BR112016009014B1

BR112016009014B1 - USO DE COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO mRNA PARA DEFICIÊNCIA DE ARGININOSSUCINATO SINTETASE

Info

Publication number: BR112016009014B1
Application number: BR112016009014-4A
Authority: BR
Inventors: Michael Heartlein; Frank DeRosa; Lianne Smith
Original assignee: Translate Bio, Inc
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2014-10-22
Publication date: 2024-02-06
Also published as: AU2019222931A1; JP2016534992A; JP2022031483A; ES2954366T3; BR112016009014A2; MX2016005237A; EP3501605A1; EP3501605C0; US11224642B2; CA2928188A1; CN106413811A; US20150110859A1; EP3501605B1; AU2014340092A1; US20220218803A1; EP3060303A1; AU2014340092B2; EP4276176A3; JP2019163322A; EP4276176A2

Abstract

uso de composição compreendendo mrna para deficiência de argininossucinato sintetase e dita composição. a presente invenção apresenta, entre outros, métodos de tratamento de deficiência de argininosuccinato sintetase (asd) que inclui a administração, a um paciente que precise de tratamento, de uma composição compreendendo um mrna que codifica argininossucinato sintetase (ass1) a uma dose eficaz e um intervalo de administração de modo que pelo menos um sintoma ou característica de asd seja reduzido quanto à intensidade, severidade ou frequência ou tenha um surgimento tardio. em algumas modalidades, o mrna é encapsulado em um lipossoma que compreende um ou mais lipídios catiônicos, um ou mais lipídios não catiônicos, um ou mais lipídios à base de colesterol e um ou mais lipídios modificados por peg.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. com N° de Série 61/894.294, depositado em 22 de outubro de 2013, cuja divulgação é incorporada neste documento por referência.

FUNDAMENTOS

[0002] A deficiência de argininossucinato sintetase (ASD) é um distúrbio genético metabólico recessivo caracterizado por uma mutação genética para a enzima de argininossucinato sintetase (ASS1), afetando a sua capacidade de se ligar a citrulina, aspartato e outras moléculas. Defeitos na proteína ASS interrompem o ciclo de ureia e impedem o fígado de processar adequadamente o excesso de nitrogênio em ureia. Um acúmulo de amônia e outros subprodutos do ciclo da ureia (como citrulina) é tóxico e, quando ocorre durante os primeiros dias de vida, pode levar a sintomas como falta de energia (letargia), dificuldade para comer, vômito, convulsões e perda de consciência. No momento, não existe cura para a doença e o padrão de atendimento é através da gestão da dieta, minimização de alimentos contendo elevadas quantidades de proteína e suplementos de dieta de arginina e fenilacetato.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção proporciona, entre outras coisas, métodos e composições melhorados para o tratamento de deficiência de argininossucinato sintetase (ASD) à base de terapia de mRNA. A invenção engloba a constatação de que a entrega de um mRNA que codifica uma proteína ASS1 humana, encapsulada em lipossoma, resultou em uma produção in vivo de proteína sustentada e altamente eficiente e na redução bem-sucedida dos níveis de amônia no plasma, um marcador da doença clinicamente relevante.

[0004] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento de ASD, incluindo a entrega, a um paciente que precise de tratamento, de uma composição compreendendo um mRNA que codifica uma argininossucinato sintetase a uma dose eficaz e um intervalo de entrega de modo que pelo menos um sintoma ou característica de ASD seja reduzido quanto à intensidade, severidade ou frequência ou tenha um surgimento tardio. Em algumas modalidades, o mRNA é encapsulado em um lipossoma.

[0005] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona composições para o tratamento de ASD compreendendo um mRNA que codifica ASS1 a, no mínimo, uma quantidade de dose eficiente encapsulada em um lipossoma.

[0006] Em algumas modalidades, um lipossoma apropriado compreende um ou mais lipídios catiônicos, um ou mais lipídios não catiônicos, um ou mais lipídios à base de colesterol e um ou mais lipídios modificados por PEG.

[0007] Em algumas modalidades, um ou mais lipídios catiônicos são selecionados entre o grupo que consiste em C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, cKK-E12, ICE (à base de Imidazol), HGT5000, HGT5001, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA and DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT4003 e combinações destes.

[0008] Em algumas modalidades, um ou mais dos lipídios catiônicos compreendem um composto de fórmula I-c1-a: ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, onde: cada R2 é, independentemente, hidrogênio ou C1-3 alquil; cada q é, independentemente, de 2 a 6; cada R' é, independentemente, hidrogênio ou C1-3 alquil; e cada RL é, independentemente, C8-12 alquil.

[0009] Em algumas modalidades, um ou mais lipídios compreender cKK-E12:

[0010] Em algumas modalidades, um ou mais dos lipídios não catiônicos apropriados à invenção são selecionados dentre DSPC (1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2- dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo- (1'rac-glicerol)) e suas combinações.

[0011] Em algumas modalidades, um ou mais lipídios à base de colesterol são selecionados dentre colesterol, colesterol peguilado e DC- Chol (N, N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), l, 4-bis (3-N-oleilamino- propil) piperazina.

[0012] Em algumas modalidades, o lipossoma compreende ainda um ou mais lipídios modificados com PEG. Em algumas modalidades, um ou mais lipídios modificados com PEG compreendem uma cadeia de poli(etileno) glicol de até 5 kDa de comprimento covalentemente ligada a um lípido com cadeia(s) de alquilo de C6-C20 de comprimento. Em algumas modalidades, um lipídio modificado com PEG é uma ceramida derivada, como N-Octanoil-esfingosina-1-[Sucinil(metoxi polietilenoglicol)-2000]. Em algumas modalidades, um lipídio modificado com PEG ou PEGuilado é colesterol peguilado ou Dimiristoilglicerol (DMG)-PEG-2K.

[0013] Em algumas modalidades, o lipossoma apropriado compreende uma combinação selecionada dentre CKK-E12, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K; ou ICE, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K.

[0014] Em algumas modalidades, os lipídios catiônicos (por exemplo, CKK-E12, C12-200, ICE e/ou HGT4003) constituem cerca de 30-60% (por exemplo, cerca de 30-55%, cerca de 30-50%, cerca de 30-45%, cerca de 30-40%, cerca de 35-50%, cerca de 35-45% ou cerca de 35-40%) do lipossoma por razão molar. Em algumas modalidades, os lipídios catiônicos (por exemplo, CKK-E12, C12-200, ICE e/ou HGT4003) constituem cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55% ou cerca de 60% do lipossoma por razão molar.

[0015] Em algumas modalidades, a razão do(s) lipídio(s) catiônico(s) (por exemplo, CKK-E12, C12-200, ICE e/ou HGT4003) por lipídio(s) não catiônico(s) (por exemplo, DOPE) por lipídio(s) à base de colesterol (por exemplo, colesterol) por lipídio(s) PEGuilado(s) (por exemplo, a DMG- PEG2K) pode estar entre cerca de 30-60:25-35:20-30:1-15, respectivamente. Em algumas modalidades, a razão de lipídio(s) catiônico(s) (por exemplo, CKK-E12, C12-200, ICE e/ou HGT4003) por lípido não catiônico(s) (por exemplo, DOPE) por lípido(s) à base de colesterol (por exemplo, colesterol) por lipídio(s) PEGuilado(s) (por exemplo, DMG-PEG2K) é de aproximadamente 40:30:20:10, respectivamente. Em algumas modalidades, a razão de lipídio(s) catiônico(s) (por exemplo, CKK-E12, C12-200, ICE e/ou HGT4003) por lípido(s) não catiônico(s) (por exemplo, DOPE) por lípido(s) à base de colesterol (por exemplo, colesterol) por lipídio(s) PEGuilados (por exemplo, DMG-PEG2K) é de aproximadamente 40:30:25:5, respectivamente. Em algumas modalidades, a razão de lipídio(s) catiônico(s) (por exemplo, CKK- E12, C12-200, ICE e/ou HGT4003) por lipídio(s) não catiônico(s) (por exemplo, DOPE) por lipídio(s) à base de colesterol (por exemplo, colesterol) por lipídio(s) PEGuilado(s) (por exemplo, a DMG-PEG2K) pode estar entre cerca de 40:32:25:3, respectivamente. Em algumas modalidades, a razão de lipídio(s) catiônico(s) (por exemplo, CKK-E12, C12-200, ICE e/ou HGT4003) por lípido(s) não catiônico(s) (por exemplo, DOPE) por lípido(s) à base de colesterol (por exemplo, colesterol) por lipídio(s) PEGuilados (por exemplo, DMG-PEG2K) é de aproximadamente 50:25:20:5.

[0016] Em algumas modalidades, o tamanho de um lipossoma é determinado pelo comprimento do maior diâmetro da partícula do lipossoma. Em algumas modalidades, um lipossoma apropriado tem um tamanho inferior a cerca de 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm ou 50 nm. Em algumas modalidades, um lipossoma apropriado tem um tamanho inferior a cerca de 100 nm, 90 nm, 80 nm, 70 nm ou 60 nm.

[0017] Em algumas modalidades, o mRNA é administrado a uma dose que varia de cerca de 0,1-5,0 mg/kg de peso corporal, por exemplo cerca de 0,1-4,5, 0,1-4,0, 0,1-3,5, 0,1-3,0, 0,1-2,5, 0,1-2,0, 0,1-1,5, 0,1-1,0, 0,1-0,5, 0,1-0,3, 0,3-5,0, 0,3-4,5, 0,3-4,0, 0,3-3,5, 0,3-3,0, 0,3-2,5, 0,3-2,0, 0,3-1,5, 0,3 - 1,0, 0,3-0,5, 0,5-5,0, 0,5-4,5, 0,5-4,0, 0,5-3,5, 0,5-3,0, 0,5-2,5, 0,5-2,0, 0,5-1,5 ou 0,5-1,0 mg/kg de peso corporal. Em algumas modalidades, o mRNA é administrado a uma dose de ou inferior a cerca de 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,0, 0,8, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ou 0,1 mg/kg de peso corporal.

[0018] Em algumas modalidades, uma composição fornecida é administrada por via intravenosa. Em algumas modalidades, uma composição fornecida é administrada por entrega pulmonar. Em certas modalidades, a entrega pulmonar é realizada por aerossolização, inalação, nebulização ou instilação. Em algumas modalidades, as composições fornecidas são formuladas como partículas respiráveis, lipídios nebulizáveis ou pó seco inalável.

[0019] Em algumas modalidades, as composições fornecidas são administradas uma vez por dia, uma vez por semana, duas vezes por mês, uma vez por mês. Em algumas modalidades, as composições fornecidas são administradas uma vez a cada 7 dias, uma vez a cada 10 dias, uma vez a cada 14 dias, uma vez a cada 28 dias ou uma vez a cada 30 dias.

[0020] Em algumas modalidades, a proteína ASS1 é expressa no fígado. Em algumas modalidades, a entrega das composições fornecidas resulta na expressão de um nível de proteína ASS1 em ou acima de cerca de 100 ng/mg (por exemplo, igual ou acima de cerca de 200 ng/mg, 400 ng/mg, 500 ng/mg, 1000 ng/mg, 2000 ng/mg ou 3000 ng/mg) da proteína total no fígado.

[0021] Em algumas modalidades, a entrega da composição resulta em um maior nível de proteína de soro ASS1. Em algumas modalidades, a entrega da composição resulta em um maior nível de proteína de soro ASS1 em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou 5 vezes em comparação ao nível de proteína de soro de linha de base ASS1 antes do tratamento.

[0022] Em algumas modalidades, a entrega da composição resulta em um nível reduzido de citrulina ao indivíduo em comparação ao nível de citrulina de linha de base antes do tratamento. Em algumas modalidades, a entrega da composição resulta em um nível reduzido de citrulina no plasma em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% em comparação ao nível de citrulina no plasma de linha de base antes do tratamento. Em algumas modalidades, a entrega da composição resulta em um nível reduzido de citrulina no plasma de menos do que cerca de 2000 μM, 1500 μM, 1000 μM, 750 μM, 500 μM, 250 μM, 100 μM, 90 μM, 80 μM, 70 μM, 60 μM, 50 μM, 40 μM ou 30 μM.

[0023] Em algumas modalidades, a entrega da composição resulta em um nível reduzido de amônia ao indivíduo em comparação ao nível de amônia de linha de base antes do tratamento. Em algumas modalidades, a entrega da composição fornecida resultou na redução dos níveis de amônia a cerca de realização, a entrega da composição resultados fornecidos na redução dos níveis de amoníaco e cerca de 3000 μmol/L ou menos, cerca de 2,750 μmol/L ou menos, cerca de 2500 μmol/L ou menos, cerca de 2250 μmol/L ou menos, cerca de 2000 μmol/L ou menos, cerca de 1750 μmol/L ou menos, cerca de 1500 μmol/L ou menos, cerca de 1250 μmol/L ou menos, cerca de 1000 μmol/L ou menos, cerca de 750 μmol/L ou menos, cerca de 500 μmol/L ou inferior, cerca de 250 μmol/L ou menos, cerca de 100 μmol/L ou menos ou cerca de 50 μmol/L ou menos no plasma ou soro. Em uma modalidade particular, a entrega da composição fornecida resulta na redução dos níveis de amônia a cerca de 50 μmol/L ou menos no plasma ou no soro.

[0024] Em algumas modalidades, a entrega da composição fornecida resulta em um nível reduzido de amônia em uma amostra biológica em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75% , pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% em comparação com o nível de linha de base antes do tratamento com amônia. A amostra biológica apropriada pode ser o sangue completo, o soro, o plasma ou urina.

[0025] Em algumas modalidades, o mRNA é otimizado por códons. Em algumas modalidades, o mRNA otimizado por códons compreende a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO:15 (correspondendo às sequências de mRNA de ASS1 humana otimizadas por códons). Em algumas modalidades, o mRNA compreende a sequência de 5' UTR da SEQ ID NO:4 (correspondente à sequência X de 5' UTR). Em algumas modalidades, o mRNA compreende a sequência de 3' UTR da SEQ ID NO:5 (correspondente à sequência Y de 3' UTR). Em algumas modalidades, o mRNA compreende a sequência de 3' UTR da SEQ ID NO:6 (correspondente à sequência Y de 3' UTR). Em algumas modalidades, o mRNA otimizado por códons compreende a SEQ ID NO:7 ou a SEQ ID NO:8 (correspondentes à sequência de mRNA de ASS1 humana otimizada por códons com as sequências de 5’ UTR e 3’ UTR).

[0026] Em algumas modalidades, o mRNA compreende um ou mais nucleotídeos modificados. Em algumas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos modificados compreendem pseudouridina, N-1-metil- pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidine, inosina, pirrolo- pirimidina, adenosina 3-metilo, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina , C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridine, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5- propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7- deazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosine, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina e/ou 2-tiocitidina. Em algumas modalidades, o mRNA não é modificado.

[0027] Em modalidades específicas, a presente invenção fornece uma composição para o tratamento de ASD que compreende um mRNA que codifica a argininossucinato sintetase (ASS1) a uma quantidade de dose eficaz encapsulada em um lipossoma, em uqe o mRNA compreende a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15 e, ainda, em que o lipossoma compreende o lipídio catiônico ou não catiônico, lipídio à base de colesterol e lipídio modificado com PEG.

[0028] Em modalidades específicas, a presente invenção fornece uma composição para o tratamento de ASD que compreende um mRNA que codifica a argininossucinato sintetase (ASS1) a uma quantidade de dose eficaz encapsulada em um lipossoma, em uqe o mRNA compreende a SEQ ID NO:7 ou a SEQ ID NO:8 e, ainda, em que o lipossoma compreende o lipídio catiônico ou não catiônico, lipídio à base de colesterol e lipídio modificado com PEG.

[0029] Outros objetivos, características e vantagens da invenção atual serão evidentes a partir da descrição detalhada, das figuras e das reivindicações a seguir. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada, as figuras e as reivindicações, embora indiquem as modalidades da presente invenção, são oferecidas apenas a título de ilustração, não como limitação. Várias alterações e modificações dentro do escopo da invenção se tornará aparentes para os versados na técnica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0030] As figuras são apenas para fins de ilustração, não de limitação.

[0031] A Figura 1 representa níveis exemplificativos de proteína ASS1 através de ELISA depois do tratamento com nanopartículas de lipídio à base de cKK-E12 carregada com mRNA de ASS1 em várias doses.

[0032] As Figuras 2A-2D representa Western blots exemplificativas que comparam os níveis de proteína ASS1 humana como uma função de dose depois de uma única dose intravenosa de nanopartículas de lipídio encapsulado com mRNA de ASS1 humana. Os camundongos CD1 foram sacrificados 24 horas após a entrega e os fígados foram coletados e analisados conforme descrito acima. A proteína ASS1 humana foi detectada utilizando um anticorpo monoclonal de camundongo 2H8. 50 microgramas de proteína total do fígado foram carregados em cada poço. A proteína humana recombinante ASS1 foi carregada em cada legal como um controle positivo (controle R5).

