KR101344303B1

KR101344303B1 - 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트

Info

Publication number: KR101344303B1
Application number: KR1020110102667A
Authority: KR
Inventors: 이양구
Original assignee: 동성제약주식회사
Priority date: 2011-10-07
Filing date: 2011-10-07
Publication date: 2013-12-24
Also published as: KR20130038042A; WO2013051778A1

Abstract

본 발명은 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트(conjugate)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 광 및 음향 과민제, 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제의 성질을 결합한 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트에 관한 것이다. 상기 콘쥬게이트는 광 및 음향 과민제, 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제, 표적 리간드 및 링커를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명인표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트 및 이의 응용은 광역학치료제에 보다 특이적으로 그리고 약리학적으로 관련이 있는 본 발명은 혈관형성과 타이로신 카이나제 억제제의 성질을 가지며, 암 및 다른 질환 치료를 위한 의약품을 제조에 사용될 수 있다.
특히 본 발명은 curcuminoids와 포르피린 conjugates에 기초한 약물, 암과 다른 질환 상태 치료를 위한 curcuminoids와 porphyrins conjugate에 기초한 화합물을 기반으로 한 화합물 제법과 관련이 있다. 발명은 또한 이 조성물에 기초한 치료법과 관련이 있고, 그것이 제안된 약물의 항암, 항혈관형성, 억제 효과를 제공할 수 있고, 수용액에서 우수한 용해성, 생체 이용률, 안정성, 암과 다른 질환 치료에서 독성의 결여라는 유리한 효과를 갖고 있다. 나아가 본 발명은 암 및 기타 질병 상태의 치료를 위한 구강, 비강 및 직장 투여용으로 사용될 수 있다.

Description

표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트{The Selective targeting of tumors for treatment conjugates}

본 발명은 광 및 음향 과민제, 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제의 성질을 결합한 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트(conjugate)에 관한 기술로서 상기 콘쥬게이트는 광 및 음향 과민제, 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제, 표적 리간드 및 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성되고 특성화된 콘쥬게이트이다.

암 화학요법은 지난 몇 십년 주요 의료 발전 중 하나였다. 전통적인 암 화학요법은 급속히 증식하는 암 세포가 세포 독성제제에 의해 살해 가능성이 더 높다는 전제에 의존한다. 그러나 현실적으로, 세포 독성제제는 거의 없거나 비특이적이며, 바람직하지 않은 부작용을 유발하는 전신 독성을 유발한다.

반면, 최근에 소개된 표적치료는 암 특이 분자와 신호 경로에 대해 직접적이며, 그래서 더 제한된 비특이적 독성을 가지고 있다.

종양 세포는 많은 수용체와 바이오마커를 과발현하며, 그것은 종양으로 세포 독성제제를 전달하기 위한 표적으로 사용될 수 있다. 일반적으로 종양 표적 약물 전달 시스템은 종양 인식 잔기, conjugate 형성을 위한 적절한 링커나 직접적으로 연결된 세포 독성 물질로 구성되어 있다. 'prodrug'로 간주될 수 있는 conjugate는 전신적으로 무독성이어야 한다. 이것은 링커가 체순환에서 안정해야한다는 것을 의미한다. 암 세포로 내면화되면 conjugate는 활성적 세포 독성제제를 재생하기 위해 쉽게 분해되어야 한다. 세포 독성제제를 함유하는 종양 표적 conjugates는 암 인식 잔기 종류에 따라 몇 그룹으로 나눌 수 있다.

종양 표적 약물 conjugates에는 종양 표적 잔기로 oligopeptides, 히알루론산, 엽산, 불포화 지방산, 단클론 항체, 타이로신 카이나제 억제제를 포함한다. 단백질 타이로신 카이나제는 세포 신호 전달 경로에서 중앙 스위칭 기전을 제공하는 효소이다. 따라서, 그들은 이러한 세포 증식, 신진 대사, 생존과 세포자멸과 같은 다양한 세포 과정에 관여하고 있다. 여러 단백질 타이로신의 카이나제는 암 세포의 활성화로 알려져있고, 종양 성장과 진행을 자극하고 있다.

타이로신 카이나제는 성장 인자 신호 조절에 중요한 역할을 하기 때문에 특히 중요 표적이 된다. 타이로신 카이나제 억제제(TKI)는 항암제제의 증가하는 분류를 대표한다. 타이로신 카이나제의 작은 분자 억제제는 여러 발암성 타이로신 카이나제의 촉매 도메인의 ATP 결합 사이트와 경쟁하게 된다. 그것은 바람직한 안전한 프로파일을 가지는 경구용 활성, 작은 입자이며, 화학요법이나 방사선 치료의 다른 형태와 쉽게 조합할 수 있다. 몇몇 타이로신 카이나제 억제제(TKIs)는 효과적인 항암 활성이 있는 것으로 확인되었고 임상 시험에 승인되고 있다. 이 억제제는 imatinib mesylate(STI571; Gleevec), gefitinib(Iressa), erlotinib(OSI-1774; Tarceva), lapatinib(GW-572016), canertinib(CI-1033), semaxinib(SU5416), vatalanib(PTK787/ZK222584), sorafenib (BAY 43-9006), sutent(SU11248), leflunomide(SU101)이다.

따라서 타이로신 카이나제 억제제는 특정 세포 신호 경로를 방해하는 표적치료의 중요한 새로운 분류이고, 선택된 악성 종양을 위한 표적 특이적 치료를 가능하게 한다. 이러한 표적 요법의 사용이 일반집단에서 종양 반응의 부족, 저항성 발달과 같은 제한점이 없는 것은 아니다. 새로운 억제제의 이용가능성과 향상된 환자 선택이 향후 이러한 문제를 해결에 도움이 될 것이다.

표적치료의 사용은 일반적 집단에서, 낮은 용해도에 의한 종양 반응성 부족 및 저항성 발달과 같은 제한점이 있다.

타이로신 카이나제 억제제의 사용이 작용하지 않는 경우도 있다. 이에 대한 가능한 이유는 신호 카이나제의 "병렬"시스템의 존재때문이다. 타이로신 카이나제 억제제는 in vivo에서 표피 성장 인자 수용체 EGFR와 HER2에 높은 억제 활성을 가진다. 그러나, in vitro에서 HER2-의존성 유방암에서 현저한 보호 효과를 가지지 않았다.

in vitro에서 HER2 카이나제 억제제 부분적 차단에 의해 세포질막에 HER3의 활성에 향상이 있고, 그 결과 새롭게 신호 전달과 세포 증식 지속 결과가 있음이 확인되었다. 아마도, 암 치료의 in vivo 효능이 HER3의 활성을 억제하는 물질과 HER2의 향상된 공동 차단제가 될 수 있다.

타이로신 카이나제 억제제 사용이 종양뿐만 아니라 정상 세포, 특히 심혈관계 세포를 표적화할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 현재까지 약 20,000 환자를 수용한 여러 연구에서 sunitinib는 심혈관계 합병증을 유발하였다(Oncourology 4, 2009). 이러한 문제는 새로운 억제제에 대한 검색을 유도한다.

식물 독소 기원에 관심이 모아졌고, 수년간 표적 암 치료에 사용되었다. 사용하는 주된 이유는 효능이 우수하기 때문이다. 세포질에 도입된 식물 독소의 단일 분자가 세포를 죽일 수 있음이 증명되었다. 따라서, 선택적 직접적 식물 독소는 강력한 항암 치료법이 되는 이유가 된다.

타이로신 카이나제의 억제제로 플라보노이드 분류(curcumin baikalein, bosvelievye acid, apigenin, 등)의 종류로부터 천연 물질이 사용될 수 있다. 가장 관심의 대상은 curcumin이다.

미국 특허 No5861415는 curcuminoids 를 포함하는 bioprotectant 조성물, 그것을 얻기 위한 추출법과 사용법을 설명한다. Curcuminoids는 항산화, 항염증, 항균, 항곰팡이, 기생충, 항돌연변이, 항암, 해독 성질을 가지는 것으로 알려졌다. 미국 특허 No5891924는 curcumin을 사용하여 NF kappa B 전사 인자의 활성화를 억제하는 방법을 설명한다. 미국 특허 No6653327은 UVB 광선에 대한 보호와 피부 lightening을 위한 tumeric 유래tetrahydrocurcumin(THC)의 교차 regulin 조성물을 설명한다. 미국 특허 No6887898은 베타-아밀로이드 단백질 유도 질환 치료에서 효과적인 turmeric 추출물을 설명한다.

특허 6,841,177은 강황 longa추출물의 약리학적 활성이다(하기 그림 1 참조). curcumin[1,7 bis (4 hydroxy 3 methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3, 5-dione]은 강황뿌리에서 만들어진다.

그림 1. curcumin[1,7 bis (4 hydroxy 3 methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3, 5-dione]

강황의 맛을 내는 노란색 천연 색소인 curcumin은 콜레스테롤 감소, 심혈관계 향상, 진행성 알츠하이머병 위험과 암에 대한 잠재적 보호 기능 향상능력이 증명되면서 최근 과학자들의 관심이 되었다. 다양한 질병에 대한 광범위한 의약 효과가 있고, 현재 임상 시험중이다. 인체내에서, curcumin은 항산화 역할로, 프리라디칼 형성을 줄인다. curcumin의 항암력은 neuroglia 세포 증식을 억제하는 기능에 기초한다. curcumin은 lipoxygenase와 cyclooxygenase-2 발현의 특정 억제제이다. curcumin은 시토크롬 P-450의 효소활성 억제와 글루타티온-S-transferase 증가에 의해 발암 개시를 억제한다. 본질적으로, 암이 성장하고 다른 장기로 확산되기 전에 암 세포를 억제하고 멈추게 한다.

종양에 대한 실험에서, curcumin은 새로운 종양 성장에 직접적이고 비가역적 영향이 증명되었다. 경구로 투여될 수 있기 때문에 curcumin은 장래성 있는 성분이며, 부작용이 없다. curcuminoids의 경구투여나 섭취에 대한 수많은 효과가 대조군 연구, 집단 연구, 사례 보고를 바탕으로 보고되었다. 경구로 투여된 curcumin 활성 결과가 암 예방에 관한, 국립 암 연구소가 후원하는 임상 시험에 기반이 되고 있다(Kelloff et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 26:1-28 (1996)). 피부와 결장 발암물질이 처리된 마우스에 curcumin 경구 투여는 대조군 마우스와 비교하여 유도된 종양의 크기와 발병률을 감소시켰다(Huang, et al., Cancer Res. 54:5841-5847 (1994); Huang et al., Carcinogenesis 16:2493-2497 (1995); Huang et al., Cancer Lett. 64:117-121; Rao et al., Cancer Res. 55:259-266 (1995); Conney et al., Adv Enzyme Regul. 31:385-396 (1991)).

curcumin은 항산화 활동 외에, 방사선 유도된 단백질 카이나제C 활성을 억제하는 것으로 알려졌다[Varadkar, et al., (2001) J. Radiol. Prot. 21: 361-370]. 단백질 카이나제 C는 ceramide 경로를 억제하여 차례로 세포자멸을 억제한다. curcumin은 잠재적으로 이 경로를 방해할 수 있고(Varadkar et al, supra) 조직 감작을 유발할 수도 있다. curcumin에 대한 연구 대부분은 항암 활성에 관여된다[Inano and Onoda, 2002, supra; Ramachandran and You, 1999, supra; Araujo, et al., (1999) Teratogen., Carcinogen., and Mutagen. 19:9-18]. 방사선 유발된 피부 또는 경구 점막 병변 치료에 대한 curcumin 적용에 대한 보고는 없다. 그러나, 조사하기 전2주 동안 curcumin투여는 성공적으로, 조사 생쥐의 간 및 비장의 glyoxalase 활성 측정에 의한 평가된 방사선 반응을 변화시켰다[Choudlary, et al., (1999) J, Ethnopharmacol. 64: 1-7] 그리고, 빛 조사에 의해 유발된 산화된 아미노산과 단백질에 대한 산화, 환원성 손상 수복에 효과적인 것으로 보여지고 있다[Kapoor S., and Priyadarsini K. I. (2001) Biophysical Chem. 92: 119-126].

세 개의 curcuminoid 화합물 curcumin, demethoxycurcumin 및 bisdemethoxycurcumin의 경구 투여가 7,12-dimethylbenzanthracene(DMBA)로 개시된 마우스 피부의 증진과 phorbol ester에 의해 자극된 ornithine decarboxylase의 유도를 억제한다(Huang, et al.). 이 화합물은 또한 JB6 세포의 phorbol ester 매개 변형을 억제하였다. Tetrahydrocurcumin의 포화 유도체는 이 실험에서 불포화 유사체보다 활성이 적었다[Huang et al., Carcinogenesis 16:2493-2497 (1995)]. curcumin의 chemopreventive 활성 기전은 항산화제로 인정되며, Ames Salmonella test 에서 항돌연변이 활성을 나타내고, 녹차에서 발견되는 chemopreventive인 폴리페놀의 것과 유사한 생화학적 효과를 내는 것으로 알려졌음에도, 이전에는 알려지지 않았다[Stoner, J. Cell. Biochem. Suppl. 22:169-180(1995)]. curcumin은 단백질 카이나제, 전사 인자 NF kappa.B, phospholipase A2 생활성, 아라키돈산 대사, 항산화 활성, 표피 성장 인자(EGF)수용체 자가인산화를 포함한 여러 신호 전달 경로를 억제하는 것으로 증명되었다[Lu et al., Carcinogenesis 15:2363-2370 (1994); Singh et al., J. Biol. Chem. 270:24995-25000 (1995); Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5292-5296 (1991); Korutla et al., Carcinogenesis 16:1741-1745 (1995); Rao et al., Carcinogenesis 14:2219-2225 (1993)].

규제 요인이나 혈관형성, 조직간 특이 병소, 혈관형성을 조절하는 요소의 복잡성 때문에, 환경에 따라, 특정 제제의 반응은 in vitro와 in vivo간, 병리적 또는 생리학적 조건하에서 다르거나 정반대일 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허No. 5,401,504 Das et al은 인간을 포함하는 동물에 강황의 경구 또는 국소 투여가 상처 치유를 촉진하며, 이 가설이 실험적으로 확인되지 않았지만 혈관형성 자극을 통해 부분적으로 활동한다는 가정을 공개하였다. curcumin투여는 in vitro에서 평활근 세포의 증식을 억제하는 것으로 보고되었다[Huang et al., European J. Pharmac. 221:381-384 (1992)]. Aggarwal에 미국 특허No. 5,891,924는 동물에 curcumin 경구 투여는 전사 인자 NF kappa B의 활성을 억제하고, 면역계와 관련된 특이 조건, 병리생리학적 상태에 사용 주장을 공개하였다. 병리생리적 상태, 체계와 관련된 구체적인 조건에서 사용을 주장하고 있다. curcumin의 여러 생화학적 활성은 상세히 연구되었으나, 어떤 단일 활성도 curcumin의 이러한 효과에 대한 역할을 보고하지 않았다. Singh et al. in Cancer Lett. 107:109-115 (1996)은 curcumin은 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 in vitro 증식을 억제하고 항 혈관형성 활성을 가질 수도 있음을 보고하였다. 그러나, 이 억제는 내피 세포 증식의 기본 fibroblast 성장 인자 자극에 비의존적이었고, in vivo 연구는 보고되지 않았다. 모세관 형성 모델에서, Matrigel에서 HUVEC의 성장과 관 구조 형성에 curcumin에 의한 억제는 HUVEC의 metalloproteinases 조절로 간주되고 있다[Thaloor et al., Cell Growth Differ. 9:305-312 (1998)].

curcumin 관련 제품의 주요 단점은 물에 거의 불용성이라는 점이다. curcumin은 다양한 암 세포주에 높은 세포 독성을 가지고 같이 있지만 물 불용성 및 불안정성이 생체 이용률을 매우 낮게 하여, in vivo 항암 시험에서 대개 비활성을 나타낸다. 때로는 curcumin의 그램 수준이 임상 반응 유도에 필요하다. 그러나, 약리 반응 유도에 필요한 높은 용량은 이전 연구에서 독성의 높은 수준 결과로 나타나고 있다. 표적화된 화학요법외에도, 종양에 대한 효과적인 치료는 광역학치료이다. 광역학 치료법(PDT)은 1998년 특정 암유형에 대해 FDA에 의해 처음 승인되었다.

악성 종양은 현대 사회에서 사망의 주요 원인이다. 광역학 치료 (PDT)는 100 년 이상 종양을 치료에 사용되고 있다. 적절한 과민제로, 높은 효율, 높은 선택성, 낮은 부작용이 있으며, 광범위한 임상 적용의 좋은 전망을 가진다(see Li Jian et al., Chinese Journal of Biomedical Engineering. 2005, 24:237-239; Thomas J., et al, Journal of the National Cancer Institute, 1998, 90: 889-905; Ionel Rosenthal et al, Ultrasonics Sonochemistry, 2004, 11: 349-336).

PDT는 두 단계로 수행된다: 처음 환자에게 경구로 광과민제를 투여하여 주사하고, 다음 "단일체 산소 '생성을 위해 적절한 파장의 빛을 환자에 노출하여 광과민제를 활성화시키고, 그것에 의해 비정상적인 세포와 미생물을 사멸시킨다(see Moan J. et al, Photochem. Photobiol. 1991;53: 549-553).

투여된 광과민제가 특히 암세포와 같은 비정상적인 세포에 집중되어 있기 때문에, 치료는 정상 세포에 피해를 최소화하는 세포 파괴에 효과적이다[see Thomas J., et al, Journal of the National Cancer Institute, 1998, 90: 889-905; Musser D. A. et al, Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 1980; 28:505-525).

84-100%의 효능을 가지며, 초기 단계와 표재성 종양 치료에 특히 효과적이다[Hopper C. et al. Int. J Cancer. 2004, 111(1):138-146; Kato H. et al. Lung Cancer. 2003, 42:103-111; Mang T. S. et al. Cancer J Sci. Am.; 1998, 4:378-84].

그러나 PDT는 3가지 주요 단점을 가진다. 첫째, 사용되는 적색 빛으로 인해, 10mm까지 깊이로만 인체에 침투하고, 표재성 또는 국소 영역에서 발생하는 종양 치료에만 사용된다(see Thomas J., et al, Journal of the National Cancer Institute, 1998, 90: 889-905). 둘째, 현재 사용 가능한 광과민제는 정상 세포에서 낮은 속도로 대사되기 때문에, 치료 후 환자는 감광성 피부염 방지를 위해, 30 일 동안 빛으로부터 차단되어야한다(see Li Jian, Chinese Journal of Biomedical Engineering, 2005,24:237-239). 셋째, PDT는 체내 또는 종양에 광학 섬유를 넣는 중재적 절차가 필요하므로 환자의 고통과 위험을 증가시킨다(see Kato H. et al, Lung Cancer. 2003, 42(1):103-111).

