CN101939027A - 用于递送核酸的脂肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含具有2-100个氨基酸残基的肽，且具有与所述肽的至少一个末端或所述肽的至少一个氨基酸残基相连的亲脂基团的脂肽化合物，其盐及其应用。所述亲脂基团可以与所述肽的N-末端、C-末端或两端相连。所述亲脂基团可以与至少一个内部氨基酸残基(即，既不是所述肽的N-末端，也不是C-末端氨基酸残基的氨基酸残基)相连。所述亲脂基团可以与任一末端或两端以及至少一个内部氨基酸残基相连。

Description

用于递送核酸的脂肽
技术领域
本发明涉及可用于向细胞递送各种分子的新型药物递送增强剂，该增强剂包括脂质。本发明提供了多种化合物，组合物，制剂，最终引导药物递送的此试剂的方法和应用，疗法，以及疾病或病症的诊断和治疗，其中包括对受试者基因表达或活性的调控作出响应的那些疾病或病症。更具体地，本发明涉及化合物、脂质体、复层脂质体(lamellar vesicles)、乳液、胶束、悬液、颗粒、溶液和其它形式的递送增强组合物和制剂，以及这些递送物质的治疗方法和应用。
背景技术
化合物到达目标细胞或组织的能力有限以及化合物在细胞内的进入或运输受限可阻止治疗性化合物向受试者的递送。治疗性物质的递送通常受到细胞膜的制约。这些递送障碍和制约可导致需要使用的化合物浓度远高于获得治疗结果的理想浓度，而这样会带来毒性作用和副作用的风险。
一个递送策略是利用脂质或聚合载体分子提高化合物向细胞内的运输。这些物质可以利用用于选择性进入细胞，并同时还排除外源分子(例如核酸和蛋白)的机制。例如，阳离子脂质可以与药物试剂相互作用，并提供与细胞膜的接触。脂质分子也可以被组装成脂质体或颗粒，作为药物试剂的载体。脂质药物载体可以保护药物分子免于降解，并同时提高细胞对药物的摄取。另外，脂质药物载体还可以通过静电或其它相互作用而封装或结合某些化合物，并且与带负电荷的细胞膜相互作用，从而启动跨膜运输。
对调控RNA的了解以及RNA干扰(RNAi)、RNAi治疗、基于RNA的药物、反义治疗和基因治疗等的发展提高了对向细胞内引入活性核酸试剂的有效方式的需求。通常，核酸在细胞或血浆内仅稳定存在有限的时间。然而，可以使基于核酸的试剂在组合物和制剂中获得稳定，然后分散以用于细胞递送。
需要的是保持细胞保护作用和较低毒性的组合物和制剂，是它们用于细胞内和体内递送最终用作治疗剂的核酸试剂。另外，还需要向细胞递送双链RNA的组合物和方法，从而产生RNA干扰应答。另外，还需要向所选择的细胞、组织或腔室递送干扰RNA的组合物和方法，从而以改变表型或疾病状态的方式调节基因表达。
发明概述
通过提供利用干扰核酸或其前体与包括脂肽、脂质和天然或合成聚合物在内的多种组分所组合的大量新型化合物、组合物、制剂和方法，本发明可以满足这些需要并实现了其它目的和优点。
在一些实施方式中，本发明包括具有2-100个氨基酸残基的肽和与所述肽的至少一个末端或至少一个氨基酸残基相连的亲脂基团，其盐及其应用。所述亲脂基团可以与所述肽的N-末端、C-末端或两端相连。所述亲脂基团可以与至少一个内部氨基酸残基(即，既不是所述肽的N-末端，也不是C-末端氨基酸残基的氨基酸残基)相连。所述亲脂基团可以与任一末端或两端以及至少一个内部氨基酸残基相连。
以上简述与本发明的详述以及所附实施例和权利要求书作为一个整体，包含了本发明的内容。
发明详述
本发明主要涉及RNA干扰、RNA治疗剂的递送以及脂质化学的领域。更具体地，本发明涉及用于核糖核酸的组合物和制剂，以及其作为治疗剂用于药物和用于递送的应用。本发明主要涉及利用核糖核酸进行RNA干扰，从而基因特异性地抑制哺乳动物基因表达的方法。
本发明提供了包含干扰核酸或其前体与多种组分所组合的多种组合物、制剂和方法，其中，所述多种组分包括脂肽、脂质、类脂部分和天然或合成聚合物。
在一些方面，本发明提供了促进向细胞、组织、器官和活体动物(例如哺乳动物和人)递送包括RNAi诱导试剂、反义RNA试剂或DNA在内的核酸的新型组合物。
脂肽
本发明提供了用于递送和施用干扰-RNA试剂或反义RNA的多种脂肽。所述脂肽可以为阳离子或非阳离子。本文使用的非阳离子包括中性和阴离子。阳离子脂肽可以具有一个或多个阳离子位点。
可以通过在肽的N-末端或C-末端或所述肽的两端取代核酸递送增强基团或类脂基团，形成本发明的脂肽。在一些方面，所述核酸递送基团或类脂基团可以连接到所述肽的一个或多个氨基酸残基的α-碳，或者连接到分别与所述肽的氨基酸残基α-碳相邻的一个或多个氨基基团，或者是连接到所述肽的N-末端、C-末端、一个或多个氨基酸残基的α-碳的这些连接方式的组合，或者连接到分别与所述肽的氨基酸残基α-碳相邻的一个或多个氨基基团。在一些实施方式中，所述核心结构肽可以包含两个或更多个连续氨基酸，或有2-100个氨基酸残基(或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸残基)的肽。
在一些方面，本发明提供了式I所示的一系列脂肽结构：
R3-J-{NRN-CR1R2-(C＝O)}n-Z-R4    式I
其中
各个R1每次出现独立地为氨基酸的非氢侧链；
{NRN-CR1R2-(C＝O)}n为核心结构肽；
R2和RN彼此独立地为氢，或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20个碳原子的有机基团，或者为C(1-22)烷基、(6-12)环烷基、(6-12)环烷基烷基、C(3-18)烯基、C(3-18)炔基、C(1-5)烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-联苯基-C(1-5)烷基、羧基或羟基；
R3和R4彼此独立地为亲脂性尾部，其源自天然存在的或合成的脂质、磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷酯或神经节苷脂，其中所述尾部可以包含类固醇或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成并且具有1-20个碳原子的有机基团，或者为取代或未取代的C(1-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-烷基、C(3-18)烯基、C(3-18)炔基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基，或者为二氢神经鞘氨醇(sphinganine)、(2R，3R)-2-氨基-1，3-十八烷二醇、2-氨基-1，3-二十烷二醇(icosasphinganine)、鞘氨醇、植物鞘氨醇、顺式-4-鞘氨醇(cis-4-sphingenine)或者神经酰胺；
Z为NH，O，或包含马来酰亚胺基、硫醚、酰胺、半胱胺(cysteamide)、半胱氨酸、硫醇或二硫基的连接子，或包含1-400个原子的聚氧乙烯或聚氧丙烯基，或者包含选自C、H、F、Cl、Br、N、O、S、Si和P的组的1-200个原子的连接子；
J为(C＝O)，O，或包含马来酰亚胺基、硫醚、酰胺、半胱胺、半胱氨酸、硫醇或二硫基的连接子，或包含1-400个原子的聚氧乙烯或聚氧丙烯基，或者包含选自C、H、F、Cl、Br、N、O、S、Si和P的组的1-200个原子的连接子；
并且，n为2-100。
可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽能够结合核酸。
可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽可以为两性氨基酸序列。例如，所述肽可以具有形成疏水序列域或基序的多个非极性或疏水氨基酸残基，所述疏水序列域或基序可以与形成带电序列域或基序的多个带电氨基酸残基相连，从而形成两性肽。
可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽可以为聚-Lys-Trp(4：1，Mw20,000-50,000)，聚-Orn-Trp(4：1，Mw 20,000-50,000)，蜂毒肽(mellitin)蛋白的片段或变体，以及组蛋白(例如组蛋白H1、组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3或组蛋白H4)的片段或变体。
可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽可以具有多个阳离子位点或多个带正电荷的残基。
所述肽可以包含约2-约45个带正电荷的残基，约3-约45个带正电荷的残基，约4-约45个带正电荷的残基，约5-约45个带正电荷的残基，约10-约45个带正电荷的残基，约15-约45个带正电荷的残基，约20-约45个带正电荷的残基，约25-约45个带正电荷的残基，约30-约45个带正电荷的残基，约35-约45个带正电荷的残基，约40-约45个带正电荷的残基。
所述肽可以是被充分硫醇化(thiolylated)的聚赖氨酸肽。它们可以包含至少约3、4、5、6、7或8个硫醇基团等，或者可以仅具有两个硫醇基团。
可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述核心结构肽为精氨酸(Arg)n(SEQID NO：341)、高精氨酸(homoArg)n(侧链-(CH2)4NH(C＝NH)NH2)、降精氨酸(norArg)n(侧链-(CH2)2NH(C＝NH)NH2)、降-降精氨酸(nornorArg)n(侧链-(CH2)NH(C＝NH)NH2)、鸟氨酸(Om)n、赖氨酸(LyS)n(SEQ ID NO：342)、组氨酸(His)n(SEQ ID NO：343)，其中n为2-100。
可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽为(Arg，His)n、(Lys，His)n、(Arg，Lys)n、His-(Arg)n-His(SEQ ID NO：344)、His-(Lys)n-His(SEQ ID NO：345)、(His)n-(Arg)n-(His)n(SEQ ID NO：346)或(His)n-(Lys)n-(His)n(SEQ ID NO：347)，其中n为2-100。
本发明脂肽的核心结构肽的实例包括表1所示的肽。
表1：脂肽的肽结构
氨基酸序列   SEQ IDNO：
  (R)n，其中n＝1-20   1
  (K)n，其中n＝1-20   2
  (R)n(K)m，其中每个n和m均独立地为1-20   3
  (RH)n或(HR)n，其中n＝1-20   4&348
  [(RH)n(HR)m]，其中每个n和m均独立地为1-20   5
  (KH)n或(HK)n，其中n＝1-20   6&349
  [(KH)n(HK)m]，其中每个n和m均独立地为1-20   7
  H(K)nH，其中n＝1-20   8
  H(R)nH，其中n＝1-20   9
  (H)8(R)8   10
  (H)4(R)8   11
  (H)4(R)4(K)4   12
  (H)8(R)8(H)8(K)   13
  (H)4(R)5(H)3(K)3   14
  HHHHHKHHHKKKHKHKKK   15
  KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   16
  KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   17
  AQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   18
  KRSRKESYSVYVYKVLKQ   19
  ESYSVYVYKVLKQ   20
  YKVLKQ   21
  RVIRWFQNKRSKDKK   22
  GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV   23
  RQIKIWFQNRRMKWKK   24
  RQIKIWFQNRRMKWKK(均为D-氨基酸)   25
  GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL   26
  LLNQLAGRMIPKWSQKSKRKV   27
  TLDHVLDHVQTWSQKSKRKV   28
  SYFILRRRRKRFPYFFTDVRVAA   29
  RRRRRRRRRR   30
  RRRRRRRR(均为D-氨基酸)   31
  KETWWETWWTEWSQPGRKKRRQRRRPPQ   32
  GRPRESGKKRKRKRLKP   33
  KSYSVYVYKVLKQ   34
  ESYSVYVYRVLRQ   35
  RSYSVYVYRVLRQ   36
  QKLVKYVYVSYSE   37
  ESYSVYVYKVLKQ(均为D-氨基酸)   38
  ASYSVYVYAVLAQ   39
  QKLVKYVYVSYSE(均为D-氨基酸)   40
  RRRRRRESYSVYVYKVLKQ   41
  ESYSVYVYKVLKQRRRRRR   42
  RRRRRRRQIKIWFQNRRMKWKK   43
  RQIKIWFQNRRMKWKKRRRRRR   44
  KTKIESLKEHGRRRRRR   45
  MDVNPTLLFLKVPAQNAISTTFPYTRRRRRR   46
  GLFEALLELLESLWELLLEARRRRRR   47
  LLNQLAGRMIPKRRRRRR   48
  TLDHVLDHVQTRRRRRR   49
  GLFGAIAGFIENGWEGMIDGRRRRRR   50
  KETWWETWWTERRRRRR   51
  HHHHHHHHHHRRRRRR   52
  AAVALLPAVLLALLAPRRRRRR   53
  KVLKQ   54
  KRRQRRR   55
  DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD   56
  VTVLALGALAGVGVG   57
  GALFLGWLGAAGSTMGA   58
  MGLGLHLLVLAAALQGA   59
  LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP   60
  GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL   61
  TPPKKKRKVEDPKKKK   62
  KLALKLALKALKAALKLA   63
  GLFGAIAGFIENGWEG   64
  FFGAVIGTIALGVATA   65
  FLGFLLGVGSAIASGV   66
  GVFVLGFLGFLATAGS   67
  GAAIGLAWIPYFGPAA   68
  ACTCPYCKDSEGRGSGDPGKKKQHICHIQGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFMC   69
  ACTCPNCKDGEKRSGEQGKKKHVCHIPDCGKTFRKTSLLRAHVRLHTGERPFVC   70
  ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPFVC   71
  ACSCPNCREGEGRGSNEPGKKKQHICHIEGCGKVYGKTSHLRAHLRWHTGERPFIC   72
  RCTCPNCTNEMSGLPPIVGPDERGRKQHICHIPGCERLYGKASHLKTHLRWHTGERPFLC   73
  TCDCPNCQEAERLGPAGVHLRKKNIHSCHIPGCGKVYGKTSHLKAHLRWHTGERPFVC   74
  RCTCPNCKAIKHGDRGSQHTHLCSVPGCGKTYKKTSHLRAHLRKHTGDRPFVC   75
  PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGNKPFAC   76
  WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR   77
  GKINLKALAALAKKIL   78
  RVIRVWFQNKRCKDKK   79
  GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ   80
  GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK   81
  KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   82
  KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   83
  RKESYSVYVYKVLKQ   84
  KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   85
  VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   86
  AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   87
  KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   88
  KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   89
  SYSVYVYKVLKQ   90
  VYVYKVLKQ   91
  KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ   92
  WWHHKKRRC   93
  WWHHKKRRCCRRKKHHWW   94
  GRKKRRQRRRPPQ   95
  KKKRKV   96
  KKKRKVKKKRKV   97
  GRKKRRC   98
  RRRPPQC   99
  CGRKKRR   100
  CRRRPPQ   101
  WKKKKC   102
  CWKKKK   103
  CRRRPPQH   104
  CRRRPPQ   105
  CKKRRRQH   106
  CRR   107
  CRRR   108
  CRRRR   109
  CRRRRR   110
  CKK   111
  CKKK   112
  CKKKK   113
  CKKKKK   114
  CRRRRWW   115
  CRRRWW   116
  CRRWW   117
  CKKWW   118
  CKKKWW   119
  CKKKKWW   120
  CWHHRRKK   121
  CRRKKHHWW   122
  CKKRRW   123
  CKKRRHW   124
  CKKRRHHW   125
  CKKRRQ   126
  KKRRQC   127
  CGRKKRR   128
  GRKKRRC   129
  CGRKKRRQ   130
  QGRKKRRC   131
  CRRH   132
  CRRRH   133
  CRRRRH   134
  CRRRRRH   135
  CKKH   136
  CKKKH   137
  CKKKKH   138
  CKKKKKH   139
  HWKKRRC   140
  CHWKKRR   141
  PPHRRRC   142
  CPPHRRR   143
  GRKKRVURRRPPQ   144
  GRKKRRVURRKKRG   145
  RRRPPQVUPPRRR   146
  RRKKRGVUGRKKRR   147
  QPPRRRVURRRPPQ   148
  WKKKKVUKKKKW   149
  KKKKWVUWKKKK   150
  HQPPRRRVURRRPPQH   151
  QPPRRRVURRRPPQ   152
  HQRRKKVUKKRRQH   153
  RRVURR   154
  RRRVURRR   155
  RRRRVURRRR   156
  RRRRRVURRRRR   157
  KKVUKK   158
  KKKVUKKK   159
  KKKKVUKKKK   160
  KKKKKVUKKKKK   161
  WWRRRRVURRRRWW   162
  WWRRRVURRRWW   163
  WWRRVURRWW   164
  WWKKVUKKWW   165
  WWKKKVUKKKWW   166
  WWKKKKVUKKKKWW   167
  KKRRHHWVUWHHRRKK   168
  WWHHKKRRVURRKKHHWW   169
  WRRKKVUKKRRW   170
  WHRRKKVUKKRRHW   171
  WHHRRKKVUKKRRHHW   172
  QRRKKVUKKRRQ   173
  KKRRQVUQRRKK   174
  RRKKRGVUGRKKRR   175
  GRKKRRVURRKKRG   176
  QRRKKRGVUGRKKRRQ   177
  QGRKKRRVURRKKRGQ   178
  HRRVURRH   179
  HRRRVURRRH   180
  HRRRRVURRRRH   181
  HRRRRRVURRRRRH   182
  HKKVUKKH   183
  HKKKVUKKKH   184
  HKKKKVUKKKKH   185
  HKKKKKVUKKKKKH   186
  HWKKRRVURRKKWH   187
  RRKKWHVUHWKKRR   188
  PPHRRRVURRRHPP   189
  RRRHPPVUPPHRRR   190
  WWHHKKRRGGRRKKHHWW   191
  WWHHKKRR   192
  YYHHKKRR   193
  RRKKHHYY   194
  YYHHKKRRCCRRKKHHYY   195
  YYHHKKRRVRRKKHHYY   196
  WWRR   197
  RRWW   198
  CWRRRWC   199
  CWWRRRWWC   200
  CWRRRRWC   201
  CWRRHHRRWC   202
  CWWRRRRWWC   203
  CWWRRHHRRWWC   204
  CWRRRRRWC   205
  VQAAIDYING   206
  CWWRRRRRWWC   207
  WWRRCCRRWW   208
  WWRRVRRWW   209
  YYRR   210
  RRYY   211
  CYRRRYC   212
  CYYRRRYYC   213
  CYRRRRYC   214
  CYRRHHRRYC   215
  CYYRRRRYYC   216
  CYYRRHHRRYYC   217
  CYRRRRRYC   218
  CYYRRRRRYYC   219
  CYYRRRRYYC   220
  YYRRCCRRYY   221
  YYRRVRRYY   222
  WWRRHH   223
  HHRRWW   224
  WWRRHHCCHHRRWW   225
  WWRRHHVHHRRWW   226
  YYRRHH   227
  HHRRYY   228
  YYRRHHCCRRHHYY   229
  YYRRHHVRRHHYY   230
  WWRRR   231
  RRRWW   232
  WWRRRCCRRRWW   233
  WWRRRVRRRWW   234
  YYRRR   235
  RRRYY   236
  YYRRRCCRRRYY   237
  YYRRRVRRRYY   238
  WWRRRHH   239
  HHRRRWW   240
  WWRRRHHCCHHRRRWW   241
  WWRRRHHVHHRRRWW   242
  YYRRRHH   243
  HHRRRYY   244
  YYRRRHHCCRRRHHYY   245
  YYRRRHHVRRRHHYY   246
  WWRRRR   247
  RRRRWW   248
  WWRRRRCCRRRRWW   249
  WWRRRRVRRRRWW   250
  YYRRRR   251
  RRRRYY   252
  YYRRRRCCRRRRYY   253
  YYRRRRVRRRRYY   254
  WWRRRRHH   255
  HHRRRRWW   256
  WWRRRRHHCCHHRRRRWW   257
  WWRRRRHHVHHRRRRWW   258
  YYRRRRHH   259
  HHRRRRYY   260
  YYRRRRHHCCRRRRHHYY   261
  YYRRRRHHVRRRRHHYY   262
  WWHHKKRRWVWRRKKHHWW   263
  WWHHRRC   264
  WWHHRRVRRHHWW   265
  WWHHHRRRC   266
  CWWHHHRRRC   267
  CWWWHHHHRRR   268
  CWWWKKRRR   269
  CKKKWRRW   270
  CWRRRWRR   271
  CWWHHKKRRC   272
  WWCHHKKCRR   273
  WWHHCKKRRC   274
  CWWHHKKCRR   275
  WWHHCCKKRR   276
  RRWWKKHHC   277
  CWWHHKKKKC   278
  CWVHHRRRRC   279
  CRRRRHHC   280
  CHHKKKKC   281
  CHHRRRRC   282
  CYYRRRRHHC   283
  CYYKKKKHHC   284
  CWKnC，其中n为1-20   285
  CHWKnC，其中n为1-20   286
  AAABXaaYXaaQWLXaaXaaXaaGPXaa，其中Xaa为任意氨基酸   287
  CKnC，其中n为1-20   288
  CHKnHC，其中n为1-20   289
本发明脂肽的核心结构肽的实例包括表2所示的肽。
表2：脂肽的肽结构
氨基酸序列   SEQ IDNO：
  GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRKV   290
  GALFLAFLAAALXaaLMGLWXaaQXaaKKKRKV   291
  WSQPKKKRKV   292
  XaaWSQPKKKRKVXaa   293
  WXaaQPKKKRKXaa   294
  XaaXaaQPKKKRKV   295
  LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK   296
  LIRLWXaaHLIHIWFQXaaRRLKWKKK   297
  QNRRLKWKKK   298
  XaaQNRRLKWKKKXaa   299
  QXaaRRLKWKKK   300
其中，表2中的各个Xaa分别独立地为L、A、Q、H、E、R或K。
本发明的氨基酸残基可以为D-或L-立构中心。
可以制备非阳离子脂肽，其中，例如所述肽仅包含亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸或其组合。
可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽可以为细胞或组织特异性靶向肽。例如，所述肽可以为与细胞表面受体相互作用的配体或其片段，或选择性地与特定类型的细胞或组织细胞表面上的脂质、肽、糖和其组合相结合的肽。所述肽可以靶向一种或多种以下细胞类型：肝实质细胞、内皮细胞、神经细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞(成肌细胞或肌管)、平滑肌细胞、成纤维细胞、红细胞、T-细胞、B细胞、白细胞、造骨细胞、关节软骨细胞、成体干细胞、胚胎干细胞和癌细胞。
可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽可以为融合肽或其片段。
可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽可以为SNARE(可溶性NSF附着蛋白受体)肽或其片段。例如，所述肽可以为v-SNARE或t-SNARE。所述肽可以为NSF(N-乙基马来酰亚胺敏感性因子)或SNAP(可溶性NSF附着蛋白)。
在一些实施方式中，用结构1表示对应于式I的多种脂肽。
Figure GPA00001081461500141
结构1
其中，R1、R2、RN、J、Z、R3、R4和n的定义如上所述。
在一些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地为C14烷基、C16烷基、C18烷基或(C18:1)烯基。
在一些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地为类脂基团。
在一些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地选自可赋予足够的亲脂特性或亲脂性(例如通过水/辛醇分层定义的亲脂特性或亲脂性)的脂质样(lipid-like)尾部，从而提供穿过细胞膜的递送或被细胞摄取。在一些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地选自可赋予足够的亲脂特性或亲脂性的脂质样尾部，从而提供细胞膜锚定。在用于氨基酸脂质结构中时，这些尾部提供了两性分子。所述脂质样尾部可以源自磷脂、甘油酯、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷酯或神经节苷脂等，并且可以含有类固醇。
在某些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地为具有甘油骨架的脂质样尾部。
在一些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地为C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基、C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C13烷基、C14烷基、C15烷基、C16烷基、C17烷基、C18烷基、C19烷基、C20烷基、C21烷基或C22烷基。
在一些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地为具有以下结构之一的亲脂性尾部。
Figure GPA00001081461500151
在以上结构中，X代表以上结构I中的Z、J、N或者α-碳，并作为数字标示(例如“18:3”)中原子计数的一个原子。在一些实施方式中，X可以为碳、氮或氧原子。
在一些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地为具有以下结构之一的亲脂性尾部。
Figure GPA00001081461500161
其中，X的定义如上所述。
在一些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地选自脂质样尾部，所述脂质样尾部可以包含胆固醇、固醇或类固醇，例如甾烷、雌烷、雄烷、孕烷、胆烷、胆甾烷、麦角甾烷、campestane、poriferastane、豆甾烷、gorgostane、羊毛甾烷、环安坦烷以及这些物质的固醇或动物固醇衍生物；及其生物中间物和前体，其可以包括，例如胆固醇、羊毛甾醇、豆甾醇、二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇及其混合物和衍生物。
