KR101756537B1 - 유방암 진단용 허셉틴-광감각제 접합체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

유방암 진단용 허셉틴-광감각제 접합체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암(특히, 유방암) 진단용 항체-광감각제 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상세하게는 HER2를 발현하는 종양 진단하기 위하여 HER2에 특이적인 항-HER2 항체(허셉틴)와 광감각제를 화학적 결합을 통해 접합시킴으로써 진단시간 단축 및 종양 진단 능력을 높인 허셉틴-광감각제 접합체에 관한 것이다. 본 발명에 따른, 항-HER2 항체에 말레이미드, 폴리에틸렌글리콜 및 광감각제가 순차적으로 연결되어 있는 암 진단용 또는 치료용 접합체는 카르복실기를 가진 광감각제에 수용성 폴리에틸렌글리콜을 도입함으로써 기존의 소수성 광감각제와 비교하였을 때, 보다 높은 용해도와 광 조사시 높은 활성산소종의 생성 효율을 보이고, 기존 항-HER2 항체(허셉틴)을 단독으로 사용하였을 때의 문제점인 여러 단계의 처리과정을 거쳐야하며 계면활성제의 사용이 필수적이라는 점을 보완하는 계면활성제가 필요하지 않으며 처리과정이 단축된 유방암 진단용 면역화학착색소재로 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제) 제조방법은 단계적이고 순차적인 방법을 통해 항-HER2 항체에 광감각제를 간단하고 용이하게 접합시킬 수 있으며, 특히 폴리에틸렌글리콜-광감각제가 결합된 1차 접합체에 말레이미드를 접합시킴으로써 안정적인 항-HER2 항체(허셉틴) 접합을 가능하게 한다.

Description

유방암 진단용 허셉틴-광감각제 접합체 및 이의 제조 방법{Herceptin-photosensitizer conjugate for breast cancer diagnosis and the preparing method thereof}
본 발명은 암(특히, 유방암) 진단용 항체-광감각제 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상세하게는 HER2를 발현하는 종양 진단하기 위하여 HER2에 특이적인 항-HER2 항체(허셉틴)와 광감각제를 화학적 결합을 통해 접합시킴으로써 진단시간 단축 및 종양 진단 능력을 높인 허셉틴-광감각제 접합체에 관한 것이다.
유방암은 선진국형 질병으로 미국에서는 가장 흔한 암으로 보고되며, 일생동안 8명의 여성 중 1명이 유방암이 발병될 수 있다. 우리나라의 경우, 전체 암에서 위함, 폐암, 간암, 대장암에 이어 다섯 번째로 2000년에는 전체 암 발생의 6.5(5,444명)를 차지했으며, 보건복지부 중앙 암등록 보고서에 의하면 2002년에는 유방암이 여성 악성종양의 16.8%를 차지하여 1위에 올랐다. 유방암의 경우 암세포가 주변 조직에 침범하거나 림프절로 전이가 시작되면 완치가 어렵기 때문에 조기발견이 다른 암보다 더욱 중요하다.
현재 일반적으로 시행되고 있는 유방암의 진단방법은 전문가에 의한 임상진찰과 유방 촬영술을 병행하여 이상이 있을시에는 조직검사를 실시하고 있으나 젊은 여성에서는 유방에 섬유질이 많아 유방 촬영술만으로는 명확한 진단에 제한이 따른다. 최근 각종질환은 점차 세분화되고, 새로운 진단기준이 소개되고 있으며, 암의 진단에 도움을 주는 암표지자, 예후를 판정할 수 있는 예후인자들이 알려지고 있어서 통상적인 헤마톡실린-에오신 염색표본이나 전자현미경만으로는 이러한 종합적인 정보를 얻는데 어려움이 있다. 이러한 문제점들을 보완해 주는 검사방법인 면역조직화학적 염색은 미분화 세포의 기원을 확인해주거나, 효소, 호르몬, 암표지자 및 예후인자의 존재 유무, 암종과 육종의 구별 및 양성종양과 악성종양의 감별, 그리고 전이암의 원발소를 추정하는데 효율적으로 이용되고 있다.
정상조직으로부터 악성종양을 진단하기 위하여 기존의 면역화학염색법시 민감성과 특이성이 높으나 분자량이 큰 항체(Antibody)를 이용하기 때문에 표적 단백질이 세포막 표면에 있는 경우 고분자 항체 사용 시 문제가 없지만 세포내의 표적단백질을 표지하기 위해서는 고분자 항체의 조직 및 세포 투과율이 낮아 문제점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 기존 면역화학염색시 계면활성제를 사용하여 고분자 항체의 조직 및 세포막 투과율을 높이고 있으나 이 또한 병변 조직의 단백질 변성을 초래할 수 있어 확실한 질병 검출에 한계가 있다. 또 여러 단계의 복잡한 염색법을 사용하기 때문에 검출 시간이 오래 걸리고, 고도의 기술이 요구되며 낮은 정확성 등의 단점을 보여 암 진단의 주 방법으로 이용되지 못하고 있다.
