JP4792567B2

JP4792567B2 - フェニルアラニンの合成に関与する遺伝子、および、フェニルアラニンを高レベルに蓄積する変異植物

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Publication number: JP4792567B2
Application number: JP2005309408A
Authority: JP
Inventors: 暁若狭; 哲也山田; 史生松田
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Agriculture and Food Research Organization; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Agriculture and Food Research Organization; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-10-25
Filing date: 2005-10-25
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2025-10-25
Also published as: JP2006149377A

Description

本発明は、フェニルアラニン、その二次代謝産物であるフェニルプロパノイド類の合成に関与する新規遺伝子およびその利用に関するものである。

フェニルアラニンは、食物から摂取しなければならない必須アミノ酸の１つである。フェニルアラニンおよびその二次代謝産物は、数多く存在する。これらの代謝産物の中には、色または匂い成分に関与する物質、病害抵抗性に関与する物質、および医薬品原料なども含まれる。そのため、フェニルアラニンおよびその二次代謝産物は、そのような物質の製造、および、病害抵抗性植物の育種などに利用できる。

本願発明者は、非特許文献１に、トリプトファンアナログである５メチルトリプトファン（５ＭＴ）に抵抗性を示すイネ変異体（ＭＴＲ１変異体）を、開示している。このＭＴＲ１変異体は、フェニルアラニンおよびトリプトファンが増加するという特徴を有している。

また、非特許文献２には、遊離フェニルアラニンを蓄積するニンジンカルスが開示されている。
Theoretical Applied Genetics (1987) 74: 49 - 54. A 5-methyltryptophan resistant rice mutant, MTR1, selected in tissue culture. K. Wakasa and J. M. Widholm. J. E. Palmer & J. Widholm (1975) Characterization of carrot and tobacco cell cultures resistant to p-fuluorophenylanine Plant Physiology 56: 233-238.

しかしながら、ＭＴＲ１変異体において、フェニルアラニンおよびトリプトファンの増加に関与する遺伝子は見出されていない。

また、非特許文献２では、遊離フェニルアラニンを蓄積するニンジンカルスが開示されているのみで、植物体については、開示されていない。さらに、フェニルアラニンの蓄積に関与するポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子についても、開示されていない。

また、これまでに、植物研究において、フェニルアラニン含量を野生型の１０倍以上に高めることに成功した例はない。

それゆえ、フェニルアラニンをより大量に蓄積することのできる変異植物が得られれば、色または匂い成分、病害抵抗性に関与する物質、および医薬品原料の製造などに利用できるフェニルアラニンをより効率的に取得することができるため、その実現が望まれている。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、発現させることによってフェニルアラニンの蓄積量をより向上させることのできる新規遺伝子、および、当該遺伝子を発現させることで、フェニルアラニンを多量に蓄積することができる新品種の植物を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者らが構築した５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）抵抗性を有するイネ変異体（ＭＴＲ１変異体）において、ポジショナルクローニングにより、フェニルアラニンの量が増加する遺伝子を同定し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明にかかるポリヌクレオチドは、フェニルアラニンの合成に関与するポリヌクレオチドであって、
下記の（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。

上記のポリヌクレオチドによれば、フェニルアラニンの合成活性を有するポリペプチドを翻訳産物として得ることができる。

本発明にかかるポリヌクレオチドは、さらに、フェニルプロパノイド類の合成に関与するものであることが好ましい。

上記のポリヌクレオチドによれば、フェニルアラニンに加えて、その二次代謝物であるフェニルプロパノイド類の合成にも関与するポリペプチドを、単一のポリペプチドとして得ることができる。単一のポリペプチドによって、フェニルアラニンに加えて、その二次代謝産物であるフェニルプロパノイド類を蓄積することは知られておらず、特に有用である。

本発明にかかるポリヌクレオチドは、さらに、トリプトファンの合成に関与するものであることが好ましい。

上記のポリヌクレオチドによれば、フェニルアラニンに加えて、トリプトファンの合成にも関与するポリペプチドを、単一のポリペプチドとして得ることができる。

本発明にかかるポリペプチドは、フェニルアラニンの合成に関与するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴とするものである。

上記のポリペプチドによれば、フェニルアラニンの合成を行うことができる。

本発明にかかるポリペプチドは、さらに、フェニルプロパノイド類の合成に関与するものであることが好ましい。また、本発明にかかるポリペプチドは、さらに、トリプトファンの合成に関与するものであることが好ましい。

上記のポリペプチドによれば、フェニルアラニンの合成に加えて、その二次代謝産物であるフェニルプロパノイド類またはトリプトファンの少なくともいずれかの合成を行うことができる。

このような、ポリペプチドとしては、例えば、配列番号４に示されているアミノ酸配列において、フェニルアラニンによるフィードバック制御領域のアミノ酸が、親水性アミノ酸から、疎水性アミノ酸へ置換されているポリペプチドが挙げられる。より詳細には、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、２９８番目のアミノ酸が、セリンからイソロイシンに置換されているポリペプチドが挙げられる。

これらのポリペプチドによれば、フェニルアラニンの合成に加えて、その二次代謝産物であるフェニルプロパノイド類、または、トリプトファンの合成も行うことができる。

本発明にかかるポリペプチドは、葉緑体に移行して機能を発現するものであってもよい。このポリペプチドによれば、葉緑体において、フェニルアラニン等の合成を行うことが可能となる。

また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記いずれかのポリペプチドをコードするものであってもよい。上記のポリヌクレオチドによれば、フェニルアラニンの合成活性を有するポリペプチド、または、フェニルアラニンに加えて、フェニルプロパノイド類またはトリプトファンの少なくともいずれかの合成活性を有するポリペプチドを、翻訳産物として得ることができる。

本発明にかかる形質転換体選抜用マーカー遺伝子は、上記の何れかのポリヌクレオチドからなるものである。

本発明にかかるポリヌクレオチドは、それが発現している細胞にトリプトファンアナログ（具体的には、５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）、５−フルオロトリプトファン（５ＦＴ）など）に対する耐性を付与する。そのため、上記マーカー遺伝子は、当該トリプトファンアナログに対する耐性を発現している形質転換細胞を選抜するためのマーカー遺伝子として利用することができる。

また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、フェニルアラニン、または、フェニルアラニンに加えて、フェニルプロパノイド類またはトリプトファンの少なくともいずれかの含量を増加させるため、上記マーカー遺伝子を用いて形質転換体の選抜を行えば、そのような必須アミノ酸を多量に有する形質転換体を取得することもできる。

本発明にかかる組換え発現ベクターは、上記の何れかのポリヌクレオチドを含むものである。上記の組換え発現ベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを細胞に導入するための組換え発現ベクターとして利用できるだけでなく、本発明に係るポリヌクレオチドを選抜マーカーとして用いた場合には、他の遺伝子を細胞に導入するための組換え発現ベクターとしても利用できる。

本発明にかかる形質転換体は、上記のポリヌクレオチドまたは上記の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、フェニルアラニンの合成活性を有するポリペプチドが発現しているものである。上記形質転換体は、植物細胞または植物体であることが好ましい。また、上記形質転換体は、イネ科植物に由来するものであることが好ましい。

