CN105377876A - 免疫原性肽缀合物及以之诱导抗流感治疗性抗体应答的方法 - Google Patents

Abstract

本文所述免疫原性流感血凝素来源的肽缀合物诱导针对流感病毒的特异性治疗性抗体应答。所述免疫原性肽缀合物包含来自与载体蛋白缀合的流感血凝素蛋白的融合起始区(FIR)结构域的区段，所述载体蛋白例如匙孔傶血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、流感血凝素(HA)蛋白(即全长HA)等。本文所述免疫原性肽缀合物可用于治疗或预防流感感染，并制备干扰流感病毒-宿主细胞膜融合的流感特异性治疗性抗体。可将肽缀合物配制在可用于流感感染的广谱治疗或预防中的药物组合物中。

Description

免疫原性肽缀合物及以之诱导抗流感治疗性抗体应答的方法

相关申请的交叉引用

本申请是2013年3月14日提交的美国顺序号13/828,988的部分继续申请，其通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及免疫原性流感血凝素A2(HA2)来源的肽缀合物和使用所述缀合物诱导针对流感病毒的特异性抗体应答的方法。

序列表并入

本申请的生物学序列信息包含于与本申请一起提交的ASCII文本文档中，所述ASCII文本文档的文件名为“TU-271-5-SEQ.txt”，创建于2013年3月14日，文件大小为29,368字节，其通过引用结合到本文中。

发明背景

血凝素(HA)是流感病毒(正黏病毒)的包膜蛋白，并且是原型RNA病毒I类融合蛋白。HA在感染细胞中作为前体蛋白HA0产生，所述HA0被蛋白水解裂解成2种蛋白质，称为HA1和HA2。HA2含有氨基端疏水结构域，被称为融合肽，它在血凝素前体蛋白裂解时被暴露出来。除融合肽以外，逆转录病毒跨膜蛋白还含有几个与HA2已知结构一样的结构特征，包括延长的氨基端螺旋(N-螺旋，通常为“七残基重复序列”或“亮氨酸拉链”)、羧基端螺旋(C-螺旋)和跨膜结构域近端的芳族基序。这5种结构域中至少4种的存在将病毒包膜蛋白界定为I类融合蛋白。

图1显示6个I类病毒家族的融合蛋白的6个已鉴定的结构域。融合蛋白起源于疏水融合肽，终止于锚肽，并整合了延长的氨基端α-螺旋(N-螺旋，通常为“七残基重复序列”或“亮氨酸拉链”)、羧基端α-螺旋(C-螺旋)和有时病毒体包膜近端的芳族基序。第6个结构域，本文称为融合起始区(FIR)，公开于美国专利号7,491,793和美国专利号8,222,204(属于Garry和Wilson)，它们的每一个通过引用以其整体结合到本文中。

存在多个甲型流感病毒亚型。各病毒亚型包含包埋在病毒的脂质膜包膜中的两种糖蛋白的一种特定形式组合。两种界定亚型的糖蛋白为血凝素HA和神经氨酸酶(NA)。有17种已知的HA变体，分别被称为H1至H17，并有9种已知的神经氨酸酶变体，被分别称为N1至N9。各个病毒亚型的特定特征分别在于其血凝素和神经氨酸酶变体号。例如，甲型流感亚型H3N2为猪流感，亚型H5N1为禽流感。

每年大约10-20%的美国人口罹患季节性流感。虽然大多数个体在1-2周内从流感中恢复，但是极年幼者、老年人和患有慢性医学病况的人可发展出流感后肺炎和其它致死并发症。流感的致病物质是流感病毒，通过分段的病毒基因组的再分布和突变过程容易发展出新毒株的正黏病毒。

I类病毒的FIR是参与病毒包膜-宿主细胞膜融合的病毒融合包膜蛋白的区域，所述融合是结合宿主细胞膜的病毒籍以打断宿主细胞膜的完整性以将病毒的遗传物质注入宿主细胞中的过程。该过程包括病毒包膜和宿主细胞膜的合并，这是由病毒融合蛋白(例如在流感病毒的情况下为血凝素)介导的，因此将宿主细胞的内部暴露于病毒的内部。如上述美国专利号7,491,793和美国专利号8,222,204(属于Garry和Wilson)所公开的一样，包含FIR区段或由FIR区段组成的相对短的肽可与病毒融合蛋白结合，并干扰融合发生所需要的构象变化。所述肽因此防止宿主细胞被病毒感染，尽管事实是病毒仍可与宿主细胞膜的表面结合。因此，FIR肽通过与传统疫苗治疗相比完全不同的机制抑制病毒感染性，传统疫苗治疗一般包括产生防止病毒与宿主细胞结合的抗体，而不是干扰包括病毒融合机制本身的生物化学事件。

甲型流感病毒高毒力毒株可产生流行病和大流行病。近年来，出现了能够引起高死亡率的甲型禽流感病毒亚型H5N1的高致病性毒株。应对由流感病毒造成的对公共健康和作为生物恐怖活动潜在物质二者的威胁是极优先考虑的事。因此，有研发控制季节性流感及大流行性流感和武器化流感的威胁增加的治疗组合物和方法的持续需要。本文所述的肽缀合物、抗体致力于这些需要。

发明概述

本文所述免疫原性流感血凝素来源的肽缀合物诱导针对流感病毒的特异性治疗性抗体应答。如本文所述，免疫原性肽缀合物包含通过连接基团与载体蛋白(例如免疫原性载体蛋白)缀合的血凝素(HA)融合起始区(FIR)肽或其变体。HAFIR肽由不超过50个氨基酸残基组成，并包含流感血凝素2蛋白的区段，所述区段包括SEQIDNO:1或与之共享至少50%序列同一性且以选自以下的一个或多个氨基酸取代之差不同于SEQIDNO:1的SEQIDNO:1的变体的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M和E14K。在一些实施方案中，流感血凝素2蛋白的区段包括来自选自以下甲型流感亚型的血凝素2蛋白的多达25个其它氨基酸残基：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17。在所选甲型流感亚型的血凝素2蛋白的氨基酸序列中其它残基与SEQIDNO:1或其变体邻接。任选HAFIR肽可包括不是来自甲型流感血凝素2蛋白的一个或多个肽序列。

