ES2861597T3 - Terapia de ARN mensajero para el tratamiento de enfermedad articular - Google Patents

Abstract

Una composición, que comprende uno o más ARNm que codifican uno o más polipéptidos, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección articular, el método comprendiendo la administración local de la composición en la cavidad sinovial de una articulación sinovial de un sujeto con necesidad de administración, de tal manera que la administración de la composición da como resultado la expresión del uno o más polipéptidos codificados por el uno o más ARNm en la articulación, en donde el uno o más ARNm se encapsulan dentro de un liposoma, en donde el liposoma tiene un tamaño de aproximadamente 100 nm o menos y comprende un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido a base de colesterol y un lípido PEGilado a una relación molar del 30%-60% de lípido catiónico, 20%-35% de lípido no catiónico, 20%-30% de lípido a base de colesterol, y 1%-15% de lípido PEGilado.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapia de ARN mensajero para el tratamiento de enfermedad articular

ANTECEDENTES

Todavía se necesitan terapias eficaces para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones articulares como las que resultan directa o indirectamente de la pérdida, expresión aberrante, desregulación o sobreproducción de una proteína asociada o localizada en una articulación. Hay varios obstáculos para implementar una estrategia de tratamiento eficaz para las enfermedades y trastornos articulares, principalmente debido a la anatomía y fisiología únicas de las articulaciones.

La US 6.004.942 describe un método para el tratamiento de la acumulación celular en enfermedades inflamatorias crónicas como la artritis reumatoide.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones articulares basadas en la terapia de ARN mensajero (ARNm). La presente invención se basa, en parte, en la observación inesperada de que el ARNm puede administrarse eficazmente a las articulaciones a pesar de la anatomía y fisiología complejas y únicas de las articulaciones. Como se describe en la presente, incluyendo los ejemplos, los presentes inventores han administrado con éxito ARNm, lo que da como resultado una expresión de proteína robusta en toda la articulación de la rodilla. Por lo tanto, los presentes inventores han demostrado por primera vez que la administración basada en ARNm puede usarse para administrar proteínas terapéuticas de manera eficaz en una articulación para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones articulares.

Específicamente, la invención proporciona una composición, que comprende uno o más ARNm que codifican uno o más polipéptidos, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección articular, el método comprendiendo la administración local de la composición en la cavidad sinovial de una articulación sinovial de un sujeto que necesita administración, de tal manera que la administración de la composición da como resultado la expresión del uno o más polipéptidos codificados por el uno o más ARNm en la articulación, en donde el uno o más ARNm se encapsulan dentro de un liposoma, en donde el liposoma tiene un tamaño de aproximadamente 100 nm o menos y comprende un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido a base de colesterol y un lípido PEGilado a una relación molar del 30%-60% de lípido catiónico, 20%-35% de lípido no catiónico, 20%-30% de lípido a base de colesterol, y 1%-15% de lípido PEGilado.

En algunas realizaciones, la expresión y/o actividad de uno o más polipéptidos se detecta en cartílago, ligamento, músculo, células de la íntima sinovial, condrocitos y/o fluidos de la articulación.

En algunas realizaciones, la expresión y/o actividad del uno o más polipéptidos es detectable por lo menos aproximadamente 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana., 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas o 1 mes después de la administración.

En algunas realizaciones, cada uno de los uno o más ARNm tiene una longitud de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb o 15 kb.

En algunas realizaciones, el uno o más polipéptidos codificados por uno o más ARNm funcionan normalmente en la articulación.

En algunas realizaciones, el uno o más polipéptidos codificados por el uno o más ARNm son antiinflamatorios.

En algunas realizaciones, el uno o más ARNm codifican un anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es una inmunoglobulina intacta, (Fab)² , (Fab')² , Fab, Fab' o scFv. En algunas realizaciones, el uno o más ARNm codifican la cadena pesada, cadena ligera o fragmento de la misma del anticuerpo. En algunas realizaciones, la composición comprende dos ARNm distintos que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo, respectivamente.

En algunas realizaciones, el anticuerpo codificado por el uno o más ARNm es un anticuerpo anti-TNFa, anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo anti-IL-Ip, anticuerpo anti-sTNFR-I, anticuerpo anti-sTNFR-II, anticuerpo anti-IL-2, anticuerpo anti-IFN-Y, anticuerpo anti-IL-18, anticuerpo anti-IL-12 o anticuerpo anti-IL-12p40.

En algunas realizaciones, el uno o más ARNm codifican un receptor soluble.

En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección articular es una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección inflamatoria es artritis. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste de artritis reumatoide, artritis psoriásica, gota, pseudogota, tendinitis, bursitis, síndrome del túnel carpiano, osteoartritis, sinovitis, espondilitis, amiloidosis, estenosis espinal lumbar y/o disfunción de la articulación sacroilíaca.

En algunas realizaciones, la composición se administra una vez a la semana. En algunas realizaciones, la composición se administra dos veces al mes. En algunas realizaciones, la composición se administra una vez al mes.

En algunas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos se seleccionan del grupo que consiste de C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, cKK-E12, ICE (a base de imidazol), HGT5000, HGT5001, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA and DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT4003, y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos comprenden cKK-E12:

En algunas realizaciones, el uno o más lípidos no catiónicos se seleccionan de DSPC (1,2-diestearoil-snglicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo- (1'-racglicerol)).

En algunas realizaciones, el uno o más lípidos a base de colesterol es colesterol o colesterol PEGilado. En algunas realizaciones, el uno o más lípidos modificados con PEG comprenden una cadena de poli(etilen) glicol de hasta 5 kDa de longitud enlazada covalentemente a un lípido con cadena(s) de alquilo de C⁶-C²⁰ de longitud.

En algunas realizaciones, el liposoma comprende cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K. En algunas realizaciones, el liposoma comprende cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K en una proporción de aproximadamente 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:30:25:5 o 40:32:25:3.

En algunas realizaciones, el liposoma comprende C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K. En algunas realizaciones, el liposoma comprende C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K en una proporción de aproximadamente 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:30:25:5 o 40:32:25:3.

En algunas realizaciones, el liposoma comprende HGT5001, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K. En algunas realizaciones, el liposoma comprende HGT5001, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K en una proporción de aproximadamente 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:30:25:5 o 40:32:25:3.

En algunas realizaciones, los liposomas tienen un tamaño de menos de aproximadamente 40-100 nm. Como se usa en la presente, el tamaño de un liposoma se define por el diámetro más grande de la partícula.

En algunas realizaciones, el uno o más ARNm comprenden uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, el uno o más nucleótidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metil-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7- desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y/o 2-tiocitidina.

En algunas realizaciones, el uno o más ARNm no están modificados.

Otras características, objetos y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones que siguen.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

Los dibujos son solo con propósitos ilustrativos, no limitativos.

Las FIGS. 1A-1C representan una visualización ejemplar de la luminiscencia de luciferasa de luciérnaga medida mediante imagenología IVIS. La proteína detectada es el resultado de su producción a partir de ARNm de FFL suministrado mediante administración intraarticular usando nanopartículas lipídicas a base de cKK-E12 (5,0 microgramos, a base de ARNm encapsulado).

Las FIGS. 2A-2C representan una visualización ejemplar de la luminiscencia de luciferasa de luciérnaga en ratones de tipo salvaje medida mediante imagenología IVIS. La proteína detectada es el resultado de su producción a partir de ARNm de FFL suministrado mediante administración intraarticular usando nanopartículas lipídicas a base de C12-200 (5,0 microgramos, a base de ARNm encapsulado).

Las FIGS. 3A-3C representan una visualización ejemplar de la luminiscencia de luciferasa de luciérnaga en ratones de tipo salvaje medida mediante imagenología IVIS. La proteína detectada es el resultado de su producción a partir de ARNm de FFL suministrado mediante administración intraarticular usando nanopartículas lipídicas a base de HGT5001 (2,5 microgramos, a base de ARNm encapsulado).

Las FIGS. 4A-4C representan una visualización ejemplar de la luminiscencia de luciferasa de luciérnaga en ratones de tipo salvaje medida mediante imagenología IVIS. La proteína detectada es el resultado de su producción a partir de ARNm de FFL suministrado mediante administración intraarticular usando nanopartículas lipídicas a base de PEI ramificadas de 25 kDa (2,5 microgramos, a base de ARNm encapsulado).

DEFINICIONES

Para que la presente invención se entienda más fácilmente, a continuación se definen primero ciertos términos. Las definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se exponen a lo largo de la memoria descriptiva.

Alquilo: como se usa en la presente, "alquilo" se refiere a un radical de un grupo hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada que tiene de 1 a 15 átomos de carbono ("alquilo C1-15"). En algunas realizaciones, un grupo alquilo tiene de 1 a 3 átomos de carbono ("alquilo C1-3"). Los ejemplos de grupos alquilo C1-3 incluyen metilo (C1), etilo (C2), n-propilo (C3) e isopropilo (C3). En algunas realizaciones, un grupo alquilo tiene de 8 a 12 átomos de carbono ("alquilo C8-12"). Los ejemplos de grupos alquilo C8-12 incluyen, sin limitación, n-octilo (C8), n-nonilo (C9), n-decilo (C10), n-undecilo (C11), n-dodecilo (C12) y similares. El prefijo "n-" (normal) se refiere a grupos alquilo no ramificados. Por ejemplo, n-alquilo C8 se refiere a -(CH2)7CH3, n-alquilo C10 se refiere a -(CH2)9CH3, etc.

