KR101760931B1 - 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법 - Google Patents

양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양파 웅성-가임(Male fertility) 또는 웅성-불임(Male sterility) 선별용 핵산분자 및 이를 이용한 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 양파에서 웅성불임의 임성 회복을 결정하는 후보 유전자로 5종을 선별하였다. 본 발명자들이 규명한 후보 유전자는 아가로오스 겔 상에서 용이하게 유전자형의 분석이 가능하고, 보편적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 판별방법을 이용하는 경우 양파의 F1 잡종 교배의 효율을 향상시킬 수 있으며, 특히 후대검정(progeny test)시 4년 이상 소요되는 작업을 단 하루 만에 끝낼 수 있어 양파 품종 육종 효율을 획기적으로 개선할 수 있는 효과가 있다.

Description

양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법{Molecular Markers related a Restorer-of-Fertility gene and Methods for Selecting of Male-Fertility or Male-Sterility in Onion}
본 발명은 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 이를 이용한 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법로서, 보다 상세하게는 벌크 분리개체 분석(bulked segregant analysis) 및 RNA 서열분석을 이용한 양파 세포질 웅성불임 임성회복(fertility restoration of cytoplasmic male-sterility) 유전자기반 분자표지 동정에 관한 것이다.
세포질 웅성불임(Cytoplasmic male-sterility, CMS)은 자성생식(female fertility)에는 특별한 영향을 미치지 않으나 화분의 생성에는 영향을 미치는 모계 유전형질(maternally inherited trait)이다. 진화에 있어서 이러한 CMS가 선택적 이점이 있는지는 여전히 불분명하지만(Hanson and Bentolila 2004), CMS는 자연계의 140 여종 이상의 식물에서 성공적인 생식 전략으로 채택되어 왔다(Laser and Lersten, 1972). 지금까지는 미토콘드리아의 지놈에서 비이상적인 유전자가 생성됨으로써 CMS의 자연발생 사례가 나타났다(Hu et al.2O14).
몇 가지 식물 미토콘드리아 지놈의 특징으로 인하여 CMS가 유도되는 것으로 예상된다(Schnable and Wise L998; Budar et al. 2003; Knoop 2004; Kubo and Newton 2008). 작고 안정적인 동물 미토콘드리아와 달리, 식물 미토콘드리아는 비교적 다양한 크기의 큰 지놈을 가지고 있는데, 예컨대 Brassica 종은 약 200 kb 크기의 지놈을 가지고 있으며(Palmer and Herbon 1987) Silene conica는 11,319 kb 크기의 지놈을 가지고 있다(Sloan et aL.2012). 또한 식물은 유전자의 역동적인 재배열로 인하여 지놈의 구성이 매우 다양하다(Palmer 1988; Park et al. 2013b). 이에 식물 미토콘드리아 지놈의 구조도 아직 명확히 정립되지 않았다(Backert et at.1997; Oldenburg and Bendich 2001; Allen et aI.20O7).
빈번한 반복 서열-매개 재조합은 역동적인 재배열을 가져온다(Palmer L988; Small et al. 1989;Albert et al. 1,998; Woloszynska and Trojanowski 2OO9). 비교적 짧은 반복서열(<1 kb)에서는 지놈 재배열이 나타나지만, 긴 반복서열은 지놈 재배열로 인해 다양한 서브지놈(subgenome)이 형성됨으로써 여러 부분의 형성에 영향을 미친다. 서브지놈의 카피넘버 및 화학량론(stoichiometry) 또한 다양하며, 동일종내(intraspecific) 레벨에서조차 그러하다. 서브지놈의 특정 화학량론은 일반적으로 세대를 거치는 동안에도 유지되지만, 아화학량론적 이동(substoichiometric shifting)이라 불리는 메커니즘에 의해 변화할 수 있다(Sakai and Imamura 1993; Bellaoui et al. 1998; Janska et al. 1998; Arrieta-Montiel et al.200L; Kim et al.20O7). 아화학량론적 이동에 의해 나타나는 CMS-유도 유전자를 가진 low-copy-number 서브지놈의 카피넘버 증가는 단기간 내에 CMS 유도를 가져온다(Janska et al. 1998). 조직 배양(Kanazawa et al. 1994) 및 특정 핵 유전자의 돌연변이는 식물에서 아화학량론적 이동을 가져오는 것으로 알려져 있다. Msh1 (Abdelnoor et al. 2006) 및 RecA (Shedge et al. 2007) 유전자는 단일가닥 DNA 결합 단백질인 OSB1 (Zaegel et aL.2006) 뿐만 아니라 DNA 복구에도 관여하며, 미토콘드리아 지놈 재배열의 억제에도 관련된다. 많은 식물 종에서 비정상적 미토콘드리아 유전자에 의해 나타나는 웅성 생식은 대부분 핵 임성회복(restorer-of-fertility, Rf) 유전자에 의해 회복된다. 옥수수에서 Rf 유전자를 최초 분리해낸 이래(Cui et al. 1.996), 다른 식물 여러 식물종에서 Rf 유전자가 클로닝되었다.
4 개의 Rf 유전자는 펜타트리코펩타이드 리피트(pentatricopeptide repeat, PPR) 단백질을 코딩하는 것으로 밝혀졌으나(Bentolila etal.2OO2; Brown et aL.2003; Desloire et al.20O3; Koizuka et al.2OO3; Komori et al.20O4; Klein et al. 2005), 알데하이드 디하이드로게나아게(Cui et al. L996), 글리신-rich 단백질(Itabashi et aI.2011) 및 다른 미규명 단백질(Fujii and Toriyama, 2009)과 같은 다른 기능 또한 보고되었다.
양파에서는 2 가지 CMS 시스템이 보고되었다: CMS-S (Jones and Emsweller 1936) 및 CMS-T (Berninger 1965). 상기 시스템은 F1 잡종 종자 생산에 널리 이용되어 왔다. 두 시스템의 웅성불임 표현형을 육안관찰로는 구별하기 어려움에도 불구하고, 임성회복 유전 메카니즘이 서로 다르다는 것이 보고되었다. Rf 유전자의 하나인 Ms 유전자좌(locus)는 CMS-S에서 임성회복을 조절하는 것으로 밝혀졌고(Jones and Clarke 1943), 3개 이상의 독립적인 Rf 유전자좌가 CMS-T의 임성회복에 관여하는 것으로 밝혀졌다(Schweisguth 1973). 그러나, 최근 연구에서 CMS-S 및 CMS-T의 웅성생식이 동일한 Ms 유전자좌 또는 밀접하게 연관된 다른 유전자에 의해 회복될 수도 있음이 보고되었다(Kim et al., 2014).
양파는 2년생 작물이고, CMS를 이용해야만 경제적인 F1 잡종 종자 생산이 가능하기 때문에, 신속하고 신뢰성 있는 세포질 타입 및 Rf 유전자 타입의 동정은 양파 F1 잡종 재배에 있어 기본적인 것이다. 이에 세포질 타입 동정을 위해 미토콘드리아 및 엽록체 지놈 다형성에 기반한 많은 분자 마커가 개발되었다(Havey 1995; Sato 1998; Engelke et al. 2OO3; Kim et al. 2OO9). 또한, Ms 유전자형의 마커-assisted 선별을 위해 Ms 유전자위와 연관된 분자적 마커가 개발되었다(Gokge et al., 2O02; Bang et al., 2013; Park et al., 2O13; Yang et al., 2013; Kim et al., 2014). 본 발명에서는 벌크 분리개체 분석(bulked segregant analysis)(BSA, Michelmore et al., 1991) 및 RNA-Seq을 결합시키는 방법으로써, CMS 양파의 웅성불임 회복에 영향을 미치는 후보 유전자를 동정하였고, 상기 후보 유전자의 다형성을 기반으로 Ms 지노타이핑을 위한 신뢰할 수 있는 유전자 마커를 동정하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 양파의 웅성불임 회복에 영향을 미치는 후보 유전자를 동정하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 벌크 분리개체 분석(bulked segregant analysis) 및 RNA-Seq을 이용하여 양파의 웅성불임 회복관련 5개의 후보 유전자를 규명하였으며, 이를 세포질 타입 분석을 위한 분자 마커로 활용하는 경우 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 양파 웅성-가임(Male fertility) 또는 양파 웅성-불임(Male sterility) 선별용 핵산분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열, 제3서열, 제5서열, 제7서열 또는 제9서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파 웅성-가임(Male fertility) 선별용 핵산분자를 제공한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열, 제4서열, 제6서열, 제8서열 또는 제10서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양파 웅성-가임(Male fertility) 선별용 핵산분자를 제공한다.
