ES2707966T3

ES2707966T3 - Terapia de ARNm para la deficiencia en síntesis de argininosuccinato

Info

Publication number: ES2707966T3
Application number: ES14799919T
Authority: ES
Inventors: Michael Heartlein; Frank Derosa; Lianne Smith
Original assignee: Translate Bio Inc
Current assignee: Translate Bio Inc
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2019-04-08
Anticipated expiration: 2034-10-22
Also published as: ES2954366T3; EP3501605C0; EP3060303A1; JP2022031483A; JP6608815B2; JP2016534992A; CA2928188A1; US20220218803A1; US11224642B2; EP3501605A1; EP4276176A3; EP4276176A2; US20150110859A1; BR112016009014A2; JP2019163322A; BR112016009014B1; EP3501605B1; JP2023101756A; EA201690590A1; WO2015061500A1

Abstract

Una composición que comprende un ARNm que codifica sintetasa de argininosuccinato (ASS1) para uso en el tratamiento de la deficiencia de sintetasa de argininosuccinato (ASD), en donde el tratamiento comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento la composición a una dosis efectiva y un intervalo de administración tal que al menos un síntoma o característica de ASD se reduce en intensidad, severidad o frecuencia o se retrasa en el inicio, en donde: el ARNm tiene una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; y el ARNm es codón optimizado.

Description

DESCRIPCION

Terapia de ARNm para la deficiencia en smtesis de argininosuccinato

ANTECEDENTES

[0001] La deficiencia de sintetasa de argininosuccinato (ASD) es un trastorno genetico metabolico autosomico recesivo caracterizado por una mutacion en el gen de la enzima de sintetasa de argininosuccinato (ASS1), que afecta su capacidad para unirse a la citrulina, aspartato y otras moleculas. Los defectos en la protema ASS interrumpen el ciclo de la urea y evitan que el Imgado procese adecuadamente el exceso de nitrogeno en la urea. Una acumulacion de amomaco y otros subproductos del ciclo de la urea (como la citrulina) es toxica y, cuando se produce durante los primeros dfas de vida, puede provocar smtomas como falta de energfa (letargo), mala alimentacion, vomitos, convulsiones y perdida de conciencia. Actualmente, no existe cura para la enfermedad y el nivel de atencion es a traves del manejo de la dieta, minimizando los alimentos que contienen altas cantidades de protemas y suplementos dieteticos de arginina y fenilacetato. El documento WO 2013/149140 describe lfpidos cationicos ionizables, utilizables en la administracion liposomal de acidos nucleicos. El documento WO 2012/170889 describe lfpidos escindibles para uso en la administracion liposomal de ARNm. El documento WO 2011/068810 describe metodos de administracion intracelular de acidos nucleicos (por ejemplo, ARNm) que son capaces de corregir defectos geneticos existentes y/o proporcionar funciones beneficiosas a una o mas celulas diana.

SUMARIO DE LA INVENCION

[0002] La presente invencion se refiere a composiciones mejoradas para el tratamiento de la deficiencia de sintetasa de argininosuccinato (ASD) basada en la terapia de ARNm. La invencion se basa en la observacion de que la administracion de un ARNm optimizado por codon que codifica una protema ASS1 humana, encapsulada dentro de un liposoma, dio como resultado una produccion de protemas altamente eficiente y sostenida In Vivo y una reduccion exitosa de los niveles plasmaticos de amomaco, un marcador de enfermedad clmicamente relevante.

[0003] Espedficamente, la presente invencion proporciona una composicion que comprende un ARNm que codifica sintetasa de argininosuccinato (ASS1) para uso en el tratamiento de ASD, en donde el tratamiento comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento la composicion a una dosis efectiva y un intervalo de administracion de tal manera que al menos un smtoma o caractenstica de ASD se reduce en intensidad, severidad o frecuencia o se ha retrasado en el inicio. En algunas realizaciones, el ARNm esta encapsulado dentro de un liposoma en el que el ARNm tiene una secuencia de nucleotidos al menos el 90% identica a la Se Q ID NO: 3, SEQ ID NO: 7. SEQ iD NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 y el ARNm esta optimizado por codones.

[0004] En algunas realizaciones, las composiciones para tratar ASD comprenden un ARNm que codifica ASS1 en una cantidad de dosis eficaz encapsulada dentro de un liposoma.

[0005] En algunas realizaciones, un liposoma adecuado comprende uno o mas lfpidos cationicos, uno o mas lfpidos no cationicos, uno o mas lfpidos basados en colesterol y uno o mas lfpidos modificados con PEG.

[0006] En algunas realizaciones, uno o mas lfpidos cationicos se seleccionan del grupo que consiste en C12-200, MC3, DLinDMA, DLinKC2DMA, cKK-E12, ICE (basado en imidazol), HGT5000, HGT5001, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA y DMDMA, DODAC, DLinDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT4003, y combinaciones de los mismos.

[0007] En algunas realizaciones, uno o mas lfpidos cationicos comprenden un compuesto de formula I-c1-a:

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde:

cada R2 es independientemente hidrogeno o C1-3 alquilo;

cada q independientemente es de 2 a 6;

cada R' es independientemente hidrogeno o C1-3 alquilo;

y cada RL es independientemente C8-12 alquilo.

[0008] En algunas realizaciones, uno o mas lfpidos cationicos comprenden cKK-E12:

[0009] En algunas realizaciones, uno o mas lfpidos no cationicos adecuados para la invencion se seleccionan de DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), Dp PC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-snglicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo(1'-racglicerol)), y combinaciones de los mismos.

[0010] En algunas realizaciones, uno o mas lfpidos a base de colesterol se seleccionan de colesterol, colesterol PEGilado y DC-Chol(N,N-dimetilo-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oilamino-propilo)piperazina.

[0011] En algunas realizaciones, el liposoma comprende ademas uno o mas lfpidos modificados con PEG. En algunas realizaciones, uno o mas lfpidos modificados con PEG comprenden una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lfpido con cadena(s) de alquilo de longitud C6-C20. En algunas realizaciones, un lfpido modificado con PEG es una ceramida derivatizada tal como N-Octanoil-Esfingosina-1-[Succinil(Metoxi Polietilenglicol)-2000]. En algunas realizaciones, un lfpido modificado con PEG o PEGilado es colesterol PEGilado o dimiristoilglicerol (DMG)-PEG-2K.

[0012] En algunas realizaciones, un liposoma adecuado comprende una combinacion seleccionada de cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; o ICE, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K.

[0013] En algunas realizaciones, los lfpidos cationicos (por ejemplo, cKK-E12, C12-200, ICE y/o HGT4003) constituyen aproximadamente el 30-60% (por ejemplo, aproximadamente el 30-55%, aproximadamente el 30-50%, aproximadamente el 30-45%, aproximadamente 30-40%, aproximadamente 35-50%, aproximadamente 35-45%, o aproximadamente 35-40%) de la relacion liposoma por molar. En algunas realizaciones, los lfpidos cationicos (por ejemplo, cKK-E12, C12-200, ICE y/o HGT4003) constituyen aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 55%, o aproximadamente el 60% del liposoma por relacion molar.

[0014] En algunas realizaciones, la relacion de lfpido(s) cationico(s) (por ejemplo, cKK-E12, C12-200, ICE y/o HGT4003) a lfpido(s) no cationico(s) (por ejemplo, DOPE) a base de colesterol los lfpidos(s) (por ejemplo, colesterol) a los lfpidos(s) PEGilados (por ejemplo, DMG-PEG2K) pueden estar entre aproximadamente 30-60: 25-35: 20-30: 1 15, respectivamente. En algunas realizaciones, la relacion de lfpido(s) cationico(s) (por ejemplo, cKK-E12, C12-200, ICE y/o HGT4003) a lfpido(s) no cationico(s) (por ejemplo, DOPE) a lfpido(s) basado(s) en colesterol) (p. ej., colesterol) a lfpido(s) PEGilado(s) (p. ej., DMG-PEG2K) es aproximadamente 40: 30: 20: 10, respectivamente. En algunas realizaciones, la relacion de lfpido(s) cationico(s) (por ejemplo, cKK-E12, C12-200, ICE y/o HGT4003) a lfpido(s) no cationico(s) (por ejemplo, DOPE) a lfpido(s) basado(s) en colesterol (por ejemplo, colesterol) a lfpido(s) PEGilado(s) (por ejemplo, DMG-PEG2K) es aproximadamente 40:30:25:5, respectivamente. En algunas realizaciones, la relacion de lfpido(s) cationico(s) (por ejemplo, cKK-E12, C12-200, ICE y/o HGT4003) a lfpido(s) no cationico(s) (por ejemplo, DOPE) a Upido(s) a base de colesterol (por ejemplo, colesterol) a lfpido(s) PEGilado(s) (por ejemplo, DMG-PEG2K) es aproximadamente 40:32:25:3, respectivamente. En algunas realizaciones, la relacion de lfpido(s) cationico(s) (por ejemplo, cKK-E12, C12-200, ICE y/o HGT4003) a lfpido(s) no cationico(s) (por ejemplo, DOPE) a lfpido(s) basado(s) en colesterol) (p. ej., colesterol) a los lfpidos PEGilados (p. ej., DMG-PEG2K) es aproximadamente 50:25:20:5.

[0015] En algunas realizaciones, el tamano de un liposoma se determina por la longitud del diametro mas grande de la partmula de liposoma. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamano inferior a aproximadamente 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm o 50 nm. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamano inferior a aproximadamente 100 nm, 90 nm, 80 nm, 70 nm o 60 nm.

[0016] En algunas realizaciones, el ARNm se administra a una dosis que vana de aproximadamente 0,1 a 5,0 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, aproximadamente 0,1 a 4,5, 0,1 a 4,0, 0,1 a 3,5, 0,1 a 3,0, 0,1 a 2,5, 0,1 a 2,0, 0,1 a 1,5, 0,1 a 1,0, 0,1 a 0,5, 0,1 a 0,3, 0,3 a 5.0, 0,3 a 4.5, 0,3 a 4.0, 0,3 a 3.5, 0,3 a 3.0, 0,3 a 2,5, 0,3 a 2,0, 0,3 a 1,5, 0,3 a 1,0, 0,3 a 0,5, 0,5 a 5.0, 0,5 a 4.5, 0,5 a 4.0, 0,5 a 3.5, 0,5 a 3.0, 0,5 a 2,5, 0,5 a 2,0, 0,5 a 1,5, o 0,5 a 1,0 mg/kg de peso corporal y se administra una vez a la semana, dos veces a la semana, dos veces al mes, una vez al mes o una vez cada 14 dfas. En algunas realizaciones, el ARNm se administra a una dosis de o menos de aproximadamente 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 mg/kg de peso corporal.

[0017] En algunas realizaciones, la composicion proporcionada se administra por via intravenosa. En algunas realizaciones, la composicion proporcionada se administra por administracion pulmonar. En ciertas realizaciones, el suministro pulmonar se realiza por aerosolizacion, inhalacion, nebulizacion o instilacion. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas se formulan como partmulas respirables, lfpidos nebulizables o polvo seco inhalable.

[0018] En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas se administran una vez al dfa, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas se administran una vez cada 7 dfas, una vez cada 10 dfas, una vez cada 14 dfas, una vez cada 28 dfas o una vez cada 30 dfas.

[0019] En algunas realizaciones, la protema ASS1 se expresa en el Imgado. En algunas realizaciones, la administracion de la composicion proporcionada da como resultado la expresion de un nivel de protema ASS1 igual o superior a aproximadamente 100 ng/mg (por ejemplo, igual o superior a aproximadamente 200 ng/mg, 400 ng/mg, 500 ng/mg, 1000 ng/mg, 2000 ng/mg o 3000 ng/mg) de protema total en el Imgado.

[0020] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado un aumento del nivel de protema ASS1 en suero. En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado un aumento del nivel de protema ASS1 en suero en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces en comparacion con el nivel basal de protema ASS1 serica antes del tratamiento.

[0021] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado un nivel de citrulina reducido en el sujeto en comparacion con el nivel de citrulina de referencia antes del tratamiento. En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado un nivel reducido de citrulina en plasma en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparacion a nivel basal de citrulina plasmatica antes del tratamiento. En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado un nivel reducido de citrulina en plasma a menos de aproximadamente 2.000 pM, 1.500 pM, 1.000 pM, 750 |JM, 500 pM, 250 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, o 30 pM.

[0022] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado un nivel de amoniaco reducido en el sujeto en comparacion con el nivel de amomaco de referencia antes del tratamiento. En algunas realizaciones, la administracion de la composicion proporcionada da como resultado una reduccion de los niveles de amomaco a aproximadamente 3.000 pmol/L o menos, aproximadamente 2750 pmol/L o menos, aproximadamente 2500 pmol/L o menos, aproximadamente 2250 pmol/L o menos, aproximadamente 2000 pmol/L o menos, aproximadamente 1750 pmol/L o menos, aproximadamente 1500 pmol/L o menos, aproximadamente 1250 pmol/L o menos, aproximadamente 1000 pmol/L o menos, aproximadamente 750 pmol/L o menos, aproximadamente 500 pmol/L o menos, alrededor de 250 pmol/L o menos, alrededor de 100 pmol/L o menos, o alrededor de 50 pmol/L o menos en el plasma o suero. En una realizacion particular, la administracion de la composicion proporcionada da como resultado la reduccion de los niveles de amomaco a aproximadamente 50 pmol/L o menos en plasma o suero.

[0023] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion proporcionada da como resultado un nivel reducido de amomaco en una muestra biologica en al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50% al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95% en comparacion con el nivel inicial de amomaco antes del tratamiento. La muestra biologica adecuada puede ser sangre entera, suero, plasma u orina.

[0024] En algunas realizaciones, el ARNm optimizado por codon tiene la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3, la Se Q ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14 o la SEQ iD NO: 15 (correspondiente a secuencias de ARNm de ASS1 humano optimizadas por codon). En algunas realizaciones, el ARNm comprende la secuencia 5' UTR de la SEQ ID NO: 4 (correspondiente a la secuencia 5' UTR X). En algunas realizaciones, el ARNm comprende la secuencia 3' UTR de la SEQ ID NO: 5 (que corresponde a una secuencia Y 3' UTR). En algunas realizaciones, el ARNm comprende la secuencia 3' UTR de la SEQ ID NO: 6 (correspondiente a una secuencia Y 3' UTR). En algunas realizaciones, el ARNm optimizado por codon tiene la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8 (correspondiente a la secuencia del ARNm de ASS1 humano optimizado por codon con las secuencias 5' UTR y 3' UTR).

[0025] En algunas realizaciones, el ARNm comprende uno o mas nucleotidos modificados. En algunas realizaciones, el uno o mas nucleotidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metilo-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metilo adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilina-citidina, C-5 propinilo-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinilo-uridina, C5-propinilo-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxosadinosina O(6)-metilguanina y/o 2-tiocitidina.

[0026] En realizaciones particulares, la presente invencion proporciona una composicion para tratar ASD que comprende un ARNm que codifica sintetasa de argininosuccinato (ASS1) en una cantidad de dosis efectiva encapsulada dentro de un liposoma, en donde el ARNm comprende la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15, y ademas en la que el liposoma comprende lfpidos cationicos o no cationicos, lfpidos a base de colesterol y lfpidos modificados con PEG.

[0027] En realizaciones particulares, la presente invencion proporciona una composicion para tratar ASD que comprende un ARNm que codifica sintetasa de argininosuccinato (ASS1) en una cantidad de dosis efectiva encapsulada dentro de un liposoma, en donde el ARNm comprende la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8 y, ademas, en donde el liposoma comprende lfpidos cationicos o no cationicos, lfpidos a base de colesterol y lfpidos modificados con PEG.

