KR20190083478A - 종양 인식형 광감각제-약물 접합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

종양 인식형 광감각제-약물 접합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양 인식형 광감각제-약물 접합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 종양 조직에 대한 우수한 특이적 활성을 가지며, 종양 조직에 효율적으로 축적될 뿐만 아니라 caspase-3에 의해 DEVD 펩타이드가 절단되어 전구약물 형태에서 약물이 국소적으로 방출되어 적은 전신 독성으로 항암제의 약효를 효과적으로 발휘하는 장점이 있다.

Description

종양 인식형 광감각제-약물 접합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학 조성물{prodrug conjucation for targeted tumor, manufacturing method thereof, pharmaceutical composition for treating and preventing tumor comprising thereof}
본 발명은 종양 인식형 광감각제-약물 접합체에 관한 것으로, 보다 구체적으로 종양 조직으로 선택적인 전달이 가능하며, 항암제의 광자극 선택적 활성화가 가능하며, 광역학적 치료 및 약물에 의하여 종양세포 특이적 치료가 가능한 광감각제-약물 접합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 우리나라를 포함하는 대다수 선진국가의 사망원인 1위로, 인류가 극복해야할 가장 중요한 질환 가운데 하나이다. 수술, 항암화학요법 및 방사선치료 등 암 치료의 3가지 주요 치료수단 이외에 면역치료, 유전자치료 등과 함께 광역학치료(photodynamic therapy, PDT)가 존재한다. 광역학치료란 광감각제(photosensitizer)가 빛과 산소에 의해 화학적 반응을 일으킴으로써 단일한 산소(singlet oxygen)과 이에 의해 유발되는 자유라디칼(free radical)이 환자에게 아무런 고통없이 암세포만 선택적으로 파괴하는 차세대 치료법이지만, 문헌이나 임상 경험이 부족하여 아직 의료인들에게도 정확히 알려지지않은 치료법이다. 그러나 이러한 치료법들은 질병 부위에 작용하여 질병 유발 세포를 제거할 수는 있으나, 정상 부위에도 세포독성이 작용하여, 정상세포의 사멸을 유도하는 부작용이 있을 뿐만 아니라, 암을 완치하지 못하고, 환자에게 심한 고통을 수반하고 있다.
이를 극복하기 위하여 다양한 광역학치료용 나노입자가 개발되어 지난 십수년간 새로운 항암 치료제로써 각광받아 왔으나, 나노입자의 구조가 복잡하여 균일한 제조가 어렵고, 공정이 복잡할 뿐만 아니라, 정상 세포에 대한 독성이 높아, 환자에게 부작용을 발생한다는 단점이 있어 현재 임상적용에 많은 제한이 있는 실정이다.
따라서 종양 세포에 대한 표적화 능력이 우수하고, 정상조직에 대한 부작용이 낮으면서도 종양 치료 효과가 높은 새로운 광역학적 치료를 위한 항암제에 대한 개발이 절실한 실정이다.
대한민국등록특허공보 제10-1756537호
따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 종양 조직에 대하여 특이적 활성을 갖는, 세포 독성이 적은 매우 안정한 종양 인식형 광감각제-약물 접합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 정맥 내 투여시 생리환경 하에서, 안정적인 전구약물 형태인 나노입자 구조로 종양 조직에 축적되고, 광원이 조사되었을 때 종양조직 내에서 과발생하는 caspase-3에 의해 활성화되어 종양세포를 사멸시키는 우수한 치료효과를 갖는 상기 광감각제-약물 접합체를 포함하는 종양 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 광감각제, 펩타이드, 링커 및 항암제가 순차적으로 접합되어 있고, 상기 펩타이드는 상기 광감각제의 일 측에 접합되고, 카스파제(caspase)에 의해 특이적으로 절단가능한 서열로 이루어진 펩타이드이며, 상기 링커는 상기 펩타이드의 일 말단에 접합되며, 상기 펩타이드와 항암제를 연결시키는 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체를 제공한다.
상기 광감각제는 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피린류(phorphyrins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 것 중에서 선택되는 어느 하나이상일 수 있다.
상기 링커는 소수의 탄소, 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 파라-아미노벤질옥시 카르바메이트(PABC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 광감각제는 클로린 e6일 수 있다.
상기 광감각제-약물 접합체는 하기 구조식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 1]
Figure pat00001
상기 종양 인식형 광감각제-약물 접합체는 용액 상에서 자기조립을 통해 나노입자 구조로 형성되어 있는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여 다음 단계를 포함하는 광감각제-약물 접합체의 제조방법을 제공한다.
a) 카스파제에 의하여 절단 가능한 서열인 펩타이드에서, 링커가 접합될 부위를 제외한 나머지 아미노산 잔기의 수소를 알릴기 혹은 알릴옥시카르보닐기로 치환하는 단계;
b) 상기 치환된 펩타이드의 C-말단에 링커를 접합시키는 단계;
c) 상기 링커에 항암제를 접합시킨 약물 접합체를 제조하는 단계;
d) 상기 c) 단계를 통해 제조된 약물 접합체의 치환된 펩타이드로부터 알릴기 또는 알릴옥시카르보닐기를 다시 수소기로 치환하는 탈보호 단계; 및
e) 상기 탈보호된 펩타이드의 N-말단의 아미노기에 항암제를 접합시키는 단계.
상기 a) 단계의 카스파제에 의하여 절단 가능한 서열인 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.
상기 치환된 펩타이드를 제조하는 상기 a) 단계는 구체적으로 서열번호 1의 카스파제에 의하여 절단가능한 펩타이드의 곁사슬의 카르복시기 수소가 알릴기(allyl group)로 치환되고, 곁사슬의 아미노기 수소가 알릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group)으로 치환하여, N 말단 아민기를 아세틸기로 보호화하는 단계인 것일 수 있다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여 상기 광감각제-약물 접합체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 광감각제-약물 접합체를 포함하는 약학 조성물은 종양 부위에 선택적으로 축적되고, 광원으로 조사된 부분에서 종양세포의 선택적 사멸을 유도하며, 종양세포에 존재하는 caspase-3에 의해 광감각제-약물이 절단되어, 전구약물 형태인 광감각제-약물 접합체로부터 약물이 방출됨으로써, 항암 효과를 나타내는 것일 수 있다.
상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 뇌종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 편평상피세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 약학 조성물은 정맥 혹은 종양 내 국소 투여를 통해 주입되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 종양 인식형 광감각제-약물 접합체는 생체 내, 외에서 전구약물형태인 나노입자 구조로 형성되어 존재하기 때문에, 독성이 매우 적다.
또한, 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 종양 조직에 대한 우수한 특이적 활성을 가지며, 종양 조직에 효율적으로 축적될 뿐만 아니라 caspase-3에 의해 DEVD 펩타이드가 절단되어 전구약물 형태에서 약물이 국소적으로 방출되어 항암제의 약효를 효과적으로 발휘한다.
또한 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 별도의 담체를 포함하지 않음에도 불구하고 상술한 종양 조직 특이적 활성과 세포독성 안정화 등의 효과를 발휘하므로, 임상적 사용에 있어서 전혀 제약받지 않는다.
나아가 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 caspase-3에 대한 특이적 활성을 통해 약물을 종양 세포 내에 방출하면서, 광역학 치료효과를 동시에 발휘할 수 있어, 광감각제와 약물을 단독으로 사용할 때보다 저농도로 사용하여도 우수한 항암 효과를 달성할 수 있다.
도 1a는 실시예 1에 따라 광감각제-약물 접합체가 합성되는 과정을 나타낸 반응도이다.
도 1b는 실시예 1로부터 제조된 광감각제-약물 접합체를 역상 고속 액체크로마토그래프로 측정한 결과 그래프이다.
도 1c는 실시예 1로부터 제조된 광감각제-약물 접합체를 ESI-MS로 측정한 결과 그래프이다.
도 2는 Ce6(a), MMAE(b) 및 광감각제-약물 접합체(CDM, c)의 1D 양성자 NMR 결과 그래프이고, 도 2d는 Ce6, MMAE 및 광감각제-약물 접합체(CDM)의 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체(CDM)의 구조를 도시한 도면이다. Ce6은 청색으로, KGDEVD는 흑색으로, PABC는 녹색으로, MMAE는 적색으로 표시하였다.
도 3b는 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체가 자기조립에 의하 나노입자로 형성된 과정을 도시한 도면이다. 본 발명의 광감각제-약물 접합체는 두 소수성 약물과 친수성 펩타이드 링커 구조때문에, 용액상에서 자기조립을 통해 나노입자 형태를 갖게된다.
도 3c는 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체가 in vivo 상에서 활성화되고, 종양세포를 사멸시키는 예방 또는 치료 원리를 도시화한 것이다. 종양 세포에서 광감각제-약물 접합체의 EPR 효과와 광특이적 활성화 경로를 나타낸 것으로, 광감각제-약물 접합체는 꼬리 생쥐 정맥을 통해 주사되어, 종양 조직에 선택적으로 누적된다. 또한 광감각제-약물 접합체는 레이저(671 ㎚)에 의해 처음 활성화된 곳을 비롯하여, caspase-3이 존재하는 부위까지 연속적이고 지속적으로 활성화된다. 즉, 레이저가 조사되거나 조사되지 않은 부위에 존재하는 종양세포에 대하여 MMAE의 세포독성 효과가 발휘되는 것이다.
도 4a는 실시예 1의 광감각제-약물 접합체(CDM)의 유체역학적 직경을 동적광산란법(DLS)로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4b는 MMAE, Ce6 및 CDM 각각의 TEM 이미지이다.
도 5는 실시예 1의 광감각제-약물 접합체가 생리식염수 상에서, 평균 직경이 약 50-200 ㎚인 특이적 나노입자를 형성하였을 때, 이의 SEM(scanning electron microscopy) 이미지이다.
도 6은 용액 상에서 실시예 1의 광감각제-약물 접합체가 나노입자 형태를 형성하였을 때, 상기 형성된 나노입자의 체적에 포함된 실시예 1의 광감각제-약물 접합체 수를 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1의 CDM 나노입자의 임계 미셀 농도(CMC)를 피렌법으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 CDM 혹은 Ce6의 농도에 따른 DMSO의 존재여부에 대한 형광 세기 비율 패턴을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 용액의 조건에 따른 CDM의 자기조립 형성여부를 확인하기 위한 것으로, 다양한 염농도를 갖는 용액에 CDM를 용해시키고, 이로부터 조립된 Ce6의 형광세기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 caspase-3와 15~120분 동안 반응시킨 후의 실시예 1 CDM에 대한 HPLC 결과 그래프이다.
도 11은 실시예 1의 광감각제-약물 접합체과 카스파제-3(caspase-3) 및 카스파제-3 저해제(Z-DEVD-FMK)를 혼합한 용액(CDM+Caspase3+Inh), 실시예 1의 광감각제-약물 접합체와 카스파제-3만 혼합한 용액(CDM_caspase3) 및 실시예 1의 광감각제-약물 접합체만 존재하는 용액(CDM)을 제조하고, 2 시간동안 반응시킨 후, HPLC로 분석한 결과 그래프이다.
도 12는 6시간 동안 배양한 후, SSC7 세포에서 실시예 1의 광감각제-약물 접합체(CDM)의 세포내 분포(intracellular distribution) 및 세포내 축적(cellular uptake)을 확인하기 위해, 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 촬영한 사진이다.
도 13은 SCC7 세포에서 Ce6, CDM, caspase-3과 혼용되어 있는 CDM 및 MMAE의 세포독성을 측정하여 나타낸 그래프이다. *은 아무것도 처리되지 않은 대조군 대비 통계학적으로 유의미하다는 것으로 p<0.01임을 의미한다.
도 14는 DMSO를 첨가하거나 첨가하지 않았을 때, Ce6와 CDM으로부터 일중항 산소(singlet oxygen)의 생성율을 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 15 및 도 16은 나노입자로 형성되지 않았을 때의 활성을 확인하기 위해 50% DMF의 존재하에서, 조사시간 및 조사량에 따른 Ce6과 CDM의 1,3-Diphenylisobenzofuran(DPBF) 농도를 분석한 그래프이다.
도 17은 SCC7 세포에 CDM을 처리하고, 레이저를 조사하기 전(0 h)와 조사한 후(1h, 3h), annexin V-FITC와 PI(propidium iodide)를 사용하여 분석한 공초점 면역형광분석결과이다.
도 18은 활성화된 xaspase-3과 actin에 대한 면역블롯을 검출하기 위하여 Ce6와 레이저를 동시에 처리(Ce6+laser)하거나, 레이저만 처리(laser)하거나, CDM으로만 처리(CDM)하거나, MMAE만 처리(MMAE)하거나 혹은 CDM과 레이저를 동시에 처리(CDM+laser)한 SCC7 세포 각각을 웨스턴블롯으로 분석한 결과이다.
도 19는 세포내에서 caspase-3 활성을 측정하여 나타낸 그래프로, 이는 비색기질(colorimetric substrate)인 Ac-DEVD-pNA를 절단하는 세포 추출물의 활성을 측정한 것이다.
도 20은 Ce6, CDM 및 MMAE를 SCC7 세포에 처리하고, 레이저로 조사하기 전(laser-)과 후(laser+)의 세포 생존력을 측정하여 나타낸 그래프이다. *은 통계적으로 유의미하다는 것으로, p<0.01임을 의미한다.
도 21은 CDM과 Ce6로 SCC7 세포를 처리하고, 레이저로 조사한 후, 이들 각각의 세포독성 효과를 측정하여 나타낸 사진이다. 흑색원은 레이저에 의해 조사된 부위를 나타낸 것이다.