음향역학 치료(SDT)는 PDT의 대안적, 보완적 요법으로 개발되고 있다. 그것은 초음파와 소리에 민감한 제제로 암을 치료한다(see Joe Z., et al., Ultrasonics Sonochemistry, 2004, 11: 349-336). 기전은 초음파가 단일체 산소를 생성하기 위해 체내 음향과민제를 활성화시키고, 종양 세포와 같은 비정상적인 세포를 사멸시킨다(see Kuroki M. et al,. 2007, Anticancer Res. 27:3673-3677). SDT는 화학요법이나 광역합요법과 병용하면 시너지 효과가 관찰될 수 있다 (see Jin Z H et al, J Dermatol, 2000, 27: 294-306; Ionel Rosenthal et al., Ultrasonics Sonochemistry, 2004, 11: 349-336).

현재, 많은 자료들이 SDT가 암 환자에 대해 전망있는 새로운 치료법임을 제안한다. 종양의 파괴는 항암약물 영향의 결과로 발생한다. 그리고 0.5-0.3 MHz 주파수와 0.5-5.0 V/see 의 강도에서 약물을 이미 포함하는 종양에서 노출된 이후에만 활성을 나타낸다.

인체는 초음파에 매우 민감하다. 이것은 SDT가 심부의 종양 치료에 특히 관련있게 한다. 두 가지 방법의 조합이 보다 효과적 치료를 만든다. 종양-국소화 포르피린 화합물은 SDT에 대한 현대적인 접근에 사용된 최초의 화합물 중 일부이다. 치료 화합물과 달리, 포르피린은 초음파가 없으면 세포 독성이 나타나지 않는다. 이러한 화합물 SDT와 유사한 몇 가지 방법으로 치료법에 처음 적용되었다; 광역학치료(“PDT”). PDT는 빛에 민감한 화합물의 세포 독성 활동을 활성화하는 적색 파장을 사용한다.

종양 치료에 PDT의 적용은 적색 파장에 의해 제한되고 제한된 조직 투여만 가능하게 한다. 심험결과 PDT는 표면에서 5-7mm에 표재성 종양만 치료할 수 있다. 심부 종양은 간질성 조사로 치료될 수도 있다.

SDT는 PDT의 단점을 극복한다. 보다 깊은 조직 치료가 가능하여, 조직 수 cm 를 통해 초음파의 특성이 쉽게 이동하도록 하기 때문에. 초음파의 온도 효과를 사용하는 다른 치료나 HIFU치료와 같이, 집중된 초음파가 특정 영역의 표적화를 위해 SDT에 사용되고, 활성화된 음향과민제로부터 비질환성 조직 주변을 보호한다. 표적 접근 방식은 고형암 치료에 작용하지만, 백혈병과 같이 혈액기원과 체내 이동성 전이의 치료에는 적합하지 않다.

포르피린 화합물은 빛과 음향에 민감한 제제로 알려져 있다. 그것은 종양 세포와 같은 비정상적인 세포에 선택적으로 부착한다(see Yao J Z et al., Chin J Pharmaceuticals 2000; 31: 2157; Liu H L et al., Chin J Laser Med Surg 2002; 11: 889; Umemura K et al., Cancer Lett., 1996, 102: 151-157; Yumita N et al., Cancer Science, 2008, 99: 166-172).

다른 광과민제 유사물과 같이 음향과민제는 표적 종양 세포에 설계될 수 있다. 미국 특허 No. 6627664("밀러")는 국소성 SDT에 사용하기 위한 종양 결합 펩티드와 conjugate된 perylenequinone 색소 유도체의 사용을 공개하였다. perylenequinone 유도체의 치료량이 투여되고, 몸 전체에 분포하도록 하였다. 음향과민제는 높은 증식 세포를 포함하는 대상 영역에 초음파 적용에 의해 활성화된다. 세포 표적 음향과민제가 SDT에서 사용되고 있으나, 이러한 치료법은 표적 초음파와 함께 사용하도록 제한되었다. 이 표적 접근 방식은 혈액암과 몸을 통해 이동하는 전이와 같은 확산 암의 치료에는 적합하지 않다.

용해도 및 효율을 높이는 약물로 구성된 conjugates의 생성으로 curcumin뿐만 아니라 PDT의 한계 및 타이로신 카이나제 억제제의 결함을 극복하였다. 특허 WO/2010/033580) 및 미국 특허 출원 20,040,009,914은 종양 성장과 혈관생성 억제로써 세포독성 화합물-단백질로 factor VIIa과 curcumin의 conjugates를 공개하였다. Mukesh K Pandey et al은 폴리에틸렌 글리콜로 curcumin의 conjugates를 공개하였다(Eur J Pharm Sci. 2011 May 24). 화학 효소법이 향상된 용해도와 생체 이용률을 가진 수용성 약물 후보로 PEGylated curcumins를 만들기 위해 설계되고 개발되고 있다. 이 경우, curcumin은 ethyl α-bromoacetate 과 potassium carbonate 를 사용하여 diester 1로 변환되었다. 후속 단계에서 diester 1은 용매가 없는 조건하에 Candida antarctica lipase[CAL-B, Novozym 435]을 사용하여 폴리 (에틸렌 글리콜)과 copolymerized했다[K.S. Parvathya, c, P.S. Negib, c and P. Srinivasa Food ChemistryVolume 120, Issue 2, 15 May 2010, Pages 523-530].

curcumin의 여러 아미노산 conjugates가 높은 수율(45-76%) 로 합성되었고 보고되었다. 이러한 curcumin 유도체는 110mg/ml 농도에서 물에 용해되었다. 알라닌, 발린, 세린과 시스테인과 같은 알킬-치환 아미노산과 curcumin 유도체는 항산화 실험에서 curcumin보다 적은 IC50 값 (~50 %)을 나타내었다. Salmonella typhimurium TA 98과 TA 1531에 대한 항돌연변이와 관련하여, 몇 가지의 경우에서 curcumin과 유사하게, 보다 더 강한 효과를 보여주었다. 이러한 결과는 아미노산과 페놀 위치에서 curcumin의 conjugation가 수용성을 만드는 반면, in vitro 생물학적 속성의 몇 가지 개선, 특정 알킬 아미노산의 경우 더 우수한 효과를 유도하였다. Shiv K. Dubeya가 발린, 글루탐산, curcumin с의 conjugates 합성을 공개하였고, demethylenated piperic 산성이 용액의 위상 방법으로 제조되었다. 항균 및 항암(항증식) 활성의 평가에서 curcumin diester의 용해도 증가, 느린 신진 대사, 향상된 세포 섭식으로 인해 curcumin 자체보다 상대적으로 높은 활성이 제안되었다. 또한, curcumin monoesters가 해당 diesters보다 더 나은 항균 활성이 있다고 하였다. methylenedioxy 고리가 열려진 demethylenated piperic 산과 curcumin의 conjugates는 이송이나 결합 과정에서 free phenolics의 역할을 강조와 해당 piperic 산 conjugate보다 향상된 활성을 보여주었다. 히알루론산과 curcumin의 conjugates 는 미국 특허 20090170195 curcumin - hyaluronan 화합물을 보여준다. 분리할 수 있는 화합물은 적어도 curcumin 한 분자, 히알루론산 한 분자, 링커 분자를 포함한다. 거기에 링커 분자의 첫 번째 분자는 curcumin과 결합되어 있고, 링커 분자의 두 번째 부분은 히알루론산과 결합되어 있다.

발명은 수용성, 생체 이용가능한 curcumin- 변경 화합물과 방법과 관련이 있다. 특히, 발명은 항암, 항산화 및 항염증 적용, 암, 류마티스 관절염 세포 또는 다른 질병 조직이나 세포의 치료, 기타 적용에 사용할 수 있는 수용성, 생체 이용성 화합물 형성을 위한 생체 고분자와 함께 curcumin 변경에 관련되어 있다.

이하 과민제에 대해서 서술한다. 포르피린 같은 광과민제는 가시 광선 파장 범위에서 활성화 후 활성 산소종을 생성하는 분자이며, 암의 광역학치료와 기타 임상 조건에서 널리 사용된다. 정상 세포가 포르피린을 축적시킬 수 있고 몸에서 천천히 제거되기 때문에, 장시간 피부 광과민화는 정상 세포와 조직의 파괴로 이어지는 문제가 있을 수 있다.

환자에 사용되는 활성 포르피린 양을 줄일 필요가 있다. 인슐린, konkonavalin, 엽산과 같은 특정 리간드를 포함하는 conjugates의 상당히 높은 광민감화 활성이 광과민제 chlorin e6에 있으며, 따라서 수용체 발현 세포를 내재화할 수 있는 것으로 나타났다. 세포 섭취는 수용체 의존적이며, 광과민성은 잉여 unconjugated 리간드의 incubation 결과로 발생할 수 있다. 이 방법은 특정 수용체를 발현하는 세포에만 고려되기 때문에, 광과민 세포의 종류에 사용가능한 선택성이 된다(Link United States Patent 7417023 Pharmaceuticals 2010, 3, 1507-1529).

국소화된 포르피린 활성화로 생성되는, 활성 산소종의 80%를 구성하는 단일체 산소에 의해, 생성된 영역의 0.1 μm미만에서 유도되는 손상으로 광과민제의 효과가 세포 축적 장소에 완전히 의존된다. chlorin e6, hematoporphyrin 유도체와 같은 대부분 포르피린이 주로 세포막에 국소화화된다는 사실에도 불구하고, 그것은 세포 내부, 특히 core부분이 광과민 손상에 가장 민감한 것으로 알려져있다. 인슐린 함유 conjugates를 사용하는 경우, 그것은 광과민제 중심부에 핵 지방화 신호(NLS), 큰 종양 항원(T - AG) 1, OV-40, 바이러스를 공포화하는 변종과 연계되어 있다. 그 결과 NLS가 2,000배 이상 EC50을 더 최소화하면서 chlorin e6의 광과민효과를 증가시킴이 증명되었고, kernel은 광과민활성에 가장 민감한 부위이다. 세포 종류에 따라 효과적인 광역학치료 달성에 이 연구가 중요하였다.

종양 대상의 약물 전달 시스템은 직접 또는 conjugate 링커를 통해 연결되어, 종양 요소 및 세포 독성을 인식하도록 구성되어 있다. 활성 약물로 몸에서 변환되는, 약물의 전구체로 간주되는 conjugate는 전신 비독성이 되어야 한다. 이것은 링커가 순환하는 동안 안정해야한다는 것을 의미하고, 암세포의 내면화 후 conjugate가 활성화된 세포 독성제제의 생성을 위해 신속하게 분할되어야 한다. 표적 화학요법과 광역학치료에 사용되는 conjugates는 표적 요소(리간드)로 단클론 항체, 불포화 지방산, 히알루론산, oligopeptides, 타이로신 카이나제 억제제를 포함한다. 효과적인 약물 캐리어 제조없이 특허에 연계된 엽산은 사용이 증가하고 있고, 그것은 종양 세포의 엽산 수용체에 높은 민감도를 가지고 있다. 캐리어로 효율적인 의약품 생성을 위한 이유로 엽산이 사용되고, 종양 세포의 엽산 수용체에 높은 감도를 가진다.

지난 25년이상 동안, 엽산 수용체(FR)는 치료 목적으로 사용될 수 있는 잠재력을 지닌 종양의 매력적 biomarker로서 등장했다(Vitam Horm. 2008;79:203-33). 많은 증거들에서 endocytosing 단백질이 천연 folates, 특정 antifolates, 엽산-약물 conjugates 의 저류와 세포내 섭취를 기능적으로 중재할 수 있음을 제시한다; 후자의 두 가지 결과는 다음과 같은(그러나 이에 국한되지 않음) 종양 표적 세포 독성을 포함하는 생물학적 조절을 낳을 수 있다(Zhao X , Li H , Lee RJ . 2008 Mar;5(3):309-19. 엽산 수용체를 통해 약물 전달을 목표, Zhao X, Li H, Lee RJ). 조직 발현 프로필이 folates의 전신 저류(예: 신장과 태반), 또는 특정 병리적 조직 (예, 종양 또는 활성화된 대식세포)로 다소 국한되기 때문에, FR은 질병 관리를 위한 유용한 생물학적 대상으로 생각된다. 실제로, 최근 몇 년간은 새로운 FR 표적치료에 대한 보고가 많았고, 상당수는 비표적성 약물 요법을 동반하는 바람직하지 않은 독성없이 in vivo 강도, 특히 종양 이종이식에 대해 증명되고 있다.

충분한 선택성이 약물에 통합할 수 없다면, 표적치료와 같은 강력한 독소의 사용이 제한되면, 특이적 세포사의 효과를 감소시킨다. 따라서, 종양세포에 대해 선택적으로 상향 조절된 세포 표면 수용체에 대한 높은 친화력이 이 접근법에 필요하다. 이러한 표적 리간드중 하나는 엽산이고 그 수용체(FR) 1(10-10m)에 대한 높은 친화력을 보여준다. FR은 다양한 암 범위에, 90 %에서 상향 조절을 보여주는 특정 상피 난소암에서, 과발현한다. unconjugated 상태 엽산은 비면역원성이고, 크기도 작고(441.4 Da), 다양한 단백질과 결합시 FR에 대한 친화력을 유지한다. 또한, in vitro에서 종양 세포 세포질에 단백질의 선택적 제공을 위한 유용한 표적 요소로 사용될 수 있음을 보여준다. 광역학치료 연구의 현재 목표 중 하나는 정상 세포의 손상으로 인한 원치 않는 부작용의 확장과 위험성을 최소화하기 위해, 종양 세포의 선택적 표적을 강화하는 것이다(2011 Apr;1808(4):1063-71). 미국 특허20,100,075,899는 정상조직에 보유하는 동안 표적화된 암세포를 파괴하고 선택적으로 감지하는 수용제 표적성, 수용성, 약리적으로 조절된 광역학치료 (PDT)제를 설명한다. 이것은 정상적인 장기 섭취(예, 간, 비장)를 최소화하고 수용체 발현에서 종양간 차이에 의해 달성된다.

발명은 친수성 기질을 구성하는 conjugate, 형광단으로 구성된 광과민제, 표적 리간드로 되어 있다. 발명은 인공 방사선 조사의 효과적인 양으로 병에 걸린 조직을 노출하고 또한 본 발명의 conjugates로 질병 조직과 접촉하는 단계로 구성된 질병 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 실시예는, 암이다.

그러나, curcumin과 표적종양의 치료는 낮은 용해도 및 치료 기간 때문에 한계가 있다. 또한, 일부 종양은 필요한 수용체를 약하게 발현한다.표적 광-음향 치료법은 제한점을 가진다. 전이, 큰 종양에 사용가능한 음향-광과민제, 타이로신 카이나제 억제제 및 항혈관형성 특성이 있는 약물의 생성을 필요로 한다. 따라서, 표적 억제제만의, 표적 PDT만의, 또는 SDT만의 독립적 적용이 항상 유효하지 않다. 더 효과적인 것은 화학요법과 광-음향 역학요법의 조합이다.

본 발명에서는 상기 서술한 결점을 제거하고, 종양에 높은 선택성을 가진 광-음향 광과민제와 타이로신 카이나제 억제제, 항혈관형성의 성질을 가진 새로운 항종양 약물을 생성하도록 하였고, 이것이 다음과 같은 문제를 해결할 수 있다.

1. 벡터에 conjugate의 전달은 선택도를 증가시키고 더 낮은 용량에서 약물의 효과를 향상시킬 것이다.

2. 타이로신 카이나제 억제제와 항혈관형성, 종양의 괴사를 일으킬 수 있는 속성을 가진 과민제의 조합이, 화학요법과 PDT 에 저항성을 가지는 다른 성향의 종양 치료 문제를 해결할 것이다.

3. 깊이 노출의 문제 해결을 위한 초음파 사용은 레이저 치료에서 고유의 부작용을 피하는데 도움이 된다.

4. PDT와 SDT의 병용은 항암 치료를 향상시킨다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명에서는 광 및 음향 과민제, 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제의 성질을 결합한 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트(conjugate)를 제공한다.

상기 콘쥬게이트는 광 및 음향 과민제, 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제, 표적 리간드 및 링커를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 광 및 음향 과민제는 pyropheophorbide, chlorin, bacteriochlorin, 포르피린 이성질체, 및 확장 포르피린으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 자유염기 또는 금속복합체인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 확장 포리피린은 purpurin, chlorin е6 및 chlorin p6로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제는 curcuminoids군으로부터 선택된 것임을 특징으로 할 수 있다.

상기 curcuminoids군은 curcumin, demethoxycurcumin 및 bisdemethoxycurcumin으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 표적 리간드는 세표 표면 수용체에 대한 리간드인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 세포 표면 수용체는 엽산, Her-2/neu, integrin, EGFR, metastin, ErbB, c-Kit, c-Met, CXR4, CCR7, endothelin-A, PPAR-delta, PDGFR A, BAG-1, TGF beta 수용체 및 엽산수용체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 링커는 dipeptide, L-alanine, phenylalanine, glycine, tryptophan, tripeptide, glutaric acid 및 diaminohexane로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 구성된 것임을 특징으로 할 수 있다.

상기 dipeptide는 ala-ala 또는 gly-gly인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 tripeptide는 gly-gly-gly 이나 ala-gly-phe인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 콘쥬게이트는 하기 화학식(1)과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

.....화학식(1)

상기 콘쥬게이트는 하기 화학식(2)과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

.....화학식(2)

상기 콘쥬게이트는 하기 화학식(3)과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

.....화학식(3)

상기 콘쥬게이트는 하기 화학식(4)과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

.....화학식(4)

상기 콘쥬게이트는 하기 화학식(5)과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

.....화학식(5)

상기 콘쥬게이트는 하기 화학식(6)과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

.....화학식(6)

상기 콘쥬게이트는 하기 화학식(7)과 같은 구조를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

.....화학식(7)

나아가 본 발명의 구성에 대해 더 설명한다.

본 발명의 다른 일면은 암세포 성장 억제법은 광 및 음향과민제, 혈관형성 억제제, 타이로신 카이나제 억제제의 성질을 결합한, 표적 치료에 관한 종양에 높은 선택성이 있는 합성되고 특성화된 conjugates를 가진 암세포에 접촉, 광역학치료의 적용으로 구성된다.