본 발명자들은 양파의 웅성불임 회복에 영향을 미치는 후보 유전자를 동정하고자 예의 연구 노력한 결과, 벌크 분리개체 분석(bulked segregant analysis) 및 RNA-Seq을 이용하여 양파의 웅성불임 회복관련 5개의 후보 유전자(Acepa31446, Acepa28839, Acepa26780, Acepa27528, Acepa23881)를 규명하였으며, 이를 세포질 타입 분석을 위한 분자 마커로 활용하는 경우 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별할 수 있음을 확인하였다.
양파의 세포질 웅성불임 임성회복에 관여하는 임성회복 유전자(Ms) 후보를 동정하기 위하여, 벌크 분리개체 분석 및 RNA-seq을 조합하여 이용하였다. 32,674 개의 새로운 조합 contig 중, 141개 contig에서 430 개의 완벽한 동종 SNP 웅성가임(male-fertile, MF) 및 웅성불임(male-sterile, MS) 벌크 간의 430 개의 완벽한 동종 SNP가 동정되었다. PCR 증폭 및 시퀀싱에 의해 SNP의 동형접합성(homozygosity)을 확인한 결과, 139 개 contig 상의 SNP는, Ms 유전자 및 밀접하게 연관된 2 개의 분자적 마커 간의 교차작용이 일어나는 2가지 재조합체의 유전자형이었다. 결과적으로, 대규모 분리집단에서 Ms 유전자와 완벽한 연관성을 나타내는 30 개 contig 가 동정되었다. 이들 중 14개는 251개 국내 품종의 지노타이핑 결과에서와 같이 Ms 유전자와 완전 연관 불균형 (linkage disequilibrium, LD)을 나타내었다. 또한, 14 개 contig를 태깅하는 분자적 마커는, 14개 마커가 2개 그룹으로 분리되며 교차(crossover)가 나타나는 한 품종을 제외하고는, 21 개국에서 도입한 124 개 외국 품종과는 거의 완전 연관 불균형을 나타내었다. 완전 LD를 나타내는 14 개 contig의 전장 cDNA를 시퀀싱한 후에, MF 및 MS 대립유전자의 아미노산 서열과 비교하였다. 4개 유전자(Acepa31446, Acepa28839, Acepa26780, 및 Acepa27528)는 공지 도메인(known domain) 내에는 매우 중요할 것으로 예상되는 아미노산 변화가 있었고, 1개 유전자(Acepa23881)는 보존구역에서 아미노산 변화가 있었다(도 5 참조).
이들 중 DNA 불일치 복구(mismatch repair) 기전에 연관된 PMS1 유전자는 양파의 웅성불임 임성회복과 관련된 가장 유력한 후보유전자로 예상된다. 미토콘드리아 유전체에 존재하는 웅성불임 유기유전자는 대부분 chimeric gene들인데 이들은 빈번하게 발생하는 미토콘드리아 유전체의 recombinaiton에 의해서 발생한다. 이러한 미토콘드리아 유전체의 recombination발생을 억제하는 핵 내에 존재하는 유전자들이 보고되고 있는데 이들 중 하나가 PMS1유전자를 포함한 DNA mismatch repair에 관여하는 유전자들이다. 따라서 이러한 연관성을 바탕으로 후보 유전자들 중에서 AcPMS1이 가장 유력한 후보유전자로 예상된다.
본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제10서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈(예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 예컨대 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NCBI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
상기 서열목록 제1서열 내지 제10서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산분자는 양파의 F1 잡종 육종 프로그램에서 개체의 분리(segregation), 즉 웅성-가임 및 웅성-불임의 개체를 분리하는 데 있어서 마커-기반 선별(marker-assisted selection)에 유용한 분자 마커로 이용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 서열목록 제1서열 내지 제10서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자는 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) 마커 또는 ILP (intron length polymorphism) 마커이다.
상기 “CAPS 마커”는, 개체 간의 유전적 차이를 제한효소를 이용하여 DNA를 분해하고 결과물을 분석하는 CAPS 방법에 이용될 수 있는 표현 형질에 따른 유전적 차이를 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 상기 CAPS 방법은 개체 간의 다른 제한효소 부위를 포함하는 PCR 증폭을 실시하고, 상기 PCR 증폭의 산물을 제한효소로 분해한다. 분해된 산물을 아가로즈 또는 아크릴아마이드 젤에 전기영동하여 분해된 산물의 밴드 패턴을 분석한다.
상기 “ILP 마커”는 분자마커로 주로 활용되며, ILP 마커는 인트론에서 나타나는 길이의 다형성(Length polymorphism)을 이용한 것이다. 타겟 인트론 주변의 서열에 기반하여 디자인된 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 검출된다. PCR 증폭된 산물을 아가로즈 또는 아크릴아마이드 젤에 전기영동하여 PCR 산물의 밴드 패턴을 분석한다.
본 발명의 명세서에서, 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임을 판별하기 위한 ‘분자 마커’는 상기 ‘CAPS 마커’ 및 ‘IPL 마커’를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 Acepa31446 이고, 상기 서열목록 제3서열 또는 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 Acepa28839 이며, 상기 서열목록 제5서열 또는 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 Acepa26780 이고, 상기 서열목록 제7서열 또는 서열목록 제8서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 Acepa27528 이며, 상기 서열목록 제9서열 또는 서열목록 제10서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분자 마커는 Acepa23881 이다. 상기 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제10서열의 뉴클레오타이드 서열은 Ms 유전자좌와 완전 연관불균형(LD)을 나타내는 유전자이다(표 4 참조).
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열은 DNA 불일치 복구 단백질(DNA mismatch repair protein) PMS1 을 코딩하고, 상기 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열은 만노오스-6-포스페이트 아이소머라아제를 코딩하고, 상기 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열의 뉴클레오타이드 서열은 단백질 AAR2 호몰로그를 코딩하며, 상기 서열목록 제7서열 및 서열목록 제8서열의 뉴클레오타이드 서열은 2-하이드록시아실-CoA 리아제 단백질, 상기 서열목록 제9서열 및 서열목록 제10서열의 뉴클레오타이드 서열은 페록시좀 생합성 단백질 22를 코딩한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별방법을 제공한다:
(a) 양파의 gDNA(genomic DNA)을 수득하는 단계; 및
(b) 상기 gDNA 중 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제10서열로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 단계.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법은 양파로부터 gDNA를 수득하고, 상기 gDNA 중 본 발명의 신규한 10종의 분자 마커, 즉 서열목록 제1서열 내지 제10서열로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 분석함으로써 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 분석은 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), ILP (intron length polymorphism), PCR(Polymerase Chain Reaction), RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA), AFLP(Amplified fragment length polymorphism), RFLP(Restriction Fragment Lennth Polymorphism), DAF(DNA Amplification Fingerprinting), AP-PCR(Arbitrarily primed PCR), PCR-SSCP(Single-strand Conformation Polymorphism), RT-PCR(Reverse transcriptase PCR), ISSR(Inter-simple Sequence Repeat Amplication), STS(Sequence Tagged Site), EST(Expressed sequence tag), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), DNA 시퀀싱, 마이크로어레이(Microarray)에 의한 혼성화, 노던 블럿(Northern Blot) 또는 서던 블럿(Southern blot)으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 ILP 분석방법은 서열목록 제11서열 및 제12서열; 또는 서열목록 제13서열 및 제14서열의 프라이머 세트를 이용하여 실시할 수 있다. ILP 분석방법은 PCR 방법을 통해 해당 유전자를 증폭하고, 증폭된 산물을 전기영동하여 밴드 패턴을 분석하는 유전자 분석 방법이다. 상기 밴드의 크기(size)를 관찰함으로써 양파 웅성-가임 또는 웅성-불임을 판단할 수 있다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제1서열 또는 제2서열을 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제11서열 및 제12서열이다. 프라이머 서열 11과 12를 이용하여 PCR을 수행한 후, band 크기 차이에 따라 웅성불임과 웅성가임을 판별할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제11서열 및 서열목록 제12서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, Indels 사이즈를 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다: (ⅰ) 상기 PCR 산물의 Indels 사이즈가 34 bp인 산물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 산물이 존재하지 않는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제3서열 또는 제4서열 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제13서열 및 제14서열이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제13서열 및 서열목록 제14서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, Indels 사이즈를 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다: (ⅰ) 상기 PCR 산물의 Indels 사이즈가 13 bp인 산물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 산물이 존재하지 않는 경우에는 웅성-가임으로 판단한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 CAPS 분석방법은 서열목록 제15서열 내지 제20서열로 구성된 군에서 선택되는 적어도 한 쌍의 프라이머 세트를 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 상기 CAPS는 PCR 방법을 통해 유전자를 증폭하고, 증폭된 산물에 제한효소를 처리하여 분해하고, 분해된 산물을 전기영동하여 밴드 패턴을 분석하는 유전자 분석 방법이다. 상기 밴드를 관찰함으로써 양파 웅성-가임 또는 웅성-불임을 판단할 수 있다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제5서열 또는 제6서열을 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제15서열 및 제16서열이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제15서열 및 서열목록 제16서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 제한효소 Hind Ⅲ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다:(ⅰ) 상기 PCR 산물이 절단되지 않고 808 bp band 1개가 있을 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 산물이 절단되어 603 bp와 205 bp의 2개의 band로 절단되면 웅성-불임으로 판단한다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제7서열 또는 제8서열을 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제17서열 및 제18서열이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제17서열 및 서열목록 제18서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 제한효소 Dra I을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다: (ⅰ) 상기 PCR 산물이 절단되지 않고 640 bp band 1개가 있을 경우에는 웅성-가임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 산물이 전단되어 427 bp와 207 bp의 2개의 band로 절단되면 웅성-불임으로 판단한다.