本文所述免疫原性肽缀合物可用于治疗或预防流感感染并用于引起干扰流感病毒-宿主细胞膜融合的流感特异性治疗性抗体。可将肽缀合物配制在可用于治疗或预防广谱的流感感染的药物组合物中。本文所述免疫原性肽缀合物可用于治疗或预防流感感染并用于引起干扰流感病毒-宿主细胞融合的流感特异性治疗性抗体。可将肽缀合物配制在与药学上可接受的载体组合,任选包括一种或多种佐剂、赋形剂等的可用于治疗或预防流感感染的药物组合物中。

在一个实施方案中，免疫原性流感血凝素来源的肽缀合物的血凝素FIR肽由SEQIDNO:1(SEQIDNO:2的残基84-99，其是甲型流感亚型H3血凝素2的代表性序列)或其变体组成。

本文所述任何免疫原性肽缀合物的载体蛋白部分可以是任何蛋白质或多肽分子，优选当给予受试者时可引起免疫反应(例如抗体产生)的蛋白质或多肽分子。所述多肽的非限制性实例包括例如KLH、鲍鱼(Concholepasconcholepas)血蓝蛋白(CCH)、牛血清白蛋白(BSA)、阳离子化BSA、卵清蛋白、流感血凝素蛋白等。所述免疫原性蛋白质是本领域众所周知的。

本发明的另一个方面是本文所述免疫原性肽缀合物在治疗或预防流感感染的方法中的用途。所述方法包括将肽缀合物(例如以治疗有效剂量)给予受试者。肽缀合物刺激受试者的免疫系统以产生特异性靶向缀合物的FIR肽部分的治疗性抗体。这种治疗性抗体应答发生，尽管事实上当给予受试者时，仅FIR肽(无载体蛋白)不引起任何免疫应答。如果需要，免疫原性肽缀合物可与药学上可接受的载体组合包含在药物组合物中。

本发明的另一个方面是分离的治疗性抗体，所述抗体能够抑制结合细胞的流感病毒与病毒与之结合的细胞的膜融合。优选治疗性抗体是人单克隆抗体、人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。所述治疗性抗体可例如通过如下获得：从用本文所述免疫原性肽缀合物治疗的患者的血清中分离抗体，产生来自已用(即给予)免疫原性肽缀合物处理的人类受试者的重组形式的人抗体，或产生来自已用(即给予)免疫原性肽缀合物治疗的合适的非人类宿主动物(例如兔或山羊)的重组嵌合或人源化形式的抗体。

提供下列非限制性实施方案以说明本发明的某些方面和特征。

实施方案1是一种免疫原性肽缀合物，其包含通过连接基团与载体蛋白(例如免疫原性载体蛋白)缀合的血凝素(HA)融合起始区(FIR)肽或其变体；其中HAFIR肽由不超过50个氨基酸残基组成，并包含流感血凝素2蛋白的区段，所述区段包括SEQIDNO:1或与之共享至少50%序列同一性且以选自以下的一个或多个氨基酸取代之差不同于SEQIDNO:1的SEQIDNO:1的变体的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M和E14K。

实施方案2包括实施方案1的免疫原性肽缀合物或由其组成，其中流感血凝素2蛋白的区段包括来自选自以下甲型流感亚型的血凝素2蛋白的多达25个其它氨基酸残基：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17，所述其它残基在所选甲型流感亚型的血凝素2蛋白的氨基酸序列中与SEQIDNO:1或其变体邻接。

实施方案3包括实施方案1或实施方案2的免疫原性肽缀合物或由其组成，其中HAFIR肽包括不是来自甲型流感血凝素2蛋白的一个或多个肽序列。

实施方案4包括实施方案1-3中任一个的免疫原性肽缀合物或由其组成，其中血凝素FIR肽具有由SEQIDNO:1或与之共享至少50%序列同一性且以选自以下的一个或多个氨基酸取代之差不同于SEQIDNO:1的SEQIDNO:1的变体组成的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M、A13T和E14K。

实施方案5包括实施方案1-4中任一个的肽缀合物或由其组成，其中载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌(Neiserriameningitidis)外膜蛋白复合物(OMPC)、破伤风类毒素蛋白、白喉毒素衍生物CRM₁₉₇、牛血清白蛋白(BSA)、阳离子化BSA、鲍鱼血蓝蛋白(CCH)、乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白(HBsAg)、HBV核心抗原蛋白、匙孔傶（limpet）血蓝蛋白(KLH)、轮状病毒衣壳蛋白、牛乳头瘤病毒(BPV)L1蛋白、人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白、卵清蛋白和全长流感血凝素(HA)蛋白。

实施方案6包括实施方案1-5中任一个的肽缀合物或由其组成，其中载体蛋白是全长流感血凝素蛋白。

实施方案7包括实施方案6的肽缀合物或由其组成，其中全长流感血凝素蛋白是某亚型的甲型流感血凝素，例如选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17的血凝素。

实施方案8包括实施方案6的肽缀合物或由其组成，其中全长流感血凝素蛋白是乙型流感血凝素蛋白。

实施方案9包括实施方案1-8中任一个的肽缀合物或由其组成，其中连接基团包含硫键(例如在本文所述通用半胱氨酸至马来酰亚胺型（commoncysteinetomaleimide-type）缀合技术的情况下)。

实施方案10包括实施方案1-8中任一个的肽缀合物或由其组成，其中连接基团是下式I的4-(N-琥珀酰亚胺基甲基环己烷-1-羰基基团：

其中式I的Cys残基通过其巯基基团与琥珀酰亚胺基部分结合，且通过肽键与FIR肽的N端结合，任选在Cys和FIR肽之间具有1-5个残基的另外的间隔肽，而且式I的环己基部分上的1-羰基基团通过酰胺键与载体蛋白上的伯胺结合。