Mejoría: como se usa en la presente, el término "mejoría" significa la prevención, reducción o paliación de un estado, o mejora del estado de un sujeto. La mejoría incluye, pero no requiere, la recuperación completa o la prevención completa de una enfermedad. En algunas realizaciones, la mejoría incluye niveles crecientes de proteína relevante o su actividad que es deficiente en tejidos patológicos relevantes.

Aminoácido: como se usa en la presente, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda incorporarse a una cadena de polipéptidos. En algunas realizaciones, un aminoácido tiene la estructura general H²N-C(H)(R)-COOH. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido de origen natural. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas realizaciones, un aminoácido es un d-aminoácido; en algunas realizaciones, un aminoácido es un 1-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte 1-aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en péptidos de origen natural. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en la presente, "aminoácido sintético" abarca aminoácidos modificados químicamente, que incluyen pero no se limitan a, sales, derivados de aminoácidos (como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos carboxi y/o amino terminales en los péptidos, pueden modificarse mediante metilación, amidación, acetilación, grupos protectores y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar adversamente su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o modificaciones postraduccionales, como la asociación con una o más entidades químicas (por ejemplo, grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, fracciones de formilo, grupos isoprenoides, grupos sulfato, fracciones de polietilenglicol, fracciones lipídicas, fracciones de carbohidratos, fracciones de biotina, etc.). El término "aminoácido" se usa indistintamente con "residuo de aminoácido" y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un residuo de aminoácido de un péptido. Resultará evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o a un residuo de un péptido.

Animal: como se usa en la presente, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En determinadas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, un ganado vacuno, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, un animal modificado genéticamente y/o un clon.

Aproximadamente o alrededor de: como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de", como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).

Enfermedad, trastorno o afección articular: como se usa en la presente, el término "enfermedad, trastorno o afección articular" se refiere a una enfermedad, trastorno o afección que afecta una articulación, una estructura de una articulación y/o un movimiento articular. Por tanto, también se hace referencia a una enfermedad, trastorno o afección articular como enfermedad, trastorno o afección de las articulaciones.

Biológicamente activo: como se usa en la presente, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activo. En realizaciones particulares, donde una proteína o polipéptido es biológicamente activo, a una parte de esa proteína o polipéptido que comparte por lo menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se hace referencia típicamente como una parte "biológicamente activa".

Administración: como se usa en la presente, el término "administración" abarca tanto la administración local como la sistémica. Por ejemplo, la administración de ARNm abarca situaciones en las que se administra un ARNm a un tejido objetivo y la proteína codificada se expresa y se retiene dentro del tejido objetivo (también referida como "distribución local" o "administración local"), y situaciones en las que se administra un ARNm a un tejido objetivo y la proteína codificada se expresa y secreta en el sistema circulatorio del paciente (por ejemplo, suero) y se distribuye sistemáticamente y es absorbida por otros tejidos (también referida “distribución sistémica” o “administración sistémica”).

Expresión: como se usa en la presente, "expresión" de una secuencia de ácidos nucleicos se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARN (por ejemplo, mediante corte y empalme, edición, formación de tapa 5' y/o formación de extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; y/o (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína. En esta solicitud, los términos "expresión" y "producción" y equivalentes gramaticales se usan indistintamente.

Fragmento: el término "fragmento", como se usa en la presente, se refiere a polipéptidos y se define como cualquier porción discreta de un polipéptido dado que es única o característica de ese polipéptido. El término como se usa en la presente también se refiere a cualquier porción discreta de un polipéptido dado que retiene por lo menos una fracción de la actividad del polipéptido de longitud completa. Preferiblemente, la fracción de actividad retenida es por lo menos el 10% de la actividad del polipéptido de longitud completa. Más preferiblemente, la fracción de actividad retenida es por lo menos el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de la actividad del polipéptido de longitud completa. Aún más preferiblemente, la fracción de actividad retenida es por lo menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la actividad del polipéptido de longitud completa. Lo más preferible, la fracción de actividad retenida es del 100% de la actividad del polipéptido de longitud completa. El término como se usa en la presente también se refiere a cualquier porción de un polipéptido dado que incluye por lo menos un elemento de secuencia establecido que se encuentra en el polipéptido de longitud completa. Preferiblemente, el elemento de secuencia abarca por lo menos 4-5, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos del polipéptido de longitud completa.

Funcional: como se usa en la presente, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la que muestra una propiedad y/o actividad por la cual se caracteriza.

Vida media: como se usa en la presente, el término "vida media" es el tiempo requerido para que una cantidad como la concentración o actividad de ácido nucleico o proteína caiga a la mitad de su valor medido al comienzo de un período de tiempo.

Mejorar, aumentar o reducir: como se usan en la presente, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición de referencia, como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en la presente, o una medición en un sujeto de control (o múltiples sujetos de control) en ausencia del tratamiento descrito en la presente. Un "sujeto de control" es un sujeto que padece la misma forma de enfermedad que el sujeto que está siendo tratado, que tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto que está siendo tratado.

In Vitro: como se usa en la presente, el término "in vitro" se refiere a eventos que se producen en un ambiente artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

In vivo: como se usa en la presente, el término "in vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo multicelular, como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que se producen dentro de una célula viva (a diferencia de, por ejemplo, los sistemas in vitro).

Aislado: como se usa en la presente, el término "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de por lo menos algunos de los componentes con los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más de aproximadamente el 99% de los otros componentes con los que estaban asociadas inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados tienen aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o más de aproximadamente el 99% de pureza. Como se usa en la presente, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Como se usa en la presente, el cálculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (por ejemplo, tampón, solvente, agua, etc.).

Articulación: como se usa en la presente, el término "articulación" se refiere a una estructura o localización en la que se conectan los huesos. A una articulación también se hace referencia como una articulación (o superficie articulada).

ARN mensajero (ARNm): como se usa en la presente, el término "ARN mensajero (ARNm)" se refiere a un polinucleótido que codifica por lo menos un polipéptido. El ARNm, como se usa en la presente, abarca ARN tanto modificado como no modificado. El ARNm puede contener una o más regiones codificantes y no codificantes. El ARNm puede purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificarse, sintetizarse químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, el ARNm puede comprender análogos de nucleósidos como análogos que tienen bases o azúcares modificados químicamente, modificaciones de la estructura principal, etc. Una secuencia de ARNm se presenta en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, un ARNm es o comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, guanosina, citidina, uridina); análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5propinil-citidina, C-5propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluoruridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases modificadas químicamente; bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforamidita).

Ácido nucleico: como se usa en la presente, el término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de polinucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de polinucleótidos mediante un enlace fosfodiéster. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a una cadena de polinucleótidos que comprende residuos de ácidos nucleicos individuales. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" abarca ARN así como ADN de cadena sencilla y/o doble y/o ADNc.

Paciente: como se usa en la presente, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a cualquier organismo al que puede administrarse una composición proporcionada, por ejemplo, con propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un humano. Un humano incluye formas pre y postnatales.

Farmacéuticamente aceptable: el término "farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

Sal farmacéuticamente aceptable: las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S.M. Berge et al., describe sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácido no tóxicas farmacéuticamente aceptables son sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido rnalónico o usando otros métodos usados en la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y N+(alquilo C¹-C⁴)⁴. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados usando contraiones como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato y arilsulfonato. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales formadas a partir de la cuaternización de una amina usando un electrófilo apropiado, por ejemplo, un haluro de alquilo, para formar una sal de amino alquilada cuaternizada.

Sujeto: como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a un humano o cualquier animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, cerdo, oveja, caballo o primate). Un humano incluye formas prenatales y posnatales. En muchas realizaciones, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, que se refiere a un humano que se presenta a un proveedor médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término "sujeto" se usa en la presente indistintamente con "individuo" o "paciente". Un sujeto puede padecer o ser susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede presentar o no síntomas de la enfermedad o trastorno.

Sustancialmente: como se usa en la presente, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, si acaso, llegan a completarse y/o proceden a ser completos o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en la presente para capturar la falta potencial de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

Cantidad terapéuticamente eficaz: como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de los síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. Los expertos en la técnica apreciarán que una cantidad terapéuticamente eficaz se administra típicamente mediante un régimen de dosificación que comprende por lo menos una dosis unitaria.