이에 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점을 극복하기 위하여 수용성을 부여시킨 광감각제(페오포르바이드 및 클로린)를 말레이미드를 화학적 링커로 사용하여 허셉틴(herceptin: HER2의 세포외 도메인을 타겟으로 하는 재조합 인간화 단일클론 항체인 트라스투주맙의 상품명)과 접합시킴으로써 계면활성제 사용이 필요 없는 원스텝 광학 면역화학착색소재를 개발하였다. 허셉틴-광감각제 접합체는 기존의 면역화학 염색법시의 여러 단계의 처리과정을 거쳐야하는 번거로움을 피하고 계면활성제 사용시의 문제점을 원천적으로 봉쇄하며 동시에 조직 및 세포 투과율을 높일 수 있기 때문에 면역화학검사 분야의 새로운 대규모 시장 형성을 기대할 수 있을 것이다.
한국공개특허 제10-2014-0048008호 한국공개특허 제10-2014-0014443호
따라서 본 발명의 목적은 계면활성제의 추가 없이도 항체의 조직 및 세포 투과율을 증진시킬 수 있는 새로운 면역화학착색소재로서 허셉틴-광감각제 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, a) 생체 적합성 고분자와 광감각제를 연결하여 1차 접합체를 제조하는 단계; b) 1차 접합체에 링커를 연결하여 2차 접합체를 제조하는 단계; 및 c) 2차 접합체에 항-HER2 항체를 연결하는 단계를 포함하는, 항체-링커-생체 적합성 고분자-광감각제가 순차적으로 연결된 암 진단용 또는 치료용 접합체 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 항-HER2 항체에 생체 적합성 고분자 및 광감각제가 순차적으로 연결되어 있는 암 진단용 또는 치료용 접합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항-HER2 항체는 트라스투주맙(Trastuzumab)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜로서 분자량이 2,000 내지 10,000인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항-HER2 항체와 생체 적합성 고분자는 링커에 의해 연결되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 링커는 말레이미드일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감각제는 포르피린계(porphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 과발현하는 암일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 유방암, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, a) 생체 적합성 고분자와 광감각제를 연결하여 1차 접합체를 제조하는 단계; b) 1차 접합체에 링커를 연결하여 2차 접합체를 제조하는 단계; 및 c) 2차 접합체에 항-HER2 항체를 연결하는 단계를 포함하는, 항체-링커-생체 적합성 고분자-광감각제가 순차적으로 연결된 암 진단용 또는 치료용 접합체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜로서 분자량이 2,000 내지 10,000인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 링커는 말레이미드인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계는 광감각제를 촉매의 존재 하에서 용매에 녹여 반응시킴으로써 광감각제의 카르복실기 반응성을 높여준 다음, 여기에 생체 적합성 고분자를 녹인 용액을 첨가하여 반응시키는 과정을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계 이후 및 b) 단계 이전에 1차 접합체로서 생체 적합성 고분자와 광감각제가 1 대1 당량인 접합체만을 선택적으로 분리 및 정제하는 단계를 추가로 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계는 링커인 말레이미드를 촉매의 존재 하에서 용매에 녹여 반응시킴으로써 말레이미드의 카르복실기 반응성을 높여준 다음, 여기에 1차 접합체를 녹인 용액을 첨가하여 반응시키는 과정을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 c) 단계는 2차 접합체와 항-HER2 항체 각각을 완충제에 녹인 후 이들을 혼합하여 반응시키는 과정을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감각제는 포르피린계(porphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물 , 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물, 페오포르바이드 A(pheophorbide a) 및 클로린 e6(chlorin e6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항-HER2 항체는 트라스투주맙(Trastuzumab)인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 촉매는 디사이클로헥실카르보디이미드(N,N`-Dicyclohexylcarbodiimide, 하이드록시숙시이미드(N-hydroxysuccinimide) 단독 또는 이들의 혼합물인 것일 수 있다.
본 발명에 따른, 항-HER2 항체에 생체 적합성 고분자 및 광감각제가 순차적으로 연결되어 있는 암 진단용 또는 치료용 접합체는 항-HER2 항체를 일부 구성에 포함함으로써 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 발현하는 암을 표적으로 하여 항체-항원 결합을 형성시킬 수 있으며; 광감각제를 일부 구성에 포함함으로써 암세포 내에서 형광 및 반응성 산소(단일항 산소)의 생성이 활성화되어 암의 선택적 형광 영상 및 광역학 치료가 가능하게 하며; 폴리에틸렌글리콜을 일부 구성에 포함함으로써 난용성 문제를 가진 광감각제의 친수성을 부여함과 동시에 분자량이 큰 항체의 조직 및 고체 투과율을 높임으로써 기존의 면역화학염색시 사용하는 계면활성제 사용이 필요로 하지 않는 이점을 갖는다. 특히, 본 발명에서는 카르복실기를 가진 광감각제에 수용성 폴리에틸렌글리콜을 도입함으로써 기존의 소수성 광감각제와 비교하였을 때, 보다 높은 용해도와 광 조사시 높은 활성산소종의 생성 효율을 보이고, 기존 항-HER2 항체(허셉틴)을 단독으로 사용하였을 때의 문제점인 여러 단계의 처리과정을 거쳐야하며 계면활성제의 사용이 필수적이라는 점을 보완하는 계면활성제가 필요하지 않으며 처리과정이 단축된 유방암 진단용 면역화학착색소재로 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한, 본 발명의 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제) 제조방법은 단계적이고 순차적인 방법을 통해 항-HER2 항체에 광감각제를 간단하고 용이하게 접합시킬 수 있으며, 특히 폴리에틸렌글리콜-광감각제가 결합된 1차 접합체에 말레이미드를 접합시킴으로써 안정적인 항-HER2 항체(허셉틴) 접합을 가능하게 한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 HER-Mal-PEG-PheoA의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 HER-Mal-PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 HER-Mal-PEG-PheoA의 분자량을 나타내는 것이다.
