択される、核酸、ならびに、
（２）
上記（１）の核酸と作動可能に連結された転写翻訳調節配列
を含む、発現ベクター。
（項目８） 項目７に記載の発現ベクターであって、前記（１）の核酸が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸である、発現ベクター。
（項目９） 植物細胞であって、項目７または８に記載の発現ベクターを含む、植物細胞。
（項目１０） 植物体であって、項目７または８に記載の発現ベクターを含む、植物体。
（項目１１） 項目９に記載の植物細胞から再生された植物体。
（項目１２） 項目１０または１１に記載の植物体の、後代または交雑株。
（項目１３） 項目１０または１１に記載の植物体から得られた植物細胞、あるいは、項目１２に記載の後代または交雑株から得られた植物細胞。
本発明の遺伝子を植物に導入することによって、植物にストレス耐性、特に光ストレス耐性および酸化ストレス耐性を付与することが可能となった。本発明は、植物にストレス耐性を付与するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、ストレス耐性が付与された植物細胞、および、植物体を提供する。
図１Ａは、アスコルビン酸輸送活性測定の結果を示すグラフである。三角（△）は、アスコルビン酸トランスポーターを再構成していないリポソームを用いた結果である。白丸（○）は、アスコルビン酸トランスポーターを再構成した再構成プロテオリポソームを用い、バリノマイシンを添加しなかった結果である。黒丸（●）は、アスコルビン酸トランスポーターを再構成した再構成プロテオリポソームを用い、バリノマイシンを添加した結果である。 図１Ｂは、アスコルビン酸輸送活性測定の結果を示すグラフである。白丸（○）は、アスコルビン酸トランスポーターを再構成した再構成プロテオリポソームを用い、バリノマイシンを添加しなかった結果である。黒丸（●）は、アスコルビン酸トランスポーターを再構成した再構成プロテオリポソームを用い、バリノマイシンを添加した結果である。図に示す種々の濃度の塩素イオンを用いた。 図１Ｃは、アスコルビン酸輸送活性測定の結果を示すグラフである。本発明のトランスポーターによる［１４Ｃ］−アスコルビン酸の輸送（左）は、コールドのアスコルビン酸によって競合的に阻害されたが（中央）、コールドのデヒドロアスコルビン酸によっては阻害されなかった（右）。 図２Ａは、野生型植物と欠損型（ノックアウト変異体）植物との生育を比較した写真である。両者に実質的な差異はなかった。 図２Ｂは、欠損型（ノックアウト変異体）植物がアスコルビン酸トランスポーターを発現していないことを示す結果である。 図２Ｃは、野生型植物と欠損型（ノックアウト変異体）植物との強光ストレス時のクロロフィル蛍光と吸収による光合成測定の結果を示すグラフである。 図２は、アスコルビン酸トランスポーターノックアウト植物の解析結果を示す。図２Ｄは、光照射時において、アスコルビン酸トランスポーター欠損植物ではゼアキサンチン生成量が著しく低下していたことを示す。 図３は、図１と図２の結果から考えられるアスコルビン酸トランスポーターの生理的意義を示す模式図である。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において使用される用語「ストレス」とは、環境からうけるあらゆるストレスをいう。ストレスとしては、例えば高温、低温、低ｐＨ、低酸素、酸化、塩、浸透圧、乾燥、水、冠水、カドミウム、銅、オゾン、大気汚染、紫外線、光（強光および／または弱光）、病原体、病原菌、害虫、除草剤、老化が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用される用語「ストレス耐性を付与する」とは、ストレス存在下において損なわれた健全な生育（例えば、生育速度の低下、および／または、生育程度の低下）が、ストレス非存在下での生育に近づくことをいう。
本明細書において使用される用語「トランスポーター」とは、脂質二重膜を透過できない物質（例えば、アスコルビン酸などの有機酸）を、脂質二重膜を越えて輸送する物質をいう。典型的には、トランスポーターは、脂質二重膜中に存在する膜タンパク質である。タンパク質であるトランスポーターは、本明細書において「輸送タンパク質」と互換可能に使用される。
本明細書において使用される用語「輸送活性」とは、脂質二重膜を透過できない物質（例えば、アスコルビン酸などの有機酸）を、脂質二重膜を越えて輸送する活性をいう。アスコルビン酸の輸送活性を本明細書において「アスコルビン酸輸送活性」という。
本明細書において使用される用語「人工膜」とは、脂質を原料として人工的に調製された膜であり、好ましくは、脂質二重膜であるがこれに限定されない。「人工膜」としては、例えば、リポソームが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書において使用される用語「アスコルビン酸輸送タンパク質の活性調節剤」とは、アスコルビン酸輸送タンパク質の輸送活性に影響を与える物質をいう。「アスコルビン酸輸送タンパク質の活性調節剤」は、輸送活性を促進する物質であっても、阻害する物質であってもよい。
本願明細書において使用する場合、特に他で示さない限り、「植物」は、植物体、植物器官、植物組織、植物細胞、および種子のいずれをも意味する。本発明の植物は、トランスジェニック植物であっても、そうでなくてもよいが、好ましくは、トランスジェニック植物である。植物器官の例としては、根、葉、茎、および花などが挙げられる。植物細胞の例としては、カルスおよび懸濁培養細胞が挙げられる。特定の実施形態では、植物は、植物体を意味し得る。本発明において使用され得る植物種の例としては、シロイヌナズナに限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアスコルビン酸トランスポーターを有する植物が包含され、例えば、ポプラ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、トウゴマ、ウマゴヤシ、ブドウ、ヤマカモジグサ、モロコシ属が挙げられるがこれらに限定されない。