[0028] Otras caractensticas, objetos y ventajas de la presente invencion son evidentes en la descripcion detallada y en los dibujos que siguen. Debe entenderse, sin embargo, que la descripcion detallada y los dibujos, aunque indican realizaciones de la presente invencion, se proporcionan solo a modo de ilustracion, no de limitacion. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS.

[0029] Los dibujos tienen fines ilustrativos, pero no limitativos.

La Figura 1 representa niveles de protema ASS1 ejemplares detectados mediante ELISA despues del tratamiento con nanopartmulas lipfdicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm ASS1 humano a varias dosis.

Las Figuras 2A-2D representan transferencias de Western de ejemplo que comparan los niveles de protema ASS1 humana en el tngado en funcion de la dosis despues de una dosis intravenosa unica de nanopartmulas de lfpidos encapsuladas con ARNm de ASS1 humano. Los ratones CD1 se sacrificaron 24 horas despues de la administracion y los tugados se recolectaron y analizaron como se describe anteriormente. La protema ASS1 humana se detecto utilizando un anticuerpo monoclonal de raton 2H8. Se cargaron 50 microgramos de protema hepatica total en cada pocillo. La protema ASS1 humana recombinante se cargo en cada gel como control positivo (control R5).

La Figura 3 muestra un grafico ejemplar de los niveles de protema de sintetasa de argininosuccinato humana (ASS1) acumulados, medidos a traves de ELISA. La protema detectada fue el resultado de su produccion a partir del ARNm de ASS1 administrado por via intravenosa a traves de una dosis unica de nanopartmulas lipfdicas (1,0 mg/kg de ARNm de ASS1 encapsulado) a lo largo del tiempo.

Las Figuras 4A-4E representan transferencias de Western ejemplares de niveles de protema ASS1 humana en el tngado a lo largo del tiempo despues de una sola dosis intravenosa de nanopartmulas de lfpidos encapsuladas con ARNm de ASS1 humano (dosis de 1,0 mg/kg).

Las Figuras 5A-5I representan la deteccion de ARN mensajero ASS1 humano a traves de hibridacion in situ en los tugados de ratones tratados. El ARNm exogeno es observable durante al menos 7 d^as despues de la administracion despues de una dosis unica (1,0 mg/kg) de nanopartmulas lip^dicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm de ASS1. El ARNm de ASS1 humano es detectable en celulas sinusoidales asf como en hepatocitos.

Las Figuras 6A-6I representan una tincion inmunohistoqmmica ejemplar de los niveles de protema ASS1 en tugado de raton en diversos puntos de tiempo despues de la administracion de 1 mg/kg de ARNm de ASS1 que contiene nanopartmulas lipfdicas cKK-E12. La protema ASS1 humana es detectable en celulas sinusoidales asf como en hepatocitos. La protema ASS1 humana es detectable durante al menos una semana despues de la administracion de una dosis unica de nanopartmulas lipfdicas cargadas con ARNm ASS1.

Las Figuras 7A-7B representan una tincion inmunohistoqmmica de bajo aumento (4x) de los niveles de protema ASS1 en tugado de raton 24 horas despues de la administracion de 1 mg/kg de liposomas cKK-El2 que contienen ARNm ASS1. Una comparacion con el tugado de raton no tratado (izquierda) demuestra la distribucion generalizada de la protema ASS1 humana en todo el tugado.

La Figura 8 representa un grafico ejemplar de los niveles de protema de sintetasa de argininosuccinato humana (ASS1) medidos a traves de ELISA. La protema detectada fue el resultado de su produccion a partir de ARNm ASS1 administrado por via intravenosa a traves de una dosis unica de varias nanopartmulas lipfdicas.

La Figura 9 representa la incorporacion de arginina 14C en protemas despues de la transfeccion del ARNm de ASS1 en una lmea celular ASSl KO (SK (-)) en comparacion con una lmea de celulas de AS1 positiva que expresa establemente (SK (+), clon #5). El control representa celulas SK (-) tratadas con lipofectamina solamente.

La Figura 10 muestra los niveles de protema ASS1 humana en el tugado de rata 24 horas despues de la administracion de nanopartmulas lipfdicas cargadas con ARNm ASS1.

La Figura 11 representa los niveles de amomaco en plasma en ratones knockout para AAS1 a los que se administro 1,0 mg/kg de nanopartmulas lipfdicas cargadas con ARNm ASS1 cada 14 dfas durante 30 dfas.

DEFINICIONES

[0030] Para que la presente invencion se entienda mas facilmente, ciertos terminos se definen primero a continuacion. Las definiciones adicionales para los siguientes terminos y otros terminos se establecen a lo largo de la especificacion.

[0031] Alquilo: como se usa en el presente documento, "alquilo" se refiere a un radical de un grupo hidrocarbonado saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 15 atomos de carbono ("C1-15 alquilo"). En algunas realizaciones, un grupo alquilo tiene 1 a 3 atomos de carbono ("C1-3 alquilo"). Los ejemplos de grupos C1-3 alquilo incluyen metilo (C1), etilo (C2), n-propilo (C3) e isopropilo (C3). En algunas realizaciones, un grupo alquilo tiene 8 a 12 atomos de carbono ("C8-12 alquilo"). Los ejemplos de grupos C8-12 alquilo incluyen, sin limitacion, n-octilo (Cs), nnonilo (C9), n-decilo (C10), n-undecilo (C11), n-dodecilo (C12) y similares. El prefijo "n-" (normal) se refiere a grupos alquilo no ramificados. Por ejemplo, n-Cs alquilo se refiere a -(CH2)7CH3, n-C10 alquilo se refiere a -(CH2)9CH3, etc.

[0032] Aminoacido: como se usa en el presente documento, el termino "aminoacido", en su sentido mas amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que puede incorporarse en una cadena polipeptfdica. En algunas realizaciones, un aminoacido tiene la estructura general H2N-C(H)(R)-COOH. En algunas realizaciones, un aminoacido es un aminoacido natural. En algunas realizaciones, un aminoacido es un aminoacido sintetico; en algunas realizaciones, un aminoacido es un d-aminoacido; en algunas realizaciones, un aminoacido es un I-aminoacido. "Aminoacido estandar" se refiere a cualquiera de los veinte aminoacidos estandar que se encuentran comunmente en los peptidos naturales. "Aminoacido no estandar" se refiere a cualquier aminoacido, distinto de los aminoacidos estandar, independientemente de si se prepara sinteticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en este documento, "aminoacido sintetico" abarca aminoacidos modificados qmmicamente, que incluyen, entre otros, sales, derivados de aminoacidos (como amidas) y/o sustituciones. Los aminoacidos, incluidos los aminoacidos carboxi y/o amino terminales en los peptidos, pueden modificarse por metilacion, amidacion, acetilacion, grupos protectores y/o sustitucion con otros grupos qmmicos que pueden cambiar la vida media circulante del peptido sin afectar adversamente su actividad. Los aminoacidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoacidos pueden comprender una o mas modificaciones postraduccionales, como la asociacion con una o mas entidades qmmicas (por ejemplo, grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, grupos polietilenglicol, grupos lipfdicos, restos de carbohidratos, restos de biotina, etc.). El termino "aminoacido" se usa de manera intercambiable con "residuo de aminoacido", y puede referirse a un aminoacido libre y/o a un residuo de aminoacido de un peptido. Sera evidente a partir del contexto en el que se usa el termino si se refiere a un aminoacido libre o un residuo de un peptido.

[0033] Animal: como se usa en el presente documento, el termino "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a los humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mairnfero (por ejemplo, un roedor, un raton, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamfferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgenico, un animal manipulado geneticamente y/o un clon.

[0034] Aproximadamente o alrededor de: como se usa en el presente documento, el termino "aproximadamente” o “alrededor de", tal como se aplica a uno o mas valores de interes, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el termino "aproximadamente” o “alrededor de" se refiere a un rango de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier direccion (mayor o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o sea evidente en el contexto (excepto cuando dicho numero supere el 100% de un valor posible).

[0035] Biologicamente activo: como se usa en el presente documento, la frase "biologicamente activo" se refiere a una caractenstica de cualquier agente que tenga actividad en un sistema biologico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biologico en ese organismo, se considera biologicamente activo.

[0036] Administracion: como se usa en el presente documento, el termino "administracion" abarca tanto la administracion local como la sistemica. Por ejemplo, el suministro de ARNm abarca situaciones en las que se envfa un ARNm a un tejido diana y la protema codificada se expresa y retiene dentro del tejido diana (tambien conocido como "distribucion local" o "suministro local") y situaciones en las que se envfa un ARNm a un tejido diana y la protema codificada se expresa y se secreta en el sistema de circulacion del paciente (p. ej., suero) y se distribuye de forma sistematica por otros tejidos (tambien conocida como "distribucion sistemica" o "administracion sistemica").

[0037] Expresion: como se usa en el presente documento, "expresion" de una secuencia de acido nucleico se refiere a la traduccion de un ARNm en un polipeptido, ensamblar multiples polipeptidos en una protema intacta (por ejemplo, enzima) y/o modificacion postraduccional de un polipeptido o protema completamente ensamblada (p. ej., enzima). En esta aplicacion, los terminos "expresion" y "produccion", y su equivalente gramatical, se usan indistintamente.

[0038] Funcional: como se usa en este documento, una molecula biologica "funcional" es una molecula biologica en una forma en la que exhibe una propiedad y/o actividad por la cual se caracteriza.

[0039] Vida media: como se usa en el presente documento, el termino "vida media" es el tiempo requerido para que una concentracion o actividad de acido nucleico o protema caiga a la mitad de su valor medido al comienzo de un penodo de tiempo.

[0040] Mejorar, aumentar o reducir: como se usa en este documento, los terminos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores relativos a una medicion de referencia, como una medicion en el mismo individuo antes de iniciar el tratamiento descrito en este documento, o una medicion en un sujeto de control (o sujeto de control multiple) en ausencia del tratamiento descrito en este documento. Un "sujeto de control" es un sujeto que padece la misma forma de enfermedad que el sujeto que esta siendo tratado, que tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto que esta siendo tratado.

[0041] In Vitro: como se usa en este documento, el termino "In Vitro" se refiere a eventos que ocurren en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o vaso de reaccion, en un cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

[0042] In Vivo: como se usa en este documento, el termino "In Vivo" se refiere a eventos que ocurren dentro de un organismo multicelular, como un animal humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en celulas, el termino puede usarse para referirse a eventos que ocurren dentro de una celula viva (en oposicion a, por ejemplo, sistemas In Vitro).

[0043] Aislado: como se usa en este documento, el termino "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o o en un entorno experimental), y/o (2) producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o mas de aproximadamente el 99% de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente el 99%, o mas del 99% de pureza. Como se usa en este documento, una sustancia es "pura" si esta sustancialmente libre de otros componentes. Tal como se usa en el presente documento, el calculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (por ejemplo, tampon, disolvente, agua, etc.).

[0044] Distribucidn o suministro local: como se usa en este documento, los terminos "distribucion local", "suministro local" o equivalente gramatical, se refieren al suministro o distribucion espedficos del tejido. Tfpicamente, la distribucion o administracion local requiere que una protema (por ejemplo, una enzima) codificada por los ARNm se traduzca y exprese de manera intracelular o con una secrecion limitada que evite ingresar al sistema de circulacion del paciente.

ARN mensajero (ARNm): como se usa en este documento, el termino "ARN mensajero (ARNm)" se refiere a un polinucleotido que codifica al menos un polipeptido. El ARNm como se usa en este documento abarca tanto el ARN modificado como el no modificado. El ARNm puede contener una o mas regiones codificantes y no codificantes. El ARNm puede purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando sistemas de expresion recombinantes y opcionalmente purificarse, sintetizarse qmmicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moleculas sintetizadas qmmicamente, el ARNm puede comprender analogos de nucleosidos tales como analogos que tienen bases o azucares modificados qmmicamente, modificaciones del esqueleto, etc. Una secuencia de ARNm se presenta en la direccion 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, un ARNm es o comprende nucleosidos naturales (por ejemplo, adenosina, guanosina, citidina, uridina); analogos de nucleosidos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metilo adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilo-citidina, C-5 propinilo-uridina, 2-aminoadenosina, C5-Bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinilo-uridina, C5-propinilo-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoadenosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases qmmicamente modificadas; bases biologicamente modificadas (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azucares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforididita).

[0045] Acido nucleico: como se usa en el presente documento, el termino "acido nucleico", en su sentido mas amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que es o puede incorporarse en una cadena de polinucleotido. En algunas realizaciones, un acido nucleico es un compuesto y/o sustancia que es o puede incorporarse a una cadena de polinucleotido a traves de un enlace fosfodiester. En algunas realizaciones, "acido nucleico" se refiere a residuos de acido nucleico individuales (por ejemplo, nucleotidos y/o nucleosidos). En algunas realizaciones, "acido nucleico" se refiere a una cadena de polinucleotido que comprende residuos de acido nucleico individuales. En algunas realizaciones, el "acido nucleico" abarca el ARN, asf como el ADN y/o el ADNc de cadena simple y/o de doble cadena.

[0046] Paciente: como se usa en el presente documento, el termino "paciente" o "sujeto" se refiere a cualquier organismo al que se le puede administrar una composicion, por ejemplo, con fines experimentales, de diagnostico, profilacticos, cosmeticos y/o terapeuticos. Los pacientes tfpicos incluyen animales (por ejemplo, mairnferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un humano. Un humano incluye formas pre y post natales.

[0047] Farmaceuticamente aceptable: el termino "farmaceuticamente aceptable" como se usa en el presente documento, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del buen juicio medico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritacion, respuesta alergica u otro problema o complicacion, proporcional a una relacion razonable entre beneficio y riesgo.

[0048] Sal farmaceuticamente aceptable: las sales farmaceuticamente aceptables son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, SM Berge et al., describe sales farmaceuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66: 1-19. Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos de esta invencion incluyen aquellas derivadas de acidos y bases inorganicos y organicos adecuados. Ejemplos de sales de adicion de acido no toxicas, farmaceuticamente aceptables, son sales de un grupo amino formado con acidos inorganicos tales como acido clorlmdrico, acido bromddrico, acido fosforico, acido sulfurico y acido perclorico o con acidos organicos tales como acido acetico, acido oxalico, acido maleico, acido tartarico, acido cftrico, acido succmico o acido rnalonico o utilizando otros metodos utilizados en la tecnica, como el intercambio ionico. Otras sales farmaceuticamente aceptables incluyen adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilo sulfato, malato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, sales de valerato y similares. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinoterreos, amonio y N+(C-m alquilo)4. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinoterreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Otras sales farmaceuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, amonio no toxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados usando contraiones tales como haluro, hidroxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato y arilsulfonato. Otras sales farmaceuticamente aceptables incluyen sales formadas a partir de la cuaternizacion de una amina usando un electrofilo apropiado, por ejemplo, un haluro de alquilo, para formar una sal de amino alquilada cuaternizada.

[0049] Distribucion o administracion sistemica: como se usa en este documento, los terminos "distribucion sistemica", "administracion sistemica" o equivalente gramatical, se refieren a un mecanismo o enfoque de administracion o distribucion que afecta a todo el cuerpo o un organismo completo. Normalmente, la distribucion o el suministro sistemico se realiza a traves del sistema de circulacion del cuerpo, por ejemplo, el torrente sangumeo. En comparacion con la definicion de "distribucion o administracion local".

[0050] Sujeto: tal como se usa en el presente documento, el termino "sujeto" se refiere a un animal humano o no humano (por ejemplo, raton, rata, conejo, perro, gato, ganado, cerdos, ovejas, caballos o primates). Un humano incluye formas pre y post natales. En muchas realizaciones, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, que se refiere a un ser humano que se presenta a un proveedor medico para el diagnostico o tratamiento de una enfermedad. El termino "sujeto" se usa aqm de manera intercambiable con "individual" o "paciente". Un sujeto puede padecer o es susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede o no mostrar smtomas de la enfermedad o trastorno.