本発明にかかる上述の各形質転換体は、植物の生育に害となるトリプトファンアナログ（具体的には、５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）、５−フルオロトリプトファン（５ＦＴ）など）に対して抵抗性を有する。

当該ポリヌクレオチドまたは組換え発現ベクターがポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入された上記形質転換体では、フェニルアラニンの合成、フェニルアラニンに加えて、フェニルプロパノイド類またはトリプトファンの少なくともいずれかの合成が促進され、フェニルプロパノイド類の蓄積量も増加させることができる。

特に、上記形質転換体がイネ科植物の場合、フェニルアラニン、または、フェニルアラニンに加えて、フェニルプロパノイド類またはトリプトファンの少なくともいずれかを多量に有する食品として利用できるため、有用性が特に高い。

また、上記形質転換体を作製すれば、フェニルアラニン、または、フェニルアラニンに加えて、フェニルプロパノイド類またはトリプトファンの少なくともいずれかを大量に取得することができる。特に、フェニルアラニンおよびその二次代謝産物は、色または匂い成分に関与する物質、病害抵抗性関与する物質、および医薬品原料として利用することができる。また、これらの物質を、効率的に生産することができる。また、本発明には上記形質転換植物から得られる種子も含まれる。

本発明にかかるフェニルアラニンの生産方法は、本発明の形質転換体を用いることを特徴とするものである。また、本発明にかかるフェニルプロパノイド類の生産方法は、本発明の形質転換体を用いることを特徴とするものである。また、本発明にかかるフェニルアラニンおよびトリプトファンの生産方法は、本発明の形質転換体を用いることを特徴とするものである。上記の生産方法によれば、色または匂い成分に関与する物質、病害抵抗性関与する物質、および医薬品原料として利用できるフェニルアラニン、フェニルプロパノイド類、または、フェニルアラニンに加えて、トリプトファンを効率的に生産することができる。また、トリプトファンの二次代謝産物も、効率的に生産できる。

本発明にかかる食品は、上記何れかの形質転換体を含むものである。この食品によれば、必須アミノ酸であるフェニルアラニン、または、フェニルアラニンに加えて、フェニルプロパノイド類またはトリプトファンの少なくともいずれかを多量に有する食品を提供できる。

本発明にかかる形質転換細胞の選抜方法は、上記のマーカー遺伝子または上記の組換え発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を阻害するトリプトファンアナログに対する耐性を細胞に付与し、さらに当該トリプトファンアナログに対する耐性を発現している細胞を選抜することからなるものである。

上記の選抜方法によれば、本発明のマーカー遺伝子を使用することで、これまで複数遺伝子を細胞に導入する際に使用できる選択マーカーの種類が制限されるといった問題を解決することができる。すなわち、通常選択マーカーとして使用されている抗生物質に対する耐性等の他に、トリプトファンアナログ、例えば５−メチルトリプトファンに対する抵抗性によって複数の目的ＤＮＡが導入された細胞の選抜が可能となる。そのため、上記マーカー遺伝子を使用した本発明の選抜方法は有用である。

本発明にかかる形質転換キットは、少なくとも上記のポリヌクレオチド、あるいは、上記の組換え発現ベクターのいずれかを含むことを特徴とするものである。上記の形質転換キットを用いれば、本発明に係るポリペプチドを発現する形質転換体を簡便かつ効率的に得ることができる。

本発明にかかるポリヌクレオチドによれば、フェニルアラニンおよびフェニルプロパノイド類の合成を行うことができる。そして、本発明のポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターがポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入された本発明の形質転換体では、フェニルアラニンの合成が促進され、それらの蓄積量を増加させることができる。

フェニルアラニンおよびフェニルプロパノイド類は、色または匂い成分、病害虫抵抗性物質、および製薬原料にもなる有用物質である。そのため、本発明の形質転換植物を利用すれば、これらの有用物質を効率的に生産することができる。

本発明の実施の形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。

（１）本発明にかかるポリヌクレオチド
本発明にかかるポリヌクレオチドは、少なくともフェニルアラニンの合成活性を有するポリペプチドをコードするものであり、好ましくはフェニルプロパノイド類の合成活性も有するものであり、より好ましくはトリプトファンの合成活性も有するものである。

なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列からなるポリヌクレオチドが意図される。

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

一実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、フェニルアラニンの合成に関与するポリヌクレオチドであって、
下記の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
のいずれかである。

上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、60℃で2×SSC 洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。

上記のポリヌクレオチドのうち、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明者らが作製したイネの変異体（ＭＴＲ１変異体）において、発現しているＭＴＲ１遺伝子の塩基配列である。ＭＴＲ１変異体は、トリプトファンアナログである５メチルトリプトファン（５ＭＴ）に対して抵抗性を有する。

また、他の実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、フェニルアラニンの合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列
のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。

上記「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、もしくは付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。

このような変異としては、例えば、配列番号４に示されているアミノ酸配列において、フェニルアラニンによるフィードバック制御領域のアミノ酸が、親水性アミノ酸（例えば水酸基を有するアミノ酸）から、疎水性アミノ酸（例えば脂肪族アミノ酸など）へ置換されていること、例えば、配列番号４に示されるアミノ酸配列において、２９８番目のアミノ酸が、セリンからイソロイシンに置換されていること、などが挙げられる。なお、配列番号２に示すポリペプチドは、本願発明者が見出した、フェニルアラニンおよびトリプトファンの合成に関与する新規なポリペプチドである。

また、他の実施形態において、本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドのフラグメントであるオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明にかかるポリヌクレオチドは、野生型のフェニルアラニンによるフィードバック制御領域のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが、一塩基置換（ＳＮＰｓ）されたものと表現することもできる。例えば、配列番号１に示されるポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるデータベース上で公開されている日本晴（野生型）の推定プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子の塩基配列において、893番目の塩基がG(グアニン)からT(チミン)への一塩基置換されたものである。この一塩基置換により、配列番号２に示されるポリペプチド（配列番号１の塩基配列にコードされるポリペプチド）は、配列番号４（配列番号３の塩基配列にコードされるポリペプチド）の末端の４アミノ酸ＥＳＲＰが、ＥＩＲＰに変異する。すなわち、配列番号４のポリペプチドの２９８番目のアミノ酸が、配列番号２のポリペプチドでは、セリン（親水性アミノ酸）からイソロイシン（疎水性アミノ酸）に、変異する。

本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。本発明にかかるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術は、標的遺伝子に対して相補的なＲＮＡ転写体を生成するキメラ遺伝子の導入を基本原理とする。その結果として得られる表現型は、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少である。つまり、本発明にかかるオリゴヌクレオチドであるアンチセンスＲＡＮを導入することによって、フェニルアラニンからフェニルプロパノイド類を合成する機能が低下し、植物中のフェニルプロパノイド類の含量を低下させることができる。

また、ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。本発明にかかるポリヌクレオチドの一例である、配列番号１に示す塩基配列は、配列番号２に示すポリペプチドのｃＤＮＡ配列の塩基配列である。