本願明細書において使用する場合、トランスジェニック植物の後代などの本発明の「後代」は、植物もしくはトランスジェニック植物から生まれる、植物もしくはトランスジェニック植物により生じる、または植物もしくはトランスジェニック植物に由来するものである。従って、「後代」植物、すなわち、「Ｆ１」世代植物は、発明の方法により作製されたトランスジェニック植物の子孫(offspringおよび／またはdescendant)である。トランスジェニック植物の後代は、本明細書に記載された方法により親のトランスジェニック植物の細胞へ組み込まれた所望のポリヌクレオチドをその細胞ゲノムの少なくとも１つ、一部、または全部に含まれうる。従って、所望のポリヌクレオチドは、後代植物により「伝達される」または「受け継がれる」。本明細書に用いられる場合の用語「後代」はまた、一群の植物の子孫(offspringおよび／またはdescendant)であるとみなされうる。
本願明細書において使用する場合、「交雑体」とは、植物を「交雑」することによって得られる後代をいう。植物を交雑する方法は、周知であり、例えば、次の工程を実施することによって行うことができる：（ａ）第１（出発系統）および第２（所望の変異、トランスジーンおよび／または対立遺伝子を含むドナー植物系統）親植物の種子を植え；（ｂ）第１および第２の親植物の種子を、開花植物へと成長させ；（ｃ）第１の親植物からの花を、第２の親食物からの花粉で受粉させ；次いで（ｄ）受精させた花を開花させる親植物で生産された種子を収穫する。
本願明細書において使用する場合、植物の「再生」とは、個体の一部分から個体の全体が復元されることをいう。植物体において、個体の一部分には細胞も含まれ、そのほかには葉、葉柄、根、カルス等の組織片も含まれる。再生の方法は、植物種によって最適条件は異なるが、当該分野においては周知の技術である。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖形態、二本鎖形態、または他の形態である、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、もしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン（ＤＮＡ分子」）、またはそれらの任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）を指し得る。
「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）中の一連のヌクレオチド塩基（「ヌクレオシド」とも呼ばれる）であり、２つの以上のヌクレオチドの任意の鎖またはその相補鎖を意味する。本発明の好ましい核酸は、配列番号１に示される核酸、ならびにその相補鎖、改変体およびフラグメントを包含する。改変体としては、配列番号１に示される核酸配列に対して、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、または、９８％以上の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、改変体としては、配列番号１に示される核酸配列に対して、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、または、９８％以上の同一性を有する核酸配列からなる核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、改変体としては、配列番号１に示される核酸配列に対して、７０％以上の相同性、７５％以上の相同性、８０％以上の相同性、８５％以上の相同性、９０％以上の相同性、９５％以上の相同性、または、９８％以上の相同性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、改変体としては、配列番号１に示される核酸配列からなる核酸に対して高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であってアスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質をコードする核酸、または、配列番号１に示される核酸配列からなる核酸に対して中程度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であってアスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられるがこれらに限定されない。
「相補鎖」とは、ある核酸配列に対して塩基対を形成し得るようなヌクレオチドの鎖を意味する。例えば、二本鎖ＤＮＡの各々の鎖は互いに相補的な塩基配列を有し、一方の鎖から見て他方の鎖は相補鎖である。
「コード配列」または発現生成物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、もしくは酵素）を「コードする」配列は、発現された場合にその生成物の生成をもたらすヌクレオチド配列である。