在某些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地衍生自脂肪酸样尾部，例如来自肉豆蔻酸(C14:0)烯基、棕榈酸(C16:0)烯基、硬脂酸(C18:0)烯基、油酸(C18:1，双键位于C9)烯基、亚油酸(C18:2，双键位于C9或C12)烯基、亚麻酸(C18:3，双键位于C9、C12或C15)烯基、花生四烯酸(C20:4，双键位于C5、C8、C11或C14)烯基和二十碳五烯酸(C20:5，双键位于C5、C8、C11、C14或C17)烯基的尾部。脂肪酸样尾部的其它实例可见于Donald Voet andJudith Voet，Biochemistry，3rd Edition(2005)，p.383中。
在一些实施方式中，各个R2、RN、R3和R4可以独立地衍生自类异戊二烯。
在一些实施方式中，R3可以为上述亲脂基团，R2、RN和R4可以为氢。
在一些实施方式中，R4可以为上述亲脂基团，R2、RN和R3可以为氢。
在一些实施方式中，R3和R4可以为上述亲脂基团，R2和RN可以为氢。
在一些实施方式中，R3、R4和R2可以为上述亲脂基团，RN可以为氢。
在一些实施方式中，R3、R4和RN可以为上述亲脂基团，R2可以为氢。
在一些实施方式中，R3和RN可以为上述亲脂基团，R2和R4可以为氢。
在一些实施方式中，RN和R4可以为上述亲脂基团，R2和R3可以为氢。
在一些实施方式中，RN和R2可以为上述亲脂基团，R3和R4可以为氢。
在一些实施方式中，R4和R2可以为上述亲脂基团，R3和RN可以为氢。
在一些实施方式中，R3和R2可以为上述亲脂基团，R4和RN可以为氢。
在一些实施方式中，亲脂基团可以与任意2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99个或100个连续氨基酸残基的α-碳相连。在一些实施方式中，亲脂基团可以与所述肽的所有其它氨基酸残基的α-碳相连。在一些实施方式中，亲脂基团可以与所述肽的任意两个连续氨基酸残基的α-碳相连，其中所述任意两个连续氨基酸残基分别与所述肽内不具有与其α-碳相连的亲脂基团的氨基酸残基相邻。
在一些实施方式中，亲脂基团可以与任意2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99个或100个连续氨基酸残基的氨基基团相连，其中所述氨基基团与所述肽的氨基酸残基的α-碳相邻。在一些实施方式中，亲脂基团可以与所述肽的所有其它氨基酸残基的氨基基团相连。在一些实施方式中，亲脂基团可以与所述肽的任意两个连续氨基酸残基的氨基基团相连，其中，所述两个连续氨基酸残基分别与所述肽内不具有与其氨基基团相连的亲脂基团的氨基酸残基相邻，所述氨基基团与所述肽内的氨基酸残基的α-碳相邻。
在一些所述方案中，与式I对应的一系列脂肽由结构2表示，其中，z为0-20(或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98(或者0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97或98)。
Figure GPA00001081461500181
结构2
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构3表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500182
结构3
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构4表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500191
结构4
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构5表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500192
结构5
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构6表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500193
结构6
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构7表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500201
结构7
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构8表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500202
结构8
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构9表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500203
结构9
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构10表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
结构10
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构11表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500212
结构11
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构12表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500213
结构12
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构13表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500221
结构13
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构14表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500222
结构14
在一些实施方式中，与式I对应的一系列脂肽由结构15表示，其中，z为0-20，各个X均独立地为任意氨基酸，R1的定义如上，n为0-98。
Figure GPA00001081461500223
结构15
本文使用的术语“氨基酸”包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。氨基酸的实例包括Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、GIy、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。因此，本发明的脂肽可以由遗传编码的氨基酸、天然存在的非遗传编码的氨基酸或合成的氨基酸制备。氨基酸的一些实例包括2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、2，3-二氨基丙二酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、2，3-二氨基丁酸、2，4-二氨基丁酸、2-氨基异丁酸、4-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，2′-二氨基庚二酸、6-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、锁链素、鸟氨酸、瓜氨酸、N-甲基异亮氨酸、正亮氨酸、叔亮氨酸、苯基甘氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸(sacrosine)、N-乙基甘氨酸、环己基甘氨酸、4-氧-环己基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、环己基丙氨酸、叔丁基丙氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸、3-氯代丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、4-卤苯基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸、4-氟苯基丙氨酸、青霉胺、2-噻吩丙氨酸、蛋氨酸、蛋氨酸亚砜、高精氨酸、降精氨酸、降-降精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、N-氨基苯基丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、6-N-甲基赖氨酸、正缬氨酸、O-烯丙基-丝氨酸、O-烯丙基-苏氨酸、α-氨基己酸、α-氨基戊酸和焦谷氨酸。
本文使用的术语“氨基酸”包括α-氨基酸和β-氨基酸。
其它氨基酸残基可见于Fasman，CRC Practical Handbook of Biochemistryand Molecular Biology，CRC Press，Inc.(1989)中。
通常，化合物可以包含一个或多个手性中心。包含一个或多个手性中心的化合物可以包括被描述为“异构体”、“立体异构体”、“非对映异构体”、“对映异构体”、“光学异构体”或“外消旋混合物”的那些化合物。本领域已知立体化学命名的惯例(例如Cahn、Ingold和Prelog的立体异构体命名规则)以及确定立体化学和分离立体异构体的方法。参见，例如Michael B.Smith and Jerry March″March’s Advanced Organic Chemistry″，5th edition，2001。本文公开的化合物和结构旨在包括可被理解为具体化合物或结构所存在的所有可能的异构体、立体异构体、非对映异构体、对映体和/或光学异构体，包括其任意混合物或外消旋物等。
本文使用的术语“亲脂基团”或“类脂基团”或“脂质样尾部”或“亲脂尾部”是指烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷基氨基、芳基、酰基、杂芳基、杂环(heterocycle)、杂环基(heterocyclyl)、烷酰氧基(alkanoyloxy)、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳酰基和芳烷基基团，同时包括它们的取代变体。
本文使用的术语“烷基”表示包含1-22个碳原子的饱和、支链或非支链、取代或非取代脂肪族基团。这个定义用于其它基团(例如烷氧基、烷酰基、芳烷基和以下定义的其它基团)的烷基部分。本文使用的术语“环烷基”指包含3-12个碳原子的饱和、取代或非取代环烷基环。本文使用的术语“烯基”指具有2-22个碳原子和至少一个碳-碳双键的不饱和、支链或非支链、取代或非取代烷基或环烷基。本文使用的术语“炔基”指具有2-22个碳原子和至少一个碳-碳三键的不饱和、支链或非支链、取代或非取代烷基或环烷基。
本文使用的术语“烷氧基”指共价结合氧原子的烷基、环烷基、烯基或炔基基团。本文使用的术语“烷酰基”指-C(＝O)-烷基，其也可被称为“酰基”。本文使用的术语“烷酰氧基”指-O-C(＝O)-烷基基团。本文使用的术语“烷基氨基”指-NRR′基团，其中各R和R′为氢或烷基，且R和R′中至少一个为烷基。烷基氨基包括诸如哌啶基的基团，其中R和R′形成环。术语“烷基氨基烷基”指-烷基-NRR′。
本文使用的术语“芳基”指每个环中具有4-12个原子的任何稳定的单环、二环或多环碳环体系，其中至少一个环为芳环。芳基的一些实例包括苯基、萘基、四氢-萘基、茚满基和联苯基。当芳基取代基为二环并且一个环为非芳环时，应理解为与芳环连接。芳基可以为取代或非取代的芳基。
本文使用的术语“杂芳基”指每个环中具有4-12个原子的任何稳定的单环、二环或多环碳环系统，其中至少一个环为芳环并包含选自氧、氮和硫的1-4个杂原子。杂芳基的一些实例包括吖啶基、喹喔啉基、吡唑基、吲哚基、苯并三唑基、呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、喹啉基、异喹啉基、噁唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基和四氢喹啉基。杂芳基包括含氮杂芳基的N-氧化物衍生物。
本文使用的术语“杂环”或“杂环基”指5-22个原子的芳环体系或非芳环体系，其中1-4个环原子为选自氧、氮和硫的杂原子。因此，杂环可以为杂芳基或其二氢或四氢形式。
本文使用的术语“芳酰基”指衍生自芳香羧酸(例如取代的苯甲酸)的芳基自由基。本文使用的术语“芳烷基”指与烷基基团连接的芳基基团，例如苯甲基基团。
本文使用的术语“羧基”表示式-C(＝O)OH或-C(＝O)O-的基团。本文使用的术语“羰基”和“酰基”表示其中的氧原子与碳原子为双键连接的基团(＞C＝O)。本文使用的术语“羟基”指-OH或-O-。本文使用的术语“腈”或“氰基”指-CN。本文使用的术语“卤素”或“卤(代)”指氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)和碘(-I)。
本文使用的术语“取代(的)”指具有一个或多个可以相同或不同的取代或取代基的原子，并且可以包括氢取代基。因此，本文使用的术语烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基和芳烷基指包括其取代变体。取代变体包括直链、支链和环状变体以及与所述基团的任意碳原子结合的一个或多个氢被一个或多个取代基取代的基团。可以与所述基团的碳原子结合的取代基包括烷基、环烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷酰基、烷酰氧基、烷基氨基、烷基氨基烷基、芳基、杂芳基、杂环、芳酰基、芳烷基、酰基、羟基、氰基、卤素、卤代烷基、氨基、氨基酰基、烷基氨基酰基、酰氧基、芳基氧基、芳基氧基烷基、巯基、硝基、氨基甲酰基(carbamyl，carbamoyl)和杂环。例如，术语乙基包括-CH2CH3、-CHFCH3、-CF2CH3、-CHFCH2F、-CHFCHF2、-CHFCF3、-CF2CH2F、-CF2CHF2、-CF2CF3和上述其它变体，但并不限于此。
本发明的基本上为碱性的肽或蛋白成分的药学上可接受的盐可以为酸加成盐，例如无机或有机酸，例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氯磺酸、三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、乙酸、丙酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、富马酸或酒石酸；以及烷烃磺酸或芳烃磺酸，例如甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、氯代苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、萘二磺酸和樟脑磺酸。
本发明的基本上为酸性的肽或蛋白成分的药学上可接受的盐可以为碱金属盐，例如钠或钾盐，或碱土金属盐，例如钙或镁盐；或者铵盐或与提供生理学上可接受的阳离子的有机碱的盐，例如与甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、缓血酸胺、N-甲基葡糖胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟乙基)胺形成的盐。参见，例如Berge et al.，J.Pharm.Sci.66：1，1971。
本发明的一些化合物、肽和/或蛋白成分可以具有一个或多个手性中心和/或几何异构中心(E-异构体和Z-异构体)，可以理解，本发明涵盖所有此类光学异构体、非对映异构体和几何异构体。
本发明涵盖了本文公开的化合物、肽和/或蛋白成分的任何以及所有互变形式、溶剂化形式或者非溶剂化形式，以及水合形式或非水合形式。
调控RNA和RNA干扰的应用
在一些方面，本发明主要涉及调控RNA和RNA干扰、反义治疗剂和递送RNA治疗剂的领域。更具体地，本发明涉及用于核糖核酸的组合物和制剂，以及其作为治疗剂用于药物和用于递送的应用。本发明主要涉及在RNA干扰中将核糖核酸用于基因特异性地抑制细胞中或哺乳动物中的基因表达，从而改变疾病状态或表型的方法。
RNA干扰是指序列特异性的转录后基因沉默方法，其由所谓小干扰RNA(siRNA)的双链RNA(dsRNA)介导。参见，Fire，et al.，Nature 391：806，1998和Hamilton，et al.，Science 286：950-951，1999。多个区系(flora)和门都具有RNAi，并且认为RNAi是用于对抗外源基因表达的在进化上保守的细胞防御机制。参见，Fire，et al.，Trends Genet.15：358，1999。
因此，RNAi是普遍存在的利用小非编码RNA使基因表达沉默的内在机制。参见，Dykxhoorn，D.M.and J.Lieberman，Annu.Rev.Biomed.Eng.8：377-402，2006。RNAi可以调控细胞死亡、分化和发育中涉及的重要基因。RNAi还可以保护基因组免于被由转座子和病毒编码的遗传元件入侵。当向细胞中引入siRNA时，其与内源的RNAi系统(RNAi machinery)结合，从而高特异性地干扰包含互补序列的mRNA的表达。RNAi可以潜在地靶向任何引起疾病的基因和任何细胞类型或组织。已经迅速将这种技术应用于基因功能分析和药物靶标的发现和确认。虽然向体内细胞中引入siRNA仍存在许多障碍，但利用RNAi具有用于治疗的巨大前景。
RNAi的机制虽然尚未被完全表征，但已知其是通过切割靶mRNA实现的。RNAi应答涉及被称为RNA-诱导的沉默复合体(RISC)的核酸内切酶复合物，该复合物介导切割与siRNA双链的反义链互补的单链RNA。靶RNA的切割发生在与siRNA双链的反义链互补的区域中(Elbashir，et al.，GenesDev.15：188，2001)。
实施RNAi的一种方法是在细胞中引入或表达siRNA。另一种方法是利用被称为dicer的内源核糖核酸酶III。Dicer的一个活性是将长dsRNA加工成siRNA。参见，Hamilton，et al.，Science 286：950-951，1999；Berstein，et al.，Nature 409：363，2001。源自dicer的siRNA全长通常为约21-23个核苷酸，其中具有约19个碱基对的双链。参见，Hamilton，et al.，supra；Elbashir，et al.，Genes Dev.15：188，2001。实际上，可以将长dsRNA作为siRNA前体引入到细胞中。
本发明提供了包含调控RNA、干扰核酸或其前体与多种组分相组合的多种组合物、制剂和方法，所述多种组分包括脂质、氨基酸脂质和天然或合成聚合物。
本文使用的术语“dsRNA”指包含至少一个核糖核苷酸分子并且能够抑制或下调基因表达的任何核酸分子，例如通过促进RNA干扰(“RNAi”)或通过序列特异性方式的基因沉默而抑制或下调基因表达。本文公开的dsRNA可以为Dicer的适当底物或者用于与RISC结合，从而通过RNAi介导基因沉默。dsRNA的一条或两条链可以进一步包含末端的磷酸基团，例如5′-磷酸或5′，3′-二磷酸。除了至少一个核糖核苷酸外，本文使用的dsRNA分子还可以进一步包含取代的、化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方式中，dsRNA分子在高达约100％的核苷酸位置包含核糖核苷酸。
dsRNA分子的实例可见于，例如美国专利申请第11/681,725号、美国专利第7,022,828和7,034,009号，以及PCT国际申请公开WO/2003/070897。
另外，本文使用的术语“dsRNA”表示与用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其它术语同义，例如，部分双链RNA(meroduplex RNA，mdRNA)、切刻dsRNA(ndsRNA)、缺口dsRNA(gdsRNA)、小干扰核酸(siNA)、siRNA、小RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰寡核苷酸、小干扰取代寡核苷酸、小干扰修饰寡核苷酸、化学修饰的dsRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。术语“大双链(ds)RNA”指长度大于约40个碱基对(bp)-约100bp或更长，尤其长达约300bp-约500bp的任何双链RNA。大dsRNA的序列可以表示为mRNA的片段或整个mRNA。双链结构可以通过自互补核酸分子或者通过两条或更多条不同的互补核酸分子链的退火而形成。
在一些方面，dsRNA包含两个分离的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含第一链(反义)和第二链(正义)，其中，所述反义链和正义链是自互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且所述两条分离的链形成双链或双链结构，例如，其中所述双链区域为约15-约24个碱基对或约26-约40个碱基对)；所述反义链包含与靶核酸分子(例如，人mRNA)或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述正义链包含与靶核酸序列或其部分对应(即同源)的核苷酸序列(例如，与靶核酸序列或其部分对应的约15-约25个核苷酸或约26-约40个核苷酸的正义链)。
在一些方面，dsRNA可以由单个核苷酸装配而成，其中，通过基于核酸的连接子或非基于核酸的连接子将dsRNA的自互补的正义链和反义链连接在一起。在一些实施方式中，通过本文所述且本领域已知的核苷酸或非核苷酸连接子共价连接dsRNA分子的第一(反义)和第二(正义)链。在一些实施方式中，通过本领域已知的核苷酸或非核苷酸连接子将第一dsRNA分子与至少一个第二dsRNA共价连接，其中所述第一dsRNA分子可以与相同或不同，或其任意组合的多个其它dsRNA分子连接。在一些实施方式中，所连接的dsRNA可以包括与所连接的dsRNA形成meroduplex的第三链。
在一些方面，本文所述的dsRNA分子形成具有三条或更多条链的meroduplex RNA(mdRNA)，例如′A′(第一或反义)链、′S1′(第二)链和′S2′(第三)链，其中，′S1′链和′S2′链与′A′链的非重叠区域互补并与之形成碱基对(bp)(例如，mdRNA可以具有A:S1S2的形式)。S1、S2或更多条链一起主要构成′A′链的正义链。通过′S1′和′A′的退火形成的双链区域与通过′S2′和′A′链的退火形成的双链区域不同，且没有重叠。mdRNA分子为“缺口”分子，所谓“缺口”是指范围在0个核苷酸至约10个核苷酸的“缺口”。在一些实施方式中，A:S1双链通过缺口与A:S2双链分开，其中，所述缺口由位于A:S1双链和A:S2双链之间的′A′链内，且不同于一条或多条′A′、′S1′或′S2′链的3′-端的任意一个或多个未配对氨基酸的至少一个未配对核苷酸(达约10个未配对核苷酸)引起。在一些实施方式中，A:S1双链通过A:S1双链和A:S2双链之间的零个核苷酸的缺口(即切刻，其中在所述多核苷酸分子的两个核苷酸之间仅有磷酸二酯键断裂或丢失)与A:S2双链分开，其也可以被称为切刻dsRNA(ndsRNA)。例如，A:S1S2可以由具有合计共约14个碱基对至约40个碱基对的至少两个双链区域并任选具有平端的dsRNA组成，并且所述双链区域之间由约0-约10个核苷酸的缺口分隔；或者A:S1S2可以包含具有由多至10个核苷酸的缺口分隔的至少两个双链区域的dsRNA，其中，至少一个双链区域包含约5个碱基对-约13个碱基对。
本文所述的包含三条或更多条链的dsRNA分子可以被称为“meroduplex”RNA(mdRNA)。mdRNA分子的实例可见于美国临时专利申请第60/934,930号和第60/973,398号。
dsRNA或大分子的dsRNA可以包括取代或修饰，其中所述取代或修饰可以位于磷酸骨架、糖、碱基或核苷中。此类核苷取代可以包括天然的非标准核苷，例如，5-甲基尿嘧啶核苷或5-甲基胞嘧啶核苷或2-硫代胸腺嘧啶核糖核苷，并且此类骨架、糖或核苷修饰可以包括烷基或杂原子取代或添加，例如甲基、烷氧基烷基、卤素、氮或硫或其它本领域已知的其它修饰。
本文使用的术语“嘧啶”指常规的嘧啶碱基，其包括标准的嘧啶碱基尿嘧啶和胞嘧啶。此外，术语嘧啶包括天然的非标准嘧啶碱基或酸，例如5-甲基尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、假尿嘧啶、二氢尿嘧啶、乳清酸(orotate)或5-甲基胞嘧啶等，以及化学修饰碱基或可用于取代本发明核酸分子内的标准嘧啶的“通用碱基(universal bases)”。适合用于本发明的dsRNA中的嘧啶的实例包括在美国专利6,846,827中公开的那些，其通过引用并入本文。
本文使用的术语“嘌呤”指常规的嘌呤碱基，其包括标准的嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤。此外，术语嘌呤包括天然的非标准嘌呤碱基或酸，例如N2-甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷或2，6-氨基嘌呤等，以及化学修饰碱基或可用于取代本发明的核酸分子内的标准嘌呤的“通用碱基”。
在另一个实施方式中，mdRNA或dsRNA包含一个或多个具有下式的核苷酸：
Figure GPA00001081461500291
其中，X为O或CH2，Y为O，Z为CH2；R1选自由以下组成的组的基团：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、C-苯基、C-萘基、次黄嘌呤核苷、吡唑甲酰胺(azole carboxamide)、1-β-D-呋喃核糖基-4-硝基吲哚、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚、1-β-D-呋喃核糖基-6-硝基吲哚或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯，以杂环，其中所述杂环选自由以下组成的组：取代的1，3-二嗪、未取代的1，3-二嗪和未取代的7H咪唑并[4，5]1，3二嗪；并且R2、R3独立地选自由以下组成的组：H、OH、DMTO、TBDMSO、BnO、THPO、AcO、BzO、OP(NiPr2)O(CH2)2CN、OPO3H、二磷酸和三磷酸，其中R2和R3可以一起形成PhCHO2、TIPDSO2或DTBSO2。
在另一个实施方式中，mdRNA或dsRNA包含一个或多个通用结合核苷酸(universal-binding nucleotide)。通用结合核苷酸的非限制性实例包括C-苯基、C-萘基、次黄嘌呤核苷、吡唑甲酰胺、1-β-D-呋喃核糖基-4-硝基吲哚、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚、1-β-D-呋喃核糖基-6-硝基吲哚或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯。在某些方面，本发明公开的内容提供了使用通过RNAi降低靶基因表达的mdRNA或dsRNA的方法，以及包含一种或多种mdRNA或dsRNA的组合物，其中至少一种mdRNA或dsRNA在mdRNA或dsRNA的反义链的反密码子中的第一、第二或第三位包含一个或多个通用结合核苷酸，并且其中所述mdRNA或dsRNA能够特异地与靶序列(例如细胞表达的RNA)结合。在靶RNA的序列中包含一个或多个单独的核苷酸取代的情况下，包含通用结合核苷酸的mdRNA或dsRNA保留了其特异地结合靶RNA的能力，从而介导基因沉默，并且由此克服了靶标对mdRNA或dsRNA介导的基因沉默的逃逸。
以上组合物的非限制性实例包括修饰mdRNA或dsRNA分子的反义链的反密码子内酪氨酸(AUA)或苯基丙氨酸(AAA或GAA)、半胱氨酸(ACA或GCA)、组氨酸(AUG或GUG)、天冬酰胺(AUU或GUU)、异亮氨酸(UAU)和天冬氨酸(AUC或GUC)的反密码子。
例如，在某些实施方式中，可以对所述异亮氨酸反密码子UAU(AUA为其关联密码子(cognate codon))进行修饰，用通用结合核苷酸次黄嘌呤核苷(I)取代第三位的尿嘧啶核苷(U)核苷酸，从而产生反密码子UAI。次黄嘌呤核苷是能够与腺嘌呤核苷(A)、尿嘧啶核苷(U)和胞嘧啶核苷(C)进行核苷酸配对，但不能与鸟嘌呤核苷(G)进行核苷酸配对的通用结合核苷酸。这种修饰反密码子UAI提高了mdRNA或dsRNA分子的特异结合能力，并由此使mdRNA或dsRNA能够与在编码链的相应位置具有AUA、UUA和CUA中任一个的mRNA配对，并由此提高了可被mdRNA或dsRNA特异结合的可用RNA降解靶标的数量。
或者，也可以或者可选地通过取代反密码子的第三或第二位的通用结合核苷酸对所述反密码子AUA进行修饰，从而使UAI(第三位取代)或UIU(第二位取代)表示的反密码子产生能够特异结合AUA、CUA和UUA，以及AAA、ACA和AUA的mdRNA或dsRNA。
在某些方面，本文公开的mdRNA或dsRNA可以包括约1个通用结合核苷酸-约10个通用结合核苷酸。在某些方面，目前公开的mdRNA或dsRNA可以包含与靶基因序列同源的正义链和与所述正义链互补的反义链，前提是其它互补mdRNA或dsRNA双链的反义链的至少一个核苷酸被一个或多个通用结合核苷酸取代。
可以理解，无论一个或多个通用结合核苷酸的取代位置如何，mdRNA或dsRNA分子都能够与靶基因以及其一个或多个变体结合，由此促进Dicer或RISC复合体对靶基因或其变体的降解。因此，适合向细胞中引入本发明的mdRNA或dsRNA，从而介导TNF基因或其变体的靶向性转录后基因沉默。当将mdRNA或dsRNA插入到细胞中时，mdRNA或dsRNA双链随后解链，并且反义链与mRNA退火从而形成Dicer底物，或者将反义链装载在蛋白装配体上，从而形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)。
在另一个实施方式中，mdRNA或dsRNA包含一个或多个2’-糖取代。2’-糖取代的非限制性实例包括2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基、2′-O-2-甲氧基乙基，其中2’-糖取代为卤素，或者其中2’-糖取代为2′-氟，或者2’-糖取代为2′-O-烯丙基。
在另一个实施方式中，mdRNA或dsRNA包含至少1、2、3、4、5或更多个碱基对(包括6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个碱基对)，每个碱基对包含与2，6-二氨基嘌呤配对的5-甲基尿嘧啶碱基，并且其中每个碱基对的5-甲基尿嘧啶都在引导链(反义链)内，或者其中每个碱基对的5-甲基鸟嘌呤都在过客链(passenger strand)(正义链)中。
在本发明的任意一个实施方式中，RNA双链区域中包含与2，6-二氨基嘌呤配对的5-甲基尿嘧啶碱基的碱基对可以为以下：
Figure GPA00001081461500321
在该示意图中，5-甲基尿嘧啶：2，6-二氨基嘌呤碱基对具有三个氢键(虚线表示氢键)。所述碱基对可以具有1、2或3个氢键，优选所述碱基对具有1个氢键，更优选所述碱基对具有2个氢键，最优选所述碱基对具有3个氢键。
在本发明的任意一个实施方式中，RNA的双链区域包含至少一个含有以下结构的非标准碱基对：
在该示意图中，R4、R5、R6、R7和R8独立地为由1-20个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)原子组成的任意一个或多个有机基团，所述原子选自碳、氧、氮、硫、氢、硒、硅、卤素、氯、氟和溴。虚线表示在上述结构中存在或不存在的任选键。在该示意图中，在以上结构中并没有显示氢键，但氢键可在R4和R7的氢键供体和氢键受体基团之间形成，在R5的氢键供体和以上嘧啶结构的第三位的氮(氢键受体)之间形成，以及在R6与R9的氢键供体和氢键受体之间形成。在本发明的实施方式中，R4具有氢键供体基团，R7具有氢键受体基团，R5具有氢键供体基团，R6具有氢键供体基团，R9具有氢键受体基团。在本发明的另一个实施方式中，R4具有氢键受体基团，R7具有氢键供体基团，R5具有氢键供体基团，R6具有氢键供体基团，R9具有氢键受体基团。在本发明的另一个实施方式中，R4具有氢键受体基团，R7具有氢键供体基团，R5具有氢键供体基团，R6具有氢键受体基团，R9具有氢键供体基团。