[0033] A Figura 3 representa um gráfico exemplificativo de níveis de proteína de sintetase de argininosucinato humana (ASS1) acumulada conforme medidos por ELISA. A proteína detectada foi resultado de sua produção a partir do mRNA de ASS1 administrado por via intravenosa em uma única dose de nanopartículas de lipídios (1,0 mg/lg de mRNA de ASS1 encapsulado). ao longo do tempo.

[0034] As Figuras 4A-4E representam exemplos de Western blots de níveis de proteína de ASS1 humana no fígado ao longo do tempo depois de uma única dose intravenosa de nanopartículas de lipídio encapsulado com mRNA de ASS1 humana (dose de 1,0 mg/kg).

[0035] As Figuras 5A-5I representam um RNA mensageiro de ASS1 humana através da hibridização in situ nos fígados dos cmaundongos tratados. O mRNA exógeno é observável por pelo menos 7 dias após a entrega de uma única dose (1,0 mg/kg) de nanopartículas de lipídio à base de cKK-E12 carregado com mRNA de ASS1. O mRNA de ASS1 humana é detectável em células sinusoidais, bem como hepatócitos.

[0036] As Figuras 6A-6I representam a coloração imuno- histoquímica dos níveis da proteína ASS1 no fígado do camundongo em vários pontos de tempo depois da entrega de 1 mg/kg de mRNA de ASS1 contendo nanopartículas de lipídio cKK-E12. A proteína ASS1 humana é detectável em células sinusoidais, bem como hepatócitos. A proteína ASS1 humana é detectável por pelo menos uma semana após a entrega de uma única dose de nanopartículas de lipídio carregado com mRNA de ASS1.

[0037] As Figuras 7A-7B representam uma coloração imuno- histoquímica de baixa magnificação (4x) dos níveis de proteína ASS1 no fígado do camundongo 24 depois da entrega de 1mg/kg de lipossomas de cKK-E12 carregado com mRNA de ASS1. A comparação com fígado de camundongo não tratado (esquerda) demonstra a ampla entrega da proteína ASS1 humana ao longo do fígado.

[0038] A Figura 8 representa um gráfico exemplificativo dos níveis de proteína de argininossucinato sintetase (ASS1) humana conforme medidos por ELISA. A proteína detectada foi resultado de sua produção a partir do mRNA de ASS1 administrado por via intravenosa em uma única dose de várias nanopartículas de lipídios.

[0039] AFigura 9 representa a incorporação de 14C Arginina às proteínas após a transfecção de mRNA de ASS1 em uma linha de células KO de ASS1 (SK (-)) em comparação a uma linha de células de expressão positiva de AS1 positiva (SK (+), Clone #5). O controle representa células SK (-) tratadas apenas com lipofectamina.

[0040] A Figura 10 representa os níveis de proteína ASS1 humana no fígado de um rato 24 horas depois da entrega de nanopartículas de lipídio carregado com mRNA de ASS1.

[0041] AFigura 11 representa os níveis de amônia no plasma em camundongos nocaute ASS1 a que foram administrados 1,0 mg/kg de nanopartículas de lipídio carregado com mRNAde ASS1 em 14 dias por 30 dias.

DEFINIÇÕES

[0042] No intuito da presente invenção ser mais facilmente compreendida, determinados termos são definidos abaixo. Definições adicionais para os seguintes termos e outros termos são estabelecidas em todo o relatório descritivo. As publicações e outros materiais de referência mencionados aqui para descrever os fundamentos ad invenção e para fornecer detalhes adicionais acerca de sua prática são incorporados aqui por referência.

[0043] Alquil: Conforme utilizado aqui, "alquil" se refere a um radical de um grupo de hidrocarboneto saturado ramificado ou de cadeia simples tendo de 1 a 15 átomos de carbono ("C1-15 alquil"). Em algumas modalidades, um grupo alquil tem de 1 a 3 átomos de carbono ("C1-3 alquil"). Exemplos de grupos C1-3 alquil incluem metil (C1), acetato (C2), n- propil (C3) e isopropil (C3). Em algumas modalidades, um grupo alquil tem de 8 a 12 átomos de carbono ("C8-12 alquil"). Exemplos de grupos C8-12 alquil incluem, sem limitação, n-octil (C8), n-nonil (C9), n-decil (C10), nundecil (C11), n-dodecil (C12) e similares. O prefixo "n- "(normal) se refere a grupos alquil não ramificados. Por exemplo, n-C8 alquil refere-se a -(CH2)7CH3, n-C10 alquil refere-se a -(CH2)9CH3, etc.

[0044] Aminoácido: Conforme utilizado aqui, o termo "aminoácido", em seu sentido mais amplo, refere-se a qualquer composto e/ou substância que podem ser incorporados a uma cadeia polipeptídica. Em algumas modalidades, um aminoácido tem uma estrutura geral H2N-C(H)(R)-COOH Em algumas modalidades, um aminoácido é um aminoácido de ocorrência natural. Em algumas modalidades, um aminoácido é um aminoácido de síntese; em algumas modalidades, um amino ácido é um d-aminoácido; em algumas modalidades, um aminoácido é um 1-aminoácido. "Aminoácido padrão" refere-se a qualquer um dos vinte 1-aminoácidos padrão normalmente encontrados em peptídeos de ocorrência natural. "Aminoácido não padrão" refere-se a qualquer aminoácido, com exceção dos aminoácidos padrão, independentemente do fato de ser preparado sinteticamente ou obtido a partir de uma fonte natural. Conforme utilizado aqui, "aminoácido sintético" engloba aminoácidos quimicamente modificados, incluindo, mas não se limitando a sais, derivados de aminoácido (como amidas) e/ou substituições. Os aminoácidos, incluindo os aminoácidos carboxi e/ou amino-terminais em peptídeos, podem ser modificados por metilação, amidação, acetilação, grupos de proteção e/ou substituição por outros grupos químicos que podem mudar a meia-vida da circulação do peptídeo sem afetar negativamente sua atividade. Os aminoácidos podem participar de uma ligação de dissulfureto. Os aminoácidos podem compreender uma ou ou mais modificações pós- tradução, como uma associação a uma ou mais entidades químicas (por exemplo, grupos metil, grupos etil, grupos acetil, grupos fosfato, unidades isoprenoides, grupos formil, grupos sulfato, porções de polietileno glicol, porções de lipídios, porções de carboidratos, porções de biotina, etc.). O termo "aminoácido" é utilizado de modo intercambiável com "resíduo de aminoácido" e pode se referir a um aminoácido livre e/ou a um resíduo de aminoácido de um peptídeo. Ficará evidente a partir do contexto em que o termo é utilizado se ele se refere a um aminoácido livre ou a um resíduo de um peptídeo.

[0045] Animal: Como utilizado aqui, o termo "animal" se refere a qualquer membro do reino animal. Em algumas modalidades, "animal" refere-se aos seres humanos, em qualquer estágio de desenvolvimento. Em algumas modalidades, "animal" refere-se a animais não humanos, em qualquer estágio de desenvolvimento. Em determinadas modalidades, o animal não humano é um mamífero (por exemplo, um roedor, um camundongo, um rato, um coelho, um macaco, um cachorro, um gato, uma ovelha, gado, um primata, e/ou um porco). Em algumas modalidades, animais incluem, mas não estão limitados a, mamíferos, aves, répteis, anfíbios, peixes, insetos e/ou vermes. Em algumas modalidades, um animal pode ser um animal transgênico, animal geneticamente modificado e/ou um clone.

[0046] Aproximadamente ou cerca de: Neste documento, o termo "aproximadamente" ou "cerca de", como aplicado a um ou mais valores de interesse, refere-se a um valor que é semelhante a um valor de referência indicado. Em determinadas modalidades, o termo "aproximadamente" ou "cerca de" refere-se a um intervalo de valores que se enquadram dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos em qualquer direção (maior ou menor do que) do valor de referência declarado salvo indicação em contrário ou caso contrário evidente do contexto (exceto onde tal número excede 100% de um valor possível).

[0047] Biologicmente ativo: Como utilizada aqui, a expressão "biologicamente ativo" refere-se a uma característica de qualquer agente que tem atividade em um sistema biológico e particularmente em um organismo. Por exemplo, um agente que, quando administrado a um organismo, tem um efeito biológico no organismo, é considerado biologicamente ativo.

[0048] Entrega: Como utilizado aqui, o termo "entrega engloba uma entrega local e sistêmica. Por exemplo, a entrega de mRNA engloba situações em que um mRNA é administrado a um tecido alvo e a proteína codificada é expressa e retida no tecido alvo (também denominada "distribuição local" ou "entrega local") e situações em que um mRNA é administrado a um tecido alvo e a proteína codificada é expressa e secretada no sistema circulatório do paciente (por exemplo, soro) e sistematicamente distribuída e absorvida por outros tecidos (também denominada "distribuição sistêmica" ou "entrega sistêmica).

[0049] Expressão: Como utilizado aqui, "expressão" de uma sequência de ácidos nucleicos se refere à tradução de um mRNA em um polipeptídeo, agrupamento de múltiplos polipeptídeos em uma proteína intacta (por exemplo, enzima) e/ou modificação pós-tradução de um polipeptídeo ou de uma proteína completamente agrupada (por exemplo, enzima). Nesta aplicação, os termos "expressão" e "produção" e equivalentes gramaticais são utilizados intercambiavelmente.

[0050] Funcional: Como utilizado aqui, uma molécula biológica "funcional" é uma molécula biológica em uma forma em que apresenta uma propriedade e/ou atividade pela qual é caracterizada.

[0051] Meia-vida: Como utilizado aqui, o termo "meia-vida" é o tempo necessário para uma quantidade, como a concentração do da proteína ou do ácido nucleico, cair pela metade do seu valor medido no início de um período de tempo.

[0052] Melhorar, aumentar ou reduzir: Como utilizados aqui, os termos "melhorar", "aumentar" ou "reduzir" ou equivalentes gramaticais, indicam valores que são relativos a uma medida de linha de base, tal como uma medida no mesmo indivíduo antes da iniciação do tratamento descrito neste documento, ou uma medição em um objeto de controle (ou vários objetos de controle) na ausência de tratamento descrito neste documento. Um "indivíduo de controle" é um indivíduo afligido com a mesma forma de doença que o sujeito a ser tratado, que é quase da mesma idade que o indivíduo a ser tratado.

[0053] In vitro: Como utilizado aqui, o termo “in vitro” refere-se aos eventos que ocorrem em um ambiente artificial, por exemplo, em um tubo de ensaio ou recipiente de reação, na cultura de célula, etc., em vez de dentro de um organismo multicelular.

[0054] In vivo: Como utilizado aqui, o termo “in vivo” refere-se aos eventos que ocorrem dentro de um organismo multicelular, como um humano e um animal não humano. No contexto dos sistemas baseados em células, o termo pode ser utilizado para se referir a eventos que ocorrem dentro de uma célula viva (ao contrário de, por exemplo, em sistemas in vitro).

[0055] Isolado: Conforme utilizado aqui, o termo "isolado" refere-se a uma substância e/ou a entidade que foi (1) separada de pelo menos alguns dos componentes com os quais estava associada quando inicialmente produzida (se na natureza e/ou em uma configuração experimental) e/ou (2) produzida, preparada e/ou fabricada por mão humana. As substâncias e/ou entidades isoladas podem ser separados a partir de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais do que cerca de 99% dos outros componentes aos quais elas foram inicialmente associadas. Em algumas modalidades, os agentes isolados são cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% , cerca de 99% ou mais do que cerca de 99% puros. Conforme utilizado aqui, uma substância é "pura" se for substancialmente livre de outros componentes. Conforme utilizado aqui, o cálculo da pureza percentual das substâncias e/ou entidades isoladas não deve incluir excipientes isolado (por exemplo, tampão, solvente, água, etc.).

[0056] Distribuição ou entrega local: Conforme utilizados aqui, os termos "distribuição local", "entrega local" ou equivalentes gramaticais referem-se à distribuição ou entrega específica ao tecido. Normalmente, a distribuição ou a entrega local requerem que uma proteína (por exemplo, enzima) codificada pelos mRNAs seja traduzida e expressa de modo intracelular ou com secreção limitada para evitar a entrada no sistema circulatório do paciente.

[0057] RNA mensageiro (mRNA): Conforme utilizado aqui, o termo "RNA mensageiro (mRNA)" se refere a um polinucleotídeo que codifica pelo menos um polipeptídeo. mRNA, conforme utilizado aqui, engloba RNA modificado e não modificado. O mRNA pode conter uma ou mais regiões codificantes e não codificantes. O mRNA pode ser purificado a partir de fontes naturais, produzido utilizando sistemas de expressão recombinante e, opcionalmente, purificado, quimicamente sintetizado, etc. Onde apropriado, por exemplo, No caso de moléculas sintetizadas quimicamente, o mRNA pode compreender análogos de nucleosídeos, como análogos tendo bases quimicamente modificadas ou açúcares, modificações de estrutura, etc. Uma sequência de mRNA é apresentada na direção de 5' a 3', salvo quando houver outra indicação. Em algumas modalidades, um mRNA é ou compreende nucleosídeos naturais (por exemplo, adenosina, guanosina, citidina, uridina); análogos de nucleosídeos (por exemplo, 2- aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina , 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2- aminoadenosina, C5-bromouridine, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5- propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7- deazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosine, 8-oxoguanosina, O (6) -metilguanina e 2- tiocitidina); bases quimicamente modificadas; bases biologicamente modificadas (por exemplo, bases metiladas); bases intercaladas; açúcares modificados (por exemplo, 2'-fluororribose, ribose, 2'-desoxirribose, arabinose e hexose); e/ou grupos de fosfato modificados (por exemplo, fosforotioatos e ligações de 5'-N-fosforamidita).

[0058] Ácido nucleico: Conforme utilizado aqui, o termo "ácido nucleico", em seu sentido mais amplo, refere-se a qualquer composto e/ou substância que é ou pode ser incorporado a uma cadeia polinucleotídica Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um composto e/ou substância que é ou pode ser incorporada a uma cadeia polinucleotídica por meio de uma ligação de fosfodiéster. Em algumas modalidades, "ácido nucleico" se refere a resíduos individuais de ácidos nucleicos (por exemplo, nucleotídeos e/ou nucleosídeos). Em algumas modalidades, "ácido nucleico" se refere a uma cadeia polinucleotídica que compreende resíduos individuais de ácido nucleico. Em algumas modalidades, "ácido nucleico" engloba RNA, bem como um DNA de fita simples e/ou dupla e/ou cDNA.

[0059] Paciente: Conforme utilizado aqui, o termo "paciente" ou "indivíduo" refere-se a qualquer organismo para o qual uma composição fornecida pode ser administrada, por exemplo, para fins experimentais, diagnósticos, profiláticos, cosméticos e/ou terapêuticos. Os pacientes típicos incluem animais (por exemplo, mamíferos como camundongos, ratos, coelhos, primatas não humanos e/ou humanos). Em algumas modalidades, o paciente é um humano. Um ser humano inclui formas pré e pós-natais.

[0060] Farmaceuticamente aceitável: O termo "farmaceuticamente aceitável", conforme utilizado neste documento, refere-se àquelas substâncias que dentro do escopo do bom julgamento médico, são adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais, sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, proporcional a uma razão de risco/benefício razoável.

[0061] Sal farmaceuticamente aceitável: Os sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, S. M. Berge, et al. descrevem sais farmaceuticamente aceitáveis em J. Farmaceutical Sciences (1977) 66:1-19. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem os derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos apropriados. Exemplos de sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos são sais de um grupo amino formados com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou com ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido sucínico ou ácido malônico ou usando outros métodos utilizados na técnica tais como permuta iônica. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formato, fumarato, gluco-heptonato, glicerofosfato, gluconato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, iodidrato, 2- hidroxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3- fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, p-toluenossulfonato, undecanoato, sais de valerato e semelhantes. Os sais derivados de bases apropriadas incluem metal alcalino, metal alcalino-terroso, amônio e sais de N+(C1-4 alquil)4 . Sais de metal alcalino ou alcalino-terroso representativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e semelhantes. Além disso, sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, quando apropriado, amônio não tóxico, amônio quaternário, e cátions de amina formados usando contra- íons tais como halogeneto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquil inferior e sulfonato de aril. Além disso, os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais formados a partir da quaternização de uma amina utilizando um eletrófilo adequado, por exemplo: um halogeneto de alquil, para formar um sal de amino alquilado quaternizados.

[0062] Distribuição ou entrega sistêmica: Conforme utilizados aqui, os termos "distribuição sistêmica", "entrega sistêmica" ou equivalentes gramaticais se referem a uma entrega ou mecanismo de entrega ou abordagem que afete o corpo todo ou todo um organismo. Normalmente, a distribuição ou entrega sistêmica é obtida por meio do sistema circulatório do corpo, por exemplo: o fluxo sanguíneo. Em comparação à definição de "distribuição ou entrega local."

