JP6947784B2 - オリゴヌクレオチド仲介型遺伝子修復を使用した標的遺伝子修飾の効率を高めるための方法および組成物 - Google Patents

Description

本出願は、参照により本明細書に組み込まれている、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０１，３３３号の優先権を主張するものである。

本発明は一般に、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定位置に対する、修飾の標的化の効率を改善するための新規な方法に関する。さらに本発明は、本明細書で開示している手法によって修飾、突然変異または顕在化された標的ＤＮＡに関する。本発明は、本発明の方法によって修飾された細胞、組織、および生物にも関する。

以下の本発明の背景の考察は、本発明を理解する際に読者を手助けするために単に提供するものであり、本発明以前の従来技術を記載または構成することを認めるものではない。

ゲノムＤＮＡの修飾は、一般にバイオテクノロジーにおける進展、および特にバイオテクノロジーに基づく医学的進展の中枢をなすものである。部位特異的ゲノム修飾に有効な方法は研究用、およびおそらく遺伝子療法用途に望ましい。一手法は、第３の鎖として二本鎖ＤＮＡに配列特異的に結合する三本鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を利用して、定方向突然変異誘発を仲介する。このようなＴＦＯは、ソラレンもしくはクロラムブシルなどの変異原性化学物質の送達（Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８７９−７８８３，１９９３；Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ６７：７３２３−７３３１，１９９３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１５：１７５９−１７６８，１９９５；Ｔａｋａｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６０２−５６０６，１９９１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５：３４４０−３４４４，１９９７）、または誤りがちの修復を誘発するのに十分なアフィニティーでの結合（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：８０２−８０５，１９９６）のいずれかによって作用し得る。

ゲノム修飾に関する別の戦略は、外来ＤＮＡ断片と標的遺伝子の間の相同組換えの誘導を含む。この手法は首尾よく使用され哺乳動物細胞中の選択遺伝子が標的化および妨害されており、特異的遺伝子ノックアウトがあるトランスジェニックマウスの生成が可能になっている（Ｃａｐｅｅｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８−１２９２，１９８９、Ｗａｇｎｅｒへの米国特許第４，８７３，１９１号）。しかしながら、この手法は、選択可能マーカーの導入に頼り所望の組換え体の単離を可能にするものである。選択がない場合、典型的遺伝子導入実験におけるトランスフェクトＤＮＡの相同と非相同組み込みの比は低く、通常は１：１０００以下の範囲内である（Ｓｅｄｉｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）。相同組み込みのこの低い効率によって、実験用途または遺伝子療法に関する遺伝子導入の利用が限定される。相同組換えの頻度は、ＵＶ照射および選択発癌性物質が原因の標的部位への損傷（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ８：１９６−２０２，１９８８）によって、ならびに部位特異的エンドヌクレアーゼ（Ｓｅｄｉｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６０６４−６０６８，１９９４；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ
．Ａ．９２：８０６−８１０，１９９５）によって高まる可能性がある。さらに、三本鎖対象ソラレン光付加物によって誘導されるＤＮＡ損傷は、染色体外ベクター内およびその間の組換えを刺激する可能性がある（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８０６−８１０，１９９５；Ｆａｒｕｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１６：６８２０−６８２８，１９９６、Ｇｌａｚｅｒへの米国特許第５，９６２，４２６号）。

他の研究が、哺乳動物細胞における組換えに影響を与えるパラメーターを決定するのに役立っている。一般に直鎖状ドナー断片は、それらの環状相当物より組換えの影響を受けやすい（Ｆｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２：１３７２−１３７８，１９８２）。組換えはドナー部位と標的部位両方の間の連続した相同性の長さ部分によっても影響を受け、短い断片は組換えに関して無力な基質であると思われる（Ｒｕｂｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ４：２２５３−２２５８，１９８４）。それにもかかわらず、幾つかの近年の試みは、遺伝子補正用のＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの短い断片の使用に焦点を当てている（Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ３：８５９−８６７，１９９６）。

ＴＦＯの配列特異的結合性を使用して、ＤＮＡ中の標的部位に一連の異なる分子を送達している。例えば、三本鎖相互作用を調べるための診断法は、Ｆｅ−ＥＤＴＡ、ＤＮＡ切断物質と結合したＴＦＯを利用した（Ｍｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８：６４５−６５０，１９８７）。他者は、単球菌ヌクレアーゼおよび連鎖球菌ヌクレアーゼのような生物学的活性酵素をＴＦＯと結合させ、ＤＮＡの部位特異的切断を実証している（Ｐｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：９８５８−９８６２，１９９０；Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：１０６０７−１０６１５，１９９４）。さらに、部位特異的ＤＮＡ損傷および突然変異誘発は、ソラレン（Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８７９−７８８３，１９９３；Ｔａｋａｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６０２−５６０６，１９９１）またはアルキル化剤（Ｂｅｌｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５：３４４０−３４４４，１９９７；Ｐｏｓｖｉｃ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ１１２：９４２８−９４３０，１９９０）のいずれかと結合したＴＦＯを使用して実施することができる。

ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２００１／０２５４６０は、（１）標的ＤＮＡ配列の少なくとも６塩基対の第１の断片の配列と同一である配列を有する第１の相同領域、および標的ＤＮＡ配列の少なくとも６塩基対の第２の断片の配列と同一である配列を有する第２の相同領域、ならびに標的ＤＮＡ配列と異種の少なくとも１個の核酸塩基を含有し第１の相同領域および第２の相同領域と結合した介在領域を含有する組換え型オリゴ核酸塩基を、植物の小胞子にエレクトロポレーション処理するステップ、（２）小胞子を培養して胚を生成させるステップ、および（３）例えば小胞子を培養して体細胞胚を生成させその胚から植物を再生するステップにより、標的ＤＮＡ配列の第１の断片と第２の断片の間に位置する突然変異がある植物を胚から生成させるステップを含む、植物の標的ＤＮＡ配列を突然変異させるための方法を記載する。本発明の様々な実施形態において、組換え型オリゴ核酸塩基はＭＤＯＮであり、それぞれの相同領域は少なくとも６ＲＮＡ型ヌクレオチドのＲＮＡセグメントを含有し、介在領域は少なくとも３ヌクレオチド長であり、第１のおよびまたは第２のＲＮＡセグメントは少なくとも８個の隣接２’−置換リボヌクレオチドを含有する。

生物学的研究の主な目的の一つはゲノムの標的型修飾である。前に記したように、哺乳動物細胞に遺伝子を送達するための方法は十分開発されているが、修飾および／または相同組換えの頻度は限られている（Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ１５：４５−５１ １９９５）。結果として、遺伝子の修飾は時間を浪費するプロセスである。ドナーとゲノムＤＮＡの間の修飾および／または組換えを高めるための多くの方法が企図または試用されている。しかしながら現在の技法は、低い割合の修飾および／または組換え、または修飾および／または組換えの割合の不一致を示すことが多く、それによって研究および遺伝子療法技術を妨げている。

本発明は、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定位置に対する、修飾の標的化の効率を改善するための新規な方法および組成物を提供する。本明細書で後に記載するように、ゲノムに対して特異的変化を誘導する核酸を様々な手法と組み合せて、修飾の標的である細胞中に存在する天然修復系の構成要素の利用性を高めることができる。

第１の態様において本発明は、植物細胞中の標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）仲介型突然変異を導入するための方法に関する。これらの方法は特に、植物細胞へのＧＲＯＮの送達、および／または５５塩基長より大きく標的ＤＮＡに導入するための２つ以上の突然変異部位を場合によっては含むＧＲＯＮの植物細胞への送達の前に、および／またはそれと同時に１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件下で植物細胞を培養するステップを含む。

特定の実施形態では、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件は、ＧＲＯＮまたは塩基除去修復の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたは非相同末端結合の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたはマイクロホモロジー仲介型末端結合の標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、ＧＲＯＮまたは相同組換えの標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入、およびＧＲＯＮまたは修復を助長する標的である植物細胞ＤＮＡへの１つまたは複数の部位の導入の１つまたは複数を含む。

本明細書で後に記載するように、本発明中で使用するためのＧＲＯＮは、従来型ＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチドからの１つまたは複数の以下の改変：
１つまたは複数の無塩基部位ヌクレオチド、
１つまたは複数の８’オキソｄＡおよび／または８’オキソｄＧヌクレオチド、
その３’末端における逆向き塩基、
１つまたは複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチド、
その５’末端における１つまたは複数、および好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くの２’Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、
挿入色素、
５’末端キャップ、
ホスホチオエート修飾、メチルホスホネート修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾、Ｏ−（２−メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾、ジＰＳ修飾、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾からなる群から選択される骨格修飾、
１つまたは複数の鎖間架橋、
好ましくはＧＲＯＮの５’または３’末端に１つまたは複数の共有結合した蛍光色素、
ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる１つまたは複数の塩基を含み得る。この一覧は限定的であることを意味しない。

本明細書で後に記載するように、特定の実施形態においてＧＲＯＮの質および変換効率は、ヌクレオチド多量体、例えば二量体、三量体、四量体などを使用してＧＲＯＮの全体
または一部分を合成することにより、その純度を改善することなどにより改善することができる。

特定の実施形態では、標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列が植物細胞ゲノム内に存在する。植物細胞は非トランスジェニックまたはトランスジェニックであってよく、標的ＤＮＡ配列は植物細胞の導入遺伝子または内在性遺伝子であってよい。

特定の実施形態では、１つまたは複数の細胞ＤＮＡ修復プロセスを増大させる条件は、植物細胞へのＧＲＯＮの送達の前またはそれと同時に、植物細胞への一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する１つまたは複数の化合物の導入を含む。例示的な化合物は本明細書で後に記載する。

本明細書で記載する方法および組成物は、一般に植物に適用可能である。例えば、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、マメ科マメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、およびユリからなる群から植物種を選択することができる。これらは、細菌、真菌および哺乳動物細胞およびさらにそれらのオルガネラ（例えば、ミトコンドリアと葉緑体）だけには限られないが、それらを含めた他の全ての生物系に全部または一部分を適用することもできる。

特定の実施形態では、方法は植物細胞からＧＲＯＮによって導入された突然変異を有する植物を再生するステップをさらに含み、植物から種子を回収するステップを含み得る。

関連態様において本発明は、本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む植物細胞、本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む植物、または本明細書で記載する方法に従いＧＲＯＮによって導入されたゲノム修飾を含む種子に関する。

本発明の他の実施形態は、以下に詳述する記載、例示的実施形態、および特許請求の範囲から明らかとなる。

（ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ部分を有する）ホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮおよび５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮによって仲介されるＢＦＰからＧＦＰへの変換を示す図である。 本明細書で「岡崎フラグメントＧＲＯＮ」と呼ぶ、ＲＮＡ／ＤＮＡを含むＧＲＯＮを示す図である。

過去数年間にわたり開発され、オリゴヌクレオチドによって仲介される標的遺伝子修飾は、欠失、短い挿入、および点突然変異をもたらすためのＤＮＡの短いストレッチの特異的改変において使用するのに値する技法であることが示されている。これらの方法はＤＮＡ対形成／アニーリング、次にＤＮＡ修復／組換え事象を含む。最初に核酸は、細胞タンパク質因子によって仲介されるプロセスにおいて、二本鎖ＤＮＡ中のその相補鎖とアニー
リングする。このアニーリングによって（点突然変異の場合）中央に位置するミスマッチ塩基対を生成し、内在性タンパク質機構を刺激して修復プロセス中に第２のステップ、染色体配列およびさらにそれらのオルガネラ（例えば、ミトコンドリアと葉緑体）の部位特異的修飾を開始させる可能性が最も高い構造不安定化をもたらす。この新たに導入されたミスマッチはＤＮＡ修復機構を誘導し、標的部位の最終修正をもたらす第２の修復事象を実施する。本発明の方法は、ＤＮＡ修復構成要素の利用性を高め、したがって標的核酸に対する遺伝子修復仲介型修飾の効率と再現性を高める新規な手法を提供することにより、これらの方法を改良する。

定義
本発明の理解を容易にするため、幾つかの用語を以下のように定義する。

本明細書で使用する「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそれらの断片もしくは一部分、および一本鎖もしくは二本鎖であってよくセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を表すゲノムもしくは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指す。

本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、プローブまたはアンプリマーとして使用することができる、少なくとも約１０ヌクレオチドおよび最大約２０１ヌクレオチド、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、およびより好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。

本明細書で使用する用語「ＤＮＡ修飾分子」および「ＤＮＡ修飾試薬」は、細胞のゲノム中の核酸配列を認識しそれに特異的に結合することができ、ゲノム内の標的ヌクレオチド配列を修飾することができ、認識およびＤＮＡ修飾分子と核酸配列の特異的結合がタンパク質非依存的である分子を指す。ＤＮＡ修飾分子に関して本明細書で使用する用語「タンパク質非依存的」は、ＤＮＡ修飾分子が核酸配列の認識、および／またはそれとの特異的結合にタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要としないことを意味する。ＤＮＡ修飾分子は、遺伝子変換の助長を目的とする、三本鎖形成オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリアミド、およびオリゴヌクレオチドだけには限られないが、これらによって例示される。本発明のＤＮＡ修飾分子は、相同組換えに使用される従来技術の核酸配列がタンパク質依存的である点で、相同組換えに使用される従来技術の核酸配列［Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２２９４−２２９５，１９８７］と区別される。分子に関して本明細書で使用する用語「タンパク質依存的」は、分子が核酸配列の認識、および／またはそれとの特異的結合にタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要とすることを意味する。ＤＮＡ修飾分子が核酸配列の認識、および／またはそれとの特異的結合にタンパク質および／または酵素の存在および／または活性を必要するかどうか決定するための方法は、当技術分野の技術の範囲内にある［例えば、Ｄｅｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：４７３４−４７４２，１９９９を参照］。例えばＤＮＡ修飾分子は、任意のタンパク質および／または酵素の不在下で核酸配列と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートすることができる。ＤＮＡ修飾分子と核酸配列の間の特異的結合の検出によって、ＤＮＡ修飾分子がタンパク質非依存的であることを実証する。他方で、ＤＮＡ修飾分子と核酸配列の間の特異的結合の不在は、ＤＮＡ修飾分子がタンパク質依存的であることおよび／または他の因子を必要とすることを実証する。

「三本鎖形成オリゴヌクレオチド」（ＴＦＯ）は、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡヘリックスの主要溝に結合して三重ヘリックスを形成することができる、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列として定義する。ＴＦＯは任意の特定長に限定されないが、ＴＦＯの好ましい長さは２００ヌクレオチド以下、より好ましくは１００ヌクレオチド以下、さらにより好ましくは
５〜５０ヌクレオチド、一層より好ましくは１０〜２５ヌクレオチド、および最も好ましくは１５〜２５ヌクレオチドである。三重ヘリックスの形成のためＴＦＯと二本鎖ＤＮＡの間で一定の度合いの配列特異性が必要であるが、三重ヘリックスが形成可能である限り、特定度合いの特異性が必要とされるわけではない。同様に、三重ヘリックスが形成可能である限り、ＴＦＯと二本鎖ヘリックスの間で特異的度合いのアビディティーまたはアフィニティーが必要とされるわけではない。ＴＦＯが特異的に結合するヌクレオチド配列の長さを限定する目的ではないが、一実施形態において、ＴＦＯが特異的に結合するヌクレオチド配列は１〜１００、より好ましくは５〜５０、さらにより好ましくは１０〜２５、および最も好ましくは１５〜２５ヌクレオチドである。さらに「三重ヘリックス」は、二重らせん核酸内の標的配列と結合したオリゴヌクレオチドを含む二重らせん核酸として定義する。「二重らせん」核酸は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡとＲＮＡの混合二本鎖を含めた任意の二本鎖核酸であってよい。二本鎖核酸は任意の特定長に限定されない。しかしながら好ましい実施形態では、二本鎖核酸は５００ｂｐを超える、より好ましくは１ｋｂを超える、および最も好ましくは約５ｋｂを超える長さを有する。多くの適用例において、二重らせん核酸は細胞、ゲノム核酸である。三本鎖形成オリゴヌクレオチドは、パラレルまたはアンチパラレル形式で標的配列に結合することができる。

「ペプチド核酸」、「ポリアミド」または「ＰＮＡ」は、リン酸骨格がＮ−アミノエチルグリシン系ポリアミド構造に置換された核酸である。ワトソン−クリックの塩基対形成法則に従うと、ＰＮＡはそれら本来の相当物より相補核酸に対して高いアフィニティーを有する。ＰＮＡは以下の化学量論比のＤＮＡとの非常に安定した三重ヘリックス構造を形成し得る：（ＰＮＡ）２．ＤＮＡ。ペプチド核酸およびポリアミドは任意の特定長に限定されないが、ペプチド核酸およびポリアミドの好ましい長さは２００ヌクレオチド以下、より好ましくは１００ヌクレオチド以下、および最も好ましくは５〜５０ヌクレオチド長である。ペプチド核酸およびポリアミドが特異的に結合するヌクレオチド配列の長さを限定する目的ではないが、一実施形態において、ペプチド核酸およびポリアミドが特異的に結合するヌクレオチド配列は１〜１００、より好ましくは５〜５０、さらにより好ましくは５〜２５、および最も好ましくは５〜２０ヌクレオチドである。

用語「細胞」は単細胞を指す。用語「細胞（複数）」は細胞の集団を指す。集団は１つの細胞型を含む純粋な集団であってよい。同様に、集団は２つ以上の細胞型を含み得る。本発明では、一細胞集団が含み得る細胞型の数に制限はない。

細胞のサンプルを言及するときの用語「同調させる」または「同調した」、または「同調細胞」もしくは「同調細胞集団」は、細胞周期の同じ時期に細胞集団が存在するように処置した複数の細胞を指す。サンプル内の全ての細胞が同調状態である必要はない。わずかな割合の細胞がサンプル内の大部分の細胞と同調していない可能性がある。同調状態である細胞の好ましい範囲は１０〜１００％である。より好ましい範囲は３０〜１００％である。さらに、細胞が一細胞型の純粋な集団である必要はない。２つ以上の細胞型がサンプル内に含有される可能性がある。この点において、サンプル内の別の細胞型と比較して、一細胞型のみが同調状態である、または細胞周期の異なる時期に存在する可能性がある。