이는 광역학치료에 대한 조사가 레이저 광선, 인공 자외선, 근적외선, 적외선, 감마 방사선, X 선, 가시광선으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 나아가 빛 조사가 레이저 광선일 수 있다. 또한 광역학치료가 과민제의 최대 흡수보다 약 20nm미만에서 약 20nm이상의 범위 파장으로 적용될 수 있다. 한편 상기 인위적 조사가 약 10에서 150 mW/cm²의 비율로 적용될 수 있으며, 인위적 조사가 음파인 것을 특징으로 할 수 있고, 음파가 초음파로 선택될 수도 있다. 초음파가 본질적으로 병렬파, 산란파, 연속파나 비연속파일 수 있을 것이다.

음향역학 치료가 도포적으로 환자 몸에 상기 기재한 음파 적용으로 구성될 수 있다. 음향역학 치료법이 환자 몸에 전신적으로 음파 적용으로 구성될 수 있으며, 음파는 액체를 통해 환자에 적용될 수 있다. 초음파는0.1-10 MHz 범위 주파수를 가질 수 있으며, 초음파는0.1-3.0W/cm²J/cm² 범위 출력밀도를 가질 수 있다. 또한 초음파는10 J/cm²이상, 바람직하게는 60-300 J/cm²,에너지 밀도를 가질 수 있다.

상기 conjugate를 가진 암세포에 접촉과 효과적인 양의 레이저와 초음파의 암세포 노출로 구성되는 암세포 성장 억제법 또한 본 발명의 다른 일면으로 본 발명에서는 conjugate를 가진 암세포에 접촉과 효과적인 양의 가시광선에 암세포 노출로 구성되는 암세포 성장 억제법 또한 제공한다.1~5일 동안 본 발명의 conjugate를 가진 암세포에 접촉하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이는 초음파와 레이저의 적용으로 구성될 수 있다.

또한 환자에 conjugate의 유도 이후 1~72시간 후, 바람직하게는 6~48시간, 더 바람직하게는 12~36시간, 가장 바람직하게는 18~24시간, 환자 몸에 음파 적용으로 구성되는 비정상세포, 바이러스, 미생물의 치료법도 본 발명의 다른 일면이다. 또한 환자에 conjugate 유도 이후, 1~72시간 후, 바람직하게는 6~48시간, 더 바람직하게는 12~36시간, 가장 바람직하게는 18~24시간, 1시간 간격이 있는 음파가 환자 몸에 음파 적용되는 것으로 구성되는 비정상세포, 바이러스, 미생물의 치료법도 본 발명의 다른 일면이다.

한편 본 발명의 conjugate의 효과적인 용량에서 병리적 조건을 가지는 개체에 conjugate의 유도와 항혈관효과의 동물이나 사람에서 병리적 조건을 조절하는 방법, 구성물이 항혈관형성과 표적세포의 증식 감소가 혈관형성을 감소시키는 방법 또한 본 발명의 일면이며, conjugate의 병리적 조건을 가지는 개체에 유도되는 단계와 타이로신 카이나제 억제의 효과(세포자멸, caspase유도)를 가지는 것으로 구성되는 동물이나 사람에서 병리적 조건을 조절할 수도 있다.

1~5일 동안 효과적인 용량으로 본 명의 conjugate를 가진 암세포에 접촉과 청구항 40, 45에 따른 초음파와 레이저의 적용으로 구성되는 암세포 성장 억제법 또한 본 발명의 또 다른 일면으로 conjugate가 약 0.5~100 mg/kg 의 용량으로 투여될 수 있고, 상기 투여는 약 500~2000mg 내의 일일 용량에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 전형적으로 매일 경구로 투여되는 제제의 양은 체중 kg 당 0.01g정도로 적을 수 있으나, 체중 kg 당 0.1g~20g, 즉 0.25~10g/kg이나 0.5~5g/kg이 바람직할 수 있다.

본 발명인 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트 및 이의 응용은 광역학치료제에 보다 특이적으로 그리고 약리학적으로 관련이 있는 혈관형성과 타이로신 카이나제 억제제의 성질을 가지며, 암 및 다른 질환 치료를 위한 의약품을 제조에 사용될 수 있다.

특히 본 발명은 curcuminoids와 포르피린 conjugates에 기초한 약물, 암과 다른 질환 상태 치료를 위한 curcuminoids와 porphyrins conjugate에 기초한 화합물을 기반으로 한 화합물 제법과 관련이 있다. 발명은 또한 이 조성물에 기초한 치료법과 관련이 있고, 그것이 제안된 약물의 항암, 항혈관형성, 억제 효과를 제공할 수 있고, 수용액에서 우수한 용해성, 생체 이용률, 안정성, 암과 다른 질환 치료에서 독성의 결여라는 유리한 효과를 갖고 있다. 나아가 본 발명은 암 및 기타 질병 상태의 치료를 위한 구강, 비강 및 직장 투여용으로 사용될 수 있다.

본 발명은 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트(conjugate)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 광 및 음향 과민제, 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제의 성질을 결합한 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트에 관한 것이다.

.....화학식(1)

.....화학식(2)

.....화학식(3)

.....화학식(4)

.....화학식(5)

.....화학식(6)

.....화학식(7)

나아가 본 발명의 구성에 대해 더 설명한다.

음향역학 치료가 도포적으로 환자 몸에 상기 기재한 음파 적용으로 구성될 수 있다. 음향역학 치료법이 환자 몸에 전신적으로 음파 적용으로 구성될 수 있으며, 음파는 액체를 통해 환자에 적용될 수 있다. 초음파는0.1-10 MHz 범위 주파수를 가질 수 있으며, 초음파는0.1-3.0W/cm²J/cm²범위 출력밀도를 가질 수 있다. 또한 초음파는10 J/cm²이상, 바람직하게는 60-300 J/cm²,에너지 밀도를 가질 수 있다.

또한 환자에 conjugate의 유도 이후 1~72시간 후, 바람직하게는 6~48시간, 더 바람직하게는 12~36시간, 가장 바람직하게는 18~24시간, 환자 몸에 음파 적용으로 구성되는 비정상세포, 바이러스, 미생물의 치료법도 본 발명의 다른 일면이다. 또한 환자에 conjugate 유도 이후, 1~72시간 후, 바람직하게는 6~48시간, 더 바람직하게는 12~36시간, 가장 바람직하게는 18~24시간, 1시간 간격이 있는 음파가 환자 몸에 음파 적용되는 것으로 구성되는 비정상세포, 바이러스, 미생물의 치료법도 본 발명이 다른 일면이다.

1~5일 동안 효과적인 용량으로 본 발명의 conjugate를 가진 암세포에 접촉과 청구항 40, 45에 따른 초음파와 레이저의 적용으로 구성되는 암세포 성장 억제법 또한 본 발명의 또 다른 일면으로 conjugate가 약 0.5~100 mg/kg 의 용량으로 투여될 수 있고, 상기 투여는 약 500~2000mg 내의 일일 용량에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 전형적으로 매일 경구로 투여되는 제제의 양은 체중 kg 당 0.01g정도로 적을 수 있으나, 체중 kg 당 0.1g~20g, 즉 0.25~10g/kg이나 0.5~5g/kg이 바람직할 수 있다.

한편 본 발명은 종양에 대한 높은 선택성을 보유하고, 표적 치료에 대해 새로운 다기능 억제제 개발에 의해 앞서 기술한 문제 해결에 도움을 준다. 진단제제로뿐 아니라 타이로신 카이나제와 혈관형성 억제, 광 및 음향 과민제 성질을 결합한다.

높은 선택성의 성질은 종양 세포의 수용체에 높은 민감도를 가지고, 표적 리간드에 의해 제공된다. 타이로신 카이나제 억제제는 항혈관형성 성질을 보유하고 종양 세포의 세포자멸을 유도하는 천연 폴리페놀이다.

또한, 본 발명은 치료 효능 희생없이도 변형이 없는 curcumin에 비해 증가된 물 용해도 및 광안정도를 제공할 수 있는 펩티드, 엽산, 포르피린을 가진 curcumin의 conjugate를 제공한다. 이 측면에서, 본 발명은 아래 조성물 (I) (II), (III), 또는 (IV)에 따라 conjugates를 제공한다.

포르피린 화합물은 클로린 e6, 클로린 e4, 클로린 p6, purpurin발명에 사용된다. 동시에 과민제가 그 유도체(아미노산 염, 에스테르 등)에 적용될 수 있다. 타이로신 카이나제 억제제는 curcumin 및 기타 curcuminoides이고 이것이 항 혈관형성 성질을 가지고, 종양 세포의 세포자멸을 유도한다.

표적 리간드는 종양 세포 수용체에 높은 민감도를 가지는 엽산이다. 발명의 다른 측면에서, 링커는 아미노산, 펩티드, 카르복실산 및 기타이다. conjugates는 암 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방이 변형되지 않은 curcumin, 포르피린으로 치료적으로 사용될 수 있다. 발명의 또 다른 측면에서, 약물학적 조성이 제공되고, 그것은 앞서 명시된 발명의 conjugates의 하나 이상, 선택적으로 추가적 항종양제제와 같은 하나 이상의 치료학적 제제를 구성한다. 발명의 또 다른 측면에서, 질병의 치료 또는 예방법이 제공되고, 발명의 conjugates는 치료적으로 효과적인 양으로 투여한다. 대표적 질환은 다양한 암 및 기타 질환을 포함한다. 발명의 conjugates는 하나 이상의 치료 제제와 결합하거나 단독 치료제제로 이용될 수 있다. 또한 발명은 광 및 음향역학치료를 위한 약물 준비에 conjugate의 사용 방법을 제공하고, 치료법은 환자에 포르피린 화합물을 투여와 환자에 레이저 빛과 음파를 적용으로 구성된다.

이하에서 구조식 등을 참조하여 본 발명의 실시예를 구체적으로 설명한다.

여기에 사용된 용어는 제한하고자 하는 의도가 아니며, 특정 실시예를 설명하기 위한 것을 이해해야 한다.

[정의]

"부형제"는 단일 부형제뿐만 아니라 동일한 또는 다른 부형제 중 두 개 이상, "화합물"은 단일 화합물뿐만 아니라 둘 이상의 화합물을 포함한다.

“세포 독성 효과”는 세포에 대한 제제 효과에 대한 언급으로 세포의 사멸을 의미한다. "Cytostatic 효과"는 세포 증식의 억제를 의미한다.

"세포 독성제제”는 세포군 내에서 각각 세포의 성장을 파괴하거나 억제하는, 세포에 세포 독성이나 cytostatic 효과를 의미한다.

[Conjugates]

본 발명의 conjugates는 다음과 같은 특성을 가진다: 억제제, 과민제, 표적 리간드와 링커를 포함하고 있다. PDT와 SDT 치료시, 과민제는 대상 세포를 사멸시키는 ROS를 생성한다.

Conjugates는 세포에 약물 도입 후 세포자멸을 유도하는 prodrug이다. 용어 "prodrug"는 화합물을 포함하기 위한 것으로 생리적 조건 하에서, 본 발명의 약물 적으로 활성화된 curcuminoid로 변환될 수 있다.

Prodrug를 만들기 위한 일반적인 방법은, 생물학적으로 바람직한 활성 약물을 제공하기 위한 생리적 조건하에서 분해하는 일부분을 선택하는 것이다.

다른 실시예에서 prodrug는 동물이나 세포의 효소 활동에 의해 변환할 수 있다.

[억제제]

여기에서 언급되는 “억제제”는 잠재적인 효과의 일부 또는 전체 제거를 의미하며, 억제제는 억제하는 능력을 가지는 화합물이다.

[혈관형성]

여기에 사용된 "혈관형성"은 혈관의 형성과 분화를 말한다.

여기에 사용된 "항혈관형성"은 혈관형성의 억제나 감소를 의미한다.

여기 사용된 용어 "혈관형성억제제"는 인체에 효과적인 양으로 투여하면 혈관 내피 세포의 증식을 억제하거나 감소시켜 신생 모세 혈관의 형성을 감소시키는 화합물이나 구성을 말한다.

혈관형성 억제제는 적어도 두 개의 부류로 나눌 수 있다. 첫 번째, 직접적 항혈관 억제제는 내피 세포에 대해 비교적 특이적인 제제를 포함하며, 종양 세포에 영향이 적다. 이러한 예로는 용해 혈관 내피 성장인자(VEGF) 수용체 길항제와 angiostatin을 포함한다. 간접 억제제는 내피 세포에 직접적인 영향을 가지지 않으나 VEGF와 같은 항혈관형성 자극제 생성을 하향 조절할 수도 있다(Arbiser et al., Molec. Med. 4:376-383 (1998)). VEGF는 화학적으로 유도된 피부 발암생성동안 상향조절되는 것으로 보여진다; 이것은 H-ras와 같은 발암유전자의 활성화로 인한 듯 하다(Arbiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:861-866 (1997)); (Larcher et al., Cancer Res. 56:5391-5396 (1996)); (Kohl et al., Nature Med. 1:792-797 (1995)). 혈관형성의 간접 억제제의 예는 farnesyl transferase 억제제와 같은 ras-매개 신호 전달의 억제제를 포함한다. 내피 세포 증식의 직접 억제는, 세포 배양 시스템에서 시험될 수 있고, 혈관형성의 복잡한 과정을 제어하는 특정 요인의 영향이 연구될 수 있다. 그러한 in virto 시스템에서 발견된 효과는 예를 들어, Kenyon et al., Invest. Ophthalmol. 37:1625-1632 (1996)에 의해 설명되는 바와 같이 in vivo에서도 연구될 수 있다.

"항혈관형성치료"는 암 또는 종양에 의한 자극에 의한 혈관형성 억제에 의한 암, 종양의 치료를 의미한다.

"암"은 통제되지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 악성 성장을 말한다. 이것은 백혈병뿐 아니라 모두 악성과 양성 고형암 형성을 포함한다. “타이로신 카이나제”는 세포내 신호 전달 경로의 중앙 스위칭 기전을 제공하는 효소이다. 따라서, 그들은 이러한 세포 증식, 신진 대사, 생존, 세포자멸과 같은 다양한 세포 과정에 관여하고 있다. 여러 단백질 타이로신의 카이나제는 암 세포의 활성화로 알려져있고, 종양 성장과 진행을 자극하고 있다. 따라서 타이로신 카이나제 억제제(TKIs)는 특정 세포 신호 경로에 방해하는 표적치료의 새로운 중요한 분류로, 선택된 악성암에 대한 대상 특정 치료를 허용한다. 또 다른 타이로신 카이나제의 억제제 및 항혈관형성 실시예로 “Curcumin”(diferuloylmethane, 1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)은 대칭성 diphenolic dienone이다. 이것은 대칭 dienone(diketo)와 케토-에놀의 tautomer의 평형 혼합물과 같은 용액으로 존재한다. 케토-에놀 폼은 분자내 수소 결합에 의해 강하게 선호된다.

curcuminoids의 어떤 형태는 순수한 형태로 사용할 수 있다. 합성 curcuminoids도 사용할 수 있다. "curcumin'은 curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin, mixtures를 의미한다. "curcuminoids"로 함께 여기서 사용되는 용어 "curcumin(diferuloylmethane)" 및 특정 analogs는 인간을 포함한 포유류에 의해 섭취와 투여에 안전하게 여겨진다 (Bille et al., Food Chem. Toxicol. 23:967-971 (1985)).

여기 사용된 용어 "curcuminoid"는 curcumin 유도체와 같은 합성 curcumin을 의미하나, 전체 참조로 여기에 포함된 PCT 일련 번호 WO 01/40188에서 공개된 것으로 국한되지 않는다. 발명은 또한 과민제를 투여하고, 환자에게 초음파를 적용하는 구성인 광역학치료법을 제공한다.

[발명의 다른 실시예 과민제- 포르피린]

“PDT”. 종양세포에 대한 친화력을 가진 광과민화합물로 치료는 비질병 세포 주변에 손상 없이 전신 빛 조사를 허용한다. 치료는 광원의 초점 맞춤에 의하기 보다 종양 세포에 의해 빛에 민감한 화합물의 결합 또는 내부화를 통해 종양 부위에 국소화된다. 미국 특허. No 5484803 (“Richter”)은 PDT방법을 공개하였고, 광과민성 Benzoporphyrin 유도체를 사용하고, 전신 조사시 정상 비악성 세포보다 백혈병 세포에 대한 높은 친화력을 보여주었다. 발명은 또한 환자에게 과민제 화합물을 투여하고 환자에게 초음파 적용으로 이루어진 음향역학 치료법을 제공한다. “음향역학치료”는 암 치료를 위해 초음파에 노출되면 세포독성이 되는 음향-과민 화합물과 초음파를 사용하는 방법이다. 그것은 낮은 독성의 이점에서 광역학요법(PDT)과 유사하다. 제한된 침투력의 빛을 이용하는 광역학치료와 달리, 음향은 내부 암 및 종양에 신체 깊게 침투할 수 있다. 음향역학 암 치료는 특정 음향과민제가 초음파에 의한 음향 cavitations에 의해 활성화되어 상당한 항암 결과를 유발함을 제안하였다. 음향-과민제의 새로운 세대는 암 세포에 의해 섭취하고 선택적으로 흡수되도록 개발되었다. 또한 상대적으로 낮은 초음파 강도가 음향과민제를 활성화하는 데 충분하며, 기본 주파수 노출과 2차 주파수 사용이 치료 결과를 높일 수 있음이 발견되었다. 치료 방법에서, 초음파와 음향과민제 모두 개별적으로 어떤 세포 독성 효과가 없고 제대로 투여하면 건강한 조직을 손상하지 않는다. 어떤 상황에서, 건강한 세포가 더 빨리 암 세포보다 음향과민제를 배출한다. 최적으로 초음파가 적용되고 건강한 세포가 제제를 배출하나 암세포에는 여전히 부착해 있을 때, 12-36시간의 치료창을 가진다. 세포 독성 효과가 초음파와 과민제의 상호 작용을 통해 최적으로 이루어진다.

