KR102007278B1 - 바이러스 진단 및 치료를 위한 인지능 물질 및 이의 제조방법 - Google Patents

바이러스 진단 및 치료를 위한 인지능 물질 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미노 옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알리락토오스를 접합하여 제조하는 시알릭락토오스 및 광감작제를 유효성분으로 포함하는 시알릭락토오스 복합체를 통하여 바이러스를 인지할 수 있는 인지능 물질의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인지능 물질은 나노 단위의 크기를 가지며 바이러스와 쉽게 결합할 수 있다. 이는 바이러스가 세포내의 수용체를 인식하여 감염되는 경로를 제조한 인지능 물질과 바이러스가 상호작용함으로써 세포내 감염을 막는 역할을 한다. 또한 인지능 물질과 상호작용하는 바이러스의 경우 그 크기가 커져 체내 면역인자와의 결합이 높아져 효율적으로 면역작용을 통한 치료를 높일 수 있으며, 광감작제를 포함하고 있어 광원을 조사하였을 경우 광역학 치료(Photodynamic Therapy, PDT) 효과에 따른 바이러스의 직접적인 사멸을 유도하여 바이러스 질환의 치료가 가능하며, 또한 면역유도가 더욱 높아져 바이러스에 대한 혁신적인 치료법이 될 수 있으며, 이를 통하여 박테리아 세포 등을 치료하기 위하여 사용될 수 있다.

Description

바이러스 진단 및 치료를 위한 인지능 물질 및 이의 제조방법{Recognition ability materials for detection and treatment of virus that manufacture methods thereof}
본 발명은 바이러스를 특이적으로 인지하여 바이러스 진단 및 치료에 유용하게 이용할 수 있는 인지능 물질 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
바이러스는 세균보다 작은 전염성 병원체이다. 유전물질인 RNA와 그 유전 물질을 둘러싸고 있는 단백질로 구성되며 극소수 바이러스는 DNA를 가지고 있기도 한다. 크기는 세균 여과기를 통과할 수 있을 정도로 작으며 주로 10 ~ 1000 nm 사이이다. 스스로 물질대사를 할 수 없기 때문에, 자신의 DNA나 RNA를 숙주 세포 안에 침투시킨 뒤 침투당한 세포의 소기관들을 이용하여 자신의 유전물질을 복제하고, 자기 자신과 같은 바이러스를 생산하며 번식한다.
바이러스는 숙주의 종류에 따라서 식물 바이러스, 동물 바이러스 및 세균 바이러스로 나누기도 한다. 그러나, 생물 증식의 근원이 핵산에 있기 때문에, 핵산의 종류에 따라 분류한다. 2개의 종류의 핵산 중에서 어떤 핵산을 가졌는가에 따라 DNA 바이러스와 RNA 바이러스로 나뉜다. 바이러스는 RNA나 DNA의 유전물질과 그것을 둘러싸고 있는 단백질 껍질로 구성되는 매우 간단한 구조를 가진다. 단백질 껍질인 캡시드는 구슬 모양의 단백질(capsomere)이 모여 이루어진 것으로 어떤 바이러스는 단백질 껍질 이외에 지질로 이루어진 막을 가지기도 한다. 이러한 바이러스는 일반적인 영양 배지에서는 배양할 수 없지만 살아 있는 세포에서는 선택적으로 증식한다. 이러한 바이러스가 원인으로 인한 질병에는 독감, 에이즈, 담배 모자이크병, 천연두, 소아마비, 구제역, 에볼라 등이 있으며, 국내에서는 인플루엔자 바이러스로 인한 독감과 코로나바이러스의 일종인 메르스 바이러스(MERS virus)로 인한 중동 호흡기 증후군의 발병으로 큰 문제점을 안고 있다.
인플루엔자 바이러스는 과거 오래 전부터 현재까지 인류와 함께 해 온 대표적인 감염성 바이러스로 인플루엔자의 증상은 감염 초기에 콧물, 코막힘, 인후통, 두통, 기침, 발열 등 일반적임 감기와 유사한 증상을 보이나, 오한, 근육통 등 감기보다는 심각한 병증을 보이며 특히 섭씨 38도 이상의 고열을 동반하는 것이 특징이고 폐렴 등 세균 감염에 의한 합병증 발병 위험이 높다. 인플루엔자 바이러스의 종류는 크게 A, B, C (또는 D) 바이러스로 분류되며, 이중 가장 흔한 종류는 A와 B 바이러스이고, 특히 A 바이러스가 가장 일반적이다. 인플루엔자 A 바이러스는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)에 속하는 외피막(envelope)을 가지고 있는 single-stranded, negative-sense RNA 바이러스이다. 다른 RNA 바이러스들과 달리 인플루엔자 A 바이러스의 지놈(genome)은 8개(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS)의 분절(segment)로 이루어져 있으며, 약 10개 정도의 바이러스 단백질을 암호화한다. 인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 단백질 중 표면 당단백질인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니데이즈(neuraminidase, NA)의 항원특이성에 따라 현재까지 16 종류의 HA와 9종류의 NA가 존재하는 것으로 알려져 있으며, HA와 NA의 조합에 의해 인플루엔자 A 바이러스의 아형(subtype)이 결정된다.
이와 같은 특징을 가지는 인플루엔자 바이러스의 치료는 바이러스가 인체의 세포 내에 침투하여 증식할 때 이를 저해하는 방법이 대표적인 치료 방법이다. 이는 바이러스가 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포내에 침투하여 증식하는데, 바이러스가 증식한 이후 밖으로 나가기 위해서는 엑소사이토시스(exocytosis)가 이루어져야 한다. 이 때, 인플루엔자 바이러스는 시알산(sialic aicd)을 포한한 수용체와 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin)이 결합되어 있는 상태인데 이 결합은 뉴라미니데이즈가 관여한다. 최근에 개발된 약은 뉴라미니데이즈의 저해제로 작용하여 바이러스가 수용체와의 결합을 끊어지는 것을 막아서 인플루엔자에 관한 병을 치료하고 있다.
한편, 코로나바이러스는 코로나바이러스과에 속하는 바이러스를 통칭하는 말로, 감기의 주된 원인으로, 다른 병원에 의한 감기와의 가장 큰 차이점은, 소화기관도 감염시킨다는 것이다. 코로나바이러스는 보통 인간보다는 다른 동물을 대상으로 전염되며, 종종 인간에게 전염되는 변종이 등장하여 큰 위험을 주고 있다. 동물에서 인간에게 전염될 수 있기 때문에, 변이로 인해 가끔씩 유행병을 가져올 수 있다. 예를 들어 사스와 최근 발생한 메르스이다. 코로나바이러스는 리노 바이러스와 마찬가지로, 폐를 직접 공격할 수 있기 때문에 심할 경우 매우 치명적 일 수 있다. 이러한 코로나바이러스는 유전물질로 단일가닥의 RNA를 가지고 있으며 외피로 둘러싸여 있다. 코로나바이러스의 게놈 크기는 26~32 kb로, RNA 바이러스 중 큰 게놈 크기를 가지고 있다.