単細胞を言及するときの用語「同調細胞」は、操作前の細胞の細胞周期の時期と異なる細胞周期の時期に細胞が存在するように、細胞を操作したことを意味する。あるいは「同調細胞」は、対照細胞（例えば、操作がない状態の細胞）と比較して、操作前の細胞が存在した細胞周期の時期の時間を改変（すなわち、延長または縮小）するよう操作した細胞を指す。

用語「細胞周期」は、分裂（すなわち、増殖）時に細胞が経る生理的および形態的変化
の進行を指す。細胞周期は一般に、「分裂間期」、「前期」、「中期」、「後期」、および「終期」と呼ばれる時期で構成されると認識されている。さらに、細胞周期の一部分は「Ｍ（有糸分裂期）」、「Ｓ（合成期）」、「Ｇ０」、「Ｇ１（ギャップ１）」および「Ｇ２（ギャップ２）」と呼ぶことができる。さらに細胞周期は、前述の名称の時期の間に存在する進行期間を含む。

用語「細胞周期抑制」は、細胞または細胞集団における細胞周期進行の休止を指す。細胞周期抑制は通常、細胞生理の態様に干渉する作用物質（化学物質、タンパク質またはその他）への細胞の露出によって誘導され細胞周期の続行を妨げる。

「増殖」または「細胞増殖」は、２つの娘細胞に繰り返し分裂し、それによって集団における全体的な細胞の増大をもたらす親細胞の能力を指す。細胞集団は生物中、または培養装置中に存在してよい。

用語「ＤＮＡ修飾可能」または「ＤＮＡ修飾手段」は、標的ＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列に対する変化を誘導する能力がある、またはその誘導を手助けすることができる手順、および内在もしくは外来作用物質もしくは試薬を指す。標的ＤＮＡセグメント上の１つまたは複数の塩基の欠失、付加または置換によって、このような変化を施すことができる。ＤＮＡ配列の変化が、標的配列によってコードされる任意の遺伝子に対する機能的変化をもたらすことは必要とされない。さらに、任意の特定部分または割合の細胞にＤＮＡに対する変化を施すことは必要とされない。

用語「対象のヌクレオチド配列」は、当業者によるその操作が何らかの理由で望ましいと思われる可能性のある、任意のヌクレオチド配列を指す。このようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子（例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬剤耐性遺伝子、増殖因子など）のコード配列、およびｍＲＮＡまたはタンパク質産物をコードしていない非コード制御配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、終止配列、ｍｉＲＮＡなどの制御ＲＮＡ）があるが、これらだけには限られない。

「アミノ酸配列」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド配列」および「ペプチド」は本明細書中で交互に使用してアミノ酸の配列を指す。

本明細書で使用する「標的配列」は、好ましくは８ヌクレオチド長を超えるが２０１ヌクレオチド長未満の配列を含む二重らせん核酸を指す。幾つかの実施形態では、標的配列は８〜３０塩基であることが好ましい。一般に標的配列は、二重らせん核酸上の一鎖上のヌクレオチド配列によって定義される。

本明細書で使用する「プリンリッチ配列」または「ポリプリン配列」は、二重らせん核酸配列の一鎖上のヌクレオチド配列を言及するとき、標的配列の５０％を超えるヌクレオチドがプリン塩基を含有するヌクレオチドの隣接配列として定義する。しかしながら、プリンリッチ標的配列は、６０％を超えるプリンヌクレオチド、より好ましくは７５％を超えるプリンヌクレオチド、次いで最も好ましくは９０％を超えるプリンヌクレオチド、および最も好ましくは１００％のプリンヌクレオチドを含有することが好ましい。

本明細書で使用する「ピリミジンリッチ配列」または「ポリピリミジン配列」は、二重らせん核酸配列の一鎖上のヌクレオチド配列を言及するとき、標的配列の５０％を超えるヌクレオチドがピリミジン塩基を含有するヌクレオチドの隣接配列として定義する。しかしながら、ピリミジンリッチ標的配列は、６０％を超えるピリミジンヌクレオチド、およびより好ましくは７５％を超えるピリミジンヌクレオチドを含有することが好ましい。幾
つかの実施形態では、配列は９０％を超えるピリミジンヌクレオチドを含有することが好ましく、他の実施形態では、１００％ピリミジンヌクレオチドであることが最も好ましい。

第１のヌクレオチド配列の「変異体」は、（例えば、ハイブリダイゼーションアッセイの使用またはＤＮＡ配列決定の使用によって検出可能である、１つまたは複数の欠失、挿入、または置換を有することにより）第１のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列として定義する。この定義内に含まれるのは、第１のヌクレオチド配列のゲノム配列に対する改変または修飾の検出である。例えば、ハイブリダイゼーションアッセイを使用して、（１）ゲノム中に含まれるとき第１のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる制限酵素断片のパターンの改変（すなわちＲＦＬＰ分析）、（２）第１のヌクレオチド配列を含有するゲノムＤＮＡのサンプルに第１のヌクレオチド配列の選択部分がハイブリダイズできないこと（例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用）、（３）第１のヌクレオチド配列に関する正常染色体遺伝子座以外の遺伝子座とのハイブリダイゼーションなどの、不適切または予想外なハイブリダイゼーションを検出することができる（例えば、中期染色体分布に対する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などを使用）。変異体の一例は突然変異野生型配列である。

本明細書で使用する用語「核酸」および「非修飾核酸」は、周知の４デオキシリボ核酸塩基（すなわち、グアニン、アデニン、シトシン、およびチミン）のいずれか１つを指す。用語「修飾核酸」は、非修飾核酸の構造に対してその構造が改変された核酸を指す。このような修飾の例示は、塩基の置換、共有結合修飾、アミノおよび窒素環のアルキル化、ならびに二重結合の飽和などであると思われる。

本明細書で使用する用語「突然変異」および「修飾」およびこれらと文法上同等な用語は、核酸配列に関して使用するとき、交互に使用して欠失、挿入、置換、鎖切断、および／または付加体の導入を指す。「欠失」は、１つまたは複数のヌクレオチドが無い核酸配列の変化として定義する。「挿入」または「付加」は、１つまたは複数のヌクレオチドの付加が起こった核酸配列の変化である。「置換」は、交換対象の１つまたは複数のヌクレオチドとは異なる分子である分子と、１つまたは複数のヌクレオチドの交換から生じる。例えば、シトシン、アデニン、グアニン、またはウリジンとチミンの交換によって例示されるように、一核酸は異なる核酸と交換することができる。ピリミジンからピリミジン（例えば、ＣからＴまたはＴからＣのヌクレオチド置換）またはプリンからプリン（例えば、ＧからＡまたはＡからＧのヌクレオチド置換）はトランジションと呼ばれ、一方ピリミジンからプリンまたはプリンからピリミジン（例えば、ＧからＴまたはＧからＣまたはＡからＴまたはＡからＣ）はトランスバージョンと呼ばれる。あるいは、チミンとチミングリコールの交換によって例示されるように、一核酸は修飾核酸と交換することができる。突然変異はミスマッチをもたらす可能性がある。用語「ミスマッチ」は、それぞれの核酸が異なるポリ核酸配列上に存在する２核酸間の非共有結合相互作用を指し、これは塩基対形成の法則に従わない。例えば、部分的相補配列５’−ＡＧＴ−３’および５’−ＡＡＴ−３’に関しては、Ｇ−Ａミスマッチ（トランジション）が存在する。用語「付加体の導入」または「付加体形成」は、結合が（好ましくは１０％〜１００％、より好ましくは５０％〜１００％、および最も好ましくは７５％〜１００％の）ＤＮＡ複製および／または転写レベルの低下をもたらすような、ＤＮＡ配列中の１つまたは複数のヌクレオチドと分子の共有結合または非共有結合を指す。

用語「鎖切断」は、二本鎖核酸配列を言及するとき、一本鎖切断および／または二本鎖切断を含む。一本鎖切断（ニック）は、二本鎖核酸配列の二本鎖の一本における妨害を指す。これは、二本鎖核酸配列の両鎖における妨害を指す二本鎖切断とは対照的である。鎖切断は、（例えば、電離放射線もしくは特定化学物質を用いた処置により）直接的にまた
は（例えば、核酸塩基における酵素での切断により）間接的に、二本鎖核酸配列に導入することができる。

用語「突然変異細胞」および「修飾細胞」は、細胞のゲノム配列中に少なくとも１つの修飾を含有する細胞を指す。

用語「一部分」は、ヌクレオチド配列の言及において使用するとき、そのヌクレオチド配列の断片を指す。断片は、５ヌクレオチド残基〜ヌクレオチド配列全体マイナス１核酸残基の大きさの範囲であり得る。

ＤＮＡ分子は「５’末端」および「３’末端」を有すると言える。１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合を介して一方向でその近隣の３’酸素に結合するような形式で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを形成するからである。したがって、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と結合しない場合、オリゴヌクレオチドの末端は「５’末端」と呼ばれる。その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と結合しない場合、オリゴヌクレオチドの末端は「３’末端」と呼ばれる。本明細書で使用する核酸配列は、多量オリゴヌクレオチド内部の場合でさえ、５’末端および３’末端を有すると言うこともできる。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、不連続なエレメントは「上流」または「下流」の５’または３’エレメントであると言える。この述語は、転写がＤＮＡ鎖に沿って５’から３’方向に進行することを表す。関連遺伝子の転写を誘導するプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、一般にコード領域の５’または上流に位置する。しかしながら、プロモーターエレメントおよびコード領域の３’に位置するときでさえ、エンハンサーエレメントはその効果を発揮し得る。転写終結およびポリアデニル化シグナルはコード領域の３’または下流に位置する。

本明細書で使用する用語「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学の技法により１つに接合したＤＮＡのセグメントで構成されるＤＮＡ分子を指す。

本明細書で使用する用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ分子を使用して発現されるタンパク質分子を指す。

本明細書で使用する用語「ベクター」と「運搬体」は、一細胞から別の細胞にＤＮＡセグメント（複数可）を移動させる核酸分子を言及する際に交互に使用する。

本明細書で使用する用語「作動可能な組合せで」、「作動可能な順序で」および「作動可能に連結した」は、所与の遺伝子の転写の誘導および／または所望のタンパク質分子の合成が可能な核酸分子を生成するような形式での核酸配列の結合を指す。これらの用語は、機能的タンパク質を生成するような形式でのアミノ酸配列の結合も指す。

本明細書で使用する用語「トランスフェクション」は、細胞中への外来ＤＮＡの導入を指す。リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティック（すなわち、パーティクルボンバードメント）などを含めた当業者に知られている様々な手段によって、トランスフェクションを実施することができる。

本明細書で使用する用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成の法則によって関連付けられる（ヌクレオチドの配列を指す交換可能な用語である）「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」を言及する際に使用する。例えば、配列「５’−ＣＡＧＴ
−３’」は配列「５’−ＡＣＴＧ−３’」と相補的である。相補性は「部分的」または「全体的」であってよい。「部分的」相補性は、塩基対形成の法則に従い１つまたは複数の核酸塩基がマッチしない場合である。核酸間の「全体的」または「完全」相補性は、塩基対形成の法則の下、それぞれ個々の核酸塩基が別の塩基とマッチする場合である。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に対して有意な影響がある可能性がある。これは増幅反応、および核酸間の結合に依存する検出法において特に重要である可能性がある。便宜上、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はヌクレオシドを含む分子を含む。

ヌクレオチド配列を言及する際に本明細書で使用する用語「相同性」および「相同的」は、他のヌクレオチド配列との相補性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性（すなわち同一性）が存在し得る。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列を言及する際に使用するとき、用語「実質的に相同的」は、前述の低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方の鎖にハイブリダイズすることができる、任意の核酸配列（例えばプローブ）を指す。核酸配列と部分的に相補的、すなわち「実質的に相同的」であるヌクレオチド配列は、標的核酸配列と完全相補配列がハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するヌクレオチド配列である。標的配列と完全相補配列のハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシーの条件下においてハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して調べることができる。実質的に相同的な配列またはプローブは、低ストリンジェンシーの条件下における完全相同配列と標的配列の結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）に関して競合しそれを阻害する。低ストリンジェンシーの条件は非特異的結合が許容されるような条件であるとは言えず、低ストリンジェンシー条件は、２配列の互いの結合が特異的（すなわち選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の不在は、部分的な割合の相補性さえ欠く（例えば、約３０％未満の同一性の）第２の標的配列の使用によって試験することができ、非特異的結合の不在下では、プローブは第２の非相補的標的とハイブリダイズしない。

低ストリンジェンシー条件は、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のプローブを利用するとき、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節）、０．１％のＳＤ
Ｓ、５×デンハルト試薬（５０×デンハルト試薬は５００ｍｌ当たり：５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ４００、Ｐｈｒｍａｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（ＦｒａｃｔｉｏｎＶ；Ｓｉｇｍａ））および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での６８℃における結合またはハイブリダイゼーション、次に２．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中での室温における洗浄と同等な条件を含む。

さらに、高ストリンジェンシーの条件下でのハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ステップの温度の増大、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの使用など）は当技術分野でよく知られている。高ストリンジェンシー条件は、核酸ハイブリダイゼーションを言及する際に使用するとき、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のプローブを利用するとき、５×ＳＳＰＥ、１％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での６８℃における結合またはハイブリダイゼーション、次に０．１％×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液中での６８℃における洗浄と同等な条件を含む。

低ストリンジェンシー条件、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、および標的の性質（溶液中または固定状態で存在するＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成など）、ならびに塩および他の構成要素の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの有無）、ならびに前述の条件とは異なるが同等である低ストリン
ジェンシーハイブリダイゼーション条件を得るため変更することができるハイブリダイゼーション溶液の構成要素などの要因を含む、多くの同等な条件を利用することができることは当技術分野でよく知られている。

用語「同等」は、対象のハイブリダイゼーション条件と関連があるハイブリダイゼーション条件を言及するとき、そのハイブリダイゼーション条件と対象のハイブリダイゼーション条件が、同じ範囲の割合（％）の相同性を有する核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらすことを意味する。例えば、対象のハイブリダイゼーション条件が、第１の核酸配列と５０％〜７０％の相同性を有する他の核酸配列と第１の核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらす場合、したがって別のハイブリダイゼーション条件は、この他のハイブリダイゼーション条件も、第１の核酸配列と５０％〜７０％の相同性を有する他の核酸配列と第１の核酸配列のハイブリダイゼーションをもたらす場合、対象のハイブリダイゼーション条件と同等であると言える。

本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖を塩基対形成により相補鎖と接合させハイブリダイゼーション複合体を形成する任意のプロセスを使用した、相補核酸の対形成を言及する際に使用する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連ストリンジェンシー条件、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因によって影響を受ける。

本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補Ｇ塩基とＣ塩基の間および相補Ａ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、２核酸配列間で形成される複合体を指し、これらの水素結合は塩基スタッキング相互作用によってさらに安定化され得る。２つの相補核酸にはアンチパラレル形状で水素結合が並ぶ。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、ＣｏｔもしくはＲｏｔ分析）、または溶液中に存在する一核酸配列と固形支持体（例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ドットブロッティングにおいて利用されるナイロン膜もしくはニトロセルロースフィルター、またはＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を含めたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて利用されるスライドグラス）に固定された別の核酸配列の間で形成され得る。

本明細書で使用する用語「Ｔｍ」は「融解温度」を言及する際に使用する。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分になり一本鎖に解離する温度である。核酸のＴｍを計算するための等式は当技術分野でよく知られている。標準参照によって示されるように、核酸が１ＭＮａＣｌで水溶液中に存在するとき、Ｔｍ値の単純推定値は等式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算することができる（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５参照）。他の参照は、Ｔｍ計算用に構造および配列特性を考慮に入れたさらに精巧な計算法を含む。

本明細書で使用する用語「ストリンジェンシー」は、その下で核酸ハイブリダイゼーションが実施される、温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件を言及する際に使用する。ストリンジェンシーは、典型的にはほぼＴｍ℃からＴｍより約２０℃〜２５℃低い範囲に存在する。当業者によって理解されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して同一ポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出することができ、または類似もしくは関連ポリヌクレオチド配列を同定もしくは検出することができる。

用語「特異的結合」、「結合特異性」、およびこれらと文法上同等な用語は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の結合を言及するとき、第２のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列の間の相互作用と比較した、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の優先的相互作用を指す。特異的結合は結合の絶対的特異性を必要としない相対語である。言い換えると、用語「特異的結合」は、第２のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列の間の相互作用の不在下で、第２のヌクレオチド配列が第１のヌクレオチド配列と相互作用することを必要としない。そうではなくて、それは第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の相互作用のレベルが、第２のヌクレオチド配列と第３のヌクレオチド配列の間の相互作用のレベルを超えることで十分である。第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の「特異的結合」は、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列の間の相互作用が、第１のヌクレオチド配列上または内部の特定構造の存在に依存することも意味する。言い換えると、第２のヌクレオチド配列は、一般に核酸またはヌクレオチド配列ではなく、第１のヌクレオチド配列上または内部の特定構造を認識しそれに結合している。例えば、第２のヌクレオチド配列が第１のヌクレオチド配列上または内部に存在する構造「Ａ」に特異的である場合、構造Ａを含有する第３の核酸配列の存在によって第１のヌクレオチド配列と結合する第２のヌクレオチド配列の量が減少する。

本明細書で使用する用語「増幅可能な核酸」は、任意の増幅法によって増幅することができる核酸を言及する際に使用する。「増幅可能な核酸」は「サンプル鋳型」を通常含むと企図される。

用語「異種核酸配列」または「異種ＤＮＡ」を交互に使用して、それが本来連結していない、またはそれが本来と異なる位置で連結した核酸配列と連結したヌクレオチド配列を指す。異種ＤＮＡはそれが導入される細胞には内在せず、別の細胞から入手される。一般に、必ずとは言えないが、このような異種ＤＮＡは、それが発現される細胞により通常生成されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例には、レポーター遺伝子、転写および翻訳制御配列、選択可能マーカータンパク質（例えば、薬剤耐性をもたらすタンパク質）などがある。

