JP2024502823A - 安定なコロナウィルスタンパク質およびそのワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供されるのは、同じ発現、培養または貯蔵条件下で、対応する天然のまたは野生型コロナウィルススパイクタンパク質に比べて、高められた発現レベル、収率および安定性を有するそれらの変異コロナウィルス「Ｓ」スパイクタンパク質または受容体結合ドメインを含む組成物および方法である。これらの変異スパイクタンパク質は、１種または複数のコロナウィルスに対するタンパク質ベースワクチンを生成するために使用できる。【選択図】図４Ａ

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り １． 「Ｄｅｅｐ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ ｏｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ＡＣＥ２ ｂｉｎｄｉｎｇ」Ｔｙｌｅｒ Ｎ．Ｓｔａｒｒ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＲｘｉｖ） ２． 「Ｄｅｅｐ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ ｏｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ＡＣＥ２ Ｂｉｎｄｉｎｇ」Ｔｙｌｅｒ Ｎ．Ｓｔａｒｒ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ．Ｖｏｌｕｍｅ １８２，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｐ１２９５－１３１０）

政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所により認可されたＡＩ１４１７０７号に基づく政府の支援によりなされた。政府は、本発明に対し一定の権利を有する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月３１日に出願された米国仮出願第６３／１３２，８６３号、および２０２１年５月１４日に出願された米国仮出願第６３／１８８，６５１号に対し、米国特許法３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく利益を主張する。これらの仮出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明の分野は、タンパク質ベースワクチンの安定性を改善するための方法および組成物に関する。

コロナウィルスは、世界的流行の顕著な脅威を維持しており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウィルスによりもたらされた２０１９／２０２０年の世界的流行は、世界中で数十万人の死亡および大規模な景気減速を生じた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、現在の世界的流行が減少した後でも、永続的に伝染性を維持する可能性がある。従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または他の将来出現するコロナウィルスに対する効果的ワクチンが強く望まれる。

本明細書で記載の組成物および方法は、一部は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ「スパイク」タンパク質アミノ酸配列中の、発現タンパク質の収率および安定性を高める（同じまたは類似の培養条件下で）単一または対でのアミノ酸変異の発見に基づいている。この高められたスパイクタンパク質（本明細書では、「スパイクタンパク質由来抗原」とも呼ばれる）安定性は、野生型または天然タンパク質をベースにしたワクチンより長い貯蔵寿命を有するワクチンの産生を可能にする（同じまたは類似の貯蔵条件下で）。

従って、一態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、配列番号１のＲＢＤに比べて、少なくとも２つの変異をさらに含む非天然起源ポリペプチドであって、少なくとも２つの変異は、Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ、からなる群より選択されるか、またはＢｌａｓｔ－ｐ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）”Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）を用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある。一実施形態では、使用されるＢｌａｓｔ－ｐプログラムは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）オンラインアラインメントツールである。あるいは、Ｂｌａｓｔ－ｐプログラムは、装置にダウンロードして、ローカルで使用できる。当業者は、Ｂｌａｓｔ－ｐアラインメントツールの使用について容易に理解するであろうが、誤解を避けるために、オンラインおよびダウンロードしたアラインメントツールのために、それぞれプロトコル１およびプロトコル２が本明細書で提供される。

プロトコル１：米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）サーバーからのＢＬＡＳＴｐアラインメントオンラインで使用するためのプロトコル。
１．以下の設定を用いてＢＬＡＳＴアラインメントを準備する：
「２つ以上配列の整列」のためのオプションを使用する
「問い合わせ配列を入力」セクションに当該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のための参考株配列（即ち、配列番号１）を入力する
「対象配列を入力」セクションに任意の対応するコロナウィルススパイクタンパク質配列を入力する
アルゴリズム：ｂｌａｓｔｐ（タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ）
期待値の閾値：０．１
ワードサイズ：６
クエリー範囲内の最大マッチ：０
マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップコスト：
存在：１１
伸長：１
低複雑度領域のフィルター？：オフ
マスク：
ルックアップテーブルのみ？：オフ
小文字？：オフ
２．「ＢＬＡＳＴ」ボタンをクリックすることにより分析を実行
３．「アラインメント」タブをクリックし、２つの配列間のアラインメントを示す。
４．各配列の目的の位置に対し、「問い合わせ」配列に一致する数を特定する。次に、「問い合わせ」配列の位置に整列された「対象」配列中の対応する残基位置を特定する。

プロトコル２：ローカルコンピューターまたはサーバーにダウンロードしたタンパク質ＢＬＡＳＴｐアラインメントツールで使用するためのプロトコル。
１．製造業者の説明書を用いてコマンドライン実行のためにＢＬＡＳＴをインストールするか、またはすでにそれがインストールされているコンピューターまたはサーバーを特定する。
２．目的のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のためのサブタイプ特異的参考株（即ち、配列番号１）を含むＦＡＳＴＡフォーマットのファイルを生成する。下記のコマンドでは、このファイルは、「ｑｕｅｒｙ．ｆａｓｔａ」と命名される。
３．同じサブタイプ由来の異なるコロナウィルスの対応するタンパク質配列を含むＦＡＳＴＡフォーマットの第２のファイルを生成する。下記のコマンドでは、このファイルは、「ｓｂｊｃｔ．ｆａｓｔａ」と命名される。
４．Ｔｅｒｍｉｎａｌ、ｉＴｅｒｍ２、ウインドウコンソール、リナックスコンソールまたは他の類似のターミナルエミュレーターなどのプログラムを用いて、以下のコマンドを実行する。これは、「ｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔ」という名称のファイルに結果を生成する。
ｂｌａｓｔｐ －ｑｕｅｒｙ ｑｕｅｒｙ．ｆａｓｔａ －ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｂｊｃｔ．ｆａｓｔａ －ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２ －ｅｖａｌｕｅ ０．１－ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ６ －ｇａｐｏｐｅｎ １１ －ｇａｐｅｘｔｅｎｄ １ －ｏｕｔ ｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔ
５．ｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔを開いて、２つの配列のアラインメントを示すセクションを見る。目的の各配列位置に対し、「問い合わせ」配列に一致する数を特定する。次に、「問い合わせ」配列の位置で整列された「対象」配列中の対応する残基位置を特定する。

他のタンパク質アラインメントツールも、問い合わせ配列と基準配列（例えば、配列番号１）との間の配列同一性を特定するために使用できることは、当業者には明らかであろう。問い合わせ配列と基準配列とが、かなりの配列同一性を共有することを考慮すると、他のタンパク質アラインメントツールは、Ｂｌａｓｔ－ｐと同一の結果ではないにしても、本明細書で記載のプロトコルを使用して類似の結果を生成することが予測される。本明細書で記載のプロトコルは、このために正確で効果的であることが示され、問い合わせ配列中で変異導入されるべきアミノ酸残基の特定において、当業者を支援するように本明細書で提供される。

本明細書で提供される別の態様は、配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９０％の同一性を含み、配列番号１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に比べて、少なくとも２つの変異をさらに含み、少なくとも２つの変異が、Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ、からなる群より選択される、第１のコロナウィルスＲＢＤを含むか、または配列番号１のＦ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；またはＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ、に対応する少なくとも２つの変異を含む第２のコロナウィルスＲＢＤを含む、非天然起源ポリペプチドを含み、対応する位置は、プロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインのスパイクタンパク質配列との配列アラインメントにより決定される。

本明細書で提供される別の態様は、配列番号１の残基３２８～５３１と、またはＢｌａｓｔ－ｐを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルスの受容体結合ドメインの対応する残基と、少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、配列番号１のＲＢＤまたは第２のコロナウィルス中の対応する残基に比べて、少なくとも２つの変異をさらに含み、少なくとも２つの変異は、少なくとも２つの変異を欠く野生型ポリペプチドの安定性に比べて、ポリペプチドの安定性を高める、非天然起源ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、非天然起源コロナウィルス受容体結合ドメインポリペプチドの安定性およびその対応する野生型ポリペプチドの安定性は、同一条件下で評価される。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の一実施形態では、少なくとも２つの変異は、配列番号１のアミノ酸位置：３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、またはＢｌａｓｔ－ｐを用いて、配列番号１と第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、少なくとも２つの変異は、配列番号１のＦ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍからなる群より選択されるか、またはＢｌａｓｔ－ｐを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルスの対応する残基にある。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、受容体結合ドメインポリペプチドは、配列番号１のＲＢＤ以外の追加のアミノ酸残基をさらに含む。本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、本明細書で記載の受容体結合ドメインポリペプチドは、コロナウィルススパイクタンパク質ポリペプチドを含む。本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、受容体結合ドメインポリペプチドまたはコロナウィルススパイクタンパク質ポリペプチドは、例えば、融合ポリペプチドを含み得る。受容体結合ドメインポリペプチドまたはコロナウィルススパイクタンパク質ポリペプチドはまた、例えば、例えば、分泌のための、リーダー配列を含み得る。種々の実施形態では、リーダー配列および／またはアミノ末端メチオニンは、存在できる、あるいは、例えば、タンパク質分解性切断により除去できる。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９５％の同一性を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、配列番号１のアミノ酸３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、または第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある少なくとも２つの変異は、野生型に比べて、受容体結合ドメイン中の変異のみである。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ＲＢＤポリペプチドの発現は、細胞中で発現される場合、少なくとも２つの変異を欠く野生型ＲＢＤポリペプチドの発現と比較して（即ち、同じまたは類似の発現条件または培養条件下で）、増大する。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ＲＢＤポリペプチドは、コロナウィルス抗体に結合する、またはコロナウィルスの同族受容体に結合する。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルス抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ポリペプチドに対応するコロナウィルスのための受容体は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）受容体を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ＡＣＥ受容体は、ＡＣＥ２受容体である。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、第２のコロナウィルスは、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）；中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）；２２９Ｅ；ＮＬ６３；ＯＣ４３；ＨＫＵ１、またはその天然起源バリアントから選択されるコロナウィルスの配列を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、受容体結合ドメインポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ＲＢＤは、第２の異種ポリペプチドに融合される。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ＲＢＤは、ナノ粒子、ナノ構造体または異種の足場タンパク質に融合される。特定の実施形態では、異種の足場タンパク質は、配列番号３のＩ５３－５０三量体「Ａ」成分を含む。他の実施形態では、異種の足場タンパク質は、米国特許第１０，３５１，６０３号の表１に記載の異種の足場タンパク質を含む。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドは、抗原性のポリペプチドである。

本明細書で提供される別の態様は、請求項１に記載のポリペプチドを含むコロナウィルススパイクタンパク質である。

本明細書で提供される別の態様は、本明細書で記載のポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物である。一実施形態では、ポリペプチドは、薬学的に許容可能なキャリアとの混合物中にある。一実施形態では、ポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体は、懸濁液として提供される。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の一実施形態では、医薬組成物は、アジュバントをさらに含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、組成物の貯蔵寿命は、少なくとも２つの変異を欠く野生型ＲＢＤポリペプチドを含む組成物より長い。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、組成物は、ワクチンとして処方される。

別の態様では、本明細書で同様に提供されるのは、少なくとも２つの変異を含む非天然起源コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドであり、少なくとも２つの変異は、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも第２の変異を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、少なくとも２つの変異は、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも第２の変異を欠く野生型ポリペプチドの安定性に比べて、コロナウィルスポリペプチドの安定性を高める。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、少なくとも１つの空洞充填変異は、コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１のリノール酸結合ポケット中の残基の変異を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、少なくとも１つの空洞充填変異は、配列番号１の残基３２８～５３１内の残基の変異、またはＢｌａｓｔ－ｐ（例えば、本明細書で記載のプロトコル１または２）を用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基の変異を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、少なくとも１つの空洞充填変異は、残基３３５～３４５；３５５～３７５、または３７８～３９５の間の配列番号１の残基の変異、またはＢｌａｓｔ－ｐ（例えば、本明細書で記載のプロトコル１または２）を用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基の変異を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、少なくとも１つの空洞充填変異は、アミノ酸３３６、３３８、３４１、３４２、３５８、３６１、３６３、３６５、３６８、３７４、３７７、３８７、または３９２にある配列番号１の残基の変異、またはＢｌａｓｔ－ｐ（例えば、本明細書で記載のプロトコル１または２）を用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルスの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基の変異を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも１つの第２の変異は、配列番号１の残基３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、またはＢｌａｓｔ－ｐ（例えば、本明細書で記載のプロトコル１または２）を用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基にある。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも１つの第２の変異は、配列番号１のＦ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ、またはＢｌａｓｔ－ｐ（例えば、本明細書で記載のプロトコル１または２）を用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基からなる群より選択される。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドは、配列番号１の残基３２８～５３１またはＢｌａｓｔ－ｐ（例えば、本明細書で記載のプロトコル１または２）を用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の受容体結合ドメイン配列と少なくとも９５％の同一性を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、配列番号１のアミノ酸３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、または第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある少なくとも２つの変異は、配列番号１に比べて、スパイクタンパク質サブユニット１中の変異のみである。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルスポリペプチドは、配列番号１、または第２のコロナウィルスの野生型スパイクタンパク質サブユニット１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルスポリペプチドの発現は、細胞中で発現される場合、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも１つの第２の変異を欠く野生型ポリペプチドの発現と同じ発現条件下で比較して、増大する。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルスポリペプチドは、コロナウィルス抗体に結合する、または同族コロナウィルス受容体に結合する。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルス抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、同族コロナウィルス受容体は、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）受容体を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ＡＣＥ受容体は、ＡＣＥ２受容体である。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルスポリペプチドは、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）；中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）；２２９Ｅ；ＮＬ６３；ＯＣ４３；ＨＫＵ１から選択されるコロナウィルスの改変された変異ポリペプチドである。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルスポリペプチドは、第２の異種ポリペプチドに融合される。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルスポリペプチドは、ナノ粒子、ナノ構造体または足場タンパク質に融合される。特定の実施形態では、異種の足場タンパク質は、配列番号３のＩ５３－５０三量体「Ａ」成分を含む。 他の実施形態では、異種の足場タンパク質は、米国特許第１０，３５１，６０３号の表１に記載の異種の足場タンパク質を含む。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルスポリペプチドまたは第２の異種ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドである。

別の態様では、本明細書でさらに提供されるのは、本明細書で記載のコロナウィルスポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む（例えば、混合物として、または懸濁液を形成して含む）組成物である。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の一実施形態では、コロナウィルスポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、アジュバントをさらに含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、組成物の貯蔵寿命は、同じまたは類似の貯蔵条件化で貯蔵される場合、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも第２の変異を欠く野生型コロナウィルスポリペプチドを含む組成物より長い。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、コロナウィルスポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、ワクチンとして処方される。

本明細書で提供される別の態様は、本明細書で記載の少なくとも２つの変異を有する受容体結合ドメイン、または本明細書で記載の少なくとも２つの変異を有するコロナウィルスポリペプチドを発現している細胞に関する。

本明細書で提供される別の態様は、本明細書で記載の少なくとも２つの変異を有する受容体結合ドメイン、または本明細書で記載の少なくとも２つの変異を有するコロナウィルスポリペプチドをコードする核酸配列に関する。

別の態様では、本発明でさらに提供されるのは、対象にコロナウィルスに対するワクチンを接種する方法であり、該方法は、本明細書で記載の医薬またはワクチン組成物を対象に投与することを含む。

本明細書で提供される別の態様は、ワクチンの製造方法に関し、該方法は、本明細書で記載の少なくとも２つの変異を有する受容体結合ドメイン、または本明細書で記載の少なくとも２つの変異を有するコロナウィルスポリペプチドを含む組成物を、アジュバントおよび薬学的に許容可能な担体と混合することを含む。

本明細書で提供される別の態様は、配列番号１のコロナウィルスポリペプチドに比べて、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７ＦおよびＦ３９２Ｗからなる群より選択される変異を含むコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、異種の足場タンパク質に融合された融合ポリペプチド組成物に関する。一実施形態では、異種の足場タンパク質は、配列番号３のポリペプチドを含む。 別の実施形態では、配列番号３のポリペプチド中の各システインは、アラニンに変異されている。

別の実施形態では、異種の足場タンパク質は、米国特許第１０，３５１，６０３号の表１に記載の異種の足場タンパク質を含む。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

別の実施形態では、融合ポリペプチド組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。

別の実施形態では、融合ポリペプチド組成物は、アジュバントをさらに含む。

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、融合ポリペプチド組成物を含むワクチン組成物である。

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、融合ポリペプチドを発現している細胞である。

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、融合ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物である。

別の実施形態では、本発明で提供されるのは、対象にコロナウィルスに対するワクチンを接種する方法であり、該方法は、本明細書で記載の融合ポリペプチド組成物を含む組成物を対象に投与することを含む。

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ワクチンの製造方法であり、該方法は、本明細書で記載の融合ポリペプチド組成物またはこのような融合ポリペプチド組成物をコードする核酸を、アジュバントおよび薬学的に許容可能な担体と混合することを含む。

本明細書で提供される別の態様は、配列番号１のコロナウィルスポリペプチドに比べて、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される変異を含むコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むポリペプチドに関する。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の一実施形態では、変異は、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、およびＦ３９２Ｗからなる群より選択される。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される第２の変異を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される第３の変異を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４または配列番号５のポリペプチド配列を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、異種の足場タンパク質を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、異種の足場タンパク質は、配列番号３のポリペプチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、異種の足場タンパク質は、配列番号３のポリペプチドを含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のポリペプチド配列を含む。

本明細書で提供される別の態様は、請求項５９～６２のいずれか１項に記載のポリペプチドからなる第１の成分、および配列番号１３～１８のいずれか１つと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する第２の成分を含むまたはこれらからなるポリペプチド複合体に関する。

別の態様では、本明細書でさらに提供されるのは、本明細書で記載の組成物またはポリペプチド複合体を含むワクチン組成物である。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の一実施形態では、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ワクチン組成物は、アジュバントをさらに含む。

本明細書で提供される別の態様は、本明細書で記載のポリペプチドを発現している細胞に関する。

本明細書で提供される別の態様は、本明細書で記載のポリペプチドをコードする核酸に関する。

本明細書で提供される別の態様は、対象にコロナウィルスに対するワクチンを接種する方法であり、該方法は、本明細書で記載のポリペプチド、タンパク質複合体、またはワクチン組成物を対象に投与することを含む。

本明細書で提供される別の態様は、ワクチンの製造方法に関し、該方法は、本明細書で記載のポリペプチドを、アジュバントおよび薬学的に許容可能な担体と混合することを含む。

本明細書で提供される別の態様は、ワクチンの製造方法に関し、該方法は、本明細書で記載のポリペプチドからなる第１の成分；配列番号１３～１８のいずれか１つと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する第２の成分；薬学的に許容可能な担体；および任意選択で、アジュバントを混合することを含む。

従って、一態様では、本明細書で提供されるのは、配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、配列番号１のＲＢＤに比べて、少なくとも１つの変異をさらに含む非天然起源ポリペプチドであって、少なくとも１つの変異は、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌ、またはＢｌａｓｔ－ｐ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）”Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）を用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基からなる群より選択される。一実施形態では、使用されるＢｌａｓｔ－ｐプログラムは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）オンラインアラインメントツールである。あるいは、Ｂｌａｓｔ－ｐプログラムは、装置にダウンロードして、ローカルで使用できる。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の一実施形態では、変異は、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、およびＦ３９２Ｗからなる群より選択される。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される第２の変異を含む。

本明細書で提供されるこの態様および全ての他の態様の別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される第３の変異を含む。

本明細書で記載される別の態様は、配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、配列番号１のＲＢＤに比べて、少なくとも２つの変異をさらに含むポリペプチドに関し、少なくとも２つの変異が、配列番号１の、
Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；
Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；
Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；
Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；および
Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；
または、
Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；
Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；
Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；
Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；および
Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ
に対応する少なくとも２つの変異を含む第２のコロナウィルスＲＢＤからなる群より選択され、対応する位置は、プロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインのスパイクタンパク質配列との配列アラインメントにより決定される。