[0063] Indivíduo: Como utilizado aqui, o termo "indivíduo" se refere a um ser humano ou qualquer animal não humano (por exemplo, camundongo, rato, coelho, cão, gato, gado, suíno, ovelhas, cavalo ou primata). Um ser humano inclui formas pré e pós-natais. Em muitas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Um indivíduo pode ser um paciente, o qual se refere a um humano apresentando a um médico para diagnóstico ou tratamento de uma doença. O termo "indivíduo" é utilizado neste documento de modo intercambiável com "sujeito" ou "paciente". Um sujeito pode ser afligido com ou suscetível a uma doença ou distúrbio mas pode ou não pode exibir os sintomas da doença ou distúrbio.

[0064] Substancialmente: Como utilizado aqui, o termo "substancialmente" refere-se à condição qualitativa de extensão de exposição total ou quase total ou grau de uma característica ou propriedade de interesse. Alguém minimamente versado nas técnicas biológicas compreenderá que fenômenos biológicos e químicos raramente, ou nunca, vão até a conclusão e/ou procedem à completude ou obtêm ou evitam um resultado absoluto. O termo "substancialmente" é utilizado neste documento, portanto, para capturar a falta potencial de completude inerente a muitos fenômenos biológicos e químicos.

[0065] Tecidos alvo: Como utilizado aqui, o termo "tecidos-alvo" se refere a todo tecido que é afetado por uma doença a ser tratada. Em algumas modalidades, os tecidos alvo incluem aqueles tecidos que apresentam sintoma, patologia ou característica associadas à doença.

[0066] Quantidade terapeuticamente eficaz: Como utilizado aqui, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente terapêutico denota uma quantidade que é suficiente, quando administrada em um indivíduo que sofre de ou é suscetível a uma doença, distúrbio e/ou condição cínica, para tratar, diagnosticar, prevenir e/ou retardar o aparecimento de sintoma(s) da doença, distúrbio, e/ou condição clínica Será apreciado por aqueles minimamente versados na técnica que uma quantidade terapeuticamente eficaz é normalmente administrada através de um regime de entrega, compreendendo pelo menos uma dose unitária.

[0067] Tratamentos: Como utilizado aqui, o termo "tratar", "tratamento", ou "em tratamento" refere-se a qualquer método utilizado parcialmente ou completamente para aliviar, amenizar, aliviar, inibir, prevenir, retardar o aparecimento de, reduzir a severidade da e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou características de uma determinada doença, distúrbio e/ou condição clínica. Tratamento pode ser administrado para um sujeito que não apresenta sinais de doenças e/ou apresenta apenas sinais precoces da doença com a finalidade de diminuir o risco de desenvolver patologia associada com a doença.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0068] A presente invenção proporciona, entre outras coisas, métodos e composições para o tratamento de deficiência de sintetase de argininosucinato (ASD) à base de terapia de mRNA. Particularmente, a presente invenção proporciona um método de tratamento de ASD pela entrega a um paciente que precise de tratamento, de uma composição compreendendo um mRNA que codifica uma argininossucinato sintetase (ASS) a uma dose eficaz e um intervalo de entrega de modo que pelo menos um sintoma ou característica de ASD seja reduzido quanto à intensidade, severidade ou frequência ou tenha um surgimento tardio. Em algumas modalidades, o mRNA é encapsulado em um ou mais lipossomas Conforme utilizado aqui, o termo "lipossoma" se refere a qualquer vesícula de nanopartícula sólida, lamelar ou multilamelar. Tipicamente, um lipossoma, tal como utilizado aqui, pode ser formado pela mistura de um ou mais lipídios ou pela mistura de um ou mais lipídios e polímero(s). Assim, o termo "lipossoma", tal como utilizado aqui, engloba nanopartículas à base de lipídio e polímero. Em algumas modalidades, um lipossoma apropriado para a presente invenção contém lipídio(s) catiônico(s) ou não catiônico(s), lipídio(s) à base de colesterol e lipídio(s) modificados por PEG.

Deficiência de argininossucinato sintetase (ASD)

[0069] A presente invenção pode ser utilizada para tratar um indivíduo que sofre de ou é suscetível à deficiência de sintetase de argininosucinato (ASD). ASD é um distúrbio genético metabólico recessivo autossômico caracterizado por uma mutação no gene para a enzima da argininossucinato sintetase (ASS1). Pelo menos 50 mutações que causam ASD tipo I foram identificadas no gene ASS1. A maior parte dessas mutações envolve substituições únicas de aminoácido. Muitas das mutações no gene ASS1 provavelmente afetam a estrutura da proteína resultante e sua capacidade de se ligar a citrulina, aspartato e outras moléculas. Algumas das mutações no gene ASS1 levam à produção de uma versão atipicamente curta da enzima que não pode desempenhar de maneira eficaz o seu papel no ciclo da ureia.

[0070] Defeitos na proteína ASS1 interrompem o ciclo de ureia e impedem o fígado de processar devidamente o excesso de nitrogênio, que é gerado quando a proteína é utilizada para fins energéticos, em ureia. Um acúmulo de amônia e outros subprodutos do ciclo da ureia (como citrulina) é tóxico e, quando ocorre durante os primeiros dias de vida, pode levar a sintomas como falta de energia (letargia), dificuldade para comer, vômito, convulsões e perda de consciência. Esses problemas médicos podem, em muitos casos, oferecer risco de morte.

[0071] As composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados para tratar pelo menos um sintoma ou característica de ASD.argininossucinato sintetase (ASS1)

[0072] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos e composições para administrar um mRNA que codifica ASS1 para um indivíduo para tratar a deficiência de argininossucinato sintetase (ASD). Um mRNA de ASS1 adequado codifica qualquer comprimento completo, fragmento ou porção de uma proteína ASS1 que pode ser substituída para a atividade da proteína ASS1 de ocorrência natural e/ou reduzir a intensidade, severidade e/ou frequência de um ou mais sintomas associados à ASD.

[0073] Em algumas modalidades, uma sequência de mRNA adequada é uma sequência de mRNA que codifica a proteína ASS1 humana. A sequência de mRNA de ASS1 humana de ocorrência natural e a sequência de aminoácidos correspondente são mostradas na Tabela 1: Tabela 1. ASS1 humana

[0074] Em algumas modalidades, um mRNA adequado é um mRNA de hASS1 de tipo selvagem da sequência (SEQ ID NO:1). Em algumas modalidades, um mRNA adequado pode ser uma sequência de hASS1 otimizada por códons, como a sequência mostrada abaixo: AUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGC CUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACG ACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGA GGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUC AUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCCCG CCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCAC CAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCC CAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGG GCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCC CCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACAAC CGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACG GCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGA GAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCC AAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCG CCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAG GGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCACC AGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAA GCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGC AUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGU ACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGU GCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUG UACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACU GCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAG CGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCUG AGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACU ACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGC CUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGA (SEQ ID NO:3)

[0075] As sequências exemplificativas de mRNA são descritas nos Exemplos da seção abaixo, por exemplo, SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, as quais incluem, ambas, regiões não traduzidas 5' e 3' que estruturam um mRNA de codificação de ASS1 otimizada por códons.

[0076] Em algumas modalidades, uma sequência de mRNA adequada pode ser uma sequência de mRNA homóloga ou análoga à proteína de ASS1 humana. Por exemplo, um homólogo ou análogo da proteína ASS1 humana pode ser uma proteína ASS1 humana modificada contendo uma ou mais substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácidos em comparação a uma proteína ASS1 humana de ocorrência natural ou de tipo selvagem, ao mesmo tempo em que retém a atividade da proteína ASS1 substancial. Em algumas modalidades, um mRNA apropriado para a presente invenção codifica a sequência de aminoácidos em pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de homologia com a SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, um mRNA apropriado para a presente invenção codifica uma proteína substancialmente idêntica à proteína ASS1 humana. Em algumas modalidades, um mRNA adequado para a presente invenção codifica uma sequência de aminoácidos em pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica à SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, um mRNA apropriado para a presente invenção codifica um fragmento ou uma porção da proteína ASS1 humana. Em algumas modalidades, um mRNA adequado para a presente invenção codifica um fragmento ou uma porção da proteína ASS1 humana, onde o fragmento ou a porção da proteína ainda mantém a atividade de ASS1 semelhante à da proteína de tipo selvagem. Em algumas modalidades, um mRNA apropriado para a presente invenção tem uma sequência nucleotídica em pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntica às SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15.

[0077] Em algumas modalidades, um mRNA adequado codifica uma proteína de fusão que compreende uma extensão total, um fragmento ou uma porção de uma proteína ASS1 fundida a outra proteína (por exemplo, uma fusão de terminação N ou C). Em algumas modalidades, a proteína fundida ao mRNA que codifica uma extensão total, um fragmento ou uma porção de uma proteína ASS1 codifica um sinal ou uma sequência de direcionamento celular.

Veículos de entrega

[0078] De acordo com a presente invenção, o mRNA que codifica uma proteína ASS1 (por exemplo, uma extensão total, um fragmento ou uma porção de uma proteína ASS1), conforme descreve-se aqui, pode ser administrado como um RNA puro (sem revestimento) ou por meio de veículos de entrega. Conforme utilizados aqui, os termos "veículo de entrega", "veículo de transferência", "nanopartícula" ou algum equivalente gramatical são utilizados de modo intercambiável.

[0079] Em algumas modalidades, os mRNAs que codificam uma proteína ASS1 pode ser administrava por meio de um único veículo de entrega. Em algumas modalidades, os mRNAs que codificam uma proteína ASS1 podem ser administrados por um ou mais veículos de entrega, cada um de uma composição diferente. De acordo com várias modalidades, os veículos de entrega adequados incluem, mas são limitados a transportadores à base de polímeros, como polietilenoimina (PEI), nanopartículas de lípidos e lipossomas, nanolipossomas, nanolipossomas contendo ceramida, proteolipossomas, tanto naturais como exossomas sinteticamente derivados, corpos lamelares naturais, sintéticos e seminaturais, nanoparticulados, nanoparticulados de fósforo-silicato, nanoparticulados de fosfato de cálcio, nanoparticulados de dióxido de silício, partículas nanocristalinas, nanoparticulados semicondutores, poli (D- arginina), sol-géis, nanodendrímeros, sistemas de entrega à base de amido, micelas, emulsões, niossomas, polímeros multi-domínio-bloco (polímeros de vinil, polímeros de ácido acrílico de polipropil, policonjugados dinâmicos), formulações de pó seco, plasmídeos, vírus, nucleótidos de fosfato de cálcio, aptâmeros, peptídeos e outras marcações vetoriais.

Veículos de entrega lipossômica

[0080] Em algumas modalidades, um veículo de entrega apropriado é um veículo de entrega lipossômica, por exemplo, uma nanopartícula de lípido. Como utilizados aqui, os veículos de entrega lipossômica, por exemplo, nanopartículas de lípidos, são normalmente caracterizados como vesículas microscópicas com um espaço interior aquoso sequestrado de um meio externo por uma membrana de uma ou mais camada dupla. Membranas de camada dupla de lipossomos são tipicamente formadas por moléculas anfifílicas, como lipídios de origem sintética ou natural que compreendem domínios hidrofóbicos e hidrofílicos separados espacialmente (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). As membranas de camada dupla dos lipossomos também podem ser formadas por polímeros anfofílicos e surfactantes (por exemplo, polimerossomos, niossomos, etc.). No contexto da presente invenção, um veículo de entrega lipossômica normalmente serve para transportar um mRNA desejado a uma célula ou tecido alvo.

Lipídios catiônicos

[0081] Em algumas modalidades, os lipossomos podem compreender um ou mais lipídios catiônicos. Conforme utilizado aqui, o termo "lipídio catiônico" se refere a qualquer um dentre uma série de espécies de lipídio que têm uma carga positiva de rede a um pH selecionado, como pH fisiológico. Vários lipídios catiônicos foram descritos na literatura, muitos deles encontram-se disponíveis no mercado. Lípidos catiônicos particularmente adequados para utilização nas composições e métodos da invenção incluem os descritos nas publicações internacionais de patente WO 2010/053572 (e, particularmente, CI2-200, descrito no parágrafo [00225]) e WO 2012/170930, ambos incorporados aqui por referência. Em certas modalidades, as composições e métodos da invenção utilizam nanopartículas de lipídio que compreendem um lipídio catiônico ionizável descrito no pedido de patente provisório U.S. 61/617.468, depositado em 29 de março de 2012 (aqui incorporado por referência), como, por exemplo, (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z, 12Z) octadeca-9, 12-dien-l-il)tetracosa-15,18- dien-1-amina (HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-il)tetracosa-4,15,18-trieno-l-amina (HGT5001) e (15Z, 18Z)-N,N- dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-il)tetracosa-5, 15, 18-trien-1- amina (HGT5002).

[0082] Em algumas modalidades, os lipossomas fornecidos incluem um lipídio catiônico descrito em WO 2013063468 e no pedido provisório U.S. intitulado “Lipid Formulations for Deliveri of Messernger RNA” depositado simultaneamente com o presente pedido de patente no mesmo dia, ambos aqui incorporados por referência.

[0083] Em algumas modalidades, um lípido catiônico compreende um composto de fórmula I-c1-a: ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, onde: cada R2 é, independentemente, hidrogênio ou C1-3 alquil; cada q é, independentemente, de 2 a 6; cada R' é, independentemente, hidrogênio ou C1-3 alquil; e cada RL é, independentemente, C8-12 alquil.

[0084] Em algumas modalidades, cada R2 é, independentemente, hidrogênio, metil ou etil. Em algumas modalidades, cada R2 é, independentemente, hidrogênio ou metil. Em algumas modalidades, cada R2 é hidrogênio.

[0085] Em algumas modalidades, cada q é, independentemente, de 3 a 6. Em algumas modalidades, cada q é, independentemente, de 3 a 5. Em algumas modalidades, cada q é 4.

[0086] Em algumas modalidades, cada R' é, independentemente, hidrogênio, metil ou etil. Em algumas modalidades, cada R' é, independentemente, hidrogênio ou metil. Em algumas modalidades, cada R' é, independentemente, hidrogênio.

[0087] Em algumas modalidades, cada RL é, independentemente, C8-12 alquil. Em algumas modalidades, cada RL é, independentemente, n- C8-12 alquil. Em algumas modalidades, cada RL é, independentemente, C9-11 alquil. Em algumas modalidades, cada RL é, independentemente, n-C9-11 alquil. Em algumas modalidades, cada RL é, independentemente, C10 alquil Em algumas modalidades, cada RL é, independentemente, n-C10 alquil.

[0088] Em algumas modalidades, cada R2 é, independentemente, hidrogênio ou metil; cada q é, independentemente, de 3 a 5; cada R' é, independentemente, hidrogênio ou metil; e cada RL é, independentemente, C8-12 alquil.

[0089] Em algumas modalidades, cada R2 é hidrogênio; cada q é, independentemente, de 3 a 5; cada R' é hidrogênio; e cada RL é, independentemente, C8-12 alquil.

[0090] Em algumas modalidades, cada R2 é hidrogênio; cada q é 4 cada R' é hidrogênio; e cada RL é, independentemente, C8-12 alquil.

[0091] Em algumas modalidades, um lipídio catiônico compreende um composto de fórmula I-g: ou um sal farmaceuticamente aceitável seu, em que cada independentemente, C8-12 alquil. Em algumas modalidades, cada independentemente, n-C8-12 alquil. Em algumas modalidades, cada independentemente, C9-11 alquil. Em algumas modalidades, cada independentemente, n-C9-11 alquil. Em algumas modalidades, cada R independentemente, C10 alquil. Em algumas modalidades, cada RL é n-C10 alquil.

[0092] Em modalidades específicas, os lipossomas fornecidos incluem um lipídio catiônico cKK-E12 ou (3,6-bis(4-(bis(2- hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona). A estrutura da CKK-E12 é mostrada abaixo:

[0093] Em algumas modalidades, um ou mais dos lípidos catiônicos pode ser cloreto de N- [1- (2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio ou "DOTMA". (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Pat. U.S. No. 4.897.355). DOTMA pode ser formulado isoladamente ou pode ser combinado com o lípido neutro, dioleoilfosfatidil-etanolamina, ou "DOPE", ou com outros lípidos catiônicos ou não catiônicos em um veículo de transferência lipossômica ou uma nanopartícula de lípido, e tais lipossomas podem ser utilizados para melhorar a distribuição de ácidos nucleicos nas células alvo. Outros lípidos catiônicos adequados incluem, por exemplo, 5- carboxiespermilglicinedioctadecilamido, ou "DOGS", 2,3-dioleilóxi-N- [2(espermina-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-l-propanamínio ou "DOSPA" (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); Pat. U.S. No. 5.171.678 Pat. U.S. N° 5.334.761), 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano, ou "DODAP", 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano ou "DOTAP".