[0051] Sustancialmente: tal como se usa en el presente documento, el termino "sustancialmente" se refiere a la condicion cualitativa de exhibir una extension o grado total o casi total de una caractenstica o propiedad de interes. Una persona con experiencia ordinaria en las artes biologicas entendera que los fenomenos biologicos y qmmicos rara vez, o nunca, se completan y/o se completan o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el termino "sustancialmente" se usa en el presente documento para capturar la posible falta de integridad inherente en muchos fenomenos biologicos y qmmicos.

[0052] Tejidos diana: como se usa en el presente documento, el termino "tejidos diana" se refiere a cualquier tejido afectado por una enfermedad a tratar. En algunas realizaciones, los tejidos diana incluyen aquellos tejidos que muestran patologfa, smtoma o caractenstica asociada con la enfermedad.

[0053] Cantidad terapeuticamente eficaz: como se usa en el presente documento, el termino "cantidad terapeuticamente eficaz" de un agente terapeutico significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que sufre o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afeccion, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparicion de los smtomas de la enfermedad, trastorno o afeccion. Los expertos en la tecnica apreciaran que una cantidad terapeuticamente eficaz se administra tfpicamente a traves de un regimen de dosificacion que comprende al menos una dosis unitaria.

[0054] Tratamiento: tal como se usa en el presente documento, el termino "tratar", "tratamiento" o "tratado" se refiere a cualquier metodo utilizado para aliviar, mejorar, aliviar, inhibir, prevenir, retrasar, retrasar la aparicion, reducir la gravedad de forma parcial o total y/o reducir la incidencia de uno o mas smtomas o caractensticas de una enfermedad, trastorno o afeccion en particular. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad y/o muestra solo signos tempranos de la enfermedad con el proposito de disminuir el riesgo de desarrollar patologfa asociada con la enfermedad.

DESCRIPCION DETALLADA

[0055] La presente invencion se refiere a composiciones para tratar la deficiencia de sintetasa de argininosuccinato (ASD) basadas en la terapia de ARNm como se expone en las reivindicaciones. La presente descripcion proporciona metodos para tratar ASD administrando a un sujeto que necesita tratamiento una composicion que comprende un ARNm que codifica sintetasa de argininosuccinato (ASS) a una dosis efectiva y un intervalo de administracion tal que al menos un smtoma o caractenstica de ASD se reduce en intensidad, severidad, o frecuencia o retraso en el inicio. En algunos aspectos de la invencion, el ARNm esta encapsulado dentro de uno o mas liposomas. Como se usa en el presente documento, el termino "liposoma" se refiere a cualquier vesmula de nanopartmulas laminares, multilamelares o solidas. Tfpicamente, un liposoma como se usa en el presente documento puede formarse mezclando uno o mas lfpidos o mezclando uno o mas lfpidos y polfmeros. Por lo tanto, el termino "liposoma", como se usa en este documento, abarca nanopartmulas basadas tanto en lfpidos como en polfmeros. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado para la presente invencion contiene lfpido(s) cationico(s) o no cationico(s), lfpidos(s) basado(s) en colesterol y lfpidos modificados con PEG.

Deficiencia de sintetasa de argininosuccinato (ASD)

[0056] La composicion de la presente invencion se usa para tratar a un sujeto que padece o es susceptible a la deficiencia de sintetasa de argininosuccinato (ASD). La ASD es un trastorno genetico metabolico autosomico recesivo caracterizado por una mutacion en el gen de la enzima de sintetasa de argininosuccinato (ASS1). Se han identificado al menos 50 mutaciones que causan ASD de tipo I en el gen ASS1. La mayona de estas mutaciones involucran sustituciones de aminoacidos individuales. Muchas de las mutaciones en el gen ASS1 probablemente afectan la estructura de la protema resultante y su capacidad para unirse a la citrulina, el aspartato y otras moleculas. Algunas de las mutaciones en el gen ASS1 conducen a la produccion de una version anormalmente corta de la enzima que no puede desempenar efectivamente su papel en el ciclo de la urea.

[0057] Los defectos en la protema ASS1 interrumpen el ciclo de la urea e impiden que el Imgado procese adecuadamente el exceso de nitrogeno, que se genera cuando la protema se utiliza para obtener energfa, en urea. Una acumulacion de amomaco y otros subproductos del ciclo de la urea (como la citrulina) es toxica y, cuando se produce durante los primeros dfas de vida, puede provocar smtomas como falta de energfa (letargo), mala alimentacion, vomitos, convulsiones y perdida de conciencia. Estos problemas medicos pueden ser potencialmente mortales en muchos casos.

[0058] Las composiciones y los metodos descritos en el presente documento pueden usarse para tratar al menos un smtoma o caractenstica de la ASD.

Sintetasa de argininosuccinato (ASS1)

[0059] La presente invencion proporciona composiciones para administrar ARNm que codifica ASS1 a un sujeto para el tratamiento de la deficiencia de sintetasa de argininosuccinato (ASD). Un ARNm de ASS1 adecuado codifica cualquier fragmento, porcion o longitud completa de una protema ASS1 que pueda sustituirse por la actividad de la protema ASS1 que se produce naturalmente y/o reduce la intensidad, la gravedad y/o la frecuencia de uno o mas smtomas asociados con el ASD.

[0060] La secuencia de ARNm de ASS1 humano natural y la secuencia de aminoacidos correspondiente se muestran en la Tabla 1:

Tabla 1. ASS1 humano

[0061] En algunas realizaciones, un ARNm adecuado puede ser una secuencia de hASSI optimizada por codones, tal como la secuencia que se muestra a continuacion:

[0062] Se describen secuencias de ARNm ejemplares adicionales en la seccion de Ejemplos a continuacion, por ejemplo, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, ambas incluyen regiones no traducidas 5' y 3' que enmarcan un ARNm codificado en ASS1 optimizado por codones.

[0063] En algunas realizaciones, una secuencia de ARNm adecuada puede ser una secuencia de ARNm, un homologo o un analogo de la protema ASS1 humana. Por ejemplo, un homologo o un analogo de la protema ASS1 humana puede ser una protema ASS1 humana modificada que contiene una o mas sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoacidos, en comparacion con una protema ASS1 humana de tipo silvestre o natural, mientras que se mantiene actividad de la protema ASS1 sustancial. Un ARNm adecuado para la presente invencion codifica una protema sustancialmente identica a la protema ASS1 humana. Un ARNm adecuado para la presente invencion codifica una secuencia de aminoacidos al menos 99% o mas identica a la SEQ ID NO: 2. Un ARNm adecuado para la presente invencion tiene una secuencia de nucleotidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas identico a la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.

[0064] En algunas realizaciones, un ARNm adecuado codifica una protema de fusion que comprende una protema ASS1 de longitud completa fusionada con otra protema (por ejemplo, una fusion N o C terminal). En algunas realizaciones, la protema fusionada al ARNm que codifica una longitud completa, fragmento o porcion de una protema ASS1 codifica una senal o una secuencia de direccionamiento celular.

Vehculos de administracion

[0065] Segun la presente invencion, el ARNm que codifica una protema ASS1 como se describe en el presente documento puede administrarse como ARN desnudo (sin empaquetar) o mediante vehmulos de administracion. Como se usa en el presente documento, los terminos "vehmulo de administracion", "vehmulo de transferencia", "nanopartmula" o equivalente gramatical, se usan de manera intercambiable.

[0066] En algunas realizaciones, los ARNm que codifican una protema ASS1 pueden administrarse a traves de un unico vehmulo de administracion. En algunas realizaciones, los ARNm que codifican una protema ASS1 pueden administrarse a traves de uno o mas vehmulos de administracion, cada uno de ellos de una composicion diferente. Segun diversas formas de realizacion, los vehmulos de administracion adecuados incluyen, entre otros, vehmulos basados en polfmeros, como polietilenimina (PEI), nanopartmulas lipfdicas y liposomas, nanoliposomas, nanoliposomas que contienen ceramidas, proteoliposomas, exosomas naturales y derivados sinteticamente, cuerpos laminares sinteticos y semisinteticos, nanopartmulas, nanopartmulas de silicato de fosforo calcico, nanopartmulas de fosfato de calcio, nanopartmulas de dioxido de silicio, partmulas nanocristalinas, nanopartmulas de semiconductores, sistemas de distribucion basados en almidon, micelulas, emulsiones, niosomas, pohmeros de bloque multi-dominio (pohmeros de vinilo, pohmeros de acido polipropilo acnlico, policonjugados dinamicos), formulaciones en polvo seco, plasmidos, virus, nucleotidos de fosfato de calcio, aptameros, peptidos y otras etiquetas vectoriales.

Vehculos de entrega liposomal.

[0067] En algunas realizaciones, un vehmulo de suministro adecuado es un vehmulo de suministro liposomal, por ejemplo, una nanopartfcula lipfdica. Como se usa en el presente documento, los vetnculos de administracion liposomal, por ejemplo, nanopartfculas lip^dicas, se caracterizan generalmente como vesfculas microscopicas que tienen un espacio acuatico interior secuestrado de un medio exterior por una membrana de una o mas bicapas. Las membranas de dos capas de los liposomas estan formadas tfpicamente por moleculas anfifflicas, como los lfpidos de origen sintetico o natural que comprenden dominios hidrofilos e hidrofobos separados espacialmente (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). Las membranas de dos capas de los liposomas tambien pueden formarse por polfmeros anfofflicos y surfactantes (por ejemplo, polimerosomas, niosomas, etc.). En el contexto de la presente invencion, un vehfculo de administracion liposomal sirve tipicamente para transportar un ARNm deseado a una celula o tejido diana.

Lipidos cationicos

[0068] En algunas realizaciones, los liposomas pueden comprender uno o mas lfpidos cationicos. Como se usa en este documento, la frase "lfpido cationico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lfpidos que tienen una carga neta positiva a un pH seleccionado, como el pH fisiologico. Varios lfpidos cationicos han sido descritos en la literatura, muchos de los cuales estan disponibles comercialmente. Los lfpidos cationicos particularmente adecuados para uso en las composiciones de la invencion incluyen los descritos en las publicaciones de patentes internacionales WO 2010/053572 (y en particular, C-I 2-200 descritas en el parrafo [00225]) y WO 2012/170930. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invencion emplean nanopartfculas lipfdicas que comprenden un lfpido cationico ionizable descrito en la solicitud de patente provisional de EE.UU. 61/617.468, presentada el 29 de marzo de 2012, tal como, por ejemplo, (15Z, 18Z)-N,N-dimetilo-6-(9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-I-ilo)tetracosa-15,18-dien-1-amina (HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N-dimetilo-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-ilo)tetracosa-4,15,18-trien-1-amina (HGT5001) y (15Z, 18Z)-N,N-dimetilo-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-ilo)tetracosa-5, 15, 18-trien-1-amina (HGT5002).

[0069] En algunas realizaciones, los liposomas proporcionados incluyen un lfpido cationico descrito en el documento WO 2013063468 y en la solicitud provisional de EE.UU. titulada "Lipid Formulations for Delivery of Messernger RNA" presentadas simultaneamente con la presente solicitud en la misma fecha.

[0070] En algunas realizaciones, un lfpido cationico comprende un compuesto de formula I-c1-a:

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde:

cada R2 es independientemente hidrogeno o C1-3 alquilo;

cada q independientemente es de 2 a 6;

cada R' es independientemente hidrogeno o C1-3 alquilo; y

cada RL es independientemente C8-12 alquilo.

[0071] En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrogeno, metilo o etilo. En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrogeno o metilo. En algunas realizaciones, cada R2 es hidrogeno.

[0072] En algunas realizaciones, cada q independientemente es de 3 a 6. En algunas realizaciones, cada q independientemente es de 3 a 5. En algunas realizaciones, cada q es 4.

[0073] En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrogeno, metilo o etilo. En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrogeno o metilo. En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrogeno.

[0074] En algunas realizaciones, cada RL es independientemente C8-12 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-C8-12 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente C9-11 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-C9-11 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente C10 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-C10 alquilo.

[0075] En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrogeno o metilo; cada q independientemente es de 3 a 5; cada R' es independientemente hidrogeno o metilo; y cada RL es independientemente C8-12 alquilo.

[0076] En algunas realizaciones, cada R2 es hidrogeno; cada q independientemente es de 3 a 5; cada R' es hidrogeno; y cada RL es independientemente C8-12 alquilo.

[0077] En algunas realizaciones, cada R2 es hidrogeno; cada q es 4; cada R' es hidrogeno; y cada RL es independientemente C8-12 alquilo.

[0078] En algunas realizaciones, un lfpido cationico comprende un compuesto de formula I-g:

o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde cada RL es independientemente C8-12 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-C8-12 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente C9-11 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-C9-11 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente C10 alquilo. En algunas realizaciones, cada RL es n-C10 alquilo.

[0079] En realizaciones particulares, los liposomas proporcionados incluyen un lfpido cationico cKK-E12, o (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxi-dodecilo)amino)butilo)piperazina-2,5-diona). La estructura de cKK-E12 se muestra a continuacion:

[0080] En algunas realizaciones, uno o mas lfpidos cationicos pueden ser cloruro de N-[I-(2,3-dioleiloxi)propilo]-N,N,N-trimetilamonio o "DOTMA". (Feigner et al. (Proc. Nat'I Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Patente de EE.UU. N° 4.897.355). DOTMA puede formularse solo o puede combinarse con el lfpido neutro, dioleoilfosfatidilo-etanolamina o "DOPE" u otros Ifpidos cationicos o no cationicos en un vehnculo de transferencia liposomal o una nanopartfcula lip^dica, y tales liposomas se pueden usar para mejorar el suministro de acidos nucleicos a las celulas diana. Otros lfpidos cationicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5-carboxispermilglicinioctadecilamida o "DOGS", 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina-carboxamido)etilo]-N,N-dimetilo-I-propanaminio o "DOSPA" (Behr y otros, Proc. Nat.'I. Acad. Sci. 86, 6982 (1989); Patente de EE.UU. N° 5.171.678; Patente de EE.UU. N° 5.334.761), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio-Propano o "DODAP", 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano o "DOTAP".

[0081] Los Kpidos cationicos ejemplares adicionales tambien incluyen I,2-diesteariloxi-N,N-dimetilo-3-aminopropano o "DSDMA", 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetilo-3-aminopropano o "DODMA", 1, 2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilo-3-aminopropano o "DLinDMA", I,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilo-3-aminopropano o "DLenDMA", cloruro de N-dioleil-N,N-dimetilamonio o "DODAC", bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilarnrnonio o "DDAB", bromuro de amonio de N-(I,2-dimiristiloxiprop-3-ilo)-N,N-dimetilo-N-hidroxietil o "DMRIE”, 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-I-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o “CLinDMA”, 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetilo M-(cis,cis-9', I-2'-octadecadienoxi)propano o "CpLinDMA", N,N-dimetilo-3,4-dioliloxibencilamina o "DMOBA", 1, 2-N,N'-dioleilcarbamilo-3-dimetilaminopropano o "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o "DLinDAP"“, I,2-N,N'-Dilinoleylcarbamilo-3-dimetilaminopropano o “DLincarbDAP”, I,2-Dilinoleoilcarbamilo-3-dimetilaminopropano o "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometilo-[1,3]-dioxolano o "DLinDMA", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[I,3]-dioxolano o "DLin-K-XTC2-DMA", y 2-(2,2-di((9Z, 12Z)-octadeca-9,1 2-dien-1-ilo)-I, 3-dioxolan-4-ilo)-N,N-dimetiletanamina (DLin-KC2-DMA)) (Ver, WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)), o mezclas de los mismos. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., Et al., Nat. Biotechnol. 23 (8): 1003-1007 (2005); Publicacion PCT WO2005/121348A1). En algunas realizaciones, uno o mas de los lfpidos cationicos comprenden al menos uno de un resto imidazol, dialquilamino o guanidinio.

