KR20050114225A - 인플루엔자 바이러스 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로 발병되는 질환에 대한 백신 및 백신접종 방법에 관한 것이다. 당해 백신은 캐리어 단백질에 접합된 인플루엔자 바이러스의 M2 및/또는 HA 단백질 기원의 펩타이드를 포함한다.

Description

인플루엔자 바이러스 백신{Influenza virus vaccine}
본 발명은 인플루엔자 바이러스가 관련된 질병의 예방 및 치료를 위한 백신, 백신 접종 및 치료 분야에 관한 것이다.
외피로 둘러싸인 분절 네가티브 쇄 RNA 바이러스인 인플루엔자 바이러스는 2개의 주요 유형, 인플루엔자 A와 인플루엔자 B로서 존재한다. 당해 바이러스는 사람에서 유행성 감기를 유발하는데 관여하는 감염원이다. 인플루엔자 A 바이러스는 추가로 2개의 바이러스 막관통 단백질인 헤마글루티닌(HA)와 뉴라미니다제(NA)의 항원 차이를 기초로 서브타입으로 세분된다. 지금까지, 3개 서브타입의 인플루엔자 A인 H1N1, H2N2 및 H3N2가 사람에서 동정되었다[문헌참조: Hilleman, Vaccine 20, 3068-3087, 2002]. 거의 사람에서 주로 혈류 순환하는 인플루엔자 B 바이러스는 항원 변화율이 보다 낮다는 특징이 있다. 최근의 인플루엔자 B 바이러스의 분리체는 2개의 주요 계통발생학적 분지도로서 인플루엔자 B/빅토리아/2/87 아부류 및 인플루엔자 B/야마가타/16/88 아부류로 분류된다. 이들 2개의 계통은 항원학적으로 및 유전학적으로 구별되어 흰담비에서 감염 후 교차 중화 항체 반응이 거의 관찰되지 않는다[문헌참조: Rota et al., J Gen Virol 73(Pt 10), 2737-42(1992)].
인플루엔자 바이러스 게놈의 분절된 특성 때문에 대량감염된 세포에서 바이러스 복제동안에 분절은 구분 분류되어야 한다. 유전자 돌연변이 및 표류와 조합된 분절의 구분 분류는 시간 경과에 따라 각각의 혈청형 그룹에서 무수히 다양한 인플루엔자주를 생성시킨다. 신규 주는 이들의 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제 단백질이 항원적으로 다양함을 나타낸다.
유행성 감기를 예방하기 위한 현재 주류의 실행 방법은 해마다 백신을 접종하는 것이다. 가장 일반적으로 전체 바이러스 백신을 사용한다. 이들은 인플루엔자 A H1N1 주, 인플루엔자 A H3N2 주 및 인플루엔자 B 주를 포함해야만 한다. 그러나, 인플루엔자 막관통 단백질의 계속적인 항원적 변화로 인해, 이들 단백질에 대한 단일 백신은 해마다 사용하기에는 적절하지 못하다. 따라서, 인플루엔자 바이러스의 대형 집단에는 무수히 많은 주가 존재하는 것이 특징이고 이들은 반복 추적되고 예보된다. 주어진 1년 동안에 바이러스 각각의 주에 대한 만연 및 예보를 기초로, 백신은 주로 예상되는 바이러스 주에 대한 보호 면역 반응을 자극하도록 디자인된다.
1회 과정의 백신 접종으로 수많은 해동안 또는 평생동안의 보호를 제공하는 백신의 용도와 비교하여, 해마다 백신 접종 과정은 환자 및 의료진에게는 성가시고 환자 집단에서 부조화스럽게 적용되고 소정의 혈청형 그룹내에서 기타 인플루엔자 바이러스 주에 대한 교차 보호를 제공하지 못하여 인플루엔자 감염으로 인해 삶을 허비하게 된다. 따라서, 1회의 접종으로 주어질 수 있고 고도로 다양한 바이러스 집단중의 신규 주에 대한 교차 보호를 제공할 수 있으며 접종자에게 수년간 또는 평생동안 당해 보호를 제공할 수 있는 인플루엔자에 대한 백신은 매우 이로울 것이다.
소정의 인플루엔자 유형의 모든 주에 공통적인 안정한 인플루엔자 항원을 기반으로 하는 백신은 당해 이득을 제공할 수 있다. 최근에, 인플루엔자 A형의 M2 단백질이 당해 백신에 대한 근간이 될 수 있는 항원 단백질로서 연구되었다[문헌참조: Slepushkin et al., 1995 Vaccine 13: 1399-1402]. M2 단백질은 구조적으로 보존된 바이러스 표면 단백질이다. M2는 인플루엔자 비리온의 상대적으로 소수 성분[문헌참조: Zebedee and Lamb, 1988 J. Virol. 62: 2762-2772]이지만 바이러스 감염동안에 감염된 세포에서 풍부하게 발현된다[문헌참조: Lamb et al., 1985 Cell 40: 627-633]. 감염된 세포에서, M2는 세포 막에 나타나고 바이러스 복제동안에 양성자를 유입한다[문헌참조: Helenius, 1992 Cell 69: 577-578].
인플루엔자 A의 복제는 감염의 생체내 및 시험관내 모델 둘 다에서 M2에 대한 항체에 의해 억제되는 것으로 알려져있다[문헌참조: Zebedee and Lamb, 1988 J. Virol. 62: 2762- 2772 ; Hughey et al. , 1995 Virology 212: 411-421]. 문헌[참조: Slepushkin et al. , 1995 Vaccine 13: 1399- 1402]은 전장 M2로 백신 접종된 마우스가 치명적인 이종 인플루엔자 A의 시험 감염(Challenge)으로부터 보호되고 감염된 폐 조직에서 바이러스의 제거가 증진됨을 보여주는 실험을 기재하였다.
보다 최근에는, 소수성 막관통 도메인이 제거된 변형된 M2 단백질이 백신 제조를 위해 유용한 것으로 보고되었다[문헌참조: 미국 특허 제6,169,175호]. 또 다른 맥락에서, 문헌[참조: Neirynck et al. , 1999 Nature Med. 5: 1157-1163]은 M2의 세포외 도메인과 B형 간염 코어 항원 N 말단의 융합체의 용도를 기재하였다. 당해 간염 코어 항원이 바이러스형 입자에 혼입되는 경우, M2 에피토프는 B형 간염 코어 항원의 노출된 N-말단의 일부로서 제시되는 것으로 알려져있다. 당해 저자는 이들 시스템에서, B형 간염 코어 항원으로의 N-말단 융합이 바이러스 입자 및 감염된 세포에서 M2 단백질의 야생형 구조를 모방하는 방식으로 M2 에피토프를 제공한다고 진술했다.
그러나, 당해 방법은 M2와 동등한 백신 표적의 결여때문에 인플루엔자 B 바이러스에 적용될 수 없다. 인플루엔자 B 바이러스에서 M2 기능과 동등한 것으로 가장 유사한 후보 단백질은 단지 5개 내지 7개의 아미노산으로 이루어진 극히 짧은 세포외 도메인을 갖는다[문헌참조: Mould et al., Developmental Cell 5, 175-184, 2003]. 또 다른 후보 단백질인 NB는 최근에 시험관내에서 바이러스 복제에 반드시 필요한 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Hatta et al., J. Virol. 77, 6050- 6054, 2003].
범용 인플루엔자 B 백신을 개발하기 위한 또 다른 방법은 HA0로 호칭되는 HA 전구체의 성숙 절단 부위를 기초로 한 것이다. HA의 보존된 에피토프 및 특히 HA0의 보존된 에피토프를 표적화하는 백신은 A형 및 B형 인플루엔자 둘 다에 적용될 수 있다.
외피 당단백질 HA는 바이러스의 초기 부착 및 이의 연속 내재화 둘 다를 매개한다[문헌참조: Skehel et al., Annual Review of Biochemistry 69,531-69, 2000]. HA는 2개의 서브유니트, HA1 및 HA2로 이루어져 있고 이것은 이의 전구체 HA0으로 부터 절단된 것이다[문헌참조: Skehel et al. , Proc Natl Acad Sci U S A 72,93-7 (1975); Chen et al., Cell 95,409-17, 1998]. HA0 성숙화는 바이러스가 복제하고 있는 세포에 의해 분비되는 프로테아제에 의해 매개되는 세포 연합 과정이다[문헌참조: Zhirnov, Biochemistry (Mosc) 68,1020-6 (2003)]. 플라스민, 칼리크레인, 우로키나제, 트롬빈, 혈액 응고 인자 Xa, 아크로신, 트립타제 클라라, 트립타제 TC30, 소형-플라스민, 사람 호흡 세척액 기원의 프로테아제 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 기원의 세균성 프로테아제를 포함하는 많은 분비된 효소는 HA0 절단과 연관되어 있다. HA0의 HA1-HA2로의 절단은 바이러스 감염성을 활성화시키고[문헌참조: Klenk et al., Virology 68,426-39, 1975; Lazarowiz & Choppin, Virology 68,440-54 (1975)] 사람 및 조류 숙주에서의 병원성에 중요하다[문헌참조: Klenk & Garten, Trends Microbiol 2,39-43 1994; Steinhauer, Virology 258,1-20, 1999].
숙주 프로테아제에 대한 감수성을 결정하는 HA의 주요 특징은 HA0 전구체의 단백질 용해 부위의 조성이고 당해 전구체의 구조는 최근에 X-선 결정학에 의해 인플루엔자 A 바이러스를 대상으로 밝혀졌다[문헌참조: Chen et al., Cell 95, 409-17, 1998]. HA0은 거의 성숙 가공된 HA1-HA2 단백질과 거의 동일하고 주로 절단 부위 주변의 18개 잔기에서 차이가 있다. 전구체에서, 당해 잔기는 연장된 비절단 루프로서 폴딩되어 있다. 서브유니트 상호 절단 부위의 아미노산 서열은 각각의 인플루엔자 서브타입 내에서 및 인플루엔자 B 바이러스의 2개의 계통내에서 고도로 보존되어 있다. 융합 펩타이드에 상응하는 HA2 측면은 또한 인플루엔자 A 서브타입에 걸쳐 보존되어 있고 H3 및 H1 뿐만 아니라 인플루엔자 B에 대해서 거의 동일하다.
명세서 전반에 걸쳐, 용어 HA0 펩타이드는 HA0의 1차 서열로부터 유래된 임의의 펩타이드를 지적하는데 사용된다. 이것은 HA0 고유의 절단 부위 서열을 포함하지만 HA0 전구체 및 성숙 HA가 공유하는 임의의 서열도 포함한다. 이어서 성숙 HA는 2개의 공유적으로 연결된 서브유니트 HA1 및 HA2로 구성된다. 이러한 이유 때문에, 절단 부위 서열로부터 상이한 HA0 펩타이드는 또한 HA 펩타이드 또는 HA2 펩타이드로서 언급된다. 이들 용어 각각은 본원에서 HA0 펩타이드로 언급되는 부류내의 특정 유형의 펩타이드를 언급한다.
당해 방법의 실행 가능성은 나기(Nagy et al) 등에 의해 처음 조사되었고 당해 연구자는 HA0의 서열 317-341(서브타입 H1)에 상응하는 합성 펩타이드로 백신 접종된 마우스가 치명적인 바이러스 시험 감염으로부터 부분적으로 보호됨을 보여주었다. 백신 표적으로서 HA0의 HA1-HA2로의 전환에 대한 추가의 타당성은 바이러스 복제에 대한 프로테아제 억제제의 효과로부터 알 수 있다. 단일염기성 절단 부위를 갖는 인플루엔자 바이러스에서 세린 프로테아제 억제제는 배양된 세포, 사람 호흡 상피 및 감염된 마우스의 폐에서 HA0의 절단 및 바이러스 활성화를 감소시킬 수 있다[문헌참조: Zhirnov et al., J Gen Virol 63, 469-74,1982 ; Zhirnov et al. , J Gen Virol 65,191-6, 1984; Zhirnov et al., J Virol 76, 8682-9, 2002].
발명의 요약
본 발명의 한 측면은 다수의 펩타이드(이의 각각은 A형 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 세포외 에피토프를 포함한다)가 캐리어 단백질의 표면에 접합되어 있는 단백질-펩타이드 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다.
본 발명의 또 다른 측면은 다수의 펩타이드(이의 각각은 A형 인플루엔자 바이러스의 HA0 단백질의 에피토프를 포함한다)가 캐리어 단백질의 표면에 접합되어 있는 단백질-펩타이드 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다.
본 발명의 또 다른 측면은 다수의 펩타이드(이의 각각은 B형 인플루엔자 바이러스의 HA0 단백질의 에피토프를 포함한다)가 캐리어 단백질의 표면에 접합되어 있는 단백질-펩타이드 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다.
특정 양태에서, 펩타이드는 펩타이드가 단백질 표면상의 반응 부위에 공유 결합되어 단백질에 접합되어 있다. 수득된 구조는 접합체이다. 단백질의 표면상의 반응 부위는 화학적으로 활성이거나 활성화될 수 있는 부위이고 입체적으로 펩타이드와의 공유 결합을 위해 접근가능하다. 바람직한 반응 부위는 아미노산 라이신의 엡실론 질소이다. 공유적으로 결합된이란 생리학적 조건하에 가수분해에 대해 안정할 수 있는 공유 결합이 존재함을 언급한다. 바람직하게, 공유 결합은 부가물 형성, 산화 및 환원을 포함하는 생리학적 조건하에 일어날 수 있는 기타 반응에 안정하다. 펩타이드의 단백질로의 공유 결합은 "결합 수단"에 의해 성취된다. 당해 수단은 상응하는 본원에 기재된 구조, 물질 또는 작용 및 이의 등가물을 포함한다.
발명의 한 측면의 특정 양태에서, 캐리어 단백질은 백신 접종 분야에서 유용한 항원 단백질이다. 발명의 특정 양태에서, 항원 단백질은 나이세리아 메닌기티디스(Neiserria meningitidis)의 외막 단백질 복합체(OMPC)이다. 또 다른 양태에서, 캐리어 단백질은 파상풍 독소, 디프테리아 독소, B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg), B형 간염 바이러스 코어 항원(HBcAg), 키홀 림펫 헤모시아닌, 로타바이러스 캡시드 단백질 또는 소 또는 사람 파필로마 바이러스의 바이러스형 입자(VLP), 예를 들어, 6, 11 또는 16형 HPV의 VLP의 L1 단백질일 수 있다.
발명의 당해 측면의 추가의 양태에서, 펩타이드는 이의 N-말단 또는 C-말단을 통해 캐리어 단백질에 접합된다.
추가의 양태에서, 펩타이드는 링커 잔기를 통해 캐리어 단백질에 접합된다. 특정 양태에서, 링커는 일원성 또는 이원성 스페이서이다.
추가의 양태에서, 캐리어 단백질은 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체(OMPC)이고 접합체는 각각의 OMPC 표면에 접합된 약 100개 내지 약 6000개의 펩타이드를 갖는다.
추가의 양태에서, 펩타이드 서열에 천연적으로 존재하는 아미노산은 기타 아미노산으로 대체된다. 특정 양태에서, 시스테인 잔기는 세린 잔기로 대체된다.
추가의 양태에서, 펩타이드 서열을 변형시켜 펩타이드의 등전점을 변화시킨다.
본 발명의 또 다른 측면은 접합체, 보조제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 갖는 백신이다. 특정 양태에서, 보조제는 알루미늄 기재의 보조제이다. 특정 양태에서, 백신은 추가로 양이온성 보조제, 예를 들어, QS21 보조제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 M2 접합체 및 B형 인플루엔자 기원의 HA0 펩타이드의 접합체, 보조제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 갖는 백신이다.
본 발명의 또 다른 측면은 M2 접합체 및 A형 인플루엔자 기원의 HA0 펩타이드의 접합체, B형 인플루엔자 기원의 HA0 펩타이드의 접합체, 보조제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 갖는 백신이다.
본 발명의 또 다른 측면은 단백질-펩타이드 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염(여기서, 다수의 펩타이드 각각은 A형 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 세포외 에피토프를 포함하고 캐리어 단백질의 표면에 접합된다)을 포함하는 백신을 사용한 A형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로 발병된 질환에 대한 환자의 백신 접종 방법이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 유효량의 백신은 환자에게 투여된다.
본 발명의 또 다른 측면은 단백질-펩타이드 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염(여기서, 다수의 펩타이드 각각은 A형 인플루엔자 바이러스의 HA0 단백질의 에피토프를 포함하고 캐리어 단백질의 표면에 접합된다)을 포함하는 백신을 사용한 A형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로 발병된 질환에 대한 환자의 백신 접종 방법이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 유효량의 백신은 환자에게 투여된다.
본 발명의 또 다른 측면은 펩타이드-단백질 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염(여기서, 다수의 펩타이드 각각은 A형 또는 B형 인플루엔자 바이러스의 HA0 단백질의 에피토프를 포함하고 캐리어 단백질의 표면에 접합된다)을 포함하는 백신을 사용한 A형 또는 B형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로 발병된 질환에 대한 백신 접종 방법이다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 유효량의 백신은 환자에게 투여된다.
본 발명의 또 다른 측면은 인플루엔자의 M2 단백질의 세포외 에피토프의 서열을 갖는 펩타이드를 단백질 표면상의 반응 부위로 공유결합시켜 펩타이드-단백질 접합체를 제조하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 접합체에 보조제를 부가하고 보조제 부가된 접합체를 약제학적으로 허용되는 담체와 제형화하여 백신을 제조하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 측면은 항원 성분중 하나가 캐리어 단백질의 표면상의 아미노산에 접합된 A형 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 세포외 에피토프를 갖는 펩타이드를 포함하는 배합 백신이다. 특정 양태에서, 배합 백신은 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenza), A, B 또는 C형 간염 바이러스, 사람 파필로마 바이러스, 홍역, 이하선염, 풍진, 수두, 로타바이러스, 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 부터 선택된 항원 성분을 포함한다. 추가로, 본 발명의 백신은 특히, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제로부터 유래된 에피토프를 포함하는 A형 및 B형 인플루엔자 바이러스의 기타 항원 성분과 배합될 수 있다.
도 1. 티올화된 캐리어(1)를 브로모아세틸화(2)되거나 말레이미드화(3)된 펩타이드와 반응시켜 티올 에테르 결합(반응식 I)을 수득한 것을 나타낸다.
도 2. 캐리어 고유 1급 아민(1)을 브로모아세틸화(2)되거나 말레이미드화(3)된 펩타이드와 반응시켜 2급 아민 결합(반응식 II)을 수득한 것을 나타낸다.
도 3. 말레이미드화된 캐리어(1)를 티올 함유 펩타이드(2)와 반응시켜 티올 에테르 결합(반응식 III)을 수득한 것을 나타낸다. 다수의 티올을 함유하는 펩타이드에 대해, 캐리어 말레이미드 그룹과의 다중 결합은 단일 펩타이드에 존재할 수 있다. 이것은 캐리어로 로딩되는 펩타이드의 총량을 감소시킬 수 있다. 다수의 링커가 분리된 단백질의 말레이미드상에 존재하는 경우, 펩타이드와 캐리어 서브유니트가 가교결합될 수 있다.
도 4. 알킬할라이드 캐리어(1)를 티올 함유 펩타이드(2)와 반응시켜 티올 에테르 결합(반응식 IV)을 수득한 것을 나타낸다. 다수의 티올을 함유하는 펩타이드에 대해, 캐리어 알킬할라이드(나타낸 요오도아세틸 또는 브로모아세틸)와의 다중 결합은 단일 펩타이드내에 존재할 수 있다. 이것은 캐리어로 로딩되는 펩타이드의 총량을 감소시킬 수 있다. 다수의 링커가 분리된 단백질의 요오도아세틸 그룹상에 존재하는 경우, 펩타이드와 캐리어 서브유니트는 가교 결합될 수 있다.
도 5. 가교 결합된 말레이미드화된 인플루엔자 펩타이드와 티올화된 OMPC의 가수분해를 나타낸다. 비단백질 아미노산 S-(1,2-디카복시에틸)-호모시스테인을 정량하여 공유 결합을 입증할 수 있다. 4-아미노부티르산 및 6-아미노헥산산을 정량하여 존재하는 총 펩타이드를 평가할 수 있다(반응식 V).
도 6. 커플링된 브로모아세틸화된 인플루엔자 펩타이드와 티올화된 OMPC의 가수분해를 나타낸다. 비단백질 아미노산 S-(카복시메틸)-호모시스테인을 정량하여 공유 결합을 입증할 수 있다. 6-아미노헥산산을 정량하여 존재하는 총 펩타이드를 평가할 수 있다(반응식 VI).
도 7. 커플링된 시스테인 함유 인플루엔자 펩타이드와 요오도아세틸화된 OMPC의 가수분해를 나타낸다. 비단백질 아미노산 S-(카복시메틸)-시스테인을 정량하여 공유 결합을 입증할 수 있다. 6-아미노헥산산을 정량하여 존재하는 총 펩타이드를 평가할 수 있다. 4-아미노벤조산을 정량하여 OMPC와 연합된 가교 링커의 총량을 평가할 수 있다(반응식 VII).
도 8. 커플링된 시스테인 함유 Flu M2 펩타이드와 말레이디드화된 OMPC의 가수분해를 나타낸다. 비단백질 아미노산 S-(1,2-디카복시에틸)-시스테인을 정량하여 공유 결합을 입증할 수 있다. 6-아미노헥산산을 정량하여 존재하는 총 펩타이드를 평가할 수 있다. 트라넥삼산을 정량하여 OMPC와 연합된 가교 링커의 총량을 평가할 수 있다(반응식 VIII).
도 9. 마우스에서 M2 펩타이드 접합체 백신에 의한 M2-특이적 항체 반응의 유도를 나타낸다. 그룹당 10마리의 암컷 Balb/c 마우스의 근육내로 0.01㎍, 0.1㎍ 또는 1㎍의 지정된 접합체(펩타이드 중량을 기준으로 하는 용량)를 면역접종하고 3주 후에 동일한 용량으로 1회 부스팅한다. 제1 면역화(PD1) 2주 후 및 부스트 면역화(PD2) 3주 후에 혈액 샘플을 수거한다. M2-특이적 항체 역가를 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA)으로 측정한다. 당해 데이터는 그룹 기하학적 평균 +/- 표준 오차(GMT +/- SE)를 나타낸다. C 말단 시스테인을 통해 말레이미드 활성화된 OMPC로 접합된 CT M2 15량체 ma-OMPC, M2 15량체(서열번호 10); 티올화된 OMPC에 접합된 CT BrAc-M2 15량체 OMPC, C-말단 브로모아세틸화된 M2 15량체(서열번호 13); 티올화된 OMPC로 접합된 NT BrAc-M2 15량체 OMPC, N-말단 브로모아세틸화된 15량체 M2 펩타이드(서열번호 11); 티올화된 OMPC로 접합된 CT BrAc-M2(SRS) OMPC, C-말단 브로모아세틸화된 M2 23량체(SRS)(서열번호 39).(GMT = 기하학적 평균 역가)
도 10. 치명적인 flu 시험 감염에 대한 CT M2 15량체 ma-OMPC 및 CT BrAc-M2 15량체 OMPC에 의한 보호를 나타낸다. 동물 면역화 프로토콜을 위한 도 9의 범례에 따름. 동물의 비강내로 부스트 면역화 4주 후에 다시 분류된 LD90의 flu A/HK/68을 시험 감염시킨다. 체중 변화 %는 다음과 같이 계산된다: 시험일에 그룹 평균 체중/시험 감염 후 0일째에 그룹 평균 체중 x 100%. 생존 %는 다음과 같이 계산한다: 시험일에 동물 수/시험 감염 후 0일째에 동물 수 x 100%
도 11. 치명적 flu 시험 감염에 대한 CT BrAc-M2 15량체 OMPC 및 CT BrAc-M2(SRS) OMPC에 의한 보호를 나타낸다. 도 9 및 도 10의 범례에 따름.
도 12. 치명적 flu 시험 감염에 대한 CT BrAc-M2 15량체 OMPC 및 NT M2 15량체 ma-OMPC에 의한 보호를 나타낸다. 도 9 및 도 10 범례에 따름.
도 13A. 말레이미드 유도체화된 인플루엔자 펩타이드의 티올화된 OMPC로의 접합을 나타낸다.
도 13B. 브로모아세틸화된 인플루엔자 펩타이드의 티올화된 OMPC로의 접합을 나타낸다.
도 14. 도 13A에 도식적으로 나타낸 바와 같이 캐리어 단백질에 결합될 수 있는 펩타이드의 예로서 서열번호 12 및 서열번호 14의 펩타이드를 나타낸다. 서열번호 11 및 서열번호 13의 펩타이드는 도 13b에 도식적으로 나타낸 바와 같이 캐리어 단백질에 결합될 수 있는 펩타이드의 예이다. 서열번호 39의 펩타이드는 OMPC 또는 기타 캐리어 단백질의 티올 반응성 유도체에 접합될 수 있는 C-말단 시스테인을 갖는 SRS M2 서열의 절두된 형태이다. 서열번호 2는 보다 긴 M2 대응물이다.
도 15. 라이신 스캐폴드상의 다중 M2 펩타이드를 도식적으로 나타낸 것이다. R = 서열번호 8.
도 16. 라이신 스캐폴드상의 다중 M2 펩타이드를 도식적으로 나타낸 것이다. R = 서열번호 1.
도 17. 라이신 스캐폴드상의 다중 M2 펩타이드를 도식적으로 나타낸 것이다. R=서열번호 2
도 18. 라이신 스캐폴드상의 다중 M2 펩타이드를 도식적으로 나타낸 것이다. R= 서열번호 2
도 19. 이량체로서 함께 결합된 다중 M2 펩타이드를 도식적으로 나타낸 것이다. DAP = L-2,3-디아미노프로피온산. 상부 이량체는 서열번호 55 및 56을 포함한다. 하부 이량체는 서열번호 57 및 58을 포함한다.