「増幅」は核酸配列の追加コピーの生成として定義し、当技術分野でよく知られているポリメラーゼ連鎖反応の技術を使用して一般に実施される（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＣＷ ａｎｄ ＧＳ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）。本明細書で使用する用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、クローニングまたは精製無しでゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列セグメントの濃度を高めるための方法を記載する、参照により本明細書に組み込まれているＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号、および同４，６８３，２０２号の方法を指す。所望標的配列の増幅セグメントの長さは２オリゴヌクレオチドプライマーの互いに対する相対的位置によって決定され、したがってこの長さは制御可能なパラメーターである。プロセスの反復態様のため、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（本明細書で以後「ＰＣＲ」）と呼ぶ。標的配列の所望増幅セグメントは（濃度の点で）混合物中の主要配列となるので、それらは「ＰＣＲ増幅された」と言える。

ＰＣＲによって、ゲノムＤＮＡにおける特異的標的配列の１コピーを、幾つかの異なる方法（例えば、標識プローブとのハイブリダイゼーション、ビオチニル化プライマーの取り込み、次にアビジン−酵素コンジュゲートの検出、増幅セグメントへのｄＣＴＰまたはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の取り込み）により検出可能なレベルまで増幅することができる。ゲノムＤＮＡ以外に、適切なセットのプライマー分子で任意のオリゴヌクレオチド配列を増幅することができる。特に、ＰＣＲプロセス独力に
よって作製した増幅セグメントはそれら自体、後のＰＣＲ増幅に有効な鋳型である。

特に市販品用途の、１つのこのような好ましい方法は広く使用されているＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ技術に基づき、対立遺伝子特異的ＰＣＲとブロッキング試薬（ＡＳＢ−ＰＣＲ）を組み合せて野生型対立遺伝子の増幅を抑制する。ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍試料を含めた任意の組織型から抽出したＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、生殖細胞系列または体細胞突然変異の検出にＡＳＢ−ＰＣＲを使用することができる。１０００倍以上過剰に野生型対立遺伝子のバックグラウンドに対する一点置換、挿入、または欠失の感受性および選択的検出を可能にする、一組の試薬設計法則が開発されている。（Ｍｏｒｌａｎ Ｊ，Ｂａｋｅｒ Ｊ，Ｓｉｎｉｃｒｏｐｉ Ｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲ：Ａ Ｓｉｍｐｌｅ、Ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ４（２）：ｅ４５８４，２００９）

用語「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＲＴ−ＰＣＲ」は、ＲＮＡ配列を逆転写してｃＤＮＡ配列の混合物を生成させ、次にクローニングまたは精製無しで混合物中の転写ｃＤＮＡ配列の所望セグメントの濃度を高めるための方法を指す。典型的には、２プライマーを使用した転写ＤＮＡの所望セグメントのＰＣＲ増幅の前に、１つのプライマー（例えばオリゴ−ｄＴプライマー）を使用してＲＮＡを逆転写する。

本明細書で使用する用語「プライマー」は、精製制限酵素消化産物に原型で存在しようと合成によって生じようと、核酸鎖と相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、適切な温度およびｐＨでヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下）に置いたとき、合成の開始地点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは最大増幅効率のため一本鎖であることが好ましいが、代替的に二本鎖であってよい。二本鎖の場合、延長産物の調製に使用する前に、プライマーを最初に処理してその鎖を分離させる。プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、誘導剤の存在下で延長産物の合成を引き起こすほど十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの源および使用法を含めた多くの要因に依存する。

本明細書で使用する用語「プローブ」は、精製制限酵素消化産物に原型で存在しようと、合成、組換えまたはＰＣＲ増幅によって生じようと、対象の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。プローブは一本鎖または二本鎖であってよい。プローブは、特定遺伝子配列の検出、同定および単離において有用である。本発明において使用する任意のプローブは任意の「レポーター分子」で標識され、したがってそれは、酵素（例えばＥＬＩＳＡ、および酵素系組織化学アッセイ）、蛍光、放射活性、および発光システムだけには限られないが、これらを含めた任意の検出システムで検出可能であることが企図される。本発明が何らかの特定検出システムまたは標識に限定されることを意図するものではない。

本明細書で使用する用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、その各々が特定ヌクレオチド配列もしくはその近辺で二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡを切断するかまたはそれに切れ目を入れる細菌酵素を指し、例えばＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６：１ １５６−６０によって教示されたように、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）のエンドヌクレアーゼドメインを使用することができる。

本明細書で使用する用語「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち遺伝子産物をコードする核酸
配列を意味する。コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ型のいずれかで存在し得る。ＤＮＡ型で存在するとき、オリゴヌクレオチドは一本鎖（すなわちセンス鎖）または二本鎖であり得る。さらに「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」は、転写の正確な開始および／または一次ＲＮＡ転写産物の正確なプロセシングを可能にすることが必要な場合、エンハンサー、プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御エレメントを含み得る。さらになお、本発明のコード領域は内在エンハンサー、スプライスジャンクション、介在配列、ポリアデニル化シグナルなどを含有し得る。

真核生物における転写制御シグナルは「エンハンサー」エレメントを含む。エンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する短いＤＮＡ配列アレイからなる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６：１２３７，１９８７）。エンハンサーエレメントは、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞ならびにウイルスにおける遺伝子を含めた、様々な真核生物供給源から単離されている。個々のエンハンサーの選択は、対象のタンパク質を発現させるのにどの細胞型を使用するかに依存する。

発現ベクターにおける「スプライシングシグナル」の存在は、組換え転写産物の高レベルの発現をもたらすことが多い。スプライシングシグナルは一次ＲＮＡ転写産物からのイントロンの除去を仲介し、スプライスドナーおよびアクセプタードナー部位からなる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１６．７−１６．８，１９８９）。一般に使用されるスプライスドナーおよびアクセプタードナー部位は、ＳＶ４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライスジャンクションである。

真核生物細胞における組換えＤＮＡ配列の有効な発現は、有効な終結と生成転写産物のポリアデニル化を誘導するシグナルの発現を必要とする。転写終結シグナルは一般にポリアデニル化シグナルの下流で見られ、数百ヌクレオチド長である。本明細書で使用する用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、終結と発生期ＲＮＡ転写産物のポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を示す。ポリＡ尾部を欠く転写産物は不安定であり急速に分解されるので、組換え転写産物の有効なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターにおいて利用されるポリＡシグナルは「異種」または「内在」であり得る。内在ポリＡシグナルは、ゲノム中の所与遺伝子のコード領域の３’末端で本来見られるシグナルである。異種ポリＡシグナルは、一遺伝子から単離され別の遺伝子の３’末端に配置されたシグナルである。

本明細書で使用する用語「プロモーター」、「プロモーターエレメント」または「プロモーター配列」は、オリゴヌクレオチド配列の５’末端に置かれる（すなわち上位に位置する）とき、そのオリゴヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。典型的にはプロモーターは、ｍＲＮＡへのその転写を制御するオリゴヌクレオチド配列の５’（すなわち上流）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼによる特異的結合および転写開始に関する部位をもたらす。

用語「プロモーター活性」は、核酸配列を言及するとき、ｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチド配列の転写を開始させる核酸配列の能力を指す。

用語「組織特異的」は、プロモーターに適用するとき、異型組織中での同じオリゴヌクレオチドの発現の相対的不在下で、特異的型の組織に対するオリゴヌクレオチド配列の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。プロモーターの組織特異性は、例えば、レポーター遺伝子とプロモーター配列を作動可能に連結させレポーター構築物を生
成させ、生成するトランスジェニック動物の各組織にレポーター構築物が組み込まれるように植物または動物のゲノムにレポーター構築物を導入し、トランスジェニック植物または動物の異なる組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出する（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質、またはレポーター遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を検出する）ことによって評価することができる。選択性は絶対的である必要はない。他の組織中でのレポーター遺伝子の発現レベルに対する、１つまたは複数の組織中でのより高レベルのレポーター遺伝子の発現の検出によって、より高レベルの発現が検出される組織にプロモーターが特異的であることを示す。

用語「細胞型特異的」は、プロモーターに適用するとき、同じ組織内の異型細胞での同じオリゴヌクレオチド配列の発現の相対的不在下で、特異的型の細胞におけるオリゴヌクレオチド配列の選択的発現を誘導することができるプロモーターを指す。用語「細胞型特異的」は、プロモーターに適用するとき、一組織内の領域におけるオリゴヌクレオチドの選択的発現を促進することができるプロモーターも意味する。再度、選択性は絶対的である必要はない。プロモーターの細胞型特異性は、当技術分野でよく知られている方法、例えば本明細書に記載する免疫組織化学的染色法を使用して評価することができる。簡単に言うと、組織切片をパラフィンに包埋し、パラフィン切片を、その発現がプロモーターによって制御されるオリゴヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド産物に特異的な一次抗体と反応させる。パラフィン切片の代替として、サンプルを凍結切片化することができる。例えば、切片化の前および最中に切片を凍結させ、残留パラフィンにより起こり得る干渉を回避することができる。一次抗体に特異的な標識（例えば、ペルオキシダーゼ結合）二次抗体は（例えば、アビジン／ビオチンを用いた）切片化組織との結合、および顕微鏡検査による特異的結合の検出を可能にする。

用語「選択的発現」、「選択的に発現」、およびそれらの文法上同等な用語は、２箇所以上の対象領域における発現の相対的レベルの比較を指す。例えば「選択的発現」は、組織と関連付けて使用するとき、別組織中での同じ遺伝子の発現レベル、およびそれを発現する細胞数とそれぞれ比較した、特定組織における対象遺伝子の実質的に高い発現レベル、またはその組織内で遺伝子を発現する細胞の実質的に多い数を指す（すなわち、選択性は絶対的である必要はない）。選択的発現は、特定組織における対象遺伝子の発現および別組織中での同じ遺伝子の発現の完全不在を必要としないが、それらを含み得る。同様に、本明細書で細胞型を言及する際に使用する「選択的発現」は、別細胞型中での遺伝子の発現レベル、およびそれを発現する細胞数とそれぞれ比較したときの、特定細胞型における対象遺伝子の実質的に高い発現レベル、またはそれを発現する細胞の実質的に多い数を指す。

用語「隣接」は、２つ以上のヌクレオチド配列を言及する際に使用するとき、１つまたは複数の制御エレメントを含まない介在配列の不在下、またはそれらの存在下のいずれかで、ヌクレオチド配列がタンデムに連結した状態であることを意味する。

本明細書で使用する用語「核酸分子コード」、「ヌクレオチドコード」、「ＤＮＡ配列コード」および「ＤＮＡコード」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序によって、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序が決まる。したがってＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。

用語「単離」は、「単離オリゴヌクレオチド」など核酸に関して使用するとき、その元の供給源と通常結合した少なくとも１つの汚染物質核酸から分離した核酸配列を指す。単離核酸は、それが本来見られるのと異なる型または設定で存在する核酸である。対照的に、非単離核酸は、それらが本来存在する状態において見られるＤＮＡおよびＲＮＡなどの
核酸である。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば遺伝子）は隣接遺伝子付近の宿主細胞染色体上に見られ、特異的タンパク質をコードする特異的ｍＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多くの他のｍＲＮＡとの混合物として細胞中に見られる。しかしながら、対象のポリペプチドをコードする単離核酸は、例えば対象のポリペプチドを通常発現する細胞中の核酸などを含み、この場合核酸は元の細胞のそれとは異なる染色体内もしくは染色体外位置に存在し、または他の場合は本来見られるのと異なる核酸配列に隣接する。単離核酸またはオリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖型で存在し得る。単離核酸は、（望む場合）様々な技法（例えば、ハイブリダイゼーション、ドットブロッティングなど）によって容易に確認することができる。単離核酸またはオリゴヌクレオチドを利用してタンパク質を発現させるとき、オリゴヌクレオチドはセンス鎖またはコード鎖を少なくとも含有し得る（すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であり得る）。あるいはオリゴヌクレオチドはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含有し得る（すなわち、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり得る）。

本明細書で使用する用語「精製した」または「精製すること」は、サンプルからの１つまたは複数の（望ましくない）成分の除去を指す。例えば、細菌宿主細胞中で組換えポリペプチドを発現させる場合、宿主細胞タンパク質を除去し、それによってサンプル中の組換えポリペプチドの割合を高めることによりポリペプチドを精製する。

本明細書で使用する用語「実質的に精製された」は、それらの本来の環境から除去、単離または分離し、それらが本来結合していた他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、およびより好ましくは９０％含まない、核酸またはアミノ酸配列いずれかの分子を指す。したがって「単離ポリヌクレオチド」は実質的に精製されたポリヌクレオチドである。

本明細書で使用する用語「コード領域」は、構造遺伝子を言及する際に使用するとき、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として発生期ポリペプチドにおいて見られるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物では、一般にイニシエーターメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」により５’側、および停止コドンを指定する３トリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の１つにより３’側に存在する。

「コード配列」によって、転写および／または翻訳してｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドまたはその断片を生成することができる、核酸の配列またはその相補配列、またはその一部分を意味する。コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未熟一次ＲＮＡ転写産物中で、細胞の生化学的機構により１つに接合して成熟ｍＲＮＡとなるエクソンを含む。アンチセンス鎖はこのような核酸の相補鎖であり、コード配列はそこから推測することができる。

「非コード配列」によって、ｉｎ ｖｉｖｏでアミノ酸に転写されない、またはｔＲＮＡが相互作用してアミノ酸を置換しないもしくは置換しようとしない場合の、核酸の配列またはその相補配列、またはその一部分を意味する。非コード配列は、ゲノムＤＮＡまたは未熟一次ＲＮＡ転写産物中のイントロン配列と、例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどの遺伝子関連配列の両方を含む。

本明細書で使用する用語「構造遺伝子」または「構造ヌクレオチド配列」は、他の遺伝子の発現を制御しないＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を指す。対照的に、「制御遺伝子」または「制御配列」は、他の遺伝子の発現を制御する産物（例えば、転写因子）をコードする構造遺伝子である。

本明細書で使用する用語「制御エレメント」は、核酸配列のある程度の発現態様を制御する遺伝子エレメントを指す。例えばプロモーターは、作動可能に連結したコード領域の転写の開始を容易にする制御エレメントである。他の制御エレメントには、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルなどがある。

本明細書で使用する用語「ペプチド転写因子結合部位」または「転写因子結合部位」は、タンパク質転写因子と結合し、それによって核酸配列のある程度の発現態様を制御するヌクレオチド配列を指す。例えば、Ｓｐ−１およびＡＰ１（アクチベータータンパク質１）結合部位はペプチド転写因子結合部位の例である。

本明細書で使用する用語「遺伝子」は、構造遺伝子のコード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに相当するように、５’末端と３’末端の両方でコード領域に隣接して位置する非翻訳配列も含み得る。コード領域の５’に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’または下流に位置しｍＲＮＡ上に存在する配列は３’非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」はｃＤＮＡとゲノム型両方の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で妨害されるコード領域を含有する。イントロンは異種核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンはエンハンサーなどの制御エレメントを含有し得る。イントロンは核または一次転写産物から除去または「スプライシング除去」され、したがってイントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは翻訳中に働いて、発生期ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を指定する。

イントロンを含有する以外に、ゲノム型の遺伝子は、ＲＮＡ転写産物上に存在する配列の５’末端と３’末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は「隣接」配列または領域と呼ばれる（これらの隣接配列はｍＲＮＡ転写産物上に存在する非翻訳配列に対して５’または３’に位置する）。５’隣接領域は、遺伝子の転写を制御するまたはそれに影響を与える、プロモーターおよびエンハンサーなどの制御配列を含有し得る。３’隣接領域は、転写の終結、転写後の切断およびポリアデニル化を誘導する配列を含有し得る。

「非ヒト動物」はヒトではない任意の動物を指し、例えばげっ歯動物、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ属、反芻動物、ウサギ目、ブタ、ヤギ、ウマ科、イヌ科、ネコ科、鳥類などの脊椎動物を含む。好ましい非ヒト動物はげっ歯動物目から選択される。さらに「非ヒト動物」は、両生類（例えばツメガエル属）、爬虫類、昆虫（例えばキイロショウジョウバエ属）、および他の非哺乳動物種を指す。

本明細書で使用する用語「トランスジェニック」は、植物または動物の体細胞および／または生殖系列細胞のいずれかのゲノムに組み込まれた状態で挿入された、別の生物由来のＤＮＡを有する生物または細胞を指す。「導入遺伝子」は、それが見られる植物または動物と部分的もしくは完全に異種である（すなわち、本来存在しない）、または内在配列（すなわち、動物中に本来見られる配列）と相同であり植物または動物ゲノム中の本来存在する配列のそれと異なる位置に挿入されたＤＮＡ配列を意味する。１つまたは複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物または動物は本発明の範囲内にある。さらに、本明細書で使用する「トランスジェニック」は、本発明の方法によって、相同組換え、ＴＦＯ突然変異によって、または類似の方法によって、１つまたは複数の遺伝子が修飾および／または「ノックアウトされた」（非機能的状態になったまたは低レベルでの機能状態になった、すなわち「ノックアウト」突然変異）動物を指す。例えば幾つかの実施形態では、トランスジェニック生物または細胞は、外来プロモーターおよび／またはコード領域を
含む挿入ＤＮＡを含む。

「形質転換細胞」は、多世代にわたり細胞培養中に増殖する能力、軟寒天中で増殖する能力、および／または細胞間接触による細胞増殖を抑制しない能力を獲得した細胞または細胞系である。この点で形質転換は、細胞または生物への外来遺伝子物質の導入を指す。細胞中への核酸の首尾良い導入を可能にして導入核酸の発現をもたらす任意の周知の方法によって、形質転換を実施することができる。「形質転換」は、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクションおよびリポフェクション（リポソーム仲介遺伝子導入）などの方法だけには限られないが、これらを含む。任意の発現ベクターを使用することにより、形質転換を実施することができる。例えば、昆虫細胞に外来核酸を導入するためのバキュロウイルスの使用が企図される。用語「形質転換」は、完全昆虫のＰエレメント仲介生殖細胞系列形質転換などの方法も含む。さらに形質転換は、通常遺伝子突然変異により、自然に形質転換された細胞を指す。