１種または複数の変異を有する例示的非天然起源ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２安定化受容体結合ドメインであり、出発構築物（即ち、天然または野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）に比べて高められた発現を示す。図１Ａは、遺伝的にＩ５３－５０Ａ三量体ナノ粒子成分に融合された設計リパックＲＢＤ（「Ｒｐｋ」）バリアントを発現するために使用される上清の還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。野生型対照は、ＲＢＤの変異を含まず、陰性対照は、どの分泌タンパク質もコードしないプラスミドを使用する。単量体および酸化二量体種の泳動を標識している。図１Ｂは、全ての構築物に含まれる変異のリストである。太字で記載の変異は、Ｓｔａｒｒ ｅｔ ａｌ．２０２０で単独で検証された。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対する安定化変異の位置を示す構造モデルである。図２Ａは、ＰＤＢ－ＩＤ ６ＶＹＢ（左）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の表面表現を示し、ボックス枠は、Ｎ－グリカンの表現を含むＲＢＤの拡大で、透明表面表現により示される。図２Ｂは、ほとんどの設計変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメインの領域の拡大図である。図２Ｃは、２つの変異の代表的設計セットの構造モデルであり、Ｒｐｋ４およびＲｐｋ９と命名され、これは、ＲＢＤを安定化する。 Ｉ５３－５０Ａ三量体成分に遺伝的に融合された安定化ＲＢＤを発現するために使用された上清への、ヒトＡＣＥ２受容体とＣＲ３０２２抗体の結合を測定するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を示す。ＡＣＥ２およびＣＲ３０２２は、上清に曝露する前に、センサー上に固定化された。（ｉ）全ての設計、（ｉｉ）野生型ＲＢＤを含む構築物、および（ｉｉｉ）陰性対照血清からのデータがグラフに示されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２同族の受容体、アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体の両方、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を認識するＣＲ３０２２ ｍＡｂに対し試験した場合、図１のそれぞれの変異させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、抗原性が損なわれていないと判断された。上清からの測定はまた、それぞれのこれらの変異体は、出発構築物より遙かに高レベルで発現したことも確証する。 単量体型中で、およびＩ５３－５０Ａ三量体に融合した場合（「－Ｉ５３－５０Ａ」の付記により示される）、Ｒｐｋ４またはＲｐｋ９変異を含む安定化ＲＢＤの生化学的、生物物理学的および抗原性キャラクタリゼーションを示す。発現、熱安定性およびローカル構造規則性は全て改善され、同時に、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤに対する類似の抗原性を維持した。図４Ａは、等体積のＨＥＫ２９３Ｆ培養物からの発現とこれに続くＩＭＡＣ精製および濃縮後の野生型および安定化ＲＢＤのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製を示す。単量体ＲＢＤ（左）をスーパーデックス７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬを用いて精製し、一方、Ｉ５３－５０Ａ三量体（右）をスーパーデックス２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬを用いて精製した。切り取ったゲルは、同等に希釈されたＳＥＣロード試料を示す。図４Ｂは、固有のトリプトファン蛍光を用いてナノＤＳＦにより監視した、野生型および安定化ＲＢＤ単量体の熱変性（左）およびＩ５３－５０Ａ三量体への融合（右）を示す。上段パネルは、温度の関数としての各蛍光発光スペクトルの重心平均（ＢＣＭ）を示し、下段パネルは、融解温度の計算に使用される平滑化された一次導関数を示す。図４Ｃは、野生型およびＩ５３－５０Ａ三量体に融合した安定化ＲＢＤの水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を示す。構造モデル（上段、ＰＤＢ ６Ｗ４１による）は、野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ三量体と比べた、Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０ＡおよびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０Ａ三量体両方のパノラマ的取り込み差異の結果を示し、陰影付けは、１分で測定した変異体三量体中の減少した取り込みレベルに基づいて決定された。ボックス枠は、残基３９２～３９９からのペプチドセグメントを強調し、このペプチドに対する交換は、複数の時点：３秒、１５秒、１分、３０分、および２０時間（下段）で示された。 各点は、２つの測定値の平均である。標準偏差は、プロットした点より小さくなければ、示される。図４Ｄは、 等濃度の野生型および安定化ＲＢＤ単量体と混合した場合のサイプロオレンジ（ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ）の蛍光を示し、より大きなシグナルは、より大きなレベルの露出された疎水性を示す。図４Ｅは、ＢＬＩで評価された固定化ＣＶ３０およびＣＲ３０２２モノクローナル抗体の単量体野生型および安定化ＲＢＤに対する結合動力学を示す。２倍希釈系列中の５種のＲＢＤ濃度由来の実験データ（灰色）を１：１相互作用を記述する結合式に当てはめた（黒線）。構造モデル（左）は、ＣＶ３０ Ｆａｂ（ＰＤＢ ６ＸＥ１）およびＣＲ３０２２ Ｆａｂ（ＰＤＢ ６Ｗ４１）に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造アラインメントにより生成した。 構築したＩ５３－５０ナノ粒子上に提示された安定化ＲＢＤは、野生型ＲＢＤに比べて、溶液安定性を高める。図５Ａは、ＲＢＤ抗原を提示しているＩ５３－５０ナノ粒子免疫原の構築体の概略図を示す（「－Ｉ５３－５０」の付記により示す）。図５Ｂは、野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０、Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０、およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０の陰性染色電子顕微鏡観察（ｎｓＥＭ）を示す（スケールバー、２００ｎｍ）。図５Ｃ～５Ｅは、４種の異なる緩衝液中の単回凍結／解凍サイクル前後の野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０、Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０、およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０に対する品質管理結果をまとめたものを示す。図５Ｃは、可視・紫外分光法領域での３２０：２８０ｎｍでの吸光度の比率で、可溶性凝集体の存在の指標である。図５Ｄは、動的光散乱（ＤＬＳ）測定を示し、これは、適切なナノ粒子構築および凝集体の形成を監視する。図５Ｅは、Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原の固定化ｈＡＣＥ２－Ｆｃ受容体（上段）およびＣＲ３０２２（下段）に対する反応率を示す。凍結前および凍結後データは、各ナノ粒子に対し、それぞれのＣＨＡＰＳ含有試料に別々に正規化された。 親野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子免疫原の強力な免疫原性は、Ｒｐｋ変異の付加で維持される。図６Ａは、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群６匹）に０週目および３週目に免役したこをと示す。各群は、等モル量のＡｄｄａＶａｘでアジュバント添加したＲＢＤ抗原の投与を受け、これにより、合計抗原は、ヘキサプロ－フォルドン（３量体化ドメイン）（ＨｅｘａＰｒｏ－ｆｏｌｄｏｎ）で単回用量当たり５μｇに、全てのその他の免疫原で単回用量当たり０．８８μｇに等しくなる。２週目および５週目に血清採取を実施した。ＲＢＤ－Ｉ５３－５０免疫原は、２種の異なる緩衝液条件で調製し、１つの群はＣＨＡＰＳを賦形剤として含む。図６Ｂは、系列希釈の血清のＥＬＩＳＡ測定値由来のＡＵＣにより評価した、２週目および５週目のヘキサプロ－フォルドンに対する結合力価を示す。各円は、個別のマウス由来のＡＵＣ測定値を表し、水平線は、各群の幾何学的平均を示す。群４の２週目のゼロ近くのＡＵＣを有する１匹のマウスはプロットしなかったが、幾何平均の計算には含めた。図６Ｃは、レンチウィルス骨格を用いた自家（Ｄ６１４Ｇ）偽ウィルス中和を示す。各円は、個別のマウスに対する５０％阻害（ＩＣ_５０）での中和抗体価を表し、水平線は、各群の幾何学的平均を示す。片側ノンパラメトリック、クラスカル・ワリス検定を用いてダンの多重比較により統計解析を実施した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。 ＲＢＤベースナノ粒子免疫原の貯蔵寿命安定性は、Ｒｐｋ変異により改善された。図７Ａは、４週間にわたるＤＬＳ測定のまとめを示す。流体力学的径は、２８日間の貯蔵後に凝集の徴候を示した３５～４０℃の野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０を除いて、全てのナノ粒子で変わらないままであった。図７Ｂは、各時点で－８０℃の試料に正規化された、ＢＬＩによる固定化ｈＡＣＥ２－Ｆｃ受容体（破線）およびＣＲ３０２２ ｍＡｂ（実線）に対する結合を示す。安定化ナノ粒子免疫原では、抗原の完全性は、変わらないままであったが、一方、３５～４０℃でインキュベートした野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０の結合シグナルは、６０％（ｈＡＣＥ２－Ｆｃ）および３０％（ＣＲ３０２２）低下した。図７Ｃは、４週間にわたるＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびｎｓＥＭをまとめたものである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分解は観察されなかった。部分的な凝集は、３５～４０℃で貯蔵されたＷＴナノ粒子の２８日目に対し、ｎｓＥＭによってのみ観察された。３５～４０℃での貯蔵後２８日目の電子顕微鏡写真が示され、ボックスで凝集体の実例が示されている（スケールバー、２００ｎｍ）。全ての試料は、ＴＢＳ、５％グリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中で配合された。 Ｒｐｋ９変異は、ヘキサプロ変異を含む、完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ外部ドメイン中に組み込まれ得る。図８Ａは、等体積のＨＥＫ２９３Ｆ培養物からの発現とそれに続くＩＭＡＣ精製および濃縮後の、野生型（ヘキサプロ－フォルドン）およびＲｐｋ９（Ｒｐｋ９－ヘキサプロ－フォルドン）融合前安定化Ｓ外部ドメインのＳＥＣ精製を示す。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬを用いて、Ｓ外部ドメインを精製した。図８Ｂは、ヘキサプロ－フォルドンおよびＲｐｋ９－ヘキサプロ－フォルドンの精製の間の中間体および最終生成物の還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。図８Ｃは、固有のトリプトファン蛍光を用いてナノＤＳＦにより監視した、ヘキサプロ－フォルドンおよびＲｐｋ９－ヘキサプロ－フォルドンの熱変性を示す。蛍光発光スペクトルの重心平均（ＢＣＭ）は、温度の関数としてプロットされる。図８Ｄは、ヘキサプロ－フォルドンおよびＲｐｋ９－ヘキサプロ－フォルドンのｎｓＥＭを示す（スケールバー、１００ｎｍ）。 ＲＢＤのＢ．１．３５１バリアントに添加される場合、Ｒｐｋ９変異は、より単純な緩衝液配合物中の適切なＳＥＣ溶出体積でＲＢＤを提示しているＩ５３－５０ナノ粒子の相対的回復を改善し、これは、Ｒｐｋ変異が異なるバリアント由来のＲＢＤを含む免疫原の完全性を改善することを示す。Ｗｕｈａｎ－１ ＲＢＤ（Ｒｐｋ変異なし）、Ｒｐｋ９変異のないＢ．１．３５１ ＲＢＤおよびＲｐｋ９変異を有するＢ．１．３５１ ＲＢＤのいずれかを提示しているＩ５３－５０ナノ粒子の場合、構築およびＳＥＣは、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、１８５ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、０．７５％のＣＨＡＰＳ、４．５％のグリセロール、または５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、５％のグリセロール中で実施された。Ｒｐｋ９変異は、Ｒｐｋ９変異のない同等の試料に比べて、収率およびいずれかの緩衝液条件中でのＲＢＤ安定性の他の尺度を高めたが、Ｒｐｋ９変異を有するＢ．１．３５１ ＲＢＤを提示しているナノ粒子は、相対収率およびＣＨＡＰＳ洗浄剤なしでのＳＥＣ泳動をより良好に維持した。 ＴＢＳ、５％グリセロール、０．７５％ＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、１８５ｍＭのＮａＣｌ、４．５％のグリセロール、０．７５％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中の試料の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。標準の分子量は、ｋＤａで記述される。各試料は、＋／－還元剤（ＤＴＴ）、凍結前および凍結後解凍（Ｆ／Ｔ）の条件で分析された。 ＴＢＳ、５％のグリセロール、０．７５％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、１８５ｍＭのＮａＣｌ、４．５％のグリセロール、０．７５％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ｈＡＣＥ２－ＦｃをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原と、（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ５％のグリセロール、０．７５％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子のＣＲ３０２２結合を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、１８５ｍＭのＮａＣｌ、４．５％のグリセロール、０．７５％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のＣＲ３０２２ ＩｇＧ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ＣＲ３０２２ ＩｇＧをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ＴＢＳ、５％グリセロール、０．７５％ＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子の動的光散乱を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、１８５ｍＭのＮａＣｌ、４．５％のグリセロール、０．７５％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中の各試料の流体力学的径（ｎｍ）を正規化強度としてプロットした。 ＴＢＳ、５％グリセロール、０．７５％ＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子の可視・紫外分光法を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、１８５ｍＭのＮａＣｌ、４．５％のグリセロール、０．７５％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＬ－アルギニン中の各試料の可視・紫外分光法スペクトル（ｎｍ）を正規化吸光度としてプロットした。 ＴＢＳ、５％グリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中の試料の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。標準の分子量は、ｋＤａで記述される。各試料は、＋／－還元剤（ＤＴＴ）、凍結前および凍結後解凍（Ｆ／Ｔ）の条件で分析された。 ＴＢＳ、５％のグリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中の抗原のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ｈＡＣＥ２－ＦｃをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ＴＢＳ、５％のグリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子のＣＲ３０２２結合を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中の抗原のＣＲ３０２２ ＩｇＧ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ＣＲ３０２２ ＩｇＧをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ＴＢＳ、５％グリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子の動的光散乱を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中の各試料の流体力学的径（ｎｍ）を正規化強度としてプロットした。 ＴＢＳ、５％グリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中のナノ粒子の可視・紫外分光法を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、１００ｍＭのＬ－アルギニン中の各試料の可視・紫外分光法スペクトル（ｎｍ）を正規化吸光度としてプロットした。 ＴＢＳ、５％グリセロール中のナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール中の試料の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。標準の分子量は、ｋＤａで記述される。各試料は、＋／－還元剤（ＤＴＴ）、凍結前および凍結後解凍（Ｆ／Ｔ）の条件で分析された。 ＴＢＳ、５％グリセロール中のナノ粒子のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール中の抗原のＡＣＥ２－Ｆｃ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ｈＡＣＥ２－ＦｃをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ＴＢＳ、５％のグリセロール中のナノ粒子のＣＲ３０２２結合を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール中の抗原のＣＲ３０２２ ＩｇＧ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ＣＲ３０２２ ＩｇＧをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ＴＢＳ、５％グリセロール中のナノ粒子の動的光散乱を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール中の各試料の流体力学的径（ｎｍ）を正規化強度としてプロットした。 ＴＢＳ、５％グリセロール中のナノ粒子の可視・紫外分光法を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール中の各試料の可視・紫外分光法スペクトル（ｎｍ）を正規化吸光度としてプロットした。 ＴＢＳ中のナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の試料の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。標準の分子量は、ｋＤａで記述される。各試料は、＋／－還元剤（ＤＴＴ）、凍結前および凍結後解凍（Ｆ／Ｔ）の条件で分析された。 ＴＢＳ中のナノ粒子のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の抗原のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ｈＡＣＥ２－ＦｃをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ＴＢＳ中のナノ粒子のＣＲ３０２２結合を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の抗原のＣＲ３０２２ ＩｇＧ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ＣＲ３０２２ ＩｇＧをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ＴＢＳ中のナノ粒子の動的光散乱を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の流体力学的径（ｎｍ）を正規化強度としてプロットした。 ＴＢＳ中のナノ粒子の可視・紫外分光法を示す。５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の各試料の可視・紫外分光法スペクトル（ｎｍ）を正規化吸光度としてプロットした。 ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。４種の温度で２８日（Ｄ）にわたるインキュベーション試験後、試料の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。標準の分子量は、ｋＤａで記述される。各試料は、＋／－還元剤（ＤＴＴ）の条件で分析された。 ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合を示す。４種の異なる温度で２８日（Ｄ）にわたりインキュベートした抗原のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ｈＡＣＥ２－ＦｃをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＣＲ３０２２結合を示す。４種の異なる温度で２８日（Ｄ）にわたりインキュベートした抗原のＣＲ３０２２ ＩｇＧ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ＣＲ３０２２をロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原と、（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子のｎｓＥＭを示す。４種の温度でのインキュベーション後の１日目（Ｄ）および２８日目の各試料の代表的陰性染色電子顕微鏡写真を示す。スケールバー、５０ｎｍ。 ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子の動的光散乱を示す。２８日（Ｄ）の期間に対する各試料の流体力学的径（ｎｍ）を正規化強度としてプロットした。 Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。４種の温度で２８日（Ｄ）にわたるインキュベーション試験後、試料の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。標準の分子量は、ｋＤａで記述される。各試料は、＋／－還元剤（ＤＴＴ）の条件で分析された。 Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０ナノ粒子のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合を示す。４種の異なる温度で２８日（Ｄ）にわたりインキュベートした抗原のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ｈＡＣＥ２－ＦｃをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＣＲ３０２２結合を示す。４種の異なる温度で２８日（Ｄ）にわたりインキュベートした抗原のＣＲ３０２２ ＩｇＧ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ＣＲ３０２２をロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原と、（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０ナノ粒子のｎｓＥＭを示す。４種の温度でのインキュベーション後の１日目（Ｄ）および２８日目の各試料の代表的陰性染色電子顕微鏡写真を示す。スケールバー、５０ｎｍ。 Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０ナノ粒子の動的光散乱を示す。２８日（Ｄ）の期間に対する各試料の流体力学的径（ｎｍ）を正規化強度としてプロットした。 Ｒｐｋ９－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。４種の温度で２８日（Ｄ）にわたるインキュベーション試験後、試料の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。標準の分子量は、ｋＤａで記述される。各試料は、＋／－還元剤（ＤＴＴ）の条件で分析された。 Ｒｐｋ９－Ｉ５３－５０ナノ粒子のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合を示す。４種の異なる温度で２８日（Ｄ）にわたりインキュベートした抗原のｈＡＣＥ２－Ｆｃ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ｈＡＣＥ２－ＦｃをロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）と、およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 Ｒｐｋ９－Ｉ５３－５０ナノ粒子のＣＲ３０２２結合を示す。４種の異なる温度で２８日（Ｄ）にわたりインキュベートした抗原のＣＲ３０２２ ＩｇＧ結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）で分析した。ＣＲ３０２２をロードしたプロテインＡバイオセンサーを免疫原と、（結合、ｘ＝５９０～８８９ｓ）およびその後、緩衝液（解離、ｘ＝８９０～１１９０ｓ）と共にインキュベートした。 Ｒｐｋ９－Ｉ５３－５０ナノ粒子のｎｓＥＭを示す。４種の温度でのインキュベーション後の１日目（Ｄ）および２８日目の各試料の代表的陰性染色電子顕微鏡写真を示す。スケールバー、５０ｎｍ。 Ｒｐｋ９－Ｉ５３－５０ナノ粒子の動的光散乱を示す。２８日（Ｄ）の期間に対する各試料の流体力学的径（ｎｍ）を正規化強度としてプロットした。

本明細書で提供されるのは、同じ発現、培養または貯蔵条件下で、天然のまたは野生型コロナウィルススパイクタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質）に比べて、それらの発現レベル、収率および／または安定性を高める少なくとも１つ、２つまたはそれを超えるアミノ酸変異を有するコロナウィルス「Ｓ」スパイクタンパク質を含む組成物および方法である。これらの変異スパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ヒトに感染することが既知の種々のコロナウィルスに対するタンパク質ベースワクチン、またはヒトに感染することが既知の複数のコロナウィルスに対する保護を提供する汎コロナウィルスワクチンを生成するために使用できる。

一実施形態では、Ｓタンパク質は、特定の発現、培養、または貯蔵条件下で、天然のまたは野生型コロナウィルススパイクタンパク質に比べて、変異体コロナウィルススパイクタンパク質の発現レベル、収率および／または安定性を高める単一変異を含む。代替的実施形態では、Ｓタンパク質は、複数の（例えば、２、３、４、または５つの）変異を含む。

定義
本明細書で使用される場合、用語「非天然起源」または「変異体」は、少なくとも１つまたは少なくとも２つのアミノ酸残基変異を含む、および好ましくは、その対応する天然のまたは野生型コロナウィルス配列に比べて、高められた安定性および／または発現を含む、コロナウィルスポリペプチド（例えば、安定化コロナウィルスＳタンパク質またはＲＢＤポリペプチド）を意味する。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の変異ポリペプチドは、例えば、少なくとも２つの変異を除いて、それらの天然の対応物と「実質的に類似」している。いくつかの実施形態では、天然の対応物には、天然起源コロナウィルスバリアントが含まれ得る。

誤解を避けるために記すと、コロナウィルスの天然起源バリアント（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント：Ｂ．１．１．７；Ｂ．１．３５１；Ｐ．１；Ｂ．１．４２７；Ｂ．１．４２９；Ｂ．１．５２６；Ｂ．１．５２６．１；Ｂ．１．５２５；Ｐ．２；Ｂ．１．６１７；Ｂ．１．６１７．１；Ｂ．１．６１７．２；およびＢ．１．６１７．３）は、「非天然起源」または「変異体」コロナウィルス配列とは見なされないが、このようなバリアントは、その用語が本明細書で使用される場合、基準コロナウィルス配列として使用できる。

本明細書で使用される場合、「非天然起源コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチド」という用語は、最低でも、受容体結合ドメイン配列（配列番号１の残基３２８～５３１）、リノール酸結合ポケットの構造形成、および少なくとも１つまたは少なくとも２つのアミノ酸変異を可能にする残基を含むポリペプチドを意味する。一実施形態では、少なくとも２つの変異の１つは、本明細書で使用される「空洞充填変異」を含む。

両方の分子が実質的に類似の構造を有する場合（即ち、それらが、デフォルトパラメーターのＢｌａｓｔ－ｐアラインメントセットにより特定されるアミノ酸配列で少なくとも９０％類似している）、および少なくとも１つの関連機能（例えば、天然のコロナウィルス対応物に結合する抗体によるポリペプチドの認識により特定される抗原活性）で実質的に類似している場合、分子は、別の分子に「実質的に類似している」と言われる。即ち、変異ポリペプチドは、天然起源ポリペプチドまたは核酸とは、１種または複数のアミノ酸または核酸欠失、付加、置換、または側鎖修飾により異なるが、それでも、天然起源分子の１種または複数の特定の機能または生物活性を保持している。アミノ酸置換には、アミノ酸が異なる天然起源または非従来的アミノ酸残基で置換される変化を含む。一部の置換は、「保存的」として分類でき、この場合、ポリペプチド中に含まれるアミノ酸残基は、極性、側鎖官能基またはサイズに関連する類似の特性の別の天然起源アミノ酸と置換される。本明細書で記載のバリアントにより包含される置換はまた、「非保存的」であり得、この場合、ペプチド中に存在するアミノ酸残基は、異なる特性（例えば、荷電または疎水性アミノ酸の非荷電または親水性アミノ酸での置換）を有するアミノ酸で置換され、あるいは、天然アミノ酸が非従来的アミノ酸で置換される。また、ポリペプチドに関連して使用される場合、用語「変異体」内に包含されるのは、基準ポリペプチドに比較して（例えば、野生型コロナウィルスポリペプチドに比較して）、一次、二次、または三次構造の変化である。変異体はまた、アミノ酸の挿入、欠失または置換を含み、これには、限定されないが、ヒトタンパク質中では通常起こらないオルニチンの挿入を含む、バリアントの基準であるペプチド配列中に通常起こらないアミノ酸および他の分子の挿入および置換を含む。

本明細書で使用される場合、「対応する」または「対応する野生型コロナウィルス」という用語は、非天然起源コロナウィルスポリペプチド（例えば、スパイクポリペプチド）またはＲＢＤポリペプチドが産生される野生型コロナウィルスポリペプチド配列（またはその天然起源バリアント）を意味する。典型的には、野生型コロナウィルス配列（またはその天然起源バリアント）は、非天然起源コロナウィルスポリペプチドと同じ株由来である。例えば、本明細書で記載の変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列の野生型コロナウィルスポリペプチドまたはその天然起源バリアント（例えば、南アフリカバリアント、ブラジルバリアント、ロスアンゼルスバリアント、など）に対応する。

本明細書で使用される場合、「天然起源バリアント」という用語は、感受性のある個体の集団で自然発生的に生ずるコロナウィルス配列を意味する。

本明細書で使用される場合、「増大した安定性」または「高められた安定性」という用語は、細胞、溶液または配合物中、同一条件下で、対応する天然のまたは野生型コロナウィルスタンパク質配列（またはその天然起源バリアント）より遅い速度で分解し、従って、例えば、本明細書の実施例で記載の熱融解アッセイを用いて評価して、対応する天然のまたは野生型コロナウィルスタンパク質配列（またはその天然起源バリアント）よりも、少なくとも１２時間長く持続する変異コロナウィルスタンパク質配列を意味する。特定の例では、対応する天然のまたは野生型コロナウィルスタンパク質配列の持続性に比べて、変異コロナウィルスタンパク質配列は、細胞、溶液または配合物中で少なくとも２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、７日間、８日間、９日間、１０日間、２週間、１か月間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、９か月間、１年間、２年間、またはそれを超えて持続する。いくつかの実施形態では、より高い発現レベルはまた、ポリペプチドの高められた安定性の指標、またはその結果であり得る。

本明細書で使用される場合、「増大した収率」または「高められた収率」という用語は、同じ細胞系から同じ増殖および単離条件下で回収される天然のまたは野生型タンパク質（またはその天然起源バリアント）の量と比較して、タンパク質が産生される細胞系から回収された変異コロナウィルスタンパク質の量の少なくとも１０％の増大を意味する。特定の実施形態では、「高められた収率」は、同じ増殖条件下の、同じ細胞系から回収される天然のまたは野生型タンパク質の量に比べて、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、またはそれを超える、タンパク質が産生される細胞系から回収される、変異コロナウィルスタンパク質の増大を意味する。

本明細書で使用される場合、「空洞充填変異」という用語は、成熟コロナウィルススパイクタンパク質の内部空洞を「充填する」ことが予測されるアミノ酸による野生型コロナウィルススパイクタンパク質中のアミノ酸残基の置換を意味する。例えば、置換アミノ酸は、それが空洞中に突出する適切なサイズまたは電荷のものであり、空洞サイズを立体的に低減するおよび／または同族リガンドの空洞またはポケット内の結合を弱める。

本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、ワクチン抗原と共に投与されると、ワクチン抗原に対する免疫応答を高めるタンパク質または化学物質を意味する。アジュバントは、免疫原または抗原に化学的に結合されないという点で、抗原性の部分または担体タンパク質から区別される。アジュバントは、当該技術分野において周知であり、例えば、フロイント完全またはフロイント不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ，Ａｄｖ．Ｔｕｂｅｒｃ．Ｒｅｓ．７：１３０（１９５６）；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．）などの鉱物油乳剤、アルミニウム塩、特に、水酸化アルミニウムまたはアルハイドロゲル（商標）（米国食品医薬品局によりヒトでの使用に認可された）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）および［Ｔｈｒ１］－ＭＤＰ（Ｂｙｅｒｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ ５：２２３（１９８７））などのその類似体、モノホスホリルリピドＡ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．９：Ｓ５１２（１９８７））、などが挙げられる。

本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、示された定義要素に加えて、他の要素も存在し得ることを意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の使用は、制限ではなく包含を示す。

本明細書で使用される場合、「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、所与の実施形態に必要なこれらの要素を意味する。この用語は、本発明のその実施形態の基本的および新規または機能的特性に実質的に影響を与えない追加の要素の存在を可能にする。

用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、その記載中に記述されないいずれの要素も除外する、本明細書で記載の組成物、方法、およびそのそれぞれの成分を意味する。

さらに、文脈により別義が要求されない限り、単数用語は複数を含むものとし、複数用語は単数を含むものとする。

操作実施例における場合以外、または別義が指示される場合以外、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表す全ての数値は、全ての場合において、用語の「約」によって修飾されているものとして理解されるべきである。用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、パーセンテージに関連して使用される場合、±１％を意味し得る。

コロナウィルス
コロナウィルスは、発熱、呼吸器疾患、および時には胃腸症状を引き起こす場合がある、数百のウィルスのファミリーである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、コロナウィルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こすウィルスは、ヒトに感染することが既知のこのファミリーの７つのメンバーの１つであり、過去３０年間に動物からヒトへ感染した３番目のウィルスである。ヒトに感染することが既知の他のコロナウィルスには、アルファコロナウィルス２２９ＥおよびＮＬ６３、およびベータコロナウィルスＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（重症急性呼吸器症候群、またはＳＡＲＳを引き起こすコロナウィルス）、およびＭＥＲＳ－ＣｏＶ（中東呼吸器症候群、またはＭＥＲＳを引き起こすコロナウィルス）が挙げられる。

本明細書で記載の方法および組成物は、ヒトに感染するコロナウィルスの場合で考察されるが、本明細書で記載の方法および組成物は、ペットまたは家畜（例えば、ブタ、ウシ、イヌ、など）を含む他の哺乳動物に感染するウィルスから安定なコロナウィルスタンパク質を生成するためにも使用できる。このようなウィルスとしては、限定されないが、ブタ伝染性胃腸炎ウィルス、ブタ呼吸器コロナウィルス、ブタ流行性下痢ウィルス（ＰＥＤＶ）、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウィルス、豚デルタコロナウィルス（ＰＤＣｏＶ）、ウシコロナウィルス（ＢＣＶ）、ネココロナウィルス（ＦＣｏＶ）、イヌコロナウィルス（ＣＣｏＶ）、トリ伝染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）、およびシチメンチョウコロナウィルス（ＴＣＶ）が挙げられる。加えて、本明細書で記載のコロナウィルスは、現在既知のもの、およびさらに後で発見されるものを含む。特に本明細書で意図されるのは、進行中のまたは将来の蔓延または世界的流行の原因となるコロナウィルスである。