지난 2003년에는 세계적으로 약 8,000여 명의 사람이 사스(SARA-CoV)에 감염되어 약 10%가 사망했다. 최근에 한국에서도 코로나바이러스의 일종인 메르스가 발병하여 감염자 중 약 10%가 사망하였다. 이러한 코로나바이러스는 연구가 계속 되고 있지만 실질적인 백신이나 치료제가 없는 실정이다. 코로나바이러스의 경우 인체에 DPP4(Dipeptidyl peptidase-4)라는 단백질을 매개로 하여 감염이 일어난다고 알려져 있다. 이와 같은 바이러스의 특징을 고려해 볼 때, 고분자를 활용한 기술 개발이나 광감작제를 통한 기술 개발이 현재 이루어지지 않은 실정이다.
미국공개특허 제2012-0015344호 (2012.01.19 공개)
본 발명의 목적은 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알릭락토오스가 접합된 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체를 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알릭락토오스가 접합된 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체를 제공한다.
본 발명은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 아미노옥시 그룹을 도입하여 연결체의 반응기를 활성화시키는 단계; 및 2) 상기 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체에 시알릭락토오스를 접합하는 단계를 포함하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법을 제공한다.
본 발명은 아미노 옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알리락토오스를 접합하여 제조하는 시알릭락토오스 및 광감작제를 유효성분으로 포함하는 시알릭락토오스 복합체를 통하여 바이러스를 인지할 수 있는 인지능 물질의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인지능 물질은 나노 단위의 크기를 가지며 바이러스와 쉽게 결합할 수 있다. 이는 바이러스가 세포내의 수용체를 인식하여 감염되는 경로를 제조한 인지능 물질과 바이러스가 상호작용함으로써 세포내 감염을 막는 역할을 한다. 또한 인지능 물질과 상호작용하는 바이러스의 경우 그 크기가 커져 체내 면역인자와의 결합이 높아져 효율적으로 면역작용을 통한 치료를 높일 수 있으며, 광감작제를 포함하고 있어 광원을 조사하였을 경우 광역학 치료(Photodynamic Therapy, PDT) 효과에 따른 바이러스의 직접적인 사멸을 유도하여 바이러스 질환의 치료가 가능하며, 또한 면역유도가 더욱 높아져 바이러스에 대한 혁신적인 치료법이 될 수 있으며, 이를 통하여 박테리아 세포 등을 치료하기 위하여 사용 될 수 있다.
도 1은 시알릭락오스와 바이러스 간의 결합과, 그로 인한 크기의 증가로 면역세포 인지능이 향상되어 식세포 작용을 통한 바이러스의 치료 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI 1.8K의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI 25K의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEG-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 SL-DAB-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI 1.8K-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI 25K-Ce6의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 SL-DAB-Pp의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 SL-PEI-Pp의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 입자의 크기를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 농도별 세포독성을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 시간변화에 따른 세포내 흡수를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 MDCK 세포에 바이러스를 감염시킬 때, a) 제조한 SLPEGCe6, SLDABCe6를 함께 반응시키고 레이저 조사 유무에 따라 생성되는 플락의 개수를 비교하여 나타낸다. b) 제조한 SL-PEI 1.8K-Ce6, SL-PEI 25K-Ce6의 농도별로 바이러스와 반응시켜 생성되는 plaque 개수의 감소정도를 나타낸다. c) 항바이러스제의 일종인 oseltamivir (Tamiflu®)와 비교하여 농도별로 비교하고 레이저의 조사 유무에 따른 plaque 개수의 감소 정도를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와 상호작용 후 세포내 바이러스 표면 단백질의 발현 정도를 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 농도별 바이러스 검출정도를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와의 상호작용과 레이저 조사 후 바이러스의 변화를 투과 전자현미경 사진으로 나타낸다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와 상호작용을 공초점 현미경 사진으로 나타낸다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 STD-NMR 실험법을 이용하여 바이러스 표면 단백질과 일실시예 사이의 상호작용하는 것을 나타낸다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와 상호작용 후 마우스 비강내로 접종하였을 때 바이러스의 생체내 감염 억제와 레이저 조사에 따른 바이러스의 불활성화로 인한 동물모델에서의 항바이러스 효과를 나타낸다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 바이러스와 상호작용 시킨 후 레이저를 조사하여 불활성화 시킨 다음 마우스 내로 접종하였을 때 마우스가 바이러스에 감염이 되면 보이는 증상이 실시예를 처리한 그룹에는 관찰되지 않는 것을 나타낸다.
바이러스가 해당하는 수용체(receptor)에 결합할 때, 대부분 구조적인 부분을 인식하여 결합을 하게 된다. 구조적인 부분이 맞지 않으면 바이러스가 해당 수용체를 인식하기 힘들다. 따라서 본 발명자들은 바이러스가 인식할 수 있는 수용체의 구조적인 부분을 유지하기 위해 구조체를 선택적으로 합성하는 방법인 옥심케미스트리를 이용하여 바이러스 표적화 물질의 활성을 극대화 시켰다. 옥심케미스트리(oxime chemistry)는 클릭케미스트리(click chemistry)의 한 종류로 아미노옥시그룹(aminooxy group)이 환원력을 가지는 당구조체 부분과 선택적으로 반응한다. 이러한 반응의 경우 당단백질이나 당구조체 간의 구조적인 특이성을 가지고 입자간 상호작용을 하는 경우에 응용이 가능하다. 구조적으로 중요한 부분을 보호하면서 상대적으로 영향이 적은 부분을 개질화 함으로서 실제 입자간 상호작용과 매우 유사하게 반응시킬 수 있다.
이에 본 발명자들은 옥심케미스트리를 이용하여 바이러스 표적화 물질의 활성을 극대화 시키고, 선택적으로 고분자를 접합하여 바이러스와 인지능 물질간의 상호작용을 더욱 증대시켰다. 바이러스의 치료를 위한 인지능 물질을 개발하고 이를 통하여 바이러스를 인식할 수 있는 인지능 물질을 제조하고, 광감작제를 포함하여 인체 내 바이러스를 인지하여 직접적인 사멸효과를 통한 바이러스의 질환의 치료효과를 기대할 수 있다.
본 발명은 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체와 시알릭락토오스가 접합된 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 시알릭락토오스 복합체는 상기 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체에 광감각제가 추가적으로 접합될 수 있다.
바람직하게는, 상기 연결체는 폴리에틸렌글리콜, 디아미노뷰테인, 폴리에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 광감각제는 클로린류(chlorins) 또는 포피린류(phophyrins)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 클로린 e6 또는 포르피린일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 시알릭락토오스 복합체는 시알릭락토오스-폴리에틸렌글리콜-클로린(SL-PEG-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린(SL-DAB-Pp), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린(SL-PEI-Pp) 또는 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민(SL-PEI)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 바이러스 질환은 인플루엔자바이러스로 인한 질환, 중증급성호흡기증후군(SARS), 중동호흡기증후군(MERS) 등과 같은 코로나바이러스로 인한 호흡기 질환, 호흡기 감염증, 유행성 각결막염, 출혈성 방광염, 신생아 장염 등과 같은 아데노바이러스로 인한 질환, 구토, 발열, 설사 등과 같은 레오바이러스로 인한 질환, 로타바이러스로 인한 질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학조성물은 약학적으로 유효한 양의 시알릭락토오스 복합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 시알릭락토오스 복합체의 약학적으로 유효한 양은 0.01 ~ 100 mg/day/체중kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다.