본 발명의 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임 판별방법의 단계（b)에서 서열목록 제9서열 또는 제10서열을 분석하는 경우, PCR을 실시하기 위해 사용되는 프라이머는 서열목록 제19서열 및 제20서열이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 양파로부터 수득한 gDNA에 서열목록 제19서열 및 서열목록 제20서열의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하고, PCR 산물에 제한효소 Pvu Ⅱ을 처리하여 분해된 패턴을 분석하여 양파의 웅성-불임 또는 웅성-가임을 판별한다:(ⅰ) 상기 PCR 산물이 절단되지 않고 1,344 bp band 1개가 있을 경우에는 웅성-불임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 산물이 전단되어 936 bp와 406 bp의 2개의 band로 절단되면 웅성-가임으로 판단한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제1서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제1서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-가임 판별용 키트; 또는
(a) 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제2서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제2서열 또는 서열목록 제2서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-불임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 프라이머는 서열목록 제11서열 및 제12서열로 구성된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명은 (a) 서열목록 제3서열 또는 서열목록 제3서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제3서열 또는 서열목록 제3서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-가임 판별용 키트; 또는
(a) 서열목록 제4서열 또는 서열목록 제4서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제4서열 또는 서열목록 제4서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-불임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 프라이머는 서열목록 제13서열 및 제14서열로 구성된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명은 (a) 서열목록 제5서열 또는 서열목록 제5서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제5서열 또는 서열목록 제5서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-가임 판별용 키트; 또는
(a) 서열목록 제6서열 또는 서열목록 제6서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제6서열 또는 서열목록 제6서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-불임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 프라이머는 서열목록 제15서열 및 제16서열로 구성된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명은 (a) 서열목록 제7서열 또는 서열목록 제7서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제7서열 또는 서열목록 제7서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-가임 판별용 키트; 또는
(a) 서열목록 제8서열 또는 서열목록 제8서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제8서열 또는 서열목록 제8서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-불임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 프라이머는 서열목록 제17서열 및 제18서열로 구성된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명은 (a) 서열목록 제9서열 또는 서열목록 제9서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제9서열 또는 서열목록 제9서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-가임 판별용 키트; 또는
(a) 서열목록 제10서열 또는 서열목록 제10서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; (b) 서열목록 제10서열 또는 서열목록 제10서열의 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-불임 판별용 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 프라이머는 서열목록 제19서열 및 제20서열로 구성된다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별방법을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 이용되는 프라이머는 타깃 핵산서열에 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 양파 웅성-가임(Male fertility) 또는 웅성-불임(Male sterility) 선별용 핵산분자 및 이를 이용한 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별방법에 관한 것이다.
(b) 본 발명자들은 양파에서 웅성불임의 임성 회복을 결정하는 후보 유전자로 5종을 선별하였으며, 특히 이중 Acepa31446 (AcPMS1) 을 최선의 후보 유전자로 선정하였다.
(c) 본 발명자들이 규명한 후보 유전자는 아가로오스 겔 상에서 용이하게 유전자형의 분석이 가능하고, 보편적으로 사용될 수 있다.
(d) 본 발명의 판별방법을 이용하는 경우 양파의 F1 잡종 교배의 효율을 향상시킬 수 있으며, 특히 후대검정(progeny test)시 4년 이상 소요되는 작업을 단 하루 만에 끝낼 수 있어 양파 품종 육종 효율을 획기적으로 개선할 수 있는 효과가 있다.
도 1a 및 도 1b는 선별된 재조합체 및 육성계통(breeding line)의 Ms 유전자좌(locus) 및 마커 유전자형의 연관맵을 나타낸다. 도 1a는 이전 연구에서 밝혀진 Ms 유전자 측면의 연관맵을 나타낸다(Park et aL. 2013a). 도 1b는 대규모 분리집단에서 선별된 2 개 재조합체 및 랜덤 선택된 4 개 육성 계통의 마커 유전자형을 나타낸다. 동형 열성 유전자형은 회색상자로 나타내었다. A: 동형 우성(homozygous dominant), H: 이형(heterozygous), B: 동형 열성(homozygous recessive), D: 동형 우성 또는 이형(homozygous dominant or heterozygous).
도 2는 외국 품종에서 Ms 유전자좌의 후보 유전자를 태깅하는 14개 분자마커의 연관관계를 나타낸다. 이전연구에서 보고된 jnurf13 마커도 포함되었다(Kim 2014). 대다수의 마커 유전자형과 일치하지 않는 마커 유전자형은 검은색 박스(filled box)로 나타내었다. 화살표는 ‘PI233186’을 나타내며, 마커들을 두 그룹으로 나누는 교차를 포함하고 있다(그룹 A 및 B). Accessions 번호는 별도 기재하지 않았다. 1: RF15334, 2: RF23881, 3: RF24123, 4: RF24998, 5: RF25191,6:RF28L84, 7: RF28314, 8 : RF31446, 9: RF31869, 10: RF24501, 11: RF26780, 12: RF27463, 13: RF28839, 14: jnurf13, 15: RF27528.
도 3은 다른 식물종으로부터 분리된, 양파의 PPR 모티프 포함 단백질의 계통발생론적 관계를 나타낸다. 다른 종으로부터 분리한 Rf 유전자의 GenBank accession number는 괄호 안에 표시하였다. 계통수는 최종 아미노산 서열을 이용하여 인접 결합 방법에 의해 구축되었다. 노드에 표시한 숫자는 1000 개 replicates 를 가진 부트스트랩 확률(%)을 나타낸다.
도 4는 Ms 유전자좌와 연관되거나 또는 완전 연관불균형(LD)를 나타내는 4 개 그룹에서의 SNP 빈도 비교 결과이다. A: 도 2에서 그룹 A에 속하는 육종계통에서 완전 LD를 나타내는 9 개 유전자, B: 도 2에서 그룹 B에 속하는 육종계통에서 완전 LD를 나타내는 5 개 유전자, C: 대규모 분리집단에서는 Ms 유전자좌와 완전 연관을 나타내고, 육종계통에서는 완전 LD가 나타나지 않은 15 개 유전자, D: Ms 유전자좌와 연관되고, 분리집단의 Ms 유전자좌와 완전 연관을 나타내지 않은 98 개 유전자.