さらに、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。

本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。

あるいは、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、イネ科植物であることが好ましい。後述する実施例においては、イネの変異体（ＭＴＲ１変異体）から本発明にかかるポリヌクレオチドの一つであるＭＴＲ１遺伝子を取得しているが、これに限定されるものではない。

（２）本発明にかかるポリペプチド
本発明にかかるポリペプチドは、上記（１）に記載したポリヌクレオチドの翻訳産物であり、少なくともフェニルアラニンの合成活性を有するものであり、好ましくはフェニルプロパノイド類の合成活性も有するものであり、より好ましくはトリプトファンの合成活性も有するものである。

本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。

用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。

本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。

一実施形態において、本発明にかかるポリペプチドは、少なくともフェニルアラニンの合成活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるポリペプチドである。

なお、上記ポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの翻訳産物である。

（３）形質転換用マーカー遺伝子および形質転換細胞の選抜方法
本発明にかかるポリヌクレオチドは、形質転換用マーカー遺伝子として利用することができる。すなわち、本発明に係る形質転換体選抜用マーカー遺伝子は、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドからなるものであればよい。本発明にかかるポリヌクレオチドを導入された細胞はトリプトファンアナログに対して耐性を有するため、トリプトファンアナログを培地に添加することにより、当該ポリヌクレオチドが導入された細胞のみを選抜することが可能となる。選抜用薬剤として用いることができる細胞の増殖を阻害するトリプトファンアナログとしては、例えば、５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）、５−フルオロトリプトファン（５ＦＴ）を挙げることができる。

具体的に、本発明にかかるポリヌクレオチドを形質転換用マーカー遺伝子として利用するには、例えば、当該ポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを目的の細胞に導入する。当該発現ベクターが導入され、本発明に係るポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現している細胞はトリプトファンアナログに対して耐性を獲得するため、上記例示した選抜用薬剤が添加された培地においても増殖ができ、一方、当該発現ベクターが導入されていない細胞や本発明にかかるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現していない細胞は増殖が阻害される。したがって、当該発現ベクターが導入され、本発明にかかるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドが発現している形質転換細胞のみを選抜することが可能となる。

上述の例では本発明にかかるポリヌクレオチドを形質転換細胞に発現させる遺伝子とマーカー遺伝子との両方の目的で用いているが、本発明にかかるポリヌクレオチドをマーカー遺伝子としてのみ用いることも可能である。また、例えば、植物のカルス細胞に特異的な転写プロモーターを使用することにより、本発明にかかるポリヌクレオチドの選択マーカーとしての発現時期の制御も可能である。この場合は、さらに目的の細胞内で発現させたいタンパク質をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、当該発現ベクターを用いて形質転換すればよい。また、本発明にかかるポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを構築せずに、本発明に係るポリヌクレオチドを単独で目的の細胞に導入することも可能である。

また、前述のように、配列番号１に示されるポリヌクレオチドは、配列番号３に示される遺伝子の塩基配列において、８９３番目の塩基が、Ｇ(グアニン)からＴ(アデニン)へ、一塩基置換されたものである。このため、８９３番目の塩基を含むポリヌクレオチドは、本発明にかかるマーカー遺伝子として利用することができる。

例えば、配列番号１に示されるポリヌクレオチドにおいて、８９３番目の塩基を含む２０〜１００個の連続した塩基からなるポリヌクレオチドは、フェニルアラニンを多量に蓄積する細胞を選抜するために利用することができる。

なお、本発明には上記本発明にかかるマーカー遺伝子または以下に説明する組換え発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を阻害するトリプトファンアナログに対する耐性を細胞に付与し、さらに当該トリプトファンアナログに対する耐性を発現している細胞を選抜する形質転換細胞の選抜方法も含まれる。

（４）組換え発現ベクターおよび形質転換キット
本発明にかかる組換え発現ベクターは、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。

ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかるポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。

本組換え発現ベクターは、本発明にかかるポリペプチドを発現させるために用いることができることはいうまでもないが、本発明にかかるポリヌクレオチドをマーカー遺伝子として利用し、他の遺伝子を組み込んで当該他の遺伝子がコードするタンパク質を発現させるための組換え発現ベクターとしても利用できる。

本発明にかかるポリヌクレオチドがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明にかかるポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。

上記ホスト細胞は、少なくともフェニルアラニン合成系（好ましくはそれに加えて、フェニルプロパノイド類合成系またはトリプトファントリプトファン合成系の少なくともいずれか）を有する細胞、生物であれば、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。

本発明に係る形質転換キットは、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドまたは当該本発明にかかる組換え発現ベクターの少なくともいずれかを含むものであればよい。その他の具体的な構成については特に限定されるものではなく、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。当該形質転換キットを用いることにより、簡便かつ効率的に形質転換細胞を得ることができる。

（５）形質転換体
本発明にかかる形質転換体は、上記（１）に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドまたは上記（４）に記載の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、少なくともフェニルアラニンの合成活性（好ましくはそれに加えて、フェニルプロパノイド類合成活性またはトリプトファントリプトファン合成活性の少なくともいずれか）を有するポリペプチドが発現している形質転換体であれば、特に限定されるものではない。ここで「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。

また、ここで、「ポリヌクレオチドが導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味するが、本発明では、これに加えてゲノム中に含まれる本発明のポリヌクレオチドが生体内で発現している場合も含むものとする。このゲノム中に含まれる本発明のポリヌクレオチドが生体内で発現している例としては、上述の変異体ＭＴＲ１が挙げられる。

形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換え発現ベクターをホスト細胞に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、少なくともフェニルアラニン合成系（好ましくはそれに加えて、フェニルプロパノイド類合成系またはトリプトファントリプトファン合成系の少なくともいずれか）を有する細胞、生物であれば、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記（４）においてホスト細胞として例示した各種微生物等を挙げることができる。

本発明にかかる形質転換体は、植物細胞または植物体であることが好ましい。このような形質転換植物は、細胞内または植物体内において少なくともフェニルアラニン（好ましくはそれに加えて、フェニルプロパノイド類またはトリプトファントリプトファンの少なくともいずれか）を合成することができる。そして、上記ポリヌクレオチドまたは組み換え発現ベクターがポリペプチドの発現を促進させるプロモーターとともに導入された上記形質転換体では、少なくともフェニルアラニン（好ましくはそれに加えて、フェニルプロパノイド類合成系またはトリプトファントリプトファン合成系の少なくともいずれか）の合成が促進され、それらの化合物の蓄積量を増加させることができる。このような形質転換体は、植物の病害虫に対する抵抗性を有する場合もある。

植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に限定しない。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系等のバイナリーベクターを用いることが好ましい。バイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。また、植物体内で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターを有するベクターであることが好ましい。プロモーターとしては公知のプロモーターを好適に用いることができ、具体的には、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、ユビキチンプロモーターやアクチンプロモーターを挙げることができる。なお、植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。

植物細胞への組み換え発現ベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など、公知の種々の方法を用いることができる。また、形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて公知の方法で行うことが可能である。

ゲノム内に本発明にかかるポリヌクレオチドが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、当該植物体から得られる種子にも当該ポリヌクレオチドが導入されている。本発明には、形質転換植物から得られる種子も含まれる。