상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여 하거나 비경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 목적하는 방법에 따라 치료 효과적인 질환 상태 또는 증상이 있는 사람 또는 기타 포유동물에 적합하게는 주사 또는 기타 다른 방법으로 전달(예: 이식, 체강 또는 가능한 공간에 넣는 것, 신체의 조직 표면을 코팅 또는 이식가능한 장치의 표면을 코팅함으로써)될 수 있지만, 특히, 상기 약학조성물은 비경구로 전달되는 것이 바람직하다. 이때, "비경구"란 근육내, 복막내,복부내, 피하, 정맥 및 동맥내를 의미한다. 그러므로 본 발명의 고분자 나노접합체를 포함하는 약학조성물은 대표적으로 주사 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 주사가능한 약학조성물은 임의의 적합한 방법, 바람직하게는 피하 바늘을 통한 주사에 의해 사람 또는 기타 포유동물의 체내에 주사 또는 삽입할 수 있다. 예를 들면, 주사 또는 기타 다른 방식으로 동맥내, 정맥내, 비뇨생식기, 피하, 근육내, 피하, 두개내, 심장막내, 흉막내, 또는 기타 신체강 또는 가능한 공간 내로 투여할 수 있다. 또는, 카테터 또는 시린지를 통해 예를 들어 관절경 시술 동안에 관절내로, 또는 비뇨생식관내로, 맥관내로, 구개내로 또는 흉막내, 또는 신체 내임의의 체강 또는 가능한 공간내로, 수술, 외과, 진단 또는 중재 시술 도중에 도입할 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 아미노옥시 그룹을 도입하여 연결체의 반응기를 활성화시키는 단계; 및 2) 상기 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체에 시알릭락토오스를 접합하는 단계를 포함하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 시알릭락토오스 복합체 제조방법은 상기 (1) 단계 이후 광감각제를 추가적으로 접합할 수도 있다.
바람직하게는, 상기 연결체는 폴리에틸렌글리콜, 디아미노뷰테인, 폴리에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 광감각제는 클로린류(chlorins) 또는 포피린류(phophyrins)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 클로린 e6 또는 포르피린일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 1) 단계는 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester) 또는 t-Boc-아미노옥시아세트산(t-Boc-aminooxyacetic acid)으로 활성화시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 시알릭락토오스 복합체는 시알릭락토오스-폴리에틸렌글리콜-클로린(SL-PEG-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린(SL-DAB-Pp), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린(SL-PEI-Pp) 또는 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민(SL-PEI)일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 옥심케미스트리(oxime chemistry) 를 이용하여 시알릭락토오스 -폴리에틸렌이민(SL-PEI 1.8K) 바이러스 인지능 물질 제조
1. 옥심케미스트리를 이용하기 위한 아미노옥시그룹이 도입된 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI, M.W = 1.8 KDa) 고분자 제조
폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W=1.8 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, M.W=1.8 KDa) 분자 한 개당 대략 16개 ~ 17개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 300 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 360 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 360 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 5mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=1.8 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다.
얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
2. 시알릭락토오스 -폴리에틸렌이민 ( SL - PEI 1.8K)을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조
상기에서 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민 (Aminooxy-PEI 1.8K) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 15배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 1.8K-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 2).
< 실시예 2> 옥심케미스트리(oxime chemistry) 를 이용하여 시알릭락토오스 -폴리에틸렌이민 ( SL - PEI 25K) 바이러스 인지능 물질 제조
1. 옥심케미스트리를 이용하기 위한 아미노옥시그룹이 도입된 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI, M.W = 25 KDa) 고분자 제조
폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W= 25 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, MW=25 KDa) 분자 한 개당 대략 200개 ~ 211개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 200 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 240 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 240 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 10mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=25 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다.
얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
2. 시알릭락토오스 -폴리에틸렌이민 ( SL - PEI 25K)을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조
제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 (Aminooxy-PEI 25K) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 200배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 (Aminooxy-PEI-Pp)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 3).
< 실시예 3> 옥심케미스트리(oxime chemistry) 를 이용하여 시알릭락토오스 - 폴리에틸렌글리콜 -클로린(SL-PEG-Ce6) 바이러스 인지능 물질 제조
1. 광감각제인 클로린과 폴리에틸렌글라이콜 (PEG- Ce6 ) 고분자 제조
폴리에틸렌글리콜과 클로린의 합성시 클로린의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. 클로린(chlorin e6, Ce6) 60mg, N,N-디사이클로핵실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 25mg, N-하이드록시숙신이미드(N-Hydrosuccinimide, NHS) 14mg을 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 5ml에 녹인 후 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol-diamine, PEG) 200mg을 디메틸설폭시드 5ml에 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 클로린 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1,000)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어낸다.
2. 광감각제인 클로린과 폴리에틸렌글리콜 (PEG- Ce6 ) 고분자 분리 및 정제
상기에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-클로린 1 대 1 당량의 결합 산물을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체를 6mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 폴리에틸렌글리콜-클로린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5 비율에서 1대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득률은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 회수하였다.
3. 시알릭락토오스 - 폴리에틸렌글리콜 - 클로린 ( SL -PEG- Ce6 ) 접합하여 바이러스 인지능 물질 제조
상기에서 분리정제된 폴리에틸렌글리콜-클로린 합성물과 시알릭락토오스를 접합하기에 앞서 시알릭락토오스의 글루코스 부분에 선택적으로 합성하기 위해 먼저 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester)를 정제 후 얻은 분말의 1.5배의 몰비율로 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 5ml에 정제 후 얻은 분말과 함께 넣어 녹인 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고 사용하였던 용매 및 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1,000)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어낸다.
얻은 분말에서 t-Boc-보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1,000)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
얻어낸 산물은 t-Boc- 보호 그룹을 제거한 아미노옥시(aminooxy) 반응기를 가진 폴리에틸렌글리콜-클로린(aminooxy-PEG-Ce6) 형태로 시알릭락토오스를 접합하기 위해 얻어낸 산물의 1.2 몰비율의 시알릭락토오스를 1차증류수 10ml을 100uM의 아세틱산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌글리콜-클로린(aminooxy-PEG-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후 60℃에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 최종 산물을 얻어내었다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다(도 4).
<반응식 1>
Figure 112018005666275-pat00001
< 실시예 4> 옥심케미스트리(oxime chemistry) 를 이용하여 시알릭락토오스 - 디아미노뷰테인 -클로린(SL-DAB-Ce6) 바이러스 인지능 물질 제조
1. 광감각제인 클로린과 디아미노뷰테인(DAB-Ce6)의 접합체 제조
디아미노뷰테인(Diaminobutane, DAB)과 클로린(Chlorin e6, Ce6)의 합성시 클로린의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. 클로린 150mg, N,N-디사이클로핵실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 62mg, N-하이드록시숙신이미드(N-Hydrosuccinimide, NHS) 35mg을 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 5ml에 녹인 후 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 디아미노뷰테인 0.44ml을 디메틸설폭시드 5ml에 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 클로린 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
2. 시알릭락토오스 - 디아미노뷰테인 - 클로린(SL-DAB-Ce6)을 접합하여 바이러스 인지능 물질 제조
상기에서 합성한 디아미노뷰테인-클로린 합성물과 시알릭락토오스를 접합하기에 앞서 시알릭락토오스의 글루코스 부분에 선택적으로 합성하기 위해 먼저 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester)를 얻은 분말의 1.5배의 몰비율로 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 5ml에 얻은 분말과 함께 넣어 녹인 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고 사용하였던 용매 및 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 분말을 얻어내었다.