本明細書で使用される場合、「コロナウィルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）」という用語は、プラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムおよびヘリカル対称性を有するエンベロープ被覆ウィルスを意味する。コロナウィルスのゲノムサイズは、約２７～３２キロベースの範囲であり、これは、全ての既知のＲＮＡウィルスの最大長のサイズである。大きなスパイク（Ｓ）糖タンパク質は、ウィルス粒子から突出し、電子顕微鏡により可視化すると、コロナウィルスに特徴的なコロナ様外観を付与している。コロナウィルスは、イヌ、ネコ、ブタ、マウス、ウシ、トリおよびヒトを含む多種多様な種に感染する（Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐ．１０７５－１０９４．Ｉｎ Ｄ．Ｍ．Ｋ．ａ．Ｐ．Ｍ．Ｈ．Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ（ｅｄ．），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）。しかし、各コロナウィルス株の天然の宿主の範囲は狭く、典型的には、単一の種からなる。

コロナウィルスは、典型的には、スパイク－受容体相互作用を介して標的細胞に結合し、受容体コロナウィルスエンドサイトーシスにより、または細胞膜との融合により細胞に侵入する（Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，前出）。スパイク－受容体相互作用は、群１および群２コロナウィルスの両方で実証されるように、種特異性の強力な決定要因である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶのゲノムは、一本鎖（＋）センスＲＮＡを含む。いくつかのＳＡＲＳコロナウィルス分離株の完全および部分的ゲノム配列が報告されており、これらには、ＳＡＲＳコロナウィルスＵｒｂａｎｉ（ジェンバンク受入番号ＡＹ２７８７４１）、ＳＡＲＳコロナウィルスＴｏｒ２（ジェンバンク受入番号ＡＹ２７４１１９）、ＳＡＲＳコロナウィルスＣＵＨＫ－Ｗ１（ジェンバンク受入番号ＡＹ２７８５５４）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓｈａｎｇｈａｉ ＬＹ（ジェンバンク受入番号Ｈ０１２９９９；ジェンバンク受入番号ＡＹ３２２２０５；ジェンバンク受入番号ＡＹ３２２２０６）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓｈａｎｇｈａｉ ＱＸＣ（ジェンバンク受入番号ＡＨ０１３０００；ジェンバンク受入番号ＡＹ３２２２０８；ジェンバンク受入番号ＡＹ３２２１９７；ジェンバンク受入番号ＡＹ３２２１９９）、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶＺＪ－ＨＺ０１（ジェンバンク受入番号ＡＹ３２２２０６）、

が挙げられる。

Ｓ（スパイク）タンパク質は、共有結合ホモ三量体（オリゴマー）を形成し、これは、受容体結合およびウィルス感染性を媒介し得る。Ｓタンパク質のホモ三量体は、受容体結合ドメイン結合ドメインの正確な天然の高次構造を提示するために、および中和抗体応答を誘発するために、必要である可能性がある。加えて、Ｓタンパク質の細胞内プロセッシングは、かなりの翻訳後オリゴ糖修飾と関連する。Ｎ－グリカンモチーフ分析から予測される翻訳後オリゴ糖修飾（グリコシル化）は、Ｓタンパク質がこのような修飾のために２３個もの多くの部位を有することを示す。加えて、Ｃ末端システイン残基はまた、タンパク質フォールディングおよび天然の（機能的）Ｓタンパク質高次構造の保存に関与し得る。一部のコロナウィルスのＳタンパク質（例えば、群ＩＩおよび群ＩＩＩウィルスの一部の株）は、Ｓタンパク質の中央近くで、ゴルジ装置中のトリプシン様プロテアーゼにより、またはＮ末端Ｓ１およびＣ末端Ｓ２ポリペプチドを含む、結合ポリペプチド中に細胞外局在化された酵素により、タンパク分解性にプロセッシングされ得る。ＩＩ型群のコロナウィルスおよび群Ｉのウィルスの一部のメンバーは、そのようにプロセッシングをされない可能性がある。

診断：対象、例えば、ヒトは、診断検査結果に基づいてコロナウィルス感染症と診断される。対象は、発熱、悪寒、咳、息切れ／呼吸困難、疲労、筋肉／身体疼痛、頭痛、味または臭いの新規消失、咽頭炎、鬱血または鼻水、悪心、嘔吐、または下痢などの１種または複数の主要徴候に基づいて、コロナウィルス感染症（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳ、など）であると疑われる可能性がある。しかし、特定の対象は、無症候性感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症）を呈する場合があり、従って、彼らがコロナウィルス感染症の対象と接触した場合、コロナウィルス感染症であると疑われる。両方のシナリオでは、活性コロナウィルス感染症は、対象から採取した試料中の１種または複数のウィルス抗原およびウィルス核酸を検出する当該技術分野において既知の方法を用いて確証できる。例としては、ウィルスＲＮＡを検出するための鼻咽頭スワブまたは喀痰からの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）診断アッセイの使用が挙げられる。他の核酸増幅法、例えば、多数の等温増幅方法のいずれかも使用でき、ＲＴ－ＰＣＲと同じではないにしても、それに近い感度を有する。等温増幅法は、増幅産物を精製するためのサーマルサイクラーを必要としない利点を有し、高感度で、より急速に結果を得ることができる。別の実施形態では、活性コロナウィルス感染症は、対象から得た生物試料中の１種または複数のコロナウィルスポリペプチド（抗原など）を検出することにより、特定できる。ウィルス抗原のためのラテラルフローアッセイは、定性的、および時には定量的診断結果を得ることができる。ウィルスポリペプチドはまた、当該技術分野において既知の、ウェスタンブロットなどの他の方法によっても検出できる。

コロナウィルス抗体の存在の評価は、対象が過去にコロナウィルスに曝露されたことがあるかどうかを判定するために、あるいは、ワクチンの有効性（即ち、変異スパイクタンパク質の免疫応答を生じさせる能力）を監視する手段として、使用できる。コロナウィルス抗体の存在を評価する方法は、当技術分野において既知であり、本明細書では詳細に考察されない。

あるいは、コロナウィルスビリオンの存在または産生は、例えば、電子顕微鏡観察を用いることにより、直接または間接的に判定できる。

タンパク質配列：天然のまたは野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、サブユニット１のアミノ酸配列は、下記の通り：
ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡ（配列番号１）。

本明細書全体を通して、配列番号１は、他のコロナウィルスアミノ酸配列を当該技術分野において既知のアラインメントプログラム（例えば、Ｂｌａｓｔ－ｐ）を用いて整列させ得る「基本（ｂａｓｅ）」または「基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」配列として使用される。異なる（または第２の）コロナウィルス配列のスパイクタンパク質配列と、配列番号１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質配列とのアラインメントを使って、本明細書で記載の安定化を達成するために所与のアミノ酸変異または複数変異を導入するための、異なる（または第２の）コロナウィルス中の対応する位置を決定できる。一実施形態では、異なるコロナウィルス配列は、Ｂｌａｓｔ－ｐ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）”Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．” Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）を用いて、配列番号１に対して整列される。一実施形態では、使用されるＢｌａｓｔ－ｐプログラムは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）オンラインアラインメントツールである。あるいは、Ｂｌａｓｔ－ｐプログラムは、装置にダウンロードして、ローカルで使用できる。当業者は、Ｂｌａｓｔ－ｐアラインメントツールの使用について容易に理解するであろうが、誤解を避けるために、オンラインおよびダウンロードしたアラインメントツールのために、それぞれプロトコル１およびプロトコル２が本明細書で提供される。

プロトコル１：米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）サーバーからのＢＬＡＳＴｐアラインメントオンラインで使用するためのプロトコル。
１．以下の設定を用いてＢＬＡＳＴアラインメントを準備する：
「２つ以上配列の整列」のためのオプションを使用する
「問い合わせ配列を入力」セクションに当該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のための参考株配列（即ち、配列番号１）を入力する
「対象配列を入力」セクションに任意の対応するコロナウィルススパイクタンパク質配列を入力する
アルゴリズム：ｂｌａｓｔｐ（タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ）
期待値の閾値：０．１
ワードサイズ：６
クエリー範囲内の最大マッチ：０
マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップコスト：
存在：１１
伸長：１
低複雑度領域のフィルター？：オフ
マスク：
ルックアップテーブルのみ？：オフ
小文字？：オフ
２．「ＢＬＡＳＴ」ボタンをクリックすることにより分析を実行
３．「アラインメント」タブをクリックし、２つの配列間のアラインメントを示す
４．各配列の目的の位置に対し、「問い合わせ」配列に一致する数を特定する。次に、「問い合わせ」配列の位置に整列された「対象」配列中の対応する残基位置を特定する。

プロトコル２：ローカルコンピューターまたはサーバーにダウンロードしたタンパク質ＢＬＡＳＴｐアラインメントツールで使用するためのプロトコル。
１．製造業者の説明書を用いてコマンドライン実施のためにＢＬＡＳＴをインストールするか、またはすでにそれがインストールされているコンピューターまたはサーバーを特定する。
２．目的のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質のためのサブタイプ特異的参考株（即ち、配列番号１）を含むＦＡＳＴＡフォーマットのファイルを生成する。下記のコマンドで、このファイルは、「ｑｕｅｒｙ．ｆａｓｔａ」と命名される。
３．同じサブタイプ由来の異なるコロナウィルスの対応するタンパク質配列を含むＦＡＳＴＡフォーマットの第２のファイルを生成する。下記のコマンドでは、このファイルは、「ｓｂｊｃｔ．ｆａｓｔａ」と命名される。
４．などのプログラムを用いて、Ｔｅｒｍｉｎａｌ、ｉＴｅｒｍ２、ウインドウコンソール、リナックスコンソールまたは他の類似のターミナルエミュレーターなどのプログラムを用いて、以下のコマンドを実行する。これにより、「ｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔ」と命名されたファイルに結果が生成される。
ｂｌａｓｔｐ －ｑｕｅｒｙ ｑｕｅｒｙ．ｆａｓｔａ －ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｂｊｃｔ．ｆａｓｔａ －ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２ －ｅｖａｌｕｅ ０．１－ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ６ －ｇａｐｏｐｅｎ １１ －ｇａｐｅｘｔｅｎｄ １ －ｏｕｔ ｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔ
５．ｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔを開いて、２つの配列のアラインメントを示すセクションを見る。目的の各配列位置に対し、「問い合わせ」配列に一致する数を特定する。次に、「問い合わせ」配列の位置で整列された「対象」配列中の対応する残基位置を特定する。

他のタンパク質アラインメントツール（例えば、ＣｌｕｓｔａｌｗまたはＣｌｕｓｔａｌ－ｏｍｅｇａ）も、問い合わせ配列と基準配列（例えば、配列番号１）との間の配列同一性を特定するために使用できることは、当業者には明らかであろう。問い合わせ配列と基準配列とが、かなりの配列同一性を共有することを考慮すると、他のタンパク質アラインメントツールは、Ｂｌａｓｔ－ｐと同一の結果ではないにしても、本明細書で記載のプロトコルを使用して類似の結果を生成することが予測される。本明細書で記載のプロトコルは、このために正確で効果的であることが示され、問い合わせ配列中で変異導入されるべきアミノ酸残基の特定において、当業者を支援するように本明細書で提供される。

受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ポリペプチド
ウィルス表面「スパイク」タンパク質は、コロナウィルスの宿主細胞への侵入を媒介する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、それぞれ、アンギオテンシン変換酵素－２（ＡＣＥ２）をその受容体として特異的に認識する受容体結合ドメインを含む。ウィルス取り込みおよび機能におけるこのドメインの重要性を考慮すると、受容体結合ドメインは、ヒトに感染することが既知のコロナウィルス中で比較的によく保存されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの配列は、以下の通りである：
ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫ（配列番号２）。

本明細書全体を通して、配列番号２は、他のコロナウィルスＲＢＤ配列を当該技術分野において既知のアラインメントプログラム（例えば、Ｂｌａｓｔ－ｐ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、など）を用いて整列させ得る「基本（ｂａｓｅ）」または「基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」受容体結合ドメイン配列として使用される。少なくとも第２のコロナウィルスＲＢＤ配列と、配列番号２とのアラインメントを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中の所与のアミノ酸変異に対する第２のコロナウィルスＲＢＤ配列中の対応する位置を決定できる。このような実施形態では、Ｂｌａｓｔ－ｐを用いて、コロナウィルスＲＢＤ問い合わせ配列と配列番号２とを、本明細書で記載のプロトコル１またはプロトコル２を用いて、整列させることができる。受容体結合ドメインポリペプチドは、配列番号２（または異なるコロナウィルスの等価物）内に少なくとも２つの変異を含む。いくつかの実施形態では、受容体結合ドメインポリペプチドは、追加の変異を含み得る。この追加の変異は、ＲＢＤ領域に存在してもよく、またはＲＢＤ領域以外で発生してもよい。通常、少なくとも１つ、２つ、またはそれ超のアミノ酸変異は、所与のコロナウィルス配列の天然起源バリアント中で見つかる変異を含まない。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の天然起源バリアント中に存在するＬ４５２ＲおよびＥ４８４Ｋは、本明細書で記載の少なくとも１つ、２つまたはそれ超のアミノ酸変異として計数されない。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の受容体結合ドメインポリペプチドは、１種または複数のコロナウィルスに対するタンパク質ワクチンの生成に使用される。当業者に離解されるように、特に、ワクチンの設定で使用される場合、変異コロナウィルスタンパク質は、その同族受容体に対する受容体結合特性を保持する必要はなく、従って、少なくとも１つのアミノ酸変異または少なくとも２つのアミノ酸変異は、ＲＢＤの機能を保持するように設計される必要はない。コロナウィルスタンパク質機能の維持が必要でないことを考慮すると、コロナウィルスタンパク質がコロナウィルス抗原として機能する（即ち、対象中でコロナウィルス結合抗体の産生を刺激するまたは対応する野生型コロナウィルスに対するコロナウィルス抗体に結合する）能力を保持する限りにおいて、配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％の同一性（例えば、配列番号１または２と少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性）を有するコロナウィルスタンパク質が、本明細書では特に意図されている。即ち、本明細書で記載の受容体結合ドメインポリペプチドは、「免疫原性」であり、即ち、受容体結合ドメインポリペプチドによる対象の免疫化（任意選択で、適切な支持体（タンパク質、脂質またはポリペプチドなど）に結合する）がＲＢＤポリペプチドに対する（Ｂ細胞型および／またはＴ細胞型の）免疫応答を誘導する。

用語「エピトープ」は、特にＭＨＣ分子の存在下の場合、抗原などの分子中の抗原決定基、即ち、免疫系により認識される、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞により認識される分子の一部またはフラグメントを意味する。タンパク質抗原のエピトープは、前記タンパク質の連続的または不連続的部分を含み、５～１００、５～５０、８～３０、１０～２５アミノ酸長さ、例えば、エピトープは好ましくは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長さであり得る。

タンパク質の免疫応答を生じさせる能力は、一部は、タンパク質が折り畳まれるその二次構造および高次構造に帰することができる。いくつかの実施形態では、特定の高次構造が抗原性応答を生成するために、および／またはタンパク質の安定性を強化するために、好ましい。ＡＣＥ２受容体に結合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の二次構造は、Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２” Ｎａｔｕｒｅ ５８１：２２１－２２４（２０２０）に記載されている。この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の結晶構造の知識により、当業者は、経験に基づく推論またはコンピューターソフトウェアを使用して、所与の受容体結合ドメインポリペプチドが、対象の免疫応答を誘導し得る形状または二次構造を含む可能性があるかどうかを判定できる。

特定の実施形態では、少なくとも２つのアミノ酸は、コロナウィルス受容体結合ドメイン中で変異導入され、この変異は、その対応する野生型タンパク質に比べて、細胞系中のタンパク質の収率を高め、および／または細胞、溶液、または配合物中のコロナウィルスタンパク質の安定性を高める。他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、コロナウィルス受容体結合ドメイン中に変異導入され、この変異は、その対応する野生型タンパク質に比べて、細胞系中のタンパク質の収率を高め、および／または細胞、溶液、または配合物中のコロナウィルスタンパク質の安定性を高める。

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの変異は、スパイクタンパク質のＲＢＤ領域（配列番号２または配列番号１の残基３２８～５３１）内に導入される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変異は、スパイクタンパク質のＲＢＤ領域内に導入される。

特定の実施形態では、少なくとも２つの変異は、配列番号１のアミノ酸残基：３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、またはＢｌａｓｔ－ｐを用いて、配列番号１と第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある。

特定の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変異は、アミノ酸残基：３３８、３５８、３６３、３６５、３６７、３７７、３９２、３９５；４９８、５０１、５０２、５１３、または５１５にある。他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変異は：Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、またはＦ５１５Ｌである。

特定の実施形態では、少なくとも２つの変異は、配列番号１のＦ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍからなる群より選択されるか、またはＢｌａｓｔ－ｐを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルスの対応する残基にある。

一実施形態では、受容体結合ドメインポリペプチドは、融合タンパク質を含む。

リノール酸結合ポケット
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 「Ｓ」（スパイク）タンパク質は、最近リノール酸結合ポケットであると特定された「ポケット」または「空洞」を含むことが示された（Ｔｏｅｌｚｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ “Ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔ ｉｎ ｔｈｅ ｌｏｃｋｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ”（２０２０））。リノール酸結合ポケット中の残基は、ヒトに感染する７種の全てのコロナウィルス中で保存されており（Ｔｏｅｌｚｅｒ、前出）、この空洞が機能的に保存されていることを示す。Ｔｏｅｌｚｅｒらはまた、リノール酸のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質への結合は、Ｓタンパク質の閉構造を安定化することを示す。本明細書では、リノール酸結合ポケットまたはリノール酸結合ポケットのサブドメイン内の変異を用いて、リノール酸の効果を模倣でき、および／またはＳタンパク質の閉構造を安定化できることが予測されている。いくつかの実施形態では、この領域中のアミノ酸変異は、「空洞充填」変異である。

一実施形態では、本明細書で使用される「空洞充填変異」は、リノール酸結合ポケット内の位置が充填される（例えば、空洞中に立体的に突出する）。天然のコロナウィルススパイクタンパク質中の空洞は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の結晶構造表現の目視検査により（例えば、Ｓｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２” Ｎａｔｕｒｅ ５８１：２２１－２２４（２０２０））、または タンパク質デザインコンピューターソフトウェア（例えば、特に、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（商標）（ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＬＬＣ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（商標）（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＭＯＥ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）、およびＲｏｓｅｔｔａ（商標）（Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ））を用いることによる、などの当該技術分野において既知の方法により特定できる。このようなモデルは、所与のコロナウィルススパイクタンパク質の安定性を高めることが予測される空洞充填変異を当業者が設計することを可能にする。

空洞充填変異のために置換されるアミノ酸には、小さい脂肪族（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＶａｌ）または小さい極性アミノ酸（例えば、ＳｅｒおよびＴｈｒ）が挙げられ、これらは、立体的により大きなおよび空洞に「充填」できる類似のアミノ酸（例えば、大きな脂肪族アミノ酸（Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＭｅｔ）または大きな芳香族アミノ酸（Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ））により置換される。他の実施形態では、荷電アミノ酸は、非荷電アミノ酸を置換し、または非荷電アミノ酸により置換され、それにより、タンパク質および空洞の二次構造を変え得る。置換のためのこのような残基はまた、所与のタンパク質高次構造中に覆い隠されるが、第２の高次構造中で溶媒に露出されるアミノ酸を含み得る。

特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質中の少なくとも２つの変異の少なくとも１つは、リノール酸結合ポケットに関与する残基にある。いくつかの実施形態では、変異は、リノール酸結合ポケットに「充填する」ことが好ましい（例えば、類似の電荷または疎水性を有するより大きなアミノ酸を用いて）。このような変異は、対応する野生型コロナウィルスと比べて、タンパク質の特定の高次構造を安定化し、および／またはタンパク質の分解速度を遅らせることができる。参照を容易にするために、リノール酸結合に関与する残基は、本明細書で３つのサブドメインに分類される。これらのサブドメインは、単純に、リノール酸結合に関与するいくつかの残基の近接性に基づいている。

非天然起源コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドは、少なくとも１つの空洞充填変異またはリノール酸結合ポケット中の残基中の変異、およびポリペプチドの安定性および／または収率を一緒に高める少なくとも１つの追加の変異を含み得る（これらの用語は本明細書で使用されるものとする）。

いくつかの実施形態では、空洞充填変異は、アミノ酸３３６、３３８、３４１、３４２、３５８、３６１、３６３、３６５、３６８、３７４、３７７、３８７、または３９２にある配列番号１の残基の変異、またはＢｌａｓｔ－ｐを用いて、配列番号１（またはその天然起源バリアント）と、第２のコロナウィルスの配列（またはその天然起源バリアント）との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基の変異を含む。他の実施形態では、空洞充填変異および少なくとも１つの第２の変異は、配列番号１の残基３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、またはＢｌａｓｔ－ｐ（例えば、本明細書で記載のプロトコル１または２）を用いて、配列番号1と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基にある。

いくつかの実施形態では、空洞充填変異および少なくとも１つの第２の変異は、配列番号１のＦ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍからなる群、またはＢｌａｓｔ－ｐ（例えば、本明細書で記載のプロトコル１または２）を用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基から選択される。

コロナウィルスタンパク質がコロナウィルスに対する抗原として機能する（即ち、対象中でコロナウィルス結合抗体の産生を刺激する）能力を保持する限りにおいて、本明細書で記載の空洞充填変異を有し、配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％の同一性（例えば、配列番号１または２と少なくとも９５％、少なくとも９９％の同一性）をさらに有するコロナウィルスタンパク質が、本明細書では特に意図されている。即ち、本明細書で記載の非天然起源のコロナウィルススパイクタンパク質ポリペプチドは、「免疫原性」であり、即ち、ポリペプチドによる対象の免疫化（任意選択で、適切な支持体（タンパク質、脂質またはポリペプチドなど）に結合する）がポリペプチドに対する（Ｂ細胞型および／またはＴ細胞型の）免疫応答を誘導する。

本明細書で記載のＲＢＤポリペプチドまたはスパイクポリペプチドは、コロナウィルスの既知のバリアント由来の１つまたは複数のアミノ酸置換を有し得る。例えば、限定されないが、ポリペプチドは、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、残基６９～７０の欠失、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Ｋ４１７Ｎ、Ｋ４１７Ｔ、Ｇ４４６Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｙ４５３Ｆ、Ｔ４７８Ｉ、Ｅ４８４Ｋ、Ｓ４９４Ｐ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ａ７０１Ｖ、およびＴ７１６Ｌからなる群より選択される配列番号１に対する１、２、３、４、５、６、７、または８つ全ての位置を含み得る。ポリペプチドは、下記の天然起源変異または変異の組み合わせの１つを含み得る：

Ｎ５０１Ｙ、任意選択で、残基６９～７０の１つまたは両方の欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、および／またはＴ７１６Ｌ（ＵＫバリアント）の１、２、３、４、または５つをさらに含む；

Ｋ４１７Ｎ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ、任意選択で、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｄ６１４Ｇ、および／またはＡ７０１Ｖ（南アフリカバリアント）の１、２、３、４、または５つをさらに含む；

Ｋ４１７ＮまたはＴ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ、任意選択で、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ６１４Ｇ、および／またはＨ６５５Ｙ（ブラジルバリアント）の１、２、３、４、または５つをさらに含む；または

Ｌ４５２Ｒ（ロスアンゼルスバリアント）。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示のポリペプチドは、配列番号４または配列番号５のポリペプチド配列を含む。
ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＦＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＷＴＮＩＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫ（配列番号４）
ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＦＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＷＴＮＩＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＮＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＫＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫ（配列番号５）

アミノ酸変異／置換
本明細書で提供されるのは、その対応する天然のまたは野生型コロナウィルスＳタンパク質に比べて、変異タンパク質の高められた安定性を付与する少なくとも２つのアミノ酸変異または置換を有する変異コロナウィルスＳタンパク質またはその受容体結合ドメインである。本明細書で例示されるのは、変異ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはその受容体結合ドメインであるが、本明細書で記載の方法および組成物は、ヒトに感染するコロナウィルスおよび他の哺乳動物（即ち、コウモリ、ウシ、ブタ、など）に感染するものの両方を含む任意のコロナウィルス Ｓタンパク質に適用できる。当業者は、別のコロナウィルスのアミノ酸配列と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（即ち、配列番号１または２）の配列とを整列させることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関し明細書中で概要を述べたものに対応する残基を容易に特定できる。