实施方案11包括实施方案1-10中任一个的肽缀合物或由其组成，其中血凝素FIR肽通过连接基团与载体蛋白缀合的具有由SEQIDNO:1组成的氨基酸序列。

实施方案12包括用于治疗或预防流感感染的药物组合物或由其组成，所述药物组合物包含在药学上可接受的载体中的实施方案1-11中任一个的免疫原性肽缀合物。

实施方案13包括治疗或预防流感感染的方法或由其组成，所述方法包括将有效量的实施方案1-11中任一个的免疫原性肽缀合物给予患有流感或有感染流感的风险的受试者。

实施方案14包括在受试者中诱导特异性治疗性抗体应答的方法或由其组成，所述方法包括将实施方案1-11中任一个的免疫原性肽缀合物给予受试者。

实施方案15包括实施方案14的方法或由其组成，其中特异性治疗性抗体应答是抑制流感病毒(例如病毒的包膜)与宿主细胞的膜融合。

实施方案16包括能够与流感病毒血凝素蛋白的FIR区特异性结合的治疗性单克隆抗体或由其组成，所述单克隆抗体包含来自在给予实施方案1-11中任一个的免疫原性肽缀合物后在宿主生物中产生的抗体的互补决定区(CDR)，所述抗体与流感病毒血凝素蛋白的FIR区特异性结合。

实施方案17包括实施方案16的治疗性单克隆抗体或由其组成，其中治疗性单克隆抗体是人单克隆抗体、人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。

实施方案18包括用于治疗或预防受试者的流感病毒感染的实施方案16或实施方案17的治疗性单克隆抗体的用途或由其组成。

实施方案19包括用于治疗或预防流感感染的实施方案1-11中任一个的免疫原性肽缀合物的用途或由其组成。

实施方案20包括用于在受试者中诱导针对流感病毒的特异性治疗性抗体应答的实施方案1-11中任一个的免疫原性肽缀合物的用途或由其组成。

发现具有由VEDTKIDLWSYNAELL，SEQIDNO:1组成的氨基酸序列的血凝素FIR肽具有有效的抗病毒性质(参见美国专利号8,222,204)。包含与KLH缀合的这种相同的血凝素FIR肽的免疫原性肽缀合物在小鼠、兔和山羊中引起产生特异性靶向血凝素FIR肽的抗体。出乎意料的是，发现这种抗体干扰病毒包膜-宿主细胞膜融合过程，但在标准测定法中不显著干扰血凝反应。这与典型的抗流感抗体的作用方式不同，其干扰病毒与宿主细胞的实际的物理相互作用(例如结合)。

附图简述

图1显示来自I型病毒6个家族的融合蛋白的6个已鉴定的结构域，包括融合起始区(FIR)。

图2提供来自比较游离FIR肽与ELISA板结合的FIR肽的肽结合竞争测定法的结果的图。

图3提供ELISA板结合的血凝素和游离FIR肽的结合竞争的图。

优选实施方案的详细描述

本文所述免疫原性流感血凝素来源的肽缀合物诱导针对流感病毒的特异性治疗性抗体应答。免疫原性肽缀合物包括来自与载体蛋白缀合的流感血凝素蛋白的融合起始区(FIR)结构域(本文称为“血凝素FIR肽”或“FIR肽”)的区段。血凝素FIR肽具有由SEQIDNO:1或与之共享至少50%序列同一性且以选自以下的一个或多个氨基酸取代之差不同于SEQIDNO:1的SEQIDNO:1的变体组成的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M、A13T和E14K。

SEQIDNO:1是具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的甲型流感血凝素亚型H3毒株的FIR的区段(即残基84-99)。是SEQIDNO:1的变体的FIR肽与之不同之处在于作为保守取代或作为来自另一种血凝素亚型(即来自H1、H2、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H15、H16或H17)的相应氨基酸残基的取代的特定取代。对应于来自这些其它亚型的SEQIDNO:1的肽见表1。优选变体与SEQIDNO:1相同或具有高的序列同一性(例如95%或更高的序列同一性，优选98%或更高的序列同一性，更优选100%序列同一性)。

本文所用术语“保守取代”和其语法变化是指在肽序列中存在不同于野生型残基但与野生型残基处于氨基酸的相同类别的氨基酸残基(即非极性残基置换非极性残基、芳族残基置换芳族残基、极性不带电荷的残基置换极性不带电荷的残基、带电荷的残基置换带电荷的残基)。另外，保守取代可包括具有与它取代的野生型残基相同正负号和一般类似量值的界面亲水性值的残基。

本文所用术语“非极性残基”是指甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸和脯氨酸；术语“芳族残基”是指苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸(其亦被认为带电荷的氨基酸)；术语“极性不带电荷的残基”是指丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；术语“带电荷的残基”是指带负电荷的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸；以及带正电荷的氨基酸赖氨酸、精氨酸和组氨酸(其亦被认为芳族氨基酸)。

表1

表1中的所有序列与SEQIDNO:1共享大于50%序列同一性，即SEQIDNO:3、4、6、7和12与SEQIDNO:1有62.5%同一性；和SEQIDNO:5、8、9、10和11与SEQIDNO:1有56.2%同一性。因此，显然各种流感血凝素亚型在通过SEQIDNO:1例示的FIR的16个氨基酸残基区段中是高度同源的。本文所述免疫原性肽缀合物的FIR肽部分(SEQIDNO:1)中的取代主要来源于存在于表1所示SEQIDNO:3至12中的变化，以及存在于SEQIDNO:1和3至12中的残基之一的普通保守取代，例如缬氨酸残基被亮氨酸，甘氨酸，丝氨酸或丙氨酸取代；天冬氨酸残基被谷氨酸残基取代；丝氨酸残基被甘氨酸或甲硫氨酸取代等。