얻은 분말에서 t-Boc-보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-보호 그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
얻어낸 산물은 t-Boc-보호 그룹을 제거한 아미노옥시(aminooxy) 반응기를 가진 디아미노뷰테인-클로린(amiooxy-DAB-Ce6) 형태로 시알릭락토오스를 접합하기 위해 얻어낸 산물의 1.2 몰비율의 시알릭락토오스를 1차 증류수 10ml을 100uM의 아세틱산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-디아미노뷰테인-클로린(aminooxy-DAB-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후 60℃에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 반응물을 얻어내었다.
3. 시알릭락토오스 - 디아미노뷰테인 - 클로린 ( SL -DAB- Ce6 )을 접합한 물질의 분리 및 정제
상기에서 제조된 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6) 결합 산물을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린 접합체를 6mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 최종산물을 회수하였다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다(도 5).
<반응식 2>
Figure 112018005666275-pat00002
< 실시예 5> 옥심케미스트리(oxime chemistry) 를 이용하여 시알릭락토오스 -폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI 1.8K- Ce6 ) 바이러스 인지능 물질 제조
1. 옥심케미스트리를 이용하기 위한 아미노옥시그룹이 도입된 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI, M.W = 1.8 KDa) 고분자 제조
폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W=1.8 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, M.W=1.8 KDa) 분자 한 개당 대략 16개 ~ 17개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 300 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 360 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 360 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 5mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=1.8 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다.
2. 아미노옥시아세트산 -폴리에틸렌이민- 클로린 ( Aminooxyaceticacid - PEI 1.8K- Ce6 ) 을 접합하여 바이러스 치료효과를 나타내는 고분자 물질 제조
상기에서 합성한 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민(t-Boc-Aminooxyacetic acid-PEI 1.8K) 합성물과 클로린 (Chlorin e6, Ce6)을 접합하기 위에 클로린 분자에 있는 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 클로린 20mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 24 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 24 mM을 디메틸설폭시드 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO) 2mL 에서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 반응물을 디메틸설폭시드 10mL 에 미리 녹여놓은 Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 접합체 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
3. 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린 (SL-PEI 1.8K-Ce6)을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조
상기에서 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 1.8K -Ce6) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 15배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 1.8K-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 3500 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 6).
<반응식 3>
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< 실시예 6> 옥심케미스트리(oxime chemistry) 를 이용하여 시알릭락토오스 -폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI 25K- Ce6 ) 바이러스 인지능 물질 제조
1. 옥심케미스트리를 이용하기 위한 아미노옥시그룹이 도입된 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W=25 KDa) 고분자 제조
폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W= 25 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, MW=25 KDa) 분자 한 개당 대략 200개 ~ 211개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 200 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 240 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 240 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 10mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=25 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다.
2. 아미노옥시아세트산 -폴리에틸렌이민- 클로린 ( Aminooxyaceticacid - PEI 25K -Ce6)을 접합하여 바이러스 치료효과를 나타내는 고분자 물질 제조
상기에서 합성한 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 (t-Boc-Aminooxyacetic acid-PEI 25K) 합성물과 클로린 (Chlorin e6, Ce6)을 접합하기 위에 클로린 분자에 있는 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 클로린 10mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 12 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 12 mM을 디메틸설폭시드 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO) 2mL 에서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 반응물을 디메틸설폭시드 15mL 에 미리 녹여놓은 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 접합체 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
3. 시알릭락토오스 -폴리에틸렌이민- 클로린 ( SL - PEI 25K- Ce6 )을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조
상기에서 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 25K -Ce6) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 200배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-클로린 (Aminooxy-PEI 25K-Ce6)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 7).
< 실시예 7> 옥심케미스트리(oxime chemistry) 를 이용하여 시알릭락토오스 - 디아미노뷰테인 -포르피린 ( SL -DAB- Pp ) 바이러스 인지능 물질 제조
1. 광감각제인 포르피린와 디아미노뷰테인(DAB-Pp)의 접합체 제조
디아미노뷰테인(Diaminobutane, DAB)과 포르피린 (Porphyrin , Pp)의 합성시 포르피린의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. 포르피린 150mg, N,N-디사이클로핵실카르보디이미드(Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 62mg, N-하이드록시숙신이미드(N-Hydrosuccinimide, NHS) 35mg을 디메틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 5ml에 녹인 후 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 디아미노뷰테인 0.44ml을 디메틸설폭시드 5ml에 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 포르피린 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
2. 시알릭락토오스 - 디아미노뷰테인 -포르피린 ( SL -DAB- Pp )을 접합하여 바이러스 인지능 물질 제조
상기에서 합성한 디아미노뷰테인-포르피린 합성물과 시알릭락토오스를 접합하기에 앞서 시알릭락토오스의 글루코스 부분에 선택적으로 합성하기 위해 먼저 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester)를 얻은 분말의 1.5배의 몰비율로 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 5ml에 얻은 분말과 함께 넣어 녹인 후 상온에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고 사용하였던 용매 및 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조하여 분말을 얻어내었다.
얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 100-500 Da)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
얻어낸 산물은 t-Boc- 보호 그룹을 제거한 아미노옥시(aminooxy) 반응기를 가진 디아미노뷰테인-포르피린 (aminooxy-DAB-Pp) 형태로, 시알릭락토오스를 접합하기 위해 얻어낸 산물의 1.2 몰비율의 시알릭락토오스를 1차 증류수 10ml을 100uM의 아세틱산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-디아미노뷰테인-포르피린 (aminooxy-DAB-Pp)와 시알릭락토오스를 녹인 후 60℃에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 1 KDa)을 이용하여 3일 동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 반응물을 얻어내었다.
3. 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린 (SL-DAB-Pp)을 접합한 물질의 분리 및 정제
상기에서 제조된 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린 (SL-DAB-Pp) 결합 산물을 선택적으로 분리 및 정제하기 위하여 소수성크로마토그래피(sephadex LH-20)를 실시하였다. 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린 접합체를 6mg/ml의 농도로 메탄올(methanol)에 녹인 후, 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린 접합체가 포함된 메탄올을 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)에 주입하고 물과 메탄올의 비율을 5 대 5 비율에서 1 대 9의 비율로 다르게 하며 1분 간격으로 수득물을 회수하였다. 소수성 크로마토그래피(sephadex LH-20)를 거친 수득물은 회전증발농축장치(evaporator)를 이용하여 메탄올을 제거하였으며 동결건조를 통해 최종산물을 회수하였다. 결과는 핵자기공명스펙트럼(1H-NMR)을 통하여 확인하였다(도 8).