[0094] Os lipídios catiônicos exemplificativos adicionais incluem ainda 1,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano ou "DSDMA", 1,2-dioleiloxi- N,N-dimetil-3-aminopropano ou "DODMA", 1 ,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3- aminopropano ou "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano ou "DLenDMA", N-dioleil-N,N-dimetilammonium chloride ou "DODAC", N,N- distearil-N,N-dimetilarnrnonium bromide ou "DDAB", N-(1,2-dimiristiloxiprop- 3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil ammonium bromide ou "DMRIE", 3- dimetilamino-2-(cholest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(ci s,cis-9,12- octadecadienoxi)propano ou "CLinDMA", 2-[5'-(cholest-5-en-3-beta-oxi)-3'- oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9', 1-2'-octadecadienoxi)propano ou "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibenzilamine ou "DMOBA", 1 ,2-N,N'- dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano ou "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoiloxi- N,N-dimetilpropilamina ou "DLinDAP", 12-N,N'-Dilinoleilcarbamil-3- dimetilaminopropano ou "DLincarbDAP", 1 ,2-Dilinoleoilcarbamil-3- dimetilaminopropano ou "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil- [1,3]-dioxolane ou "DLin- -DMA", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]- dioxolane ou "DLin-K-XTC2-DMA", and 2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,1 2- dien- 1-il)-1 ,3-dioxolan-4-il)-N,N-dimetiletanamine (DLin-KC2-DMA)) (Ver, WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)) ou misturas destes. (Heies, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissei, DV, et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005) Publicação de PCT WO2005/121348A1). Em algumas modalidades, um ou mais dos lípidos catiônicos compreendem pelo menos um dentre um imidazol, dialquilamino ou uma porção de guanidínio.

[0095] Em algumas modalidades, um ou mais lipídios catiônicos podem ser escolhidos dentre XTC (2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]- dioxolano), MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4- (dimetilamino)butanoato), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2- di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d] [1 ,3]dioxol-5- amina)), NC98-5 (4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-N1,N16- diundecil-4,7,10,13-tetraazahexadecano-1,16-diamida), DODAP (1,2-dioleil- 3-dimetilamônio propano), HGT4003 (WO 2012/170889, cujos ensinamentos são incorporados aqui por referência em sua totalidade), ICE (WO 2011/068810, cujos ensinamentos são incorporados aqui por referência em sua totalidade), HGT5000 (Pedido Provisório de Patente U.S. 61/617.468, cujos ensinamentos são incorporados aqui por referência em sua totalidade) ou HGT5001 (cis ou trans) (Pedido Provisório de Patente No. 61/617.468), lipidoides de aminoálcol, como os divulgados em WO2010/053572, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamônio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano), DLinDMA (Heies, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. “Cationic lipid saturation influences intracellular deliveri of encapsulated nucleic acids” J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287), DLIN-KC2-DMA (Semple, SC et al. “Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery” Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. “Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing” PNAS 2010, 107, 1864-1869).

[0096] Em algumas modalidades, o percentual de lipídio catiônico em um lipossoma pode ser superior a 10%, superior a 20%, superior a 30%, superior a 40%, superior a 50%, superior a 60% ou superior a 70%. Em algumas modalidades, o(s) lípido(s) constitui(em) cerca de 30-50% (por exemplo, cerca de 30-45%, cerca de 30-40%, cerca de 35-50%, cerca de 35-45% ou cerca de 35-40 %) do lipossoma em peso. Em algumas modalidades, o lipídio catiônico (por exemplo, cKK-E12) constitui cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% do lipossoma por razão molar.

Lipídios não catiônicos/auxiliares

[0097] Em algumas modalidades, os lipossomas fornecidos contêm um ou mais lipídios não catiônicos ("auxiliares"). Conforme utilizado aqui, o termo "lipídio não catiônico" se refere a qualquer lipídio aniônico, zwitteriônico ou neutro. Conforme utilizado aqui, o termo "lipídio catiônico" se refere a qualquer um dentre uma série de espécies de lipídio que têm uma carga positiva de rede a um H selecionado, como um pH fisiológico Os lipídios não catiônicos incluem, mas não estão limitados a, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina- fosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamina-4-(N- maleimidometil)-ciclo-hexano-1-carboxilato (DOPE-Mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimuristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil- fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1- trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE) ou uma mistura destes.

[0098] Em algumas modalidades, esses lipídios não catiônicos podem ser utilizados isoladamente, mas são utilizados, preferencialmente, em combinação com outros excipientes, por exemplo, com lipídios catiônicos. Em algumas modalidades, o lipídio não catiônico pode compreender uma razão molar de cerca de 5% a cerca de 90% ou cerca de 10% a cerca de 70% do total de lípidos presentes em um lipossoma. Em algumas modalidades, um lipídio não catiônico é um lipídio neutro, isto é, um lipídio que não apresenta uma carga de rede nas condições sob as quais a composição é formulada e/ou administrada. Em algumas modalidades, o percentual de lipídios não catiônicos em um lipossoma pode ser maior do que 5%, maior do que 10%, maior do que 20%, maior do que 30% ou maior do que 40%.

Lipídios à base de colesterol

[0099] Em algumas modalidades, os lipossomas fornecidos compreendem um ou mais lipídios à base de colesterol. Por exemplo, os lípidos catiônicos à base de colesterol apropriados incluem, por exemplo, DC-Choi (N, N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino- propil)piperazina ( Gao, et al. Biochem. Biofis. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); Pat. U.S. No. 5.744.335) ou ICE. Em algumas modalidades, o lipídio à base de colesterol pode compreender uma razão molar de cerca de 2% a cerca de 30% ou cerca de 5% a cerca de 20% do total de lípidos presentes em um lipossoma. Em algumas modalidades, o percentual de lipídios à base de colesterol na nanopartícula de lipídio pode ser maior do que 5,%, 10%, maior do que 20%, maior do que 30% ou maior do que 40%.

Lipídios PEGuilados

[0100] Em algumas modalidades, os lipossomas fornecidos compreender um ou mais lipídios PEGuilados. Por exemplo, o uso de fosfolipídios modificados por PEG de glicol de polietileno e lipídios derivados, como ceramidas derivadas (PEG-CER), incluindo N-Octanoil- esfingosina-1-[Sucinil(Glicol de Metóxipolietileno) -2000] (ceramida de C8 PEG-2000) também é contemplado pela presente invenção em combinação com um ou mais dos lipídios catiônicos e, em algumas modalidades, outros lipídios que, juntos, compreendem o lipossoma. Outros lipídios modificados por PEG incluem, mas não são limitados a, uma cadeia de polietileno glicol de até 5 kDa de comprimento ligada covalentemente a um lipídio com cadeia(s) de alquil de C6-C20 de comprimento. Em algumas modalidades, um lipídio modificado com PEG ou PEGuilado é colesterol peguilado ou PEG-2K. A adição desses componentes pode impedir a agregação complexa e pode também proporcionar meios de aumentar a vida útil da circulação e aumentar a entrega da composição de ácido lipídio-nucleico à célula alvo (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237) ou podem ser selecionados de modo a serem permutados rapidamente para fora da formulação in vivo (ver Pat. U.S. No. 5.885.613).

[0101] Em algumas modalidades, os lipídios permutáveis particularmente úteis são PEG-ceramidas com cadeias de acil mais curtas (por exemplo, C14 ou C18). O fosfolipídio modificado com PEG e os lipídios derivados da presente invenção podem compreender uma razão molar de cerca de 0% a cerca de 15%, cerca de 0,5% a cerca de 15%, cerca de 1% a cerca de 15%, cerca de 4% a cerca de 10% ou cerca de 2% do total de lípidos presentes no lipossoma.

[0102] De acordo com várias modalidades, a seleção de lipídios catiônicos, lipídios não catiônicos e/ou lipídios modificados com PEG que compreende a nanopartícula de lipídio, bem como a razão molar relativa desses lipídios entre si, é baseada nas características do(s) lipídio(s) selecionado(s), na natureza das células alvo pretendidas e nas características do mRNA a ser administrado. As considerações adicionais incluem, por exemplo, a saturação da cadeia de alquil, bem como o tamanho, a carga, o pH, o pKa, a fusogenicidade e a toxicidade do(s) lipídio(s) selecionado(s). Assim, as razões molares podem ser ajustadas de acordo.

Polímeros

[0103] Em algumas modalidades, um veículo de entrega adequado é formulado pelo uso de um polímero como transportador, isoladamente ou em combinação com outros transportadores, incluindo vários lipídios aqui descritos. Assim, em algumas modalidades, os veículos de entrega lipossômica, conforme utilizados aqui, englobam também as nanopartículas que contêm polímeros. Os polímeros adequados podem incluir, por exemplo, poliacrilatos, polialquicianoacrilatos, polilactida, copolímeros de polilactida-poliglicólido, policaprolactonas, dextrano, albumina, gelatina, alginato, colágeno, quitosano, ciclodextrinas, protamina, protamina PEGuilada, PLL, PLL PEGuilada e polietilenimina (PEI). Quando PEI estiver presente, ele pode ser PEI ramificado com um peso molecular que varia de 10 a 40 kDa, por exemplo: PEI ramificado de 25 kDa (Sigma # 408727).

[0104] Um lipossoma adequado para a presente invenção pode incluir um ou mais de qualquer um dentre: lípidos catiônicos, lípidos não catiônicos, lípidos de colesterol, lipidos PEGuilados e/ou os polímeros aqui descritos, em várias razões. Como exemplos não limitativos, uma formulação de lipossoma adequada pode incluir uma combinação selecionada a partir de CKK-E12, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K; C12200, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K; HGT4003, narcótico, colesterol e DMG-PEG2K; ou ICE, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K.

[0105] Em diversas modalidades, os lipídios catiônicos (por exemplo, CKK-E12, C12-200, ICE e/ou HGT4003) constituem cerca de 30-60% (por exemplo, cerca de 30-55%, cerca de 30-50%, cerca de 30-45% , cerca de 30-40%, cerca de 35-50%, cerca de 35-45% ou cerca de 35-40%) do lipossoma por razão molar. Em algumas modalidades, o percentual de lipídios catiônicos (por exemplo, CKK-E12, C12-200, ICE e/ou HGT4003) é de ou maior do que cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55% ou cerca de 60% do lipossoma por razão molar.

[0106] Em algumas modalidades, a razão de lipídio(s) catiônico(s) por lipídio(s) não catiônico(s) por lipídio(s) à base de colesterol por lipídio(s) peguilado(s) pode ficar entre cerca de 30-60:25-35:20-30:1-15, respectivamente. Em algumas modalidades, a razão de lipídio(s) catiônico(s) por lipídio(s) não catiônico(s) por lipídio(s) à base de colesterol por lipídio(s) peguilado(s) é de cerca de 40:30:20:10, respectivamente. Em algumas modalidades, a razão de lipídio(s) catiônico(s) por lipídio(s) não catiônico(s) por lipídio(s) à base de colesterol por lipídio(s) peguilado(s) é de cerca de 40:30:25:5, respectivamente. Em algumas modalidades, a razão de lipídio(s) catiônico(s) por lipídio(s) não catiônico(s) por lipídio(s) à base de colesterol por lipídio(s) peguilado(s) é de cerca de 40:32:25:3, respectivamente. Em algumas modalidades, a razão de lipídio(s) catiônico(s) por lipídio(s) não catiônico(s) por lipídio(s) à base de colesterol por lipídio(s) peguilado(s) é de aproximadamente 50:25:20:5.

Síntese de mRNA

[0107] Os mRNAs, de acordo com a presente invenção, podem ser sintetizados de acordo com qualquer um dentre uma variedade de métodos conhecidos. Por exemplo, os mRNAs, de acordo com a presente invenção, podem ser sintetizados por transcrição in vitro (IVT). Em resumo, a IVT normalmente é realizada com um modelo de DNA linear ou circular contendo um promotor, um agrupamento de trifosfatos de ribonucleotídeos, um sistema de tampão que pode incluir DTT e íons de magnésio e uma polimerase de RNA adequada (por exemplo, T3, T7 ou SP6 ARN polimerase), DNAse I, pirofosfatase e/ou inibidor de RNAse. As condições exatas variarão de acordo com a aplicação específica.

[0108] Em algumas modalidades, para a preparação do mRNA de acordo com a invenção, um modelo de DNA é transcrito in vitro. Um modelo de DNA adequado tem, tipicamente, um promotor, por exemplo: um promotor de T3, T7 ou SP6, para a transcrição in vitro, seguido da sequência de nucleotídeos desejada para o mRNA pretendido e um sinal de terminação.

[0109] A(s) sequência(s) de mRNA desejada(s), de acordo com a invenção, pode(m) ser determinada(s) e incorporada(s) a um modelo de DNA utilizando métodos convencionais. Por exemplo, a partir de uma sequência de aminoácidos desejada (por exemplo, uma sequência de enzimas), uma tradução reversa virtual é realizada com base no código genético degenerado. Algoritmos de otimização podem então ser utilizados para a seleção dos códons adequados. Tipicamente, o conteúdo de G/C pode ser otimizado para obter o maior conteúdo de G/C possível, por um lado, tendo o máximo possível em vista a frequência dos tRNAs, de acordo com a utilização de códons, por outro lado. A sequência de RNA pode ser estabelecida e exibida, por exemplo, com a ajuda de um dispositivo de exibição apropriado e comparada à sequência original (de tipo selvagem). A estrutura secundária pode também ser analisada para calcular a estabilização e as propriedades desestabilizadoras ou, respectivamente, as regiões do RNA.

mRNA modificado

[0110] Em algumas modalidades, o mRNA, de acordo com a presente invenção, pode ser sintetizado como um mRNA modificado ou não modificado. Tipicamente, os mRNAs são modificados para aumentar a estabilidade. As modificações de mRNA podem incluir, por exemplo, modificações dos nucleotídeos do RNA. Um mRNA modificado de acordo com a invenção pode, assim, incluir, por exemplo, modificações estruturais, modificações de açúcar ou modificações de base. Em algumas modalidades, os mRNAs podem ser sintetizados a partir de nucleotídeos naturais e/ou análogos de nucleotídeos (nucleotídeos modificados) incluindo, mas não se limitando a, purinas (adenina (A), guanina (G)) ou pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracila (U)) e como análogos de nucleotídeos modificados ou derivados de purinas e pirimidinas, como, por exemplo, 1-metil-adenina, 2-metil-adenina, 2-metiltio-N-6-isopentenil- adenina, N6-metil-adenina, N6-isopentenilo-adenina, citosina-tio-2, 3-metil- citosina , 4-acetil-citosina 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metil- guanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7-metil-guanina, inosina, 1- metil-inosina, pseudouracil (5-uracil), di-hidro-uracil, 2-tio-uracil, 4-tio-uracil, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracil, 5-(carboxi-hidroximetil)-uracil, 5-fluoro- uracil, 5-bromo-uracil, 5-carboximetilaminometil-uracil, 5-metil-2-tio-uracil, 5- metil-uracil, éster de ácido metil N-uracil-5-oxiacético, 5-metilaminometil- uracil, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracil, 5'-metoxicarbonilmetil-uracil, 5- metoxi-uracil, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5- oxiacético (v), 1-metil-pseudouracil, queosina, .beta.-D-mannosil-queosina, wibutoxosina e fosforamidatos, fosforotioatos, nucleotídeos de peptídeo, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. A preparação desses análogos é conhecida por uma pessoa especialista na técnica, por exemplo, a partir da Patente U.S. No. 4.373.071, Patente U.S. No. 4.401.796, US Pat. No. 4.415.732, Pat. U.S. No. 4.458.066, Pat. U.S. No. 4.500.707, Pat. U.S. No. 4.668.777, Pat. U.S. No. 4.973.679, Pat. U.S. No. 5.047.524, Pat. U.S. No. 5.132.418, Pat. U.S. No. 5.153.319, Pat. U.S. Nos. 5.262.530 e 5.700.642, cujas descrições são incorporadas por referência na sua totalidade.

[0111] Em algumas modalidades, os mRNAs (por exemplo, os mRNAs que codificam ASS1) podem conter modificações estruturais do RNA. Tipicamente, uma modificação estrutural é uma modificação em que os fosfatos da estrutura dos nucleotídeos contidos no RNA são modificados quimicamente. Os exemplos de modificações da estrutura incluem, tipicamente, mas não se limitam a, modificações no grupo que consiste em metilfosfonatos, fosforamidatos, metilfosforamidatos, fosforotioatos (por exemplo, citidina 5'-O-(1-tiofosfato)), boranofosfatos, grupos guanidínio positivamente carregados etc., o que implica substituir a ligação de fosfodiéster por grupos aniônicos, catiônicos ou neutros.

[0112] Em algumas modalidades, os mRNAs (por exemplo, os mRNAs que codificam ASS1) podem conter modificações de açúcar). Uma modificação típica de açúcar é uma modificação química do açúcar dos nucleotídeos que ele contém, incluindo, sem se limitar a, modificações de açúcar escolhidas dentre o grupo consistindo em 2'-desoxi-2'-fluoro- oligorribonucleotídeo (2'-fluoro-2'-deoxicitina 5'-trifosfato, 2'-fluoro-2'- desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-desoxi-2'-deamino-oligorribonucleotídeo (2'- amino-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-O-alquiloligoribonucleotídeo, 2'-desoxi-2'-C-alquiloligoribonucleotídeo (2'- O-metilcitidina 5'-trifosfato, 2'-metiluridina 5'-trifosfato), 2'-C- alquilogorribonucleotídeo e seus isômeros (2'-aracitidina 5'-trifosfato, 2'- arauridina 5'-trifosfato) ou azidotrifosfatos (2'-azido-2'-desoxicitidina 5'- trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato).