本发明的任意一个实施方式中，RNA的双链区域包含至少一个含有以下结构的非标准碱基对：
在该示意图中，R4、R5、R6、R7、R8和R9独立地为由1-20个(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)原子组成的任意一个或多个有机基团，所述原子选自碳、氧、氮、硫、氢、硒、硅、卤素、氯、氟和溴。虚线表示在上述结构中存在或不存在的任选键。以上两个结构的取代基团之间的虚线表示存在氢键(在该示意图中显示三个氢键)。在另一个实施方式中，R4具有供体基团，R7具有受体基团。在另一个实施方式中，R4具有受体基团，R7具有受体基团。在另一个实施方式中，R5具有供体基团，R8具有受体基团。在另一个实施方式中，R5具有受体基团，R8具有受体基团。在另一个实施方式中，R6具有供体基团，R9具有受体基团。在另一个实施方式中，R6具有受体基团，R9具有受体基团。
本发明另一个方面公开了包含无环核苷酸单体的mdRNA或dsRNA。在优选的实施方式中，无环核苷酸单体为2’-3’-seco-核苷酸单体。优选地，所述无环核苷酸单体选自由单体E、F、G、H、I或J组成的组(参见以下)。
Figure GPA00001081461500341
无环核苷酸单体的其它实例阐述于，例如PCT专利申请PCT/US2008/64417中，其通过引用整体并入本文。
此外，本文使用的术语“RNAi”的含义等同于用于描述序列特异性RNA干扰的其它术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传学。例如，本发明的dsRNA可以用于在转录后水平或转录前水平或其组合上通过表观遗传学方式沉默基因。
在一些方面，本发明提供了包含靶向一个或多个目标转录本的一个或多个RNAi诱导剂以及一个或多个递送组分的组合物。所述递送组分的实例包括脂肽、脂质、具有结合的类脂部分或结合的天然或合成聚合物的肽，以及聚合脂类。
本发明的制剂的组合物可用于向完整哺乳动物受试者的细胞递送RNAi诱导体，例如dsRNA、siRNA、mdRNA、miRNA、shRNA或RNAi-诱导载体，还可以用于向培养的细胞递送这些试剂。
本发明还提供了向哺乳动物体内的器官和组织递送一种或多种RNAi诱导体的方法。在一些实施方式中，可以通过体内的多种运输途径引入包含RNAi诱导体和一种或多种脂肽组分的组合物，并由一个或多个器官或组织的细胞摄取，在此调控靶转录本的表达。
本发明提供了药学上可接受的核酸组合物，其具有各种脂肽、脂质或与类脂部分或天然或合成的聚合物结合的肽，其中所述聚合物可用于核酸和基因沉默RNA的治疗性递送。具体而言，本发明提供了用在体外或体内递送dsRNA的组合物和方法，其中所述dsRNA用于降低、下调或沉默靶核酸序列的翻译或基因的表达。这些组合物和方法可以用于预防和/或治疗哺乳动物疾病。
在本发明的示例性方法中，使诸如dsRNA、siRNA、mdRNA或shRNA的核糖核酸分子与脂肽接触，从而配制能够施用于细胞或受试者(例如哺乳动物)的组合物。在一些实施方式中，本发明提供了通过细胞与含核酸组合物的接触，向细胞内递送干扰RNA试剂(例如dsRNA、siRNA、mdRNA或shRNA)的方法。
在示例性实施方式中，本发明包括包含核酸分子的组合物，例如双链核糖核酸分子(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、meroduplex RNA(mdRNA)或小发夹RNA(shRNA)，其与脂肽混合或复合而形成的增强所述核酸分子的细胞内递送的组合物。在一些实施方式中，本发明的递送组合物可以包含干扰RNA试剂和一种、二种或更多种脂肽，以及一种或多种聚合脂质。
在某些实施方式中，脂肽和核酸的N/P比例为0.5-8，约1-约4，约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或约4。
本发明的组合物可以形成能够引入干扰RNA试剂的稳定颗粒。本发明的组合物和制剂可以进一步包含递送增强组分或赋形剂。
在一些实施方式中，本发明的组合物包含直径为约5nm-约400nm的稳定的RNA-脂质颗粒。在一些实施方式中，所述颗粒可具有约10nm-约300nm的均一直径。在一些实施方式中，所述颗粒可具有约50nm-约150nm的均一直径。
在本发明的示例性组合物中，干扰RNA试剂可以与脂肽混合或复合，从而形成使dsRNA的细胞内递送强于使靶细胞与裸dsRNA接触的组合物。
用于递送和施用RNA的脂质
在本发明的一些方面，利用脂肽和额外的脂质递送和施用RNA组分。更具体地，本发明的组合物可包含可以为阳离子的一种或多种脂肽以及其它阳离子脂质和非阳离子脂质。
阳离子脂质可以为单阳离子或多阳离子。非阳离子脂质包括中性脂质和在具体pH时净电荷接近零的脂质，例如两性离子脂质。非阳离子脂质还包括阴离子脂质。
在一些实施方式中，组合物可以为RNA组分与脂肽和(非脂肽)阳离子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，组合物可以为一种或多种干扰RNA试剂与一种或多种脂肽和一种或多种阳离子脂质的混合物或复合物。
阳离子脂质的实例包括N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)；1，2-双(油酰氧基)-3-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)、1，2-双(二肉豆蔻酰基氧基)-3-3-(三甲基氨基)丙烷(DMTAP)；1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)；二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)；3-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)；3β-[N′，N′-二胍基乙基-氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(BGTC)；2-(2-(3-(双(3-氨基丙基)氨基)丙基氨基)乙酰胺基)-N，N-二(十四烷基)乙酰胺(RPR209120)；其药学上可接受的盐及其混合物。
阳离子脂质的实例包括1，2-二烯酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(EPCs)，例如1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱，其药学上可接受的盐及其混合物。
多阳离子脂质的实例包括四甲基四棕榈酰基精胺(TMTPS)、四甲基四油基精胺(TMTOS)、四甲基四月桂基精胺(TMTLS)、四甲基四肉豆蔻基精胺(TMTMS)、四甲基二油基精胺(TMDOS)，其药学上可接受的盐及其混合物。
多阳离子脂质的实例包括2，5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(十八烷基)氨基)-2-氧代乙基)戊酰胺(DOGS)；2，5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(Z)-十八碳-9-二烯基氨基)-2-氧代乙基)戊酰胺(DOGS-9-en)；2，5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯基氨基)-2-氧代乙基)戊酰胺(DLinGS)；3-β-(N4-(N1，N8-二羰基苯甲氧基亚精胺)氨基甲酰基)胆固醇(GL-67)；(9Z，9’Z)-2-(2，5-双(3-氨基丙基氨基)戊酰氨基)丙烷-1，3-二基-二(十八碳-9-烯酸酯)(DOSPER)；2，3-二油基氧基N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟-乙酸酯(DOSPA)；其药学上可接受的盐及其混合物。
阳离子脂质的实例包括表3所示的那些阳离子脂质。
表3
阳离子脂质的实例
  化合物的名称  FA链   M.W.   CAS登记号#
  DS404-28BGTC  胆固醇   642.96   182056-06-0
  DOSPER  C18:1   848.34   178532-92-8
  GL-67  胆固醇   615.00   179075-30-0
  RPR209120  肉豆蔻酰基C14   695.16   433292-13-8
  DOGS  C18:0   807.37   12050-77-7
  DOGS(9-en)  C18:1   803.34
  DLinGS  C18:2   799.31
  DOTMA  C18:1   712.57   104162-48-3
阳离子脂质的实例阐述于美国专利第4,897,355号、第5,279,833号、第6,733,777号、第6,376,248号、第5,736,392号、第5,334,761号、第5,459,127号、第5,208,036号、第5,264,618号、第5,283,185号、第5,753,613号、第5,785,992号，和美国专利公布第2005/0064595号中。
在一些实施方式中，所述组合物为RNA组分与脂肽和非阳离子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，所述组合物为一种或多种RNA组分与一种或多种脂肽和一种或多种非阳离子脂质的混合物或复合物。非阳离子脂质包括中性、两性和阴离子脂质。
在一些实施方式中，组合物可以为RNA组分与阳离子脂肽和(非脂肽)非阳离子或中性脂质的混合物或复合物。
在一些实施方式中，组合物可以为一种或多种RNA组分与一种或多种阳离子脂肽、一种或多种(非脂肽)阳离子脂质和一种或多种(非脂肽)非阳离子或中性脂质的混合物或复合物。
非阳离子脂质的实例包括1，2-二月桂酰基-sn-甘油(DLG)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油(DMG)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油(DPG)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油(DSG)；1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DLPA)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DMPA)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DPPA)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DSPA)；1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DAPC)；1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-0-乙基-3-磷酸胆碱(氯化物或三氟甲磺酸盐；DPePC)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DLPG)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DMPG)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸-sn-1-甘油(铵盐；DMP-sn-1-G)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DPPG)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DSPG)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-sn-1-甘油(钠盐；DSP-sn-1-G)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐；DPPS)；1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PLinoPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(铵盐；POPG)；1-棕榈酰基-2-4o-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(P-lyso-PC)；1-硬脂酰基-2-lyso-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(S-lyso-PC)；及其混合物。
非阳离子脂质的实例包括聚合的化合物和聚合物-脂质结合物(conjugate)或聚合的脂质，例如具有分子量为300、500、1000、1500、2000、3500、5000或10,000的PEG区的PEG化脂质，包括聚乙二醇，N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DMPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DMPE-MPEG-5000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-5000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇750)-1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-750)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-5000)；胆固醇硫酸酯钠盐(SCS)；其药学上可接受的盐及其混合物。
非阳离子脂质的实例包括聚合的脂质，例如DOPE-PEG、DLPE-PEG、DDPE-PEG、DLinPE-PEG和二酰基甘油-PEG-2000、-5000或-10,000。
非阳离子脂质的实例包括聚合的脂质，例如多支链的PEG化化合物，例如DSPE-PTE020和DSPE-AM0530K。
非阳离子脂质的实例包括聚合的脂质，例如DSPE-PG8G聚甘油脂质。
非阳离子脂质的实例包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二癸酰基磷脂酰胆碱(DDPC)、二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、和1，2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPhPC)。
非阳离子脂质的实例包括胆固醇、固醇和类固醇，例如甾烷、雌烷、雄烷、孕烷、胆烷、胆甾烷、麦角甾烷、campestane、poriferastane、豆甾烷、gorgostane、羊毛甾烷、环安坦烷以及上述任意物质的固醇或动物固醇衍生物，及其生物中间物和前体，其可以包括，例如胆固醇、羊毛甾醇、豆甾醇、二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇及其混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括PEG化的胆固醇，和胆甾烷3-氧代(C1-22酰基)衍生物，例如胆甾醇乙酸酯、胆甾醇花生四烯酸酯、胆甾醇丁酸酯、胆甾醇己酸酯、胆甾醇辛酸酯、胆甾醇正癸酸酯、胆甾醇月桂酸酯、胆甾醇肉蔻酸酯、胆甾醇棕榈酸酯、胆甾醇山嵛酸酯、胆甾醇硬脂酸酯、胆甾醇神经酸酯、胆甾醇壬酸酯、胆甾醇正戊酸酯、胆甾醇油酸酯、胆甾醇反油酸酯、胆甾醇芥酸酯、胆甾醇庚酸酯、胆甾醇反亚油酸酯、胆甾醇亚油酸酯及其混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自植物固醇的化合物，所述植物固醇包括植物甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、麦角固醇、菜子甾醇、δ-7-豆甾醇、δ-7-燕麦甾醇及其混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括胆汁酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甲基-石胆酸及其混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，所述类固醇包括糖皮质激素、皮质醇、氢化可的松、皮质甾酮、Δ5-孕烯醇酮、孕酮、脱氧皮质甾酮、17-OH-孕烯醇酮、17-OH-孕酮、11-二氧皮质醇、脱氢表雄甾酮、脱氢表雄甾酮硫酸酯、雄甾烯二酮、醛甾酮、18-羟基皮质甾酮、四氢皮质醇、四氢可的松、可的松、泼尼松、6α-甲基泼尼松(6α-methylpredisone)、9α-氟-16α-羟基泼尼松龙、9α-氟-16α-甲基泼尼松龙、9α-氟皮质醇，及其混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，所述类固醇包括雄激素(adrogens)、睾丸激素、二氢睾丸激素、雄烯二醇、雄甾烯二酮、雄甾烯二酮、3α，5α-雄烷二醇(3α，5α-androstanediol)，及其混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，所述类固醇包括雌激素、雌三醇、雌激素酮、雌二醇，及其混合物和衍生物。
非阳离子脂质的实例包括衍生自光甾醇和维生素D化合物的化合物。
非阳离子脂质的实例包括表4所示的C10:0至C22:6磷酸乙醇胺的脂质。
表4
非阳离子脂质的实例
  名称   FA链   M.W.   CAS登记号#
  DDPE   C10:0   523.64   253685-27-7
  DLPE   C12:0   579.76   59752-57-7
  DSPE   C18:0   748.08   1069-79-0
  DOPE   C18:1   744.05   4004-05-1
  DLinPE   C18:2   740.01   20707-71-5
  DLenPE   C18:3   735.98   34813-40-6
  DARAPE   C20:4   788.06   5634-86-6
  DDHAPE   C22:6   836.10   123284-81-1
  名称   FA链   M.W.   CAS登记号#
  DPhPE   16:0[(CH3)4]   804.19   201036-16-0
阴离子脂质的实例包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰胆碱、血小板活化因子(PAF)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰-DL-甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇(pi(4)p、pi(4，5)p2)、心磷脂(钠盐)、溶血磷脂(lysophosphatides)、氢化磷脂、鞘脂(sphingoplipids)、神经节苷脂、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇(sphinganines)、其药学上可接受的盐及其混合物。
在某些方面，所述脂肽为不包括核酸(例如RNA)在内的递送组分的约10％-约100％(摩尔百分比)。在其它实施方式中，所述脂肽为递送组分的约20％-约80％或约30％-约70％或约40％-约60％(摩尔百分比)或约20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(摩尔百分比)。
额外的递送脂质
在本发明的一些方面，可以利用氨基酸脂质和额外的非氨基酸脂质用于递送和施用调控RNA组分、RNA拮抗剂、干扰RNA或核酸。更具体地，本发明的组合物可以包含一种或多种氨基酸脂质和非氨基酸阳离子脂质以及非氨基酸非阳离子脂质。
非氨基酸阳离子脂质可以为单阳离子的或多阳离子的。一些非氨基酸阳离子脂质包括中性脂质和在特定pH的净电荷约为零的脂质，例如两性脂质。非氨基酸非阳离子脂质还包括阴离子脂质。
在一些实施方式中，组合物为RNA组分与氨基酸脂质和非氨基酸阳离子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，组合物可以为一种或多种调控或干扰RNA试剂与一种或多种氨基酸脂质和一种或多种非氨基酸阳离子脂质的混合物或复合物。
本发明的化合物和组合物可以与多种靶向配体或试剂混合或结合，从而向生物体的细胞、组织、器官或区域递送活性试剂。靶向试剂的实例包括抗体、受体的配体、肽、蛋白、凝集素、(多)糖、半乳糖、甘露糖、环糊精、核酸、DNA、RNA、适体和多氨基酸。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)；1，2-双(油酰氧基)-3-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)、1，2-双(二肉豆蔻酰基氧基)-3-3-(三甲基铵基)丙烷(DMTAP))；1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)；二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDAB)；3-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)；3β-[N′，N′-二胍基乙基-氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(BGTC)；2-(2-(3-(双(3-氨基丙基)氨基)丙基氨基)乙酰胺基)-N，N-二(十四烷基)乙酰胺(RPR209120)；其药学上可接受的盐及其混合物。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括1，2-二烯酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(EPCs)，例如1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱，其药学上可接受的盐及其混合物。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括1，2-二硬脂酰氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1，2-二油酰氧基-N，N二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1，2-二亚油酰氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)和1，2-二亚麻酰氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。
非氨基酸多阳离子脂质的实例包括四甲基四棕榈酰基精胺(TMTPS)、四甲基四油基精胺(TMTOS)、四甲基四月桂基精胺(TMTLS)、四甲基四肉豆蔻基精胺(TMTMS)、四甲基二油基精胺(TMDOS)，其药学上可接受的盐及其混合物。
非氨基酸多阳离子脂质的实例包括2，5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(十八烷基)氨基)-2-氧代乙基)戊酰胺(DOGS)；2，5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(Z)-十八碳-9-二烯基氨基)-2-氧代乙基)戊酰胺(DOGS-9-en)；2，5-双(3-氨基丙基氨基)-N-(2-(二(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯基氨基)-2-氧代乙基)戊酰胺(DLinGS)；3-β-(N4-(N1，N8-二羰基苯甲氧基亚精胺)氨基甲酰基)胆固醇(GL-67)；(9Z，9’Z)-2-(2，5-双(3-氨基丙基氨基)戊酰氨基)丙烷-1，3-二基-二(十八碳-9-烯酸酯)(DOSPER)；2，3-二油基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟-乙酸酯(DOSPA)；其药学上可接受的盐及其混合物。
非氨基酸阳离子脂质的实例包括DS404-28BGTC(CAS 182056-06-0)、DOSPER(CAS 178532-92-8)、GL-67(179075-30-0)、RPR209120(CAS433292-13-8)、DOGS(12050-77-7)、DOGS(9-en、C18:1)、DLinGS(C18:2)和DOTMA(104162-48-3)。
非氨基酸阳离子脂质的实例阐述于美国专利第4,897,355号、第5,279,833号、第6,733,777号、第6,376,248号、第5,736,392号、第5,334,761号、第5,459,127号、第2005/0064595号、第5,208,036号、第5,264,618号、第5,279,833号、第5,283,185号、第5,753,613号和第5,785,992号。
在一些实施方式中，所述组合物为RNA组分与氨基酸脂质和非氨基酸非阳离子脂质的混合物或复合物。在一些实施方式中，所述组合物可以为一种或多种RNA组分与一种或多种氨基酸脂质和一种或多种非氨基酸非阳离子脂质的混合物或复合物。
非氨基酸非阳离子脂质包括中性、两性和阴离子脂质。因此，非阳离子两性脂质可以包含阳离子头部基团(cationic head group)。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括1，2-二月桂酰基-sn-甘油(DLG)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油(DMG)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油(DPG)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油(DSG)；1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DLPA)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DMPA)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DPPA)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(钠盐；DSPA)；1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DAPC)；1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-0-乙基-3-磷酸胆碱(氯化物或三氟甲磺酸盐；DPePC)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)；1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)；1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DLPG)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DMPG)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸-sn-1-甘油(铵盐；DMP-sn-1-G)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DPPG)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；DSPG)；1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸-sn-1-甘油(钠盐；DSP-sn-1-G)；1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐；DPPS)；1-棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PLinoPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(钠盐；POPG)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油(铵盐；POPG)；1-棕榈酰基-2-4o-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(P-lyso-PC)；1-硬脂酰基-2-lyso-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(S-lyso-PC)；及其混合物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合的化合物和聚合物-脂质结合物或聚合的脂质，例如具有分子量为300、500、1000、1500、2000、3500或5000的PEG区的PEG化脂质，包括聚乙二醇，N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DMPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-5000)-1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DMPE-MPEG-5000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DPPE-MPEG-5000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇750)-1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-750)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-2000)；N-(羰基-甲氧基聚乙二醇5000)-1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(钠盐；DSPE-MPEG-5000)；胆固醇硫酸酯钠盐(SCS)；其药学上可接受的盐及其混合物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合的脂质，例如DOPE-PEG、DLPE-PEG、DDPE-PEG、DLinPE-PEG和二酰基甘油-PEG-2000或-5000。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合的脂质，例如多支链PEG化化合物，例如DSPE-PTE020和DSPE-AM0530K。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括聚合的脂质，例如DSPE-PG8G聚甘油脂质。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(DPhPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)和1，2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPhPC)。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括胆固醇、固醇和类固醇，例如甾烷、雌烷、雄烷、孕烷、胆烷、胆甾烷、麦角甾烷、campestane、poriferastane、豆甾烷、gorgostane、羊毛甾烷、环安坦烷以及上述任意物质的固醇或动物固醇衍生物，及其生物中间物和前体，其可以包括，例如胆固醇、羊毛甾醇、豆甾醇、二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇及其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括PEG化的胆固醇，和胆甾烷3-氧代(C1-22酰基)衍生物，例如胆甾醇乙酸酯、胆甾醇花生四烯酸酯、胆甾醇丁酸酯、胆甾醇己酸酯、胆甾醇辛酸酯、胆甾醇正癸酸酯、胆甾醇月桂酸酯、胆甾醇肉蔻酸酯、胆甾醇棕榈酸酯、胆甾醇山嵛酸酯、胆甾醇硬脂酸酯、胆甾醇神经酸酯、胆甾醇壬酸酯、胆甾醇正戊酸酯、胆甾醇油酸酯、胆甾醇反油酸酯、胆甾醇芥酸酯、胆甾醇庚酸酯、胆甾醇反亚油酸酯、胆甾醇亚油酸酯及其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自植物固醇的化合物，所述植物固醇包括植物甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇、麦角固醇、菜子甾醇、δ-7-豆甾醇、δ-7-燕麦甾醇及其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括胆汁酸、胆酸、鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸、石胆酸、甲基-石胆酸及其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，所述类固醇包括糖皮质激素、皮质醇、氢化可的松、皮质甾酮、Δ5-孕烯醇酮、孕酮、脱氧皮质甾酮、17-OH-孕烯醇酮、17-OH-孕酮、11-二氧皮质醇、脱氢表雄甾酮、脱氢表雄甾酮硫酸酯、雄甾烯二酮、醛甾酮、18-羟基皮质甾酮、四氢皮质醇、四氢可的松、可的松、泼尼松、6α-甲基泼尼松、9α-氟-16α-羟基泼尼松龙、9α-氟-16α-甲基泼尼松龙、9α-氟皮质醇及其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，所述类固醇包括雄激素、睾丸激素、二氢睾丸激素、雄烯二醇、雄甾烯二酮、雄甾烯二酮、3α，5α-雄烷二醇及其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自类固醇的化合物，所述类固醇包括雌激素、雌三醇、雌激素酮、雌二醇，及其混合物和衍生物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括衍生自光甾醇和维生素D化合物的化合物。