< 실시예 8> 옥심케미스트리(oxime chemistry) 를 이용하여 시알릭락토오스 -폴리에틸렌이민-포르피린 ( SL - PEI - Pp ) 바이러스 인지능 물질 제조
1. 옥심케미스트리를 이용하기 위한 아미노옥시그룹이 도입된 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI, M.W = 25 KDa) 고분자 제조
폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI, M.W= 25 KDa) 에 있는 아민그룹에 t-Boc-그룹으로 protection되어 있는 아미노옥시아세트산 분자를 접합하여 폴리에틸렌이민의 아민그룹을 아미노옥시 그룹으로 변환시켜주기 위해 합성을 진행하였다. 폴리에틸렌이민(PEI, MW=25 KDa) 분자 한 개당 대략 200개 ~ 211개의 1차 아민기가 존재하고, 1차 아민기를 아미노옥시그룹으로 변환시키기 위해 반응물의 양을 계산하였다. 먼저 t-Boc-아미노옥시아세트산 (t-Boc-Aminooxyacetic acid)의 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 촉매를 이용하였다. t-Boc-아미노옥시아세트산 200 mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 240 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 240 mM을 디메틸포름아미드 (Dimethylformamide , DMF) 10mL 에 서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 폴리에틸렌이민 (M.W=25 KDa) 20mM 을 디메틸포름아미드 5 mL에서 녹인 후 미리 반응시켜 두었던 t-Boc-아미노옥시아세트산 용액에 첨가한 후 상온에서 36시간 동안 반응하였다. 36시간 후 미반응물을 제거하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 과량의 디에틸에테르 (Diethylether)에 재결정시켜 침전물을 얻어내고 얻어낸 침전물을 감압 건조하여 분말을 얻어내었다.
2. 아미노옥시아세트산 -폴리에틸렌이민-포르피린 ( Aminooxyaceticacid - PEI 25K-Pp)을 접합하여 바이러스 치료효과를 나타내는 고분자 물질 제조
상기에서 합성한 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 (t-Boc-Aminooxyacetic acid-PEI) 합성물과 광감작제의 일종인 포르피린 (Protoporphyrin IX, Pp)을 접합하기 위에 포르피린 분자에 있는 카르복실기의 반응성을 높이기 위해 포르피린 10mM, 디사이클로헥시카르보이미드 (Dicyclohexycarbodiimide, DCC) 12 mM (1.8, N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydrosuccinimide, NHS) 12 mM을 디메틸설폭시드 (Dimethyl Sulfoxide, DMSO) 2mL 에서 상온에서 4시간 반응하였다. 4시간 반응 후 반응물을 디메틸설폭시드 15mL 에 미리 녹여놓은 t-Boc 아미노옥시아세트산-폴리에틸렌이민 접합체 용액에 첨가한 후 상온에서 24시간 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 사용하였던 용매 및 촉매를 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
얻은 분말에서 t-Boc- 보호 그룹(tert-Butyloxycarbonyl protecting group)을 제거하기 위해 5ml의 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid, TFA) 용액을 넣고 2시간 반응 후 회전증발농축장치(rotary evaporator)을 통해 트리플루오로아세틱산를 증발시킨 후, 남은 용매와 t-Boc-그룹을 제거하기 위해 투석막(Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다.
3. 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린 (SL-PEI 25K-Pp)을 접합하여 바이러스와 상호작용하는 바이러스 치료용 고분자 물질의 제조
상기에서 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 (Aminooxy-PEI 25K -Pp) 에 시알릭락토오스를 접합하기 위해 제조된 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 분말의 무게를 잰 후 계산한 몰 수에서 200배의 몰비율로 시알릭락토오스를 넣어준다. 반응은 3차 증류수 를 0.1 mM 의 아세트산(acetic acid)를 이용하여 pH 5.3으로 조정 후 아미노옥시-폴리에틸렌이민-포르피린 (Aminooxy-PEI-Pp)와 시알릭락토오스를 녹인 후, 60℃ 에서 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후 반응물을 여과하고, 미반응물을 제거하기 위해 투석막 (Spectra/Por; molecular weight cutoff size 12,000~14,000 Da)을 이용하여 3일동안 1차 증류수로 투석하였다. 투석 후 반응물을 동결건조 하여 분말을 얻어내었다(도 9).
< 실험예 1> 바이러스 인지능 물질의 크기 측정
1. 실험을 실시한 목적
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 바이러스와 상호작용하기 위해 적정한 크기를 가지고 있는지 확인하는데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예에서 제조한 인지능 물질의 입자 사이즈 분포를 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK)를 이용하여 측정하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 인지능 물질의 입자 사이즈 분포를 Zetasizer Nano ZS로 측정한 결과, SL-PEG-Ce6의 크기는 102.0nm, SL-DAB-Ce6의 크기는 211.3nm, SL-PEI 1.8K-Ce6의 크기는 129.9nm로 측정되었다(도 10).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질의 크기를 측정한 결과 물질의 크기가 100nm~200nm 정도로 인플루엔자 바이러스의 크기로 알려져 있는 80nm~120nm 와 유사한 크기를 갖는 것을 측정하였다. 바이러스와 유사한 크기를 갖는 것이 바이러스와 상호작용하기에 효과적일 것으로 판단할 수 있었다.
< 실험예 2> 제조한 바이러스 인지능 물질의 세포독성 확인
1. 실험을 실시한 목적
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 세포독성을 나타내지 않는 농도를 확인하는데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질의 세포독성을 확인하기 위하여 L929 (마우스 섬유아세포), MDCK (개과동물 신장상피세포), A549 (사람 폐암세포)에 대하여 각각의 세포를 96well에 1 × 104 cells/well의 농도로 세포를 각 well에 100ul씩 넣어 분주하고 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24시간 후 각각의 세포에 상기 실시예에서 제조한 인지능 물질을 0.5ug/mL 에서 50ug/mL 까지 다양한 농도로 처리하고 4시간, 37℃, 5% CO2 조건에서 반응 후 MTT 시험법을 이용하여 세포 생존율을 대조군과 비교하여 계산하였다. 대조군은 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다. MTT 용액 처리 후 나타나는 형광강도를 570nm에서 멀티리더기 (Synergy H1 Multi-mode Reader, Biotek)을 이용하여 확인 하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 일반 세포에서 독성을 나타내는 농도를 파악할 수 있었고, 실시예에서 제조한 물질 모두 5μg/mL 이하의 농도에서 세포 독성을 거의 나타내지 않는 것으로 확인하였다(도 11).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 여러 세포주에서 어떤 농도에서 세포독성을 나타내는지 확인할 수 있었고, 실시예의 인지능 물질 모두 5μg/mL 이하의 농도에서 세포독성을 거의 나타내지 않는 것으로 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 제조한 바이러스 인지능 물질을 세포독성이 없으면서 바이러스 치료효과를 보이는 농도 범위를 설정하는데 참고할 수 있었다.
< 실험예 3> 시간 변화에 따른 바이러스 인지능 물질의 일반 세포 내로 함입 확인
1. 실험을 실시한 목적
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 시간변화에 따라 세포 내로 어느 정도 유입되는지 확인하고, 바이러스와 인지능 물질 간의 반응시간을 결정하고자 하는데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 MDCK 세포 (개과동물 신장상피세표)에 2-3μg/mL의 농도로 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 별로 처리하였다. 4시간 후 DPBS로 2번 세척 후 세포를 회수한 후 유세포 분석기 (Flow cytometer, BD FACSCanto Ⅱ)로 분석하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 유세포 분석기로 분석한 결과, SL-PEG-Ce6는 30분-4시간 동안 세포 내 흡수가 큰 변화를 보이지 않았으며, SL-DAB-Ce6는 처리 후 30분부터 세포 내 흡수가 진행되고 시간이 경과함에 따라 더 많은 물질이 세포내 흡수되는 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지로 SL-PEI 1.8K-Ce6, SL-PEI 25K-Ce6도 30분부터 세포내 흡수가 진행되고 시간이 경과함에 따라 더 많은 물질이 세포내로 흡수되는 것을 확인 할 수 있었다(도 12).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질의 세포내 흡수를 시간변화에 따라 결과를 유세포 분석기로 관찰하였다. 그 결과 SL-DAB-Ce6의 경우가 30분부터 세포 내로 흡수가 되는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 제조한 물질이 실제 세포환경에서 바이러스와 상호작용을 하고 추후 진행되는 실험에서 제조한 인지능 물질과 바이러스의 상호작용시 시간 범위 설정에 있어 참고할 수 있었다.