在描述本发明的背景下(尤其在随附权利要求书的背景下)使用的术语“a”和“an”和“the”和类似指代词要解释为涵盖单数和复数两者，除非本文中另有说明或上下文中明确抵触。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”要解释为开放式术语(即意指“包括但不限于”)，除非另有说明。本文值的范围的陈述只欲用作单独提及落入该范围的各个单独值的简写方法，除非本文另有说明，并且各个单独的值结合到本说明书中，就像在本文中单独陈述一样。本文所述所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或上下文中另有明确抵触。本文提供的任何和所有的实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅仅旨在更好地说明本发明，并不为本发明的范围设置限制，除非另作声明。本说明书的语言不应解释为表明任何未要求保护的要素为本发明实践所必需的。

可用于本文所述肽缀合物和方法的载体蛋白包括当给予受试者时可引起抗体产生的任何蛋白质，优选免疫原性蛋白质。所述载体蛋白和使载体蛋白与目标肽缀合的方法是本领域众所周知的，并已被用于所谓“缀合物疫苗”的生产。载体蛋白、连接基团和缀合方法的一些实例描述于以申请号PCT/US2011/060318提交的PCT国际公开号WO2012/065034，其通过引用以其整体结合到本文中。载体蛋白的一些非限制性实例包括脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白复合物(OMPC)、破伤风类毒素蛋白、白喉毒素的衍生物(CRM197)、牛血清白蛋白(BSA)、阳离子化BSA、鲍鱼血蓝蛋白(CCH)、乙型肝炎病毒(HBV)蛋白质(例如表面抗原蛋白(HBsAg)和HBV核心抗原蛋白)、匙孔傶血蓝蛋白(KLH)、轮状病毒衣壳蛋白、牛乳头瘤病毒L1蛋白(BPVL1)、人乳头瘤病毒L1蛋白(HPVL1；例如、HPV6、11或16型)、卵清蛋白和流感血凝素(HA)蛋白，例如来自血凝素A亚型H1-H17的HA蛋白质。流感HA蛋白质的代表性序列包括H1(SEQIDNO:13)、H2(SEQIDNO:14)、H3(SEQIDNO:15)、H5(SEQIDNO:16)和H7(SEQIDNO:17)。用于本文所述免疫原性肽缀合物的载体蛋白，偶联(缀合)技术和连接基团的选择尽在蛋白质疫苗合成领域普通技术人员的能力内。

载体蛋白经由载体蛋白和目标肽的反应部位通过连接基团缀合。可用于缀合的亲核官能团是本领域众所周知的(参见例如美国专利号5,606,030，其通过引用以其整体结合到本文中)。例如，存在于氨基酸残基上的伯胺基例如赖氨酸的ε氨基和蛋白质N端氨基酸的α氨基可用作缀合的官能团。通常需要将载体蛋白的一个或多个伯胺基转化为含硫醇基的基团(例如来自半胱氨酸或高半胱氨酸残基)、亲电子不饱和基团例如马来酰亚胺基或卤化基团例如溴乙酰基，用于与硫醇基反应肽缀合。任选，在血凝素FIR肽或与肽连接的接头部分上的伯胺基可转化为含硫醇基基团，用于例如通过二硫键与载体蛋白上的硫醇基(巯基)部分偶联。

可使用本领域已知的任何连接基团和缀合方法使血凝素FIR肽和载体蛋白缀合。在一些实施方案中，缀合可以通过如下实现：例如，使用4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(sSMCC)、ε-[ε-马来酰亚胺基己酰氧基]-磺基琥珀酰亚胺酯(sEMCS)、双偶氮联苯胺(BDB)、N-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)或N-乙酰基高半胱氨酸硫内酯(NAHT)。

在SMCC方法中，SMCC使半胱氨酸残基的SH-基团与载体蛋白上的赖氨酸残基的氨基交联。在SMCC方法中，通过使SMCC与伯胺(例如载体蛋白的赖氨酸残基上的伯胺)反应，首先激活载体蛋白。然后将所得的活化载体从任何过量的SMCC和其副产物中分离，并加入含半胱氨酸的肽。半胱氨酸的硫醇基跨SMCC衍生化载体蛋白的马来酰亚胺部分的双键加入，因此形成使载体与肽偶联的共价硫键。如果血凝素FIR肽不包括半胱氨酸残基，则应将半胱氨酸残基加入该肽中，优选在N端或C端加入。如果血凝素FIR肽的表位部分含有半胱氨酸或如果在肽中有多于一个半胱氨酸基团，则应采用不改性半胱氨酸残基的另一种缀合技术。因为载体蛋白和肽之间的键不应干扰肽的表位部分，所加入的半胱氨酸残基任选可通过包括一个或多个氨基酸残基作为间隔区与血凝素FIR肽分隔开。半胱氨酸、间隔区残基和与载体连接的修饰的SMCC一起构成血凝素FIR肽缀合物的连接基团。

肽与载体蛋白的另一种简单偶联可用碳二亚胺交联剂例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-环己基-2-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸酯(CMC)等使羧基与伯胺基共价连接来实现。该方法简单，并提供允许针对许多可能表位的抗体生成的相对随机的定向。一个缺点是EDC偶联可能导致一定量的聚合。这可降低缀合物的溶解度，这可使材料处理复杂化。

可使用其它偶联剂以使FIR肽直接或通过连接基团与载体蛋白缀合。例如，可以使用异氰酸酯偶联剂例如2-吗啉代乙基胩；N-乙酰基高半胱氨酸硫内酯，其可用于将硫醇基加到载体蛋白(例如与马来酰亚胺或溴乙酰基官能化的肽偶联的OMPC)上；或用于使半抗原(潜在免疫原)与多肽和蛋白质偶联的任何其它剂，来实现缀合，其中许多在蛋白质和疫苗领域中是众所周知的。