本明細書で使用する「外因性」は、タンパク質をコードする遺伝子が通常細胞中で発現されないことを意味する。さらに「外因性」は、その遺伝子の正常（すなわち本来）レベルの発現を高めるために細胞にトランスフェクトされる遺伝子を指す。

ペプチド配列およびヌクレオチド配列は「内在」または「異種」（すなわち外来）であってよい。用語「内在」は、それが本来存在する配列に対して何らかの修飾を含有しない限り、それが導入される細胞中で本来見られる配列を指す。用語「異種」は、それが導入される細胞に内在しない配列を指す。例えば異種ＤＮＡは、それが本来連結していない、またはそれが本来と異なる位置で連結した核酸配列と連結した、または連結状態に操作したヌクレオチド配列を含む。異種ＤＮＡは、それが導入される細胞中で本来見られ本来存在する配列に対して何らかの修飾を含有するヌクレオチド配列も含む。一般に、必ずとは言えないが、異種ＤＮＡは、それが導入される細胞により通常生成されない異種ＲＮＡおよび異種タンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例には、レポーター遺伝子、転写および翻訳制御配列、選択可能マーカータンパク質（例えば、薬剤耐性をもたらすタンパク質）をコードするＤＮＡ配列などがある。

構築物
本明細書で開示している核酸分子（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲのガイドＲＮＡ）は、組換え核酸構築物の生成において使用することができる。一実施形態では、本開示の核酸分子を、核酸構築物、例えば対象植物における発現用の発現カセットの調製において使用することができる。例えば構築物が宿主ゲノム中に組み込まれない、またはそれが組み込まれた状態の場合はプロモーターによってもたらされる制御下で宿主のゲノム内の構築物の位置に維持されるとき、この発現は一過的である可能性がある。

発現カセットは、本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡ配列と作動可能に連結した制御配列を含み得る。カセットは、生物に同時形質転換される少なくとも１つの別の遺伝子を別に含有し得る。あるいは、多数の発現カセットに別の遺伝子（複数可）を提供することができる。

制御領域の転写制御下にある部位特異的ヌクレアーゼコード配列の挿入用の複数の制限部位を有する、核酸構築物を提供することができる。核酸構築物は、選択可能マーカー遺伝子をコードする核酸分子を別に含有し得る。

任意のプロモーターを、核酸構築物の生成において使用することができる。プロモーターは、本明細書で開示している植物宿主核酸配列に固有もしくは類似、または外来もしく
は異種であってよい。さらに、プロモーターは天然配列、または代替的に合成配列であってよい。プロモーターが「外来」または植物宿主と「異種」である場合、プロモーターはそれが導入される元の植物中で見られないと考えられる。本明細書で使用するキメラ遺伝子は、コード配列と異種である転写開始領域と作動可能に連結したコード配列を含む。

本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼ配列は、異種プロモーターを使用して発現させることが可能である。

植物において構成的、組織優先的、誘導的発現をもたらすプロモーター、または他のプロモーターなどの任意のプロモーターを、部位特異的ヌクレアーゼ配列の発現を制御するための構築物の調製において使用することができる。構成的プロモーターは、例えばＲｓｙｎ７プロモーターのコアプロモーターおよびＷＯ９９／４３８３８と米国特許第６，０７２，０５０号中に開示された他の構成的プロモーター、コアＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ３１３：８１０−８１２；１９８５）、イネアクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１６３−１７１，１９９０）、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２，１９８９およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９，１９９２）、ｐＥＭＵプロモーター（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８，１９９１）、ＭＡＳプロモーター（Ｖｅｌｔｅｎ
ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．３：２７２３−２７３０，１９８４）、ＡＬＳプロモーター（米国特許第５，６５９，０２６号）などを含む。他の構成的プロモーターには、例えば米国特許第５，６０８，１４９号、同第５，６０８，１４４号、同第５，６０４，１２１号、同第５，５６９，５９７号、同第５，４６６，７８５号、同第５，３９９，６８０号、同第５，２６８，４６３号、同第５，６０８，１４２号および同第６，１７７，６１１号のプロモーターを含む。

組織優先的プロモーターを利用して、特定植物組織内の部位特異的ヌクレアーゼの発現を誘導することができる。このような組織優先的プロモーターには、葉優先的プロモーター、根優先的プロモーター、種子優先的プロモーター、および茎優先的プロモーターがあるが、これらだけには限られない。組織優先的プロモーターには、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１２（２）：２５５−２６５，１９９７；Ｋａｗａｍａｔａｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２−８０３，１９９７；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７−３４３，１９９７；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７−１６８，１９９７；Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１−１３４１，１９９６；Ｖａｎ
Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５−５３５，１９９６；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３−５２４，１９９６；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３−７７８，１９９４；Ｌａｍ，Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１８１−１９６，１９９４；Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９−１１３８，１９９３；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（２０）：９５８６−９５９０，１９９３およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．４（３）：４９５−５０５，１９９３のプロモーターがある。

核酸構築物は転写終結領域も含み得る。転写終結領域を使用する場合、任意の終結領域を核酸構築物の調製において使用することができる。例えば、終結領域は別の供給源（す
なわち、外来またはプロモーターと異種）に由来する可能性がある。本開示の構築物中での使用に利用することができる終結領域の例には、オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終結領域などの、エーツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミド由来の終結領域がある。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４，１９９１；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｃｅｌｌ６４：６７１−６７４，１９９１；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９，１９９１；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ２：１２６１−１２７２，１９９０；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ９１：１５１−１５８，１９９０；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３，１９８９；およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９，１９８７も参照。

本明細書で開示している任意の態様、実施形態、方法および／または組成物に関して、形質転換植物中での発現を高めるために核酸を最適化することができる。すなわち、部位特異的ヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸を、発現改善用の植物優先的コドンを使用して合成することができる。例えば、宿主優先的コドン使用頻度の考察に関する、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ，（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１，１９９０）を参照。植物優先的遺伝子の合成に関する当技術分野の方法が利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号、および米国特許第５，４３６，３９１号、およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８，１９８９を参照。

さらに、他の配列修飾を本明細書で開示している核酸に施すことができる。例えば、細胞宿主における遺伝子発現を高めるための、別の配列修飾が知られている。これらは、擬似ポリアデニル化シグナル、エクソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復単位をコードする配列、および遺伝子発現に有害であり得る他のこのような十分特徴付けられた配列の排除を含む。配列のＧ−Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現される周知の遺伝子を参照することにより計算した、標的細胞宿主の平均レベルに調節することもできる。さらに、配列を修飾して予想ヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避することができる。

他の核酸配列を本開示の構築物の調製において使用して、例えば部位特異的ヌクレアーゼコード配列の発現を高めることもできる。このような核酸配列には、メイズＡｄｈＩ、イントロン１遺伝子のイントロン（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１：１１８３−１２００，１９８７）、ならびにタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、メイズ萎黄病ウイルスおよびアルファルファモザイクウイルス由来のリーダー配列（Ｗ−配列）がある（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：８６９３−８７１１，１９８７およびＳｋｕｚｅｓｋｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６５−７９，１９９０）。メイズの収縮１型遺伝子座由来の第１のイントロンは、キメラ遺伝子構築物における遺伝子の発現を高めることが示されている。米国特許第５，４２４，４１２号および米国特許第５，５９３，８７４号は遺伝子発現構築物における特異的イントロンの使用を開示しており、Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：９２９−９３９，１９９４）は、イントロンが組織特異的偏位で遺伝子発現を制御するのに有用であることも示している。部位特異的ヌクレアーゼ遺伝子発現をさらに高めるまたは最適化するため、本明細書で開示している植物用発現ベクターは、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含有するＤＮＡ配列も含有することができる。したがって、このような修飾発現系で形質転換した植物細胞は、本開示のヌクレオチド配列の過剰発現または構成的発現を示す可能性がある。

本明細書で開示している発現構築物は、葉緑体に対する部位特異的ヌクレアーゼ配列の発現を誘導することができる核酸配列も含み得る。このような核酸配列には、植物細胞葉緑体に対象遺伝子産物を誘導する葉緑体輸送ペプチドをコードする葉緑体標的配列がある。このような輸送ペプチドは当技術分野で知られている。葉緑体標的配列に関して、「作動可能に連結した」は、輸送ペプチドをコードする核酸配列（すなわち、葉緑体標的配列）が、２配列が隣接し同じリーディングフレームに存在するように、本明細書で開示している部位特異的ヌクレアーゼ核酸分子と連結していることを意味する。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６，１９９１；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０，１９８９；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８，１９８７；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１，１９９３およびＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：４７８−４８１，１９８６を参照。

葉緑体標的配列は当技術分野でよく知られており、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｓｉｌｖａ Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９−７８０，１９９６；Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５−３３４２，１９９１）、５−（エノールピルビル）シキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）：７８９−８１０，１９９０）、トリプトファンシンターゼ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１−６０８７，１９９５）、プラストシアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）：２０３５７−２０３６３，１９９７）、コリスミ酸シンターゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７−２７４５７，１９９３）、および光吸収性クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６−１４９９９，１９８８）の葉緑体小サブユニットを含む。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６，１９９１；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０，１９８９；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｏｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８，１９８７；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１，１９９３およびＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３３：４７８−４８１，１９８６も参照。

本明細書で開示している任意の態様、実施形態、方法および／または組成物に関して、核酸構築物を調製して、植物細胞葉緑体由来の突然変異部位特異的ヌクレアーゼコード配列の発現を誘導することができる。葉緑体を形質転換するための方法は当技術分野で知られている。例えば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８５２６−８５３０，１９９０；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：９１３−９１７，１９９３；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，ＥＭＢＯＪ．１２：６０１−６０６，１９９３を参照。この方法は、選択可能マーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガン送達法、および相同組換えによるプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化を利用する。さらに、核コードおよびプラスチド対象ＲＮＡポリメラーゼの組織優先的発現によるサイレントプラスチド媒介導入遺伝子のトランス作用によって、プラスチド形質転換を実施することができる。このようなシステムはＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：７３０１−７３０５，１９９４中で報告されている。

葉緑体を標的化する対象の核酸を、植物の核とこのオルガネラの間のコドン使用頻度の違いを考慮して、葉緑体での発現用に最適化することができる。このようにして、葉緑体優先的コドンを使用して対象の核酸を合成することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，３８０，８３１号を参照。

核酸構築物を使用して植物細胞を形質転換し、部位特異的ヌクレアーゼコード配列を含むトランスジェニック植物を再生することができる。植物形質転換用の多数の植物形質転換ベクターおよび方法が利用可能である。例えば、米国特許第６，７５３，４５８号、Ａｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８１：３０１−３０５，１９８６；Ｆｒｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．６：３２１−３２５，１９８７；Ｂｌｏｃｋ，Ｍ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ．７６：７６７−７７４，１９８８；Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｄｌｅｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｍｐ．２０３２１２．２０３−２１２，１９９０；Ｃｏｕｓｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８：４８１−４９４，１９９１；Ｃｈｅｅ，Ｐ．Ｐ．ａｎｄ Ｓｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ．１１８：２５５−２６０，１９９２；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２３９−２４６，１９９２；Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３０９−３１４，１９９２；Ｄｈｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９９：８１−８８，１９９２；Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１２１２−１１２１６，１９９３；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ｐｌａｎｔ２９Ｐ：１１９−１２４，１９９３；Ｄａｖｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２：１８０−１８３，１９９３；Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ Ｍｃ Ｈｕｇｈｅｎ，Ａ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ９１：１３９−１４８，１９９３；Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｃ．Ｉ．ａｎｄ Ｔｒｉｅｕ，Ｔ．Ｎ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：１６７，１９９３；Ｇｏｌｏｖｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．９０：４１−５２，１９９３；Ｇｕｏ Ｃｈｉｎ Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．３８：２０７２−２０７８；Ａｓａｎｏ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３，１９９４；Ａｙｅｒｅｓ Ｎ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｄ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｓｃｉ．１３：２１９−２３９，１９９４；Ｂａｒｃｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：５８３−５９２，１９９４；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｊ．５：２９９−３０７，１９９４；Ｂｏｒｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ。１６：２２５−２３０，１９９４；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．，Ａｇｒｏ．Ｆｏｏｄ．Ｉｎｄ．Ｈｉ Ｔｅｃｈ．５：１７−２７，１９９４；Ｅａｐｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１３：５８２−５８６，１９９４；Ｈａｒｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：９１９９２３，１９９４；Ｒｉｔａｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３１７−３２５，１９９４およびＷａｎ，Ｙ．Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｍａｕｘ，Ｐ．Ｇ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０４：３７４８，１９９４を参照。相同組換えを使用して、構築物を植物細胞に形質転換することもできる。

用語「野生型」は、ペプチド配列およびヌクレオチド配列を言及するとき、本来存在する供給源から単離したときのペプチド配列およびヌクレオチド配列の特徴を有する、ペプチド配列およびヌクレオチド配列（遺伝子座／遺伝子／対立遺伝子）をそれぞれ指す。野生型ペプチド配列およびヌクレオチド配列は集団内で最も頻繁に観察される配列であり、したがって任意でそれぞれ「正常」または「野生型」形のペプチド配列およびヌクレオチド配列と示される。「野生型」は、１つまたは複数の特異的ヌクレオチド位置における配列、または１つまたは複数の特定コドン位置における配列、または１つまたは複数の特定アミノ酸位置における配列を指すこともできる。

「コンセンサス配列」は、同一アミノ酸もしくはヌクレオチドまたは少なくとも２５％の配列に関して機能上同等なアミノ酸もしくはヌクレオチドを含有する、アミノ酸またはヌクレオチドの配列として定義する。同一または機能上同等なアミノ酸またはヌクレオチドが隣接している必要はない。

本明細書で使用する用語「アブラナ」はアブラナ属の植物を指す。例示的なアブラナ種には、ビーカリナタ（Ｂ．ｃａｒｉｎａｔａ）、ビーエロンゲート（Ｂ．ｅｌｏｎｇａｔｅ）、ビーフルチクローサ（Ｂ．ｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ）、ビージュンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、ビーナプス（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、ビーナリノーサ（Ｂ．ｎａｒｉｎｏｓａ）、ビーニグラ（Ｂ．ｎｉｇｒａ）、ビーオレラセア（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、ビーペリビリディス（Ｂ．ｐｅｒｖｉｒｉｄｉｓ）、ビーレーパ（Ｂ．ｒａｐａ）（合成ビーカムペストリス（ｓｙｎＢ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、ビールペストリス（Ｂ．ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ）、ビーセプティセプス（Ｂ．ｓｅｐｔｉｃｅｐｓ）、およびビートウルネフォルティ（Ｂ．ｔｏｕｒｎｅｆｏｒｔｉｉ）があるが、これらだけには限られない。

核酸塩基は、特定の好ましい実施形態においてプリン、ピリミジン、またはそれらの誘導体もしくはアナログである塩基である。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル成分を含有する核酸塩基、例えば場合によっては置換されたリボシドまたは２’−デオキシリボシドである。ヌクレオシドは数個の連結成分の１つによって連結することができ、それは亜リン酸を含有し得るかまたは含有し得ない。非置換ホスホジエステル結合によって結合したヌクレオシドはヌクレオチドと呼ばれる。本明細書で使用する用語「核酸塩基」は、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニット、およびモルホリン核酸塩基、ならびにヌクレオシドとヌクレオチドを含む。

オリゴ核酸塩基は核酸塩基を含むポリマーであり、その少なくとも一部分は相補配列を有するＤＮＡとワトソン−クリック塩基対形成によりハイブリダイズ可能であることが好ましい。オリゴ核酸塩基鎖は、ポリマーの末端核酸塩基である一本鎖５’末端と３’末端を有し得る。特定オリゴ核酸塩基鎖は全タイプの核酸塩基を含有することができる。オリゴ核酸塩基化合物は、相補的でありワトソン−クリック塩基対形成によりハイブリダイズ可能である１つまたは複数のオリゴ核酸塩基鎖を含む化合物である。リボ型核酸塩基は、２’炭素がヒドロキシ、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンであるペントースフラノシル含有核酸塩基を含む。デオキシリボ型核酸塩基はリボ型核酸塩基以外の核酸塩基であり、ペントースフラノシル成分を含有しない全ての核酸塩基を含む。

特定の実施形態では、オリゴ核酸塩基鎖部分は、オリゴ核酸塩基鎖とオリゴ核酸塩基鎖のセグメントまたは領域の両方を含み得る。オリゴ核酸塩基鎖部分は３’末端と５’末端を有することができ、オリゴ核酸塩基鎖部分が鎖と共に延長するとき、鎖部分の３’末端と５’末端は鎖の３’末端と５’末端でもある。

本明細書で使用する用語「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド、非ヌクレオチド含有分子、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドおよび他の遺伝子修復分子を含めたオリゴ核酸塩基を示す。

本明細書で使用する用語「コドン」は、タンパク質合成中のポリペプチド鎖における指定アミノ酸の挿入またはタンパク質合成を停止させるためのシグナルを決定する遺伝子コードを構成する、３個の隣接ヌクレオチドの配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を指す。用語「コドン」は、元のＤＮＡが転写されるメッセンジャーＲＮＡにおける３ヌクレオチドの対応（および相補）配列を指すためにも使用する。

本明細書で使用する用語「相同性」は、タンパク質とＤＮＡの間の配列類似性を指す。
用語「相同性」または「相同的」は同一性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性が存在し得る。部分的に相同的な配列は、別の配列と比較したとき１００％未満の配列同一性を有する配列である。