続いて、本発明の形質転換植物の性質について説明する。

本発明にかかる形質転換植物は、本発明にかかるポリヌクレオチドを導入されているため、植物に対して毒性を有する５−メチルトリプトファン（５ＭＴ）、５−フルオロトリプトファン（５ＦＴ）などのトリプトファンアナログに対して耐性を有する。

また、フェニルアラニンを蓄積するニンジンのカルスが既に知られている（非特許文献２）。このニンジンカルスでは、合成されるフェニルアラニンの増加率は、野生型に比べて１０倍未満である。これに対して、ＭＴＲ１変異体では、フェニルアラニンを２０倍という高レベルで蓄積する。フェニルアラニンおよびその二次代謝産物産物は、色または匂い成分、病害虫抵抗性物質、および製薬原料にもなる有用物質である。そのため、本発明の形質転換植物を利用すれば、これらの有用物質を効率的に生産することができる。

（６）フェニルアラニン・フェニルプロパノイド類・フェニルアラニンおよびトリプトファンの生産方法
本発明は、本発明にかかる形質転換体を用いてフェニルアラニン、フェニルプロパノイド、およびフェニルアラニンおよびトリプトファン、並びにそれら全てを生産する方法を提供する。

一実施形態において、本発明にかかるフェニルアラニン、フェニルプロパノイド、およびフェニルアラニンおよびトリプトファン、並びにそれら全ての生産方法は、本発明にかかるポリヌクレオチドが導入された形質転換体またはその組織を用いてフェニルアラニン（またはフェニルアラニンおよびトリプトファン）を生産することを特徴とする。好ましくは、これらの化合物を生産する生物体は植物である。

本実施形態の好ましい局面において、本発明にかかる各生産方法は、本発明にかかるポリヌクレオチドを植物に導入する工程を包含する。ポリヌクレオチドを植物に導入する工程としては、上述した種々の遺伝子導入方法を用いればよい。さらに、本実施形態にかかる各生産方法は、上記植物からフェニルアラニン、フェニルプロパノイド、およびフェニルアラニンおよびトリプトファン、並びにそれら全てを抽出する工程を包含することが好ましい。

これらの生産方法によれば、フェニルアラニン、フェニルプロパノイド、およびフェニルアラニンおよびトリプトファン、並びにそれら全てを多量に蓄積する本発明の形質転換体を利用しているため、色または匂い成分に関与する物質、病害抵抗性関与する物質、および医薬品原料として利用できるフェニルアラニン、フェニルプロパノイド類、または、トリプトファンを効率的に生産することができる。また、フェニルアラニンおよびトリプトファンの二次代謝産物も、効率的に生産できる。

（７）本発明の有用性・利用
ＭＴＲ１変異体（カルスおよび植物体）は、フェニルアラニンおよびトリプトファンを蓄積している。

また、後述の実施例では、５ＭＴ抵抗性因子が、優性の１遺伝子であることを、遺伝学的に証明している。したがって、ＭＴＲ１における変異（５ＭＴ抵抗性因子）が、第7染色体の長腕末端付近のさらに別の領域にあるとは考えられない。

また、ＭＴＲ１変異体は、実際に５ＭＴ（トリプトファンアナログ）抵抗性を示す。これは、トリプトファンの蓄積が、原因と考えられる。図１０に示すように、植物のトリプトファンの生合成経路では、アントラニル酸合成酵素が、鍵酵素である。しかし、トリプトファン合成系の鍵酵素であるアントラニル酸合成酵素は、ＭＴＲ１変異体でも野生型と同じように、トリプトファンによるフィードバック阻害を受ける。このため、野生型のアントラニル酸シンターゼ（ＡＳ）遺伝子を、過剰発現したとしても、トリプトファンは蓄積しない。トリプトファンが蓄積するためには、フィードバック阻害を受けない改変型酵素遺伝子の過剰発現が必要となる。ＭＴＲ１変異体では、アントラニル酸合成酵素の特性は、野生型と同じである。それにもかかわらず、トリプトファンが蓄積している。このような現象は、これまで、知られていない。すなわち、これまで知られていないトリプトファン合成の制御機構、しかもフェニルアラニン合成と関係した制御機構が存在する。

さらに、野生型カルスに、フェニルアラニンを添加して培養すると、５ＭＴ抵抗性を示す。このような現象も知られていない。この現象は、フェニルアラニンとトリプトファンが何らかの関係を持つことを示している。

このように、ＭＴＲ１変異体における５ＭＴ抵抗性因子は、フェニルアラニンの合成系に関与するだけでなく、トリプトファンの合成系にも関与している。言い換えれば、５ＭＴ抵抗性因子（配列番号１のポリヌクレオチド）は、単一の遺伝子によって、フェニルアラニンおよびトリプトファンを増加させることができる、有用な遺伝子である。

後述の実施例のように、配列番号１のポリヌクレオチドは、ＭＴＲ１変異体における、５ＭＴ抵抗性因子（ＭＴＲ１遺伝子）である。このポリヌクレオチドは、単一の変異酵素遺伝子により、フェニルアラニンおよびトリプトファンを増加させられるものである。従来、遊離のフェニルアラニンを蓄積する植物は、ニンジンカルスで報告されているのみである（J. E. Palmer & J. Widholm (1975) Characterization of carrot and tobacco cell cultures resistant to p-fuluorophenylanine Plant Physiology 56: 233-238）。

フェニルアラニンに由来する二次代謝産物は、数多く存在する。これらの代謝産物の中には、色または匂い成分に関与する物質も、病害抵抗性関与する物質も含まれる。このため、本発明は、そのような物質の製造、および、病害抵抗性植物の育種などに利用できる。

また、トリプトファンに由来するに二次代謝産物も、数多く存在する。この二次代謝産物であるインドールグルコシノレート類（ＩＧｓ）の中には、害虫を選択的に誘引すること、および、病害虫に対して抵抗性を有する（M.D. Mikkelsen, B.L. Petersen, C.E. Olsen, and B.A. Halkier, Amino Acids (2002) 22: 279-295，；Giamoustaris,A and Mithen, R., (1995) Ann Appl Biol.126:347-363）。

また、従来は、有用な二次代謝産物の生産性を高めるために、目的化合物に近い酵素遺伝子の導入など、目的化合物の合成経路の下流への操作が試みられてきた。

これに対し、本願発明では、フェニルアラニンの蓄積によって、その二次代謝産物（下流の化合物）も増えている。従って、本願発明のポリヌクレオチドと、現在試みられている個別の化合物生産システムとを組み合わせることによって、効率的な、有用二次代謝産物を製造することが可能となる。

また、ＭＴＲ１変異体は、５ＭＴ抵抗性によって選抜されたものである。したがって、この変異遺伝子（本発明にかかるポリヌクレオチド）は、５ＭＴを選抜薬剤として用いた形質転換体作出の、新しい選抜マーカーとしても利用できる。