非氨基酸非阳离子脂质的实例包括具有C10:0至C22:6尾部的脂质，例如DDPE(C10:0)(CAS 253685-27-7)、DLPE(C12:0)(CAS 59752-57-7)、DSPE(C18:0)(CAS 1069-79-0)、DOPE(C18:1)(CAS 4004-05-1)、DLinPE(C18:2)(CAS 20707-71-5)、DLenPE(C18:3)(CAS 34813-40-6)、DARAPE(C20:4)(CAS5634-86-6)、DDHAPE(C22:6)(CAS 123284-81-1)、DPhPE(16:0[(CH3)4])(CAS201036-16-0)。
非氨基酸阴离子脂质的实例包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰胆碱、血小板活化因子(PAF)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰-DL-甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇(pi(4)p、pi(4，5)p2)、心磷脂(钠盐)、溶血磷脂、氢化磷脂、鞘脂、神经节苷脂、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇、其药学上可接受的盐及其混合物。
施用的组合物和制剂
本发明的所述核酸组合物和制剂可以通过各种途径施用，例如通过静脉、肠胃外或腹膜内途径从而实现系统递送。在一些实施方式中，可以在细胞内递送siRNA，例如在诸如肺或肝脏的目标组织的细胞中或者发炎的组织中。本发明公开的内容包括通过取出受试者的细胞、将siRNA试剂递送至所取出的细胞中并将所述细胞重新引入到受试者中，从而递送siRNA试剂的组合物和方法。在一些实施方式中，本发明提供了体内递送siRNA的方法。可以通过静脉内、皮下或腹膜内向受试者施用核酸组合物。在一些实施方式中，本发明提供了向哺乳动物受试者的肺体内递送干扰RNA的方法。
在一些实施方式中，本发明提供了治疗哺乳动物受试者的疾病或病症的方法。可以向患有与基因表达或过表达相关的疾病或病症的受试者施用治疗有效量的包含干扰RNA、脂肽和任选的非阳离子脂质、聚合的脂质和一种或多种递送增强组分或赋形剂的本发明组合物，其中所述组合物可以减少、降低、下调或沉默所述基因的表达或过表达。
本发明包括通过向受试者施用治疗有效量的组合物治疗肺病的方法，所述肺部例如呼吸窘迫、哮喘、囊性纤维化、肺部纤维化、慢性障碍性肺部疾病、支气管炎或肺气肿。
本发明包括治疗风湿性关节炎、肝病、脑炎、骨折、心脏病、病毒病(包括肝炎和流行性感冒)或癌症的方法。
本发明的组合物和制剂可用于向多种体外细胞递送药物试剂或生物活性试剂。体外递送所涉及的细胞的实例包括在存在或不存在各种血清等的情况下培养的上皮细胞(例如A549)、永生细胞系(例如HeLa)、肝癌细胞(例如HepG2)、大鼠胶质肉瘤细胞(例如9L/LacZ)、人单核细胞(例如THP-1)、Madin-Darby犬肾细胞(MDCk)、各种成纤维细胞系和原代细胞等。
本发明的组合物和制剂可用于向多种体内细胞、组织或器官递送药物试剂或生物活性试剂。体内递送试剂的形式包括局部、肠和肠胃外途径。体内递送试剂的形式包括吸入颗粒或小滴，递送鼻或鼻-咽滴剂、颗粒或助悬剂，经皮或经粘膜途径，以及通过肌内、皮下、静脉内、动脉内、心脏内、胸内、骨内、腹膜内和硬膜外途径的注射或输注。
在一些实施方式中，可以通过直接接触来自哺乳动物受试者的细胞、组织或器官而离体施用试剂。
发现利用本发明的组合物或制剂递送的药物试剂或生物活性试剂可以为任何形式，例如纯化形式，晶体形式、固体形式、纳米颗粒、浓缩形式、复合形式或结合形式。
本发明还提供了向哺乳动物体内的器官和组织递送一种或多种RNAi诱导体的方法。在一些实施方式中，可以通过多种途径引入包含RNAi诱导体、一种或多种氨基酸脂质和一种或多种额外的脂质组分的组合物，以使其在体内运输并由一个或多个器官或组织的细胞摄取，在此调控靶转录本的表达。
用于本发明的核糖核酸试剂可以靶向多种基因。适合作为靶标的人基因的实例包括TNF、PLK1、BIRC5、APOB、FLT1、VEGF家族、ERBB家族、PDGFR家族、BCR-ABL和MAPK家族等。适合用作靶标的人基因及其核酸序列的实例包括公开于以下文献中的那些：PCT/US08/55333、PCT/US08/55339、PCT/US08/55340、PCT/US08/55341、PCT/US08/55350、PCT/US08/55353、PCT/US08/55356、PCT/US08/55357、PCT/US08/55360、PCT/US08/55362、PCT/US08/55365、PCT/US08/55366、PCT/US08/55369、PCT/US08/55370、PCT/US08/55371、PCT/US08/55372、PCT/US08/55373、PCT/US08/55374、PCT/US08/55375、PCT/US08/55376、PCT/US08/55377、PCT/US08/55378、PCT/US08/55380、PCT/US08/55381、PCT/US08/55382、PCT/US08/55383、PCT/US08/55385、PCT/US08/55386、PCT/US08/55505、PCT/US08/55511、PCT/US08/55515、PCT/US08/55516、PCT/US08/55519、PCT/US08/55524、PCT/US08/55526、PCT/US08/55527、PCT/US08/55532、PCT/US08/55533、PCT/US08/55542、PCT/US08/55548、PCT/US08/55550、PCT/US08/55551、PCT/US08/55554、PCT/US08/55556、PCT/US08/55560、PCT/US08/55563、PCT/US08/55597、PCT/US08/55599、PCT/US08/55601、PCT/US08/55603、PCT/US08/55604、PCT/US08/55606、PCT/US08/55608、PCT/US08/55611、PCT/US08/55612、PCT/US08/55615、PCT/US08/55618、PCT/US08/55622、PCT/US08/55625、PCT/US08/55627、PCT/US08/55631、PCT/US08/55635、PCT/US08/55644、PCT/US08/55649、PCT/US08/55651、PCT/US08/55662、PCT/US08/55672、PCT/US08/55676、PCT/US08/55678、PCT/US08/55695、PCT/US08/55697、PCT/US08/55698、PCT/US08/55701、PCT/US08/55704、PCT/US08/55708、PCT/US08/55709、PCT/US08/55711、美国专利申请第61/086,435号和美国专利申请第61/086,445号。
可以通过多种粘膜施用方式，包括通过口腔、直肠、阴道、鼻内、肺内或透皮的递送，或通过局部递送至眼睛、耳朵、皮肤或其它粘膜表面，向受试者施用本发明的组合物和方法。在本发明的一些方面，粘膜组织层包括上皮细胞层。所述上皮细胞可以为肺、气管、支气管、肺泡(alveolar)、鼻、口颊、表皮或胃肠的上皮细胞。可以利用常规的致动器，例如机械喷雾装置以及加压、电动或其它形式的致动器，施用本发明的组合物。
本发明的组合物可以以水溶液(如鼻喷雾或肺喷雾)的形式施用，并且可以通过本领域技术人员已知的多种方法分散成喷雾的形式。可以通过以滴剂、颗粒或喷雾的形式施用可以经喷雾化、气雾化或雾化的组合物，从而完成本发明组合物肺部递送。可以通过以滴剂、颗粒或喷雾的形式经鼻或支气管通路施用所述组合物，来实施肺部递送。所述组合物颗粒、喷雾或气溶胶的颗粒可以为液体或固体的形式。美国专利第4,511,069号公开了将液体作为鼻喷雾分散的优选系统。通常通过将本发明的组合物溶解在水中从而产生水溶液，并使所述溶液灭菌，从而制备此类制剂。所述制剂可以存在于多剂量容器中，例如在美国专利第4,511,069号公开的密封分散系统中。TRNAsdermalSystemic Medication，Y.W.Chien ed.，Elsevier Publishers，New York，1985；和美国专利第4,778,810号公开了其它合适的鼻喷雾递送系统。其它的气溶胶递送形式可以包括，例如压缩空气喷雾器、喷射喷雾器、超声喷雾器和压电喷雾器，其递送溶解或悬浮在制药溶剂(例如水、乙醇或其混合物)中的生物活性试剂。
本发明的鼻和肺喷雾溶液通常包含所述药物或待递送的药物，其任选地用表面活性剂(例如非离子表面活性剂，例如聚山梨醇-80)和一种或多种缓冲液配制。在本发明的一些实施方式中，鼻喷雾溶液还包括推进剂。所述鼻喷雾溶液的pH可以为约pH 6.8-7.2。所使用的制药溶剂还可以为pH 4-6的弱酸性含水缓冲液。可以加入其它组分从而增强或保持化学稳定性，其包括防腐剂、表面活性剂、分散剂或气体。
在一些实施方式中，本发明为药物产品，其包括含本发明组合物的溶液和用于肺部、粘膜或鼻内喷雾或气溶胶的致动器。
本发明的组合物的剂型可以为滴剂或乳剂形式或者气溶胶形式的液体。
本发明的组合物的剂型可以为固体，其可以在施用前在液体中复原。所述固体可以以粉末的形式施用。所述固体可以为胶囊、片剂或凝胶的形式。
为了配制本发明用于肺部递送用的组合物，所述生物活性试剂可以与多种药学上可接受的添加剂或递送增强组分，以及用于分散所述活性试剂的基料(base)或载体组合。添加剂或递送增强组分的实例包括pH控制试剂，例如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸和其混合物。其它添加剂或多种增强组分包括局部麻醉剂(例如苯甲醇)、等渗剂(isotonizing agent，例如氯化钠、甘露醇、山梨醇)、吸附抑制剂(例如吐温80)、增溶剂(例如环糊精及其衍生物)、稳定剂(例如血清白蛋白)和还原剂(例如谷胱甘肽)。当用于粘膜递送的组合物为液体时，通常参照0.9％(w/v)生理盐水溶液整体的渗透压计算，将所述制剂的渗透压调整到不会在施用位点的粘膜内诱导基本不可逆的组织损伤的数值。通常，将所述溶液的渗透压调整为约1/3-3，更通常为1/2-2，最通常为3/4-1.7的数值。
所述生物活性试剂可以分散在基料或媒介中，所述基料或媒介可以包含具有分散所述活性试剂或任何期望的添加剂的能力的亲水性化合物。所述基料可以选自多种合适的载体，包括但不限于聚羧酸或其盐的共聚物，羧酸酐(例如马来酸酐)和其它单体(例如(甲基)丙烯酸甲酯、丙烯酸等)，亲水性乙烯基聚合物(例如聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮)，纤维素衍生物(例如羟甲基纤维素、羟丙基纤维素等)，和天然聚合物(例如壳聚糖、胶原质、藻酸钠、明胶、透明质酸及其无毒金属盐)。可以选择可生物降解的聚合物作为基料或载体，例如，聚乳酸，聚(乳酸-乙醇酸)共聚物，聚羟基丁酸，聚(羟丁酸-乙醇酸)共聚物及其混合物。可选择地或者另外，可以将合成的脂肪酸酯，例如聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等用作载体。亲水性聚合物和其它载体可以单独或组合使用，并且可以通过部分结晶、离子键合和交联等增强载体的结构完整性。所述载体可以以多种形式提供，包括直接应用于鼻粘膜的流体或粘性溶液、凝胶、软膏、粉末、微球和膜。在这种情况下，使用所选择的载体可以促进生物活性试剂的吸收。
可以通过多种方法将所述生物活性试剂与基料或载体组合，并且可以通过扩散、载体的分解或与水通道的相关制剂释放活性试剂。在一些情况下，所述活性试剂分散在由合适的聚合物(例如异丁基-2-氰基丙烯酸酯)制备的微胶囊(微球)或纳米胶囊(纳米球)中(参见，例如Michael，et al.，J.PharmacyPharmacol.43：1-5，1991)，并且分散在应用于鼻粘膜的生物相容性分散介质中，从而在一段长时间内产生持续性递送和生物活性。
用于粘膜、鼻或肺递送的制剂可以包含亲水性低分子量化合物作为基料或赋形剂。此类亲水性低分子量化合物提供了通道介质(passage medium)，水溶性活性试剂(例如生理活性肽或蛋白)可以通过该通道介质扩散穿过基料至吸收所述活性试剂的身体表面。所述亲水性低分子量化合物任选地从粘膜或施用气氛(administration atmosphere)吸收水分，并溶解水溶性活性肽。所述亲水性低分子量化合物的分子量通常不高于10,000，并且优选不高于3,000。亲水性低分子量化合物的实例包括多羟基化合物，例如寡聚糖、二糖或单糖，包括蔗糖、甘露醇、乳糖、L-阿拉伯糖、D-赤藓糖、D-核糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、乳果糖、纤维二糖、龙胆二糖、甘油、聚乙二醇及其混合物。亲水性低分子量化合物的其它实例还包括N-甲基吡咯烷酮、醇(例如寡聚乙烯醇、乙醇、乙二醇、丙二醇等)及其混合物。
本发明的组合物也可以选择性地包含所需要的作为药学上可接受的载体的物质，以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、渗透压调节剂和润湿剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及其混合物。对于固体组合物，可以使用常规的药学上可接受的无毒载体，其包括，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁等。
在本发明的某些实施方式中，可以在随时间释放的制剂中施用所述生物活性试剂，例如在包含缓释聚合物的组合物中。所述活性试剂可以与使其免于快速释放的载体，例如控释媒介(例如聚合物、微胶囊化递送系统或生物粘附性凝胶)一起制备。可以通过向所述组合物试剂中加入延长吸收的试剂，例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶，从而延长本发明各种组合物中活性试剂的递送。
在本发明的某些实施方式中，siNA组合物可以包含一种或多种天然或合成的表面活性剂。在人肺中发现某些天然的表面活性剂(肺部表面活性剂)，其是磷脂和蛋白的复合混合物，其在肺泡气-液界面形成单层，在呼气时，将表面张力降低至几乎为零并防止肺泡塌陷。超过90wt.％的肺部表面活性剂由磷脂构成，且约40-80％为DPPC，其余为不饱和的磷脂酰胆碱POPG、POPC和磷脂酰甘油。其余10wt.％的表面活性剂由血浆蛋白和脱辅基蛋白(例如表面蛋白(SP)-A、SP-B、SP-C和SP-D)构成。
可以用于本发明的天然表面活性剂的实例包括SURVANTATM(beractant)、CUROSURFTM(poractant alfa)和NFASURFTM(calfactant)及其混合物。
合成的表面活性剂的实例包括西那普肽(sinapultide)；二棕榈酰基磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰甘油和棕榈酸的组合；SURFAXINTM(lucinactant)；和EXOSURFTM(colfosceril)；可包含泰洛沙泊(tyloxapol)、DPPC和十六烷醇的组分；及其混合物。
可以通过本领域已知的方法制备本发明的组合物。制备脂质组合物的方法包括乙醇注射法和利用具有限定孔径的层叠聚碳酸酯膜滤器的NorthernLipids Lipex Extruder系统的挤出法。利用探针头和浴超声仪的超声法可用于产生均匀大小的脂质颗粒。可以在不加入核酸组分的情况下获得均匀且单分散的粒径。对于体外转染组合物，可以在制备转染试剂并加入其它缓冲组分使其稳定之后，加入核酸组分。对于体内递送组合物，核酸组分是制剂的一部分。
可以利用包括用缓冲液分级取代乙醇的混合过程产生窄且均匀分散的粒径分布。所述脂质组分和脂肽可以溶解在USP无水乙醇中，RNA组分可以溶解在含水缓冲液中，例如以0.9mg/mL溶解。可将两种混合物通过HPLC混合三通(mixing tee)注射到20mM、pH 7.2的柠檬酸缓冲液中。对于脂质，乙醇的初始浓度可以为90％，对于RNA组分，乙醇的初始浓度可以为0％。混合成45％的乙醇混合物后，可以立即将RNA-脂质颗粒稀释在柠檬酸缓冲液中，使乙醇的终浓度为30％。可以通过在带有2K MWCO膜的Pierce透析盒中透析过夜，从而将乙醇和柠檬酸缓冲液置换为pH 7.2的PBS。可以针对各siRNA脂质颗粒进行颗粒大小的测量和PAGE凝胶分析，从而确定是否成功捕获。由PAGE凝胶结果可以确定siRNA在多个处理步骤后是否依然完整。
可以首先将核酸组分、脂肽和任何额外组分混合在合适的介质(例如细胞培养基)中，然后向该混合物中加入一种或多种额外脂质或化合物。或者，也可以首先将脂肽一起混合在合适的介质(例如细胞培养基)中，然后加入核酸组分。
在本发明的某些实施方式中，将dsRNA与一种或多种脂肽，或者一种或多种脂肽和非阳离子脂质的组合混合。
干扰RNA试剂也可以与脂肽或聚合脂质复合或结合，并与一种或多种非阳离子脂质或一种或多种非阳离子和阳离子脂质的组合混合。
可以首先将干扰RNA试剂和脂肽在一起混合，然后加入一种或多种非阳离子脂质，或加入到合适的介质(例如细胞培养基)中的非阳离子和阳离子脂质的组合。或者，也可以首先将脂肽和脂质组分混合，然后加入含RNA试剂的合适介质。
RNA治疗剂和RNA干扰
本发明提供了通过RNA干扰调节基因表达的组合物和方法。本发明的组合物可以向能够产生RNAi应答的细胞递送核糖核酸试剂。可用于本发明的核酸试剂的实例包括双链核酸、经修饰的或耐降解的核酸、RNA、siRNA、siNA、mdRNA、shRNA、单链核酸、DNA-RNA嵌合体、反义核酸和核酶。本文使用的术语siRNA、siNA和shRNA分别包括siRNA、siNA和shRNA的前体。例如，术语siRNA包括适合作为dicer底物的RNA或双链RNA。
美国临时申请第60/934,930号以及国际公开第WO/2007/056153号中阐述了meroduplex RNA(mdRNA)。
用于本发明的核糖核酸试剂可以靶向不同的基因。例如，本发明的siRNA可以具有与TNF-α基因的区域互补的序列。在本发明的一些实施方式中，化合物和组合物可用于调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达。TNF-α可与，例如在肺部疾病中发生的炎症过程有关，并可具有抗炎效果。可以通过递送本发明的组合物来阻断TNF-α，可用于治疗或预防类风湿性关节炎的病征和/或症状。本发明提供了通过RNA干扰调节TNF-α表达与活性的组合物和方法。
可以通过向细胞递送，例如siRNA分子Inm-4，从而调节TNF-α的表达和/或活性。Inm-4是序列与小鼠TNF-α基因同源的21-nt的双链siRNA分子。Inm-4在正义链上具有3’dTdT悬端，在反义链上具有3’dAdT悬端。Inm-4的一级结构为：
(SEQ ID NO：301)正义
5’-CCGUCAGCCGAUUUGCUAUdTdT
(SEQ ID NO：302)反义
5’-AUAGCAAAUCGGCUGACGGdTdT
可以通过向细胞递送，例如siRNA分子LC20，从而调节TNF-α的表达和/或活性。LC20是与人TNF-α基因具有序列同源性的21-nt的双链siRNA分子。LC20靶向人TNF-α的3’-UTR区。LC20具有19个碱基对，在正义链上具有3’dTdT悬端，在反义链上具有3’dAdT悬端。其钠盐形式的分子量为14,298。LC20的一级结构为：
(SEQ ID NO：303)正义
(5′)GGGUCGGAACCCAAGCUUAdTdT
(SEQ ID NO：304)反义
(5′)UAAGCUUGGGUUCCGACCCdTdA
利用β-半乳糖苷受体细胞系检测各种制剂的RNAi活性。Lac-Z的结构为：
正义：CN2938.(SEQ ID NO：305)
5′-CUACACAAAUCAGCGAUUUdTdT-3′
反义：CN2939.(SEQ ID NO：306)
5′-AAAUCGCUGAUUUGUGUAGdTdC-3′
本发明的siRNA可以具有与病毒基因的区域互补的序列。例如，本发明的一些组合物和方法可用于调节流感病毒病毒基因组的表达。
在本文中，本发明提供了通过RNA干扰调节流感病毒的表达和感染活性的组合物和方法。可以通过向细胞递送，例如序列与流感病毒RNA聚合酶亚基的区域互补的小干扰RNA分子，从而调节流感病毒的表达和/或活性。例如，表5中显示了与流感病毒的RNA聚合酶亚基具有序列同源性的双链siRNA分子。
表5
靶向流感病毒的双链siRNA分子
  siRNA   亚基   序列
  G3789 PB2   (SEQ ID NO 307)CGGGACUCUAGCAUACUUAdTdT(SEQ ID NO 308)UAAGUAUGCUAGAGUCCCGdTdT
  G3807 PB2   (SEQ ID NO 309)ACUGACAGCCAGACAGCGAdTdT(SEQ ID NO 310)UCGCUGUCUGGCUGUCAGUdTdT
  G3817 PB2   (SEQ ID NO 311)AGACAGCGACCAAAAGAAUdTdT(SEQ ID NO 312)AUUCUUUUGGUCGCUGUCUdTdT
  G6124 PB1   (SEQ ID NO 313)AUGAAGAUCUGUUCCACCAdTdT(SEQ ID NO 314)UGGUGGAACAGAUCUUCAUdTdT
  G6129 PB1   (SEQ ID NO 315)GAUCUGUUCCACCAUUGAAdTdT(SEQ ID NO 316)UUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT
  G8282 PA   (SEQ ID NO 317)GCAAUUGAGGAGUGCCUGAdTdT(SEQ ID NO 318)UCAGGCACUCCUCAAUUGCdTdT
  G8286 PA   (SEQ ID NO 319)UUGAGGAGUGCCUGAUUAAdTdT(SEQ ID NO 320)UUAAUCAGGCACUCCUCAAdTdT
  G1498 NP   (SEQ ID NO 321)GGAUCUUAUUUCUUCGGAGdTdT(SEQ ID NO 322)CUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT
本发明的siRNA可以具有与流感病毒的RNA聚合酶亚基的区域互补的序列。
本发明提供了施用靶向流感病毒mRNA的siNA的组合物和方法，所述siNA可有效下调流感病毒RNA，从而降低、预防或缓解流感感染。
在一些实施方式中，本发明提供了通过向受试者施予包含有效量的RNAi诱导化合物(例如小干扰寡核苷酸分子或其前体)的组合物，从而抑制受试者中靶转录本的表达的组合物和方法。RNAi利用小干扰RNA(siRNA)靶向信使RNA(mRNA)，并消弱翻译。本发明中使用的siRNA可以为dicer加工的前体，例如被加工成siRNA的长dsRNA。本发明提供了与靶转录本的表达或由靶转录本编码的肽或蛋白的活性相关的疾病或病症的治疗或预防方法。
通过关闭病毒或微生物的生长或功能，以及通过关闭疾病通路中的内源基因产物的功能，可将基于RNAi的治疗策略用于治疗多种疾病。
在一些实施方式中，本发明提供了用于递送RNAi诱导体(例如小干扰寡核苷酸分子及其前体)的新型组合物和方法。具体而言，本发明提供了包含靶向受试者的细胞、组织和/或器官的一种或多种转录本的RNAi诱导体的组合物。
siRNA可以是具有长度为约19个核苷酸的互补区域的两条RNA链。siRNA任选地包含一个或两个单链悬端或环。
shRNA可以为具有自互补区域的单条RNA链。所述单条RNA链可以形成发夹结构，该结构具有茎、环以及任选地在RNA的5′和/或3′部分的一个或多个未配对部分。
所述活性治疗剂可以为经过化学修饰的siNA，其保持了RNAi活性，并且对体内核酸酶降解的抗性提高和/或细胞摄取提高。
本发明的siRNA试剂可以具有与靶基因的区域互补的序列。本发明的siRNA可以具有29-50个碱基对，例如，序列与靶基因的区域互补的dsRNA。或者，所述双链核酸也可以为dsDNA。
在一些实施方式中，所述活性试剂可以为能够调节基因产物表达的小干扰核酸(siNA)、小干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、小RNA或小发夹RNA(shRNA)。
本发明提供了靶向与受试者的特定疾病状况相关的一个或多个不同基因的表达的类似方法和组合物，所述基因包括已知其表达异常增加是与所选择疾病状况相关的起因或促进因素的任意多个基因。
本发明的RNAi诱导化合物可以与针对疾病状况的其它已知治疗结合施用。
在一些实施方式中，本发明公开了包含与递送增强化合物混合或复合或结合的小核酸分子(例如小干扰核酸、小干扰RNA、双链RNA、小RNA或小发夹RNA)的组合物。
本发明使用的“小干扰核酸”、“siNA”、“小干扰RNA”、“siRNA”、“小干扰核酸分子”、“小干扰寡核苷酸分子”和“经过化学修饰的小干扰核酸分子”指能够抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子，例如，通过以序列特异性的方式介导RNA干扰(RNAi)或基因沉默，从而抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。
在一些实施方式中，siNA为包含自互补正义区域和反义区域的双链多核苷酸分子，其中，所述反义区域包含与表达待下调的靶核糖核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述正义区域包含与靶核糖核酸序列或其部分对应(即，序列基本相同)的核苷酸序列。
“siNA”表示小干扰核酸，例如siRNA，其是长度短的双链核酸或其任选的较长前体。在一些实施方式中，本发明中使用的siNA的长度优选为约20-50bp。然而，对所使用的siNA(例如siRNA)的长度并没有具体限制。例如，siNA可以首先以前体形式出现在细胞中，该前体形式完全不同于在递送时或递送至靶细胞后出现并发挥基因沉默活性的siNA的最终形式或经加工形式。SiNA的前体形式可以包括，例如在递送时或递送后被加工、降解、改变或切割，从而产生在细胞内介导基因沉默的活性siNA的前体序列元素。在一些实施方式中，所使用的siNA具有例如约100-200个碱基对，或50-100个碱基对，或小于约50个碱基对的前体长度，其将在靶细胞内产生活性的经加工siNA。在其它实施方式中，所使用的siNA或siNA前体的长度约为10-49bp，或15-35bp，或约21-30bp。
在本发明的一些实施方式中，利用多核苷酸递送增强多肽促进大于常规siNA的核酸分子(包括siNA的大核酸前体)的递送。例如，可以利用本发明的方法和组合物增强代表所需siNA的“前体”的较大核酸的递送，其中所述前体氨基酸可在向靶细胞递送前、递送过程中和递送后被切割或其它加工，从而形成用于在靶细胞中调节基因表达的活性siNA。
例如，可以选择具有两个或更多个环结构和包含自互补正义区域和反义区域的茎的环状、单链寡核苷酸作为siNA前体寡核苷酸，其中，所述反义区域包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述正义链具有与靶核酸序列或其部分对应的核苷酸序列，并且其中可以在体内或体外加工所述环状多核苷酸，从而产生能够介导RNAi的活性siNA分子。
本发明的siNA分子，特别是非前体形式，可以为小于30个碱基对，或约17-19bp，或19-21bp，或21-23bp。
siRNA可以在哺乳动物系统中介导选择性基因沉默。具有短环且在茎中具有19-27个碱基对的发夹RNA也选择性地沉默与双链茎中的序列同源的基因的表达。哺乳动物细胞可以将小发夹RNA转换为介导选择性基因沉默的siRNA。
RISC介导切割序列与siRNA双链的反义链互补的单链RNA。靶RNA的切割发生在siRNA双链的反义链互补的区域内。通常，21个核苷酸的siRNA双链在包含两个核苷酸3′-悬端时活性最高。
可以用脱氧核糖核苷酸替代具有2个核苷酸的3′悬端的21-mer siRNA双链的3′-悬端部分，而不对RNAi活性产生不利影响。用脱氧核糖核苷酸取代siRNA各末端的多达4个核苷酸是可耐受的，然而用脱氧核糖核苷酸完全取代则可导致RNAi活性完全丧失。
或者，也可以将由编码单个或多个siNA并指导其在靶细胞中表达的多核苷酸载体表达的单个或多个转录产物作为siNA进行递送。在这些实施方式中，有待于在靶细胞中表达的siRNA的终转录产物的双链部分的长度可以为，例如15-49bp、15-35bp或约21-30bp。
在本发明的一些实施方式中，其中的两条链配对的siNA的双链区域可以包含凸出(bluge)部分或错配部分或两者。其中的两条链配对的siNA的双链部分并不限于完全配对的核苷酸部分，并且可由于，例如错配(对应的核苷酸不互补)、凸出(一条链上缺少对应的互补核苷酸)或悬端而包含未配对的部分。可包含未配对部分的程度以不影响siNA的形成为限。在一些实施方式中，“凸出”可以为1-2个未配对核苷酸，siNA中两条链配对的双链区域可以包含约1-7个凸出，或约1-5个凸出。此外，siNA的双链区域包含的“错配”部分的存在数量可以为约1-7个，或约1-5个。在大多数错配情况下，一个核苷酸为鸟嘌呤，另一个为尿嘧啶。这种错配可能是由于在编码正义RNA的对应DNA中，例如从C至T、从G至A的突变或其混合，但是还可能涉及其它原因。