[0082] En algunas realizaciones, uno o mas lfpidos cationicos se pueden elegir entre XTC (2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminatil-[1,3]-dioxolano), MC3 (((6Z, 9Z, 28Z, 31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il4-(dimetilamino)butanoato), Al Ny -100 ((3aR, 5s, 6aS)-N,N-dimetilo-2,2-di((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienilo)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina)), NC98-5 (4,7.13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propilo)-N1,N16-diundecilo-4,7.10,13-tetraazahexadecano-1,16-diamida), DODa P (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), HGT4003 (WO 2012/170889), ICE (WO 2011/068810), HGT5000 (Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 61/617.468) o HGT5001 (cis o trans) (Solicitud de Patente Provisional N° 61/617.468), lipidoides de aminoalcohol como los descritos en el documento WO2010/053572, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetil-amonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenilo-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K; MacLachlan, I. "Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids" J. Contr. Rel. 2005, 107. 276-287), DLin-KC2-DMA (Semple, SC et al. "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery" Nature Biotech. 2010, 28, 172 176), C12-200 (Love, KT et al. "Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing" PNAS 2010, 107. 1864-1869).

[0083] En algunas realizaciones, el porcentaje de lfpido cationico en un liposoma puede ser mayor que 10%, mayor que 20%, mayor que 30%, mayor que 40%, mayor que 50%, mayor que 60% o mayor que 70%. En algunas realizaciones, los lfpidos cationicos constituyen uno o mas 30-50% (por ejemplo, aproximadamente 30-45%, aproximadamente 30-40%, aproximadamente 35-50%, aproximadamente 35-45% o aproximadamente 35-40%) del liposoma en peso. En algunas realizaciones, el lfpido cationico (por ejemplo, cKK-E12) constituye aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, o aproximadamente el 50% de la relacion liposomica por molar.

Lipidos no cationicos/auxiliares

[0084] En algunas realizaciones, los liposomas proporcionados contienen uno o mas lfpidos no cationicos ("auxiliares"). Como se usa en el presente documento, la frase "lfpido no cationico" se refiere a cualquier lfpido neutro, zwitterionico o anionico. Como se usa en el presente documento, la frase "lfpido anionico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lfpidos que llevan una carga neta negativa en un H seleccionado, como el pH fisiologico. Lfpidos no cationicos incluyen, pero no se limitan a, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), dioleoilfosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-I-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidilo etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoilfosfatidilo-etanolamina (DSPE), 16-O-monometilo PE, 18-1-trans-PE, I-estearoil-2-oleoilfosfatidietanolamina (SOPE), o una mezcla de los mismos.

[0085] En algunas realizaciones, tales lfpidos no cationicos se pueden usar solos, pero se usan preferiblemente en combinacion con otros excipientes, por ejemplo, lfpidos cationicos. En algunas realizaciones, el lfpido no cationico puede comprender una relacion molar de aproximadamente 5% a aproximadamente 90%, o aproximadamente 10% a aproximadamente 70% del lfpido total presente en un liposoma. En algunas realizaciones, un lfpido no cationico es un lfpido neutro, es decir, un lfpido que no lleva una carga neta en las condiciones en las que se formula y/o administra la composicion. En algunas realizaciones, el porcentaje de lfpido no cationico en un liposoma puede ser mayor que 5%, mayor que 10%, mayor que 20%, mayor que 30% o mayor que 40%.

Lipidos a base de colesterol

[0086] En algunas realizaciones, los liposomas proporcionados comprenden uno o mas lipidos basados en colesterol. Por ejemplo, los lfpidos cationicos adecuados basados en colesterol incluyen, por ejemplo, DC-Choi (N,N-dimetilo-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propilo)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); Patente de EE.UU. N° 5.744.335), o ICE. En algunas realizaciones, el lfpido a base de colesterol puede comprender una racion molar de aproximadamente 2% a aproximadamente 30%, o aproximadamente 5% a aproximadamente 20% del lfpido total presente en un liposoma. En algunas realizaciones, el porcentaje de lfpidos a base de colesterol en la nanopartfcula lipfdica puede ser mayor que 5,%, 10%, mayor que 20%, mayor que 30% o mayor que 40%.

Lipidos PEGilados

[0087] En algunas realizaciones, los liposomas proporcionados comprenden uno o mas lipidos PEGilados. Por ejemplo, el uso de fosfolfpidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lipidos derivados como ceramidas derivatizadas (PEG-CER), que incluyen N-Octanoil-Esfingosina-I-[Succinilo(Metoxi Polietilenglicol)-2000] (C8 PEG-2000 Ceramida) tambien esta contemplado por la presente invencion en combinacion con uno o mas de los cationicos y, en algunas realizaciones, otros lipidos juntos que comprenden el liposoma. Los lipidos modificados con PEG contemplados incluyen, pero no se limitan a, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lfpido con cadena(s) de alquilo de longitud C6-C20. En algunas realizaciones, un lfpido modificado con PEG o PEGilado es colesterol PEGilado o PEG-2K. La adicion de dichos componentes puede prevenir la agregacion compleja y tambien puede proporcionar un medio para aumentar la vida util de la circulacion y aumentar el suministro de la composicion de lfpido-acido nucleico a la celula diana, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), o pueden seleccionarse para intercambiar rapidamente fuera de la formulacion In Vivo (ver la patente estadounidense n.° 5.885.613).

[0088] En algunas realizaciones, los lipidos intercambiables particularmente utiles son PEG-ceramidas que tienen cadenas de acilo mas cortas (por ejemplo, C14 o C-is). El fosfolfpido modificado con PEG y los lipidos derivados para uso con la presente invencion pueden comprender una relacion molar de aproximadamente 0% a aproximadamente 15%, aproximadamente 0,5% a aproximadamente 15%, aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, aproximadamente 4% a aproximadamente 10%, o aproximadamente el 2% del total de lipidos presentes en el liposoma.

[0089] De acuerdo con diversas realizaciones, la seleccion de lipidos cationicos, lipidos no cationicos y/o lipidos modificados con PEG que comprenden la nanopartfcula lipfdica, asf como la relacion molar relativa de tales lipidos entre sf, se basa en las caractensticas de los lipidos seleccionados, la naturaleza de las celulas diana deseadas, las caractensticas del ARNm que se administrara. Las consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturacion de la cadena de alquilo, asf como el tamano, carga, pH, pKa, fusogenicidad y toxicidad de los lipidos seleccionados. Por lo tanto, las relaciones molares se pueden ajustar en consecuencia

Polimeros

[0090] En algunas realizaciones, un vehfculo de suministro adecuado se formula usando un polfmero como vehfculo, solo o en combinacion con otros vehfculos que incluyen diversos lipidos descritos en el presente documento. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los vehfculos de administracion liposomal, como se usan en el presente documento, tambien abarcan nanopartfculas que contienen polfmeros. Los polfmeros adecuados pueden incluir, por ejemplo, poliacrilatos, polialquialcanoacrilatos, polilactida, copolfmeros de polilactida-poliglicolida, policaprolactonas, dextrano, albumina, gelatina, alginato, colageno, quitosano, ciclodextrinas, protamina, protamina PEGilada, PLL, PLL PEGilada y polietilenimina (PEI). Cuando PEI esta presente, puede ser PEI ramificado de un peso molecular que vana de 10 a 40 kDa, por ejemplo, PEI ramificado de 25 kDa (Sigma # 408727).

[0091] Un liposoma adecuado para la presente invencion puede incluir uno o mas de cualquiera de los lipidos cationicos, lipidos no cationicos, lipidos de colesterol, lipidos PEGilados y/o polfmeros descritos en el presente documento en diversas proporciones. Como ejemplos no limitantes, una formulacion de liposoma adecuada puede incluir una combinacion seleccionada de cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; o ICE, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K.

[0092] En diversas realizaciones, los lipidos cationicos (por ejemplo, cKK-E12, C12-200, ICE y/o HGT4003) constituyen aproximadamente el 30-60% (por ejemplo, aproximadamente el 30-55%, aproximadamente el 30-50%, aproximadamente el 30-45%, aproximadamente 30-40%, aproximadamente 35-50%, aproximadamente 35-45%, o aproximadamente 35-40%) de la relacion liposoma por molar. En algunas realizaciones, el porcentaje de lipidos cationicos (por ejemplo, cKK-E12, C12-200, ICE y/o HGT4003) es o es mayor que aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 55%, o aproximadamente el 60% de la relacion liposoma por molar.

[0093] En algunas realizaciones, la relacion de lfpido(s) cationico(s) a lfpido(s) no cationico(s) a lfpido(s) a base de colesterol a lfpido(s) PEGilado(s) puede estar entre aproximadamente 30-60: 25-35: 20-30: 1-15, respectivamente. En algunas realizaciones, la relacion de Kpido(s) cationico(s) a Kpido(s) no cationico(s) a lfpido(s) a base de colesterol a lfpido(s) PEGilado(s) es de aproximadamente 40:30:20:10, respectivamente. En algunas realizaciones, la proporcion de lfpido(s) cationico(s) a Kpido(s) no cationico(s) a Kpido(s) a base de colesterol a lfpido(s) PEGilado(s) es de aproximadamente 40:30:25:5, respectivamente. En algunas realizaciones, la proporcion de lfpido(s) cationico(s) a lfpido(s) no cationico(s) a Kpido(s) a base de colesterol a lfpido(s) PEGilado(s) es de aproximadamente 40:32:25:3, respectivamente. En algunas realizaciones, la relacion de lfpido(s) cationico(s) a lfpido(s) no cationico(s) a Upido(s) a base de colesterol a lfpido(s) PEGilado(s) es de aproximadamente 50:25:20:5.

S^ntesis de ARNm

[0094] Los ARNm de acuerdo con la presente invencion se pueden sintetizar de acuerdo con cualquiera de una variedad de metodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm de acuerdo con la presente invencion pueden sintetizarse mediante transcripcion In Vitro (TIV). En resumen, la TIV se realiza tfpicamente con una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor, un conjunto de trifosfatos de ribonucleotido, un sistema de tampon que puede incluir DTT e iones de magnesio, y una polimerasa de ARN apropiada (por ejemplo, polimerasa de ARN T3, T7 o SP6), ADNasa I, pirofosfatasa e/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variaran segun la aplicacion espedfica.

[0095] En algunas realizaciones, para la preparacion de ARNm de acuerdo con la invencion, una plantilla de ADN se transcribe In Vitro. Una plantilla de ADN adecuada tiene tfpicamente un promotor, por ejemplo un promotor T3, T7 o SP6, para la transcripcion In Vitro, seguido por la secuencia de nucleotidos deseada para el ARNm deseado y una senal de terminacion.

[0096] La secuencia o secuencias de ARNm deseadas de acuerdo con la invencion pueden determinarse e incorporarse en una plantilla de ADN utilizando metodos estandar. Por ejemplo, a partir de una secuencia de aminoacidos deseada (por ejemplo, una secuencia de enzima), se realiza una traduccion inversa virtual basada en el codigo genetico degenerado. Los algoritmos de optimizacion se pueden usar para seleccionar los codones adecuados. Por lo general, el contenido de G/C se puede optimizar para lograr el contenido de G/C mas alto posible, por un lado, teniendo en cuenta de la mejor manera posible la frecuencia de los ARNt de acuerdo con el uso del codon por otro lado. La secuencia de ARN optimizada puede establecerse y mostrarse, por ejemplo, con la ayuda de un dispositivo de visualizacion adecuado y compararse con la secuencia original (tipo salvaje). Tambien se puede analizar una estructura secundaria para calcular las propiedades de estabilizacion y desestabilizacion o, respectivamente, las regiones del ARN.

ARNm modificado

[0097] En algunas realizaciones, el ARNm de acuerdo con la presente invencion se puede sintetizar como un ARNm sin modificar o modificado. Normalmente, los ARNm se modifican para mejorar la estabilidad. Las modificaciones del ARNm pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleotidos del ARN. Un ARNm modificado de acuerdo con la invencion puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la estructura principal, modificaciones de azucar o modificaciones de bases. En algunas realizaciones, los ARNm pueden sintetizarse a partir de nucleotidos naturales y/o analogos de nucleotidos (nucleotidos modificados) que incluyen, entre otros, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U), y como analogos de nucleotidos modificados o derivados de purinas y pirimidinas, como por ejemplo 1-metilo-adenina, 2-metilo-adenina, 2-metiltio-N6-isopendenilo-adenina, N6-metiloadenina, N6-isopentenilo-adenina, 2-tio-citosina, 3-metilo-citosina, 4-acetilo-citosina, 5-metilo-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metilo-guanina, 2-metilo-guanina, 2,2-dimetilo-guanina, 7-metilo-guanina, inosina, 1-metilo-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometilo-2-tio-uracilo, 5-(carboxihidroximetilo)-uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometilo-uracilo, 5-metilo-2-tiouracilo, 5-metilo-uracilo, metilo ester del acido N-uracil-5-oxiacetico, 5-metilaminometilo-uracilo, 5-metoxiaminometilo-2-tio-uracilo, 5'-metoxicarbonilmetilo-uracilo, 5-metoxi-uracilo, metilo ester del acido uracilo-5-oxiacetico, acido uracilo-5-oxiacetico (v), 1-metilo-pseudouracilo, queosina, p-D-manosilo-queosina, wybutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleotidos peptfdicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparacion de tales analogos es conocida por un experto en la tecnica, por ejemplo, de la patente de EE.UU. N° 4.373.071, Patente de EE.UU. N° 4.401.796, Patente de EE.UU. N° 4.415.732, Patente de EE.UU. N° 4.458.066, Patente de EE.UU. N° 4.500.707. Patente de EE.UU. N° 4.668.777. Patente de EE.UU. N° 4.973.679, Patente de EE.UU. N° 5.047.524, Patente de EE.UU. N° 5.132.418, Patente de EE.UU. N° 5.153.319, Patente de EE.UU. Nos 5.262.530 y 5.700.642.

[0098] En algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, los ARNm que codifican ASS1) pueden contener modificaciones de la cadena principal de ARN. Tfpicamente, una modificacion del esqueleto es una modificacion en la que los fosfatos del esqueleto de los nucleotidos contenidos en el ARN se modifican qmmicamente. Las modificaciones de la columna vertebral a modo de ejemplo tfpicamente incluyen, pero no se limitan a, modificaciones del grupo que consiste en metilfosfonatos, metilfosforamidatos, fosforamidatos, fosforotioactivos (por ejemplo, citidina 5'-O-(1-tiofosfato), boranofosfatos, grupos guanidinio cargados positivamente etc., lo que significa reemplazar el enlace fosfodiester por otros grupos anionicos, cationicos o neutros.

[0099] En algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, los ARNm que codifican ASS1) pueden contener modificaciones de azucar. Una modificacion tipica del azucar es una modificacion qmmica del azucar de los nucleotidos que contiene, incluidas, entre otras, modificaciones del azucar elegidas del grupo que consiste en 2'-desoxi-2'-fluoro-oligorribonucleotido (2'-fluoro-2'-deoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-fluoro-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-deoxi-2'-deamina-oligorribonucleotido (2'-amino-2'-deoxicicididina 5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-O-alquiloligoribonucleotido, 2'-desoxi-2'-C-alquilol-goribonucleotido (2'-O-metilcitidina 5'-trifosfato, 2'-metiluridina 5'-trifosfato), 2'-C-alquiloligoribonucleotido y sus isomeros (2'-aracitidina 5'-trifosfato, 2'-arauridina 5'-trifosfato), o azidotrifosfatos (2'-azido-2'-deoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato).