[0113] Em algumas modalidades, os mRNAs (por exemplo, os mRNAs que codificam ASS1) podem conter modificações das bases dos nucleotídeos (modificações de base). Um nucleotídeo modificado que contém uma modificação de base também é chamado de nucleotídeo modificado na base. Exemplos de tais nucleotídeos modificados na base incluem, mas não estão limitados a, 2-amino-6-cloropurina ribosídica 5'- trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2- tiouridina 5'-trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'- trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5- bromouridina 5'-trifosfato, 5-iodocitidina 5'-trifosfato, 5-iodouridina 5'- trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina-5'-trifosfato, cloropurina-6 ribosídica 5'-trifosfato , 7-deazaadenosina 5'-trifosfato, 7-deazaguanosina 5'-trifosfato, 8- azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, benzimidazol ribosídico 5'-trifosfato, N1-metiiladenosina 5'-trifosfato, N1-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'-trifosfato ou xantosina 5'-trifosfato.

[0114] Tipicamente, a síntese de mRNA inclui a adição de um "cap" na extremidade N-terminal (5') e uma "cauda" na extremidade C-terminal (3'). A presença do cap é importante para fornecer resistência às nucleases encontradas na maioria das células eucarióticas. A presença de uma "cauda" serve para proteger o mRNA da degradação da exonuclease.

[0115] Assim, em algumas modalidades, os mRNAs (por exemplo, MRNAs de codificação de ASS1) incluem uma estrutura de cap 5'. Um cap 5' é tipicamente adicionado da seguinte maneira: primeiro, uma fosfatase terminal de RNA remove um dos grupos de fosfatase terminal do nucleotídeo 5', deixando duas fosfatases terminais; trifosfato de guanosina (GTP) é então adicionado aos fosfatos terminais por meio de transferase de guanilil, produzindo uma ligação de 5'5'5 trifosfato; e o 7-nitrogênio da guanina é então metilado por uma metiltransferase. Os exemplos de estruturas de cap incluem, mas não estão limitados a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A e G(5')ppp(5')G.

[0116] Em algumas modalidades, os mRNAs (por exemplo, os mRNAs que codificam ASS1) incluem uma estrutura de cauda 3' poli(A). Uma cauda poli-A na terminação 3' do mRNA inclui, tipicamente, cerca de 10 a 300 nucleótidos de adenosina (SEQ ID NO: 9) (por exemplo, cerca de 10 a 200 nucleotídeos de adenosina, cerca de 10 a 150 nucleotídeos de adenosina, cerca de 10 a 100 nucleotídeos de adenosina, cerca de 20 a 70 nucleótidos de adenosina ou cerca de 20 a 60 nucleotídeos de adenosina). Em algumas modalidades, os mRNAs incluem uma estrutura de cauda 3' poli(C). Uma cauda poli-C adequada na terminação 3' do mRNA inclui, tipicamente, cerca de 10 a 200 nucleótidos de citosina (SEQ ID NO:10) (por exemplo, cerca de 10 a 150 nucleotídeos de citosina, cerca de 10 a 100 nucleotídeos de citosina, cerca de 20 a 70 nucleotídeos de citosina, cerca de 20 a 60 nucleotídeos de citosina ou cerca de 10 a 40 nucleotídeos de citosina). A cauda poli-C pode ser adicionada à cauda poli A ou pode substituir a cauda poli A.

[0117] Em algumas modalidades, os mRNAs incluem a região 5' e/ou 3' não traduzida. Em algumas modalidades, uma região 5' não traduzida inclui um ou mais elementos que afetam a estabilidade ou a tradução do mRNA, por exemplo, um elemento de resposta a ferro. Em algumas modalidades, uma região 5' não traduzida pode ter entre cerca de 50 a 500 nucleotídeos de comprimento.

[0118] Em algumas modalidades, uma região 3' não traduzida inclui um ou mais dentre um sinal de poliadenilação, um local de ligação a proteínas que afetam a estabilidade do local do mRNA de uma célula ou um ou mais locais de ligação a miRNAs. Em algumas modalidades, uma região 3' não traduzida pode ter entre 50 e 500 nucleotídeos ou mais de comprimento.

Estrutura de cap

[0119] Em algumas modalidades, os mRNAs incluem uma estrutura 5' de cap. Um cap 5' é tipicamente adicionado da seguinte maneira: primeiro, uma fosfatase terminal de RNA remove um dos grupos de fosfatase terminal do nucleotídeo 5', deixando duas fosfatases terminais; trifosfato de guanosina (GTP) é então adicionado aos fosfatos terminais por meio de transferase de guanilil, produzindo uma ligação de 5'5'5 trifosfato; e o 7-nitrogênio da guanina é então metilado por uma metiltransferase. Os exemplos de estruturas de cap incluem, mas não estão limitados a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A e G(5')ppp(5')G.

[0120] As estruturas de cap de ocorrência natural compreendem uma 7metil guanosina que é ligada por uma ponte de trifosfato à extremidade 5' do primeiro nucleotídeo transcrito, resultando em um cap do dinucleotídeo de m7G(5')ppp(5') N, onde N é qualquer nucleosídeo. In vivo, o cap é adicionado enzimaticamente. O cap é adicionado no núcleo e catalisado pela enzima guanilil transferase. A adição do cap à extremidade de terminação 5' do RNA ocorre imediatamente depois da iniciação da transcrição. O nucleosídeo terminal é, tipicamente, uma guanosina e está na orientação inversa a todos os outros nucleosídeos, isto é: G(5')ppp(5')GpNpNp.

[0121] Um cap comum para o mRNA produzido por transcrição in vitro é m7G(5')ppp(5')G, que foi utilizado como o cap de nicleotídeo na transcrição com T7 ou polimerase de RNA de SP6 in vitro para obter os RNAs que têm uma estrutura de cap em suas terminações 5'. O método predominante para a síntese in vitro do mRNA com cap emprega um dinucleotídeo pré-formado de forma m7G(5')ppp(5')G ("m7GpppG") como um iniciador de transcrição.

[0122] Até o momento, uma forma usual de cap de dinucleotídeo sintético utilizado nos experimentos de tradução in vitro é o análogo de cap anti-reverso ("ARCA") ou ARCA modificado, que geralmente é um análogo de cap modificado em que o grupo OH 2' ou 3' é substituído por -OCH3.

[0123] Os análogos adicionais de cap incluem, mas não estão limitados a uma das estruturas químicas selecionadas a partir do grupo que consiste em m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; análogos de cap não metilados (por exemplo, GpppG); análogos de cap dimetilados (por exemplo, m2,7GpppG), análogos de cap trimetilados (por exemplo, m2,2,7GpppG), danálogos de cap dimetilados simétricos (por exemplo, m7Gpppm7G) ou análogos de cap anti-reverso (por exemplo, ARCA; m7,2'OMeGpppG, m72'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG e seus tetrafosfatos derivados) (ver, por exemplo, Jemieliti, J. et al., “Novel ‘anti-reverse’ cap analogs wit superior translational properties”, RNA, 9: 11081122 (2003)).

[0124] Em algumas modalidades, um cap adequado é um 7-metil guanilato ( "m7G ") ligado através de uma ponte de trifosfato à extremidade 5' do primeiro nucleotídeo transcrito, resultando em m7G(5')ppp(5')N, onde N é qualquer nucleosídeo. Uma modalidade preferida de um cap de m7G utilizado nas modalidades da invenção é m7G(5')ppp(5')G.

[0125] Em algumas modalidades, o cap é uma estrutura de Cap0. As estruturas de CAP0 não têm o resíduo de 2'-O-metil da ribose ligada às bases 1 e 2. Em algumas modalidades, o cap é uma estrutura de Cap1. As estruturas de Cap1 têm um resíduo de 2'-O-metil na base 2. Em algumas modalidades, o cap é uma estrutura de Cap2. As estruturas de Cap2 têm um resíduo de 2'-O-metil ligado às bases 2 e 3.

[0126] Uma variedade de análogos de cap de m7G são conhecidos na técnica, muitos dos quais se encontram disponíveis no mercado. Estes incluem o m7GpppG descrito acima, bem como os análogos de cap de ARCA 3'-OCH3 e 2'-OCH3 (Jemieliti, J. et al, RNA, 9: 1108-1122 (2003)). Os análogos de cap adicionais para uso nas modalidades da invenção incluem análogos de tetrafosfato de dinucleosídeo N7-benzilado (descritos em Grudzien, E. et al., RNA, 10: 1479-1487 (2004)), os análogos de cap de fosforotioato (descritos em Grudzien-Nogalska, E., et al, RNA, 13: 17451755 (2007)) e análogos de cap (incluindo análogos de cap biotnilados), descritos nas Patentes U.S. Nos. 8.093.367 e 8.304.529, incorporadas aqui por referência.

Estrutura de cauda

[0127] Normalmente, a presença de uma "cauda" serve para proteger o mRNA da degradação da exonuclease. Acredita-se que a cauda poli A estabilize os mensageiros naturais e o RNA sense sintético. Assim, em certas modalidades, uma cauda poli A longa pode ser adicionada a uma molécula de mRNA, tornando o RNA mais estável. As caudas poli A podem ser adicionadas utilizando-se de uma variedade de técnicas reconhecidas. Por exemplo, caudas poli-A longas podem ser adicionadas ao RNA transcrito in vitro ou sintético utilizando uma polimerase poli A (Iokoe, et al. Nature Biotechnologi. 1996; 14: 1252-1256). Um vetor de transcrição também pode codificar caudas poli A longas. Ademais, as caudas poli A podem ser adicionadas por transcrição diretamente dos produtos de PCR. A poli A também pode ser ligada à extremidade 3' de um RNA sense com ligase de RNA (ver, por exemplo, Molecular Cloning A Laboratori Manual, 2nd Ed., ed. bi Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratori Press: 1991)).

[0128] Em algumas modalidades, os mRNAs incluem uma estrutura de cauda 3' poli(A). Tipicamente, o comprimento da cauda poli A pode ser, pelo menos, de cerca de 10, 50, 100, 200, 300, 400 e pelo menos 500 nucleotídeos (SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, uma cauda poliA na terminação 3' do mRNA inclui, tipicamente, cerca de 10 a 300 nucleótidos de adenosina (SEQ ID NO:9) (por exemplo, cerca de 10 a 200 nucleotídeos de adenosina, cerca de 10 a 150 nucleotídeos de adenosina, cerca de 10 a 100 nucleotídeos de adenosina, cerca de 20 a 70 nucleótidos de adenosina ou cerca de 20 a 60 nucleotídeos de adenosina). Em algumas modalidades, os mRNAs incluem uma estrutura de cauda 3' poli(C). Uma cauda poli-C adequada na terminação 3' do mRNA inclui, tipicamente, cerca de 10 a 200 nucleótidos de citosina (SEQ ID NO:10) (por exemplo, cerca de 10 a 150 nucleotídeos de citosina, cerca de 10 a 100 nucleotídeos de citosina, cerca de 20 a 70 nucleotídeos de citosina, cerca de 20 a 60 nucleotídeos de citosina ou cerca de 10 a 40 nucleotídeos de citosina). A cauda poli-C pode ser adicionada à cauda poli A ou pode substituir a cauda poli A.

[0129] Em algumas modalidades, o comprimento da cauda poli A ou poli C é ajustado para controlar a estabilidade de uma molécula de mRNA sense modificada da invenção e, por conseguinte, a transcrição da proteína. Por exemplo, visto que o comprimento da causa poli A pode influenciar a meia-vida de uma molécula de mRNA sense, o comprimento da cauda poli A pode ser ajustado de modo a modificar o nível de resistência do mRNA às nucleases e, assim, controlar o curso de tempo de expressão do polinucleotídeo e/ou da produção de polipeptídeo em uma célula alvo.

Região 5' e 3' não traduzidas

[0130] Em algumas modalidades, os mRNAs incluem a região 5' e/ou 3' não traduzida. Em algumas modalidades, uma região 5' não traduzida inclui um ou mais elementos que afetam a estabilidade ou a tradução do mRNA, por exemplo, um elemento de resposta a ferro. Em algumas modalidades, uma região 5' não traduzida pode ter entre cerca de 50 a 500 nucleotídeos de comprimento.

[0131] Em algumas modalidades, uma região 3' não traduzida inclui um ou mais dentre um sinal de poliadenilação, um local de ligação a proteínas que afetam a estabilidade do local do mRNA de uma célula ou um ou mais locais de ligação a miRNAs. Em algumas modalidades, uma região 3' não traduzida pode ter entre 50 e 500 nucleotídeos ou mais de comprimento. As sequências de UTR em 3' e/ou 5' podem ser derivadas de moléculas de mRNA que são estáveis (por exemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histonas ou enzimas de ciclo de ácido cítrico) para aumentar a estabilidade da molécula de mRNA sense. Por exemplo, uma sequência de 5' UTR pode incluir uma sequência parcial de um gene inicial imediato 1 (IE1) de CMF ou um fragmento deste para aumentar a resistência da nuclease e/ou aumentar a meia-vida do polinucleotídeo. Também é contemplada a inclusão de uma sequência de codificação de hormônio de crescimento humano (hGH) ou um fragmento seu para a extremidade 3' ou para a região não traduzida do polinucleotídeo (por exemplo, mRNA) para estabilizar adicionalmente o polinucleotídeo. De modo geral, essas modificações aumentar a estabilidade e/ou as propriedades farmacocinéticas (por exemplo, a meia-vida) do polinucleotídeo em relação às suas partes não modificadas e incluem, por exemplo, as modificações feitas para aumentar a resistência desses polinucleotídeos à digestão da nuclease in vivo.

Formação de lipossomas

[0132] Os veículos de transferência lipossômicas para uso nas composições da invenção podem ser preparados por várias técnicas que são conhecidas atualmente na técnica. Os lipossomas para utilização nas composições fornecidas podem ser preparados por várias técnicas atualmente conhecidas na técnica. Por exemplo, as vesículas multilamelares (MLV) podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais, como por deposição de um lipídio selecionado na parede interna de um contêiner adequado ou um recipiente através da dissolução do lipídio em um solvente adequado e, em seguida pela evaporação do solvente para deixar uma película fina no interior do recipiente ou por pulverização a seco. Uma fase aquosa pode então ser adicionada ao recipiente com um movimento em vórtice, resultando na formação de MLVs. As vesículas unilamelares (ULV) podem então ser formadas por homogenização, sonicação ou extrusão das vesículas multilamelares. Além disso, as vesículas unilamelares podem ser formadas por técnicas de remoção de detergente.

[0133] Em certas modalidades, as composições fornecidas compreendem um lipossoma em que o mRNA é associado na superfície do lipossoma e encapsulado no mesmo lipossoma. Por exemplo, durante a preparação das composições da presente invenção, os lipossomas catiônicos podem se associar com o mRNA por meio de interações eletrostáticas. Por exemplo, durante a preparação das composições da presente invenção, os lipossomas catiônicos podem se associar ao mRNA por meio de interações eletrostáticas.

[0134] Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção compreendem um mRNA encapsulado em um lipossoma. Em algumas modalidades, uma ou mais espécies de mRNA podem ser encapsuladas no mesmo lipossoma. Em algumas modalidades, uma ou mais espécies de mRNA podem ser encapsuladas em diferentes lipossomas. Em algumas modalidades, o mRNA é encapsulado em um ou mais lipossomas, que diferem em sua composição de lipídio, na razão molar dos componentes do lipídio, em tamanho, em carta (potencial Zeta), em ligantes de direcionamento e/ou em combinações destes. Em algumas modalidades, um ou mais lipossomas podem ter uma composição diferente de lipídios catiônicos, lipídios neutros, lipídios modificados por PEG e/ou suas combinações. Em algumas modalidades, um ou mais lipossomas podem ter uma razão molar diferente de lipídio catiônico, lipídio neutro, colesterol e lipídio modificado por PEG utilizados para criar o lipossoma.

[0135] O processo de incorporação de um mRNA desejado em um lipossoma é frequentemente denominado "carregamento". Os exemplos de métodos estão descritos em Lasic, et al., FEBS Lett, 312.: 255-258, 1992, incorporado aqui por referência. Os ácidos nucleicos incorporados a lipossomas podem ser completamente ou parcialmente localizados no espaço interno do lipossoma, na membrana de dupla camada do lipossoma ou associados à superfície externa da membrana do lipossoma. A incorporação de um ácido nucleico aos lipossomas também é referida aqui como "encapsulação", em que o ácido nucleico está inteiramente contido no espaço interno do lipossoma. A finalidade de incorporar um mRNA a um veículo de transferência, como um lipossoma, é muitas vezes a de proteger o ácido nucleico de um meio que pode conter enzimas ou produtos químicos que degradam os ácidos nucleicos e/ou sistemas ou receptores que causam a excreção rápida dos ácidos nucleicos. Por conseguinte, em algumas modalidades, um veículo de entrega apropriado é capaz de aumentar a estabilidade do mRNA contido no mesmo e/ou facilitar a entrega de mRNA à célula ou tecido alvo.