本发明的siNA的末端结构可以为平末端或者粘性末端(悬端)，只要siNA保持其沉默靶基因表达的活性。所述粘性末端(悬端)结构并不限于3′悬端，还包括5′悬端，只要其保持了诱导基因沉默的活性。此外，悬端核苷酸的数量不限于2或3个核苷酸，而可以为任何数量的核苷酸，只要其保持诱导基因沉默的活性。例如，悬端可以包含1-8个核苷酸，或者2-4个核苷酸。
具有粘性末端(悬端)结构的siNA长度可表示为配对双链部分和各末端的任何悬端部分。例如，具有2-bp 3’反义悬端的25/27-mer siNA双链具有25-mer正义链和27-mer反义链，其中配对部分的长度为25bp。
任何悬端序列都可以具有与靶基因的低特异性，并且可以与靶基因序列不互补(反义)或不相同(正义)。只要siNA保持其基因沉默活性，其可以在悬端部分包含低分子量结构，例如天然RNA分子，例如tRNA、rRNA、病毒RNA，或人工RNA分子。
siNA的末端结构可以具有茎环结构，其中双链核酸一侧的末端通过连接子核酸(例如连接子RNA)而相连。双链区域(茎部分)的长度可以为，例如15-49bp，或15-35bp，或约21-30bp。可选择地，待表达siNA在靶细胞中的转录终产物的双链区域的长度可以为，例如约15-49bp，或15-35bp，或约21-30bp。
siNA可以包含具有与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的单链寡核苷酸，其中，所述单链寡核苷酸可以包含末端磷酸酯基团，例如5’-磷酸酯(参见，例如Martinez，et al.，Cell.110：563-574，2002，and Schwarz，et al.，Molecular Cell 10：537-568，2002)或5′，3′-二磷酸酯。
本文使用的术语siNA分子不限于仅包含天然存在的RNA或DNA的分子，还涉及经化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在一些实施方式中，本发明的小干扰核酸分子缺乏包含2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。在一些实施方式中，小干扰核酸不需要用于介导RNAi的具有2′-羟基基团的核苷酸，由此，本发明的小干扰核酸分子任选地不包含任何核糖核酸(例如，具有2′-OH基团的核苷酸)。然而，不需要在siNA分子中具有支持RNAi的核糖核酸的siNA分子可以具有一个或多个结合的连接子或，或者其它结合或连接的基团、部分或含有一个或多个具有2′-OH基团的核苷酸的链。siNA分子可以在至少约5、10、20、30、40或50％的核苷酸位置中包含核糖核苷酸。
本文使用的术语siNA包括能够介导序列特异性RNAi的核酸分子，例如小干扰RNA(siRNA)分子、双链RNA(dsRNA)分子、小RNA分子、小发夹RNA(shRNA)分子、小干扰寡核苷酸分子、小干扰核酸分子、小干扰修饰寡核苷酸分子、经化学修饰的siRNA分子和转录后基因沉默的RNA(ptgsRNA)分子等。
在一些实施方式中，siNA分子包含分离的正义和反义序列或区域，其中正义和反义区域通过核苷酸或非核苷酸连接子分子共价连接，或者通过离子相互作用、氢键、范德华相互作用、疏水相互作用和/或堆积相互作用而非共价连接。
“反义RNA”为具有与靶基因mRNA互补的序列的RNA链，其可以通过与靶基因mRNA结合而诱导RNAi。
“正义RNA”为具有与反义RNA互补的序列的RNA链，其与其互补反义RNA退火从而形成siRNA。
本文使用的术语“RNAi构建体”或“RNAi前体”指RNAi诱导化合物，例如小干扰RNA(siRNA)、发夹RNA和其它可以在体内切割从而形成siRNA的RNA分子。本文的RNAi前体还可以包括能够产生在细胞内形成dsRNA或发夹RNA的转录本，和/或可以在体内产生siRNA的转录本的表达载体(也被称为RNAi表达载体)。
siHybrid分子为具有与siRNA类似的功能的双链核酸。siHybrid由RNA链和DNA链组成，而不是双链RNA分子。优选地，所述RNA链为与靶mRNA结合的反义链。通过DNA与RNA链杂交产生的siHybrid具有杂交的互补部分，并且优选具有至少一个3′-悬端。
本发明中使用的siNA可以由两条分离的寡核苷酸组装而成，其中一条链为正义链，另一条链为反义链，其中反义链和正义链自互补(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，例如反义链和正义链形成双链结构，例如其中的双链区域为约19个碱基对)。所述反义链可以包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，所述正义链可以包含与靶核酸序列或其部分对应的核苷酸序列。可选择地，siNA可以由单个寡核苷酸组装而成，其中siNA的自互补正义区域和反义区域通过基于核酸或基于非核酸的连接子的方式连接。
在一些实施方式中，用于细胞内递送的siNA可以为具有双链、不对称双链、发夹或不对称发夹二级结构且具有自互补的正义区域和反义区域的寡核苷酸，其中，所述反义区域包含与分离的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，所述正义区域包含与靶核酸序列或其部分对应的核苷酸序列。
可以在siNA中进行的化学修饰的实例包括硫代磷酸酯核苷酸间连接、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖核苷酸、2′-脱氧-2′-氟核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、“无环”核苷酸、5-C-甲基核苷酸和末端甘油基和/或反向的脱氧无碱基残基的引入。
siNA的反义区域可以包含在所述反义区域3′-末端的硫代磷酸酯核苷酸间连接。所述反义区域可以包含在所述反义区域5′-末端的约1-约5个硫代磷酸酯核苷酸间连接。siNA分子的3′-末端核苷酸悬端可以包含在核酸、糖、碱基或骨架上经过化学修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述3′-末端核苷酸悬端可以包含一个或多个通用碱基核糖核苷酸。所述3′-末端核苷酸悬端可以包含一个或多个无环核苷酸。
例如，经过化学修饰的siNA可以在一条链内具有1、2、3、4、5、6、7、8或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接，或者可以在每条链内具有1-8个或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接。所述硫代磷酸酯核苷酸间连接可以存在于siNA双链的一条或两条寡核苷酸链中，例如存在于正义链、反义链或两条链中。
siNA分子可以在正义链、反义链或两条链的3′-末端、5′-末端或者3′-和5′-末端包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间连接。例如，示例性siNA分子可以在正义链、反义链或两条链的5′-末端包含1、2、3、4、5或更多个硫代磷酸酯核苷酸间连接。
在一些实施方式中，siNA分子在正义链、反义链或两条链中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘧啶硫代磷酸酯核苷酸间连接。
在一些实施方式中，siNA分子在正义链、反义链或两条链中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个嘌呤硫代磷酸酯核苷酸间连接。
siNA分子可以包括环状核酸分子，其中siNA的长度为约38-约70个核苷酸，例如约38、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸，具有约18-约23个碱基对，例如约18、19、20、21、22或23个碱基对，其中所述环状寡核苷酸形成具有约19个碱基对和2个环的哑铃型结构。
环状siNA分子可以包含两个环基序，其中siNA分子的一个或两个环部分为生物可降解的。例如，环状siNA分子的环部分可在体内转化，产生具有3′-末端悬端的双链siNA分子，例如包含约2个核苷酸的3′-末端核苷酸悬端。
siNA分子中的修饰核苷酸可以位于反义链、正义链或两者中。例如，修饰核苷酸可以具有Northern构型(例如，Northern pseudorotation cycle，参见例如Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag ed.，1984)。具有Northern构型的核苷酸的实例包括锁核酸(LNA)核苷酸(例如，2′-O，4′-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)、2′-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2′-甲基-硫代-乙基，2′-脱氧-2′-氟代核苷酸、2′-脱氧-2′-氯代核苷酸、2′-叠氮核苷酸和2′-O-甲基核苷酸。
化学修饰的核苷酸可以具有核酸酶降解耐性，同时保持介导RNAi的能力。
双链siNA的正义链可以在正义链的3′-末端、5′-末端或3′-末端和5′-末端两端具有末端帽结构，例如反向的脱氧无碱基结构。
结合物的实例包括Vargeese，et al.在2003年4月30日提交的美国申请第10/427,160号中阐述的结合物和配体，其将其包括附图在内的全文通过引用并入本文。
在本发明的一些实施方式中，结合物可以通过生物可降解的连接子与经化学修饰的siNA分子共价连接。例如，可以在经化学修饰的siNA分子的正义链、反义链或两条链的3′-末端连接结合物分子。
在一些实施方式中，在经化学修饰的siNA分子的正义链、反义链或两条链的5′-末端连接结合物分子。在一些实施方式中，在经化学修饰的siNA分子的正义链、反义链或两条链的3′-末端和5′-末端两端或任意组合连接结合物分子。
在一些实施方式中，结合物分子包含促进经化学修饰的siNA分子向生物系统(例如细胞)内递送的分子。
在一些实施方式中，与经化学修饰的siNA分子连接的结合物分子为聚乙二醇、人血清白蛋白或针对能够介导细胞摄取的细胞受体的配体。Vargeese，et al.的美国专利公布第2003/0130186和第2004/0110296号中阐述了本发明涉及的能够与经化学修饰的siNA分子结合的具体结合物分子的实例。
siNA可以包含核苷酸、非核苷酸或使siNA的正义区域与siNA的反义区域相连的混合的核苷酸/非核苷酸连接子。在一些实施方式中，所述核苷酸连接子的长度可以为3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸连接子可以为核酸适配体。本文使用的术语“适配体”或“核酸适配体”包含与靶分子特异结合的核酸分子，其中所述核酸分子包含靶分子在其天然环境下识别的序列。或者，适配体也可以为与靶分子结合的核酸分子，其中所述靶分子不与核酸天然地结合。
例如，所述适配体可用于结合蛋白的配体结合域，从而抑制天然存在的配体与所述蛋白的相互作用。参见，例如Gold，et al.，Annu.Rev.Biochem.64：763，1995；Brody and Gold，J.Biotechnol.74：5，2000；Sun，Curr.Opin.Mol.Ther.2：100，2000；Kusser，J.Biotechnol.74：27，2000；Hermann and Patel，Science 287：820，2000；以及Jayasena，Clinical Chemistry 45：1628，1999。
非核苷酸连接子可以为无碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃或其它聚合的化合物(例如聚乙二醇，例如具有2-100个乙二醇单元的聚乙二醇)。具体的实例包括在以下文献中阐述的那些：Seelaand Kaiser，Nucleic Acids Res.18：6353，1990，以及Nucleic Acids Res.15：3113，1987；Cload and Schepartz，J.Am.Chem.Soc.113：6324，1991；Richardson andSchepartz，J.Am.Chem.Soc.113：5109，1991；Ma，et al.，Nucleic Acids Res.21：2585，1993，and Biochemistry 32：1751，1993；DuRNAd，et al.，Nucleic AcidsRes.18：6353，1990；McCurdy，et al.，Nucleosides&Nucleotides 10：287，1991；Jaschke，et al.，Tetrahedron Lett.34：301-304，1993；Ono，et al.，Biochemistry30：9914，1991；Arnold，et al.，国际公布第WO/1989/02439号；Usman，et al.，国际公布第WO/1995/06731号；Dudycz，et al.，国际公布第WO/1995/11910号以及Ferentz and Verdine，J.Am.Chem.Soc.113：4000，1991。
“非核苷酸连接子”指包括糖和/或磷酸酯取代在内的能够引入到核酸链中从而取代一个或多个核苷酸单元，并可以使剩余的碱基发挥其酶活性的基团或化合物。所述基团或化合物可以为无碱基的，其在例如糖的C1位置不含通常识别的核苷酸碱基，例如腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷或胸腺嘧啶核苷。
在一些实施方式中，经修饰的siNA分子可以具有磷酸酯骨架修饰，包括一个或多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酸三酯、吗啉代、酰胺化、氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰亚胺(acetamidate)、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、formacetal、thioformacetal和/或硅烷基取代。在Hunzikerand Leumann，Nucleic Acid Analogues：Synthesis and Properties，in ModernSynthetic Methods，VCH，pp.331-417，1995和Mesmaeker，et al.，Novel BackboneReplacements for Oligonucleotides，in Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch，ACS，pp.24-39，1994中给出了寡核苷酸骨架修饰的实例。
可以通过以下方法合成可接受化学修饰的siNA分子：(a)合成siNA分子的两条互补链；和(b)在适合获得双链siNA分子的条件下使两条互补链一起退火。在一些实施方式中，通过固相寡核苷酸合成法，或通过固相随机寡核苷酸合成法而合成siNA分子的互补部分。
利用本领域已知的方法，例如在Caruthers，et al.，Methods in Enzymology211：3-19，1992；Thompson，et al.，国际公布第WO/1999/54459号；Wincott，etal.，Nucleic Acids Res.23：2677-2684，1995；Wincott，et al.，Methods Mol.Bio.74：59，1997；Brennan，et al.，Biotechnol Bioeng.61：33-45，1998；和Brennan，美国专利第6,001,311号中阐述的方法合成寡核苷酸(例如，某些经修饰的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的那部分寡核苷酸)。RNA(包括本发明的某些siNA分子)的合成遵循例如，在Usman，et al.，J.Am.Chem.Soc.109：7845，1987；Scaringe，et al.，Nucleic Acids Res.18：5433，1990；和Wincott，et al.，NucleicAcids Res.23：2677-2684，1995；Wincott，et al.，Methods Mol.Bio.74：59，1997中阐述的常规方法.
本文使用的“不对称发夹”为包含反义区域、环部分和正义区域的线性siNA分子，其中，所述环部分可以包含核苷酸或非核苷酸，所述正义区域包含的核苷酸少于反义区域，其程度使正义区域具有足够多的互补核苷酸以与反义区域进行碱基配对并形成具有环的双链。
本文使用的“不对称双链”为具有两条包含正义区域和反义区域的独立链的siNA分子，其中，所述正义区域包含的核苷酸少于所述反义区域，其程度使正义区域具有足够多的互补核苷酸以与反义区域进行碱基配对并形成双链。
本文使用的“调节基因表达”为上调或下调靶基因的表达，其可以包括上调或下调细胞内存在的mRNA水平，或mRNA翻译，或靶基因编码的蛋白或蛋白亚基的合成。
本文使用的术语“抑制”、“下调”或“降低表达”表示基因的表达，或编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或等效RNA分子的水平，或由靶基因编码的一种或多种蛋白或蛋白亚基的水平或活性被降低至低于没有本发明的核酸分子(例如siNA)时所观察的结果。
本文使用的“基因沉默”指细胞中基因表达被部分或完全抑制，并且还可以表示为“基因敲减”。可以通过本领域已知的方法确定基因沉默的程度，其中一些方法概述于国际公布第WO/1999/32619号中。
本文使用的术语“核糖核酸”和“RNA”指包含至少一个核糖核酸残基的分子。核糖核酸是在β-D-呋喃核糖的2′位具有羟基基团的核苷酸。这些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，例如部分纯化的RNA、基本纯化的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、删除、取代、修饰和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在RNA的修饰和改变的RNA。RNA的改变可以包括加入非核苷酸物质，例如在siNA的末端或中部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处加入非核苷酸物质。
RNA分子的核苷酸包括非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。可以将这些改变的RNA称为类似物。
“高度保守的序列区域”表示，靶基因中的一个或多个区域的核苷酸序列在从一代到另一代或从一个生物系统至另一个生物系统的过程中没有显著变化。
“正义区域”表示与siNA分子的反义区域互补的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的正义区域可以包含与靶核酸序列同源的核苷酸序列。
“反义区域”表示与靶核酸序列互补的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区域可以包含与siNA分子的正义区域互补的核酸序列。
“靶核酸”表示其表达或活性将被调节的任何核酸序列。靶核酸可以为DNA或RNA。
“互补”表示核酸可以通过传统的Watson-Crick或其它非传统的结合模型与另一个核酸序列形成一个或多个氢键。
本文使用的术语“生物可降解的连接子”指被设计为连接一个分子与另一个分子的生物可降解连接子的核酸或非核酸连接子分子，例如连接生物活性分子与siNA分子或siNA分子的正义链和反义链。设计其稳定性可根据特定目的(例如递送至特定组织或细胞类型)而调节的生物可降解连接子。可以通过各种方式调节基于核酸的生物可降解连接子的稳定性，例如，通过核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和经化学修饰的核苷酸的组合，所述经化学修饰的核苷酸为，例如2′-O-甲基、2′-氟、2′-氨基、2′-O-氨基、2′-C-烯丙基、2′-O-烯丙基和其它2′-修饰或碱基修饰的核苷酸。生物可降解的核酸连接子可以为二聚体、三聚体、四聚体或更长的核酸分子，例如长度约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的寡核苷酸，或者可以包含具有基于磷的键(例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键)的单个核苷酸。所述生物可降解的核酸连接子分子还可以包含核酸骨架、核酸糖或核酸碱基修饰。
与本文所述的2′-修饰核苷酸相关的“氨基”表示可以为修饰的或未修饰的2′-NH2或2′-O-NH2。Eckstein，et al.的美国专利第5,672,695号和Matulic-Adamic，et al.，的美国专利第6,248,878号中阐述了此类经修饰的基团。
例如，在Akhtar et al.，Trends Cell Bio.2：139，1992；″Delivery Strategies forAntisense Oligonucleotide Therapeutics，″e d.Akhtar，1995，Maurer et al.，Mol.Membr.Biol.16：129-140，1999；Hofland and Huang，Handb.Exp.Pharmacol.137：165-192，1999；以及Lee et al.，ACS Symp.Ser.752：184-192，2000中阐述了用于递送本发明中使用的核酸分子的辅助或补充方法。Sullivan，et al.的国际公布第WO/1994/02595号进一步阐述了用于递送酶核酸分子的常规方法。
可以在包含一种或多种附件组分，例如药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、乳化剂、缓冲液、稳定剂或防腐剂的制剂内施用核酸分子。
本文使用的术语“载体”表示药学上可接受的固体或液体填料、稀释剂或封装材料。含水脂质载体可以包含药学上可接受的添加剂，例如酸化剂、碱化剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、螯合剂、络合剂、增溶剂、湿润剂、溶剂、悬浮和/或粘性增加剂、渗透调节剂、湿润剂或其它生物相容性材料。以上种类的组分的实例见于U.S.Pharmacopeia National Formulary，1990，pp.1857-1859，以及Raymond C.Rowe，et al.，Handbook ofPharmaceutical Excipients，5th ed.，2006，和″Remington：The Science andPractice of Pharmacy，″′21st ed.，2006，editor David B.Troy。
防腐剂的实例包括苯酚、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸酯、间甲酚、硫柳汞、苯扎氯铵及其混合物。
表面活性剂的实例包括油酸、失水山梨糖醇三油酸酯、聚山梨醇酯、卵磷脂、磷脂酰胆碱、各种长链甘油二酯和磷酯及其混合物。
磷酯的实例包括磷脂酰胆碱、卵磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺及其混合物。
分散剂的实例包括乙二胺四乙酸。
气体的实例包括氮、氦、氯氟化碳(CFC)、氟烷(HFC)、二氧化碳、空气及其混合物。
在某些实施方式中，siNA和/或多肽可以封装在脂质体中，或者存在于脂质体内部或外部，或者存在于脂质体层内，或者通过离子电渗疗法施用，或者引入到其它媒介中，例如水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊、生物粘附性微球或者蛋白质的载体。参见，例如O′Hare and Normand的国际公布第WO/2000/53722号。或者，也可以通过直接注射或通过使用输注泵局部递送核酸组合物。可以利用标准的针和注射方法，或者通过无针技术，例如Conry et al.，Clin.Cancer Res.5：2330-2337，1999和Barry et al.国际公布第WO/1999/31262号中阐述的技术，进行本发明核酸分子的直接注射(皮下、肌内或皮内注射)。
可以有效地将本发明的组合物用作药物试剂。药物试剂预防、调节患者的疾病状况或其它不利状况的发生或严重性，或治疗(将一种或多种症状减轻至可检测或可计算的程度)患者的疾病状况或其它不利状况。
在一些实施方式中，本发明提供了特征在于存在或施用一种或多种多核酸的药物组合物和方法，所述一种或多种多核酸通常为与脂质组合、复合或结合的一种或多种siNA，其可以进一步与药学上可接受的载体(例如稀释剂、稳定剂或缓冲剂)一起配制。
通常，siNA靶向作为与目标疾病状态或不利病症相关的起因或促进因素的高水平表达基因。在这种情况下，siNA可有效地将基因的表达下调至预防、缓解或降低一种或多种相关疾病症状的严重度或复发的水平。或者，对于靶基因的表达不一定作为疾病或其它不利病症的结果或后果而提高的多种不同的疾病模型，下调靶基因仍然可通过降低基因表达(即，减少所选择的mRNA的水平和/或靶基因的蛋白产物)达到治疗效果。可选择地，本发明的siNA的目的可以为降低一个基因的表达，从而可以引起表达受到靶基因的产物或活性负调控的“下游”基因的上调。
本发明的siNA可以以任何形式施用，例如透皮或通过局部注射(例如，在牛皮癣斑的位置进行局部注射以治疗牛皮癣，或局部注射入患牛皮癣性关节炎或RA的患者的关节)。在更详细的实施方式中，本发明提供了施用治疗有效量的靶向TNF-αmRNA的siNA的制剂和方法，所述siNA可有效下调TNF-αRNA，并由此减轻或预防一种或多种与TNF-α相关的炎症病症。本发明提供了靶向动物受试者中与所选疾病状况相关的一个或多个不同基因的表达的类似方法和组合物，所述基因包括已知其表达异常增加是与所选择疾病状况相关的起因或促进因素的任意多个基因。
还可以配制本发明的组合物，并用作用于口服的片剂、胶囊或酏剂(elixirs)，用于直肠施用的栓剂，用于注射施用的无菌溶液、悬浮液，以及本领域已知的其它形式。
药物组合物或制剂指其形式适合施用的组合物或制剂，例如适合系统施用至细胞或患者(包括，例如人)的组合物或制剂。所述合适形式部分依赖于应用或进入途径，例如口服、透皮、经表皮或者通过注射。此形式不应抑制组合物或制剂到达靶细胞(即，预期向其递送带负电的核酸的细胞)。例如，注射至血液内的药物组合物应是可溶的。本领域已知其它因素，包括需要考虑的诸如毒性等事项。
“系统施用”表示药物的体内系统吸收或在血液中的累积，随后分布遍及全身。引起系统吸收的施用途径包括，但不限于静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌内施用。
适合与本发明的核酸分子一起配制的试剂的实例包括：P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)，其可以增强药物进入CNS(Jolliet-Riant and Tillement，Fundam.Clin.Pharmacol.13：16-26，1999)；生物可降解的聚合物，例如植入大脑内之后缓释递送的聚(DL-乙丙交酯)微球(Emerich，D.F.，et al.，CellTRNAsplant 8：47-58，1999，Alkermes，Inc.，Cambridge，Mass.)；和负载纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制备的那些，其能够递送药物穿过血脑屏障并可以改变神经摄取机制(Prog.Neuropsychopharmacol Biol.Psychiatry23：941-949，1999)。Boado，et al.，J.Pharm.Sci.87：1308-1315，1998；Tyler，et al.，FEBS Lett.421：280-284，1999；Pardridge，et al.，PNAS USA.92：5592-5596，1995；Boado，Adv.Drug Delivery Rev.15：73-107，1995；Aldrian-Herrada et al.，NucleicAcids Res.26：4910-4916，1998和Tyler，et al.，PNAS USA.96：7053-7058，1999.中阐述了用于本发明核酸分子的递送策略的其它实例。
本发明还包括所制备的用于贮存或施用的组合物，其包括含药学有效量的所需化合物的药学上可接受的载体或稀释剂。用于治疗性应用的可接受的载体或稀释剂在药学领域是熟知的，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro ed.1985)中所阐述的。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染料和芳香剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和p-羟基苯甲酸酯。此外，可以使用抗氧化剂和助悬剂。
药学有效剂量是预防、抑制病症的发生，治疗或缓解病症至某个程度的疾病状况所需要的剂量。应该施用0.01mg/kg体重/天-50mg/kg体重/天的活性核酸的量。
含水悬液包含与适合用于制备含水悬液的赋形剂混合的活性物质。此类赋形剂为助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂可以为天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七烷基乙烯氧基十六烷醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。所述含水悬液还可以包含一种或多种防腐剂，例如乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯、一种或多种着色剂、一种或多种芳香剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。
可以通过将活性组分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中而配制油性悬液。所述油性悬液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。可以加入甜味剂和芳香剂，从而提供美味的口服制剂。可以通过加入抗氧化剂(例如抗坏血酸)对这些组合物进行保存。
适合通过加入水而制备含水悬液的可分散粉末和颗粒提供了与分散剂或湿润剂、助悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性组分。还可以存在其它赋形剂，例如甜味剂、芳香剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以为水包油乳剂的形式。所述油相可以为植物油或矿物油或其混合物。合适的乳化剂可以为天然存在的胶，例如阿拉伯胶或黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如失水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。所述乳化剂还可以包含甜味剂和芳香剂。
所述药物组合物的形式可以为含水或含油的无菌注射悬液。可以利用上述提及的合适的分散剂或湿润剂和助悬剂，根据现有技术配制该悬液。所述无菌注射制剂还可以为胃肠外施用可接受的无毒稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可以应用的所述可接受的媒介和溶剂为水、Ringer′s溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常将无菌的不挥发油用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以使用包括合成的甘油单酯或甘油二酯在内的任何温和的不挥发油。此外，脂肪酸(例如油酸)也可用于注射剂的制备。