「ヘテロ接合型」は、相同染色体セグメントにおける１つまたは複数の遺伝子座に異なる対立遺伝子を有することを指す。本明細書で使用する「ヘテロ接合型」は、１つまたは複数の遺伝子座に異なる対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指すことができる。ヘテロ接合型サンプルを、例えば核酸配列決定などの、当技術分野で知られている方法によって決定することもできる。例えば、配列決定エレクトロフェログラムが１つの遺伝子座で２つのピークを示し、２つのピークがほぼ同じサイズである場合、サンプルはヘテロ接合型として特徴付けることができる。または、１つのピークが他方より小さいが、大きなピークの少なくとも約２５％のサイズである場合、サンプルはヘテロ接合型として特徴付けることができる。幾つかの実施形態では、小さなピークは大きなピークの少なくとも約１５％である。他の実施形態では、小さなピークは大きなピークの少なくとも約１０％である。他の実施形態では、小さなピークは大きなピークの少なくとも約５％である。他の実施形態では、最小量の小さなピークが検出される。

本明細書で使用する「ホモ接合型」は、相同染色体セグメントにおける１つまたは複数の遺伝子座に同一対立遺伝子を有することを指す。「ホモ接合型」は、１つまたは複数の遺伝子座に同じ対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指すことができる。ホモ接合型サンプルを、例えば核酸配列決定などの、当技術分野で知られている方法によって決定することができる。例えば、配列決定エレクトロフェログラムが特定遺伝子座で１つのピークを示す場合、サンプルはその遺伝子座に関して「ホモ接合型」と呼ぶことができる。

用語「ヘミ接合型」は、第２の対立遺伝子が欠失状態であるため細胞または生物の遺伝子型に一回のみ存在する、遺伝子または遺伝子セグメントを指す。本明細書で使用する「ヘミ接合型」は、遺伝子型に一回のみ存在する、１つまたは複数の遺伝子座における対立遺伝子が検出可能であるサンプル、細胞、細胞集団または生物も指すことができる。

本明細書で使用する用語「接合状態」は、サンプル、細胞集団、または生物が、当技術分野で知られており本明細書に記載する試験法により決定される、ヘテロ接合型、ホモ接合型、またはヘミ接合型と考えられることを指す。用語「核酸の接合状態」は、核酸の供給源がヘテロ接合型、ホモ接合型、またはヘミ接合型と考えられるかどうかの決定を意味する。「接合状態」は配列中の１ヌクレオチドの違いを指すことができる。幾つかの方法では、一突然変異に関するサンプルの接合状態を、ホモ接合野生型、ヘテロ接合型（すなわち、１つの野生型対立遺伝子と１つの突然変異対立遺伝子）、ホモ接合突然変異型、またはヘミ接合型（すなわち、野生型もしくは突然変異対立遺伝子いずれかの１コピー）として分類することができる。

本明細書で使用する用語「ＲＴＤＳ」は、Ｃｉｂｕｓによって開発されたＴｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＲＴＤＳ）を指す。ＲＴＤＳは、外来遺伝子または対照配列の取り込み無しで遺伝子配列に正確な改変を施す際に有効である、部位特異的遺伝子修飾システムである。

本明細書で使用する用語「約」は、プラスマイナス１０％の量を表す用語である。例えば「約３％」は２．７〜３．３％を包含し、「約１０％」は９〜１１％を包含する。

修復オリゴヌクレオチド
本発明は一般に、ゲノムまたは他のヌクレオチド配列中の特定位置に対する、修飾の標
的化の効率を改善するための新規な方法に関する。さらに本発明は、本明細書で開示している手法により修飾、突然変異または顕在化された標的ＤＮＡに関する。本発明はさらに、本発明の方法によって修飾された細胞、組織、および生物に関する。本発明は、成功した変換システム、ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｉｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＤＳ（商標）、Ｃｉｂｕｓ ＵＳ ＬＬＣ）と部分的に関連する組成物および方法の開発に基づく。

ＲＴＤＳは、細胞独自の遺伝子修復システムを利用し、外来ＤＮＡおよび遺伝子発現制御配列を挿入せずにｉｎ ｓｉｔｕで遺伝子配列を特異的に修飾することによる、標的遺伝子の改変に基づく。この手順は遺伝子配列の正確な改変に影響を与え、一方でゲノムの残り部分は不変状態である。従来のトランスジェニックＧＭＯと対照的に、外来遺伝子物質の組み込みがなく、如何なる外来遺伝子物質も植物中に残っていない。ＲＴＤＳによって導入される遺伝子配列の改変はランダムに挿入されない。影響を受ける遺伝子はその元の位置に留まるので、ランダム、制御不能または有害なパターンの発現は起こらない。

この改変に影響を与えるＲＴＤＳは、ＤＮＡと修飾ＲＮＡ塩基の両方、ならびに他の化学成分で構成され得る化学的に合成されたオリゴヌクレオチドであり、標的遺伝子位置でハイブリダイズしてミスマッチ塩基対（複数可）を形成するよう設計されている。このミスマッチ塩基対は細胞独自の天然遺伝子修復システムをその部位に向けるシグナルとして働き、遺伝子内の指定ヌクレオチド（複数可）を補正する（置換、挿入または欠失）。補正プロセスが終了した後、ＲＴＤＳ分子は分解され、現在修飾または修復中の遺伝子は、その遺伝子の通常の内在制御機構の下で発現される。

本明細書で開示している方法および組成物は、以下で詳細に記載する立体配座および化学的性質を有する「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」（ＧＲＯＮ）を用いて実施または作製することができる。本明細書で企図する「遺伝子修復オリゴ核酸塩基」は、「組換え可能オリゴ核酸塩基」、「ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド」、「キメラオリゴヌクレオチド」、「混合型二本鎖オリゴヌクレオチド」（ＭＤＯＮ）、「ＲＮＡＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）」、「遺伝子標的化オリゴヌクレオチド」、「ゲノプラスト」、「一本鎖修飾オリゴヌクレオチド」、「一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドミューテーターベクター」（ＳＳＯＭＶ）、「二本鎖突然変異ベクター」、および「ヘテロ二本鎖突然変異ベクター」を含めた他の名称を使用して、刊行済みの科学誌および特許文献中にも記載されている。遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、マイクロキャリア（バイオリスティックデリバリー）、マイクロファイバー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介取り込み、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションだけには限られないが、これらを含めた、当技術分野で一般に使用される任意の方法を使用して植物細胞に導入することができる。

一実施形態において、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、２’−ヒドロキシルとフルオロ、クロロもしくはブロモ官能基の置換または２’−Ｏ上の置換基の配置によって混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ型ヌクレオチドがＲＮａｓｅ耐性になった、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）である。適切な置換基はＫｍｉｅｃＩＩによって教示された置換基を含む。別の置換基には、米国特許第５，３３４，７１１号（Ｓｐｒｏａｔ）によって教示された置換基と特許公開ＥＰ６２９３８７およびＥＰ６７９６５７（まとめて、Ｍａｒｔｉｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）によって教示された置換基があり、これらは参照により本明細書に組み込まれている。本明細書で使用する、リボヌクレオチドの２’−フルオロ、クロロもしくはブロモ誘導体、またはＭａｒｔｉｎ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓもしくはＳｐｒｏａｔ中に記載された置換基で置換されたＴ−ＯＨを有するリボヌクレオチドは「Ｔ−置換リボヌクレオチド」と呼ばれる。本明細書で使用する用語「ＲＮＡ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃＩもしくはＫｍ
ｉｅｃＩＩによって教示された任意の非天然結合によって混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドと結合した、Ｔ−ヒドロキシルまたは２’−置換ヌクレオチドを意味する。本明細書で使用する用語「デオキシリボ型ヌクレオチド」は、非置換ホスホジエステル結合またはＫｍｉｅｃＩもしくはＫｍｉｅｃＩＩによって教示された任意の非天然結合によって遺伝子修復オリゴ核酸塩基の他のヌクレオチドと結合することができる、Ｔ−Ｈを有するヌクレオチドを意味する。

本発明の特定の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基は、非置換ホスホジエステル結合によってのみ結合した混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）である。代替実施形態では、結合は置換ホスホジエステル、ホスホジエステル誘導体、およびＫｍｉｅｃＩＩによって教示された非亜リン酸系結合による結合である。さらに別の実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中の各ＲＮＡ型ヌクレオチドは２’−置換ヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドの特に好ましい実施形態は、２’−フルオロ、Ｔ−メトキシ、２’−プロピルオキシ、２’−アリルオキシ、２’−ヒドロキシルエチルオキシ、２’−メトキシエチルオキシ、Ｔ−フルオロプロピルオキシおよび２’−トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレオチドである。２’−置換リボヌクレオチドのより好ましい実施形態は、２’−フルオロ、２’−メトキシ、２’−メトキシエチルオキシ、および２’−アリルオキシ置換ヌクレオチドである。別の実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドは非置換ホスホジエステル結合によって結合している。

１型の２’−置換ＲＮＡ型ヌクレオチドのみを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（ＭＤＯＮ）はより好都合に合成されるが、本発明の方法は、２型以上のＲＮＡ型ヌクレオチドを有する混合型二本鎖オリゴヌクレオチドで実施することができる。ＲＮＡセグメントの機能が、２つのＲＮＡ型トリヌクレオチド間へのデオキシヌクレオチドの導入により引き起こされる介入によって影響を受ける可能性はなく、したがって用語ＲＮＡセグメントは「介入ＲＮＡセグメント」などの用語を包含する。非介入ＲＮＡセグメントは隣接ＲＮＡセグメントと呼ばれる。代替実施形態では、ＲＮＡセグメントは改変ＲＮａｓｅ耐性および非置換２’−ＯＨヌクレオチドを含有し得る。混合型二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは１００個より少ないヌクレオチド、およびより好ましくは８５個より少ないヌクレオチド、ただし５０個を超えるヌクレオチドを有する。第１の鎖部分と第２の鎖部分はワトソン−クリックの法則に従い塩基対形成する。一実施形態では、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの鎖部分は、第１の鎖部分と第２の鎖部分が１つの３’末端と１つの５’末端を有する一本のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントであるように、一本鎖ヘキサ、ペンタまたはテトラヌクレオチドなどのリンカーによって共有結合する。３’末端と５’末端は「ヘアピンキャップ」の付加によって保護することができ、これにより３’末端と５’末端ヌクレオチドはワトソン−クリックの法則に従い隣接ヌクレオチドと塩基対形成する。さらに第２のヘアピンキャップを、第１の鎖部分と第２の鎖部分の間のワトソン−クリックの法則に従う塩基対形成が安定するように、３’末端と５’末端から離れた第１の鎖部分と第２の鎖部分の間の接合部に置くことができる。

第１の鎖部分と第２の鎖部分は、標的遺伝子の２セグメントと相同的である２領域を含有する、すなわち標的遺伝子と同じ配列を有する。相同領域はＲＮＡセグメントのヌクレオチドを含有し、結合ＤＮＡセグメントの１つまたは複数のＤＮＡ型ヌクレオチドを含有する可能性があり、介在ＤＮＡセグメント内に存在しないＤＮＡ型ヌクレオチドを含有する可能性もある。２つの相同領域は、「異種領域」と呼ばれる標的遺伝子の配列と異なる配列を有する領域によって隔てられ、それぞれ隣接している。異種領域は１、２または３個のミスマッチヌクレオチドを含有し得る。ミスマッチヌクレオチドは隣接する可能性があり、または代替的に、標的遺伝子と相同的である１個または２個のヌクレオチドによって隔てられる可能性がある。あるいは異種領域は、挿入物、または１、２、３もしくは５個以下のヌクレオチドも含有し得る。あるいは、混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの配列
は、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド由来の１、２、３もしくは５個以下のヌクレオチドの欠失のみ標的遺伝子の配列と異なる可能性がある。異種領域の長さと位置は、この場合、異種領域内に混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチドが存在しないが、欠失部分の長さであると考えられる。２つの相同領域と相補的である標的遺伝子の断片間の距離は、１つまたは複数の置換が考えられる異種領域の長さと同一である。異種領域が挿入物を含有する場合、相同領域は、遺伝子中のそれらの相補相同断片より遠く混合型二本鎖オリゴヌクレオチド中でそれによって隔てられており、異種領域が欠失をコードするときは逆のことが当てはまる。

混合型二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡセグメントは、それぞれ相同領域、すなわち標的遺伝子の断片と配列が同一である領域の一部分であり、これらのセグメントは、好ましくは少なくとも１３のＲＮＡ型ヌクレオチド、および好ましくは１６〜２５のＲＮＡ型ヌクレオチド、またはさらにより好ましくは１８〜２２のＲＮＡ型ヌクレオチド、または最も好ましくは２０のヌクレオチドを全体として含有する。一実施形態では、相同領域のＲＮＡセグメントは隔てられ、介在ＤＮＡセグメントと隣接、すなわち「結合」している。一実施形態では、異種領域のそれぞれのヌクレオチドは介在ＤＮＡセグメントのヌクレオチドである。混合型二本鎖オリゴヌクレオチドの異種領域を含有する介在ＤＮＡセグメントは、「ミューテーターセグメント」と呼ばれる。

本発明の別の実施形態では、遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドミューテーターベクター（ＳＳＯＭＶ）であり、それは、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳＯＯ／２３４５７、米国特許第６，２７１，３６０号、同第６，４７９，２９２号、および同第７，０６０，５００号中に開示されている。ＳＳＯＭＶの配列は、米国特許第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号、および同第６，０１０，９０７号中、ならびに国際公開Ｎｏｓ．ＷＯ９８／４９３５０、ＷＯ９９／０７８６５、ＷＯ９９／５８７２３、ＷＯ９９／５８７０２、およびＷＯ９９／４０７８９中に記載されたミューテーターベクターと同じ原理に基づく。ＳＳＯＭＶの配列は、ミューテーター領域と呼ばれる所望の遺伝子改変を含有する領域によって隔てられた、標的配列と相同的である２領域を含有する。ミューテーター領域は、標的配列中の相同領域を隔てる配列と同じ長さであるが、異なる配列を有する配列を有し得る。このようなミューテーター領域は置換を引き起こす可能性がある。あるいは、ＳＳＯＭＶ中の相同領域は互いに隣接している可能性があり、一方同じ配列を有する標的遺伝子中の領域は１個、２個以上のヌクレオチドにより隔てられている。このようなＳＳＯＭＶは、ＳＳＯＭＶが不在のヌクレオチドの標的遺伝子からの欠失を引き起こす。最後に、相同領域と同一である標的遺伝子の配列は標的遺伝子中では隣接しているが、ＳＳＯＭＶの配列中では１個、２個以上のヌクレオチドにより隔てられている可能性がある。このようなＳＳＯＭＶは標的遺伝子の配列における挿入を引き起こす。

ＳＳＯＭＶのヌクレオチドは、非修飾ホスホジエステル結合によって結合したデオキシリボヌクレオチドであるが、ただし１つの３’末端および／または５’末端ヌクレオチド間結合、または代替的に２つの３’末端および／または５’末端ヌクレオチド間結合がホスホロチオエートまたはホスホアミデートであり得る。本明細書で使用するヌクレオチド間結合は、ＳＳＯＭＶのヌクレオチドの間の結合であり、３’末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドとブロッキング置換基の間の結合は含まない。具体的実施形態では、ＳＳＯＭＶの長さは２１〜５５デオキシヌクレオチドであり、したがって相同領域の長さは全長少なくとも２０デオキシヌクレオチドであり、少なくとも２つの相同領域は少なくとも８デオキシヌクレオチドの長さをそれぞれ有するはずである。

標的遺伝子のコード鎖または非コード鎖のいずれかと相補的であるように、ＳＳＯＭＶを設計することができる。所望の突然変異が一塩基の置換であるとき、ミューテーターヌクレオチドと標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。所望の機能的結果の獲得と一致する範囲で、相補鎖中のミューテーターヌクレオチドと標的ヌクレオチドの両方がピリミジンであることが好ましい。特に好ましいのは、トランスバージョン突然変異をコードする、すなわちそれぞれ相補鎖中のＣまたはＴヌクレオチドとＣまたはＴミューテーターヌクレオチドがミスマッチである、ＳＳＯＭＶである。

効率の改善
本発明は、修復オリゴヌクレオチドを使用する、標的遺伝子の転換の有効性を高めるための幾つかの手法を記載し、それらは単独でまたは互いに組み合せて使用することができる。これらは以下を含む：
１．標的（ミスマッチ）部位にＤＮＡ修復機構を向ける修復オリゴヌクレオチドに対する修飾の導入。
Ａ．オリゴヌクレオチド（例えば、１０塩基以内、およびより好ましくは所望ミスマッチ部位の５塩基）における１つまたは複数の無塩基部位の導入により塩基切除修復（ＢＥＲ）中の中間体である損傷が生じ、それによってＢＥＲ機構を修復オリゴヌクレオチドによる転換標的の部位近辺に向ける。ｄスペーサー（無塩基フラン）修飾オリゴヌクレオチドは、例えばＴａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１０１７１−７９，１９８７中に記載されたように調製することができる。
Ｂ．オリゴヌクレオチド中へのまたはオリゴヌクレオチドと一緒のいずれかの、一本鎖または二本鎖切断を誘導する化合物の封入によって、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー仲介末端結合（ＭＭＥＪ）、および相同組換えにより修復される損傷が生じる。例えば、ブレオマイシンファミリーの抗生物質、ジンクフィンガー、ＦｏｋＩ（または任意のＩＩＳ型クラスの制限酵素）および他のヌクレアーゼを修復オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に共有結合させて、修復オリゴヌクレオチドによる転換標的の部位近辺に二本鎖切断を導入することが可能である。ブレオマイシンファミリーの抗生物質は、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびその他を含めたＤＮＡ切断糖ペプチドである。
Ｃ．オリゴヌクレオチド（例えば、１０塩基以内、およびより好ましくは所望ミスマッチ部位の５塩基）に取り込まれる１つまたは複数の８’オキソｄＡまたはｄＧの導入によって、反応性酸素種によって生成する損傷と類似した損傷が生じる。これらの損傷はいわゆる「助長型修復」系を誘導する。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７：６５７−６２，２００４を参照。
２．修復オリゴヌクレオチドの安定性の増大：
修復オリゴヌクレオチド上に３’ブロッキング末端を作製するためのオリゴヌクレオチドの３’末端における逆向き塩基（ｉｄＣ）の導入。
修復オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端における、ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる１つまたは複数の２’Ｏ−メチルヌクレオチドまたは塩基の導入（例えば、ＷＯ２００７／０７３１４９参照）。
修復オリゴヌクレオチドの５’末端における複数の２’Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチドの導入、所望のミスマッチ部位をもたらすＤＮＡ塩基が生じ、それによって岡崎フラグメント様核酸構造を生成する。
アクリジン、ソラレン、臭化エチジウムおよびサイバー染色液などの結合（５’または３’）挿入色素。
Ｔ／Ａクランプ、コレステロール成分、ＳＩＭＡ（ＨＥＸ）、リボＣおよびアミダイトなどの５’末端キャップの導入。
ホスホチオエート、２’Ｏ−メチル、メチルホスホネート、ロックド核酸（ＬＮＡ）、（ＭＯＥ）（メトキシエチル）、ジＰＳおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの骨格修飾。
例えばシスプラチンおよびマイトマイシンＣなどの鎖間架橋試薬物質による、修復オリ
ゴヌクレオチドの架橋。
Ｃｙ３、ＤＹ５４７、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５およびＤＹ６４７などの蛍光色素との結合。
３．ハイブリダイゼーションエネルギーを増大させる塩基の取り込みによる、修復オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションエネルギーの増大（例えば、ＷＯ２００７／０７３１４９参照）。
４．合成用の構成単位としてヌクレオチドマルチマー（ジマー、トリマー、テトラマーなど）を使用することによる、修復オリゴヌクレオチド合成の質の向上。これによって、より少ないカップリングステップ、および構成単位からの完全長産物の容易な分離をもたらす。
５．好ましくは修復オリゴヌクレオチド中に２個以上の標的突然変異がある、長鎖修復オリゴヌクレオチド（すなわち、５５ヌクレオチド長を超える、好ましくは７５〜３００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド長、および最も好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド長）の使用。