< 실험예 4> 플락 억제 분석(Plaque inhibition assay)을 통한 바이러스 인지능 물질의 바이러스의 세포내 감염 억제와 레이저 조사 후 활성화된 바이러스 개수 변화 관찰하여 바이러스 사멸효과 확인
1. 실험을 실시한 목적
바이러스 인지능 물질에 포함되어 있는 광감각제의 효과로 레이저를 조사했을 때 발생되어 지는 일항산소로 바이러스가 불활화되어 감염력을 잃는지 확인하고 세포 내 감염시켰을 때 일정 시간 후 증식된 바이러스의 차이가 있는지 확인하는 데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예에서 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체를 3ug/ml 농도와 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza virus A H1N1 A/California/07/2009) 1 × 104 PFU/ml 농도를 1:1로 섞은 후 37℃에서 2시간 반응시킨다. 반응 후 671nm 파장의 레이저를 3 J/cm2의 세기로 조사한 후, MDCK 세포가 있는 12well 세포배양 접시에 0.1mL 씩 넣고 1시간 30분 동안 세포에 바이러스를 감염시킨다. 1시간 30분 후 무혈청 DMEM 배지가 포함된 1% 아가로스 겔(agarose gel)을 well에 1.5mL 씩 넣어 준 후 굳힌다. 37℃, 5% 조건에서 72시간 동안 배양한다. 72시간 후 고정용액(메탄올:아세트산=3:1)과 크리스탈바이올렛 용액을 1대1로 섞은 후 굳은 겔 위에 2mL씩 넣어준 후, 24시간 염색한다. 염색 후 well에 들어있는 겔을 제거하고 세척하여 건조한 후 염색되지 않은 부분인 플락(plaque)의 개수를 세어 결과를 확인한다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 바이러스와 반응시킨 후 레이저를 조사하고 이를 세포에 감염시키게 되면, 레이저를 조사한 실험군에서 바이러스가 생성하는 플락의 개수가 감소하는 것을 확인하였다. 실시예에서 제조한 인지능 물질 SL-PEG-Ce6, SL-DAB-Ce6, SL-PEI 1.8K-Ce6, SL-PEI 25K-Ce6를 비교한 결과 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 효과적으로 바이러스를 불활화시키는 것을 확인하였다(도 13).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 인지능 물질을 바이러스와 반응시키고 레이저 조사 후 세포에 감염시켰을 때, 감염 후 바이러스가 생성하는 플락의 개수가 감소하였다. 이는 감염력을 가지는 바이러스의 개수가 감소한 것을 의미하고 제조한 인지능 물질이 바이러스의 불활성화를 유도한 것으로 판단하였다. 또한 실시예에서 제조한 인지능 물질에 레이저를 조사하지 않은 실험군에서도 플락의 개수가 감소한 것으로 보아 인지능 물질을 처리하는 것으로도 바이러스의 세포감염을 억제하는 것을 확인하였다.
< 실험예 5> 바이러스 인지능 물질의 바이러스의 세포내 감염 억제 및 바이러스 불활화 정도를 Western blot 실험을 통한 확인
1. 실험을 실시한 목적
바이러스 인지능 물질과 바이러스를 같이 처리하고 바이러스의 표면단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)를 인식하는 항체를 이용하여 세포내 존재하는 바이러스 단백질의 양을 western blot 실험을 통해 확인한 결과, 바이러스만 처리한 대조군에 비해서 적은 양의 바이러스 표면단백질이 검출되는지 확인하여 실제로 바이러스와 제조한 인지능 물질이 바이러스의 세포내 감염을 억제하는지 확인하는데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예에서 각각 제조한 바이러스 인지능 물질 15 μg/mL 을 MDCK (Canine kidney cell line) 세포 5 × 105 cells/well에 바이러스(인플루엔자 A H1N1 A/California/07/2009) 2 × 104 PFU와 동시에 처리한 후 한 그룹에는 레이저를 조사하고 다른 한 그룹에는 레이저를 조사하지 않고 이틀간 배양한다. 이틀후 Cell lysis buffer (RIPA buffer)처리 후 scraper로 세포가 배양되고 있는 plate의 각 well을 긁어 세포를 모은다. 모은 세포를 원심분리하여 상층액을 분리해 내고 분리해낸 상층액에 존재하는 단백질의 양을 BCA 정량법을 이용하여 정량한다. 각 well에서 정량하여 계산한 단백질의 양을 기준으로 SDS-PAGE를 실시하여 전기영동을 실시한다. 전기영동 후 Gel에 존재하는 단백질을 PVDF membrane에 transfer 시킨 후 5% skim milk 용액으로 blocking 과정을 거친다. Blocking 후 1차 항체(mouse anti-hemagglutinin antibody)로 인플루엔자 A 바이러스의 표면단백질인 헤마글루티닌(HA, Hemagglutinin)에 특이적으로 인식하는 항체를 처리한 후 4℃ 에서 overnight 반응 시킨다. 반응 후 0.1 % tween 20 이 포함되어 있는 TBS buffer 용액으로 충분히 세척 후, 2차 항체(goat anti-mouse antibody HRP conjugated)를 처리한 후 상온에서 2시간 정도 반응 후, 0.1 % tween 20 이 포함되어 있는 TBS buffer 용액으로 충분히 세척한다. 세척 후 Chemi-doc 이라는 장비를 이용하여 blotting하여 나타나는 밴드를 관찰한다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 바이러스와 함께 처리 후 이틀간 배양한 결과, SL-PEG-Ce6에서는 인플루엔자 표면단백질인 헤마글루티닌이 검출이 된 반면, SL-DAB-Ce6에서는 레이저 조사 유무에 관계없이 세포내에서 인플루엔자 바이러스의 표면단백질은 헤마글루티닌이 검출되지 않은 것을 확인할 수 있었다(도 14).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질을 바이러스와 함께 세포에 처리하였을 때, 인플루엔자 바이러스이 표면단백질인 헤마글루티닌에 대한 western blot 실험 결과 바이러스 표면단백질이 세포내에서 검출되지 않는 것을 확인하였다. 이를 통해 제조한 바이러스 인지능 물질이 바이러스가 세포내로 감염되는 것을 충분히 억제하는 것으로 판단하였다.