도 22는 꼬리 정맥을 통해 CDM, Ce6을 주입한 종양동물모델의 몸전체를 시간에 따라 촬영하여 나타낸 형광이미지이다.
도 23은 약물이 주입된 후 초과된 시간에 따라 동물종양모델의 종양에서 축적된 형광물질의 양을 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 24는 심장, 신장, 비장, 폐 및 간을 포함하는 다른 기관의 종양을 형광이미지로 촬영한 것이다.
도 25는 종양동물모델의 각각의 종양 및 기관에서 Ce6 형광과 CDM의 형광세기를 정량적으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 26은 동물종양모델의 종양조직에서 Ce6과 CDM의 분포와 축적 정도를 비교하기 위하여 조직학적 염색을 통해 분석한 결과이다. 이때 청색은 DAPI이고, 초록색은 Ce6 영역이다.
도 27은 종양동물모델에서 Ce6과 CDM을 각각 주입하였을 때(1 ㎎/㎏). 시간에 따른 플라즈마 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 28은 Balb/c nu/nu 마우스의 왼쪽과 오른쪽 측면에 SCC7 세포를 주입하여 종양동물모델(Balb/c nu/nu)을 제조하고, 종양 조직의 크기가 도달했을 때, 종양동물모델의 꼬리정맥을 통해 CDM(0.5 mg/kg)을 주입한 후, 오른쪽 종양 조직에만 레이저를 조사한 후 몸 전체의 형광이미지와, 이로부터 형광세기를 측정하여 도시한 그래프이다.
도 29는 상기 종양동물모델(Balb/c nu/nu)의 꼬리정맥을 통해 CDM, Ce6을 0.5 ㎎/㎏ 각각 주입한 후, 오른쪽 종양 조직에만 레이저를 조사하고, 15일이 지난 후, 양 종양조직의 크기를 측정하여 나타낸 그래프와 실제 사진이다.
도 30은 약물을 종양동물모델(C3H)에 주입한 후, 시간에 따라 종양 조직의 크기를 측정하여 나타낸 그래프(a)와 실제 사진(b)이다. 이때, 상기 약물에 따라 각 그룹을 나눌 수 있으며, 구체적으로 다음과 같다:saline 그룹, 레이저(10 min, 25 mW/cm2)만 처리한 Laser 그룹, Ce6(1 mg/kg)과 레이저를 같이 처리한 Ce6+Laser 그룹, CDM(MMAE 농도 기준 0.25 mg/kg)만 처리한 CDM 그룹, MMAE(0.25 mg/kg)만 처리한 MMAE 그룹, CDM(MMAE 농도 기준 0.25 mg/kg)와 레이저를 같이 처리한 CDM+Laser 그룹. 이때, He-Ne 레이저(671 nm)를 사용하였고, 약물을 주입하고 6 시간이 지난 후 10 분동안, 25mW/cm2 조건으로 세 번 조사하였다(n=6).
도 31은 도 30의 실험이 마무리된 후, 각각의 종양동물모델로부터 적출한 종양 조직의 평균무게를 측정하여 도시한 그래프이다.
도 32는 도 30의 종양동물모델 각각으로부터 적출한 종양 슬라이스를 H&E 염색으로 분석한 결과이다. 이때, 바는 150 μm을 나타낸다.
도 33은 도 31의 종양동물모델의 각 그룹으로부터 장기조직을 적출한 후, 조직검사를 실시한 결과이다.
도 34는 시간에 따른 각 종양동물모델 그룹에서의 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 35는 시간에 따른 각 종양동물모델 그룹에서의 체중(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 36은 MMAE(50, 200, 500 ㎍/㎏), CDM(MMAE 기준 50, 200, 500 ㎍/㎏) 투여한 종양동물모델에서, 시간에 따른 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 37은 각 종양동물모델 그룹에서의 비장 무게(㎎)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 38은 각 종양동물모델 그룹으로부터 비장을 적출하고, 이의 림프구(lymphoid tissue)(백색 펄프)의 변화를 분석한 사진으로, 조직학적 분석에서 비장에서 회전 타원형의 백색 펄프는 림프 조직을 나타내는 것이다.
도 39는 CDM 그룹(MMAE 기준 0.5 ㎎/㎏)과 MMAE(0.5 ㎎/㎏) 그룹의 혈장 내 총 백혈구(WBC)의 수를 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 40은 CDM 그룹(MMAE 기준 0.5 ㎎/㎏)과 MMAE(0.5 ㎎/㎏)에서 혈중 호중구 비율(%)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 41은 CDM 그룹(MMAE 기준 0.5 ㎎/㎏)과 MMAE(0.5 ㎎/㎏)에서 aspartate aminotransferase(AST) 및 alanine aminotransferase(ALT)를 포함하는 간 효소의 혈장 수준을 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
광역학치료(Photodynamic therapy, PDT)는 다양한 암을 치료할 수 있는 가장 효과적인 방법으로, 효과적인 광감각제(photosensitzers)의 개발이 십수년간 진행되어 왔다. 화학요법이나 수술과 같은 다른 치료법에 비하여 광역학 치료법(PDT)은 최소한의 침습성과, 간편한 종양 타겟능력, 낮은 독성과 같은 다양한 이점을 갖는다. 보다 발전된 형태의 광감각제 기반 나노입자들이 개발되었으나, 나노입자 특유의 복잡한 구조와 독성으로 인하여 임상단계에서 더 이상 나아가지 못하고 있다.
항암치료에 있어서, 우수한 잠재력에도 불구하고, PDT는 낮은 효율과 독성과 관련된 몇가지 문제들에 직면해있고, 이를 극복하기 위하여 광감각제를 담체와 결합시켜 나노복합체를 형성하거나, 나노입자를 형성하여, 종양 부위에 광감각제가 전달되도록 하는 기술이 개발된 바 있다. 이는 자기조립 광감각제 기반 고분자를 사용하여 종양 부위에 약물을 집증시켜, 효과를 개선하고자 한 것이다. 그러나 상기 치료제는 여전히 나노입자 구조가 복잡하여 다양한 제조공정상의 문제와 신뢰성 문제를 야기하며, 정상세포에 대해서 세포독성을 나타내기 때문에, 사용에 제한이 있다.
현재까지 광감각제는 다양한 종양을 치료할 수 있도록, 강력하고, 광-활성 생체물질을 제조하는데 초점을 맞춰 개발되었기 때문에, 여전히 임상학적 문제점과, 구조의 복잡성에 의해 야기된 문제점들이 개선되지 못하고 있는 실정이다.
광감각제는 빛에 의해 일중항산소(singlet oxygen)를 생성하는데, 빛이 조사되는 영역에 한해서 효과를 나타내므로, 행동반경이 매우 협소하다. 따라서, 빛이 닿지 못하는 부위에 존재하는 종양세포나, 발견하지 못한 종양세포 혹은 크기가 큰 종양세포에 대해서는, 치료효과를 나타내지 못한다는 단점을 가지고 있다. 게다가 격렬한 진동의 빛(intense pulsed light)에 의해, 피부 조직에 여러 부작용이 야기되고, 광감각제가 충분한 세포독성을 나타내지 못하며, 빛이 세포조직을 투과하지 못하므로 다양한 크기의 종양에 대해 치료효과를 발휘하지 못하는 문제점들도 존재한다. 이러한 이유들 때문에, PDT의 치료적 적용이 확장되지 못하고 머리, 목의 종양을 포함한 구강 치료에 대해서만 제한적으로 사용되고 있다.
또한 MMAE(Monomethyl auristatin E)는 우수한 합성 항종양 약물로, 매우 낮은 농도(10-7~10-10 M)에서도 튜불린(tubulin)의 중합반응을 방해하여 세포 분리를 억제하는 역할을 수행한다. 이러한 항종양 효과에도 불구하고, 비특이적 활성과 강한 독성 때문에 약물로 사용될 수 없다는 문제가 있다. 최근 낮은 독성과 우수한 효과를 나타내는 몇몇 항체-MMAE 접합체가 개발되었으나, 여전히 부작용을 발생시키는 문제점을 가지고 있어, 상용화되지 못하고 있다.
나노기술의 발전으로 광역학치료(PDT) 분야에도 비약적인 발전이 이루어져왔다. 특히 광역학치료용 나노입자는 지난 십수년간 우수한 항암치료제로 각광받았다. 그러나 나노입자가 기능적으로 우수함에도 불구하고, 앞서 설명한 바와 같이 복잡성과 독성으로 인해 사용이 매우 제한적이라는 단점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 화학물질이나 담체없이 매우 안정한 새로운 구조의 전구약물 형태의 접합체를 제안하고자 한다.
본 발명의 일 측면은 광감각제, 펩타이드, 링커 및 항암제가 순차적으로 접합되어 있는 것을 특징으로 하며, 상기 펩타이드는 상기 광감각제의 일 측에 접합되고, 카스파제(caspase)에 의해 특이적으로 절단가능한 서열로 이루어진 펩타이드이며, 상기 링커는 상기 펩타이드의 일 말단에 접합되며, 상기 펩타이드와 항암제를 연결시키는 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체에 관한 것이다.
본 발명의 광감각제-약물 접합체는 소량의 빛으로도 약물이 활성화되고, 타겟하는 약물이 효과적으로 방출되어, 주변 암세포를 연속적으로 죽일 수 있는 종양치료제이다. 게다가 광감각제가 효소-특이적 펩타이드와 링커와 접합됨으로써, 상기 광감각제-약물 접합체는 종양 부위에만 세포독성 및 기능을 나타낸다. 나아가 MMAE의 소수성은 나노캐리어가 없는데도 불과하고 Ce6과 상호작용하여, 구형의 나노입자 형태를 갖도록 하여, 생체 내에서 매우 안정적인 구조의 전구약물 형태를 제공할 수 있다. 본 발명의 광감각제-약물 접합체가 자기조립되어 형성된 나노입자는 종래 암 치료용 나노입자를 대체할 수 있는 하나의 대안이 될 것이다.
구체적으로 광감각제는 생리학적 조건 하에서 스스로 나노입자를 형성하는 카스파제에 대해 특이적 활성을 갖는 펩타이드-약물 접합체에 접합되어 있고, 상기 광감각제-약물 접합체가 나노입자 형태로 형성될 때는 caspase-3 특이적 항암활성과 더불어 PDT의 광 반응성 특성에 의한 항암활성을 동시에 나타낸다.
본 발명에 따른 상기 광감각제-약물 접합체는 종양 세포 내로 흡수 및 축적이 용이하고, 수동적으로 종양세포에만 축적되며, caspase-3 특이적 활성을 가지고 있기 때문에, 체내 정상세포에서는 세포독성을 나타내지 않는다. 즉 생체 내에서는 세포독성을 전혀 나타내지 않으므로, 매우 안정적이다. 게다가 극도로 낮은 농도(1-50 nM)를 처리함에도, 동량의 종래 항암제 혹은 PDT 제제에 비해 매우 우수한 항암효과를 나타낼 뿐만 아니라, 소량의 빛으로도 활성화되는 장점을 갖는다.
대부분의 PDT는 특정 암에 대해서만 효과를 나타내므로, 전이되거나 발견되지 못한 암에 대해서는 항암 효과를 발휘하지 못하지만, 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 담체가 없음에도 불구하고, 특정 암세포뿐만 아니라 광범위한 범위의 암에 대해 효과를 나타낸다.
상기 광감각제-약물 접합체는 생체 내에서 자기조립에 의해 나노입자로 형성되기 때문에, 나노입자 형태로 제조하기 위한 별도의 공정을 생략할 수 있으며, 종래 PDT 제제가 가지고 있던 대부분의 문제(임상적용, 부작용, 독성 등)를 해결할 수 있다.
상기 광감각제는 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피린류(phorphyrins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 빛이 조사될 때 활성산소종을 생성하여 세포로부터 산화스트레스를 유발할 수 있는 것이라면 특별히 이에 한정되지 않는다. 다만, 본 발명에 따른 상기 광감각제-약물 접합체를 형성하고, 용액 상에서 다른 물질과의 상호작용을 통해 효율적으로 나노입자를 형성하도록 하기 위해서는 상기 광감각제가 클로린 e6인 것이 가장 바람직하다.
상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 것 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있는데, 가장 바람직하게는 caspase-3에 대해 특이적 활성이 가장 우수한 서열번호 1로 표시되는 펩타이드일 수 있다.
[서열번호 1]
KGDEVD
[서열번호 2]
GDEVD
[서열번호 3]
DEVDG
[서열번호 4]
DEVD
상기 링커는 소수의 탄소, 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 파라-아미노벤질옥시 카르바메이트(PABC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있는데, 바람직하게는 자기 희생적 역할을 통해, 용액 상에서 나노입자의 형성을 효율적으로 이루어지게 하는 파라-아미노벤질옥시 카르바메이트(PABC)일 수 있다.
상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 소수성을 나타내면서 종양에 대해 항암 효과를 갖는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 광감각제-약물 접합체는 바람직하게 하기 구조식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 1]
Figure pat00002
상기 종양 인식형 광감각제-약물 접합체는 용액 상에서 자기조립을 통해 나노입자 구조로 형성되어 있고, 이는 생체 내에서 전혀 세포독성을 나타내지 않는 전구약물 형태이다.