アラインメントは、機能が所与の残基または複数残基の受容体との直接接触であるか、または、例えば、残基が、他の残基がこのような接触をすることを可能にする高次構造の維持に関与するかに関わらず、機能に必要である可能性が高い残基に関するガイダンスを提供できる；後者の非限定的例には、リノール酸結合ポケットを満たす、またはスパイクタンパク質の所与の高次構造を維持するのに役立つ可能性のある残基が含まれる。例えば、アラインメントが対応する位置で２つの同一のまたは類似のアミノ酸を示す場合、その位置は、機能的に重要（即ち、リノール酸結合または受容体結合）である可能性がより高い。バリアントアミノ酸配列は、天然のまたは基準配列、例えば、配列番号１と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ超の同一性であり得る。天然のおよび変異体配列間の相同性の程度（パーセント同一性）は、例えば、このために通常採用され、ワールドワイドウェブ上で自由に利用できるコンピュータープログラムを用いて、２つの配列を比較することにより、決定できる。バリアントアミノ酸またはＤＮＡ配列は、それが由来する配列（本明細書では、「元の」、「天然の」、または「野生型」配列とも呼ばれる）と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ超の類似性であり得る。元のおよび変異体配列間の類似性の程度（パーセント類似性）は、例えば、類似性マトリックスを用いて決定できる。類似性マトリックスは当該技術分野において周知であり、類似性マトリックスを用いた２つの配列の比較のための多数のツールがオンラインで自由に利用可能であり、例えば、ＢＬＡＳＴｐ（ワールドワイドウェブのｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能）をデフォルトパラメーターセットで、または本明細書で記載のプロトコル１またはプロトコル２を用いて利用できる。

空洞充填変異が望ましい場合、所与のアミノ酸を、類似の生理化学的特性を有する残基で置換でき、例えば、１つの脂肪族残基で別の残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａなどを交互に）を置換、または１つの極性残基で別の残基（ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；ＧｌｎとＡｓｎ；またはＧｌｎとＡｓｎ間など）を置換でき、好ましくは、より小さい残基が、立体的に空洞を「充填する」または空洞サイズおよび／または構造の変化を誘導するために、電荷が変えられるより大きな残基により置換される。他のこのような置換、例えば、類似の疎水特性を有する全領域の置換は、よく知られており、機能を保存できる。所望のアミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書で記載のいずれかの１つのアッセイで試験して、（ｉ）所望の高次構造が維持され、天然のまたは参照ポリペプチドの抗原活性が実質的に維持されること、または（ｉｉ）タンパク質の安定性が高められることを確認できる。

いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含み得る。用語「保存的アミノ酸置換」は、当該技術分野において周知であり、特定のアミノ酸の類似の特性（例えば、類似の電荷または疎水性）を有するアミノ酸による置換に関する。本明細書で記載の保存的変異は、例えば、類似の電荷または疎水性であるが、サイズまたはかさ高さが異なる（例えば、空洞充填機能を提供する）アミノ酸残基での置換を含み得る。例示的保存的アミノ酸置換のリストを下表に示す。

あるいは、例えば、天然のコロナウィルスＳタンパク質二次構造の可撓性部分の除去が望ましい場合、例えば、システイン残基の付加による非保存的アミノ酸置換が好ましい場合がある（またはその逆の場合もある）。「非保存的置換」は、１つのクラスのアミノ酸の、別のクラス由来のアミノ酸による置換（例えば、ＡｌａのＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＧｌｎによる置換）を意味する。非保存的置換の追加の非限定的例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸による、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンなどの極性（親水性）残基の置換および／または極性残基による非極性残基の置換が挙げられる。

当業者により理解されるように、本明細書で記載の変異コロナウィルスポリペプチド（例えば、ＲＢＤポリペプチドまたは安定化コロナウィルスＳポリペプチド）は、任意に望ましい構成の保存的および非保存的アミノ酸置換の混合物を含み得る。本明細書で記載のポリペプチドは、当該技術分野において既知の、または実施例で記載の方法を使用して、抗原活性、受容体結合ドメイン活性または高次構造に関し試験できる。

システイン残基は、タンパク質二次構造または高次構造のために重要であり得る。例えば、その同族受容体（例えば、ＡＣＥ２受容体）への結合を評価すること、結晶学またはＥＭを用いて二次構造を評価すること、または天然のまたは野生型タンパク質に対する抗体への結合を確認することにより、変異タンパク質の二次構造が機能性および／または抗原性である場合には、システイン残基の変異が本明細書で意図される。ポリペプチドの適切な高次構造の維持に関与しないシステイン残基はまた、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、例えば、セリンで置換できる。逆に、システイン結合は、その安定性を改善する、またはオリゴマー化を促進するために、ポリペプチドに付加できる。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の安定化コロナウィルスＳタンパク質またはＲＢＤポリペプチドは、生物により産生されるポリペプチドおよび／またはタンパク質中でよく見つかる天然起源アミノ酸、例えば、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、およびＨｉｓ（Ｈ）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の安定化コロナウィルスＳタンパク質またはＲＢＤポリペプチドは、代替アミノ酸を含み得る。代替アミノ酸の非限定的例としては、Ｄ－アミノ酸；βアミノ酸；ホモシステイン、ホスホセリン、ホスホトレオニン、フォスフォチロシン、ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸；馬尿酸、オクタヒドロインドール－２－カルボン酸、スタチン、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、ペニシラミン（３－メルカプト－Ｄ－バリン）、オルニチン、シトルリン、αメチルアラニン、パラベンゾイルフェニルアラニン、パラアミノフェニルアラニン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、およびｔｅｒｔ－ブチルグリシン、ジアミノ酪酸、７－ヒドロキシテトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ナフチルアラニン、ビフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、アミノイソ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、ｔｅｒｔ－ロイシン、テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ピペコリン酸、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、デヒドロロイシン、２，２－ジエチルグリシン、１－アミノ－１－シクロペンタンカルボン酸（１－ａｍｉｎｏ－ｌ－ｃｙｃｌｏｐｅｔａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、１－アミノ－１－シクロヘキサンカルボン酸（１－ａｍｉｎｏ－ｌ－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、アミノ安息香酸、アミノナフトエ酸、γアミノ酪酸、ジフルオロフェニルアニリン、ニペコ酸、αアミノ酪酸、チエニルアラニン、ｔ－ブチルグリシン、トリフルオロバリン；ヘキサフルオロロイシン；フッ化類似体；アジド修飾アミノ酸；アルキン修飾アミノ酸；シアノ修飾アミノ酸；およびこれらの誘導体が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ポリペプチド、例えば、変異コロナウィルスポリペプチドは、例えば、一緒にペプチドを構成する１種または複数のアミノ酸への付加により、修飾され得る。修飾および／または部分の非限定的例には、ペグ化；グリコシル化；ヘシル化（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ）；ＥＬＰｙｌａｔｉｏｎ；脂質化；アセチル化；アミド化；エンドキャッピング修飾；シアノ基；リン酸化；アルブミンコンジュゲーション、および環化が挙げられる。所与の溶液（即ち、水溶液）中での可溶化を改善する修飾または部分は、本明細書で特に意図されている。

元のアミノ酸配列の変化は、当業者に既知の多数の技術のいずれかにより達成できる。例えば、天然配列のフラグメントへの連結を可能にする制限酵素部位に挟まれた変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の位置で、核酸レベルで変異を導入できる。連結後、得られた再構築配列は、目的のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異法を用いて、置換、欠失、または挿入により変更された特定のコドンを有する改変されたヌクレオチド配列を提供できる。このような変化を作製する技術には、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．“Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２００２；Ｂｒａｍａｎ “Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ” Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２００４；およびＲａｐｌｅｙ “Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ” Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０００；により開示されたものが挙げられる。これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のポリペプチドは、化学的に合成でき、変異は、化学合成工程の一部として組み込むことができる。

本明細書で記載の変異スパイクタンパク質またはＲＢＤポリペプチドは、組換え法および化学合成を含むよく知られた方法を用いて合成できる。ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターの好適な宿主細胞中への導入によりポリペプチドを産生する組換え法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ，Ｖｏｌｓ １ ｔｏ ８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｂ．Ｍ．Ｄｕｎｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌ ３５，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔａｗａ，ＮＪ（１９９４）に記載されているように、当該技術分野において周知である。これらの文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ペプチドはまた、当該分野で周知の方法を使用して化学的に合成できる。例えば、以下の文献を参照されたい。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６４）；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｉｍｍｅｒｌｉｎ，Ｔ．ａｎｄ Ｓｅｅｂａｃｈ，Ｄ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６５：２２９－２６０（２００５）；Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．（２００５）３４：９１－１１８；Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ（Ｅｄｓ．）Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｒｙ，ＮＣ（２０００）；Ｎ．Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（２００５）；Ｊ．Ｊｏｎｅｓ，Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｒｙ，ＮＣ（２００２）；およびＰ．Ｌｌｏｙｄ－Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，ａｎｄ Ｅ．Ｇｉｒａｌｔ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９７）。これら全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ペプチド誘導体はまた、米国特許第４，６１２，３０２号；同第４，８５３，３７１号；および同第４，６８４，６２０号、ならびに米国特許出願公開第２００９／０２６３８４３号に記載されているようにして調製できる。これらの全ての特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

ＲＢＤポリペプチドまたは変異導入コロナウィルスＳタンパク質の製造と精製
ＲＢＤポリペプチドまたは変異コロナウィルスＳタンパク質（これらの用語は本明細書で使用されているものとする）は、例えば、溶液または固相ペプチド合成、またはＤｕｇａｓら（１９８１）に記載の従来の溶液法により連結されたタンパク質フラグメントから始まる半合成により化学的に製造できる。しかし、組換え法を用いて本明細書で記載のポリペプチドを合成するのが通常好ましい。

本明細書で記載の方法および組成物で有用なポリペプチドをクローニングおよび発現するための系には、組換え技術で良く知られている種々の微生物および細胞が含まれ、従って、本明細書では詳細に記述されない。これらには、例えば、大腸菌、桿菌、ストレプトマイセスおよび酵母類の種々の株、ならびに哺乳動物、酵母および昆虫細胞が挙げられる。本明細書で記載のポリペプチドは、所望であれば、ペプチドまたは融合タンパク質として産生できる。ペプチドおよびポリペプチドを産生するための好適なベクターは既知であり、民間および公的研究所および供託所ならびに市販品納入業者から入手可能である。遺伝子産物を発現できるレシピエント細胞は、その後に遺伝子導入される。遺伝子導入されたレシピエント細胞は、組み換え遺伝子産物の発現を可能にする条件下で培養され、組み換え遺伝子産物は培養物から回収される。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ－１細胞などの宿主哺乳動物細胞を使用できる。これらの宿主は、ワクシニアまたは豚痘などのポックスウィルス発現ベクターと併せて使用できる。合成遺伝子を宿主細胞中に運ぶように改変できる好適な非病原性ウィルス発現ベクターには、ワクシニア、アデノウィルス、レトロウィルス、などのポックスウィルス発現ベクターが挙げられる。多数のこのような非病原性ウィルス発現ベクターがヒト遺伝子療法のために、および他のワクチン薬剤のための担体としてよく使用され、よく知られており、当業者により選択できる。他の好適な宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物製造ならびに精製のための方法は、既知の技術を参照することにより、当業者により実施され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のように、合成された変異ポリペプチドを単離および／または精製することが望ましい場合がある。タンパク質精製技術は、当業者には周知であり、従って、本明細書では詳細に記述されない。これらの技術は、１つのレベルで、ホモジナイゼーションおよび細胞、組織または臓器のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への粗分別を含み得る。変異体コロナウィルススパイクタンパク質または受容体結合ドメインポリペプチドは、クロマトグラフおよび電気泳動技術を用いてさらに精製して、部分的または完全精製（または均質性までの精製）を達成できる。純粋なペプチドまたはポリペプチドの調製に特に向いている分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、親和性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動である。特に有効なペプチド／ポリペプチド精製方法は、高性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）あるいは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。

「精製ポリペプチド」は、他の成分から分離できる組成物を意味することが意図され、変異体コロナウィルスＳポリペプチドまたはその受容体結合ドメインは、生物産生組換えタンパク質またはその天然で得られる状態に対して、任意の程度に精製される。単離または精製ポリペプチドはまた、従って、それが天然で発生する環境から束縛されないポリペプチドを意味する。一実施形態では、「精製」は、種々の他の成分を除去するために、分別に供されたポリペプチド組成物で、天然のまたは野生型コロナウィルスＳタンパク質に結合するコロナウィルス抗体に結合する能力を実質的に保持しているポリペプチド組成物を意味する。用語「実質的に精製」が使用される場合、この指定は、コロナウィルスポリペプチドが、例えば、組成物中の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ超のタンパク質を構成する組成物の主要成分を形成する組成物を意味する。

本明細書で記載のポリペプチドが最も精製された状態で提供される一般的な要件は存在しない。実際に、より低い精製生成物は、特定の実施形態中で有用であることが意図されている。部分精製は、より少ない精製ステップを組み合わせて用いて達成できるか、または異なる形態の同じ一般精製スキームを利用することにより達成できる例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは通常、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技術よりも大きな「倍数」の精製が得られることは理解されよう。より低い程度の相対精製を示す方法は、タンパク質生成物の全回収または発現タンパク質の活性の維持における利点を有し得る。

所与のポリペプチドの精製の程度を定量化する各種方法が当業者に既知であり、例えば、活性画分の比活性を測定すること、または画分内のポリペプチドの量をＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により評価することを含む。

コロナウィルス融合タンパク質および足場
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の受容体結合ドメインポリペプチドまたは変異コロナウィルスＳタンパク質は、融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のＲＢＤポリペプチドまたは変異コロナウィルスＳタンパク質は、足場、ナノ粒子、異種の足場タンパク質、またはポリマーに融合される。特定の実施形態では、異種の足場タンパク質は、配列番号３のＩ５３－５０三量体「Ａ」成分を含む。 他の実施形態では、異種の足場タンパク質は、米国特許第１０，３５１，６０３号の表１に記載の異種の足場タンパク質を含む。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の変異体コロナウィルスポリペプチドは、融合タンパク質として提供される。このような融合タンパク質は、例えば、得られる免疫応答を高めるために抗原性部分を含み得る。このような抗原性部分は、本明細書で記載の融合タンパク質を用いてワクチン接種される個体に対し異種である担体タンパク質などの異種分子を含み得る。免疫応答を活性化し、本明細書で記載の融合タンパク質と結合できる異種タンパク質は、少なくとも約２０，０００ダルトン、好ましくは少なくとも約４０，０００ダルトン、より好ましくは少なくとも約６０，０００ダルトンの分子量を有するタンパク質または他の分子を含む。このような状況で有用な担体タンパク質には、例えば、ＧＳＴ、鍵穴カサガイ由来などのヘモシアニン、血清アルブミンまたはカチオン化血清アルブミン、チログロブリン、卵白アルブミン、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドなどの種々のトキソイドタンパク質、免疫グロブリン、ヒートショックタンパク質、などが挙げられる。

化学的に１つのタンパク質（例えば、ＲＢＤポリペプチドまたは変異コロナウィルスＳタンパク質）を別のタンパク質（例えば、担体または抗原性部分）に化学的に連結する方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、１－エチル－３－（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性カルボジイミドによる結合、例えば、ＮＨＳエステル基またはスルホ－ＮＨＳエステル類似体を有するホモ二官能性架橋剤による結合、例えば、ＮＨＳエステルおよびスルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、などのマレイミド基ヘテロ二機能性架橋剤による結合、ならびにグルタルアルデヒドによる結合が挙げられる。

タンパク質ベースウィルス様粒子
本開示は、タンパク質ベースウィルス様粒子（ＶＬＰ）をさらに提供する。ｐｂＶＬＰは、融合タンパク質を含む記載の受容体結合ドメインポリペプチドまたは変異コロナウィルスＳタンパク質を含み、融合タンパク質は、本明細書で記載の「第１の成分」などの多量体化ドメインを含む。

本明細書で記載の方法および組成物で使用するためのＶＬＰは、ＲＢＤの外部ドメインまたはコロナウィルススパイクタンパク質の外部ドメイン、またはそれらの抗原性フラグメントの提示に適合された多量体タンパク質構築物を含み得る。本明細書で記載の方法および組成物で使用するためのＶＬＰは、少なくとも第１の複数ポリペプチドを含み得る。第１の複数ポリペプチド（「第１の成分」とも呼ばれる）は、天然起源タンパク質配列から少なくとも１つのアミノ酸残基の置換により、１種または複数の残基のまたはＮまたはＣ末端での付加により、誘導され得る。場合によっては、第１の成分は、コンピューター法により決定されたタンパク質配列を含む。この第１の成分は、ＶＬＰ全コア部を形成できる；またはＶＬＰのコア部は１つまたは複数の追加のポリペプチド（「第２の成分」または第３の、第４の、第５の成分、などとも呼ばれる）を含み、それにより、ＶＬＰは、２、３、４、５、６、７つ、またはそれを超える複数ポリペプチドを含む。場合によっては、第１の複数状態は、３回転対称により関連付けられた三量体を形成し、第２の複数状態は、５回転対称により関連付けられた五量体を形成する。このような場合には、ＶＬＰは、Ｉ５３対称を有する「二十面体粒子」を形成する。これらの１つまたは複数ポリペプチドは一緒に、複数ポリペプチドの各メンバーが対称演算子により相互に関連するように、配置できる。タンパク質構成単位のシンメトリカルドッキングを伴う、自己集合性タンパク質物質を設計する一般的コンピューター法は、米国特許出願公開第２０１５／０３５６２４０Ａ１号に開示されている。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＶＬＰの「コア部」は、本明細書では、ＶＬＰにより提示される、ＲＢＤまたはコロナウィルスＳタンパク質外部ドメイン、またはそれらの抗原フラグメントのいくつかのコピーを一緒に連結するＶＬＰの中心部分を記載するために使用される。ある実施形態では、第１の成分は、ＲＢＤを含む第１のポリペプチド、リンカー、および多量体化ドメインを含む第１のポリペプチドを含む。

非限定的実施形態を図６Ａに示し、これは、ＶＬＰの成分に遺伝的に融合されたＲＢＤを示し、ＶＬＰは任意選択で、宿主細胞中で組換え発現される（例えば、２９３Ｆ細胞）；これは、五量体タンパク質構築物と共に、任意選択で同じまたは異なる宿主細胞（例えば、大腸菌細胞）中で組換え発現され、これら２つの複数ポリペプチドは、２０個の抗原三量体を二十面体コア部の周辺に提示するＶＬＰに自己集合する。

場合によっては、ＶＬＰは、コロナウィルスの２つ以上の多様な株由来のＲＢＤまたはスパイクタンパク質を提示するように適合される。非限定的例では、同じＶＬＰは、タンパク質抗原の混合種個体群またはコロナウィルスの種々の株由来のタンパク質抗原の混合ヘテロ三量体を提示する。

本明細書で記載の方法および組成物で使用するためのＶＬＰは、遺伝子融合体としてまたは本明細書で開示の他の手段によるなどの種々の方法で抗原性タンパク質を提示する。本明細書で使用される場合、「に連結」または「に結合」は、２つのポリペプチドを結合させるために、当該技術分野において公知の任意の手段を意味する。結合は、直接的または間接的、可逆的または不可逆的、弱いまたは強い、共有または非共有、および選択的または非選択的であってよい。

いくつかの実施形態では、結合は、ＶＬＰを含む複数ポリペプチドの１つに対する抗原のＮまたはＣ末端融合体を遺伝子工学で作製することにより、達成される。従って、ＶＬＰは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の複数抗原を提示する１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の複数ポリペプチドからなり得、または基本的になり得、少なくとも１つの複数の抗原は、少なくとも１つの複数のポリペプチドに遺伝的に融合される。場合によっては、ＶＬＰは、自己集合でき、それに遺伝的に縮合された複数の抗原性タンパク質を含む１つの複数ポリペプチドから基本的になる。場合によっては、ＶＬＰは、複数の抗原を含む第１の複数ポリペプチド；および２成分ＶＬＰ、抗原性タンパク質をＶＬＰに連結する１つの複数ポリペプチドおよびＶＬＰの自己集合を促進するその他の複数ポリペプチドに共集合できる第２の複数ポリペプチドから基本的になる。

いくつかの実施形態では、結合は、１つまたは複数ポリペプチドと、１つまたは複数抗原性タンパク質との間の翻訳後共有結合により達成される。場合によっては、化学的架橋は、非特異的に抗原をＶＬＰポリペプチドに結合するために使用される。場合によっては、化学的架橋は、抗原性タンパク質をＶＬＰポリペプチド（例えば、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチド）に特異的に結合するために使用される。クリックケミストリーおよび他の方法などの種々の特異的および非特異的架橋化学反応が当技術分野において既知である。一般に、２つのタンパク質を連結するために使用されるいずれの架橋化学反応も、本明細書で開示のＶＬＰを用いた使用に適合させ得る。特に、免疫複合体または抗体薬物複合体の生成に使用される化学反応を使用し得る。場合によっては、ＶＬＰは、切断可能なまたは切断不能リンカーを用いて作製される。抗原の担体への結合工程および方法は、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１４５３７３Ａ１号により提供される。この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示のＶＬＰの成分は、種々のアミノ酸配列のいずれかを有し得る。米国特許出願公開第２０１５／０３５６２４０Ａ１号（この特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、タンパク質構築物の設計のための種々の方法を記載している。米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２Ａ１号および国際公開第ＷＯ２０１４／１２４３０１Ａ１号に記載のように、ポリペプチドが、ペアーで自己集合して二十面体粒子などのＶＬＰを形成するそれらの能力のために、設計された。設計は、集合してＶＬＰを形成できるポリペプチド対の各メンバーのための好適な界面残基の設計を含む。そのように形成されたＶＬＰは、二十面体対称を有するものなどのような、第１の構築体および第２の構築体をＶＬＰに配向させる対称的に反復された、非天然の、非共有結合ポリペプチド－ポリペプチド界面を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＢＤまたはコロナウィルスＳタンパク質外部ドメイン、またはその抗原フラグメントは、第１の多量体化ドメインとの融合タンパク質として発現される。いくつかの実施形態では、第１の多量体化ドメインおよびＲＢＤまたはコロナウィルスＳタンパク質外部ドメインは、リンカー配列により連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、フォルドンを含み、フォルドン配列は、ＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫ（配列番号８）である。

本開示のタンパク質ベースＶＬＰに有用な設計されたタンパク質複合体の非限定的例には、米国特許第９，６３０，９９４号；国際公開第ＷＯ２０１８１８７３２５Ａ１号；米国特許出願公開第２０１８／０１３７２３４Ａ１号；米国特許出願公開第２０１９／０１５５９８８Ａ２号に開示されたものが挙げられる。これらの特許文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。例示的配列は、表３に提供される。

いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、配列番号９～１３のいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する融合タンパク質を含み、および本明細書で開示のＲＢＤまたはコロナウィルススパイクタンパク質；および配列番号１３～１８のいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する第２の成分を含む。

いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、配列番号１９と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する融合タンパク質を含み、および本明細書で開示のＲＢＤまたはコロナウィルススパイクタンパク質；および配列番号２０と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する第２の成分を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示のポリペプチドは、配列番号６または配列番号７のポリペプチド配列を含む。
ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＦＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＷＴＮＩＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（配列番号６）
ＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＦＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＷＴＮＩＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＮＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＫＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＹＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥ（配列番号７）

タンパク質安定性
ほとんどの生物学的産物は、熱的、光化学的、または酸化的分解などの分解を受ける傾向がある。ワクチンおよびインスリンなどの生物由来物質は、世界中に配布する必要があり、異なる地域の周囲温度は大きく変化するので、急速に分解するタンパク質／組成物と比べて、延長された貯蔵寿命（または貯蔵中に安定化されているタンパク質）を有するワクチンが好ましい。増大した細胞内安定性はまた、組換えタンパク質のより大きな収率をもたらし得る。本明細書で記載の変異コロナウィルススパイクタンパク質またはその受容体結合ドメインは、それらの野生型対応物と比較して、増大した安定性を有する。これらのタンパク質の安定性は、当該技術分野において既知の１種または複数のアッセイを用いて、または実施例で記載の方法を用いて決定できる。例示的タンパク質安定性アッセイには、限定されないが、示差走査熱量測定、パルスチェイス法、ブリーチチェイス（ｂｌｅａｃｈ ｃｈａｓｅ）法、シクロヘキサミドチェイス法、円偏光二色性分光分析、および蛍光系活性アッセイが挙げられる。

所与の組成物の安定性は、単離調製物またはワクチン調製物に適用される場合、組成物の「貯蔵寿命」とも本明細書で呼ばれ、組成物の貯蔵条件ならびに組成物の処方（例えば、化学成分の添加）または組成物が提供される物理的状態（例えば、凍結乾燥、乾燥、凍結、など）に依存する。

本明細書で使用される場合、用語「凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、または「凍結乾燥された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）」は、脱水過程を意味し、一般に、「凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）」と呼ばれ、本明細書で記載の組成物を保存するために、または組成物を貯蔵および輸送に好都合にするために使用される。凍結乾燥は、組成物を凍結した後、周囲圧力を下げて、組成物中の凍結水を固相から気相へ直接昇華させることにより機能する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、本明細書で記載のワクチン組成物を保存し、それにより、ワクチン組成物を持ち運び可能にし、冷蔵の必要なしに、室温で貯蔵可能にする。