도 20. 라이신 스캐폴드상의 다중 M2 펩타이드를 도식적으로 나타낸 것이다. R = 서열번호 2. 도 18에 나타낸 구조로 Cys 잔기를 도입하여 도 17 및 20에 나타낸 바와 같이 유리 티올 작용기를 갖는 MAP를 수득한다. 당해 MAP는 브로모아세틸, 말레이미드 및 티올 반응성 그룹을 포함하는 캐리어 단백질로의 접합을 위해 사용될 수 있다.
도 21. 스캐폴드가 함께 결합되어 있는 다중 라이신 스캐폴드상의 다중 M2 펩타이드를 도식적으로 나타낸 것이다. R = 서열번호 2
도 22A. B형 인플루엔자 펩타이드 접합체 백신에 대한 HA0 특이적 항체 반응을 나타낸다.
도 22B. B 형 인플루엔자 펩타이드-접합체 백신으로 백신 접종된 마우스에서 B형 인플루엔자 바이러스 시험 감염 후 생존 곡선을 나타낸다.
도 23. 생체내 바이러스 복제에 대한 B형 인플루엔자 백신 성분의 효과를 준치명적 시험 감염 모델에서 시험한 것을 나타낸다.
도 24. A형 인플루엔자 HA2 펩타이드 접합체 백신으로 면역화된 마우스에 대한 생존 곡선이다.
도 25. 12 캡소머 VLP에서 X선에 의해 측정된 바와 같은 L1 단백질의 리본 다이아그람을 나타낸다[문헌참조: Chen et al. ,"Structure of small virus-like-particles assembled from the Ll protein of human papillomavirus 16", Mol. Cell. , Vol. 5, pp. 557-567,2000]. 각각의 중간 회색 구형은 VLP의 외부 표면상에 있는 19개의 Lys 쇄의 NZ 원자를 나타낸다. 암회색 부분은 H16.V5 및 H16.E70 항체 둘다에 대한 에피토프의 일부인 Phe 50을 나타낸다. 담회색 클러스터는 H16.J4 항체에 대한 결합 루프를 나타낸다. 도 25는 프로그램 MolMol을 사용하여 작성되었다[문헌참조: Koradi, R., Billeter, M., and Wutrich, K. 1996. MOLMOL : a program for display and analysis of macromolecular structures. J. Mol. Graphics 14, 51-55].
도 26A 및 26B. (27A)SEC-HPLC 및 (27B) 분석 초원심분리에 의해 결정된 바와 같은 16형 HPV VLP(실선), 활성화되고/켄칭된 HPV-VLP(점선) 및 접합체 M2-HPV VLP(원을 갖는 실선)에 대한 입자 크기 분포를 나타낸다.
도 27. M2-HPV VLP에 대한 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 28. 16형 HPV VLP(실선), 활성화되고/켄칭된 HPV-VLP(점선) 및 접합체 M2-HPV VLP(원을 갖는 실선)에 대해 350nm에서 OD에 의해 모니터된 온도 유도된 응집체를 나타낸다.
도 29A 및 29B. 29A: 펩타이드 용량이 상이한 M2-HPV VLP를 함유하는 백신을 사용한, T=0 및 T=4주에서 면역화한 후 T=2 및 6주에서, 마우스에서 M2-HPV VLP에 의해 유도된 항-M2 항체의 기하학적 평균 역가(GMT)를 나타낸다. 29B: 펩타이드 용량이 상이한 M2-HPV VLP를 함유하는 백신으로 면역화된 마우스에 대한 치명적인 시험 감염에 따른 생존율을 나타낸다.
도 30. 마우스에서 비강 및 폐 바이러스 발산에 대한 M2-KLH 접합체 백신으로의 면역화에 의한 보호를 나타낸다. 마우스에서 준치사량의 바이러스 시험 감염에 따른 상부 및 하부 호흡기에서의 바이러스 발산 프로필이다. 데이터는 각각의 데이터 시점에서 8마리의 마우스에 대한 GMT +/- S.E.를 나타낸다. 점선은 분석 검출 한계선이다. GMT = 기하학적 평균 역가.
도 31. M2-OMPC 접합체 백신에 의한 레서스 몽키에서의 항체 반응 유도를 나타낸다. 30마리의 레서스 몽키를 각각 3마리의 동물로 이루어진 10개의 그룹으로 나눈다. 각각의 데이터 지점은 그룹당 3마리 동물에 대한 평균 GMT를 나타낸다. 평균/알루미늄(Alum)은 알루미늄 속에서 제형화된 M2-OMPC를 투여받은 OMPC 면역된 몽키 또는 OMPC 비면역된 몽키의 모든 4개 그룹에 대한 GMT를 나타낸다. GMT = 기하학적 평균 역가.
본 발명은 A형 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 세포외 에피토프를 포함하는 다수의 펩타이드가 캐리어 단백질의 표면상의 아미노산으로 접합된 인플루엔자 백신을 제공한다. 접합체를 제조하는 방법 및 백신을 제형화하는 방법이 제공된다. 본 발명은 또한 A형 인플루엔자 바이러스로 감염되어 발병된 질환 및 쇠약 증상으로부터 환자를 장기간동안 보호해주는 환자의 백신 접종 방법을 제공한다.
펩타이드
A형 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 세포외 부분은 일반적으로 단백질의 24개 N-말단 아미노산으로서 인지된다. 백신에 사용되는 펩타이드는 이러한 24개 아미노산 서열에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 펩타이드의 특정 서열은 전체 24개 아미노산 서열 또는 7개 이상의 아미노산을 갖고 항원 에피토프를 포함하는 서브세트일 수 있다.
인플루엔자의 M2 단백질의 제1 아미노산은 메티오닌임을 주지해야한다. 발명의 임의의 양태에서, 말단에 메티오닌의 존재는 임의적이다.
24개 N-말단 아미노산의 효과적인 준서열은 예를 들어, 하기의 과정을 통해 측정될 수 있다. 처음에, 준서열을 갖는 펩타이드를 시험하여 이것이 24개의 아미노산 서열에 대해 생성된 항체에 의해 결합되어 있는지를 측정한다. 이어서, 펩타이드를 캐리어 단백질에 접합시키고 수득한 접합체를 사용하여 마우스, 흰담비 또는 몽키와 같은 동물에게 백신 접종한다. 당해 동물 기원의 혈청에 펩타이드에 대한 항체가 존재하는지를 시험한다. 마지막으로, 동물을 인플루엔자 바이러스로 시험 감염시킨다. 감염 과정 및 수득한 질환의 중증도를 평가한다. 다수의 동물로 당해 과정을 수행하는 것이 가장 양호하고 당해 결과를 모든 동물에 걸쳐 평가한다. 접합체를 사용한 백신 접종이 감염 수준 또는 수득한 질환의 중중도를 감소시키는 경우, 펩타이드는 백신 제조에 유용한 것으로 간주된다.
바람직한 양태에서, 펩타이드의 아미노산 서열은 M2 단백질의 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개등의 N-말단 아미노산을 포함한다. 최소 크기는 환자의 면역계에 부여하고자 하는 에피토프 크기에 의해서만 제한된다. 몇몇 바람직한 아미노산 서열은 서열번호 1, 10 및 39이다.
펩타이드의 아미노산 서열이 M2 단백질의 17번 또는 19번에서 시스테인을 포함하는 양태에서, 당해 시스테인은 바람직하게 세린으로 치환될 수 있다. 시스테인의 세린으로의 치환은 사용된 접합 기술에 따라 시스테인의 반응성이 첨가된 펩타이드의 말단 시스테인 보다는 내부 시스테인에서의 펩타이드의 다량체화, 펩타이드와 펩타이드의 접합 또는 펩타이드와 캐리어 단백질의 접합을 유도할 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 당해 부반응은 접합체의 펩타이드 로딩 수율을 저하시킬 수 있다. 그러나, 펩타이드의 내부 시스테인에서 펩타이드와 캐리어 단백질의 접합은 비효과적인 백신을 유도하지 않고 본 발명의 범위내에 있음을 주지해야만한다.
서브유니트 상호 절단 부위 영역 및 HA2 서브유니트에 위치한 특정 HA0의 절편은 고도로 보존되어 있다. 광범위한 시리즈의 중첩 HA0 펩타이드를 사용한 생체내 면역원성 및 보호 연구를 기준으로, 본 발명자는 보호 에피토프를 포함하는 수개의 HA0 영역을 동정하였다. 하나의 영역은 HA0의 절단 부위를 포함하고 또 다른 영역들은 HA2 서브유니트내에 위치한다(하기 표 참조)
추가로, HA 펩타이드로 제조된 접합체와 M2 펩타이드로 제조된 접합체를 조합함으로써 단독의 접합체가 주어지는 경우와 비교하여 A형 인플루엔자에 의해 발병되는 질환에 대해 보다 우수한 보호를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 양태는 또 다른 보존된 보호 인플루엔자 바이러스 펩타이드로 구성된 접합체와 조합된 M2 펩타이드 접합체를 함유하는 백신이다. 본 발명의 방법의 바람직한 양태는 단독의 M2 펩타이드 접합체를 갖는 백신을 투여한 경우 나타나는 면역학적 반응 보다 높은 A형 인플루엔자에 대한 면역학적 반응을 필요로 하는 환자에게 당해 백신을 투여하는 것이다.
HA 펩타이드는 하기 표에 기재된 것으로부터 선택될 수 있다:
BrAc = 브로모아세틸
Ac = 아세틸
Mal = 말레이미딜
Suc = 숙시닐
Ahx = 6-아미노헥산산
b = 베타-알라닌
Abu = 2-아미노부티르산
추가로, B형 인플루엔자 HA0 절단 부위 펩타이드로 제조된 접합체와 A형 인플루엔자 M2 펩타이드로 제조된 접합체를 조합함으로써 A형 및 B형 인플루엔자 둘다에 의해 발병된 질환으로부터 보호받을 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 양태는 B형 인플루엔자 기원의 또 다른 보존된 보호 펩타이드로 이루어진 접합체와 조합된 M2 펩타이드 접합체를 함유하는 백신이다. 본 발명의 추가의 바람직한 양태는 A형 인플루엔자 기원의 또 다른 보존된 보호 펩타이드로 이루어진 접합체 및 B형 인플루엔자 기원의 또 다른 보존된 보호 펩타이드로 이루어진 접합체와 조합된 M2 펩타이드 접합체를 함유하는 백신이다. 본 발명의 방법의 바람직한 양태는 단독의 M2 펩타이드 접합체를 갖는 백신을 투여한 경우 나타나는 면역학적 반응 보다 높은 A형 인플루엔자에 대한 면역학적 반응을 필요로 하는 환자에게 당해 백신을 투여하는 것이다.
M2 또는 HA0 펩타이드 항원은 또한 라이신 또는 기타 적합한 스캐폴드상의 다중 항원 펩타이드에 의해 제공될 수 있다. 당해 방식으로 배열된 펩타이드는 본 발명의 접합체 백신에 사용될 수 있다. 이의 예는 도 15-18 및 20-21에서 알 수 있다. 본 발명의 접합체 백신에 제공되는 또 다른 펩타이드는 이량체 M2 또는 HA0 펩타이드이다. 당해 포맷에서, 결합, 바람직하게 공유결합을 사용하여 2개의 펩타이드를 가교 결합시켜 이량체를 형성한다. M2 펩타이드에 대한 예는 도 19에서 알 수 있다. 펩타이드가 당해 방식으로 배열된 접합체 백신은 상응하는 단량체 펩타이드 접합체로 제조된 백신 보다 항원성이 높을 수 있다.
펩타이드는 문헌에 널리 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 당해 기술은 화학적 및 생화학적 합성을 포함한다. 펩타이드의 화학적 합성에 대한 기술의 예는 문헌[참조: Vincent, in Peptide and Protein Drug Delivery, New York, N.Y., Dekker, 1990]에 제공되어 있다. 핵산의 세포로의 도입 및 핵산 발현을 포함하는 생화학적 합성에 대한 기술의 예는 문헌[참조: Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987-1998, and Sambrook, et al., in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 제공되어 있다.
캐리어 단백질
본원에 언급된 바와 같이, 캐리어 단백질은 펩타이드가 접합된 면역원성 단백질을 의미한다. 다양한 캐리어 단백질은 기술분야에 공지되어 있고 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신에 사용되어 왔다. 이들 및 기타 면역원성 단백질은 또한 본 발명의 백신에 사용될 수 있다. 바람직한 캐리어 단백질은 나이제리아 메닌기티디스(Neiserria meningitidis)의 외막 단백질 복합체, 파상풍 독소 단백질, 표면 항원 단백질(HBsAg) 및 코어 항원 단백질(HB Core)를 포함하는 B형 간염 바이러스 단백질, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 로타바이러스 캡시드 단백질 및 소 파필로마 바이러스 VLP 또는 사람 파필로마 바이러스 VLP, 예를 들어, 6형, 11형 또는 16형 등의 HPV의 VLP의 L1 단백질이다.
용이한 제조를 위해, 단일 유형의 캐리어 단백질을 사용하여 접합체를 제조할 수 있다. 그러나, 또한 각각 상이한 캐리어 단백질을 사용하여 하나 이상의 접합체를 제조할 수 있다. 이어서, 백신을 제형화할때 당해 접합체를 혼합할 수 있다. 이러한 방식으로 인플루엔자에 대한 면역 반응을 생성시키는 것 뿐만 아니라 접합체에 사용되는 상이한 캐리어 단백질에 대한 면역 반응을 생성시키는 백신을 제공할 수 있다. 경우에 따라 추가로 다양한 펩타이드 및 캐리어 단백질을 조합하여 접합체를 변화시킬 수 있다.
바람직한 캐리어 단백질은 OMPC이다. OMPC는 접합에 유용한 다수의 반응 부위를 포함한다. 접합을 위한 반응 부위의 유용성은 OMPC에 존재하는 원자 그룹 및 그룹의 위치에 의해 결정된다. 접합을 위해 유용한 친핵성 작용기는 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 결정할 수 있다[문헌참조: Emini, et al. 미국 특허 제5,606,030호]. 접합을 위한 반응 부위로서 사용될 수 있는 한가지 유형의 그룹은 라이신의 엡실론 아미노 그룹 및 단백질의 N-말단 아미노산의 알파 아미노 그룹과 같은 아미노산상에 존재하는 1급 아미노 그룹이다. 추가로, 당해 아미노 그룹을 전환시켜 티올화된 형태의 OMPC를 제조하여 반응성 작용기를 수득하고 이는 티올 반응 펩타이드로의 접합을 위해 사용될 수 있다. 티올 반응 펩타이드의 예는 도 13에 기재된 바와 같은 브로모아세틸화되거나 말레이미드 유도체화된 펩타이드이다. OMPC는 문헌[Fu, 미국 특허 제5,494,808호]에 기재된 바와 같은 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
또 다른 바람직한 카테고리의 캐리어 단백질은 바이러스형 입자(VLP)로 자가 어셈블리되는 능력을 갖는 바이러스 캡시드 단백질이다. 펩타이드 캐리어로서 사용되는 VLP의 예는 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg) 및 코어 항원(HBcAg)[문헌참조: Pumpens et al. ,"Evaluation of HBs, HBc, and frCP virus-like particles for expression of human papillomavirus 16 E7 oncoprotein epitopes", Intervirology, Vol. 45, pp. 24- 32,2002], E형 간염 바이러스 입자[문헌참조: Niikura et al. ,"Chimeric recombinant hepatitis E virus-like particles as an oral vaccine vehicle presenting foreign epitopes", Virology, Vol. 293, pp. 273- 280,2002], 폴리오마 바이러스[문헌참조: Gedvilaite et al. ,"Formation of Immunogenic Virus-like particles by inserting epitopes into surface-exposed regions of hamster polyomavirus major capsid protein", Virology, Vol. 273, pp. 21-35,2000] 및 소 파필로마 바이러스[문헌참조: Chackerian et al., "Conjugation of self-antigen to papillomavirus-like particles allows for efficient induction of protective autoantibodies", J. Clin. Invest. , Vol. 108 (3), pp. 415-423,2001]이다. 보다 최근에, 항원 제시 인공 VLP가 실제 바이러스 입자의 분자량 및 크기를 모방하여 작제되었다[문헌참조: Karpenko et al. ,"Construction of artificial virus-like particles exposing HIV epitopes and the study of their immunogenic properties", Vaccine, pp. 386-392,2003].
펩타이드 항원 캐리어로서 파필로마바이러스 VLP의 미심적인 잇점은 이것이 정돈된 배열로 일련의 항원성 서열을 제시할 수 있다는 것이고 이는 면역계로부터 최적의 반응을 보장하는 것으로 사료된다. 당해 보고에서, 정이십면체 비리온을 모방하는 매트릭스로 배열된 항원의 노출은 자가 항원 및 외래 항원을 구분하는 체액성 면역계의 능력을 폐지시키는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Chackerian et al. ,"Induction of autoantibodies to mouse CCR5 with recombinant papillomavirus particles", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 2373-2378, 1999]. 마우스 자가 펩타이드 TNF-α를 파필로마 바이러스 VLP에 결합시킴에 의해 고 역가의 장기 지속적인 자가항체가 마우스에서 유도되었다. 최소 항원 캐리어로서 VLP를 사용하는데 있어서 한가지 극복해야할 것은 VLP 캐리어에 먼저 노출되어 유도된 항-캐리어 항체가 존재함으로 인한, 개발된 접합체 백신의 면역원성의 감소를 회피해야만 한다는 것이다.
사람 파필로마바이러스(HPV) VLP는 크기가 약 60nm인 전형적인 정이십면체 격자 구조를 갖고 각각은 72개의 L1 단백질 오량체(캡소머(capsomer)로 언급됨)가 어셈블리하여 형성된다[문헌참조: Chen et al. , 2000; Modis et al.,"Atomic model of the papilloma virus capsid", EMBO J. , Vol. 21, pp. 4754-4762,2002]. 소 파필로마바이러스 VLP는 유전자 융합에 의해 VLP의 L1 단백질[문헌참조: Chackerian et al., 1999] 또는 L2 단백질[문헌참조: Greenstone et al. ,"Chimeric papillomavirus virus-like particle elicit antitumor immunity against the E7 oncoprotein in an HPV 16 tumor model", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, pp. 1800-1805,1998] 또는 스트렙트아비딘과 융합함에 이어서 비오티닐화된 VLP에 결합된 L1 또는 L2 단백질[문헌참조: Chackerian et al., 2001]로 삽입되는 일련의 항원을 성공적으로 수송하는데 사용되었다.
사람 및 소 파필로마 바이러스 VLP의 제조는 상기 인용된 문헌 및 하기 예시된 특허 및 특허 공보[미국 특허 제6,159,729호, 제5,840,306호, 제5,820,870호 및 WO 01/14416]에 지적된 바와 같이 본 기술분야에 널리 공지되어 있다.
하기의 예는 인플루엔자의 펩타이드 단편을 사람 파필로마바이러스(HPV) 바이러스형 입자(VLP)에 화학적으로 접합시켜 수득한 예시된 접합체 백신의 제법 및 면역원성을 기재하고 있다. VLP당 약 800 내지 4,000 카피의 항원 펩타이드로 이루어진 수득한 접합체 분자는 펩타이드상의 C-말단 시스테인 잔기와 말레이미드 활성화된 HPV VLP를 반응시킴에 의해 수득되었다. 당해 접합체의 평균 입자 크기는 단독의 VLP 캐리어 보다 약간 크고 화학적 및 열적 유도된 변성에 대한 전반적인 안정성이 증진되었음을 보여준다. M2-HPV VLP 접합체는 몇몇 항-HPV 형태의 항체에 대한 결합 친화성을 상실하였지만 항-M2 항체에 의해 완전히 인지된다. 인플루엔자 M2 펩타이드-HPV VLP 접합체 백신은 알루미늄 보조제와 제형화하였다. 2개의 30ng 펩타이드 용량이 마우스에서 고도로 면역원성이고 시험 감염된 치명적인 인플루엔자 바이러스로부터 양호하게 보호해주는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 HPV VLP가 접합체 백신에서 인플루엔자 펩타이드에 대한 캐리어로서 사용될 수 있음을 지적한다.
화학적으로 커플링된 인플루엔자 접합체 백신을 개발하기 위한 항원 캐리어로서의 사람 파필로마바이러스 VLP 시스템의 사용은 특정 잇점을 제공한다. 화학적 커플링은 VLP의 적절한 어셈블리를 방해할 수 있는 L1 서열로의 펩타이드 삽입과 같은 잠재적인 문제점을 회피하고 비오티닐화 및 결합 과정 보다 훨씬 단순하다. 더욱이, 제시된 결과는 화학적 커플링이 이전에 보고된 과정과 비교하여 VLP당 훨씬 많은 펩타이드를 로딩시킬 수 있음을 보여준다. 더욱이, 하기의 실시예에서, 펩타이드 접합 과정은 HPV VLP의 형태를 크게 변화시키지 않는다. 따라서, HPV VLP 및 유사한 소 파필로마 바이러스 VLP를 포함하는 VLP를 사용하여 본 발명에 속하는 백신을 작제할 수 있다.
접합
본 발명의 펩타이드 및 캐리어는 당해 기술 분야의 임의의 접합 방법을 사용하여 접합될 수 있다. 예를 들어, 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sSMCC), N-[ε-말레이미도카프로일옥시]설포숙신이미드 에스테르(sEMCS), N-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBS), 글루타르알데하이드, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDCI), 비스-디아조벤지딘(BDB) 또는 N-아세틸 호모시스테인 티올락톤(NAHT)를 사용하여 접합시킬 수 있다.
캐리어 말레이미드-활성화 방법에서, 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sSMCC) 또는 N-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르(MBS)를 사용하여 접합시킨다. sSMCC를 사용한 방법이 광범위하게 사용되고 고도로 특이적이다[문헌참조: Meyer et al. 2002, J. of Virol. 76, 2150-2158]. sSMCC는 시스테인 잔기의 SH 그룹을 캐리어 단백질상의 라이신 잔기의 아미노 그룹에 가교결합시킨다.
sSMCC를 사용한 접합 반응에서, 당해 캐리어는 먼저 sSMCC 시약을 캐리어의 아민(예를 들어, 라이신) 잔기에 결합시켜 활성화시킨다. 과량의 시약 및 부산물로부터 활성화된 캐리어를 분리한 후, 시스테인 함유 펩타이드를 첨가하고 SH 그룹을 활성화된 캐리어의 말레이미드 작용기에 첨가하여 결합시킨다. MBS를 사용한 방법은 유사한 기작을 통해 펩타이드와 캐리어를 접합시킨다.
sSMCC를 사용한 접합은 SH 그룹에 대해 고도로 특이적일 수 있다. 따라서, 펩타이드내 시스테인 잔기는 용이한 접합을 위해 필수적이다. 펩타이드가 시스테인 잔기를 갖지 않는 경우, 시스테인 잔기가 바람직하게는 N-말단 또는 C-말단에 첨가되어야 한다. 펩타이드내 목적하는 에피토프가 시스테인을 함유하는 경우, sSMCC 활성화된 캐리어를 사용하지 않는 방법으로 접합되어야만 한다. 펩타이드가 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 경우, 펩타이드는 과량의 시스테인 잔기가 대체되거나 변형될 수 없는 한 펩타이드를 접합시키는데 sSMCC를 사용하지 말아야 한다.
당해 결합은 펩타이드내 목적하는 에피토프를 간섭하지 말아야 한다. 시스테인은 바람직하게 스페이서로서 하나 이상의 아미노산 거리로 목적하는 일련의 에피토프로부터 격리시킨다.
본 발명에 유용한 또 다른 접합은 N-아세틸 호모시스테인 티올락톤(NAHT)를 사용하여 성취된다. 예를 들어, 티올락톤을 사용하여 티올 작용기를 OMPC에 도입하여 말레이미드화되거나 브로모-아세틸화된 펩타이드와 접합시킬 수 있다[문헌참조: Tolman et al. Int. J. Peptide Protein Res. 41,1993, 455-466; Conley et al. Vaccine 1994,12, 445-451].
본 발명의 특정 양태에서, 펩타이드를 캐리어 단백질에 커플링시키기 위한 접합 반응은 하나의 반응물상의 고유 친핵성 그룹을 도입하고/하거나 사용하고 또 다른 반응물에 고유 친전자성 그룹을 도입하고/하거나 사용함을 포함한다. 바람직한 활성화 반응(I)(도 1)은 친핵성 티올 그룹을 캐리어 단백질(바람직하게는 OMPC)에 도입하고 친전자성 그룹(바람직하게 알킬 할라이드 또는 말레이미드)를 펩타이드로 첨가해야만 한다. 수득한 접합체는 펩타이드와 담체를 결합시키는 티올 에테르 결합을 갖는다. 캐리어 단백질의 펩타이드 친전자성 그룹(말레이미드 또는 알킬 할라이드)과 고유 친핵성 그룹(바람직하게 1급 아민 또는 티올의 직접적인 반응은 2급 아민 결합(반응식 (II) 도 2) 또는 티올 에테르 결합을 유도한다. 그러나, 유사한 반응 조건하에 아민 보다 높을 것으로 예상되는 친핵성 티올의 반응성때문에 반응식 I가 바람직하다. 또 다른 반응은 말레이미드 그룹(III)(도 3) 또는 알킬 할라이드(IV)(도 4)를 캐리어에 첨가하고 말단 시스테인을 펩타이드로 도입하고/하거나 다시 고유 펩타이드 티올을 사용하여 티올 에테르 결합을 생성시킴을 포함한다.