여기에 사용되는 용어 "과민제"는 광역학치료와 음향치료에 사용되는 제제를 포함한다. 제거되지 않으면 그러한 제제는 빛과 산소에 노출시 활성화되어서 예를 들어, 종양 세포를 죽일 치명적인 ROS를 생산한다. 따라서, 과민제의 활성 형태는 치명적인 반응 산소종을 생산한다. 한 실시예에서, 현재의 발명에 사용되는 과민제는 산소와 적절한 파장의 빛에 노출시 단일체 산소를 생성한다. 포르피린 화합물은 광과민성과 음향 과민성 제제로 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그들은 종양 세포와 같은 비정상적인 세포에 선택적으로 부착한다(see Yao J Z et al., Chin J Pharmaceuticals 2000; 31: 2157; Liu H L et al., Chin J Laser Med Surg 2002; 11: 889; Umemura K et al., Cancer Lett., 1996, 102: 151-157; Yumita N et al., Cancer Science, 2008, 99: 166-172). 종양-국소화 포르피린 화합물은 SDT에 대한 현대적인 접근에 사용된 최초의 화합물 중 일부이다.

화학치료요법 화합물과 달리, 포르피린은 초음파가 없을 시 세포 독성이 없다. 본 발명의 측면에서, 과민제는(포르피린 (예: 포르피린), 환원된 포르피린(예: chlorin), 엽록소, 엽록소 유도체(예: phyropheophorbide, chlorin e6, purpurin 18), 합성 chlorin(예: benzoporphyrin 유도체 및 purpurin), bacteriochlorin(예: bacteriochlorophyll 유도체, 합성 bacteriochlorin), 포르피린 이성질체(예: porphycence, heteroatom-fused 포르피린 및 inverted 포르피린), 확장 포르피린 (예: texaphyrin) 및 포르피린 아날로그(예, phthalocyanine 및 naphthalocyanine)를 구성하는 그룹에서 선택된 화학물의 자유염기나 금속 복합체이다. 또한, 광과민제는 nonporphyrin (예: hypericin, 양이온 염료 (즉, rhodamine), psoralen)이다.

본 발명 conjugates에 사용을 위한 추가 광과민제는 기술의 하나로 명백할 것이다.앞서 언급된 바와 같이, 본 발명의 conjugates는 억제제, 광과민제, 표적 리간드, 링커로 구성된다.

[표적 리간드]

여기에 사용된 바와 같이 용어 "표적 리간드"는 발명의 conjugates과 함께 처리되는 세포 또는 조직에 선택적으로 결합하는 제제를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 표적 리간드는 같은 종류의 세포나 정상 조직 대비 선택적으로 종양 조직에 결합한다. 또 다른 실시예에서, 일반적으로 표적 리간드는 종양 조직에서 과발현 세포 표면 수용체에 대한 리간드이다. 정상 조직 대비 암조직에서 과발현되는 세포 표면 수용체는 포함하지만, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)(역형성 갑상선암, 유방과 폐 종양에 과발현), metastin 수용체(유두성 갑상선 암에 과발현), ErbB군 수용체 타이로신 카이나제 (유방암의 상당한 부분에 과발현), 인간 표피 성장 인자수용체 2(Her2/neu)(유방암에 과발현), 타이로신 카이나제-18-수용체(c-Kit)(육종성 신암종에 과발현), HGF 수용체 c-Met(식도 선암에 과발현), CXCR4 및 CCR7(유방암에 과발현), 엔도테린-A 수용체(전립선 암에 과발현), peroxisome proliferator activated receptor 델타(PPAR - 델타)(대부분의 결직장암에 과발현), PDGFR-A(난소암종에 과발현), BAG-1(각종 폐암에 과발현), 수용성 타입 II TGF 베타 수용체(췌장암에 과발현) 엽산과 인테그린(예 : αvβ3)에 한정되지는 않는다. 또 다른 실시예에서, 표적 리간드는 엽산, 나트륨 엽산과 그 유도체이다. “엽산 수용체”는 종양 마커로 확인되고 있다. 그리고 난소, 결직장암, 유방암과 같은 상피성 암에 정상 조직대비 높은 수치로 발현된다(Wang, S. et al., Journal of Controlled Release 1998:53(1-3):39-48). 엽산의 γ - 카르 복실 잔기를 통해, 분자 중 하나에 공유결합하는 것으로 보이고, 세포 표면 수용체에 대한 친화성은 본질적으로 변형되지 않는다. endocytosis와 vesicular trafficking 후, 많은 물질이 세포질로 방출되고 있다. 엽산 수용체는 다음 세포 표면에 리싸이클될 수 있으며, 따라서 각각의 엽산 수용체는 세포에 많은 엽산 conjugates를 가져올 수도 있다. 엽산 수용체(FR), 2 glycosyl phosphatidylinositol(GPI) folate 수용체(FR)는 2개의 glycosyl phosphatidylinositol(GPI)-anchored isoform, α 및 β를 가진다. FR-α 발현이 상피 암에서 빈번히 증폭되는 반면, FR-β 발현은 골수양 백혈병 및 만성 염증성 질환과 연관된 활성화 대식세포에서 발견된다. 엽산과 항FR 항체의 conjugates는 수용체-매개 endocytosis를 통해 암세포에 의해 획득되어 FR+ 세포로 표적화된 이동을 위한 기전을 제공한다. 이미지 제제, 화학치료제제, oligonucleotides, 단백질, haptens, liposomes, nanoparticles 및 유전자 전달 벡터를 포함한 다양한 분자와 약물 운반체가 엽산과 conjugate되고, FR 표적 전달을 위해 측정되었다. 실질적인 표적 효능은 in vitro와 in vivo에서 발견되고 있다. 또한, 선택 FR의 상향 조절에 대한 기전과 방법이 밝혀졌고, 그것은 FR 표적 전달 전략의 효과를 향상시킬 수 있다. FRα는 암에 유용한 표지 역할을 하는 반면, FR-β는 골수양 백혈병과 만성 염증성 질병에 대한 마커로 역할한다. FR 표적제제는 다양한 범위의 질병에서 향후 임상적용을 위한 유의성 있는 잠재성과 전임상 모델에서 전망있는 모델을 보여주었다.

[링커]

여기 사용된 용어 "링커"는 단백질 아미노산 사이드 체인에 세포 독성 화합물을 공유결합할 수 있는 분자를 말한다. 용어 "링커"는 비peptidyl 링커 또는 peptidyl 링커일 수 있다. 아래에 정의된 바와 같이 링커는 링커에 대한 세포 독성 화합물을 연결하기 위해 최적으로 공유결합한다. 여기로 사용된 용어 "peptidyl 링커”는 최소한 두 아미노산으로 구성된 펩티드를 말하며, 단백질의 아미노산 사이드 체인으로 결합 수 있다. 링커는 국한되지 않으나, chloromethylketone과 같은 카르복실 말단에 반응 그룹을 가지고 있을 수 있다. peptidyl 링커의 펩타이드는 세포 내에서 발견 단백질 가수분해 효소에 의해 잘려질 수 있다. 용어 "링커"는 적어도 하나의 효과기와 결합자를 연결하는 어떤 구조를 의미한다. 여기에 사용되는, "operably 링크"는 pH, 이온강도와 삼투성의 생리학적인 조건하에서 효과기와 결합자 실재의 대부분이 서로 관련되어 있고, 두 종류가 의도한 기능을 나타낼 수 있다. 링커가 공유적으로 효과기와 결합자를 결합한다면, 최소 길이는 예를 들어 펩티드 결합과 같은 하나의 공유 결합이다. 다른 링커는 예를 들어, homo또는 heteromultifunctional, oligo 또는 heterofunctional crosslinking 제제를 포함하는 crosslinking 제제와 화학의 링킹 제제를 구성한다. 연결 또는 crosslinking은 예를 들어 활성화 polyethylene glycols, aldehydes, isocyanates, maleimide와 같은 것을 포함하여 알려진 다양한 화학에 의해 얻을 수 있다. 알려진 다른 링커도 사용할 수 있다: 2-10 탄소 원자에서 선호되는 링커, 예를 들어, 아세테이트 링커, 짧은 PEG 체인, 에스테르 링커, sugar, lectins, 항체 및 조각, 그리고 호르몬 및 호르몬 아날로그. 본 발명 측면에 링커가 포함된지만, polypeptides, 핵산 분자, 합성 폴리머, 갈락토오스 함유 화합물, 또는 조합에 국한되지 않는다. Glutarate 에스테르 linkage는 수용액에서 안정한 유도체를 생성하지만, 운반 장소에서 약물 분자를 방출하기 위해 esterase에 의해 쉽게 가수분해된다. 피리딘의 존재하에서 glutaric 무수물와 curcumin의 반응이 Curcumin glutarate 에스테르를 생산한다.

또 다른 실시예, 링커 L 알라닌, 본 발명의 또 다른 실시예, 링커 L-phenylalanine, 본 발명의 또 다른 실시예, 링커 Glycyl-glycine, 본 발명의 또 다른 실시예, 링커 2,2′-(ethylenedioxy)diethylamine, 본 발명의 또 다른 실시예, 링커 1,6-hexanediamine, 본 발명의 다른 실시예, 링커는 여러 목적을 가진다.

그들은 표적 리간드, 과민제 및 억제제의 분리를 방지하는 안정하고 친화성 링커이며, 물 용해도를 향상시킨다. 그들은 표적의 방해를 피하기 위해 표적 리간드에서 과민제를 구분짓고 있다. 더 나은 전달 효율을 위한 약리학적 조절 역할로 작용하고, 정상 조직 독성을 감소시킨다. 본 발명의 목적은 표적치료를 포함하고 종양에 높은 선택도를 보유하고 광, 음향 과민제와 타이로신 카이나제, 혈관형성 억제의 특성을 결합하여 효과적으로 안정적이며 안전한 다기능 억제제를 만드는 것이다. 이 작업을 해결하기 위해 본 발명은 새로운 표적 광역학, 음향역학 치료제 제조법을 제안한다-링커에 의해 연결되는 표적 리간드와 curcumin, 포르피린의 conjugate를 구성하는 혈관형성과 타이로신 카이나제 억제제, 그것은 conjugate 의 합성과 정화의 방법, 안정제를 구성하는 준비, 여과, 혼합, osmolarity 조절, pH 확립, 살균, 여과, 동결건조, 일정 농도 %에서 chlorin e6, purpurin, chlorin p6또는 다른 약리학적으로 허용되는 과민제 사용, curcumin 및 기타 curcuminoids 사용, 표적 리간드로 엽산, folate, sodium folate potassium digidrofolic acid, 다른 약리적으로 허용되는 염, 엽산 유도체 사용, 링커로 아미노산, 펩타이드 사용을 포함하며, osmomolarity는 0,8-0,9%의 농도에서 나트륨 염화물 또는 염화칼륨으로 조절하고, 여과는 0,45-0,22μm의 막에 두 단계로 수행된다.

[발명의 conjugates의 합성]

규정된 데로, 본 발명에서 다양한 curcuminconjugates가 합성될 수 있다. curcumin conjugate는, 알려진 화학정보를 사용하여 제조되었다. curcumin은 생체분자와 공유결합과 화학적 다양성을 위한 잠재적 위치로 이용될 수 있는 활성 메틸렌 그룹과 두 가지 페놀 군이 있다. 우리는 curcumin conjugate를 합성하였고, curcumin의 활성 메틸렌 그룹과 phenolic hydroxyls이 활용되었다. conjugates는 3가지 10 단계 합성으로 얻어졌다.

일반적인 방법

curcumin은 Sigma(St. Louis, MO)에서 구매하였다. Chromatography purification: Silica gel column chromatography (Merck, Darmstadt, 독일), 박막 크로마 토그래피 (TLC, 머크), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Shimadzu, 교토, 일본)는 일반적 purification 절차 수행에 사용되었다. 스펙트럼 분석: 반응 제품의 특성은 1H NMR 분광기와 질량 분광법에 의해 실시되었다. 프로톤 및 탄소 NMR 스펙트럼(500,13 MHz 이상)은 Bruker AVANCE-500 기구 내부 보조 기준으로 용매의 잔류 신호(δ 2.50 PPM)를 사용하여 DMSO - D6 용액으로 기록되었다. 재료: N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-alanine)Boc-alanin,THF,CDI, curcumin (diferuloylmethane,1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione), 엽산, EtOAc , dichloromethane TFA trifluoroacetic acid, DCC, DMF. 사용된 모든 용매는 사용하기 전 유리에서 증류되거나 스펙트럼 등급 이었다. 유도체 합성을 위한 일반적 방법은 Schemes 1-4에 있다(아래의 그림 2 참조).

그림 2. Scheme 1 : 실시예에서, conjugates는 아래 명시한 화학식(1) 내지 화학식 (7) 중에 선택된 어느 하나의 에 따른 구조를 가진다.

1. THF의 (N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-alanine) 유도체 용액에 CDI를 첨가한다. 3h 동안 stirring 후 THF curcumin의 환류된 용액에 3h 동안 점적 첨가한다. 4h 동안 용액은 환류시키고, 감압하에서 용매를 증발시킨다. 잔여물은 EtOAc에 녹이고, NaHCO₃와 NaCl (1:1) 포화용액으로 wash 하고, Na₂SO₄로 건조시킨다. 용매는 curcumine, 모노-및 diadduct 비율 3:6:1로 증발되도록 한다. 이 혼합물은 정제를 위해 다음 단계에서 사용된다.

2. monoadduct를 포함하는 이전 단계로부터의 혼합물을 dichloromethane에 녹이고, trifluoroacetic 산이 추가되었다. 어두운 분홍색 용액이 48h동안 실온에서 stirring 되었다. 용매와 휘발성 물질이 증발되었고, 결과 잔류는 에틸 에테르와 함께 두 번 sonificate했다. 상층액은 제거하고 침전물은 건조되었다.

3. 건조한 DMF에 포르피린 및 DCC 용액이 1 시간동안 sonificate되었다. 그 동안 용액은 어두운 녹색에서 거의 검은색으로 변한다. 1 시간 후, crude free curcumin - 알라닌 유도체가 첨가되었으며, 결과 용액은 24 시간동안 stirring 했다. crude 유도체량은 1.3 몰의 초과 및 curcumin 시작의75 %의 수율로 계산되었다. 24 시간 후 물이 추가되었으며 침전물이 여과되었다. 침전물은 연속적으로 water acetonitrile과 에테르로 wash하였다.

4. 상온 질소에서, 무수 DMSO 및 피리딘 혼합에 엽산의 용액으로, N-BOC-2,2′-(ethylenedioxy)diethylamine(1:1)와 dicyclohexylcarbodiimide(DCC)(4:1)로 첨가하였고, 혼합물은 실온에서 14-24시간동안 stirring 하였다. 엽산과 N-BOC-1, 6간 상관 관계는 엽산 중 하나 분자와 결합한 N-BOC-2,2′-(ethylenedioxy)diethylamine 한 분자로 선택된다. 오렌지 노란색 침전물이 여과에 의해 수집되고 여과물은 DMSO, pyridine의 잔량 제거를 위해 강하게 stirring되는 0° C 로 냉각된 건조 Et20 용액으로 넣었고, 높은 진공 하에서 건조되었다.

5. 엽산 유도체가 dichloromethane에 추가되었고 trifluoroacetic 산이 첨가되었다. 결과 용액은 24 시간 동안 상온에서 stirring 했다. 상층액은 제거하였고, 기름 잔여물은 에틸 에테르와 함께 두 번 sonificate되었다. 상층액은 제거하였고, 침전물은 건조되었다.

6. 드라이 DMF에 포르피린-알라닌-curcumin 및 DCC용액이 1 시간 동안 sonificate되었다. 그 동안 용액은 녹색 색조 검은색으로 되었다. 1시간 후 엽산 유도체가 첨가되었고, 결과 용액이 24시간동안 stirring 되었다. Crude 유도체량이 1.3 몰의 초과 및 curcumin 시작의 75 %의 수율로 계산되었다. 24 시간 후 물이 첨가되었으며 침전물이 여과되었다. 침전물은 연속적으로 water acetonitrile 과 ether 로 wash하였다.

7. conjugate는 0.2 M의 수산화 나트륨(NaOH)으로 처리되었고, 0.2 HCl로 침전되었다..

8. 침전물이 원심분리되었다. 발열원 없는 물에 용해시켰다.

9. 용액은 30-60 분 혼합한다. 다음 pH를 7.6-8,5로 조정하고, 안정제가 첨가되고 30-60 분동안 용액이 혼합된다. pore size가 2000 Da인 초여과 투석막으로 용액을 투석한다.

10. 제제는 알려진 방법으로 플래시 크로마토그래피에 의해 불순물이 정화되었다.

11.conjugate를 포함하는 부분은 확실시되었고, 살균 여과는 0,22-0,45 μм의 막에 실시하고 동결 건조되었다. 원칙적으로 발명 수용액의 pH 는 7,6에서 8,6으로 다양하고, 물리적으로 안정적인 용액을 얻기 위해 가장 바람직한 것은 8.5이다. 산도 조정을 위해 사용 가능한 구성 요소는 수산화 나트륨, 염화 수소와 같은 염기와 산을 포함한다. 여과는 0,45-0, 22 μм 막을 사용하여 두 단계로 진행된다. 획득 용액은 용량 양식을 제조에 사용된다. 독성 및 발열원에 대한 물리-화학적인 매개 변수의 완전한 제어가 완벽하게 제어되며 규범 문서에 명시된 기능에 따라 시행되었다. 획득 용액은 의약품을 준비하는 데 사용되었다. 발명의 주제는 암 및 기타 질병의 치료를 위한 경구용, 비강 및 직장 의약품의 제조를 위한 구성을 포함한다.

[conjugate 사용법]

conjugates 발명은 초음파나 빛의 영향아래이거나 주변 투여에서, in vivo에서 변형되지 않은 curcumin과 광과민제를 방출하는 전구체 약물 역할을 하는 것으로 믿어지고 있다. 그러므로, conjugates는 conjugates 발명의 curcumin 구성 요소의 항혈관형성 성질에 반응하는 어떤 조건을 치료하거나 방지하는데에 유용하다고 믿어진다.

치료될 수 개체는 동물, 포유 동물(예, 인간, 고양이, 개, 소, 말, 양, 돼지, 원숭이, 원숭이 등)과 조류(예, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩 등)을 포함하는 일반적으로 척추 동물을 포함한다.

예를 들어, 본 발명의 화합물은 암성 조직과 유방, 결장, 전립선, 피부암을 포함하는, 그와 관련된 종양 치료에 사용될 수 있다. 발명에 따라 치료 가능한 종양 질병은 예를 들어, 항문 암종, 방광 암종, 자궁 경부 암종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 자궁내막 암종, 모양 세포성 백혈병, 두경부암, 폐(소세포) 암종, 다중 골수종, 비호지킨 림프종, 여포성 림프종, 난소 암종, 뇌 종양, 대장 암종, 간세포암, Kaposi 육종, 폐(비소세포 암종), 흑색종, 췌장 암종, 전립선암, 신장 세포 암종, 선관성 암종, 위장 암종, 편평세포 암종, 기저세포 암종, 연조직 육종을 포함한다.