「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の連続列を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２に示されるペプチド、ならびにその改変体およびフラグメントを包含する。改変体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、または、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、アスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、改変体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性、７５％以上の同一性、８０％以上の同一性、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、または、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、アスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、改変体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性、７５％以上の相同性、８０％以上の相同性、８５％以上の相同性、９０％以上の相同性、９５％以上の相同性、または、９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質であって、アスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、改変体としては、配列番号１に示される核酸配列からなる核酸に対して高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であってアスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質をコードする核酸によってコードされるタンパク質、または、配列番号１に示される核酸配列からなる核酸に対して中程度にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であってアスコルビン酸輸送活性を有するタンパク質をコードする核酸によってコードされるタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
「タンパク質配列」、「ペプチド配列」、または「ポリペプチド配列」または「アミノ酸配列」は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中にある一連の２つ以上のアミノ酸を指す。
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。また、本明細書において配列（核酸配列、アミノ酸配列など）の同一性とは、２以上の対比可能な配列の、互いに対する同一の配列（個々の核酸、アミノ酸など）の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて相同性と同一性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、相同性と同一性とは同じ数値を示す。
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて算出される。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５
Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容する。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどのタンパク質をコードする天然の核酸は、例えば、配列番号１の核酸配列の一部またはその改変体を含むＰＣＲプライマーおよびハイブリダイゼーションプローブを有するｃＤＮＡライブラリーから容易に分離される。配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で７％ ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列番号１に示す配列またはその一部とハイブリダイズし得る。
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列（他の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする）と比較したときに、付加または欠失（すなわちギャップ）が含まれる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−２４４８、 Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
（１） ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２） ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３） ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４） ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリー配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５） ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ： Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プライマーとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、最も好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１〜数個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、もしくは、１個であり得る。そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ ＥＳ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