また、フェニルアラニンおよびトリプトファンは、必須アミノ酸である。このため、これらのアミノ酸を増加させた食品は、栄養学的な観点から見ても、過去に例を見ない食品となる。この食品は、特に限定されるものではないが、日本において主食となる米（イネ）であることが好ましい。これにより、フェニルアラニンおよびトリプトファンを多く含む有用な米（イネ）の品種育成を実現できる。特に、ＭＴＲ１変異体は、形質転換体ではなく、体細胞変異体であるため、直接従来の交雑育種に利用することができる。

また、現在までに、植物研究において、フェニルアラニン含量を１０倍以上に高めた報告はない。後述の実施例のように、本発明にかかる遺伝子を有するＭＴＲ１変異体は、野生型に比べて、フェニルアラニンの含量が、１０倍以上（２０倍）多い。従って、本遺伝子を過剰発現させることによって、フェニルアラニン含量が極めて高い変異作物を作出することが可能となる。また、この変異作物は、トリプトファン含量も高い作物である。

また、図１０に示すように、フェニルアラニンおよびトリプトファンの生合成経路は、コリスミ酸から、プレフェン酸とアントラニル酸を合成する経路に分岐する。プレフェン酸を合成する経路では、コリスメートムターゼ（ＣＭ）が、アントラニル酸を合成する経路では、アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）が、作用する。

コリスメートムターゼ（ＣＭ）は、一次代謝産物であるフェニルアラニンによって、また、アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）は、一次代謝産物であるトリプトファンによって、それぞれフィードバック制御を受けると考えられている。

図１１は、コリスミ酸からフェニルアラニンおよびチロシンの生合成経路を示す模式図である。図１１の生合成経路では、植物で利用されている経路を実線で、バクテリアで利用されている経路を破線で、それぞれ示している。つまり、植物では、プレフェン酸にプレフェン酸デヒドラターゼが作用して、フェニルピルビン酸を経由して、フェニルアラニンが合成される経路は、存在しないとされている。

しかしながら、配列番号１に示すポリヌクレオチドがプレフェン酸デヒドラターゼ活性を持つとなると今まで植物では報告のない経路が存在することになる。

また、単一のポリペプチドによって、フェニルアラニンに加えて、その二次代謝産物であるフェニルプロパノイド類を蓄積することは知られておらず、特に有用である。また、そのポリヌクレオチドは、そのような機能を有する形質転換体を生産する上で、特に有用である。なお、トリプトファンを蓄積させるポリペプチドは、フェニルアラニンを蓄積させない。

本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

〔実施例１〕
（ａ）ＭＴＲ１の作製
本願発明者が考案した文献（Theoretical Applied Genetics (1987) 74: 49 - 54. A 5-methyltryptophan resistant rice mutant, ＭＴＲ１, selected in tissue culture. K. Wakasa and J. M. Widholm）に記載の方法に従い、5-メチルトリプトファン(５ＭＴ)に抵抗性を示すイネ変異体ＭＴＲ１を作製した。すなわち、農林8号の胚盤由来カルスを、300μM ５ＭＴを含む培地上に置床し（通常のカルスは増殖せず死滅する）、旺盛に増殖するものを選抜した。さらに、そのカルスを再分化培地に移植して再分化植物体を得た。
（ｂ）５ＭＴ抵抗性因子をマッピングするための集団の作製
次に、イネ変異体（ＭＴＲ１変異体）の５ＭＴ抵抗性因子（ＭＴＲ１遺伝子）をマッピングするための集団を作製した。

すなわち、図３に示すように、まず、ＭＴＲ１変異体とカサラスとの交配からF₁個体を得た。そして、このF_１集団から５ＭＴ抵抗性個体を選抜し、自殖させF_２集団を得た。次に、このＦ_２集団を用いて、５ＭＴ抵抗性因子を、SSRマーカー（いわゆるマイクロサテライトマーカー）、または、CAPSマーカーによりマッピングした。

その結果、図４に示すように、第7染色体の長腕末端付近に、５ＭＴ抵抗性因子（ＭＴＲ１遺伝子）を、マッピングした。

なお、イネゲノムプロジェクトで公開されている分子マーカーのマップは、「日本晴」と「カサラス」の交雑集団が用いられている。これらは、日本型イネとインド型イネという異なる生態型イネの交雑であるため、日本型イネ同士の交雑による集団よりも多型検出（塩基配列の違いを反映しているので、これを検出することでゲノムの特定部分がどちらの親から由来するか判定できる）が容易である。また、カサラスのゲノムシーケンスの一部はイネゲノムプロジェクトで公開されており、新たな分子マーカーを容易に作成することができる。以上のことから、カサラスを本実施例におけるマップ集団作成の花粉親に用いた。
（ｃ）ＭＴＲ１遺伝子のマップベースクローニング
すなわち、図３に示すように、さらに、Ｆ_２集団において、５ＭＴ抵抗性因子の候補領域が、ヘテロの遺伝子型を示すＦ_２個体を自殖したＦ_３個体を用い、マップベースクローニングを試みた。

その結果、図５に示すように、５ＭＴ抵抗性因子（ＭＴＲ１遺伝子）の座上位置を、PACクローン(P0627E10)内の約100kb領域に特定した。図５は、PACクローン(P0627E10)のアノテーションマップの一部である。図５では、推定プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子の位置を、（５）として記載している。

なお、イネPACクローンとはイネ品種「日本晴」のゲノムDNA断片をP1ファージ由来人工染色体に挿入したものである。P0627E10クローンもその中の一つで、この中に挿入されているゲノムDNA領域はイネの第7染色体長腕の末端に位置することがわかっている。

図５に示されるように、公開されているイネゲノムデータベース（http://rgp.dna.affrc.go.jp/index.html）上ある日本晴のアノテーションマップから、シキミ酸経路に関与すると考えられる推定プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子が、５ＭＴ抵抗性因子候補領域に存在することが明らかとなった。

日本晴ゲノムデータベースに基づき、推定プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子配列に特異的（開始コドンATGから終止コドンTGAまでを含む領域）なプライマーを作成し、ＭＴＲ１変異体からRT-PCRによって、その遺伝子のクローニング、および、シーケンスを行った。クローニングした遺伝子は、図１および配列番号１に示すように、1,095bp（開始コドンおよび終止コドンを含む）の大きさであった。また、図２および配列番号２は、この遺伝子にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。なお、配列番号３には、配列番号１に対応する日本晴（野生型）のポリヌクレオチドを、配列番号４にはそのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ示す。

〔実施例２〕変異体遺伝子の解析（SNPｓ解析）
データベース上で公開されている日本晴（野生型）の推定プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子の塩基配列と、実施例１でＭＴＲ１変異体（変異型）から取得した遺伝子（ＭＴＲ１遺伝子）の塩基配列とを比較した。その結果を、図６（ａ）に示す。なお、図６（ａ）の上段は、日本晴の配列、下段は、ＭＴＲ１変異体の配列を、それぞれ示している。

図６（ａ）に示すように、ＭＴＲ１変異体では893番目の塩基がG(グアニン)からT(チミン)への一塩基置換が認められた。

多数のクローンの中から、野生型および変異型のそれぞれ4クローンを無差別に選んで塩基配列を決定したところ、この一塩基多型は、変異型の4クローンすべてで見られた。

図６（ｂ）は、図６（ａ）の塩基配列にコードされるアミノ酸配列（アミノ酸１文字略記）を示す図である。これらを比較すると、図６（ａ）の変異箇所は、大腸菌などで報告されている、コリスミ酸ムターゼ遺伝子およびプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子の一部であることがわかる。すなわち、大腸菌では、図６（ｂ）における、末端の４アミノ酸（ＥＳＲＰ）が、フェニルアラニンによるフィードバック制御部位であると推定されている。