前述の手法の例を以下の表中に与える。

前述の修飾は、メチル化、５’挿入色素、５’と３’末端に対する修飾、骨格修飾、架橋剤、環化、および「キャップ」、およびイノシンなどのアナログと１つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの置換などの、周知のヌクレオチド修飾も含み得る。ヌクレオチドの修飾は、アクリジン、アミン、ビオチン、カスケードブルー、コレステロール、Ｃｙ３＠、Ｃｙ５＠、Ｃｙ５．５＠、ダボイル、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、エダンス、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＩＲＤ−７００、ＩＲＤ−８００、ＪＯＥ、ホスフェートソラレン、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ−Ｓ’’、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ°、マリーナブルー＠、パシフィックブルー＠、オレゴングリーン＠、ローダミングリーン＠、ローダミンレッド＠、ロドールグリーン＠およびテキサスレッド＠の付加を含む。ポリヌクレオチド骨格修飾には、メチルホスホネート、２’−ＯＭｅメチルホスホネートＲＮＡ、ホスホロチオレート、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅＲＮＡがある。塩基修飾には、２−アミノ−ｄＡ、２−アミノプリン、３’−（ｄｄＡ）、３’ｄＡ（コルジセピン）、７−デアザ−ｄＡ、８−Ｂｒ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＡ、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ、無塩基部位（ｄスペーサー）、ビオチンｄＴ、２’−ＯＭｅ−５Ｍｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｃ、３’−（５−Ｍｅ−ｄＣ）、３’−（ｄｄＣ）、５−Ｂｒ−ｄＣ、５−１−ｄｕｃ、５−Ｍｅ−ｄＣ、５−Ｆ−ｄＣ、カルボキシ−ｄＴ、転換可能ｄＡ、転換可能ｄＣ、転換可能ｄＧ、転換可能ｄＴ、転換可能ｄＵ、７−デアザ−ｄＧ、８−Ｂｒ−ｄＧ、８−オキソ−ｄＧ、Ｏ６−Ｍｅ−ｄＧ、Ｓ６−ＤＮＰ−ｄＧ、４−メチル−インドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−イノシン、２’−ｄｌ、ｏ６−フェニル−ｄｌ、４−メチル−インドール、２’−デオキシネブラリン、５−ニトロインドール、２−アミノプリン、ｄＰ（プリンアナログ）、ｄＫ（ピリミジンアナログ）、３−ニトロピロール、２−チオ−ｄＴ、４−チオ−ｄＴ、ビオチン−ｄＴ、カルボキシ−ｄＴ、０４−Ｍｅ−ｄＴ、０４−トリアゾ
ール−ｄＴ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、２’−ｄＵ、５−Ｆ−ｄＵ、５−ｌ−ｄＵ、０４−トリアゾール−ｄＵがある。前記用語は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、その骨格が糖ではなくＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなる擬似ペプチドであるＤＮＡアナログも包含する。ＰＮＡはＤＮＡの挙動を模倣し、相補核酸鎖と結合する。ＰＮＡの中性骨格は、通常得られるものより強い結合と高い特異性をもたらす。さらに、強力な生体分子ツール、アンチセンスおよび抗原物質、分子プローブおよびバイオセンサーを生み出すため、ＰＮＡの独自の化学的、物理的および生物学的性質が利用されている。

オリゴ核酸塩基は、ニック（複数可）、ギャップ（複数可）、修飾オリゴヌクレオチド骨格、無塩基部位ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、または他の化学成分を有する可能性がある。さらなる実施形態では、オリゴ核酸塩基の少なくとも一本の鎖は、少なくとも１つの他の修飾ヌクレオチド、例えばＭＯＥ（メトキシエチル）などの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、コレステリル誘導体と結合した末端ヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基部位ヌクレオチド（核酸塩基は欠失状態であるかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ／ＧｌｅｎＲｅｐｏｒｔｓ／ＧＲ２１−１４．ｈｔｍｌを参照）、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミダイト、および非天然塩基含有ヌクレオチドを含む。様々な塩、混合塩および遊離酸型も含まれる。

好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミダイトおよびアミノアルキルホスホラミダイト、チオノホスホラミダイトを含めたホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常３’−５’結合を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、ならびに反転極性を有し１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’または２’−２’結合である骨格がある。反転極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、３’の大部分のヌクレオチド間結合に１つの３’−３’結合、すなわち無塩基であり得る（核酸塩基が欠失状態であるかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）１つの反転ヌクレオシド残基を含む。結合反転の最も一般的な用途は、ホスホロチオエート骨格を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの末端への３’−３’結合の付加である。３’−３’結合は、２個の５’−ＯＨ末端と０個の３’−ＯＨ末端を有するオリゴヌクレオチドを作製することによって、エクソヌクレアーゼ分解に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに安定化させる。結合反転は、「逆ホスホラミダイト」を使用することによって、オリゴヌクレオチド合成中に特定位置に導入することができる。これらの試薬は５’−ＯＨ位置にホスホラミダイト基、および３’−ＯＨ位置にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を有する。通常、ＤＭＴ保護基は５’−ＯＨ位置に存在し、ホスホラミダイト基は３’−ＯＨ位置に存在する。

修飾塩基の例には、２−アミノプリン、２’−アミノ−ブチリルピレン−ウリジン、２’−アミノウリジン、２’−デオキシウリジン、２’−フルオロ−シチジン、２’−フルオロ−ウリジン、２，６−ジアミノプリン、４−チオ−ウリジン、５−ブロモ−ウリジン、５−フルオロ−シチジン、５−フルオロウリジン、５−インド−ウリジン、５−メチル−シチジン、イノシン、Ｎ３−メチル−ウリジン、７−デアザ−グアニン、８−アミノヘキシル−アミノ−アデニン、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、２−チオ−チミン
、５−ヨード−ウリジン、５−ヨード−シチジン、８−ブロモ−グアニン、８−ブロモ−アデニン、７−デアザ−アデニン、７−ジアザ−グアニン、８−オキソ−グアニン、５，６−ジヒドロ−ウリジン、および５−ヒドロキシメチル−ウリジンがあるが、これらだけには限られない。これらの合成単位は市販されており（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙから購入可能）、化学合成によりＤＮＡに取り込むことができる。

糖成分の修飾の例は、３’−デオキシ化、２’−フルオロ化、およびアラビノシド化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。ＤＮＡ中へのこれらの取り込みも化学合成によって可能である。

５’末端修飾の例は、５’−アミノ化、５’−ビオチニル化、５’−フルオレセイン化、５’−テトラフルオロフルオレセイン化、５’−チオール化、および５’−ダブシル化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。

３’末端修飾の例は、３’−アミノ化、３’−ビオチニル化、２，３−ジデオキシ化、３’−チオール化、３’−ダブシル化、３’−カルボキシル化、および３’−コレステリル化であるが、しかしながらこれらに限られると解釈すべきではない。

好ましい一実施形態において、オリゴ核酸塩基は、リンカーを介して５’末端炭素に結合した５’ブロッキング置換基を含有することができる。リンカーの化学的性質はその長さ以外は重要ではなく、長さは好ましくは少なくとも６原子長でなければならず、リンカーは柔軟性でなければならない。ビオチン、コレステロールもしくは他のステロイドなどの様々な非毒性置換基、または非挿入剤カチオン性蛍光色素を使用することができる。オリゴ核酸塩基を作製するのに特に好ましい試薬は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｖａ．（現在ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってＣｙ３（商標）およびＣｙ５（商標）として販売されている試薬であり、これらは、オリゴヌクレオチドへの取り込みによって、３，３，３’，３’−テトラメチルＮ，Ｎ’−イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシアニン色素をそれぞれ生成するブロッキングホスホラミダイトである。Ｃｙ３が特に好ましい。インドカルボシアニンがＮ−オキシアルキル置換状態であるとき、５’末端ホスフェートを有するホスホジエステルとしてオリゴデオキシヌクレオチドの５’末端とそれを好都合に結合させることが可能である。市販のＣｙ３ホスホラミダイトを指示通り使用するとき、生じる５’修飾はブロッキング置換基とリンカーからなり、それらはまとめてＮ−ヒドロキシプロピル，Ｎ’−ホスファチジルプロピル３，３，３’，３’−テトラメチルインドモノカルボシアニンである。企図される他の色素には、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン、スルホローダミン１０１、メロシアニン５４０、Ａｔｔｏ５６５、Ａｔｔｏ５５０２６、Ｃｙ３．５、Ｄｙ５４７、Ｄｙ５４８、Ｄｙ５４９、Ｄｙ５５４、Ｄｙ５５５、Ｄｙ５５６、Ｄｙ５６０、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙおよびｍＣｈｅｒｒｙがある。

好ましい実施形態では、インドカルボシアニン色素はインドール環の３および３’位置でテトラ置換されている。理論について制限されずに、これらの置換基は色素が挿入色素となるのを妨げる。これらの位置における置換基の同一性は重要ではない。

本明細書に記載するオリゴ設計は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮｓ）またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲｓ）による部位特異的相同組換えを使用する遺伝子標的化だけには限られないが、これらを含めた他のＤＮＡ編集または組換え技術と組み合せて、より有効なドナー鋳型としても有用であり得る。

本発明は一般に、ゲノム細胞ＤＮＡの効率良い修飾および／または細胞のゲノムＤＮＡへのＤＮＡの組換えのための方法に関する。任意の特定用途に限られず、本発明の方法は、例えば、細胞に対する修飾の影響を決定する目的で細胞のゲノムに修飾を導入する際に有用である。例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列に修飾を導入して、修飾が酵素の酵素活性を変えるかどうかを決定する、および／または酵素の触媒領域の位置を決定することができる。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質のコード配列に修飾を導入して、タンパク質のＤＮＡ結合活性が変わるかどうかを決定することができ、したがってタンパク質内の特定ＤＮＡ結合領域をたどることができる。さらに別の代替は、非コード制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、制御ＲＮＡ配列（ｍｉＲＮＡ）など）に修飾を導入して、非コード制御配列と作動可能に連結した第２の配列の発現レベルに対する修飾の影響を決定することである。これは例えば、制御活性を有する特定配列を画定するのに望ましい可能性がある。

標的遺伝子の妨害をもたらすための一戦略は、部位特異的エンドヌクレアーゼにより引き起こされる一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断の発生によるものである。エンドヌクレアーゼは、藻類、植物、およびヒトを含めた巨大動物モデルなどの、より従来型の遺伝子標的法の影響を従来受けにくい生物における、標的遺伝子の妨害に最も頻繁に使用される。例えば、ＨＩＶ感染を治療および予防するための、ジンクフィンガーヌクレアーゼに関する現在進行中のヒト臨床試験が存在する。さらに、エンドヌクレアーゼ操作は、穀物中に望ましくない表現型をもたらす遺伝子を妨害する試みにおいて現在使用されている。

メガヌクレアーゼとしても知られるホーミングエンドヌクレアーゼは、それらの大きな（例えば１４ｂｐを超える）切断部位のため、高度の特異性でゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を発生させる配列特異的エンドヌクレアーゼである。それらの標的部位に対するホーミングエンドヌクレアーゼの特異性によって誘導型ＤＮＡ切断の正確な標的化が可能になるが、ホーミングエンドヌクレアーゼの切断部位は希少であり、標的遺伝子中の本来存在する切断部位を発見する確率は低い。

１クラスの人工エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼである。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼは、非特異的切断ドメイン、典型的にはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼのドメインと、特異的ＤＮＡ配列と結合するように操作したジンクフィンガータンパク質ドメインを組み合せる。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのモジュラー構造によって、それらはゲノムに部位特異的二本鎖切断をもたらす用途の広い基盤となる。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼの１つの制約は、標的部位に対する低い特異性またはゲノムにおける多数の標的部位の存在が、オフターゲット切断事象をもたらし得ることである。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼはジマーとして切断するので、オフターゲット切断事象を予防するための一戦略は、隣接９塩基対部位で結合するジンクフィンガードメインの設計となっている。

ＴＡＬＥＮは、特異的ＤＮＡ部位への一本鎖および二本鎖切断の誘導に使用される標的化可能ヌクレアーゼであり、次いでそれらは切断部位に配列変化を作製するのに利用可能な機構により修復される。

ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合領域を操作するのに使用される基本構成単位は、キサントモナス種プロテオバクテリアによってコードされる、天然に存在するＴＡＬＥ由来の高度に保存された反復ドメインである。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ結合は、反復単位のアミノ末端とカルボキシ末端で別のＴＡＬＥ由来ドメインと隣接した、高度に保存された３３〜３５アミノ酸反復単位のアレイによって仲介される。

これらのＴＡＬＥ反復単位はＤＮＡの一塩基と特異的に結合し、その同一性は、反復単位の位置１２と１３に典型的に見られる２つの超可変残基、および所望標的核酸の長さに相当するアレイ中の反復単位の数、標的核酸配列とマッチするよう選択した反復単位の同一性によって決定される。標的部位の選択性を最大にするため、標的核酸は１５〜２０塩基対であることが好ましい。標的核酸の切断は、典型的にＴＡＬＥＮ結合の５０塩基対以内で起こる。ＴＡＬＥＮ認識部位設計に関するコンピュータプログラムは当技術分野で記載されている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１１ Ｊｕｌｙ；３９（１２）：ｅ８２を参照。

所望標的配列とマッチするよう設計した後、ＴＡＬＥＮを組換えによって発現させ、外来タンパク質としてプロトプラストに導入し、またはプロトプラスト内でプラスミドから発現させることが可能である。

別のクラスの人工エンドヌクレアーゼは操作型メガヌクレアーゼである。操作型ホーミングエンドヌクレアーゼは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼの特異性を改変することにより生成する。一手法では、本来存在するホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列に変異を導入し、次いで生成した操作型ホーミングエンドヌクレアーゼをスクリーニングして、標的結合部位を切断する機能性タンパク質を選択する。別の手法では、キメラホーミングエンドヌクレアーゼを、２つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位を組み合せて各ホーミングエンドヌクレアーゼの半分の部位で構成される新たな認識部位を作製することによって操作する。

他のＤＮＡ修飾分子を標的遺伝子組換えにおいて使用することができる。例えば、ペプチド核酸を使用して、１つまたは複数の標的細胞のゲノムに対する修飾を誘導することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｅｃｋｅｒへの米国特許第５，９８６，０５３号を参照）。簡単に言うと、部分的ペプチド骨格を少なくとも含む合成ヌクレオチドを使用して、相同ゲノムヌクレオチド配列を標的化する。二重らせんＤＮＡとの結合によって、またはペプチド核酸と連結した変異原性化学物質を介して、標的ＤＮＡ配列の修飾および／または組換えが起こるよう誘導する。標的特異性は、標的配列とゲノム配列の間の配列相同性の程度によって決定する。

さらに本発明は、ゲノム配列の修飾を実施するため本明細書で使用する個々の方法に限られない。実際、幾つかの方法が企図される。例えば、三重ヘリックス形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）を使用して遺伝子を標的化することができる。ＴＦＯは合成により、例えばＰＣＲにより、または遺伝子合成装置の使用により作製することができる。さらに、適切な天然配列が見られる場合、ゲノムＤＮＡからＴＦＯを単離することができる。例えばソラレンまたはクロラムブシルだけには限られないがこれらなどの変異原性化学物質との結合を含めた、幾つかの方法においてＴＦＯを使用することができる（例えば、Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８７９−７８８３，１９９３；Ｈａｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ６７：７３２３−７３３１，１９９３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：１７５９−１７６８，１９９５；Ｔａｋａｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：５６０２−５６０６，１９９１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ２５：３４４０−３４４４，１９９７を参照）。さらに例えば、ＴＦＯはドナー二本鎖ＤＮＡと結合させることが可能である（例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７２：１１５４１−１１５４８，１９９９を参照）。ＴＦＯは誤りがちの修復を誘発するのに十分なアフィニティーでの結合により作用することもできる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：８０２−８０５，１９９６）。