결합
황 함유 아미노산은 반응성 황 그룹을 함유한다. 황 함유 아미노산의 예는 시스테인 및 호모시스테인과 같은 비단백질 아미노산을 포함한다. 추가로, 반응성 황은 활성화되기 전 및 캐리어와 반응하기 전에 디설파이드 형태로 존재할 수 있다. M2 서열에 존재하는 시스테인 17번 및 19번은 말레이미드 또는 알킬 할라이드와 같은 친전자성 그룹으로 활성화된 캐리어로의 커플링 반응에 사용될 수 있다(반응식 III(도 3) 및 IV(도 4)). 반응성 말레이미드 및 활성화된 에스테르를 함유하는 이종이작용성 가교 링커를 사용하여 말레이미드 그룹을 도입하는 것이 일반적이다. 다량체성 단백질에 대해 고수준의 말레이미드 활성화를 획득하기 위한 시도는 아민 그룹이 가교 링커의 2개의 작용성 그룹과 반응할 수 있는 가교 결합 반응을 유도할 수 있다. 이것은 유용한 말레이미드 그룹의 수준을 저하시킴에 따라서 펩타이드 로딩을 저하시킨다. 다량체성 캐리어의 서브유니트의 가교결합은 접합체의 면역원성 및/또는 안정성에 효과적일 수 있다. 다수의 시스테인을 갖는 펩타이드에 대해 캐리어 말레이미드 또는 알킬할라이드 그룹과의 다중 결합은 단일 펩타이드와 함께 발생할 수 있다. 이것은 능히, 펩타이드 로딩 수준을 감소시킬 수 있다. 다중 결합이 상이한 캐리어 단백질상의 말레이미드를 통해 일어나는 경우, 캐리어 단백질 서브유니트는 펩타이드를 통해 가교결합될 수 있다. N-아세틸시스테인 락톤을 사용한 OMPC 1 급 아민의 티올화는 적절한 완충 반응 조건하에 캐리어 서브유니트의 최소 가교 결합(디설파이드 결합 형성을 통해)을 유도하는 고수준의 티올 그룹을 형성시킬 수 있다[문헌참조: Marburg et al., 1986 J. Am. Chem. Soc. 108: 5282-5287]. 단일 말단 친전자성 그룹(말레이미드 또는 알킬 할라이드)을 갖는 펩타이드의 활성화는 펩타이드가 고수준으로 캐리어에 커플링되면서 고수준의 펩타이드 로딩을 유도할 수 있다.
링커
펩타이드를 캐리어에 연결하는 공유 링커는 생리학적 조건하에서 안정하다. 당해 링커의 예는 비특이적 가교 결합제, 일원성 스페이서 및 이원성 스페이서이다. 비특이적 가교결합제 및 이의 용도는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 당해 시약과 이의 용도에 대한 예는 글루타르알데하이드와의 반응; 숙시닐화된 캐리어의 혼합 또는 혼합 부재하에 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드와의 반응; 수소화붕소나트륨 또는 수소화붕소시아노나트륨의 존재하에 당화된 치환체의 페리오데이트 산화에 이어서 단백질 캐리어의 유리 아미노 그룹으로의 커플링; 말단 알데하이드를 생성시키고 이어서 아민 또는 하이드라지드와 반응하여 수소화붕소시아노로 2급 아민으로 환원될 수 있는 쉬프 염기 또는 하이드라존을 생성할 수 있는 비-아실화된 말단 세린 및 트레오닌 잔기의 페리오데이트 산화; 방향족 아미노 그룹의 디아조화에 이어서 단백질의 타이로신 측쇄 잔기상으로의 커플링; 이소시아네이트와의 반응; 또는 혼합된 무수물과의 반응을 포함한다. 일반적으로 문헌[Briand, et al., 1985 J. Imm. Meth. 78:59]을 참조한다.
일원성 스페이서 및 이의 용도는 기술분야에 널리 공지되어 있다. 일원성 스페이서는 이작용성이고 접합되기 전에 반응 쌍의 파트너중 단지 하나의 작용성화를 요구한다. 일원성 스페이서 및 이의 용도의 예는 카보디이미드의 존재하에 이작용성 분자 아디프산 디하이드라지드의 한쪽 말단에 면역원성 HCV 펩타이드를 커플링시킴을 포함한다. 추측컨대, 디아세틸화된 하이드라진은 캐리어의 펜던트 글루타믹 또는 아스파르틱 카복실 그룹과 함께 형성된다. 이어서 카보디이미드의 존재하에 캐리어 단백질과 제2 커플링 반응을 수행하여 접합시킨다.
이원성 스페이서 및 이의 용도는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이원성 스페이서는 각각의 반응 쌍의 파트너가 작용성화된 후 형성된다. 각각의 작용성화된 파트너가 이의 상대 파트너와 반응하여 안정한 공유 결합 또는 결합들을 형성할때 접합된다[문헌참조: Marburg, et al., 1986 J. Am. Chem. Soc. 108 : 5282-5287 ; and Marburg, et al., U. S. Patent No. 4,695, 624.].
펩타이드 커플링 로드
본 발명의 잇점은 접합체중에 다양한 몰비율의 펩타이드 대 캐리어 단백질을 형성할 수 있다는 것이다. 캐리어 단백질상의 이러한 "펩타이드 커플링 로드"는 시도 및 오류 방식으로 접합 과정을 변화시켜 다양화함으로써 목적하는 성질을 갖는 접합체를 수득할 수 있다. 예를 들어, 캐리어 단백질상의 모든 반응성 부위가 펩타이드에 접합되도록 높은 커플링 로드가 요구되는 경우, 캐리어상의 반응성 부위를 결정하고 커플링 반응에서 높은 몰 과량의 펩타이드를 포함할 수 있다. 낮은 밀도의 커플링 로드가 요구되는 경우, 캐리어 단백질상의 반응성 부위 몰당 1몰 미만의 몰비로 펩타이드를 포함할 수 있다.
선택된 특정 조건은 궁극적으로 성취되는 수율, 접합체의 물성, 수득한 접합체의 효능, 투여받고 싶은 환자 집단 및 목적하는 용량에 따라 설정한다. 백신내 단백질의 총량이 중요한 고려 사항이 아닌 경우, 커플링 로드가 상이하고 면역원성이 상이한 접합체 용량을 제형화하여 동일한 유효 용량을 제공할 수 있다. 그러나, 단백질의 총량 및 용적이 중요한 고려사항인 경우, 예를 들어, 접합체가 배합 백신에 사용되어야만 하는 경우, 최종 배합 백신에서 당해 접합체가 부여하는 총 용적 또는 단백질을 명심해야 한다. 커플링 로드가 상이한 여러 접합체의 면역원성을 평가한 후 적당한 면역원성 및 배합 백신에 첨가하는데 적합한 총 단백질의 수준 또는 용적과 함께 접합체를 선택하여 사용할 수 있다.
일반적으로, 고펩타이드 로딩을 수득하는데 2개의 주요 장애가 있다: (i) 수득한 접합체의 용해도 및 (ii) 펩타이드의 용해도. 이들 성질은 종속적이고 이를 개선시키는 조작은 전자에 해로울 수 있다. 따라서, 고펩타이드 로드를 수득한다는 것은 어렵다.
따라서, 2003년 12월 18일자로 출원된 미국 특허원 제60/530,867호에 기재된 바와 같이 펩타이드의 서열을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 당해 특허 출원은 펩타이드의 면역원성을 증가시키는 방법을 기재하고 있다. 당해 방법은 펩타이드를 변형시키고 펩타이드를 캐리어에 접합시킴에 의해 펩타이드의 등전점을 조정하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "펩타이드의 pI 조정"은 접합체의 펩타이드 로드와 용해도 둘다가 증가되는 범위로 펩타이드의 pI를 변화시킴을 의미한다. 흔히, 펩타이드의 pI는 당해 범위로 저하된다.
펩타이드의 pI는 등전점 분리(Isoelectric focusing)(IEF)와 같은 실험 또는 적절한 소프트웨어를 사용한 계산으로 측정할 수 있다. 미국 특허원 제60/530,867호에 기재된 바와 같이, 펩타이드의 pI는 펩타이드의 전체 하전을 변화시키는 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 당해 변형은 펩타이드의 하전을 변화시키는 펩타이드에 대한 임의의 변화 또는 변화들일 수 있다. 변형은 펩타이드내 아미노산 잔기의 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 변형은 또한 잔기의 측쇄 또는 펩타이드의 N-말단 아미노 그룹 또는 C-말단 카복실레이트 그룹의 변형을 포함할 수 있다. 당해 변형 방법은 당업자가 인지하고 있다.
펩타이드는 면역학적 활성 배열, 즉, 목적하는 에피토프의 외부에서 변형되어 면역학적 성질이 확실히 유지되어야만 한다. 당해 변형은 펩타이드내 목적하는 에피토프에 포함되거나 이를 간섭하지 말아야 한다. 당해 변형은 펩타이드-접합체의 면역학적 성질에 영향을 주지말아야 하기 때문에, 바람직하게 펩타이드의 N 및/또는 C 말단에서 변화되어야 한다.
가장 높은 커플링 로드가 항상 가장 높은 면역원성의 접합체를 수득할 수 있도록 하는 것은 아님을 명심해야 한다. 임의의 주어진 캐리어 단백질에 대한 펩타이드 길이 및 커플링 로드는 접합체의 전체 면역원성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 임의의 특정 캐리어 단백질상의 임의의 특정 펩타이드의 커플링 로드 범위에 대한 면역원성을 평가해야만 한다. 이어서 당해 정보를 사용하여 환자에서 허용되는 면역 반응을 자극시키는 적절한 용량의 접합체를 제공하도록 백신을 제조하고 제형화할 수 있다.
제형화
본 발명의 백신은 기술 분야에 공지되고 사용되는 방법에 다라 제형화될 수 있다. 일반적인 약제학적 투여를 위한 지침은 예를 들어, 문헌[참조: Modem Vaccinology, Ed. Kurstak, Plenum Med. Co. 1994; Remington's Phannaceutical Sciences 18th Edition, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 1990; and Modern Phannaceutics 2nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker, Inc. , 1990]에 보고되어 있다.
본 발명의 접합체는 산성 또는 염기성 염으로서 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염(수용성 또는 지용성 또는 분산성 제품 형태)은 예를 들어, 무기산 또는 유기산 또는 염기로부터 형성되는 통상적인 비독성 염 또는 4급 암모늄 염을 포함한다. 당해 염의 예는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디플루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트와 같은 산 부가염; 및 암모늄 염과 같은 염기염, 나트륨 및 칼륨염과 같은 알칼리 금속 염, 칼슘 및 마그네슘 염과 같은 알칼린 토금속 염, 디사이클로헥실아민 염과 같은 유기 염기와의 염, N-메틸-D-글루카민 및 아르기닌 및 라이신과 같은 아미노산과의 염을 포함한다.
최종 제제의 이온 조성 뿐만 아니라 접합체에 사용되는 특정 캐리어 단백질에 사용하기에 적합한 보조제를 선택하는 것이 바람직하다. 단독의 접합체가 백신으로 제형화될지 또는 접합체가 배합 백신으로 제형화될지를 고려해야만 한다. 후자 경우에, 완충제, 보조제 및 최종 배합 백신에 존재할 기타 제형화 성분을 고려해야만 한다.
알루미늄 기본 보조제가 본 기술분야에 일반적으로 사용되고 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 알루미늄 하이드록시-포스페이트 및 알루미늄 하이드록시-설페이트-포스페이트를 포함한다. 공통적으로 사용되는 보조제의 상표명은 ADJUPHOS, MERCK ALUM 및 ALHYDROGEL을 포함한다. 접합체는 목적하는 바와 같고 사용되는 특정 보조제에 대해 적합한 보조제와 결합되거나 공침전할 수 있다.
비알루미늄 보조제를 또한 사용할 수 있다. 비알루미늄 보조제는 QS21, 지질 A 및 이의 유도체 또는 변이체, 푸로인트 완전 또는 불완전 보조제, 중성 리포좀, 백신 및 사이토킨 도는 케모카인 함유 리포좀을 포함한다.
백신은 알루미늄 보조제와 제형화하는 것이 바람직하다. 기타 바람직한 양태에서, 백신은 알루미늄 보조제 및 QS21 둘 다와 제형화한다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 B형 인플루엔자 기원의 면역원 및/또는 해모필러스 인플루엔자, A형, B형 또는 C형 간염 바이러스, 사람 파필로마 바이러스, 홍역, 이하선염, 풍진, 수두, 로타바이러스, 스트렙토코커스 뉴모니아 및 스타필로코커스 아우레우스 기원의 면역원과 함께 M2 펩타이드-단백질 접합체를 제형화하는 것이 바람직하다. 추가로, 본 발명의 백신은 특히, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 기원의 에피토프를 포함하는 A형 인플루엔자의 기타 항원 성분과 배합할 수 있다. 당해 방식으로, 배합 벡신을 제조할 수 있다. 배합 백신은 요구되는 접종 횟수가 줄어 환자의 위안감을 증가시켜주고 투여 비용이 저렴하다는 잇점을 갖는다.
배합 백신을 제형화하는 경우, 기타 면역원과 사용되는 다양한 완충제 및 보조제를 명심해야 한다. 몇몇 완충제는 몇몇 면역원-보조제 쌍에 대해 적합하지만 다른 것에 대해서는 적합하지 않을 수 있다. 특히, 다양한 면역원-보조제 쌍에 대한 인산 수준의 효과를 평가하여 최종 제제중에서의 혼화성을 확실히 해야만 한다.
백신 접종
본 발명의 백신은 정맥내, 복강내, 피하내 또는 근육내와 같은 상이한 경로로 환자에게 투여할 수 있다. 바람직한 경로는 근육내이다. 적합한 투여 섭생은 바람직하게 연령, 체중, 성별 및 대상체의 의학적 조건; 투여 경로, 목적하는 효과; 및 사용되는 특정 접합체(예를 들어, 펩타이드, 캐리어상에 로딩되는 펩타이드등)를 포함하는 기술 분야에 널리 공지된 인자를 고려하여 결정한다. 백신은 다중 용량 백신 접종 포맷으로 사용할 수 있다. 용량은 총 단백질 1㎍ 내지 1.0mg 범위로 이루어질 것으로 예상된다. 본 발명의 양태에서, 당해 범위는 0.1mg 내지 1.0mg이다. 그러나, 전달되는 펩타이드의 양을 기준으로 용량을 조정하는 것이 바람직할 수 있다. 둘중 어느 경우에도 당해 범위는 지침이 된다. 보다 정확한 용량은 면역학적 유효량이 전달될 수 있도록, 제조된 접합체의 면역원성을 평가하여 결정해야만 한다. 면역학적 유효량은 환자의 면역계를 자극하여 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 발병되는 질환으로부터 장기간 보호하기에 충분한 면역학적 기억 수준을 설정하는 양이다. 접합체는 바람직하게 보조제와 함께 제형화한다.
투여 시점은 기술분야에 널리 공지된 인자에 의존한다. 초기 투여 후, 이어서 1회 이상의 부스터 용량을 투여하여 항체 역가를 유지할 수 있다. 투여 섭생의 예는 제1일 첫번째 투여후 1 또는 2개월에 2번째 투여, 이후 4, 6 또는 12개월에 3번째 투여하고, 추가의 부스터 투여는 필요에 따라 긴 투여 시점을 두고 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 환자 또는 대상체는 동물이다. 포유동물 및 새, 특히 가금류는 백신 접종을 위해 적합한 대상이다. 바람직하게 환자는 사람이다. 환자는 본 발명의 백신의 접종에 응답하여 면역 반응을 생성시킬 수 있는 임의의 연령일 수 있다. 생성된 면역 반응은 인플루엔자 바이러스의 감염에 의해 발병된 질환 및 쇠약 증상으로부터 완전히 또는 부분적으로 보호해줄 수 있다.
단지 M2 펩타이드를 갖는 본 발명의 백신은 환자의 세포 감염을 예방하지 못함을 주지해야한다. 이것은 환자에게 진입하여 감염된 경우 백신내 펩타이드의 M2 에피토프가 인플루엔자 바이러스상에 매우 적은 수로 존재하기 때문이다. 당해 M2 에피토프는 전형적으로 바이러스에 의해 감염된 세포 표면상에서만 나타난다. 따라서, M2 펩타이드-단백질 접합체 기본 백신을 사용한 백신 접종에 의해 생성된 면역 반응은 감염된 세포에 대해 지시된다. 특정 효과 이론에 얽매이지 않고, 환자의 면역 반응은 바이러스 증폭(burst) 크기를 감소시키고 전체 바이러스 감염을 약화시킴에 의해 필수적으로 감염을 초기 감염된 세포로 국한시키는 것으로 사료된다.
본 발명의 백신의 잇점은 인플루엔자 바이러스의 보존된 에피토프에 대해 면역반응이 생성된다는 것이다. 따라서, 당해 백신을 투여함으로써, 인플루엔자 감염으로부터 환자를 계속 보호하기 위해 해마다 백신을 접종할 필요가 없다.
본 발명의 M2-펩타이드-단백질 접합체 백신을 기타 백신과 제형화하여 상기된 바와 같은 배합 백신을 수득할 수 있다. 배합 백신을 환자에게 접종하여 M2 에피토프에 대한 것 뿐만 아니라 배합 백신내 기타 면역원에 대한 면역 반응을 생성시킬 수 있다.
실시예 1
펩타이드의 제조
M2 단백질 서열의 일부를 제공하고 C-말단 또는 N-말단 반응성 브로모아세틸 또는 말레이미드 그룹을 함유하는 합성 펩타이드를 기술 분야에서 일반적으로 수행되는 고형상 화학적 합성 방법으로 제조한다.
예를 들어, C-말단 브로모아세틸화된 M2 15량체, CT-BrAcM2-15량체, Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Aha-Lys(Nε-BrAc)-NH2 TFA 염 (서열번호 13)을 어플라이드 바이오시스템 430A 펩타이드 합성기(APPLIED BIOSYSTEMS, CITY STATE)상의 보호된 수지 결합 펩타이드로서 합성하였다. 0.5mmol p-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지로 개시하여 당해 프로토콜은 각각 4배 과량(2mmol)의 Na-Boc 보호된 아미노산을 사용하였다. 측쇄 보호는 Lys(Fmoc), Trp(Formyl), Glu(OcHex), Arg(Tos), Thr(Bzl)이다. 메틸-2-피롤리돈(NMP)중에서 DCC 및 HOBT 활성화를 사용하여 커플링시켰다. N 말단 아세틸 그룹을 도입하기 위해 아세트산을 커플링시켰다. Boc 그룹은 메틸렌 클로라이드(MeCl2)중의 1:1 TFA 및 디이소프로필에틸아민으로 중화된 TFA 염을 사용하여 제거하였다.
보호된 펩타이드 수지의 어셈블리 후, Trp 잔기상의 포밀 그룹 및 Nε-Lys 잔기상의 Fmoc 보호를 NMP중의 25% 피페리딘을 사용하여 10분동안 통상의 처리로 제거하였다. NMP 및 MeCl2로 수지를 세척한 후, Lys상의 Nε아미노 그룹을 1시간동안 또는 음성 닌하이드린 반응이 관찰될때까지 무수 브로모아세트산(1g/20ml Me Cl2)과 반응시켰다. MeCl2로 세척한 후 수지를 일정한 중량(2.70g)이되도록 건조시켰다.
보호된 펩타이드 수지(2.70g)를 0℃에서 1시간동안 스캐빈저로서 HF(30ml) 및 아니졸(3ml)로 처리하였다. HF 및 아니졸을 증발시킨 후, 잔사를 에테르로 잘 세척하고 여과하고 H2O(200ml)중의 아세트산 25%로 추출하였다. 여액을 동결건조시켜 1.5g의 조 생성물을 수득하였다.
정제용 HPLC, 완충액 A = 0.1% TFA-H2O; B= 0.1% TFA-CH3CN을 사용하여 조 생성물을 정제하였다. 조 생성물(0.75g)을 20% 아세트산 - H2O( 약 100ml)의 최소용적에 용해시키고 90% A - 10% B 완충액으로 평형화된 C-18 역상 HPLC 방사 압착 칼럼(WATERS, Milford, MA, DELTA-PAK, 15 urn, 100 A, 5 x 30 cm)상으로 펌핑하였다.
펩타이드를 첨가함에 이어서 1L의 90% A -10% B 완충액 혼합물을 첨가하였다. 각각 연속적으로 증가하는 농도(5%)의 이동상 1L로부터 단계적 농도구배(10% B에서 40% B)(100ml 증액)를 생성시켰다. 80ml/분의 유속을 사용하여 생성물을 용출시켰다. 214nm에서 UV 흡광도를 모니터링하여 검출하였다. 균일한 생성물 분획물(분석용 HPLC에 의한 순도 98% <)을 모으고 동결건조시켜 200mg의 CT-BrAcM2-15량체 펩타이드를 수득하였다. 아미노산 분석 및 질량 스펙트럼 분석으로 동정하였다.
C-말단 브로모아세틸화된 펩타이드는 유사하게 합성할 수 있다. 예를 들어, C-말단 브로모아세틸화된 M2 23량체 펩타이드, CT BrAc-M2-23량체, Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Lys (Nε-BrAc)-NH2 TFA 염, (서열번호 39)을 다음과 같이 어플라이드 바이오시스템 430A 펩타이드 합성기(APPLIED BIOSYSTEMS, CITY STATE)상에서 보호된 수지 결합 펩타이드로서 합성하였다. 0.75mmol p-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지로 개시하는 이중 커플링 프로토콜은 과량(2mmol)의 각각의 Nα-Boc 보호된 아미노산을 사용하였다. 측쇄 보호는 Ser(Bzl)Lys(Fmoc), Trp(Formyl), Glu(OcHex), Arg(Tos), Thr(Bzl), Asp(OcHex)이다. 메틸-2-피롤리돈(NMP)중에서 DCC 및 HOBT 활성화를 사용하여 커플링시켰다. N 말단 아세틸 그룹을 도입하기 위해 아세트산을 커플링시켰다. 메틸렌 클로라이드(MeCl2)중의 TFA 및 디이소프로필에틸아민으로 중화된 TFA 염 1:1를 사용하여 Boc 그룹을 제거하였다. 보호된 펩타이드 수지의 어셈블리 후, Trp상의 포르밀 그룹과 Nε-Lys상의 Fmoc 보호를 10분동안 NMP중의 25% 피페리딘으로 수동 처리하여 제거하였다. 수지를 NMP 및 MeCl2를 사용하여 세척한 후, Lys상의 Nε아미노 그룹을 10분동안 또는 음성 닌하이드린 반응이 관찰될때까지 무수 브로모아세트산(1g/20ml MeCl2)과 반응시켰다. MeCl2로 세척한 후, 수지를 일정한 중량이 될때까지 건조시켰다.
보호된 펩타이드 수지의 절반(1.83g)은 0℃에서 1시간동안 스캐빈저로서 HF(30ml) 및 아니졸(3ml)로 처리하였다. HF 및 아니졸을 증발시킨 후, 잔사를 에테르로 잘 세척하고 여과하고 H2O(200ml)중의 아세트산 25%로 추출하였다. 여액을 동결건조시켜 1.1g의 조 생성물을 수득하였다.
정제용 HPLC, 완충액 A = 0.1% TFA-H2O; B= 0.1% TFA-CH3CN을 사용하여 조 생성물을 정제하였다. 조 생성물(1.1g)을 20% 아세트산 - H2O( 약 100ml)의 최소용적에 용해시키고 90% A - 10% B 완충액으로 평형화된 C-18 역상 HPLC 방사 압착 칼럼(WATERS, DELTA-PAK, Milford, MA, 15㎛, 100 Å, 5 x 30 cm)상으로 펌핑하였다. 펩타이드를 첨가함에 이어서 1L의 90% A -10% B 완충액 혼합물을 첨가하였다. 각각 연속적으로 증가하는 농도(5%)의 이동상 1L로부터 단계적 농도구배(10% B에서 40% B)(100ml 증액)를 생성시켰다. 80ml/분의 유속을 사용하여 생성물을 용출시켰다. 214nm에서 UV 흡광도를 모니터링하여 검출하였다. 균일한 생성물 분획물(분석용 HPLC에 의한 순도 98% <)을 모으고 동결건조시켜 224mg의 CT-BrAcM2-23량체 를 수득하였다. 아미노산 분석 및 질량 스펙트럼 분석으로 동정하였다.
말이미드화된 펩타이드를 다음과 같이 합성한다. 펩타이드 Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Aha-Lys(Nε-4-말레이미도부티릴-NH2 TFA 염(서열번호 14)은 0.75mmol의 p-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지로 개시하여 합성하였다. 보호된 수지 결합 펩타이드는 어플라이드 바이오시스템 430A 펩타이드 합성기(APPLIED BIOSYSTEMS, CITY STATE)상에서 합성하였다. 당해 프로토콜은 4배 과량(2mmol)의 각각의 Nα-Boc 보호된 아미노산을 사용하였다. 측쇄 보호는 Lys(Fmoc), Trp(Formyl), Glu(OcHex), Arg(Tos), Thr(Bzl)이다. 메틸-2-피롤리돈(NMP)중에서 DCC 및 HOBT 활성화를 사용하여 커플링시켰다. N 말단 아세틸 그룹을 도입하기 위해 아세트산을 커플링시켰다. 메틸렌 클로라이드(MeCl2)중의 TFA 및 디이소프로필에틸아민으로 중화된 TFA 염 1:1를 사용하여 Boc 그룹을 제거하였다. 보호된 펩타이드 수지의 어셈블리 후, Trp상의 포르밀 그룹과 Nε-Lys상의 Fmoc 보호를 10분동안 NMP중의 25% 피페리딘으로 수동 처리하여 제거하였다. 수지를 NMP 및 MeCl2를 사용하여 세척한 후, 25%의 수지 부분을 제거(0.188mmol)하고 Lys상의 Nε아미노 그룹을 3시간동안 또는 음성 닌하이드린 반응이 관찰될때까지 NMP중의 4-말레이미도부티르산(2mmol) 및 2mmol의 DCC 및 HOBT과 반응시켰다. NMP 및 MeCl2로 세척한 후, 수지를 일정한 중량(0.7g)이 될때까지 건조시켰다.