本明細書において核酸の存在を確認するには、放射能法、蛍光法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され得る。
本発明の遺伝子は、ｓｉＲＮＡを用いてその発現をノックダウン（抑制）することが可能である。所定の遺伝子からｓｉＲＮＡを調製する方法は周知であり、例えば、当該分野で公知のｓｉＲＮＡ提供業者（例えば、株式会社 ニッポンイージーティー、富山、日本）により、アニーリングしている２本鎖の合成ｓｉＲＮＡを入手することができる。その合成ｓｉＲＮＡをＲＮＡｓｅフリーの溶液に溶解し、最終濃度が２０μＭになるように調整し、その後細胞へ導入する。ｓｉＲＮＡを調製する場合には、例えば、（１）ＧまたはＣが連続して４つ以上存在しない、（２）ＡまたはＴが連続して４つ以上存在しない、（３）ＧあるいはＣが９塩基以上存在しない、などの条件を加えてもよい。本発明のｓｉＲＮＡは、１９塩基長、２０塩基長、２１塩基長、２２塩基長、２３塩基長、２４塩基長、２５塩基長、２６塩基長、２７塩基長、２８塩基長、２９塩基長、または３０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡは、好ましくは、１９塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２０塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２１塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２２塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２３塩基長である。本発明のｓｉＲＮＡはまた、好ましくは２４塩基長である。
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列中の情報が明らかになるのを可能にすることまたはそれを引き起こすこと（例えば、対応する遺伝子の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、タンパク質を生成すること）を意味する。ＤＮＡ配列は、細胞中でかまたは細胞によって、「発現生成物」（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはタンパク質）を形成するように発現される。その発現生成物自体はまた、その細胞によって「発現される」と言われ得る。
用語「形質転換」とは、核酸を細胞中に導入することを意味する。導入される遺伝子または配列は、「クローン」と呼ばれ得る。その導入されるＤＮＡまたはＲＮＡを受ける宿主細胞は、「形質転換」されており、これは、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、任意の供給源由来であり得、宿主細胞と同じ属または種の細胞由来であっても、異なる属または種の細胞由来であってもよい。
用語「ベクター」は、宿主を形質転換し、必要に応じて導入された配列の発現および／または複製を促進するように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が宿主細胞中に導入され得る媒体（例えば、プラスミド）を包含する。
本発明において使用され得るベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡフラグメント、および宿主ゲノム中への核酸の導入を促進し得る他の媒体が挙げられる。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるが、同様の機能を提供しかつ当該分野で公知であるかまたは公知となる他のすべての形態のベクターが、本明細書中で野使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら、（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ １９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
用語「発現系」とは、適切な条件下で、そのベクターにより保有されて宿主細胞中に導入されるタンパク質または核酸を発現し得る、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物宿主細胞およびベクターが挙げられる。
本発明の配列番号２に記載のポリペプチドをコードする核酸の発現は、好ましくは真核生物細胞において従来の方法によって実行され得る。核酸を発現するために適切な宿主細胞としては、高等真核生物が挙げられ、好ましくは、植物細胞である。