도 4은 본 발명의 일실시예에 따른 PEG-PheoA의 소수성 크로마토그래피를 이용한 정제 전과 정제 후의 용해도를 광학 사진으로 나타내는 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 폴리에틸렌글리콜 분자량 차이에 따른 PEG2K-PheoA, PEG6K-PheoA, PEG2K-Ce6, PEG6K-Ce6의 용해도를 광학 사진으로 나타내는 것이다.
도 6는 본 발명의 일실시예에 따른 HER-Mal-PEG-PheoA와 HER-Mal-PEG-Ce6의 형광 강도를 형광 영상 장치 사진으로 나타내는 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 HER-Mal-PEG2K-PheoA와 HER-Mal-PEG6K-PheoA, HER-Mal-PEG2K-Ce6, HER-Mal-PEG6K-Ce6의 수용액상에서의 단일항산소 (singlet oxigen) 생성능을 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 Herceptin(8a), HER-Mal-PEG-PheoA(8b), HER-Mal-PEG-Ce6(8c)의 SK-BR-3 세포에서의 유방암 표지능을 나타내는 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 HER-Mal-PEG-PheoA의 유방암 조직 표지능을 나타내는 것이다.
도 10는 본 발명의 일실시예에 따른 HER-Mal-PEG-PheoA의 SK-BR-3 암 모델 마우스에서의 조직 투과율 증가를 나타내는 것이다.
본 발명은 항-HER2 항체에 생체 적합성 고분자 및 광감각제가 순차적으로 연결되어 있는 암 진단용 또는 치료용 접합체를 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 기존의 면역 화학 착색 소재가 가지는 단점으로서, 진단시 여러 단계의 처리과정이 소요되는 점 및 계면활성제를 필요로 하는 특징의 문제점을 극복하기 위하여 일항산소를 생성할 수 있는 특징을 가지는 광감각제를 특정 암세포에서 발현이 증가된 표적단백질에 대한 항체(본 발명에서는 항-HER2 항체인 허셉틴을 이용)와 화학적 결합에 의한 접합체를 형성시키고자 하였다.
그러나 종래(기존)의 광감각제의 경우 난용성(소수성)의 특성으로 인해 유기용매에서 항체와의 직접적인 접합이 불가능한바, 이러한 문제점을 극복하고자 다양한 방법과 아이디어로 항체와 광감각제의 접합을 시도하였으며, 그 결과 1차 아민기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜을 카르복실기를 갖는 광감각제와 접합시켜 광감각제의 용해도를 증가시킨 후, 광감각제와 접합되지 않은 폴리에틸렌글리콜의 1차 아민기에 카르복실기를 포함하는 말레이미드를 접합시켰으며, 이후 말레이미드와 허셉틴을 다이설파이드 결합을 통해 접합시킴으로써 허셉틴-광감각제 접합체 제조를 완성하였고, 완성된 허셉틴-광감각제 접합체가 허셉틴 리셉터(HER2) 과발현 세포에만 특이적인 결합을 나타냄으로써 유방암 특이적 진단이 가능한 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
상기 HER2는 human epidermal growth factor receptor 2의 약어로서, 유방암 세포의 증식과 생존에 관계하는 중요한 신호전달 체계 중의 하나인 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR) 패밀리이다. EGFR 패밀리의 티로신 인산화효소 수용체(receptor tyrosine kinases) 는 erb1, erb2/HER2, erb3, erb4의 4개로 되어 있으며 세포 증식(proliferation)과 생존(survival) 외에도 세포의 부착(adhesion), 이동(migration) 및 분화(differentiation)를 조절하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 4개의 erb family 중 erb2/HER2가 결합하는 리간드는 없지만 유방암에서 가장 강력한 암유전자(oncoprotein)로 알려져 있다. HER2가 정상적인 수준인 경우에는 정상적인 유선조직의 성장과 발달에 관여하지만, 비정상적으로 HER2가 과발현하거나 증폭되면 정상세포 조절이 붕괴되어 유선조직에서는 공격적인 암세포가 형성되게 된다. 이 과정은 HER2가 다른 EGFR family member와 올리고머화(oligomerization)되어 활성화되면 많은 하부 분자(downstream molecules)를 인산화하여 차례로 여러 가지 신호전달계(signaling cascades)를 활성화시킨다. 이 중 세포증식에 관여하는 SOS-Ras-Raf-MEK-MAPK 경로와 세포사멸(apoptosis)를 억제하는 PI-3K/Akt 경로가 암 증식에 관여하는 대표적인 기전이다. 전임상과 임상실험 결과 HER2 과발현은 암발생 단계의 초기부터 나타나는 중요한 현상이며, 이는 암의 성장과 진행에 중요한 역할을 하고 있다. HER2 과발현은 침윤성 유방암의 약 20-30%에서 나타나고 있으며 과발현은 악성도가 보다 높은 공격적인 암으로 유방암의 불량한 예후와도 관계가 있는 것으로 알려지고 있다.