또한, 본 발명의 화합물은 염증과 관련된 조건과 건선, 류마티스 관절염, 당뇨병의 특정 형태와 같은 질환을 중재하는 데 유용할 수 있다. 특정 실시예에서는, 발명의 화합물이 암, 건선, 그와 같은 다양한 피부 조건 치료를 위한 도포성 조성에 사용될 수 있다고 믿어진다. 이러한 국소 적용에서는, curcumin 아날로그의 방출, conjugate 화합물의 분해를 유도하기 위해 열이나 빛(예, UV)의 사용하는 것이 바람직하거나 필요할 수도 있다.

발명 중 한 측면에서, 발명의 화합물의 효과적인 양의 투여가 암성 조직에 혈관형성 억제를 낳을 수 있다고 믿어진다. 그래서, 본 발명은 종양이 있는 개체 치료를 위한 방법을 제공할 수 있다. 발명의 화합물이 예를 들어 종양내에서 혈관형성 억제에 의해 그러한 종양을 대처하기 위한 효과적인 방법으로, 효과적인 양에서 그러한 치료를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있다.

항혈관형성 효과는 적어도 부분적으로, 종양에서 TF 및/ 또는 VEGF의 생산 억제에서 결과로 생각된다. 또한, 본 발명의 화합물은 피부염, 피부암의 경증 증례에 국한되지 않으며, 염증성 피부 상태의 특정 유형을 방지하기 위한 예방적 치료로 사용될 수 있다고 생각된다.

일반적인 조건으로, 0.5~약 20mg/kg 체중의 용량, 바람직하게는 1.0~약 5.0mg/ kg이 치료 효능을 가지고 있다. 다른 약물학적으로 활성 제제와 같이 투여될 때, 발명의 화합물의 적은 양도 치료적으로 효과가있을 수 있다. 발명의 화합물은 하루에 한번이나 여러 번 투여될 수도 있다. 치료 기간은 2~3주 기간 동안 하루에 한 번 일 수 있다.

동물 시험에서 발명에 따라 사용되는 포르피린 화합물이 국소 조직에 고농도였으며, 정상 조직에서 낮은 농도에서 발생하는 것이 증명되었다. 이것이 임상 치료에 SDT를 사용가능하게 한다. 여기서는, 용어 "인체"가 발명의 그림과 설명으로 대개 언급된 반면, 발명은 또한 다른 포유류에 적용되는 것이 이해되어야 한다.

발명에 따른 사용법의 바람직한 실시예에서, 치료법은 몸에 도포적으로 음파적용으로 구성된다.

발명에 따른 사용법의 바람직한 실시예에서, 치료법은 몸에 전신적으로 음파적용으로 구성된다.

발명에 따른 사용법의 바람직한 실시예에서, 적용되는 음파는 초음파이다.

발명에 따른 사용법의 바람직한 실시예에서, 적용되는 초음파는0.1-10 MHz범위, 바람직하게는 0.5-2.5 MHz 주파수를 가진다.

발명에 따른 사용법의 바람직한 실시예에서, 적용되는 초음파는 0.1-3.0 W/cm²범위, 바람직하게는 0.2-2.0 W/cm²,더 바람직하게는 0.3-1.2 W/cm²출력 밀도를 가진다.

발명에 따른 사용법의 바람직한 실시예에서, 적용 초음파가 10J/cm²이상, 바람직하게는 60-300J/cm²의 범위에서, 더 바람직하게는108-212J/cm²의 에너지 밀도를 가진다(초음파 에너지 밀도 = 전력 밀도 (W /cm²)× 조사 시간(초) = J/cm²).

또한 발명은 환자에게 위에서 설명한 포르피린 화합물 중 하나를 투여, 그리고 환자의 신체에 음파 적용으로 구성된 음향역학요법을 제공한다.

다른 실시예에서, 본 발명의 암 치료의 방법에서, 인공 방사선은 약 10초~ 60 분동안 적용될 수 있으며 또는 인공 방사선은 약 15 초~30분동안 적용된다. 또 다른 실시예에서는, 본 발명은 본 발명의 conjugates와 약리적으로 허용되는 운반체로 구성된 약리학적 조성물을 더 제공한다.

본 발명은 본 발명의 약리학적 조성물의 치료적으로 효과적인 양의 투여 단계와 사용으로 이루어진, 개체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

아래 예시는 좀 더 자세히 발명을 설명한다. 다음 조성물과 예시는 숙련된 사람이 본 발명을 시행하고 좀 더 명확하게 이해하는 것을 가능하게 하기 위해 주어진다.

그러나, 본 발명은, 예시된 실시예의 범위내에 제한되지 않으며, 단지 발명의 그림 측면에서 의도되는 것이며, 기능적으로 동등한 방법이 발명의 범위내에 있다.

[예시]

다음 예시는 발명을 설명하기 위해 제공하지만, 발명의 한계로 간주되어서는 안된다.

[예시 1]

[Step 1]

THF 10ml에 유도체(N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-alanine)(294mg, 1.56 mmol) 용액에, CDI(259 mg, 1.6 mmol)이 첨가되었다. 결과 용액은 3h시간 동안 stirring 되었고, THF 10ml에 curcumin(442 mg, 1.2 mmol) 환류 용액에 3시간 동안 점적첨가되었다. 용액이 4 h 동안 환류되었고, 감압하에서 용매는 증발시켰다. 오렌지 잔류물은 EtOAc에 녹였고, 포화 용액 NaHCO₃와 NaCl (1:1)로 wash 후 Na₂SO₄로 건조하였다. 용매는 HPLC 자료에 기초하여 curcumine, mono-, diadduct의 3:6:1의 비율로 692 mg 을 얻도록 증발되었다. 이 혼합물은 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다(아래의 그림 3 참조).

그림 3. N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-alanine curcumin(M.M. 525,2)과 Di-N-(tert-Butoxycarbonyl)-L-alanine curcumin(M.M. 682,27)

[Step 2]

약 0.53 mmol monoadduct 을 포함하는 이전 단계로부터 혼합물 (382 mg)이 15 ml dichloromethane에 녹였고, 0.6 ml trifluoroacetic 산을 첨가하였다. 어두운 분홍색 용액이 48h 위해 상온에서stirring되었다. 용매 및 휘발성 물질이 증발되었고 결과 잔유물은 에틸 에테르와 함께 두 번 sonificate되었다. 상층액은 제거되었고, 침전물은 건조되었다(아래의 그림 4 참조).

그림 4. L-alanine curcumin(M.M.439,16)과 Di- L-alanine curcumin(M.M.510,2).

[Step 3]

건조 DMF(8ml)에 chlorine(168mg, 0.18mmol)과 DCC(78mg, 0.38mmol) 용액이 1시간 동안 sonicate되었다. 이 용액은 진한녹색에서 검정으로 변하였다. 1 시간 후, crude free curcumin-alanine 유도체가 1.3 몰의 초과 및 curcumin 시작 75% 수율로 계산되었다. 24시간 후, 물이 추가되었고(40ml) 침전물이 여과되었다. 침전물은 이후 물 (50 ml), acetonitrile (20 ml)과 에테르 (20 ml)로 wash 되었다(아래의 그림 5 참조)..

그림 5. Chlorine-alanine-curcumin(M.M. 1017,42)와 chlorine di-L-alanine curcumin (M.M. 1088,45)

[Step 4]

상온 질소에서, 무수 DMSO 및 피리딘의 혼합에 엽산 용액으로, N-BOC-2,2′-(ethylenedioxy)diethylamine(1:1)와 dicyclohexylcarbodiimide(DCC)(4:1)로 첨가하였고, 혼합물은 실온에서 14-24시간동안 stirring 하였다.

엽산과 N-BOC-2,2′-(ethylenedioxy)diethylamine(1:1)간 상관관계는 엽산 중 하나 분자와 결합한 N-BOC-2,2′-(ethylenedioxy)diethylamine 한 분자로 선택된다.

오렌지 노란색 침전물이 여과에 의해 수집되고 여과물은 DMSO, pyridine의 잔량 제거를 위해 강하게 stirring되는 0° C 로 냉각된 건조 Et20 용액에 넣었고, 높은 진공 하에서 건조되었다. 침전물은 헥산으로 wash하였고, 감압하에서 증발시켰다.

엽산 유도체가 dichloromethane에 추가되었고 trifluoroacetic 산이 첨가되었다. 결과 용액은 24 시간 동안 상온에서 stirring 했다. 상층액은 제거하였고, 기름 잔여물은 에틸 에테르와 함께 두 번 sonificate되었다. 상층액은 제거하였고, 침전물은 다음 건조되었다(아래의 그림 6 참조).

그림 6. r-{(tert-butyl N 2,2′-(ethylenedioxy)diethylamine}folic acid

[Step 5]

r-{(tert-butyl N-(2.2′-(ethylenedioxy)diethylamine }folic acid(0.995 g)이trifluoro-acetic acid(TFA)(8 ml)에 처리되었다. 2시간 동안 주변온도에서 stirring 후, TFA가 높은 진공 하에서 증발되었고 잔류물은 무수 N-N-Dimethyl formamide-DMF에 수집되었다. 피리딘은 오렌지 노란색 침전물의 완전한 형태까지 점적첨가하였고, 여과에 의해 수집되었고, Et2Q 헥산으로 wash하였고, 진공 하에서 건조하였다. 침전물은 클로로포름에서 결정화하였고 분획되었다. r-(6 aminohexyl)만 있는 분획이 수집되었고, 0,84 g(90 %)을 얻기 위해 진공 하에서 건조되었다

만약 언급된 데로 되지 않으면, DMSO: 0,1N NaOH, 3:7로 silicagel L(170-390 mesh) 칼럼 크로마토그래피로 분획한다(아래의 그림 7 참조).

그림 7. {gamma-{N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl}folic acid}})

[Step 6]

건조 DMF(8 ml)에 chlorine(168mg, 0.18 mmol) 과 DCC(78 mg, 0.38 mmol) 용액이 1시간 동안 sonicate되었다. 1시간 후, 엽산 유도체가 첨가되었고, 결과 용액은 24시간 동안 stirring되었다. 유도체의 양은 1.3 몰의 초과 및 Chlorine-alanine-curcumin 시작 75 % 수율로 계산되었다. 24시간 후, 물이 추가되었고(40ml) 침전물이 여과되었다. 침전물은 이후 물(50ml), acetonitrile(20ml)과 에테르(20ml)로 wash 되었다(아래의 그림 8 참조)..

그림 8. Conjugate 1 : 1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-[(4-O-alanine-O-Chlorin-e6-{gamma-{N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl}folic acid}})3-methoxyphenyl]-1,6-heptadiene-3,5-dione Mass 1578,26

[예시 2]

예시 2 - 링커, 클로린과 curcumin의 coupling은 phenylalanine 이나glycine이다(아래의 그림 9 내지 그림 13 참조).

그림 9. L-phenylalanine-curcumin(M.M. 515,19)와chlorine di-L-phenylalanine curcumin (M.M. 662,26)

그림 10 및 그림 11. (좌측그림) ChlorineL-phenylalanine-curcumin(M.M. 1093, 45)와 chlorine di- L-phenylalanine curcumin (M.M. 1240, 52) ; (우측 그림) ChlorineL-glycine-curcumin (M.M. 1017,42)와 chlorine di-L-glycine curcumin (M.M. 1088,45)

그림 12. Conjugate 2는 1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-[(4-O-phenylalanine-O-Chlorin-e6-{gamma-{N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl}folic acid}})3-methoxyphenyl]-1,6-heptadiene-3,5-dione (M.M. )이다.

그림 13. Conugate 3은1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-[(4-O-glycine-O-Chlorin-e6-{gamma-{N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl}folic acid}})3-methoxyphenyl]-1,6-heptadiene-3,5-dione (M.M.)이다.

[예시 3 (Scheme 2)]

예시 3 - 링커, 엽산과 curcumin의 coupling은 glutaric acid 이다. 이scheme에서, curcumin 의 양쪽 끝부분과 관련있다.

1. Mono-carbonyl butanoic acid의 합성

THF 10ml에 curcumin (0.52 g, 1.41 mmol)의 용액에, glutaric 무수물(171 mg, 1.5 mmol), Et₃N(0.33ml,2.38mmol),DMAP(28mg,0.22mmol)가 첨가되었다. 결과 용액은 4시간 동안 환류되었고, glutaric 무수물 (171 mg, 1.5 mmol)가 추가되었다, 혼합물이 4시간 동안 추가로 환류되었다.

용액은 냉각되었고, 용매는 감압하에서 증발되었고, 잔류물은 EtOAc에 녹였다. 얻은 용액은, 물로 wash, Na₂SO₄로 건조, 여과되었고, 추가 정제 없이 사용되는 잔류물(820mg)을 주기 위해 증발되었다. 칼럼 크로마 토그래피에 정제, CH₂Cl₂-CH₂Cl₂:MeOH,95:5로 분리 했다(아래의 그림 14 참조).

그림 14. Conjugate 4는 1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-[(4-O--phenylalanine-O-Chlorin-e6-{gamma-{N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl}folic acid}})3-methoxyphenyl]-1,6-heptadiene-3,5-dione이다.

[예시 4 (Scheme 3)]

그림 15 conjugate 5 는 1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-[(4-OL alanine-O-Chlorin-e6-{gamma-{N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl}folic acid}})3-methoxyphenyl]-1,6-heptadiene-3,5-dione이다.

[예시 5 (Scheme 4)]

.

그림 16. 엽산은 메틸기에 부착되어 있다.

[예시 6] 안정화 및 살균 여과

1. 건조물은 pH 8,5-9,0증류수에 용해되었다. 용액은 종이 필터로 여과하였다. 0.9 %의 농도로 NaCl을 추가하였다. 여과액의 pH는 8,0-8,5의 값으로 조정되었다.

2.또한, 용액은 구멍 직경 0.22 m의 항균 microporous 필터 "Millipore"로 여과하였고, 유리병에 넣어 동결 건조하였다.

3. 제제의 습도는 4%를 넘지 않았다.

독성 및 발열원에 대한 물리-화학적인 매개 변수의 완전한 제어가 완벽하게 제어 규범 문서에 명시된 기능에 따라 시행되었다. 획득 용액은 의약품을 준비하는 데 사용되었다.

발명의 바람직한 conjugate는 변형되지 않는 curcumin과 클로린 e6에 비해 우수한 용해도와 광안정성을 가진다.

발명의 주제는 암 및 기타 질병의 치료를 위한 경구용, 비강 및 직장 의약품의 제조를 위한 구성을 포함한다.

비경구 적용을 위해, 조합은 정맥내, 근육내, 피하 주사로 도입될 수 있다. 주사에 대한 조성은 방부제와 함께 여러 용량을 함유하는 앰플이나 bowl의 복용량 형태로 사용될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액, 수용성 용매에 이멀젼으로 사용될 수 있고, 분산제, 안정제 및/또는 유화제 및/또는 용액 tonicity 조절을 위한 방법과 같은 보조제를 함유할 수 있다. 대안적으로 활성 물질이 멸균수와 같은 적절한 희석제와 함께 조합된 파우더로 도입될 수 있다. 약물은 좌약과 같은 직장 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 이 조성은 카카오 오일 및 기타 글리세라이드와 같은 알려진 베이스를 포함할 수 있다.

비강 도입을 위해 조성물은 액체 스프레이나 방울의 형태로 사용될 수 있다.

흡입으로, 조성물은 스프레이 형태로 제조하는 것이 합리적이다.

예를 들어, 흡입기 또는 취분기에 캡슐과 젤라틴의 카트리지는 유당이나 녹말과 같은 부형제처럼 적절한 파우더와 활성 조성물의 혼합을 함유하기 위해 설계되었다.

다른 용량 형태에 대한 약물은 하나 또는 여러 약리적으로 인정되는 bulking 제제 또는 희석제를 사용하여 알려진 방법으로 제조한다. 경구, 비경구, 직장 또는 비강 도입 또는 흡입과 취분을 통한 조성물은 일반적인 방법을 통해 준비되었다. 가장 바람직한 조성물은 경구용 도입을 위한 것이다. 경구 도입을 위한 약리학적 조성분은 알약의 정제 형태로 있을 수 있고, 약리학적으로 허용되는 희석제, 결합제(gelled maize starch, polyvinylpyrrolidone 또는 hydroxypropyl cellulose), 충전제(유당, saccharose, mannitol, maize starch, microcrystalline cellulose, calcium hydrophasphate), 윤활제 (stearic산, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 스테아레이트, talc 또는 silicon dioxide), separators(감자 녹말, sodium carboxymethylcellulose) 또는 penetrating agents (sodium lauryl sulfate)을 사용하여 알려진 방법에 의해 생산된다. 경구용 액체 조성물은 물 또는 기름 용액, 시럽, 엘릭서제, 에멀전 또는 현탁액의 형태로 생산 수 있다. 도입전 유사한 운반체나 물과 결합을 위한 건조 제품의 형태로 생산할 수 있다. 이러한 액체 조성은 suspension(sorbitol syrup, cellulose derivatives, glucose/sugar syrup, gelatin, jellous alluminium stearat, hydrogenated edible fats), 유화제(lecitine, Acacia or sorbitane monooleate), nonaqueous carrier(almond oil, oil ether, ethanol, refined vegetable oil), 보존제(methyl-, propyl- hydroxybenzoate, sorbic acid)와 같은 약리학적으로 허용된 첨가제를 사용하여 알려진 방법으로 생산될 수 있다. 필요하다면 알려진 버퍼, gustatory agents, 방향족, 색소 및 단맛을 제공하는 물질을 액체 조성물이 포함할 수 있다.

[예시 7] 경구용 정제의 조성물

직접 압축

1. 활성 물질: 1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-[(4-O-alanine-O-Chlorin-e6-{gamma-{N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl}folic acid}})3-methoxyphenyl]-1,6-heptadiene-3,5-dione-10-15 mg/pill

(분쇄된 약리학적 물질로 해당량) : 0.5 ~ 1.0 g/pill

2. Hydroxy-p-cyclodextrin : 3 ~ 5 mg/pill

3. Magnesium stearate : 0.65 mg/pill

4. 비수용성 lactose : 80 mg/pill

활성 물질은 hydroxy-p-cyclodextrin, 비수용성 lactose, magnesium stearate와 혼합된다. 혼합물은 걸러서 알약의 형태로 압축한다.