도 5는 다른 식물 종에서 분리된 상위 50 개 상동(homologous) 단백질에서 나타나는 MF 및 MS 특이적 아미노산 변화 비율을 나타낸 것이다. 검은색 및 회색 막대는 각각 MF 및 MS-특이적 아미노산 비율을 나타낸다. 공지된 도메인은 Pfam search (Finn et al., 2014)를 이용하여 동정하였고, 위치는 상기 그래프에서 수평선(가로선)으로 나타내었다. MS 대립유전자에 특이적이고, 공지 도메인 상에 위치한 아미노산 변화는 그래프 위에 별표로 표시하였다.
도 6a 및 도 6b는 벼 염색체 맵이며, Ms 유전자좌-연관된 양파 유전자와 이종상동성(orthologous)인 유전자의 위치를 보여준다. 맵에서의 거리 단위는 kbp (kilobase pair)이며, MapChart 2.L software (Voorrips 2OO2)를 이용하여 생성하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
식물재료
웅성불임(male-sterile, MS)인 모계(506L) 및 웅성가임(male-fertile, MF)인 부계(H6)의 사이에서 유래한 F2:5 분리집단을 이용하여 BSA 및 RNASeq 분석을 수행하였다. 밀접하게 연관된 contig를 스크리닝하기 위하여, 이전 연구에서 만들어진 4,273 개의 분리식물에서(Park et al. 2013), Ms 유전자 및 밀접 연관된 jnurf05 (Park et al., 2013) 및 OPT (Bang et al., 2O11) 마커 간에 교차가 나타나는 2개의 재조합체(12-510 및 11-248)를 선별하였다. 한국의 6 개 다른 육종기관에서 보유하고 있는 251 개 육성계통을 이용하여 Ms 유전자와의 연관불균형(LD)이 있는 곳에서 상기 contig를 동정하였다(육종기관: 농우바이오, 농협종묘센터, 양파나라, 국립원예특작과학원, 씨앗과 사람들, 양파연구소). 이러한 육종계통의 웅성가임 표현형 및 세포질 타입은 이전 연구에서 확인되었다(Kim et al., 2014).
또한 21 개국에서 도입한 124개 외국 품종을 분석하여 육종계통 중 완전 LD를 나타내는 contig 의 연관불균형(LD) 레벨을 평가하였다. 이들 중 83개 품종이 국자 식물 생식질 시스템(농업 연구서비스, 볼티모어, MD, USA)으로부터 도입되었다. 다른 41 개 종은 다양한 국가에서 상업적으로 구입가능한 품종이다.
MF 및 MS 벌크(bulks) 간의 RNA-Seq 분석 및 동형 SNP 분석
외관시험(visual examination)에서 결정된 웅성가임 표현형 및 Ms 유전자좌 근처의 밀접 연관 분자마커(jnurf05 and OPT)의 유전자형에 따라 MF 및 MS 동형 식물그룹에서 각각 10개의 개체를 선별하였다. 상기 2개의 마커는 이전 연구에서 보고된 것이다(Bang et al., 2011; Park et al., 2013). RNA 추출키트를 이용하여 MF 및 MS 식물 10개 벌크 샘플의 개화전 꽃에서 RNA를 추출하였다(RNeasy Plant Mini Kit, QIAGEN, Valencia, CA, USA). RNA 시퀀싱 및 SNP 분석은 전문기관에서 수행하였다(Phyzen, Seoul, Republic of Korea). 즉, Illumina TruSeqⓡ RNA sample preparation v2 guide (Illumina, Hayward, CA, USA)를 이용하여 RNA 샘플로부터 cDNA 라이브러리를 생성하였다. HiSeq 2000 (Illumina)를 이용하여 전사체(transcriptome)를 시퀀싱하였으며, 101 bp paired-end reads 를 생성하였다. 이어 전사체 서열을 “accession numbers SRP056991”로서 SRA 데이터베이스에 저장하였다. 트리니티 소프트웨어(Trinity software, Haas et al. 20l3)를 이용하여, MF 및 MS 벌크의 조정된 미가공 리드(Trimmed Raw reads)를 결합하여 새로운 contig로 조합하였다. SAMTools 소프트웨어 (Li et al., 2OO9)를 이용하여 벌크 간에 나타나는 SNP를 분석하기 위하여, MF 및 MS 벌크의 미가공 리드를 별도로 조합된 contig로 맵핑하였다. MF 및 MS에서 각 contig의 정량은 RSEM 소프트웨어 (Li and Dewey, 2011)를 이용하여 수행하였다.
MF 벌크에서 유의적인 발현증가를 나타내는 꽃 조직-특이적 contig를 동정하기 위하여, 이전 잎 조직에서 조합된 30,004 contigs를 이용하였다(Kim et al., 2Ol5). 본 발명에서와 같이 상기 contig는 동일한 친계 (H6)를 이용하여 만들어졌다. 30,004 contig 에서 검출되지 않고 달리 발현되는 contig를 꽃 조직-특이적 contig 로 판단하였다. contigs는 중복 부위를 갖는 DNA 단편들의 집합을 나타낸다.
DNA 추출, PCR 증폴 및 PCR 결과물 시퀀싱
세틸트리메틸암모늄브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB) 방법을 이용하여(Doyle and Doyle, 1987) 잎 또는 꽃자루 조직으로부터 전체 지노믹 DNA를 추출하였다. MF 및 MS 벌크 간의 동형 SNP를 확인하기 위하여, 139개 스크리닝된 contig의 1개 또는 2개 예상 인트론 근처의 엑손 서열에 기반하여 프라이머 쌍을 디자인하였다. 엑손-인트론 추정 경계는 Rice Genome Annotation Project (Ouyang et al., 2OO7)에서 검색된 벼 이종상동성(orthologous) 서열과 비교함으로써 결정하였다(데이터미기재). 프라이머서열 및 일부 contig에 대한 정보는 표 1 )에 기재하였다. 이와 동일하게, MF 벌크에서 유의적인 전사 증가를 나타내는 145 contig의 엑손 서열에 기반하여 프라이머 서열을 디자인 하였다.
contig contig 길이 SNP 수 Annotation 프라이머
(5‘ to 3’)
RF31446 1,023 1 DNA 불일치 복구 단백질 PMS1 F: GGCTAAAGGGGTTCGGTTAC
R: AAGAGTGCCTTCATCGGAAA
RF28839 1,278 5 만노오스-6-포스페이트 아이소머라아제 F: TTACACAAGATGCACCCAAA
R:GGGGCTCATTAGCATCCAG
RF26780 1,227 3 단백질 AAR2 호몰로그 F: GGGCCTTACCCTCTAAACCA
R: CGCTCCTTGACAATATGAGGA
RF27528 1,704 11 2-하이드록시아실-CoA 리아제 F: GCTTGGCCTGCTGTTATGAT
R: GGAGACTCGCCAAAATGAAG
RF23881 675 7 페록시좀 생합성 단백질 22 F: GATCCTCATGGCTTTGGAGA
R: GGGAAGTGAACACGTTTGGT
contigs의 PCR 증폭은 0.1 μg 주형, 2.5 μL l0 x PCR 버퍼, 0.5 μL forward 프라이머 (10 μM), 0.5 μL reverse 프라이머 (10 μM), 0.5 μL dNTPs (각 10 mM), 및 0.25 μL 폴리머라아제 믹스(Advantage 2 Polymerase Mix, Clontech, Palo Alto, CA, USA)를 포함하는 25 μL 반응 혼합물 내에서 수행하였다. PCR 증폭은 다음 과정으로 구성된다: 최초 변성단계 95℃, 4분; 10 사이클, 95℃, 30초, 65℃ (각 사이클마다 0.8℃씩 감소), 30초 및 72℃, 1분; 35 사이클, 95℃, 30초, 57℃, 30초, 72℃, 1분; 및 최종 72℃, 10분 연장반응. PCR 결과물은 1.5% 아가로스 젤에서 에티티움 브로마이드 염색 후 확인하였다. 단일 PCR 생성물이 관찰되는 경우, QlAquick PCR 정제 키트(QIAGEN)를 이용하여 PCR 생성물을 정제하였다. 시퀀싱 반응은 Big Dye (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였으며, 서열은 ABI PRISM 3730XL Analyzer (Applied Biosystems)를 이용하여 얻었다.
CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) 및 ILP (intron length polymorphism) 마커의 PCR 증폭은, 대량 샘플 분석을 위하여 10 μL 반응혼합물 및 0.25 U Taq polymerase (Prime Tag DNA polymerase; GeNet Bio, Nonsan, Korea)를 사용하였다. 그리고 상술한 PCR 조건과 동일한 PCR 증폭 조건을 적용하였다. CAPS 마커의 PCR 결과물을 적절한 온도에서 3시간 동안 제한효소로 처리하였다. 이어 PCR 산물 또는 제한효소처리 산물을 1.5% 아가로스 젤에서 확인하였다. 프라이머 서열은 및 제한 효소는 표 2에 기재하였다.
본 발명의 분자마커
Figure 112015067490253-pat00001
RT-PCR 및 RACE (rapid amplification of cDNA ends)
Ms 유전자좌와 완전 LD를 나타내는 contig의 MF 및 MS 전장 cDNA 서열을 얻기 위하여, 조립된 contig로부터 전장 cDNA 서열이 얻어질 수 있는 경우 RT-PCR을 수행하였다. 만약 일부 서열만이 조립될 수 있다면, MF 및 MS 대립유전자의 전장 cDNA 서열을 얻기 위해 RACE를 수행하였다. RT-PCR 방법에 따라, RNA 시퀀싱 분석에 사용된 동일한 MF 및 MS 벌크 RNA 및 상업적으로 구입가능한 cDNA 합성 키트(SuperScriptrM III first-strand synthesis system for RT-PCR, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 생성하였다. RT-PCR 증폭은 다음의 조건으로 수행하였다: 최초 변성단계 94℃, 3분; 40 사이클, 94℃, 30초, 65℃, 30초, 72℃, 3분 min; 및 최종 연장반응 72℃, 10분. RACE 는 상업적으로 구입가능한 키트를 이용하여 수행하였다.(SMART RACE cDNA Amplification Kit; Clontech). PCR 결과물은 상술한 방법으로 정제 및 시퀀싱하였다.
양파 PPR 유전자의 동정, 및 양파와 다른 식물종에서 분리된 PPR 단백질의 계통수 구축
BioEdit software를 이용하는 로컬 BLAST 검색을 통하여, PPR 모티프를 포함하는 양파 contig를 동정하였다(Hall 1999). 벼의 Rf1a 단백질 (GenBank accession number ABC4233O)을 쿼리(query)로 이용하였다. BioEdit software (Hall 1999)를 이용하여 PPR-포함 Rf 유전자와 비교적 가까운 양파 PPR 유전자의 아미노산 서열을 옥수수, 벼, 무 및 페튜니아(petunia)로부터 분리된 PPR-포함 Rf 유전자와 얼라인하였다. 5 가지 애기장대 Rf-PPR-like (RFL) 유전자(Fujii et al. 2011) 또한 얼라인 과정에 포함시켰다. 얼라인에서 나타난 gap은 Gblocks software (Castresana 2000)를 이용하여 “less stringent selection”으로 제거하였다. 계통수(phylogenetic tree)는 neighbor-joining method를 적용하는 MEGA version 4 (Tamura et al.2007)를 이용하여 구축하였다. 계통수의 노드지원은 1,000 부트스트랩(bootstrap) 복사체에 의해 평가되었다.
실험결과
BSA 및 RNA-Seq 분석을 이용한 Ms 유전자좌와 밀접 연관된 contig의 선별
양파에서 웅성 생식회복에 관련된 후보유전자를 동정하기 위하여, MF 및 MS 벌크 샘플의 꽃 조직에서 RNA를 추출하여 전사체 시퀀싱을 수행하였고, 그 결과 미가공 서열인 전체 4.9 Gb 및 5.3 Gb 서열을 얻었다. 낮은 퀄리티 서열을 트리밍(trimming)하고, MF 및 MS 서열을 풀링한 이후에, 32,674 개 contig를 새로이 조립하였다. MF 및 MS 벌크로부터의 미가공 리드(raw reads) 벌크간의 SNP를 동정하기 위해 조립된 contig로 분리하여 맵핑하였다. 벌크 간 430 개 완전 동형 SNP가 동정되었으며, 이들은 141 contigs 에 분포되어 있었다. 상기 SNP는 IGV viewer (Robinson et aL.2011)를 이용하여 얼라인된 리드의 가시적 관찰 (visual investigation)로써 재확인하였고, 이형(heterozygous) SNP를 나타내는 2 개의 contigs 는 제거하였다 (표 3).
Ms 유전자좌와 연관불균형(LD)를 나타내는 contigs의 선별 과정
단계 스크리닝 기준 contigs 수
1 De novo assembly of contigs from raw reads produced by RNASeq 32,674
2 Contigs containing homozygous SNPs between MF and MS bulks 141
3 Contigs containing reliable SNPs verified by the IGV viewer 139
4 Contigs containing perfectly homozygous SNPs verified by PCR amplification and sequencing of bulked DNAs of MF and MS individuals 128
5 Contigs containing the SNPs showing perfect linkage with the Ms locus in the large-sized segregating population consisting of 4,273 plants 30
6 Contigs containing the SNPs showing perfect LD with the Ms locus in diverse breeding lines 14
벌크 간의 동형(homozygous) SNP를 확인하기 위하여, 139개 contig에서 SNP 서열에 대한 프라이머 쌍을 디자인하였다(일부 contigs에 대한 프라이머 서열, 표 1 참조). 벼의 이종상동성(orthologous) 유전자를 이용하여 엑손-인트론 연결지점(Putative exon-intron junction)을 추측하였으며, 가능하다면 프라이머는 1개 또는 2개의 인트론 근접의 엑손 서열에 기반하여 디자인 하였다. 처음에는 분리집단에서 선별된 10개 동형 개체를 구성하는, MF 및 MS 벌크 DNA를 PCR 증폭의 주형으로 이용하였다. 만약, PCR 증폭이 실패할 경우 다른 프라이머 쌍을 디자인 하였으며, PCR 증폭이 성공하는 경우에는 PCR 생성물을 즉시 시퀀싱하여 동형 SNP를 확인하였다. 11개의 contigs 를 제외하고, 예상한대로 모든 contigs에서 벌크 간 완전 동형 SNP가 나타남을 발견하였다. 또한, 시퀀싱 결과 contigs 중 81.3%에서의 인트론 위치(적어도 하나의 인트론을 포함하고 있는 75개 contigs 중 61개 contigs)는 벼 오솔로그(orthologs)에 있는 인트론 위치와 완벽히 매칭되었다. 그러나, 상기 위치가 완전 무작위적이 아님에도 불구하고 벼 이종상동성 유전자(orthologous gene)의 염색체 위치는 벼 지놈 상에서 서로 연관되지 않는다(도 6a 및 도 6b).
이어 스크리닝 단계에서는, 128개 선별된 contigs 상에 있는 SNP를 시퀀싱함으로써, Ms 유전자좌 및 jnurfO5 마커 간의 교차가 나타난 재조합체 (12-510)를 지노타이핑하였다(도 1a 내지 도 1b). jnurf05 마커는 Ms 유전자좌와 0.047 cM 거리로서 밀접하게 연관되어 있다(도 1a, Park et al. 20l3). '12-510' 식물의 웅성가임 표현형은 웅성 불임이었으며; 이의 Ms 유전자형은 열성 동형접합성으로 예상하였다. 그러나 상기 재조합체에서 85 개 contig의 SNP 유전자형이 이형접합성이었다. 이는 85개 유전자가 jnurf05 마커와 동일한 방향의 위치에서 Ms 유전자좌와 연관되어 있음을 의미한다(도 1b). 이어, Ms 유전자좌 및 OPT 마커 간 교차를 포함하는 또 다른 재조합체(11-248)를 대상으로, 12-510 재조합체의 열성 동형접합체 SNP 유전자형을 나타내었던 43개 contig의 SNP에 대하여 분석하였다. 이중, 30개 contigs 가 Ms 유전자좌와 동일한 유전자형을 나타내었으며, 이는 대규모 분리집단에서 Ms 유전자좌와 완전연관 되었음을 나타낸다(표 3).