[0100] En algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, los ARNm que codifican ASS1) pueden contener modificaciones de las bases de nucleotidos (modificaciones de la base). Un nucleotido modificado que contiene una modificacion de base tambien se denomina nucleotido modificado de base. Los ejemplos de dichos nucleotidos modificados con bases incluyen, pero no se limitan a, 2-amino-6-cloropurina ribosido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2-tiouridina 5'-trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5-yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina 5'-trifosfato, 6-cloropurina ribosido 5'-trifosfato, 7-deazaadenosina 5'-trifosfato, 7-deazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, benzimidazole ribosido 5'-trifosfato, Nl-metiladenosina 5'-trifosfato, Nl-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'-trifosfato o xantosina 5'-trifosfato.

[0101] Tfpicamente, la smtesis de ARNm incluye la adicion de una "tapa" en el extremo N-terminal (5'), y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). La presencia de la tapa es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayona de las celulas eucarioticas. La presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradacion de la exonucleasa.

[0102] De este modo, en algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, los ARNm que codifican ASS1) incluyen una estructura de tapa 5'. Una tapa 5' se agrega tipicamente de la siguiente manera: primero, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleotido 5', dejando dos fosfatos terminales; El trifosfato de guanosina (GTP) se agrega luego a los fosfatos terminales a traves de una transferasa de guanililo, produciendo un enlace 5'5'5 trifosfato; y el 7-nitrogeno de la guanina se metila luego por una metiltransferasa. Los ejemplos de estructuras de tapa incluyen, pero no se limitan a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

[0103] En algunas realizaciones, los ARNm (por ejemplo, los ARNm que codifican ASS1) incluyen una estructura de cola poli(A) 3'. Una cola poli-A en el extremo 3' del ARNm generalmente incluye aproximadamente 10 a 300 nucleotidos de adenosina (SEQ ID NO: 9) (por ejemplo, aproximadamente 10 a 200 nucleotidos de adenosina, aproximadamente 10 a 150 nucleotidos de adenosina, aproximadamente 10 a 100 nucleotidos de adenosina, aproximadamente 20 a 70 nucleotidos de adenosina, o aproximadamente 20 a 60 nucleotidos de adenosina). En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de cola poli(C) 3'. Una cola poli-C adecuada en el extremo 3' del ARNm incluye tpicamente de aproximadamente 10 a 200 nucleotidos de citosina (SEQ ID NO: 10) (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 150 nucleotidos de citosina, de aproximadamente 10 a 100 nucleotidos de citosina, de 20 a 70 citosina) nucleotidos, aproximadamente 20 a 60 nucleotidos de citosina, o aproximadamente 10 a 40 nucleotidos de citosina). La cola de poli-C se puede agregar a la cola de poli-A o puede sustituir a la cola de poli-A.

[0104] En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una region no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una region 5' no traducida incluye uno o mas elementos que afectan la estabilidad o traduccion de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una region no traducida 5' puede tener una longitud de aproximadamente 50 a 500 nucleotidos.

[0105] En algunas realizaciones, una region 3' no traducida incluye una o mas de una senal de poliadenilacion, un sitio de union para protemas que afectan la estabilidad de la ubicacion de un ARNm en una celula, o uno o mas sitios de union para los ARNmi. En algunas realizaciones, una region 3' no traducida puede tener una longitud de entre 50 y 500 nucleotidos o mas.

Estructura de tapa

[0106] En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de tapa 5'. Una tapa 5' se agrega tfpicamente de la siguiente manera: primero, una ARN fosfatasa terminal elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleotido 5, dejando dos fosfatos terminales; el trifosfato de guanosina (GTP) se agrega luego a los fosfatos terminales a traves de una transferasa de guanililo, produciendo un enlace 5'5'5 trifosfato; y el 7-nitrogeno de la guanina se metila luego por una metiltransferasa. Los ejemplos de estructuras de tapa incluyen, pero no se limitan a, m7G(5')ppp (5'(A, G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

[0107] Las estructuras de los tapa naturales comprenden una 7-metilguanosina que esta unida mediante un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleotido transcrito, lo que da como resultado una tapa de dinucleotido de m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleosido. In Vivo, la tapa se anade enzimaticamente. La tapa se agrega en el nucleo y es catalizada por la enzima transferasa de guanililo. La adicion de la tapa al extremo 5' terminal del ARN se produce inmediatamente despues del inicio de la transcripcion. El nucleosido terminal es tipicamente una guanosina, y esta en la orientacion inversa a todos los otros nucleotidos, es decir, G(5')ppp(5')GpNpNp.

[0108] Una tapa comun para el ARNm producido por transcripcion In Vitro es m7G(5')ppp(5')G, que se ha usado como la tapa dinucleotido en la transcripcion con polimerasa de ARN T7 o SP6 In Vitro para obtener ARN que tienen una estructura de tapa en sus 5'-terminales. El metodo predominante para la smtesis In Vitro de ARNm bloqueado emplea un dinucleotido preformado de la forma m7G(5')ppp(5')G ("m⁷GpppG") como iniciador de la transcripcion.

[0109] Hasta la fecha, una forma habitual de una tapa de dinucleotido sintetico usado en experimentos de traduccion In Vitro es el analogo de tapa anti-inverso ("ARCA") o ARCA modificado, que generalmente es un analogo de tapa modificado en el que el grupo OH 2' o 3 se sustituye por -OCH3.

[0110] Los analogos de tapa adicionales incluyen, pero no se limitan a, estructuras qmmicas seleccionadas del grupo que consiste en m⁷GpppG, m⁷GpppA, m⁷GpppC; analogos de tapa no metilados (por ejemplo, GpppG); analogo de tapa dimetilada (por ejemplo, m²⁷GpppG), analogo de tapa trimetilada (por ejemplo, m²²⁷GpppG), analogos de tapa simetricos dimetilados (por ejemplo, m⁷Gpppm⁷G), o analogos de tapa inversa (por ejemplo, ARCA; m72OmeGpppG, m72'dGpppG, m73OmeGpppG, m73'dGpppG y sus derivados de tetrafosfato) (ver, por ejemplo, Jemielity, J. et al., "Nuevos analogos de tapa" anti-inversos "Novel 'anti-reverse' cap analogs with superior translational properties", RNA, 9: 1108-1122 (2003)).

[0111] En algunas realizaciones, una tapa adecuada es un 7-metilo guanilato ("m⁷G") unido a traves de un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleotido transcrito, dando como resultado m⁷G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleosido. Una realizacion preferida de una tapa m⁷G utilizada en realizaciones de la invencion es m⁷G(5')ppp(5')G.

[0112] En algunas realizaciones, la tapa es una estructura Tapa0. Las estructuras de Tapa0 carecen de un residuo 2'-O-metilo de la ribosa unida a las bases 1 y 2. En algunas realizaciones, la tapa es una estructura de Tapa1. Las estructuras de Tapa1 tienen un residuo 2'-O-metilo en la base 2. En algunas realizaciones, la tapa es una estructura de Tapa2. Las estructuras de Tapa2 tienen un residuo 2'-O-metilo unido a ambas bases 2 y 3.

[0113] En la tecnica se conoce una variedad de analogos de cap de m⁷G, muchos de los cuales estan disponibles comercialmente. Estos incluyen los m⁷GpppG descritos anteriormente, asf como los analogos de tapa ARCA 3'-OCH3 y 2 -OCH3 (Jemielity, J. et al., RNA, 9: 1108-1122 (2003)). Los analogos de tapa adicionales para uso en realizaciones de la invencion incluyen analogos de tetrafosfato de dinucleosido bencilado en N7 (descritos en Grudzien, E. et al., RNA, 10: 1479-1487 (2004)), analogos de tapa de fosforotioato (descritos en Grudzien-Nogalska, E., et al., RNA, 13: 1745-1755 (2007)), y analogos de tapa (incluidos analogos de tapa biotinilados) descritos en las patentes de EE.UU. Numeros 8.093.367 y 8.304.529.

Estructura de cola

[0114] Tfpicamente, la presencia de una "cola" sirve para proteger al ARNm de la degradacion de la exonucleasa. Se cree que la cola poli A estabiliza los mensajeros naturales y el ARN de sentido sintetico. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, se puede agregar una larga cola poli A a una molecula de ARNm, lo que hace que el ARN sea mas estable. Las colas de poli A se pueden agregar utilizando una variedad de tecnicas reconocidas por el arte. Por ejemplo, pueden agregarse colas largas de poli A al ARN transcrito sintetico o In Vitro usando polimerasa de poli A (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripcion tambien puede codificar largas colas de poli A. Ademas, las colas de poli A se pueden agregar mediante transcripcion directamente de los productos de PCR. La poli A tambien se puede ligar al extremo 3' de un ARN sentido con ARN ligasa (ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a edicion, ed. Por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: edicion de 1991)).

[0115] En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de cola poli(A) 3'. Tfpicamente, la longitud de la cola de poli A puede ser al menos aproximadamente 10, 50, 100, 200, 300, 400 al menos 500 nucleotidos (SEQ ID NO: 11). En algunas realizaciones, una cola poli-A en el extremo 3' del ARNm tfpicamente incluye aproximadamente 10 a 300 nucleotidos de adenosina (SEQ ID NO: 9) (por ejemplo, aproximadamente 10 a 200 nucleotidos de adenosina, aproximadamente 10 a 150 nucleotidos de adenosina, aproximadamente 10 a 100 nucleotidos de adenosina, aproximadamente 20 a 70 nucleotidos de adenosina, o aproximadamente 20 a 60 nucleotidos de adenosina). En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de cola poli(C) 3'. Una cola poli-C adecuada en el extremo 3' del ARNm incluye tfpicamente de aproximadamente 10 a 200 nucleotidos de citosina (SEQ ID NO: 10) (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 150 nucleotidos de citosina, de aproximadamente 10 a 100 nucleotidos de citosina, de 20 a 70 citosina) nucleotidos, aproximadamente 20 a 60 nucleotidos de citosina, o aproximadamente 10 a 40 nucleotidos de citosina). La cola de poli-C se puede agregar a la cola de poli-A o puede sustituir a la cola de poli-A.

[0116] En algunas realizaciones, la longitud de la cola de poli A o poli C se ajusta para controlar la estabilidad de una molecula de ARNm de sentido modificado para uso con la invencion y, por lo tanto, la transcripcion de protema. Por ejemplo, dado que la longitud de la cola de poli A puede influir en la vida media de una molecula de ARNm con sentido, la longitud de la cola de poliA se puede ajustar para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y asf controlar el curso del tiempo de la expresion de polinucleotidos y/o la produccion de polipeptidos en una celula diana.

Region no traducida de 5' y 3'

[0117] En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una region no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una region 5' no traducida incluye uno o mas elementos que afectan la estabilidad o traduccion de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una region no traducida 5' puede tener una longitud de aproximadamente 50 a 500 nucleotidos.

[0118] En algunas realizaciones, una region 3' no traducida incluye una o mas de una senal de poliadenilacion, un sitio de union para protemas que afectan la estabilidad de la ubicacion de un ARNm en una celula, o uno o mas sitios de union para los ARNmi. En algunas realizaciones, una region 3' no traducida puede tener una longitud de entre 50 y 500 nucleotidos o mas.

Las secuencias UTR 3' y/o 5' ejemplares pueden derivarse de moleculas de ARNm que son estables (por ejemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del acido cftrico) para aumentar la estabilidad de la molecula de ARNm sentido. Por ejemplo, una secuencia UTR 5' puede incluir una secuencia parcial de un gen CMV inmediato-temprano 1 (IE1), o un fragmento del mismo para mejorar la resistencia a la nucleasa y/o mejorar la vida media del polinucleotido. Tambien se contempla la inclusion de una secuencia que codifica la hormona de crecimiento humana (hGH), o un fragmento de la misma en el extremo 3' o region no traducida del polinucleotido (por ejemplo, ARNm) para estabilizar aun mas el polinucleotido. En general, estas modificaciones mejoran la estabilidad y/o las propiedades farmacocineticas (por ejemplo, la vida media) del polinucleotido en relacion con sus homologos no modificados, e incluyen, por ejemplo, modificaciones realizadas para mejorar la resistencia de tales polinucleotidos a la digestion con nucleasas In Vivo.

Formacion de liposomas

[0119] Los vehfculos de transferencia liposomal para uso en las composiciones de la invencion pueden prepararse mediante diversas tecnicas que se conocen actualmente en la tecnica. Los liposomas para uso en composiciones proporcionadas pueden prepararse mediante diversas tecnicas que se conocen actualmente en la tecnica. Por ejemplo, las vesfculas multilamelares (MLV) se pueden preparar de acuerdo con tecnicas convencionales, como depositar un lfpido seleccionado en la pared interior de un recipiente o recipiente adecuado disolviendo el lfpido en un disolvente apropiado, y luego evaporando el disolvente para dejar una pelfcula delgada en el interior del recipiente o por secado por pulverizacion. Luego se puede agregar una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vortice que da como resultado la formacion de m Lv . Las vesfculas unilamelares (ULV) pueden entonces formarse por homogeneizacion, sonicacion o extrusion de las vesfculas multilamelares. Ademas, las vesfculas unilamelares pueden formarse mediante tecnicas de eliminacion de detergentes.

[0120] En ciertas realizaciones, las composiciones proporcionadas comprenden un liposoma en el que el ARNm esta asociado tanto en la superficie del liposoma como encapsulado dentro del mismo liposoma. Por ejemplo, durante la preparacion de las composiciones de la presente invencion, los liposomas cationicos pueden asociarse con el ARNm a traves de interacciones electrostaticas. Por ejemplo, durante la preparacion de las composiciones de la presente invencion, los liposomas cationicos pueden asociarse con el ARNm a traves de interacciones electrostaticas.

[0121] En algunas realizaciones, las composiciones de la invencion comprenden ARNm encapsulado en un liposoma. En algunas realizaciones, una o mas especies de ARNm pueden estar encapsuladas en el mismo liposoma. En algunas realizaciones, una o mas especies de ARNm pueden encapsularse en diferentes liposomas. En algunas realizaciones, el ARNm esta encapsulado en uno o mas liposomas, que difieren en su composicion lipfdica, relacion molar de componentes lipfdicos, tamano, carga (potencial Zeta), ligandos dirigidos y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, uno o mas liposomas pueden tener una composicion diferente de lfpidos cationicos, lfpidos neutros, lfpidos modificados con PEG y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, uno o mas lipisomas pueden tener una relacion molar diferente de lfpido cationico, lfpido neutro, colesterol y lfpido modificado con PEG usado para crear el liposoma.

[0122] El proceso de incorporacion de un ARNm deseado en un liposoma a menudo se denomina "carga". Los metodos ejemplares se describen en Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992. Los acidos nucleicos incorporados en el liposoma se pueden ubicar completa o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma, o asociarse con la superficie exterior de la membrana del liposoma. La incorporacion de un acido nucleico en liposomas tambien se denomina en este documento "encapsulacion" en la que el acido nucleico esta completamente contenido dentro del espacio interior del liposoma. El proposito de incorporar un ARNm en un vehfculo de transferencia, como un liposoma, a menudo es proteger el acido nucleico de un entorno que puede contener enzimas o sustancias qrnmicas que degradan los acidos nucleicos y/o sistemas o receptores que causan la rapida excrecion de acidos nucleicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un vehnculo de suministro adecuado es capaz de mejorar la estabilidad del ARNm contenido en el mismo y/o facilitar el suministro de ARNm a la celula o tejido diana.