Tratamiento: como se usa en la presente, el término "tratamiento" (también "tratar" o "tratando") se refiere a cualquier administración de una sustancia (por ejemplo, composiciones proporcionadas) que alivia, mejora, revive, inhibe, retrasa la aparición, reduce la gravedad y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas, características y/o causas de una enfermedad, trastorno y/o afección particular (por ejemplo, gripe). Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no muestra signos de la enfermedad, trastorno y/o condición relevante y/o de un sujeto que muestra solo signos tempranos de la enfermedad, trastorno y/o afección. Alternativa o adicionalmente, dicho tratamiento puede ser de un sujeto que muestra uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. El tratamiento puede ser de un sujeto al que se le ha diagnosticado que padece la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. El tratamiento puede ser de un sujeto que se sabe que tiene uno o más factores de susceptibilidad que están estadísticamente correlacionados con un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones basado en la terapia de ARNm. En particular, la presente invención proporciona composiciones para su uso en métodos para tratar enfermedades, trastornos y afecciones de las articulaciones administrando a un sujeto con necesidad de tratamiento una composición que comprende uno o más ARNm que codifican uno o más polipéptidos adecuados para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones de las articulaciones (por ejemplo, polipéptidos terapéuticos). En algunas realizaciones, el uno o más ARNm se encapsulan dentro de uno o más liposomas. Como se usa en la presente, el término "liposoma" se refiere a cualquier vesícula de nanopartículas laminares, multilaminares o sólidas. Típicamente, un liposoma como se usa en la presente puede formarse mezclando uno o más lípidos o mezclando uno o más lípidos y polímero(s). Un liposoma de acuerdo con la invención contiene lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos, lípidos a base den colesterol y lípidos modificados con PEG.

En las siguientes secciones se describen con detalle varios aspectos de la invención. El uso de secciones no pretende limitar la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.

Enfermedades, trastornos o afecciones articulares

Las composiciones de la invención se usan para tratar a un sujeto que padece una enfermedad, trastorno o afección articular. Como se usa en la presente, una "enfermedad, trastorno o afección articular" se refiere a una enfermedad, trastorno o afección que afecta una articulación, una estructura de una articulación y/o un movimiento articulado. Por tanto, a una enfermedad, trastorno o afección articular también se hace referencia como enfermedad, trastorno o afección de las articulaciones. Las enfermedades, trastornos o afecciones articulares pueden afectar a cualquier tipo de articulación o cualquier estructura de una articulación. En algunas realizaciones, la estructura de una articulación incluye huesos, ligamentos, tendones, cartílago, músculo, bolsa y/o membranas sinoviales. Típicamente, las enfermedades, trastornos o afecciones articulares descritas en la presente pueden afectar a articulaciones fibrosas, articulaciones cartilaginosas y/o articulaciones sinoviales. Las enfermedades trastornos o afecciones articulares de acuerdo con al invención afectan a las articulaciones sinoviales.

Las enfermedades, trastornos o afecciones articulares descritas en la presente pueden afectar a las articulaciones clasificadas como articulaciones de la mano, articulaciones del codo, articulaciones de la muñeca, articulaciones axilares, articulaciones esternoventriculares, articulaciones vertebrales, articulaciones temporomandibulares, articulaciones sacroilíacas, articulaciones de la cadera, articulaciones de la rodilla y/o articulaciones del pie.

En algunas realizaciones, una enfermedad, trastorno o afección articular puede estar provocada por una deficiencia de proteínas o disfunciones en una articulación o estructura de una articulación. En algunas realizaciones, una enfermedad, trastorno o afección articular puede estar provocada por un exceso, sobreexpresión y/o sobreactivación de proteínas en una articulación o estructura de una articulación.

Las enfermedades, trastornos o afecciones articulares ejemplares incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, artritis psoriásica, gota, pseudogota, tendinitis, bursitis, síndrome del túnel carpiano, osteoartritis, sinovitis, espondilitis, amiloidosis, estenosis espinal lumbar y/o disfunción de la articulación sacroilíaca.

ARNm para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones articulares

Las composiciones de la presente invención puede usarse para administrar cualquier ARNm que sea adecuado para tratar enfermedades, trastornos o afecciones articulares. En varias realizaciones, la presente invención puede usarse para administrar un ARNm que codifica una proteína que es deficiente en cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones articulares descritos en la presente. En tales realizaciones, la administración de ARNm típicamente da como resultado una expresión y/o actividad de proteínas aumentadas en una articulación suficiente para tratar la deficiencia de proteínas. En algunas realizaciones, un ARNm adecuado para la invención puede codificar una secuencia de proteína de tipo salvaje o de origen natural que normalmente se encuentra en una articulación sana. En algunas realizaciones, el ARNm adecuado para la invención puede ser una secuencia de tipo salvaje o de origen natural. En algunas realizaciones, el ARNm adecuado para la invención puede ser una secuencia de codones optimizados. En algunas realizaciones, un ARNm adecuado para la invención puede codificar una secuencia de aminoácidos que tiene sustancialmente homología o identidad con la secuencia de proteínas de aminoácidos de tipo salvaje o de origen natural (por ejemplo, tiene por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% de identidad de secuencia con la secuencia de tipo salvaje o de origen natural) que está normalmente presente en una articulación sana.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden usarse para administrar un ARNm que codifica un agente terapéutico que inhibe, regula por disminución, reduce la expresión y/o actividad de una proteína, cuyo nivel en exceso está asociado con una enfermedad, trastorno o afección articular. Dicho agente terapéutico puede ser un péptido, un anticuerpo u otros polipéptidos o proteínas.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden usarse para administrar ARNm que codifican un anticuerpo, un receptor soluble u otras proteínas de unión. Típicamente, los ARNm adecuados codifican un anticuerpo que inhibe, regula por disminución o reduce una proteína que está presente en exceso en cantidad y/o actividad en una enfermedad, trastorno o afección articular. En algunas realizaciones, los ARNm adecuados codifican un anticuerpo que activa, regula por incremento o aumenta la actividad de una proteína que es deficiente en una enfermedad, trastorno o afección articular. Los anticuerpos ejemplares adecuados codificados por ARNm de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos contra TNFa, IL-6, IL-1 p, sTNFR-I, sTNFR-II, IL-2, IFN- ^y , IL-18, IL-12, IL-12p40.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden usarse para administrar múltiples ARNm distintos, cada ARNm distinto codificando por lo menos un polipéptido. Por ejemplo, cada ARNm distinto puede codificar una cadena pesada, una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento del mismo (por ejemplo, una región variable, una región Fc, etc.).

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" abarca tanto el anticuerpo intacto como el fragmento de anticuerpo. Típicamente, un "anticuerpo" intacto es una inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno particular. Un anticuerpo puede ser miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgE, IgA e IgD. Típicamente, un anticuerpo intacto es un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, cada par teniendo una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas regiones correspondientes en la cadena ligera y pesada, respectivamente. Cada región variable puede subdividirse en regiones hipervariables (HV) y marco (FR). Las regiones hipervariables comprenden tres áreas de secuencia de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR 1, CDR 2 y CDR 3), separadas por cuatro regiones marco (FR1, FR2, FR2 y FR4) que forman una estructura de lámina beta y sirven como un andamiaje para mantener las regiones HV en su posición. El extremo C-terminal de cada cadena ligera y pesada define una región constante que consiste de un dominio para la cadena ligera (CL) y tres para la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Una cadena ligera de inmunoglobulinas puede diferenciarse adicionalmente en los isotipos kappa y lamda.

En algunas realizaciones, los términos "anticuerpo intacto" o "anticuerpo completamente ensamblado" se usan en referencia a un anticuerpo que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, opcionalmente asociadas por enlaces disulfuro como ocurre con los anticuerpos producidos de manera natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención es un fragmento de anticuerpo.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención pueden usarse para administrar un "fragmento de anticuerpo". Como se usa en la presente, un "fragmento de anticuerpo" incluye una porción de un anticuerpo intacto como, por ejemplo, la región variable o de unión al antígeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab^')2 y Fv; triacuerpos; tetracuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados, fragmentos "Fv", que consisten de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas de polipéptidos de cadena simple recombinantes en las que las regiones variables de la cadena ligera y pesada están conectadas por un conector peptídico ("proteínas ScFv") y unidades de reconocimiento mínimo que consisten de los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable. En muchas realizaciones, un fragmento de anticuerpo contiene una secuencia suficiente del anticuerpo original del que es un fragmento que se une al mismo antígeno que el anticuerpo original; en algunas realizaciones, un fragmento se une al antígeno con una afinidad comparable a la del anticuerpo original y/o compite con el anticuerpo original por unirse al antígeno. Ejemplos de fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')² , fragmento scFv, fragmento Fv, diacuerpo dsFv, fragmento dAb, fragmento Fd', fragmento Fd y una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, mezclas o cócteles de anticuerpos, anticuerpos humanos o humanizados, anticuerpos quiméricos o anticuerpos biespecíficos.

Síntesis de ARNm

Los ARNm adecuados para la presente invención pueden sintetizarse de acuerdo con cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm adecuados para la presente invención pueden sintetizarse mediante transcripción in vitro (IVT). Brevemente, la IVT se realiza típicamente con una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor, un grupo de trifosfatos de ribonucleótidos, un sistema tampón que puede incluir DTT e iones de magnesio y una ARN polimerasa apropiada (por ejemplo, T3, T7 o SP6 ARN polimerasa), ADNsa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variarán de acuerdo con la aplicación específica.

En algunas realizaciones, para la preparación de ARNm de acuerdo con la invención, se transcribe una plantilla de ADN in vitro. Una plantilla de ADN adecuada típicamente tiene un promotor, por ejemplo, un promotor T3, T7 o SP6, para la transcripción in vitro, seguido de la secuencia de nucleótidos deseada para el ARNm deseado y una señal de terminación.