本発明の方法は、使用するＤＮＡ修復試薬の性質または型に制約を受けない。例えば、このようなＤＮＡ修復試薬はラジカルを放出し、これによってＤＮＡ鎖切断をもたらす。あるいは、試薬はＤＮＡをアルキル化して、複製および転写を遮断し得る付加体を形成する。別の代替では、試薬は細胞酵素を阻害する架橋または分子をもたらし、鎖切断をもたらす。オリゴヌクレオチドに結合してＴＦＯを形成するＤＮＡ修復試薬の例には、インドロカルバゾール、ナフタレンジイミド（ＮＤＩ）、トランスプラチン、ブレオマイシン、シクロプロパピロールインドールのアナログ、およびフェナントジヒドロジオキシンがあるが、これらだけには限られない。特に、インドロカルバゾールはトポイソメラーゼＩ阻害剤である。これらの酵素の阻害は、鎖切断およびＤＮＡタンパク質付加体形成をもたらす［Ａｒｉｍｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．８，７７７，２０００］。ＮＤＩはグアニンを酸化することができる光酸化剤であり、これはグアニン残基の部位に突然変異を引き起こす可能性がある［Ｎｕｎｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９，６１９０，２０００］。ＴＦＯが試薬と結合したとき、トランスプラチンが三本鎖標的中のＤＮＡと反応することが示されている。この反応は、突然変異誘発性であるＤＮＡ付加体の形成を引き起こす［Ｃｏｌｕｍｂｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：４５１９，１９９６］。ブレオマイシンは、放射性模倣体として広く使用されているＤＮＡ切断物質である。それはオリゴヌクレオチドと結合し、その形式で切断物質として活性があることが示されている［Ｓｅｒｇｅｙｅｖ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２３，４４００，１９９５；Ｋａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１６７１５，１９９５］。シクロプロパピロールインドールのアナログはＴＦＯと結合し、三本鎖標的配列中のＤＮＡをアルキル化することが示されている。したがってアルキル化ＤＮＡは、突然変異誘発性である化学的付加体を含有する［Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５，５０７７，１９９７］。フェナントジヒドロジオキシンは、光活性化によりラジカル種を放出する遮蔽キノンである。それらはＴＦＯと結合し、光活性化により二本鎖ＤＮＡに切断をもたらすことが示されている［Ｂｅｎｄｉｎｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９，５５５，１９９８］。

修飾および／または組換えを誘導する他の方法は本発明によって企図される。例えば別の実施形態は、外来ＤＮＡ断片と標的遺伝子の間の、または標的部位に対するアフィニティーがあるペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用による相同組換えの誘導に関する（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１２８８−１２９２，１９８９を参照）。さらに他の方法は、ポリアミドによる配列特異的ＤＮＡ認識および標的化（例えば、Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ３：６８８−６９３，１９９９；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８：２１４３−２１５１，１９９９を参照）、および部位特異的活性を有するヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼおよび／またはＣＲＩＳＰＲ）の使用を含む。

本発明は、任意の特定の修飾および／または組換え頻度に限られない。本発明の方法は、標的ヌクレオチド配列において０．２％〜３％の修飾頻度をもたらす。それでもなお、任意の（すなわち、０％と１００％の間の）修飾および／または組換え頻度が本発明の範囲内にあると企図される。修飾および／または組換え頻度は、修飾および／または組換えを誘導するために使用する方法、使用する細胞型、特異的標的遺伝子、および存在する場合使用するＤＮＡ突然変異誘発試薬に依存する。さらに、修飾および／または組換えを検出するために使用する方法は、検出法における制約のため、全ての修飾および／または組換えの発生を検出できるわけではない。その上、幾つかの修飾および／または組換え事象はサイレント状態であり、修飾および／または組換えが生じた検出可能な指標を与えない可能性がある。サイレント状態の修飾および／または組換え事象の検出不能は、修飾および／または組換えの人為的に低い推定値をもたらす。これらの理由、および他の理由のた
め、本発明は任意の特定の修飾および／または組換え頻度に限られない。一実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．０１％と１００％の間である。別の実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．０１％と５０％の間である。さらに別の実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．１％と１０％の間である。他のさらに別の実施形態では、修飾および／または組換え頻度は０．１％と５％の間である。

本明細書で使用する用語「突然変異の頻度」は、細胞のゲノム中の標的部位に突然変異を導入することができるＤＮＡ修飾分子で処置した細胞の集団を言及する際には、ＤＮＡ修飾分子で処置した細胞の合計数と比較した、標的部位に突然変異を含有する処置集団中の細胞の数を指す。例えば、細胞のゲノム中の標的部位に突然変異を導入するよう設計したソラレン結合ＤＮＡ修飾分子ＴＦＯで処置した細胞の集団に関しては、５％の突然変異の頻度は、ＴＦＯ−ソラレンで処置した合計１００細胞のうち、５細胞が標的部位に突然変異を含有することを意味する。

本発明は細胞中のＤＮＡの任意の精度の修飾および／または組換えに限られず、本発明の幾つかの実施形態は、望む結果に応じてより高い精度を必要とすることが企図される。例えば、遺伝子修復を必要とする特異的配列変化（例えば、特定塩基の変化）は、遺伝子の妨害のみが必要である遺伝子ノックアウトの発生と比較して、より高い精度を必要とする。本発明の方法を用いると、従来技術の方法を用いるより、高レベルの修飾および／または相同組換え技法の精度を得る可能性が高くなる。

植物細胞への遺伝子修復オリゴ核酸塩基の送達
植物細胞を形質転換するのに使用される任意の一般に知られる方法を、遺伝子修復オリゴ核酸塩基の送達に使用することができる。例示的な方法を以下に列挙する。本発明は、１つまたは複数のＤＮＡ修飾試薬で細胞をトランスフェクトするための多くの方法を企図する。実際本発明は、任意の特定の方法に限られない。１つまたは複数の細胞にＤＮＡ修飾試薬を導入するための方法は当技術分野でよく知られており、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、受動吸着、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、リポソーム融合、リポフェクション、ヌクレオフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、バイオリスティクス（すなわち、パーティクルボンバードメント）などだけには限られないが、これらを含む。

投射浸透によりセルロース細胞壁を有する植物細胞にＤＮＡの巨大断片を導入するための金属製マイクロキャリア（ミクロスフェア）の使用は、当業者にはよく知られている（以後バイオリスティック送達）。米国特許第４，９４５，０５０号、同第５，１００，７９２号および同第５，２０４，２５３号は、それらの投射用マイクロキャリアおよびデバイスの選択に関する一般的な技法を記載する。

本発明の方法におけるマイクロキャリアの使用に関する具体的条件は国際公開ＷＯ９９／０７８６５中に記載されている。例示的一技法では、氷冷マイクロキャリア（６０ｍｇ／ｍＬ）、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド（６０ｍｇ／ｍＬ）、２．５ＭのＣａＣｌ₂
および０．１Ｍのスペルミジンをこの順で加え、混合物を軽く撹拌し、例えば１０分間撹拌し、次いで室温で１０分間放置し、この場合マイクロキャリアは５倍体積のエタノールに希釈し、遠心分離し１００％エタノールに再懸濁する。マイクロキャリア８〜１０μｇ／μＬ、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド１４〜１７μｇ／ｍＬ、ＣａＣｌ₂１．１〜１
．４Ｍおよびスペルミジン１８〜２２ｍＭの接着溶液中濃度で良い結果を得ることができる。マイクロキャリア８μｇ／μＬ、混合型二本鎖オリゴヌクレオチド１６．５μｇ／ｍＬ、ＣａＣｌ₂１．３Ｍおよびスペルミジン２１ｍＭの条件下で最適な結果を観察した。

細胞壁および細胞膜に浸透させるためのマイクロファイバーを使用して本発明を実施するため、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入することもできる。Ｃｏｆｆｅｅ ｅｔ ａｌへの米国特許第５，３０２，５２３号は、ブラックメキシカンスイートトウモロコシの懸濁培養物の形質転換を容易にするための炭化珪素繊維の使用を記載する。マイクロファイバーを使用した植物細胞の形質転換のためのＤＮＡ導入に使用することができる任意の機械的技法を使用して、トランスミューテーション用の遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達することができる。

遺伝子修復オリゴ核酸塩基のマイクロファイバー送達に関する例示的な技法は以下の通りである。滅菌マイクロファイバー（２μｇ）を、約１０μｇの混合型二本鎖オリゴヌクレオチドを含有する１５０μＬの植物培養培地に懸濁させる。懸濁培養物を沈殿させ、同体積の充填細胞および滅菌ファイバー／ヌクレオチド懸濁液を１０分間撹拌し平板培養する。個々の形質に適したように、選択培地に直後に、または最大約１２０時間遅らせて施用する。

代替実施形態では、植物の一部に由来するプロトプラストのエレクトロポレーションにより、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を植物細胞に送達することができる。当業者によく知られる技法に従い、プロトプラストは植物の一部、特に葉の酵素処置によって形成される。例えば、Ｇａｌｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ，１９９６，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ５５：８９−１０７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．；Ｋｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ１３３：２１３−２２１，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪを参照。エレクトロポレーション前に、プロトプラストを増殖培地中で培養する必要はない。エレクトロポレーションに関する例示的な条件は、３回、０．３ｍＬの合計体積中に１０．懸濁液、５．プロトプラスト、および０．６〜４μｇ／ｍＬの遺伝子修復オリゴ核酸塩基濃度である。

代替実施形態では、当業者によく知られる技法に従い、膜修飾物質ポリエチレングリコールの存在下で植物プロトプラストに核酸を取り込ませる。別の代替実施形態では、マイクロキャピラリーを用いて植物細胞またはプロトプラストにそれを注入することにより、遺伝子修復オリゴ核酸塩基を送達することができる。

代替実施形態では、アルギン酸カルシウムで構成されるマイクロビーズ中に核酸を包埋し、膜修飾物質ポリエチレングリコールの存在下で植物プロトプラストに取り込ませる（例えば、Ｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００４を参照）。

代替実施形態では、核酸を水中で凝固させ、マイクロ粒子の型でボンバードメントにより植物細胞に導入する（例えば、Ｇｉｌｍｏｒｅ，１９９１，米国特許第５，２１９，７４６号；Ｂｒｉｎｅｇａｒ ｅｔ ａｌ．を参照）。

代替実施形態では、ナノ粒子と結合した核酸を、ナノ粒子を含有する懸濁液中での細胞のインキュベーションによって（例えば、Ｐａｓｕｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００８を参照）、またはパーティクルボンバードメントを介して完全細胞にそれらを送達することにより、または共インキュベーションによりプロトプラストに送達することにより（例えば、Ｔｏｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００７を参照）、完全植物細胞中に導入する。

代替実施形態では、核酸は浸透ペプチドと複合体形成し、共インキュベーションにより細胞に送達する（例えば、Ｃｈｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＷＯ２００８１４８２２３ Ａ１；Ｅｕｄｅｓ ａｎｄ Ｃｈｕｇｈを参照）。

代替実施形態では、エレクトロポレーションを介して完全細胞に核酸を導入する（例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＵＳ２００３／０１１５６４１Ａｌ，Ｄｏｂｒｅｓ
ｅｔ ａｌ．を参照）。

代替実施形態では、核酸を含む溶液中にそれらを浸すことにより、乾燥胚の細胞に核酸を送達する（例えば、Ｔｏｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｓｅｎａｒａｔｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９１を参照）。

植物の選択
様々な実施形態において、本明細書で開示している植物は、高木もしくは低木として成長する任意の樹木植物種、任意の草本植物種、または可食果実、種子もしくは野菜を生成する任意の種、または有色もしくは芳香性品種の花を生成する任意の種を含めた、任意の種の双子葉植物、単子葉植物または裸子植物であってよい。例えば植物は、それらが既に具体的に言及されていない限り、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、マメ科マメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、ユリ、および堅果産生植物からなる群の植物種から選択することができる。

植物および植物細胞は、当技術分野で一般的に知られている方法を使用して、例えば除草剤の存在下で植物または植物細胞を成長させ、除草剤の不在下での成長速度と比較した成長速度を測定することによって、除草剤に対する抵抗性または耐性に関して試験することができる。

本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な成長は、対応する植物、植物器官、植物組織、または野生型ＡＨＡＳタンパク質を発現する植物細胞における成長速度または細胞分裂速度の少なくとも３５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７５％である、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の成長速度または細胞分裂速度として定義する。

本明細書で使用する、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な発生は、対応する植物、植物器官、植物組織、または野生型タンパク質を発現する植物細胞で起こる事象と実質的に同じ、植物、植物器官、植物組織または植物細胞における１つまたは複数の発生事象の出現として定義する。

特定の実施形態において、本明細書で提供する植物器官には、葉、茎、根、枝芽、花芽、分裂組織、胚、子葉、内胚乳、がく片、花弁、めしべ、心皮、おしべ、やく、小胞子、花粉、花粉管、胚珠、子房および果実、またはこれらから得る切片、薄片もしくは薄板があるが、これらだけには限られない。植物組織には、カルス組織、地下組織、脈管組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、苗条組織、根組織、菌こぶ組織、植物腫瘍組織、および生殖組織があるが、これらだけには限られない。植物細胞には、細胞壁を有する単離細胞、様々な大きさのそれらの凝集体、およびプロトプラストがあるが、これらだけには限られない。

植物に除草剤を施用し、同様に施用した非耐性の同様の植物によって与えられる曲線との比較時に右に移動した用量／応答曲線を与えるとき、植物は関連除草剤に実質的に「耐性がある」。このような用量／応答曲線はＸ軸にプロットされた「用量」、およびＹ軸にプロットされた「殺傷率」、「除草剤効果」などを有する。耐性植物は、所与の除草剤効果をもたらすのに、非耐性の同様の植物より多量の除草剤を必要とし得る。除草剤に実質的に「抵抗性がある」植物は、原野の雑草を殺傷するため農薬散布地域により典型的に利用される濃度と割合で除草剤を施用すると、示す場合でも、わずかな壊死、溶解、萎黄病または他の損傷を示す。除草剤に抵抗性がある植物は除草剤耐性でもある。

植物の作製
植物種の様々な組織の組織培養、およびそこからの植物の再生は知られている。例えば、組織培養によるキャノーラ品種の繁殖は、以下のいずれか、Ｃｈｕｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｒａｓｓｉｃａ
ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ４：４−６，１９８５；Ｂａｒｓｂｙ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｒａｐｉｄ
ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ，」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，１９９６）；Ｋａｒｔｈａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｐｌａｎｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｓｔｅｍ Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｒａｐｅ，「Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，３１：２１７−２２０，１９７４；Ｎａｒａｓｉｍｈｕｌｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｈｏｏｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｂｒａｓｓｉｃａｓ，」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇ１９８８）；Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｅ．，「Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ，」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６，Ｃｈａｐｔｅｒ１７，ｐ．１５９，１９９０だけには限られないが、これらのいずれかに記載されている。

変種のさらなる生殖を組織培養および再生によって行うことができる。ダイズの様々な組織の組織培養およびそこからの植物の再生は、よく知られており広く公開されている。例えば、Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｘ Ｓｕｃｒｏｓｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｓｏｙｂｅａｎ」，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．３１：３３３−３３７，１９９１；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，「Ａｇｒｏｎｏｍｉｃ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ−Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｐｌａｎｔｓ」，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８２：６３３−６３５，１９９１；Ｋｏｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，「Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｓ ａｓ Ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｉｎ Ｓｏｙｂｅａｎｓ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｇｒａｃｉｌｉｓ Ｓｋｖｏｒｔｚ ａｎｄ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｌ．）Ｍｅｒｒ．」Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ，２８：１０３−１１３，１９９２；Ｄｈｉｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｔｉｌｅ Ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｓｏｙｂｅａｎ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．Ｍｅｒｒ．）；Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ１１：２８５−２８９，１９９２；Ｐａｎｄｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，「Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ
Ｌｅａｆ ａｎｄ Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ Ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｗｉｇｈｔｉｉ（Ｗ．ａｎｄ Ａ．）ＶＥＲＤＣ．ｖａｒ．ｌｏｎｇｉｃａｕｄａ」，Ｊ
ａｐａｎ Ｊ．Ｂｒｅｅｄ．４２：１−５，１９９２；ａｎｄ Ｓｈｅｔｔｙ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｈｏｏｔ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（Ｍｅｒｒｉｌｌ．）ｂｙ Ａｌｌａｎｔｏｉｎ ａｎｄ Ａｍｉｄｅｓ」，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ８１：２４５−２５１，１９９２を参照することができる。１９９１年６月１８日に発行されたＣｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌへの米国特許第５，０２４，９４４号および１９９１年４月１６日に発行されたＲａｎｃｈ ｅｔ ａｌへの米国特許第５，００８，２００号の開示は、参照によりそれらの全容が本明細書に組み込まれている。

ＧＲＯＮの長さ
Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：１１５−２２，２００６）は、一ヌクレオチド変化を利用し緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）変異体において青色蛍光と緑色蛍光を転換する、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子転換を検出するためのレポーターシステムを記載する。このレポーターシステムを、モデル種としてシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）を使用しＧＲＯＮ長修飾後のＧＲＯＮ転換の効率を評価した、以下の実験中での使用に適合させた。

要約すると、この実施例および後の実施例用に、青色蛍光タンパク質遺伝子の多数のコピーを有するシロイヌナズナ系統を、当業者に知られる方法によって作製した（例えば、Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ，１９９８を参照）。根部由来分裂組織培養物をこの系統で樹立し、これをプロトプラスト単離および培養に使用した（例えば、Ｍａｔｈｕｒ
ｅｔ ａｌ．，１９９５を参照）。プロトプラストへのＧＲＯＮ送達は、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介ＧＲＯＮ取り込みによって実施した。Ｆｕｊｉｗａｒａ ａｎｄ Ｋａｔｏ（２００７）によって記載された方法と類似した、９６ウエル形式を使用する方法を使用した。以下に、そのプロトコールを簡潔に記載する。所与の体積は、９６ウエル皿の個々のウエルに施用した体積である。

１．９６ウエルプレートの各ウエルにおいて、５×１０⁶細胞／ｍｌで６．２５μｌの
ＧＲＯＮ（８０μＭ）と２５μｌのシロイヌナズナＢＦＰトランスジェニック根部分裂組織由来プロトプラストを混合する。