Tamano del liposoma

[0123] Los liposomas adecuados de acuerdo con la presente invencion se pueden fabricar en varios tamanos. En algunas realizaciones, los liposomas pueden hacerse mas pequenos que los liposomas de encapsulacion de ARNm conocidos anteriormente. En algunas realizaciones, el tamano reducido de los liposomas se asocia con un suministro mas eficaz de ARNm. La seleccion de un tamano de liposoma apropiado puede tomar en consideracion el sitio de la celula o tejido diana y hasta cierto punto la aplicacion para la cual se esta realizando el liposoma.

[0124] En algunas realizaciones, se selecciona un tamano apropiado de liposoma para facilitar la distribucion sistemica del anticuerpo codificado por el ARNm. En algunas realizaciones, puede ser deseable limitar la transfeccion del ARNm a ciertas celulas o tejidos. Por ejemplo, para apuntar a los hepatocitos, un liposoma puede tener un tamano tal que sus dimensiones sean mas pequenas que las ventanillas de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepaticos en el hngado; en tales casos, el liposoma podna penetrar facilmente en tales fenestraciones endoteliales para alcanzar los hepatocitos diana.

[0125] Alternativa o adicionalmente, un liposoma puede dimensionarse de manera que las dimensiones del liposoma sean de un diametro suficiente para limitar o evitar expresamente la distribucion en ciertas celulas o tejidos. Por ejemplo, un liposoma puede dimensionarse de manera tal que sus dimensiones sean mayores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubren los sinusoides hepaticos para limitar asf la distribucion de los liposomas a los hepatocitos.

[0126] En algunas realizaciones, el tamano de un liposoma se determina por la longitud del diametro mas grande de la partfcula de liposoma. En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamano no mayor que aproximadamente 250 nm (por ejemplo, no mayor que aproximadamente 225 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm o 50 nm). En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamano que vana de aproximadamente 10 a 250 nm (por ejemplo, que vana de aproximadamente 10 a 225 nm, de 10 a 200 nm, de 10 a 175 nm, de 10 a 150 nm, de 10 a 125 nm, de 10 a 100 nm, 10 a 75 nm, o 10 a 50 nm). En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamano que vana de aproximadamente 100 - 250 nm (por ejemplo, que vana de aproximadamente 100 - 225 nm, 100 - 200 nm, 100 - 175 nm, 100 - 150 nm). En algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamano que vana de aproximadamente 10 a 100 nm (por ejemplo, que vana de aproximadamente 10 a 90 nm, 10 a 80 nm, 10 a 70 nm, 10 a 60 nm o 10 a 50 nm).

[0127] Una variedad de metodos alternativos conocidos en la tecnica estan disponibles para dimensionar una poblacion de liposomas. Uno de tales metodos de dimensionamiento se describe en la patente de EE.UU. N° 4.737.323. La sonicacion de una suspension de liposomas, ya sea por bano o sonda, produce una reduccion progresiva del tamano hasta un ULV pequeno de menos de aproximadamente 0,05 micrones de diametro. La homogenizacion es otro metodo que se basa en la energfa de cizallamiento para fragmentar los liposomas grandes en otros mas pequenos. En un procedimiento de homogeneizacion tfpico, las MLV se recirculan a traves de un homogeneizador de emulsion estandar hasta que se observan tamanos de liposomas seleccionados, tipicamente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micrones. El tamano de los liposomas puede determinarse por dispersion de luz casi electrica (QELS) como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10: 421-150 (1981). El diametro promedio de los liposomas puede reducirse por sonicacion de los liposomas formados. Los ciclos de sonicacion intermitentes se pueden alternar con la evaluacion QELS para guiar la smtesis de liposomas eficiente.

Composiciones farmaceuticas

[0128] Para facilitar la expresion de ARNm In Vivo, los vehfculos de administracion, como los liposomas, se pueden formular en combinacion con uno o mas acidos nucleicos adicionales, portadores, ligandos dirigidos o reactivos estabilizantes, o en composiciones farmacologicas donde se mezcla con excipientes adecuados. Las tecnicas para la formulacion y administracion de medicamentos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, ultima edicion.

[0129] Siempre que los ARNm encapsulados en liposomas o asociados, y las composiciones que los contienen, se puedan administrar de acuerdo con la practica medica actual, teniendo en cuenta el estado clmico del sujeto, el sitio y el metodo de administracion, la programacion de la administracion, la edad del sujeto, el sexo, el peso corporal y otros factores relevantes para los clmicos de habilidad ordinaria en la tecnica. La "cantidad efectiva" para los fines de este documento puede determinarse por las consideraciones relevantes que conocen los expertos en investigacion clmica experimental, farmacologica, clmica y medica. En algunas realizaciones, la cantidad administrada es eficaz para lograr al menos cierta estabilizacion, mejora o eliminacion de los smtomas y otros indicadores que se seleccionan como medidas apropiadas de progreso, regresion o mejora de la enfermedad por los expertos en la materia. Por ejemplo, una cantidad adecuada y un regimen de dosificacion es uno que causa al menos la produccion de protemas transitorias (por ejemplo, enzimas).

[0130] Las vfas de administracion adecuadas incluyen la administracion intravenosa.

[0131] Como alternativa o adicionalmente, los ARNm encapsulados en liposomas y las composiciones de la invencion pueden administrarse de manera local mas que sistemica, por ejemplo, mediante inyeccion de la composicion farmaceutica directamente en un tejido espedfico, preferiblemente en una formulacion de liberacion sostenida. Las composiciones de la presente invencion se pueden inyectar en el sitio de manifestacion de la enfermedad, por ejemplo.

[0132] Los metodos proporcionados de la presente descripcion contemplan administraciones unicas y multiples de una cantidad terapeuticamente eficaz de los agentes terapeuticos (por ejemplo, ARNm que codifica una protema ASS1) descritos en el presente documento. Los agentes terapeuticos se pueden administrar a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, la gravedad y el alcance de la afeccion del sujeto (por ejemplo, ASD). En algunos aspectos, una cantidad terapeuticamente eficaz de los agentes terapeuticos (por ejemplo, ARNm que codifica una protema ASS1) de la presente descripcion puede administrarse por via intratecal periodicamente a intervalos regulares (por ejemplo, una vez al ano, una vez cada seis meses, una vez cada cinco meses, una vez cada tres meses, bimestral (una vez cada dos meses), mensual (una vez cada mes), quincenal (una vez cada dos semanas), una vez cada 30 dfas, una vez cada 28 dfas, una vez cada 14 dfas, una vez cada 10 dfas, una vez cada 7 dfas, semanales, diarios o continuos).

[0133] En algunas realizaciones, los liposomas y/o composiciones proporcionados se formulan de modo que sean adecuados para la liberacion prolongada del ARNm contenido en los mismos. Dichas composiciones de liberacion prolongada pueden administrarse convenientemente a un sujeto a intervalos de dosificacion prolongados. Por ejemplo, en una realizacion, las composiciones de la presente invencion se administran a un sujeto dos veces al dfa, diariamente o cada dos dfas. En una realizacion preferida, las composiciones de la presente invencion se administran a un sujeto dos veces por semana, una vez a la semana, una vez cada 7 dfas, una vez cada 10 dfas, una vez cada 14 dfas, una vez cada 28 dfas, una vez cada 30 dfas, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o mas preferiblemente una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada seis meses, una vez cada ocho meses, una vez cada nueve meses o anualmente. Tambien se contemplan composiciones y liposomas que estan formulados para la administracion de depositos (por ejemplo, por via intramuscular, por via subcutanea, por via intravftrea) para liberar un ARNm durante penodos prolongados de tiempo. Preferiblemente, los medios de liberacion prolongada empleados se combinan con modificaciones hechas al ARNm para mejorar la estabilidad.

[0134] Como se usa en el presente documento, el termino "cantidad terapeuticamente eficaz" se determina en gran medida basandose en la cantidad total del agente terapeutico contenido en las composiciones farmaceuticas de la presente invencion. En general, una cantidad terapeuticamente efectiva es suficiente para lograr un beneficio significativo para el sujeto (por ejemplo, tratar, modular, curar, prevenir y/o mejorar el ASD). Por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz puede ser una cantidad suficiente para lograr un efecto terapeutico y/o profilactico deseado. En general, la cantidad de un agente terapeutico (por ejemplo, ARNm que codifica una protema ASS1) administrada a un sujeto que lo necesite dependera de las caractensticas del sujeto. Tales caractensticas incluyen la afeccion, la gravedad de la enfermedad, la salud general, la edad, el sexo y el peso corporal del sujeto. Un experto habitual en la tecnica podra determinar facilmente las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores relacionados. Ademas, se pueden emplear opcionalmente ensayos objetivos y subjetivos para identificar los intervalos de dosificacion optimos.

[0135] Una cantidad terapeuticamente eficaz se administra comunmente en un regimen de dosificacion que puede comprender multiples dosis unitarias. Para cualquier protema terapeutica particular, una cantidad terapeuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un regimen de dosificacion eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la via de administracion, en combinacion con otros agentes farmaceuticos. Ademas, la cantidad terapeuticamente efectiva espedfica (y/o la dosis unitaria) para cualquier paciente en particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se esta tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmaceutico espedfico empleado; la composicion espedfica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administracion, la via de administracion y/o la tasa de excrecion o metabolismo de la protema espedfica empleada; la duracion del tratamiento; y como factores bien conocidos en las artes medicas.

[0136] En algunas realizaciones, la dosis terapeuticamente eficaz vana de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 500 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 400 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 300 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 200 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg peso corporal a 90 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 80 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 70 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 60 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 40 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 30 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 25 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 20 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso corporal a 15 mg/kg de peso corporal, desde alrededor de 0,005 mg/k G Peso corporal hasta 10 mg/kg de peso corporal.

[0137] En algunas realizaciones, la dosis terapeuticamente eficaz es mayor que aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 1,0 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 3 mg/kg de cuerpo corporal peso, mayor que aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 30 mg/kg de cuerpo peso, mayor que aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 70 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 80 mg/kg de cuerpo peso, mayor que aproximadamente 90 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 150 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 250 mg/kg de cuerpo peso, mayor que aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 450 m g/kg de peso corporal, mayor que aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal.

[0138] Tambien se contemplan en el presente documento composiciones farmaceuticas liofilizadas que comprenden uno o mas de los liposomas descritos en el presente documento y metodos relacionados para el uso de tales composiciones como se describe, por ejemplo, en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° 61/494.882, presentada el 8 de junio de 2011. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas liofilizadas de acuerdo con la invencion pueden reconstituirse antes de la administracion o pueden reconstituirse In Vivo. Por ejemplo, una composicion farmaceutica liofilizada se puede formular en una forma de dosificacion apropiada (por ejemplo, una forma de dosificacion intradermica, como un disco, varilla o membrana) y se puede administrar de manera tal que la forma de dosificacion se rehidrate con el tiempo In Vivo por los fluidos corporales del individuo.

[0139] Los liposomas y composiciones proporcionadas pueden administrarse a cualquier tejido deseado. En algunas realizaciones, el ARNm administrado por liposomas o composiciones proporcionadas se expresa en el tejido en el que se administraron los liposomas y/o las composiciones. En algunas realizaciones, el ARNm administrado se expresa en un tejido diferente del tejido en el que se administraron los liposomas y/o las composiciones. Los tejidos ejemplares en los cuales el ARNm administrado puede administrarse y/o expresarse incluyen, entre otros, tngado, rinon, corazon, bazo, suero, cerebro, musculo esqueletico, ganglios linfaticos, piel y/o lfquido cefalorraqrndeo.

[0140] De acuerdo con la presente invencion, una dosis terapeuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, da como resultado un aumento de los niveles de ASS1 hepatico. En algunas realizaciones, una dosis terapeuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, da como resultado un nivel reducido de citrulina en suero en comparacion con el nivel de referencia de citrulina antes del tratamiento. En algunas realizaciones, una dosis terapeuticamente eficaz, cuando se administra regularmente, da como resultado un nivel reducido de amomaco en el suero en comparacion con el nivel basal de amomaco antes del tratamiento.

[0141] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion proporcionada da como resultado un aumento de la expresion de la protema ASS1 en el Imgado en comparacion con los niveles de referencia antes del tratamiento. En alguna realizacion, la administracion de las composiciones proporcionadas da como resultado un nivel de protema ASS1 en o por encima de aproximadamente 3.000 ng/mg, en o por encima de aproximadamente 2.000 ng/mg, en o por encima de aproximadamente 1.000 ng/mg, en o por encima de aproximadamente 500 ng/mg, en o por encima de aproximadamente 400 ng/mg, en o por encima de aproximadamente 200 ng/mg o en o por encima de aproximadamente 100 ng/mg de protema total en el tngado. En una realizacion particular, la administracion de las composiciones proporcionadas da como resultado un nivel de protema ASS1 en o por encima de 120 ng/mg de protema total en el tngado.

[0142] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion proporcionada da como resultado un aumento en el nivel de protema ASS1 en plasma o suero en comparacion con el nivel de referencia antes del tratamiento. En algunas realizaciones, la administracion de la composicion proporcionada resulta en un aumento del nivel de protema ASS1 en plasma o suero en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% en comparacion con el nivel de referencia antes del tratamiento.

[0143] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado niveles reducidos de citrulina y/o amoniaco en el sujeto en comparacion con los niveles de referencia antes del tratamiento. Normalmente, los niveles de referencia se miden inmediatamente antes del tratamiento. Tfpicamente, los niveles de citrulina y/o amoniaco se miden en una muestra biologica. Las muestras biologicas adecuadas incluyen, por ejemplo, sangre completa, plasma, suero, orina o lfquido cefalorraqrndeo.

[0144] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado un nivel reducido de citrulina en una muestra biologica (por ejemplo, una muestra de suero, plasma u orina) en al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparacion con el nivel de referencia de citrulina inmediatamente antes del tratamiento. En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado un nivel reducido de citrulina en plasma a menos de aproximadamente 2.000 pM, 1.500 pM, 1.000 pM, 750 pM, 500 pM, 250 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, o 30 pM.

[0145] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado niveles reducidos de amomaco en una muestra biologica (por ejemplo, una muestra de suero, plasma u orina) en al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 35%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95% en comparacion con el nivel inicial inmediatamente antes del tratamiento.

[0146] En algunas realizaciones, la administracion de la composicion proporcionada da como resultado niveles reducidos de amomaco en plasma o suero en comparacion con el nivel basal de amomaco inmediatamente antes del tratamiento. En algunas realizaciones, la administracion de la composicion proporcionada da como resultado niveles reducidos de amomaco en plasma o suero en comparacion con el nivel de amomaco en sujetos que no estan tratados. En algunas realizaciones, la administracion de la composicion da como resultado la reduccion de los niveles de amomaco a aproximadamente 3.000 pmol/L o menos, aproximadamente 2.750 pmol/L o menos, aproximadamente 2.500 pmol/L o menos, aproximadamente 2.250 pmol/L o menos, aproximadamente 2.000 pmol/L o menos, alrededor de 1.750 pmol/L o menos, alrededor de 1.500 pmol/L o menos, alrededor de 1.250 pmol/L o menos, alrededor de 1.000 pmol/L o menos, alrededor de 750 pmol/L o menos, alrededor de 500 pmol/L o menos, aproximadamente 250 pmol/L o menos, aproximadamente 100 pmol/L o menos o aproximadamente 50 pmol/L o menos en el plasma o suero. En una realizacion particular, la administracion de la composicion da como resultado la reduccion de los niveles de amomaco a aproximadamente 50 pmol/L o menos en el plasma o suero.

[0147] De acuerdo con diversas realizaciones, el tiempo de expresion de los ARNm administrados puede ajustarse para adaptarse a una necesidad medica particular. En algunas realizaciones, la expresion de la protema codificada por el ARNm administrado es detectable 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48, 72 y/o 96 horas despues de la administracion de los liposomas y/o composiciones proporcionados. En algunas realizaciones, la expresion de la protema codificada por el ARNm administrado es detectable 1 semana, 2 semanas y/o 1 mes despues de la administracion.