Las secuencias de ARNm deseadas de acuerdo con la invención pueden determinarse e incorporarse en una plantilla de ADN usando métodos estándar. Por ejemplo, partiendo de una secuencia de aminoácidos deseada (por ejemplo, una secuencia de enzimas), se lleva a cabo una traducción inversa virtual en base al código genético degenerado. Luego pueden usarse algoritmos de optimización para la selección de codones adecuados. Típicamente, el contenido de G/C puede optimizarse para lograr el contenido de G/C más alto posible por un lado, teniendo en cuenta la mejor frecuencia posible de los ARNt de acuerdo con el uso de codones por otro lado. La secuencia de ARN optimizada puede establecerse y presentarse, por ejemplo, con la ayuda de un dispositivo de visualización apropiado y compararse con la secuencia original (tipo salvaje). También puede analizarse una estructura secundaria para calcular propiedades de estabilización y de desestabilización o, respectivamente, regiones de ARN.

ARNm modificado

En algunas realizaciones, el ARNm de acuerdo con la presente invención puede sintetizarse como ARNm modificado o no modificado. Típicamente, los ARNm se modifican para mejorar la estabilidad. Las modificaciones del ARNm pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleótidos del ARN. Por tanto, un ARNm modificado de acuerdo con la invención puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la estructura principal, modificaciones de azúcar o modificaciones de bases. En algunas realizaciones, los ARNm pueden sintetizarse a partir de nucleótidos de origen natural y/o análogos de nucleótidos (nucleótidos modificados) que incluyen, pero no se limitan a, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)), y como análogos o derivados de nucleótidos modificados de purinas y pirimidinas como, por ejemplo, 1-metil-adenina, 2-metil-adenina, 2-metiltio-N-6-isopentenil-adenina, N6-metil-adenina, N6-isopentenil-adenina, 2-tio-citosina, 3-metil-citosina, 4-acetil-citosina, 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metil-guanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7-metil-guanina, inosina, 1-metil-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tio-uracilo, 5-metil-uracilo, éster metílico de ácido N-uracil-5-oxiacético, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracilo, 5’-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 1-metil-pseudouracilo, queosina, .beta.-D-manosil-queosina, wybutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparación de tales análogos es conocida por un experto en la técnica, por ejemplo, de la Patente de Estados Unidos N° 4,373,071, Patente de Estados Unidos N° 4,401,796, Patente de Estados Unidos N° 4,415,732, Patente de Estados Unidos N° 4,458,066, Patente de Estados Unidos N° 4,500,707, Patente de Estados Unidos N° 4,668,777, Patente de Estados Unidos N° 4,973,679, Patente de Estados Unidos N° 5,047,524, Patente de Estados Unidos N° 5,132,418, Patente de Estados Unidos N° 5,153,319, Patentes de Estados Unidos N° 5,262,530 y 5,700,642.

En algunas realizaciones, los ARNm pueden contener modificaciones de la estructura principal del ARN. Típicamente, una modificación de la estructura principal es una modificación en la que los fosfatos de la estructura principal de los nucleótidos contenidos en el ARN se modifican químicamente. Las modificaciones de la estructura principal ejemplares incluyen típicamente, pero no se limitan a, modificaciones del grupo que consiste de metilfosfonatos, metilfosforamidatos, fosforamidatos, fosforotioatos (por ejemplo, citidina 5'-O-(1-tiofosfato)), boranofosfatos, grupos guanidinio cargados positivamente, etc. lo que significa reemplazar el enlace fosfodiéster por otros grupos aniónicos, catiónicos o neutros.

En algunas realizaciones, los ARNm pueden contener modificaciones de azúcar. Una modificación de azúcar típica es una modificación química del azúcar de los nucleótidos que contiene incluidas, pero no limitadas a, modificaciones de azúcar elegidas del grupo que consiste de 2'-desoxi-2'-fluoro-oligoribonucleótido (2'-fluoro-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-fluoro-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-desoxi-2'-deamina-oligorribonucleótido (2'-amino2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-O-alquiloligoribonucleótido, 2'-desoxi-2'-C-alquiloligoribonucleótido (2'-O-metilcitidina 5'-trifosfato, 2'-metiluridina 5'-trifosfato), 2'-C-alquiloligoribonucleótido, e isómeros de los mismos (2'-aracitidina 5'-trifosfato, 2'-arauridina 5'-trifosfato) o azidotrifosfatos (2'-azido-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato).

En algunas realizaciones, los ARNm pueden contener modificaciones de las bases de los nucleótidos (modificaciones de bases). Un nucleótido modificado que contiene una modificación de base también se denomina nucleótido de base modificada. Ejemplos de tales nucleótidos de base modificada incluyen, pero no se limitan a, 2-amino-6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2-tiouridina 5'-trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5-yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina 5'-trifosfato, 6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 7-desazaadenosina 5'-trifosfato, 7-desazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, bencimidazol ribosido 5'-trifosfato, N1-metiladenosina 5'-trifosfato, N1-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'-trifosfato o xantosina 5'-trifosfato

Típicamente, la síntesis de ARNm incluye la adición de una "tapa" en el extremo N-terminal (5 ') y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). La presencia de la tapa es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas.

Estructura de tapa

En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de tapa 5'. Típicamente, se añade una tapa 5' de la siguiente manera: primero, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5', dejando dos fosfatos terminales; luego, se añade trifosfato de guanosina (GTP) a los fosfatos terminales mediante una guanilil transferasa, produciendo un enlace trifosfato 5'5'5; y luego el nitrógeno 7 de la guanina se metila mediante una metiltransferasa. Los ejemplos de estructuras de tapa incluyen, pero no se limitan a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

Las estructuras de tapa de origen natural comprenden una 7-metil guanosina que está enlazada mediante un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleótido transcrito, lo que da como resultado una tapa de dinucleótido de m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleósido. In vivo, la tapa se añade enzimáticamente. La tapa se añade en el núcleo y es catalizada por la enzima guanilil transferasa. La adición de la tapa al extremo 5' terminal del ARN se produce inmediatamente después del inicio de la transcripción. El nucleósido terminal es típicamente una guanosina, y está en orientación inversa a todos los otros nucleótidos, es decir, G(5')ppp(5')GpNpNp.

Una tapa común para el ARNm producida por transcripción in vitro es m7G(5')ppp(5')G, que se ha usado como tapa de dinucleótidos en la transcripción con la ARN polimerasa T7 o SP6 in vitro para obtener ARN que tienen una estructura de tapa en sus extremos 5'-terminales. El método predominante para la síntesis in vitro de ARNm con tapa emplea un dinucleótido preformado de la forma m7G(5')ppp(5')G ("m7GpppG") como iniciador de la transcripción.

Hasta la fecha, una forma habitual de una tapa de dinucleótido sintético usada en experimentos de traducción in vitro es el análogo de tapa anti-inverso ("ARCA") o ARCA modificado, que generalmente es un análogo de tapa modificado en el que el grupo OH 2' o 3' se reemplaza con -OCH³.

Los análogos de tapa adicionales incluyen, pero no se limitan a, estructuras químicas seleccionadas del grupo que consiste de m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; análogos de tapa no metilados (por ejemplo, GpppG); análogo de tapa dimetilados (por ejemplo, m27GpppG), análogo de tapa trimetilado (por ejemplo, m2-2-7GpppG), análogos de tapa simétricos dimetilados (por ejemplo, m7Gpppm7G), o análogos de tapa anti-inversos (por ejemplo ARCA; m7’2OmeGpppG, m72dGpppG, m7’3OmeGpppG, m7’3dGpppG y sus derivados de tetrafosfato) (ver, por ejemplo, Jemielity, J. et al., "Novel ’anti-reverse’ cap analogs with superior translational properties", RNA, 9: 1108-1122 (2003)).

En algunas realizaciones, una tapa adecuada es un 7-metil guanilato ("m7G") enlazado mediante un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleótido transcrito, lo que da como resultado m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleósido. Una realización preferida de tapa m7G utilizada en realizaciones de la invención es m7G(5')ppp(5')G.

En algunas realizaciones, la tapa es una estructura Cap0. Las estructuras Cap0 carecen de un residuo de 2'-O-metilo de la ribosa unido a las bases 1 y 2. En algunas realizaciones, la tapa es una estructura Cap1. Las estructuras Cap1 tienen un residuo de 2'-O-metilo en la base 2. En algunas realizaciones, la tapa es una estructura Cap2. Las estructuras Cap2 tienen un residuo de 2'-O-metilo unido a ambas bases 2 y 3.

En la técnica se conocen una variedad de análogos de tapa m7G, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Estos incluyen la m7GpppG descrita anteriormente, así como los análogos de tapa ARCA 3'-OCH3 y 2'-OCH3 (Jemielity, J. et al., RNA, 9:1108-1122 (2003)). Análogos de tapa adicionales para su uso con la invención incluyen análogos de tetrafosfato de dinucleósido N7 bencilados (descritos en Grudzien, E. et al., RNA, 10: 1479­ 1487 (2004)), análogos de tapa de fosforotioato (descritos en Grudzien-Nogalska, E., et al., RNA, 13: 1745-1755 (2007)) y análogos de tapa (incluyendo análogos de tapa biotinilados) descritos en las Patente de Estados Unidos N° 8.093.367 y 8.304.529.