変異型では、野生型のアミノ酸配列に存在するＥＳＲＰが、ＥＩＲＰに変異していた。すなわち、の２９８番目のアミノ酸が、セリン（親水性アミノ酸）からイソロイシン（疎水性アミノ酸）に、変異していた(298残基目：S298I)。

〔実施例３〕ＭＴＲ１変異体カルスのプロファイル分析
（ａ）カルス中のフェニルアラニンおよびトリプトファン含量
次に、ＭＴＲ１変異体カルスおよび野生型カルス（Ｎ８：農林８号）のプロファイル分析を行った。ＭＴＲ１変異体は、フェニルアラニンに加えて、トリプトファンの量が増加する。このため、各カルスに含まれるフェニルアラニンおよびトリプトファンの量を測定した。

分析条件は、装置（ＬＣ−ＭＳ）：ＬＣＭＳ−２０１０シリーズ（島津社製）、カラム：ＣａｄｅｎｚａＣＤ−１８（２．０×７５ｍｍ）、流速：０．２ｍＬ／分、カラム温度：３５℃、移動層：アセトニトリル／０．１％ギ酸（グラジエント溶出）、検出：ＳＩＭモード、検出質量数：m/z=166（フェニルアラニン），m/z=205（トリプトファン）、分析時間：１２分で行った。

図７は、このようにして測定した各カルスに含まれるフェニルアラニンおよびトリプトファンの量を比較したグラフである。このグラフから、５ＭＴ抵抗性を示すＭＴＲ１のカルスは、野生型（５ＭＴに対して感受性）のカルスに比べて、フェニルアラニンが20倍、トリプトファンが17倍、それぞれ増加していることがわかる。

（ｂ）代謝プロファイル分析
また、各カルスについて、代謝プロファイル分析を行った。分析条件は、装置：ＬＣ−１０Ａｖｐシリーズ（島津社製）、カラム：ＣａｄｅｎｚａＣＤ−１８（４．６×２５０ｍｍ）、流速：０．８５ｍＬ／分、カラム温度：３５℃、移動層：アセトニトリル／０．０２％ＴＦＡ（グラジエント溶出）、検出：ＵＶ１９０〜４００ｎｍ、分析時間：９０分で行った。

図８は、ＵＶ２８０ｎｍにおける、代謝プロファイル分析結果を示すクロマトグラムである。図８では、上段に変異体（ＭＴＲ１）のクロマトグラムを、下段に野生型（Ｎ８：農林8号）のクロマトグラムを示した。このクロマトグラムに示すように、ＭＴＲ１のクロマトグラムには、野生型にはない、複数のピークが検出された。

これら複数のピークのうち、さらに解析した結果、図８に示すように、変異体に特有のピークの成分が、フェニルアラニンの二次代謝産物およびトリプトファンであることを確認した。さらに、フェニルアラニンの二次代謝産物（フェニルアラニンに由来するフェニルプロパノイド類）の１つが、フェルロイルキナ酸であることも確認した。

〔実施例４〕
次に、変異型と野生型（農林8号）とによる戻し交雑を行い、後代の個体について、遺伝学的に解析した。図９は、戻し交雑後代の個体を、５ＭＴ抵抗性個体，５ＭＴ感受性個体，および不発芽の個体に分類した結果を示す表である。図９に示すように、全ての交雑の組み合せにおいて、後代の５ＭＴ抵抗性個体の分離比が、約１：１となった。従って、遺伝学的に、５ＭＴ抵抗性が、単一の優性遺伝であることが確認された。

また、そもそも、ＭＴＲ１は、イネのカルス培養によって５ＭＴ抵抗性個体として作製された変異体である。また、当代で、５ＭＴ抵抗性出現していることから優性であることは明らかである（K. Wakasa & J. M. Widholm (1987) A 5-methyltryptophan resistant rice mutant, ＭＴＲ１, selected in tissue culture. Theoretical Applied Genetics 74: 49 - 54）。

また、200個体以上の５ＭＴ抵抗性個体を育成し、その次代の種子を用いて発芽試験により、５ＭＴ抵抗性を調べた。その結果、この200余個体からは、抵抗性と感受性個体とが発生した。このように、ＭＴＲ１変異体は、５ＭＴ抵抗性因子を、ホモで維持するのが極めて困難である。このため、常に、その遺伝子型はヘテロで維持されている。すなわち、５ＭＴ抵抗性個体の遺伝子型は、ヘテロで維持されており、かつ、優性形質である（Wakasa, K. & J. Widholm (1991) Rice mutants resistant to amino acids and amino acid analogs. In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, Rice (ed. by Y. P. S. Bajaj), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. Vol. 14: 304-315）。

また、その後何代にも渡って栽培維持しても、現在に至るまで、ＭＴＲ１変異体の５ＭＴ抵抗性因子を、ホモで有する個体を獲得できていない。これは、受精、種子発育、発芽の段階でホモ個体は弱勢であるためと推測される（若狭暁（1999）トリプトファン含量の向上したイネの特性：体細胞変異体と形質転換体の比較育種学最近の進歩 41: 45-48）。

以上のように、実施例１〜実施例４では、５ＭＴ抵抗性突然変異体ＭＴＲ１が有する、５ＭＴ抵抗性因子のマップベースクローニングの結果、５ＭＴ抵抗性の原因遺伝子がプレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子であり、ＭＴＲ１変異体では、プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子に認められた一つの非同義置換されていることが確認された。そして、その非同義置換が、５ＭＴ抵抗性の原因であることが示唆された。

そこで、以下の実施例では、変異型プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子および野生型プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子を導入した形質転換体を作出し、それらの形質転換体の５ＭＴ抵抗性，生成した二次代謝産物，および酵素活性を検討した。

〔実施例５〕形質転換体の作製
１）変異型プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子（変異型ＰＤＴ遺伝子）あるいは野生型プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子（野生型ＰＤＴ遺伝子）を過剰発現するための発現ベクターの構築
図１２は、変異型ＰＤＴ遺伝子を発現するベクターの模式図であり、図１３は、野生型ＰＤＴ遺伝子を発現するベクターの模式図である。なお、配列番号１の塩基配列が変異型ＰＤＴ遺伝子に、配列番号３の塩基配列が野生型ＰＤＴ遺伝子に、それぞれ対応する。