보호된 펩타이드 수지(0.70g)는 0℃에서 1시간동안 스캐빈저로서 HF(15ml) 및 아니졸(1.5ml)로 처리하였다. HF 및 아니졸을 증발시킨 후, 잔사를 에테르로 잘 세척하고 여과하고 H2O(100ml)중의 아세트산 25%로 추출하였다. 여액을 동결건조시켜 0.40g의 조 생성물을 수득하였다.
정제용 HPLC, 완충액 A = 0.1% TFA-H2O; B= 0.1% TFA-CH3CN을 사용하여 조 생성물을 정제하였다. 조 생성물(0.40g)을 20% 아세트산 - H2O( 약 100ml)의 최소용적에 용해시키고 90% A - 10% B 완충액으로 평형화된 C-18 역상 HPLC 방사 압착 칼럼(DELTA-PAK, 15㎛, 100 Å, 5 x 30 cm, WATERS, Milford, MA)상으로 펌핑하였다. 펩타이드를 첨가함에 이어서 1L의 90% A -10% B 완충액 혼합물을 첨가하였다. 각각 연속적으로 증가하는 농도(5%)의 이동상 1L로부터 단계적 농도구배(10% B에서 35% B)(100ml 증액)를 생성시켰다. 80ml/분의 유속을 사용하여 생성물을 용출시켰다. 214nm에서 UV 흡광도를 모니터링하여 검출하였다. 균일한 생성물 분획물(분석용 HPLC에 의한 순도 98% <)을 모으고 동결건조시켜 94mg의 생성물을 수득하였다. 아미노산 분석 및 질량 스펙트럼 분석으로 동정하였다.
분석 HPLC 조건
칼럼: Vydac 15cm #218TP5415, C18
용출제: 45분에 걸친 농도구배 95:5(0.1% TFA/아세토니트릴) 내지 5:95(0.1% TFA/아세토니트릴)
유속: 1.5ml/분
파장: 214nM, 254nM.
체류 시간: 16.9분
분자식: C99H155N25O31
분자량: 2190.13.
제2 말이미데이드화된 펩타이드 Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Lys(Nε-4-말레이미도부티릴)-NH2 TFA 염(서열번호 23)은 다음과 같이 합성하였다. 0.50mmol의 p-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지로 개시하여 보호된 수지 결합 펩타이드는 어플라이드 바이오시스템 430A 펩타이드 합성기(APPLIED BIOSYSTEMS, CITY STATE)상에서 합성하였다. 이중 커플링 프로토콜은 과량(2mmol)의 각각의 Nα-Boc 보호된 아미노산을 사용하였다. 측쇄 보호는 Ser(Bzl)Lys(Fmoc), Trp(Formyl), Glu(OcHex), Arg(Tos), Thr(Bzl), Asp(OcHex)이다. 메틸-2-피롤리돈(NMP)중에서 DCC 및 HOBT 활성화를 사용하여 커플링시켰다. N 말단 아세틸 그룹을 도입하기 위해 아세트산을 커플링시켰다. 메틸렌 클로라이드(MeCl2)중의 TFA 및 디이소프로필에틸아민으로 중화된 TFA 염 1:1를 사용하여 Boc 그룹을 제거하였다. 보호된 펩타이드 수지의 어셈블리 후, Trp상의 포르밀 그룹과 Nε-Lys상의 Fmoc 보호를 10분동안 NMP중의 25% 피페리딘으로 수동 처리하여 제거하였다. 수지를 NMP 및 MeCl2를 사용하여 세척한 후, 50%의 수지 부분(0.25mmol)을 3시간동안 또는 음성 닌하이드린 반응이 관찰될때까지 4-말레이미도부티르산(2mmol) 및 2mmol의 DCC 및 HOBT과 반응시켰다. NMP 및 MeCl2로 세척한 후, 수지를 일정한 중량(2.0g)이 될때까지 건조시켰다.
보호된 펩타이드 수지(2.0g)는 0℃에서 1.5시간동안 스캐빈저로서 HF(20ml) 및 아니졸(2ml)로 처리하였다. HF 및 아니졸을 증발시킨 후, 잔사를 에테르로 잘 세척하고 여과하고 H2O(200ml)중의 아세트산 50%로 추출하였다. 여액을 동결건조시켜 1.0g의 조 생성물을 수득하였다.
정제용 HPLC, 완충액 A = 0.1% TFA-H2O; B= 0.1% TFA-CH3CN을 사용하여 조 생성물을 정제하였다. 조 생성물(1.0g)을 10% 아세트산 - H2O( 약 100ml)의 최소용적에 용해시키고 85% A - 15% B 완충액으로 평형화된 C-18 역상 HPLC 방사 압착 칼럼(DELTA-PAK, 15㎛, 100 Å, 5 x 30 cm, WATERS, Milford, MA)상으로 펌핑하였다. 펩타이드를 첨가함에 이어서 90분에 걸쳐 15% B 내지 45% B로 농도 구배 용출시켰다. 80ml/분의 유속을 사용하여 생성물을 용출하였다. 214nm에서 UV 흡광도를 조사하여 검출하였다. 균일한 생성물 분획물(분석용 HPLC에 의한 순도 98% <)을 모으고 동결건조시켜 320mg의 생성물을 수득하였다. 아미노산 분석 및 질량 스펙트럼 분석으로 동정하였다.
분석 HPLC 조건
칼럼: Vydac 15cm #218TP5415, C18
용출제: 45분에 걸친 농도구배 95:5(0.1% TFA/아세토니트릴) 내지 5:95(0.1% TFA/아세토니트릴)
유속: 1.5ml/분
파장: 214nM, 254nM.
체류 시간: 16.4분
분자식: C129H203N37O48
분자량: 3038.46.
합성 펩타이드의 티올 등가물을 분석하였다. 예를 들어, NT-BrAcM2-15(N-말단 브로모아세틸화된 M2 15량체 서열번호 11) 및 CT-BrAcM2-15(C-말단 브로모아세틸화된 M2 15량체 서열번호 13)을 7.5mg의 펩타이드 분말/ml의 최종 농도에서 N2-주입된 25mM 보레이트, 0.15M NaCl, 2mM의 EDTA, pH 8.5 완충액중에 용해시켰다. pH를 0.97N의 NaOH를 사용하여 8.5로 조정하였다. 당해 용액을 0.2 마이크론에 대해 여과하였다. 분액을 다음과 같이 티올 소모 분석에 의해 Br아세틸 등가물에 대해 분석하였다. N2-주입된 25mM 보레이트, 0.15M NaCl, 2mM EDTA, pH 8.5 완충액중에 용해된 N-아세틸-시스테인을 적절히 희석된 펩타이드(∼15 - 30μM의 최종 농도) 및 동일 용적의 완충액에 첨가하였고(50μM의 최종 농도) 실온에서 30분동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 5,5'-디티오-비스-[2-니트로벤조산](DTNB; 엘만 시약)을 첨가(N2 포화된 0.1M Na 포스페이트, 0.1M NaCl, 2mM EDTA, pH 7중의 50mM DTNB 스톡을 사용한 5mM 최종 농도)한다. 실온에서 15분동안 항온처리한 후 및 적당한 DTNB 블랭크를 공제한 후 티올 농도를 ε412nm, 1cm = 14.15 x 103 M-1 cm-1을 사용하여 측정하였다. 펩타이드의 존재 및 부재하에 유리된 티올의 차이를 사용하여 티올 반응성 등가물을 평가한다.
유사하게, NT-MalM2-15(N-말단 말레이미드화된 M2 15량체 서열번호 12) 및 CT-MalM2-15(C-말단 말레이미드화된 M2 15량체 서열번호 14)을 7.5mg의 펩타이드 분말/ml의 최종 농도에서 N2-주입된 25mM HEPES, 0.15M NaCl, 2mM의 EDTA, pH 7.3 완충액중에 용해시켰다. pH를 0.97N의 NaOH를 사용하여 7.3으로 조정하였다. 당해 용액을 0.2 마이크론에 대해 여과하였다. 분액을 다음과 같이 티올 소모 분석에 의해 말레이미드 등가물에 대해 분석하였다. N2-주입된 20mM HEPES, 0.15M NaCl, 2mM EDTA, pH 7.3 완충액중에 용해된 N-아세틸-시스테인을 적절히 희석된 펩타이드(∼15 - 30μM의 최종 농도) 및 동일 용적의 완충액에 첨가하였고(50μM의 최종 농도) 실온에서 30분동안 항온처리하였다. 항온처리 후, DTNB를 첨가( 0.1M Na 포스페이트, 0.1M NaCl, 2mM EDTA, pH 7중의 50mM DTNB 스톡을 사용한 5mM 최종 농도)한다. 실온에서 15분동안 항온처리한 후 및 적당한 DTNB 블랭크를 공제한 후 티올 농도를 ε412nm, 1cm = 14.15 x 103 M-1 cm-1을 사용하여 측정하였다. 펩타이드의 존재 및 부재하에 유리된 티올의 차이를 사용하여 티올 반응성 등가물을 평가한다.
티올 함유 펩타이드(예를 들어, 서열번호 1, 2, 3, 4, 10등)에 대해, 펩타이드를 빙냉 N2 포화된 0.1M HEPES, 2mM EDTA, 0.15M NaCl, pH 7.3 완충액중에 용해시키고(2.5 내지 7.5mg/ml) 0.2마이크론상에서 여과하였다. 티올 함량을 적정한 용적의 펩타이드를 N2 포화된 0.1M Na 포스페이트, 0.1M NaCl, 2mM EDTA, pH 7 완충액으로 희석시켜 측정하였다. DTNB를 0.1 Na 포스페이트, 0.1M NaCl, 2mM의 EDTA, pH 7 완충액중의 50mM DTNB 스톡을 사용하여 최종 농도 5mM로 첨가하였다. 실온에서 15분동안 항온처리한 후, 티올 농도를, 적절한 DTNB 블랭크를 공제한 후 ε412nm, 1cm = 14.15 x 103 M-1 cm-1를 사용하여 측정하였다.
여과된 브로모아세틸 또는 말레이미드화된 펩타이드의 티올 반응성 등가물
펩타이드 샘플 [티올 반응성 등가물]a μmol/ml [펩타이드]b μmol/ml 펩타이드c당 티올 반응성 등가물 mol/mol
보레이트 완충액 OMPC-FLU-9-BrAc 펩타이드중 NT-BrAcM2-15 0.71n=1 3.37n=1 0.21
HEPES 완충액 OMPC-FLU-9-Mal 펩타이드중 NT-MalM2-15 3.12n=1 2.98n=1 1.05
보레이트 완충액 OMPC-FLU-10-펩타이드 BrAC중 CT-BrAcM2-15 0.91n=1 3.06n=1 0.30
보레이트 완충액 OMPC-FLU-10-펩타이드Mal중 CT-MalM2-15 3.31n=1 3.11n=1 1.06
a 티올 소모 분석에 의해 측정됨
b asp, glu, gly, val, ile, leu 및 arg 값의 AAA 평균에 의해 측정됨
c주석: NT-BrAcM2-15에 대한 [티올 반응성 등가물]은 티올 소모 분석에서 브로모아세틸 그룹의 보다 느린 반응성으로 인해 약 3 내지 5배 저평가될 수 있다.
시스테인 함유 여과된 M2 펩타이드의 티올 함량
펩타이드 티올/펩타이드 mol/mol예상치a 실험치b
서열번호 1 3 3.0
서열번호 2 1 0.9
서열번호 10 1 1.0
a 펩타이드 서열을 기준으로함
b 변형된 엘만 분석 기준의 티올 함량. 펩타이드 농도는 M2 펩타이드의 단일 트립토판을 근거로 한다(ε278nm, 1cm = 5,550 M-1cm-1 및 ε288nm, 1cm = 4,550 M-1cm-1로 가정) 사용되는 농도는 이들 2개의 파장에서 측정된 것의 평균값이다.
실시예 2
나이제리아 메닌기티디스의 티올화된 외막 단백질 복합체(OMPC)의 제조
OMPC를 기술 분야에 널리 공지되어 있고 푸(Fu)의 미국 특허 제5,494,808호에 기재된 기술을 사용하여 수득하였다. N-아세틸호모시스테인 락톤을 사용한 OMPC의 티올화는 문헌[참조: Marburg et al. 1986]에 기재된 무균 기술을 사용하는 일반 방법에 의해 제조하였다. 티올화된 OMPC는 NT-BrAcM2-15 및 CT-BrAcM2-15에 대한 N2 포화된 25mM 보레이트, 0.15M NaCl, 2mM EDTA, pH 8.5 및 NT-MalM2-15 및 CT-MalM2-15와의 반응을 위한 20mM HEPES, 0.15M NaCl, 2mM EDTA, pH 7.3중에 최종 재현탁시킨다. 티올화된 OMPC를 N2 포화된 0.1M Na포스페이트, 0.1M NaCl, 2mM EDTA, pH 7 완충액으로 적절히 희석함에 의해 티올 함량을 측정하였다. DTNB를 N2 포화된 0.1M Na 포스페이트, 0.1M NaCl, 2mM EDTA, pH 4 완충액중의 50mM DTNB 스톡을 사용하여 DTNB를 최종농도 5mM이 되도록 첨가하였다. 실온에서 15분동안 항온처리한 후, 적절한 DTNB 블랭크 및 OMPC 블랭크(DTNB 부재)를 공제한 후 ε412nm, 1cm = 14.15 x 103M-1cm-1를 사용하여 티올 농도를 측정하였다.
티올화된 OMPC의 성질
티올화된 OMPC 샘플 [티올]aμmol/ml [단백질]b mg/mL 티올/단백질μmol/mg
보레이트중의 티올화된 OMPC
OMPC-FLU-9-1 1.63 6.35 0.26
OMPC-FLU-10-1 1.54 6.09 0.25
HEPES중의 티올화된 OMPC
OMPC-FLU-9-2 1.72 6.57 0.26
OMPC-FLU1-10-2 1.55 6.29 0.25
a 변형된 엘만 분석에 의해 측정됨
b 변형된 로우리 분석에 의해 측정됨
실시예 3
말레이미드화되거나 알킬할라이드-활성화된 OMPC의 제조
모든 조작은 무균적으로 수행하였다. H20 (5.5 mg/mL)중의 멸균 OMPC에 적절한 용적의 멸균 NaHCO3 0.5M을 첨가하여 NaHCO3 pH 8.5 ±0.1중에서 50mM이 되도록 하였다. 설포숙신임딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(sSMCC) 또는 설포숙신임딜 (4-요오도세틸) 아미노벤조에이트 (sSIAB) (빙냉 H2O중의 10 mM 스톡; 제조원(PIERCE CHEMICAL CO. , ROCKFORD, IL)으로부터의 화학물질)을 약하게 혼합하면서 완충된 OMPC에 적가하여 최종 농도 2.5 mM의 sSIAB 또는 sSMCC 및 약 3.8 mg/mL의 OMPC 농도를 수득하였다. 브로모아세트산 N-하이드록시설포숙신이미드 에스테르를 또한 사용할 수 있다. 반응물을 4℃에서 1시간동안 암실에서 숙성시킨다. 1시간 후, 반응 혼합물을 멸균 1M의 Na 포스페이트를 사용하여 pH 7.3으로 조정하고 12 내지 24시간동안 4℃에서 멸균 6.3mM의 Na 포스페이트, pH 7.3, 0.15M의 NaCl에 대해 300K 분자량 컷-오프(MWCO) 분산투석기(DISPODIALYZER)R(SPECTRUM INDUSTRIES, INC. , RANCO DOMINGUEZ, CA)중에서 완전히 투석한다. 또한 pH 조정은 배제될 수 있고 반응 혼합물을 직접 투석할 수 있다. 투석을 위해 20 mM의 HEPES, 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA, pH 7.3, 기타 적합한 완충제 또는 물을 또한 사용할 수 있다. 암실에서 SIAB 투석을 수행하였다. 투석 완충액의 N2 주입을 부가할 수 있다.
sSIAB 활성화된 OMPC 혼합물에 대해 바람직한 투석 완충액은 NaHC03 pH 8.5 ±0. 1중에서 50mM이다. 투석된 활성화된 OMPC는 펩타이드에 대해 상기된 바와 같은 N-아세틸-시스테인 소모 분석을 사용하여 티올 반응성 등가물에 대해 분석하고 단, 분석 완충액은 0.1M Na 포스페이트, 0.1M NaCl, 2mM EDTA, pH 7이고 N-아세틸시스테인 항온처리 기간은 15분이다. OMPC 블랭크(DTNB 부재)는 412nm에서 이의 분포를 보정하기 위해 수행한다. 변형된 로우리법으로 단백질을 측정한다. pH 8.5에서 말레이미드 활성화를 위해, 전형적으로 로우리 단백질의 말레이미드 등가물/mg의 0.09 내지 0.12μmol 수준이 되도록 한다. 당해 수준은 약 pH 7.3에서 수득한 값 보다 약 2배 내지 3배 높다. 활성화된 OMPC는 멸균 0.5M EDTA, pH 8 스톡을 사용하여 2mM EDTA 최종 농도가 되게한다.
실시예 4
M2 펩타이드와 티올화된 OMPC의 접합
무균 기술을 사용하여 다음과 같이 티올화된 OMPC를 M2 펩타이드 NT-BrAcM2-15(N-말단 브로모아세틸화된 M2 15량체 서열번호 11), CT-BrAcM2-15(C-말단 브로모아세틸화된 M2 15량체 서열번호 13), NT-MalM2-15(N-말단 말레이미드화된 M2 15량체 서열번호 12) 및 CT-MalM2-15(C-말단 말레이미드화된 M2 15량체 서열번호 14)와 접합시켰다. 티올화된 OMPC를 상이한 양의 펩타이드에 첨가하고 약하게 혼합하였다. 반응 혼합물을 암실에서 4℃에서 밤새 혼합없이 숙성시켰다.
이어서 반응물을 무균 기술을 사용하여 캡핑하고 탈염시켰다. OMPC상의 과량의 티올과 반응하도록 N-에틸말이미드(NEM)중에 반응 혼합물 5mM을 제조하고 암실에서 4℃에서 4시간동안 숙성시켜 NT-BrAcM2-15 및 CT-BrAcM2-15/티올화된 OMPC 접합 반응물을 캡핑시켰다. 캡핑된 반응 혼합물을, 4℃에서 멸균 0.15M NaCl에 대해 300K MWCO 분산투석기R중에 투석하여 탈염시켰다. NT-MalM2-15/티올화된 OMPC 접합 반응물을 요오도아세트아미드중에 반응 혼합물 5mM을 제조하고 암실에서 4℃에서 밤새 숙성시켜 캡핑하였다. 캡핑된 반응 혼합물을 4℃에서 멸균 0.15M NaCl에 대해 300K MWCO 분산투석기R중에 투석하여 탈염시켰다.
실시예 5
말이미드화되거나 요오도아세틸화된 OMPC로의 M2 펩타이드의 접합
티올 함유 M2 펩타이드(서열번호 1)과, 말레이미드화된 OMPC 또는 요오도아세틸화된 OMPC(또는 브로모아세틸화된 OMPC)의 접합은 무균 기술을 사용하여 다음과 같이 수행하였다. M2 펩타이드를 몰비가 약 3인 티올/말레이미드에서 약하게 혼합된 말레이미드화되거나 요오도아세틸화된 OMPC에 적가하였다. 역으로 예를 들어, OMPC를 펩타이드로 첨가하는 것도 가능하고 바람직하다. 반응 혼합물을 혼합없이 암실에서 4℃에서 12 내지 24시간동안 숙성시킨다. OMPC상의 과량의 티올 반응성 그룹을 시약이 암실에서 4℃에서 혼합없이 3 내지 4시간동안 접합체와 반응하도록 함에 의해 0.2마이크론 여과된 베타-머캅토메탄올(15mM 최종 농도)로 켄칭("캡핑")시켰다. 캡핑된 반응물을 4℃에서 멸균 0.15M NaCl에 대해 300K KWCO 분산투석기R중에서 완전히 투석하였다.
실시예 6
접합체의 분석
접합체에서 OMPC 단백질의 측정 또는 단백질 + 펩타이드의 측정을 위해, 변형된 로우리 분석법을 사용하였다. 당해 분석에서, 단백질 샘플을 캐리어 나트륨 데옥시콜레이트의 존재하에 트리클로로아세트산과 침전시켰다[문헌참조: Bensadoun and Weinstein 1976 Anal. Biochem. 70:241-250]. 단백질 펠렛을 로우리 시약 A를 함유하는 SDS로 용해시켰다. BSA 표준물을 유사 방식으로 처리하였다.
아미노산 분석(AAA)를 위해, 샘플을 내부 표준물인 노르류신으로 처리하고 70시간동안 진공하에 110℃에서 6N HCl, 0.2%의 페놀(w/v)로 가수분해하였다[예상되는 가수분해 생성물에 대해 반응식 V-VIII, 도 5 내지 8을 참조한다]. 가수분해 후, 샘플을 건조시키고 샘플 완충액중에 재현탁시키고 칼럼 후 닌하이드린 검출과 함께 양이온 교환 크로마토그래피(BECKMAN 모델 6300, Palo Alto,CA)로 분석하였다. 또한 감수성 및/또는 해상도의 잇점을 제공할 수 있는 ACCUTAGTM(WATERS CORP., MILFORD, MA) 또는 AMINO ACID DIRECTTM(DIONEX CORP., SUNNYVALE, CA)를 포함하는 기타 시스템을 사용하여 아미노산 분석을 또한 수행할 수 있다.
접합체의 펩타이드 로딩은 2개 이상의 방법에 의해 아미노산 데이터로부터 측정할 수 있다. 펩타이드내 독특한 아미노산(예를들어, 6-아미노헥사노산, AHA)로부터, 펩타이드 양을 평가할 수 있다. OMPC 단백질의 양은 OMPC에 존재하지만 펩타이드에는 부재인 아미노의 양으로부터 평가할 수 있다. 로우리 단백질 수를 통해 펩타이드로부터의 기여도를 수득하고 높은 펩타이드 로딩에서 수득된 값에 상당히 기여할 수 있다. 또 다른 방법은 스프레드 쉬트 포맷으로 AAA 데이터의 다중 회귀 최소 스퀘어 분석의 사용을 포함한다(문헌참조: Shuler et al. 1992 J. Immunol. Meth. 156:137-149). 일반적으로 2개의 방법은 서로 20% 이내인 것과 일치하는 값을 생성한다.
감소된 접합체 샘플의 SDS-PAGE/염색 분석은 펩타이드 접합에 대한 정성적인 증거를 제공할 수 있다. 말레이미드 또는 요오도아세틸-활성화된 OMPC/티올 함유 M2 펩타이드 접합체 분석을 위해, 켄칭된/활성화된 OMPC의 분석은 3량체로서 존재하는 OMPC의 주요 클래스 2 단백질을 가교결합시키는 SMCC 또는 SIAB의 부반응에 대한 증거를 제공할 수 있다.
실시예 7
티올화된 OMPC/말레이미드화된 또는 브로모아세틸 M2 접합체의 성질
투석된 NT-BrAcM2-15/티올화된 OMPC 접합체의 성질
반응 샘플OMPC-FLU-9-1 변형된 로우리a "단백질 + 펩타이드" mg/mL AAAb 단백질 mg/ml(로우리/AAA) S-카복시메틸-호모시스테인c 펩타이드/OMPCd mol/mol
A2.8μmol의 OMPC 티올 + 5.7μmol 펩타이드 1.22 0.82(1.49) 예 5,122
B2.8μmol OMPC 티 올 + 2.9μmol 펩타이드 1.78 1.54(1.16) 예 3,662
C2.8μmol OMPC 티올 + 1.4μmol 펩타이드 2.29 1.95(1.17) 예 3,258
D2.8μmol OMPC 티올 + 0.7μmol 펩타이드 2.17 2.05(1.06) 예 2,398
E2.8μmol OMPC 티올 + 펩타이드 부재 1.64 1.64(1.00) 아니오 NA
a 변형된 로우리 분석법
b 0.42μmol 라이신/mg 로우리 단백질 및 0.63μmol 알라닌/mg 로우리 단백질을 가정하는 AAA 데이터로부터 계산된 값의 평균값을 기준으로 함
cS-카복시메틸호모시스테인 분석은 정성 분석이다.
d AAA에 의해 결정된 단백질 값을 기준으로 함, 추정된 OMPC MW = 40 x 106 및 AAA 단백질/6-아미노헥산산(Aha) 값으로부터 펩타이드 몰을 구한다.
투석된 NT-MalM2-15/티올화된 OMPC 접합체의 성질
반응 샘플OMPC-FLU-9-2 변형된 로우리a"단백질 + 펩타이드" mg/ml AAAb단백질mg/ml(로우리/AAA) S-디카복시에틸-호모시스테인c 펩타이드/OMPCdmol/mol
A2.9μmol OMPC 티 올 + 2.8 μmol 펩타이드 2.91 2.40(1.21) 예 4,300
B2.9μmol OMPC 티올 + 1.4μmol 펩타이드 2.53 2.29(1.10) 예 3,872
C2.9μmol OMPC 티 올 + 0.7μmol 펩타이드 2.21 2.07(1.07) 예 2,606
D2.9μmol OMPC 티올 + 펩타이드 부재 0.65 0.59(1.10) 아니오 NA
a 변형된 로우리 분석법
b 0.42μmol 라이신/mg 로우리 단백질 및 0.63μmol 알라닌/mg 로우리 단백질을 가정하는 AAA 데이터로부터 계산된 값의 평균값을 기준으로 함
cS-디카복시에틸호모시스테인 분석은 정성 분석이다.
d AAA에 의해 결정된 단백질 값을 기준으로 함, 추정된 OMPC MW = 40 x 106 및 AAA 단백질/6-아미노헥산산(Aha) 값으로부터 펩타이드 몰을 구한다.