Estructura de cola

Típicamente, la presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasas. Se cree que la cola de poli A estabiliza los mensajeros naturales y el ARN de sentido sintético. Por lo tanto, en ciertas realizaciones puede añadirse una cola poli A larga a una molécula de ARNm, volviendo de este modo el ARN más estable. Las colas de Poli A pueden añadirse usando una variedad de técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden añadirse colas de poli A largas a ARN sintético o transcrito in vitro usando poli A polimerasa (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripción también puede codificar colas de poli A largas. Además, pueden añadirse colas de poli A mediante transcripción directamente a partir de productos de PCR. La poli A también puede ligarse al extremo 3' de un ARN de sentido con ARN ligasa (ver, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., Ed. Por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: edición de 1991)).

En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de cola de poli (A) 3'. Típicamente, la longitud de la cola de poli A puede ser de por lo menos aproximadamente 10, 50, 100, 200, 300, 400 y por lo menos 500 nucleótidos. En algunas realizaciones, una cola de poli-A en el extremo terminal 3' del ARNm incluye típicamente aproximadamente de 10 a 300 nucleótidos de adenosina (por ejemplo, aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 10 a 150 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos de adenosina, aproximadamente de 20 a 70 nucleótidos de adenosina, o aproximadamente de 20 a 60 nucleótidos de adenosina). En algunas realizaciones, puede usarse una cola de poli(U) en lugar de una cola de poli(A) descrita en la presente. En algunas realizaciones, puede añadirse una cola de poli(U) a una cola de poli(A) descrita en la presente. En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de cola de poli(C) 3'. Una cola de poli(C) adecuada en el extremo terminal 3' del ARNm incluye típicamente aproximadamente de 10 a 200 nucleótidos de citosina (por ejemplo, aproximadamente de 10 a 150 nucleótidos de citosina, aproximadamente de 10 a 100 nucleótidos de citosina, aproximadamente de 20 a 70 nucleótidos de citosina, aproximadamente de 20 a 60 nucleótidos de citosina o aproximadamente de 10 a 40 nucleótidos de citosina). La cola de poli(C) puede añadirse a una cola de poli(A) y/o poli(U) o puede sustituir la cola de poli(A) y/o poli(U).

En algunas realizaciones, la longitud de la cola de poli(A), poli(U) o poli(C) se ajusta para controlar la estabilidad de una molécula de ARNm de sentido modificada de acuerdo con la invención y, por tanto, la transcripción de la proteína. Por ejemplo, como la longitud de la estructura de la cola puede influir en la vida media de una molécula de ARNm de sentido, la longitud de la cola puede ajustarse para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y controlar de este modo el curso temporal de la expresión de polinucleótidos y/o producción de polipéptidos en una célula objetivo.

Región no traducida 5r y 3r

En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una región no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una región no traducida 5' incluye uno o más elementos que afectan a la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una región no traducida 5' puede tener una longitud de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos.

En algunas realizaciones, una región no traducida 3' incluye uno o más de una señal de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan a la estabilidad de ARNm de localización en una célula, o uno o más sitios de unión para ARNmi. En algunas realizaciones, una región no traducida 3' puede tener entre 50 y 500 nucleótidos de longitud o más.

Las secuencias de UTR 3' y/o 5' ejemplares pueden derivarse de moléculas de ARNm que son estables (por ejemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del ácido cítrico) para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm de sentido. Por ejemplo, una secuencia 5' UTR puede incluir una secuencia parcial de un gen 1 temprano inmediato (IE1) de CMV, o un fragmento del mismo para mejorar la resistencia a nucleasas y/o mejorar la vida media del polinucleótido. También se contempla la inclusión de una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humana (hGH), o un fragmento de la misma en el extremo o región no traducida 3' del polinucleótido (por ejemplo, ARNm) para estabilizar adicionalmente el polinucleótido. Generalmente, estas modificaciones mejoran la estabilidad y/o propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, vida media) del polinucleótido con respecto a sus contrapartidas no modificadas, e incluyen, por ejemplo modificaciones elaboradas para mejorar la resistencia de tales polinucleótidos a la digestión por nucleasas in vivo.

Vehículos de administración

De acuerdo con la presente invención, el uno o más ARNm se encapsulan dentro de un liposoma como el vehículo de administración

En algunas realizaciones, los ARNm pueden administrarse mediante un único vehículo de administración. En algunas realizaciones, los ARNm pueden administrarse mediante uno o más vehículos de administración, cada uno de ellos con una composición diferente.

Vehículos de administración liposomal

Como se usan en la presente, los vehículos de administración liposomal se caracterizan habitualmente como vesículas microscópicas que tienen un espacio acuoso interior secuestrado de un medio externo por una membrana de una o más bicapas. Las membranas bicapa de los liposomas están formadas típicamente por moléculas anfifílicas, como lípidos de origen sintético o natural que comprenden dominios hidrófilos e hidrófobos separados espacialmente (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). Las membranas bicapa de los liposomas también pueden estar formadas por polímeros anfófilos y surfactantes (por ejemplo, polimerosomas, niosomas, etc.). En el contexto de la presente invención, un vehículo de administración liposomal sirve típicamente para transportar un ARNm deseado a una célula o tejido objetivo. Al proceso de incorporación de un ARNm deseado en un liposoma se hace referencia a menudo como "carga". Métodos ejemplares se describen en Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255­ 258, 1992. Los ácidos nucleicos incorporados en el liposoma pueden estar localizados completa o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma o asociados con la superficie exterior de la membrana del liposoma. A la incorporación de un ácido nucleico en liposomas también se hace referencia en la presente como "encapsulación" en donde el ácido nucleico está contenido completamente dentro del espacio interior del liposoma. El propósito de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, como un liposoma, es a menudo para proteger el ácido nucleico de un entorno que puede contener enzimas o agentes químicos que degradan los ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que provocan la excreción rápida de los ácidos nucleicos.

Lípidos catiónicos

Los liposomas de acuerdo con la invención comprenden uno o más lípidos catiónicos. Como se usa en la presente, la frase "lípido catiónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que tienen una carga neta positiva a un pH seleccionado, como pH fisiológico. Se han descrito varios lípidos catiónicos en la bibliografía, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Los lípidos catiónicos particularmente adecuados para su uso en las composiciones y métodos de la invención incluyen los descritos en las publicaciones de patente internacional WO 2010/053572 (y particularmente, CI 2-200 descrita en el párrafo [00225]) y WO 2012/170930. En ciertas realizaciones, los liposomas comprenden un lípido catiónico ionizable descrito en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos 61/617.468, presentada el 29 de marzo de 2012, como por ejemplo, (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-il)tetracosa-15,18-dien-1-amina (HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-il)tetracosa-4,15,18-trien-1-amina (HGT5001), y (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12z )-octadeca-9, 12-dien- 1 -il)tetracosa-5, 15, 18-trien- 1-amina (HGT5002).

En algunas realizaciones, los liposomas proporcionados incluyen un lípido catiónico descrito en la WO 2013063468 y en la solicitud provisional de Estados Unidos titulada "Lipid Formulations for Delivery of Messenger RNA" presentada simultáneamente con la presente solicitud en la misma fecha. En algunas realizaciones, un lípido catiónico comprende un compuesto de fórmula I-c1-a:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:

cada R2 es independientemente hidrógeno o alquilo C^1-3;

cada q es independientemente de 2 a 6;

cada R' es independientemente hidrógeno o alquilo C^1-3;

y cada RL es independientemente alquilo C^8-12.

En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrógeno, metilo o etilo. En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrógeno o metilo. En algunas realizaciones, cada R2 es hidrógeno.

En algunas realizaciones, cada q es independientemente de 3 a 6. En algunas realizaciones, cada q es independientemente de 3 a 5. En algunas realizaciones, cada q es 4.

En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrógeno, metilo o etilo. En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrógeno o metilo. En algunas realizaciones, cada R' es independientemente hidrógeno.

En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C^8-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C^8-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C^9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C¹⁰. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C¹⁰.

En algunas realizaciones, cada R2 es independientemente hidrógeno o metilo; cada q es independientemente de 3 a 5; cada R' es independientemente hidrógeno o metilo; y cada RL es independientemente alquilo C^8-12.

En algunas realizaciones, cada R2 es hidrógeno; cada q es independientemente de 3 a 5; cada R' es hidrógeno; y cada RL es independientemente alquilo C^8-12.

En algunas realizaciones, cada R2 es hidrógeno; cada q es 4; cada R' es hidrógeno; y cada RL es independientemente alquilo C^8-12.

En algunas realizaciones, un lípido catiónico comprende un compuesto de fórmula I-g:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada RL es independientemente alquilo Cs^-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo Cs^-12. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C^9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente n-alquilo C^9-11. En algunas realizaciones, cada RL es independientemente alquilo C¹⁰. En algunas realizaciones, cada RL es n- alquilo C10.