本明細書で記載の変異により提供される抗原の増大した安定性に加えて、酸化防止剤またはワクチン組成物の貯蔵寿命を伸ばすことを目的とする他の薬剤も同様に本明細書で意図されている。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の組成物は、室温で貯蔵し、冷蔵する必要性をなくすことが意図されている。

貯蔵方法に関わらず、変異コロナウィルススパイクタンパク質またはそのＲＢＤは、対応する野生型コロナウィルススパイクタンパク質またはそのＲＢＤのタンパク質安定性および組成物貯蔵寿命に比べて、タンパク質安定性および組成物貯蔵寿命の両方が増大する。

本明細書で記載の変異コロナウィルスタンパク質またはペプチドを含む配合物は、所定の温度での一定の期間にわたり、それらの特性変化がわずかであるという点で、安定である。一般に、本明細書で記載の配合物は、少なくとも約１か月安定である。いくつかの実施形態では、配合物は、少なくとも約６週間、少なくとも約２か月、少なくとも約４か月、少なくとも約６か月、少なくとも約８か月、少なくとも約１０か月、少なくとも約１２か月（１年間）、少なくとも約１４か月、少なくとも約１６か月、少なくとも約１８か月（１．５年間）、少なくとも約２０か月、少なくとも約２２か月、少なくとも約２４か月（２年間）、少なくとも約２６か月、少なくとも約２８か月、少なくとも約３０か月、少なくとも約３２か月、少なくとも約３４か月、少なくとも約３６か月（３年間）、少なくとも約３８か月、少なくとも約４０か月、少なくとも約４２か月、少なくとも約４４か月、少なくとも約４６か月または少なくとも約４８か月（４年間）にわたり安定である。

配合物が安定である温度は通常、約３０℃未満である。いくつかの実施形態では、配合物安定性は、約２５℃、約２０℃、約１５℃、約１０℃、約８℃、約５℃、約４℃、または約２℃未満の温度を基準にしている。従って、いくつかの実施形態では、温度は、約２５℃～約２℃、約２０℃～約２℃、約１５℃～約２℃、約１０℃～約２℃、約８℃～約２℃、または約５℃～約２℃の範囲である。他の実施形態では、温度は、約２５℃～約５℃、約２０℃～約５℃、約１５℃～約５℃、約１０℃～約５℃、または約８℃～約５℃の範囲である。さらに他の実施形態では、温度は、約２５℃～約８℃、約２０℃～約８℃、約１５℃～約８℃、または約１０℃～約８℃の範囲である。さらに他の実施形態では、温度は、約２５℃～約１０℃、約２０℃～約１０℃、約１５℃～約１０℃、約２５℃～約１５℃、約２０℃～約１５℃、または約２５℃～約２０℃の範囲である。いくつかの実施形態では、組成物は、長期的貯蔵のために、４℃または－２０℃で貯蔵できる。

ワクチン組成物
本明細書で記載のＲＢＤポリペプチド、変異コロナウィルスＳタンパク質またはそれらを含む融合タンパク質は、ワクチン製剤の製造に使用できる。このようなワクチン製剤は、ヒト個体に感染することが既知の７種のコロナウィルスのそれぞれに対し保護を提供できる、またはヒトに感染することが既知の７種のコロナウィルスの内の、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、または少なくとも６種に対して保護を提供できる。一実施形態では、本明細書で記載のワクチン製剤は、ヒトに感染することが既知のコロナウィルスの７種全てに対し、保護を提供できる。本明細書で記載のワクチン製剤は、将来、動物種（例えば、コウモリ）からヒトへ感染することが予測されるコロナウィルスに対して保護を提供できることも本明細書で特に意図されている。他の実施形態では、本明細書で記載のワクチン製剤は、１種または複数のコロナウィルスに対する感受性の高い動物に対する保護を提供できる。本明細書で記載の変異スパイクタンパク質ポリペプチドをコードするＲＮＡおよび／またはＤＮＡワクチン製剤はまた、本明細書で特に意図されている。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のコロナウィルス抗原に対し生成された免疫は、長く持続する（例えば、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、あるいは、対象の全寿命期間の間）。あるいは、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のワクチン製剤は、インフルエンザワクチンによる免疫化と同様に、蔓延している、または蔓延すると予測される標的ウィルス株に合わせて、年間ベースで投与され、最後の投与から少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも８か月間、少なくとも１年間、少なくとも１．５年間、または少なくとも２年間にわたり保護を提供できることが意図されている。

当業者は、地域免疫または集団免疫を１種または複数のコロナウィルスに付与するために、コロナウィルスワクチン製剤の１００％の有効性は要求されないことを理解するであろう。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のワクチン製剤は、ワクチン接種個体の集団中の少なくとも４０％が有効である、例えば、ワクチン接種個体の集団中の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％が有効である。

いくつかの実施形態では、地域感染を減らし、コロナウィルス感染および伝播を防ぐ／制御するために、本明細書で記載のワクチンを、ユニバーサルワクチネーションとして健康な子供および個体に投与できる。子供は、より穏やかな症状を有し、コロナウィルス感染症であるとは必ずしも診断されないので、彼らは、学校、家庭および地域内でコロナウィルスの伝染に重要な役割を果たし得る。インフルエンザワクチンによる研究は、地域の約８０％の学童のワクチン接種が成人の呼吸器疾患および高齢者の過剰死亡を減らしたことを示した（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００１）。この概念は、地域免疫または「集団免疫」として知られ、疾患に対して地域の保護の重要な役割を果たすと考えられている。ワクチン接種した人は特定のウィルスを中和する抗体を有するので、彼らは、ウィルスを他の人に伝染させる可能性がはるかに少ない。この概念は、コロナウィルス感染症にも同様に適用できる。従って、ワクチン接種していない人でも（およびワクチン接種が弱まった人または完全に効果的でない人でも）多くの場合、周りの人がワクチン接種している人は病気にならない、またはウィルスを伝染させないので、集団免疫により遮蔽できる。集団免疫は、ワクチン接種した人が増加するに伴いより効果的になる。集団免疫を達成するためには、地域の人の約６０％（しかし、９０～９５％により近いのが好ましい）がワクチンにより保護される必要がある。免疫されていない人は、彼らまたはその他の人が病気になる確率を増大させる。

従って、別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で記載のワクチン製剤を地域の集団に投与することにより、免疫障害を持つ個体またはワクチン接種していない個体中のコロナウィルス感染症の発生率を減らすために、集団または地域に、コロナウィルス感染症に対する実質的に防御免疫を誘導する方法である。一実施形態では、ほとんどの学童期の子供は、本明細書で記載のワクチンを投与することによりコロナウィルス感染症に対し免疫される（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ超の学童期の子供が免疫される）。別の実施形態では、地域のほとんどの（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ超の）健康な個体は、本明細書で記載のワクチンを投与することにより、所与のコロナウィルスまたはコロナウィルス群に対し免役される。別の実施形態では、本明細書で記載のワクチンは、「動的ワクチン」戦略の一部として使用できる。動的ワクチンは、新たに出現したまたは既存の世界的流行株に関連するが、抗原変異のために、哺乳動物での完全な保護を提供し得ない低い有効性のワクチンの定常生産である（Ｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００６を参照）。世界的流行株の将来の同一性に関する不確定性のために、十分に適合した世界的流行株を備蓄するのはほぼ不可能である。しかし、不十分な適合性であるが、潜在的に効果的なワクチンは、世界的流行ウィルスの伝播を遅らせ、および／またはコロナウィルスの世界的流行株の症状の重症度を低減する可能性がある。一実施形態では、本明細書で記載のワクチンは、２０１９／２０２０ ＣＯＶＩＤ－１９世界的流行の原因である１種または複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して向けられる。

本明細書で記載のワクチン製剤は、コロナウィルス感染症に付随する少なくとも１つの症状を防止、または任意の症状の出現を完全に防止できる。コロナウィルス感染症の一般症状としては、限定されないが、発熱、悪寒、咳、息切れ／呼吸困難、疲労、筋肉／身体疼痛、頭痛、味または臭いの新規消失、咽頭炎、鬱血または鼻水、悪心、嘔吐、または下痢が挙げられる。症状の低減は、主観的にまたは客観的に、例えば、対象による自己評価、臨床医の評価または、例えば、生活の質評価、コロナウィルス感染症または追加の症状の進行の遅延化、コロナウィルス関連疾患症状の重症度の低下を含む適切なアッセイ（例えば、抗体価および／またはＴ細胞活性化アッセイ）または測定（例えば、体温、肺炎感染症の程度、肺の瘢痕形成、など）の実施により、判断され得る。

好ましくは、本明細書で記載のワクチン製剤は、ワクチン接種個体から個体の地域内他の人への、または２つの異なる個体間の活性コロナウィルスの感染を、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％あるいは１００％減らす（即ち、ワクチン接種個体および２つ以上の個体中の検出可能な感染がない）。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載のワクチン製剤は、１種または複数のアジュバントを含む。アジュバントの非限定的例には、完全フロインドアジュバント（死滅結核菌を含む免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロインドアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。他のアジュバントには、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、ｔｈｕｒ－ＭＤＰおよびｎｏｒ－ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ－ＰＥ）、リピドＡ、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が含まれる。細菌から抽出された３種の成分を含むＲＩＢＩ、ＭＰＬ、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）および２％スクアレン／ツイーン８０乳剤中の細胞壁骨格（ＣＷＳ）も意図されている。ＭＦ－５９、ノバソーム（登録商標）、ＭＨＣ抗原も使用できる。

一態様では、アジュバント効果は、ミョウバン（リン酸緩衝食塩水中の約０．０５～約０．１％の溶液で使用される）などの薬剤の使用により達成される。あるいは、本明細書で記載のワクチンは、約０．２５％溶液として使用される糖類の合成ポリマー（カーボポール（登録商標））との混合剤として作製できる。いくつかのアジュバント、例えば、細菌から得られる特定の有機分子は、抗原に対してではなく、宿主に対して作用する。例は、細菌性ペプチドグリカンであるムラミルジペプチド（Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＭＤＰ））である。他の実施形態では、ヘモシアニンおよびヘモエリトリンも、本明細書で記載のワクチン製剤と共に使用され得る。スカシガイ科のカサガイ類由来のヘモシアニン（ＫＬＨ）は、特定の実施形態で使用できるが、他の軟体動物および節足動物ヘモシアニンならびにヘモエリトリンは、代替実施形態で使用し得る。

種々の多糖類アジュバントも使用できる。例えば、種々の肺炎球菌多糖類アジュバントのマウスの抗体応答に対する効果が報告されている（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。最適応答を生成する投与量、または、示されるように、それがないと抑制が生じない投与量を採用すべきである（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。多糖類のポリアミン変種は、脱アセチル化キチンを含むキチンおよびキトサンなどが特に好ましい。別の実施形態では、ムラミルジペプチドの親油性の二糖トリペプチド誘導体を使用でき、これは、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形成された人工リポソーム中に入れて使用するために記載されている。

両親媒性および界面活性剤、例えば、サポニンおよびＱＳ２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）などの誘導体は、本明細書で記載のワクチン製剤中で使用するためのさらに別のアジュバント群を形成する。非イオン性ブロックコポリマー界面活性物質（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４）も使用できる。オリゴヌクレオチドアジュバント（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、Ｑｕｉｌ Ａおよびレンチネン（ｌｅｎｔｉｎｅｎ）は、特定の実施形態で使用できる他のアジュバントである。

加えて、解毒した精製エンドトキシンは、脊椎動物でアジュバント応答を生成するために、単独で、または複数アジュバント製剤として使用できる。例えば、解毒したエンドトキシンとトレハロースジマイコレートの組み合わせ、または解毒したエンドトキシンとトレハロースジマイコレートおよびエンドトキシン糖脂質の組み合わせが本明細書で意図されている。あるいは、解毒したエンドトキシンと細胞壁骨格（ＣＷＳ）またはＣＷＳとトレハロースジマイコレートの組み合わせ、または解毒したエンドトキシンなしのＣＷＳとトレハロースジマイコレートだけの組み合わせも意図されている。

当業者は、本明細書で記載のワクチンに結合できるまたはそれと混合できる異なる種類のアジュバントを知っており、これらには、特に、アルキルリゾホスホリピド（ＡＬＰ）；ＢＣＧ；およびビオチン（ビオチン化誘導体を含む）が含まれる。使用が意図されている特定のアジュバントは、グラム陰性菌細胞由来のタイコ酸である。これらには、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、リビトールタイコ酸（ＲＴＡ）およびグリセロールタイコ酸（ＧＴＡ）が含まれる。それらの合成対応物の活性型も使用できる。

種々のアジュバントが、ヒトには一般的に使用されないものも含めて、他の脊椎動物のためのワクチンとしての使用に想定されている。

ワクチン製剤は、当該技術分野において周知の方法を用いて（例えば、リポソーム（例えば、Ｇａｒｃｏｎ ａｎｄ Ｓｉｘ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３６９７（１９９１）参照）中に、例えば、ウシロタウィルスの内側カプシドタンパク質中に（Ｒｅｄｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２６９（１９９１））、Ｑｕｉｌ Ａなどのサポニンから構成される免疫刺激分子（ＩＳＣＯＭＳ）中に（Ｍｏｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０８：４５７（１９８４））；Ｍｏｒｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ａｌ．ｅｄｓ．）ｐｐ．１５３－１６２，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８７））、または例えば、ラクチド－グリコリドコポリマーから構成される徐放型生分解性マイクロスフェア中に（Ｏ’Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７３：２３９（１９９１）；Ｏ’Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：１４９（１９９３））、マイクロカプセル化またはマクロカプセル化されている本明細書で記載のコロナウィルスポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み得る。

本明細書で記載の安定化コロナウィルスポリペプチドまたはその融合タンパク質はまた、Ｌ－１２１などのプルロニックブロックコポリマーで調製され、ツイーン８０などの洗浄剤で安定化されたスクアレンまたはスクアラン乳剤を含む脂質マイクロスフェアの表面上に吸着され得る（Ａｌｌｉｓｏｎ ａｎｄ Ｂｙｅｒｓ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ（Ｒ．Ｅｌｌｉｓ ｅｄ．）ｐｐ．４３１－４４９，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ－Ｈｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｔｏｎｅｍａｎ Ｎ．Ｙ．（１９９２）を参照）。

本明細書で記載のワクチン製剤は、本明細書で記載の安定化コロナウィルスポリペプチドまたはその融合タンパク質を「有効量」または「治療有効量」で含む。本明細書で使用される場合、表現「有効量」または「治療有効量」は、そのレシピエント中で免疫応答を生成する（またはその生成に寄与する）ための十分高い濃度を提供するのに十分な投与量を意味する。任意の特定の対象に対する具体的な有効量レベルは、治療される障害、その障害の重症度、特定の化合物の活性、投与経路、投与された薬剤の排出速度、治療期間、投与される薬剤と組み合わせて、または同期して使われる薬物、対象の年齢、体重、性別、食事、および総体的な健康、ならびに医療技術および科学において周知の同様の因子を含む種々の要因に依存するであろう。「治療有効量」の決定で考慮される種々の一般的考察は、当業者に既知であり、例えば、Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９０；ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０に記載されている。

処方のｐＨも同様に変わってもよい。一般に、それは、約ｐＨ６．２～約ｐＨ８．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．２、約６．４、約６．６、約６．８、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、約７．８、または約８．０である。無論、ｐＨは一連のｐＨ値内であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．２～約８．０、約６．２～７．８、約６．２～７．６、約６．２～７．４、約６．２～７．２、約６．２～７．０、約６．２～６．８、約６．２～約６．６、または約６．２～６．４である。他の実施形態では、ｐＨは、６．４～約８．０、約６．４～７．８、約６．４～７．６、約６．４～７．４、約６．４～７．２、約６．４～７．０、約６．４～６．８、または約６．４～約６．６である。さらに他の実施形態では、ｐＨは、約６．６～約８．０、約６．６～７．８、約６．６～７．６、約６．６～７．４、約６．６～７．２、約６．６～７．０、または約６．６～６．８である。さらに他の実施形態では、ｐＨは、約６．８～約８．０、約６．８～７．８、約６．８～７．６、約６．８～７．４、約６．８～７．２、または約６．８～７．０である。さらに他の実施形態では、ｐＨは、約７．０～約８．０、約７．０～７．８、約７．０～７．６、約７．０～７．４、約７．０～７．２、約７．２～８．０、約７．２～７．８、約７．２～約７．６、約７．２～７．４、約７．４～約８．０、約７．４～約７．６、または約７．６～約８．０である。

いくつかの実施形態では、製剤は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはこれらの組み合わせなどの１種または複数の塩を含み得る。一般に、各塩は、製剤中で、約１０ｍＭ～約２００ｍＭで存在する。従って、いくつかの実施形態では、存在する任意の塩は、約１０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２５ｍＭ～約２００ｍＭ、約３０ｍＭ～約２００ｍＭ、約４０ｍＭ～約２００ｍＭ、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、約７５ｍＭ～約２００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約１２５ｍＭ～約２００ｍＭ、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１７５ｍＭ～約２００ｍＭで存在する。他の実施形態では、存在する任意の塩は、約１０ｍＭ～約１７５ｍＭ、約２０ｍＭ～約１７５ｍＭ、約２５ｍＭ～約１７５ｍＭ、約３０ｍＭ～約１７５ｍＭ、約４０ｍＭ～約１７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約１７５ｍＭ、約７５ｍＭ～約１７５ｍＭ、約１００ｍＭ～約１７５ｍＭ、約１２５ｍＭ～約１７５ｍＭ、または約１５０ｍＭ～約１７５ｍＭで存在する。さらに他の実施形態では、存在する任意の塩は、約１０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約２５ｍＭ～約１５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約４０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約７５ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、または約１２５ｍＭ～約１５０ｍＭで存在する。さらに他の実施形態では、存在する任意の塩は、約１０ｍＭ～約１２５ｍＭ、約２０ｍＭ～約１２５ｍＭ、約２５ｍＭ～約１２５ｍＭ、約３０ｍＭ～約１２５ｍＭ、約４０ｍＭ～約１２５ｍＭ、約５０ｍＭ～約１２５ｍＭ、約７５ｍＭ～約１２５ｍＭ、または約１００ｍＭ～約１２５ｍＭで存在する。いくつかの実施形態では、存在する任意の塩は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２５ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、または約７５ｍＭ～約１００ｍＭで存在する。さらに他の実施形態では、存在する任意の塩は、約１０ｍＭ～約７５ｍＭ、約２０ｍＭ～約７５ｍＭ、約２５ｍＭ～約７５ｍＭ、約３０ｍＭ～約７５ｍＭ、約４０ｍＭ～約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ～約７５ｍＭで存在する。さらに他の実施形態では、存在する任意の塩は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２５ｍＭ～約５０ｍＭ、約３０ｍＭ～約５０ｍＭ、または約４０ｍＭ～約５０ｍＭで存在する。他の実施形態では、存在する任意の塩は、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２５ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、または約１０ｍＭ～約２０ｍＭで存在する。一実施形態では、塩化ナトリウムは、製剤中に約１００ｍＭで存在する。一実施形態では、リン酸ナトリウムは、製剤中に約２５ｍＭで存在する。

本明細書で記載の変異コロナウィルスタンパク質を含む製剤は、非イオン洗浄剤などの可溶化剤をさらに含み得る。このような洗浄剤には、限定されないが、ポリソルベート８０（ツイーン（登録商標）８０）、トリトンＸ１００およびポリソルベート２０が挙げられる。

ワクチン投与および有効性
本明細書で記載のワクチン製剤は、任意の好適な希釈剤または賦形剤を含む薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、これには、それ自体組成物を投与された脊椎動物に有害な免疫応答の生成を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る任意の医薬品が含まれる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、脊椎動物、さらに限定すればヒトで使用するために、連邦または州政府の規制当局によって承認されている、あるいは米国薬局方、欧州薬局方または他の一般的に認められている薬局方に収載されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物で防御免疫応答を誘導するためにワクチンおよび／または抗原組成物として有用であり得る。

薬学的に許容可能な担体または賦形剤には、限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、無菌等張性緩衝水溶液、およびこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、および他の賦形剤の完全な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ）に示されている。 製剤は、投与方法に適合する必要がある。好ましい実施形態では、配合物は、ヒトへの投与に好適し、好ましくは無菌の非粒子および／または非発熱性である。

必要に応じ、組成物は少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。組成物は、再構成に好適な凍結乾燥粉末などの固形、液体溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、持続放出製剤、または粉剤であり得る。経口製剤には、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム、などを含めることができる。

通常、本明細書で記載のコロナウィルスワクチンは、有効量または１種または複数のコロナウィルス株に対して免疫応答を刺激するのに十分な量で投与される。好ましくは、ワクチン製剤の投与は、少なくとも１種のコロナウィルスに対して実質的免疫を誘発する。通常、投与量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与時期、および他の臨床因子に応じて調節できる。

単回投与による実質的免疫の刺激が好ましいが、同じまたは異なる経路により追加の投与量を投与して、目的の効果を達成できる。新生児および乳幼児では、例えば、複数投与が十分なレベルの免疫を誘発するために必要になる場合がある。投与は、コロナウィルス感染症に対して十分なレベルの保護を維持するために、必要に応じ、小児期全体を通して間隔を置いて継続することができる。同様に、例えば、健康管理作業者、デイケア作業者、幼児のファミリーメンバー、高齢者、損傷心肺機能を有する個体などの特に重篤な疾患の影響を受けやすいまたは感染を繰り返す成人は、防御免疫応答を樹立および／または維持するために、複数回の免疫化が必要となる場合がある。誘導免疫のレベルは、所望のレベルの保護を誘発および維持するために、必要に応じ、例えば、中和分泌および血清抗体の量、ならびに、調整された投与量または反復されたワクチン接種を測定することにより、監視できる。

予防ワクチン製剤は、例えば、針および注射器または無針注入装置を用いて、皮下または筋肉注入により、全身投与できる。あるいは、ワクチン製剤は、点滴剤、大きな粒子のエアロゾル（約１０ミクロンより大きい）、または上気道への噴霧により鼻腔内に投与される。上記いずれかの送達経路は、免疫応答を生じ得るが、鼻腔内投与は、コロナウィルスの侵入部位の１つで粘膜免疫誘発の追加のメリットを付与し得る。

本明細書で記載のワクチン製剤の投与の非限定的方法としては、限定されないが、非経口的投与（例えば、皮内、筋肉内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば、鼻腔内および経口または肺経路または坐剤により）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で記載のワクチン組成物は、筋肉内、静脈内、皮下、経皮または皮内に投与される。組成物は、任意の簡便な経路で投与され得、例えば、注入またはボーラス注入により、上皮または皮膚粘膜表層（例えば、口腔粘膜、結腸、結膜、鼻咽頭、中咽頭、膣、尿道、膀胱および腸粘膜、など）による吸収によって投与され、および他の生理活性物質と共に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の鼻腔内または他の粘膜のワクチン組成物投与経路は、他の投与経路よりも実質的に高い抗体または他の免疫応答を誘導し得る。別の実施形態では、本明細書で記載の鼻腔内または他の粘膜のワクチン組成物投与経路は、他のコロナウィルス株に対して交差防御を誘導する抗体または他の免疫応答を誘導し得る。投与は、全身性または局所的であり得る。いくつかの実施形態では、ワクチン製剤は、免疫化の部位で免疫応答を誘発するために、粘膜組織を標的にするような方法で投与される。例えば、腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）などの粘膜の組織は、特定の粘膜標的化特性を有するアジュバントを含む組成物の経口投与を用いて免疫化の標的にされ得る。鼻咽頭リンパ組織（ＮＡＬＴ）および気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）などの追加の粘膜組織も、標的にされ得る。

本明細書で記載のワクチン製剤はまた、投与スケジュール、例えば、ワクチンの初期投与に続けて、ブースター投与に基づいて投与できる。特定の実施形態では、第２の組成物投与は、２週間後～１年後のどこかで、好ましくは、初期投与の約１か月後から、約２か月後から、約３か月後から、約４か月後から、約５か月後から約６か月後に投与される。さらに、第３の投与は、第２の投与後で、初期投与から３か月後から約２年後に、あるいはより長期に、好ましくは約４か月後、約５か月後または約６か月後、または約７か月後から約１年後に投与され得る。第３の投与は、第２の投与後に、免疫グロブリンの非存在または低いレベルの存在が対象の血清および／または尿または粘膜の分泌物で検出される場合に、任意選択で投与され得る。好ましい実施形態では、第２の投与は、第１の投与の約１か月後に投与され、第３の投与は、第１の投与の約６か月後に投与される。別の実施形態では、第２の投与は、第１の投与の約６か月後に投与される。