투석된 CT-BrAcM2-15/티올화된 OMPC 접합체의 성질
반응 샘플OMPC-FLU-10-1 변형된 로우리a"단백질 + 펩타이드" mg/ml AAAb단백질mg/ml(로우리/AAA) S-카복시메틸-호모시스테인c 펩타이드/OMPCdmol/mol
A2.6μmol OMPC 티 올 + 5.2 μmol 펩타이드 2.27 2.03(1.11) 예 4,783
B2.6μmol OMPC 티올 + 2.6μmol 펩타이드 2.19 2.04(1.07) 예 3,255
D2.6μmol OMPC 티 올 + 0.65μmol 펩타이드 2.00 2.44(0.89) 예 1,929
E2.6μmol OMPC 티올 + 펩타이드 부재 1.69 1.92(0.88) 아니오 NA
a 변형된 로우리 분석법
b 0.63μmol 알라닌/mg 로우리 단백질을 가정하는 AAA 데이터로부터 계산된 값의 평균값을 기준으로 함
cS-카복시메틸호모시스테인 분석은 정성 분석이다.
d AAA에 의해 결정된 단백질 값을 기준으로 함, 추정된 OMPC MW = 40 x 106 및 AAA 단백질/6-아미노헥산산(Aha) 값으로부터 펩타이드 몰을 구한다.
투석된 CT-MalM2-15/티올화된 OMPC 접합체의 성질
반응 샘플OMPC-FLU-10-2 변형된 로우리a"단백질 + 펩타이드" mg/ml AAAb단백질mg/ml(로우리/AAA) S-디카복시에틸-호모시스테인c 펩타이드/OMPCdmol/mol
A2.6μmol OMPC 티 올 + 2.5 μmol 펩타이드 2.72 2.45(1.11) 예 5,677
B2.6μmol OMPC 티올 + 1.3μmol 펩타이드 2.51 2.64(0.95) 예 3,439
C2.6μmol OMPC 티 올 + 0.65μmol 펩타이드 2.43 2.47(0.98) 예 2,298
D2.6μmol OMPC 티 올 + 0.33μmol 펩타이드 2.14 2.38(0.90) 예 1,882
E2.6μmol OMPC 티올 + 펩타이드 부재 1.90 1.98(0.96) 아니오 NA
a 변형된 로우리 분석법
b 0.63μmol 알라닌/mg 로우리 단백질을 가정하는 AAA 데이터로부터 계산된 값의 평균값을 기준으로 함
cS-디카복시에틸호모시스테인 분석은 정성 분석이다.
d AAA에 의해 결정된 단백질 값을 기준으로 함, 추정된 OMPC MW = 40 x 106 및 AAA 단백질/6-아미노헥산산(Aha) 값으로부터 펩타이드 몰을 구한다
일반적으로, 동몰의 펩타이드 첨가에서, 말레이미드화된 펩타이드는 브로모아세틸화된 펩타이드 보다 접합체내 접합체의 펩타이드 로딩이 보다 높다. 그 차이는 말레이미드 그룹과 비교하여 브로모아세틸 그룹의 보다 낮은 역학적 반응성때문이다.
실시예 8
말레이미드화된 OMPC 및 선택된 시스템인 함유 펩타이드 접합체의 성질
투석된 시스테인 함유 펩타이드/말레이미드화된 OMPC 접합체의 성질
펩타이드 접합체 변형된 로우리a "단백질 + 펩타이드"mg/ml DCEC/AHAb 펩타이드/OMPCc mol/mol
OMPC-FLU-2-4서열번호 1 2.09 3.1 1,110
OMPC-FLU-2-5서열번호 2 2.84 0.99 2,873
OMPC-FLU-3-5서열번호 10 2.40 ND 3,398
a 변형된 로우리 분석법
b S-디카복시에틸시스테인(DCEC) 및 6-아미노헥산산(AHA)은 AAA로 정량하였다. DCEC 반응 인자/ASP 반응 인자 = 1.285.
c 0.63μmol의 알라닌/mg의 로우리 단백질을 추정하는 AAA에 의해 측정된 단백질 값을 기준으로 추정된 OMPC MW = 40 x 106 및 6-아미노헥산산(AHA)값으로부터 펩타이드의 몰을 구한다.
단일 시스테인을 갖는 펩타이드(서열번호 2)에 대한 다중 시스테인 잔기를 함유하는 M2 펩타이드의 보다 높은 DCEC/AHA 수준은 단일 M2 단백질당 다수의 말레이미드/시스테인이 결합됨을 시사한다. 보다 작은 펩타이드(예를 들어, 서열번호 10)가, 단일 시스테인 함유 M2 펩타이드 접합체에 대한 반응물로의 동일한 펩타이드 첨가에서 보다 높은 펩타이드 로딩을 부여하는 것으로 나타난다. 당해 효과는 OMPC상의 말레이미드 부위의 입체적 장애 및/또는 펩타이드상의 반응성 시스테인 근처의 전하 차이에 의한 것일 수 있다. 활성화 및 탈염 단계동안에 가교 결합하는 OMPC내 고유 친핵성 잔기와 말레이미드의 반응[문헌참조: Brewer and Riehm 1967 Anal. Biochem. 18:248-255]은 켄칭된/말레이미드 활성화된 OMPC에 대한 SDS-PAGE 분석에서 시사된다. 보다 낮은 pH에서의 활성화는 가교 결합이 덜 명백하다. SIAB-활성화된 OMPC는 최소 가교 결합을 보여주었다. 몇몇 말레이미드 그룹은 또한 이미드의 개환반응에 의해 말레아민산으로 전환되었다. 말레아민산은 티올 반응성이 부족하다. 일반적으로, 단일 시스테인 함유 펩타이드를 사용하는 유사한 펩타이드 반응에 대해 말레이미드화된 펩타이드 및 티올화된 OMPC를 사용하여 제조된 접합체에 대한 펩타이드 로딩이 보다 높은 것으로 관찰되었다. 그렇게 관찰되는 이유는 말레이미드화(0.09 내지 0.12 μmol의 말레이미드/mg의 단백질)에 대해 티올화를 사용한 OMPC의 활성화(약 0.26 μmol 티올/mg의 단백질) 수준이 보다 높기 때문일 수 있다.
실시예 9
동물 연구를 위한 접합체
동물 연구를 위해, NT-BrAcM2-15가 약 2의 비율로 사용되는 것을 제외하고는 약 1의 펩타이드/OMPC 티올 첨가 비율(mol/mol)을 사용하여 접합체를 제조하였다. 0.15M NaCl중에서 무균적으로 제조된 접합체는 제형화를 위해 알루미늄 보조제(MERCK alum)로 전달하였다.
동물 연구에서 사용되는 접합체의 성질
접합체 샘플 AAAa 단백질mg/ml 펩타이드/OMPCb mol/mol
CT-BrAcM2-15 6.29 3,771
CT-BrAc(SRS)M2-23 6.04 2,762
OMPC-Flu-10-1GNT-BrAcM2-15 2.18 4,453
켄칭된/티올화된 OMPC 6.13 NA
CT-CysM2-15 2.70 4,576
a0.63μmol의 알라닌/mg의 로우리 단백질을 추정하는 AAA 데이터로부터 계산된 값을 기준으로 함.
b AAA에 의해 측정된 단백질 값을 기준으로 추정된 OMPC MW= 40 x 106 및 6-아미노헥산산(AHA) 값으로 펩타이드 몰을 구한다.
실시예 10
백신의 제형화
하기의 접합체를 실시예 11에서 사용하였다. "그룹"의 번호 지정은 백신 접종된 동물 그룹을 언급한다. 제형화에 사용되는 접합체는 그룹 1 내지 3으로 사용되는 CT-M2-15량체-ma-OMPC(추가로 접합체 "A"로 언급됨), 그룹 4 내지 6으로 사용되는 CT-BrAcM2-15량체-OMPC(추가로 접합체 "B"로서 언급됨), 그룹 7 내지 9로서 사용되는 NT-BrAcM2-15량체-OMPC(추가로 접합체 "C"로서 언급됨), 그룹 10 내지 12로 사용되는 CT-BrAcM2(SRS)-23량체-OMPC 및 그룹 13으로 사용되는 활성화된/켄칭된 OMPC(추가로 화합물 "E"로서 언급됨)이다. 희석은 로우리 방법에 의한 스톡의 단백질 농도 측정값 및 아미노산 분석에 의한 펩타이드 로딩을 기준으로 한다.
단계 1. 1 x 식염수 내지 0.1mg/ml의 단백질 농도로 접합체 A 내지 D를 희석한다. 화합물 E를 0.5mg/ml의 단백질 농도로 희석한다.
단계 2. 단계 1의 각각의 용액을 1 x 알루미늄중에 최종 50mcg/ml의 펩타이드 비율이 1:1이 되도록 미리 교반된 2 x 알루미늄(MERCK ALUM, Prod. #39943, MERCK & CO, West Point, PA)에 첨가한다(화합물 E에 대해서는 최종 단백질 농도는 1 x 알루미늄에서 0.25mg/ml의 단백질이다.
단계 3. 실온에서 2시간동안 회전 휠상에서 혼합한다.
단계 4. 표적 펩타이드 농도에 달하도록 접합체를 1 x 알루미늄으로 희석한다.
4.1 단계 3으로부터의 용액을 다음과 같이 1 x 알루미늄으로 희석한다: 4부 1 x 알루미늄에 대한 1부 용액(v/v).
4.2 1시간동안 실온에서 회전 휠상에서 혼합한다.
4.3 그룹 3, 6, 9, 12(1mcg 펩타이드 수용) 및 그룹 13(5mcg 활성화된/켄칭된 OMPC)에 대한 단계 4.2에서 필요한 용적의 용액을 분리.
4.4 단계 4.2로부터의 잔류 용액을 다음과 같이 1 x 알루미늄과 혼합한다: 9부 1 x 알루미늄에 대한 1부 용액(v/v).
4.5 실온에서 1시간동안 회전 휠상에서 혼합한다.
4.6 0.1mcg 펩타이드를 투여받은 그룹 2, 5, 8, 11에 대한 단계 4.5에서의 필요한 용적의 용액을 분리.
4.7 단계 4.5의 잔류 용액을 다음과 같이 1 x 알루미늄과 혼합한다: 9부 1 x 알루미늄에 대한 1부 용액(v/v).
4.8 실온에서 1시간동안 회전 휠상에서 혼합한다.
4.9 단계 4.8에서의 용액은 0.01 mcg 펩타이드를 투여받은 그룹 1, 4, 7, 10에 대한 제형화를 나타낸다.
단계 5. 바이알로 분산한다.
모든 샘플 조작은 무균 조건하에 수행하였다.
실시예 11
백신의 포유동물로의 투여
마우스 시험 감염 모델에서 M2 펩타이드 접합체 백신의 면역원성 및 보호.
4개의 상이한 M2 펩타이드 접합체에 대해서, M2 펩타이드 특이적 항체 반응을 유발하고 마우스내 치명적인 인플루엔자 바이러스 시험 감염으로부터 보호해주는 능력을 평가한다. 당해 시험 접합체는 하기 표에 나타낸다.
통상적인 명칭 M2 펩타이드 서열 접합 화학
CT BrAc-15량체-OMPC서열번호 13 SLLTEVETPIRNEWG C-말단에서 티올화된 OMPC에 커플링된 브로모아세틸 펩타이드
CT BrAc-23량체(SRS)-OMPC서열번호 39 SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD C-말단에서 티올화된 OMPC에 커플링된 브로모아세틸 펩타이드
NT BrAc-15량체-OMPC서열번호 11 SLLTEVETPIRNEWG N-말단에서 티올화된 OMPC에 커플링된 브로모아세틸 펩타이드
CT 15량체-ma-OMPC서열번호 10 SLLTEVETPIRNEWGC C-말단에서 말레이미드 활성화된 OMPC에 커플링된 티올화된 펩타이드
모든 접합체는 실시예 10에 기재된 바와 같이, 머크 알룸상에 제형화하였다. 그룹당 10마리의 암컷 Balb/c 마우스로 이루어진 그룹 각각의 동물들을 근육내로 100㎕의 접합체를 사용하여 면역화시키고 3주 후 동일한 접합체로 1회 부스팅하였다. 각각의 접합체를 펩타이드 함량을 기준으로 3개의 상이한 용량, 즉, 0.01㎍, 0.1㎍ 및 1㎍으로 동물에서 시험하였다. 예를 들어, 실시예 10의 제형화된 접합체 A는 그룹 1에 0.01㎍, 그룹 2에 0.1㎍ 및 그룹 3에 1㎍으로 투여한 반면 제형화된 접합체 B는 그룹 4에 0.01㎍, 그룹 5에 0.1㎍ 및 그룹 6에 1㎍ 등으로 투여하였다.
대조군 동물에는 MERCK ALUM에 제형화된 비접합된 OMPC를 사용하여 동일한 스케줄로 면역화시켰다. 2주째(첫번째 투여 후) 및 6주(2번째 투여 후)에 혈액 샘플을 채취하였다. 부스트 면역화시킨지 4주 후에, 동물의 비강내로 마우스 적합 A/홍콩/68 재분류물(A/HK/68 기원의 HA 유전자 및 A/PR/8/34(H2N2) 기원의 M2 유전자)(본원에서 "A/HK/68 재분류물"로서 언급됨) LD90(90% 치사율의 용량)을 투여하였다. 투여 후, 총 20일 동안 매일 체중 감소 및 치사율에 대해 마우스를 모니터하였다.
M2-특이적 항체 역가는 검출 항원으로서 비변형된 23개 아미노산 M2 펩타이드를 사용한 면역-결합된 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 측정하였다. 비면역화된 그룹 및 OMPC 대조군 그룹 둘다는 어떠한 검출 가능한 항-M2 항체 역가를 나타내지 않는다. 접합체 백신 접종된 그룹으로부터의 결과는 도 9에 나타낸다. 명백한 용량 효과는 모든 백신 그룹에 대해 PD1 및 PD2 샘플 둘다에서 관찰되었고 당해 백신은 적절한 용량 범위에서 시험되었음을 지적한다. 모든 접합체는 M2-특이적 항체 반응을 상당히 유발할 수 있다. 부스트 면역화 후, 1㎍ 투여량으로 주어진 접합체 모두는 50만 이상의 특이적 항체 역가를 유발하였다. 상이한 백신 중에서, CT BrAc 23량체(SRS)-OMPC는 가장 높은 역가를 나타낸 반면, CT 15량체-ma-OMPC는 가장 낮은 역가를 나타내었다. CT BrAc-15량체-OMPC와 NT BrAc-15량체-OMPC사이에서 어떠한 명백한 차이가 관찰되지 않았고 이것은 N 말단을 통해 접합된 펩타이드와 C-말단을 통해 접합한 펩타이드가 상응할만한 면역원성을 갖는다는 것을 지적한다.
치명적인 바이러스 시험 감염 후, 예상되는 바와 같이 대조군 그룹은 90 내지 100% 치사율을 나타내었다. 대조적으로 1㎍ 용량을 투여받은 모든 백신 그룹은 80 내지 100%의 생존율을 나타내었다. 이것은 시험된 백신이 치사율에 대해 보호작용을 부여할 수 있음을 보여준다. 도 10은 CT BrAc-15량체-OMPC와 CT 15-ma-OMPC간의 비교를 보여준다. 2개의 접합체간의 가장 현저한 차이는 0.01㎍에서 CT BrAc-15량체-OMPC를 투여받은 마우스는 80%의 생존율을 나타내는 반면 CT 15-ma-OMPC를 투여받은 마우스는 근본적으로 대조군과 동일한 치사율을 갖는다. 이것은 CTBrAc-15량체-OMPC가 CT 15-ma-OMPC 보다 치명적 투여에 대한 보호 관점에서 보다 효과적임을 지적한다. 이러한 주장은 실질적으로 당해 2개 그룹에 의해 나타나는 상대적 M2 항체 역가와 일치한다. 도 11은 CT BrAc-15량체-OMPC와 CT BrAc-23량체(SRS)-OMPC간의 비교를 나타낸다. 이 경우에, 치사율에 있어서 2개 사이의 차이는 명백하지 않다. 그러나, CT BrAc-15량체-OMPC를 투여받은 그룹에서 보다 총 체중감량이 덜함을 보여주고 이것은 전자가 잠재적으로 보다 보호성일 수 있다는 경향을 나타낸다. 도 12는 CT BrAc 15량체-OMPC와 NT BrAc-15량체-OMPC간의 비교를 보여준다. 전체적으로, CT BrAc-15량체 접합체를 투여 받은 그룹은 NT BrAc-15량체 접합체를 투여받은 그룹 보다 높은 생존율을 보여주었다. 당해 실험에서, 모든 M2 펩타이드 접합체는 치명적인 바이러스 시험 감염에 대해 보호적이고 C 말단을 통해 티올화된 OMPC에 접합된 M2 23량체(SRS)는 가장 효과적인 백신인 것으로 나타난다.
실시예 12
펩타이드 A/H3/HA0-2
서열번호 명칭 펩타이드 서열
83 A/H3/HA0-2 CGPEKQTRGLFGAIAGFIENG-NH 2
A/H3/HA0-2의 펩타이드 서열은 인플루엔자 A 서열, H3 서브타입, 홍콩 A/68의 헤마글루티닌 단백질 전구체 HA0의 절단 부위를 포함하는 서브유니트 상호 영역에 상응한다. N-말단에 글라이신 및 시스테인과 같은 잔기가 굵게 표시되어 있다. 이들은 스페이서 및 시스테이닐 리간드로서 말레이미드 활성화된 OMPC 캐리어와 반응시켜 티오에테르 결합을 통해 펩타이드-OMPC 접합체를 제조하는데 필요하다.
A/H3/HA0-2의 펩타이드 합성
파이오니아 펩타이드 합성기(APPLIED BIOSYSTEMS, Foster City, CA)상의 Fmoc/t-Bu 화학을 사용하는 고형상에 의해 헵타이드를 합성하였다. 사용되는 수지는 1% 가교 결합된 Fmoc-연결체 AM-챔피온(BIOSEARCH TECHNOLOGIES, INC., Novato, CA), 변형된 Rink 연결체 p-[(R,S)-α-[9H-플루오렌-9-일-메톡시포름아미도]-2,4-디메톡시벤질]-페녹시아세트산(문헌참조: Rink, H.(1987) Tetrahedron Lett. 28, 3787-3789; Bernatowicz, M.S., Daniels, S.B. and Koster, H. (1989) Tetrahedron Lett. 30, 4645-4667]으로 유도체화된 PEG-PS 기본 수지이다.
모든 아실화 반응은 수지 유리 아미노 그룹에 대해 4배 과량의 활성화된 아미노산을 사용하여 60분동안 수행하였다. 아미노산은 동몰량의 HBTU(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 및 2배 몰 초과량의 DIEA(N,N-디이소프로필에틸아민)을 사용하여 활성화시켰다. 측쇄 보호 그룹은 Asp, Glu, Ser, Thr 및 Tyr에 대해 3급 부틸; Cys, Asn, His 및 Gln에 대해 트리틸; Lys 및 Trp에 대해 3급-부톡시-카보닐이다. 어셈블리 말기에, 무수 펩타이드 수지를 실온에서 1.5시간동안 88% TFA, 5% 페놀, 2% 트리이소프로필실란 및 5% 물(문헌참조: Sole, N.A. and Barany, G.(1992) J. Org. Chem., 57, 5399-5403)로 처리하였다.
수지를 여과하고 용액을 냉각 메틸-t-부틸 에테르에 첨가하여 펩타이드를 침전시켰다. 원심분리 후, 펩타이드 펠렛을 새로운 냉각 메틸-t-부틸 에테르로 세척하여 유기 스캐빈저를 제거하였다. 당해 방법을 2회 반복하였다. 최종 펠렛을 건조시키고 H2O, 20% 아세토니트릴에 현탁시키고 동결건조시켰다.
조 펩타이드를, 용출제로서 (A) 물중 0.1% 트리플루오로아세트산 및 (B) 아세토니트릴중 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하여 반-정제용 WATERS(MILFORD, MA) RCM 델타-PAKTM C-18 카트리지(40 x 100mm, 15㎛)에 의해 정제하였다. 본 발명자는 20분에 걸친 25% - 40%의 농도 구배, 유속 80ml/분을 사용하였고, 16'의 체류시간(tR)에 용출하는 당해 생성물에 해당하는 피크가 나타난다. 분석용 HPLC는 20'분동안 B: 20% - 50%의 농도 구배, 유속 1ml/분과 함께 ULTRASHPERE, C18 칼럼, 25 x 4.6mm, 5㎛상에서 수행하였다. 퍼킨-엘머(PERKIN-ELMER)(WELLESLEY, MA) API-100상에서 전자분무 질량 스펙트럼에 의해 정제된 펩타이드의 특성을 밝혔다. 이론적인 평균 mw는 2163.48Da이고 실측치는 2163.6Da이다.
펩타이드 A/H3/HA0-2의 OMPC로의 접합
그람 음성 세균으로부터 OMPC를 정제하기 위한 다양한 방법은 문헌[참조:Frasch et al., J. Exp. Med. 140,87 (1974); Frasch et al., J. Exp. Med. 147,629 (1978) ; Zollinger et al. , 미국 특허 번호 제4,707, 543호 (1987); Helting et al., Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. C. 89, 69 (1981) ; Helting et al. ,미국 특허 번호 제 4,271, 147호]에 보고되었다. 엔. 메닌기티디스 B 개선된 외막 단백질 복합체(iOMPC)는 푸의 미국 특허 번호 제5,494,808호에 기재된 바와 같이 당해 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
나이제리아 메닌기티디스 개선된 외막 단백질 복합체(iOMPC) 용액(6.84mg/ml) 2.9ml에 0.5M NaHCO3(0.322ml)를 최종 농도 50mM(pH 8.5)로 첨가하였다. 여기에, 2배 과량(OMPC 라이신 잔기에 대해, 0.42μmol 라이신/mg OMPC 단백질)으로 이종이작용성 가교링커인 설포숙시닌이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sSMCC, PIERCE CHEMICAL CO., Rockford, II) 20μM 용액 0.83ml을 적가하였다. 암실에서 4℃에서 1시간동안 용액을 숙성시킨 후, 1M의 NaH2PO4 용액(46㎕)을 첨가하여 pH를 중성으로 저하시켰다. 당해 용액을 4℃에서 , 20mM HEPES pH 7.3(4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산), 2mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)의 완충액을 2시간 간격으로 6회 변화시키면서 300K MWCO 분산투석기(DISPODIALYZER)(SPECTRUM LABORATORIES INC., Rancho Cominguez CA)를 사용하여 투석하여 과량의 시약을 제거하였다. 총 8.08ml의 활성화된 OMPC(aOMPC)를 투석 후 회수하였다.
Cys 함유 펩타이드 리간드 A/H3/HA0-2의 스톡 용액 0.7mg/ml을 0.1M HEPES, 2mM EDTA(pH 7.3)의 탈기 용액중에서 제조하였다. 펩타이드 용액의 티올 함량은 엘만 분석으로 측정하였고(문헌참조: Ellman, G. L. (1959), Arch. Biochem. Biophys., 82, 70) 230μM의 -SH 역가를 보여주었다.
침전없이 aOMPC로 안전하게 혼입될 수 있는 최대량의 펩타이드 리간드를 규명하기 위해, 먼저 aOMPC가 증가량의 펩타이드 기간드와 항온처리되는 소규모 시험에서 접합 반응을 수행하였다. OMPC로 혼입될 수 있는 최대수의 말레이미드 그룹은 OMPC상의 총 라이신 잔기, 즉 0.42μmol 라이신/mg OMPC에 의해 제한된다. OMPC에 대한 평균 분자량이 40 x 106 Da임을 고려하는 경우, 이것은 OMPC mol당 16,000의 라이신 몰에 상응한다. 이들중 단지 소량만이 35% 이하까지 sSMCC로 활성화될 수 있고 이것은 약 5000몰의 달성될 수 있는 최대 펩타이드 로딩에 해당한다. 따라서, aOMPC는 OMPC 몰당 500, 1000, 2000, 3000의 몰 과량의 펩타이드 리간드와 항온처리한다. 1시간 후, 샘플을 aOMPC 샘플과 비교하여 임의의 침전 발생 또는 탁도의 증진에 대해 조사하였다.
A/H3/HA0-2의 경우에, 접합 반응으로, 1시간의 항온처리 반응동안 2000이하의 몰 과량을 사용하는 경우에만 가용성 생성물이 생성되었다. 이러한 비율을 초과하는 경우 OMPC 용액은 완전히 침전하게된다.
이들 관찰을 기준으로, 대규모 반응을 수행하였다. OMPC 4ml(9.8mg)을 20mM의 HEPES, 2mM의 EDTA pH 7.3으로 희석하였다. 여기에 펩타이드 스톡 용액 2.08ml을 약하게 볼텍싱시키면서 적가하고 이것은 2000몰 과량의 펩타이드 몰/OMPC 몰에 상응한다. 말레이미드 활성화된 OMPC 용액의 샘플을 최종 접합체의 펩타이드 로딩을 측정하기 위한 블랭크로서 잔류시켰다. 접합체 반응 혼합물을 암실에서 4℃에서 17시간동안 숙성시켰다. OMPC상의 임의의 잔여 말레이미드 그룹을 이어서 암실에서 4℃에서 1시간동안 최종 농도 15mM(총 용적 8.6㎕를 첨가함)의 β-머캅토에탄올로 켄칭시켰다. 당해 용액을 4회에 걸쳐 4시간/갈아주면서, 300K MWCO 분산투석기를 사용하여 4℃에서 20mM의 HEPES pH 7.3 1L로 투석하여 비접합된 펩타이드 및 β-머캅토에탄올을 제거하였다.