En realizaciones particulares, los liposomas proporcionados incluyen un lípido catiónico cKK-E12 o (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino) butil)piperazina-2,5-diona). A continuación se muestra la estructura de cKK-E12:

Como se describe en la sección de Ejemplos a continuación, los presentes inventores observaron que los liposomas basados en esta clase particular de lípidos catiónicos, como los que tienen una estructura de fórmula I-c1-a o fórmula I-g descrita en la presente (por ejemplo, cKK-E12) son inesperadamente eficaces en la administración de ARNm y la producción de proteína codificada in vivo. Aunque el ARNm que codifica la proteína PAH se usa como ejemplo en esta solicitud, se contempla que esta clase de lípidos catiónicos que tienen una estructura de fórmula I-c1-a o fórmula I-g descrita en la presente (por ejemplo, cKK-E12) puede ser útil para administrar cualquier ARNm para la producción sostenida y altamente eficiente de proteína (por ejemplo, proteína terapéutica) in vivo. Por ejemplo, los lípidos catiónicos que tienen una estructura de fórmula I-c1-a o fórmula I-g descrita en la presente (por ejemplo, cKK-E12) pueden usarse para administrar un ARNm que codifica uno o más péptidos de origen natural o uno o más péptidos modificados o no naturales. En algunas realizaciones, los lípidos catiónicos que tienen una estructura de fórmula I-c1-a o fórmula I-g descrita en la presente (por ejemplo, cKK-E12) pueden usarse para administrar un ARNm que codifica una proteína intracelular que incluye, pero no se limita a, una proteína citosólica (por ejemplo, una proteína chaperona, una enzima intracelular (por ejemplo, ARNm que codifica una enzima asociada con el ciclo de la urea o trastornos de almacenamiento lisosómico)), una proteína asociada con el citoesqueleto de actina, una proteína asociada con la membrana plasmática, una proteína perinuclear, una proteína nuclear (por ejemplo, un factor de transcripción) y cualquier otra proteína implicada en el metabolismo celular, reparación, transcripción y/o traducción del ADN). En algunas realizaciones, los lípidos catiónicos que tienen una estructura de fórmula I-c1-a o fórmula I-g descrita en la presente (por ejemplo, cKK-E12) pueden usarse para administrar un ARNm que codifica una proteína transmembrana, como una proteína de canal iónico. En algunas realizaciones, los lípidos catiónicos que tienen una estructura de fórmula I-c1-a o fórmula I-g descrita en la presente (por ejemplo, cKK-E12) pueden usarse para administrar un ARNm que codifica una proteína extracelular que incluye, pero no se limita a, una proteína asociada con la matriz extracelular, una proteína secretada (por ejemplo, hormonas y/o neurotransmisores).

En algunas realizaciones, uno o más lípidos catiónicos adecuados para su uso con la presente invención pueden ser cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil] -N,N,N-trimetilamonio o "DOTMA". (Feigner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Patente de Estados Unidos N° 4.897.355). DOTMA puede formularse solo o puede combinarse con el lípido neutro, dioleoilfosfatidil-etanolamina o “DOPE" u otros lípidos catiónicos o no catiónicos en un vehículo de transferencia liposomal o una nanopartícula lipídica, y tales liposomas pueden usarse para mejorar la administración de ácidos nucleicos en las células objetivo. Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen, por ejemplo, 5-carboxispermilglicinodioctadecilamida o "DOGS”, 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1 -propanaminio o “DOSPA” (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); Patente de Estados Unidos N° 5.171.678; Patente de Estados Unidos N° 5.334.761), 1,2-Dioleoil-3-Dimetilamonio-Propano o "DODAP", 1,2-Dioleoil-3-Trimetilamonio-Propano o "DOTAP".

Lípidos catiónicos ejemplares adicionales también incluyen, 1,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DSDMA", 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DODmA", 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLenDMA", cloruro de N-dioleil-N,N-dimetilamonio o "DODAC", bromuro de N,N-distearil-N,N-dimetilamonio o "DDAB", bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil amonio o "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o "CLinDMA", 2-[5’-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3’-oxapentoxi)-3-dimeti 1 -1 -(cis,cis-9’,1 -2’-octadecadienoxi)propano o "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibenzilamina o "DMOBA", 1 ,2-N,N’-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o "DLinDAP", 1,2-N,N’-Dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLincarbDAP", 1,2-Dilinoleoilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano o "DLin- -DMA", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano o "DLin-K-XTC2-DMA", y 2-(2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)-1,3-dioxolan-4-il)-N,N dimetiletanamina (DLin-KC2-DMA)) (ver la, w O 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)), o mezclas de los mismos. (Heies, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissei, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicación de PCT WO2005/121348A1). En algunas realizaciones, uno o más de los lípidos catiónicos comprenden por lo menos una fracción de imidazol, dialquilamino o guanidinio.

En algunas realizaciones, el uno o más lípidos catiónicos pueden elegirse de XTC (2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano), MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31 -tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoato),ALNI-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina)), NC98-5 (4,7,13-tris(3-oxo-3-(undecilamino)propil)-N1 ,N16-diundecil-4,7,10,13-tetraazahexadecano-1,16-diamida), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), HGT4003 (WO 2012/170889), ICE (WO2011/068810), HGT5000 (Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/617.468) o HGT5001 (cos o trans) (Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 61/617.468), lipoides de aminoalcoholes como los divulgados en la WO2010/053572, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. "La saturación de lípidos catiónicos influye en la administración intracelular de ácidos nucleicos encapsulados" J. Contr. Rel. 2005, 107, 276­ 287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. "Diseño racional de lípidos catiónicos para la administración de ARNip" Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. "Materiales similares a lípidos para el silenciamiento génico in vivo en dosis bajas" PNAS 2010, 107, 1864-1869).

En algunos casos de la divulgación, el porcentaje de lípido catiónico en un liposoma puede ser mayor del 10%, mayor del 20%, mayor del 30%, mayor del 40%, mayor del 50%, mayor del 60% o mayor del 70%. En algunas realizaciones como se define en las reivindicaciones, los lípidos catiónicos constituyen aproximadamente el 30-50% (por ejemplo, aproximadamente el 30-45%, aproximadamente el 30-40%, aproximadamente el 35-50%, aproximadamente el 35-45% o aproximadamente el 35-40%) del liposoma en peso. En algunas realizaciones como se define en las reivindicaciones, el lípido catiónico (por ejemplo, cKK-E12) constituye aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45% o aproximadamente el 50% del liposoma en relación molar.

Lípidos no catiónicos/auxiliares

Los liposomas proporcionados también contienen uno o más lípidos no catiónicos ("auxiliares"). Como se usa en la presente, la frase "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido neutro, zwitteriónico o aniónico. Como se usa en la presente, la frase "lípido aniónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que llevan una carga negativa neta a un pH seleccionado, como pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, pero no se limitan a, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoilfosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-stearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), o una mezcla de los mismos.

En algunas realizaciones, un lípido no catiónico es un lípido neutro, es decir, un lípido que no lleva una carga neta en las condiciones en las que se formula y/o administra la composición. En algunas realizaciones, el porcentaje de lípido no catiónico en un liposoma puede ser mayor del 20%, o mayor del 30%.

Lípidos a base de colesterol

Los liposomas proporcionados también comprenden uno o más lípidos a base de colesterol. Por ejemplo, los lípidos catiónicos a base de colesterol adecuados incluyen, por ejemplo, DC-Choi (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); Patente de Estados Unidos N° 5.744.335), o ICE. En algunos casos de la divulgación, el lípido a base de colesterol puede comprender una relación molar del 20% al 30% del lípido total presente en un liposoma. En algunos casos de la divulgación, el porcentaje de lípidos a base de colesterol en la nanopartícula lipídica puede ser mayor del 20%.

Lípidos PEGilados

Los liposomas proporcionados también comprenden uno o más lípidos PEGilados. Por ejemplo, se contempla el uso de fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivatizados como ceramidas derivatizadas (PEG-CER), incluyendo N-octanoil-esfingosina-1-[succinil(metoxi polietilenglicol)-2000] (C8 PEG-2000 ceramida) junto con otros lípidos que comprende el liposoma. Los lípidos modificados con PEG contemplados incluyen, pero no se limitan a, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) de alquilo de C⁶-C²⁰ de longitud. En algunas realizaciones, un lípido PEGilado o modificado con PEG es colesterol PEGilado o PEG-2K. La adición de tales componentes puede prevenir la agregación compleja y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida útil de la circulación y aumentar la administración de la composición de lípido-ácido nucleico a la célula objetivo, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1):235-237), o pueden seleccionarse para intercambiar rápidamente fuera de la formulación in vivo (ver la Patente de Estados Unidos N25.885.613).

En algunas realizaciones, los lípidos intercambiables particularmente útiles son PEG-ceramidas que tienen cadenas de acilo más cortas (por ejemplo, C¹⁴ o C¹⁸). El fosfolípido PEG-modificado y los lípidos derivatizados pueden comprender una relación molar de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15%, por ejemplo, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 10%, o aproximadamente el 2% del lípido total presente en el liposoma.

De acuerdo con varias realizaciones, la selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos, y lípidos modificados con PEG que comprenden la nanopartícula lipídica, así como la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características de los lípidos seleccionados, la naturaleza de las células objetivo pretendidas, las características del ARNm que se va a administrar. Consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena de alquilo, así como el tamaño, carga, pH, pKa, fusiogenicidad y toxicidad de los lípidos seleccionados. Por tanto, las relaciones molares pueden ajustarse en consecuencia.