高等真核生物組織培養細胞もまた、本発明の配列番号２に記載のポリペプチドの組換え生成のために使用され得る。任意の高等真核生物組織培養細胞株（昆虫バキュロウイルス発現系が挙げられる）が使用され得るが、植物細胞が、好ましい。そのような細胞株のための発現ベクターは、通常は、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使用される場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結部位を含む。これらのベクターはまた、通常は、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを保有する、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスであり得る。発現ベクターの例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ（Ｏｋａｙａｍａら、（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：１１３６）、ｐＭＣ１ｎｅｏ Ｐｏｌｙ−Ａ（Ｔｈｏｍａｓら、（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３）、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびそれらの誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０）が挙げられる。
本発明はまた、本発明の配列番号２に記載のポリペプチドおよび配列番号１に記載のポリヌクレオチドと、第２ポリペプチド部分もしくは第２ポリヌクレオチド部分（「タグ」と呼ばれ得る）とを含む、融合物を包含する。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを、発現ベクター中に挿入することによって、簡便に構築され得る。本発明の融合物は、精製または検出を容易するタグを含み得る。そのようなタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、セルロース結合タンパク質（ＣＢＰ）タグ、およびｍｙｃタグが挙げられる。検出可能なタグ（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１３ｍＩｎ、７６Ｂｒ、６７Ｇａ、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎおよび６８Ｇａ）もまた、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを標識するために使用され得る。このような融合物を構築および使用するための方法は、当該分野で周知である。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウムを介する形質転換、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
（アスコルビン酸トランスポーターの活性調節剤のスクリーニング法）
本発明のタンパク質を使用する種々の方法によって、アスコルビン酸トランスポーターの活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。例えば、
（ａ）リポソームに本発明の膜タンパク質を再構成し、さらに、バリノマイシンを添加し、
（ｂ）そのリポソームに（１）放射性標識したアスコルビン酸のみ、（２）放射性標識したアスコルビン酸と候補薬剤をそれぞれ添加してインキュベートし、
（ｃ）リポソームを遠心して沈澱させ、（１）の場合と（２）の場合とで、そのリポソームに取り込まれた放射性標識アスコルビン酸の量を比較し、
（ｄ）その候補薬剤がアスコルビン酸輸送活性に影響を与えたか否かを決定する
ことによって、アスコルビン酸輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。
あるいは、
（ａ）本発明の膜タンパク質を発現する細胞を調製し（例えば、本発明の遺伝子を用いて形質転換する）、
（ｂ）その細胞に、（１）放射性標識したアスコルビン酸のみ、（２）放射性標識したアスコルビン酸と候補薬剤をそれぞれ添加してインキュベートし、
（ｃ）細胞を破壊し、膜画分を調製し、（１）の場合と（２）の場合とで、膜画分に存在する放射性標識アスコルビン酸の量を比較し、
（ｄ）その候補薬剤がアスコルビン酸輸送活性に影響を与えたか否かを決定する
ことによって、アスコルビン酸輸送タンパク質の活性調節剤をスクリーニングすることが可能である。
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
（実施例１：アスコルビン酸トランスポーターのクローニング）
Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｇａｔｅｗａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（インビトロジェン Ｎｏ． １１８２７−０１１）を用い、アクセッション番号ＮＭ＿１１６２６１．４の核酸配列に基づいて、アスコルビン酸トランスポーターｃＤＮＡのクローニングおよび発現用ウイルスベクターを調製した。アスコルビン酸トランスポーターのアミノ末端領域には、６×ヒスチジンタグを付加した。
（実施例２：アスコルビン酸トランスポーターの精製）
遺伝子組換えバキュロウイルス（トランスポーターを大量発現するよう改変）をＨｉｇｈ５細胞（昆虫細胞）にＭＯＩ＝１で感染させ、トランスポーターを大量発現させた。これを超音波破砕（ＯＵＴＰＵＴ４、３０秒８回）（ＴＯＭＹ ＵＤ２００チップソニケーター）し、超遠心（１６，０００ｘｇ、１時間、４℃）した。沈殿物（膜画分）を２％オクチルグルコシド（ＯＧ：界面活性剤）緩衝液にて可溶化し、超遠心（２６，０００ｘｇ、３０分、４℃）した。上清をＮｉ−ＮＴＡアフィニティー樹脂１ｍＬと混和し、４℃、４時間インキュベートした。この樹脂を洗浄液２０ｍＬにて洗浄し、６０ｍＭイミダゾールを添加し、アスコルビン酸トランスポーターを得た。