본 발명의 새로운 구조의 광감각제-약물 접합체는 caspase-3에 특이적인 펩타이드(DEVD);와 자기희생적 링커; 자기조립가능한 Ce6; 및 MMAE가 접합되어 형성되었다. 이의 장점은 다음과 같다. (i) 어떠한 종류의 나노담체없이도 자기조립에 의해 구형의 나노입자를 형성하고, 평상시에 세포에 독성을 전혀 나타내지 않는 전구약물 형태로 존재한다. (ii) Ce6에 의해 빛-유도 타겟팅 효과를 가지며, (iii) 종양 세포에 특이적 활성을 가지며, (iv) 자기 희생적 링커를 가지며, (v) 낮은 농도에서도 매우 우수한 항암 효과를 나타낸다.
DEVD는 caspase-3에 의해 절단가능한 펩타이드로 잘알려져있다. 본 발명의 빛-유도 종양 타겟팅 치료는 Ce6에 의해 종양 부위에서 세포자멸을 증가시킬 수 있고, caspase-3가 물질 내에 존재하는 DEVD 시퀀스를 선택적으로 인식할 수 있으며, Ce6과 MMAE 사이 결합을 효소적으로 가수분해할 수 있다. 결과적으로 매우 소량의 빛으로, 전구약물 형태를 활성화하여 항암 효과를 나타내도록 조절할 수 있고, 평상시에는 PDT와 MMAE에 의한 부작용을 전혀 나타내지 않은 안정적인 구조로 존재한다는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 측면은 하기 단계를 포함하는 광감각제-약물 접합체의 제조방법에 관한 것이다.
a) 카스파제에 의하여 절단 가능한 서열인 펩타이드에서, 링커가 접합될 부위를 제외한 나머지 아미노산 잔기의 수소를 알릴기 혹은 알릴옥시카르보닐기로 치환하는 단계;
b) 상기 치환된 펩타이드의 C-말단에 링커를 접합시키는 단계;
c) 상기 링커에 항암제를 접합시킨 약물 접합체를 제조하는 단계;
d) 상기 c) 단계를 통해 제조된 약물 접합체의 치환된 펩타이드로부터 알릴기 또는 알릴옥시카르보닐기를 다시 수소기로 치환하는 탈보호 단계; 및
e) 상기 탈보호된 펩타이드의 N-말단의 아미노기에 항암제를 접합시키는 단계.
본 발명의 광감각제-약물 접합체의 구체적인 공정을 하기 반응식 1에 도시하였으며, 이에 대한 자세한 설명을 기재하였다.
[반응식 1]
Figure pat00003
우선, 상기 카스파제에 의하여 절단 가능한 서열인 펩타이드에서 링커가 접합될 부위를 제외한 나머지 아모산 잔기의 수소를 탈보호가 가능한 알릴(allyl)기와 알릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group)기로 보호하였다(a). 구체적으로 서열번호 1 내지 4 중에서 선택되는 어느 하나의 카스파제에 의하여 절단가능한 펩타이드의 곁사슬의 카르복시기 수소를 알릴기(allyl group)로 치환되고, 곁사슬의 아미노기 수소를 알릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group)으로 치환하여, N 말단 아민기를 아세틸기로 보호화한다.
이후, b) 상기 치환된 펩타이드의 C-말단에 링커를 접합시키기 위해, 상기 치환된 펩타이드에 실온에서 DMF(Dimethyl Fumarate) 존재 하에서 4-아미노벤질알코올 및 EEDQ(2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline)을 처리하고, bis(p-nitrophenyl)carbonate와 DIPEA를 처리하여, 화학식 3의 펩타이드-링커 접합체를 합성하였다.
다음 c) 상기 링커에 항암제를 접합시킨 약물 접합체를 제조한다. 이를 위해 상기 화학식 3의 펩타이드-링커 접합체에 항암제와 HOBt를 무수 DMF 존재 하에서 반응시키고, Pyridine과 DIPEA를 첨가하여 실온에서 10 내지 100 시간 동안 반응시켜, 화학식 5로 표시되는 펩타이드-링커-항암제 약물 접합체를 합성하였다.
여기에 바로 Ce6을 접종시키지 않고, 먼저 d) 상기 c) 단계를 통해 제조된 약물 접합체의 치환된 펩타이드로부터 알릴기 또는 알릴옥시카르보닐기를 다시 수소기로 치환하는 탈보호하는 단계를 거친다.
최종적으로 e) 상기 탈보호된 펩타이드의 N-말단의 아미노기에 광감각제를 접합시킨다. 이를 위해 NHS로 활성화된 광감각제를 상기 접합체와 반응시켜 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체를 제조한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 광감각제-약물 접합체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 종양 세포의 성장을 억제하고, 사멸시켜 효율적으로 암을 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 물질을 개발하고자 노력하였고, 그 결과, 본 발명자들은 평소에는 세포 독성을 전혀 나타내지 않는 매우 안정한 구조로 존재함으로써, 동물의 정상세포 또는 정상조직에서는 전혀 사멸 효과를 발생하지 않다가, 외부 자극이 주어졌을 때 구조적 변화가 야기되어 종양 세포에 성공적으로 흡수 및 축적되면서, 종양 세포를 선택적으로 사멸 및 성장을 억제할 수 있는 효과를 확인하였다.
즉 본 발명의 광감각제-약물 접합체는 종래 다양한 문제점을 가지고 있던 광감각제와 약물을 새로운 구조 및 새로운 구성의 조합에 적용함으로써 평상시에는 매우 안정한 상태로 존재하다가, 빛이 조사되거나 특정 조건에 도달할 경우 구조적 변화를 통해 종양세포 특이적 세포 사멸 및 세포 성장 억제 효과를 나타낸다. 독성이나, 약물 동태학 실험을 수행한 결과, 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 이들 각각을 따로 사용하는 것보다 현저히 우수한 항암 효과와 종양세포 타겟효과를 가지고 있음을 확인하였다.
구체적으로 광감각제를 단독으로 사용할 경우 특정 암에 한해서만 항암효과를 나타낼 뿐이므로 발견되지 암세포에 대해서는 항암효과를 발휘하지 못한다. 또한 빛이 타겟위치까지 닿지 못하는 경우에는 종양 세포에 대한 항암 효과가 발휘되지 못하여, 매우 낮은 치료효과를 가지는 문제가 있다. 또한, 생체 내에서 분해되지 않고 생체 내 모든 세포에 장기간 잔류하기 때문에, 시술 후 행동에 제약이 발생한다는 단점이 있다. 약물을 단독으로 사용할 경우 종양세포 뿐만 아니라 정상세포에도 세포사멸 및 세포성장 억제 효과가 발휘되므로, 정상조직이 괴사하는 등의 부작용이 발생한다.
그러나 본 발명에서는 상술한 문제점을 해결함과 동시에, 현저히 우수한 항암 효과를 종양특이적으로 나타냄을 확인한 바 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광감각제는 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피린류(phorphyrins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 빛이 조사될 때 활성산소종을 생성하여 세포로부터 산화스트레스를 유발할 수 있는 것이라면 특별히 이에 한정되지 않는다. 다만, 본 발명에 따른 상기 광감각제-약물 접합체를 형성하고, 용액 상에서 다른 물질과의 상호작용을 통해 효율적으로 나노입자를 형성하도록 하기 위해서는 상기 광감각제가 클로린 e6인 것이 가장 바람직하다.
상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 것 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있는데, 가장 바람직하게는 caspase-3에 대해 특이적 활성이 가장 우수한 서열번호 1로 표시되는 펩타이드일 수 있다.
[서열번호 1]
KGDEVD
[서열번호 2]
GDEVD
[서열번호 3]
DEVDG
[서열번호 4]
DEVD
상기 링커는 소수의 탄소, 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 파라-아미노벤질옥시 카르바메이트(PABC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있는데, 바람직하게는 자기 희생적 역할을 통해, 용액 상에서 나노입자의 형성을 효율적으로 이루어지게 하는 파라-아미노벤질옥시 카르바메이트(PABC)일 수 있다.
상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 소수성을 나타내면서 종양에 대해 항암 효과를 갖는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 광감각제-약물 접합체는 바람직하게 하기 구조식 1로 표시되는 것일 수 있다.
[구조식 1]
Figure pat00004
상기 종양 인식형 광감각제-약물 접합체는 용액 상에서 자기조립을 통해 나노입자 구조로 형성되어 있고, 이는 생체 내에서 전혀 세포독성을 나타내지 않는 전구약물 형태이다.
앞선 언급한 바와 같이 암을 치료하기 위한 다양한 치료제들이 개발되어 왔으나, 여러 문제들을 동반하고 있어, 장기간 치료가 어려우며, 재발할 가능성이 높다는 문제가 있다. 또한, 부작용이 있거나, 비용이 터무니없이 비싸 환자에게 쓰이지 못하는 단점이 있다.
이를 해결하기 위하여 광역학 치료제제가 개발되어 있으나, 이들은 생체 외 혹은 동물모델에서만 그 안정성과 치료효과가 밝혀졌을 뿐이고, 실질적으로 적용할 경우에는 빛의 조사량, 종양 위치에 따라 많은 제한이 발생한다는 문제가 있다.
다시 말해 본 발명의 조성물은 SCC7 세포 내로 흡수 및 축적이 성공적으로 이루어지고, 종양세포의 성장을 억제하고 사멸을 유도하고 있음을 후술하는 실험예를 통해 확인하였다.
나아가 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 종양동물모델에서 치료 효과를 관찰한 결과, 광감각제-약물 접합체가 항암 치료제로 매우 효과적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 유효성분인 광감각제-약물 접합체는, 각각 광감각제 및 약물이 암의 치료를 위하여 사용된 바 있으나, 여러 가지 문제점들을 내포하고 있었기 때문에, 실질적인 임상 적용이 어려웠다. 그러나 본 발명의 광감각제-약물 접합체는 종양세포에 대하여 특이적으로 항암 효과를 나타내므로, 매우 안정한 매커니즘을 통해 작동되기 때문에, 암을 치료할 수 있을 뿐, 발견하지 못한 암에 대해서도 광범위하게 치료효과를 가지고 있으므로, 단독으로 사용할 때보다 항암효과, 세포 내 흡수 및 축적, 특이성 등이 현저히 우수하다.
또한, 상기 조성물은 암의 성장을 억제하고 암의 사멸을 유도하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하여, 상기 암에 대하여 예방 또는 치료 효과를 가지고 있다.
본 발명의 조성물에서, 유효성분의 함량은 특별히 한정할 필요는 없으나, 1 nM 이상일 수 있고, 바람직하게는 10 nM 이상인 것이면 암 세포의 성장을 억제하고 암세포 사멸을 유도하여, 암의 개선, 치료 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 광감각제-약물 접합체의 암 치료 또는 예방 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
또한 상기 광감각제-약물 접합체를 유효성분으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 광감각제-약물 접합체는 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1 g/kg 이상 포함된다. 광감각제-약물 접합체는 용액 상에서 전구약물 형태인 나노입자로 형성되어, 세포에 전혀 독성을 나타내지 않은 매우 안정적인 상태로 존재하기 때문에 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 광감각제-약물 접합체의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 종양 내 국소 주입 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
상기 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10g/㎏이다.
상기 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험재료 및 방법
1) 실험재료
클로린 e6(Ce6)는 Frontier Scientific Inc(Logan, USA)에서 구입하여 사용하였다. Ac-KGDEVD는 Peptron(대전)에 의뢰하여 합성한 것을 사용하였다. bis(p-nitrophenyl)carbonate, 1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC), 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline(EEDQ), N,N-Diisopropylethylamine(DIPEA), Hydroxybenzotriazole(HOBt), N-hydroxysuccinimide(NHS), p-aminobenzyl alcohol 및 tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0)는 Sigma chemical Co.(St. Louis, MO)로부터 구입하여 사용하였다. Tributyltin hydride (Bu3SnH)와 빙초산(glacial acetic acid)은 Acros(USA)로부터 구입하여 사용하였다. Anhydrous dimethylformamide(DMF), dimethylsulfoxide(DMSO)는 Merck(Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. DMEM 고 포도당 배지, 소태아혈청(FBS), 페니실린-스트렙토마이신(penicillin??streptomycin)은 GIBCO(Grand Island, NY)로부터 구입하여 사용하였다. 다른 모든 화학 물질은 분석 등급의 것을 사용하였고, 추가 정제하지 않았다.
2) 특성분석(Characterization)
실시예 1로부터 제조된 분획물 또는 생성물을 시료로, 고속 액체 크로마토 그래피(HPLC; TFA 0.1 %, UV 214 nm의 증류수 및 아세토니트릴)로 분석하였다. 특히, 분석하고자 하는 시료는 ODS-A 역상 칼럼(YMC, Dinslaken, Germany)과 농도구배 조건(물 및 0.05 % 트리플루오로아세트산을 함유한 CH3CN)으로 semi-preparative HPLC(Shimadzu, Kyoto, Japan)로 정제하였다.
실시예 1로부터 제조된 화학식 a로 표시되는 Ce6-KGDEVD-PABC-MMAE는 proton-NMR 및 MALDI-TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometer)로 분석하였다.
시료의 분자구조는 ChemBioDraw Ultra 12.0(Cambridge Soft Corporation), PyMOL 1.7.0.1(DeLano Scientific) 또는 Discovery Studio 4.0으로 확인하였으며, 실시예 1을 통해 합성된 화학식 a의 Ce6-KGDEVD-PABC-MMAE는 DPBS(Dulbecco 's Phosphate-Buffered Saline solution; 0.1 mg / mL)에 용해시킨 후 분석하였다. 유체역학적 크기와 분포는 532 nm DPSS 레이저를 이용한 동적광산란법(SZ-100, Horiba, Ltd., Japan)으로 측정하였다.
형태를 관찰하기 위해 투과전자현미경(Talos F200X, FEI company, USA)을 사용하였고, 모든 시료는 negative stained microscope image를 위해, 우라닐 아세테이트 1 % 용액으로 처리하였다.