한편, 허셉틴(Herceptin)은 HER2의 세포외 도메인을 타겟으로 하는 재조합 인간화 단일클론항체에 해당하는 트라스투주맙(Trastuzumab)의 상품명에 해당한다.
따라서 본 발명의 암 진단용 접합체는 항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제로 구성되어 있으며, 상기 항-HER2 항체는 트라스투주맙(Trastuzumab)이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 2,000 내지 10,000일 수 있으며; 상기 광감각제는 카르복실기를 갖는 화합물로서 포르피린계(porphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계 (naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고; 상기 암은 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 과발현하는 암으로서 유방암, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 광감각제는 카르복실기를 갖는 페오포르바이드 A 또는 클로린 e6가 바람직하며, 상기 암은 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 과발현하는 유방암이 바람직하다.
따라서 본 발명의 접합체는 항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제의 구성을 가지며, 구체적으로는 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르마이드 A/클로린 e6의 구성이 순차적으로 연결되어 있는 암(특히, 유방암, 대장암, 위암) 진단용 또는 치료용 접합체에 관한 것이다.
이러한 본 발명의 접합체는, a) 생체 적합성 고분자와 광감각제를 연결하여 1차 접합체를 제조하는 단계; b) 1차 접합체에 링커를 연결하여 2차 접합체를 제조하는 단계; 및 c) 2차 접합체에 항-HER2 항체를 연결하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.
이하, 본 발명의 접합체 제조방법을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 항-HER2 항체에 생체 적합성 고분자 및 광감각제가 순차적으로 연결된 접합체를 제조하기 위하여, 상기 항-HER2 항체로는 허셉틴을 사용하였으며, 상기 광감각제로는 카르복실기를 가지고 있는 페오포르마이드 A 또는 클로린 e6를 사용하였고(하기 화학식 1 참조), 생체 적합성 고분자로는 폴리에틸렌글리콜을 사용하였다. 이때 본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 유연하게 조절이 가능한 것으로, 바람직하게는분자량 2,000 내지 6,000인 것을 사용할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015094042313-pat00001
한편, 광감각제의 난용성(소수성) 문제를 해결을 위하여 카르복실기를 가지는 페오포르마이드 A 또는 클로린 e6와 같은 광감각제와의 접합이 가능하면서, 동시에 허셉틴과의 또 다른 접합을 가능한 최적의 친수성 고분자를 선별하고자 하였으며, 그 결과 2개의 1차 아민기를 가지는 폴리에틸렌글리콜의 경우 촉매 사용시 상기와 같은 광감각제와 접합이 가능함을 확인함으로써 폴리에틸렌글리콜은 사용하였다(하기 화학식 2 참조).
[화학식 2]
Figure 112015094042313-pat00002
하지만, 이러한 2개의 1차 아민기를 가지는 폴리에틸렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜과 광감각제간의 1대1 당량의 접합뿐만 아니라 1대2 당량의 접합이 될 수 있으므로 폴리에틸렌글리콜과 광감각제간의 1대1 당량의 접합비율을 가지는 산물만을 소수성 크로마토그래피를 이용하여 소수성 차이에 의해 폴리에틸렌글리콜과 광감각제 1대1 당량의 접합산물을 분리 및 정제하였다.
상기 과정을 통해 제조된 1개의 1차 아민기를 가지는 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(1차 접합체)와 허셉틴을 다이설파이드 결합을 통해 접합시키기 위하여, 먼저 폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체의 1차 아민기와 1개의 카르복실기를 가지는 말레이미드 접합체를 제조하였다(하기 화학식 3 참조).
[화학식 3]
Figure 112015094042313-pat00003
최종적으로 상기 과정들을 통해 제조된 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체는 허셉틴과 버퍼에서 촉매를 사용하지 않고 다이설파이드 결합을 통해 접합을 실시하였다(화학식 4 참조).
[화학식 4]
Figure 112015094042313-pat00004
또한, 본 발명은 상기 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제가 순차적으로 연결되어 있는 접합체)를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 접합체는 항-HER2 항체를 일부 구성에 포함함으로써 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 발현하는 암을 표적으로 하여 항체-항원 결합을 형성시킬 수 있으며; 또한 광감각제를 일부 구성에 포함함으로써 암세포 내에서 형광 및 반응성 산소(단일항 산소)의 생성이 활성화되어 암의 선택적 형광 영상 및 광역학 치료가 가능하게 하며; 또한 폴리에틸렌글리콜을 일부 구성에 포함함으로써 난용성 문제를 가진 광감각제의 친수성을 부여함과 동시에 분자량이 큰 항체의 조직 및 고체 투과율을 높임으로써 기존의 면역화학염색시 사용하는 계면활성제 사용이 필요로 하지 않는다.