Los lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos, colesterol y/o lípidos modificados con PEG pueden combinarse a varias relaciones molares relativas. Por ejemplo, la proporción de lípidos catiónicos (por ejemplo, CKK-E12, C12-200, HGT5001, etc.) con lípidos no catiónicos (por ejemplo, DOPE, etc.) con lípidos a base den colesterol (por ejemplo, colesterol) con lípidos PEGilados. (por ejemplo, DMG-PEG2K) está entre aproximadamente 30-60:20-35:20-30:1-15, respectivamente. En algunas realizaciones, el liposoma comprende cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K. En algunas realizaciones, el liposoma comprende cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K en una proporción de 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:30:25:5 o 40:32:25:3. En algunas realizaciones, el liposoma comprende C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K. En algunas realizaciones, el liposoma comprende C12-200, DOPE, colesterol, y DMG-PEG2K en una proporción de 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:30:25:5 o 40:32:25:3. En algunas realizaciones, el liposoma comprende HGT5001, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K. En algunas realizaciones, el liposoma comprende C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K en una proporción de 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:30:25:5 o 40:32:25:3.

Formación de liposomas

Los vehículos de transferencia liposomal para su uso en la presente invención pueden prepararse mediante varias técnicas que se conocen actualmente en la técnica. Los liposomas para su uso en las composiciones proporcionadas pueden prepararse mediante varias técnicas que se conocen actualmente en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse vesículas multilaminares (MLV) de acuerdo con técnicas convencionales, como depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un envase o recipiente adecuado disolviendo el lípido en un solvente apropiado, y luego evaporando el solvente para dejar una película fina en el interior del recipiente o mediante secado por pulverización. Luego puede añadirse una fase acuosa al recipiente con un movimiento de vórtice que da como resultado la formación de MLV. Luego pueden formarse las vesículas unilamelares (ULV) por homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilaminares. Adicionalmente, las vesículas unilamelares pueden formarse mediante técnicas de eliminación de detergentes.

En ciertas realizaciones, las composiciones proporcionadas comprenden un liposoma en el que el ARNm está asociado tanto en la superficie del liposoma como encapsulado dentro del mismo liposoma. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los liposomas catiónicos pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas.

Las composiciones de la invención comprenden ARNm encapsulado en un liposoma. En algunas realizaciones, la una o más especies de ARNm pueden encapsularse en el mismo liposoma. En algunas realizaciones, la una o más especies de ARNm pueden encapsularse en liposomas diferentes. En algunas realizaciones, el ARNm se encapsula en uno o más liposomas, que difieren en su composición lipídica, relación molar de componentes lipídicos, tamaño, carga (potencial Zeta), ligandos de direccionamiento y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el uno o más liposomas pueden tener una composición diferente de lípidos catiónicos, lípidos neutros, lípidos modificados con PEG y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el uno o más liposomas pueden tener una relación molar diferente de lípido catiónico, lípido neutro, colesterol y lípido modificado con PEG usado para crear el liposoma.

Al proceso de incorporación de un ARNm deseado en un liposoma se hace referencia a menudo como "carga". Métodos ejemplares se describen en Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992. Los ácidos nucleicos incorporados en liposomas pueden estar localizados completa o parcialmente en el espacio interior del liposoma, dentro de la membrana bicapa del liposoma o asociados con la superficie exterior de la membrana del liposoma, como se define en las reivindicaciones. A la incorporación de un ácido nucleico en liposomas también se hace referencia en la presente como "encapsulación", en donde el ácido nucleico está completamente contenido dentro del espacio interior del liposoma. El propósito de incorporar un ARNm en un vehículo de transferencia, como un liposoma, es a menudo para proteger el ácido nucleico de un entorno que puede contener enzimas o agentes químicos que degradan los ácidos nucleicos y/o sistemas o receptores que provocan la excreción rápida de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, un vehículo de administración adecuado es capaz de mejorar la estabilidad del ARNm contenido en el mismo y/o facilitar la administración de ARNm a la célula o tejido objetivo.

Tamaño de nanopartículas

Los liposomas adecuados de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse en varios tamaños. Como se usa en la presente, el término "tamaño", cuando se usa en conexión con una nanopartícula, significa el diámetro más grande de una nanopartícula. Como se define en las reivindicaciones, en algunas realizaciones, un liposoma adecuado tiene un tamaño de aproximadamente 100 nm o menos (por ejemplo, de aproximadamente 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm o 20 nm o menos). En algunas realizaciones, la nanopartícula tiene un tamaño de aproximadamente 60 nm o menos (por ejemplo, de aproximadamente 55 nm o menos, de aproximadamente 50 nm o menos, de aproximadamente 45 nm o menos, de aproximadamente 40 nm o menos, de aproximadamente 35 nm o menos, de aproximadamente 30 nm o menos, o de aproximadamente 25 nm o menos). En algunas realizaciones, una nanopartícula adecuada tiene un tamaño que varía de aproximadamente 10 - 100 nm (por ejemplo, que varía de aproximadamente 10 - 90 nm, 10 - 80 nm, 10 - 70 nm, 10 - 60 nm, 10 - 50 nm, 10-40 nm, o 10-30 nm).

Hay disponibles una variedad de métodos alternativos conocidos en la técnica para el dimensionamiento de una población de liposomas. Uno de tales métodos de dimensionamiento se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.737.323. La sonicación de una suspensión de liposomas mediante sonicación en baño o sonda produce una reducción progresiva de tamaño hasta un ULV pequeño de menos de aproximadamente 0,05 micras de diámetro. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, las MLV se hacen recircular a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan los tamaños de liposomas seleccionados, típicamente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micras. El tamaño de los liposomas puede determinarse mediante dispersión de luz cuasi eléctrica (QELS) como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-150 (1981). El diámetro medio de los liposomas puede reducirse mediante sonicación de los liposomas formados. Los ciclos de sonicación intermitentes pueden alternarse con la evaluación QELS para guiar la síntesis de liposomas eficaz.

Composiciones farmacéuticas y administración

Para facilitar la expresión de ARNm in vivo, pueden formularse vehículos de administración como liposomas en combinación con uno o más ácidos nucleicos, portadores, ligandos de direccionamiento o reactivos de estabilización adicionales, o en composiciones farmacológicas en las que se mezcla con excipientes adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pa., Última edición.

En particular, las composiciones proporcionadas que contienen el ARNm se administran en una articulación de un sujeto mediante administración intraarticular. Como se usa en la presente, los términos "inyección intraarticular", "administración intraarticular", "entrega intraarticular" o equivalentes gramaticales, se refieren a un procedimiento que provoca la administración directa o local en una articulación. Por ejemplo, las composiciones proporcionadas que contienen el ARNm pueden inyectarse en el espacio articular con el propósito de aliviar el dolor o la inflamación de la articulación.

Típicamente, las composiciones proporcionadas que contienen el ARNm se administran en una cantidad o dosis eficaz. Como se usa en la presente, la "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que, cuando se administra una vez o de acuerdo con un régimen de dosificación, es eficaz para lograr por lo menos cierta estabilización, mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores que se seleccionan como medidas apropiadas del progreso regresión o mejora de la enfermedad por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, una cantidad y un régimen de dosificación adecuados es uno que da como resultado la expresión o actividad de la proteína (por ejemplo, anticuerpos) en la articulación. En algunas realizaciones, la expresión y/o actividad de la proteína se detecta en el cartílago, ligamento, músculo, células de la íntima sinovial, condrocitos y/o fluidos de la articulación. En algunas realizaciones, la expresión y/o actividad de la proteína es detectable por lo menos aproximadamente 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, o más después de una administración individual.

La presente invención contempla administraciones individuales así como múltiples de una cantidad terapéuticamente eficaz de ARNm o una composición descrita en la presente de acuerdo con un régimen de dosificación. El ARNm o una composición descrita en la presente puede administrarse a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, gravedad y extensión de la afección del sujeto. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de ARNm o una composición descrita en la presente puede administrarse periódicamente a intervalos regulares (por ejemplo, una vez al año, una vez cada seis meses, una vez cada cinco meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada tres meses, bimensualmente (una vez cada dos meses), mensualmente (una vez cada mes), una vez cada tres semanas, bisemanalmente (una vez cada dos semanas), semanalmente, una vez cada tres días, una vez cada dos días, diariamente o continuamente). En algunas realizaciones, el ARNm o una composición descrita en la presente puede administrarse a intervalos variables.

EJEMPLOS

Aunque la presente invención se ha descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar la invención y no se pretende que limiten los mismos.

Ejemplo 1. Formulaciones de liposomas ejemplares para la administración y expresión de ARNm

Este ejemplo proporciona formulaciones de liposomas ejemplares para la administración y expresión eficaces de ARNm in vivo.

Materiales lipídicos

Las formulaciones descritas en la presente se basan en una mezcla de lípidos de múltiples componentes de proporciones variables que emplean uno o más lípidos catiónicos, lípidos auxiliares y lípidos PEGilados diseñados para encapsular varios materiales basados en ácidos nucleicos. Los lípidos catiónicos pueden incluir (pero no exclusivamente) DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. "La saturación de lípidos catiónicos influye en la administración intracelular de ácidos nucleicos encapsulados" J. Contr. Rel. 2005, 107, 276- 287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. "Diseño racional de lípidos catiónicos para la administración de ARNip" Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. "Materiales similares a lípidos para el silenciamiento génico in vivo en dosis bajas” PnAs 2010, 107, 1864-1869), cKK-E12 (3,6-bis(4-(bis(2-hidroxidodecil)amino)butil)piperazina-2,5-diona), HGT5000, HGT5001, HGT4003, ICE, a base de dialquilamino, a base de imidazol, a base de guanidinio, etc. Los lípidos auxiliares pueden incluir (pero no exclusivamente) DSPC (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-snglicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(I'-racglicerol)), colesterol, etc. Los lípidos PEGilados puede incluir (pero no exclusivamente) una cadena de poli(etilen) glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) de alquilo de longitud C6-C20. La polietilenimina puede ser lineal o ramificada. Para PEI ramificada se prefiere de 25 kDa pero no exclusivamente.