医薬製剤の投与量は、当業者により容易に、例えば、最初に、予防的または治療的免疫応答を誘発するのに効果的な量を、例えば、ウィルス特異的免疫グロブリンの血清力価の測定により、または血清試料または尿試料または粘膜の分泌物中の抗体の阻害比率を測定することにより、特定することにより容易に決定できる。前記投与量は、動物試験から決定できる。コロナウィルスを試験するために使用される動物の非限定的リストには、モルモット、シリアンハムスター、チンチラ、ヘッジホッグ、ニワトリ、ラット、マウス、ブタ、ウシ、コウモリおよびケナガイタチが挙げられる。コウモリは特にコロナウィルスに対する天然の宿主と考えられ、ワクチンの研究または試験に特に有用であり得る。しかし、いずの上記動物も、本明細書で記載のようにワクチン製剤で投与して、誘導された免疫応答を部分的に特徴付けることができ、および／またはなんらかの中和抗体が生成されたかどうかを判定できる。

加えて、ヒト臨床試験を、当業者によりヒトに好ましい有効量を決定するために実施できる。このような臨床試験は定型業務であり、当該技術分野において周知である。用いられる正確な投与量はまた、投与経路に依存する。有効量は、インビトロまたは動物試験系から由来の用量反応曲線から外挿できる。

免疫応答を誘導する、または高める別の方法は、本明細書で記載のようにワクチン組成物を調製し、免疫賦活、免疫強化、および／または炎症促進活性を有する１種または複数のサイトカイン、リンホカインまたはケモカインなどの１種または複数の免疫刺激剤（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３）、成長因子（例えば、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子コロニー刺激因子（ＣＳＦ））；およびマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１；Ｂ７．２、などの他の免疫賦活分子を含めることにより達成できる。このような免疫賦活分子は、コロナウィルスワクチン製剤ワクチン製剤と同じ配合物中に入れて、または別々に、投与できる。

本明細書で記載のＲＢＤポリペプチドまたは安定化コロナウィルススパイクタンパク質は、脊椎動物（例えば、ヒト）に投与される場合に、脊椎動物中で実質的免疫を誘導できるワクチン製剤で使用できる。実質的免疫は、ＲＢＤポリペプチドまたは安定化コロナウィルススパイクタンパク質に対する免疫応答から生じ、前記脊椎動物のコロナウィルス感染症に対し保護する、またはウィルス感染症を回復する、または、コロナウィルスウィルス感染症の症状を少なくとも軽減する。いくつかの事例では、ワクチン接種し、その後感染した対象は、無症候性である。しかし、応答は、完全に防御反応ではなく、部分的な免疫応答もまた本明細書で意図されている。例えば、後でコロナウィルスに感染した部分的保護対象は、非免疫された脊椎動物に比べて、低減した重度症状、またはより短い症状の期間を経験する。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２安定化スパイクタンパク質を含む製剤をワクチン接種した対象は、ＣＯＶＩＤ－１９を治療するために、長期入院または人工呼吸器の使用を必要としない可能性がある。

一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象の１種または複数のコロナウィルスによる感染症または少なくとも１つのその症状に対する実質的免疫を誘導する方法であり、該方法は、本明細書で記載のＲＢＤポリペプチドまたは安定化コロナウィルスＳタンパク質を含む少なくとも１種の有効量のワクチン製剤を投与することを含む。別の実施形態では、前記実質的免疫の誘導は、コロナウィルス関連病徴（例えば、ＳＡＲＳ、ＣＯＶＩＤ－１９）の期間を短くする。

一実施形態では、本明細書で記載のワクチン製剤は、コロナウィルスの１種以上の株に対して保護を提供する免疫応答を誘発できる。安定化コロナウィルスＳタンパク質または特定の亜群の特定の株から構築されたＲＢＤポリペプチドによる脊椎動物のこの交差防御は、異なる株および／または亜群のコロナウィルスに対して交差防御を誘導できる。
キット

さらに本明細書で提供されるのは、個体または動物のワクチン接種のための、本明細書で記載のワクチン製剤の１種または複数の成分を充填した１つまたは複数の容器を含むキットである。一実施形態では、キットは、２つの容器を含み、１つは、安定化コロナウィルスポリペプチドまたはその融合タンパク質を含み、もう１つは、アジュバントを含む。医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形式の、ヒトへの投与のための製造、使用または販売についてその機関によって承認されていることを示す告知をこのような容器に添付することができる。

ワクチン製剤は、組成物の量を表示するアンプルまたはサシェなどの密閉容器中に梱包される。一実施形態では、ワクチン組成物は、液体として供給され、別の実施形態では、密閉容器中の無水滅菌凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給され、例えば、水または生理食塩水を用いて、対象への投与のために適切な濃度に再構成できる。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、密閉容器中の無水無菌凍結乾燥粉末として、好ましくは、約１μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約１２５μｇ、約１５０μｇ、または約２００μｇの単位投与量で供給される。あるいは、ワクチンの単位投与量は、約１μｇ未満、（例えば、約０．０８μｇ、約０．０４μｇ；約０．２μｇ、約０．４μｇ、約０．８μｇ、約０．５μｇ以下、約０．２５μｇ以下、または約０．１μｇ以下）、または約１２５μｇ超、（例えば、約１５０μｇ以上、約２５０μｇ以上、または約５００μｇ以上）である。これらの投与量は、総コロナウィルスポリペプチドとして、またはＨＡのμｇとして測定できる。ワクチン組成物は、凍結乾燥粉末から再構成後、約１２時間以内、好ましくは、約６時間以内、約５時間以内、約３時間以内、または約１時間以内に投与する必要がある。

代替的実施形態では、本明細書で記載のワクチン組成物は、組成物の量および濃度を表示する密閉容器に入れた液体形態で供給される。好ましくは、液体形態のワクチン組成物は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、少なくとも５００μｇ／ｍｌ、または少なくとも１ｍｇ／ｍｌで、密閉容器に入れて供給される。

本発明は、以下の番号を付した項目のいずれか１つに記載の通りであり得る：

１．配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、配列番号１のＲＢＤに比べて、少なくとも２つの変異をさらに含む非天然起源ポリペプチドであって、少なくとも２つの変異は、Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ、からなる群より選択されるか、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある、非天然起源ポリペプチド。

２．配列番号１の残基３２８～５３１と、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルスの受容体結合ドメインの対応する残基と、少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、配列番号１のＲＢＤまたは第２のコロナウィルス中の対応する残基に比べて、少なくとも２つの変異をさらに含み、少なくとも２つの変異が、少なくとも２つの変異を欠く野生型ポリペプチドの安定性に比べて、ポリペプチドの安定性を高める、非天然起源ポリペプチド。

３．項目２に記載のポリペプチドであって、少なくとも２つの変異が、配列番号１のアミノ酸３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；
および／または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある、ポリペプチド。

４．項目２または３に記載のポリペプチドであって、少なくとも２つの変異が、配列番号１のＦ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍからなる群より選択されるか、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルスの対応する残基にある、ポリペプチド。

５．項目２～４のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、配列番号１のＲＢＤ以外の追加のアミノ酸残基をさらに含む、ポリペプチド。

６．項目２～５のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、コロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が、配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９５％の同一性を含む、ポリペプチド。

７．項目２～６のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、または第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある少なくとも２つの変異は、野生型に比べて、受容体結合ドメイン中の変異のみである、ポリペプチド。

８．項目２～７のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドの発現が、細胞中で発現される場合、少なくとも２つの変異を欠く野生型ＲＢＤポリペプチドの発現と比較して、増大する、ポリペプチド。

９．項目２～８のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、コロナウィルス抗体に結合する、またはコロナウィルスの同族受容体に結合する、ポリペプチド。

１０．項目９に記載のポリペプチドであって、コロナウィルス抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む、ポリペプチド。

１１．項目９または１０に記載のポリペプチドであって、ポリペプチドに対応するコロナウィルスのための受容体が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）受容体を含む、ポリペプチド。

１２．項目１１に記載のポリペプチドであって、ＡＣＥ受容体が、ＡＣＥ２受容体である、ポリペプチド。

１３．項目２～１２のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、第２のコロナウィルスが、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）；中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）；２２９Ｅ；ＮＬ６３；ＯＣ４３；またはＨＫＵ１から選択されるコロナウィルスの配列を含む、ポリペプチド。

１４．項目２～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を含む、ポリペプチド。

１５．項目２～１４のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ＲＢＤが第２の異種ポリペプチドに融合される、ポリペプチド。

１６．項目１５に記載のポリペプチドであって、ＲＢＤが、ナノ粒子、ナノ構造体または異種の足場タンパク質に融合される、ポリペプチド。

１７．項目２～１６のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、ＲＢＤポリペプチドおよび／または第２のポリペプチドが、抗原性のポリペプチドである、ポリペプチド。

１８．項目１～１７のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。

１９．項目１８に記載の組成物であって、アジュバントをさらに含む、組成物。

２０．項目１８または１９に記載の組成物であって、組成物の貯蔵寿命が、少なくとも２つの変異を欠く野生型ＲＢＤポリペプチドを含む組成物より長い、組成物。

２１．項目１８～２０のいずれか１項に記載の組成物であって、ワクチンとして処方される、組成物。

２２．少なくとも２つの変異を含む非天然起源コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドであって、少なくとも２つの変異が、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも第２の変異を含む、コロナウィルスポリペプチド。

２３．項目２２に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、少なくとも２つの変異が、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも第２の変異を欠く野生型ポリペプチドの安定性に比べて、コロナウィルスポリペプチドの安定性を高める、コロナウィルスポリペプチド。

２４．項目２２または２３に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、少なくとも１つの空洞充填変異が、コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１のリノール酸結合ポケット中の残基の変異を含む、コロナウィルスポリペプチド。

２５．項目２２～２４のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、少なくとも１つの空洞充填変異が、配列番号１の残基３２８～５３１内の残基の変異、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基の変異を含む、コロナウィルスポリペプチド。

２６．項目２２～２５のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、少なくとも１つの空洞充填変異が、残基３３５～３４５；３５５～３７５、または３７８～３９５の間の配列番号１の残基の変異、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基の変異を含む、コロナウィルスポリペプチド。

２７．項目２２～２６のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、少なくとも１つの空洞充填変異が、アミノ酸３３６、３３８、３４１、３４２、３５８、３６１、３６３、３６５、３６８、３７４、３７７、３８７、または３９２にある配列番号１の残基の変異、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルスの配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基の変異を含む、コロナウィルスポリペプチド。

２８．項目２２～２７のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも１つの第２の変異が、配列番号１の残基３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、またはプロトコル１または２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基にある、コロナウィルスポリペプチド。

２９．項目２２～２８のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも１つの第２の変異が、
配列番号１のＦ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍからなる群、またはプロトコル１または２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基から選択される、コロナウィルスポリペプチド。

３０．項目２２～２９のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドが、配列番号１の残基３２８～５３１またはプロトコル１または２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の受容体結合ドメイン配列と少なくとも９５％の同一性を含む、コロナウィルスポリペプチド。

３１．項目２２～３０のいずれか１項に記載のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸３３８＆３６５；３６５＆５１３；３６５＆３９２；３３８、３６３、３６５＆３７７；３６５＆３９２；３６５＆３９５；３６５、３９２＆３９５；３６５、５１３、＆５１５；３３８、３６３、＆３６５；３３８、３５８＆３６５；３５８、３６５、＆５１３；３５８、３６５＆３９２；３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；３５８、３６５、＆３９２；３５８、３６５＆３９５；３５８、３６５、３９２、＆３９５；３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または３３８、３５８、３６３、＆３６５にあるか、または第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある少なくとも２つの変異が、配列番号１に比べて、スパイクタンパク質サブユニット１中の変異のみである、コロナウィルスポリペプチド。

３２．項目２２～３１のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、コロナウィルスポリペプチドが、配列番号１、または第２のコロナウィルスの野生型スパイクタンパク質サブユニット１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を含む、コロナウィルスポリペプチド。

３３．項目２２～３２のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、コロナウィルスポリペプチドの発現が、細胞中で発現される場合、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも１つの第２の変異を欠く野生型ポリペプチドの発現と同じ発現条件下で比較して、増大する、コロナウィルスポリペプチド。

３４．項目２２～３３のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、コロナウィルス抗体に結合する、または同族コロナウィルス受容体に結合する、コロナウィルスポリペプチド。

３５．項目３４に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、コロナウィルス抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む、コロナウィルスポリペプチド。

３６．項目３５に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、同族コロナウィルス受容体が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）受容体を含む、コロナウィルスポリペプチド。

３７．項目３６に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、ＡＣＥ受容体が、ＡＣＥ２受容体である、コロナウィルスポリペプチド。

３８．項目２２～３７のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）；中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）；２２９Ｅ；ＮＬ６３；ＯＣ４３；またはＨＫＵ１から選択されるコロナウィルスの改変された変異ポリペプチドである、コロナウィルスポリペプチド。

３９．項目２２～３８のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を含む、コロナウィルスポリペプチド。

４０．項目２２～３９のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、第２の異種ポリペプチドに融合される、コロナウィルスポリペプチド。

４１．項目２２～４０のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、ナノ粒子、ナノ構造体または足場タンパク質に融合される、コロナウィルスポリペプチド。

４２．項目４０に記載のコロナウィルスポリペプチドであって、コロナウィルスポリペプチドまたは第２の異種ポリペプチドが、抗原性ポリペプチドである、コロナウィルスポリペプチド。

４３．項目２２～４２のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む組成物。

４４．項目４３に記載の組成物であって、アジュバントをさらに含む、組成物。

４５．項目４３または４４に記載の組成物であって、同じ貯蔵条件下での貯蔵寿命が、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも第２の変異を欠く野生型コロナウィルスポリペプチドを含む組成物より長い、組成物。

４６．項目４３～４５のいずれか１項に記載の組成物であって、ワクチンとして処方される、組成物。

４７．項目１～１５のいずれか１項に記載の受容体結合ドメインまたは項目２２～４２のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドを発現する細胞。

４８．項目１～１５のいずれか１項に記載の受容体結合ドメインまたは項目２２～４２のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドをコードする核酸配列。

４９．対象にコロナウィルスに対するワクチンを接種する方法であって、項目２１または項目４６に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。

５０．ワクチンの製造方法であって、項目１～１５または項目２２～４２のいずれか１項に記載の組成物を、アジュバントおよび薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、方法。

５１．項目１～２５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、コロナウィルススパイクタンパク質。

５２．項目１～５１のいずれか１項に記載の方法または組成物であって、プロトコル１のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターが下記を含む、方法または組成物：
アルゴリズム：ｂｌａｓｔｐ（タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ）
期待値の閾値：０．１
ワードサイズ：６
クエリー範囲内の最大マッチ：０
マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップコスト：
存在：１１
伸長：１
低複雑度領域のフィルター？：オフ
マスク：
ルックアップテーブルのみ？：オフ
小文字？：オフ

５３．項目１～５２のいずれか１項に記載の方法または組成物であって、プロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターが下記を含む、方法または組成物：
ｂｌａｓｔｐ －ｑｕｅｒｙ ｑｕｅｒｙ．ｆａｓｔａ －ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｂｊｃｔ．ｆａｓｔａ －ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２ －ｅｖａｌｕｅ ０．１－ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ６ －ｇａｐｏｐｅｎ １１ －ｇａｐｅｘｔｅｎｄ １ －ｏｕｔ ｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔ

５４．配列番号１のコロナウィルスポリペプチドに比べて、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される変異またはそのバリアントを含むコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、ポリペプチド。

５５．項目５４に記載のポリペプチドであって、変異が、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、およびＦ３９２Ｗからなる群より選択される、ポリペプチド。

５６．項目５４または項目５５に記載のポリペプチドであって、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される第２の変異を含む、ポリペプチド。

５７．項目５８に記載のポリペプチドであって、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される第３の変異を含む、ポリペプチド。

５８．項目５７に記載のポリペプチドであって、配列番号４または配列番号５のポリペプチド配列を含む、ポリペプチド。

５９．項目５４～５８のいずれか１項に記載のポリペプチドであって、異種の足場タンパク質を含む、ポリペプチド。

６０．項目５８に記載のポリペプチドであって、異種の足場タンパク質が、配列番号３のポリペプチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する、ポリペプチド。

６１．項目５９に記載のポリペプチドであって、異種の足場タンパク質が、配列番号３のポリペプチドを含む、ポリペプチド。

６２．項目６１に記載のポリペプチドであって、配列番号６または配列番号７のポリペプチド配列を含む、ポリペプチド。

６３．項目５９～６２のいずれか１項に記載のポリペプチドからなる第１の成分、および配列番号１３～１８のいずれか１つと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する第２の成分を含むまたはこれらからなる、ポリペプチド複合体。

６４．項目５４～６２のいずれか１項に記載の組成物または項目６３に記載のポリペプチド複合体を含むワクチン組成物。

６５．項目６４に記載のワクチン組成物であって、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、ワクチン組成物。

６６．項目６４または項目６５に記載のワクチン組成物であって、アジュバントをさらに含む、ワクチン組成物。

６７．項目５４～６２のいずれか１項に記載のポリペプチド発現している細胞。

６８．項目５４～６２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。

６９．対象にコロナウィルスに対するワクチンを接種する方法であって、項目５４～６２のいずれか１項に記載ポリペプチド、項目６３に記載のタンパク質複合体、または項目６４～６８のいずれか１項に記載のワクチン組成物を対象に投与することを含む、方法。

７０．ワクチンの製造方法であって、項目５４～６２のいずれか１項に記載のポリペプチドを、アジュバントおよび薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、方法。

７１．ワクチンの製造方法であって、項目５９～６２のいずれか１項に記載のポリペプチドからなる第１の成分；配列番号１３～１８のいずれか１つと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する第２の成分；薬学的に許容可能な担体；および任意選択でアジュバントを、混合することを含む、方法。

７２．非天然起源ポリペプチドであって、配列番号1の残基３２８～５３１と少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、配列番号１のＲＢＤに比べて、少なくとも１つの変異をさらに含み、少なくとも１つの変異が、配列番号１のＩ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌ、または第２のコロナウィルス基準配列から選択され、第２のコロナウィルス基準配列の対応する位置が、プロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインのスパイクタンパク質配列との配列アラインメントにより決定される、非天然起源ポリペプチド。

７３．項目７２に記載のポリペプチドであって、Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；およびＦ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍから選択される２つ以上の変異を含む、ポリペプチド。

実施例
実施例１
理想的タンパク質ベースコロナウィルスワクチンは、高度に効果的および規模拡大可能性の両方を満たして製造できなければならず、後者の特性は、ワクチン収率および安定性により大きく影響を受ける。ＲＮＡまたはＤＮＡ免疫化を用いた遺伝子ワクチンはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して、より高頻度で探索さており、それらの有効性は、標的抗原の発現レベルにより影響を受ける。多くのコロナウィルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および関連サルベコウィルスの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、多くのＲＢＤに向けられた強力中和抗体の単離によって、高度に有用なドメインベースワクチン標的であると考えられる。ＲＢＤは、多くの形態で産生に適用できるが、その収率および安定性に対する制限は、ＲＢＤベースタンパク質ワクチンの規模拡大可能製造および配布を妨害する可能性がある。

本明細書で提供されるのは、このようなコロナウィルスＲＢＤを含む免疫原の収率と安定性を高めるように設計されたコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ポリペプチド中の例示的変異である。受容体結合ドメインを含む免疫原は、天然の（即ち、野生型）ＲＢＤ配列を有する同等の免疫原に比べて、溶液中での改善された安定性に加えて、高度に改善された発現および／または収率を示す一連の安定化変異を含んで生成される。当業者なら理解できるように、所与のタンパク質の増大した発現は、一部は、タンパク質の改善された安定性に起因し得る。設計された免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に向けられる抗体およびＡＣＥ２受容体により確証されるように、抗原性が損なわれていない。まとめると、これらの一連の変異は、多様なコロナウィルスに対し、ワクチンを大規模に製造する能力の改善を可能にし、これはまた、ＲＢＤに向けられる遺伝子ワクチンの性能を支援し得る。

塩基配列および変異数：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列（配列番号１）は、本明細書を通して、他のコロナウィルスにおける変異のナンバリングのための基準として使用される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列の受容体結合ドメインは、下記に太字の下線文字として示される（配列番号２）：下記の配列（またはその受容体結合ドメイン；配列番号２）は、少なくとも第２のコロナウィルス配列と整列され得る。

コロナウィルスタンパク質の収率および安定性の両方を高める変異の例示的リストが下記に提供される（全てのアミノ酸残基番号は、上記「塩基配列」（配列番号１）に基づいている）：
１．Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ、
２．Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ、
３．Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ、
４．Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ、
５．Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ、
６．Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ、
７．Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ、
８．Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ、
９．Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ、
１０．Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ、
１１．Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ、
１２．Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ、
１３．Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ、
１４．Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ、
１５．Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ、
１６．Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ、
１７．Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ、
１８．Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ、
１９．Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ、および
２０．Ｉ３５８Ｆ／Ｆ３９２Ｗ。

材料および方法
発現およびタンパク質精製：１６残基リンカーでＩ５３－５０三量体「Ａ」成分に遺伝的に融合された変異体受容体結合ドメイン（配列番号１の天然の受容体結合ドメイン残基３２８～５３１、またはバリアント、例えば、Ｂ．１．３５１バリアント由来の同等の配列）をコードする遺伝子をＸｂａＩおよびＡｖｒＩＩ制限酵素部位を用いて、ｐＣＭＶ／Ｒベクターにクローニングした。

Ｉ５３－５０三量体「Ａ」成分の配列は下記である：
ＭＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰ
ＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＣＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶＳＰＨＬＤ
ＥＥＩＳＱＦＣＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱ
ＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧＶＮＬＤＮＶＣＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫ
ＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＣＴＥ（配列番号３）

全ての配列には、「ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴ」分泌シグナルが先行し、Ｃ末端は、精製を可能にするために「ＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ」配列でタグ付けされた。いくつかの実施形態では、Ｉ５３－５０三量体成分のＮ末端メチオニンは、抗原のアクセスし易さを改善するために、ヘリカル配列「ＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲ」で置換される。Ｉ５３－５０三量体成分の全てのシステインは、アラニンに変異された。ヒトＡＣＥ２外部ドメインは、トロンビン切断部位およびＣ末端のヒトＦｃフラグメントをコードする配列に遺伝的に融合された。ｈＡＣＥ２－Ｆｃは、ＢＭ４０シグナルペプチドと共に、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成およびクローニングされた。ＣＲ３０２２重鎖および軽鎖をコードする遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔに注文し、ｐＣＭＶ／Ｒにクローニングした。

Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、３３℃、７０％湿度、８％ＣＯ_２、１５０ｒｐｍで回転下、浮遊状態で増殖させたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞中で全てのタンパク質を産生した。３．０百万細胞／ｍＬの密度まで増殖させた細胞と共に、ＰＥＩ－ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、細胞培養物に遺伝子導入し、３日間培養した。上清を４０００ｒｃｆで遠心分離することにより清澄化し、ＰＤＡＤＭＡＣを最終濃度の０．０３７５％まで加え（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、４０００ｒｃｆで２回目の遠心分離を行った。

Ｈｉｓタグ含有タンパク質をバッチ結合法により清澄化上清から精製した。この場合、各清澄化上清を１Ｍのトリス塩酸 ｐＨ８．０で４５ｍＭおよび５ＭのＮａＣｌの最終濃度まで補充し、約３１０ｍＭの最終濃度にした。Ｔａｌｏｎコバルト親和性樹脂（Ｔａｋａｒａ）を処理した上清に添加し、緩やかな振盪を加えながら１５分間インキュベートした。０．２μｍのフィルターによる減圧濾過を用いて樹脂を収集し、重量カラムに移した。樹脂を２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、タンパク質を３カラム体積の２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾールで溶出した。モノクローナル抗体およびヒトＡＣＥ２－Ｆｃを発現している細胞の清澄化上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ ２．６ｘ５ｃｍカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ１５０ ＦＰＬＣ（Ｃｙｔｉｖａ）で精製した。結合抗体を５カラム体積の２０ｍＭのＮａＰＯ_４、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．２で洗浄し、その後、５カラム体積の２０ｍＭのＮａＰＯ_４、１ＭのＮａＣｌ ｐＨ７．４で洗浄して、カラム体積の１００ｍＭのｐＨ３．０の３グリシンで溶出した。溶出液を２Ｍのトリズマ塩基で中和し、最終濃度の５０ｍＭにした。