본 발명에서 상기 암은 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 발현하는 암으로서, 유방암, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 유연하게 조절이 가능하며, 바람직하게는 분자량 2,000 내지 6,000인 것으로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 광감각제는 특정 파장의 빛이 조사되었을 때 여기(exitation)된 후, 형광 신호를 생성하거나 주변의 기질 또는 산소와 반응하여 반응성 산소종(reactive oxygen species)을 생성하고, 생성된 반응성 산소종은 주변 종양 세포를 자멸 또는 괴사시키는 효과가 있다. 본 발명에서 사용되는 광감각제는 카르복실기를 포함하는 화합물로서, 바람직하게는 페오포르마이드 A 또는 클로린 e6를 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제가 순차적으로 연결되어 있는 접합체)를 유효성분으로 포함하는 조성물은 암 진단 또는 치료의 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 접합체는 표적 암세포에 높은 민감성을 가지고 결합될 수 있으며, 이때 형광 및 반응성 산소의 생성이 활성화되어 암 선택적 형광 영상이 가능함과 동시에 광역학 치료가 가능하게 한다.
상기 암 진단용 또는 치료용 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제가 순차적으로 연결되어 있는 접합체), 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 상기 담체는 희석제일 수 있다. 상기 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제 등의 보조제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, 약제학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
이러한 암 진단용 또는 치료용 조성물은 의도된 투여 경로와 조화되도록 제형화할 수 있다. 투여 경로의 예는, 비경구, 예를 들어 정맥내, 피부내, 피하, 비내, 경피(국소), 점막관통 및 직장 투여를 포함하나, 이들에 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 암 진단용 또는 치료용 조성물은 정맥주사, 복강내주사, 근육내주사, 두개내주사, 종양내주사, 상피내주사, 피부관통전달, 식도투여, 복부투여, 동맥주사, 관절내주사 및 구강내투여로 이루어진 군으로부터 선택된 경로로 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위해 사용될 수 있는 적절한 담체는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로오스 주사액, 덱스트로오스 및 염화나트륨 주사액, 및 락테이트 함유 링거 주사액를 포함하나 이들에 한정되지 않는 수성 운반체(vehicle); 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌글리콜을 포함하나 이들에 한정되지 않는 수-혼화성 운반체; 및 옥수수 유, 면실 유, 땅콩 유, 참깨 유, 에틸올레이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트를 포함하나 이들에 한정되지 않는 비-수성 운반체일 수 있다.
이러한 암 진단용 또는 치료용 조성물은 종양 치료 또는 종양 진단을 위해 사용될 수 있다. 종양 치료 또는 종양 진단을 위해 사용되는 경우에, 유효량은 케이스 별로 의사에 의해 결정될 수 있다. 이 때, 환자의 나이, 성별, 체중, 또는 치료 또는 진단되어야 할 병태의 중증도가 고려될 수 있다. 일예로서, 본 발명의 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제가 순차적으로 연결되어 있는 접합체)는 광감각제의 당량 및 환자 체중을 기준으로 0.001㎍ 내지 10 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다. 특정 예에서 상기 접합체는 광감각제를 기준으로 0.1㎎ 내지 1 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제가 순차적으로 연결되어 있는 접합체)를 유효성분으로 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 암(특히, 유방암)이 의심되는 환자에서 세포 내 HER2(human epidermal growth factor receptor 2) 수준을 확인함으로써 유방암을 검출 또는 진단하는데 사용될 수 있다. 상기 키트에는 본 발명의 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제)뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제)를 이용하여 암(특히, 유방암)이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 HER2 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 유방암의 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 접합체(항-HER2 항체-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제)를 유방암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에 처리하여 HER2 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계; 상기 단계에서 검출된 HER2 단백질의 수준을 정상 대조군과 비교하여, 정상 대조군에 비하여 HER2 단백질 수준이 높으면 유방암에 걸릴 수 있는 가능성이 높은 환자로 판정하는 단계를 포함하는, 유방암의 진단을 위한 정보의 제공방법일 수 있다.
본 발명에서 용어, 생물학적 시료란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 HER2 단백질의 수준을 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, 항원-항체 복합체란 시료 중의 HER2 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 광감작제의 형광 유무를 통해 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
시약
페오포르바이드 A(Pheophorbide a), 클로린 e6(Chloin e6)는 Frontier Scientific에서 구입, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide(DCC), N-hydroxysuccinimide(nhs), 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO), 9,10-Dimethylanthracene, 말레이미드(4-Maleimidobutyric acid)는 Sigma aldrich에서 구입, 인간 유방암세포(SK-BR-3)는 한국세포주 은행에서 구입, 허셉틴(Herceptin, Trastuzumab)은 한국로슈(Roche)에서 구입, 2차 항체(Rabbit anti-Human IgG-h+I)는 Bethyl Laboratories Inc에서 구입하였다.
<실시예 1>
본 발명의 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체(HER-Mal-PEG-PheoA)의 제조
<1-1> 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체(PEG-PheoA)의 제조
폴리에틸렌글리콜과 페오포르바이드 접합에 앞서 페오포르바이드 A의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 페오포르바이드 A(pheophorbide a, PheoA, 0.146g)와 N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide(DCC, 0.0695g), N-hydroxysuccinimide(nhs, 0.0385g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 25ml)에 녹인 후 상온에서 6시간동안 반응시켰다. 6시간 반응 이 후 분자량 2,000 또는 분자량 6,000인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-bisamine, PEG, 1g) 각각을 디메틸설폭시드(DMSO, 25ml)에 녹인 후 앞선 페오포르바이드 용매에 첨가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였으며, 이후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하였다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.