EJEMPLOS

[0148] Aunque ciertas composiciones de la presente invencion se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar las composiciones de la invencion y no pretenden limitarlas.

Ejemplo 1. Formulaciones de liposomas ejemplares para la administracion y expresion de ARNm de ASS1

[0149] Este ejemplo proporciona formulaciones de liposomas a modo de ejemplo para el suministro y la expresion eficaces de ARNm de ASS1 In Vivo.

Materiales lip^dicos

[0150] Las formulaciones descritas en este documento incluyen una mezcla de lfpidos de multiples componentes de proporciones variables que emplean uno o mas lfpidos cationicos, lfpidos auxiliares (por ejemplo, lfpidos no cationicos y/o lfpidos a base de colesterol) y lfpidos PEGilados disenados para encapsular ARNm que codifica protema ASS1. Los lfpidos cationicos pueden incluir (pero no exclusivamente) DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenilo-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. "Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids" J. Contr. Rel. 2005, 107. 276- 287), DLin-KC2-DMA (sem., SC et al. "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery" Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, KT et al. "Lipid like materials for low-dose in vivo gene silencing" PNAS 2010, 107. 1864-1869), cKK-E12 (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodil)amino)butilo)piperazina-2, 5-diona), HGT5000, HGT5001, HGT4003, ICE, a base de dialquilamino, a base de imidazol, a base de guanidinio, etc. Los lfpidos pueden incluir (pero no exclusivamente) DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoeth)anolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-) fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfos (1'-rac-glicerol), colesterol, etc. Los lfpidos PEGilados pueden incluir (pero no exclusivamente) una cadena de poli(etileno)glicol de hasta 5 kDa de longitud covalentemente unidos a un lfpido con cadena(s) de alquilo de longitud C6-C20.

[0151] El ARN mensajero de sintetasa de argininosuccinato (ASS1) humano optimizado con codon se sintetizo mediante transcripcion In Vitro de una plantilla de ADN plasirndica que codifica el gen, que fue seguida por la adicion de una estructura de tapa 5' (Tapa 1) (Fechter, P.; Brownlee, GG "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) y una cola 3' de poli(A) de aproximadamente 250 nucleotidos de longitud (SEQ ID NO: 12) segun lo determinado por electroforesis en gel. Las regiones no traducidas en 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, y se definen como se indica (vide infra).

ARNm de sintetasa de argininosuccinato humano (ASS1) ejemplar optimizado en codon

Diseno de construcciones:

[0152]

X -SEQ ID NO: 3 - Y ;

X -SEQ ID NO: 13 - Y;

X-SEQ ID NO: 14 - Y ; y

X -SEQ ID NO: 15 - Y.

Secuencias UTR 5’ y 3'

[0153]

X (secuencia UTR 5') =

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUC

CGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG [SEQ

ID NO.:4]

Y (secuencia 3' UTR) = CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAG CCUtlGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU [SEQ ID NO.:5]

OR

GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGC

CUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU (SEQ ID NO.:6)

[0154] Las secuencias de ARNm de ASS1 humano optimizadas en codon ejemplares incluyen la SEQ ID NO: 3 descrita en la seccion de descripcion detallada, y la SeQ ID NO: 13, la SEQ iD NO: 14 y la SEQ ID NO: 15 a continuacion:

SEQ ID NO: 13

AUGAGCUCAAAGGGAUCUGUGGUGCUGGCAUACUCGGGGGGAUUGGACACUUCAUGCAUACUUGUCUGGU

UGAAGGAACAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCUAACAUCGGUCAAAAGGAGGACUUCGAGGAGGCC

CGGAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCGAAGAAAGUGUUCAUCGAGGACGUGUCCCGGGAAUUUGUGGAAG

AGUUCAUCUGGCCCGCCAUCCAAAGCAGCGCACUGUACGAGGAUAGAUACCUCCUCGGAACAUCCCUUGCCC

GGCCAUGUAUUGCCAGGAAACAGGUGGAAAUCGCCCAGCGGGAAGGAGCCAAAUACGUGUCCCACGGGGCG

ACCGGAAAGGGGAACGACCAAGUGCGCUUCGAGCUGUCGUGCUACUCCCUGGCACCGCAGAUUAAGGUCAU

CGCGCCGUGGAGAAUGCCUGAAUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGAUCUGAUGGAAUACGCCAAGCA

GCACGGCAUCCCGAUCCCCGUGACCCCUAAGAACCCUUGGUCAAUGGACGAGAAUCUGAUGCACAUCAGCUA

CGAAGCGGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAAUCAAGCUCCGCCCGGACUGUACACUAAGACUCAGGAUCCCGC

UAAGGCGCCCAACACUCCUGAUAUUUUGGAAAUCGAAUUCAAGAAGGGUGUCCCAGUGAAGGUCACCAACG

UGAAGGACGGCACUACCCACCAGACCUCGCUGGAACUGUUUAUGUAUCUGAACGAGGUGGCCGGCAAACAU

GGAGUCGGCAGAAUCGAUAUUGUGGAGAACCGCUUUAUUGGCAUGAAGUCCAGGGGGAUCUAUGAAACCC

CGGCCGGAACCAUCCUCUACCACGCCCAUCUCGACAUUGAAGCGUUCACCAUGGACCGCGAGGUCCGCAAGA

UUAAGCAGGGCCUGGGACUCAAGUUCGCCGAGCUCGUGUACACCGGUUUCUGGCAUUCCCCGGAAUGCGAA

UUCGUGCGACACUGCAUUGCCAAGAGCCAGGAGCGGGUGGAAGGAAAGGUCCAGGUGUCCGUGCUGAAGG

GUCAAGUGUACAUCCUGGGGCGGGAGUCCCCUCUUUCCCUGUACAACGAAGAACUGGUGUCGAUGAACGUG

CAGGGAGACUACGAGCCGACCGACGCCACGGGUUUCAUUAACAUCAAUUCCCUGAGACUGAAGGAGUACCAC

CGGCUCCAGUCCAAAGUCACCGCUAAGUGA (SEQ ID NO:13),

SEQ ID NO: 14

AUGAGCUCAAAAGGAUCGGUGGUGCUGGCAUACUCGGGAGGAUUGGACACUUCAUGUAUUCUUGUCUGGC

UCAAGGAACAGGGCUACGACGUCAUUGCCUACCUGGCCAACAUCGGUCAGAAAGAGGACUUCGAGGAAGCCA

GAAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGAGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGUCCCGCGAAUUUGUGGAAGA

AUUCAUCUGGCCUGCCAUUCAAUCCUCCGCGCUCUACGAGGAUCGGUACCUUCUGGGAACUUCCUUGGCUC

GCCCGUGCAUCGCCCGGAAACAAGUGGAGAUUGCACAGCGGGAAGGAGCUAAGUACGUGUCCCACGGGGCC

ACUGGAAAGGGCAACGAUCAAGUGCGCUUCGAGCUGUCCUGCUACUCCCUGGCGCCACAGAUCAAGGUCAUC

GCGCCGUGGCGGAUGCCCGAGUUCUAUAACCGCUUCAAGGGACGGAACGAUCUGAUGGAGUACGCCAAGCA

GCACGGCAUUCCGAUACCCGUGACCCCCAAGAACCCUUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCAUAUCUCUUA

CGAAGCCGGGAUUCUCGAAAACCCUAAGAAUCAGGCGCCGCCUGGCCUGUACACCAAAACCCAGGACCCCGCC

AAGGCGCCGAACACGCCCGACAUCCUCGAAAUCGAGUUCAAGAAGGGGGUGCCAGUGAAGGUCACCAACGUG

AAGGACGGAACCACCCAUCAGACCUCACUGGAACUCUUCAUGUACCUCAACGAGGUCGCAGGGAAGCACGGC

GUGGGGAGAAUCGACAUCGUGGAAAACAGGUUCAUCGGCAUGAAGUCCCGGGGAAUCUACGAAACACCCGC

CGGGACUAUCCUCUACCACGCCCACCUGGACAUUGAGGCCUUCACCAUGGAUAGAGAAGUGCGCAAGAUUAA

GCAGGGUCUGGGUCUGAAGUUCGCCGAGUUGGUCUACACCGGAUUCUGGCAUUCCCCUGAAUGCGAAUUC

GUGCGCCACUGCAUUGCCAAGAGCCAGGAAAGAGUGGAGGGCAAAGUCCAAGUGUCGGUGCUGAAGGGCCA

AGUGUACAUCCUGGGAAGGGAAAGCCCGCUCUCCCUGUACAACGAGGAACUGGUGUCGAUGAACGUCCAGG

GCGAUUAUGAGCCGACUGACGCCACUGGUUUUAUCAAUAUCAACAGCCUGCGACUGAAGGAGUACCACCGG

CUGCAGUCCAAGGUCACCGCUAAGUAG (SEQ ID NO:14),

SEQ ID NO: 15

AUGAGCUCGAAAGGAUCCGUGGUUUUGGCAUACUCCGGUGGACUUGACACUUCAUGCAUUUUGGUUUGGC

UCAAAGAACAGGGCUACGAUGUGAUCGCCUACCUGGCGAACAUCGGACAGAAAGAGGACUUUGAAGAGGCC

CGCAAGAAGGCACUGAAGCUGGGUGCCAAGAAAGUGUUUAUCGAGGAUGUGUCGAGAGAAUUCGUGGAAG

AAUUCAUUUGGCCAGCCAUUCAAAGCUCCGCGCUGUACGAGGACAGAUACCUCCUCGGCACCUCACUGGCCC

GCCCUUGCAUCGCGCGCAAACAGGUCGAGAUCGCUCAAAGAGAAGGAGCUAAAUACGUGUCACACGGCGCCA

CCGGAAAGGGAAAUGACCAAGUCCGCUUCGAGCUGUCUUGCUACUCACUCGCUCCGCAAAUCAAGGUCAUCG

CACCGUGGAGGAUGCCCGAGUUCUACAACCGGUUCAAGGGGCGGAACGACCUGAUGGAGUACGCGAAGCAG

CACGGUAUCCCGAUCCCUGUCACCCCAAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAAAAUCUGAUGCACAUCAGCUAC

GAAGCAGGAAUCCUGGAGAACCCGAAAAAUCAAGCACCUCCUGGACUGUACACUAAGACCCAGGACCCAGCCA

AGGCCCCGAAUACCCCGGACAUCUUGGAAAUCGAGUUCAAGAAGGGGGUGCCAGUGAAGGUUACCAAUGUC

AAGGAUGGGACCACUCACCAAACUAGCCUGGAACUGUUCAUGUACCUGAACGAAGUGGCUGGAAAACAUGG

CGUGGGAAGAAUCGAUAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGUCAAGGGGAAUCUACGAAACUCCGG

CCGGGACGAUACUGUAUCAUGCGCAUCUCGACAUUGAAGCCUUUACUAUGGAUCGGGAAGUCCGAAAGAUC

AAACAGGGCUUGGGCCUCAAGUUUGCCGAGCUGGUGUACACGGGAUUCUGGCACUCGCCGGAAUGCGAAUU

CGUGCGCCACUGUAUUGCGAAGUCCCAGGAGCGCGUGGAAGGGAAGGUCCAAGUCUCCGUGCUCAAAGGAC

A6GUCUACAUCCUUGGACGGGAGUCGCCCCUGUCGCUCUACAACGAAGAACUGGUGUCGAUGAACGUGCAG

GGAGACUAUGAACCAACGGAUGCUACUGGUUUCAUCAACAUCAAUUCGCUGCGGCUUAAGGAGUACCAUCG

GCUGCAGUCCAAGGUCACCGCGAAGUAG (SEQ ID NO:15).

[0155] Una secuencia ejemplar de ARN mensajero de sintetasa de argininosuccinato humana (ASS1) optimizada en codon de longitud completa se muestra a continuacion:

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUC

CGCGGCCGGGAACGGU6CAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUG

AGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAA

GGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAA

GAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUC

AUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCU

GCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCA

AGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCU

GGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCA

UCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGG

CAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCA

ACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCA

CCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCA

UCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCC

UGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGG

GCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGU6CGCCACUGC

AUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCU

GGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGC

CCACCGACG CCACCGGCU UCAU CAACAU CAACAGCCU GCG CCUG AAGG AG U ACCACCG CC UGCAG AGCAAGGU

GACCGCCAAGUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUC

CAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU (SEQ ID NO:7).

[0156] En otro ejemplo, a continuacion se muestra una secuencia de ARN mensajero de sintetasa de argininosuccinato humana (ASS1) optimizada en codon de longitud completa:

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUC

CGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUG

AGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAA

GGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAA

GAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUC

AUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCU

GCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCA

AGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCU

GGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCA

UCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGG

CAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCA

ACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCA

CCACCCACC AG ACCAGCC UGGAGCUGUU CAUG U ACCUG A ACG AGG U G G CCGGC AAGCACGGCG UGG G CCGCA

UCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCC

UGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGG

GCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGC

AUCGCCAAGAGCCAGGA6CGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCU

GGGCCGCGA6AGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGC

CCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGU

GACCGCCAAGUGAGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCC

AGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU (SEQ ID NO:8).

Protocolos de formulacion ejemplares

A. cKK-E12

[0157] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparo una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm ASS1 a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,64 mg/ml de ARNm ASS1 (encapsulado). Zave = 78 nm (Dv(50)) = 46 nm; Dv(g0) = 96 nm.

B. C12-200

[0158] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparo una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm ASS1 a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,82 mg/ml de ARNm ASS1 (encapsulado). Zave = 86 nm (Dv(50) = 50 nm; Dv(g0) = 101 nm).

C. HGT4003

[0159] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparo una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm ASS1 a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,82 mg/ml de ARNm ASS1 (encapsulado). Zave = 86 nm (Dv(50) = 50 nm; Dv(90) = 101 nm).

D. ICE

[0160] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de ICE, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparo una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm ASS1 a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,91 mg/ml de ARNm ASS1 (encapsulado). Zave = 81 nm (Dv(50) = 48 nm; DV(90) = 96 nm).

E. HGT5001

[0161] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de HGT5001, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparo una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm ASS1 a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,20 mg/ml ARNm ASS1 (encapsulado). Zave = 87,0 nm (Dv(50) = 75 nm; Dv(90) = 103 nm).

F. HGT5000

[0162] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de HGT5000, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparo una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm ASS1 a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,20 mg/ml ARNm ASS1 (encapsulado). Zave = 81 nm (Dv(50) = 67 nm; Dv(⁹⁰) = 97 nm).

G. DLinKC2DMA

[0163] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de DLinKC2DMA, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparo una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm ASS1 a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,20 mg/ml ARNm ASS1 (encapsulado). Zave = 78 nm (Dv(50) = 60 nm; Dv(90) = 92 nm).

H. DODAP

[0164] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de DODAP, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparo una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm ASS1 a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,20 mg/ml ARNm ASS1 (encapsulado). Zave = 84 nm (Dv(50) = 62 nm; Dv(⁹⁰) = 92 nm).

I. DODMA

[0165] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de DODMA, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) del ARNm ASS1 se preparo a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,20 mg/ml ARNm ASS1 (encapsulado). Zave = 86 nm (DV(50) = 69 nm; DV(90) = 98 nm).

Ejemplo 2. Administracion de nanopartfculas de liposomas cargadas con ARNm ASS1

[0166] Este ejemplo ilustra metodos ejemplares de administracion de nanopartmulas de liposomas cargados con ARNm ASS1 y metodos para analizar protemas expresadas en varios tejidos diana In Vivo.

[0167] Todos los estudios se realizaron utilizando ratones machos CD-1 de aproximadamente 6-8 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Las muestras se introdujeron mediante una inyeccion unica en la vena de la cola de un bolo de una dosis total equivalente de 1,0 mg/kg (o especificado de lo contrario) de ARNm ASS1 encapsulado. Los ratones se sacrificaron y se perfundieron con solucion salina en los puntos de tiempo designados.