다음으로, 무작위 선별된 4개의 육종계통에서(90377, 90143, 90904 및 90027), Ms 유전자좌와 완전연관을 나타내는 30개 contigs의 SNP를 지노타이핑하였다. 상기 육종계통의 Ms 및 연관 마커 유전자형은 알려져 있다(도 1b). 30 개 contigs 중 16개에서 Ms 유전자좌와 동일한 유전자형이 나타났다. 대량 샘플 분석을 위하여, 16개 contigs에서 SNP 및 indel 다형성에 기반하여 공동-우성 CAPS 또는 ILP 마커를 개발하였다. 상기 마커는 6개 다른 기관에서 251 개 육종계통을 분석하는데 이용되었으며, RF24000 및 RF24437 마커를 제외한 모든 마커의 유전자형은 Ms 유전자좌의 표현형과 완전 매칭되었다. 이는 14개 contigs 가 Ms 유전자좌와 거의 완전 연관불균형(Linkage disequilibrium, LD)임을 나타낸다.
추가적으로, 다양한 생식질(germplasm)에서 이들 마커의 LD 레벨을 평가하기 위하여, 21개국에서 도입한 124개 외국 품종에서 15개 마커를 분석하였다. 일 품종인 PI233186 는 15개 마커를 2 그룹으로 분류하는 교차가 일어나는 것으로 나타났다(도 2). 도 2에서 그룹 A를 포함하는 9 개 마커는 서로 완전 LD를 나타내었으나, 그룹 B의 5개 마커 중 하나인 RF27528 (15번)은 여러 재조합체를 나타내었다. 이전 연구(Kim et al., 2O14)에서 밝혀진 jnurfl3 마커 또한 그룹 B에 포함되었다. 그러나, P1233186 이 정상적인 세포질을 가지고 있었기 때문에 본 발명자들은 Ms 유전자좌의 위치를 결정할 수 없었다.
MF 및 MS 벌크 간 유전자 발현차이 분석 및 Ms 유전자좌 및 양파 PPR 유전자 패밀리 간의 연관관계분석
MS 식물에서 열성 Ms 대립유전자가 전사되지 않는다면, 상술한 SNP 분석에서 후보유전자가 검출될 수 없다. 따라서 MS 벌크와 비교하여 MF 벌크에서 10 배 이상의 발현증가를 나타내는 contig를 스크리닝하였다.
단계적인 스크리닝 방법을 사용하여, 최종 145개 contigs를 선별하였다. 145 개 contigs 중 97개의 전사는 잎 조직으로부터 조립된 전사체에서 검출되지 않았기 때문에 꽃 조직-특이적인 것으로 판단된다. 그러나 5개의 contigs 가 Ms 유전자좌와 밀접한 연관을 나타내었음에도 불구하고(Acepa02974, Acepa068l0, Acepal3742, Acepa15612 및 Acepa27928), 재조합체인 MF 및 MS 벌크 및 4개의 육종계통으로부터 증폭된 PCR 생산물의 분석 이후, SNP 분석에서와 같이 Ms 유전자좌와 완전 LD를 보여주는 contigs 는 없었다.
다른 식물종에서 클로닝된 Rf 유전자 대부분은 PPR 단백질을 코딩하므로, 후보유전자로서 양파 전사체로부터 PPR 도메인을 포함하는 contigs를 선별하였다. 쿼리(query)로서 벼 RF1a 단백질을 이용하여 로컬 BLAST 검색을 수행하여 적어도 하나의 PPR 모티프를 가지는 483개 contigs 를 선별하였다. 2개 contigs (Acepa02436 및 Acepa14756)는 MF 및 MS 벌크 간 동형 SNP를 포함하는 contig 리스트에 포함되었으나 Ms 유전자와 완전 연관을 나타내지는 않았다. 또한 MF 벌크에서 적어도 3배 발현증가를 나타내는 14 개 PPR 유전자를 분석하였으나, 이들 모두 Ms 유전자좌와 어떠한 연관도 나타내지 않았다. 다른 종에서 분리된 Rf 및 Rf-유사 PPR 유전자와 밀접하게 연관된 41개 PPR 유전자를 분석하였으나(도 3), 이들 유전자들은 동형 SNP를 포함하거나, MF 벌크에서 2 배 이상의 발현증가를 나타내지 않았다(데이터 미기재).
Ms 유전자좌와 LD를 나타내는 contigs 의 전장 cDNA 서열 아노테이선 및 Ms 유전자좌에 대한 후보유전자의 동정
RT-PCR 및 RACE 을 이용하여 MF 및 MS 동형 개체로부터, 육종 계통에서 Ms 유전자좌와 완전 LD를 나타내었던 14개 contigs 의 전장 cDNA 서열을 수득하였다. 14개 유전자 코딩부위에서의 SNP 빈도는 다른 연관 유전자와 비교하여 현저히 높았다(도 4). 특히 도 2에서 그룹 A에 속했던 9개의 유전자가 가장 높은 SNP 빈도를 나타내었다. 유전자의 위치가 Ms 유전자좌와 가까웠기 때문에 SNP 빈도는 더 높아진다.
이어 아미노산 서열을 이용하는 BLAST-p 검색을 통하여 상기 14개 유전자의 예상 기능을 분석하였다(표 4). PPR 단백질과 같은 Rf 유전자의 기능이 밝혀지지는 않았다. 중요 돌연변이를 동정하기 위하여 MF 및 MS 대립유전자인 14개 유전자의 아미노산 서열을 비교하였다. 상기 유전자 중 하나인 Acepa15334 는 MF 및 MS 대립유전자 간에 다형성 아미노산 서열을 나타내지 않았으므로 이후의 분석에서 제외시켰다. 남은 13개 유전자 중, 다른 식물종에서 분리된 상위 50개 동형 단백질의 아미노산 서열을 양파 서열과 얼라인하여 보존 서열(conserved region)을 동정하였다. 알려진 도메인(known domain) 내에 위치하고, MS 대립 유전자에 특이적인 아미노산 서열변화를 검색하였다. 4개 유전자(Acepa31446, Acepa28839, Acepa26780, 및 Acepa27528)는 알려진 도메인에서 중요한 아미노산 변화가 나타났다(도 5). Acepa23881 유전자의 경우, 공지 도메인에서는 아미노산 변화가 없었음에도 불구하고 보존구역에서 2개의 아미노산 변화가 관찰되었다(도 5). LD 분석 즉, 아노테이션된 기능 및 중요 아미노산 변화여부에 근거하여, DMA 미스매치 복구 단백질 PMS1을 코딩하는 유전자(Acepa31446)를 양파에서 가장 유력한 임성회복 유전자 후보로 선정하였다. 이하 본 발명에서 동정한 PMS1 유전자를 AcPMS1 으로 표기하였다.
Ms 유전자좌와 완전 연관불균형(LD)를 나타내는 유전자 및 MF/MS 대립유전자 간의 아미노산 변화의 수
유전자 Annotation 코딩서열 길이 (bp) 아미노산 변화 수
Acepa15334 60S ribosomal protein L37a 276 0
Acepa23881 Peroxisome biogenesis protein 22 765 6
Acepa24123 Inactive leucine-rich repeat receptor-like serine/threo nine-protein kinase 2,001 8
Acepa24501 66 kDa stress protein 1,766 4
Acepa24998 Beta-galactosidase 2,487 6
Acepa25191 Uncharacte rized protein 744 11
Acepa26780 Protein AAR2 homolog 1,224 10
Acepa27463 KH domain-containing protein 1,920 6
Acepa27528 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1,7O1 5
Acepa28184 Uncharacterized protein 942 10
Acepa28314 Kinesin-13A 2,163 7
Acepa28839 Mannose-6-phosphate isomerase 1,275 13
Acepa31446 DNA mismatch repair protein PMS1 2,640 26
Acepa31869 Serine/threonine-protein kinase EDR1 2,724 17
논의
BSA 및 RNA-Seq 을 이용한 Ms 유전자좌와 완전 LD를 나타내는 유전자의 동정
BSA 및 RNA-Seq 을 이용하여 Ms 유전자좌와 완전 LD를 나타낸 14개 유전자를 성공적으로 동정하였다. 차세대 시퀀싱의 도입으로, RNA 시퀀싱은 다양한 종의 대량 SNP 연구에 있어 강력한 도구가 되었다(Schneeberger and Weigel 2011; Mutz et aI. 2013; Wolf 2013). 이러한 분석에 있어 지놈 서열에 대한 신뢰성 있는 자료가 없기 때문에(Edwards et al., 2013), 특히 RNA-seq 분석은 특히 양파와 같이(16,400 Mb/lC) 복합 또는 거대 지놈을 포함하는 작물 종의 연구에 유용하다. 옥수수(Liu et al. 2012) 및 밀(Trick et al.2012)에서 중요한 특성을 나타내는 원인 유전자를 클로닝하는데 있어, BSA 및 RNA-Seq 분석의 조합방법이 유용한 것으로 보고되었다.