당해 농도를 로우리 분석법으로 측정(문헌참조: Lowry, O. H., Rosebrough, N. J. , Farr, A. L. and Randall, R. J. (1951), J. Biol. Chem., l93, 265)하여 OMPC-A/H3/HA0-2가 1.0mg/ml임을 밝혔다. 당해 접합체 및 aOMPC 샘플을 110℃에서 70시간동안 공비 HCl을 사용하여 진공 밀봉된 유리 튜브에서 가수분해시켰다. 아미노산 조성을 아미노산 분석을 사용하여 측정하였다. OMPC 단백질에 대한 펩타이드의 접합 로딩은 접합체 아미노산 조성을 OMPC 캐리어의 조성 및 펩타이드 리간드의 조성 둘다를 비교하고 당해 데이터의 다중 회귀 최소 스퀘어 분석에 의해 측정하였다[문헌참조: Shuler et al. Journal of Immunological Methods, 156, (1992) 137-149]. 접합체 OMPC와 A/H3/HA0-2에 대해, 몰비가 1160인 펩타이드 대 OMPC를 수득하였다.
실시예 13
펩타이드 A/H3/HA0-18
A/H3/HA0-2의 펩타이드 서열의 PI는 ProMac(단백질 질량 계산기) 소프트웨어 v. 1.5.3.을 사용하여 계산된 바와 같이 8.4이다. 당해 서열을 조작하여 펩타이드의 PI 값을 4.1로 저하시켜 인플루엔자 HA0 전구체와 동일한 서열을 A/H3/HA0-2와 공유하는 펩타이드 HA0-18을 수득한다. 접합, 스페이싱 및 PI 조작을 위해 요구되는 잔기는 굵게 표시한다.
서열번호 명칭 펩타이드 서열1
102 A/H3/HA0-18 Ac-CGPEKQTRGLFGAIAGFIENGE-OH
1Ac-, 아세틸, CH3-CO-
A/H3/HA0-18의 펩타이드 합성
A/H3/HA0-2에 대해 기술된 바와 같이 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드 C 말단 산을 형성하기 위해, 펩타이드를, 활성화제로서 DIPCDI/HOBt를 사용하는 4-하이드록시메틸페녹시아세트산 링커로 미리 유도체화된 챔피온 PEG-PS 수지(BIOSEARCH TECHNOLOGIES, INC., Novato, CA)상에서 합성하였다. 제1 아미노산인 글루타메이트를 DIPC를 사용하여 대칭 무수물로서 활성화시키고 촉매량의 DMAP(디메틸아미노피리딘)의 존재하에 수지에 에스테르 결합시켰다. 펩타이드 어셈블리 말기에 DMF중의 10배 과량의 무수 아세트산과 반응시킴에 의한 아세틸화 반응을 수행하였다.
조 펩타이드 HA0-18을 용출제로서 (A) 물중 0.1% 트리플루오로아세트산 및 (B) 아세토니트릴중 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하여 반-정제용 (WATERS, Milford, MA) RCM 델타-PAKTM C-18 카트리지(40 x 100mm, 15㎛)에 의해 정제하였다. 본 발명자는 20분에 걸친 B: 30% - 45%의 농도 구배, 유속 80ml/분을 사용하였다.분석용 HPLC는 3'분동안 B: 30% - 45%B-의 농도 구배, 유속 1ml/분과 함께 ULTRASHPERE, C18 칼럼(BECKMAN FULLERTON, CA), 25 x 4.6mm, 5㎛상에서 수행하였다. 퍼킨-엘머(PERKIN-ELMER)(WELLESLEY, MA) API-100상에서 전자분무 질량 스펙트럼에 의해 정제된 펩타이드의 특성을 밝혔다. 이론적인 평균 MW는 2336.83Da이고 실측치는 2336Da이다.
A/H3/HA0-18의 OMPC로의 접합
iOMPC를 A/H3/HA0-2에 대해 실시예 12에서 기술된 바와 같이 활성화시켰다. Cys 함유 펩타이드 리간드 A/H3/HA0-18의 스톡 용액을 0.1M HEPES, 2mM EDTA(pH 7.3)의 탈기 용액중에서 제조하였다. 펩타이드 용액의 티올 함량은 엘만 분석으로 측정하였고 200μM의 -SH 역가를 보여주었다. 침전없이 aOMPC로 안전하게 혼입될 수 있는 최대량의 펩타이드 리간드를 규명하기 위해, 먼저 aOMPC가 증가량의 펩타이드 리간드와 항온처리되는 소규모 시험에서 접합 반응을 수행하였다. 즉, aOMPC는 OMPC 몰당 1000, 2000, 3000의 몰 과량의 펩타이드 리간드와 항온처리한다. 1시간 후, 샘플을 aOMPC 샘플과 비교하여 임의의 침전 발생 또는 탁도의 증진에 대해 조사하였다. 보다 낮은 pI에서 가공된 서열에서는 사용되는 최대 몰 과량의 리간드, 즉 3000mole/OMPC mol까지는 침전이나 탁도의 증가가 나타나지 않았다.
이들 관찰에 따라, aOMPC 용액 2ml(4.6mg)에 펩타이드 스톡 용액 1.68ml(엘만 분석에 의해 200μM, 3000 몰 과량에 상응함)을 첨가하였다. 접합 반응 혼합물을 암실에서 4℃에서 17시간동안 숙성시켰다. OMPC상의 임의의 잔여 말레이미드 그룹을 암실에서 4℃에서 1시간동안 최종 농도 15mM까지 β-머캅토에탄올로 켄칭하였다. 당해 용액을 광범위하게 300K MWCO 분산투석기를 사용하여 4℃에서 20mM의 HEPES(pH 7.3)에 대해 투석하여 비접합된 펩타이드 및 β-머캅토에탄올를 제거하였다. 최종 접합체는 A/H3/HA0-2에 대해 기재된 바와 같이, 로우리 분석법 및 아미노산 분석법에 의해 분석하였다. 접합체 OMPC 및 A/H3/HA0-18에 대해, 몰비가 2542인 펩타이드 대 OMPC를 수득하였다.
실시예 14
펩타이드 A/H3/HA0-17
서열번호 명칭 펩타이드 서열
104 A/H3/HA0-17 Suc-EPEKQTRGLFGAIAGFIENGC-OH
1Suc-, 숙시닐, HOOC-(CH2)2-CO-
A/H3/HA0-17의 펩타이드 서열은 인플루엔자 A 서열의 헤마글루티닌 단백질 전구체인 HK A/68, H3 서브타입의 절단 부위에 상응한다. 당해 서열은 실시예 1의 A/H3/HA0-2의 서열과 유사하지만 이 경우에, 말레이미드 활성화된 캐리어와의 접합을 위해 필요한 시스테인 잔기는 C-말단에 존재한다. 당해 서열은 추가로 변형시켜 펩타이드의 pI 값을 4로 조정하였다. 당해 변형은 아미드 대신 Cys 말단 카복실레이트, N-말단에 글루타메이트 및 숙시닐의 첨가를 포함한다.
A/H3/HA0-17의 펩타이드 합성
펩타이드 C 말단 산을 형성하기 위해, 펩타이드를, 활성화제로서 DIPCDI/HOBt를 사용하는 4-하이드록시메틸페녹시아세트산 링커로 미리 유도체화된 챔피온 PEG-PS 수지(BIOSEARCH TECHNOLOGIES, INC)상에서 합성하였다. 제1 아미노산인 글루타메이트를 DIPC(디이소프로필카보디이미드)를 사용하여 대칭 무수물로서 활성화시키고 촉매량의 DMAP(디메틸아미노피리딘)의 존재하에 수지에 에스테르 결합시켰다. A/H3/HA0-2에 대해 기재된 바와 같이 어셈블리를 수행하였다. 숙시닐화 반응은 펩타이드 어셈블리 말기에 DMF중의 10배 과량의 무수 아세트산과 반응시킴에 의해 수행하였다.
조 펩타이드 A/H3/HA0-17을 용출제로서 (A) 물중 0.1% 트리플루오로아세트산 및 (B) 아세토니트릴중 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하여 반-정제용 (WATERS, Milford, MA) RCM 델타-PAKTM C-18 카트리지(40 x 100mm, 15㎛)을 사용하는 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 본 발명자는 20분에 걸친 B: 30% - 45%의 농도 구배, 유속 80ml/분을 사용하였다. 분석용 HPLC는 유속 1ml/분으로 20'에 걸쳐 B: 30% - 45%-의 농도 구배, 3'에 걸쳐 20' 내지 80%로 ULTRASHPERE, C18 칼럼(BECKMAN FULLERTON, CA), 25 x 4.6mm, 5㎛상에서 수행하였다. 퍼킨-엘머(PERKIN-ELMER)(WELLESLEY, MA) API-100상에서 전자분무 질량 스펙트럼에 의해 정제된 펩타이드의 특성을 밝혔다. 이론적인 평균 MW는 2337.62Da이고 실측치는 2336.8Da이다.
A/H3/HA0-17의 aOMPC로의 접합
iOMPC를 실시예 12에 기술된 바와 같이 활성화시켰다. HA0-17의 스톡 용액을 0.1M HEPES, 2mM EDTA(pH 7.3)의 탈기 용액중에서 제조하였다. 펩타이드 용액의 티올 함량은 엘만 분석으로 측정하였고 200μM의 -SH 역가를 보여주었다. 침전없이 aOMPC로 안전하게 혼입될 수 있는 최대량의 펩타이드 리간드를 규명하기 위해, 먼저 aOMPC가 증가량의 A/H3/HA0-17과 항온처리되는 소규모 시험에서 접합 반응을 수행하였다. 즉, aOMPC는 OMPC 몰당 1000, 2000, 3500의 몰 과량의 펩타이드 리간드와 항온처리한다. 1시간 후, 샘플을 aOMPC 샘플과 비교하여 임의의 침전 발생 또는 탁도의 증진에 대해 조사하였다. 보다 낮은 pI에서 가공된 서열에서는 사용되는 최대 몰 과량의 리간드, 즉 3000mole/OMPC mol까지는 침전이나 탁도의 증가가 나타나지 않았다.
이들 관찰을 기준으로, 대규모 반응을 aOMPC 3mg(0.94ml)상에서 수행하였다. 여기에 펩타이드 스톡 용액 1.334ml을 약하게 볼텍싱시키면서 적가하고 이것은 3500몰 과량의 펩타이드 몰/OMPC 몰에 상응한다. 접합체 반응 혼합물을 암실에서 4℃에서 17시간동안 숙성시켰다. OMPC상의 임의의 비반응 말레이미드 그룹을 이어서 암실에서 4℃에서 1시간동안 최종 농도 15mM의 β-머캅토에탄올로 켄칭시켰다. 당해 용액을 300K MWCO 분산투석기(SPECTRUM LABORATORIES, INC., RANCHO DOMINGUEZ, CA)를 사용하여 4℃에서 20mM의 HEPES pH 7.3 1L로 투석하여 비접합된 펩타이드 및 β-머캅토에탄올을 제거하였다. 최종 접합체를 A/H3/HA0-2에 대해 기재된 바와 같이 로우리 분석법 및 아미노산 분석법으로 분석하였다. 당해 분석으로 1860몰의 A/H3/HA0-17의 펩타이드/몰 OMPC의 혼입 수준을 수득하였다.
실시예 15
펩타이드 A/H3/HA2-25
서열번호 명칭 펩타이드 서열
77 A/H3/HA2-25 GLFGAIAGFIENGWEGMVDGCE-OH
A/H3/HA2-25의 펩타이드 서열은 인플루엔자 A 서열, H3 서브타입의 홍콩 A/68의 헤마글루티닌 단백질 HA2의 융합 펩타이드 영역에 상응한다. 당해 서열은 말레이미드 활성화된 OMPC와의 접합을 위해 시스테인(굵은 표시), 스페이스로서 글라이신 잔기 및 pI의 3.4의 값으로 조정하기 위한 C-말단 잔기로서 글루타메이트의 혼입을 포함한다.
A/H3/HA2-25의 펩타이드 합성
펩타이드 C 말단 산을 형성하기 위해, 펩타이드를, 활성화제로서 DIPCDI/HOBt를 사용하는 4-하이드록시메틸페녹시아세트산 링커로 미리 유도체화된 챔피온 PEG-PS 수지(BIOSEARCH TECHNOLOGIES, INC)상에서 합성하였다. 제1 아미노산인 글루타메이트를 DIPC(디이소프로필카보디이미드)를 사용하여 대칭 무수물로서 활성화시키고 촉매량의 DMAP(디메틸아미노피리딘)의 존재하에 수지에 에스테르 결합시켰다. A/H3/HA0-2에 대해 기재된 바와 같이 어셈블리를 수행하였다.
조 펩타이드 A/H3/HA0-25를 용출제로서 (A) 물중 0.1% 트리플루오로아세트산 및 (B) 아세토니트릴중 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하여 반-정제용 (WATERS, Milford, MA) RCM 델타-PAKTM C-18 카트리지(40 x 100mm, 15㎛)을 사용하는 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 본 발명자는 B: 40% - 40%(5')-60%(20')의 농도 구배, 유속 80ml/분을 사용하였다. 분석용 HPLC는 유속 1ml/분으로 20'에 걸쳐 B: 35% - 55%-의 농도 구배, 3'에 걸쳐 80%로 Phenomenex, Jupiter, C4 칼럼, 15 x 4.6mm, 5㎛상에서 수행하였다. 퍼킨-엘머(PERKIN-ELMER)(WELLESLEY, MA) API-100상에서 전자분무 질량 스펙트럼에 의해 정제된 펩타이드의 특성을 밝혔다. 이론적인 평균 MW는 2271.55Da이고 실측치는 2271.2Da이다.
A/H3/HA0-25의 aOMPC로의 접합
iOMPC를 실시예 12에 기술된 바와 같이 활성화시켰다.
A/H3/HA2-25의 용액을 0.1M HEPES, 2mM EDTA(pH 7.3)의 탈기 용액중에서 제조하였다. 펩타이드 용액의 티올 함량은 엘만 분석으로 측정하였고 250μM의 -SH 역가를 보여주었다.
침전없이 aOMPC로 안전하게 혼입될 수 있는 최대량의 펩타이드 리간드를 규명하기 위해, 먼저 aOMPC가 증가량의 A/H3/HA2-25과 항온처리되는 소규모 시험에서 접합 반응을 수행하였다. 즉, aOMPC는 OMPC 몰당 500, 1000, 2000, 4000, 6000의 몰 과량의 펩타이드 리간드와 항온처리한다. 1시간 후, 샘플을 aOMPC 샘플과 비교하여 임의의 침전 발생 또는 탁도의 증진에 대해 조사하였다. 보다 낮은 pI에서 가공된 서열에서는 사용되는 최대 몰 과량의 리간드, 즉 6000mole/OMPC mol까지는 침전이나 탁도의 증가가 나타나지 않았다.
이들 관찰에 따라, 대규모 반응을 aOMPC 6.3mg(2.57ml)상에서 수행하였다. 여기에 펩타이드 스톡 용액 3.85ml을 약하게 볼텍싱시키면서 적가하고 이것은 6000몰 과량의 펩타이드 몰/OMPC 몰에 상응한다. 접합체 반응 혼합물을 암실에서 4℃에서 17시간동안 숙성시켰다. OMPC상의 임의의 비반응 말레이미드 그룹을 이어서 암실에서 4℃에서 1시간동안 최종 농도 15mM의 β-머캅토에탄올과 반응시켰다. 당해 용액을 300K MWCO 분산투석기(SPECTRUM LABORATORIES, INC., RANCHO DOMINGUEZ, CA)를 사용하여 4℃에서 20mM의 HEPES pH 7.3 1L로 광범위하게 투석하여 비접합된 펩타이드 및 β-머캅토에탄올을 제거하였다. 최종 접합체를 A/H3/HA0-2에 대해 기재된 바와 같이 로우리 분석법 및 아미노산 분석법으로 분석하였다. 당해 분석으로 2436몰의 펩타이드 A/H3/HA0-25/몰 OMPC의 혼입 수준을 수득하였다.
실시예 16
펩타이드 B/HA0-22
B/HA0-22의 펩타이드 서열은, 빅토리아 및 야마가타 계열, 예를 들어, B/Ann Arbor/54, B/Hong Kong/330/2001 및 B/Yamanashi/166/1998의 인플루엔자 B 바이러스와 동일한 인플루엔자 B 바이러스의 헤마글루티닌 단백질 전구체 HA0의 절단 부위에 상응한다.
서열번호 명칭 펩타이드 서열
60 B/HA0-22 BrAc-EGPAKLLKER↓GFFGAIAGFLEE-OH
N-말단에 브로모아세틸 그룹을 도입하여 서열을 변형시킴으로써 글라이신 스페이서의 티올화된 OMPC에 접합하도록 하고[문헌참조: Tolman et al. Int. J. Peptide Protein Res. 41, 1993, 455-466; Conley et al. Vaccine 1994, 12, 445-451] 변형시켜 펩타이드의 pI값을 조정한다. 당해 변형은 카복스아미드 대신 C-말단 카복실화 및 N 및 C 말단에 글루타메이트의 첨가를 포함한다.
B/HA0-22의 펩타이드 합성
파이오니어 펩타이드 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA)상에서 Fmoc/t-Bu 화학을 사용한 고형상에 의해 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드 C 말단 산을 형성하기 위해, 펩타이드를, 활성화제로서 DIPCDI/HOBt를 사용하는 4-하이드록시메틸페녹시아세트산 링커로 미리 유도체화된 챔피온 PEG-PS 수지(BIOSEARCH TECHNOLOGIES, INC., Novato, CA)상에서 합성하였다. 제1 아미노산인 Glu를 DIPC(디이소프로필카보디이미드)를 사용하여 대칭 무수물로서 활성화시키고 촉매량의 DMAP(디메틸아미노피리딘)의 존재하에 수지에 에스테르 결합시켰다. 활성화제로서 DIPCDI/HOBt를 사용하여 3배 과량의 브로모아세트산과 반응시켜 펩타이드 어셈블리 말기에 브로모아세틸화 반응을 수행하였다.
수지 유리 아미노 그룹에 대해 4배 과량의 활성화된 아미노산을 사용하여 60분동안 모든 아실화 반응을 수행하였다. 아미노산을 동몰량의 HBTU-(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트) 및 2배 몰 과량의 DIEA(N,N-디이소프로필에틸아민)으로 활성화시켰다. 측쇄 보호 그룹은 Glu에 대해 3급-부틸; Lys에 대해 3급-부톡시-카보닐; Arg에 대해 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-설포닐이다. 어셈블리 말기에 무수 펩타이드 수지를 실온에서 1.5시간동안 88% TFA, 5% 페놀, 2% 트리이소프로필실란 및 5% 물을 사용하여 처리하였다[문헌참조: Sole, N. A., and Barany, G. (1992) J. Org. Chem., 57,5399-5403]. 수지를 여과하고 용액을 냉각 메틸-t-부틸 에테르에 첨가하여 펩타이드를 침전시켰다. 원심분리 후, 펩타이드 펠렛을 새로운 냉각 메틸-t-부틸 에테르로 세척하여 유기 스캐빈저를 제거하였다. 당해 과정을 2회 반복하였다. 최종 펠렛을 건조시키고 H2O, 20% 아세토니트릴중에 재현탁시키고 동결건조시켰다.
조 펩타이드를 용출제로서 (A) 물중 0.1% 트리플루오로아세트산 및 (B) 아세토니트릴중 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하여 반-정제용 (WATERS, Milford, MA) RCM 델타-PAKTM C-18 카트리지(40 x 100mm, 15㎛)을 사용하는 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 본 발명자는 20분에 걸쳐 B: 30% - 45%의 농도 구배, 유속 80ml/분을 사용하였다. 분석용 HPLC는 유속 1ml/분으로 20'에 걸쳐 B: 30% - 50%-의 농도 구배, 3'에 걸쳐 80%로 ULTRASPHERE(BECKMAN, FULLERTON, CA) C18 칼럼, 25 x 4.6mm, 5㎛상에서 수행하였다. 퍼킨-엘머(PERKIN-ELMER)(WELLESLEY, MA) API-100상에서 전자분무 질량 스펙트럼에 의해 정제된 펩타이드의 특성을 밝혔다. 이론적인 평균 MW는 2500.7Da이고 실측치는 2500.4Da이다.
B/HA0-22의 OMPC로의 접합
iOMPC 출발 물질(150mg)을 먼저 초원심(Ti-70 로터, 50,000RPM, 45분, 4℃) 및 10mg/ml의 농도로 다운스 균질화/재현탁에 의해 질소 주입된 멸균 여과 CM761(0.11 붕산나트륨, pH 11.3)으로 전달하였다. 당해 다백질을 이어서 EDTA-DTT 용액(CM761중의 0.57g EDTA/g OMPC, 0.11g DTT/g OMPC)과 함께 N-아세틸 호모시스테인 티올락톤(NAHT)(질소 주입된 물중의 0.89g NAHT/g OMPC)을 사용하여 단백질을 티올화시켰다. 당해 티올화 반응을 실온(약 20℃)에서 4시간동안 진행시켰다. 이어서 티올화된 iOMPC를 2회 초원심(50,000 RPM, 45분, 4℃) 및 다운스 균질화/재현탁 단계에 의해 25mM의 붕산나트륨으로 전달하였다. 티올화 말기에, 로우리 분석법 및 엘만 분석법을 다음 단계로 진행하기 전에 수행하였다. 티올화된 OMPC의 티올 함량은 0.25μmol 티올/mg이었다.
먼저 65mg의 B/HA0-22를 5mg/ml의 농도로 25mM의 붕산나트륨(pH 8.0)에 용해시켰다. 이어서, 펩타이드 용액의 pH를 1N NaOH를 사용하여 8.0으로 재조정함에 이어서 0.22 마이크론 멸균 필터로 여과하였다. (1.2g의 펩타이드/g OMPC의 질량 하전 비에서) 티올화된 OMPC 53mg을 약간 혼합하면서 펩타이드 스톡 용액에 적하하였다. 접합 반응을 교반 없이 실온에서 15.5시간동안 진행시켰다.
접합 반응의 말기에, 접합체 용액을 각각의 작동 용적이 5mL인 6개의 300kD MWCO 분산투석기에 이동시켰다. 3개의 분산투석기를 각각 3.5 내지 4L의 멸균 여과수를 갖는 4L 비이커에 놓는다. 접합체 및 멸균 여과수 3.5 내지 4L 둘다를 함유하는 각각의 4L 유리 비이커를 3인치 자기 교반 막대 및 조절 가능한 속도 교반 플레이트를 사용하여 약간 교반시켰다. 최소 6시간마다 한번 갈아줄어 총 5회의 투석을 수행하여 반응 부산물 및 과량의 유리 펩타이드를 제거하였다.
최종 접합체를 A/H3/HA0-2에 대해 기재된 바와 같이 로우리 분석법 및 아미노산 분석법에 의해 분석하였다. 당해 분석으로 6500몰 펩타이드/몰 OMPC의 B/HA0-22의 수준을 수득하였다.
실시예 17
HA0펩타이드-OMPC 접합체로 백신 접종된 마우스에서 A형 인플루엔자 바이러스를 사용한 마우스 시험 감염 실험
암컷 Balb/c 마우스를 OMPC에 접합된 HA 펩타이드 접합체를 사용하여 근육내로 면역화시켰다. HA0-21(H1) 및 HA0-22(H3)을 사용한 실험에서, 접합을 위해 사용되는 화학물질은 티올화된 OMPC 및 브로모아세틸화된 펩타이드이다. HA0-25(H3L) 및 HA0-25(H1)을 사용한 실험에서, 사용되는 화학물질은 말레이미딜-OMPC 및 시스테이닐-펩타이드였다. 표준 절차를 사용한 제형화를 위해 접합체를 정제하고 제조하였다.
모든 백신을 머크 알룸 또는 QS21 보조제 20㎍과 제형화하고 마우스당 1회 주사로서 100ul의 용적으로 투여하였다. 당해 마우스를 0주, 2주 및 4주에 백신 접종하였다. 마우스의 비강내로 7주째에 치사량의 인플루엔자 바이러스 PR8 또는 HK를 시험 감염시켰다. 데이터는 하기에 나타낸다.
HA 펩타이드/OMPC 접합체 백신을 사용한 마우스 시험 감염 실험
백신 보조제 백신 용량a 생존 대조군 생존 시험 감염 바이러스
A/H1/HA0-21 알룸 1㎍ 5/10 0/10 PR8(H1)
A/H3/HA0-22 알룸 1㎍ 1/10 1/10 HK(H3)
A/H1/HA0-25 알룸 1㎍ 6/10 0/10 PR8(H1)
A/H3(L)/HA0-25 QS21 4㎍ 7/10 1/10 HK(H3)
A/H3(L)/HA0-25 알룸 1㎍ 2/10 1/10 HK(H3)
A/H3(L)/HA0-25 알룸 3㎍ 4/10 1/10 HK(H3)
A/H3(L)/HA0-25 QS21 3㎍ 7/10 1/10 PR8(H1)
a 각각의 펩타이드-OMPC 접합체 제형내 펩타이드의 양
혈청 샘플을 수거하고 상기된 바와 같이 표준 ELISA 포맷으로 분석하였다.