[예시 8] 정제의 조성물

1. 활성 물질: 1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-7-[(4-O-phenilalanine-O-Chlorin-e6-{gamma-{N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy] ethyl}folic acid}})3-methoxyphenyl]-1,6-heptadiene-3,5-dione-45-70 mg/pill

(분쇄된 약리학적 물질로 해당량) : 0.5 ~ 1.0 g/pill

2. Hydroxy-p-cyclodextrin : 5 ~ 10 mg/pill

3. 유당 : 150.0 mg/pill

4. 전분 : 30.0 mg/pill

5. Gelled 옥수수 전분 : 15.0 mg/pill

6. Magnesium stearate : 1.5 mg/pill

활성 성분은 적당한 체에 걸러서 Hydroxy-p-cyclodextrin, 유당, 전분, gelled 옥수수 전분과 혼합한다. 물의 필요량을 추가한다. 파우더는 과립화된다. 과립 건조후 체에 거르고, magnesium stearate 와 혼합한다. 과립은 프레스를 사용하여 알약으로 된다. 유당이나 다른 밀도에 따른 활성물질의 농도에 따라 알약이 만들어 질 수 있다.

[예시 9] 정제의 조성물

활성 물질: conjugate 3 : 15 ~ 30 mg/tablet

스프레이 약물 성분 해당량 : 0.5 ~ 1.0 g/tablet

유당 : 150,0 mg/tablet

전분 : 30.0 mg/tablet

젤라틴화된 옥수수 전분 : 15,0 mg/tablet

Magnesium stearate : 1.5 mg/tablet

활성 성분은 적당한 체에 걸러서 유당, 전분, 젤라틴화된 옥수수 전분과 혼합한다. 물의 필요량을 추가한다. 파우더는 과립화된다. 과립 건조후 체에 거르고, magnesium stearate 와 혼합한다.

과립은 해당 구멍 직경 스탬프에 의해 정제로 압축된다. 스탬프를 사용하여, 유당이나 다른 활성 물질의 함유로 다른 조성물의 정제가 만들어 질 수 있다.

[예시 10] 설하정

활성 성분 conjugate 4 : 50 ~ 100 mg/tablet

(약물의 추출물 해당량) : 0.5 ~ 1.0 g/tablet

Hydroxy-p-cyclodextrin : 5 ~ 10 mg/pill

Pressed sugar : 50.5 mg/tablet

Magnesium stearate : 0.5 mg/tablet

활성 성분은 적당한 체에 걸르고 스탬프의 적당한 breakdown으로 누른다. 정제는 프레스 후 다른 질량이나 희석제와 관련된 활성 물질의 다른 용량으로 조제될 수 있다.

[예시 11] 시럽

활성 성분 : conjugate 2

DMSO : 15 ~ 30 mg

Hydroxypropylmethylcellulose (점도 type 4000) : 22.5mg

정제수 : 5.0 ml까지

추가적으로 Buffer, Flavor, Dye, 보존제 및 단맛을 내는 성분 포함될 수 있다.

Hydroxypropylmethylcellulose는 뜨거운 물에 분산 냉각 후 활성 성분, 조성의 다른 요소를 포함하는 수성 현탁액과 혼합된다. 결과 용액은 필요로 하는 부피로 조절되고 혼합된다.

[예시 12] 마시는 용액

경구용 용액 : 100 ml(10 ml/1dose)

Conjugate : 0.936 g

dehydrated magnesium lactate : 0.186 g

아스코르브산 : 200 mg

정제수 : 100 ml

추가적으로 관능측면에서 saharinat sodium을 포함할 수 있다.

[예시 13] 비강 스프레이(스프레이병 15 ml)

100 ml 내에 Conjugate 100 mg, Glycine 100 mg을 포함한다.

구성 요소의 개별 용액 준비 : polyethylene oxide 50 % 용액, polyvinylpyrrolidone 6% 용액, Trilon B. 10 % 용액. 용매는 phosphate-salt, buffer 버퍼 혼합물을 사용하여, 용액은 여과되었다. 표시된 용액은 주어진 순서대로 단일 용기에 합하여 살균되었다. 다음 formylglycine를 추가한다. 모든 구성물을 혼합한다. 필요한 용량에 부어 봉인하고 라벨한다. 버퍼 혼합물 1 ml 에 formylglycine의 제안되는 조성물:

formylglycine : 1 mg

Polyvinylpyrrolidone : 0.014 mg

Polyethylene : 0.7 mg

Trilon B, r : 0.0008

α-tocopherol : 20 mg/kg/day

curcumin 오일 : 0.5 ml/day 에 200 mg/kg/day

점도 : 30.0 ·10^-3 Pa ·sec

생물학적 실험

[예시 14]

HeLa 세포 배양에서 엽산 수용체와 conjugate결합의 연구방법

세포 배양

HeLa : 사람, 상피성 자궁경부 암종

영양 배지

RPMI-1640 배지 : L-glutamine, 엽산, NaHCO₃을 포함하지 않은 RPMI-1640 배지(10x)

Hanks

Phosphate : saline buffer

Detergent : Triton X 100

L- glutamine

Bicarbonate

Versen

실험실 유리제품- 세포 배양용 병, 초자류

기구: CO₂를 공급하는 37℃ 항온기

현미경

실험

1. RPMI-1640 배지가 HeLa 세포 배양에 사용되고, CO₂와 함께 37℃에서 2일간 배양되었다. 세포 수가 측정되었다. 3일 째에, 배지는 병의 일부와 병합되었고, RPMI-1640 배지(10X)(엽산이 포함되지 않은)가 이 병에 첨가되었다(초기 배지는 10 배 희석되었고 L-glutamine, NaHCO₃이 첨가되었다).

성장은 24시간 지속되었다. 남은 병(대조군)은 RPMI-1640 배지(엽산이 포함)의 최초 환경에서 24 시간 동안 배양되었다. 24 시간 후 엽산이 없는 병에 추가되었다: chlorine e6 10 ^-6-10^-7mol/l,chlorinee6-curcumin-conjugate10^-6-10^-7mol/l

성장은 37℃에서 지속되었다. 배지는 1, 3, 5, 24 시간에 즉시 신속하게 부었다. 세포 단층은 FSB로 wash 하였고, FSB 잔류물은 피펫으로 제거하였다. Versen 0.5ml 용액이 첨가되었고, 세포 단층이 37℃에서 10분동안 배양되었다.

세포는 slur되었고 카메라 Goryaeva에서 그 수를 계산하였다. 세포는 "동결-해동" 과정이나 Triton Х-100(10%) 처치에 의해 파괴되었다. 찬 Hanks (10⁵mcl/ml)용액으로 wash하였고, 원심분리하였다. 얻어진 샘플에 chlorine e6와 chlorine e6-curcumin-conjugate의 상대적 농도는 λ_возб =405nm, λ_рег=665nm 형광으로 용액의 강도로 측정하였다.

[결과]

광활성 화합물의 표적성 운반과 세포내 축적이 Hela세포를 사용하여 연구되었고, 엽산 수용체가 과발현되는 많은 종양세포 유형의 하나에서 연구되었다. 세포는 앞서 언급된 바와 같이 배양되었다.

얻어진 샘플에 chlorine e6와 chlorine e6-curcumin-conjugate의 상대적 농도는 λ_возб = 405 nm, λ_рег =665 nm 형광으로 용액의 강도로 측정하였다.

그림 17, 18은 배양 후 Hela세포에 chlorine e6와 chlorine e6-curcumin-conjugate 농도를 나타낸다(상대적 units/병).

chlorine e6와 chlorine e6-curcumin-conjugate의 세포내 축적이 그림 17, 18에서 확인된다. 축적 kinetic은 다르다. 자유 chlorine e6대부분은 5시간 내에 세포와 결합하며, chlorine e6-curcumin-conjugate 결합은 24시간동안 선형으로 증가한다. 배양 6~24시간 후, 엽산-conjugate 광과민제의 축적은 chlorine e6의 세포내 축적보다 명백히 높다.

24시간 노출 후 conjugate의 세포내 섭취는 chlorine e6 농도보다 평균 2,5배 높았다. Conjugate의 세포내 섭취는 24시간 이상 꾸준히 증가하였고, 이것은 비특이적 세포 흡수라기보다 수용체 매개 endocytosis를 통한 능동 수동인 듯 하다.

chlorine e6 의 엽산-매개 표적화가 chlorine e6 지표 분자의 광생물학적 활성을 변화시킴을 증명하였다.

종양 세포는 건강한 조직과 종양의 다른 유형에 비해 과발현되는 수용체의 수와 종류에서 상당한 변화를 나타내는 것으로 알려져 있다. 특정 수용체의 과발현은 in vitro 와 in vivo에서 종양 세포에 광과민제 운반을 표적화하기 위해 종종 사용된다. 엽산 수용체를 과발현하는 Hela 세포는 엽산-표적화 리간드의 사용이 엽산 수용체를 통해 다수의 분자와 항암제제의 섭취를 매개한다.

Hela 세포에서 conjugate 의 세포내 섭취는 엽산 특이적이며, conjugate되지 않은 chlorine e6보다 훨씬 더 강력하다..

형광 양자 수율과 관련하여, conjugate와 chlorine e6 도 진단에서 광의학적 접근 방법에 제안될 수 있다. 사실, chlorine e6 및 관련 화합물이 종양 조직에 축적하고, 오랜 기간 유지하는 능력이 있는 것이 알려져왔다. 따라서, conjugated chlorine e6-기반 광과민제도 암 검출에 제안될 수 있다(아래의 그림 17 참조).

그림 17. 분홍선-chlorine e6-curcumin-conjugate - 10^-6mol/l,세포 농도 - 3·10⁵cell/ml , 파란선- chlorine e6-10^-6mol/l, 세포 농도- 3·10⁵cell/ml

영양 배지에서 배양 후 Hela 세포에서 chlorine e6, chlorine e6-curcumin-conjugate 농도(상대적units/1 vial)는 아래의 그림 18을 참조하면 된다.

그림 18. 분홍선 - chlorine e6-curcumin- conjugate - 10^-6mol/l, 파란선 - chlorine e6-10^-6mol/l,세포 농도- 3·10⁵cell/ml

[예시 15] 축적

광활성 화합물의 표적성 운반과 세포내 축적이 Hela세포를 사용하여 연구되었고, 엽산 수용체가 과발현되는 많은 종양세포 유형의 하나에서 연구되었다.

세포는 배지 199에서 3일동안 배양되었고, 화합물-Hank’s solution/medium 199 (9/1)로 옮겨졌다. 3시간 후 세포는 트립신으로 수집하였고, Hank’s solution(10⁵кл/ml)에 두었다. 세포 부유액에서, chlorine conjugate 용액이 2·10^-7M/l농도로 첨가되었고, 37℃에서 배양되었다. 10분, 2,3,5,10,15,24 시간 후 샘플은 원심분리되었고, 침전물은 찬 Hank’s solution 으로 wash 하였고, 침전물은 초기 부유물에 세포농도로 Hank’s solution 에 옮겼다. 얻어진 샘플에 сhlorine e6와 chlorine e6-curcumin-conjugate의 상대적 농도는 λ_возб = 405 nm, λ_рег =665 nm 형광으로 용액의 강도를 측정하였다. 하기 표 1은 약물10mcg/ml을 포함하는 영양 배지에서 배양 후 Hela 세포에서 chlorine e6, chlorine e6- curcumin- conjugate 농도(상대적units/1 vial)에 관한 것이다.

제제의 배양 시간, h	chlorine e6	chlorine e6-curcumin- conjugate
1	0.86	0.40
5	1.45	1.80
10	1.72	2.50
15	0.81	12.5
24	0.40	15.0

엽산сhlorine e6-conjugate와 자유기가 세포내에 축적된다는 것은 명백하다. 축적 kinetic은 다르다. 자유 chlorine e6대부분은 5시간 내에, chlorine e6-conjugate의 결합은 20시간동안 선형으로 증가한다.

6시간 배양후, 엽산-conjugate chlorine e6curcumin의 축적이 chlorine e6 의 세포내 섭취보다 더 높았다(그림. 19).

conjugate 세포내 섭취는 24시간 이상 꾸준히 증가하였고, 이것은 비특이성 세포 흡수라기보다 수용체-매개 endocytosis를 통한 능동수송임을 제안한다. 24시간 후 conjugate의 세포내 섭취는 chlorine e6의 농도보다 평균 8~10배 높았다.

Hela세포에 chlorine conjugate, 자유기의 결합에 외인성 엽산의 효과를 측정하기 위해, 엽산이 4μM/l의 농도로 chlorine 유도 전에 세포 부유물에 첨가되었고, 6시간내에 chlorine conjugate, 자유기와 배양되었다. 원심분리 후에, 상층액이 얻어졌고, 침전물은 찬 Hank’s solution 에 다시 wash하였고, 얻어진 두 번째 침전물은 Hank’s solution 으로 다시 옮겼다. 상층액과 두 번째 원심분리 후 침전물의 chlorine의 형광강도는 표 2 에 있다(아래의 그림 19 참조).

그림 19. chlorine e6, chlorine e6-curcumin-conjugate 의 섭취 kinetic. Hela 세포는 광과민제 20 mkg/ml 로 배양되었다. 세포 형광 강도는 660 nm 에서 측정되었다.

표 2에서 보여지는 바와 같이, 자유 chlorine으로 세포 배양 6시간 후에, 결합chlorine의 양은 처음 3시간내 결합에 비해 감소한다(표. 1). conjugated chlorine에 대한 세포의 흡수능은 훨씬 더 높았다. 6시간 동안, 세포는 conjugate의 21% 이상을 선택하였고, 결합은 낮은 속도로 지속되었다.

24시간 노출후, conjugate 축적은 conjugate 되지 않은 chlorine e6의 세포내 섭취보다 더 높았다. 그림 20에서 4mM 자유 엽산이 Hela세포에서 conjugated chlorine e6의 섭취를 유의성있게 감소시켰으나(p < 0.05), chlorine e6 섭취에 대한 유의성있는 효과는 없었다. 실제로 chlorine e6의 세포내 섭취는 배양 배지내 엽산의 경쟁적 농도에 의해 영향 받지 않았다. 그러나, 경쟁적 엽산의 존재하에서 conjugate 축적의 감소에도 불구하고, chlorine e6에 비해 세포내 축적이 훨씬 유지되었고, 이것은 엽산의 존재가 비특이적 섭취를 증가시킴을 제안한다(아래의 그림 20 참조).

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그림 20. 엽산 유무에 따라 Hela 세포에서 연구된 화합물의 세포내 농도. Hela 세포는 4 x 10*³M 에 엽산의 경쟁적 농도 유무에서, 24시간 동안 광활성 화합물(chlorine e6, chlorine e6-curcumin-conjugate)의 10~⁸M로 배양되었다. 결과는 측정된 세포내 농도로 표현되었다.

[예시 16] 세포 생존시험

세포 독성(항증식 시험).

재료 HeLa 종양 세포의 단층 배양

방법: HeLa 종양 세포배양은 kanamycin 100 mg/ml, 10% 소배아혈청이 첨가된 hemohydrolyzate된 영양배지나 영양배지 199에서 키웠다. 플라스크에 접종 후(영양배지 2.0ml에 100,000세포) 세포 배양 4일째에, 광과민제 1; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0 mg/ml가 첨가되었다. 빛 차단 커버(어두운 세포독성)이 있는 플라스크가 37, 5℃에서 1시간 동안 배양되었다; Hanks solution을 사용하여 4번 조성물로부터 세포를 wash; 신선한 영향 배지 2,0ml 추가와 “METALAZ” 레이저 의료 기기(627,8 nm, 578,2 나 510,6 nm 파장) 나 680-2000(670-690nm 파장의 빛에 의해 5, 10, 15, 20분 동안 녹는 얼음의 온도에서 빛 조사 40J/cm²의 용량에서, 연구되는 광과민제의 스펙트럼 최대 흡수 파장에 따라;20-24 시간 후 효과-0,02%-Versen 용액에 의해 분산시킨 세포 단층; Goriaev’s chamber 에서 종양 세포 수 계산한다. 하기 표 2는 24시간 후 제제와 배양 후 Hela세포의 수(대조군에 %로)를 나타낸다.

제제 농도, μm	Chlorin e6	chlorine e6-curcumin- conjugate
1	101.3	102.1
5.0	99.1	95.6
10.0	98.4	94.1
20.0	96.5	85.9
40.0	90.0	78.0
80.0	89.7	62.3

약 90% 세포 분획 생존 수율 실험에서 광활성 화합물chlorine e6로 Hela 세포의 24시간 배양이 빛 노출 없이 세포 독성을 유발하지 않음을 증명하였다(그림. 21). 엽산의 첨가가 chlorine e6로 측정된 세포독성의 결여를 변화시키지 않는다(아래의 그림 21 참조).

그림 21. 항증식시험(세포독성 시험)으로 측정된Hela 세포에서 chlorine e6, chlorine e6-curcumin- conjugate의 세포 독성 의존성 농도. 데이터는 3번의 독립적 실험의 평균값은 나타낸다. 오차 막대는 표준편차이다.

Hela 세포는 24시간 동안 chlorine e6-curcumin conjugate 의 증가되는 농도에 노출되었다. 세포 생존 능력의 주목할만한 손실 (약 40 %) 이 chlorine e6-curcumin conjugate 80 μm의 처리 후 관찰되었다(아래의 그림 22 참조). 세포 생존 능력의 유의성 있는 감소가 chlorine e6-curcumin conjugate 80μm 6시간 투여 후 처음 관찰되었으며 24시간 후 최대로 발견되었다(아래의 그림 23 참조). . 80μm에서 curcumin도 세포 생존이 감소하지만 강도는 다양하였다(아래의 그림 24 참조).

그림 22.

그림 23.

그림 24.

예시 17. curcumin-chlorine-folic acid conjugate vs. chlorine e6의 광독성(광역학 활성)

플라스크에 세포를 심은 후, 3일째에 Hela세포에서 광역학 효과를 연구하는 동안, 영양 배지내 연구된 제제의 0.2 ml 용액이 0,1; 0,5; 1,0; 5,0나 10 mcg/ml 의 최종 농도로 첨가되었다. 빛 보호 커버에 싸인 플라스크는 3.5시간 37℃에서 온도에 배양되었고, Hank’s solution에 의해 제제를 wash 하였고, 3,3joule/cm²용량으로 레이저 의료 기기680-2000(670-690 nm 파장)에 의해 얼음위에 노출되었다. 20~24시간 후, 세포 단층이 0,02%-Versene 용액으로 분산되었고, 종양 세포는 Goriaev’s chamber 로 계산되었다. 각 지점 3 플라스크가 사용되었다.

결과는 표 3에 보여진다.