まず、変異型ＰＤＴ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを含む1,095bpのcDNA(PDT298I)を過剰発現する発現プラスミド（図１２）、および、野生型ＰＤＴ遺伝子のcDNA(PDT298S) 遺伝子を過剰発現する発現プラスミド（図１３）を構築した。具体的には、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む公知の外来遺伝子導入用組換えベクター（ｐＵＢ−Ｈｍ）の制限酵素サイト（Ｓｅｅ８３８７Ｉ）に、ＰｓｔＩを用いて、変異型ＰＤＴ遺伝子をライゲーションした。これにより、図１２に示すように、トウモロコシユビキチンプロモーターの下流（そのプロモーターとｎｏｓターミネータとの間）に、変異型ＰＤＴ遺伝子を繋いだベクター（pUBPDT298I）を作製した。また、コントロールとして、変異型ＰＤＴ遺伝子を野生型ＰＤＴ遺伝子に置換し、野生型ＰＤＴ遺伝子を過剰発現するpUBPDT298S(図１３）を作製した。

２）pUBPDT298IおよびpUBPDT298Sを導入したイネ形質転換体の作製
次に、アグロバクテリウム法を用いて、変異型ＰＤＴ遺伝子形質転換体を作製した。イネ種子(品種：日本晴)の胚盤由来カルスに、pUBPDT298IベクターまたはpUBPDT298Sベクターを持つアグロバクテリウムEHA101を感染させた。形質転換された細胞を、ハイグロマシン40mg/Lにより選抜した。

〔実施例６〕選抜カルスにおける導入遺伝子の確認と５ＭＴ抵抗性試験
実施例５において、ハイグロマイシン抵抗性を示した形質転換カルス（形質転換細胞）からゲノムDNAを抽出し、導入遺伝子であるＰＤＴ遺伝子(cDNA)ならびにハイグロマイシン耐性遺伝子を、PCRにより確認した。そして、変異型ＰＤＰ遺伝子が導入された形質転換カルス、および、野生型ＰＤＰ遺伝子が導入された形質転換カルスを、それぞれ、１２系統ずつ選抜し、選抜した形質転換カルスを１５０μＭの５ＭＴを含む培地に移植して抵抗性試験を行った。

図１４は、各形質転換カルスの抵抗性試験の結果を示す図である。図１５は、５ＭＴを含む培地で培養した、各形質転換カルスを示す図である。なお、図１５において、Ａ〜Ｄは、それぞれ独立した形質転換カルス系統である。

図１４および図１５に示されるように、変異型ＰＤＴ遺伝子を過剰発現した形質転換カルス（pUBPDT298I）のみで、５ＭＴに対する抵抗性が認められた。また、これらの形質転換カルスは、プロファイリング等を含めた以後の分析のために維持すると共に、再分化個体の獲得を試みた。

〔実施例７〕形質転換カルスにおける導入遺伝子の発現解析
各形質転換体それぞれ１２系統における導入遺伝子の発現レベルをノーザンブロットにより解析した。図１６は、ノーザンブロットの結果を示す図である。ＰＤＴ遺伝子cDNAのN末端領域に相当する部分をプローブに用いてノザンブロットを行った結果、全ての形質転換カルスにおいて導入遺伝子の過剰発現が認められた。

〔実施例８〕形質転換カルスのアミノ酸分析
変異型ＰＤＴ遺伝子が導入された形質転換カルス（変異型形質転換体）３系統(M47, M50, M71)、野生型ＰＤＴ遺伝子が導入された形質転換カルス（野生型形質転換体）２系統(WT17, WT24)、農林８号のカルス、およびＭＴＲ１変異体系統（突然変異体）のカルスにおけるアミノ酸分析を行った。

図１７（ａ）〜図１７（ｃ）は、そのアミノ酸分析の結果を示すグラフである。図１７（ａ）〜図１７（ｃ）に示すように、本実施例では、３種の芳香族アミノ酸(フェニルアラニン（図１７（ａ）、トリプトファン（図１７（ｂ））、チロシン（図１７（ｃ））)を、ＬＣ‐ＭＳを用いて定量した。

その結果、変異型形質転換体とＭＴＲ１変異体とは、農林8号に比べ、フェニルアラニンとトリプトファンが数十倍増加した。一方、野生型形質転換カルス２系統に関しては、フェニルアラニンならびにトリプトファンの増加は認められなかった。

〔実施例９〕形質転換カルスにおける二次代謝産物(フェニルプロパノイド)の分析
次に、形質転換カルスの二次代謝産物を分析した。図１８は、分析により特定した二次代謝産物の化学構造を示す図である。図１８の化合物４，６，７，８は、植物では初めて同定された化合物である。
図１９は、変異型形質転換体（ＰＤＴＭ４７），ＭＴＲ１変異体（ＭＴＲ１−１），および農林８号（Ｎ８）の各カルスの二次代謝産物の分析結果を示すチャートである。図２０は、各カルスについて、６’−マロニルロジンの定量分析の結果を示すグラフである。なお、図１９における「１〜８」は、図１８の化合物番号に対応している。

図１８の化合物群のうち、ＭＴＲ１変異体では７種のフェニルプロパノイド化合物（ロジン，６’−マロニルロジン，２’β-グルコシルロジン，２’β-グルコシル−６’−マロニルロジン，γ−グルタミルフェニルアラニン，グリコシルベンジルアルコール，フェルロイルキナ酸）と、１種のインドール化合物が増加していることが明らかとなった。

変異型形質転換体についても、ＭＴＲ１変異体と同様のプロファイリング結果が認められた(図１９)。

また、各カルスについて、６’−マロニルロジンを分析したところ、変異型形質転換体のみに、顕著な増加が認められた(図２０)。

〔実施例１０〕変異型ＰＤＴ遺伝子の葉緑体への移行の確認
変異型ＰＤＴ遺伝子のｃＤＮＡを、小麦胚芽の無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質を合成した。次に、エンドウから単離した葉緑体と無細胞系で^３５ＳによりラベルしたＰＤＴホモログとを用いて、葉緑体移行試験を行った。図２１（ａ）および図２１（ｂ）は、この葉緑体移行試験結果を示す図である。

図２１（ｂ）に示すように、合成されたタンパク質をサーモリシンプロテアーゼで処理すると、葉緑体内部に移行していないタンパク質（Ｐｒｅ−Ｎ５ＰＤＴ）は分解されるが、葉緑体内部に移行したタンパク質（transit-peptideが切断された成熟タンパク質；Ｍａｔｕｒｅ−Ｎ５ＰＤＴ）は分解されない。つまり、このＰＤＴホモログは、図２１（ａ）に示すように、葉緑体に移行して機能するタンパク質である。

〔実施例１１〕クローニングした変異型ＰＤＴ遺伝子のコムギ無細胞系によるタンパク合成
変異型ＰＤＴ遺伝子のｃＤＮＡを、小麦胚芽の無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質を合成し、^１４Ｃでラベルしたタンパク質を検出した。図２２（ａ）は^１４Ｃでラベルしたタンパク質を検出した結果を示しており、図２２（ｂ）はhis-tagタンパク質の精製を示す図である。

図２２（ａ）に示すように、totalとsupのバンドの濃さがほぼ同じであるので、合成されたタンパク質の可溶性が高いことがわかる。この際に、Ｎ末端の葉緑体移行シグナル領域４２アミノ酸残基を削ったタンパクを合成している。これは、葉緑体移行実験の結果から推測したサイズで、活性測定にはＮ末端を削ったものを使用した。図２２（ｂ）のように精製されたhis-tagタンパク質は、以下の活性測定に使用した。

