JP6935876B2 - 新規ペプチド及びその利用方法 - Google Patents
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Description
下記アミノ酸配列(1)及び/又は(2)のアミノ酸配列を有するペプチド。
(1) (ALRKNMDFCPQSETGWHYIV)−(LIVFA)−(HPWRK)−(TSNQ)−(TSNQ)−(LIVFA)−(TSNQ)−(TSNQ)−(LIVFA)−(FYW)−(LIVFA)−(HPWRK)
(2) (LIVFA)−(RHK)−(TSNQ)−(LIVFA)−(LIVFA)−(TSNQ)−(LIVFA)−(LIVFA)−(LIVFA)−(RHK)−(RHK)−(HPW)
{ただし、上記式の()中の少なくとも1種のアミノ酸のいずれか1つが選択される}
以下のうち、いずれか1つのアミノ酸配列を含むペプチド。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
以下のうち、いずれか1つのアミノ酸配列で表されるペプチド。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
以下のうち、いずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも90%同一である配列を含むペプチド。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
以下のうち、いずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも95%同一である配列を含むペプチド。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
以下のうち、いずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも98%同一である配列を含むペプチド。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
以下のいずれか1つのアミノ酸配列において、1〜5個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された配列を含むペプチド。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
鉱物を選別するための組成物であって、発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチドを含む、該組成物。
発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチドをコードする核酸。
発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチドをコードする核酸の配列と少なくとも90%以上同一の配列を有する核酸。
発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチドをコードする核酸の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチドを表面に提示した微生物。
発明9〜11のいずれか1つに記載の核酸を有する微生物。
発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチドを表面に有する微粒子。
発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチドを有する精製カラム。
発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチドを有する捕収剤。
発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチドを使用する、モリブデンを抽出するための方法。
発明1〜7のいずれか1つに記載のペプチド又は発明8の組成物を使用する、鉱物を選別するための方法。
発明18に記載の方法であって、前記鉱物が輝水鉛鉱である、該方法。
発明18又は19に記載の方法であって、
前記ペプチドを表面に有する微生物を、鉱物粒子が分散した液に添加するステップと、
前記鉱物を凝集させ、沈降させるステップと、
前記凝集及び沈降した鉱物を回収するステップと
を含む方法。
発明18又は19に記載の方法であって、
前記ペプチドを担体に固定するステップと、
前記担体をカラムに導入するステップと、
鉱物粒子が分散した液を前記カラムに通過させるステップと