3) 생체 외(in vitro)에서, 형광 퀀칭 분석(fluorescent quenching assays)
실시예 1로부터 합성된 CDM의 임계 미셀 농도(critical micelle concentration)를 확인하기 위해, 피렌(pyrene) 방법을 사용하여 형광 자기-퀀칭 효과를 측정하였다. 간단히 말하면, 0.01-10 μM CDM 용액을 증류수에 용해시킨 후, 0.5 μM 피렌(pyrene)을 첨가하여 24 시간 동안 배양하였다. 다음으로 여기 파장 340 nm으로 분광 광도계(F-7000, Hitachi High-Technologies Corporation, Japan)를 사용하여 372 nm, 383 nm 파장에서 방출 스펙트럼을 획득하였다. 그리고 실시예 1의 CDM 형광을 실시간 광학 이미징 시스템(IVIS Lumina K, PerkinElmer Inc., USA)을 사용하여 농도 의존적으로 조사하였다. 이때 사용된 실시예 1의 CDM 용액인 0.1-10 μM 농도로 CDM이 용해된 수용액이고, 여기에 10 % DMSO 또는 5 % SDS를 첨가한 것을 사용하였다. 형광 이미지는 여기(660 nm) 및 방출(710 nm) 파장에서 얻었다.
4) 생체 외에서( In vitro ) ROS 생성평가
Ce6, CDM으로부터 반응성 산소종(reactive oxygen species)의 양자 수율(quantum yield)을 평가하기 위해, p-nitroso-N, N′-dimethylaniline (RNO)의 광표백을 사용하였다. 보다 구체적으로 Ce6, CDM 용액을 1% 250 μM RNO와 30 mM L-histidine이 혼합된 수용액을 포함하는 1 % of DMSO용매를 이용해 제조하였다. 상기 용액에 671 nm He-Ne 레이저를 조사하고, UV-vis spectrometer를 사용하여 405 nm에서 흡수 스펙트럼을 측정하였다.
5) 생체 외에서( in vitro ) 세포내 흡수 및 세포사멸 평가
SCC7 세포를 사용하여 세포 실험을 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로 상기 세포는 10% 소태아혈청(FBS)과 1% 항생제를 함유한 배지, 37 ℃에서 5% CO2 조건의 배양기를 사용하여 배양하였다. 상기 SCC7 세포에서 Ce6과 CDM의 세포내 흡수 거동을 관찰하기 위하여, 2×105 개의 SCC7 세포를 유리바닥의 35 pi 세포 배양 접시에 접종한 후, 24 시간동안 배양하여 단층을 형성하였다. 이후, 상기 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 10 μM의 Ce6 또는 CDM가 포함된 무혈청 배지를 첨가하여 배양하였다. 배양이 완료된 후, 세포를 세척하고, 2% 파라포름 알데히드 용액으로 고정하였다. 그리고, 세포를 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, Invitrogen, USA)으로 염색하였다.
세포에서 세포사멸을 검출하기 위해서는 상기 고정된 세포에, annexin V-FITC 세포사멸 검출키트(Sigma-Aldrich Co., USA)를 사용하여 측정하였다. 구체적으로 Ce6 또는 CDM를 첨가하여 6 시간동안 배양한 다음, 배지를 교체하고 IR 램프를 사용하여 2.4 J/cm2의 광량으로 세포를 조사하였다. 다음으로 상기 광이 조하된 세포를 트립신으로 처리하고 제조사의 설명서를 참고하여, 세포를 FITC-annexin V와 propidium iodide(PI)로 30 분동안 염색 하였다. 염색된 세포를 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Leica TCS SP8; Leica Microsystems, Germany)을 사용하여 형광 이미지를 촬영하였다. 세포의 형광 이미지를 얻기 위해, He-Ne 레이저(633 nm) 및 UV 다이오드(405 nm)를 CDM 및 DAPI의 여기를 위해 사용하였고, FITC-Annexin V 및 propidium iodide(PI)의 여기를 위해서는 Ar 레이저(458, 514 nm)를 사용하였다.
6) HPLC 분석
CDM이 caspase-3에 대해 특이적 활성을 가지고 있음을 확인하기 위하여, 다양한 효소를 이용하여 HPLC 분석을 수행하였다. 구체적으로 pH 7.4 caspase 측정용 완충액(50 mM HEPES, 0.9 % NaCl, 0.1 % CHAPS, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 10 % glycerol)에 10 μM CDM 용액을 용해하고, 여기에 500 ng/mL caspase-3을 첨가하여 함께 37 ℃에서 15 분 내지 120 분 동안 배양하였다. 마지막으로 상기 배양액을 UV-검출기가 구비되어 있는 RP-HPLC(Agilent 1200 시리즈, Agilent Technology, USA)로 분석하였다.
7) caspase -3 발현의 정량분석
효소 발현을 정량화하기 위하여, caspase-3 비색 분석(colorimetric assay)과 웨스턴 블롯을 사용하였다. 우선 SCC7 세포를 70% 컨플루언스 상태(confluence)가 될 때까지 100 ㎟ 세포 배양 접시에서 배양하고, 약물을 첨가한 후(500 nM) 6 시간동안 추가 배양하였다. 상기 세포에서 배지를 교체한 후, 5 분간, 20mW/cm2로 빛을 조사하였다. 3 시간 더 배양한 후, caspase-3 분석을 위해, 세포를 회수하였다. 면역블롯 분석(immunoblotting assay)을 위해, 일차 항체로 Cell Signaling Technology(Danvers, MA)로부터 구매한 anti-cleaved caspase-3 항체(1 : 650)와 항-PARP 항체(1 : 1000)를 처리한 다음, 2차 항체로 HRP-접합된 항-토끼 IgG와 항-마우스 IgG(1 : 1000; R & D Systems)를 처리해 주었다. 블롯된 막(blotted membrane)을 화학발광 생체분자 이미저(LAS-3000; Fuji Photo Film, Japan)로 분석하였다. caspase-3의 비색 분석을 위해서는 microplate reader(VERSAmaxTM, Molecular Devices Corp., USA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 caspase-3 분석 키트 (Abcam, Cambridge, MA)를 사용하여 측정한다.
8) 세포 외에서, 세포 독성 분석
약물의 세포 독성분석을 위해, cell counting kit-8(CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., USA)을 사용하여 비색 분석으로 평가하였다. 구체적으로 세포 1×104 개를 96-웰 플레이트의 각 웰에 접종하고, 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 세포를 24 시간 동안 다양한 농도의 약물과 함께 배양하였다. 배양액을 제거하고, 상기 플레이트를 PBS로 두 파례 세척하였다. 상기 세포를 10 % CCK-8 용액을 포함하는 배지에서 30 분간 배양한 다음, 마이크로 플레이트 리더기(VERSAmaxTM; Molecular Devices Corp., USA)를 사용하여, 450 nm에서 각각의 흡광도를 측정하였다.
CDM의 광에 대한 세포 독성을 평가하기 위하여, IR 램프를 이용하여 CCK-8을 이용한 비색 분석을 사용하였다. 구체적으로 96-웰 플레이트에 1×104 세포를 접종하고, 24 시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS로 2 회 세척하고 500nM의 약물로 6 시간 동안 배양하였다. 상기 세포에서 배지를 교체한 후, 2.4 J/cm2의 광량으로 빛을 조사하였다. 다음으로 상기 세포를 10 % CCK-8 용액을 함유하는 배지에 첨가하여 30 분 동안 배양하고, 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
조사가 완료된 후, CDM의 연속적인 세포 독성을 확인하기 위해, SCC7 세포를 60 mm 세포 배양 접시에서, 80 % 컨플루언스 상태가 될 때까지 배양한 다음, 상기 세포에 Ce6 또는 CDM(500 nM)을 첨가하여 6 시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 상기 세포 배양액을 회수하고, 세포 내로 흡수된 후 배지를 교체하였다. 배양접시에서 작은 원으로 표시한 부분에만 5 분 동안 20 mW/cm2 광량의 레이저를 조사하였다. 그리고 나서 상기 세포를 1 분간 트리판 블루(trypan blue)로 처리하였다.
9) 동물모델에서 종양억제 효과 평가분석( in vivo )
생체 내 동물실험을 수행하기 위하여, 우선 5 주령의 BALB/c 누드 마우스를, 동종이식 종양동물모델(BALB/c)로 사용하였다. 종양은 1×106 SCC7 세포와 80 ㎕의 배지를 포함하는 세포 현탁액을 제조하고, 이를 호흡을 통한 운동의 영향이 적은 BALB/c 누드 마우스의 측면에 대퇴골에 주입하여 종양동물모델(BALB/c)을 제조하였다. 그런 다음 동물모델에서 종양이 약 80 mm3 크기로 자랄때까지 약 8 일 동안 사육하였다. 모든 동물 실험은 KIST 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 가이드 라인과 관련 법규에 따라 수행되었고, IACUC에 의해 모든 실험 공정을 승인받아 진행하였다.
10) 생체 내에서( in vivo ) 생물학적 분포도( biodistribution ) 분석
생체 내에서 생물학적 분포도를 평가하기 위하여, 실시간 광학 이미징 시스템을 통해, 근적외선 형광이미징(NIR fluorescent imaging)을 분석하였다. 종양동물모델에 0.5 mg/kg의 CDM 또는 Ce6를 각각 꼬리정맥을 통해 투여하고, 660 nm의 여기 필터 및 710 nm의 방출 필터를 사용하여 48 시간 동안 마우스의 형광 이미지를 측정하였다. 이후, 상기 약물이 처리된 종양동물모델은 48 시간이 지난 후에 안락사한 다음 장기를 적출하여, 형광 분석을 실시하였다.
11) 생체 내에서 caspase -3 발현 분석
9) 방법에서와 같이, 다양한 약물이 각각 투여되어 제조된 종양동물모델은, 광역학 치료가 완료된 후 caspase-3의 생체내 발현정도를 모니터링하였다. 이를 위해 caspase-3에 특이적으로 반응하여 활성화되는 프로브(Cas3p; Cy5-GDEVD-BHQ3)를 사용하여 NIR 형광이미징을 얻었다.
종양동물모델에 0.25 mg/kg의 CDM을 꼬리정맥을 통해 주입한 후, 6 시간이 지난 다음 671 nm 레이저를 조사하였다. 3 시간 후에, Cas3p를 주입하고, 이의 생물학적 분포도를, 640 nm의 여기 필터 및 710 nm의 방출 필터를 통해 측정하였다.
12) 생체 내에서( in vivo ) 약동학적 분석
생체 내에서 약동학적(pharmacokinetic)인 특성을 비교 분석하기 위하여, 9)에서의 종양동물모델 제조과정 중에서, BALB/c 누드 마우스 대신 C57/BL6 마우스를 사용하여 종양동물모델을 제조하였다는 점을 제외하고는 모두 동일하게 제조하였다.
상기 종양동물모델(C57/BL6)에 CDM과 Ce6을 1 ㎎/㎏ 농도로 각각 동물모델의 꼬리정맥을 통해 주입하였다. 주입 후, 종양동물모델(C57/BL6)으로부터 꼬리정맥을 통해 12 시간까지 매 20 ㎕의 혈액을 소정 시간마다 회수하였다. 회수한 혈액은 그 즉시 0.5 mg/kg 저분자량-헤파린 용액(DMSO:DIW 공용매)으로 5배 희석하였다. 그런 다음 이를 96- 웰 플레이트로 옮겼다. 660 nm 여기 필터와 710 nm 방출 필터가 구비된 실시간 광학 이미징 시스템을 사용하여 근적외선 형광정량 분석(NIR fluorescence quantification)을 통해 혈액 내 약물의 형광강도를 측정하였다. 검출된 형광강도로부터 약물의 농도를 분석하기 위해서는, 약물의 농도에 따른 검량선을 계산하고, 이를 통해 계산하였다. 본 실험에서 검량선은 비처리된 종양동물모델로부터 회수한 혈랙을 사용하여, 상기 혈액 내에 약물의 농도가 10-8~10-4 범위로 하여, 작성되었다.
13) 생체 내에서( in vivo ) 독성 분석
CDM 또는 MMAE를 처리한 마우스로부터 중성구 비, 총 호중구수(ANC), 총 백혈구 수(WBC), AST 및 ALT와 같은 혈액 독성 지표를 측정하여 동물모델에서 독성여부를 평가하였다.
종양동물모델의 체중 변화는, 약물을 처리한 후, 매일 측정하였다. 동물모델에서 특성을 평가하기 위하여, 마우스(7 주령, 수컷)에 0.5 mg/kg의 CDM과 MMAE를 각각 꼬리정맥을 통해 주입하였다. 5 일이 지난 후, 종양동물모델의 꼬리로부터 혈액 샘플(400 μL)을 수집하였다. 모든 혈액 샘플은 4 ℃에서 보관하였고, SCL(서울 임상 실험실, 한국)에 의해 하루 내에 분석하였다.
14) 생체 내에서( in vivo ) 항종양 효과분석
생체 내에서 치료효과를 평가하기 위하여, 종양동물모델로부터 종양부피를 14일동안 측정하였다, 종양조직이 약 80 mm3로 자랄 때, 종양동물모델은 다음과 같이 총 6 그룹으로 제조하여, 평가하였다.