< 실험예 6> ELISA 키트를 이용하여 바이러스 인지능 물질과 바이러스 간의 상호작용 확인
1. 실험을 실시한 목적
바이러스 표적화 기능을 가진 시알릭락토오스 복합체와 바이러스를 같이 처리하고 바이러스의 표면단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)를 인식하는 ELISA 키트상에서 바이러스만 처리한 대조군에 비해서 더 낮은 바이러스 양이 검출되는지 확인하여 실제로 바이러스와 제조한 시알릭락토오스 복합체가 상호작용을 하는지 확인하는데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예에서 각각 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체를 포함되어 있는 클로린(Ce6)의 농도로 양을 결정하고 바이러스(인플루엔자 A H1N1 A/Puerto Rico/8/1934) 1 × 106 PFU/ml 농도에 0.25ug/ml 10ug/ml 농도로 시료를 준비한 후 ELISA 키트 (Influenza A H1N1 A/Pureto Rico/8/1934 Hemagglutinin ELISA kit, Sino Biological Inc.) 96well판에 농도별 4개의 well을 사용한다. 결과는 멀티리더기를 이용하여 키트의 형광강도를 측정하여 바이러스의 양을 확인한다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체를 바이러스와 함께 인플루엔자 헤마글루티닌 ELISA 키트의 각 well에 농도별로 넣어 주었을 때, 바이러스만 처리한 대조군에 비해서 제조한 시알릭락토오스 복합체를 함께 처리한 군에서 바이러스의 검출이 확연히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 15).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체를 바이러스와 함께 처리하였을 때, 인플루엔자 헤마글루티닌 ELISA 키트에 의한 바이러스의 검출량이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 바이러스가 세포내 존재하는 바이러스 유도기(receptor)에 결합하는 것을 제조한 시알릭락토오스 복합체가 방해하고 바이러스의 세포감염을 방해할 수 있을 것으로 판단하였다.
< 실험예 7> 투과전자현미경을 통한 바이러스와 표적화 물질의 상호작용 및 레이저 조사 후 바이러스의 형태 변화 관찰
1. 실험을 실시한 목적
상기 실시예에서 제조한 바이러스 표적화 광감작 시알릭락토오스 복합체가 바이러스와 실제로 상호작용을 하는지 직접적으로 확인하고 레이저 조사 후 광감각제에 의해 발생하는 일항산소가 바이러스에 어떤 영향을 미치는지 확인하는데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
바이러스 인지능 물질인 SL-DAB-Ce6에서 25ug/ml의 클로린 농도를 바이러스(인플루엔자 A H1N1 A/PR/8/34) 2.5 × 107 PFU/ml에 처리하고 2시간 37℃에서 반응시킨다. 2시간 후 바이러스-시알릭락토오스 복합체에 671nm 파장의 레이저를 3J/cm2 세기로 조사 후 투과전자현미경 전용 그리드(Grid)에 올린 후 건조시켜 전처리 과정을 한다. 투과전자 현미경으로 바이러스-인지능 물질을 관찰하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 반응시킨 후 투과 전자현미경을 통해 관찰한 결과, 바이러스와 인지능 물질간 서로 붙어있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 인지능 물질에 포함되어 있는 광감각제(클로린, Chlorin e6)의 영향으로 바이러스와 인지능 물질을 반응시킨 후 레이저를 조사하였을 때, 바이러스의 외막(envelope)이 일부 파괴되어 있는 것을 관찰하였다(도 16).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스가 실제로 상호작용을 하는 것을 투과전자현미경을 통해 파악할 수 있었다. 그리고 바이러스와 반응시킨 인지능 물질에 레이저를 조사하면 바이러스의 외막이 파괴되어 불활화가 되는 것으로 예상할 수 있었다.
< 실험예 8> 공초점현미경을 통한 바이러스 인지능 물질의 상호작용 확인
1. 실험을 실시한 목적
상기 실시예에서 제조한 인지능 물질이 세포주변, 세포막, 세포질 내부에서도 바이러스와 상호작용을 하는지 확인하는 데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
MDCK 세포(개과동물 신장 상피세포, 한국세포주은행)를 1 × 105 cells/well의 농도로 2mL의 배양액을 유리 글라스가 덧대어져 있는 6well 세포배양접시에 분주한 뒤 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양조건에서 배양하였다. 배양액을 제거한 후 바이러스(인플루엔자 A H1N1 Influenza A H1N1 A/California/07/2009), 시알릭락토오스 복합체(SL-PEG-Ce6, SL-DAB-Ce6), 바이러스-인지능 물질 그룹으로 각각의 well에 처리하고 2시간 동안 세포와 반응시킨다. 바이러스는 1.5 × 105 PFU/ml, 인지능 물질 5ug/ml 농도로 처리하였다. 2시간 후 DPBS로 2번에 걸쳐 세척 후, 세포가 붙어 있는 유리글라스를 4% 파라포름알데하이드(Paraformaldehyde)에서 30분간 세포성장을 정지시키고 고정한 후, DPBS로 2회 세척 후, PBST(PBS 용액에 0.1%의 트윈20)에 5% BSA(Bovine serum albumin)가 포함된 용액을 넣고 30분간 반응시킨 후 DPBS로 2회 세척한다. PBST에 1% BSA가 포함된 용액으로 항바이러스 항체(rabbit Anti-neuraminidase antibody, Abcam)를 희석하여 2ug/ml의 농도로 1시간 동안 반응시킨다. 1시간 후 DPBS로 2회 세척하고 PBST에 1% BSA가 포함된 용액으로 FITC가 포함된 항토끼 항체(goat Anti-rabbit antibody FITC labeled, Santa cruz)를 희석하여 2ug/ml에 농도로 처리한 후 1시간 반응시킨다. 1시간 후 DPBS로 2회 세척 후 각각의 시료를 처리한 세포에 대해 세포핵 염색을 실시하였다. 결과는 공초점 현미경 (Confocal laser scanning microscope, Carl Zeiss, LSM710)을 이용하여 관찰하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 동시에 세포에 처리한 후 바이러스에 대한 항체를 이용하여 이미지를 확인하고, 광감각제가 빛을 흡수한 후 더 낮은 파장의 빛으로 방출한다는 특성을 이용하여 공초점 현미경에서 바이러스와 제조한 인지능 물질이 동일한 곳에 존재하는 지를 확인하였다. 상기 실시예에서 제조한 인지능 물질을 바이러스와 함께 처리해준 실험군에서 바이러스를 나타내는 색인 초록색의 강도가 증가하는 것을 확인하였다(도 17).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 동시에 처리한 실험군이 그렇지 않은 대조군에 비해 바이러스를 나타내는 초록색의 형광강도가 더 높은 수치를 나타내었고, 또한 실시예 4의 경우가 실시예 3에 비해 동시에 처리한 실험군에서 바이러스에 대한 형광강도와 인지능 물질의 형광강도가 타 실험군 및 대조군에 비해 더욱 큰 것을 확인할 수 있다. 이를 바탕으로 실시예 4에서 제조한 인지능 물질이 인플루엔자 바이러스와 확실히 상호작용하는 것을 확인할 수 있으며, 바이러스와 인지능 물질이 동일한 곳에 존재하게 되면 색이 노란색으로 보이게 되는데 이 부분도 타 실험군에 비해 크게 증가하고 노란색으로 보이는 영역이 크게 존재하는 것으로 실시예 4에서 제조한 인지능 물질이 바이러스와 상호작용하는 것으로 판단하였다.