２％オクチルグルコシド緩衝液は、２％ オクチルグルコシド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、および、１０％ グリセロールを含む。洗浄液は、１％ オクチルグルコシド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、および、２０％ グリセロールを含む。溶出液は、２％ オクチルグルコシド、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、２０％ グリセロール、および、６０ｍＭ イミダゾールを含む。
（実施例３：アスコルビン酸トランスポーターの人工膜小胞への再構成）
２０μｇの精製アスコルビン酸トランスポーターとＬ−ａ−ホスファチジルコリンＴｙｐｅＩＩ−Ｓ（シグマ Ｎｏ．Ｐ−５６３８）から調製した５００μｇの人工膜小胞を混和し、−８０℃にて１５分、凍結し、素早く溶かし、再構成バッファーにて界面活性剤にて３０倍希釈し、超遠心（２００，０００ｘｇ、１時間、４℃）した。沈殿物を再構成バッファーにて懸濁し、プロテオリポソームを調製した。
再構成バッファーは、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、および、５ｍＭ 酢酸マグネシウムを含む。
（実施例４：アスコルビン酸輸送活性測定）
反応液に２μＭ バリノマイシン、１００μＭ ［１４Ｃ］−アスコルビン酸を添加し、２７℃でインキュベートした。これに再構成プロテオリポソームを添加し、１、２、５分後にセファデックスＧ−５０カラム（ＧＥヘルスケア）へ添加し、遠心（７００ｘｇ，２分，４℃）した。溶出液を液体シンチレーションカウンター（パーキンエルマー社製）にて放射能測定し、輸送されたアスコルビン酸を定量した。駆動力の原理はカリウムイオノファであるバリノマイシンを添加すると、カリウムが外から内に流入し、外に比べ内側が＋電荷を帯びることとなる。反応液は、２０ｍＭ ＭＯＰＳ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ 酢酸カリウム、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、および、４ｍＭ ＫＣｌを含む。
結果を図１に示す。三角（△）は、アスコルビン酸トランスポーターを再構成していないリポソームを用いた結果であり、白丸（○）は、アスコルビン酸トランスポーターを再構成した再構成プロテオリポソームを用い、バリノマイシンを添加しなかった結果であり、黒丸（●）は、アスコルビン酸トランスポーターを再構成した再構成プロテオリポソームを用い、バリノマイシンを添加した結果である。配列番号１によってコードされるタンパク質は、アスコルビン酸を特異的に輸送する活性を示した（図１Ａ）。また、この輸送活性は、塩素イオンの存在によって活性化された（図１Ｂ）。反応液に、過剰量（１ｍＭ）のコールドのアスコルビン酸を添加すると、競合的阻害によって、［１４Ｃ］−アスコルビン酸の輸送が阻害された（図１Ｃ中央）。その一方で、過剰量（１ｍＭ）のデヒドロアスコルビン酸を添加しても、［１４Ｃ］−アスコルビン酸の輸送は阻害されなかった（図１Ｃ右）。この結果は、本発明のトランスポーターがアスコルビン酸特異的トランスポーターであることを示す。
（実施例５：植物材料と遺伝子型の決定）
植物体は、鉢植えして、よく水をあげた状態で、室温２２°Ｃ、蛍光灯下１６時間明／８時間暗のサイクルで生育させた。シロイヌナズナのｐｈｔ４；４−１（ＥＴ４９７０）変異体とｐｈｔ４；４−２（ＧＴ５０３９）変異体は、ＬａｎｄｓｂｅｒｇエコタイプのＤｓトランスポゾン挿入体であり、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）から購入した。
シロイヌナズナからのゲノムＤＮＡ抽出には、自動核酸抽出システム（ＰＩ−５０ａｌｐｈａ、クラボー）を用いた。変異体の遺伝子型の決定はゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲ法により行った。その際、以下のプライマーを用いた。ＰＨＴ４＿Ｌ２（配列番号３：５’−ＡＴＧＧＡＧＡＴＧＣＧＴＴＣＴＧＴＡＧＡＴＴ−３’）、ＰＨＴ４＿Ｒ（配列番号４：５’−ＧＧＴＴＣＣＡＡＣＧＡＧＴＡＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’）、Ｄｓ３−４（配列番号５：５’−ＣＣＧＴＣＣＣＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧ−３’）、Ｄｓ５−３（配列番号６：５’−ＴＡＣＣＴＣＧＧＧＴＴＣＧＡＡＡＴＣＧＡＴ−３’）。
シロイヌナズナからのＲＮＡ抽出には、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲは、上記のプライマーＰＨＴ４＿Ｌ２とＰＨＴ４＿Ｒを用いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（タカラバイオ）により行った。また発現している遺伝子のコントロールとしてＡｃｔｉｎ２遺伝子を用いるため、以下のプライマーを使用した。Ａｃｔｉｎ２ＲＴ−Ｆ（配列番号７：５’−ＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＡＴＡＣＴＣＧ−３’）、および、Ａｃｔｉｎ２ＲＴ−Ｒ（配列番号８：５’−ＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴ ＴＣＣ−３’）。
結果を図２Ａおよび図２Ｂに示す。ｐｈｔ４；４−１（ＥＴ４９７０）変異体（図２Ｂの欠損株１）とｐｈｔ４；４−２（ＧＴ５０３９）変異体（図２Ｂの欠損株２）のいずれも、Ａｃｔｉｎ２遺伝子を正常に発現したが、アスコルビン酸トランスポーターを発現していなかった。図２Ａに示すように、いずれの欠損株（ノックアウト変異体）も、正常に成長した。
（実施例６：クロロフィル蛍光測定）