Tamanho do lipossoma

[0136] Os lipossomas adequados, de acordo com a presente invenção, podem ser feitos de vários tamanhos. Em algumas modalidades, os lipossomas fornecidos podem ser feitos de tamanho menor do que os lipossomas de encapsulamento de mRNA conhecidos anteriormente. Em algumas modalidades, o tamanho reduzido dos lipossomas é associado a uma administração mais eficaz de mRNA. A seleção de um tamanho apropriado de lipossoma pode ser ter em vista o local da célula ou tecido alvo e, até certo ponto, a aplicação a que o lipossoma se destina.

[0137] Em algumas modalidades, um tamanho apropriado de lipossoma é selecionado de modo a facilitar a distribuição sistêmica do anticorpo codificado pelo mRNA. Em algumas modalidades, pode ser desejável limitar a transfecção do mRNA a determinadas células ou tecidos. Por exemplo, para se direcionar aos hepatócitos, um lipossoma pode ser dimensionado de modo que suas dimensões sejam inferiores às fenestrações da camada endotelial que reveste os sinusoides hepáticos no fígado; nesses casos, o lipossoma poderia penetrar imediatamente nessas fenestrações endoteliais, de modo a alcançar os hepatócitos alvo.

[0138] Alternativamente ou adicionalmente, um lipossoma pode ser dimensionado de tal modo que as dimensões do lipossoma sejam de um diâmetro suficiente para limitar ou evitar expressamente a distribuição em certas células ou certos tecidos. Por exemplo, um lipossoma pode ser dimensionado de tal modo que as suas dimensões sejam maiores do que as fenestrações da camada endotelial que reveste os sinusoides hepáticos, limitando a distribuição dos lipossomas aos hepatócitos.

[0139] Em algumas modalidades, o tamanho de um lipossoma é determinado pelo comprimento do maior diâmetro da partícula do lipossoma. Em algumas modalidades, um lipossoma adequado tem um tamanho não superior a cerca de 250 nm (por exemplo, não superior a cerca de 225 nm, 200 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100 nm, 75 nm ou 50 nm). Em algumas modalidades, um lipossoma adequado tem um tamanho que varia de cerca de 10 a 250 nm (por exemplo, variando de cerca dei 0 - 225 nm, 10 - 200 nm, 10 - 175 nm, 10 - 150 nm, 10 - 125 nm, 10 - 100 nm, 10 - 75 nm ou 10 - 50 nm). Em algumas modalidades, um lipossoma adequado tem um tamanho que varia de cerca de 10 a 100 nm (por exemplo, varia de cerca de 10 a 90 nm, 10 a 80 nm, 10 a 70 nm, 10 a 60 nm ou 10 a 50 nm).

[0140] Uma variedade de métodos alternativos conhecidos na técnica estão disponíveis para o dimensionamento de uma população de lipossomas. Um método de dimensionamento está descrito em Pat. US No. 4.737.323, incorporada a este instrumento por referência. A sonicação de uma suspensão de lipossomas, por sonicação por banho ou sonda produz uma redução progressiva de tamanho até ULV pequena inferior a cerca de 0,05 mícrons de diâmetro. A homogeneização é outro método que se baseia na energia de cisalhamento para fragmentar lipossomas grandes em menores. Num procedimento típico de homogeneização, MLV são recirculados através de um homogeneizador de emulsão padrão até que os tamanhos do lipossoma selecionados, tipicamente entre cerca de 0,1 e 0,5 microns, sejam observados. O tamanho dos lipossomas pode ser determinado por dispersão de luz quasi-elétrica (QELS), conforme descrito em Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-150 (1981), incorporado a este instrumento por referência. O diâmetro médio dos lipossomas pode ser reduzido pela sonicação de lipossomas formados. Os ciclos de sonicação intermitentes podem ser alternados com a avaliação QELS para orientar a síntese eficiente de lipossomas.

Composições Farmacêuticas

[0141] Para facilitar a expressão de mRNA in vivo, veículos de entrega como lipossomas podem ser formulados em combinação com um ou mais ácidos nucleicos, transportadores, ligantes de direcionamento ou reagentes de estabilização, ou em composições farmacológicas onde são misturados com excipientes adequados. As técnicas para a formulação e administração de drogas podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., edição mais recente.

[0142] Os mRNAs encapsulados por lipossoma ou associados fornecidos e as composições que os contêm podem ser administrados e dosados de acordo com a prática médica corrente, levando em consideração a condição clínica do sujeito, o local e o método de administração, o cronograma da administração, a idade do sujeito, sexo, peso corporal e outros fatores relevantes para os clínicos versados na técnica. A "quantidade eficaz", para os efeitos descritos neste documento, pode ser determinada por essas considerações relevantes, as quais são conhecidas pelos versados nas técnicas de pesquisa clínica experimental, farmacológicas, clínicas e médicas. Em algumas modalidades, a quantidade administrada é eficaz para atingir pelo menos alguma estabilização, melhoria ou eliminação dos sintomas e de outros indicadores, como são selecionados como medidas apropriadas do progresso, regresso ou melhoria da doença pelos versados na técnica. Por exemplo, a quantidade e o regime de dosagem apropriados causam pelo menos a prodição de proteína transiente (por exemplo, enzima).

[0143] As vias de administração adequadas incluem, por exemplo, administração oral, retal, vaginal, transmucosa, pulmonar, incluindo intratraqueal ou por inalação, ou intestinal; entrega parentérica, incluindo intradérmica, transdérmica (tópica), intramuscular, subcutânea, injeções intramedulares, bem como intratecal, intraventricular direta, intravenosa, intraperitoneal ou intranasal.

[0144] Alternativa ou adicionalmente, os mRNAs encapsulados por lipossomas e as composições da invenção podem ser administrados num local em vez de forma sistêmica, por exemplo, através de injeção da composição farmacêutica diretamente num tecido alvo, preferencialmente, numa formulação de liberação sustentada. A entrega local pode ser afetada de diversas maneiras, dependendo do tecido a ser direcionado. Por exemplo, aerossóis que contêm composições da presente invenção podem ser inalados (por entrega nasal, traqueal ou brônquica); as composições da presente invenção podem ser injetadas no local da lesão, da manifestação da doença, ou de dor, por exemplo; as composições podem ser fornecidas em pastilhas para aplicação oral, traqueal ou esofágica; podem ser fornecidas no estado líquido, em comprimido ou cápsula para administração no estômago ou intestinos, pode ser fornecida na forma de supositório para aplicação retal ou vaginal; ou pode até ser distribuída para o olho pelo uso de cremes, colírios ou até mesmo injeção. As formulações que contêm as composições apresentadas complexadas com moléculas terapêuticas ou ligantes podem ser administradas ainda cirurgicamente, por exemplo, em associação com um polímero ou outra estrutura ou substância que pode permitir que as composições se difundam do local de implantação para as células circundantes. Alternativamente, elas podem ser aplicadas cirurgicamente sem o uso de polímeros ou suportes.

[0145] Os métodos apresentados da presente invenção contemplam administrações únicas e múltiplas de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos agentes terapêuticos (por exemplo, mRNA que codifica uma proteína ASS1) descritos neste documento. Os agentes terapêuticos podem ser administrados em intervalos regulares, dependendo da natureza, gravidade e extensão da condição do sujeito (por exemplo, ASD). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz dos agentes terapêuticos (por exemplo, mRNA que codifica uma proteína ASS1) da presente invenção pode ser administrada periodicamente por via intratecal em intervalos regulares (por exemplo, uma vez ao ano, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada três meses, bimensalmente (uma vez a cada dois meses), mensalmente (uma vez por mês), quinzenalmente (uma vez a cada duas semanas), uma vez a cada 30 dias, uma vez a cada 28 dias, uma vez a cada 14 dias, uma vez a cada 10 dias, uma vez a cada 7 dias, semanalmente, diariamente ou de forma contínua).

[0146] Em algumas modalidades, os lipossomas e/ou composições apresentados são formuladas de modo que sejam apropriados para a liberação prolongada do mRNA contido neles. Essas composições de liberação prolongada podem ser convenientemente administradas a um sujeito em intervalos de dosagem prolongados. Por exemplo, numa modalidade, as composições da presente invenção são administradas a um sujeito duas vezes ao dia, diariamente ou em dias alternados. Numa modalidade preferencial, as composições da presente invenção são administradas a um sujeito duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada 7 dias, uma vez a cada 10 dias, uma vez a cada 14 dias, uma vez a cada 28 dias, uma vez a cada 30 dias, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas ou, mais preferencialmente, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada seis meses , uma vez a cada oito meses, uma vez a cada nove meses ou anualmente. Também são contempladas composições e lipossomas que são formulados para administração de depósito (por exemplo, por via intramuscular, subcutânea, intravítrea) para distribuir ou liberar um mRNA ao longo de períodos prolongados. De um modo preferencial, os meios de liberação prolongada empregados são combinados com modificações feitas que o mRNA potencialize a estabilidade.

[0147] Como usado neste documento, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é amplamente determinado com base na quantidade total do agente terapêutico contido nas composições farmacêuticas da presente invenção. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para alcançar um benefício significativo para o sujeito (p.ex., tratamento, modulação, cura, prevenção e/ou melhoria de ASD). Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma quantidade suficiente para conseguir um efeito terapêutico e/ou profilático desejado. Geralmente, a quantidade de um agente terapêutico (por exemplo, mRNA que codifica uma proteína ASS1) administrado a um sujeito que tem necessidade do mesmo dependerá das características do sujeito. Essas características incluem a condição, gravidade da doença, saúde geral, idade, sexo e peso corporal do sujeito. Versados na técnica serão capazes de determinar as dosagens adequadas dependendo destes e de outros fatores relacionados. Além disso, os ensaios objetivos e subjetivos podem ser empregados opcionalmente para identificar intervalos da dosagem ideal.

[0148] Uma quantidade terapeuticamente eficaz é normalmente administrada em um regime de dosagem que pode compreender múltiplas doses unitárias. Para qualquer proteína terapêutica particular, uma quantidade terapeuticamente eficaz (e/ou uma dosagem unitária apropriada dentro de um regime de dosagem eficaz) pode variar, por exemplo, dependendo da via de administração, em combinação com outros agentes farmacêuticos. Além disso, a quantidade terapeuticamente eficaz específica (e/ou dose unitária) para qualquer paciente particular pode depender de vários fatores incluindo o distúrbio que está sendo tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do agente farmacêutico específico empregado; a composição específica empregada; idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; tempo de administração, via de administração, e/ou a taxa de excreção ou metabolismo da proteína específica empregada duração do tratamento; e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.

[0149] Em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz varia de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 500 mg/kg do peso corporal, por exemplo, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 400 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 300 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 200 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 100 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 90 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 80 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 70 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 60 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 50 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 40 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 30 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 25 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 20 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 15 mg/kg do peso corporal, de cerca de 0,005 mg/kg do peso corporal a 10 mg/kg do peso corporal.

[0150] Em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz é superior a cerca de 0,1 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 0,5 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 1,0 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 3 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 5 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 10 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 15 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 20 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 30 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 40 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 50 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 60 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 70 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 80 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 90 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 100 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 150 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 250 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 300 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 350 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 400 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 450 mg/kg do peso corporal, superior a cerca de 500 mg/kg do peso corporal.

[0151] Também são contempladas neste documento composições farmacêuticas liofilizadas que compreendem um ou mais lipossomas aqui descritos e métodos relacionados para o uso dessas composições como divulgado, por exemplo, no Pedido Provisório dos Estados Unidos N° 6 1/494.882, depositado em 8 de junho de 2011, sendo que seus ensinamentos incorporados por referência na sua totalidade a este instrumento. Por exemplo, as composições farmacêuticas liofilizadas de acordo com a invenção podem ser reconstituídas antes da administração ou pode ser reconstituídas in vivo. Por exemplo, uma composição farmacêutica liofilizada pode ser formulada numa forma de dosagem apropriada (por exemplo, uma forma de dosagem intradérmica como um disco, haste ou membrana) e administrada de modo que a forma de dosagem seja reidratada ao longo do tempo in vivo pelos fluidos corporais do indivíduo.

[0152] Os lipossomas e as composições apresentados podem ser administrados a qualquer tecido desejado. Em algumas modalidades, o mRNA distribuído pelos lipossomas ou composições apresentados é expresso no tecido em que os lipossomas e/ou composições foram administrados. Em algumas modalidades, o mRNA distribuído é expresso num tecido diferente do tecido em que os lipossomas e/ou composições foram administrados. Tecidos exemplares em que o mRNA distribuído pode ser distribuído e/ou expresso incluem, entre outros, fígado, rim, coração, baço, soro, cérebro, músculo esquelético, nódulos linfáticos, pele e/ou fluido cerebroespinhal.

[0153] De acordo com a presente invenção, uma dose terapeuticamente eficaz, quando administrada com regularidade, resulta no aumento dos níveis de ASS1 hepática. Em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, resulta em um nível reduzido de citrulina no soro em comparação com o nível de citrulina de referência antes do tratamento. Em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz, quando administrada regularmente, resulta em um nível reduzido de amônia no soro em comparação com o nível de amônia de referência antes do tratamento.

[0154] Em algumas modalidades, a administração da composição apresentada resulta no aumento da expressão da proteína ASS1 no fígado em comparação com os níveis de referência antes do tratamento. Em algumas modalidades, a administração das composições apresentadas resulta em um nível de proteína ASS1 igual ou superior a cerca de 3000 ng/mg, igual ou superior a cerca de 2000 ng/mg, igual ou superior a cerca de 1000 ng/mg, igual ou superior a cerca de 500 ng/mg, igual ou superior a cerca de 400 ng/mg, igual ou superior a cerca de 200 ng/mg ou igual ou superior a cerca de 100 ng/mg, da proteína total no fígado. Numa modalidade particular, a administração das composições apresentadas resulta num nível de proteína ASS1 igual ou superior a 120 ng/mg de proteína total no fígado.

[0155] Em algumas modalidades, a administração da composição resulta no aumento do nível de proteína ASS1 no plasma ou soro em comparação com o nível de referência antes do tratamento. Em algumas modalidades, a administração da composição apresentada resulta no aumento da proteína ASS1 no plasma ou soro em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% em comparação com o nível de referência antes do tratamento.

[0156] Em algumas modalidades, a administração da composição resulta na redução dos níveis de citrulina e/ou amônia no sujeito em comparação com os níveis de referência antes do tratamento. Tipicamente, os níveis de referência são medidos imediatamente antes do tratamento. Tipicamente, os níveis de citrulina e/ou amônia são medidos numa amostra biológica. As amostras biológicas adequadas incluem, por exemplo, sangue total, plasma, soro, urina ou fluido cerebral espinhal.

[0157] Em algumas formas de realização, a administração da composição resulta na redução do nível de citrulina numa amostra biológica (por exemplo, amostra de soro, plasma ou urina) em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% em comparação com o nível de referência de citrulina imediatamente antes do tratamento. Em algumas modalidades, a administração da composição resulta na redução do nível de citrulina no plasma para menos do que cerca de 2000 μM, 1500 μM, 1000 μM, 750 μM, 500 μM, 250 μM, 100 μM, 90 μM, 80 μM, 70 μM, 60 μM, 50 μM, 40 μM ou 30 μM.

[0158] Em algumas modalidades, a administração da composição resulta na redução dos níveis de amônia numa amostra biológica (por exemplo, amostra de soro, plasma ou urina) em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65% , pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% em comparação com o nível de referência imediatamente antes do tratamento.

[0159] Em algumas modalidades, a administração da composição apresentada resulta na redução dos níveis de amônia no plasma ou soro em comparação com o nível de referência de amônia imediatamente antes do tratamento. Em algumas modalidades, a administração da composição apresentada resulta na redução dos níveis de amônia no plasma ou soro em comparação com o nível de referência de amônia em sujeitos que não são tratados. Em algumas modalidades, a administração da composição resulta na redução dos níveis de amônia em cerca de 3000 μmol/L ou menos, cerca de 2750 μmol/L ou menos, cerca de 2500 μmol/L ou menos, cerca de 2250 μmol/L ou menos, cerca de 2000 μmol/L ou menos, cerca de 1750 μmol/L ou menos, cerca de 1500 μmol/L ou menos, cerca de 1250 μmol/L ou menos, cerca de 1000 μmol/L ou menos, cerca de 750 μmol/L ou menos, cerca de 500 μmol/L ou menos, cerca de 250 μmol/L ou menos, cerca de 100 μmol/L ou menos ou cerca de 50 μmol/L ou menos no plasma ou no soro. Em uma modalidade particular, a administração da composição resulta na redução dos níveis de amônia em cerca de 50 μmol/L ou menos no plasma ou no soro.