광역학 활성의 연구는 높은 효율성을 보여준다. 5-10mcg/ml농도로 Hela 세포의 증식의 완전한 억제에서 conjugate이다. 하기 표 3은 3,5 시간 동안 제제의 배양과 3,3joule/сm²양으로 광노출(PhE)후 Hela 세포의 수(대조군에 대한 %)에 관한 것이다(아래의 그림 25 참조).

제제 농도, mcg/ml	chlorine e6	Conjugate
0.1	87.1	65.1
0.5	83.6	42.3
1.0	64.7	12.6
5.0	19	0.1
10.0	3.8	-

그림 25. 광과민제의 광역학 활성

실험에서, 세포는 광과민제로 배양되었고, 1,5-15joule/cm²의 양으로 레이저 의료기기680-2000(670-690 nm 파장)에 의해 얼음 위헤서 빛 조사되었다. Hela 세포는 37 °C 에서 24시간 동안 색소에 노출되었다. 그림. 25는 본 실험 조건에서, chlorine e6대조군 광과민제가 적은 광독성을 나타냄을 보여준다. 반대로, 생존 측정시험에서 chlorine e6-curcumin- folic acid-conjugated 사용에 의해, 광과민성은 chlorine e6-매개 광과민화에 비해 향상되었음이 증명되었다(아래의 그림 26 참조).

그림. 26 Hela 세포에서 Chlorine e6, chlorine e6curcumin-folic acid conjugate의 광역학 민감도 측정. 광역학 시험에 의해 얻어진 생존 곡선은 1.5~15.0J/cm 의 빛의 증가된 양에 노출된 세포에서 측정되었다. 세포는 빛 치료전 24시간 동안 광과민제 10^-3M로 배양되었다. 데이터는 3번의 독립적 실험의 평균값은 나타낸다. 오차 막대는 표준편차이다.

chlorine e6를 표적화하는 chlorine e6curcumin-엽산 conjugate는 지표 분자 chlorine e6의 광생물학적 활성을 변화시킴을 증명하였다.

그래서, 엽산 수용체가 과발현하는 Hela 세포를 사용하여 24시간 후 chlorine e6 보다 평균 약 10배 높게 conjugate가 축적되었다.

종양 세포는 건강한 조직과 종양의 다른 유형에 비해 과발현되는 수용체의 수와 종류에서 상당한 변화를 나타내는 것으로 알려져 있다. in vitro 와 in vivo에서 특정 수용체의 과발현은 종양 세포에 광과민제 운반을 표적화하기 위해 종종 사용된다. 엽산 수용체를 과발현하는 Hela 세포와 같은 세포에서, 엽산-표적화 리간드의 사용이 엽산 수용체를 통해 다수의 분자와 항암제제의 섭취를 매개한다. Hela 세포에서 엽산 수용체의 섭취 의존도는 4mM 자유 엽산의 존재하에서 경쟁적 섭취시험에 의해 실시되었다. 엽산의 경쟁적 농도하에서 Hela 세포내에 conjugate 가 낮게 축적되었다.

Hela 세포에서 conjugate 의 세포내 섭취는 엽산 특이적이고, conjugate되지 않은 chlorine e6보다 훨씬 더 강력하다고 결론지었다.

형광 양자 수율과 관련하여, conjugate와chlorine e6 도 진단에서 광의학적 접근 방법에 제안될 수 있다. 사실, chlorine e6 및 관련 화합물이 종양 조직에 축적하고, 오랜 기간 동안 유지하는 능력이 있는 것이 알려져있다. 따라서, conjugated chlorine e6-기반 광과민제도 암 검출에 제안될 수 있다.

[예시 17]

Vero 세포(정상 신장 세포) 생존율에 curcumin-chlorine conjugate, curcumin 의 효과

재료 : Vero 세포의 단층 배양.

방법 : Vero 세포배양은 kanamycin 100 mg/ml, 10% 소배아혈청이 첨가된 DMEM에서 배양되었다. 플라스크에 접종 후(영양배지 2.0ml에 100,000세포) 세포 배양 4일째에, 광과민제 1; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0mg/ml이 첨가되었다. 빛 차단 커버(어두운 세포독성)이 있는 플라스크가 37, 5^оС 에서 1시간 동안 배양되었다; Hanks solution을 사용하여 4번 조성물로부터 세포를 wash; 신선한 영양 배지 2,0 ml 의 추가와 20~24시간 후 효과-0,02%-Versen 용액에 의해 분산에 대해 Goriaev’s chamber 에서 종양 세포 수를 계산하였다. 하기 표 4는 는 24시간 후 제제와 배양 후 Vero 세포의 수(대조군에 %로)를 나타낸다.

제제 농도, μm	Chlorin e6	chlorine e6-curcumin- conjugate
1	101.3	102.1
5.0	99.1	100.6
10.0	98.4	99.1
20.0	96.5	96.9
40.0	95.0	96.0
80.0	89.7	94.3

약 96% 세포 분획 생존 수율 실험에서, curcumin-chlorine conjugate 와 curcumin 으로 Vero 세포의 24시간 배양이 정상 신장 세포에서 독성을 유발하지 않음을 증명하였다(표 4).

[예시 18]

OKP-GS (사람 신장세포암종), A549(사람 비소세포 폐암) 종양세포 생존율에 curcumin-chlorine conjugate, curcumin 의 효과

신장암종은 사람에서 가장 약물저항성이 있는 종양중 하나이며, 암 사망율의 빈번한 요인이다.

curcumin이 인간 신장 세포 암종에서 세포자멸을 유발할 수 있음이 여러 연구에서 증명되었다. 이것은 curcumin-chlorine conjugate도 인간의 신장 세포 암종에서 세포자멸 유도에 대한 측정을 가능하게 한다. 이러한 목적을 위해, 세포자멸 유도에 대한 curcumin, curcumin-conjugate의 능력을 비교하였고, curcumin-conjugate가 세포자멸을 유도하는 가능한 기전을 조사하였다.

세포는 10% (v/v) 소 태아혈청, 1% (v/v) penicillin-streptomycin(PS)을 포함하는 EMAM에서 배양되었고, 96-well plate에 40%의 포화로 성장하도록 하였다.

제제의 약물 도입전 2시간에, 각 well의 배지는 2% (v/v) B27, 1% (v/v) PS가 첨가된 200 μl Neurobasal 배지로 교체되었다(약물 투여 배지, Helicon, 모스크바, 러시아).

curcumin, curcumin-conjugate 용액(40mM)이 멸균된 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 조제되었다. 다음 농도가 얻어졌다: 20 μM, 50 μM(caspase 3/7 시험용)나 25 μM, 50 μM (MTT시험용)

각 well에 약물 투여 배지가 흡인되었고, 각 농도의 약물용액이나 운반체-포함 배지(대조군)가 세포의 3개 well에 첨가되었다(50 μl/well).

세포는 37 °C 조직배양 인큐베이터에서 24, 48시간동안 제제와 함께 배양되었다. 적절한 대조군 well이 제제없이 동일한 배지안에 DMSO의 동일한 부피를 포함하는 용액을 사용하여 준비되었다. 또한 배경 흡광도는 약물의 특정 농도와 약물 투여 배지만을 포함하는 병렬 well에서 측정되었다(세포는 없음).

MTT (3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 시험

세포는 well당 100 μl 배지내 triplicate로 제제와 함께 다음날 투여되었다. curcumin과 curcumin-conjugate 투여에서, 병렬 well(triplicate)은 배지(세포 없음)만 포함하였고, 동일한 curcumin과 curcumin-conjugate 농도가 배경으로 사용되었다. 세포(2,000/well)가 실험에 필요한 특정 시간에 0.1 ml 의 최종 부피에서 표시된 시험 샘플 여부에서, 96 well 플레이트에서 triplicate 배양되었다. MTT 용액(PBS에서 5 mg/ml) (25 μl)가 각 well에 추가되었다. 세포는 37℃에서 2시간동안 배양되었다. 추출 버퍼(20% SDS, 50% dimethylformamide)(100 μl)가 각 well에 추가되었고, 내용물은 부드럽게 혼합하여 37° C 에서 하룻밤 배양하였다. 흡광도는 blank로 사용되는 추출 버퍼와 함께 96 well 멀티 스캐너 자동 판독기를 사용하여 570 nm에서 측정되었다. curcumin과 curcumin-conjugate 샘플에 대해, 배지 샘플과 해당 curcumin에서 얻은 흡광도가 공제되었다. MTT를 사용하여 세포 생존 능력 시험은 제제를 투여하지 않은 대조군 세포에 비해 curcumin과 curcumin-conjugate 가 있는 OKP-GS 와 A 549 세포의 생존이 감소함을 보여주었다.

OKP-GS 와 A549세포에서 curcumin-conjugate투여는 caspase-3/7 활성 (프로그램된 세포사 또는 “세포자멸”를 유발)을 증가시킨다.

[Caspase-3/7 시험]

약물 추가 후, 플레이트는 37℃, CO₂(5%)에서 16시간 동안 배양되었고, 세포는 Apo-ONEHomogeneous Caspase-3/7 Assay를 사용하여 caspase3 / 7 시험되었다.

먼저, dithiothreitol(DTT) 용액이 시험 버퍼 1 ml(component D)과 함께 1 M DTT (component E) 40 μl을 혼합하여 준비되었다. 다음, caspase-3/7 기질(component A) 1 μl가 DTT 용액100 μl에 희석되어 혼합되었다. 희석된 caspase-3/7 기질 용액(50 μl)이 각 well에 첨가되었고, 100 rpm 으로 교반기에서 60분간 플레이트를 부드럽게 흔들어주었다. 각 well에 형광은 485/20nm 여기, 528/20nm 방출 파장, 민감도 70으로 FLx 800 플레이트 리더기(Bio-Tek Instruments, Winooski, Vt.)로 측정되었다. 통계학적인 분석은 Bonferroni post-hoc 시험으로 ANOVA를 사용하여 실시하였다.

curcumin 치료로Curcumin-chlorineconjugate는 OKP-GS, A549세포에서 caspase-3/7 활성(프로그램된 세포사 또는 “세포자멸”를 유발)을 증가시켰다.

[예시 19]

OKP-GS (사람 신장세포암종)에서 세포자멸 에 의한 세포 생존능의 감소에 curcumin-chlorine conjugate, Curcumin의 효과

인간의 신장 암종 OKP-GS가 24 시간 동안 curcumin-chlorine conjugate, curcumin 농도 증가에 노출되었다. 세포 생존능의 주목할만한 손실(약 50 %)이 curcumin-chlorine conjugate 60μm 투여 후 관찰되었고, 24시간 투여 후가 최대였다.

세포자멸성 세포사로 여겨지는 DNA 분절화의 사다리 패턴이 curcumin-chlorine conjugate, curcumin 60로 24시간 동안 투여했을 때 관찰되었으며, 이것은 이러한 제제에 의한 세포 생존능의 손실이 세포자멸의 유도에 의함을 보여준다.

Annexin V/PI 염색법을 사용하여 세포자멸의 양적 측정은 다른 농도의curcumin-chlorine conjugate으로 12시간 후 세포자멸을 겪는 암 세포의 비율을 보여준다. 세포자멸의 유도가 처음 curcumin-chlorine conjugate 60 μm의 6시간후 관찰되었고, 24시간까지 점차 증가되었다. OKP-GS 세포가 curcumin 80 μm에 12시간 동안 노출되었을 때, 세포자멸성 세포의 비교할만한 증가도 관찰되었다. 다음, curcumin-chlorine conjugate 는 세포자멸유도에 가장 효과적이었고 그 다음이 curcumin 이었다.

[예시 20]

RD (횡문근육종) 종양세포 생존율에 curcumin-chlorine conjugate, Curcumin의 효과

세포는 10% (v/v) 소 태아혈청, 1% (v/v) penicillin-streptomycin(PS)을 포함하는 basal medium Eagle(BME)에서 배양되었고, 96 well plate에 40%의 포화로 성장하도록 하였다.

세포 생존력은 변경된 MTT 환원시험으로 측정되었다. MTT는 옅은 노란색 기질로, 살아있는 세포에 의해 짙은 파란색 formazan산물로 환원된다. 이 과정은 미토콘드리아의 활성을 필요로 하고, 갓 사멸한 세포도 MTT의 유의성 있는 양을 환원하지 못한다.

RD 세포가 5×10⁵cells/ml농도로 96-well 납작한 바닥 플레이트에 배양되었다. 12시간의 preconditioning 후, 24시간 동안 세포는 다양한 농도의 curcumin-chlorine conjugate 이나 curcumin으로 처리되었다. 그런 다음, 배양 배지는 흡인되었고, MTT 색소 100 (phosphate-buffered saline[PBS]에 1mg/ml)이 첨가되었다; 37℃에서 4시간 배양되었다. 살아있는 세포에 의한 색소 환원에 의해 생성된 formazan 결정이 산성화된 isopropanol (0.1 N HCl) 사용에 의해 용해되었다. 세포 생존능의 지표는 570nm에서 MTT 색소 환원에 의해 생성되는 색깔의 광학적 밀도 측정에 의해 계산되었다.

MTT 사용한 세포 생존능 시험은 제제가 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 curcumin과 curcumin-conjugate 가 있는 OKP-GS와 A 549세포의 생존이 감소함을 보여주었다.

[예시 21]

혈관형성에서 curcumin-chlorine conjugate, curcumin 의 효과

수정된 달걀은 3 일 동안 37℃에서 습윤한 인큐베이터에 보관되었다. 달걀 알부민의 약 2 ml을 피하 바늘로 제거하여 융모요막과 난황이 난각에서 떨어지도록 한다.

3.5일에, 난각은 부수고 제거되었고 껍질 막이 벗겨졌다. 계태아4.5일에, curcumin과 curcumin-conjugate(20 μg/달걀)가 추가되었다 - 주입된 coverslip은 공기중 건조되었고, 융모요막 표면에 적용되었다. 2일 후 10 % 지방 유제 2 ml 이 융모요막으로 주입되었으며 융모요막의 세포막은 현미경으로 관찰되었다.

retinoic acid (RA)가 항혈관형성 화합물로 알려져 있기 때문에, RA 20 μg/달걀이 항혈관형성 반응에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 샘플로 함께 처리된 융모요막이 빈 coverslip와 비교할 경우, 적은 혈관을 가진 RA-처리 융모요막과 비슷한 정도로 avascular 영역을 보여줄 때, 반응이 양성으로 계산되었고, 시험된 총 달걀수에 대한 양성 달걀의 %에 기초하여 계산되었다. 독립적인 실험이 세 번 반복되었고 최소한 20개 이상 달걀이 조사되었다(표 5). 하기 표 5는 in vivo에서 융모요막의 혈관형성 억제에 관한 실험이다.

제제	Amount \| disc	억제 (%)
control	Methanol 2μl	14
Retinoic acid	20 μg	88
curcumin conjugate	20 μg	95
curcumin	20 μg	84
control 2	-	-

curcumin-chlorin conjugates의 상응하는 억제 효과는 잘 알려진 항혈관 제제인 curcumin, retinoic acid의 것보다 더 강력하였다. 표 5에 보여지는 데이터는 curcumin-conjugate, curcumin가 항혈관형성 제제임을 나타낸다.

[예시 22] curcumin-chlorin conjugates의 항혈관형성 활성.

curcumin-chlorin conjugates의 항혈관형성 활성이 연구되었다. 혈관형성이11일째 달걀 융모요막에 헤파린 10mcg을 포함하는 2mm methylcellulose 디스크를 두는 것으로 융모요막에 유도되었다. curcumin-chlorin conjugates의 200, 100, 50 mcg 용량이 각 6개 달걀의 3 세트에 헤파린을 함유한 디스크에 동시에 첨가되었다. 6개 달걀은 대조군으로 사용하였다. 4일 후, 융모요막에 큰 창을 내서, 신생혈관 수를 측정하였다.

혈관형성에 대한 % 억제는 다음 등식에 따라 얻어졌다: 혈관형성억제 (%)=(시험군의 새로운 혈관의 평균 수/새로운 혈관의 평균 수) × 100.

얻은 결과는 표 6에 보여진다. 혈관형성이나 새로운 혈관의 유도가 용량 의존적으로 curcumin-chlorin conjugates의 투여에 의해 유의성있게 억제되었음을 보여준다. 하기 표 6은 curcumin, conjugate의 혈관형성 억제의 용량의존성에 관한 것이다.

[예시 23]

OKP-GS (사람 신장암종) 종양세포 생존능에 curcumin-chlorine conjugate의 광역학 효과

세포는 10% (v/v) 소 태아혈청, 1% (v/v) penicillin-streptomycin (PS)을 포함하는 EMAM에서 배양되었고, 96-well plate에 40%의 포화로 성장하도록 하였다.

플라스크에 세포를 심은 후, 3일째에 OKP-GS 세포의 curcumin-chlorine conjugate 광역학 효과를 연구하는 동안, 영양 배지내 연구된 제제의 0.2 ml 용액이 0.1 ; 0.5 ; 1.0 ; 5.0 또는 10 mcg/ml 의 최종 농도로 첨가되었다. 빛 차단된 플라스크는 3.5 시간 37℃에서 온도에 배양되었고, Hank`s solution으로 제제를 wash 하였고, 3,3 joule/cm²용량으로 레이저 의료기기 LD 680-2000 (670-690nm 파장)을 사용하여 얼음위에 노출되었다. 20~24시간 후, 세포 단층이 0,02%-Versene 용액으로 분산되었고, 종양 세포는 Goriaev’s chamber 로 계산되었다. 각 지점 3 플라스크가 사용되었다.

결과는 표 7에 보여진다.

광역학 활성의 연구는 높은 효율성을 보여준다. 5-10 mcg/ml농도로 OKP-GS세포의 증식의 완전한 억제에서 conjugate이다. 하기 표 7은 3.5 시간 동안 제제의 배양과 3.3 joule/сm²양으로 광노출(PhE)후 OKP-GS 세포의 수(대조군에 대한 %)에 관한 것이다.

제제 농도, mcg/ml	Chlorine e6	Conjugate
0.1	89.1	62.1
0.5	83.6	40.3
1.0	74.7	12.6
5.0	29	0.1
10.0	3.8	-

그림. 27 광과민제의 광역학 활성

[예시 34]

육종 M1 세포에서 chlorine e6, curcumin-chlorin conjugate 의 광역학 효과

실험은 피하 이식된 육종 М-1으로 실시되었다. Rat 육종 М-1과 정상 조직 (반대편 엉덩이 피부)의 축적의 광과민제 dynamic의 추적조사가 컴퓨터 형광 분광 광도법으로 시행되었다. 이 목적을 위해 헬륨-네온 진단레이저와 레이저 섬유 스펙트럼 분석기가 사용되었다.