非特异性交联剂及其用途是本领域众所周知的。所述试剂及其用途的实例包括与戊二醛反应；在有或没有琥珀酰化的载体的混合物的情况下，与N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺反应；糖基化取代基的高碘酸盐氧化，接着在硼氢化钠或氰基硼氢化钠存在下与蛋白质载体的游离氨基偶联；非酰化末端丝氨酸和苏氨酸残基的高碘酸盐氧化形成末端醛，所述醛然后可与胺或酰肼反应产生席夫碱或腙，其可用氰基硼氢化物还原成仲胺；芳族氨基的重氮化，接着偶联在蛋白质酪氨酸侧链残基上；与异氰酸酯反应；或混合酐的反应。可以补充接头，并用间隔区基团(例如其它的氨基酸残基、己二酸二酰肼等)使其延长。

用于使FIR肽与载体蛋白缀合的典型的间隔肽基团包括与FIR肽连接的单一氨基酸(例如，Cys)和短肽序列(即，短的非血凝素FIR肽序列)，例如，含赖氨酸的肽例如flag标签序列DYKDDDDK(SEQIDNO:18)、含半胱氨酸的肽等。一些优选的连接基团包含硫键(例如SMCC和相关偶联方法中)。一些优选的连接基团包括下式I的4-(N-琥珀酰亚胺基甲基环己烷-1-羰基：

其中式I中的Cys残基通过其巯基侧链与琥珀酰亚胺基部分结合和通过肽键结合FIR肽的N端。任选，在Cys和FIR肽之间可包括1-5个氨基酸残基的另外的间隔肽。式I的环己基部分上的1-羰基通过酰胺键与载体蛋白上的伯胺结合。

在一些实施方案中，肽缀合物包括与载体蛋白连接的单个血凝素FIR肽，而在其它实施方案中，两个或更多个血凝素FIR肽可与载体蛋白连接。

另一方面，本发明提供对本文所述免疫原性肽缀合物的血凝素FIR肽部分有特异性(即能够与之特异性和选择性与之结合结合)和与流感病毒的HA2的FIR结合的治疗性单克隆抗体。所述治疗性单克隆抗体包含来源于与本文所述免疫原性肽缀合物的FIR部分特异性结合的抗体的互补决定区(CDR)。治疗性抗体可以是人抗体(例如自暴露于肽缀合物的受试者的血清分离)、非人类抗体(例如自暴露于肽缀合物的非人类受试生物例如小鼠、大鼠、兔、山羊或其它合适的生物分离)以及这类非人抗体的嵌合和人源化形式。

当给予(例如以治疗有效剂量)暴露于流感病毒的受试者时，治疗性单克隆抗体抑制流感病毒-宿主细胞膜融合，并因此防止宿主细胞被流感病毒感染。这种抑制通过抗体与流感病毒的HA蛋白的FIR区结合来实现。因此，本文所述治疗性单克隆抗体具有与免疫原性肽缀合物的血凝素FIR肽部分相同或非常类似的治疗机制(有关FIR肽治疗性机制的论述参见美国8,222,204)。

本文所用术语“治疗有效剂量”和其语法变化是指使得当给予受试者时引起针对流感病毒的特异性治疗性抗体应答的免疫原性肽缀合物的量，或足以防止或提供流感感染的临床降低的治疗性抗体的量。给予受试者的剂量和剂量次数(例如单剂或多剂)会根据包括以下的多个因素变化：给药途径、患者病况和特征(性别、年龄、体重、健康状况、身材大小)、症状的程度、同期治疗、治疗频率和所需效果、其所给予形式中缀合物或抗体的浓度等。剂量范围的调节和操控，以及确定个体中组合物的疗效的体内和体外方法，尽在医学领域的普通技术人员的能力范围内。举例来说，可使用在药学上可接受的载体中包含肽缀合物或治疗性抗体的溶液的约1-100mL溶液范围的剂量。肽缀合物或治疗性抗体会以约0.01μg/mL-约10mg/mL范围内的浓度存在于溶液中。可以肠胃外(例如通过静脉内，腹膜内，皮下或肌内注射或输注)或跨粘膜(例如通过吸入雾化液体或粉状组合物)给予肽或抗体。

本文所述治疗性抗体籍以起作用的结合特异性和机制在响应用传统流感疫苗接种时形成的抗体截然不同，所述传统流感疫苗接种时形成的抗体通常干扰病毒与宿主细胞的物理相互作用，并且通常是毒株特异性的，如通过每年重新配制季节性疫苗以与流通的流感毒株相适应的必要性所强调。相比之下，本文所述治疗性抗体出乎意料地干扰病毒融合过程，并且对不同的流感毒株(包括甲型流感和乙型流感两者)有广泛反应性。

优选治疗性单克隆抗体是人单克隆抗体、人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。用于制备单克隆抗体的方法是本领域众所周知的，如按常规从分离的天然抗体产生单克隆抗体的商业公司。嵌合和人源化单克隆抗体和制备所述抗体的方法也是抗体领域众所周知的(参见例如，美国专利号5,824,307、6,800,738、7,070,775、7,087,409、7,456,260和7,807,161，其每一个通过引用以其整体结合到本文中)。

嵌合化过程包括将非人抗体的部分用来自人抗体的相应部分(例如恒定区)置换。完成该过程以防止人免疫系统攻击作为外源蛋白质的非人抗体。嵌合抗体一般保留非人抗体的CDR和/或完整的可变区，并将非人恒定结构域用人恒定结构域置换。因此，嵌合抗体保留非人抗体的抗原特异性，但是具有低水平的对抗体的不需要的免疫反应(例如变态反应)。

人源化抗体与嵌合抗体类似，此外人源化抗体一般包括较少的非人类特征。这可通过例如修饰嵌合抗体的可变区的序列以更好地反应人抗体的特性，例如通过修饰抗体中非人序列的CDR或其它部分间的序列来实现。不是所有的治疗性单克隆抗体可需要被人源化，因为一些治疗性治疗的持续时间可能短到足以使变应性副作用不太可能。