in silico에서 동정된 SNP를 확인하고 RCR-기반 마커를 규명하기 위하여, 1개 또는 2개 인트론에 근접한 엑손 서열에 기반하여 프라이머를 디자인하였다. 벼는 양파와 가장 밀접하게 연관된 모델이므로, 벼 이종상동성 유전자의 정보로부터 각 contig의 엑손-인트론 경계를 예상하였다. 양파 인트론 위치의 약 81%가 벼의 이종상동성 유전자와 매칭되었다. 이와 유사하게, 양파 인트론의 83%의 위치가 벼 인트론의 위치와 동일하으나(Martin et al., 2005), 양파와 벼의 지놈간에는 공선성(collinearity)이 없었다. 본 발명자들은 단자엽 식물아강(monocotyledonous) 작물 간의 마이크로신터니(microsynteny)가 없는지 재확인하였다. Ms 유전자좌와 밀접하게 연관된 양파 유전자에 이종상동성인 벼 유전자의 위치는 거의 무작위적이다(도 6a 및 도 6b). 본 발명에서 분석한 양파 유전자는 모두 Ms 유전자좌와 연관되어 있었으므로, 만약 벼와 양파 지놈간의 신터니(synteny)가 보존되었다면, 벼 오솔로그 유전자는 벼 지놈상에서 클러스터(cluster)를 형성했을 것이다. 따라서, 양파 지노믹 소스의 확립에 있어 별도의 노력이 필요하다.
양파 CMS에서 웅성임성회복과 관련된 후보유전자의 동정
4,273 개체로 구성된 대규모 집단에서 선별된 2개 재조합체(12-510 및 11-248)를 이용하여 후보유전자를 스크리닝하였다. 상기 재조합체를 이용하여 OPT 및 jnurf05 마커 사이의 약 0.55 cM 간격 내에 위치한 30개의 유전자를 성공적으로 동정하였다. 231개 육종계통(breeding lines) 분석을 통하여 유전자 중 16개를 제거하였다. 이들 육종계통은 6개의 다른 기관에서 수득하였지만 상기 기관들이 모두 대한민국에 있어, 이들의 유전적 다양성은 매우 협소한 것으로 보인다.
21 개국에서 도입한 124 개 외국 품종의 분석을 통하여 14개 유전자를 2 그룹으로 분류하였다(그룹 A 및 B, 도 2 및 표 4 참조). 특히, PI233186 은 두 그룹 간 교차(crossover)를 포함하고 있다. 그룹 A의 마커 유전자형은 이형접합성(heterozygous)이었고, 그룹 B는 열성 동형접합성(homozygous recessive)이었다. 그러나, 성장조건이 맞지 않아 이들 외국 품종에서 웅성임성 표현형을 찾는데 실패하였다. 또한, P1233186 는 정상적인 세포질을 가지고 있어 P1233186의 Ms 유전자좌를 지노타이핑하는데는 적어노 4년이 걸릴 것이다. Ms 유전자형이 동정되지 않았음에도 불구하고, 그룹 B의 마커인 RF27528가 124 개 accession 중 여러 개의 재조합체를 포함하고 있으므로, Ms 유전자좌는 그룹 A에 속하는 것으로 판단된다. 반면, 그룹 A에 속한 마커는 모든 accession에서 완전 LD를 나타내었다. 그룹 A의 유전자 코딩 서열에서 나타나는 SNP 빈도는 그룹 B보다 약간 높았고, 연관 유전자(그룹 D, 도 4)보다 3.8 배 더 높았다. 그룹 A 유전자를 포함하는 LD 블록에서 나타나는 높은 SNP 빈도는 오랜 번식기간동안 선택(selection)에 의한 특징으로 보여진다(Gupta et al., 2005). SNP 빈도는 유전자간의 거리에 따라 점진적으로 감소하였고, Ms 유전자좌는 LD 감소에 따라 더 멀어졌다(도 4).
아노테이션된 기능. 높은 SNP 빈도 (1.97 / 100 bp) 및 중요 아미노산 변화여부에 근거하였을 때, AcPMSl는 양파 CMS에서 웅성임성 회복에 관여하는 가장 유력한 후보유전자로 예상된다. 이 유전자는 PMS1 단백질을 코딩하는데, 상기 단백질은 DNA 미스매치 복구 (DNA mismatch repair, MMR)에 관여한다. MMR 시스템은 DNA 복구 경로 중의 하나이며, 박테리아에서 동물/식물에 이르기까지 매우 보존되어 있다. 3개 호모다이머(homodimeric) 단백질, MutS, MutL, 및 MutH 는
대장균 (Escherichia coli.) MMR 시스템의 구성이며, MutS는 DNA 부정합(mismatch)을 인지하여 MutL을 리크루닝한다. 이로 인해 부정합 부분에 엔도뉴클레아제 활성을 가진 MutH가 리그루팅된다(Kolodner and Marsischky 1999; Bray and West 2005; Kimura and Sakaguchi 2006). PMS1 단백질은 MLHL 와 헤테로다이머를 형성하여 효모 및 식물에서 MutL과 유사한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Bray and West 2005).
애기장대에서 2개의 독립적 PMS1 유전자 돌연변이체는 화분 알갱이가 50% 이상 파괴되었으며 동형접합 재조합이 증가하였다(Li et al., 2009). 화분의 높은 붕괴비율은 MLH1 유전자 돌연변이를 가진 애기장대에서도 관찰되었다. MLH1 유전자는 PMS1와 헤테로다이머를 형성하는 파트너이다(Dion et al., 2007). 또한, Msh1 유전자 산물은 MutS와 상동이며, MMR 및 식물 미토콘드리아 재조합 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다(Abdelnoor et al., 2003). 애기장대에서 Msh1 돌연변이는 광범위한 미토콘드리아 지놈의 재배열을 가져온다(Arrieta-Montiel et al., 2009). 담배와 토마토에서 RNAi를 통한 Msh1 유전자 비활성은 유전적 세포질 융성불임을 가져온다(Sandhu et al., 2007). MMR 시스템 및 CMS 유도 간의 관련성이 명확히 밝혀지지 않았음에도 불구하고, AcPMS1 유전자는 양파 CMS의 임성회복에 관여한다면, AcPMS1 유전자는 이들의 연관성을 연구하는데 훌륭한 도구가 될 것으로 예상된다. AcPMS1 유전자는 본 발명에서 Ms 유전자좌의 강력한 후보로 제안되며, 실제 원인 유전자가 동형 SNP 및 유전자 발현차이 동정을 위한 본 발명의 스크리닝 과정에서 발견되지 않을 가능성을 배제할 수도 없다.
양파 육종에서 Ms 유전자좌와 완전 LD를 나타내는 분자마커의 적용
방임수분(open-pollinate) 품종에서 F1 잡종으로의 변화는 양파를 포함한 채소 종자 시장에서 세계적인 추세가 되어왔다. CMS는 F1 잡종 종자 생산을 실현시키는 유일한 방법이므로, 양파 F1 잡종 육종을 위한 필수 도구가 되었다. 그러나, 시간-소모적이고 노력이 많이 소요되는 후대검정(progeny test)으로 인하여 다양한 보유 계통(maintainer line) 개발이 제한되어왔다. 이러한 한계점은 Ms 유전자좌의 유전자형 분석을 위한 신뢰성 있는 분자마커를 이용함으로써 극복할 수 있을 것이다.