< 실험예 9> STD-NMR을 통한 바이러스 인지능 물질과 실제 바이러스 유래 단백질간의 상호작용 확인
1. 실험을 실시한 목적
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 바이러스 유래 단백질인 헤마글루티닌과 상호작용을 하는지 확인하여 바이러스와 실제로 상호작용을 하는지 STD-NMR을 통하여 확인하는데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예에서 제조한 인지능 물질과 바이러스 표면 단백질인 헤마글루티닌과의 상호작용을 확인하기 위해 제조한 인지능 물질과 표면단백질을 적정농도로 PBS buffer에 용해 시킨 후, 측정전 튜브에 인지능 물질과 표면단백질을 1:1로 섞은 후 Burker 850 MHz 기기를 이용하여 STD-NMR을 측정한다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 인지능 물질이 유기체 인식 물질인 시알릭락토오스가 바이러스 표면단백질인 헤마글루티닌과 상호작용하는 특정 피크를 제조한 인지능 물질에서 나타나는 것을 확인하였다(도 18).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스 표면단백질인 헤마글루티닌과 상호작용을 STD-NMR을 통해 측정한 결과 유기체 인식 물질인 시알릭락토오스와 바이러스 표면 단백질과의 상호작용시 나타나는 특정 피크가 동일하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 시알릭락토오스보다 제조한 인지능 물질에서 그 특정 피크의 크기가 더 크게 나타나는 것으로 바이러스 표면 단백질과 더 강하게 상호작용하는 것으로 판단하였다.
< 실험예 10> 바이러스 감염 동물 모텔을 통한 바이러스 인지능 물질의 바이러스 불활화 능력 및 치료효과 확인
1. 실험을 실시한 목적
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질의 동물모델에서 바이러스 치료효과 및 레이저 조사에 의한 바이러스 불활화로 인한 감염 억제를 확인하는데 목적이 있다.
2. 실험 재료 및 방법
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 동물모델에서 항바이러스효과를 나타내는지 확인하기 위해, 6주령의 BALB/C 마우스에 인플루엔자 바이러스 (인플루엔자 A 바이러스 H1N1 A/California/07/2009)를 양성대조군으로 설정하고 인플루엔자 바이러스와 SL-DAB-Ce6를 5mg/kg, SL-PEI 1.8K-Ce6를 0.5mg/kg, SL-PEI 25K-Ce6를 0.5mg/kg의 농도로 설정하여 바이러스 인지능 물질을 미리 37 ℃에서 2시간 배양하여 상호작용을 유도한 후 671 nm 파장의 레이저의 조사한 그룹(10mW, 300s, 3J), 조사하지 않은 그룹으로 나눈 후 각각의 그룹을 마우스에 비강내 접종하여 바이러스를 전달하고 몸무게와 생존율을 확인하여 실제 동물에서 레이저 조사 유무 및 인지능 물질에 따른 바이러스 감염 억제 효능을 확인하였다.
3. 결과 확인
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 상호작용 후 마우스 비강내로 감염시켰을 때, 바이러스 인지능 물질을 처리하지 않은 바이러스만 마우스내로 감염시킨 군에서는 바이러스의 감염증상으로 나타나는 털의 뭉침현상 및 지속적인 몸무게 감소로 인한 생존율의 감소가 나타나는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 상기 제조한 바이러스 인지능 물질과 상호작용한 바이러스를 비강내 감염시킨 마우스 그룹에서는 일시적인 털 뭉침현상 및 바이러스 감염에 따른 몸무게 감소가 나타나지만 9일 뒤부터 털이 정상적으로 변하고 몸무게가 다시 회복하고 생존율의 변화도 나타나지 않은 것을 확인하였다. 더욱이 실시예 4와 실시예 5에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스의 상호작용 후 레이저를 조사한 뒤 비강내 감염시킨 그룹에서는 생존율의 변화도 없을 뿐 아니라 털뭉침현상 및 몸무게의 감소도 관찰되지 않아 바이러스 인지능 물질에 포함되어 있는 광감작제의 역할로 인한 바이러스가 불활성화되어 그 감염력을 상실하여 마우스로 감염되지 않은 것으로 판단되었다(도 19 및 도 20).
4. 결과에 따른 결론
상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질과 바이러스를 상호작용한 후 레이저의 조사 유무에 따른 바이러스 감염 동물모델에서 항바이러스 효능을 확인한 결과 제조한 바이러스 인지능 물질과 상호작용을 한 후 동물모델에 투여한 그룹에서 바이러스만 감염시킨 마우스보다 생존율의 변화 없이 오랜기간동안 생존해 있는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 인지능 물질에 포함되어 있는 광감작제의 역할로 인해 특정 레이저를 조사해 준 그룹에서는 바이러스 감염에 따른 마우스의 체중의 감소가 나타나지 않고 생존율로 유지하는 것을 관찰하였다. 이로 인해 상기 실시예에서 제조한 바이러스 인지능 물질이 생체내 바이러스의 감염을 억제하는 역할을 충분히 수행하고 또한 레이저조사에 따른 바이러스를 불활성화를 유도하여 바이러스의 감염을 효과적으로 막고 치료할 수 있는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 시알릭락토오스, 연결체 및 광감각제가 접합된 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 연결체는 폴리에틸렌글리콜, 디아미노뷰테인, 폴리에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 광감각제는 클로린류(chlorins) 또는 포피린류(phophyrins)인 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 시알릭락토오스 복합체는 시알릭락토오스-폴리에틸렌글리콜-클로린(SL-PEG-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린(SL-DAB-Pp) 또는 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린(SL-PEI-Pp)인 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체.
  7. 청구항 1에 따른 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 진단용 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 진단용 조성물.
  9. 청구항 1에 따른 시알릭락토오스 복합체를 유효성분으로 포함하는 바이러스 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 바이러스 질환은 인플루엔자바이러스로 인한 질환, 코로나바이러스로 인한 호흡기 질환, 아데노바이러스로 인한 질환, 로타바이러스로 인한 질환 및 레오바이러스로 인한 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  11. 1) 아미노옥시 그룹을 도입하여 연결체의 반응기를 활성화시키는 단계;
    2) 상기 아미노옥시 그룹이 도입된 연결체에 광감각제를 접합하는 단계; 및
    3) 상기 접합체에 시알릭락토오스를 접합하는 단계를 포함하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.
  12. 삭제
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 연결체는 폴리에틸렌글리콜, 디아미노뷰테인, 폴리에틸렌이민, 풀루란, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 키토산, 폴리카프로락톤 및 폴리다이옥산로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 광감각제는 클로린류(chlorins) 또는 포피린류(phophyrins)인 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 1) 단계는 t-Boc-아미노옥시아세틸 N-하이드록시숙신이미드 에스터((t-Boc-aminooxyacetyl) N-hydroxysuccinimide ester) 또는 t-Boc-아미노옥시아세트산(t-Boc-aminooxyacetic acid)으로 활성화시키는 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 시알릭락토오스 복합체는 시알릭락토오스-폴리에틸렌글리콜-클로린(SL-PEG-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-클로린(SL-DAB-Ce6), 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-클로린(SL-PEI-Ce6), 시알릭락토오스-디아미노뷰테인-포르피린(SL-DAB-Pp) 또는 시알릭락토오스-폴리에틸렌이민-포르피린(SL-PEI-Pp)인 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스, 아데노바이러스, 레오바이러스 및 로타바이러스로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 바이러스 인지능을 갖는 시알릭락토오스 복합체 제조방법.
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