葉緑体における光合成活性を調べるために、ＦｌｕｏｒＣａｍ ７００ＭＦ（Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｄｒａｓｏｖ，Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）を用いてクロロフィル蛍光測定を行った。播種後４週齢の植物体に５時間の強光処理（１，７００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２ ｓ１）を行い、ロゼット葉を１２穴マルチタイタープレートに並べた。１５分の暗処理後、飽和光パルスを与えてから作用光（２２０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２ ｓ１）を５分間当てた。Ｆｍを暗処理後の最大ＰＳＩＩ蛍光、Ｆｍ’を光処理後の最大ＰＳＩＩ蛍光とすると、ＮＰＱの値は（Ｆｍ−Ｆｍ’）／Ｆｍ’として計算される。
強光ストレス時のクロロフィル蛍光と吸収による光合成測定の結果を図２Ｃに示す（ｐ＜０．０１）。光のエネルギーは光合成に使われ、蛍光として放出される経路（光化学消光）と、熱として放散する経路（非光化学消光）がある。光化学消光の指標として、Ｆｖ／Ｆｍ、Ｆｖ’／Ｆｍ’、（Ｆｍ’−Ｆｔ）／Ｆｍ’、および、ｑＰを用いた。非光化学消光の指標として、ｑＮ、および、ＮＰＱを用いた。このうち、アスコルビン酸トランスポーター遺伝子破壊植物は非光化学消光のみ低下していた。この低下量は主要な非光化学消光経路を欠損させた場合の低下量と同程度であった。
この結果は、本発明のアスコルビン酸トランスポーターを欠損する植物では、強光ストレス時における過剰エネルギーの非光化学消光（すなわち、熱放散）が低下することを示す。強光ストレス時の過剰エネルギーは、植物にとってストレスの一種である。そのため、過剰エネルギーの非光化学消光（すなわち、熱放散）が低下した植物は、強光ストレスに対する耐性が低下する。逆に、過剰エネルギーの非光化学消光（すなわち、熱放散）を増加させることによって、強光ストレスに対する耐性が向上する。したがって、この結果は、本発明のアスコルビン酸トランスポーターを大量に発現するように遺伝子組換えした植物では、強光ストレスのようなストレスに対する耐性が向上することを示す。
（実施例７：ゼアキサンチン生成量測定）
実験材料には播種後４〜５週齢の植物体の葉を用いた。１５分の暗処理後、飽和光パルスを与えてから作用光（２３０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓ、あるいは ５４０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２・ｓ）を２分間あて、その葉を８０％（ｖ／ｖ）アセトンにて抽出した。抽出物を９００ｘｇ、４℃、５分遠心し上清を回収した。これをＭｕｌｌｅｒ−Ｍｏｌｅら（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２８： ９７０−９７７， ２００２）の方法に従ってＨＰＬＣ測定した。
測定条件は、以下のとおりである。
カラム：Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ Ｓ５ ＯＤＳ１ ４．６ｘ２５０ｍｍカートリッジカラム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）
測定波長：４４５ｎｍ（リファレンス ５５０ｎｍ）
移動相Ａ：アセトニトリル：メタノール：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＝８４：２：１４（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：メタノール：エチルアセテート＝６８：３２（ｖ／ｖ）
（１００％移動相Ａから１００％移動相Ｂへ１５分間かけて直線的に勾配をかけた）
流速：１．２ｍＬ／分。
結果を図２Ｄに示す。光照射時（「明所」）において、キサントフィルサイクル最終産物であるゼアキサンチンをＨＰＬＣ 法にて定量すると、アスコルビン酸トランスポーター欠損植物ではゼアキサンチン生成量が著しく低下していた（ｐ＜０．０５）。
（考察）
これまでの知見では我々が見いだしたアスコルビン酸トランスポーターは葉緑体の内膜に局在している（ＰＬＡＮＴＡ，２１８：４０６−４１６，２００４）。また、したがって、アスコルビン酸トランスポーターが葉緑体内のアスコルビン酸量を上昇させ、過剰のエネルギーを熱放散する機構に寄与する。
アスコルビン酸は非光化学消光に重要なキサントフィルサイクルの補酵素として働く（図３参照）。興味深いことに熱放散を担う機構の一つであるキサントフィルサイクル反応の補酵素としてアスコルビン酸が必須であることが示された。理論に拘束されることは好まないが、図３に示す機構を利用して、光ストレス耐性が付与されていると考えられる。
本発明の遺伝子を植物に導入することによって、植物にストレス耐性、特に光ストレス耐性および酸化ストレス耐性を付与することが可能となった。本発明は、植物にストレス耐性を付与するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、ストレス耐性が付与された植物細胞、および、植物体を提供する。
光ストレスは世界的に農業・環境（温暖化等）において大きな問題の一つであると考えられてきたが、本発明のアスコルビン酸トランスポーターの過剰発現植物は光・酸化ストレス耐性を獲得することができる。
配列番号１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のアスコルビン酸トランスポーターをコードする核酸配列である。
配列番号２は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のアスコルビン酸トランスポーターのアミノ酸配列である。