<1-2> 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체(PEG-PheoA)의 분리ㆍ정제
상기 실시예 <1-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 1대1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 먼저, 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-페오로프바이드 A가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5대5의 비율에서 1대9의 비율로 다르게하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 이베퍼레이터(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 건조하였다. 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체의 분리ㆍ정제 결과는 도3과 도4와 같이 용해도 측정을 통해 확인하였다.
<1-3> 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드A 접합체(Mal-PEG-PheoA)의 제조
상기 실시예 <1-2>에서 분리ㆍ정제된 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체와 말레이미드 접합에 앞서 말레이미드의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 말레이미드(4-Maleimidobutyric acid, Mal, 0.007g)와 N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide(DCC, 0.009g), N-hydroxysuccinimide(nhs, 0.005g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 5ml)에 녹인 후 상온에서 6시간동안 반응시켰다. 6시간 반응 후 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 접합체(PEG-PheoA, 0.2g)를 디메틸설폭시드(DMSO, 10ml)에 녹인 후 앞선 말레이미드 용매에 첨가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였으며, 이후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하였다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.
<1-4> 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체의 제조
상기 실시예 <1-3>에서 제조한 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체와 허셉틴 접합을 위해 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체(0.010g)와 허셉틴(Trastuzumab, HER, 0.010g)을 각각 0.5M MES 완충제(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, 1ml)에 녹인 후 두 용매를 섞어주고 30분간 반응시켰다. 30분간 반응 이후 허셉틴과 반응하지 않은 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 12,000~14,000)을 이용하여 24시간 동안 1차 증류수를 이용하여 4℃ 환경에서 투석하며, 4℃에서 보관하였다. 결과는 투석막 내의 페오포르바이드 형광 유무를 통하여 확인하였다.
<실시예 2>
본 발명의 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체(HER-Mal-PEG-Ce6)의 제조
<2-1> 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체(PEG-Ce6)의 제조
폴리에틸렌글리콜과 클로린 e6 접합에 앞서 클로린 e6의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 클로린 e6(Chlorin e6, Ce6, 0.146g)와 N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide(DCC, 0.0695g), N-hydroxysuccinimide(nhs, 0.0385g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 25ml)에 녹인 후 상온에서 6시간동안 반응시켰다. 6시간 반응 이 후 분자량 2,000 또는 분자량 6,000인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-bisamine, PEG, 1g) 각각을 디메틸설폭시드(DMSO, 25ml)에 녹인 후 앞선 페오포르바이드 용매에 첨가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였으며, 이후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하였다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.
<2-2> 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체(PEG-Ce6)의 분리ㆍ정제
상기 실시예 <2-1>에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 1대1 당량의 접합산물만을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 먼저, 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6를 5mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5대5의 비율에서 1대9의 비율로 다르게하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 이베퍼레이터(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 건조하였다. 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체의 분리ㆍ정제 결과는 도3과 도4와 같이 용해도 측정을 통해 확인하였다.
<2-3> 말레이미드 - 폴리에틸렌글리콜 - 클로린 e6 접합체( Mal -PEG- Ce6 )의 제조
상기 실시예 <2-2>에서 분리ㆍ정제된 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체와 말레이미드 접합에 앞서 말레이미드의 카르복실기를 촉매를 이용해 반응성을 높여주기 위해 말레이미드(4-Maleimidobutyric acid, Mal, 0.007g)와 N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide(DCC, 0.009g), N-hydroxysuccinimide(nhs, 0.005g)를 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO, 5ml)에 녹인 후 상온에서 6시간동안 반응시켰다. 6시간 반응 후 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체(PEG-Ce6, 0.2g)를 디메틸설폭시드(DMSO, 10ml)에 녹인 후 앞선 말레이미드 용매에 첨가하고 상온에서 24시간동안 반응시켰다. 이 반응물을 여과한 후에 디메틸설폭시드 및 반응에 사용된 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 3,500)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석하였으며, 이후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조하였다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다.
<2-4> 허셉틴- 말레이미드 - 폴리에틸렌글리콜 - 클로린 e6 (HER- Mal -PEG- Ce6 ) 접합체의 제조
상기 실시예 <2-3>에서 제조한 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체와 허셉틴 접합을 위해 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체(0.010g)와 허셉틴(Trastuzumab, HER, 0.010g)을 각각 0.5M MES 완충제(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, 1ml)에 녹인 후 두 용매를 섞어주고 30분간 반응시켰다. 30분간 반응 이후 허셉틴과 반응하지 않은 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 12,000~14,000)을 이용하여 24시간 동안 1차 증류수를 이용하여 4℃ 환경에서 투석하며, 4℃에서 보관하였다. 결과는 MALDI-TOF MS 질량분석 결과와 투석막 내의 페오포르바이드 형광 유무를 통하여 확인하였다.