〔実施例１２〕his-tagタンパク質の酵素活性
実施例１１で精製したhis-tagタンパク質（変異型および野生型）について、酵素活性およびフィードバック阻害効果を測定した。図２３（ａ）は、野生型ＰＤＴおよび変異型ＰＤＴのプレフェン酸デヒドラターゼ活性を示すグラフであり、図２３（ｂ）は野生型ＰＤＴおよび変異型ＰＤＴのフェニルアラニンによるフィードバック阻害効果を測定したグラフである。

図２３（ａ）に示すように、若干弱いながらもプレフェン酸デヒドラターゼ活性が認められる。通常の活性測定の状態では、両者にほとんど違いは見られない。

図２３（ｂ）に示すように、野生型ＰＤＴにおいてはフェニルアラニンにより濃度依存的に阻害が起きているが、変異型ＰＤＴでは野生株に比べフェニルアラニンに対して非感受性になっている。

以上のように、変異型ＰＤＴ遺伝子は、フェニルアラニンによるフィードバックレギュレーションサイトと考えられる部分に変異が挿入されることにより、（ａ）フェニルアラニンとトリプトファンが増加すること；および（ｂ）このトリプトファンの増加がＭＴＲ１変異体における５ＭＴ抵抗性をもたらすことが示唆された。さらに、（ｃ）フェニルアラニンの増加により、フェニルプロパノイド等の二次代謝産物の生合成量を増大できることも示された。それゆえ、変異型ＰＤＴ遺伝子を過剰発現させた形質転換体（形質転換植物）は、フェニルプロパノイド化合物を増大するために利用が可能である。例えば、ダイズなどのマメ科植物に、変異型ＰＤＴ遺伝子を導入することによって、フラボノイド(イソフラボン)やビタミンＥといった機能性成分含量をコントロールすることが期待される。

本発明によれば、フェニルアラニンを多量に蓄積することのできる新品種の植物を得ることができる。フェニルアラニンおよびその二次代謝産物は、色または匂い成分、病害虫抵抗性物質、および製薬原料として利用することのできる有用物質であるため、本発明は、農業、食品製造業、医薬品製造分野などに利用することができる。

本発明にかかる遺伝子の塩基配列を示す図である。本発明にかかるポリヌクレオチドのアミノ酸配列を示す図である。実施例における５ＭＴ抵抗性因子解析のためのマッピング集団の作成を示す模式図である。実施例における５ＭＴ抵抗性因子のマッピングの結果を示す模式図である。実施例における、PACクローンP0627E10(AP005199)の主要なアノテーションマップを示す模式図である。実施例におけるＭＴＲ１の推定プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子の一塩基変異を示す模式図であり、図６（ａ）は遺伝子配列であり、図６（ｂ）はアミノ酸配列である。実施例において、ＭＴＲ１カルス中のフェニルアラニンおよびトリプトファン含量を示すグラフである。実施例において、ＬＣ／ＰＤＡによる代謝プロファイル分析結果（UV280nm）を示すクロマトグラムである。同定した成分の推定構造を図示した。実施例において、戻し交雑後代における５ＭＴ抵抗性の分離結果を示す表である。コリスミ酸から、フェニルアラニンおよびトリプトファンの生合成経路を示す模式図である。図１０の生合成経路を詳細に示す模式図である。変異型ＰＤＴ遺伝子を発現するベクターの模式図である。野生型ＰＤＴ遺伝子を発現するベクターの模式図である。変異型ＰＤＴ遺伝子または野生型ＰＤＴ遺伝子が導入された形質転換カルスの特性を示す図である。５ＭＴを含む培地で培養した、形質転換カルスを示す図である。形質転換カルスにおける導入遺伝子を、ノーザンブロットにより確認した図である。形質転換カルスにおける芳香族アミノ酸の定量分析結果を示すグラフであり、（ａ）はフェニルアラニン，（ｂ）はトリプトファン，（ｃ）はチロシンの定量分析結果を示すグラフである。形質転換カルスの二次代謝産物の構造を示す図である。形質転換カルスの二次代謝産物の分析結果を示すチャートである。形質転換カルスにおける６’−マロニルロジンの定量分析の結果を示すグラフである。変異型ＰＤＴ遺伝子の葉緑体移行試験結果を示す図であり、（ａ）は合成されたＰＤＴタンパク質の葉緑体への移行を説明する模式図であり、（ｂ）はそのタンパク質のサーモリシン処理の結果を示す図である。コムギ胚芽無細胞系によるイネＰＤＴホモログのタンパク質合成を示す図であり、（ａ）は^１４Ｃでラベルしたタンパク質の検出結果を示す図であり、（ｂ）は（ａ）のhis-tagタンパク質の精製を示す図であｗる。（ａ）は野生型ＰＤＴおよび変異型ＰＤＴの酵素活性を示すグラフであり、（ｂ）は各ＰＤＴのフェニルアラニンによるフィードバック阻害効果を測定したグラフである。

Claims

フェニルアラニンの合成に関与する、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
さらに、フェニルプロパノイド類の合成に関与するものであることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。
さらに、トリプトファンの合成に関与するものであることを特徴とする請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
フェニルアラニンの合成に関与する、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
さらに、フェニルプロパノイド類の合成に関与するものであることを特徴とする請求項４に記載のポリペプチド。
さらに、トリプトファンの合成に関与するものであることを特徴とする請求項４または５に記載のポリペプチド。
配列番号４に示されているアミノ酸配列において、２９８番目のアミノ酸が、親水性アミノ酸から、疎水性アミノ酸へ置換されていることを特徴とするポリペプチド。
配列番号４に示されるアミノ酸配列において、２９８番目のアミノ酸が、セリンからイソロイシンに置換されていることを特徴とする請求項７に記載のポリペプチド。
葉緑体に移行して機能を発現することを特徴とする請求項４〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
請求項４〜９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項１、２、３、または１０に記載のポリヌクレオチドからなる形質転換体選抜用マーカー遺伝子。
請求項１、２、３、または１０に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
請求項１、２、３、または１０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、フェニルアラニンの合成活性を有するポリペプチドを発現してなる形質転換体。
上記形質転換体は、植物細胞または植物体であることを特徴とする請求項１３に記載の形質転換体。
上記植物細胞または植物体は、イネ科植物に由来するものであることを特徴とする請求項１４に記載の形質転換体。
請求項１３〜１５の何れか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とするフェニルアラニンの生産方法。
請求項１３〜１５の何れか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とするフェニルプロパノイド類の生産方法。
請求項１３〜１５の何れか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とするフェニルアラニンおよびトリプトファンの生産方法。
請求項１３〜１５の何れか１項に記載の形質転換体を含む食品。
請求項１１に記載のマーカー遺伝子または請求項１２に記載の組換え発現ベクターを細胞に導入することにより、細胞の増殖を阻害するトリプトファンアナログに対する耐性を細胞に付与し、さらに当該トリプトファンアナログに対する耐性を発現している細胞を選抜することからなる、形質転換細胞の選抜方法。
少なくとも請求項１、２、３、または１０に記載のポリヌクレオチド、あるいは請求項１２に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含むことを特徴とする形質転換キット。