[0160] De acordo com várias modalidades, o momento de expressão de mRNAs distribuídos pode ser ajustado para se adequar a uma necessidade médica particular. Em algumas modalidades, a expressão da proteína codificada pelo mRNA distribuído é detectável 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48, 72 e/ou 96 horas após a administração de lipossomas e/ou composições apresentadas. Em algumas modalidades, a expressão da proteína codificada pelo mRNA distribuído é detectável 1 semana, duas semanas e/ou 1 mês após a administração.

EXEMPLOS

[0161] Embora determinados compostos, composições e métodos da presente invenção tenham sido descritos com especificidade em conformidade com certas modalidades, os exemplos a seguir servem apenas para ilustrar os compostos da invenção e não se destinam a limitar os mesmos.

Exemplo 1. Formulações Exemplares de Lipossoma para Entrega e Expressão do mRNA da ASS1

[0162] Este exemplo apresenta formulações de lipossomas exemplares para a entrega e expressão eficaz de mRNA da ASS1 in vivo.

Materiais Lipídicos

[0163] As formulações descritas neste documento incluem uma mistura de lípidos de multi-componente de razões variáveis empregando um ou mais lipídios catiônicos, lipídios auxiliares (por exemplo, lipídios não catiônicos e/ou lipídios à base de colesterol) e lipídios PEGilados concebidos para encapsular mRNA que codifica a proteína ASS1. Os lipídios catiônicos podem incluir (mas não exclusivamente) DOTAP (1,2- dioleil-3-trimetilamônio propano), DODAP (propano 1,2-dioleil-3- dimetilamônio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano), DLinDMA(Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. “Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids” J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. “Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery” Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. “Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing” PNAS 2010, 107, 1864-1869), cKK-E12 (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona), HGT5000, HGT5001, HGT4003, ICE, à base de dialquilamino, à base de imidazol, à base de guanidina, etc. Os lipídios auxiliares pode incluir (mas não exclusivamente) DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (, 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'rac- glicerol)), colesterol, etc. Os lipídios PEGilados podem incluir (mas não exclusivamente) uma cadeia de poli(etileno)glicol de até 5 kDa em comprimento covalentemente ligada a um lipídio com cadeia(s) alquil de comprimento C6-C20 .

[0164] O RNA mensageiro da argininosuccinato sintetase (ASS1) humana otimizada por códon foi sintetizado por transcrição in vitro de um molde de DNA de plasmídeo que codifica o gene, que foi seguido pela adição de uma estrutura de cápsula 5' (Cápsula 1) (Fechter, P.; Brownlee, GG. “Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins” J Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) e um iniciador 3 'poli (A cauda) de cerca de 250 nucleótidos de comprimento (SEQ ID NO: 12) tal como determinado por electroforese em gel. As regiões 5' e 3' não traduzidas presentes em cada produto do mRNA são representadas como X e Y, respectivamente, e definidas como indicado (vide infra). mRNAs da Argininosuccinato Sintetase (ASS1) Humana Otimizada por Códon Exemplares Concepção do construto: X - SEQ ID NO:3 - Y; X - SEQ ID NO:13 - Y; X - SEQ ID NO:14 - Y; e X - SEQ ID NO:15 - Y. Sequências UTR 5' e 3' X (Sequência UTR 5’) = GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUC CAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGU GCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUU GACACG [SEQ ID NO.:4] X (Sequência UTR 3’) = CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGC CCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAU UAAGUUGCAUCAAGCU [SEQ ID NO.:5] OU GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCC CUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUU AAGUUGCAUCAAAGCU (SEQ ID NO.:6)

[0165] As sequências de mRNA da ASS1 humana otimizadas por códon exemplares incluem SEQ ID NO:3 descrita na seção de descrição detalhada, e SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:15 abaixo: SEQ ID NO: 13 AUGAGCUCAAAGGGAUCUGUGGUGCUGGCAUACUCGGGGGGA UUGGACACUUCAUGCAUACUUGUCUGGUUGAAGGAACAGGGCUACG ACGUGAUCGCCUACCUGGCUAACAUCGGUCAAAAGGAGGACUUCGA GGAGGCCCGGAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCGAAGAAAGUGUUC AUCGAGGACGUGUCCCGGGAAUUUGUGGAAGAGUUCAUCUGGCCCG CCAUCCAAAGCAGCGCACUGUACGAGGAUAGAUACCUCCUCGGAACA UCCCUUGCCCGGCCAUGUAUUGCCAGGAAACAGGUGGAAAUCGCCC AGCGGGAAGGAGCCAAAUACGUGUCCCACGGGGCGACCGGAAAGGG GAACGACCAAGUGCGCUUCGAGCUGUCGUGCUACUCCCUGGCACCG CAGAUUAAGGUCAUCGCGCCGUGGAGAAUGCCUGAAUUCUACAACC GCUUCAAGGGCCGCAACGAUCUGAUGGAAUACGCCAAGCAGCACGG CAUCCCGAUCCCCGUGACCCCUAAGAACCCUUGGUCAAUGGACGAG AAUCUGAUGCACAUCAGCUACGAAGCGGGCAUCCUGGAGAACCCCAA GAAUCAAGCUCCGCCCGGACUGUACACUAAGACUCAGGAUCCCGCUA AGGCGCCCAACACUCCUGAUAUUUUGGAAAUCGAAUUCAAGAAGGGU GUCCCAGUGAAGGUCACCAACGUGAAGGACGGCACUACCCACCAGA CCUCGCUGGAACUGUUUAUGUAUCUGAACGAGGUGGCCGGCAAACA UGGAGUCGGCAGAAUCGAUAUUGUGGAGAACCGCUUUAUUGGCAUG AAGUCCAGGGGGAUCUAUGAAACCCCGGCCGGAACCAUCCUCUACC ACGCCCAUCUCGACAUUGAAGCGUUCACCAUGGACCGCGAGGUCCG CAAGAUUAAGCAGGGCCUGGGACUCAAGUUCGCCGAGCUCGUGUAC ACCGGUUUCUGGCAUUCCCCGGAAUGCGAAUUCGUGCGACACUGCA UUGCCAAGAGCCAGGAGCGGGUGGAAGGAAAGGUCCAGGUGUCCGU GCUGAAGGGUCAAGUGUACAUCCUGGGGCGGGAGUCCCCUCUUUCC CUGUACAACGAAGAACUGGUGUCGAUGAACGUGCAGGGAGACUACG AGCCGACCGACGCCACGGGUUUCAUUAACAUCAAUUCCCUGAGACU GAAGGAGUACCACCGGCUCCAGUCCAAAGUCACCGCUAAGUGA (SEQ ID NO:13), SEQ ID NO:14 AUGAGCUCAAAAGGAUCGGUGGUGCUGGCAUACUCGGGAGGA UUGGACACUUCAUGUAUUCUUGUCUGGCUCAAGGAACAGGGCUACG ACGUCAUUGCCUACCUGGCCAACAUCGGUCAGAAAGAGGACUUCGA GGAAGCCAGAAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGAGCCAAGAAGGUGUUC AUCGAGGACGUGUCCCGCGAAUUUGUGGAAGAAUUCAUCUGGCCUG CCAUUCAAUCCUCCGCGCUCUACGAGGAUCGGUACCUUCUGGGAAC UUCCUUGGCUCGCCCGUGCAUCGCCCGGAAACAAGUGGAGAUUGCA CAGCGGGAAGGAGCUAAGUACGUGUCCCACGGGGCCACUGGAAAGG GCAACGAUCAAGUGCGCUUCGAGCUGUCCUGCUACUCCCUGGCGCC ACAGAUCAAGGUCAUCGCGCCGUGGCGGAUGCCCGAGUUCUAUAAC CGCUUCAAGGGACGGAACGAUCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACG GCAUUCCGAUACCCGUGACCCCCAAGAACCCUUGGAGCAUGGACGA GAACCUGAUGCAUAUCUCUUACGAAGCCGGGAUUCUCGAAAACCCUA AGAAUCAGGCGCCGCCUGGCCUGUACACCAAAACCCAGGACCCCGC CAAGGCGCCGAACACGCCCGACAUCCUCGAAAUCGAGUUCAAGAAGG GGGUGCCAGUGAAGGUCACCAACGUGAAGGACGGAACCACCCAUCA GACCUCACUGGAACUCUUCAUGUACCUCAACGAGGUCGCAGGGAAG CACGGCGUGGGGAGAAUCGACAUCGUGGAAAACAGGUUCAUCGGCA UGAAGUCCCGGGGAAUCUACGAAACACCCGCCGGGACUAUCCUCUA CCACGCCCACCUGGACAUUGAGGCCUUCACCAUGGAUAGAGAAGUG CGCAAGAUUAAGCAGGGUCUGGGUCUGAAGUUCGCCGAGUUGGUCU ACACCGGAUUCUGGCAUUCCCCUGAAUGCGAAUUCGUGCGCCACUG CAUUGCCAAGAGCCAGGAAAGAGUGGAGGGCAAAGUCCAAGUGUCG GUGCUGAAGGGCCAAGUGUACAUCCUGGGAAGGGAAAGCCCGCUCU CCCUGUACAACGAGGAACUGGUGUCGAUGAACGUCCAGGGCGAUUA UGAGCCGACUGACGCCACUGGUUUUAUCAAUAUCAACAGCCUGCGA CUGAAGGAGUACCACCGGCUGCAGUCCAAGGUCACCGCUAAGUAG (SEQ ID NO:14), SEQ ID NO:15 AUGAGCUCGAAAGGAUCCGUGGUUUUGGCAUACUCCGGUGGA CUUGACACUUCAUGCAUUUUGGUUUGGCUCAAAGAACAGGGCUACG AUGUGAUCGCCUACCUGGCGAACAUCGGACAGAAAGAGGACUUUGA AGAGGCCCGCAAGAAGGCACUGAAGCUGGGUGCCAAGAAAGUGUUU AUCGAGGAUGUGUCGAGAGAAUUCGUGGAAGAAUUCAUUUGGCCAG CCAUUCAAAGCUCCGCGCUGUACGAGGACAGAUACCUCCUCGGCAC CUCACUGGCCCGCCCUUGCAUCGCGCGCAAACAGGUCGAGAUCGCU CAAAGAGAAGGAGCUAAAUACGUGUCACACGGCGCCACCGGAAAGG GAAAUGACCAAGUCCGCUUCGAGCUGUCUUGCUACUCACUCGCUCC GCAAAUCAAGGUCAUCGCACCGUGGAGGAUGCCCGAGUUCUACAAC CGGUUCAAGGGGCGGAACGACCUGAUGGAGUACGCGAAGCAGCACG GUAUCCCGAUCCCUGUCACCCCAAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAA AAUCUGAUGCACAUCAGCUACGAAGCAGGAAUCCUGGAGAACCCGAA AAAUCAAGCACCUCCUGGACUGUACACUAAGACCCAGGACCCAGCCA AGGCCCCGAAUACCCCGGACAUCUUGGAAAUCGAGUUCAAGAAGGG GGUGCCAGUGAAGGUUACCAAUGUCAAGGAUGGGACCACUCACCAA ACUAGCCUGGAACUGUUCAUGUACCUGAACGAAGUGGCUGGAAAACA UGGCGUGGGAAGAAUCGAUAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUG AAGUCAAGGGGAAUCUACGAAACUCCGGCCGGGACGAUACUGUAUC AUGCGCAUCUCGACAUUGAAGCCUUUACUAUGGAUCGGGAAGUCCG AAAGAUCAAACAGGGCUUGGGCCUCAAGUUUGCCGAGCUGGUGUAC ACGGGAUUCUGGCACUCGCCGGAAUGCGAAUUCGUGCGCCACUGUA UUGCGAAGUCCCAGGAGCGCGUGGAAGGGAAGGUCCAAGUCUCCGU GCUCAAAGGACAGGUCUACAUCCUUGGACGGGAGUCGCCCCUGUCG CUCUACAACGAAGAACUGGUGUCGAUGAACGUGCAGGGAGACUAUG AACCAACGGAUGCUACUGGUUUCAUCAACAUCAAUUCGCUGCGGCUU AAGGAGUACCAUCGGCUGCAGUCCAAGGUCACCGCGAAGUAG (SEQ ID NO:15).

[0166] Uma sequência de RNA mensageiro da argininosuccinato sintetase (ASS1) humana otimizada por códon de comprimento total exemplar é mostrada abaixo: GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUC CAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGU GCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUU GACACGAUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCG GCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUA CGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUC GAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGU UCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCC CGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGC ACCAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCG CCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAA GGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCC CCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACA ACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCA CGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGAC GAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACC CCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCC GCCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAA GGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCAC CAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCA AGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGG CAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUG UACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGG UGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGU GUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCAC UGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGA GCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCU GAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGAC UACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCG CCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGA CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUG GAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAG UUGCAUCAAGCU (SEQ ID NO:7).

[0167] Em outro exemplo, uma sequência de RNA mensageiro da argininosuccinato sintetase (ASS1) humana otimizada por códon de comprimento total é mostrada abaixo: GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUC CAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGU GCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUU GACACGAUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCG GCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUA CGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUC GAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGU UCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCC CGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGC ACCAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCG CCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAA GGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCC CCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACA ACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCA CGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGAC GAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACC CCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCC GCCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAA GGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCAC CAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCA AGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGG CAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUG UACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGG UGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGU GUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCAC UGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGA GCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCU GAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGAC UACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCG CCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGA GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGG AAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGU UGCAUCAAAGCU (SEQ ID NO:8).

Protocolos de Formulação Exemplares A. cKK-E12

[0168] Alíquotas de 50 mgmL de soluções etanólicas de cKK-E12, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa tamponada (10 mM de citrato/150 mM Nacl, pH 4,5) do mRNA da ASS1 foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lipídio foi injetada rapidamente na solução aquosa de mRNA e foi agitada para produzir uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultantes foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), concentrada e armazenada a 2-8oC. A concentração final = 0,64 mg/mL mRNA de ASS1 (encapsulado). Zave = 78 nm (Dv(50)) = 46 nm; Dv(90) = 96 nm).

B. C12-200

[0169] Alíquotas de 50 mg/mL de soluções etanólicas de C12-200, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa tamponada (10 mM de citrato/150 mM Nacl, pH 4,5) do mRNA da ASS1 foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lipídio foi injetada rapidamente na solução aquosa de mRNA e foi agitada para produzir uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultantes foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), concentrada e armazenada a 2-8oC. A concentração final = 0,82 mg/mL mRNA de ASS1 (encapsulado). Zave = 86 nm (Dv(50) = 50 nm; Dv(90) = 101 nm).

C. HGT4003

[0170] Alíquotas de 50 mg/mL de soluções etanólicas de HGT4003, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa tamponada (10 mM de citrato/150 mM Nacl, pH 4,5) do mRNA da ASS1 foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lipídio foi injetada rapidamente na solução aquosa de mRNA e foi agitada para produzir uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultantes foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), concentrada e armazenada a 2-8oC. A concentração final = 0,82 mg/mL mRNA de ASS1 (encapsulado). Zave = 86 nm (Dv(50) = 50 nm; Dv(90) = 101 nm).

D. ICE

[0171] Alíquotas de 50 mg/mL de soluções etanólicas de ICE, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa tamponada (10 mM de citrato/150 mM Nacl, pH 4,5) do mRNA da ASS1 foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lipídio foi injetada rapidamente na solução aquosa de mRNA e foi agitada para produzir uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultantes foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), concentrada e armazenada a 2-8oC. A concentração final = 0,91 mg/mL mRNA de ASS1 (encapsulado). Zave = 81 nm (Dv(50) = 48 nm; Dv(90) = 96 nm).

E. HGT5001

[0172] Alíquotas de 50 mg/mL de soluções etanólicas de HGT5001, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa tamponada (10 mM de citrato/150 mM Nacl, pH 4,5) do mRNA da ASS1 foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lipídio foi injetada rapidamente na solução aquosa de mRNA e foi agitada para produzir uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultantes foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), concentrada e armazenada a 2-8oC. A concentração final = 0,20 mg/mL mRNA de ASS1 (encapsulado). Zave = 87.0 nm (Dv(50) = 75 nm; Dv(90) = 103 nm).

F. HGT5000

[0173] Alíquotas de 50 mg/mL de soluções etanólicas de HGT5000, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa tamponada (10 mM de citrato/150 mM Nacl, pH 4,5) do mRNA da ASS1 foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lipídio foi injetada rapidamente na solução aquosa de mRNA e foi agitada para produzir uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultantes foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), concentrada e armazenada a 2-8oC. A concentração final = 0,20 mg/mL mRNA de ASS1 (encapsulado). Zave = 81 nm (Dv(50) = 67 nm; Dv(90) = 97 nm).

G. DLinKC2DMA

[0174] Alíquotas de 50 mg/mL de soluções etanólicas de DLinKC2DMA, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa tamponada (10 mM de citrato/150 mM Nacl, pH 4,5) do mRNA da ASS1 foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lipídio foi injetada rapidamente na solução aquosa de mRNA e foi agitada para produzir uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultantes foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), concentrada e armazenada a 2-8oC. A concentração final = 0,20 mg/mL mRNA de ASS1 (encapsulado). Zave = 78 nm (Dv(50) = 60 nm; Dv(90) = 92 nm).