还可使用完全人抗体。这类人抗体可为例如遗传工程化的抗体，例如，其中CDR是人源的，但具有在一个或多个方面不同于天然产生的人抗体(即用免疫原性肽缀合物处理的人类受试者而产生的抗体)的来源于人的结构的抗体；或人抗体可以是获自用肽缀合物处理的人类受试者的血清的天然抗体的克隆。

另一方面，提供药物组合物，其包含所述免疫原性肽缀合物或抗体，并且其可用于治疗或预防流感感染。在某些优选的实施方案中，该组合物包括例如通过胃肠外或肠内给药、优选通过注射(例如优选通过静脉内、腹膜内、皮下或肌内注射)或通过鼻(例如气雾剂)给药，适于将肽、类似物、衍生物或抗体递送给受试者的药学上可接受的溶媒或载体中的免疫原性肽缀合物或抗体。适于递送活性成分的溶媒和载体是本领域众所周知的，包括盐水溶液、缓冲盐水溶液等，优选在生理pH(例如约6.5-7.4的pH)下的。载体还可包括其它赋形剂成分，例如表面活性剂、防腐剂、分散剂、稀释剂，稳定剂等，其是药学制剂领域众所周知的。药物组合物可用作通过给予受试者治疗有效量的药物组合物来治疗或预防流感感染的方法的一部分。肽缀合物和抗体的载体可以是固体或液体，其选择取决于所需的给药方式。

提供下列非限制性实施例以进一步说明本文所述免疫原性肽缀合物和方法的某些方面和特征。

实施例1.血凝素FIR肽-KLH缀合物的制备。

用添加的N端Cys连接残基合成SEQIDNO:1的FIR肽；即产生SEQIDNO:19的肽，然后采用SMCC方法使之与KLH缀合。简单地说，通过使SMCC与一个或多个伯胺基(例如在载体蛋白的赖氨酸残基上)反应，首先激活载体KLH蛋白。然后从任何过量的SMCC及其副产品分离所得的活化载体。然后使半胱氨酸衍生化FIR肽与活化的KLH反应；跨SMCC衍生化载体蛋白马来酰亚胺部分的双键而加入半胱氨酸的巯基(硫醇基)，因此形成共价硫键。然后分离所得的FIR肽-KLH缀合物。

实施例2.小鼠单克隆抗FIR肽抗体的产生。

给5只Balb/C小鼠注射实施例1中制备的缀合物。在第0天，第一次注射使用与完全弗氏佐剂混合的FIR肽-KLH缀合物。在第21、35、49和63天，给小鼠注射不完全弗氏佐剂中的FIR-肽-KLH缀合物。在第45、59和73天，从小鼠中收集血清样品，采用ELISA方法用与96孔塑料板的孔被动结合的FIR肽(SEQIDNO:1)，测试抗FIR肽抗体的存在。处死具有最高效价的抗FIR抗体的3只小鼠，并收获脾。采用标准技术，收获脾细胞，并与sp2/0细胞融合，产生抗FIR抗体的杂交瘤通过ELISA鉴定，并通过有限稀释亚克隆。鉴定出几个克隆，一个命名为MAF3-2，被用于进一步分析。

实施例3.山羊中治疗性抗FIR肽抗体的产生。

给山羊注射实施例1中制备的缀合物。第一次注射是用完全弗氏佐剂中的500μgFIR肽-KLH缀合物。两周间隔的后续注射是用不完全弗氏佐剂中的250μg剂量的缀合物。在总共3次注射后，在第一次注射后第5周制备血清样品。在平板ELISA试验中发现血清样品含有可检出效价的FIR肽。

给山羊再次注射250μg的FIR肽-KLH，在第7和8周制备血清样品。用平板ELISA测定法，针对其对FIR肽(SEQIDNO:1)的反应性对第7和8周的血清样品进行滴定。板用非缀合的FIR肽包被，发现血清样品中的抗体与包被板特异性结合。

实施例4.兔中治疗性抗FIR肽抗体的产生。

给2只兔注射实施例1中制备的缀合物。第一次注射是用完全弗氏佐剂中的200μg的FIR肽-KLH缀合物。两周间隔的后续注射是用不完全弗氏佐剂中的100μg剂量的缀合物。在总共3次注射后，在第一次注射后第5周从每只动物中抽取血清样品。在平板ELISA试验中发现血清样品含有可检出效价的FIR肽。

给兔再次注射，在第7和8周收集血清样品。用平板ELISA测定法，针对其对FIR肽的反应性滴定第7和8周的血清样品。通过标准方法将板用非缀合的FIR肽包被，发现血清样品与包被板特异性结合。通过结合与固相色谱法支持体连接的FIR肽从血清样品中分离抗体。通过低pH(即约pH2.68)释放抗体。

发现分离的抗体对FIR肽有特异性，如通过在板结合的FIR肽和溶液中游离FIR肽之间的竞争所通常定义的。为了证实特异性，将96孔免疫测定板孔用溶于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的FIR肽包被。塑料上未结合的带电部位用缓冲脱脂奶粉/去污剂悬浮液封闭。将纯化的兔抗FIR肽抗体与生物素偶联。随后在加入板前，通过FIR肽的连续稀释将约0.1mL等分部分的生物素化抗体溶液中和约45分钟。在进一步温育后，将孔用含有去污剂的缓冲盐水洗涤。通过与链霉抗生物素-辣根过氧化物酶缀合物一起温育，接着洗涤并应用比色试剂3,3',5,5'-四甲基联苯胺，来检测结合的抗FIR抗体。图2提供板结合的和游离FIR肽之间的结合竞争的图。