생리 식염수가 처리된 Saline 그룹, 레이저만 처리된 Laser 그룹, 레이저와 Ce6(1 mg/kg)이 동시에 처리된 Ce6+Laser 그룹, MMAE(0.25 ㎎/kg)만 처리된 MMAE 그룹, CDM(MMAE 기준 0.25 mg/kg)만 처리된 CDM 그룹 및 CDM(MMAE 기준 0.25 mg/kg)과 레이저가 동시에 처리된 CDM+Laser 그룹
각 그룹별로 약물을 꼬리정맥을 통해 주사하고, 671 nm He-Ne 레이저를 이용하여 CDM+Laser 그룹과 Ce6+Laser 그룹에 광을 조사한 후(6 시간마다 25 mW/cm2, 10 분간)하였다. 다음으로 2 일마다 종양의 크기를 측정하였다.
15) 생체 외( ex vivo )에서 조직학적 분석
생체 내 동물모델로부터 적출된 장기의 조직학적 분석을 위하여, 해당하는 항종양 성장 분석을 수행한 후, 회수된 종양동물모델로부터 종양 조직과 장기 조직을 적출하였다. 적출된 조직은 PBS로 세척한 후, 4 % 파라 포름알데히드 용액으로 고정하였다. 이후 H&E(hematoxylin and eosin)으로 조직 슬라이드를 염색하고, 상기 염색된 조직을 파라핀에 봉입시킨 뒤, 4 ㎛ 두께의 슬라이스로 절단하여 슬라이드 유리 위에 올려두었다. 상기 조직에서 파라핀을 제거하고, 광학 현미경으로 분석하기 위해 H&E로 염색하였다(BX 51; Olympus, USA). 종양 조직에서 CDM 또는 Ce6가 축적되었는지를 관찰하기 위하여, 정맥 주사한 후, 24 시간이 지났을 때 종양조직을 적출하였다. 조직은 10 μm 두께로 잘라, 동결 슬라이스를 만든 후, 공초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다.
16) 통계 분석
각 그룹간의 유의미한 차이를 통계적으로 분석하기 위하여, 일원 분산 분석(one-way ANOVA test)을 사용하였다. P 값이 0.05 미만이면 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다(도면에 별표로 표시함)
실시예 1. Ce6 - KGDEVD - MMAE 접합체( CDM ) 합성.
본 발명에서의 가설을 입증하기 위해, Ce6을 갖는 caspase-3 특이적 MMAE 프로드러그와 자기희생적 링커를 합성하여, 광감각제-약물 접합체를 제조하였다. 합성과정은 하기 반응식 1에 나타낸 일련의 과정을 통해 수행되였다(도 1a 참조).
[반응식 1]
Figure pat00005
우선, (Ac)-KGDEVD에 링커를 접합시키기 위해, (Ac)KGDEVD (1 g, 1.10 mmol), p-aminobenzyl alcohol(0.67 g, 2.20 mmol, 2 eq)와 EEDQ(0.27 g, 2.20 mmol, 2 eq)를 anhydrous DMF(30 mL)에 혼합하여, 실온에서 밤새동안 반응시켰다. 상기 반응액에 디에틸에테르(diethyl ethe)에 부어, 침전물을 형성한 다음, 건조시켰다(수율 99.6%). 이후 상기 침전물을 용해시키고, bis(p-nitrophenyl)carbonate(5 eq)가 용해된 DMF(50 mL)와 DIPEA(3 eq)가 용해된 DMF(50 mL)화 함께 상온에서 1 시간동안 반응시켰다. 이를 다시 디에틸에테르(diethyl ethe)에 부어 침전시켜 화학식 3의 펩타이드-링커 접합체를 합성하였다(수율 91.4%).
상기 화학식 3의 펩타이드-링커 접합체에 MMAE를 접합시키기 위해, 상기 화학식 3의 펩타이드-링커 접합체 침전물을 건조하여 분말형태(653 mg)로 준비하고, 여기에 MMAE(478 mg, 1.2 eq)와 HOBt(56 mg, 0.75 eq)를 anhydrous DMF(40 mL) 하에서 혼합하였다. 이후 Pyridine(10 mL)과 DIPEA(193 μL, 2 eq)를 첨가하고, 실온에서 72 시간동안 교반하여, 반응혼합물을 얻었다. 이를 농축하고, 디에틸에테르(diethyl ethe)에 부어 침전시켜 화학식 5로 표시되는 펩타이드-링커-MMAE 접합체를 합성하였다.
상기 화학식 5로 표시되는 펩타이드-링커-MMAE 접합체에서 펩타이드는 아미노산 잔기의 수소가 알릴기 혹은 알릴옥시카르보닐기로 보호된 상태이므로, 이를 탈보호하기 위해, anhydrous DMF에 용해하고, 0 ℃에서 교반하였다. tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0)(0.5 eq), tributyltin hydride(17.3 eq), 빙초산(glacial acetic acid)(20 eq)을 질소 분위기 하에서 첨가하고, 2시간 동안 반응시킨 후, 용액을 여과하였다. 여과된 용액을 차가운 디에틸에테르(diethyl ethe)와 혼합하여, 탈보호된 KGDEVD-PABC-MMAE를 침전시켰다. 이후 NHS로 활성화된 Ce6를 DIPEA가 용해되어 있는 anhydrous DMF 용액에 탈보호된 KGDEVD-PABC-MMAE과 함께 첨가하여 반응시켜, 화학식 a의 Ce6-(Ac)KGDEVD-PABC-MMAE를 합성하였다. 상기 합성된 Ce6-(Ac)KGDEVD-PABC-MMAE를 C18 플래시 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 이때 용리액은 0.05 % trifluoroacetic acid(TFA)와 acetonitrile(ACN)(10 내지 50% 농도구배) 용액을 사용하였다.
상기 DEVD는 caspase-3 특이적으로 분해되는 기능을 가지며, 빛(radiation)과 같은 외부 요인에 의해 세포자멸괴사(apoptosis) 또는 종양세포에서 선택적으로 분해되는 특성이 있다. 또한 MMAE와 Ce6은 종래 PDT 기반의 치료가 가지고 있던 복잡성과 독소루비신의 퀀칭 효과의 한계점을 해결하기 위한 구성으로 채택되었다. 보다 구체적인 광감각제-약물 접합체 구성은 도 3a에 나타내었다.
이러한 일련의 구성의 조합으로 설계된 광감각제-약물 접합체는 PDT의 한계점을 극복할 수 있는 새로운 구조로 설계되었고, 전구약물(prodrug) 기반의 자기조립형 나노입자 형태의 물질이라 할 수 있다(도 3b 참조).
이는 소량의 빛으로도, 광감각제-약물 접합체를 특이적이고 연속적으로 활성화할 수 있고, 종양세포에서만 특이적으로 MMAE가 방출되므로, 효과적인 치료 또는 예방효과를 나타낸다. 세포자멸(spoptosis)을 유도하는 활성산소종(ROS)와 MMAE는 PDT의 치료적 효과를 증폭시키고, 평소에는 독성이 없다가 특정 세포에서 활성화되는 본원발명의 광감각제-약물 접합체의 새로운 형태는, 종래 PDT가 직면하고 있던 문제점들을 대부분 해결할 수 있다(도 3c).
본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 양 말단에 위치한 두 소수성 화합물과 친수성 펩타이드 링커를 포함하는 양친성 구조로, 용액상에서 자기조립에 의해 나노입자 형태를 형성한다. 상기 광감각제-약물 접합체의 분자 구조는 Ce6, caspase-3에 의해 절단가능한 펩타이드(DEVD), 자기 희생적 링커 및 MMAE으로 이루어져 있다. 이중에서 Ce6은 접합체를 형성하기 전, 세 개의 카르복시산을 갖는 방향족 고리에 네 개의 변형된 피롤 단위체를 가지고 있었으나, 접합체를 형성하고 난 후에는 두 개의 카르복시산만 포함되어 있다. 이로 인해 광감각제-약물 접합체는 물리 화학적 성질을 유지할 수 있다.
한편 DEVE는 물에 잘 녹는 친수성 펩타이드로 구성되어 있으므로, 접합체가 용액 상에서 나노입자로 자기조립될 때 중요한 역할을 수행한다.
적절한 길이의 링커는, 프로드러그의 특성을 유지함에 있어서 caspase-3과 DEVD 사이에 입체장애(steric hindrance)를 피할 수 있게 해준다. MMAE는 PDT 분야에서 주목받지 못했던 강력한 항암제였으나, 본 발명에서 새로운 전구약물 형태로 새롭게 도입되었다. 이는 일반적인 펩타이드 구조와 유사하나, 자기조립에 의해 나노입자를 형성하기 매우 적합한 소수성을 나타낸다.
실험예 1. 실시예 1로부터 제조된 광감각제 -약물 접합체( CDM )의 특성분석
생체 외(in vitro) 실험에서, 최종 생성물을 다양한 방법을 통해 동정하였다. 각 단계에서 합성된 생성물을 역상 고속 액체크로마토그래피(reverse phase-high performance liquid chromatography; RP-HPLC)로 정제하고, 순도를 확인하여 도 1b에 도시하였다. 또한 상기 광감각제-약물 접합체(CDM)의 분자량은 ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry)(m/z calculated: 2131.1, found: 2131.1 Da)로 측정하였고, 도 1c에 나타내었다.
다음으로, 도 2는 Ce6(a), MMAE(b) 및 광감각제-약물 접합체(CDM, c)의 1D 양성자 NMR 결과 그래프이고, 도 2d는 Ce6, MMAE 및 광감각제-약물 접합체(CDM)의 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이를 통해 Ce6 또는 MMAE와는 달리, 실시예 1로부터 합성된 광감각제-약물 접합체는 물, PBS, 생리식염수 모두에 잘 용해되는 것을 확인하였다.
실험예 2. 용액 상에서, 광감각제 -약물 접합체의 자기조립 나노입자 형성
광감각제-약물 접합체(CDM)는 자체적으로 나노입자를 형성할 수 있기 때문에, 담체가 필요없다는 장점을 갖는다. 특히 본 발명의 광감각제-약물 접합체(CDM)은 PDT와 프로드로그의 특성을 유지하면서 안정적으로 나노입자를 형성한다는 것에 큰 강점이 있다. 상기 펩타이드는 아스파르트 산(aspartic acid; Asp)과 글루탐산(glutamic acid; Glu)로 이루어져, 적절한 모이어티(moiety)를 가지고 있다. 이로 인해 상기 광감각제-약물 접합체는 두 불용성 약물을 포함하고 있음에도 불구하고 양친성 특성을 갖게되는 것이다.
도 4a는 실시예 1의 광감각제-약물 접합체(CDM)의 유체역학적 직경을 동적광산란법(DLS)로 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 4b는 MMAE, Ce6 및 CDM 각각의 TEM 이미지이다.
도 4a, b에 나타난 바와 같이, 약물-약물 접합된 물질인 광감각제-약물 접합체는, 독특고, 개선된 특성에 의해 성공적으로 자기조립을 통해 나노입자 형태를 갖게되고, 이때 평균 직경은 90.8±18.9 nm이다. 상기 광감각제-약물 나노입자가 나노사이즈인 것은, 생체내에서 EPR 효과에 의하여 종양 조직에서 잘 축적될 수 있다는 장점을 갖는다(도 4a).
또한 자기조립된 광감각제-약물 접합체(CDM)가 용액 상에서 나노입자로 형성되었을 때, 이의 형태(morphogy)를 TEM(transmission electron microscopy)으로 확인한 결과, 생리식염수 상에서 Ce6 및 MMAE에 비해 비교적 원형의 균질한 형태를 갖는 나노입자로 형성되어 있음을 알 수 있다(도 4b).
도 4b의 TEM 이미지 분석 결과에 따르면, 자기조립화된 나노입자 기반의 광감각제-약물 접합체는 평균직경이 약 52.6 ± 20.0 nm이고, 균일한 크기 분포를 갖고 있음을 확인하였다.
이에 반해 Ce6 및 MMAE 각각을 단독으로 물에 용해시킬 경우, 물에 불용성이고, 좋지 않은 물리적 특성을 가지고 있으므로, 일부만 나노입자로 형성될 뿐, 그 외는 나노입자로 형성되지 못함을 확인하였다. 상기 Ce6 및 MMAE을 함께 물에 용해시킨 경우에는 강력한 반데르발스 상호작용에 의하여, 물속에서 자연스럽게 결정을 형성하게 된다.
도 5는 실시예 1의 광감각제-약물 접합체가 생리식염수 상에서, 평균 직경이 약 50-200 ㎚인 특이적 나노입자를 형성하였을 때, 이의 SEM(scanning electron microscopy) 이미지이고, 도 6은 용액 상에서 실시예 1의 광감각제-약물 접합체가 나노입자 형태를 형성하였을 때, 상기 형성된 나노입자의 체적에 포함된 실시예 1의 광감각제-약물 접합체 수를 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 5 및 도 6에 따르면, 광감각제-약물 접합체는 나노입자를 형성하는데 반해 Ce6 및 MMAE를 단독으로 사용할 경우 나노입자로 형성되지 않는 것을 확인하였다.
나노입자를 기반으로 하는 순수 전구약물(prodrug)의 경우, 약물-약물 접합체로 제조된 나노입자를 기준으로, 이론적인 캡슐화 효율이 100%이다. 이는 염화 나트륨(0.9% 생리식염수)을 제외하고는 다른 물질이 포함되지 않는다고 가정하였기 때문이다. 그렇기 때문에 캡슐화 효율(encapsulation efficiency value)이라는 것은 약물-약물 접합체를 제외한 새로운 구조의 접합체에서는 무의미하다.