siNA还可以以栓剂的形式施用，例如用于药物的直肠施用。可以通过将所述药物与适合的非刺激性赋形剂混合来制备这些组合物，所述非刺激性赋形剂在常温下为固体，但在直肠温度下为液体，并且由此在直肠中融化从而释放药物。此类物质包括可可油和聚乙二醇。
可以通过用核酸酶抗性基团，例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H对siNA进行广泛修饰从而增强其稳定性。综述参见Usman andCedergren，TIBS 17：34，1992；Usman，et al.，Nucleic Acids Symp.Ser.31：163，1994。可以利用常规方法通过凝胶电泳纯化siNA构建体，或者可以通过高压液相色谱纯化siNA构建体并将其重悬在水中。
具有修饰(碱基、糖和/或磷酸酯修饰)的化学合成的核酸分子可以防止血清核糖核酸酶对其的降解，这可以提高其效能。参见，例如Eckstein，et al.，国际公布第WO/1992/07065号；Perrault et al.，Nature 344：565，1990；Pieken，et al.，Science 253，314，1991；Usman and Cedergren，Trends in Biochem.Sci.17：334，1992；Usman，et al.，国际公布第WO/1993/15187号；和Rossi et al.，国际公布第WO/1991/03162号；Sproat，美国专利第5,334,711号；和Gold，et al.，美国专利第6,300,074号。所有以上参考文献都阐述了可以对本文所述的核酸分子的碱基、磷酸和/或糖部分进行的各种修饰。
本领域中描述了有多种可以被引入到核酸分子并显著增强其核酸酶稳定性和功效的糖、碱基和磷酸酯修饰的实例。例如，可以通过用核酸酶抗性基团，例如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-H、核苷酸碱基修饰的修饰对寡核苷酸进行修饰，从而增强其稳定性和/或增强生物活性。综述，参见Usman and Cedergren，TIBS 17：34，1992；Usman，et al.，NucleicAcids Symp.Ser.31：163，1994；Burgin，et al.，Biochemistry 35：14090，1996。本领域已经广泛阐述了核酸分子的糖修饰。参见，Eckstein et al.，国际公布第WO/1992/07065号；Perrault，et al. Nature 344：565-568，1990；Pieken，et al.Science 253：314-317，1991；Usman and Cedergren，Trends in Biochem.Sci.17：334-339，1992；Usman et al.国际公布第WO/1993/15187号；Sproat，美国专利第5,334,711号和Beigelman，et al.，J.Biol. Chem.270：25702，1995；Beigelman，et al.，国际公布第WO/1997/26270号；Beigelman，et al.，美国专利第5,716,824号；Usman，et al.，美国专利第5,627,053号；Woolf，et al.，国际公布第WO/1998/13526号；Thompson，et al.，Karpeisky，et al.，Tetrahedron Lett.39：1131，1998；Earnshaw and Gait，Biopolymers(Nucleic Acid Sciences)48：39-55，1998；Verma and Eckstein，Annu.Rev.Biochem.67：99-134，1998；以及Burlina，et al.，Bioorg.Med.Chem.5：1999-2010，1997。这些公开文献阐述了用于确定向核酸分子内引入糖、碱基和/或磷酸酯修饰等而不改变其催化作用的的位置的一般方法和策略。根据这些教导，可以利用本文阐述的类似修饰对本发明的siNA核酸分子进行修饰，只要siNA在细胞中促进RNAi的能力没有受到明显抑制。
尽管利用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5’-碱基磷酸酯连接对寡核苷酸核苷酸间连接进行化学修饰提高其稳定性，但是过量的修饰可能引起一些毒性或使活性降低。因此，在设计核酸分子时，应当使这些核苷酸间连接的数量最小化。这些连接的浓度降低将降低毒性，并且提高这些分子的功效和特异性。
在一个实施方式中，本发明的特征在于用包含一个或多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、磷酸三酯、吗啉基、酰胺化氨基甲酸酯、羧甲基、乙酰亚胺、聚酰胺、磺酸酯、磺酰胺、氨基磺酸酯、formacetal、thioformacetal和/或硅烷基取代的磷酸酯骨架修饰的siNA分子。对于寡核苷酸骨架修饰的综述，参见Hunziker and Leumann，Nucleic Acid Analogues：Synthesis andProperties，in Modern Synthetic Methods，VCH，1995，pp.331-417，和Mesmaeker，et al.，″Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides，inCarbohydrate Modifications in Antisense Research，″ACS，1994，pp.24-39。
Akhtar，et al.，Trends Cell Bio.2：139，1992；″Delivery Strategies forAntisense Oligonucleotide Therapeutics，″ed.Akhtar，1995；Maurer，et al.，Mol.Membr.Biol.16：129-140，1999；Hofland and Huang，Handb.Exp.Pharmacol.137：165-192，1999以及Lee，et al.，ACS Symp.Ser.752：184-192，2000中阐述了递送核酸分子的方法。Beigelman，et al.，美国专利第6,395,713号和Sullivan etal.，国际公布第WO/1994/02595号中进一步阐述了递送核酸分子的一般方法。实际上，可以利用这些方法递送的任何核酸分子。可以利用本领域技术人员已知的多种方法施用核酸分子，所述方法包括但不限于通过脂质体的内封装或外封装，通过离子电渗疗法，或者通过引入到其它媒介中，例如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精(参见，例如Gonzalez，et al.，BioconjugateChem.10：1068-1074，1999；Wang，et al.，国际公布WO/2003/47518和WO/2003/46185)、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA微球(参见，例如美国专利第6,447,796号和美国专利申请公布第US 2002/130430号)、生物可降解的纳米胶囊和生物粘附性微球，或通过蛋白质的载体(O′Hare and Normand，国际公布第WO/2000/53722号)。或者通过直接注射或通过使用输注泵局部递送所述核酸/媒介组合物。可以利用标准的针和注射方法，或者通过无针技术，例如Conry et al.，Clin.Cancer Res.5：2330-2337，1999和Barry et al.国际公布第WO/1999/31262号中阐述的技术，进行本发明的核酸分子的直接注射(皮下、肌内或皮内注射)。可以将本发明的分子用作药物试剂。药物试剂预防、调节受试者中疾病状况的发生，或治疗(将症状减轻至某种程度，优选所有症状)受试者的疾病状况。
“RNA”表示包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”表示在β-D-呋喃核糖部分的2′位具有羟基基团的核苷酸。这些术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，例如部分纯化的RNA、基本纯化的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、删除、取代、修饰和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在RNA的改变RNA。此改变可以包括加入非核苷酸物质，例如在siNA的末端或中部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处加入非核苷酸物质。本发明RNA分子的核苷酸还包括非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或经过化学修饰的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称为类似物或天然存在RNA的类似物。
“帽结构”表示已引入在寡核苷酸任一末端的化学修饰(参见，例如Adamic，et al.，美国专利第5,998,203号，其通过引用并入本文)。这些末端修饰保护核酸分子免于核酸外切酶降解，并有助于细胞内的递送和/或定位。所述帽可以位于5’-末端(5’-帽)或者3’-帽(3’-帽)，或者可以位于两个末端端。在非限制性实例中，5’-帽包括但不限于，甘油基，反向的脱氧无碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃赤藓戊糖基)核苷酸，4′-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；碱基修饰的核苷酸；二硫代磷酸酯连接；呋喃苏糖-戊糖基核苷酸；无环3′，4′-seco-核苷酸；无环3，4-二羟基丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸，′-3′-反向核苷酸部分；3′-3′-反向无碱基部分；3′-2′-反向核苷酸部分；3′-2′-反向无碱基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3′-磷酸酯；3′-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或者桥接或非桥接甲基膦酸酯部分。
3′-帽的实例包括但不限于，甘油基、反向的脱氧无碱基残基(部分)；4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃赤藓戊糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸，碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟基丙基磷酸酯；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；碱基修饰的核苷酸；二硫代磷酸酯；呋喃苏糖-戊糖基核苷酸；无环3′，4′-seco-核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸，5′-5′-反向核苷酸部分；5′-5′-反向无碱基部分；5′-氨基磷酸酯；5′-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥接或非桥接5′-氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥接或非桥接的甲基膦酸酯和5′-巯基部分(更详细的信息，参见Beaucage and Lyer，Tetrahedron 49：1925，1993；其通过引用并入本文)。
术语“非核苷酸”指包括糖和/或磷酸酯取代在内的能够引入到核酸链中取代一个或多个核苷酸单元，并可以使剩余的碱基发挥其酶活性的基团或化合物。所述基团或化合物可以为无碱基的，其不含通常识别的核苷酸碱基，例如腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷或胸腺嘧啶核苷，并由此缺乏1’-位的碱基。
如本领域中的理解，本文使用的“核苷酸”包括天然碱基(标准)和本领域熟知的修饰碱基。此碱基通常位于核苷酸糖部分的1’位。核苷酸通常包含碱基、糖和磷酸酯基团。所述核苷酸的糖、磷酸酯和/或碱基部分可以是未修饰的或修饰的，(也可称为核苷酸类似物、经修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等，参见，例如Usman and McSwiggen，supra；Eckstein，et al.，国际公布第WO/1992/07065号；Usman，et al，国际公布第WO/1993/15187号；Uhlman&Peyman，见上文，所有文献都通过引用并入本文)。如Limbach，etal.，Nucleic Acids Res.22：2183，1994的综述，本领域已知经修饰的核苷酸碱基的多个实例。一些可以引入到核酸分子中的碱基修饰的非限定性实例包括，次黄嘌呤核苷，嘌呤，吡啶-4-酮，吡啶-2-酮，苯基，假尿嘧啶，2，4，6-三甲氧基苯，3-甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶核苷，萘基，氨基苯基，5-烷基胞嘧啶核苷(例如，5-甲基胞嘧啶核苷)，5-烷基尿嘧啶核苷(例如，胸腺嘧啶核糖核苷)，5-卤代尿嘧啶核苷(例如，5-溴尿嘧啶核苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿嘧啶核苷)和丙炔等(Burgin，et al.，Biochemistry 35：14090，1996；Uhlman&Peyman，见上文)。该方面的“经修饰碱基”表示在1’位的不同于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸碱基或其等价物。
“靶位点”或“靶序列”或“靶向序列”表示靶核酸(例如RNA)内的序列，该序列被“靶向”地进行反义区域内包含与靶序列互补的序列的siNA构建体介导的切割。
siNA分子可以与阳离子脂质复合，包装在脂质体内或以其它方式递送至靶细胞或组织内。可以通过注射、输注泵或支架局部施用所述核酸或核酸复合物(其被引入到或没有被引入到生物聚合物中)。在另一个实施方式中，聚乙二醇(PEG)可以与本发明的siNA化合物、多肽或两者共价连接。所连接的PEG可以为任意分子量，优选约2,000-约50,000道尔顿(Da)。
所述正义区域可以通过连接子分子(例如多核苷酸连接子或非核苷酸连接子)与所述反义区域相连。
“反向重复”表示包含正义元件和反义元件，且正义元件和反义元件的位置使其在转录所述重复时能够形成双链siRNA的核酸序列。所述反向重复可以任选地包含连接子或异源序列，例如在所述重复的两个元件之间的自切割核酶。所述反向重复元件的长度足以形成双链RNA。通常，所述反向重复的各个元件的长度为约15-约100个核苷酸，优选约20-30个碱基的核苷酸，优选长度约20-25个核苷酸，例如长度20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或连接的核酸，其中，所述核酸是合成的、天然存在的或非天然存在的，其与参照核酸具有类似的结合特性并以与参照核苷酸类似的方式被代谢。此类似物的实例包括硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)，但不限于此。
“大双链RNA”表示大小大于约40bp，例如大于100bp或更具体地大于300bp的任何双链RNA。大dsRNA的序列可以表示为mRNA的片段或整个mRNA。本文中对所述大dsRNA的最大大小没有限制。所述双链RNA可以包含经修饰的碱基，其中所述修饰可以是对磷酸酯糖骨架的修饰或者是对核苷的修饰。此修饰可以包括氮或硫杂原子，或任何本领域已知的其它修饰。
所述双链结构可以通过自互补RNA链而形成，例如在发夹或小RNA中存在的自互补RNA链而形成，或者通过两条不同的互补RNA链的退火而形成。
“重叠”表示，两个RNA片段的序列在一条链上有多个核苷酸相重叠，例如其中所述多个核苷酸(nt)数量可以为2-5个核苷酸，或者5-10个核苷酸或更多。
“一个或多个dsRNA”表示在一级序列的基础上彼此不同的dsRNA。
“靶基因或mRNA”表示任何目标基因或mRNA。实际上，此前通过遗传学或通过测序鉴定的任何基因都可以表示靶。靶基因或mRNA可以包含发育基因和调控基因以及代谢或结构基团或编码酶的基因。可以以直接或间接影响表型特性的方式在正在研究该表型的细胞中或者生物体中表达所述靶基因。靶基因可以为内源的或外源的。此细胞包括成体或胚胎动物或植物的任何细胞(包括配子)，或者任何分离的细胞，例如永生细胞系或原代细胞培养中存在的分离细胞。
本文引用的所有公布、参考文献、专利、专利公布和专利申请均分别通过引用全文并入本文。
尽管已参考某些实施方式描述了本发明，并且阐述了许多用于说明的细节，但对于本领域技术人员来说，本发明明显还包括其它实施方式，并且可以对本文中阐述的一些细节进行一定的改变而不脱离本发明。本发明包括此类其它施方式、改进和等同方式。具体地，本发明包括所示例的各种组分和实例的特征、术语或元件的任意组合。
本文在阐述本发明和权利要求书中使用的术语“a”、“an”、“the”以及类似术语应被理解为包括单数或复数。术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”(comprising，having，including和containing)应被理解为开放式术语，其表示，例如“包括但不限于”。本文引用的数值范围单独表示各个和任何落入该范围的独立数值，不论该范围内的有些数值是否被特别指出，都如同在本文中单独指出一样。例如，范围“4-12”包括但不限于数值5、5.1、5.35和大于等于4且小于等于12的任何其它所有整数、小数或有理数。本文使用的具体数值可以被理解为示例性的，而不限制本发明的范围。
应该理解本文提供的技术术语的定义包括本领域技术人员已知与这些术语相关的未引用的含义，但并不限于本发明的范围。应该理解，在其它定义与本文提供的定义冲突时，本文提供的技术术语的定义优先于本领域其它定义或者通过引用并入本文的定义。
本文给出的实例和本文给出的示例性语言仅出于说明的目的，并不限制本发明的范围。
在给出一系列实例，例如给出适合本发明的一系列化合物或分子时，对于本领域技术人员来说，所述一系列化合物或分子的混合物显然也是适合的。
实施例1
9L细胞中LacZ基因表达敲减的体外实验
9L/LacZ是稳定表达编码细菌半乳糖苷酶的LacZ基因的大鼠神经胶质瘤细胞系。可以利用LacZ基因敲减测定作为干扰RNA递送制剂的基于活性的体外试验。
针对LacZ基因敲减测定，利用RNAi制剂转染9L/LacZ细胞，并对转染后第3天收集的细胞进行β-半乳糖苷酶试验。进行其它试验以量化蛋白的浓度。
以8000细胞/孔(96孔)对9L/LacZ细胞进行铺板，并在培养基中培养过夜。在转染时的汇合度为约15-20％。转染复合物的制备如下：向OpfiMEMTM培养基中加入干扰RNA并涡旋，向另一份OptiMEMTM培养基中加入递送制剂并涡旋，最后将含干扰RNA的培养基与含递送制剂的培养基混合从而制备转染复合物。用新鲜的无血清培养基(无血清的OptiMEMTM)替换用于培养细胞的培养基，并向每孔中加入转染复合物。培养细胞5小时，然后在加入100μl完全培养基(DMEM加10％胎牛血清)后于37℃、5％CO2下培养过夜。次日(转染后24小时)，将培养基替换为新鲜的完全培养基，并将细胞在37℃、5％CO2下再培养48小时。
进行LacZ敲减时，用PBS洗涤收集的9L/LacZ细胞，用M-PERTM试剂(Pierce)裂解，并在室温下孵育15分钟。从各孔中取出裂解物，并用Micro BCA试剂盒(Pierce，Thermo Fisher Scientific)进行蛋白试验，用All-in-OneTM β-半乳糖苷酶试验试剂(Pierce)进行β-gal试验。
A549细胞中PPIB基因表达敲减的体外实验
可以利用亲环素B(PPIB)基因敲减测定作为干扰RNA递送制剂的基于活性的体外实验。在人肺泡基底上皮细胞A549中测定亲环素B(PPIB)基因表达的敲减。进行PPIB基因敲减测定时，用干扰RNA制剂转染A549细胞，在转染后24小时制备总RNA，并通过RT-PCR测定PPIB mRNA。对36B4(酸性核糖体磷酸蛋白PO)mRNA表达进行QRT-PCR，以用于标准化。
以7,500细胞/孔(96孔)对A549细胞进行铺板，并在培养基中培养过夜。在转染时的汇合度为约50％。转染复合物的制备如下：向培养基(OptiMEMTM)中加入干扰RNA并涡旋，向另一份培养基(OptiMEMTM)中加入递送制剂并涡旋，最后将含干扰RNA的培养基与含递送制剂的培养基混合，并在室温下孵育20分钟从而制备转染复合物。用新鲜的OptiMEMTM替换用于培养细胞的培养基，并向每孔中加入转染复合物。在37℃、5％CO2下培养细胞5小时，然后加入完全培养基(胎牛血清的终浓度为10％)，并培养直至转染后24小时。
进行PPIB基因敲减时，裂解细胞，并制备RNA(Invisorb RNA Cell HTS96-试剂盒/C(Invitek，Berlin)或者RNeasy 96试剂盒(Qiagen))。利用One-StepqRT-PCR试剂盒(Invitrogen)在DNA Engine Opticon2热循环仪(BioRad)上进行定量RT-PCR。
用于PPIB的引物为：
(SEQ ID NO：323)
5’-GGCTCCCAGTTCTTCATCAC-3’(正向)和
(SEQ ID NO：324)
5’-CCTTCCGCACCACCTC-3’(反向)以及
(SEQ ID NO：325)
5’-FAM-CTAGATGGCAAGCATGTGGTGTTTGG-TAMRA-3’，作为探针。
对于36B4，引物为：
(SEQ ID NO：326)
5’-TCTATCATCAACGGGTACAAACGA-3’(正向)和
(SEQ ID NO：327)
5’-CTTTTCAGCAAGTGGGAAGGTG-3’(反向)以及
(SEQ ID NO：328)
5’-FAM-CCTGGCCTTGTCTGTGGAGACGGATTA-TAMRA-3’，作为探针。
小鼠体内流感病毒滴度敲减试验
可以利用小鼠的流感病毒滴度敲减测定作为干扰RNA脂肽递送制剂功效在体内的标志。
在此试验中，通常向用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉的7-9周龄Balb/C小鼠鼻内施用50uL干扰RNA脂肽制剂或PBS(对照组)。在第-2、-1和0天连续三天进行每日给药。在最后一次给药后4小时诱导感染。
用流感病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8，H1N1亚型)诱导流感感染。进行感染时，向用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉的小鼠鼻内施用50μl用0.3％BSA/1XPBS/PS稀释的20pfu PR8。感染48小时后，收集肺并在600uL 0.3％BSA/1XPBS/PS中匀浆。将所述匀浆冻融2次以释放病毒。进行TCID50试验(半数组织培养感染剂量，Tissue-Culture Infectious Dose 50)以滴定肺匀浆中的病毒。以2x104MDCK细胞/孔接种到平底的96孔板中，24小时后，除去含血清的培养基。向一式四份的孔中加入30uL未稀释的或以10倍-107倍稀释(10倍稀释梯度)的肺匀浆。孵育1小时后，向各个孔中可入含4μg/ml胰蛋白酶的170μl感染培养基(DMEM/0.3％BSA/10mM HEPES/PS)。在37℃孵育48小时后，通过鸡血红细胞的红血球凝聚试验测定培养上清中是否存在病毒。利用Spearman and Karber公式评估病毒滴度。
siRNA浓度的SYBR TM 金试验
可以通过以下SYBRTM金试验测定制剂中dsRNA的浓度：向100ulMeOH中加入10ul dsRNA制剂，并在55℃温育5分钟。加入50ul肝素(200mg/ml)，并使溶液在55℃温育5分钟。加入790ul PBS(磷酸盐缓冲液)，并使样品在微离心仪中旋转沉淀。将90ul所述沉淀样品与10ul SYBRTM金试剂(Molecular Probes，Eugene，Oregon)一起温育。在495nm的激发光下读取Em 535nm的荧光。
实施例2
表6显示了本发明的一些双链RNA的结构。
表6双链RNA
DX3030流感病毒   (SEQ ID NO：329)正义5′-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG-3′(SEQ ID NO：330)反义5′-CAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCUU-3′
  DX2816Non-targetQneg   (SEQ ID NO：331)正义5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′(SEQ ID NO：332)反义5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3′
DX2940LacZ   (SEQ ID NO：333)正义5′-CUACACAAAUCAGCGAUUUdTdT-3′(SEQ ID NO：334)反义5′-AAAUCGCUGAUUUGUGUAGdTdC-3′
  DX2742PPIBMoCypB   (SEQ ID NO：335)正义5′-GGAAAGACUGUUCCAAAAAUU-3′(SEQ ID NO：336)反义5′-UUUUUGGAACAGUCUUUCCUU-3′
  DX 2744G1498流感病毒   (SEQ ID NO：337)正义5′-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGdTdT-3′(SEQ ID NO：338)反义5′-CUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT-3′
  DX2918Inm4TNFa经修饰的   (SEQ ID NO：339)正义5′-CCGTCAGCCGATTTGCTATTT-3′(SEQ ID NO：340)反义5′-p-AUAGCAAATCGGCTGACGGTT-3′
实施例3
本发明的活性RNA制剂的制备如下：将干扰RNA溶解在缓冲液或细胞培养基中并涡旋，将递送制剂与另一份缓冲液或细胞培养基混合并涡旋，最后将干扰RNA混合物与递送制剂混合物混合，从而制备活性RNAi转染制剂。
制备递送制剂时，可以将脂肽与其它脂质和/或赋形剂溶解在CHCl3/MeOH中，在N2下干燥，并在含5％葡萄糖的10mM HEPES(pH 7.4)中水合。可以超声或挤压、透析和/或切向流过滤所述混合物。
表7显示了本发明的示例性干扰RNA制剂。在该实施例中，提供了仅由脂肽进行干扰siRNA治疗剂的细胞内递送的制剂。脂肽的量表示为不包括活性RNA试剂的递送组分的摩尔百分数。
表7siRNA制剂
  组分   量
  siRNA   50nM
  脂肽   100摩尔％
表8显示了本发明的示例性干扰RNA制剂。在该实施例中，提供了仅由脂肽进行干扰siRNA治疗剂的细胞内递送的制剂。脂肽的量表示为不包括活性RNA试剂的递送组分的摩尔百分数。以上表中各个肽的亲脂基团的长度表示为“(CX)”，其中“X”表示亲脂基团中碳的数量。例如C20表示链长度为20个碳的亲脂基团。
表8
dsRNA制剂
  组分 量
  dsRNA   50nM
  (C16)-(H)8(R)8(H)8K-NH-(C16)(SEQ ID NO：13)   100摩尔％
表9显示了本发明的示例性RNAi制剂。在该实施例中，脂肽在共递送制剂中与非阳离子脂质组合。
表9
DX3030制剂
  组分   量
  siRNA DX3030   50nM
  (C20)-(H)8(R)8(H)8K-NH-(C20)(SEQ ID NO：13)   50摩尔％
  1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)   50摩尔％
表10显示了本发明的示例性RNAi制剂。在该实施例中，脂肽在多组分递送制剂中与阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG化的脂质组合。
表10
dsRNA制剂
  组分   量
  dsRNA   25nM
  (C20)-(H)8(R)8(H)8K-NH-(C20)(SEQ ID NO：13)   50摩尔％
  DSPC   49摩尔％
  DSPE-PEG2000   1摩尔％
表11显示了用于本发明的RNAi制剂的其它脂质的实例。
表11用于递送制剂的脂质
  物质   MW
  DOTAP Avanti 890890C   698.55
  DOPE Avanti 850725C   744.04
  DPhyPE Avanti 850402P   804.18
实施例4
表12显示了本发明的干扰RNA组合物的示例制剂的敲减活性。
表12递送制剂的敲减
N∶P比 SEQID NO： 脂肽   ％KD(vs QNeg)A549/PPIB   ％KD(vs QNeg)9L/lacZ
  2   RNAiMAXTM   73.4   82.4
  2   350   (C18)-HHHHRRRRRRR-半胱胺   15.3   -0.8
  2   351   (C18)-PEG27-HHHHHHHHRRRRRRRR-酰胺   30.6   9.2
  2   352   Ac-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRKV-半胱胺   20.5   29.1
  2   353   Ac-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKSKRKV-半胱胺   15.5   29.5
  2   296   Ac-LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-酰胺   8.7   -19.9
  2   13   (C20)-(H)8(R)8(H)8K-NH-(C20)   29.7   60.1
  2   354   (C16)-HHHHHKHHHKKKHKHKKK-半胱胺   14.7   12.0
  2   355   (C18)-HHHHHKHHHKKKHKHKKK-半胱胺   25.5   -11.3
  2   356   Ac-GALFLGFLGAAG STMGAWSQPKSKRKV-酰胺   -8.1   -0.4
  4   10   (C18)-PEG27-HHHHHHHHRRRRRRRR-酰胺   7.4   -16.1
  4   353   Ac-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKSKRKV-半胱胺   16.0   -9.3
  4   296   Ac-LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-酰胺   -28.8   -4.5
  4   13   (C20)-(H)8(R)8(H)8K-NH-(C20)   65.8   57.5
  4   354   (C16)-HHHHHKHHHKKKHKHKKK-半胱胺   -19.8   12.4
  4   355   (C18)-HHHHHKHHHKKKHKHKKK-半胱胺   21.6   -19.4
  4   356   Ac-GALFLGFLGAAG STMGAWSQPKSKRKV-酰胺   -3.7   -1.6
对于表12中的脂肽，结果显示与Qneg和媒介相比(媒介的数据没有显示)，至少两个脂肽，(C20)-(H)8(R)8(H)8K-NH-(C20)(SEQ ID NO：13)和(C18)-HHHHHKHHHKKKHKHKKK-半胱胺(SEQ ID NO：355)至少在A549/PPIB实验中显示显著敲减。
序列表
<110>MDRNA有限公司
 