实施例5.通过小鼠单克隆抗体的广谱结合。

发现抗来自实施例2的针对FIR肽的分离的小鼠来源的单克隆抗体(MAF3-2)识别并特异性结合不同亚型的血凝素(HA)，如通常通过与FIR肽抗原竞争而定义的一样。为了证实特异性，将96孔免疫测定板孔用溶于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中的不同亚型的市购可获得的血凝素(HA：H1毒株A/加利福尼亚/04/2009(H1N1)pdm09；H3毒株A/乌拉圭/716/07(H3N2)；H3毒株A/威斯康星/67/2005(H3N2)；H5毒株A/斑头雁/青海/1A/05(H5N1))包被。塑料上未结合的带电部位用缓冲脱脂奶粉/去污剂悬浮液封闭。使纯化的MAF3-2抗体与生物素偶联(btn-MAF3-2)。然后在加入HA包被板之前，通过FIR肽的连续稀释将约0.1mL等分部分的抗体溶液中和约45分钟。在进一步温育后，将孔用含有去污剂的缓冲盐水洗涤。通过与链霉抗生物素-辣根过氧化物酶缀合物一起温育，接着洗涤并应用比色试剂3,3',5,5'-四甲基联苯胺，来检测结合的FIR抗体。图3提供ELISA板结合的HA和游离FIR肽之间的结合竞争的图，这再次证实了抗FIR肽抗体对FIR抗原的特异性。

实施例6.针对流感病毒治疗性抗FIR肽抗体的评价。

细胞和病毒：马-达二氏犬肾细胞(MDCK)用于所有实验。细胞在补充有青霉素/链霉素溶液、碳酸氢钠溶液、非必需氨基酸溶液和热灭活胎牛血清的完全Dulbecco极限必需培养基(cDMEM)中供养并增殖。表2中包括的流感病毒用于所有感染/抗体结合研究。采用标准方法，使所有病毒在9日龄含胚鸡蛋中繁殖，通过离心从尿囊液中纯化。所有感染以5.0的感染复数进行。

抗体和试剂：将来自实施例3的山羊抗FIR肽抗体血清保持在4℃下直到用于结合研究。用1:500稀释于补充有1%牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐水(PBS)中的抗体进行结合研究。作为甲型流感或乙型流感感染的对照，使用1:1000稀释于PBS/BSA的针对甲型流感或乙型流感核蛋白(NP)产生的小鼠单克隆抗体(SantaCruzBiotechnology)，进行双份培养物的染色。使用与辣根过氧化物酶(HRP)或ALEXA488(MolecularProbes)缀合的第二抗体(抗山羊或抗小鼠)可视化结合的第一抗体。

MDCK感染和抗体结合方案：采用标准方法使MDCK细胞在室载玻片中生长至90%汇合。对于病毒感染，除去培养基，将各病毒以200μL的体积加入合适的室中在潮湿的CO₂培养箱中在37℃下维持1小时。在温育后，通过抽吸和洗涤，除去未结合的病毒，培养基更换为补充有TPCK胰蛋白酶(WorthingtonChemicals，USA)的无血清cDMEM。使被感染的MDCK细胞在35℃/5%CO₂下温育24小时以允许病毒复制。对于抗体结合研究，从各室中除去培养基，将细胞用4%低聚甲醛(PBS中)在4℃下固定30分钟。在洗涤后，使细胞透化，通过用PBS+20mM甘氨酸/0.01%TRITONX-100表面活性剂在室温下温育20分钟封闭剩余的醛。在洗涤后，将山羊抗FIR血清(1:500在PBS+1%BSA中)加入室中在室温下3小时。在PBS中洗涤而除去未结合的抗体。通过与用于荧光或可视的检测显微术的ALEXA488或辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(抗山羊)一起温育30分钟，来进行结合的抗FIR肽的可视化。通过洗涤(PBS/BSA)除去未结合的第二抗体后，按照生产商说明书，通过加入3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)底物试剂(VectorlabsUSA)，使HRP缀合物处理的室显色。使用补充有碘化丙锭复染剂的VECTASHIELD含水封固介质(VectorlabsUSA)将ALEXA488缀合室封固，在加上盖玻片后，将载玻片用指甲油密封。

抗体结合的显微镜评价：使用具有数字图像拍摄能力的EVOS光显微镜(AMGInstruments，USA)，通过可见光显微术评价载玻片室。代表性图像使用仪器软件拍摄，并作为标签图像文件(TIF)保存。使用分别用以可视化绿色和红色荧光的488nm和455nm激光线，使用ZeissLSM700激光扫描共聚焦显微镜(JenaGermany)，检查荧光标记的(ALEXA488)染色室。应用LSM软件将代表性图像作为标签图像文件(TIF)保存。

在固定和抗体结合之前，获得受感染细胞的可视图像。在感染后24小时时，在A/香港/2369/2009、A/PR/8/34(H5N1)和B/上海/362/2002感染的MDCK细胞培养物中观察到病毒感染的致细胞病变效应。甲型流感/加利福尼亚/04/2004在感染后的这个时间点上不诱导CPE。

可视化地评价了抗FIR肽抗体或抗流感核衣壳蛋白(NP)抗体(A或B)的可视的(AEC)和荧光(Alexa488)染色图像。在所检查的所有病毒中，在所观察的反应性的范围内，用NP和抗FIR抗体两者观察到阳性染色。在两种可视化条件下，用H5表达细胞(A/PR/8/1934+H5N1)比用H1、H3或乙型流感感染的细胞观察到更弥散的染色。表3提供所观察到的结合性质的概要。表3中+符号的数目表明抗体与所标明的病毒感染的细胞结合的程度；+符号的数目越大，表明结合度超高。

总之，这些结果表明对于针对SEQIDNO:1的FIR肽的产生的抗体的关于甲型流感和乙型流感病毒的广泛的结合特异性。这种广度可能是因FIR肽所来源的区域中不同亚型的血凝素蛋白的高度同源性所致。识别流感核蛋白(NP)的对照抗体的结合证实了MDCK细胞被各病毒感染，证实抗FIR肽抗体对流感病毒的特异性。