본 발명자들은 이전연구에서, Ms 유전자좌와 연관불균형(Linkage Disequilibrium, LD을 나타내는 분자마커(jnurf13)에 대해 보고하였다(Kim et al., 2014). 그러나 상기 마커는 유전자간 부위의 indel 다형성에 근거하여 디자인되었고, indel (12 bp)의 크기가 매우 작아서 아크릴아마이드 젤 상에서만 마커 지노타이핑이 가능했다. 또한, jnurf13 는 도 2에 있는 그룹 B 마커에 속하는 것으로 나타났다. 따라서, 만약 AcPMS1 유전자가 양파의 임성 회복에 관여하는 것으로 밝혀진다면, AcPMS1 유전자 상의 다형성에 근거한 간단한 PCR 마커(RF31446)가 Ms 유전자좌의 지노타이핑 마커가 될 것이다. 상기 마커는 그룹 A에 속하며, 21 개국의 모든 검정 품종(tested accessions)에서 완전 LD를 나타내었다. 또한, 비교적 큰 34 bp indel이 사용되므로 이 마커는 아가로스 젤을 이용하여 쉽게 지노타이핑될 수 있다. 따라서, 본 발명의 RF31446 마커는 널리 이용될 수 있으며, 양파의 F1 잡종 육종의 효율성을 크게 증가시킬 것이다. 실험적인 적용 외에도, AcPMS1 및 Ms 유전자좌와 완전 연관불균형을 나타내는 다른 유전자은 향후 Ms 유전자좌를 클로닝하는데 매우 유용한 물질이 될 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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cagttttggt acagaatgaa ccaaggacga ggctggatgc aggaacatgg 1380 ggaacaatgg gggttggctt aggatactgc attgcagcag cagttgcttc accagataga 1440 cttgtagtcg cagtcgaggg agattcaggt ttcgggttta gtgctattga agtcgagacg 1500 ttggtgagat atcagcttcc agttatcgtg atcgttttta acaacggagg tgtatatggt 1560 ggtgatcgta gaagccctga agaaataacc ggaccctaca aaagcgaccc tgcccctact 1620 tcatttgtcc ctgatgctgc atatcacaag ttaatagaag cctttggagg taaaggttac 1680 attgcaagca ctactcaaga actaaaatca gctctcaaag actctttttc tgccaaaaaa 1740 cctgctgtgg ttaatgttat tatcgatcct tatgctggag cagagagtgg gaggttacag 1800 cacaaaaact gacgcattca tgaaatggat ccaggtactg tactcttttc cttgttgaat 1860 aaa 1863 <210> 9 <211> 871 <212> DNA <213> Onion Acepa23881 Male-fertile <400> 9 tcatcaatcc attgataaat tgataaagca ctacaaggaa attaatgtca gacaacattt 60 caaatcaatc caaatcccta attctcaaaa tcgcccaatc tttcaaccgc aaaatctctc 120 aatttttctt cattctcatc aatcaaaaga acgcgggatc tattggagct ctcgctggat 180 tagcgattgc tttgatattc atcttgaagt tattgagttt gccacgtgga aggcccagaa 240 gatccaatag agtcaaacga agagaactga gctctagaaa tgaggttgac tcgaggtcaa 300 agaatttgaa tttcactgaa tcgccagctg agcttgatct tgggaaaatt gtgaaaatga 360 agctgaatgg gggacgaaag atgactatcc aattgcttgg agcaatttta gaggagacga 420 gcatagaaga gcttcagaaa caagctacca ttaagctttc atctttaaaa gtgcttgtgg 480 aaatctccaa aacttgtgat gtctatctaa tggaaacggt gcttgatgat gaaagtgagg 540 aaaggatcct catggctttg gagaacgctg ggcttttcct caccgggagt ctgagcaagg 600 agaaggttct attctgtagc actgacattg gcagatcatc tttcgttcga caactggagt 660 cagattggca tgtagattca aatttagaag tagtttctca actagctaga tttatcagga 720 accaacttca catatcgcaa atcgacacag gttcaattgg accaaacgtg ttcacttccc 780 caagcttgga gcagtatttt tcctgcctct aatttaccac acacaattta tattgtaagt 840 ccctgcataa tatactagaa gagtagagtc a 871 <210> 10 <211> 865 <212> DNA <213> Onion Acepa23881 Male-sterile <400> 10 cttactccat tataatcgac aaagcactgc aaggaaatta atgtcagaca acatttcaaa 60 tcaatccaaa tccctaattc tcaaaatcgc ccaatctttc aaccgcaaaa tctctcagtt 120 tttcttcatt ctcatcaatc aaaagaacgc gggatctatt ggagctctcg 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<223> AcPMS1 reverse primer <400> 12 aagagtgcct tcatcggaaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acepa28839 forward primer <400> 13 ttacacaaga tgcacccaaa 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acepa28839 reverse primer <400> 14 ggggctcatt agcatccag 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acepa26780 forward primer <400> 15 gggccttacc ctctaaacca 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acepa26780 reverse primer <400> 16 cgctccttga caatatgagg a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acepa27528 forward primer <400> 17 gcttggcctg ctgttatgat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acepa27528 reverse primer <400> 18 ggagactcgc caaaatgaag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acepa23881 forward primer <400> 19 gatcctcatg gctttggaga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acepa23881 reverse primer <400> 20 gggaagtgaa cacgtttggt 20

Claims (15)

  1. 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 양파 웅성-가임(Male fertility) 선별용 핵산분자.
  2. 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 양파 웅성-불임(Male sterility) 선별용 핵산분자.
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  11. 다음의 단계를 포함하는 양파의 웅성-가임 또는 웅성-불임 판별방법:
    (a) 양파의 gDNA(genomic DNA)을 수득하는 단계;
    (b) 상기 gDNA 중 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열을 증폭시키는 단계로서, 상기 서열목록 제1서열의 1-7087 부위 및 7289-14474 부위 에 결합하는 프라이머 세트 또는 서열목록 제2서열의 1-7184 부위 및 서열목록 제2서열의 7440-14900 부위에 혼성화되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭시키는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 증폭산물을 분석하는 단계로서, (ⅰ) 상기 증폭산물의 Indels 사이즈가 34 bp인 산물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 Indels 사이즈가 34 bp인 산물이 존재하지 않는 경우에는 웅성-가임으로 판단하는 단계.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 분석은 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), ILP (intron length polymorphism), PCR(Polymerase Chain Reaction), RFLP(Restriction Fragment Lennth Polymorphism), STS(Sequence Tagged Site), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), DNA 시퀀싱 또는 서던 블럿(Southern blot)인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 서열목록 제11서열 및 서열목록 제12서열의 프라이머 세트를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. (a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 1-7087 부위 또는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드1-7087 부위에 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 7289-14474 부위 또는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 7289-14474 부위에 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-가임 판별용 키트로서, 상기 프라이머에 의해 증폭되는 산물을 분석하여, (ⅰ) 상기 증폭산물의 Indels 사이즈가 34 bp인 산물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 Indels 사이즈가 34 bp인 산물이 존재하지 않는 경우에는 웅성-가임으로 판단하는 양파의 웅성-가임 판별용 키트.
  15. (a) 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1-7184 부위 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 1-7184 부위에 상보적인 서열에 혼성화되는 정방향 프라이머; 및 (b) 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 7440-14900 부위 또는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 7440-14900 부위에 상보적인 서열에 혼성화되는 역방향 프라이머를 포함하는 양파의 웅성-불임 판별용 키트로서, 상기 프라이머에 의해 증폭되는 산물을 분석하여, (ⅰ) 상기 증폭산물의 Indels 사이즈가 34 bp인 산물이 존재하는 경우에는 웅성-불임으로 판단하고, (ⅱ) 상기 Indels 사이즈가 34 bp인 산물이 존재하지 않는 경우에는 웅성-가임으로 판단하는 양파의 웅성-가임 판별용 키트.
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J. Kor. Soc. Hort. Sci. Vol.42, No.5, pp.527-532
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