H. DODAP

[0175] Alíquotas de 50 mg/mL de soluções etanólicas de DODAP, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa tamponada (10 mM de citrato/150 mM Nacl, pH 4,5) do mRNA da ASS1 foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lipídio foi injetada rapidamente na solução aquosa de mRNA e foi agitada para produzir uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultantes foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), concentrada e armazenada a 2-8oC. A concentração final = 0,20 mg/mL mRNA de ASS1 (encapsulado). Zave = 84 nm (Dv(50) = 62 nm; Dv(90) = 92 nm).

I. DODMA

[0176] Alíquotas de 50 mg/mL de soluções etanólicas de DODMA, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K foram misturadas e diluídas com etanol para um volume final de 3 mL. Separadamente, uma solução aquosa tamponada (10 mM de citrato/150 mM Nacl, pH 4,5) do mRNA da ASS1 foi preparada a partir de um estoque de 1 mg/mL. A solução de lipídio foi injetada rapidamente na solução aquosa de mRNA e foi agitada para produzir uma suspensão final em 20% de etanol. A suspensão de nanopartículas resultantes foi filtrada, diafiltrada com 1x PBS (pH 7,4), concentrada e armazenada a 2-8oC. A concentração final = 0,20 mg/mL mRNA de ASS1 (encapsulado). Zave = 86 nm (Dv(50) = 69 nm; Dv(90) = 98 nm).

Exemplo 2. Administração de nanopartículas de lipossoma carregadas com mRNA da ASS1

[0177] Este exemplo ilustra os métodos exemplares de administração de nanopartículas de lipossomacarregadas com mRNA da ASS1 e métodos para a análise de proteína expressa em vários tecidos alvo in vivo.

[0178] Todos os estudos foram realizados utilizando camundongos CD-1 macho de aproximadamente 6 a 8 semanas de idade no início de cada experimento. As amostras foram introduzidas por uma injeção única na veia da cauda de bólus de uma dose total equivalentes de 1,0 mg/kg (ou especificado de outro modo) de mRNA da ASS1 encapsulado. Os camundongos foram sacrificados e perfundidos com soro fisiológico nos momentos designados.

[0179] Os tecidos como fígado, baço, rim e coração de cada camundongo foram colhidos, repartidos em partes separadas e armazenados em 10% de formalina tamponada neutra ou congelados instantaneamente e armazenados a -80oC para análise.

[0180] Todos os animais foram sacrificados por asfixia de CO2 nos momentos designados administração de pós-dose (±5%), seguida de toracotomia e coleta de sangue cardíaco terminal. O sangue total (volume máximo obtido) foi coletado através de punção cardíaca em animais sacrificados em tubos separadores de soro, que foram deixados para coagular a temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos, centrifugados a 22oC ± 5oC a 9300 g por 10 minutos e o soro foi extraído. Para coletas de sangue intercalares, aproximadamente 40-50 μL do sangue total foram coletados através de punção da veia facial ou ponta da cauda. As amostras coletadas de animais sem tratamento foram usadas como níveis de referência de ASS1 para comparação com animais do estudo.

Análise por Ensaio Imunoenzimático Ligado à Enzima (ELISA) - ELISA da ASS1 Humana

[0181] Os procedimentos ELISA padrão foram seguidos utilizando IgG anti-ASS1 2D1-2E12 de camundongo como anticorpo de captura com IgG anti-ASS1 #3285 de coelho como o anticorpo (Shire Human Genetic Therapies) secundário (detecção). IgG anti-coelho de cabra conjugada com (Peroxidase de rábano (HRP) da solução do substrato 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina (TMB). A reação foi extinta com 2N H2SO4 após 20 minutos. A detecção foi monitorada por meio de absorção (450 nm) sobre um instrumento Molecular Device SpectraMax. O soro, os órgãos e a proteína ASS1 humana do camundongo não tratado foram utilizados como controles negativo e positivo respectivamente.

Exemplo 3. Expressão da Proteína ASS1 Eficiente in vivo

[0182] Este exemplo demonstra que a administração de mRNA da ASS1 resulta na produção bem-sucedida da proteína e na eficácia clínica in vivo.

[0183] A produção da proteína humana ASS1 humana via nanopartículas de lipídio carregadas por mRNA de hASS1 otimizadas por códon carregados foi testada em camundongos CD-1 como uma injeção única intravenosa de bólus. A Figura 1 representa a quantidade proteína ASS1 humana através de ELISA quando os camundongos foram tratados com nanopartículas do lipídio à base de cKK-E12 carregadas com mRNA de ASS1 em várias doses. Os camundongos foram sacrificados 24 horas após a injeção e os órgãos foram coletados (conforme descrito acima).

[0184] Como mostrado na Figura 1, uma resposta clara à dose foi obtida na medição dos níveis hepáticos da proteína ASS1 humana. A variação de dosagem era de 0,10-2,0 mg/kg do mRNA da ASS1 humana encapsulado. Estes dados demonstram a capacidade das nanopartículas de lipídio de se acumularem no fígado e de liberarem a carga de mRNA e do fígado para processar este mRNA exógeno através da tradução para produzir a proteína ASS1 humana. Os valores brutos de proteína ASS1 humana medidos por meio de análise por ELISA (conforme representado na Figura 1) foram mostrados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 O mRNA da ASS1 humana otimizado por códon foi distribuído através de nanopartículas lipídicas à base de CKK-E12. As doses se baseiam no mRNA da ASS1 encapsulado. Os valores são descritos como nanograma da proteína ASS1 humana por miligrama de proteína total no fígado. BLD = Abaixo do Limite de Detecção para ELISA.

[0185] Embora a sensibilidade do teste ELISA ter limitações em valores mais baixos, a análise de Western Blot permite uma clara visualização da proteína ASS1 humana em doses mais baixas (0,30 mg/kg) (Figuras 2A-2D).

[0186] Para entender melhor a capacidade de nanopartículas lipídicas encapsuladas por mRNA da ASS1 para facilitar a entrega do mRNA para os órgãos selecionados (fígado), prosseguimos com um estudo farmacocinético que monitora os níveis de proteína da ASS1 humana no fígado por uma semana. A Figura 3 mostra a quantidade de proteína ASS1 humana detectada no fígado em vários momentos após a administração de nanopartículas lipídicas carregadas com ASS1 humana (cKK-E12). Isto foi realizado como uma dose única (1,0 mg/kg de mRNA encapsulado) administrada por via intravenosa.

[0187] Neste caso, observou-se um nível sérico máximo da proteína ASS1 humana em aproximadamente 24 a 48 horas após a administração. Os níveis mensuráveis de proteína foram ainda observados 1 semana após a administração, conforme determinado por ELISA e Western blot (Figuras 3 e 4A-4E, respectivamente).

[0188] A detecção direta do ingrediente farmacêutico ativo (mRNA da ASS1) nos fígados dos camundongos tratados foi conseguida utilizando métodos à base de hibridação in situ (ISH). Como demonstrado nas Figuras 5A-5I, o RNA mensageiro da ASS1 humana exógena pode ser detectado em níveis elevados no momento inicial (30 minutos) testado e o sinal se manteve forte por 48 horas após a dosagem. Além disso, o mRNA da ASS1 humana ainda era detectável 7 dias após a administração.

[0189] Além da ISH, a detecção da proteína ASS1 humana resultante foi conseguida pelo uso do meio imuno-histoquímico (IHC). Usando um anticorpo monoclonal (02D2-2E12) do camundongo para ligação específica, observamos prontamente a proteína ASS1 humana alvo no citoplasma de hepatócitos de fígados tratados. O sinal foi observado pela primeira vez em fígados tratados fracamente no prazo de 30 minutos, mas claramente 3 horas após a administração. As Figuras 6A-6I mostram a coloração da proteína ASS1 humana em fígados de camundongo tratados em função do tempo após a administração.

[0190] Além disso, observa-se uma entrega generalizada em todo o fígado com forte detecção da proteína ASS1 humana nas células sinusoidais, bem como nos hepatócitos alvo. As Figuras 7A-7B são uma representação de baixa ampliação da coloração de IHC positiva para a proteína ASS1 humana 24 horas após a administração.

[0191] A entrega do mRNA da ASS1 humana e a produção de proteína subsequente não estão limitadas a um sistema de nanopartículas lipídicas único. Vários sistemas de nanopartículas à base de lipídios catiônicos foram explorados quanto à sua capacidade de distribuir mRNA e produzir a proteína desejada. Uma tela de 10 sistemas lipídicos catiônicos diferentes foi investigada usando mRNA da ASS1 humana como o analito de escolha. O componente lipídico catiônico para cada formulação é listado na Tabela 2 e representado na Figura 8. As injeções intravenosas únicas foram administradas e as amostras de fígado foram retiradas 24 horas após a administração.

[0192] As doses das formulações eram todas de 1,0 mg/kg com base no mRNA encapsulado. Os valores se baseiam nas amostras de fígado 24 horas após a administração. Tabela 2 Os valores brutos de proteína ASS1 humana para vários sistemas de nanopartículas à base de lipídio catiônico medidos por meio de análise por ELISA (conforme representado na Figura 9). Todas as doses foram administradas por via intravenosa a 1,0 mg/kg. Os valores da proteína são descritos como nanograma da proteína ASS1 humana por miligrama de proteína total no fígado. cKK-E12 (1) tem um percentual menor de lipídio PEG do que cKK-E12 (2) (3% vs 5% de lipídio PEG).

[0193] Embora a produção de proteína via nanopartículas lipídicas carregadas com mRNA possa ser detectada, determinamos ainda se a proteína resultante está ativa e se pode funcionar adequadamente. Para este fim, estudos da atividade in vitro foram realizados, os quais mediram a incorporação de 14C arginina em proteínas celulares através de suplementação de 14C citrulina. A citrulina radioativa foi convertida em 14C- argininosuccinato e, posteriormente, 14C-arginina, na presença da proteína ASS1 ativa. Ao comparar as células transfectadas de mRNA da ASS1 versus células não tratadas, poderíamos medir a atividade da proteína ASS1 derivada de mRNA exógena respectiva. A Figura 9 representa as contagens radioativas por minuto da incorporação de 14C de arginina nas proteínas celulares. A transfecção das células SK (-) (linha celular de nocaute da proteína ASS1) com mRNA de ASS1 humana exposto a meios esgotados (sem arginina nem leucina) resultou num aumento de radioatividade observada em comparação com as células SK(-) não tratadas. A atividade medida nestas células transfectadas foi comparável a uma linha celular ASS1 positiva estavelmente transfectada (SK(+)).

Exemplo 4. Os níveis de proteína ASS1 humana após o tratamento com nanopartículas lipídicas carregadas com ASS1 do mRNA[

[0194] Este exemplo demonstra que a administração de mRNA da ASS1 resulta na produção bem-sucedida da proteína ASS1 no fígado.

[0195] Foi administrada uma dose única em camundongos CD-1 macho de 1,0 mg/kg de nanopartículas lipídicas (nanopartícula lipídica à base de cKK-E12 carregada pela ASS1 do mRNA) via intravenosa ou não tratado (ou seja, Controle), como descrito acima no Exemplo 2. Os ratinhos foram sacrificados e os órgãos foram recolhidos 24 horas após a administração. Os níveis da proteína argininosuccinato sintetase (ASS1) no fígado foram medidos por ELISA. Estes dados que demonstram aumento dos níveis de proteína ASS1 foram detectados em relação ao controle e que a proteína produzida resultou do mRNA da ASS1 distribuído por via intravenosa (Figura 10).

Exemplo 5: Níveis de amônia do plasma após o tratamento com nanopartículas lipídicas carregadas com ASS1 do mRNA

[0196] Este exemplo demonstra que a administração de mRNA da ASS1 resulta na redução bem-sucedida dos níveis de amônia no plasma.

[0197] Foi administrado 1,0 mg/kg de nanopartículas lipídicas de mRNA da ASS1 (nanopartícula lipídica à base de cKK-E12 carregada pelo mRNA da ASS1) ou nanopartículas lipídicas vazias a cada 14 dias por 30 dias, conforme descrito acima no Exemplo 2. Os camundongos foram administrados com nanopartículas lipídicas vazias que serviram como controle do veículo. Os controles adicionais incluídos camundongos camundongo do tipo selvagem não tratado e camundongo knockout ASS1 não tratado. Antes de cada dose nos dias 1, 15 e 29, as amostras de plasma foram coletadas (isto é, antes da dose). As amostras de plasma também foram coletadas em 24 horas após cada dose nos dias 2, 16 e 30 As amostras de plasma adicionais foram coletadas nos dias 8 e 22. Os níveis de amônia no plasma foram quantificados em todas as amostras e demonstraram que os níveis de amônia no plasma foram reprodutivelmente reduzidas por, pelo menos, 24 horas após o tratamento para níveis próximos dos observados em camundongos de tipo selvagem. EQUIVALENTES Todos aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar o uso de não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descrita neste documento. O escopo da presente invenção não se pretende estar limitado à Descrição acima, mas sim está estabelecida nas seguintes reivindicações.

Claims

1. Uso de uma composição compreendendo mRNA que codifica uma argininossucinato sintetase (ASS1), caracterizado por ser para preparar um medicamento para tratar Deficiência de Argininosuccinato Sintetase (ASD), em que o tratamento compreende administrar a um sujeito em necessidade de tratamento a composição a uma dose eficaz e um intervalo de administração de modo que o nível de amônia no soro do sujeito seja reduzido em comparação ao nível basal de amônia antes do tratamento, em que (i) o mRNA é encapsulado em um lipossoma que consiste em um lipídio catiônico, um lipídio não catiônico, um lipídio à base de colesterol e um lipídio PEGuilado, (ii) o lipídio catiônico constitui de 30-50% do lipossoma por razão molar, (iii) o lipossoma tem um tamanho inferior a 100 nm, (iv) o mRNA tem uma sequência de nucleotídeos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15; e (v) o mRNA é um mRNA otimizado por códons que codifica uma proteína argininosuccinato sintetase (ASS1) humana tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por (i) o lipídio catiônico ser selecionado a partir do grupo que consiste em C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, cKK-E12, ICE (à base de Imidazol), HGT5000, HGT5001, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA e DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT4003, e uma combinações destes, opcionalmente, em que um ou mais lipídios catiônicos compreende cKK-E12: e/ou (ii) o um ou mais dos lipídios não catiônicos são selecionados dentre DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2- dioleil- sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn- glicero-3- fosfo-(1'-rac-glicerol)); e/ou (iii) o um ou mais lipídios à base de colesterol são colesterol e/ou colesterol PEGuilado; e/ou (iv) o um ou mais lipídios modificados por PEG compreendem uma cadeia de poli(etileno) glicol de até 5 kDa de comprimento covalentemente ligada a um lípidio com cadeia(s) de alquila de C6-C20 de comprimento.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a razão molar de lipídio catiônico:lipídio não catiônico: colesterol:lipídio PEGuilado ser de (i) 40:30:20:10 em peso, (ii) 40:30:25:5 em peso, ou (iii) 40:32:25:3 em peso.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado por o lipossoma compreender uma combinação selecionada de: cKK-E12, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, colesterol, DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K; ou ICE, DOPE, colesterol e DMG-PEG2K.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o mRNA ser administrado: (a) na dose eficaz que varia de 0,1 a 5,0 mg/kg de peso corporal, por exemplo, que varia de 0,1 a 3,0 mg/kg de peso corporal ou de 0,1 a 1,0 mg/kg de peso corporal; e (b) uma vez por semana, duas vezes por semana, duas vezes ao mês, uma vez ao mês, uma vez a cada 14 dias.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a composição ser administrada de forma intravenosa.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a proteína ASS1 ser expressa no fígado, e/ou a administração da composição resultar em: (i) . na expressão de um nível da proteína ASS1 igual ou superior a 100 ng/mg de proteína total no fígado; e/ou (ii) . aumento do nível da proteína ASS1 no soro; e/ou (iii) . redução do nível de citrulina no sujeito em comparação com o nível de citrulina de referência antes do tratamento; e/ou redução dos níveis de amônia em 50 μmol/L ou menos, 300 μmol/L ou menos, ou 1500 μmol/L ou menos, no plasma.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por: (i) o mRNA otimizado por códon compreender a SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:15, opcionalmente, em que o mRNA otimizado por códons compreender ainda (a) a sequência UTR 5' da SEQ ID NO:4, ou (b) a sequência UTR 3' da SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:6; e/ou (ii) o mRNA compreender SEQ IDNO:7 ou SEQ ID NO:8; e/ou (iii) o mRNA compreender um ou mais nucleotídeos modificados, opcionalmente, em que um ou mais dos nucleotídeos modificados compreendem pseudouridina, N-1-metil-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrol-pirimidina, 3- metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5- fluorouridina, C5- iodouridina, C5-propinil-uridina, C5- propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2- aminoadenosina, 7- deazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8- oxoguanosina, O(6)-metilguanina e/ou 2-tiocitidina.