２．３１．２５μｌの４０％ＰＥＧ溶液を加えプロトプラストを混合した。

３．処置した細胞を氷上で３０分間インキュベートした。

４．各ウエルに２００μｌのＷ５溶液を加え細胞を混合した。

５．プレートを氷上で３０分間インキュベートし、各ウエルの底部にプロトプラストを沈殿させた。

６．沈殿したプロトプラスト上の培地２００μｌを除去した。

７．８５μｌの培養培地（ＭＳＡＰ，Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を加えた。

８．プレートは４８時間暗所において室温でインキュベートした。培養培地添加後のＧＲＯＮの最終濃度は８μＭである。

ＧＲＯＮ送達後４８時間で、サンプルをフローサイトメトリーによって分析し、その緑
色蛍光と黄色蛍光が対照プロトプラストのそれと異なるプロトプラストを検出した（ＢＦＰ０はＢＦＰ標的と比較して変化がない非標的ＧＲＯＮを示し、Ｃはコード鎖設計であり、ＮＣは非コード鎖設計である）。ＢＦＰ４分子の中心においてＣ→Ｔの１ヌクレオチド差（コード鎖）またはＧ→Ａのヌクレオチド標的突然変異（非コード鎖）。緑色蛍光はＢＦＰ遺伝子における標的突然変異の導入によって引き起こされ、ＧＦＰの合成をもたらす。結果は図１中に示す。

以下の表は、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子から緑色蛍光への転換用に設計した、例示的な１０１量体および２０１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’−３ＰＳ／３’−３ＰＳＧＲＯＮの配列を示す。（３ＰＳは、５’と３’オリゴ末端それぞれにおける３個のホスホチオエート結合を示す）。

５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮを使用した転換率
この実験系の目的は、（ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ成分を有する）ホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮと、５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮの効率を比較することである。５’Ｃｙ３／３’ｉｄＣ標識ＧＲＯＮは、５’Ｃｙ３フルオロフォア（アミダイト）および３’ｉｄＣ逆向き塩基を有する。青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）から緑色蛍光への転換を使用して効率を評価した。

個々のファルコンチューブ中（「チューブ」で標識）または９６ウエルプレート（「９６ウエル皿」で標識）のいずれかにおいてプロトプラストへのＧＲＯＮのＰＥＧ送達により行った、３つ全ての実験において、サイトメトリーにより測定して、ＢＦＰからＧＦＰへの転換効率において異なるＧＲＯＮの化学的性質の間に有意な差はなかった（図１）。

４１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’−３ＰＳ／３’−３ＰＳＧＲＯＮと岡崎フラグメントＧＲＯＮの間の比較
この実験系の目的は、ＤＮＡ切断を誘導するブレオマイシンファミリーのメンバー、ゼオシン（商標）（１ｍｇ／ｍｌ）の有無の下で、ＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ成分を有するホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮと「岡崎フラグメントＧＲＯＮ」の転換効率を比較することである。これらのＧＲＯＮの設計は図２中に示す。ＧＲＯＮはＰＥＧ処置によりシロイヌナズナＢＥＰプロトプラストに送達し、ＢＦＰからＧＦＰへの転換は処置後２４時間でサイトメトリーにより測定した。ゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）で処置したサンプルは、ＰＥＧ処置前に氷上で９０分間ゼオシンとインキュベートした。

一般に、サイトメトリーにより測定して、ゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在によってＢＦＰからＧＦＰへの転換は増大した（表２）。ゼオシンの存在下と不在下の両方で、ＧＲＯＮの５’末端における第１のＲＮＡ塩基上に１つの２’−ＯＭｅ基を含有するＮＣ岡崎フラグメントＧＲＯＮは、第１の９個の５’ＲＮＡ塩基のそれぞれに１つの２’−ＯＭｅ基を含有するＮＣ岡崎フラグメントＧＲＯＮと比較したとき、ＢＦＰからＧＦＰへの転換においてより有効であった（図２および表２）。

全ての実験において、サイトメトリーにより測定して、１ｍｇ／ｍｌのゼオシンの存在下と不在下の両方でＢＦＰからＧＦＰへの転換において、４１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’３ＰＳ／３’３ＰＳと、第１の５’ＲＮＡ塩基上に１つの５’２’−Ｏｍｅ基を含有する７１量体岡崎フラグメントＢＦＰ４／ＮＣＧＲＯＮ（ＢＦＰ４７１量体（１）ＮＣと示す）の間に有意な差はなかった（図２および表２）。ゼオシン（およびおそらくブレオマイシン、フレオマイシン、タリソマイシン、ペプレオマイシンおよびこの抗生物質ファミリーの他のメンバー）の存在下において、転換は鎖非依存的になる（すなわち、これらの実験中で試験した設計を有するＣＧＲＯＮとＮＣＧＲＯＮの両方がほぼ同じ活性を示す）ことを記すことは重要である。

４１量体、１０１量体、および２０１量体ＢＦＰ４／ＮＣ５’−３ＰＳ／３’−３ＰＳＧＲＯＮの間の比較
この実験系の目的は、（ゼオシンの有無の下で）、異なる長さのＧＲＯＮの各末端に３ＰＳ成分を有するホスホチオエート（ＰＳ）標識ＧＲＯＮの転換効率を比較することであった。４１量体、１０１量体、および２０１量体を表１中に示す。再度、サイトメトリーにより測定して、ゼオシン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在によってＢＦＰからＧＦＰへの転換率は増大した（表３）。３つの実験全てにおける大まかな傾向は、ゼオシンの存在下と不在下の両方でＮＣＧＲＯＮ長の増大に比例した。ゼオシン存在下でのＢＦＰ−４／ＮＣ／１０１とＢＦＰ−４／Ｃ／１０１以外、これは４１量体ＮＣＧＲＯＮとほぼ等しいがそれよりは低い転換率を有していた。これは、ＢＦＰ−４／４１コードおよび非コードＧＲＯＮを使用した前の全ての実験とは対照的であり、この場合非コードＧＲＯＮは常にコードＧＲＯＮより優れていた。転換頻度のこの非対称性は、この実験系で使用したＢＦＰ−４／２０１ＧＲＯＮにも当てはまった。

植物における転換を改善するためＧＲＯＮと組み合せたＣＲＩＳＰＲ。
ＣＲＩＳＰＲ複合体を構築する際に、３つの設計成分、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）、および標的領域（内在標的遺伝子中のプロト−スペーサー）を考慮に入れなければならない。

Ｃａｓ９
− それぞれ３５Ｓまたはコーンユビキチンによって誘導される、シロイヌナズナまたはコーンに最適化させた化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）コドンからのＣａｓ９遺伝子の一過的発現。最適化遺伝子はＧｅｎｅｗｉｚまたはＤＮＡ２．０によって合成された。ＮＢは隠れイントロンが生成されないことを確実にしなければならない。
− Ｇ１１５５に従うＲＢＣＳＥ９ターミネーター
− Ｃ末端融合体としての１つのＳＶ４０ＮＬＳ（ＰＫＫＲＫＶ）
− ベクター骨格は、いずれも本発明者らの一過的発現系−Ｇ１１５５に従うものである。

ｇＲＮＡ
− ＬｅＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３およびＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３に従うキメラトレーサーＲＮＡ−プレ−ｃｒｅＲＮＡの使用の提案。ＬｅＣｏｎｇ ｅｔ ａｌが、原型完全長トレーサー＋プレ−ｃｒｅＲＮＡ複合体が、キメラ型よりはるかに効率良く切断したことを示したことを記す。したがって一つの選択肢は、完全長（８９ｂｐ）トレーサーＲＮＡを使用したキメラの作製である。
− ｇＲＮＡの配列（（Ｎ）₂₀はガイド配列を表す）。括弧付きの配列は完全長８９ｂｐ型を含む。
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧ（ＴＴＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴ）

Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌからの以下の図は原型複合体とキメラを示す：

− ｇＲＮＡはシロイヌナズナにおいてＡｔＵ６ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターの下で発現する（配列は以下に与える）。コーンでは、ＺｍＵ６ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターが使用可能である。これらの選択はＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００８に基づく。
− Ｇ１１５５に従うＲＢＣＳＥ９ターミネーターまたはＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３に従う一連のターミネーター、および一成分手法を以下に示す。

Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌからのＵ６プロモーター配列
標的領域
−ガイド配列の特異性を標的領域配列によって定義する。モデル生物の選択とは無関係に、これはＢＦＰのＹ６６Ｈ遺伝子座である。Ｙ６６Ｈ近辺のＰＡＭ（ＮＧＧ）配列は唯一の設計制限配列である。さらに、３’における１２ｂｐのガイド配列にＹ６６Ｈ位置（「シード配列」）を含めることは、修復が実施された後、その部位は再度切断されないことを意味する。

Ｇ１１５５と異なるベクター骨格が、Ｃａｓ９とｇＲＮＡの同時送達を可能にするため必要となる。この問題は一成分手法を用いて回避される。

一成分手法
ＬｅＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）は、以下に略述するような、ｐｏｌＩＩＩＵ６プロモーターの誘導により１つの一過的構築物としてｇＲＮＡとＣａｓ９の両方を発現させる、簡略化された手法を使用した。このように、所与の穀物に関して、ガイド挿入配
列を単に交換することによって多数の遺伝子を標的化することができる。本発明者らは、ＥＦ１αプロモーターを穀物に適したプロモーターと交換する（ｐＭＡＳとＡｔ、ＵｂｉとＺｉｍ）。ターミネーターに関して、本発明者らはＲＢＣＳＥ９を使用する。植物において使用するＮＬＳは、前に略述した１つのＣ末端ＳＶ４０である。

以下の構築物において、トレーサーＲＮＡ領域が含まれない切断型ｇＲＮＡを使用することを記す。著者らは、ヒト中で、これはＣａｓ９の誘導において完全長型より有効性が低かったことを示した。したがって、ここでは完全長ｇＲＮＡを使用することを提案する。特に、酵母においてＣＲＩＳＰＲを使用した後の論文において、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ
ａｌ．（２０１３）は完全長型を使用した。カセットはＧ１１５５バックグラウンドにクローニングされ得る。

キメラｃｒＲＮＡ用発現ベクターの概略。アニーリングオリゴヌクレオチドを使用して、ガイド配列を２ＢｂｓＩ部位間に挿入することができる。ベクターは、部分的誘導反復単位（グレー）および部分的トレーサーＲＮＡ（赤）配列を既に含有する。ＷＰＲＥ、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後制御エレメント。

Ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
一過的選択肢
− 植物において標的認識およびヌクレアーゼ活性を確認するための一手法は、ＴＡＬＥＮに関してＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）が使用したＹＦＰ一本鎖アニーリングアッセイに匹敵する。スペーサー配列（標的配列）およびＰＡＭはＹＦＰまたは同等遺伝子に挿入する必要がある。
一過的選択肢
− ＴＡＬＥＮ−ＢＦＰシステムを対照として使用することが可能である。
− 前述の手法は、所与のスペーサー配列に関する所与のＣＲＩＳＰＲシステムの機能を確認するための現在のツールであるが、植物におけるＣＲＩＳＰＲの活性の概念を証明するのはＧＦＰシステムの使用である。
− 本明細書においてＢＦＰ→ＧＦＰに使用した設計は、Ｇ１１５５と一緒に、およびＧＲＯＮなしでＡｔに同時形質転換することが可能である。切断が十分有効であった場合、ＧＦＰ発現の低下は明らかであると思われる。これはおそらく、プラスミドローディングの最適化を必要とする可能性が高い。
− 活性を確認した後、ゲノムＢＦＰ標的を映像および配列ベースの読み出しで標的化する。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
− ＣＲＩＳＰＲシステムの活性を迅速に確認するため、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．２０１２に従いｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用することが可能である。本明細書において予め作製し精製した化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９を、合成ｇＲＮＡおよび認識配列含有プラスミドと共にインキュベートする。切断の成功はゲル電気泳動により分析し切断プラスミドを検索する。
詳細なプロトコール：

プラスミドＤＮＡ切断アッセイ。合成またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写トレーサーＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを、９５℃まで加熱し室温にゆっくりと冷却することにより、反応前に予めアニーリング状態にした。原型または制限酵素消化した直鎖状プラスミドＤＮＡ（３００ｎｇ（約８ｎＭ））を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２有りまたは無しのＣａｓ９プラスミド切断用バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）中で、精製Ｃａｓ９タンパク質（５０〜５００ｎＭ）およびトレーサーＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二本鎖（５０〜５００ｎＭ、１：１）と共に３７℃で６０分間インキュベートした。反応は２５０ｍＭのＥＤＴＡを含有する５×ＤＮＡローディングバッファーで停止させ、０．８または１％アガロースゲル電気泳動により解像し、臭化エチジウム染色により目に見える状態にした。Ｃａｓ９突然変異体切断アッセイ用に、アガロースゲルへのローディング前に、反応を５×ＳＤＳローディングバッファー（３０％のグリセロール、１．２％のＳＤＳ、２５０ｍＭのＥＤＴＡ）で停止させた。

穀物における形質標的
ＣＲＩＳＰＲ認識配列の柔軟性を考慮すると、３’ＮＧＧＰＡＭ配列によって定義される潜在的プロトスペーサー配列を見つけるのは難しくない。
ＺｍＥＰＳＰＳ

以下の実施例は、ＺｍＥＰＳＰＳの触媒部位においてＤＳ切断をもたらすのに適したプロトスペーサー配列（黄色）およびＰＡＭ（青色）を示し、この場合Ｔ９７とＰ１０１における突然変異はグリホサート耐性を引き起こすことが知られている。後の切断のオリゴ仲介修復（ＯＤＭ）は所望の変化をもたらす。

以下の表は、対象穀物における対象遺伝子のプロトスペーサー配列を与える。

設計の拘束制約は、ＯＤＭにより改変される１２塩基対ヌクレオチド内にＮＧＧ配列を見つけるのに困難が多いことである。これが当てはまる場合、首尾良いＯＤＭは、プロトスペーサーシード配列が変わるため後の切断が可能でないことを意味するので、これは重要である。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）は、これが切断効率を損ねたことを示した。

参考文献

ＬｅＣｏｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｓｃｉｅｎｃｅ：ｖｏｌ．３３９ｎｏ．６１２１ｐｐ．８１９−８２３．

Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ ２０１２ Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３７：８１６−２１

Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２００８ ＲＮＡ１４：９０３−９１３

Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１３．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６１：２０−２７

当業者は、本発明が目的を実行し、言及する目的および利点、ならびに本発明に固有の目的および利点を得るのに十分適応していることを容易に理解する。本明細書で提供する例は好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的であり、本発明の範囲を制限するものとして考えない。

本明細書で開示している本発明に対する様々な置換および修正を、本発明の範囲および精神から逸脱せずに施すことができることは、当業者には容易に明らかとなる。

本明細書中で言及した全ての特許および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。全ての特許および刊行物は、それぞれ個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれている。

本明細書で適切に例示的に記載した本発明は、本明細書で具体的に開示していない如何なる１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制約の不在下でも実施することができる。したがって、例えば本明細書中でのそれぞれの場合において、用語「含む」、「から本質的になる」および「からなる」のいずれも、他の２つの用語のいずれかと交換することができる。利用している用語および表現は、制約ではなく記載のための用語として使用し、このような用語および表現の使用において、示し記載する特徴の任意の均等物、またはそれらの一部分の排除を意図するものではないが、特許請求する本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識される。したがって、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって本発明を具体的に開示してきたが、本明細書で開示している概念の修正および変更は当業者に委ねることができ、このような修正および変更は、添付の特許請求の範囲によって定義する本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるはずである。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内で言及する。

Claims (9)

1. 植物細胞中の標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列に遺伝子修復オリゴ核酸塩基（ＧＲＯＮ）仲介型突然変異を、ＧＲＯＮを標的ＤＮＡ配列中に取り込ませることなく、導入するための方法であって、
   ブレオマイシンファミリーの抗生物質の存在下で植物細胞へのＧＲＯＮの送達を含み、
   ＧＲＯＮが、標的ＤＮＡ配列でハイブリダイズして、植物細胞の遺伝子修復システムをミスマッチ塩基対形成部位に向けるシグナルとして働くミスマッチ塩基対を形成し、かつ、植物細胞の遺伝子修復システムによる標的ＤＮＡ配列内の指定ヌクレオチドの改変の後に分解されるものであり、及び
   ＧＲＯＮが、その５’末端に、１つまたは複数のホスホチオエート修飾、末端２’Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド、２’Ｏ−メチルヌクレオチドおよび蛍光色素から選択される１つまたは複数の従来型ＲＮＡおよびＤＮＡからの改変を含む、方法。
2. ヌクレオチド多量体を使用してＧＲＯＮの全体または一部分を合成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列が植物細胞ゲノム内に存在する、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
4. 植物細胞が、キャノーラ、ヒマワリ、コーン、タバコ、テンサイ、ワタ、メイズ、コムギ、オオムギ、イネ、アルファルファ、オオムギ、モロコシ、トマト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、タマネギ、ダイズ、ダイズ種、サトウキビ、マメ科植物、ヒヨコマメ、フィールドピー、マメ科マメ、レンズマメ、カブ、スウェーデンカブ、芽キャベツ、ルピナス、カリフラワー、ケール、エンドウマメ、ポプラ、マツ、ユーカリノキ、ブドウ、カンキツ属、ライコムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、芝生と飼草、アマ、ナタネ、カラシナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリゴールド、ロータス属、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、アヤメ属、ユリおよび堅果産生植物からなる群から選択される種である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＧＲＯＮが、３’逆向き塩基ブロッキング基を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 標的ＤＮＡ配列が植物細胞の内在性遺伝子である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記植物細胞から植物を再生するステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記植物から種子を回収するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. ブレオマイシンファミリーの抗生物質が、ブレオマイシン、ゼオシン、フレオマイシン、タリソマイシンおよびペプレオマイシンからなる群から選択される１つまたは複数のＤＮＡ切断糖ペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

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