<120>用于递送核酸的脂肽
 
<130>07-23PCT
 
<140>
<141>
 
<150>60/976,894
<151>2007-10-02
 
<160>356
 
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)..(20)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(20)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>1
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Arg
            20
 
<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)..(20)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(20)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>2
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Lys
            20
 
<210>3
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)..(20)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(20)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(22)..(40)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(40)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>3
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
            20                  25                  30
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
        35                  40
 
<210>4
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(40)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(40)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>4
Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His
1               5                   10                  15
Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His
            20                  25                  30
Arg His Arg His Arg His Arg His
        35                  40
 
<210>5
<211>80
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(40)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(40)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(43)..(80)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(80)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>5
Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His
1               5                   10                  15
Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His
            20                  25                  30
Arg His Arg His Arg His Arg His His Arg His Arg His Arg His Arg
        35                  40                  45
His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg
    50                  55                  60
His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg
65                  70                  75                  80
 
<210>6
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(40)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(40)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>6
Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His
1               5                   10                  15
Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His
            20                  25                  30
Lys His Lys His Lys His Lys His
        35                  40
 
<210>7
<211>80
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(40)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(40)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(43)..(80)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(43)..(80)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>7
Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His
1               5                   10                  15
Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His
            20                  25                  30
Lys His Lys His Lys His Lys His His Lys His Lys His Lys His Lys
        35                  40                  45
His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys
    50                  55                  60
His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys
65                  70                  75                  80
 
<210>8
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(21)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(21)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>8
His Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Lys Lys His
            20
 
<210>9
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(21)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(21)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>9
His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Arg Arg His
            20
 
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>10
His His His His His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
 
<210>11
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>11
His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
 
<210>12
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>12
His His His His Arg Arg Arg Arg Lys Lys Lys Lys
1               5                   10
 
<210>13
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>13
His His His His His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
His His His His His His His His Lys
            20                  25
 
<210>14
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>14
His His His His Arg Arg Arg Arg Arg His His His Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
 
<210>15
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>15
His His His His His Lys His His His Lys Lys Lys His Lys His Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys
 
<210>16
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>16
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
            20                  25                  30
Val Leu Lys Gln
        35
<210>17
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>17
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Glu Gly Lys
1               5                   10                  15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
            20                  25                  30
Val Leu Lys Gln
        35
 
<210>18
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>18
Ala Gln Lys Lys Glu Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser
1               5                   10                  15
Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
            20                  25
 
<210>19
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>19
Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu
1               5                   10                  15
Lys Gln
 
<210>20
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>20
Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1               5                   10
 
<210>21
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>21
Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1               5
 
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>22
Arg Val Ile Arg Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ser Lys Asp Lys Lys
1               5                   10                  15
 
<210>23
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>23
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1               5                   10                  15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val
            20                  25
 
<210>24
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>24
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1               5                   10                  15
 
<210>25
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)..(2)
<223>D-Gln
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)..(3)
<223>D-Ile
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)..(4)
<223>D-Lys
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(5)
<223>D-Ile
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)..(6)
<223>D-Trp
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)..(7)
<223>D-Phe
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>D-Gln
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)..(9)
<223>D-Asn
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)..(10)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(11)..(11)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(12)..(12)
<223>D-Met
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(13)..(13)
<223>D-Lys
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(14)..(14)
<223>D-Trp
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(15)..(15)
<223>D-Lys
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(16)..(16)
<223>D-Lys
 
<400>25
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1               5                   10                  15
<210>26
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>26
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Ile Asn Leu Lys
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
            20                  25
 
<210>27
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>27
Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Trp Ser Gln Lys
1               5                   10                  15
Ser Lys Arg Lys Val
            20
 
<210>28
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>28
Thr Leu Asp His Val Leu Asp His Val Gln Thr Trp Ser Gln Lys Ser
1               5                   10                  15
Lys Arg Lys Val
            20
 
<210>29
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>29
Ser Tyr Phe Ile Leu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Phe Pro Tyr Phe Phe
1               5                   10                  15
Thr Asp Val Arg Val Ala Ala
            20
 
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>30
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
 
<210>31
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)..(2)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)..(3)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)..(4)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(5)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)..(6)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)..(7)
<223>D-Arg
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>D-Arg
 
<400>31
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5
 
<210>32
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
<400>32
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Gly
1               5                   10                  15
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
            20                  25
 
<210>33
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>33
Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys
1               5                   10                  15
Pro
 
<210>34
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>34
Lys Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1               5                   10
 
<210>35
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>35
Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Arg Val Leu Arg Gln
1               5                   10
 
<210>36
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>36
Arg Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Arg Val Leu Arg Gln
1               5                   10
 
<210>37
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>37
Gln Lys Leu Val Lys Tyr Val Tyr Val Ser Tyr Ser Glu
1               5                   10
 
<210>38
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>D-Glu
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)..(2)
<223>D-Ser
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)..(3)
<223>D-Tyr
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)..(4)
<223>D-Ser
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(5)
<223>D-Val
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)..(6)
<223>D-Tyr
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)..(7)
<223>D-Val
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>D-Tyr
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)..(9)
<223>D-Lys
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)..(10)
<223>D-Val
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(11)..(11)
<223>D-Leu
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(12)..(12)
<223>D-Lys
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(13)..(13)
<223>D-Gln
 
<400>38
Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1               5                   10
 
<210>39
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>39
Ala Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Ala Val Leu Ala Gln
1               5                   10
 
<210>40
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>D-Gln
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(2)..(2)
<223>D-Lys
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(3)..(3)
<223>D-Leu
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(4)..(4)
<223>D-Val
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(5)
<223>D-Lys
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(6)..(6)
<223>D-Tyr
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)..(7)
<223>D-Val
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>D-Tyr
<220>
<221>MOD_RES
<222>(9)..(9)
<223>D-Val
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(10)..(10)
<223>D-Ser
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(11)..(11)
<223>D-Tyr
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(12)..(12)
<223>D-Ser
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(13)..(13)
<223>D-Glu
 
<400>40
Gln Lys Leu Val Lys Tyr Val Tyr Val Ser Tyr Ser Glu
1               5                   10
 
<210>41
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>41
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val
1               5                   10                  15
Leu Lys Gln
 
<210>42
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>42
Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg
 
<210>43
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
<400>43
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg
1               5                   10                  15
Arg Met Lys Trp Lys Lys
            20
 
<210>44
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>44
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
            20
 
<210>45
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>45
Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg
 
<210>46
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>46
Met Asp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Val Pro Ala Gln Asn
1               5                   10                  15
Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Arg Arg Arg Arg Arg Arg
            20                  25                  30
 
<210>47
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>47
Gly Leu Phe Glu Ala Leu Leu Glu Leu Leu Glu Ser Leu Trp Glu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Glu Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg
            20                  25
 
<210>48
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>48
Leu Leu Asn Gln Leu Ala Gly Arg Met Ile Pro Lys Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg
 
<210>49
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>49
Thr Leu Asp His Val Leu Asp His Val Gln Thr Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg
 
<210>50
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>50
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
1               5                   10                  15
Met Ile Asp Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg
            20                  25
 
<210>51
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>51
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg
<210>52
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>52
His His His His His His His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
 
<210>53
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>53
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg
            20
 
<210>54
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>54
Lys Val Leu Lys Gln
1               5
 
<210>55
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>55
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5
 
<210>56
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>56
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1               5                   10                  15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
            20                  25                  30
Val Asp
 
<210>57
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>57
Val Thr Val Leu Ala Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly
1               5                   10                  15
 
<210>58
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>58
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1               5                   10                  15
Ala
 
<210>59
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>59
Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Ala
 
<210>60
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>60
Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro
            20
 
<210>61
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>61
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Lys Ile Asn Leu Lys
1               5                   10                  15
Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
            20                  25
 
<210>62
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>62
Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Lys Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
 
<210>63
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>63
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Ala
 
<210>64
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>64
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly
1               5                   10                  15
 
<210>65
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
<400>65
Phe Phe Gly Ala Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
 
<210>66
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>66
Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val
1               5                   10                  15
 
<210>67
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>67
Gly Val Phe Val Leu Gly Phe Leu Gly Phe Leu Ala Thr Ala Gly Ser
1               5                   10                  15
 
<210>68
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>68
Gly Ala Ala Ile Gly Leu Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala
1               5                   10                  15
 
<210>69
<211>56
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>69
Ala Cys Thr Cys Pro Tyr Cys Lys Asp Ser Glu Gly Arg Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Asp Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Gln Gly Cys Gly
            20                  25                  30
Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His
        35                  40                  45
Thr Gly Glu Arg Pro Phe Met Cys
    50                  55
 
<210>70
<211>54
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>70
Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Asp Gly Glu Lys Arg Ser Gly Glu
1               5                   10                  15
Gln Gly Lys Lys Lys His Val Cys His Ile Pro Asp Cys Gly Lys Thr
            20                  25                  30
Phe Arg Lys Thr Ser Leu Leu Arg Ala His Val Arg Leu His Thr Gly
        35                  40                  45
Glu Arg Pro Phe Val Cys
    50
 
<210>71
<211>55
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>71
Ala Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Glu Gly Gly Gly Arg Gly Thr Asn
1               5                   10                  15
Leu Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Pro Gly Cys Gly Lys
            20                  25                  30
Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His Ser
        35                  40                  45
Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys
    50                  55
 
<210>72
<211>56
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>72
Ala Cys Ser Cys Pro Asn Cys Arg Glu Gly Glu Gly Arg Gly Ser Asn
1               5                   10                  15
Glu Pro Gly Lys Lys Lys Gln His Ile Cys His Ile Glu Gly Cys Gly
            20                  25                  30
Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Trp His
        35                  40                  45
Thr Gly Glu Arg Pro Phe Ile Cys
    50                  55
<210>73
<211>60
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>73
Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Thr Asn Glu Met Ser Gly Leu Pro Pro
1               5                   10                  15
Ile Val Gly Pro Asp Glu Arg Gly Arg Lys Gln His Ile Cys His Ile
            20                  25                  30
Pro Gly Cys Glu Arg Leu Tyr Gly Lys Ala Ser His Leu Lys Thr His
        35                  40                  45
Leu Arg Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Leu Cys
    50                  55                  60
 
<210>74
<211>58
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>74
Thr Cys Asp Cys Pro Asn Cys Gln Glu Ala Glu Arg Leu Gly Pro Ala
1               5                   10                  15
Gly Val His Leu Arg Lys Lys Asn Ile His Ser CysHis Ile Pro Gly
            20                  25                  30
Cys Gly Lys Val Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg
        35                  40                  45
Trp His Thr Gly Glu Arg Pro Phe Val Cys
    50                  55
 
<210>75
<211>53
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>75
Arg Cys Thr Cys Pro Asn Cys Lys Ala Ile Lys His Gly Asp Arg Gly
1               5                   10                  15
Ser Gln His Thr His Leu Cys Ser Val Pro Gly Cys Gly Lys Thr Tyr
            20                  25                  30
Lys Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Lys His Thr Gly Asp
        35                  40                  45
Arg Pro Phe Val Cys
    50
 
<210>76
<211>56
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>76
Pro Gln Ile Ser Leu Lys Lys Lys Ile Phe Phe Phe Ile Phe Ser Asn
1               5                   10                  15
Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ser Arg Ile His Ile Cys His Leu Cys Asn
            20                  25                  30
Lys Thr Tyr Gly Lys Thr Ser His Leu Arg Ala His Leu Arg Gly His
        35                  40                  45
Ala Gly Asn Lys Pro Phe Ala Cys
    50                  55
 
<210>77
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>77
Trp Trp Glu Thr Trp Lys Pro Phe Gln Cys Arg Ile Cys Met Arg Asn
1               5                   10                  15
Phe Ser Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn His Arg Arg Arg His Arg
            20                  25                  30
 
<210>78
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>78
Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
1               5                   10                  15
 
<210>79
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>79
Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys
1               5                   10                  15
<210>80
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>80
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Arg Lys
1               5                   10                  15
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Arg Lys Lys Arg Arg
            20                  25                  30
Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
        35
 
<210>81
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>81
Gly Glu Gln Ile Ala Gln Leu Ile Ala Gly Tyr Ile Asp Ile Ile Leu
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Lys Ser Lys
            20
 
<210>82
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>82
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
            20                  25                  30
Val Leu Lys Gln
        35
 
<210>83
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>83
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
            20                  25                  30
Val Leu Lys Gln
        35
 
<210>84
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>84
Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1               5                   10                  15
 
<210>85
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>85
Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys
1               5                   10                  15
Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys
            20                  25                  30
Gln
 
<210>86
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>86
Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg
1               5                   10                  15
Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
            20                  25                  30
 
<210>87
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>87
Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser
1               5                   10                  15
Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
            20                  25
 
<210>88
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>88
Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val
1               5                   10                  15
Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
            20
 
<210>89
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>89
Lys Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr
1               5                   10                  15
Lys Val Leu Lys Gln
            20
 
<210>90
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>90
Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1               5                   10
 
<210>91
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>91
Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
1               5
 
<210>92
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>92
Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Glu Gly Lys
1               5                   10                  15
Lys Arg Lys Arg Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys
            20                  25                  30
Val Leu Lys Gln
        35
 
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>93
Trp Trp His His Lys Lys Arg Arg Cys
1               5
 
<210>94
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>94
Trp Trp His His Lys Lys Arg Arg Cys Cys Arg Arg Lys Lys His His
1               5                   10                  15
Trp Trp
 
<210>95
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>95
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1               5                   10
 
<210>96
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>96
Lys Lys Lys Arg Lys Val
1               5
 
<210>97
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>97
Lys Lys Lys Arg Lys Val Lys Lys Lys Arg Lys Val
1               5                   10
 
<210>98
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>98
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Cys
1               5
 
<210>99
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>99
Arg Arg Arg Pro Pro Gln Cys
1               5
 
<210>100
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>100
Cys Gly Arg Lys Lys Arg Arg
1               5
 
<210>101
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>101
Cys Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1               5
 
<210>102
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>102
Trp Lys Lys Lys Lys Cys
1               5
 
<210>103
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>103
Cys Trp Lys Lys Lys Lys
1               5
 
<210>104
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Cys Arg Arg Arg Pro Pro Gln His
1               5
 
<210>105
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>105
Cys Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1               5
 
<210>106
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>106
Cys Lys Lys Arg Arg Gln His
1               5
 
<210>107
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Cys Arg Arg
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<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Cys Arg Arg Arg
1
 
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<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Cys Arg Arg Arg Arg
1               5
 
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<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>110
Cys Arg Arg Arg Arg Arg
1               5
 
<210>111
<211>3
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Cys Lys Lys
1
 
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<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>112
Cys Lys Lys Lys
1
 
<210>113
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>113
Cys Lys Lys Lys Lys
1               5
 
<210>114
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>114
Cys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5
 
<210>115
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
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<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Cys Arg Arg Arg Arg Trp Trp
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<210>116
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Cys Arg Arg Arg Trp Trp
1               5
 
<210>117
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>117
Cys Arg Arg Trp Trp
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<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>118
Cys Lys Lys Trp Trp
1               5
 
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<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>119
Cys Lys Lys Lys Trp Trp
1               5
 
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>120
Cys Lys Lys Lys Lys Trp Trp
1               5
 
<210>121
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Cys Trp His His Arg Arg Lys Lys
1               5
 
<210>122
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>122
Cys Arg Arg Lys Lys His His Trp Trp
1               5
 
<210>123
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>123
Cys Lys Lys Arg Arg Trp
1               5
 
<210>124
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>124
Cys Lys Lys Arg Arg His Trp
1               5
 
<210>125
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>125
Cys Lys Lys Arg Arg His His Trp
1               5
 
<210>126
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>126
Cys Lys Lys Arg Arg Gln
1               5
 
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<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>127
Lys Lys Arg Arg Gln Cys
1               5
 
<210>128
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>128
Cys Gly Arg Lys Lys Arg Arg
1               5
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<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>129
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Cys
1               5
 
<210>130
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>130
Cys Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
1               5
 
<210>131
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>131
Gln Gly Arg Lys Lys Arg Arg Cys
1               5
 
<210>132
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>132
Cys Arg Arg His
1
 
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1               5                   10
 
<210>185
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)..(7)
<223>瓜氨酸
 
<400>185
His Lys Lys Lys Lys Val Xaa Lys Lys Lys Lys His
1               5                   10
 
<210>186
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>瓜氨酸
 
<400>186
His Lys Lys Lys Lys Lys Val Xaa Lys Lys Lys Lys Lys His
1               5                   10
 
<210>187
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>瓜氨酸
 
<400>187
His Trp Lys Lys Arg Arg Val Xaa Arg Arg Lys Lys Trp His
1               5                   10
<210>188
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>瓜氨酸
 
<400>188
Arg Arg Lys Lys Trp His Val Xaa His Trp Lys Lys Arg Arg
1               5                   10
 
<210>189
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>瓜氨酸
 
<400>189
Pro Pro His Arg Arg Arg Val Xaa Arg Arg Arg His Pro Pro
1               5                   10
 
<210>190
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(8)..(8)
<223>瓜氨酸
 
<400>190
Arg Arg Arg His Pro Pro Val Xaa Pro Pro His Arg Arg Arg
1               5                   10
 
<210>191
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>191
Trp Trp His His Lys Lys Arg Arg Gly Gly Arg Arg Lys Lys His His
1               5                   10                  15
Trp Trp
<210>192
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Trp Trp His His Lys Lys Arg Arg
1               5
 
<210>193
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>193
Tyr Tyr His His Lys Lys Arg Arg
1               5
 
<210>194
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>194
Arg Arg Lys Lys His His Tyr Tyr
1               5
 
<210>195
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>195
Tyr Tyr His His Lys Lys Arg Arg Cys Cys Arg Arg Lys Lys His His
1               5                   10                  15
Tyr Tyr
 
<210>196
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>196
Tyr Tyr His His Lys Lys Arg Arg Val Arg Arg Lys Lys His His Tyr
1               5                   10                  15
Tyr
 
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<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Trp Trp Arg Arg
1
 
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<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Arg Arg Trp Trp
1
 
<210>199
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>199
Cys Trp Arg Arg Arg Trp Cys
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<210>200
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>200
Cys Trp Trp Arg Arg Arg Trp Trp Cys
1               5
 
<210>201
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>201
Cys Trp Arg Arg Arg Arg Trp Cys
1               5
<210>202
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>202
Cys Trp Arg Arg His His Arg Arg Trp Cys
1               5                   10
 
<210>203
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>203
Cys Trp Trp Arg Arg Arg Arg Trp Trp Cys
1               5                   10
 
<210>204
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>204
Cys Trp Trp Arg Arg His His Arg Arg Trp Trp Cys
1               5                   10
 
<210>205
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>205
Cys Trp Arg Arg Arg Arg Arg Trp Cys
1               5
 
<210>206
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>206
Val Gln Ala Ala Ile Asp Tyr Ile Asn Gly
1               5                   10
 
<210>207
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>207
Cys Trp Trp Arg Arg Arg Arg Arg Trp Trp Cys
1               5                   10
 
<210>208
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>208
Trp Trp Arg Arg Cys Cys Arg Arg Trp Trp
1               5                   10
 
<210>209
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>209
Trp Trp Arg Arg Val Arg Arg Trp Trp
1               5
 
<210>210
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Tyr Tyr Arg Arg
1
 
<210>211
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>211
Arg Arg Tyr Tyr
1
 
<210>212
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Cys Tyr Arg Arg Arg Tyr Cys
1               5
 
<210>213
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>213
Cys Tyr Tyr Arg Arg Arg Tyr Tyr Cys
1               5
 
<210>214
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>214
Cys Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Cys
1               5
 
<210>215
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>215
Cys Tyr Arg Arg His His Arg Arg Tyr Cys
1               5                   10
 
<210>216
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>216
Cys Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Tyr Cys
1               5                   10
 
<210>217
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>217
Cys Tyr Tyr Arg Arg His His Arg Arg Tyr Tyr Cys
1               5                   10
 
<210>218
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>218
Cys Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Tyr Cys
1               5
 
<210>219
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>219
Cys Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Arg Tyr Tyr Cys
1               5                   10
 
<210>220
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>220
Cys Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Tyr Tyr Cys
1               5                   10
 
<210>221
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>221
Tyr Tyr Arg Arg Cys Cys Arg Arg Tyr Tyr
1               5                   10
 
<210>222
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>222
Tyr Tyr Arg Arg Val Arg Arg Tyr Tyr
1               5
 
<210>223
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>223
Trp Trp Arg Arg His His
1               5
 
<210>224
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>224
His His Arg Arg Trp Trp
1               5
 
<210>225
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>225
Trp Trp Arg Arg His His Cys Cys His His Arg Arg Trp Trp
1               5                   10
 
<210>226
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>226
Trp Trp Arg Arg His His Val His His Arg Arg Trp Trp
1               5                   10
 
<210>227
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>227
Tyr Tyr Arg Arg His His
1               5
 