归纳起来，将由与KLH缀合的SEQIDNO:1的血凝素FIR肽组成的肽缀合物给予兔、小鼠和山羊刺激由动物产生抗FIR肽抗体。在用甲型流感(H1、H3和H5)和乙型流感病毒的试验中，出人意料地发现，来自这些动物的血清与FIR肽本身结合，与暴露于病毒的细胞结合，并且抑制病毒感染性。如使用可视技术和荧光技术两者所检测的一样，抗体与暴露细胞的表面上的HA反应。来自用近来的流感疫苗接种的受试者的血清产生稳健的抗HA应答，但出乎意料的是似乎不产生针对SEQIDNO:1的FIR肽的抗体。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读前面的描述时，这些优选的实施方案的变化对本领域技术人员而言可以变得显而易见。本发明人预期技术人员适当时利用所述变化，而且本发明人预期本发明按与本文具体描述不同的方式实施。因此，本发明包括如被适用法律允许的其随附权利要求书中引述的主题的所有修改和等同内容。而且，其所有可能的变化中上述要素的任何组合都包括在本发明中，除非本文另有说明或上下文中另有明确抵触。本文引述的各参考文献，包括美国和非美国专利、美国和非美国的已公开的专利申请、杂志文章、书籍、书籍章节和本文中引用的任何其它文献，藉此都通过引用以其整体(包括其所有细节)结合到本文中，达到就像单独结合一样的程度。

Claims (20)

1.一种免疫原性肽缀合物，其包含通过连接基团与载体蛋白缀合的血凝素(HA)融合起始区(FIR)肽或其变体；其中所述HAFIR肽由不超过50个氨基酸残基组成，并包含流感血凝素2蛋白的区段，所述区段包括SEQIDNO:1或与之共享至少50%序列同一性且以选自以下的一个或多个氨基酸取代之差不同于SEQIDNO:1的SEQIDNO:1的变体的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M和E14K。

2.权利要求1的免疫原性肽缀合物，其中所述流感血凝素2蛋白的区段包括来自选自以下甲型流感亚型的血凝素2蛋白的多达25个其它氨基酸残基：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17，所述其它残基在所选甲型流感亚型的血凝素2蛋白的氨基酸序列中与SEQIDNO:1或其变体邻接。

3.权利要求1或权利要求2的免疫原性肽缀合物，其中所述HAFIR肽包括不是来自甲型流感血凝素2蛋白的一个或多个肽序列。

4.权利要求1-3中任一项的免疫原性肽缀合物，其中所述血凝素FIR肽具有由SEQIDNO:1或与之共享至少50%序列同一性且以选自以下的一个或多个氨基酸取代之差不同于SEQIDNO:1的SEQIDNO:1的变体组成的氨基酸序列：V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M和E14K。

5.权利要求1-4中任一项的免疫原性肽缀合物，其中所述载体蛋白选自脑膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白复合物(OMPC)、破伤风类毒素蛋白、白喉毒素衍生物CRM₁₉₇、牛血清白蛋白(BSA)、阳离子化BSA、鲍鱼血蓝蛋白(CCH)、乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白(HBsAg)、HBV核心抗原蛋白、匙孔傶血蓝蛋白(KLH)、轮状病毒衣壳蛋白、牛乳头瘤病毒(BPV)L1蛋白、人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白、卵清蛋白和全长流感血凝素蛋白。

6.权利要求1-5中任一项的免疫原性肽缀合物，其中所述载体蛋白是全长流感血凝素蛋白。

7.权利要求6的免疫原性肽缀合物，其中所述全长流感血凝素蛋白是来自选自以下的甲型流感亚型的血凝素：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16和H17。

8.权利要求6的免疫原性肽缀合物，其中所述全长流感血凝素蛋白是乙型流感血凝素蛋白。

9.权利要求1-8中任一项的免疫原性肽缀合物，其中所述连接基团包含硫键。

10.权利要求1-8中任一项的免疫原性肽缀合物，其中所述连接基团包含实施方案1-6中任一个的肽缀合物,其中所述连接基团是下式I的4-(N-琥珀酰亚胺基甲基环己烷-1-羰基：

其中式I的Cys残基通过其巯基基团与琥珀酰亚胺基部分结合，且通过肽键与FIR肽的N端结合，任选在Cys和FIR肽之间具有1-5个残基的另外的间隔肽，而且式I的环己基部分上的1-羰基基团通过酰胺键与所述载体蛋白上的伯胺连接。

11.权利要求1-10中任一项的免疫原性肽缀合物，其包含通过连接基团与所述载体蛋白缀合的具有由SEQIDNO:1组成的氨基酸序列的血凝素2FIR肽。

12.一种用于治疗或预防流感感染的药物组合物，其包含药学上可接受的载体中的权利要求1-11中任一项的免疫原性肽缀合物。

13.一种治疗或预防流感感染的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求1-11中任一项的免疫原性肽缀合物给予患有流感或有感染流感的风险的受试者。

14.一种在受试者中诱导针对流感病毒的特异性治疗性抗体应答的方法，所述方法包括将权利要求1-11中任一项的免疫原性肽缀合物给予所述受试者。

15.权利要求14的方法，其中所述特异性治疗性抗体应答是抑制流感病毒与宿主细胞的膜的融合。

16.一种能够与流感病毒血凝素的FIR区特异性结合的治疗性单克隆抗体，即包含来自在给予权利要求1-11中任一项的免疫原性肽缀合物后在宿主生物中产生的抗体的互补决定区(CDR)的单克隆抗体，所述抗体与流感病毒血凝素蛋白的FIR区特异性结合。

17.权利要求16的治疗性单克隆抗体，其中所述治疗性单克隆抗体是人单克隆抗体、人源化单克隆抗体或嵌合单克隆抗体。

18.权利要求16或权利要求17的治疗性单克隆抗体用于治疗或预防流感感染的用途。

19.权利要求1-11中任一项的免疫原性肽缀合物用于治疗或预防流感感染的用途。

20.权利要求1-11中任一项的免疫原性肽缀合物用于在受试者中诱导针对流感病毒的特异性治疗性抗体应答的用途。