< 실험예 1>
폴리에틸렌글리콜 - 클로린 e6 접합체(PEG- Ce6 )의 수용액에서의 용해도 확인
난용성을 개선시킨 폴리에틸렌글리콜(분자량 2,000/6,000)-클로린 e6를 1mg/ml의 농도로 증류수에 녹인 후 디지털카메라로 촬영하였다.
그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 분자량 2,000과 6,000의 폴리에틸렌글리콜을 접합시킨 광감각제(클로린 e6)의 용해도를 상대적으로 비교시 분자량 2,000의 폴리에틸렌글리콜을 접합시킨 것보다 분자량 6,000의 폴리에틸렌글리콜을 접합시킨 경우 용해도가 더욱 증가하였음을 확인하였고, 뭉침 현상이나 침전물 없는 것으로 보아 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체는 기존 광감각제의 난용성이 개선된 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 2>
허셉틴, 말레이미드 - 폴리에틸렌글리콜 - 광감각제 접합체( Mal -PEG- PheoA / Ce6 , 허셉틴- 말레이미드 - 폴리에틸렌글리콜 -광감각제 접합체(HER- Mal -PEG- PheoA / Ce6 )의 형광 강도 확인
허셉틴과 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(Mal-PEG-PheoA/Ce6, 10mg/ml)를 증류수에 녹인 후, 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(HER-Mal-PEG-PheoA/Ce6)는 투석을 통한 정제과정이 종료된 상태에서 형광 영상 장치 (12-bit CCD camera, Kodak)를 이용하여 형광강도를 측정하였다.
그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 기존의 허셉틴은 형광강도를 나타내지 않지만 형광강도를 가지는 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제와 접합시킨 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콘-광감각제가 형광강도를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 3>
본 발명의 허셉틴- 말레이미드 - 폴리에틸렌글리콜 - 광감각제 접합체의 단일항산소 ( Singlet oxigen ) 생성능 확인
본 발명의 상기 실시예 1 및 2를 통해 제조된 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체인 HER-Mal-PEG-PheoA와 HER-Mal-PEG-Ce6의 일항산소발생 특성을 확인하기위해 시약 (9,10-Dimethylanthracene, Singlet oxygen quencher, Sigma aldrich, USA)을 이용하여 10mW의 레이저 강도를 갖는 670nm 파장의 레이저를 조사하여 단일항산소를 측정하였다.
그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(HER-Mal-PEG-PheoA/Ce6)는 분자량 6,000의 폴리에틸렌글리콜을 사용한 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드(HER-Mal-PEG6K-PheoA)의 단일항산소 생성능이 가장 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 4>
본 발명의 허셉틴- 말레이미드 - 폴리에틸렌글리콜 - 광감각제 접합체의 유방암 세포 분별능 확인
본 발명의 상기 실시예 1 및 2를 통해 제조된 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체인 HER-Mal-PEG-PheoA와 HER-Mal-PEG-Ce6의 유방암 세포 분별능을 확인하기 위해서 SK-BR-3 세포(인간 유방암 세포, 한국세포주은행)를 1×106 cells/well의 농도로 2mL의 배양액을 유리 글라스가 덧대어져 있는 6-well 세포 배양 접시에 각각 분주한 뒤 12 시간동안 37℃ 배양기에서 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양액을 제거한 후 SK-BR-3 세포가 붙어있는 유리 글라스를 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)에서 10분간 세포 성장을 정지시키고 DPBS로 3회에 걸쳐 세척 후, 0.1%의 트윈20(tween 20)이 포함된 5% BSA(Bovine serum albumin)에서 30분간 반응시키고 DPBS로 3회에 걸쳐 세척 후, 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(HER-Mal-PEG-PheoA/Ce6)를 각각 10μg, 1μg, 0.1μg, 0.01μg의 농도로 세포에 처리하고 1시간동안 반응하였다. 이 후, 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(HER-Mal-PEG-PheoA/Ce6)를 처리한 세포 각각에 대해 세포핵염색을 실시하였다.
그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 유방암 세포 분별능력을 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인할 수 있었다.
< 실험예 5>
본 발명의 허셉틴- 말레이미드 - 폴리에틸렌글리콜 - 광감각제 접합체의 유방암 조직 분별능 확인
본 발명의 상기 실시예 1 및 2를 통해 제조된 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체인 HER-Mal-PEG-PheoA와 HER-Mal-PEG-Ce6의 유방암 조직 분별능을 확인하기 위해서 인간 유방암 조직(Origene 구매, HER negative, HER positive, HER strong positive)들을 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)에서 10분간 세포 성장을 정지시키고 DPBS로 3회에 걸쳐 세척 후, 0.1%의 트윈20(tween 20)이 포함된 5% BSA(Bovine serum albumin)에서 30분간 반응시키고 DPBS로 3회에 걸쳐 세척 후, 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(HER-Mal-PEG-PheoA/Ce6)를 각각 0.01μg의 농도로 세포에 처리하고 1시간동안 반응하였다. 이 후, 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(HER-Mal-PEG-PheoA/Ce6)를 처리한 조직 각각에 대해 세포핵염색을 실시하였다.
그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 유방암 조직 분별능력을 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인할 수 있었다.