[0168] Los tejidos como el hngado, el bazo, el rinon y el corazon de cada raton se recolectaron, se repartieron en partes separadas y se almacenaron en formalina neutra al 10% neutralizada o se congelaron instantaneamente y se almacenaron a -80°C para su analisis.

[0169] Todos los animales se sometieron a eutanasia por asfixia con CO2 en los puntos de tiempo designados despues de la administracion de la dosis (+ 5%), seguidos de una toracotoirna y una extraccion terminal de sangre cardfaca. La sangre completa (volumen maximo obtenible) se recogio mediante puncion cardfaca en animales sacrificados en tubos separadores de suero, se dejo coagular a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, se centrifugo a 22°C 5°C a 9.300 g durante 10 minutos, y se extrajo el suero. Para las recolecciones de sangre provisionales, se recolectaron aproximadamente 40-50 pl de sangre completa mediante puncion de la vena facial o corte de cola. Las muestras recogidas de animales sin tratamiento se utilizaron como niveles basales de ASS1 para la comparacion con los animales de estudio.

Analisis de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)- ELISA ASS1 humano

[0170] Se siguieron los procedimientos ELISA estandar empleando IgG anti-ASS1 2D1-2E12 de raton como anticuerpo de captura con IgG anti-ASS1 #3285 de conejo como anticuerpo secundario (deteccion) (Shire Human Genetic Therapies). Se utilizo IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rabano picante (HRP) para la activacion de la solucion de sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). La reaccion se detuvo utilizando H2SO42N despues de 20 minutos. La deteccion se controlo mediante absorcion (450 nm) en un instrumento Molecular Device SpectraMax. Se utilizaron suero y organos de raton no tratados y protema ASS1 humana como controles negativo y positivo, respectivamente.

Ejemplo 3. Expresion de protema ASS1 eficiente In Vivo

[0171] Este ejemplo demuestra que la administracion de ARNm ASS1 da como resultado la produccion exitosa de protemas y la eficacia clmica In Vivo.

[0172] La produccion de la protema ASS1 humana a traves de nanopartmulas lipfdicas cargadas con ARNm de hASS1 optimizadas en codon se ensayo en ratones CD-1 como una inyeccion intravenosa unica en bolo. La Figura 1 representa la cantidad de protema ASS1 humana detectada a traves de ELISA cuando los ratones se trataron con nanopartmulas lipfdicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm ASS1 humano a diversas dosis. Los ratones se sacrificaron veinticuatro horas despues de la inyeccion y los organos se recogieron (como se describe anteriormente).

[0173] Como se muestra en la Figura 1, se logro una respuesta clara a la dosis al medir los niveles hepaticos de la protema ASS1 humana. El intervalo de dosificacion fue de 0,10 a 2,0 mg/kg de ARNm ASS1 humano encapsulado. Estos datos demuestran la capacidad de las nanopartmulas lipfdicas para acumularse en el hngado y liberar la carga util del ARNm y el tngado para procesar este ARNm exogeno a traves de la traduccion para producir la protema ASS1 humana. Los valores crudos de la protema ASS1 humana medidos mediante analisis ELISA (como se muestra en la Figura 1) se muestran en la Tabla 1 a continuacion.

Tabla 1

El ARNm de ASS1 humano optimizado en codon se administro a traves de nanopartmulas lipfdicas basadas en cKK-E12. Las dosis se basan en el ARNm de ASS1 encapsulado. Los valores se representan como nanogramos de protema ASS1 humana por miligramo de protema total en el hngado. BLD = Por debajo del Ifmite de deteccion para ELISA.

[0174] Mientras que la sensibilidad del ELISA tiene limitaciones a valores mas bajos, el analisis de transferencia Western permite una visualizacion clara de la protema ASS1 humana a dosis mas bajas (0,30 mg/kg) (Figuras 2A-2D).

[0175] Para comprender mejor la capacidad de las nanopartmulas lipfdicas encapsuladas con ARNm ASS1 para facilitar el suministro de ARNm a organos seleccionados (hngado), se realizo un estudio farmacocinetico que controla los niveles de protema ASS1 humana en el hngado durante un penodo de una semana. La Figura 3 representa la cantidad de protema ASS1 humana detectada en el hngado en varios puntos de tiempo despues de la administracion de nanopartmulas lipfdicas cargadas con ASS1 (cKK-E12). Esto se logro como una dosis unica (1,0 mg/kg de ARNm encapsulado) administrada por via intravenosa.

[0176] En este caso, observamos un nivel serico maximo de protema ASS1 humana aproximadamente a las 24-48 horas despues de la administracion. Se observaron niveles medibles de protema 1 semana despues de la administracion, segun lo determinado por ELISA y transferencia Western (Figuras 3 y 4A-4E, respectivamente).

[0177] La deteccion directa del ingrediente farmaceutico activo (ARNm de ASS1) en los hngados de los ratones tratados se logro utilizando metodos basados en hibridacion in situ (ISH). Como se demuestra en las Figuras 5A-5I, el ARN mensajero ASS1 humano exogeno se pudo detectar en niveles altos en el punto de tiempo mas temprano ensayado (30 minutos) y la senal permanecio fuerte durante 48 horas despues de la dosificacion. Ademas, el ARNm de ASS1 humano todavfa era detectable 7 dfas despues de la administracion.

[0178] Ademas de ISH, la deteccion de la protema ASS1 humana resultante se logro utilizando medios inmunohistoqmmicos (IHC). Usando un anticuerpo monoclonal de raton (02D2-2E12) para la union espedfica, observamos facilmente la protema ASS1 humana diana en el citoplasma de hepatocitos de hngados tratados. La senal se observo por primera vez en los hngados tratados, ligeramente dentro de los 30 minutos, pero claramente dentro de las 3 horas posteriores a la administracion. Las Figuras 6A-6I muestran la tincion de la protema ASS1 humana en hngados de raton tratados en funcion del tiempo despues de la administracion.

[0179] Ademas, se observa una distribucion generalizada en todo el hngado con una fuerte deteccion de la protema ASS1 humana tanto en las celulas sinusoidales como en las celulas diana de hepatocitos. Las Figuras 7A-7B representan una representacion de bajo aumento de la tincion de IHC positiva para la protema ASS1 humana 24 horas despues de la administracion.

[0180] La administracion de ARNm de ASS1 humano y la produccion de protema posterior no se limita a un unico sistema de nanopartfculas lipfdicas. Se exploraron varios sistemas de nanopartfculas cationicas basadas en lfpidos para determinar su capacidad para administrar ARNm y producir la protema deseada. Se investigo un cribado de 10 sistemas lipfdicos cationicos diferentes utilizando ARNm ASS1 humano como el analito de eleccion. El componente lipfdico cationi

administraron inyecciones unicas por via intravenosa y se tomaron muestras de hngado 24 horas despues de la administracion.

[0181] Las dosis de formulaciones fueron todas de 1,0 mg/kg basadas en ARNm encapsulado. Los valores se basan en muestras de tngado 24 horas despues de la administracion.

Tabla 2

Los valores sin procesar de la protema ASS1 humana para varios sistemas de nanopartfculas cationicas basadas en lfpidos se miden mediante un analisis ELISA (como se muestra en la Figura 9). Todas las dosis se administraron por via intravenosa a 1,0 mg/kg. Los valores de protema se representan como nanogramos de protema ASS1 humana por miligramo de protema hepatica total. cKK-E12 (1) tiene un porcentaje menor de lfpidos PEG que cKK-E12 (2) (3% frente a 5% de lfpidos PEG).

[0182] Mientras que la produccion de protema a traves de nanopartfculas lipfdicas cargadas con ARNm se puede detectar, se determino ademas si la protema resultante esta activa y puede funcionar correctamente. Con este fin, se realizaron estudios de actividad In Vitro que midieron la incorporacion de arginina 14C en protemas celulares a traves de la suplementacion con citrulina 14C. La citrulina radiactiva se convirtio en argininosuccinato 14C, y posteriormente en arginina 14C, en presencia de la protema ASS1 activa. Al comparar las celulas transfectadas con ARNm ASS1 humano frente a las celulas no tratadas, podrtamos evaluar la actividad de la protema ASS1 derivada de ARNm exogena respectiva. La Figura 9 representa los recuentos radiactivos por minuto de la incorporacion de arginina 14C en protemas celulares. La transfeccion de las celulas SK (-) (lmea celular knockout de la protema ASS1) con el ARNm ASS1 humano expuesto a medios agotados (sin arginina o leucina) produjo un aumento en la radioactividad observada en comparacion con las celulas SK no tratadas (-). La actividad medida en estas celulas transfectadas fue comparable a una lmea celular ASS1 positiva transfectada de manera estable (SK (+)).

Ejemplo 4. Niveles de protema ASS1 humana despues del tratamiento con nanoparticulas lipidicas ASS1 cargadas con ARNm

[0183] Este ejemplo demuestra que la administracion de ARNm ASS1 da como resultado la produccion exitosa de protema ASSl en el Idgado.

[0184] A los ratones CD-1 machos se les administro una dosis unica de 1,0 mg/kg de nanoparticulas lipfdicas (Nanoparticulas lipfdicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm ASS1) por via intravenosa o sin tratar (es decir, control), como se describio anteriormente en el Ejemplo 2. Los ratones se sacrificaron y los organos se recogieron 24 horas despues de la administracion. Los niveles de protema de sintetasa de argininosuccinato humana (ASS1) en el hfgado se midieron mediante ELISA. Estos datos demuestran que se detectaron niveles elevados de protema ASS1 en relacion con el control y que la protema producida resulto del ARNm ASS1 administrado por via intravenosa (Figura 10).

Ejemplo 5: Niveles de amomaco en plasma despues del tratamiento con nanoparticulas lipidicas ASS1 cargadas con ARNm

[0185] Este ejemplo demuestra que la administracion de ARNm ASS1 da como resultado una reduccion exitosa de los niveles de amonia en plasma.

[0186] A los ratones knock-out ASS1 se les administro 1,0 mg/kg de nanoparticulas lipidicas de ARNm ASS1 (Nanoparticulas lipidicas basadas en cKK-E12 cargadas con ARNm ASS1) o nanoparticulas lipidicas vadas una vez cada 14 dfas durante 30 dfas como se describe anteriormente en el Ejemplo 2. Ratones a los que se administraron nanoparticulas lipidicas vadas sirvieron como control del vehmulo. Los controles adicionales incluyeron ratones de tipo salvaje no tratados y ratones knockout ASS1 no tratados. Antes de cada dosis los dfas 1, 15 y 29, se recogieron muestras de plasma (es decir, antes de la dosis). Las muestras de plasma tambien se recolectaron dentro de las 24 horas siguientes a cada dosis los dfas 2, 16 y 30. Las muestras de plasma adicionales se recolectaron los dfas 8 y 22. Los niveles de amomaco en plasma se cuantificaron en todas las muestras y demostraron que los niveles de amomaco en plasma se redujeron de manera reproducible al menos 24 horas despues del tratamiento a niveles cercanos a los observados en ratones de tipo salvaje.

EQUIVALENTES

[0187] Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar, utilizando solo la experimentacion de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones espedficas de la invencion descritas en el presente documento. El alcance de la presente invencion no pretende limitarse a la descripcion anterior, sino que se establece en las siguientes reivindicaciones:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende un ARNm que codifica sintetasa de argininosuccinato (ASS1) para uso en el tratamiento de la deficiencia de sintetasa de argininosuccinato (ASD), en donde el tratamiento comprende administrar a un sujeto que necesita tratamiento la composicion a una dosis efectiva y un intervalo de administracion tal que al menos un smtoma o caractenstica de ASD se reduce en intensidad, severidad o frecuencia o se retrasa en el inicio, en donde:

el ARNm tiene una secuencia de nucleotidos al menos 90% identica a la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15; y

el ARNm es codon optimizado.

2. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el ARNm esta encapsulado dentro de un liposoma, opcionalmente en el que el liposoma comprende uno o mas lfpidos cationicos, uno o mas lfpidos no cationicos, uno o mas lfpidos basados en colesterol y uno o mas PEG lfpidos modificados, opcionalmente en los que:

(i) uno o mas lfpidos cationicos comprenden un lfpido cationico seleccionado del grupo que consiste en C12-200, MC3, DLinDMA, DLinKC2DMA, cKK-E12, ICE (a base de imidazol), HGT5000, HGT5001, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA y DMDMA, DODAC, DLinDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT400, y combinaciones de los mismos, opcionalmente en donde uno o mas lfpidos cationicos comprenden cKK-E12:

y/o

(ii) uno o mas lfpidos no cationicos se seleccionan de DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-snglicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo(1'-rac-glicerol)); y/o

(iii) uno o mas lfpidos a base de colesterol son colesterol y/o colesterol PEGilado; y/o

(iv) uno o mas lfpidos modificados con PEG comprenden una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lfpido con cadena(s) de alquilo de longitud C6-C20.

3. La composicion para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que el lfpido cationico constituye aproximadamente el 30-50% en peso del liposoma, opcionalmente en la que el lfpido cationico constituye aproximadamente el 40% en peso del liposoma; y/o en donde la relacion de lfpido cationico: lfpido no cationico: colesterol: lfpido PEGilado es aproximadamente (i) 40:30:20:10 en relacion molar, (ii) 40:30:25:5 en peso, o (iii) 40:32:25:3 en peso.

4. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en la que el liposoma comprende una combinacion seleccionada de:

cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K;

C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K;

HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; o

ICE, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K; y/o

en donde el liposoma tiene un tamano inferior a aproximadamente 100 nm.

5. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el ARNm se administra:

(a) a la dosis efectiva que vana de 0,1 a 5,0 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, de 0,1 a 3,0 mg/kg de peso corporal o de 0,1 a 1,0 mg/kg de peso corporal; y

(b) una vez a la semana, dos veces a la semana, dos veces al mes, una vez al mes o una vez cada 14 dfas

6. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la composicion se administra por via intravenosa.

7. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la protema ASS1 se expresa en el Imgado, y/o en la que la administracion de la composicion da como resultado:

(i) la expresion de un nivel de protema ASS1 igual o superior a aproximadamente 100 ng/mg de protema total en el Imgado; y/o

(ii) aumento del nivel de protema ASS1 en suero; y/o

(iii) reduccion del nivel de citrulina en el sujeto en comparacion con el nivel de referencia de citrulina antes del tratamiento; y/o

(iv) reduccion del nivel de amomaco en el sujeto en comparacion con el nivel de referencia de amomaco antes del tratamiento; y/o

(v) reduccion de los niveles de amomaco a aproximadamente 50 pmol/L o menos, aproximadamente 300 pmol/L o menos, o aproximadamente 1.500 pmol/L o menos, en el plasma.

8. La composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que:

(i) el ARNm optimizado por codon comprende la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14 o la SEQ ID NO: 15, en donde opcionalmente el ARNm comprende ademas (a) la secuencia UTR 5' de la SEQ ID NO: 4 o (b) la secuencia 3' UTR de la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6; y/o

(ii) el ARNm comprende la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8; y/o

(iii) el ARNm comprende uno o mas nucleotidos modificados, en donde opcionalmente uno o mas nucleotidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metilo-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metilo adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilo-citidina, C-5 propinilo-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinilo-uridina, C5-propinilo-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y/o 2-tiocitidina.

9. Una composicion que comprende un ARNm que codifica sintetasa de argininosuccinato (ASS1) en una cantidad de dosis efectiva encapsulada dentro de un liposoma, en la que:

el ARNm comprende (a) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 o (b) SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; y

el liposoma comprende lfpidos cationicos o no cationicos, lfpidos a base de colesterol y lfpidos modificados con PEG.