配列番号３は、シロイヌナズナの変異体の遺伝子型の決定に用いたプライマーＰＨＴ４＿Ｌ２の核酸配列である。
配列番号４は、シロイヌナズナの変異体の遺伝子型の決定に用いたプライマーＰＨＴ４＿Ｒの核酸配列である。
配列番号５は、シロイヌナズナの変異体の遺伝子型の決定に用いたプライマーＤｓ３−４の核酸配列である。
配列番号６は、シロイヌナズナの変異体の遺伝子型の決定に用いたプライマーＤｓ５−３の核酸配列である。
配列番号７は、Ａｃｔｉｎ２遺伝子を増幅するためのコントロールプライマーＡｃｔｉｎ２ＲＴ−Ｆの核酸配列である。
配列番号８は、Ａｃｔｉｎ２遺伝子を増幅するためのコントロールプライマーＡｃｔｉｎ２ＲＴ−Ｒの核酸配列である。

Claims (13)

  1. 植物にストレス耐性を付与するための組成物であって、以下：
    （ａ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｂ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｃ）配列番号１に記載の核酸配列からなる核酸、
    （ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
    （ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
    からなる群から選択される、核酸を含む、組成物。
  2. 請求項１に記載の組成物であって、配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸を含む、組成物。
  3. 植物にストレス耐性を付与するための方法であって、以下：
    （１）
    （ａ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｂ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｃ）配列番号１に記載の核酸配列からなる核酸、
    （ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
    （ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
    からなる群から選択される、核酸を植物に導入する工程、
    を包含する、方法。
  4. 請求項３に記載の方法であって、前記植物に導入される核酸が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸である、方法。
  5. 植物体にストレス耐性を付与するための方法であって、以下：
    （１）
    （ａ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｂ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｃ）配列番号１に記載の核酸配列からなる核酸、
    （ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
    （ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
    からなる群から選択される、核酸を植物細胞に導入する工程、ならびに、
    （２）
    工程（１）で得られた植物細胞から植物体を再生する工程、
    を包含する、方法。
  6. 請求項５に記載の方法であって、前記植物細胞に導入される核酸が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸である、方法。
  7. 発現ベクターであって、
    以下：
    （１）
    （ａ）配列番号１に記載の核酸配列を含む核酸の相補鎖と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｂ）配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸配列を含む核酸であって、アスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｃ）配列番号１に記載の核酸配列からなる核酸、
    （ｄ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸、および
    （ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において１または数個の変異、置換、挿入または欠失を含むアミノ酸配列を有し、かつアスコルビン酸輸送活性を有するポリペプチドをコードする核酸
    からなる群から選択される、核酸、ならびに、
    （２）
    上記（１）の核酸と作動可能に連結された転写翻訳調節配列
    を含む、発現ベクター。
  8. 請求項７に記載の発現ベクターであって、前記（１）の核酸が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸である、発現ベクター。
  9. 植物細胞であって、請求項７または８に記載の発現ベクターを含む、植物細胞。
  10. 植物体であって、請求項７または８に記載の発現ベクターを含む、植物体。
  11. 請求項９に記載の植物細胞から再生された植物体。
  12. 請求項１０または１１に記載の植物体の、後代または交雑株。
  13. 請求項１０または１１に記載の植物体から得られた植物細胞、あるいは、請求項１２に記載の後代または交雑株から得られた植物細胞。
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