Material de ARN mensajero

Se sintetizó ARN mensajero de luciferasa de luciérnaga (FFL) optimizado con codón mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico que codifica el gen, que fue seguido por la adición de una estructura de tapa 5' (Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Reconocimiento de estructuras de tapa de ARNm por proteínas virales y celulares” J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) y una cola de poli(A) 3’ de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud como se determina por electroforesis en gel. Las regiones 5' y 3' no traducidas presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, y se definen como se indica (ver a continuación).

ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) optimizado con codón:

XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAA GACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGC CCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGA GUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAA UACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCC GUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACA ACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGU GAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAU ACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUG UACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGC CCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAG UACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUC AGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCC UCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUU GAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUU

GCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUU AGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACG AGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAA ACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGC GCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGG UGCC CUU CUUCGAGGCUAAGGU GGU GGACUU GGAC AC CGGU AAGAC ACU GGGU G UGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGU UAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGC GGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGA AGAGCCUGAUC AAAU AC AAGGGCU AC C A GGU AGCCC C A GC CGAACUGGAGAGC AU CCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGAC GAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGA CCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCU GC GC GGU GGU GUU GU GUU C GU GGAC GAGGUGC CU A A AGGACU GAC C GGCAAGUU GGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUC GCCGUGUAAY [SEQ ID NO.:l]

Secuencias UTR 5' y 3'

X (Secuencia UTR 5’) =

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG UGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG [SEQ ID NO.:2]

Y (Secuencia UTR 3’) =

CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCC

ACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU [SEQ

ID N0. 3]

O

GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCA

CUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU (SEQ

ID NO.: 4)

Protocolos de formulación ejemplares

A. cKK-E12

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de FFL a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución de ARNm acuosa y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1 x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8° C. Concentración final = 1,0 mg/ml de ARNm de FFL (encapsulado). Zave = 78 nm; PDI: 0,13.

B. C12-200

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de FFL a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución de ARNm acuosa y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1 x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8° C. Concentración final = 0,82 mg/ml de ARNm de FFL (encapsulado). Zave = 83 nm; PDI: 0,13.

C. HGT5001

Se mezclaron alícuotas de 50 mg/ml de soluciones etanólicas de HGT5001, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de FFL a partir de una solución madre de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución de ARNm acuosa y se agitó para producir una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1 x PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8° C. Concentración final = 1,0 mg/ml de ARNm de FFL (encapsulado). Zave = 80 nm; PDI: 0,13.

D. PEI

Se mezcló una solución de PEI ramificada de 25 kDa a una concentración de 1,34 mg/ml (pH 5,0) con volúmenes iguales de ARNm de FFL (1,0 mg/ml). La formulación resultante se almacenó a 2-8° C. Concentración final = 0,50 mg/ml de ARNm de FFL.

Ejemplo 2. Producción eficiente de proteínas in vivo

Este ejemplo demuestra que la administración de ARNm de FFL da como resultado una producción satisfactoria de proteínas in vivo.

Resultados de la producción de proteína de luciferasa luciérnaga in vivo

La producción de proteína luciferasa de luciérnaga a través de nanopartículas poliméricas y lipídicas cargadas de ARNm de FFL optimizadas con codón se probó en ratones CD-1 como una única inyección intraarticular en bolo. Las FIGS. 1A-4C representan la luminiscencia detectada a través de imagenología bioluminiscente in vivo usando un generador de imágenes IVIS. Dicha luminiscencia se midió 24 horas después de la inyección de nanopartículas de ARNm de FFL en ratones de tipo salvaje. La Tabla 1 representa los valores de luminiscencia después de la administración de luciferina (flujo total (fotones/seg), 10 minutos después de la luciferina). Los ratones se sacrificaron veinticuatro horas después de la inyección y se recogieron los órganos (como

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición, que comprende uno o más ARNm que codifican uno o más polipéptidos, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección articular, el método comprendiendo

la administración local de la composición en la cavidad sinovial de una articulación sinovial de un sujeto con necesidad de administración, de tal manera que la administración de la composición da como resultado la expresión del uno o más polipéptidos codificados por el uno o más ARNm en la articulación,

en donde el uno o más ARNm se encapsulan dentro de un liposoma, en donde el liposoma tiene un tamaño de aproximadamente 100 nm o menos y comprende un lípido catiónico, un lípido no catiónico, un lípido a base de colesterol y un lípido PEGilado a una relación molar del 30%-60% de lípido catiónico, 20%-35% de lípido no catiónico, 20%-30% de lípido a base de colesterol, y 1%-15% de lípido PEGilado.

2. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la expresión y/o actividad del uno o más polipéptidos es:

(a) detectada en cartílago, ligamento, músculo, células de la íntima sinovial, condrocitos y/o fluidos de la articulación; y/o

(b) detectable por lo menos aproximadamente 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana., 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas o 1 mes después de la administración.

3. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada uno de los uno o más ARNm tiene una longitud de o de más de aproximadamente 0,5 kb, 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb o 15 kb.

4. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uno o más polipéptidos codificados por el uno o más ARNm (a) funcionan normalmente en la articulación y/o (b) son antiinflamatorios.

5. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uno o más ARNm codifican un anticuerpo, opcionalmente en donde el anticuerpo es una inmunoglobulina intacta, (Fab)², (Fab')² , Fab, Fab' o scFv, opcionalmente en donde:

(a) el uno o más ARNm codifican la cadena pesada, cadena ligera o fragmento de la misma del anticuerpo; (b) la composición comprende dos ARNm distintos que codifican una cadena pesada del anticuerpo y una cadena ligera del anticuerpo, respectivamente; y/o

(c) el anticuerpo codificado por el uno o más ARNm es un anticuerpo anti-TNFa, anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo anti-IL-1 p, anticuerpo anti-sTNFR-I, anticuerpo anti-sTNFR-II, anticuerpo anti-IL-2, anticuerpo anti-IFN-Y, anticuerpo anti-IL-18, anticuerpo anti-IL-12 o anticuerpo anti-IL-12p40.

6. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uno o más ARNm codifican un receptor soluble.

7. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la enfermedad, trastorno o afección de las articulaciones es una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria, opcionalmente en donde la enfermedad, trastorno o afección inflamatoria:

(a) es artritis; y/o

(b) se selecciona del grupo que consiste de artritis reumatoide, artritis psoriásica, gota, pseudogota, tendinitis, bursitis, síndrome del túnel carpiano, osteoartritis, sinovitis, espondilitis, amiloidosis, estenosis espinal lumbar y/o disfunción de la articulación sacroilíaca.

8. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición se administra una vez a la semana, dos veces al mes, o una vez al mes.

9. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

(a) el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste de C12-200, MC3, DLinDMA, DLinkC2DMA, cKK-E12, ICE (a base de imidazol), HGT5000, HGT5001, DODAC, DDAB, DMRIE, DOSPA, DOGS, DODAP, DODMA y DMDMA, DODAC, DLenDMA, DMRIE, CLinDMA, CpLinDMA, DMOBA, DOcarbDAP, DLinDAP, DLincarbDAP, DLinCDAP, KLin-K-DMA, DLin-K-XTC2-DMA, HGT4003, y combinaciones de los mismos, opcionalmente en donde el uno o más lípidos catiónicos comprenden cKK-E12:

(b) el lípido no catiónico se selecciona de DSPC (1,2-diestearoil-sn-gl¡cero-3-fosfocol¡na), DPPC (1,2-dipalmitoilsn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPC (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfotidilcolina) DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)) y combinaciones de los mismos;

(c) el lípido a base de colesterol es colesterol o colesterol PEGilado; y/o

(d) el lípido PEGilado comprende una cadena de poli(etilen) glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena(s) de alquilo de C⁶-C²⁰ de longitud.

10. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el liposoma comprende:

(a) cKK-E12, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K, opcionalmente en una proporción de aproximadamente 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:30:25:5 o 40:32:25:3;

(b) C12-200, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K, opcionalmente en una proporción de aproximadamente 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:30:25:5 o 40:32:25:3; o

(c) HGT5001, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K, opcionalmente en una proporción de aproximadamente 50:25:20:5, 50:20:25:5, 50:27:20:3, 40:30:20:10, 40:30:25:5 o 40:32:25:3.

11. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el liposoma tiene un tamaño de aproximadamente 80 nm.

12. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el uno o más ARNm:

(a) comprenden uno o más nucleótidos modificados, opcionalmente en donde el uno o más nucleótidos modificados comprenden pseudouridina, N-1-metil-pseudouridina, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7- desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y/o 2-tiocitidina; o

(b) no están modificados.