を含む方法。
発明18又は19に記載の方法であって、
前記ペプチドを微粒子に固定するステップと、
鉱物粒子が分散した液に、前記微粒子を添加するステップと
を含む方法。
発明18又は19に記載の方法であって、
前記ペプチドを用いた浮遊選鉱を行うステップ
を含む方法。
発明18〜23いずれか1つに記載の方法であって、鉱物を懸濁させた液のpHが4以上である、該方法。
発明18〜23いずれか1つに記載の方法であって、鉱物を懸濁させた液のpHが7以上である、該方法。
本発明は、一実施形態において、特定の物質を分離する方法に適用することができる。特定の物質として、モリブデンを含む物質が挙げられる。より具体的には、モリブデンを含む鉱物を分離する方法に適用することができる。モリブデンを含む鉱物としては、輝水鉛鉱、モリブデン鉛鉱、パウエライト、鉄水鉛鉱等が挙げられる。実質採掘されているという観点から、典型的なモリブデンを含む鉱物として、輝水鉛鉱が挙げられる。
上述した物質を分離するため、本発明は、一実施形態において、ペプチドを用いることができる。より具体的には、少なくとも以下のいずれか1つの配列を含むペプチドを用いることができる。典型的には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20のうちから選択される2つの数で規定される範囲(例:1以上10以下、5以上20以下)のアミノ酸をN末端側及び/又はC末端側に付加することができる。
(2) (LIVFA)−(RHK)−(TSNQ)−(LIVFA)−(LIVFA)−(TSNQ)−(LIVFA)−(LIVFA)−(LIVFA)−(RHK)−(RHK)−(HPW)
{ただし、上記式の()中の少なくとも1種のアミノ酸のいずれか1つが選択される}
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
配列(A)の10番目はチロシンである。チロシンは芳香族アミノ酸であるため、同様の性質を有するトリプトファンやフェニルアラニンに置換しても、同様の効果を有すると考えられる。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
アミノ酸配列(A)及び(B)のN末端側及び/又はC末端側には、任意の数のアミノ酸が付加されてもよい。典型的には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20のうちから選択される2つの数で規定される範囲(例:1以上10以下、5以上20以下)のアミノ酸をN末端側及び/又はC末端側に付加することができる。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
本発明は、一実施形態において、上述したペプチドをコードする核酸を包含する。核酸は、DNAでもRNAでもよい。また、本発明は、一実施形態において、上述したペプチドをコードする核酸のセンス鎖に対して相補的な配列を有する核酸であってもよい。
上述したペプチド及び/又は核酸は、様々な形で応用することができる。
例えば、遺伝子工学的な手法を用いて(例えば、微生物の遺伝子に上述した核酸を導入して)、微生物に目的のペプチドを大量に生成させることができる。あるいは、微生物の表面に目的のペプチドを発現させて、該微生物を利用して、目的の物質を分離することができる。本明細書で述べる「微生物」には、五界説で述べるところの菌界、モネラ界、又は原生生物界に属する生物が含まれる。また、厳密な意味では生物には該当しないものの、本明細書で述べる「微生物」には、ウイルスも含まれる。典型的には、真菌、細菌、ウイルスを用いる。特に好ましいのは、遺伝子工学的な手法が確立された物である(例:酵母、E.coli、乳酸菌、バクテリオファージなど)。本発明は、一実施形態において、このような微生物を包含する。
本発明は、一実施形態において、ペプチドを表面に有する微粒子を包含する。ペプチドは、上述したペプチドを用いることができる。また、微粒子は、ビーズ(例:磁気ビーズ、ガラスビーズ、高分子ビーズなど)、担体等が挙げられる。微粒子の大きさについては、特に限定されず、用途に応じて適宜調整すればよい。また、微粒子の表面にペプチドを結合させる手法については、当分野で公知の手法を用いることができる。
目的の物質を分離する方法としてカラムクロマトグラフィーが挙げられる。カラムクロマトグラフィーは、カラム(カラム表面の官能基)が特定の物質に選択的に結合することを利用する。本発明の一実施形態では、上述したペプチドを担体に担持させることができる。そして、この担体をカラムに導入することができる。こうしたカラムを使用することにより、目的の物質を分離することができる。