<210>228
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>228
His His Arg ArgTyr Tyr
1               5
 
<210>229
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>229
Tyr Tyr Arg Arg His His Cys Cys Arg Arg His His Tyr Tyr
1               5                   10
 
<210>230
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>230
Tyr Tyr Arg Arg His His Val Arg Arg His His Tyr Tyr
1               5                   10
 
<210>231
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>231
Trp Trp Arg Arg Arg
1               5
 
<210>232
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>232
Arg Arg Arg Trp Trp
1               5
 
<210>233
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>233
Trp Trp Arg Arg Arg Cys Cys Arg Arg Arg Trp Trp
1               5                   10
 
<210>234
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>234
Trp Trp Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Trp Trp
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<210>235
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>235
Tyr Tyr Arg Arg Arg
1               5
 
<210>236
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>236
Arg Arg Arg Tyr Tyr
1               5
 
<210>237
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>237
Tyr Tyr Arg Arg Arg Cys Cys Arg Arg Arg Tyr Tyr
1               5                   10
 
<210>238
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>238
Tyr Tyr Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Tyr Tyr
1               5                   10
 
<210>239
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>239
Trp Trp Arg Arg Arg His His
1               5
 
<210>240
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>240
His His Arg Arg Arg Trp Trp
1               5
 
<210>241
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>241
Trp Trp Arg Arg Arg His His Cys Cys His His Arg Arg Arg Trp Trp
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<210>242
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>242
Trp Trp Arg Arg Arg His His Val His His Arg Arg Arg Trp Trp
1               5                   10                  15
 
<210>243
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
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Tyr Tyr Arg Arg Arg His His
1               5
 
<210>244
<211>7
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<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>244
His His Arg Arg Arg Tyr Tyr
1               5
<210>245
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>245
Tyr Tyr Arg Arg Arg His His Cys Cys Arg Arg Arg His His Tyr Tyr
1               5                   10                  15
 
<210>246
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>246
Tyr Tyr Arg Arg Arg His His Val Arg Arg Arg His His Tyr Tyr
1               5                   10                  15
 
<210>247
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>247
Trp Trp Arg Arg Arg Arg
1               5
 
<210>248
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>248
Arg Arg Arg Arg Trp Trp
1               5
 
<210>249
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>249
Trp Trp Arg Arg Arg Arg Cys Cys Arg Arg Arg Arg Trp Trp
1               5                   10
 
<210>250
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>250
Trp Trp Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Trp Trp
1               5                   10
 
<210>251
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>251
Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg
1               5
 
<210>252
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>252
Arg Arg Arg Arg Tyr Tyr
1               5
 
<210>253
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>253
Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Cys Cys Arg Arg Arg Arg Tyr Tyr
1               5                   10
 
<210>254
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>254
Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg Val Arg Arg Arg Arg Tyr Tyr
1               5                   10
 
<210>255
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
<400>255
Trp Trp Arg Arg Arg Arg His His
1               5
 
<210>256
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>256
His His Arg Arg Arg Arg Trp Trp
1               5
 
<210>257
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>257
Trp Trp Arg Arg Arg Arg His His Cys Cys His His Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Trp Trp
 
<210>258
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>258
Trp Trp Arg Arg Arg Arg His His Val His His Arg Arg Arg Arg Trp
1               5                   10                  15
Trp
 
<210>259
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>259
Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg His His
1               5
 
<210>260
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>260
His His Arg Arg Arg Arg Tyr Tyr
1               5
 
<210>261
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>261
Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg His His Cys Cys Arg Arg Arg Arg His His
1               5                   10                  15
Tyr Tyr
 
<210>262
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>262
Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg His His Val Arg Arg Arg Arg His His Tyr
1               5                   10                  15
Tyr
 
<210>263
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>263
Trp Trp His His Lys Lys Arg Arg Trp Val Trp Arg Arg Lys Lys His
1               5                   10                  15
His Trp Trp
 
<210>264
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>264
Trp Trp His His Arg Arg Cys
1               5
<210>265
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>265
Trp Trp His His Arg Arg Val Arg Arg His His Trp Trp
1               5                   10
 
<210>266
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>266
Trp Trp His His His Arg Arg Arg Cys
1               5
 
<210>267
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>267
Cys Trp Trp His His His Arg Arg Arg Cys
1               5                   10
 
<210>268
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>268
Cys Trp Trp Trp His His His His Arg Arg Arg
1               5                   10
 
<210>269
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>269
Cys Trp Trp Trp Lys Lys Arg Arg Arg
1               5
 
<210>270
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>270
Cys Lys Lys Lys Trp Arg Arg Trp
1               5
 
<210>271
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>271
Cys Trp Arg Arg Arg Trp Arg Arg
1               5
 
<210>272
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>272
Cys Trp Trp His His Lys Lys Arg Arg Cys
1               5                   10
 
<210>273
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>273
Trp Trp Cys His His Lys Lys Cys Arg Arg
1               5                   10
 
<210>274
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>274
Trp Trp His His Cys Lys Lys Arg Arg Cys
1               5                   10
 
<210>275
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
<400>275
Cys Trp Trp His His Lys Lys Cys Arg Arg
1               5                   10
 
<210>276
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>276
Trp Trp His His Cys Cys Lys Lys Arg Arg
1               5                   10
 
<210>277
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>277
Arg Arg Trp Trp Lys Lys His His Cys
1               5
 
<210>278
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>278
Cys Trp Trp His His Lys Lys Lys Lys Cys
1               5                   10
 
<210>279
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>279
Cys Trp Trp His His Arg Arg Arg Arg Cys
1               5                   10
 
<210>280
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>280
Cys Arg Arg Arg Arg His His Cys
1               5
<210>281
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>281
Cys His His Lys Lys Lys Lys Cys
1               5
 
<210>282
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>282
Cys His His Arg Arg Arg Arg Cys
1               5
 
<210>283
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>283
Cys Tyr Tyr Arg Arg Arg Arg His His Cys
1               5                   10
 
<210>284
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>284
Cys Tyr Tyr Lys Lys Lys Lys His His Cys
1               5                   10
 
<210>285
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(4)..(22)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(22)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
<400>285
Cys Trp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys
            20
 
<210>286
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(5)..(23)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(5)..(23)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>286
Cys His Trp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Cys
            20
 
<210>287
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(5)..(5)
<223>任意氨基酸
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(7)..(7)
<223>任意氨基酸
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(11)..(13)
<223>任意氨基酸
 
<220>
<221>MOD_RES    
<222>(16)..(16)
<223>任意氨基酸
 
<400>287
Ala Ala Ala Asx Xaa Tyr Xaa Gln Trp Leu Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa
1               5                   10                  15
 
<210>288
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(21)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(21)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>288
Cys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Lys Lys Cys
            20
 
<210>289
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(4)..(22)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(22)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>289
Cys His Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Lys Lys Lys His Cys
            20
 
<210>290
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>290
Gly Ala Leu Phe Leu Ala Phe Leu Ala Ala Ala Leu Ser Leu Met Gly
1               5                   10                  15
Leu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
            20                  25
 
<210>291
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(13)..(13)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(19)..(19)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(21)..(21)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(21)..(21)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>291
Gly Ala Leu Phe Leu Ala Phe Leu Ala Ala Ala Leu Leu Leu Met Gly
1               5                   10                  15
Leu Trp Leu Gln Leu Lys Lys Lys Arg Lys Val
            20                  25
 
<210>292
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>292
Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1               5                   10
 
<210>293
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)..(1)
<223>/取代＝”Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(12)..(12)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>293
Leu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu
1               5                   10
 
<210>294
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(2)..(2)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(10)..(10)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>294
Trp Leu Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Leu
1               5                   10
 
<210>295
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)..(2)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>295
Leu Leu Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1               5                   10
<210>296
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>296
Leu Ile Arg Leu Trp Ser His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Asn Arg
1               5                   10                  15
Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys
            20
 
<210>297
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(6)..(6)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(15)..(15)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>297
Leu Ile Arg Leu Trp Leu His Leu Ile His Ile Trp Phe Gln Leu Arg
1               5                   10                  15
Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys
            20
 
<210>298
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>298
Gln Asn Arg Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys
1               5                   10
 
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<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
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<222>(1)..(1)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
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<221>VARIANT
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<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>299
Leu Gln Asn Arg Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys Leu
1               5                   10
 
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<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
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<221>VARIANT
<222>(2)..(2)
<223>/取代＝″Ala″或″Gln″或″His″或″Glu″或″Arg″或″Lys″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)..(2)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>300
Gln Leu Arg Arg Leu Lys Trp Lys Lys Lys
1               5                   10
 
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<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成引物”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成引物”
 
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ccgucagccg auuugcuaut t                                               21
 
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成引物”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成引物”
 
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auagcaaauc ggcugacggt t                                               21
 
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成引物”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成引物”
 
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gggucggaac ccaagcuuat t                                               21
 
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成引物”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成引物”
 
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uaagcuuggg uuccgaccct a                                               21
 
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<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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cuacacaaau cagcgauuut t                                               21
 
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<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
<400>306
aaaucgcuga uuuguguagt c                                               21
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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cgggacucua gcauacuuat t                                               21
 
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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uaaguaugcu agagucccgt t                                               21
 
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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acugacagcc agacagcgat t                                               21
 
<210>310
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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ucgcugucug gcugucagut t                                               21
 
<210>311
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>311
agacagcgac caaaagaaut t                                              21
 
<210>312
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>312
auucuuuugg ucgcugucut t                                              21
 
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>313
augaagaucu guuccaccat t                                              21
 
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>314
ugguggaaca gaucuucaut t                                              21
 
<210>315
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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gaucuguucc accauugaat t                                               21
 
<210>316
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>316
uucaauggug gaacagauct t                                               21
 
<210>317
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
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<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>317
gcaauugagg agugccugat t                                               21
 
<210>318
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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ucaggcacuc cucaauugct t                                               21
 
<210>319
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>319
uugaggagug ccugauuaat t                                               21
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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uuaaucaggc acuccucaat t                                               21
 
<210>321
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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ggaucuuauu ucuucggagt t                                               21
 
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸”
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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cuccgaagaa auaagaucct t                                               21
 
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<211>20
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<213>人工序列
 
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<212>DNA
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成引物”
 
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<212>DNA
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ctagatggca agcatgtggt gtttgg                                         26
 
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<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成引物”
 
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<210>327
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成引物”
 
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cttttcagca agtgggaagg tg                                             22
 
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成探针”
 
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cctggccttg tctgtggaga cggatta                                        27
 
<210>329
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>329
ggaucuuauu ucuucggaga caatg                                          25
 
<210>330
<211>27
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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cauugucucc gaagaaauaa gauccuu                                        27
 
<210>331
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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uucuccgaac gugucacgut t                                              21
 
<210>332
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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acgugacacg uucggagaat t                                              21
 
<210>333
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>333
cuacacaaau cagcgauuut t                                              21
 
<210>334
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>334
aaaucgcuga uuuguguagt c                                              21
 
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<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
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<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>336
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<210>337
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
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<223>组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
 
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>337
ggaucuuauu ucuucggagt t                                              21
 
<210>338
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>338
cuccgaagaa auaagaucct t                                              21
 
<210>339
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
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<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>339
ccgtcagccg atttgctatt t                                              21
 
<210>340
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成寡核苷酸”
 
<400>340
auagcaaatc ggctgacggt t                                              21
 
<210>341
<211>100
<212>PRT
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<223>/取代＝″″
 
<220>
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<222>(3)..(100)
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<400>341
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
            20                  25                  30
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
        35                  40                  45
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
    50                  55                  60
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
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Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
                85                  90                  95
Arg Arg Arg Arg
            100
 
<210>342
<211>100
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成多肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(100)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(100)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>342
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
            20                  25                  30
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
        35                  40                  45
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
    50                  55                  60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
65                  70                  75                  80
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Lys Lys Lys Lys
            100
 
<210>343
<211>100
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成多肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(100)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(100)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>343
His His His His His His His His His His His His His His His His
1               5                   10                  15
His His His His His His His His His His His His His His His His
            20                  25                  30
His His His His His His His His His His His His His His His His
        35                  40                  45
His His His His His His His His His His His His His His His His
    50                  55                  60
His His His His His His His His His His His His His His His His
65                  70                  75                  80
His His His His His His His His His His His His His His His His
                85                  90                  95
His His His His
            100
 
<210>344
<211>102
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成多肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(4)..(101)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(101)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>344
His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
            20                  25                  30
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
        35                  40                  45
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
    50                  55                  60
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
65                  70                  75                  80
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
                85                  90                  95
Arg Arg Arg Arg Arg His
            100
 
<210>345
<211>102
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成多肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(4)..(101)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(101)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>345
His Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
            20                  25                  30
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
        35                  40                  45
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
    50                  55                  60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
65                  70                  75                  80
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
                85                  90                  95
Lys Lys Lys Lys Lys His
            100
 
<210>346
<211>300
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成多肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(100)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(100)
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<220>
<221>VARIANT
<222>(103)..(200)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(103)..(200)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(203)..(300)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(203)..(300)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>346
His His His His His His His His His His His His His His His His
1               5                   10                  15
His His His His His His His His His His His His His His His His
            20                  25                  30
His His His His His His His His His His His His His His His His
        35                  40                  45
His His His His His His His His His His His His His His His His
    50                  55                  60
His His His His His His His His His His His His His His His His
65                  70                  75                  80
His His His His His His His His His His His His His His His His
                85                  90                  95
His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
            100                 105                 110
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
        115                 120                 125
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
    130                 135                 140
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
            180                 185                 190
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His His His His His His His His
        195                 200                 205
His His His His His His His His His His His His His His His His
    210                 215                 220
His His His His His His His His His His His His His His His His
225                 230                 235                 240
His His His His His His His His His His His His His His His His
                245                 250                 255
His His His His His His His His His His His His His His His His
            260                 265                 270
His His His His His His His His His His His His His His His His
        275                 280                 285
His His His His His His His His His His His His
    290                 295                 300
 
<210>347
<211>300
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(100)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(100)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(103)..(200)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(103)..(200)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(203)..(300)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(203)..(300)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>347
His His His His His His His His His His His His His His His His
1               5                   10                  15
His His His His His His His His His His His His His His His His
            20                  25                  30
His His His His His His His His His His His His His His His His
        35                  40                  45
His His His His His His His His His His His His His His His His
    50                  55                  60
His His His His His His His His His His His His His His His His
65                  70                  75                  80
His His His His His His His His His His His His His His His His
                85                  90                  95
His His His His Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
            100                 105                 110
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
        115                 120                 125
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
    130                 135                 140
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
145                 150                 155                 160
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
                165                 170                 175
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
            180                 185                 190
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys His His His His His His His His
       195                 200                 205
His His His His His His His His His His His His His His His His
    210                 215                 220
His His His His His His His His His His His His His His His His
225                 230                 235                 240
His His His His His His His His His His His His His His His His
                245                 250                 255
His His His His His His His His His His His His His His His His
            260                 265                 270
His His His His His His His His His His His His His His His His
        275                 280                 285
His His His His His His His His His His His His
    290                 295                 300
 
<210>348
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(40)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(40)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>348
His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg
1               5                   10                  15
His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg His Arg
            20                  25                  30
His Arg His Arg His Arg His Arg
        35                  40
 
<210>349
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>VARIANT
<222>(3)..(40)
<223>/取代＝″″
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(40)
<223>/注释＝“对位于所述注释位置中的那些残基，序列中给出的残基并没有优先的涵义”
 
<400>349
His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys
1               5                   10                  15
His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys His Lys
            20                  25                  30
His Lys His Lys His Lys His Lys
        35                  40
 
<210>350
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(13)..(13)
<223>半胱胺
 
<400>350
His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Xaa
1               5                   10
 
<210>351
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列的描述：合成肽
 
<400>351
His His His His His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10                  15
 
<210>352
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(28)..(28)
<223>半胱胺
 
<400>352
Gly Ala Leu Phe Leu Ala Phe Leu Ala Ala Ala Leu Ser Leu Met Gly
1               5                   10                  15
Leu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Xaa
            20                  25
<210>353
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(13)..(13)
<223>半胱胺
 
<400>353
Gly Ala Leu Phe Leu Ala Phe Leu Ala Ala Ala Leu Ser Leu Met Gly
1               5                   10                  15
Leu Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val Xaa
            20                  25
 
<210>354
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(19)..(19)
<223>半胱胺
 
<400>354
His His His His His Lys His His His Lys Lys Lys His Lys His Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Xaa
 
<210>355
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(19)..(19)
<223>半胱胺
 
<400>355
His His His His His Lys His His His Lys Lys Lys His Lys His Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Xaa
 
<210>356
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>source
<223>/注释＝″人工序列的描述：合成肽”
 
<400>356
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1               5                   10                  15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val
            20                  25

Claims (19)

1.包含式I所示结构的化合物：
R3-J-{NRN-CR1R2-(C＝O)}n-Z-R4    式I
其中
各个R1独立地为氨基酸的非氢侧链；
{NRN-CR1R2-(C＝O)}n为核心结构肽；
R2和RN彼此独立地为氢，或为由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20个碳原子的有机基团，或者为C(1-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基烷基、C(3-18)烯基、C(3-18)炔基、C(1-5)烷酰基、C(1-5)烷酰氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-联苯基-C(1-5)烷基、羧基或羟基；
R3和R4彼此独立地为亲脂性尾部，其源自天然存在的或合成的脂质、磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷酯或神经节苷脂，其中所述尾部可以包含类固醇，或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成并且具有1-20个碳原子的有机基团，或取代或未取代的C(1-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-烷基、C(3-18)烯基、C(3-18)炔基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基，或二氢神经鞘氨醇、(2R，3R)-2-氨基-1，3-十八烷二醇、2-氨基-1，3-二十烷二醇、鞘氨醇、植物鞘氨醇、顺式-4-鞘氨醇或者神经酰胺；
Z为NH、O，或包括马来酰亚胺基、硫醚、酰胺、半胱胺、半胱氨酸、硫醇或二硫基的连接子，或包含1-400个原子的聚氧乙烯基或聚氧丙烯基，或者包含1-200个选自C、H、F、Cl、Br、N、O、S、Si和P的组中的原子的连接子；
J为(C＝O)，O，或包括马来酰亚胺基、硫醚、酰胺、半胱胺、半胱氨酸、硫醇或二硫基的连接子，或包含1-400个原子的聚氧乙烯基或聚氧丙烯基，或包含1-200个选自C、H、F、Cl、Br、N、O、S、Si和P的组中的原子的连接子；
其中
n为2-100。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述肽的氨基酸序列选自由SEQ IDNOs：1-300和350-356组成的组。
3.如权利要求1所述的化合物，其中，所述肽的氨基酸序列选自由以下组成的组：GALFLAFLAAALXaaLMGLWXaaQXaaKKKRKV(SEQ ID NO：291)、WSQPKKKRKV(SEQ ID NO：292)、WWHHKKRRCCRRKKHHWW(SEQ ID NO：94)、XaaWSQPKKKRKVXaa(SEQ ID NO：293)、WXaaQPKKKRKXaa(SEQ ID NO：294)XaaXaaQPKKKRKV(SEQ ID NO：295)、LIRLWXaaHLIHIWFQXaaRRLKWKKK(SEQ ID NO：297)、QNRRLKWKKK(SEQ ID NO：298)、XaaQNRRLKWKKKXaa(SEQ ID  NO：299)和QXaaRRLKWKKK(SEQ ID NO：300)，其中每个Xaa独立地为L、A、Q、H、E、R或K。
4.如权利要求1所述的化合物，其中，所述肽连有侧链，所述侧链包含选自以下的释放官能团：3，5-二碘-酪氨酸，1-甲基组氨酸，2-甲基丁酸，2-o-茴香基丙酸，内消旋酒石酸，4，6-二甲基氨基嘧啶，对苯二甲酸，肌氨酸酐，丁酸，N，N-二甲基-1-萘胺，戊酸，4-甲基戊酸，N-甲基苯胺，1，10-邻二氮杂菲，3-吡啶羧酸，己酸，丙酸，4-氨基苯甲酸，2-甲基丙酸，庚酸，辛酸，环己羧酸，喹啉，3-氨基喹啉，2-氨基苯甲酸，4-吡啶羧酸，壬酸，三聚氰胺，8-羟基喹啉，三甲基乙酸，6-甲氧基喹啉，4-(甲基氨基)苯甲酸，对甲苯胺，3-(甲基氨基)苯甲酸，苹果酸，N-乙基苯胺，2-苯甲基吡啶，3，6-二硝基酚，N，N-二甲基苯胺，2，5-二甲基哌嗪，对氨基苯乙醚，5-甲基喹啉，2-苯基苯并咪唑，吡啶，吡啶甲酸，3，5-二碘酪氨酸，对茴香胺，2-(甲基氨基)苯甲酸，2-氨基噻唑，戊二酸，己二酸，异喹啉，衣康酸，邻苯二甲酸，苯并咪唑，哌嗪，庚二酸，吖啶，菲啶，琥珀酸，甲基琥珀酸，4-甲基喹啉，3-甲基吡啶，7-羟基异喹啉，丙二酸，甲基丙二酸，2-甲基喹啉，2-乙基吡啶，2-甲基吡啶，4-甲基吡啶，组胺，组氨酸，马来酸，顺式-1，2-环己二胺，3，5-二甲基吡啶，2-乙基苯并咪唑，2-甲基苯并咪唑，可卡酸，萘嵌间二氮杂苯，柠檬酸，异柠檬酸，2，5-二甲基吡啶，罂粟碱，6-羟基-4-甲基蝶啶，L-甲状腺素，3，4-二甲基吡啶，甲氧基吡啶，反式-1，2-环己二胺，2，5-吡啶二胺，l-1-甲基组氨酸，l-3-甲基组氨酸，2，3-二甲基吡啶，黄蝶呤，1，2-丙二胺，N，N-二乙基苯胺，阿脲酸，2，6-二甲基吡啶，L-肌肽，2-氨基吡啶，N-b-丙氨酰基组氨酸，毛果芸香碱，1-甲基咪唑，1H-咪唑，2，4-二甲基吡啶，4-硝基酚，2-硝基酚，酪氨酸酰胺，5-羟基喹唑啉，1，1-环丙二羧酸，2，4，6-三甲基吡啶，巴比妥，2，3-二氯苯酚，1，2-乙二胺，1-氨基异喹啉，及其组合。
5.药物组合物，其包含干扰RNA试剂和一种或多种权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述干扰RNA试剂为siRNA。
7.如权利要求5所述的组合物，其中，所述干扰RNA试剂为mdRNA。
8.药物组合物，其包含干扰RNA试剂、一种或多种权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐、一种或多种非阳离子脂质、和聚合脂质。
9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述干扰RNA试剂为siRNA。
10.如权利要求8所述的组合物，其中，所述干扰RNA试剂为mdRNA。
11.如权利要求8所述的组合物，其中，所述一种或多种化合物为(C20)-(H)88(H)8K-NH-(C20)(SEQ ID NO：13)。
12.如权利要求8所述的组合物，其中，所述非阳离子脂质选自DDPE、DLPE、DSPE、DOPE、DLinPE、DlenPE、DARAPE、DDHAPE、DphPE、DSPC、DPPC、DDPC、DPPS、DSPS、胆固醇、羊毛甾醇、豆甾醇、二氢羊毛甾醇、酵母甾醇、酵母甾烯醇、链甾醇、7-脱氢胆固醇、PEG化的胆固醇、胆甾醇乙酸酯、胆甾醇花生四烯酸酯、胆甾醇丁酸酯、胆甾醇己酸酯、胆甾醇辛酸酯、胆甾醇正癸酸酯、胆甾醇月桂酸酯、胆甾醇肉蔻酸酯、胆甾醇棕榈酸酯、胆甾醇山嵛酸酯、胆甾醇硬脂酸酯、胆甾醇神经酸酯、胆甾醇壬酸酯、胆甾醇正戊酸酯、胆甾醇油酸酯、胆甾醇反油酸酯、胆甾醇芥酸酯、胆甾醇庚酸酯、胆甾醇反亚油酸酯、胆甾醇亚油酸酯、及其混合物和衍生物。
13.如权利要求8所述的组合物，其中，所述聚合脂质选自DMPE-MPEG-2000、DMPE-MPEG-5000、DPPE-MPEG-2000、DPPE-MPEG-5000、DSPE-MPEG-750、DSPE-MPEG-2000、DSPE-MPEG-5000、胆固醇硫酸酯钠盐、PEG化的胆固醇、其药学上可接受的盐、及其混合物。
14.向细胞递送干扰RNA试剂的方法，其包括制备权利要求8所述的组合物和用所述组合物处理细胞。
15.抑制细胞中基因表达的方法，其包括制备权利要求8所述的组合物和用所述组合物处理细胞。
16.抑制哺乳动物中基因表达的方法，其包括制备权利要求8所述的组合物和向所述哺乳动物施用所述组合物。
17.权利要求8所述的组合物在制备用于治疗疾病、病变或病症的药物中的应用。
18.如权利要求17所述的应用，其中，所述疾病或病症为癌症、代谢疾病或病变、或炎症。
19.权利要求8的组合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的应用。
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