따라서 본 발명에서는 Discovery Studio와 PyMOL dynamic simulation을 통해 확인하였고, 이에 따르면, 하나의 나노입자에는 평균 20,641 개의 광감각제-약물 접합체 분자(CDM molecules)가 포함되어 있음을 확인하였다. 즉 본 발명에 따른 CDM이 자기조립을 통해 형성된 나노입자 하나가 종양에 도달할 경우, 약 2 만개의 광감각제-약물 접합체 분자가 종양 조직내에 전구약물 형태로 축적됨을 알 수 있다.
본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체가 용액상에서 나노입자로 자기조립될 때, 임계 미셀 농도(CMC)를 계산하고자 하였다.
도 7은 실시예 1의 CDM 나노입자의 임계 미셀 농도(CMC)를 피렌법으로 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 용액 상에 약 1.382 μM 농도부터 나노입자로 자기조립되는 것을 확인하였다. 이는 종래 CDM 나노입자의 임계 미셀 농도가 자기조립 나노입자를 생성하기 위해 요구되는 농도보다도 현저히 낮은 농도임을 알 수 있다.
도 8은 CDM 혹은 Ce6의 농도에 따른 DMSO의 존재여부에 대한 형광 세기 비율 패턴을 측정하여 나타낸 그래프로, 상기 DMSO의 존재여부에 대한 형광 세기 비율 패턴은 간접적으로 나노입자의 형성을 평가할 수 있게한다. 즉, PDT 제제로 사용됨에 있어서, 입자의 치밀화(densification)에 따라 방출되는 빛의 양이 달라지게 된다. Ce6의 조립을 고려하여, 실시예 1의 광감각제-약물 접합체를 용액상에서 구조적 변화를 야기하기 위하여 10 % DMSO를 비율별로 처리하였다. 그 결과, CDM은 용액에 따라 구조적 변화를 동반하고 있음을 알 수 있는데 반해, Ce6은 구조적 변화가 나타나지 않음을 알 수 있다. 즉 본 실험을 통해 CDM이 용액상에서 치밀한 구조의 나노입자 형태로 존재함을 다시금 확인하였다.
도 9는 용액의 조건에 따른 CDM의 자기조립 형성여부를 확인하기 위한 것으로, 다양한 염농도를 갖는 용액에 CDM를 용해시키고, 이로부터 조립된 Ce6의 형광세기를 측정하여 나타낸 그래프이다. 이에 따르면 강한 이온강도 때문에 높은 염화 나트륨의 환경에서는, 실시예 1의 광감각제-약물 접합체가 나노입자로 잘 형성되지 못하고 형광세기가 감소하고 있음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 CDM은 소수성 혹은 양친성에 기인하여 자기조립을 통해 나노입자로 형성됨을 알 수 있다.
실험예 3. 실시예 1의 광감각제 -약물 접합체( CDM )와 caspase -3 특이성 평가
본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 자기조립을 통해 나노입자로 형성되었을 때, 프로드로그로 기능을 발휘한다는 것에 큰 장점이 있다. 생체 내, apoptotic 영역과 유사한 조건인 caspase-3 완충액을 준비하고, 여기에 본 발명의 광감각제-약물 접합체를 120분동안 처리하였을 때의 변화를 관찰하여, 이를 평가하고자 하였고, 그 결과를 도 10에 도시하였다.
도 10은 caspase-3와 15~120분 동안 반응시킨 후의 실시예 1 CDM에 대한 HPLC 결과 그래프로, 이에 따르면 실시예 1의 광감각제-약물 접합체는 2시간 이내에 caspase-3에 의해 효과적으로 활성화되었음을 알 수 있다. 카스파제-3 특이적 펩타이드의 시퀀스는 DEVD로 잘 알려져 있으므로, 이를 HPLC 분석을 통해 성공적으로 확인하였다.
도 11은 실시예 1의 광감각제-약물 접합체과 카스파제-3(caspase-3) 및 카스파제-3 저해제(Z-DEVD-FMK)를 혼합한 용액(CDM+Caspase3+Inh), 실시예 1의 광감각제-약물 접합체와 카스파제-3만 혼합한 용액(CDM_caspase3) 및 실시예 1의 광감각제-약물 접합체만 존재하는 용액(CDM)을 제조하고, 2 시간동안 반응시킨 후, HPLC로 분석한 결과 그래프이다.
도 11에 나타난 바와 같이 카스파제-3 저해제(Z-DEVD-FMK)를 처리한 경우에는 CDM이 완전히 카스파제-3에 의해 활성화되지 못한 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 CDM이 종양 조직에서 카스파제-3에 의해 특이적으로 분해되어, 활성화된다는 것을 알 수 있다.
도 12는 6시간 동안 배양한 후, SSC7 세포에서 실시예 1의 광감각제-약물 접합체(CDM)의 세포내 분포(intracellular distribution) 및 세포내 축적(cellular uptake)을 확인하기 위해, 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 촬영한 사진으로, 이에 따르면 실시예 1의 광감각제-약물 접합체(CDM)는 SCC7 세포에 50 ㎍/㎖의 농도로 0-24 시간 동안 처리하였을 때, 3 시간내에 세포 내에 충분한 양의 CDM이 축적되어 있음을 확인하였다.
본 발명에 포함되어 있는 항암제인 MMAE는 세포질에 분포하는 tubulin을 표적으로 하고 있으므로, 본 발명에 따른 CDM과 Ce6의 활성부위는 유사할지 모르나, Ce6으로 처리한 SCC7 세포에서는 형광이 세포의 핵부분을 제외하고, 전체 세포에서 관찰되고 있으므로, 세포 내로 완전히 흡수되지 못하고 있음을 확인한 바, Ce6을 단독으로 처리할 경우 충분한 항암 효과를 종양 세포에 전달하지 못하는 단점이 있다.
도 13은 SCC7 세포에서 Ce6, CDM, caspase-3과 혼용되어 있는 CDM 및 MMAE의 세포독성을 측정하여 나타낸 그래프이다. *은 아무것도 처리되지 않은 대조군 대비 통계학적으로 유의미하다는 것으로 p<0.01임을 의미한다.
도 13을 살펴보면 CCK 시약을 사용한 세포 생존력 시험에서, caspase-3과 혼용하여 CDM을 10 nM 처리한 경우에는 50.1% 종양 세포의 성장이 효과적으로 억제되었음을 확인하였다. 이에 반해 caspase-3이 없는 비활성화된 CDM이 10 nM 처리된 경우에는 전구약물 형태로 존재하기 때문에 효과가 거의 나타나지 않음을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 CDM은 평상시에는 독성이 전혀 없는 전구약물 형태로 존재하기 때문에 SCC7 종양세포에 독성을 나타내지 않다가, 빛이 조사되거나 caspase-3이 존재하면 활성화되어 종양 세포의 사멸을 유도한다는 것을 확인하였다.
이에 반해 Ce6만 단독으로 처리한 경우, 상대적으로 높은 농도에서만 종양세포 억제효과를 나타낼 뿐, 10 nM에서는 전혀 효과를 나타내지 못하고 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 CDM을 caspase-3이 존재하는 환경에서, 서로 다른 낮은 농도(50, 200, 600 nM)로 처리할 경우에는, 세포 생존율이 각각 42.5, 32.5 및 25.5 %로 낮아지는 것을 확인하였다. MMAE 자체의 항암효과는 분명하며, CDM을 저농도로 처리하였을 때는 MMAE와 유사하거나 더 효과적임을 알 수 있다.
실험예 4. 실시예 1의 광감각제 -약물 접합체( CDM )와 Ce6 의 ROS 생성 효과 비 교
종래 PDT 분야에서, Ce6는 화학적 결합 또는 강한 π-π 상호작용에 의해 기능을 상실할 수 있는 문제가 있을 수 있다. 이에 본 발명에 따른 CDM의 ROS를 생성하는 능력을 조사(irradation) 시간과 조건을 달리하여 비교 평가하였다.
먼저, Ce6, CDM의 ROS 생성능력을 비교하였고, Ce6과 CDM으로부터 세포 독성 반응성 산소종은 p-nitroso-N,N'-dimethylaniline(RNO)의 표백을 측정함으로써 분석하였다.
도 14는 DMSO를 첨가하거나 첨가하지 않았을 때, Ce6와 CDM으로부터 일중항 산소(singlet oxygen)의 생성율을 분석하여 나타낸 그래프이고, 이에 따르면 CDM의 경우, 소수성 MMAE이 CDM이 용액상에서 자기조립에 의해 나노입자를 형성하는데 도움을 줄 뿐, Ce6의 ROS 능력에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 또한 동량의 Ce6에 비해 CDM으로 처리하는 것이 생성되는 일중항 산소가 더 높다는 것을 확인하였다. 구체적으로 CDM의 경우에 ROS 생성효율이 83.1~58.2%로 높게 유지되고 있음을 알 수 있다.
도 15 및 도 16은 나노입자로 형성되지 않았을 때의 활성을 확인하기 위해 50% DMF의 존재하에서, 조사시간 및 조사량에 따른 Ce6과 CDM의 1,3-Diphenylisobenzofuran(DPBF) 농도를 분석한 그래프이다. 이를 통해 Ce6과 CDM 모두 조사량에 따른 차이는 거의 없는 것으로 확인되었다.
또한 Ce6 및 CDM은 레이저 출력(0-200 mW/㎠)에 따른 ROS 생성 능력을 비교하였을 때, 동일 조건에서는 유사하다는 것을 확인하였다.
종양 세포에 대한 치료효과를 확인하기 위하여, 광조사에 의한 CDM의 세포 독성 행동을 annexin V 세포 염색을 통해 공초점레이저 주사현미경으로 확인하였다. 도 17은 SCC7 세포에 CDM을 처리하고, 레이저를 조사하기 전(0 h)와 조사한 후(1h, 3h), annexin V-FITC와 PI(propidium iodide)를 사용하여 분석한 공초점 면역형광분석결과이다.
우선, CDM을 처리한 SCC7 세포에서 3 시간 동안 세포사멸이 없음을 나타내는 PI(propidium iodide) 형광염료의 신호가 관찰되지 않다가, 빛이 배양된 접시에 부딪히면서 세포의 색깔이 변화하기 시작했다. 이는 흡수되는 처음 3 시간동안에는 세포 죽음이 없다가, 빛이 세포 내부에 존재하는 CDM을 자극하였을 때 세포사멸이 시작되었음을 의미한다. 이를 통해 본 발명에 따른 CDM은 SCC7 세포에 신속하고 효율적으로 흡수 및 축적되고, 적은 빛으로도 세포사멸을 유도함을 확인하였다.
본 발명에서 CDM 처리된 세포가 빛이 조사된 후, 세포사멸상태(apoptotic condition)가 되었을 때, caspase-3 상향조절 여부를 관찰하고자 하였다. 도 18은 활성화된 xaspase-3과 actin에 대한 면역블롯을 검출하기 위하여 Ce6와 레이저를 동시에 처리(Ce6+laser)하거나, 레이저만 처리(laser)하거나, CDM으로만 처리(CDM)하거나, MMAE만 처리(MMAE)하거나 혹은 CDM과 레이저를 동시에 처리(CDM+laser)한 SCC7 세포 각각을 웨스턴블롯으로 분석한 결과이다.
도 18에 나타난 바와 같이, 활성화된 CDM는 pocaspase-3의 수준을 감소시키고, 세포내 caspase-3의 농도를 증가시켰고, 이는 세포사멸에 의해 caspase-3 발현수준이 증가되는 것을 의미한다.
도 19는 세포내에서 caspase-3 활성을 측정하여 나타낸 그래프로, 이는 비색기질(colorimetric substrate)인 Ac-DEVD-pNA를 절단하는 세포 추출물의 활성을 측정한 것이다.
CDM에 의해 세포죽음(cell death)과 레이저 조사의 결과로 방출된 caspase-3의 수준을 측정하기 위하여 csapase-3 측정키트를 사용하였고, 도 19에 나타난 바와 같이 MMAE가 레이저 조사에 의해 Ce6과 CDM 뿐만 아니라 caspase-3의 수준도 증가시키고 있음을 확인하였다. 이는 CDM에 존재하는 MMAE가 방출되어, 연속적인 세포사멸 과정을 유도할 수 있음을 의미하는 것이고, 이의 결과로 다른 CDM을 추가적으로 활성화시키게 되므로, 지속적으로 종양효과가 이어지게 됨을 알 수 있다.
도 20은 Ce6, CDM 및 MMAE를 SCC7 세포에 처리하고, 레이저로 조사하기 전(laser-)과 후(laser+)의 세포 생존력을 측정하여 나타낸 그래프이고(*은 통계적으로 유의미하다는 것으로, p<0.01임을 의미한다.), 도 21은 CDM과 Ce6로 SCC7 세포를 처리하고, 레이저로 조사한 후, 이들 각각의 세포독성 효과를 측정하여 나타낸 사진이다. 흑색원은 레이저에 의해 조사된 부위를 나타낸 것이다.
이를 살펴보면 Ce6과 CDM으로 처리된 세포에서, 세포사멸로 염색된 세포들은 레이저 조사후에 아폽토시스 세포(apoptotic cell)로 판명된 것으로, Ce6으로 처리할 경우에는 레이저 처리된 세포만 죽었으나, CDM으로 처리될 경우에는 caspase-3을 통한 확산효과에 의해 효과적으로 주변 세포까지 사멸시키는 것을 확인하였다.