浮遊選鉱(浮選)は、微粒子を気泡にトラップさせることにより分離する方法である。この際に、捕収剤を使用することができる。本発明の一実施形態では、上述したペプチドが気泡にトラップされやすい場合には、ペプチドそのものを捕収剤として用いることができる。もしくは、ペプチドを公知の捕収剤や起泡剤に結合し、気泡にトラップしやすい形態として用いることができる。これにより、目的の物質を気泡にトラップすることができ、結果として分離することができる。
上述した応用形態に関する方法を以下具体的に説明する。
上述した応用形態はいずれも所定の物質を分離することに関する。ここで、分離対象の物質はモリブデンである。例えば、上述したモリブデン含有鉱物(例えば、輝水鉛鉱)を分離することができる。
本発明は、一実施形態において、微生物を用いて、物質(具体的には、モリブデン含有鉱物、より具体的には輝水鉛鉱)を分離することができる。微生物としては、上述した微生物であれば、いずれも用いることができる。典型的にはバクテリオファージが挙げられる。
本発明は、一実施形態において、カラムクロマトグラフィーを用いて、物質(具体的には、モリブデン含有鉱物、より具体的には輝水鉛鉱)を分離することができる。方法としては、まず、上述したペプチドを、公知の手法により、担体に固定させることができる。その後、その担体を精製用のカラムに導入することができる。前記カラムが準備できたら、分離対象の物質が分散した液を、前記カラムの中に通す。すると、前記物質は、カラムの中に結合するか、又は溶出が遅れる。これにより、特定の物質を分離することができる。
本発明は、一実施形態において、微粒子を用いて、物質(具体的には、モリブデン含有鉱物、より具体的には輝水鉛鉱)を分離することができる。まず、上述したペプチドを、公知の手法により、微粒子表面に固定させることができる。その後、鉱物粒子が分散した液に、微粒子を添加することができる。微粒子を添加した後、暫く放置すると、微粒子表面にあるペプチドが鉱物粒子と結合し、凝集が起こる。そして、溶液の底に沈降する。その後、底に沈降した鉱物を回収することができる。あるいは、微粒子として磁気ビーズを用いることができ、沈降することを待つことなく、磁力を用いて、鉱物粒子を回収することができる。
本発明は、一実施形態において、捕収剤又は起泡剤を用いて、物質(具体的には、モリブデン含有鉱物、より具体的には輝水鉛鉱)を分離することができる。具体的には、捕収剤又は起泡剤を、公知の方法により、上述したペプチドと結合させる。そして、結合させた捕収剤を溶液に導入して撹拌させ(適宜他の薬剤も導入し)、気泡を発生させる。その後、鉱物粒子を導入し、該鉱物粒子を気泡にトラップさせる。これにより、鉱物粒子を回収することができる。あるいは、ペプチドそのものを捕収剤として使用してもよい。
上述したペプチドは、特定の鉱物に特に強く結合し、他の鉱物には結合しないという選択性を有する。より具体的には、モリブデンを含む鉱物(例:輝水鉛鉱)には強く結合し、他の鉱物(例えば、硫黄、黄銅鉱、硫砒銅鉱、黄鉄鉱)には、結合しない(又は、モリブデンを含む鉱物の場合と比べて結合度合いが著しく低い)という性質を有する。従って、モリブデンを含む鉱物と他の鉱物との混合物であっても、上述した方法を用いることにより、モリブデンを含む鉱物を分離することができる。
上述したペプチドが、モリブデンを含む鉱物(例:輝水鉛鉱)と結合する際には、溶液を特定のpH範囲に調整することにより、結合(更には凝集)を促すことができる。具体的にはpHが増大する程、溶液中の粒度分布における最大粒子径が増大する。例えば、pHが4〜12の範囲、より好ましくはpHが5以上の範囲で、最大粒子径を増大させることができる。
上述したペプチドは、様々な方法で製造することができる。上述したペプチドをコードするDNAを、発現ベクターに組み込んで、微生物等に導入し、大量にペプチドを発現させて回収することができる。
輝水鉛鉱に吸着するペプチド分子の選択としては、ファージディスプレイ法を用いた。具体的には、アミノ酸12個がランダムに結合したM13バクテリオファージライブラリーを用い、粒度75μm以下に粉砕した輝水鉛鉱と接触させ、輝水鉛鉱に吸着したバクテリオファージのみを回収し、回収したファージについて大腸菌に感染させ再度増殖後、再び輝水鉛鉱に接触させ、吸着したファージのみを回収した。この吸着・回収操作(パニング)を数回繰り返し、選択されたファージのDNA配列を解析し、ファージに結合したアミノ酸配列を特定した。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp
以後、(A)に示すペプチドが結合したファージを50−phage、(B)に示すペプチドが結合したファージをM48−phageと呼ぶ。
輝水鉛鉱と実施例1にて選択した50−phage、M48−phageについて、ELISA法(Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay、酵素結合免疫吸着法)により、輝水鉛鉱との結合量を測定した。具体的には輝水鉛鉱3000mg/Lを懸濁した液を96穴マイクロプレートの各ウェルに添加し、それぞれのウェルに各ファージを添加後、未結合のファージを洗浄した。さらにこの懸濁液に酵素(ペルオキシダーゼ)標識した抗M13ファージ抗体を添加したのち、未結合の抗ファージ抗体を洗浄した。ここに酵素の基質となる2,2’−azino−bis(3−ethylbenzothiazoline−6−sulphonic acid) diammonium salt(ABTS)を添加し、青色の発色をマイクロプレートリーダーで波長405nmにて吸光度測定した。更に、これらの手順を、他の鉱物(硫黄、黄銅鉱、硫砒銅鉱、黄鉄鉱)に変更したうえで行った。
温度30℃において、粒子径75μm以下の輝水鉛鉱を3g/Lのパルプ濃度となるように水に懸濁した。この懸濁液に、50−phageおよびnull−phageの各ファージを107〜109pfu/mlとなる濃度に添加し、添加後ただちに懸濁液上部における濁度を波長660nmにて分光光度計で添加時から5秒ごとに測定した。図2にその時の濁度の推移を示す(ファージ添加時=0秒を100%とする)。その結果、50−phageを108pfu/ml添加した場合、迅速な濁度の低下すなわち輝水鉛鉱粒子の急速な沈降が確認された。また同条件における輝水鉛鉱粒子を光学顕微鏡にて観察したところ(図3)、50−phageを輝水鉛鉱に添加した場合に、より顕著に輝水鉛鉱粒子が凝集することが確認された。本結果から、50−phageを輝水鉛鉱懸濁液に適切な濃度で添加することで、輝水鉛鉱を選択的に分離回収できる可能性が示された。
輝水鉛鉱粒子のパルプ濃度を10g/Lとした以外は実施例3と同様の方法にて50−phage添加時の沈降速度を測定した。その結果を図4に示す。輝水鉛鉱10g/L時には、50−phage濃度109pfu/mlにおいて輝水鉛鉱の沈降が顕著に進むことがわかった。
温度30℃において、粒子径75μm以下の輝水鉛鉱を10g/Lのパルプ濃度となるように水に懸濁した。この懸濁液に、50−phageを109pfu/mlとなる濃度で添加し、添加後、NaOHおよびHClで懸濁液のpHを所定の値に調整した。粒子径をAcoustoSizerIIx(協和界面科学(株)製)で測定した。結果を図5に示す。pHが大きくなるほど、最大粒子径が増加する傾向が見られた。特にpH4以上の場合に、輝水鉛鉱だけと比べて50−phageを添加すると最大粒子径が顕著に増加する傾向が見られた。
Claims (9)
- モリブデンを含む鉱物を選別するための組成物であって、
前記組成物は、以下のうち、いずれか1つのアミノ酸配列で表されるペプチドを含み、前記ペプチドは、モリブデンを含む鉱物に結合する活性を有する、組成物。
(A)Gly−Leu−His−Thr−Ser−Ala−Thr−Asn−Leu−Tyr−Leu−His
(B)Ile−Arg−Ser−Leu−Ile−Ser−Ile−Val−Leu−Arg−Arg−Trp - 請求項1のペプチドを使用する、モリブデンを含む鉱物を選別するための方法。
- 請求項2に記載の方法であって、前記鉱物が輝水鉛鉱である、該方法。
- 請求項2又は3に記載の方法であって、
前記ペプチドを表面に有する微生物を、鉱物粒子が分散した液に添加するステップと、
前記鉱物を凝集させ、沈降させるステップと、
前記凝集及び沈降した鉱物を回収するステップと
を含む方法。 - 請求項2又は3に記載の方法であって、
前記ペプチドを担体に固定するステップと、
前記担体をカラムに導入するステップと、
鉱物粒子が分散した液を前記カラムに通過させるステップと
を含む方法。 - 請求項2又は3に記載の方法であって、
前記ペプチドを微粒子に固定するステップと、
鉱物粒子が分散した液に、前記微粒子を添加するステップと
を含む方法。 - 請求項2又は3に記載の方法であって、
前記ペプチドを用いた浮遊選鉱を行うステップ
を含む方法。 - 請求項2〜7いずれか1項に記載の方法であって、鉱物を懸濁させた液のpHが4以上である、該方法。
- 請求項2〜7いずれか1項に記載の方法であって、鉱物を懸濁させた液のpHが7以上である、該方法。
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