약물과 광역학치료의 항종양 효율은 Evans blue에 의한 동물-종양 운반체의 염색에서 종양에 형성된 괴사 영역의 양적 평가에 의해 (레이저 장비- 2000) 50 J/cm²의 광노출후 24 시간동안 모니터되었다.

실험은 Hank’s solution에 10 %의 종양 먹이의 0,5 ml 도입을 통해 사타구니 부위에 피하 이식된 육종 М-1이 있는 10마리 흰색 outbred rat(180~250g) 두 그룹에서 시행되었다.

육종 М-1 이식 후, 동물은 실험 동물에 대한 기존 규범에 따라 자연광 시간에 먹이의 표준 조건(엽산 없이)에서 유지되었다. 습도, 온도, 방 조명은 사육장의 유지를 위한 기존 위생 규정에 따랐다.

[윤리적 문제]

연구는 세계 의학 협회 헬싱키 선언 (2000)의 요구 사항을 따르는 동물에 대한 연구의 시행과 계획의 연구 품질 기준, 기존의 국제 윤리에 따라 실시되었다. 동물에 대한 모든 조작은 신경이완성진통(근육내로, 체중 100g당 0,2 ml 에 의해 2:1의 droperidole과 phentanile 용액)상태로 둔 후에 실시되었다. 동물은 안락사의 일반적으로 인정되는 방법을 사용하여 희생시켰다.

[실험의 Scheme]

연구는 종양 이식 후 7-9일에 동물의 두 시리즈에서 실시되었다. 광과민제는 1,0-2.0mg/동물 체중 kg의 용량으로 0,5-1ml의 양을 1회, 정맥으로 동물에 도입하였다. DMCO과 NaCl의 무균 발열원이 제거된 등장성 용액이 용매로 사용되었다. 종양과 정상 조직에 약물 축적의 dynamic에 대한 관찰이 광과민제 도입 후 1~5, 24 시간 후 시행되었다.

Rat 육종 M-1과 정상 조직(반대편 엉덩이 피부)의 축적의 광과민제 dynamic의 추적조사가 컴퓨터 형광 분광 광도법으로 시행되었다. 이 목적을 위해, 헬륨-네온 진단레이저와 레이저 섬유 스펙트럼 분석기633-25(BIOSPEC, 모스크바)가 섬유-광학 probe에 대한 조직과 장기 접근성에서 광과민제 축적 수치를 국소적으로 측정가능하게 하였다.

실시간 모니터링을 위해 카테터의 약물 말단(진단) 유도 후, 매시간마다 종양과 정상 조직에 배치되었다. 약물 축적의 최종 도입, 약물 축적의 강도는 최대 형광에 해당하는 파장에 기록되었다.

인덱스의 획득 디지털 값은 컴퓨터 프로그램 Origin 6.1. 을 사용하여 일반적으로 허용 통계 방법으로 처리되었다. 유의성 수준은 0.05 와 상응하였다.

curcumin-chlorine conjugate PDT의 항종양 효능은 Evans blue를 가진 동물-종양 운반체의 염색에서 종양에 형성된 괴사 영역의 양적 평가를 통해 광노출 후 24시간에 모니터하였다. 생리적 용액에0,6% Evans Blue 용액이 rat 정맥으로 투여되었다(100g체중당1 ml).

3시간 후 동물은 일반적으로 허용되는 안락사법을 사용하여 희생되었고, 종양은 절제되어 10% 포르말린에 1 시간 동안 고정되었다. 고정 후, 가장 큰 직경이 종양 결절의 가로 부분이 되었고 사진은 컴퓨터에 연결된 카메라로 얻었다.

PDT 후 형성된 괴사와 생존 종양 영역의 정량적 측정을 위해, 특별한 프로그램을 사용하여 조직-구축학적 종양 슬라이드의 색상의 컴퓨터 분석법을 사용하였다.

이 프로그램은 종양의 눈에 보이는 영역을 염색하여 파란색 식별(Evans blue)의 알고리즘을 포함한다. 직접 세포 독성 효과로부터 살해된 종양 영역 또는 미세순환 구조-기능적 장애로 인한 영역은 파란색으로 염색되지 않는다. 염색되지 않은 점과 종양 슬라이드 경계에 점의 총 양의 비율이 파괴 효율로 간주되었다.

curcumin-chlorine conjugate 도입 후 처음 5시간과 24 시간 동안 rat의 육종 М- 1과 정상 조직의 형광 수치가 앞서 언급되었다. 4-5시간에, 용량에 관계없이 광과민제 축적 대조도는 종양 vs 정상 조직에서 5~7 배 높았다.

선택도 인자의 추정(종양 평균 축적/정상 조직에 평균축적)은 curcumin-chlorine conjugate 최대 축적이 5~24 검사 시간 동안 도입 후 기록되었음을 보여준다. curcumin-chlorine conjugate PDT는 육종 M-1의 괴사를 유도하였다. 괴사 영역 데이터는 1,0mg/kg 용량으로 chlorine conjugate 의 50J/cm² PDT 후 형성된 rat 육종 М1의 조직구축학적 슬라이드로 표현된다. 괴사 영역은 40 95%였다. 가장 현저한 항종양효과는 curcumin-chlorine conjugate 유도 후 5~7시간 노출에서 기록되었다(표 8 참조 및 그림 28 참조).

그림. 28 괴사 영역은 1.0과 2.0 mg/kg 용량으로 curcumin-chlorin conjugate 의 50J/cm² PDT 후 형성된 rat 육종 М1의 조직구축학적 슬라이드로 표현된다.

[예시 35]

Hela 세포와 OKP-GS (사람 신장암종) 종양세포 생존능에 curcumin-chlorine conjugate의 음향역학 효과

OKP-GS와Hela 세포는 curcumin-chlorin conjugate 단독 또는 초음파와 결합하여 처치되었다. 세포 증식은 MTT시험으로 측정되었고, 세포 형태는 도립 형광현미경으로 관찰되었다.

결과： 초음파(1.0 MHz, 1.0-2.0W/cm²，60 초)나 curcumin-chlorin conjugate (0.10-1.60 mg/mL)단독 치료는 OKP-GS와 Hela 세포 둘다를 각각 강도 의존적으로, 용량의존적으로 유의성있게 세포증식을 억제하였다.

OKP-GS와 Hela 세포 성장 억제를 위한 초음파 50% 강도는 각각1.23W/cm²,1.25W/cm²이고(P>0.05), curcumin-chlorin conjugate의 IC50은 각각 0.38 mg/mL, 0.77 mg/mL이다 (P<0.05).

단일 초음파(1.0 MHz, 0.5W/cm²，60 초)나 curcumin-chlorin conjugate(0.05-0.20 mg/mL) 투여와 비교하여, curcumin-chlorin conjugate 와 초음파 병합은 OKP-GS와 Hela 세포 증식을 유의성있게 억제하였다(P<0.05).

단일 초음파(1.0 MHz, 0.5W/cm²，60초)나 curcumin-chlorin conjugate(0.20mg/mL) 투여와 비교하여, curcumin-chlorin conjugate 와 초음파 병합은 OKP-GS와 Hela 세포 사멸율을 유의성있게 증가시켰다 (P<0.05).

chlorin-e6 와 병합한 초음하는 세포 증식에 특이적 억제 효과를 발휘하였다.

[예시 36]

Conjugate 투여와 초음파 노출 후 OKP-GS 세포에서 ROS 생성, Cyt c 방출, DNA 분절화, caspase-3 활성의 측정

OKP-GS 사람 신장 암종 세포는 conjugate 유무에서 3분까지 초음파에 노출되었고, 세포자멸 유도는 세포 모양, ROS 생성 수치, DNA분절화, caspase-3 활성 분석으로 연구되었다.

특이 형광 색소 DCF-DA를 사용하여 세포성 시스템에서 연구되었다. 이 탐지자는 세포내 DCF 형성 후 형광과 세포내ROS를 감지한다. 그러므로, 형광의 증가는 세포내 증가된 ROS 생성을 의미한다.

세포내 ROS 수치의 변화가 DCFH-DA가 형광 DCF로 산화성 변화를 측정하는 것에 의해 확인되었다.

OKP-GS 세포는 curcumin-chlorine conjugate 0.10-1.60mg/mL로 배양되었고, 초음파(1.0 MHz, 1.0-2.0 W/cm²,3분)가 노출되었다.

세포는 PBS로 wash 하였고, 부드러운 scraping으로 수득하였다. 10,000 세포내 DCF 형광은 FACS에 의해 감지되었다.

결과는 형광 강도에 대한 세포 수의 히스토그램 plot으로 얻어졌고, 실험내 각 샘플의 평균 형광은 CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)를 사용하여 분석되었다(아래의 그림 29 참조).

그림 29. DNA 분절화 시험

OKP-GS 세포는 curcumin-chlorine conjugate 0.10-1.60mg/mL로 배양되었고, 초음파(1.0 MHz, 1.0-2.0 W/cm², 3분)에 노출되었다.

세포는 0.5% sarkosyl, 0.5 mg/ml proteinase K, 50mM tris(hy droxymethyl) aminomethane (pH 8.0), 10 mM EDTA를 포함하는 소화 버퍼로 56℃에서 하룻밤 융해되었다. 융해 후, 세포는 56℃, 3시간 동안 RNase A (0.5 /ml) 로 처리되었다. 그 다음, DNA는 로딩 전 phenol/ chloroform isoamyl alcohol (25:24:1) 를 사용하여 추출되었으며 2% agarose gel전기 영동에 의해 분석되었다. agarose gel은 Tris-borate/EDTA 전기 영동 버퍼에서 120 분 50 V에서 실행되었다. DNA의 약 20 μg이 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene xyanol, 40% sucrose을 포함한 6x 로딩 버퍼와 함께 각 웰에 로드되었다. DNA는 ethidium bromide로 염색되었고, 자외선 (260 nm 파장)에서 시각화되었고, 플레이트 사진을 찍었다.

실험은 유사한 결과로 triplicate 반복되었다.

curcumin-chlorine conjugate 와 초음파로 처치된 세포는 명백한 세포막 공포 형성 및 세포 수축이 나타났고, 미미한 형태학적 변화도 동일한 강도에서 초음파 단독이나 conjugate에 노출된 세포에서 관찰되었다.

또한, DNA의 사다리 형성 및 caspase-3 활성은 초음파와 conjugate 둘다 처치된 세포에서 관찰되었다(아래의 그림 30 참조).

그림 30. DNA 분절화 는 agarose gel 전기영동에 의해 분석되었다.

이 결과는 초음파와 conjugate 음향화학적 조합이 OKP-GS 사람 신장 암종 세포에서 괴사뿐만 아니라 세포자멸을 유도하는 것을 제안한다.

[예시 37]

육종 M1 rat에서 광, 음향 노출에서 curcumin-chlorin conjugate 의 항암 효과

활성도의 스케쥴에 따라, 다음과 같은 측면이 연구되었다: 1.0와2,0mg/kg의 용량으로 curcumin-chlorine conjugate, chlorine e6의 육종 M-1의 정맥내 유도에서 괴사 영역. 종양 주사 2시간 후 1 MHz, 0.7 W/cm², 10분에서 초음파로 처치되었다. 1시간 후, 50J/cm²의 용량으로 레이저 치료에 의해 생성되었다. 실험은 피하 이식된 육종 М1이 있는 10마리 흰색 outbred rat 두 그룹에서 시행되었다.

Rat 육종 М1과 정상 조직(반대편 엉덩이 피부)의 축적의 광과민제 dynamic의 추적조사가 컴퓨터 형광 분광 광도법으로 시행되었다. 이 목적을 위해 헬륨-네온 진단레이저 “LHN 633-25”와 레이저 섬유 스펙트럼 분석기가 사용되었다.

curcumin-chlorine conjugate와 chlorine e6의 음향-광 항암효율은 Evans blue에 의한 동물- 종양 운반체의 염색에서 종양에 형성된 괴사 영역의 양적 평가에 의해 광-음향 노출24 시간후에 모니터되었다.

[연구의 재료 및 방법]

[윤리적 문제]

연구는 세계 의학 협회 헬싱키 선언(2000)의 요구 사항을 따르는 동물에 대한 연구의 시행과 계획의 연구 품질 기준, 기존의 국제 윤리뿐 아니라, 2008. 3.28에 승인되고 도입된 GCP의 기술적 법령에 따라 실시되었다.

동물에 대한 모든 조작은 신경이완성진통(근육내로, 체중 100g당 0,2 ml 에 의해 2:1의 droperidole과 phentanile 용액)상태로 둔 후에 실시되었다. 동물은 안락사의 일반적으로 인정되는 방법을 사용하여 희생시켰다.

실시간 모니터링을 위해, 카테터의 약물 말단(진단) 유도 후 매시간마다 종양과 정상 조직에 배치되었다. 약물 축적의 최종 도입, 약물 축적의 강도는 최대 형광에 해당하는 파장에 기록되었다.

인덱스의 획득 디지털 값은 컴퓨터 프로그램 Origin 6.1. 을 사용하여 일반적으로 허용 통계 방법으로 처리되었다. 유의성 수준은 0,05 와 상응하였다.

curcumin-chlorine conjugate 의 PDT의 항종양 효능은 Evans blue를 가진 동물-종양 운반체의 염색에서 종양에 형성된 괴사 영역의 양적 평가를 통해 광노출 후 24시간에 모니터하였다.

이 이유로, 생리적 용액에0,6% Evans Blue 용액이 rat 정맥으로 투여되었다(100g 체중당1 ml).

2시간 후 동물은 일반적으로 허용되는 안락사법을 사용하여 희생되었고, 종양은 절제되어 10% 포르말린에 1 시간 동안 고정되었다. 고정 후, 가장 큰 직경이 종양 결절의 가로 부분이 되었고 사진은 컴퓨터에 연결된 카메라로 얻었다.

PDT 후 형성된 괴사와 생존 종양 영역의 정량적 측정을 위해, 특별한 프로그램을 사용하여 조직-구축학적 종양 슬라이드의 색상의 컴퓨터 분석 법을 사용하였다.

[얻어진 결과]

curcumin-chlorine conjugate 도입 후 처음 5시간과 24 시간 동안 rat의 육종 М - 1과 정상 조직에 형광 수치가 앞서 언급되었다. 4-5시간에, 용량에 관계없이 광과민제 축적 대조도는 종양 vs 정상 조직에서 2-3 배 높았다. 선택도 인자의 추정 (종양 평균 축적 / 정상 조직에 평균축적)은 curcumin-chlorine conjugate 최대 축적이 5~24 검사 시간 동안 도입 후 기록되었다. curcumin-chlorine conjugate PDT는 육종 M-1의 괴사를 유도하였다. 괴사 영역 데이터는 1,0 과2,0 mg/kg 용량으로 chlorine conjugate 의 샘플을 가진 50J/cm² PDT 후 형성된 rat 육종 М1의 조직구축학적 슬라이드로 표현된다. 괴사 영역은 60 ~ 95%였다. 가장 현저한 항종양효과는 curcumin-chlorine conjugate 유도 후 3~4시간 노출에서 기록되었다.

그림. 31 괴사 영역은 1 MHz, 0.7 W/cm², 10 분에서 SDT 와 1,0 과2,0 mg/kg 용량으로 curcumin-chlorin conjugate 의 샘플을 가진 50J/cm² PDT 후 형성된 rat 육종 М1의 조직구축학적 슬라이드로 표현된다.

그림. 32 괴사 영역은 1 MHz, 0.7 W/cm², 10 분에서 SDT 와 1.0 과 2.0 mg/kg 용량으로 chlorine e6의 샘플을 가진 50J/cm² PDT 후 형성된 rat 육종 М 1의 조직구축학적 슬라이드로 표현된다.

여기에 인용된 모든 출판물 (특허, 특허 적용, 저널 기사, 실험실 매뉴얼, 서적, 또는 기타 문서 포함)의 전체 공개는 참고문헌에 의해 통합된다. 이러한 정관에도 불구하고, 신청자는 인용 출판물에서 사용에 의해 제한되는 것으로 하여 용어의 범위를 한정하지 않는다.

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

Claims

광 및 음향 과민제, 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제를 부분 구조로 갖는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트(conjugate)로서,
상기 광 및 음향 과민제는 파이로페오포르바이드(pyropheophorbide), 클로린(chlorin), 박테리오클로린(bacteriochlorin), 포르피린 이성질체, 퍼푸린(purpurin), 클로린 e6(chlorin е6) 및 클로린 p6(chlorin p6)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 자유염기 또는 금속복합체이고,
상기 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제는 커큐민(curcumin), 디메톡시커큐민(demethoxycurcumin) 및 비스디메톡시커큐민(bisdemethoxycurcumin)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나이며,
상기 콘쥬게이트는 하기 화학식(1) 내지 화학식(7)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트.

.....화학식(1)

.....화학식(2)

.....화학식(3)

화학식(4)

..... 화학식(5)

화학식(6)

....화학식(7)
제1항에 있어서, 상기 콘쥬게이트는 광 및 음향 과민제, 혈관형성 억제제 및 타이로신 카이나제 억제제, 표적 리간드 및 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트.
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제2항에 있어서, 상기 표적 리간드는 세포 표면 수용체에 대한 리간드인 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트.
제7항에 있어서, 상기 세포 표면 수용체는 엽산, Her-2/neu, 인테그린(integrin), 상피세포 성장인자 수용체(EGFR), 메타스틴(metastin), ErbB, c-Kit, c-Met, CXR4, CCR7, 엔도쎌린-에이(endothelin-A), 퍼옥시즘 증식인자 활성화 수용체-델타(PPAR-delta), 혈소판 유래 성장인자 수용체 에이(PDGFR A), BAG-1, 형질전환 생장인자 베타(TGF beta) 수용체 및 엽산 수용체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트.
제2항에 있어서, 상기 링커는 디펩타이드, L-알라닌, 페닐알라닌, 글리신, 트립토판, 트리펩타이드, 글루타르산 및 디아미노헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 구성된 것임을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트.
제9항에 있어서, 상기 디펩타이드는 알라닌-알라닌(ala-ala) 또는 글리신-글리신(gly-gly)인 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트.
제9항에 있어서, 상기 트리펩타이드는 글리신-글리신-글리신(gly-gly-gly) 또는 알라닌-글리신-페닐알라닌(ala-gly-phe)인 것을 특징으로 하는 표적 치료에 관한 종양에 선택성이 있는 콘쥬게이트.
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