ELISA 역가
백신 서열 ELISA 역가 서열번호
A/H1/HA0-21 BrAc-GPSIQSRGLFGAIAGFIEE-OH 9 x 105 63
A/H3/HA0-22 BrAc-EGPEKQTRGIFGAIAGFIEE-OH 2 x 107 64
A/H1/HA0-25 Ac-CEGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGE-OH 4 x 105 61
A/H3(L)/HA0-25 Ac-CEGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGE-OH 3 x 107 62
실시예 18
OMPC에 접합된 B형 인플루엔자 바이러스 기원의 HA0 펩타이드로 백신 접종된 B형 인플루엔자 바이러스를 사용한 마우스 시험 감염 실험
인플루엔자 B HA0 접합체를 상기된 바와 같이 제조하였다(상기 실시예 참조). B형/HA0-22 EGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE(서열번호 60) 펩타이드-OMPC 접합체를 위해 사용되는 접합은 티올화된 OMPC에 접합된 브로모아세틸 펩타이드이다.
암컷 Balb/c 마우스를 근육내로 0주 및 28주째에 머크 알룸중에 제형화된 1, 10, 100 또는 1000ng의 B/HA0-22(제제내 접합체의 펩타이드 함량을 기준으로 ng)으로 면역화시켰다. 혈청 샘플을 2주 및 4주째에 수거하고 HA0 특이적 항체 역가에 대해 ELISA로 측정하였다.
제2 면역화 3주 후에, 마우스의 비강내로 마우스 적응된 B형 인플루엔자 바이러스,B/Ann Arbor/54 LD90(90% 마우스 치사량)을 투여하였다. 이후 20일동안 마우스를 생존 및 체중 변화에 대해 모니터한다.
B/HA0-OMPC 접합체 백신은 강력한 HA0-특이적 항체 반응을 유발하였다(도 22A). 항체 반응은 용량 의존성이다. 백신 1ng은 감지할만한 HA0-특이적 항체 역가를 유발할 수 있고 1000ng의 백신은 약 100만의 역가를 유발하였다.
B/HA0-OMPC 접합체 백신은 또한 치명적인 바이러스 시험 감염에 대해 매우 효과적이다. 생존 곡선에서 보여지는 바와 같이(도 22B), 10ng, 100ng 또는 1000ng의 B/HA0-OMPC를 투여받은 마우스는 100%의 생존율을 보여주고 1ng의 백신을 투여받은 마우스는 70%의 생존율을 갖는다. 예상된 바와 같이 천연 대조군은 90% 치사율을 나타내었다. B/HA0-OMPC 백신은 또한 체중 감량에 대해 상당히 보호해줌을 보여주었다. 예를 들어, 100ng 또는 1000ng의 백신을 투여받은 마우스는 대조군 마우스에서 30%의 체중 감소와 비교하여 단지 10%의 최대 체중 감소를 가졌다.
생체내 바이러스 복제에 대한 인플루엔자 B 백신의 효과는 준치명적 시험 감염 모델에서 시험되었다. 마우스를 4주 간격으로 2회 면역화시키고 준치사량의 B/Ann Arhor/54를 시험감염시켰다. 비강 및 폐 세척액을 1일, 3일, 5일 및 7일째에 수거하였다. 백신 및 대조군은 비강 바이러스 발산 관점에서 어떠한 명백한 차이를 나타내지 않았다. 그러나, 대조군과 비교하여 면역화된 마우스에서 폐 바이러스 발산이 상당히 감소하였다(도 23).
실시예 19
A/H3/HA2 펩타이드-KLH 접합체로 백신 접종된 마우스에서 A형 인플루엔자 바이러스를 사용한 마우스 시험 감염 실험
펩타이드의 N 말단으로 시스테인 잔기를 첨가하여 말레이미드 활성화된 KLH와의 반응을 위한 티올 그룹을 제공하여 A/H3/HA2-6-KLH 접합체(KIDLWSYNAELLVALENQHT(서열번호 59))를 제조하였다. 그룹당 10마리의 Balb/c 마우스를 0주, 3주 및 5주째에 피하내로 20 QS21중의 A/H3/HA2-6-KLH 20ug으로 면역화시켰다. 마지막 면역 2주 후에, 마우스의 비강내로 인플루엔자 HK 재분류물 LD90을 시험 감염시켰다. HA6-KLH는 치명적인 시험 감염에 대해 부분적인 보호를 나타내었다. 예를 들어, 시험 감염 후, 대조군 그룹은 90%의 치사율을 나타내는 반면 백신 그룹은 60%의 치사율을 나타내었다. 추가로, 백신을 투여받은 마우스는 대조군 보다 덜한 체중 손실을 보여주었다(도 24).
실시예 20
M2 펩타이드의 HPV VLP로의 접합
16형 HPV VLP를 문헌[참조: Tobery et al., 2003]에 기재된 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애로부터 발현시키고 정제하였다. 본 연구에 사용되는 항원은 표준 t-Boc 고형상 합성에 의해 제조된 합성 25 잔기 M2-펩타이드이다. 펩타이드의 서열은 인플루엔자 바이러스 주 A/Aichi/470/68(H3N1)내 M2 단백질의 세포외 절편인 Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD-Aha-C-NH2(서열번호 2)이고 비천연 아미노산인 6-아미노헥산산(Aha)를 포함한다.
항원-캐리어 접합
L1 단백질 농도 14μM에서 50mM NaHCO3 pH 8.4중의 HPV VLP를 sSMCC/L1 단백질의 최종 비가 약 100이 되도록 시판되는 이종이작용성 가교링커인 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(sMCC)(PIERCE ENDOGEN, ROCKFORT, IL)과 혼합하였다. 반응을 2 내지 8℃에서 1시간동안 진행시킴에 이어서 10mM 히스티딘, 0.5M NaCl, 0.015%의 폴리소르베이트 80을 함유하는 pH 6.2의 완충액에 대해 투석하여 sSMCC-활성화된 HPV VLP를 제조하였다. 말레이미드 등가물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 DTNB 분석법으로 측정하였다. N2 주입된 완충액중에 용해된 M2 펩타이드를 티올/말레이미드(몰/몰)의 비가 약 3이 되도록 sSMCC-활성화된 HPV VLP와 혼합하였다. 또한, 활성화된/켄칭된 HPV VLP(A/Q HPV VLP)를 티올/말레이미드(몰/몰)의 비가 약 10이 되도록 sSMCC-활성화된 HPV VLP와 N-아세틸시스테인과 혼합하여 제조하였다. 당해 반응을 2 내지 8℃에서 약 15시간동안 진행하였다. 이어서 2개의 샘플을 β-머캅토에탄올로 처리하여 임의의 과량의 말레이미드를 켄칭하였다. 최종적으로 샘플을 0.5M NaCl 및 0.015% 폴리소르베이트 80에 대해 투석(분산투석기 MWCO 300,000 SPECTRUM INDUSTRIES INC., RANCHO DOMINGUEZ, CA)하였다. 접합전에 HPV VLP중의 유리 티올이 요오도아세트아미드로 켄칭되는 경우 유사한 결과를 수득하였다.
VLP당 단백질 농도 및 펩타이드 로딩 측정
용액내 단백질의 농도를 열량계 비신초닌산(BCA) 분석법으로 측정하였다. VLP당 펩타이드 로딩을 아미노산 분석법으로 측정하였다. 샘플을 110℃에서 6N HCl중에서 70시간동안 가수분해함에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 처리 후 정량하였다(AAA SERVICES INC., BORING, OR). 펩타이드의 양을 Aha 함량을 참조하거나 문헌[참조:Shuler et al., 1992]에 기재된 과정을 기본으로 하는 분석법을 수행하여 측정하였다. 양 방법으로 유사한 결과를 수득하였다.
바이러스형 입자상으로의 항원 펩타이드 로딩
HPV VLP상으로의 펩타이드 로딩은 펩타이드내 비천연 아미노산(Aha, 6-아미노헥산산)을 정량하거나 데이터의 다중 회귀 최소-스퀘어 분석법[문헌참조: Shuler et al. ,"A simplified method for determination of peptide-protein molar ratios using amino acid analysis", J. Immunol. Meth. , Vol. 156 pp. 137-149,1992]에 의한 아미노산 분석법을 사용하여 측정하였다. 양 방법은 펩타이드 로딩이 L1 단백질당 약 11개의 펩타이드임을 지적하였다. 총 로딩이 VLP당 약 4,000개의 펩타이드가 되게하는 HPV VLP(1개의 VLP는 72개의 L1 단백질 오량체 또는 캡소머를 함유한다)내에 360개 카피의 L1 단백질이 존재한다. 당해 수치는 이전에 보고된 소 파필로마 바이러스 입자상에 운반되는 펩타이드 총 수 보다 상당히 크다(문헌참조: Chackerian et al., 2001). 소 파필로마바이러스 경우에, 항원 펩타이드를 스트렙트아비딘(SA)과 융합시키고 융합 작제물을 비오틸화된 VLP와 반응시켰다. VLP의 L1 단백질은 약 1.5 SA 사량체를 수용하여 L1 단량체당 약 약 6개의 펩타이드 비율이 되도록 한다. 당해 로딩은 본 발명의 M2 펩타이드의 HPV VLP로의 접합에서 관찰되는 로딩의 약 절반이다. SA 사량체의 용적 크기는 보고된 경우에서의 보다 높은 항원 로딩을 배제할 수 있다.
접합 효율은 sSMCC에 의해 활성화된 초기 부위가 얼마나 많이 펩타이드 커플링을 유도하는가를 측정함에 의해 모니터할 수 있다. 아미노산 분석법은 가수분해 과정에서 sSMCC 가교 링커의 생성물인 TXA(트라넥삼산)의 정량적인 평가를 제공할 수 있다. TXA의 측정된 평균 양은 L1 단백질 당 약 19개의 활성화된 부위임을 지적하고 이것은 활성화된 몇몇 부위가 펩타이드 커플링에 관여함을 시사한다. 몇몇 활성화된 부위는 Cys, Lys 또는 His의 인접 측쇄와 상호작용하여 단백질을 가교결합시킬 수 있다. 본 발명자는 M2 HPV VLP와 활성화된/켄칭된(A/Q) HPV VLP 둘다가 70℃에서 변성 용액 처리에 대한 10분 노출에도, 환원 조건하에 10%의 SDS-Bis-트리스 겔을 침투할 수 없음을 관찰하였다. 비활성화된 HPV VLP는 겔로 로딩하기 전에 동일한 조건하에 처리후에 예상되는 이동성의 단백질 밴드를 제공한다. 따라서, 말레이미드 활성화 후에 상당한 내부 VLP 가교 결합이 일어나는 것으로 나타난다. 하기에서 밝혀지는 바와 같이, VLP 크기 측정은 VLP의 입자 크기 분포상의 내부 VLP 가교 결합의 영향이 무시될 수 있음을 지적한다.
HPV VLP의 표면상의 항원 펩타이드의 공간 분포를 고려하는 경우, Lys 측쇄의 1급 아민은 sSMCC의 활성화를 위해 가장 유망한 부위이다. 16형 HPV의 L1 단백질에는 34개의 Lys가 있고 이들 라이신중에 9개가 C 말단에 위치하고 있다. 도 25에 보여지는 분자 모형은 16형 HPV VLP상의 추정 활성화 부위가 VLP 표면상에 고르게 분포되어 있음을 보여준다. 도 25에 제공된 Lys 잔기의 NZ 원자는 VLP 외부 방향으로 배향되어 있다. Lys 230을 제외하고는 모든 Lys 잔기는 용매에 노출된 표면의 25% 이상을 차지한다. C-말단 지역은 매우 유동성이고 프로테아제의 작용을 받기 쉬워 당해 지역에 위치하는 Lys의 측쇄는 활성화를 위해 가용적임을 능히 짐작할 수 있다. 불행하게도, C 말단 영역은 X선 구조에 나타나지 않았다[문헌참조: Chen et al., 2000).
실시예 21
M2-HPV VLP 접합체의 약제학적 특성 분석
전자 현미경 측정은 고배율의 JEOL 1200 EX 투과 전자 현미경을 사용하는 전자 현미경 바이오서비스(MONROVIA, MD)를 사용하여 수행하였다. 공기 건조된 샘플을 2%의 포스포텅스트산으로 염색하였다. 역학적 광 산란 측정을 90°및 실온에서의 검출과 함께 Malvern 4700 장치에 대해 수행하였다. 출력 전력은 0.25W이고 100의 열극이고 총 단백질 농도는 0.1mg/ml이다. 보고된 당해 크기는 동일한 샘플에 대해 5회 연속 측정에서 수득한 데이터의 단일방식의 분석으로부터 수득한 바와 같이 Z 평균 유체역학 직경을 나타낸다. HPV VLP 또는 M2-HPV VLP 접합체 용액의 탁도에서 열 유도 증가는 89090A형 열 조절기를 장착한 분광기 HP 8453상에서 모니터하였다. 350nm에서의 광학 밀도의 변화를 분당 약 1.5℃의 속도로 24℃에서 74℃로 증가된 온도로서 기록하였다. 침강 속도 실험을 로터 An6Ti 및 이중-섹터 셀을 사용하는 분석학적 초원심 벡크만 XL-I상에서 수행하였다. 로터 속도는 10,000rpm이고 경계선 이동은 280nm 흡광도에 의해 관찰되었다. 데이터는 프로그램 DCDT + (http://www.jphilo.mailway.com)을 사용하여 분석하였다. SEC-HPLC는 Shodex OHpak SB-805 칼럼을 장착한 HP 1100 시스템 및 25mM의 포스페이트, 0.75M NaCl을 함유하는 용출 완충액(pH 7.0)을 사용하여 수행하였다.
역학적 광 산란(DLS) 측정은 비처리된 HPV VLP 캐리어에 대한 약 60nm에서 접합체(M2-HPV VLP)에 대해 약 80nm로 M2-HPV VLP의 평균 입자 크기가 약간 증가하였음을 지적한다. A/Q HPV VLP는 평균 유체역학 크기가 약 65nm임을 밝히고 이 수치는 비처리된 캐리어의 크기에 매우 인접한 것이다. SEC-HPLC 결과(도 26A)는 A/Q 또는 비처리된 HPV VLP와 비교하여 보다 짧은 체류 시간에 용출하는 주요 피크 M2-HPV VLP 접합체를 제공하고 이것은 A/Q 또는 비처리된 HPV VLP의 크기 보다 큰 접합체의 평균 크기에 상응한다. 크로마토그램에서 작은 쇼율더(Shoulder)는 접합 전 및 후에 응집된 물질 소분획이 존재함을 밝힌다. 최종적으로, 침강 속도 데이터(도 26B)는 비처리된 또는 A/Q HPV VLP의 값 보다 큰 s* 값에 집중된 M2-HPV VLP에 대한 침강 계수의 분포를 나타낸다. 단독의 캐리어와 비교하여 접합체의 침강 계수의 약간의 증가는 DLS 및 크로마토그래피 측정에 의해 밝혀진 바와 같이 응집시 크기가 약간 증가한 것과 일치한다. 전체 결과는 또한 어떠한 상당한 내부 VLP 가교 결합(및 잠재하는 응집)이 접합 과정동안에 일어나지 않음을 시사한다.
EM에 의해 관찰된 M2-HPV VLP 접합체는 평균이 약 65nm인 40 내지 95nm의 크기 분포를 제공한다. 당해 값은 비처리된 HPV VLP의 값에 매우 인접한 것이다. 그러나, 비접합된 캐리어와는 대조적으로, 접합체는, 접합된 펩타이드의 존재때문일 수 있는 M2-HPV-VLP내에서 "보풀모양의 외형"을 갖는 것으로 밝혀졌다. EM 이미지로 나타낸 다중-VLP 응집체는 또한 HPV VLP에 대해서 관찰되었고 따라서 이들은 EM 측정을 위한 샘플 조작의 결과일 수 있고 용액내 샘플을 나타내는 것이 아니다. 결론적으로 EM 결과는 HPV VLP의 형태가 보존되고 HPV VLP 스캐폴드의 주요 붕괴가 화학적 접합 과정동안에 일어나지 않음을 지지한다.
처리되고 비처리된 HPV VLP 또는 접합체에 대한 용액 탁도 분석에 의해 측정된 열 유도 응집에 대한 프로필은 도 28에 나타낸다. 비처리된 HPV VLP에 대해, 열 유도된 응집(광 산란으로 인한 광학 밀도의 증가에 의해 밝혀진 바와 같이)은 60℃에서 검출가능하고 온도가 추가로 증가하는 경우 순간적으로 증가한다. A/Q VLP 또는 M2-HPV VLP 접합체에 대해, 용액의 탁도는 70℃ 미만에서 검출가능한 응집을 제공하지 못한다. 열 유도된 응집에 대해 증진된 안정성이 sSMCC 처리에 의해 유도된 내부 VLP 가교 결합덕택일 가능성이 높다. sSMCC를 통해 형성되는 추가의 내부 VLP 결합은 L1 단백질이 부분적으로 풀어져 소수성 표면이 노출되는 것을 차단할 수 있다. 접합 또는 sSMCC 처리는 HPV VLP의 표면 성질을 변화시키고 이것이 캐리어 안정성 증가에 부분적으로 기여할 수 있음은 주지할 만한다.
실시예 22
M2-HPV 접합체의 시험관내 항원성 분석
항-HPV 및 항-M2 항체와의 접합체 상호작용에 대한 검출
M2 또는 16형 HPV에 특이적인 항체에 대한 16형 HPV VLP 및 M2-HPV VLP 접합체의 결합은 비아코어 2000 장치상의 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여 평가하였다. 항-HPV 항체(입체적 항체 H16.V5, H16E70 및 선형 에피토프 결합 항체 H16.J4) 및 항-M2 항체는 CM5형 센서 칩의 표면상에 화학적으로 고정화된 래트 항 마우스 Fcγ 항체에 결합시켰다.
항원의 공간 분포는 추가로, 선형 및 입체적 항-HPV 마우스 항체(mAB)로의 M2-HPV VLP 접합체 및 A/Q HPV VLP의 결합을 측정함에 의해 조사하였다. 입체적 또는 중화 항체 H16.V5 및 H16.E70의 결합 친화성은 급격하게 감소하는 반면 선형 항체 H16J4로의 결합은 접합시 단지 약간 영향받는 것으로 밝혀졌다. 입체적 항체 H16.V5 및 H16.E70의 결합에 관여하는 에피토프는 Phe 50(문헌참조: White et al., "Characterization of a Major Neutralizing Epitope on Human Papillomavirus Type 16L1", J. Virol., Vol 73(6), pp. 4882-4889, 1999)을 포함한다. 도 25에 나타낸 바와 같이, Phe 50 양 측면에서는 6개의 Lys 잔기가 존재한다. Phe 50 주변의 Lys 잔기중 임의의 하나의 잔기로 펩타이드의 접합은 항체 결합을 방해할 가능성이 있다. H16.J4는 VLP내 L1 단백질 상부위의 루프와 결합한다. 당해 루프를 따라 단지 하나의 Lys가 존재하고 이것은, H16.J4로의 결합이 M2-HPV VLP내에서 변화되지 않기때문에 펩타이드와 접합되지 않을 수 있다.
한가지 문제는 펩타이드가 올바른 3-D 구조로 캐리어 표면상에 제시되느냐하는 것이다. M2 단백질은 인플루엔자 A 바이러스의 통합 막 단백질이고 선택된 항원 서열은 M2의 세포외 부분을 제시한다. M2 단백질은 2개의 디설파이드 결합 이량체에 의해 형성되는 동종사량체이고[문헌참조: Tian et al. 9 6Initial structural and dynamic characterization of the M2 protein transmembrane and amphipathic helices in lipid bilayer", Prot. Sci., Vol. 12, pp. 2597-2605, 2003], 본 발명자의 지식 범위내에서 어떠한 세부적인 3D 구조가 M2의 세포외 절편에 대해 문헌에 보고되지 않았다. CD 및 형광 측정은 용액내 비접합 펩타이드는 주로 무작위 구조 배위로 존재함을 시사한다. 이들 발견이 VLP 표면상의 한정된 구조적 배위로의 펩타이드 제시가 불가능할 것 같이 보이게 하지만 표면 플라스몬 공명에 의해 수득한 예비 결과는 M2-HPV VLP 접합체가 항-M2 항체 L18.H12 및 P6.C8에 결합함을 지적한다. 항-M2 항체에 어떠한 결합도, HPV VLP 또는 (A/Q)HPV VLP과 함께 유사한 조건하에서 검출되지 않음을 지적한다.
실시예 23
생체내 면역학적 평가
4주 내지 10주된 암컷 Balb/c 마우스를 기관[CHARLES RIVER LABORATORIES(Wilmington, MA))로부터 구하였다. 상이한 펩타이드 용량에서 머크 알룸 보조제(MAA)상에 흡착된 M2-HPV VLP는 4주 간격의 2회 주사로 0.1mL의 I.M으로 전달하였다. 제2 주사 3주 후에 마우스를 시험 감염시켰다. 3, 30 및 300ng의 펩타이드 용량은 HPV VLP 약 5, 50 및 500ng에 상응한다. 각각의 주사 후에 전달되는 MAA의 용량은 45mcg이다. 항-M2 기하학적 평균 역가는 각각 주사후 2주째에 측정하였다. M2 항체 ELISA를 위해, 96웰 플레이트를 4℃에서 50mM 바이카보네이트 완충액(pH 9.6)중 ml당 4㎍의 농도로 M2 펩타이드를 웰당 50㎕로 밤새 피복하였다. 플레이트를 인산 완충된 식염수(PBS)로 세척하고 0.05% 트윈 -20(밀크-PBST)을 함유하는 PBS중의 3% 스킴 밀크로 차단하였다. 처리 샘플을 4배 연속으로 PBST중에 희석시켰다. 100㎕의 희석 샘플을 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 2시간동안 24℃에서 항온처리하였고 이어서 PBST로 세척하였다. 밀크-PBST중의 HRP-접합된 2차 항체의 예비 측정된 희석액 50㎕를 웰당 첨가하고 플레이트를 1시간동안 24℃에서 항온처리하였다. 플레이트를 세척하고 100mM 나트륨 시트레이트(pH 4.5)중의 1mg/ml의 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 100㎕를 웰당 첨가하였다. 24℃에서 30분 항온처리 한 후, 웰당 100㎕의 1N H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시키고 플레이트를 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 490nm에서 판독하였다. 항체 역가를 접합체 대조군 웰의 평균 + 2개의 표준 오차 이상의 OD490nm의 값을 제공하는 가장높은 희석의 역수로서 정의하였다. 바이러스 시험 감염을 위해, PR8과 A/Aichi/68(H3N2)사이의 재분류물인 마우스 적응된 A/Puerto Rico/8/34(PR8; H1N1) 및 X-31을 10일된 배아 형성된 요막 유체중에서 번식시켰다. LD90이 1인 20㎕의 바이러스를 비강에 주입시켰다. 시험 감염 후, 마우스 생존율을 매일 기록하였다. 치사율은 다음과 같이 계산하였다: (특정일에 마우스의 수/0일에 마우스의 수) x 100%.
각각의 면역화 2주후에 채취한 혈액 샘플에 대한 ELISA 측정 결과는 당해 접합체가 높은 항-M2 항체 반응을 유발함을 지적한다(도 29A). M2 펩타이드 용량이 3에서 300ng으로 증가함으로써 역가가 대칭적 방식으로 증가하지만 최저 및 최고 용량간의 역가 차이는 1 로그 유니트 범위내에 있다. 이들 결과는 ng 용량의 항원 펩타이드가 적합한 캐리어상으로 제공되는 경우 상당한 면역 반응을 유도할 수 있음을 지적한다. M2 펩타이드가 상기된 바와 같이 나이제리아 메닌기티디스 외막 단백질 복합체(OMPC)인 보다 큰 크기의 캐리어상에 접합되는 경우 마우스에서 유사한 역가가 관찰됨이 주목할만하다.
치명적인 시험 감염에 대한 마우스의 생존율은 도 29B에 나타나 있다. 최저 용량의 펩타이드(3ng)을 투여받은 그룹은 단지 60%의 생존율을 나타내는 반면 보다 큰 용량의 30 또는 300ng의 펩타이드를 사용한 그룹내 보호는 100%이다. 대조군 그룹에 대해서는 시험 감염 후 어떠한 생존도 관찰되지 않았고 이것은 바이러스 시험 감염 및 백신 보호 모두가 효과적임을 확증한다. 상기 M2-OMPC 접합체 백신에 대해서 관찰되는 바와 같이, 몇몇 체중 손실이 100% 생존율을 갖는 그룹내에서도 시험 감염후 관찰되었다. 결론적으로, M2-HPV VLP 접합체 백신을 사용한 Balb/c 마우스의 백신 접종은 생바이러스 시험 감염에 대해 동물을 효과적으로 보호한다.
캐리어-유도된 에피토프 특이적 억제는 문헌[참조: Rauly et al., 1999]에 기재되었다. 따라서, 미래의 실험은 접합체의 면역원성이 생체내에서 항-캐리어 항체의 존재에 의해 어떻게 영향받는지를 측정해야만한다. M2-OMPC 접합체 백신을 사용한 실시예 26에 제공된 실험은 캐리어로의 예비 노출이 인플루엔자 펩타이드 접합체 백신에 대한 반응을 차단하지는 않지만 단지 약하게 감소시켰음을 지적한다. 그러나, 후속적인 부스트는 캐리어에 대해 이미 존재하는 항체의 임의의 해로운 효과를 극복하게 할 수 있음을 시사한다.