게다가, 외부로부터 빛이 조사되어 CDM이 종양세포를 사멸시켰을 때(세포 생존율; 12.8 ± 9.2 %), MMAE만을 처리하였을 때(viability; 25.8 ± 10.1 %) 보다 더 많은 세포들이 사멸하였음을 확인하였다(도 20)
본 발명에 따른 CDM은 외부 자극(빛의 조사 혹은 caspase-3)에 의한 전구약물 기반의 전환효과가 뚜렷한 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 단독으로 사용할 경우에 비해서 훨씬 적은 농도로 2배 이상의 세포독성효과를 발휘함을 확인하였다. 이는 caspase-3에 특이적으로 인식하는 DEVD 펩타이드 부분이, Ce6과 MMAE보다 훨씬 친수성이기 때문에, 나노입자를 형성할 경우 나노입자의 표면부분에 펩타이드가 위치할 가능성이 높기 때문인 것으로 여겨진다.
실험예 5. EPR 효과에 의한 종양모델에서 자기조립된 CDM 의 축적 효과 분석
본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 CDM은 자기조립을 통해 구형의 나노입자로 형성될 수 있고, 이 역시 전구약물 특성을 갖고 있다. 게다가 나노입자 형태로 존재할 경우, 일반적인 형태로 분산되어 있을 때보다 종양특이적 작용을 통해 생체 내 종양표적 효과가 증가되는 장점이 있다.
본 발명에 따른 CDM이 실질적으로 생체 내에 적용될 경우, 종양 특이적 효과를 가질 것으로 기대하고, 생체 내 실험을 통해 이를 확인하고자 하였다. 생체 내 실험을 위해, 1×106 개의 SCC7 세포를 누드 마우스의 왼쪽 옆구리에 접종하여 종양동물모델을 제조하였다. 종양의 크기가 약 200 nm3에 도달하면, 상기 종양동물모델의 꼬리정맥을 통해 CDM과 Ce6을 각각 주입하였다(n=3).
도 22는 꼬리 정맥을 통해 CDM, Ce6을 주입한 종양동물모델의 몸전체를 시간에 따라 촬영하여 나타낸 형광이미지이고, 도 23은 약물이 주입된 후 초과된 시간에 따라 동물종양모델의 종양에서 축적된 형광물질의 양을 정량적으로 분석한 그래프이며, 도 24는 심장, 신장, 비장, 폐 및 간을 포함하는 다른 기관의 종양을 형광이미지로 촬영한 것이며, 도 25는 종양동물모델의 각각의 종양 및 기관에서 Ce6 형광과 CDM의 형광세기를 정량적으로 측정하여 나타낸 그래프이며, 도 26은 동물종양모델의 종양조직에서 Ce6과 CDM의 분포와 축적 정도를 비교하기 위하여 조직학적 염색을 통해 분석한 결과이다. 이때 청색은 DAPI이고, 초록색은 Ce6 영역이다. 도 27은 종양동물모델에서 Ce6과 CDM을 각각 주입하였을 때(1 ㎎/㎏). 시간에 따른 플라즈마 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
앞선 실험들을 통해 CDM이 종양동물모델 내로 주입되었을 때, 생체 조건 하에서 CDM은 자기조립을 통해 나노입자로 형성될 것이므로, 종양표적 효과가 증가할 것이라 기대했고, 도 22에서 확인한 바와 같이 실질적으로 CDM을 생체내로 주입한 결과에서도 종양세포 표적효과가 Ce6에 비해 매우 현저함을 확인하였다.
상기 도 22의 종양동물모델에서 종양 조직에서의 형광세기를 측정하여 도 23에 나타내었고, 이에 따르면 본 발명의 CDM(실시예 1)은 종양동물모델의 종양세포에서 6 내지 12 시간 동안 최고치를 나타내다가 12시간 이후부터 감소한 것을 확인하였다. 이에 반해 Ce6만 처리할 경우 종양조직에서 거의 형광이 관찰되지 않았음을 알 수 있다.
실시예 1의 CDM은 자기조립을 통해 나노입자로 형성됨에 따라, 종양 표적 능력이 향상되었으므로, EPR 효과에 의해 종양 조직에 분명하게 축정되고 있음을 확인할 수 있었다. 상술한 결과를 통해서 본 발명에 따른 CDM는 신체의 생리적 환경에 노출될 경우, 나노입자 형태를 형성하고, 기능한다는 것을 의미하는 것이다.
종양동물모델에 Ce6과 CDM(실시예 1)을 각각 주입하고 24 시간이 지난 후, 다른 기관에서의 종양 조직을 측정한 결과(도 24), 동일한 양의 형광을 주입하였을 때, CDM을 주입한 종양동물모델에서 24 시간 후 종양과 간, 폐, 비장, 신장, 심장 및 종양조직에서 전체 형광량이 높다는 것을 확인하였다. 이를 통해 CDM의 종양특이적 축적은 Ce6의 종양 특이적 축적과 비교하였을 때 현저히 유의적으로 증가함을 알 수 있다.
CDM을 주입한 종양동물모델의 종양조직에서 형광의 양이 Ce6을 주입한 종양동물모델의 종양조직에서보다 12.8ㅁ4.2배 더 높음을 확인하였다(도 25) 따라서, Ce6에 비해 생체 조건에서, 본 발명에 따른 새로운 구조의 CDM(광감각제-약물 접합체)가 종양조직에 특이적으로 활성화되고, 축적되고 타겟화되는, 향상된 EPR 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.
본 발명의 CDM은 생체조건 하에서 자기조립을 통해 나노입자형태로 변화하게 되는데, 이에 의해 생체내에서 CDM의 약물동력학(PK) 특성도 변화하는 것으로 예측된다. 이를 확인하기 위하여 종양동물모델의 혈액에 동일한 양(1 ㎎/㎏)의 CDM과 Ce6을 주입한 후, CDM과 Ce6의 혈중농도를 측정하였다(도 26, 27). 그 결과 초반에는 CDM의 혈중농도가 Ce6에 비해 높았으나, 시간이 지남에 따라 Ce6과 동일한 농도까지 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 도 22와 연계하여 결과를 살펴보면, 6 내지 12시간동안 CDM의 혈중농도는 점차감소하는 대신 종양조직 내에 축적되는 CDM의 함량이 증가하였음을 알 수 있다.
실험예 6. 종양동물모델에서 CDM 의 종양 억제 효과
본 발명에서는 종양동물모델(Balb/c nu/nu 혹은 C3H)에서 CDM을 사용하여 항암 요법을 시행한 후, 종양에 대한 예방 또는 치료효과를 분석하였다. SCC7 세포는 쥐과(murin)에서 가장 강력한 종양세포주로, 동물모델에 주입시, 빠르고 공격적으로 성장하기 때문에, 종양동물모델을 제조할 때 주로 사용된다. 본 발명에서도 SCC7 세포를 사용하여 종양동물모델을 제조하였고, 이를 통해 CDM의 강력한 효과들을 정확하게 측정할 수 있었다.
1) 종양동물모델( Balb /c nu / nu ) 실험
먼저, 종양동물모델에서 자극 특이적 치료효과를 명확히하기 위해서, 동일한 동물모델에 동일한 종양조직을 각각 다른 부위(왼쪽과 오른쪽)에 이식하였고, 상기 두 종양조직의 양상을 비교하여, 효과를 분석하였다.
실험방법 9)에 언급한 바와 같이 종양동물모델(Balb/c nu/nu)을 제조하고, CDM을 정맥을 통해 주입한 후, 5일이 지난 다음, 종양동물모델의 오른쪽 종양 조직에만 단일 선량(30 ㎽/㎠, 671nm, 10min)의 레이저를 조사하였다.
도 28은 Balb/c nu/nu 마우스의 왼쪽과 오른쪽 측면에 SCC7 세포를 주입하여 종양동물모델(Balb/c nu/nu)을 제조하고, 종양 조직의 크기가 도달했을 때, 종양동물모델의 꼬리정맥을 통해 CDM(0.5 mg/kg)을 주입한 후, 오른쪽 종양 조직에만 레이저를 조사한 후 몸 전체의 형광이미지와, 이로부터 형광세기를 측정하여 도시한 그래프이다.
도 28에 나타난 바와 같이, CDM을 처리하고, 오른쪽 종양에만 레이저를 조사한 종양동물모델에 caspase-3에 민감하게 반응하여 활성화되는 프로브(Cy5-GDEVD-BHQ3)를 주입한 결과, 오른쪽 종양에서만 caspase-3에 의한 형광이 관찰되었고, 이를 통해 레이저가 조사될 경우 세포사멸이 분명하게 발생함을 알 수 있다.
도 29는 상기 종양동물모델(Balb/c nu/nu)의 꼬리정맥을 통해 CDM, Ce6을 0.5 ㎎/㎏ 각각 주입한 후, 오른쪽 종양 조직에만 레이저를 조사하고, 15일이 지난 후, 양 종양조직의 크기를 측정하여 나타낸 그래프와 실제 사진이다.
이후, 양 종양조직의 크기를 관찰한 결과(도 29), 동일한 종양동물모델에서 왼쪽과 오른쪽 종양 성장이 명백하게 차이가 있음을 확인하였다. 이를 통해 생체 내에서, 본 발명에 따른 CDM은 빛에 의해 유도된 자극에 의해 효과가 변화한다는 것을 알 수 있다. 또한 CDM은 MMAE가 접합되어 있기 때문에, Ce6과 비교하여 종양세포 사멸 효과가 현저히 향상되어 있음을 알 수 있다.
2) 종양동물모델( C3H ) 실험
도 30은 약물을 종양동물모델(C3H)에 주입한 후, 시간에 따라 종양 조직의 크기를 측정하여 나타낸 그래프(a)와 실제 사진(b)이다. 이때, 상기 약물에 따라 각 그룹을 나눌 수 있으며, 구체적으로 다음과 같다:saline 그룹, 레이저(10 min, 25 mW/cm2)만 처리한 Laser 그룹, Ce6(1 mg/kg)과 레이저를 같이 처리한 Ce6+Laser 그룹, CDM(MMAE 농도 기준 0.25 mg/kg)만 처리한 CDM 그룹, MMAE(0.25 mg/kg)만 처리한 MMAE 그룹, CDM(MMAE 농도 기준 0.25 mg/kg)와 레이저를 같이 처리한 CDM+Laser 그룹. 이때, He-Ne 레이저(671 nm)를 사용하였고, 약물을 주입하고 6 시간이 지난 후 10 분동안, 25mW/cm2 조건으로 세 번 조사하였다(n=6).
도 31은 도 30의 실험이 마무리된 후, 각각의 종양동물모델로부터 적출한 종양 조직의 평균무게를 측정하여 도시한 그래프이고, 도 32는 도 30의 종양동물모델 각각으로부터 적출한 종양 슬라이스를 H&E 염색으로 분석한 결과이다. 이때, 바는 150 μm을 나타낸다. 도 33은 도 31의 종양동물모델의 각 그룹으로부터 장기조직을 적출한 후, 조직검사를 실시한 결과이다.
이를 상세히 평가하기 위하여 SCC7 종양세포를 갖는 C3H 마우스의 측면에 Ce6(1 ㎎/㎏), MMAE(0.25 ㎎/㎏) 및 CDM(MMAE 기준 0.5 ㎎/㎏)을 각각 정맥을 통해 주사하여, 각각의 그룹을 제조하였다. 각 그룹에서 시간에 따라 종양 크기를 분석한 결과(도 30a, b), 레이저가 조사되지 않은 CDM 그룹에서는 종양세포의 크기가 전혀 감소하지 않았다. 광감각제인 Ce6과 레이저가 동시에 처리된 Ce6+Laser 그룹에서는 종양 성장 억제 효과가 관찰되었는데, 이는 Ce6으로부터 생성된 ROS가 산화 스트레스를 유발하여, 종양 세포 사멸을 유발하기 때문인 것으로 여겨진다. MMAE 그룹은 독성이 너무 강해서 MMAE 그룹 전부 실험도중 사망하였다.
CDM+Laser 그룹은 종양동물모델(C3H)에서 종양성장을 현저하게 억제하였고, 다른 그룹과 비교해서도 매우 우수하게 종양조직의 성장을 억제하고 있음을 알 수 있다. CDM과 레이저를 동시에 처리한 CDM+Laser 그룹에서는 모든 종양 조직이 전혀 성장하지 않았고, 저선량의 레이저를 조사하여도 종양조직이 거의 다 사멸한 것으로 관찰되었다. 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 CDM은 적은 양의 감광성 물질을 포함하고 있을 뿐인데도 불구하고, 단독으로 사용하는 경우보다 종양동물모델에서 종양 억제 효과 및 치료 효과가 매우 우수함을 확인하였다.
추가적으로 앞선 종양동물모델(C3H)에서 CDM 그룹, Laser 그룹 및 CDM+Laser 그룹의 종양 무게를 측정한 결과, CDM 그룹, Laser 그룹에 비해 CDM+Laser 그룹이 99.6% 까지 현저히 낮아진 것을 확인할 수 있었다.
또한 종양 내 종양세포가 실제로 사멸하였는지를 확인하기 위하여 동물실험이 종료된 후, 각 그룹으로부터 조직을 회수하고, H&E로 염색하여 조직검사를 실시하였다(도 32). 그 결과 CDM+Laser 그룹에서는 종양세포가 광??위하게 사멸되어 있는 것을 확인하였으나. Ce6+Laser 그룹에서는 그 정도가 매우 미미한 것을 확인하였다.
또한, 상기 약물이 처리된 종양동물모델의 각 그룹으로부터 장기조직을 적출한 후, 조직검사를 실시하였다(도 33). 그 결과 Ce6+Laser 그룹과 CDM+Laser 그룹에서 다른 장기의 손상은 관찰되지 않았다.
이러한 결과들을 종합하면 본 발명에 따른 CDM과 레이저를 동시에 처리할 경우 종양조직만 특이적으로 손상시키고 사멸시킴을 확인한 바, 본 발명에 따른 CDM은 다른 치료제에 비해 현저히 우수하고 종양특이적 치료 및 예방 효과를 가지고 있음을 분명하게 확인하였다.