< 실험예 6>
본 발명의 허셉틴- 말레이미드 - 폴리에틸렌글리콜 - 광감각제 접합체의 조직 투과율 증가 확인
본 발명의 상기 실시예 1 및 2를 통해 제조된 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체인 HER-Mal-PEG-PheoA와 HER-Mal-PEG-Ce6의 유방암 조직 투과율 증가를 확인하기 위해서 SK-BR-3 세포를 Athmic nude mice(오리엔트)마우스에 이식하여 유방암 모델을 제작하였다. 상기 과정들을 통해 제작된 마우스 모델 암 부위에 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체(HER-Mal-PEG-PheoA/Ce6)를 각각 1mg/kg의 농도로 국소주사하고 3시간 뒤, 670nm파장의 레이저를 100J/cm2의 세기로 부여해준 뒤, 암 조직을 적출하여 10μm의 두께로 절편을 제조하고 조직 각각에 대해 세포핵염색을 실시하였다.
그 결과, 도 10에서 나타낸 바와 같이, 유방암 조직 투과율이 증가되었음을 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scattering microscopy)을 통해 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
PEG2K-PheoA: 분자량 2,000의 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체
PEG6K-PheoA: 분자량 6,000의 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체
PEG2K-Ce6: 분자량 2,000의 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체
PEG6K-Ce6: 분자량 6,000의 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체
Mal-PEG-PheoA: 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체
Mal-PEG-Ce6: 말레이미드-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체
HER-Mal-PEG-PheoA: 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체
HER-Mal-PEG-PheoA: 허셉틴-말레이미드-폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체
HER-Mal-PEG2k-PheoA: 허셉틴-말레이미드-분자량 2,000의 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체
HER-Mal-PEG6k-PheoA: 허셉틴-말레이미드-분자량 6,000의 폴리에틸렌글리콜-페오포르바이드 A 접합체
HER-Mal-PEG2k-Ce6: 허셉틴-말레이미드-분자량 2,000의 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체
HER-Mal-PEG6k-Ce6: 허셉틴-말레이미드-분자량 6,000의 폴리에틸렌글리콜-클로린 e6 접합체

Claims (18)

  1. 항-HER2 항체에 6,000 내지 10,000 분자량의 폴리에틸렌글리콜 및 광감각제로서 페오포르바이드 A (PheoA)가 순차적으로 연결되어 있는 암 진단용 또는 치료용 접합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항-HER2 항체는 트라스투주맙(Trastuzumab)인 것을 특징으로 하는 접합체.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항-HER2 항체와 생체 적합성 고분자는 링커에 의해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 링커는 말레이미드인 것으로 특징으로 하는 접합체.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 암은 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)를 과발현하는 암인 것을 특징으로 하는 접합체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 접합체.
  9. a) 촉매를 이용하여 6,000 내지 10,000 분자량의 폴리에틸렌글리콜과 광감각제로서 페오포르바이드 A (PheoA)를 연결하여 1차 접합체를 제조하는 단계;
    b) 촉매를 이용하여 1차 접합체에 링커를 연결하여 2차 접합체를 제조하는 단계; 및
    c) 2차 접합체에 항-HER2 항체를 연결하는 단계를 포함하는, 항체-링커-생체 적합성 고분자-광감각제가 순차적으로 연결된 암 진단용 또는 치료용 접합체 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 링커는 말레이미드인 것으로 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 a) 단계는 페오포르바이드 A (PheoA)를 촉매의 존재 하에서 용매에 녹여 반응시킴으로써 페오포르바이드 A (PheoA)의 카르복실기 반응성을 높여준 다음, 여기에 6,000 내지 10,000 분자량의 폴리에틸렌글리콜을 녹인 용액을 첨가하여 반응시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 a) 단계 이후 및 b) 단계 이전에 1차 접합체로서 6,000 내지 10,000 분자량의 폴리에틸렌글리콜과 페오포르바이드 A (PheoA)가 1 대 1 당량인 접합체만을 선택적으로 분리 및 정제하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 b) 단계는 링커인 말레이미드를 촉매의 존재 하에서 용매에 녹여 반응시킴으로써 말레이미드의 카르복실기 반응성을 높여준 다음, 여기에 1차 접합체를 녹인 용액을 첨가하여 반응시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 c) 단계는 2차 접합체와 항-HER2 항체 각각을 완충제에 녹인 후 이들을 혼합하여 반응시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 삭제
  17. 제9항에 있어서,
    상기 항-HER2 항체는 트라스투주맙(Trastuzumab)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 제9항에 있어서,
    상기 촉매는 디사이클로헥실카르보디이미드(N,N`-Dicyclohexylcarbodiimide), 하이드록시숙시이미드(N-hydroxysuccinimide) 단독 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
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WO2022149934A1 (ko) * 2021-01-08 2022-07-14 가톨릭대학교 산학협력단 암세포의 항암 면역치료를 위한 항체-폴리에틸렌글리콜-광감각제 접합체

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioconjugate Chem., (2014.02.24.), Vol. 25, pp 611-617.*
Org. Biomol. Chem., 2009, Vol. 7, pp 3400-3406.*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3508221A1 (en) 2018-01-04 2019-07-10 Korea Institute of Science and Technology Tumor-targeting photosensitizer-drug conjugate, method for preparing same and pharmaceutical composition for preventing or treating tumor containing same
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