캐리어로의 예비 면역이 항체 반응에 손상을 주는 것으로 밝혀진 압도적인 수의 경우에도 불구하고 항-캐리어 항체의 존재가 단순히 접합체 백신의 면역원성에 역효과를 갖는다고 제안할 수 없다. 캐리어에 대한 우선적인 면역(파상풍 독소)이 항-hCG(사람 융모성 성선자극호르몬(문헌참조: Shah et al.,"Prior immunity to a carrier enhances antibody responses to hCG in recipients of an hCG-carrier conjugate vaccine", Vaccine, Vol. 17, pp. 3116-3123,1999)) 또는 말라리아 펩타이드[문헌참조: Lise et al. ,"Enhanced epitopic response to a synthetic human malarial peptide by preimmunization with tetanus toxid carrier", Infect. Immun., Vol. 55, pp. 2658-2661, 1987] 반응에 이로울 수 있는 것으로 보고되었다. 인플루엔자 펩타이드 에피토프의 캐리어로서 재조합 플라겔라를 기재하는 상이한 경우에, 캐리어에 대한 예비 노출 효과가 없는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Ben-Yedidia and Amon,"Effect of pre-existing immunity on the efficacy of synthetic influenza vaccine', Immunol. Lett. , Vol. 64, pp. 9-15,1998]. HPVVLP의 경우에, 미처리된 형태(항-HPV 백신으로서) 또는 처리된 형태(상이한 항원을 제공하는 캐리어로서)의 담체에 미리 노출된 동물 모델에 어떠한 차이가 있는지 아직 결정되지 않았다. 75% 이상의 반응성 사람 혈청이 H16.V5 항체에 의해 완전히 차단되는 것으로 밝혀졌다[문헌참조: Wang et al. ,"A monoclonal antibody against intact human papillomavirus type 16 capsids blocks the serological reactivity of most human sera", J. Gen. Virol. , Vol. 78, pp. 2209-2215,1997]. 접합된 M2-HPV VLP가 H16.V5 항체에 의해 결합된 입체적 에피토프를 나타낸다는 사실은 항원과 캐리어로서 HPV VLP사이에 화학적 접합을 통해 제조되는 백신에 대한 캐리어 억제가 HPV에 미리 노출된 대상체에 대해서는 별 문제가 되지 않음을 제안한다.
본원에 나타낸 M2-OMPC를 사용한 실험은 인플루엔자 바이러스 치명적 시험 감염에 대한 보호가 면역화된 동물 혈청을 투여함에 의해 수동적으로 전달될 수 있음을 입증하였고 이것은 중화 항체가 보호를 제공하기에 충분함을 지적한다. 동일한 항원이 HPV 캐리어에 접합되기 때문에, 유사한 체액성 반응이 M2-HPV VLP 접합체를 사용한 면역화에 의해 유발되는 것으로 예상된다. 세포 반응과 관련하여, 이전 실험은 16형 HPV VLP가 IL-4의 CD4+ T 세포의 생산에 의해 측정된 바와 같이 강한 Th2 반응을 유도함을 보여주었다[문헌참조: Tobery et al. ,"Effect of vaccine delivery system on the induction of HPV16 Ll-specific humoral and cell-mediated immune responses in immunized rhesus macaques", Vaccine, Vol. 21, pp. 1539-1547,2003]. 이것은 또한 HPV VLP에 의해 제공되는 비-입체적 항원 서열이 세포 매개되는 면역 반응을 증진시킬 수 있는 것으로 제안되었다[문헌참조: Greenstone et al., 1998].
실시예 24
헤마글루티닌-유래 펩타이드의 VLP로의 접합
펩타이드 시스-A/H3/HA0-22를 HPV VLP에 접합시켰다.
서열번호 명칭 펩타이드 서열 MW
113 Cys-A/H3/HA0-22 Ac-CEGPEKQTRGIFGAIAGFIEE-OH 2293
Cys-A/H3/HA0-22의 펩타이드 서열은 인플루엔 A 보존 서열, H3 서브타입의 헤마글루티닌 단백질 전구체 HA0의 절단 부위에 걸친 영역에 상응한다. 각각 N-말단에서 상이한 기능을 성취도록 요구되는 잔기가 굵게 표시되어 있다: 스페이서로서 글라이신, pI 변형 그룹으로서 글루탐산(본원에 기술된 바와 같음) 및 말레이미드 활성화된 HPV VLP 캐리어와 반응하여 티오에테르 결합을 통해 펩타이드-VLP 접합체를 제조하기 위한 리간드로서 시스테인; C 말단에 pI- 변형 그룹으로서 글루타메이트.
Cys-A/H3/HA0-22의 펩타이드 합성
파이오니어 펩타이드 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA)상에서 Fmoc/t-Bu 화학을 사용한 고형상에 의해 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드 C 말단 산을 형성하기 위해, 펩타이드를, 활성화제로서 DIPCDI/HOBt를 사용하는 4-하이드록시메틸페녹시아세트산 링커로 미리 유도체화된 챔피온 PEG-PS 수지(BIOSEARCH TECHNOLOGIES, INC., Novato, CA)상에서 합성하였다. 제1 아미노산인 글루타메이트를 DIPC(디이소프로필카보디이미드)를 사용하여 대칭 무수물로서 활성화시키고 촉매량의 DMAP(디메틸아미노피리딘)의 존재하에 수지에 에스테르 결합시켰다. 펩타이드 어셈블리 말기에 DMF중의 10배 과량의 무수 아세트산과 반응시켜 아세틸화 반응을 수행하였다.
모든 아실화 반응을 60분동안 수지 유리 아미노 그룹에 비해 4배 과량의 활성화된 아미노산과 함께 수행하였다. 동몰량의 HBTU(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 및 2배 몰 과량의 DIEA(N,N-디이소프로필에틸아민)으로 아미노산을 활성화시켰다. 일반적인 측쇄 보호 그룹은 다음과 같다: Asp, Glu, Ser, Thr 및 Tyr에 대해 3급 부틸; Cys, Asn, His 및 Gln에 대해 트리틸; Arg에 대해 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-설포닐; Lys, Trp에 대해 3급-부톡시-카보닐. 어셈블리 말기에, 무수 펩타이드 수질을 실온에서 1.5시간동안 88% TFA, 5% 페놀, 2% 트리이소프로필실란 및 5% 물로 처리하였다[문헌참조: Sole, N.A., and Barany, G.(1992) J, Org. Chem., 57, 5399-5403].
수지를 여과하고 용액을 냉각 메틸-t-부틸 에테르에 첨가하여 펩타이드를 침전시켰다. 원심분리 후, 펩타이드 펠렛을 새로운 냉각 메틸-t-부틸 에테르로 세척하여 유기 스캐빈저를 제거하였다. 당해 과정을 2회 반복하였다. 최종 펠렛을 건조시키고 H2O 및 20% 아세토니트릴중에 재현탁시키고 동결건조시켰다.
조 펩타이드를, 용출제로서 (A) 물중 0.1% 트리플루오로아세트산 및 (B) 아세토니트릴중 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하여 반-정제용 RCM 델타-PAKTM (WATERS, MILFORD, MA)C-18 카트리지(40 x 200mm, 15㎛)을 사용하는 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 본 발명자는 20분에 걸친 B: 30% - 45%의 농도 구배, 유속 80ml/분을 사용하였다. 분석용 HPLC는 20'분동안 B: 30% - 45%의 농도 구배, 유속 1ml/분과 함께 ULTRASHPERE(BECKMAN, FULLERTON, CA) C18 칼럼, 25 x 4.6mm, 5㎛상에서 수행하였다. 퍼킨-엘머(PERKIN-ELMER)(WELLESLEY, MA) API-100상에서 전자분무 질량 스펙트럼에 의해 정제된 펩타이드의 특성을 밝혔다. 이론적인 평균 mw는 2293.4Da이고 실측치는 2293.8Da이다.
펩타이드 Cys-A/H3/HA0-22의 HPV VLP로의 접합
HPV VLP 16 멸균 스톡 용액을 pH 6.2에서 0.5M NaCl, 20mM His 완충액, 0.026% PS80중에서 0.869mg/ml의 농도로 제조하였다. HPV VLP 스톡 용액 분취액 2.5ml을 4℃에서, 2L의 0.5M NaCl, 0.026 PS80의 의 완충액을 2시간 간격으로 6회 갈아주면서 300K MWCO 분산투석기(DISPODIALYZER)(SPECTRUM LABORATORIES INC., Rancho Cominguez CA)를 사용하여 투석하여 활성화 반응을 방해할 수 있는 His 완충액을 제거하였다. HPV VLP용액(0.474mg/ml, 4.58ml)에 최종 농도가 50mM(pH 8.2)가 되도록 0.5M NaHCO3(0.506ml)를 첨가하였다. 여기에, 가용한 VLP 라이신 잔기에 대해 4배 과량에 상응하는 20μM의 이종이작용성 가교링커 설포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(sSMCC, PIERCE CHEMICAL CO, ROCKFORD, IL) 0.156ml을 적가하였다. 4℃의 암실에서 2시간동안 당해 용액을 숙성시킨 후, 활성화된 HPV VLP를 4℃에서, 2L의 10mM His 완충액, 0.5M NaCl, 0.015%의 PS80의 완충액을 최소 2시간 간격으로 6회 갈아주면서 300K MWCO 분산투석기(DISPODIALYZER)(SPECTRUM LABORATORIES INC., Rancho Cominguez CA)를 사용하여 투석하여 과량의 시약을 제거하였다. 투석 후, 0.356mg/ml의 활성화된 HPV VLP(aVLP) 총 6.1ml을 회수하였다.
Cys 함유 펩타이드 리간드 Cys-A/H3/HA0-22의 0.5mg/ml 스톡 용액을 0.1M His, 0.5M NaCl, 0.015% PS80(pH 7.2)의 탈기 용액중에서 제조하고 0.2㎛로 여과하였다. 펩타이드 용액의 티올 함량은 엘만 분석(Ellman, G.L.(1959), Arch. Biochem. Biophys., 82, 70)으로 측정하고 -SH 역가가 218μM임을 보여주었다.
침전 없이 VLP상에 안전하게 혼입될 수 있는 펩타이드 최대량을 규명하기 위해, 먼저 VLP가 증가량의 펩타이드 리간드로 항온처리되는 소규모 시험에서 접합 반응을 수행하였다. VLP상에 혼입될 수 있는 최대 수의 말레이미드 그룹은 화학적 변형을 위해 가용한 외부 표면상에 보여지는 라이신 잔기 수에 의해 제한된다. L1 단백질의 X-선 구조 분석을 기초로, 0.36μmole의 라이신/mg VLP가 접합을 위해 가용될 수 있음을 밝혔다. VLP에 대한 평균 분자량이 20 x 106 Da임을 감안하면 이것은 7,200 라이신 몰/VLP 몰에 상응한다. 따라서, aVLP를 VLP 몰당 하기의 몰 과량의 펩타이드 리간드와 항온처리한다: 1000, 2000, 4000, 6000. 1시간 후, 당해 샘플을 VLP 샘플과 비교하여 임의의 침전 또는 탁도가 존재하는지를 조사하였다. 접합 반응은 1시간 항온처리 반응동안 1000(몰 Cys-펩타이드/VLP 몰)이하의 몰 과양이 사용되는 경우에만 가용성 생성물을 수득한다. 상기 비율 이상에서는 VLP 용액은 완전히 침전한다.
이들 관찰을 기초로, 대규모 반응을 수행하였다: 10mM His, 0.5M NaCl중의 3.5ml(1.25mg)에 56㎕의 NaOH 0.25M을 첨가하여 pH를 7.2로 상승시켰다. 여기에, VLP 몰당 1000몰 과량의 펩타이드 몰에 상응하는 펩타이드 스톡 용액 0.28ml을 약하게 볼텍싱시키면서 적가하였다. 말레이미드 활성화된 VLP 용액 샘플을 최종 접합체의 펩타이드 로딩을 측정하기 위한 블랭크로서 유지시켰다. 접합 반응 혼합물을 암실에서 4℃에서 17시간동안 숙성시켰다. 이어서 VLP상의 임의의 잔여 말레이미드 그룹을 4℃의 암실에서 1시간동안 최종 농도가 15mM(4㎕의 총 용적이 첨가됨)이 되도록 β-머캅토에탄올로 켄칭시켰다. 당해 용액을 4℃에서 1L의 0.5M NaCl, 0.015% PS80을 사용하여 5시간마다 갈아주면서 300K MWCO 분산투석기(DISPODIALYZER)(SPECTRUM LABORATORIES INC., Rancho Cominguez CA)로 4회 투석하여 비접합된 펩타이드 및 β-머캅토에탄올을 제거하였다. 당해 농도를 BCA-분석법(PIERCE CHEMICAL CO., ROCKFORD, IL)으로 측정하여 VLP-A/H3/HA0-22가 0.131mg/ml(4.5ml)임을 밝힌다.
접합체 및 aOMPC 샘플을 진공 밀봉된 유리 튜브에서 110℃에서 70시간동안 공비 HCl로 가수분해시켰다. 아미노산 조성을 아미노산 분석법으로 측정하였다. OMPC 단백질로의 펩타이드 접합 로딩은 접합체 아미노산 조성을 VLP 캐리어의 조성과 펩타이드 리간드의 조성 둘다와 비교하고 데이터의 다중 회귀 최소 스퀘어 분석법에 의해 측정하였다[문헌참조: Shuler et al., J. Immunol. Meth., 156, (1992) 137-149]. VLP와 A/H3/HA0-22간의 접합체에 대해, 770의 몰비를였다(펩타이드/VLP 몰/몰).
실시예 25
M2 접합체 백신에 의한 바이러스 발산의 억제
실시예 5에 기재된 바와 같이 M2 펩타이드 서열번호 1로 제조된 M2-KLH 접합체 백신에 대해 마우스 호흡기에서의 바이러스 복제에 대한 효과를 평가하였다(도 30). 그룹당 Balb/c 마우스를 0일, 14일 및 28일째에 20㎍의 접합체 백신 M2-KLH + 20㎍의 QS21(M2-KLH/QS21) 또는 20㎍의 QS21 단독(QS21)로 근육내 면역화시켰다. 제3 면역화한 후 3주째에 마우스의 비강내로 75 TCID 50의 A/HK/68 재분류물을 시험 감염시켰다. 시험 감염 후, 각 그룹으로부터 8마리의 마우스를 1, 3, 5, 7 또는 9일째에 희생시켜 비강 및 폐 세척액을 수거하였다. 각각의 시점에서 바이러스 역가를 측정하였다. 면역화된 마우스는 대조군 마우스 보다 비강 및 폐 샘플 둘다에서 총 바이러스 역가가 저하되었다. 바이러스 발산의 감소는 폐에서 보다 명백하게 나타났다. 대조군과 백신 접종체 사이의 폐에서의 바이러스 발산의 차이는 통계적으로 상당하였다(p < 0.05).
실시예 26
레서스 몽키에서의 M2 접합체 백신의 면역원성
실시예 5에서 제조된 바와 같이, M2 펩타이드 서열번호 2로 제조된 M2-OMPC 접합체는 비면역 및 OMPC 면역 레서스 몽기 둘다에서 시험하였다(도 31). 인가된 해모필러스 인플루엔자 백신(PEDVAXHIB, MERCK & CO., INC., WEST POINT, PA)을 포함하는 여러 세균성 폴리사카라이드 접합체 백신에 대한 캐리어로서 OMPC가 사용되어 왔다. 따라서, 당해 실험은 OMPC에 대해 기존의 면역성이 명백하게 flu 백신 효능에 영향을 줄 수 있는 지를 시험하였다.
30마리의 몽키를 각각 15마리의 몽키 2개 그룹으로 나누었다. 하나의 그룹에는 2회 사람 용량의 PEDVAXHIB를 예비 면역화시켜 항-OMPC 항체 반응을 유도하였다. PEDVAXHIB로 면역화된 몽키는 M2-OMPC 면역화 6주전에 14,703의 OMPC GMT를 나타내었다.
이어서 OMPC-면역화된 몽키 및 비면역 몽키를 각각 3마리의 몽키로 이루어진 5 그룹으로 나누고 알루미늄에 제형화된 10㎍, 30㎍, 100㎍ 및 300㎍의 M2-OMPC 접합체 백신(총 접합체 단백질을 기준으로 하는 용량) 또는 알루미늄 + QS21에 제형화된 100㎍의 백신을 사용하여 근육내 면역화시켰다. 면역화는 0-, 8- 및 25-주 스케줄을 사용하여 수행하였다. 33주 동안 4 내지 5주 간격으로 혈액 샘플을 채취하였다.
M2-OMPC 백신은 1회 면역화 후 상당한 M2 특이적 역가를 유발하였다. 이들 반응은 추가로 제2 및 제3 면역화 후 부스팅하였다. OMPC 면역화되고 OMPC 비면역 화된 몽키 둘다에서 어떠한 명백한 용량 효과가 없었는데 최소 투여량 10㎍에서 최대 용량 300㎍에 의해 유발된 역가에 필적하는 M2-특이적 역가를 유발하였다. 알루미늄 + QS21에 제형화된 백신은 단독의 알루미늄에 제형화된 동일 용량의 접합체 보다 5배 내지 10배 높은 항체 역가를 나타내었다. 추가로 알룸 + QS21중의 백신을 투여받은 몽키에서 항체 역가는 알룸 단독의 백신을 투여받은 몽키에서 관찰되는 것 보다 느린 감소율을 갖는 것으로 나타난다.
OMPC-면역화된 몽키와 OMPC-비면역화된 몽키를 비교하는 경우, 전자는 제1 주사 후 비면역 몽키보다 약 10배 낮은 역가를 나타내었다. 이것은 캐리어에 대한 기존 항체가 M2-OMPC 접합체 백신의 면역원성에 역효과를 나타냄을 지적한다. 그러나, 캐리어에 대한 기존 면역의 해로운 효과는 후속 부스트에 의해 극복되었다. 제2 및 제3 면역화 후, 2개의 연구 그룹은 필적할만한 항-M2 역가에 도달하였다. 따라서 당해 결과는 M2-OMPC 백신이 캐리어에 대한 기존의 항체 부재 또는 존재하에서 비사람 영장류에서 면역원성임을 보여준다. 별도의 몽키 연구에서, 본 발명자는 또한 PEDVAXHIB 및 M2-OMPC 접합체 백신의 동시 투여를 포함하는 섭생을 시험하였고 M2 펩타이드에 대한 총 항체 반응에 대해 역효과를 나타내지 않았다. 따라서, 당해 백신은 기타 OMPC 기본 접합체 백신에 이미 노출된 집단에 사용할 수 있다.
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 본원에 참조로서 인용되는, 2003년 3월 7일자 및 2003년 12월 18일자로 각각 출원된 미국 가출원 제60/452,749호 및 제60/530,690호에 대한 우선권을 주장한다.
<110> Merck & Co., Inc. Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. 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VIRUS <400> 118 Cys Glu Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gly Phe Ile Glu Glu 20 <210> 119 <211> 23 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 119 Cys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp 1 5 10 15 Thr Gly Met Ile Asp Gly Glu 20 <210> 120 <211> 34 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 120 Cys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp 20 25 30 Gly Glu <210> 121 <211> 25 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 121 Cys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp 1 5 10 15 Thr Gly Met Ile Asp Gly Lys Lys Glu 20 25 <210> 122 <211> 36 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 122 Cys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Glu 35 <210> 123 <211> 16 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 123 Cys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile 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Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe 1 5 10 <210> 152 <211> 10 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 152 Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly 1 5 10 <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 153 Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg 1 5 <210> 154 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 154 Ala Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 155 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 155 Glu Gly Ala Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 156 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 156 Glu Gly Pro Ala Ala Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 157 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 157 Glu Gly Pro Ala Lys Ala Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 158 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 158 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Ala Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 159 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 159 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Ala Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 160 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 160 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Ala Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 161 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 161 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Ala Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 162 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 162 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Ala Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 163 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 163 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Ala Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 164 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 164 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ala 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Glu 20 <210> 165 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 165 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Ala Leu Glu Glu 20 <210> 166 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 166 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Ala Glu Glu 20 <210> 167 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 167 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Ala Glu 20 <210> 168 <211> 22 <212> PRT <213> INFLUENZA VIRUS <400> 168 Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Leu Glu Ala 20

Claims (39)

  1. A형 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질의 세포외 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 다수의 펩타이드를 포함하고 이들 다수의 펩타이드가 캐리어 단백질의 표면에 공유 결합되어 있고 각각의 당해 결합이 펩타이드의 한쪽 말단과 당해 단백질 표면의 반응 부위 사이에 존재하는 M2 펩타이드-단백질 접합체로서, 캐리어 단백질이 나이제리아 메닌기티디스(Neiserria meningitidis)의 외막 단백질 복합체, 파상풍 독소, B형 간염 바이러스 표면 항원, 키홀 림펫 헤모시아닌, 로타바이러스 캡시드 단백질 및 소 또는 사람 파필로마 바이러스 VLP의 L1 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, M2 펩타이드-단백질 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염.
  2. 제1항에 있어서, 펩타이드 아미노산 서열이 서열번호 1, 2, 10 및 39로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
  3. 제2항에 있어서, 펩타이드가 서열번호 39의 서열을 갖는 접합체.
  4. 제1항에 있어서, 캐리어 단백질이 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체인 접합체.
  5. 제4항에 있어서, 펩타이드가 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖고 면역원성 단백질이 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체인 접합체.
  6. 제1항에 있어서, 펩타이드가 티오에테르 링커를 통해 단백질에 공유 결합되어 있는 접합체.
  7. 제1항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 보조제 및 생리학적으로 허용되는 이의 담체를 포함하는, A형 인플루엔자 바이러스에 의한 포유동물의 감염을 예방하거나 완화시키는 백신.
  8. 제7항에 있어서, 보조제가 알루미늄 함유 보조제를 포함하는 백신.
  9. 제7항에 있어서, 보조제가 알루미늄 및 QS21을 포함하는 백신.
  10. 제7항에 있어서, 펩타이드-단백질 접합체가 서열번호 39의 아미노산 서열을 갖는 다수의 펩타이드를 포함하고 단백질이 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체인 백신.
  11. 제1항에 따른 유효량의 접합체를 환자에게 접종하는 단계를 포함하는, 환자의 면역반응을 유도하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 환자가 사람인 방법.
  13. A형 인플루엔자 바이러스의 HA0 단백질 기원의 아미노산 서열을 갖는 다수의 펩타이드를 포함하고 이들 다수의 펩타이드가 캐리어 단백질의 표면에 공유결합되어 있고 각각의 결합이 펩타이드의 한쪽 말단과 당해 단백질 표면의 반응 부위 사이에 존재하는, HA0 펩타이드-단백질 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염.
  14. 제13항에 있어서, 펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 59, 60, 61 및 62로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 펩타이드가 서열번호 62의 서열을 갖는 접합체.
  16. 제13항에 있어서, 캐리어 단백질이 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체, 파상풍 독소, B형 간염 바이러스 표면 항원, B형 간염 바이러스 코어 항원, 키홀 림펫 헤모시아닌, 로타바이러스 캡시드 단백질 및 소 또는 사람 파필로마 바이러스 VLP의 L1 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 펩타이드가 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖고 면역원성 단백질이 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체인 접합체.
  18. 제13항에 있어서, 펩타이드가 티오에테르 링커를 통해 단백질에 공유결합되어 있는 접합체.
  19. 제13항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 보조제 및 생리학적으로 허용되는 이의 담체를 포함하는, A형 인플루엔자 바이러스에 의한 대상체의 감염을 예방하거나 완화시키는 백신.
  20. 제19항에 있어서, 보조제가 알루미늄 함유 보조제를 포함하는 백신.
  21. 제19항에 있어서, 보조제가 알루미늄 및 QS21을 포함하는 백신.
  22. 제19항에 있어서, 펩타이드-단백질 접합체가 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 다수의 펩타이드를 포함하고 단백질이 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체인 백신.
  23. 제13항에 따른 유효량의 접합체를 환자에게 접종하는 단계를 포함하는, 환자의 면역반응을 유도하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 환자가 사람인 방법.
  25. B형 인플루엔자 바이러스의 HA0 단백질 기원의 아미노산 서열을 갖는 다수의 펩타이드를 포함하고 이들 다수의 펩타이드가 캐리어 단백질의 표면에 공유결합되어 있고 각각의 결합이 펩타이드의 한쪽 말단과 당해 단백질 표면의 반응 부위 사이에 존재하는, HA0 펩타이드-단백질 접합체 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염.
  26. 제25항에 있어서, 펩타이드의 아미노산 서열이 서열번호 60 및 126 내지 168로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
  27. 제26항에 있어서, 펩타이드가 서열번호 60의 서열을 갖는 접합체.
  28. 제25항에 있어서, 캐리어 단백질이 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체, 파상풍 독소, B형 간염 바이러스 표면 항원, B형 간염 바이러스 코어 항원, 키홀 림펫 헤모시아닌, 로타바이러스 캡시드 단백질 및 소 또는 사람 파필로마 바이러스 VLP의 L1 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 접합체.
  29. 제28항에 있어서, 펩타이드가 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖고 면역원성 단백질이 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체인 접합체.
  30. 제25항에 있어서, 펩타이드가 티오에테르 링커를 통해 단백질에 공유결합되어 있는 접합체.
  31. 제25항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 보조제 및 생리학적으로 허용되는 이의 담체를 포함하는, B형 인플루엔자 바이러스에 의한 대상체의 감염을 예방하거나 완화시키는 백신.
  32. 제31항에 있어서, 보조제가 알루미늄 함유 보조제를 포함하는 백신.
  33. 제31항에 있어서, 보조제가 알루미늄 및 QS21을 포함하는 백신.
  34. 제31항에 있어서, 펩타이드-단백질 접합체가 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는 다수의 펩타이드를 포함하고 단백질이 나이제리아 메닌기티디스의 외막 단백질 복합체인 백신.
  35. 제25항에 따른 유효량의 접합체를 환자에게 접종하는 단계를 포함하는, 환자의 면역반응을 유도하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 환자가 사람인 방법.
  37. 제1항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 제13항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 보조제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 의한 환자의 감염을 예방하거나 완화시키는 백신.
  38. 제1항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 제25항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 보조제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 의한 환자의 감염을 예방하거나 완화시키는 백신.
  39. 제1항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 제13항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 제25항에 따른 하나 이상의 펩타이드-단백질 접합체, 보조제 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 의한 환자의 감염을 예방하거나 완화시키는 백신.
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