실험예 7. 동물모델에서 CDM 의 세포독성 평가
최근, 대부분 Ce6을 기반으로 하는 나노입자 또는 MMAE 접합체는 복잡성과 독성으로 인해, 임상적 사용에 제한이 있다. 본 발명에 따른 CDM는 종래 Ce6 나노입자, MMAE 접합체가 가지고 있던 문제점을 모두 해결할 뿐만 아니라, 안정적이고, 더 우수한 치료효과를 갖고 있음을 본 실험을 통해 입증하고자 하였다.
우선, C3H 마우스에 SCC7 종양 세포를 이식하여, 종양동물모델을 제조하였고, 구체적인 과정은 실험방법에 기재된 바와 같다.
약물을 상기 종양동물모델의 꼬리 정맥을 통해 주입하여 하기와 같은 6 그룹을 제조하였다. 약물을 주입하고 5일이 지난 후, 종양 조직에 단일 선량(30 mW/cm2, 671nm, 10min)의 레이저를 조사하였다. 총 치료기간은 14일이였다.
saline 그룹, 레이저(10 min, 25 mW/cm2)만 처리한 Laser 그룹, Ce6(1 mg/kg)과 레이저를 같이 처리한 Ce6+Laser 그룹, CDM(MMAE 농도 기준 0.25 mg/kg)만 처리한 CDM 그룹, MMAE(0.25 mg/kg)만 처리한 MMAE 그룹, CDM(MMAE 농도 기준 0.25 mg/kg)와 레이저를 같이 처리한 CDM+Laser 그룹. 이때, He-Ne 레이저(671 nm)를 사용하였고, 약물을 주입하고 6 시간이 지난 후 10 분동안, 25mW/cm2 조건으로 세 번 조사하였다(n=6).
도 34 내지 도 41은 동물모델에서 CDM의 세포독성을 평가하기 위한 실험을 진행한 결과이다.
우선 도 34는 시간에 따른 각 종양동물모델 그룹에서의 생존율(%)을 측정하여 나타낸 그래프로, 도 34에 나타난 바와 같이, 치료 3일부터 MMAE 그룹은 사망하기 시작하여, 4일째에는 모두 사망하였다. 이에 반해 CDM, laser, Ce6의 경우 생존율이 100%로, 생체 내에서 독성을 전혀 나타내지 않음을 확인할 수 있다.
도 35는 시간에 따른 각 종양동물모델 그룹에서의 체중(%)을 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 MMAE 그룹에서만 31.9ㅁ1.6% 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이는 MMAE의 독성에 의한 것이라 여겨진다.
도 36은 MMAE(50, 200, 500 ㎍/㎏), CDM(MMAE 기준 50, 200, 500 ㎍/㎏) 투여한 종양동물모델에서, 시간에 따른 체중 변화를 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면, 다양한 농도의 CDM을 투여한 그룹에서는 체중 변화가 거의 관찰되지 않았다(4.8±0.2%). 그러나 다양한 농도의 MMAE를 투여한 그룹에서는 매우 큰 체중 변화가 관찰되었다(31.6 ± 2.2 %).
도 37은 각 종양동물모델 그룹에서의 비장 무게(㎎)를 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면, MMAE 그룹에서만 비장의 무게가 75±11.8% 감소하였으며, 비장의 크기가 너무 수축되어 비장의 기능이 거의 작동하지 않는 것으로 확인되었다.
도 38은 각 종양동물모델 그룹으로부터 비장을 적출하고, 이의 림프구(lymphoid tissue)(백색 펄프)의 변화를 분석한 사진으로, 조직학적 분석에서 비장에서 회전 타원형의 백색 펄프는 림프 조직을 나타내는 것이다. 이를 통해 T 림프구가 포함된 비장에서 림프구의 변화를 살펴본 결과 MMAE 그룹에서 림프구의 크기가 현저히 감소하였음을 확인하였다. 즉 MMAE는 면역 독성이 있음을 알 수 있다.
도 39 내지 도 41은 각 그룹의 혈액을 분석하여, 혈중 독성 실험을 실시한 결과이다. 우선 도 39는 CDM 그룹(MMAE 기준 0.5 ㎎/㎏)과 MMAE(0.5 ㎎/㎏) 그룹의 혈장 내 총 백혈구(WBC)의 수를 분석하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 CDM 그룹에서는 안정한 전구약물 형태의 나노입자를 형성하기 때문에, 총 백혈구수(WBC)에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 이에 반해 MMAE 그룹은 총 백혈구수가 약간 감소하였다(35.7 ± 13.8 %).
도 40은 CDM 그룹(MMAE 기준 0.5 ㎎/㎏)과 MMAE(0.5 ㎎/㎏)에서 혈중 호중구 비율(%)을 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 MMAE 그룹은 순환하는 호중구의 수를 급격하게 감소시킨다는 것을 확인하였다. 즉, 동일한 MMAE를 포함하는 CDM 그룹에서는 호중구의 수가 약간 감소하였을 뿐(1.6 ± 1.0000 / μL)인데, MMAE 그룸은 식염수를 처리한 saline 그룹에 비해 4.9배 더 낮은 수치임을 알 수 있다. 구체적으로 총 백혈구 수에 대한 호중구 백분율을 계산해 본 바, MMAE 그룹은 79.3%에서 2.5±1.4%로 감소하였음을 확인하였다.
도 41은 CDM 그룹(MMAE 기준 0.5 ㎎/㎏)과 MMAE(0.5 ㎎/㎏)에서 aspartate aminotransferase(AST) 및 alanine aminotransferase(ALT)를 포함하는 간 효소의 혈장 수준을 측정하여 나타낸 그래프로, 이에 따르면 MMAE 그룹은 간독성을 현저히 증가시키고 있음을 확인하였다. 구체적으로 MMAE 그룹에서만 AST 2.7배, ALT 1.5배 증가하였다. 상술한 결과를 종합하면 본 발명에 따른 CDM이 생체내에서 부작용이 거의 나타나지 않은 매우 효과적인 치료 물질임을 알 수 있다.
<결론>
기존의 나노입자는 기능이 우수한데 반해, 임상적 사용에 제한이 있다는 문제가 있었다. 왜냐하면 나노운반체를 사용한 항암 요법은 치료효율이 5% 미만이며, 정상 조직에 대하여 독성을 나타내고, 제조과정이 복잡하거나 민감하여, 조작에 어려움이 있다는 여러 문제들이 산재해 있었기 때문이다. 이에 본 발명에서는 상술한 문제점을 해결하고, 종양 조직에 대하여 특이적 활성을 가지며, 안전할뿐만 아니라 단순한 새로운 구조의 치료물질을 개발하고자 노력한 바, 완성하게 되었다.
본 발명에 따른 새로운 구조의 광감각제-약물 접합체는 종양 세포에 특이적 표적 효과를 가지고 있을 뿐만 아니라, 빛에 의해 세포사멸을 선택적으로 유도할 수 있다는 장점을 갖고 있다.
또한 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 생체내에서, 자기조립을 통해 나노입자 형태를 형성하므로, 동물실험을 통해 종양 조직에 대한 우수한 특이적 활성을 가져, 성공적으로 종양조직에 축적되며, caspase-3에 의해 DEVD 펩타이드가 절단되어 전구약물 형태에서 약물이 방출되어, 종양 조직에 효과적으로 작용될 수 있다.
게다가 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 세포독성을 전혀 나타내지 않는 전구약물형태이면서, 스스로 자기조립을 통해 나노입자 형태를 형성하므로, 복잡한 제조과정과 별도의 약물담체를 포함하여야 하는 문제에서 벗어났다. 즉 본 발명의 광감각제-약물 접합체는 평소에는 종래 다른 나노입자와 달리 임상적 사용에 있어서 전혀 제약받지 않는, 가장 생체친화적 물질로 존재한다.
그러다, 빛이 조사될 경우에는 ROS를 생성하여 PDT 제제로서 산화스트레스를 증폭시키고, caspase-3가 존재할 경우에는 항암제인 MMAE를 방출하여, 신속하게 세포자멸을 유도하는 활성을 갖는 것으로, 하나의 물질에서 광역학 치료와 약물학적 치료효과가 동시에 발현된다는 점에서, 매우 효율적이라 할 수 있다.
다시 말해 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 별도의 담체가 없음에도 불구하고, 자체적으로 독성이 낮은 형태로 존재하다가, EPR 효과에 의해 종양조직에 특이적으로 축적되고, 종양조직 내에서 전구약물 형태에서 활성형태로 전환된다. 게다가 종양 조직에 빛을 조사할 경우, 1차적으로 광감각제-약물 접합체로부터 ROS가 유도되어, 인접한 종양세포에서 세포사멸이 유도되고, caspase-3에 의해 절단되어 방출된 항암제에 의해 2차적으로 종양세포의 사멸이 유도된다. 따라서 광감각제-약물 접합체가 저농도가 존재하더라도 연속적이고 지속적인 항암 효과로 인하여, 종양 조직에서 매우 효과적인 예방 또는 치료효과를 나타내며, 종양 성장을 완전히 억제한다.
또한 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 혈액 순환 반감기가 연장되었으며, 정상 조직에 대한 독성이 현저히 감소되어, 종양세포가 존재하지 않는 다른 조직에 대하여 부작용을 일으키지 않으며, 광감각제-접합체가 활성화되는 기작이 신뢰할만한 과정을 통해 수행되기 때문에 임상분야에 적용이 가능하다는 장점이 있다.
세포 독성 실험에 있어서, 종래 항암제의 경우 독성이 강하기 때문에, 동물을 사망에 이르게 함을 확인하였으나, 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 거의 독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 광감각제-약물 접합체는 종양세포에 축적되어 있다고 하더라도 빛에 의해 활성화되기 전까지는 독성이 전혀 없는 전구약물형태, 나노입자 형태로 존재하기 때문에 이중 안정성을 갖는다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> prodrug conjucation for targeted tumor, manufacturing method thereof, pharmaceutical composition for treating and preventing tumor comprising thereof <130> HPC7736 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> caspase-3 specifically cleavable paptide <400> 1 Lys Gly Asp Glu Val Asp 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> caspase-3 specifically cleavable paptide <400> 2 Gly Asp Glu Val Asp 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> caspase-3 specifically cleavable paptide <400> 3 Asp Glu Val Asp Gly 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> caspase-3 specifically cleavable paptide <400> 4 Asp Glu Val Asp 1

Claims (15)

  1. 광감각제, 펩타이드, 링커 및 항암제가 순차적으로 접합되어 있는 것을 특징으로 하며,
    상기 펩타이드는 상기 광감각제의 일 측에 접합되고, 카스파제(caspase)에 의해 특이적으로 절단가능한 서열로 이루어진 펩타이드이며, 말단에 링커를 접합하며,
    항암제를 연결시키는 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 광감각제는 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피린류(phorphyrins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이상인 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 표시되는 것 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 소수의 탄소, 펩타이드, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 파라-아미노벤질옥시 카르바메이트(PABC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 광감각제는 클로린 e6인 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 광감각제-약물 접합체는 하기 구조식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체.
    [구조식 1]
    Figure pat00006
  8. 제1항에 있어서,
    상기 종양 인식형 광감각제-약물 접합체는 용액 상에서 자기조립을 통해 나노입자 구조로 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 종양 인식형 광감각제-약물 접합체.
  9. a) 카스파제에 의하여 절단 가능한 서열인 펩타이드에서, 링커가 접합될 부위를 제외한 나머지 아미노산 잔기의 수소를 알릴기 혹은 알릴옥시카르보닐기로 치환하는 단계;
    b) 상기 치환된 펩타이드의 C-말단에 링커를 접합시키는 단계;
    c) 상기 링커에 항암제를 접합시킨 약물 접합체를 제조하는 단계;
    d) 상기 c) 단계를 통해 제조된 약물 접합체의 치환된 펩타이드로부터 알릴기 또는 알릴옥시카르보닐기를 다시 수소기로 치환하는 탈보호 단계; 및
    e) 상기 탈보호된 펩타이드의 N-말단의 아미노기에 항암제를 접합시키는 단계;를 포함하는 광감각제-약물 접합체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 a) 단계의 카스파제에 의하여 절단 가능한 서열인 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 광감각제-약물 접합체의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 치환된 펩타이드를 제조하는 상기 a) 단계는 구체적으로 서열번호 1의 카스파제에 의하여 절단가능한 펩타이드의 곁사슬의 카르복시기 수소가 알릴기(allyl group)로 치환되고, 곁사슬의 아미노기 수소가 알릴옥시카르보닐기(allyloxycarbonyl group)으로 치환하여, N 말단 아민기를 아세틸기로 보호화하는 단계인 것을 특징으로 하는 광감각제-약물 접합체의 제조방법.
  12. 제1항 내지 제8항 중에서 선택되는 어느 한 항에 따른 광감각제-약물 접합체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서.
    상기 광감각제-약물 접합체를 포함하는 약학 조성물은 종양 부위에 선택적으로 축적되고, 광원으로 조사된 부분에서 종양세포의 선택적 사멸을 유도하며,
    종양세포에 존재하는 caspase-3에 의해 광감각제-약물이 절단되어, 전구약물 형태인 광감각제-약물 접합체로부터 약물이 방출됨으로써, 항암 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 두개내인종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 뇌종양, 후두암, 구인두암, 비강/부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 항문암, 방광암, 신장암, 전립선암, 고환암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 편평상피세포암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 정맥 혹은 국소 투여를 통해 주입되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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