バイオレイヤー干渉法：上清中のタンパク質の分泌レベルを測定するために、タンパク質発現由来の全ての上清を１：１０でＫＢ１（２５ｍＭのトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のウシ血清アルブミンおよび０．０１％のツイーン－２０）中に希釈した。精製したＡＣＥ２－ＦｃまたはＣＲ３０２２抗体をＫＢ１中に０．０２ｍｇ／ｍＬで希釈し、８チャネルＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、ＡＨＣチップ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）上に３００秒間固定した。６０秒後、ベースラインをＫＢ１中に収集し、センサーをそれぞれの希釈したＡＣＥ２－ＦｃまたはＣＲ３０２２溶液に３００秒間曝露し、続けて、ＫＢ１中で３００秒間の解離ステップを実施した。親和性測定のために、全てのタンパク質および抗体を、黒色９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅマイクロプレート中の０．５％のウシ血清アルブミンおよび０．０１％のツイーン－２０（ＫＢ２）を含むリン酸緩衝食塩水中にウェル当り２００μＬで希釈した。ベースラインおよび解離ステップの場合には、緩衝液単独で使用した。ＣＶ３０またはＣＲ３０２２ ＩｇＧを事前水和プロテインＡバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に１０ｕｇ／ｍＬで１５０秒間、続けて６０秒間ベースラインをロードした。その後、バイオセンサーを、野生型または安定化単量体ＲＢＤの５つの２倍系列希釈の内の１つとの１２０秒間の結合ステップに移した。ＣＶ３０の場合、１２５μＭ、６２．５μＭ、３１．３μＭ、１５．６μＭおよび７．８μＭを、ならびにＣＲ３０２２の場合、３１．３μＭ、１５．６μＭ、７．８μＭ、３．９μＭおよび２．０μＭのＲＢＤ濃度を使用した。結合後、バイオセンサーを３００秒間、解離の緩衝液中に移した。結合および解離ステップ由来のデータからベースラインを減算し、１：１結合モデルを使用して動力学測定値を全５種の希釈ＲＢＤ全体にわたり計算した（ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェア、バージョン１２．０）。ナノ粒子免疫原の抗原性比率の測定のために、ｈＡＣＥ２－Ｆｃ（二量体化受容体）およびＣＲ３０２２ ＩｇＧの単量体ＲＢＤおよびＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子に対する結合を周囲温度で、１０００ｒｐｍで振盪を加えながら解析した。タンパク質試料を動力学緩衝液（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で１００ｎＭに希釈した。その後、緩衝液、抗体、受容体、および免疫原を黒色９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅマイクロプレートに２００μＬ／ウェルで適用した。プロテインＡバイオセンサーを最初に動力学緩衝液中で１０分間水和した後、固定化ステップで、動力学緩衝液中で１０μｇ／ｍＬに希釈したｈＡＣＥ２－ＦｃまたはＣＲ３０２２中に浸漬した。５００秒後、ベースラインに到達させるために、チップを９０秒間、動力学緩衝液に移した。ロードしたバイオセンサーを免疫原中に３００秒間浸漬することにより、結合ステップを実施し、その後、動力学緩衝液中にバイオセンサーを戻して、さらに３００秒間浸漬することにより、解離ステップを実施した。データからベースラインを減算した後に、ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析ソフトウェア（バージョン１２．０）を用いてプロットした。

熱融解物：５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、５％のグリセロールを含む緩衝液中でＲＢＤベース試料を調製し、同時に、５０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％ｗ／ｖのＬ－ヒスチジン、５％グリセロールを含む緩衝液中でヘキサプロ－フォルドンベース試料を調製した。１℃／分の昇温速度で２０～９５℃で収集した固有のトリプトファン蛍光発光スペクトルの重心平均に基づくＵＮｃｌｅ（商標）（ＵＮｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を用いて非平衡融解温度を測定した。融解温度は、融解曲線の一次導関数の最大点として定義され、一次導関数は、二次多項式設定を用いた４つの隣接点での平滑化後に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使って計算された。

サイプロオレンジ蛍光：５０００ｘ サイプロオレンジタンパク質ゲル染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を２５ｍＭのトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール中で希釈し、同じ緩衝液中で調製された単量体ＲＢＤにさらに加え、ＲＢＤで１．０ｍｇ／ｍＬおよびサイプロオレンジで２０ｘの最終濃度とした。試料をＵＮｃｌｅ Ｎａｎｏ－ＤＳＦ（ＵＮＣｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にロードし、サイプロオレンジを試料に添加の５分後、全ての試料の蛍光発光スペクトルを収集した。

インビトロナノ粒子構築体：精製した個々のナノ粒子成分の総タンパク質濃度を、ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃａｒｙ ８４５４）を用いて２８０ｎｍで総吸光度を測定することにより決定し、吸光係数を計算した。次の順番で加えて、室温で構築ステップを実施した：野生型または安定化ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ三量体融合タンパク質、続けて、必要に応じ目的の最終濃度を達成するために適量の緩衝液、および最後に、Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１五量体成分（５０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．７５％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ中、１．１：１のＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ：Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１のモル比で）。適量の緩衝液は、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、１８５ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、０．７５％のＣＨＡＰＳ、４．５％のグリセロール、または５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、５％のグリセロールを含んだ。全てのＲＢＤ－Ｉ５３－５０インビトロ構築物を緩やかに揺らしながら、２～８℃で少なくとも３０分間インキュベートし、続けて、ＳＥＣにより精製して、残留している構築されない成分を除去した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムをナノ粒子製造に使用した。構築粒子は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６カラムを用いて、約１１ｍＬで溶出する。構築ナノ粒子は、カラムに適用の直前に、およびＳＥＣ画分のプール後に、濾過滅菌（０．２２μｍ）された。

陰性染色電子顕微鏡観察：野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子およびＲｐｋ－Ｉ５３－５０ナノ粒子を最初に、５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、５％ｖ／ｖのグリセロール中の７５μｇ／ｍＬに希釈した後、３μＬの試料を新たにグロー放電させた３００メッシュ銅グリッドに適用した。試料をグリッド上で１分間インキュベートした後、グリッドを５０μＬの水滴中に浸漬し、過剰な液体を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ）で吸い取った。その後、グリッドを３μＬの０．７５％ｗ／ｖギ酸ウラニル染料に浸漬した。染料を濾紙で拭き取った後に、グリッドを別の６μＬの染料に浸漬し、約９０秒インキュベートした。最後に、染料を吸い取り、グリッドを１分間乾燥させた後、貯蔵または画像処理した。調製したグリッドをＧａｔａｎカメラを５７，０００ｘで用いて、ＴａｌｏｓモデルＬ１２０Ｃ透過型電子顕微鏡で撮像した。

動的光散乱：ＵＮｃｌｅ（ＵＮＣｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、動的光散乱（ＤＬＳ）により、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子試料の流体力学的径（Ｄｈ）および多分散度（％Ｐｄ）を測定した。試料を８．８μＬの石英キャピラリーカセット（ＵＮｉ、ＵＮＣｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に適用し、レーザーの自動減衰を使用して、それぞれ５秒ずつ１０回の取込で測定した。Ｄｈの測定では、ＲＢＤナノ粒子緩衝液中の５％ｖ／ｖグリセロールによる粘度の増大は、ＵＮｃｌｅ Ｃｌｉｅｎｔソフトウェアにより考慮された。

水素／重水素交換質量分析：３ｍｇのＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ、Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０Ａ、およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０Ａ三量体を、重水素化緩衝液（ｐＨ^＊７．５、８５％Ｄ_２Ｏ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中、２２℃で、３、１５、６０、１８００、および７２０００秒間、Ｈ／Ｄ交換（ＨＤＸ）した。その後、２．５の最終ｐＨのために、交換試料を氷冷クエンチ緩衝液（２００ｍＭのリン酸トリス（２－クロロエチル）（ｔｒｉｓ（２－ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＴＣＥＰ）、８Ｍの尿素、０．２％ギ酸（ＦＡ））と１：１に混合し、液体窒素中で直ちに急速冷凍した。全てのカラム、ループ、弁、および配管を０℃に保持するロードシステムを用いて、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ質量分析計で試料をＬＣ－ＭＳにより分析した。凍結試料を氷上で解凍し、固定化ペプシンカラム（２．１ｘ５０ｍｍ）に２００ｍＬ／分の流量の２％アセトニトリル含有０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と共にロードした。ペプチドをＷａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ１８トラップカートリッジ（２．１ｘ５ｍｍ）で捕捉後、Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ１８ １ｘ１００ｍｍ １．７μｍカラムで３％～４０％Ｂの直線勾配を用いて１８分かけて分離した（Ａ：９８％水、２％アセトニトリル、０．１％ＦＡ、０．０２５％ＴＦＡ；Ｂ：１００％アセトニトリル、０．１％ＦＡ、４０ｍＬ／分の流量）。持ち越し汚染を最小化するために、実験試料間で一連の洗浄を実施した。特に指定されない限り、使用した全ての水および有機溶媒は、ＭＳグレード（Ｏｐｔｉｍａ（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ）とした。各試料シリーズに対する完全重水素化対照は、ペプシン消化非重水素化試料からのＬＣ溶出液収集、ｓｐｅｅｄｖａｃ乾燥、重水素化緩衝液中の８５℃で１時間のインキュベーション、および全ての他のＨＤＸ試料と同じクエンチにより作製された。内部交換標準（Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｉｌｅ［ＰＰＰＩ］およびＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ［ＰＰＰＦ］）を各試料に添加し、全ての試料に対し、一貫した標識条件を確保した。ＤｒｉｆｔＳｃｏｐｅ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ）を用いてペプチドをマニュアルで検証し、直交保持時間とドリフト時間座標で特定した。ＨＸ－Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ２で重水素取り込み分析を実施した。ペプチドｍ／ｚ値に基づいてペプチドスペクトルからピークを特定し、二項式フィッティングを適用した。重水素取り込みレベルを完全重水素化対照に対し正規化した。

マウス免疫化：４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（ストック：０００６５１）マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅから購入し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）公認のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡのＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで維持した。６週齢で、投与群当り６匹のマウスにプライム免疫でワクチン接種し、３週後、２回目のワクチン接種によりマウスに追加免役した。接種の前に、免疫原懸濁液をＡｄｄａＶａｘアジュバント（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と１：１ｖｏｌ／ｖｏｌで穏やかに混合して、０．００９または０．０５ｍｇ／ｍＬ抗原の最終濃度に到達させた。２７標準規格注射針（ＢＤ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、注入部位当り５０μＬ（合計１００μＬ）の免疫原を、イソフルラン麻酔下でマウスの各後肢の腓腹筋中に筋肉注射した。全マウスの血清を得るために、プライムおよび追加免役後２週後に採血した。オトガイ下静脈穿刺経由で血液を収集し、１．５ｍＬのプラスチックエッペンドルフチューブ中、室温で３０分間静置し、凝血させた。２，０００ｇで１０分間の遠心分離により、ヘマトクリットから血清を分離した。分離血清中の補体因子および病原体を５６℃で６０分間のインキュベーションにより加熱不活性化した。使用するまで、血清を４℃または－８０℃で貯蔵した。全ての実験を承認されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコルに従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡで実施した。

ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてマウス血清の送達された抗原に対する結合を測定した。簡単に説明すると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ）ＥＬＩＳＡプレートを４℃で、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．４中の、ウェル当り０．０８μｇ／ｍＬの目的のタンパク質を一晩コートした。次に、プレートをドライミルク粉末（ＢｉｏＲａｄ）の０．０５％ｖ／ｖツイーン２０（ＴＢＳＴ）を含むＴＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）溶液で、室温下、１時間ブロックした。系列希釈した血清をプレートに加え、洗浄後、水素ペルオキシダーゼ結合ウマ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、抗体結合を顕色させた。次にプレートをＴＢＳＴ中で完全に洗浄し、比色分析基質（ＴＭＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を加え、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。曲線下面積（ＡＵＣ）計算は、吸光度測定およびベースラインの隣接対間で生成される台形領域を追加して生成された。

偽ウィルス中和アッセイ：スパイク偽型レンチウィルス中和アッセイは、スパイクＨＤＭ＿Ｓｐｉｋｅｄｅｌｔａ２１＿Ｄ６１４Ｇを使用し、これは、Ａｄｄｇｅｎｅ（＃１５８７６２）またはＢＥＩ（ＮＲ－５３７６５）から入手でき、完全配列は、ワールドワイドウェブ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１５８７６２で入手できる。手短に説明すると、２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞（ＢＥＩ ＮＲ－５２５１１）を、ポリ－Ｌ－リシン被覆黒色壁透明底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ６５５９３０）に、ウェル当り１．２５ｘ１０^４個の細胞を５０ｕＬ Ｄ１０増殖培地（１０％加熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ）中に播種した。翌日、マウス血清試料を５６℃で３０分間加熱不活性化した後、Ｄ１０増殖培地中で系列希釈した。スパイク偽型レンチウィルスを１：５０に希釈し、ウェル当り約２００，０００ＲＬＵを得て、血清希釈物と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、１００μＬのウィルス－血清混合物を細胞に加え、約５２時間後、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ２６１０）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。中和アッセイの各バッチには、２０１７～２０１８年に収集したヒト血清の陰性対照試料および既知の中和抗体を含め、バッチ間の一貫性を確保した。各ウェルの感染率は、プレートの同じ横列中の２つの「無血清」対照ウェルと比較して計算した。各血清試料に対し、「ｎｅｕｔｃｕｒｖｅ」パッケージ（ｊｂｌｏｏｍｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｎｅｕｔｃｕｒｖｅバージョン０．５．２のワールドワイドウェブで入手可能）を用いて、下端を０に固定し、上端を１に固定したＨｉｌｌ曲線に当てはめることにより、阻害濃度５０％（ＩＣ_５０）および単純に１／ＩＣ_５０である中和力価５０％（ＮＴ５０）を計算した。

定量化および統計解析：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８のＤｕｎｎの事後解析とノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定を用いて多群比較を実施した。Ｐ値が０．０５未満の場合、差異は有意であると見なされた。

実施例２
材料および方法

細胞株
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株から誘導され、浮遊状態で増殖するように形質転換および適合された雌ヒト胎児腎臓細胞株である（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞をＥｘｐｉ２９３発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させ、３６．５℃、８％ＣＯ_２および１５０ｒｐｍの振盪下で培養した。ベロＥ６は、アフリカミドリザル由来の雌腎臓上皮細胞である。ＨＥＫ－ＡＣＥ２接着細胞株は、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＮＩＡＩＤ，ＮＩＨ：Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｃｅｌｌｓ（ＨＥＫ２９３Ｔ）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ２，ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＡＣＥ２ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ，ＮＲ－５２５１１から得た。全ての接着細胞を３７℃、８％ＣＯ_２下、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＋１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むフラスコ中で培養した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ以外の細胞株は、マイコプラズマ汚染の試験も、確認もしなかった。

マウス
雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅから得た。動物処置方法は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡの承認の下で実施した。

安定化変異の設計
Ｒｏｓｅｔｔａでの全ての計算は、バージョン２０２０．２２－ｄｅｖ６１２８７を用いて実施した。全ての設計トラジェクトリーは、スパイクのクライオＥＭ構造（ＰＤＢ６ＶＸＸ）中で観察された密閉対称三量体高次構造中、およびＲＢＤ（ＰＢＤ６ＹＺ５）の結晶構造中でＲＢＤを評価した。ＰＤＢ項目６ＶＸＸの３回対称軸を［０，０，１］に整列させ、単一プロトマーを、．ｐｄｂフォーマットで保存した。ＰＤＢ６ＹＺ５からのＲＢＤ単量体をＰＤＢ６ＶＸＸのプロトマーと構造的に重ね合わせ、同様に保存した。設計プロトコルを、整列プロトマーおよびカスタムｒｅｓｆｉｌｅを入力として採用するＲｏｓｅｔｔａスクリプト（５８、５９）を用いて記述した。ｒｅｓｆｉｌｅは、側鎖の識別点（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および設計中に採取した高次構造を指示する。プロトコルは、２つの設計ラウンドを入力ｒｅｓｆｉｌｅに基づいて、対称モデルに適用し、各設計ステップ後、側鎖の最小化を適用する。プロトコルは、側鎖最小化と同時に実施されるべき骨格の最小化を可能にし、トラジェクトリーは骨格最小化を許容して、または許容しないで実施された。設計および最小化ステップの両方は、ｒｅｓｆｉｌｅ中にリストされた全ての変異可能または詰め込み可能な残基の１０Å以内の残基を再詰め込みまたは最小化可能にした。残基位置は、マニュアルで選択して位置３５８、３６５、３９２およびスパイクおよびＲＢＤ構造を基準にして周辺の残基を含め、可能な残基識別点は、ｒｅｓｆｉｌｅ中の各位置に対し「ＰＩＫＡＡ」オプションを使って、指定された。ｒｅｓｆｉｌｅ入力は、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、および／またはＦ３９２Ｗの種々の組み合わせを含むように多様化されたが、また、同時に、周辺残基に対しする変異を制限または許容することもあった。追加のｒｅｓｆｉｌｅ入力が、同様に設定されたが、位置３５８、３６５、および３９２を特定の識別点に制限しなかった。設計モデルおよびスコアは、マニュアルで検査して、構造上好ましく見える相互作用を特定した。変異は、それらが天然で溶媒に露出されるかまたは水素結合に関与する極性基を覆い隠す場合には、廃棄された。抗原性に対する望ましくない変化を防ぐために、表面露出残基は、頻繁に考慮されることはなかった。好ましい変異セットは、最適化ｒｅｓｆｉｌｅから繰り返し再試験され、一連の多様な設計を完結するために、マニュアルで精密化された。

プラスミド構築
１６グリシンおよびセリン残基のリンカーを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの野生型および安定化配列を三量体Ｉ５３－５０Ａナノ粒子成分のＮ末端に遺伝的に融合した。各Ｉ５３－５０Ａ融合タンパク質はまた、Ｃ末端オクタヒスチジンタグを提示し、単量体配列は、Ａｖｉおよびオクタヒスチジンタグを含んだ。Ｘｂａｌ１およびＡｖｒＩＩ制限酵素部位およびギブソンアセンブリーを用いて、全配列をｐＣＭＶ／Ｒにクローニングした。全ＲＢＤ含有成分は、Ｎ末端ミューホスファターゼシグナルペプチドを含んだ。ｈＡＣＥ２－Ｆｃは、ＢＭ４０シグナルペプチドと共に、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成およびクローニングされた。免疫化試験に使用されたヘキサプロ－フォルドン構築物を報告にあるようにして生成し（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９：１５０１－０５（２０２０））、オクタヒスチジンタグと共にｐＣＭＶ／Ｒ中に置いた。発現および安定性比較に使用した、Ｒｐｋ９変異含有および非含有ヘキサプロ－フォルドン構築物は、ＢＭ４０シグナルペプチドを含み、ｐＣＭＶ／Ｒ中に置かれた。その後の細菌培養物からＤＮＡ抽出し（ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ）、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞中への一時的遺伝子導入のためのプラスミドを得るために、プラスミドを大腸菌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）のＮＥＢ ５α株に形質転換した。この試験で使用した全ての新規タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２１～４７として提供される。
＞ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ三量体（１６－ＧＳリンカー、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１由来の野生型ＲＢＤ使用）
配列番号２１
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹ ＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡ ＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹ ＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡ ＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶ ＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧ ＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ
＞Ｒｐｋ１－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号２２
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＷ ＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡ ＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹ ＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡ ＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶ ＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧ ＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ
＞Ｒｐｋ２－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号２３
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＬＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＷ ＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡ ＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹ ＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡ ＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶ ＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧ ＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ
＞Ｒｐｋ３－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号２４
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＷ ＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡ ＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹ ＱＰＹＲＶＶＶＭＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡ ＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶ ＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧ ＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ
＞Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０Ａ；配列番号２５
三量体ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮ
ＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＷＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧ
ＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹ ＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡ ＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶ ＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧ ＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ
＞Ｒｐｋ５－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号２６
ＭＧＩＬＰＳＰＧＭＰＡＬＬＳＬＶＳＬＬＳＶＬＬＭＧＣＶＡＥＴＧＴＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＷ ＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＷＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡ ＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹ ＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＳＧＳＥＫＡＡＫＡＥＥＡＡＲＫＭＥＥＬＦＫＫＨＫＩＶＡＶＬＲＡ ＮＳＶＥＥＡＩＥＫＡＶＡＶＦＡＧＧＶＨＬＩＥＩＴＦＴＶＰＤＡＤＴＶＩＫＡＬＳＶＬＫＥＫＧＡＩＩＧＡＧＴＶＴＳＶＥＱＡＲＫＡＶＥＳＧＡＥＦＩＶ ＳＰＨＬＤＥＥＩＳＱＦＡＫＥＫＧＶＦＹＭＰＧＶＭＴＰＴＥＬＶＫＡＭＫＬＧＨＴＩＬＫＬＦＰＧＥＶＶＧＰＱＦＶＫＡＭＫＧＰＦＰＮＶＫＦＶＰＴＧＧ ＶＮＬＤＮＶＡＥＷＦＫＡＧＶＬＡＶＧＶＧＳＡＬＶＫＧＴＰＤＥＶＲＥＫＡＫＡＦＶＥＫＩＲＧＡＴＥＧＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ
＞Ｒｐｋ６－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号２７
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＞Ｒｐｋ７－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号２８
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＞Ｒｐｋ８－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号２９
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＞Ｒｐｋ９－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号３０
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＞Ｒｐｋ１０－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号３１
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＞Ｒｐｋ１１－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号３２
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＞Ｒｐｋ１２－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号３３
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＞Ｒｐｋ１３－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号３４
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＞Ｒｐｋ１４－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号３５
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＞Ｒｐｋ１６－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号３７
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＞Ｒｐｋ１７－Ｉ５３－５０Ａ三量体；配列番号３８
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＞ＲＢＤ単量体（Ａｖｉおよびヘキサヒスチジンタグを含む）；配列番号３９
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＞Ｒｐｋ４単量体（Ａｖｉおよびヘキサヒスチジンタグを含む）；配列番号４０
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＞Ｒｐｋ９単量体（Ａｖｉおよびヘキサヒスチジンタグを含む）；配列番号４１
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＞Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１五量体：配列番号４２
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＞２ＯＢＸ五量体；配列番号４３
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＞ヘキサプロ－フォルドン、免疫化のために使用（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）；配列番号４４
ＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴ ＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧ ＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩ ＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＰＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣ ＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＰＡＬＱＩＰＦＰＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧ ＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＰＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩ ＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭ ＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴ ＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡ ＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＲＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＨＨＨＨＨＨＨＨＳＡＷ ＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ
＞ヘキサプロ－フォルドン、Ｒｐｋ９－ヘキサプロ－フォルドンとの発現および安定性比較のために使用（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）；配列番号４５
ＭＡＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦ ＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦ ＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳ ＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦ ＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴ ＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴ ＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧ ＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳ ＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨ ＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹ ＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲ
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＞Ｒｐｋ９－ヘキサプロ－フォルドン（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）；配列番号４６
ＭＡＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦ ＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦ ＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳ ＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦ ＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴ ＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＦＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＷＴＮＩＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴ ＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧ ＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳ ＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨ ＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＧＳＡＳＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹ ＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲ ＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＰＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫ ＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＰＡＬＱＩＰＦＰＭＱＭＡＹＲ ＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＰＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳ ＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＰＰＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫ ＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩ ＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲ ＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＲＳＬＥＶＬＦＱＧＰＧＨＨＨＨＨＨＨＨ

＞ｈＡＣＥ２－ＦＣ；配列番号４７
ＡＦＬＫＥＱＳＴＬＡＱＭＹＰＬＱＥＩＱＮＬＴＶＫＬＱＬＱＡＬＱＱＮＧＳＳＶＬＳＥＤＫＳＫＲＬＮＴＩＬＮＴＭＳＴＩＹＳＴＧＫＶＣＮＰＤＮＰＱＥ ＣＬＬＬＥＰＧＬＮＥＩＭＡＮＳＬＤＹＮＥＲＬＷＡＷＥＳＷＲＳＥＶＧＫＱＬＲＰＬＹＥＥＹＶＶＬＫＮＥＭＡＲＡＮＨＹＥＤＹＧＤＹＷＲＧＤＹＥＶＮ ＧＶＤＧＹＤＹＳＲＧＱＬＩＥＤＶＥＨＴＦＥＥＩＫＰＬＹＥＨＬＨＡＹＶＲＡＫＬＭＮＡＹＰＳＹＩＳＰＩＧＣＬＰＡＨＬＬＧＤＭＷＧＲＦＷＴＮＬＹＳ ＬＴＶＰＦＧＱＫＰＮＩＤＶＴＤＡＭＶＤＱＡＷＤＡＱＲＩＦＫＥＡＥＫＦＦＶＳＶＧＬＰＮＭＴＱＧＦＷＥＮＳＭＬＴＤＰＧＮＶＱＫＡＶＣＨＰＴＡＷＤ ＬＧＫＧＤＦＲＩＬＭＣＴＫＶＴＭＤＤＦＬＴＡＨＨＥＭＧＨＩＱＹＤＭＡＹＡＡＱＰＦＬＬＲＮＧＡＮＥＧＦＨＥＡＶＧＥＩＭＳＬＳＡＡＴＰＫＨＬＫＳ ＩＧＬＬＳＰＤＦＱＥＤＮＥＴＥＩＮＦＬＬＫＱＡＬＴＩＶＧＴＬＰＦＴＹＭＬＥＫＷＲＷＭＶＦＫＧＥＩＰＫＤＱＷＭＫＫＷＷＥＭＫＲＥＩＶＧＶＶＥＰＶＰＨＤＥＴＹＣＤＰＡＳＬＦＨＶＳＮＤＹＳＦＩＲＹＹＴＲＴＬＹＱＦＱＦＱＥＡＬＣＱＡＡＫＨＥＧＰＬＨＫＣＤＩＳＮＳＴＥＡＧＱＫＬＦＮＭＬＲＬ ＧＫＳＥＰＷＴＬＡＬＥＮＶＶＧＡＫＮＭＮＶＲＰＬＬＮＹＦＥＰＬＦＴＷＬＫＤＱＮＫＮＳＦＶＧＷＳＴＤＷＳＰＹＡＤＰＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧＤＰＥＰ ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ

一過性遺伝子導入
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、３３℃、７０％湿度、８％ＣＯ_２、１５０ｒｐｍで回転下、浮遊状態で増殖させたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞中でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳおよびＡＣＥ２－Ｆｃタンパク質を産生した。３．０百万細胞／ｍＬの密度まで増殖させた細胞と共に、ＰＥＩ－ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、培養物に遺伝子導入し、３日間培養した。上清を遠心分離（４０００ｒｃｆで５分）することにより清澄化し、ＰＤＡＤＭＡＣ溶液を最終濃度の０．０３７５％まで加え（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、＃４０９０１４）、２回目の遠心分離ステップ（４０００ｒｃｆで５分）を行った。

ＣＶ３０およびＣＲ３０２２の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔに注文し、ｐＣＭＶ／Ｒにクローニングした。ＰＥＩ ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）遺伝子導入試薬を用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞中の重鎖および軽鎖プラスミドの両方の一過性同時遺伝子導入により抗体を発現させた。細胞上清を採取し、上記のように、３または６日後に清澄化した。

糖タンパク質の精製
Ｈｉｓタグ含有タンパク質をバッチ結合法により清澄化上清から精製した。この場合、各清澄化上清を１Ｍのトリス塩酸 ｐＨ８．０で４５ｍＭおよび５ＭのＮａＣｌの最終濃度まで補充し、３１３ｍＭの最終濃度にした。Ｔａｌｏｎコバルト親和性樹脂（Ｔａｋａｒａ）を処理した上清に添加し、緩やかな振盪を加えながら１５分間インキュベートした。０．４５μｍのフィルターによる減圧濾過を用いて樹脂を収集し、重量カラムに移した。樹脂を１０カラム体積の２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、結合タンパク質を３カラム体積の２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾールで溶出した。次に、同じ上清試料に対しバッチ結合工程を反復し、第１および第２の溶出液を混合した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて純度を評価した。ＲＢＤベース構築物の収率の定量化のために、同等の培養条件および体積からのＩＭＡＣ溶出液に、１００ｍＭのＬ－アルギニンおよび５％のグリセロールを補充し、１．５ｍＬに濃縮した。続けて、濃縮試料を１ｍＬのループにロードし、５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、５％のグリセロールでプレ平衡化したスーパーデックス７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（単量体ＲＢＤの場合）またはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラム（Ｉ５３－５０Ａ三量体へのＲＢＤ融合の場合）に適用した。Ｒｐｋ９変異を含むおよび含まない場合のヘキサプロ－フォルドン構築物の収率の定量化のために、同等の培養条件および体積からのＩＭＡＣ溶出液に、５％のグリセロールを補充し、１．５ｍＬに濃縮し、続けて、これを１ｍＬのループにロードし、５０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％ｗ／ｖのＬ－ヒスチジン、５％のグリセロールでプレ平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬカラムに適用した。免疫化試験のために、ヘキサプロ－フォルドンをＩＭＡＣにより精製し、５０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％ｗ／ｖのＬ－ヒスチジン、５％のグリセロールに対し、室温で４時間にわたり３回の透析を実施した。

熱変性（ナノＤＳＦ）
５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、５％のグリセロールを含む緩衝液中でＲＢＤベース試料を調製し、同時に、５０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２５％ｗ／ｖのＬ－ヒスチジン、５％グリセロールを含む緩衝液中でヘキサプロ－フォルドンベース試料を調製した。１℃／分の昇温速度で２０～９５℃で収集した固有のトリプトファン蛍光発光スペクトルの重心平均に基づくＵＮｃｌｅ（商標）（ＵＮｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を用いて非平衡融解温度を測定した。融解温度は、融解曲線の一次導関数の最大点として定義され、一次導関数は、二次多項式設定を用いた４つの隣接点での平滑化後に、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使って計算された。

サイプロオレンジ蛍光：
５０００ｘ サイプロ（商標）オレンジタンパク質ゲル染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を２５ｍＭのトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロール中で混合および希釈し、同じ緩衝液中で調製された単量体ＲＢＤにさらに加え、ＲＢＤで１．０ｍｇ／ｍＬおよびサイプロ（商標）オレンジで２０ｘの最終濃度とした。試料をＵＮｃｌｅ（商標）Ｎａｎｏ－ＤＳＦ（ＵＮＣｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にロードし、サイプロ（商標）オレンジを試料に添加の５分後、全ての試料の蛍光発光スペクトルを収集した。

Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１の微生物タンパク質発現および精製
ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ、Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１（配列番号１７）に相補的な五量体ナノ粒子成分を、米国特許出願公開第２０１６／０１２２３９２号（この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように産生し、２ＯＢＸ非構築対照五量体の精製にも同じプロトコルを使用した。

インビトロナノ粒子構築体：
精製した個々のナノ粒子成分の総タンパク質濃度を、ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｃａｒｙ ８４５４）を用いて２８０ｎｍで総吸光度を測定することにより決定し、吸光係数を計算した。次の順番で加えて、室温で構築ステップを実施した：野生型または安定化ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ三量体融合タンパク質、続けて、必要に応じ目的の最終濃度を達成するために適量の緩衝液、および最後に、Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１五量体成分（配列番号１７）（５０ｍＭのトリス ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．７５％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳ中、１．１：１のＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ：Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１のモル比で）。適量の緩衝液は、５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４、１８５ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、０．７５％のＣＨＡＰＳ、４．５％のグリセロール（溶液安定性試験用）、または５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、５％のグリセロールを含んだ。全てのＲＢＤ－Ｉ５３－５０インビトロ構築物を緩やかに揺らしながら、２～８℃で少なくとも３０分間インキュベートし、続けて、ＳＥＣにより精製して、残留している構築されていない成分を除去した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムをナノ粒子製造に使用した。構築粒子は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（商標）６カラムを用いて、約１１ｍＬで溶出する。構築ナノ粒子は、カラムに適用の直前に、およびＳＥＣ画分のプール後に、濾過滅菌（０．２２μｍ）された。

単量体ＲＢＤの動態解析のためのバイオレイヤー干渉法
Ｏｃｔｅｔ（商標）Ｒｅｄ ９６ システム（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（登録商標））を用いて、２５℃、１０００ｒｐｍで振盪させながら、動力学的測定を実施した。全てのタンパク質および抗体を、黒色９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅマイクロプレート中の０．５％のウシ血清アルブミンおよび０．０１％のツイーン－２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中にウェル当り２００μＬで希釈した。ベースラインおよび解離ステップの場合には、緩衝液単独で使用した。ＣＶ３０またはＣＲ３０２２ ＩｇＧを事前水和プロテインＡバイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（登録商標））に１０ｕｇ／ｍＬで１５０秒間、続けて６０秒間ベースラインをロードした。その後、バイオセンサーを、野生型または安定化単量体ＲＢＤの５つの２倍系列希釈の内の１つとの１２０秒間の結合ステップに移した。ＣＶ３０の場合、１２５μＭ、６２．５μＭ、３１．３μＭ、１５．６μＭおよび７．８μＭを、ならびにＣＲ３０２２の場合、３１．３μＭ、１５．６μＭ、７．８μＭ、３．９μＭおよび２．０μＭのＲＢＤ濃度を使用した。結合後、バイオセンサーを３００秒間、解離の緩衝液中に移した。結合および解離ステップ由来のデータからベースラインを減算し、１：１結合モデルを使用して動力学測定値を全５種の希釈ＲＢＤ全体にわたり計算した（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）分析ソフトウェアバージョン１２．０）。

ＲＢＤナノ粒子の抗原性比率のためのバイオレイヤー干渉法
ｈＡＣＥ２－Ｆｃ（二量体化受容体）およびＣＲ３０２２ ＩｇＧの単量体ＲＢＤおよびＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子に対する結合をＯｃｔｅｔ（商標）Ｒｅｄ ９６システムを用いて、周囲温度で、１０００ｒｐｍで振盪を加えながら解析した。タンパク質試料を動力学緩衝液（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（登録商標））中で１００ｎＭに希釈した。その後、緩衝液、抗体、受容体、および免疫原を黒色９６ウェルＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅマイクロプレートに２００μＬ／ウェルで適用した。プロテインＡバイオセンサーを最初に動力学緩衝液中で１０分間水和した後、固定化ステップで、動力学緩衝液中で１０μｇ／ｍＬに希釈したｈＡＣＥ２－ＦｃまたはＣＲ３０２２中に浸漬した。５００秒後、ベースラインに到達させるために、チップを９０秒間、動力学緩衝液に移した。ロードしたバイオセンサーを免疫原中に３００秒間浸漬することにより、結合ステップを実施し、その後、動力学緩衝液中にバイオセンサーを戻して、さらに３００秒間浸漬することにより、解離ステップを実施した。データからベースラインを減算した後に、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）分析ソフトウェア（バージョン１２．０）を用いてプロットした。

陰性染色電子顕微鏡観察
野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子およびＲｐｋ－Ｉ５３－５０ナノ粒子を最初に、５０ｍＭのトリス ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＬ－アルギニン、５％ｖ／ｖのグリセロール中の７５μｇ／ｍＬに希釈した後、３μＬの試料を新たにグロー放電させた３００メッシュ銅グリッドに適用した。試料をグリッド上で１分間インキュベートした後、グリッドを５０μＬの水滴中に浸漬し、過剰な液体を濾紙で吸い取った。その後、グリッドを３μＬの０．７５％ｗ／ｖギ酸ウラニル染料に浸漬した。染料を濾紙で拭き取った後に、グリッドを別の６μＬの染料に浸漬し、約９０秒インキュベートした。最後に、染料を吸い取り、グリッドを１分間乾燥させた後、貯蔵または画像処理した。調製したグリッドをＧａｔａｎ（商標）カメラを５７，０００ｘで用いて、Ｔａｌｏｓ（商標）モデルＬ１２０Ｃ透過型電子顕微鏡で撮像した。

動的光散乱
ＵＮｃｌｅ（商標）（ＵＮＣｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用し、動的光散乱（ＤＬＳ）により、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子試料の流体力学的径（Ｄｈ）および多分散度（％Ｐｄ）を測定した。試料を８．８μＬの石英キャピラリーカセット（ＵＮｉ（商標）、ＵＮＣｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に適用し、レーザーの自動減衰を使用して、それぞれ５秒ずつ１０回の取込で測定した。Ｄｈの測定では、ＲＢＤナノ粒子緩衝液中の５％ｖ／ｖグリセロールによる粘度の増大は、ＵＮｃｌｅ（商標）Ｃｌｉｅｎｔソフトウェアにより考慮された。

エンドトキシン測定
タンパク質試料中のエンドトキシンレベルをＥｎｄｏＳａｆｅ（商標）Ｎｅｘｇｅｎ－ＭＣＳ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使って測定した。試料をエンドトキシン不含ＬＡＬ試薬水中で１：５０または１：１００に希釈し、ＥｎｄｏＳａｆｅ（商標）ＬＡＬ試薬カートリッジのウェルに適用した。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＥｎｄｏＳｃａｎ（商標）－Ｖソフトウェアを用いて、エンドトキシン含量を分析した。これは、希釈因子を自動的に逆算する。エンドトキシン値は、ＥＵ／ｍＬで報告され、その後、可視・紫外分光測定に基づいてＥＵ／ｍｇに変換された。我々の免疫化に好適する試料のための閾値は、＜１００ＥＵ／ｍｇであった。

可視・紫外分光法
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｒｙ ８４５４を用いて、紫外線－可視分光光度法（ＵＶ－Ｖｉｓ）測定を採用した。試料を１０ｍｍ、５０μＬ石英セル（Ｓｔａｒｎａ Ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）に適用し、１８０～１０００ｎｍの吸光度を測定した。測定値から単一基準波長ベースラインを減算した２８０ｎｍでの正味吸光度を、計算した吸光係数および分子量と共に用いて、タンパク質濃度を得た。３２０／２８０ｎｍでの吸光度の比率を用いて、リアルタイム安定性試験試料における相対的凝集レベルを測定した。試料をそれぞれのブランキング緩衝液で希釈して、０．１～１．０の吸光度を得た。ＵＶ／Ｖｉｓ装置から生成した全てのデータを８４５ｘ ＵＶ／可視Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアで処理した。

水素／重水素交換質量分析
３ｍｇのＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ、Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０Ａ、およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０Ａ三量体を、重水素化緩衝液（ｐＨ^＊７．５、８５％Ｄ_２Ｏ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中、２２℃で、３、１５、６０、１８００、および７２０００秒間、Ｈ／Ｄ交換（ＨＤＸ）した。その後、２．５の最終ｐＨのために、交換試料を氷冷クエンチ緩衝液（２００ｍＭのリン酸トリス（２－クロロエチル）（ｔｒｉｓ（２－ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＴＣＥＰ）、８Ｍの尿素、０．２％ギ酸（ＦＡ））と１：１に混合し、液体窒素中で直ちに急速冷凍した。全てのカラム、ループ、弁、および配管を０℃に保持する特注のロードシステムを用いて、Ｓｙｎａｐｔ（商標）Ｇ２－Ｓｉ質量分析計で試料をＬＣ－ＭＳにより分析した。凍結試料を氷上で解凍し、カスタムパックした固定化ペプシンカラム（２．１ｘ５０ｍｍ）に２００ｍＬ／分の流量の２％アセトニトリル含有０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と共にロードした。ペプチドをＷａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ１８トラップカートリッジ（２．１ｘ５ｍｍ）で捕捉後、Ｗａｔｅｒｓ ＣＳＨ Ｃ１８ １ｘ１００ｍｍ １．７μｍカラムで３％～４０％Ｂの直線勾配を用いて１８分かけて分離した（Ａ：９８％水、２％アセトニトリル、０．１％ＦＡ、０．０２５％ＴＦＡ；Ｂ：１００％アセトニトリル、０．１％ＦＡ、４０ｍＬ／分の流量）。持ち越し汚染を最小化するために、実験試料間で一連の洗浄を実施した。特に指定されない限り、使用した全ての水および有機溶媒は、ＭＳグレード（Ｏｐｔｉｍａ（商標）、Ｆｉｓｈｅｒ）とした。各試料シリーズに対する完全重水素化対照は、ペプシン消化非重水素化試料からのＬＣ溶出液収集、ｓｐｅｅｄｖａｃ乾燥、重水素化緩衝液中の８５℃で１時間のインキュベーション、および全ての他のＨＤＸ試料と同じクエンチにより作製された。内部交換標準（Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｉｌｅ［ＰＰＰＩ］およびＰｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ［ＰＰＰＦ］）を各試料に添加し、全ての試料に対し、一貫した標識条件を確保した。

ペプチド参照リストは、変異を含む新規ペプチドの追加により野生型ＲＢＤペプチドリストから更新された。ＤｒｉｆｔＳｃｏｐｅ（商標）を用いてこれらのペプチドをマニュアルで検証し、直交保持時間とドリフト時間座標で特定した。ＨＸ－Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ２で重水素取り込み分析を実施した。ペプチドｍ／ｚ値に基づいてペプチドスペクトルからピークを特定し、二項式フィッティングを適用した。重水素取り込みレベルを完全重水素化対照に対し正規化した。

マウス免疫化
４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（ストック：０００６５１）マウスを購入した。６週齢で、投与群当り６匹のマウスにプライム免疫でワクチン接種し、３週後、２回目のワクチン接種によりマウスに追加免役した。接種の前に、免疫原懸濁液をＡｄｄａＶａｘ（商標）アジュバントと１：１ｖｏｌ／ｖｏｌで穏やかに混合して、０．００９または０．０５ｍｇ／ｍＬ抗原の最終濃度に到達させた。２７標準規格注射針を用いて、注入部位当り５０μＬ（合計１００μＬ）の免疫原を、イソフルラン麻酔下でマウスの各後肢の腓腹筋中に筋肉注射した。全マウスの血清を得るために、プライムおよび追加免役後２週後に採血した。オトガイ下静脈穿刺経由で血液を収集し、１．５ｍＬのプラスチックエッペンドルフチューブ中、室温で３０分間静置し、凝血させた。２，０００ｇで１０分間の遠心分離により、ヘマトクリットから血清を分離した。分離血清中の補体因子および病原体を５６℃で６０分間のインキュベーションにより加熱不活性化した。使用するまで、血清を４℃または－８０℃で貯蔵した。

ＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてマウス血清の送達された抗原に対する結合を測定した。簡単に説明すると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）（Ｎｕｎｃ（登録商標））ＥＬＩＳＡプレートを４℃で、０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．４中の、ウェル当り０．０８μｇ／ｍＬの目的のタンパク質を一晩コートした。次に、プレートをドライミルク粉末の０．０５％ｖ／ｖツイーン２０を含むＴＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）溶液（ＴＢＳＴ）で、室温下、１時間ブロックした。系列希釈した血清をプレートに加え、洗浄後、水素ペルオキシダーゼ結合ウマ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、抗体結合を顕色させた。次にプレートをＴＢＳＴ中で完全に洗浄し、比色分析基質（ＴＭＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を加え、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。曲線下面積（ＡＵＣ）計算は、吸光度測定およびベースラインの隣接対間で生成される台形領域を追加して作成された。パイソンのＳｃｉＰｙライブラリーを用いて、中点力価計算値（ＥＣ_５０）を当てはめた４点ロジスティック方程式に基づいて生成した。この場合、ＥＣ_５０は、カーブがその最大の５０％に達する血清希釈であった。

レンチウィルスベース偽ウィルス中和アッセイ
スパイク偽型レンチウィルス中和アッセイ中和アッセイを（６７）に実質的に記載のように実施した。プロトコルをこの試験のために２１アミノ酸細胞質側末端短縮化を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクを使用するように修正した。この短縮化は、スパイク偽型レンチウィルス力価およびＤ６１４Ｇ変異を増大させ、これは、今日では、ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中で最も多い。このスパイク、ＨＤＭ＿Ｓｐｉｋｅｄｅｌｔａ２１＿Ｄ６１４Ｇをコードするプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（＃１５８７６２）またはＢＥＩ（ＮＲ－５３７６５）から入手でき、完全配列は、ワールドワイドウェブ：ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１５８７６２で入手できる。

手短に説明すると、２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞（ＢＥＩ ＮＲ－５２５１１）を、ポリ－Ｌ－リシン被覆黒色壁透明底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ６５５９３０）に、ウェル当り１．２５ｘ１０^４個の細胞を５０ｕＬ Ｄ１０増殖培地（１０％加熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ）中に播種した。翌日、マウス血清試料を５６℃で３０分間加熱不活性化した後、Ｄ１０増殖培地中で系列希釈した。スパイク偽型レンチウィルスを１：５０に希釈し、ウェル当り約２００，０００ＲＬＵを得て、血清希釈物と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、１００μＬのウィルス－血清混合物を細胞に加え、約５２時間後、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標），Ｅ２６１０）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。中和アッセイの各バッチには、２０１７～２０１８年に収集したヒト血清の陰性対照試料および既知の中和抗体を含め、バッチ間の一貫性を確保した。各ウェルの感染率は、プレートの同じ横列中の２つの「無血清」対照ウェルと比較して計算した。各血清試料に対し、「ｎｅｕｔｃｕｒｖｅ」パッケージ（ｊｂｌｏｏｍｌａｂ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｎｅｕｔｃｕｒｖｅバージョン０．５．２のワールドワイドウェブで入手可能）を用いて、下端を０に固定し、上端を１に固定したＨｉｌｌ曲線に当てはめることにより、阻害濃度５０％（ＩＣ_５０）および単純に１／ＩＣ_５０である中和力価５０％（ＮＴ５０）を計算した。全ての中和アッセイデータは、ワールドワイドウェブ：ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｊｂｌｏｏｍｌａｂ／ＲＢＤ＿ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ＿ｖａｃｃｉｎｅで入手できる。

ＭＬＶベース偽ウィルス中和アッセイ
ＭＬＶベースＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ偽型を次に報告のように調製した（ＡＣ Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８１，２８１－２９２．ｅ６（２０２０）；ＡＣ Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １８３，１３６７－１３８２．ｅ１７（２０２０）；ＡＣ Ｗａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｏａｄｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｓａｒｂｅｃｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．０３．１５．４３５５２８；ＪＫ Ｍｉｌｌｅｔ ＆ ＧＲ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ．Ｂｉｏ Ｐｒｏｔｏｃ ６（２０１６））。手短に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をリポフェクタミン（商標）２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓコードプラスミド、ＭＬＶ Ｇａｇ－Ｐｏｌパッケージング構築物、およびルシフェラーゼレポーターをコードするＭＬＶ導入ベクターと共に、製造業者の説明書に従って、同時遺伝子導入した。細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭで３回洗浄し、３７℃で遺伝子導入培地と共に５時間インキュベートした。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを６０時間にわたり添加した。２，５００ｇで回転させることにより上清を採取し、０．４５にμｍのフィルターを通して濾過し、１００ｋＤａ膜を用い、２，５００ｇで１０分間濃縮した後、分取し、－８０℃で貯蔵した。

中和アッセイのために、ＨＥＫ－ｈＡＣＥ２細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ中、８％ＣＯ_２下、３７℃のインキュベーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。感染の１日以上前に、４０μＬのポリリジン（Ｓｉｇｍａ）を９６ウェルプレート中に置き、回転させながら５分間インキュベートした。ポリリジンを除去し、プレートを５分間乾燥し、水で１回洗浄後、ＨＥＫ－ｈＡＣＥ２細胞を播種した。翌日、細胞を８０％集密度であることを検査した。ハーフエリア９６ウェルプレートを用いて、ＤＭＥＭ中で、最終体積２２μＬで血清の１：３段階希釈を作製した。その後、２２μＬの偽ウィルスを段階希釈に加え、室温で３０～６０分間インキュベートした。混合物を細胞に加え、２時間後、４４μＬの２０％のＦＢＳおよび２％のＰｅｎＳｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭを加え、細胞を４８時間インキュベートした。４８時間後、４０μＬ／ウェルのＯｎｅ－Ｇｌｏ－ＥＸ（商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に加え、暗所で５～１０分間インキュベートした後、ＢｉｏＴｅｋ（商標）プレートリーダーで読み取った。正規化応答に対するｌｏｇ（阻害剤）の非線形回帰を使用して、カーブフィットからＩＣ_５０値を決定した。

定量化および統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８のＤｕｎｎの事後解析とノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定を用いて多群比較を実施した。Ｐ値が０．０５未満の場合、差異は有意であると見なされた。統計方法およびＰ値の範囲は、図および図表の凡例中に見つけることができる。

結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＢＤの次の５つの変異を安定化ＲＢＤ抗原の設計の出発点と見なした：Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７ＦおよびＦ３９２Ｗ。融合前Ｓ外部ドメイン三量体（ＰＤＢ ＩＤ ６ＶＸＸ）のクライオＥＭ構造を用いて、ＰｙＭｏｌ（商標）およびＲｏｓｅｔｔａ（商標）で５個の変異を解析した。Ｖ３６７Ｆ変異のみが溶媒に露出されていることがわかり、従って、抗原性を好ましくないように変えるリスクを回避するために、安定化ＲＢＤ設計に含めることを考慮しなかった。他の４つの変異は、最近特定されたリノール酸（ＬＡ）結合ポケットの近くまたはそれ内で観察され、Ｙ３６５はこの相互作用のための重要なゲーティング残基として特定された（図２Ａ～２Ｂ）。ＬＡ結合ポケット中のいくつかの変異に対するＤＭＳにより観察された発現および安定性の改善は、ＲＢＤのこの領域が、構造的に準最適であることを示した。

次に、これらの変異の組み合わせがＲＢＤのこれらのおよび他の特性をさらに改善し得るかどうかを探索した。Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗおよび／またはＦ３９２Ｗの１つまたは複数をモデル化し、同時に、近くの残基の変異も可能にするコンピュータープロトコルを、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）で開発した（図２Ｃ）。これらの４つの検証されたＬＡ結合ポケット内の変異のいずれかの含有を強制しない設計トラジェクトリーも実施され、その代わりに、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）が同じ領域中で一連の新規安定化変異を設計するのを可能にする。完全Ｓ外部ドメイン（ＰＤＢ ＩＤ ６ＶＸＸ）の場合、およびＲＢＤ単量体（ＰＤＢ ＩＤ ６ＹＺ５）の結晶構造の両方で全ての設計トラジェクトリーが実施され、ＬＡ結合ポケットの周りの領域で、僅かに異なる骨格高次構造を示した。空洞を充填するおよび／または覆い隠された極性基を除去する変異を有する１７種のリパック設計（「Ｒｐｋ」と略称）が実験解析のために選択され、ＤＭＳで特定した個別の変異のいくつかもまた、比較のために含まれた（表１）。

設計は、二十面体Ｉ５３－５０ナノ粒子中に組み込むことができるＩ５３－５０Ａナノ粒子三量体に対するＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＲＢＤの遺伝子融合に関連して選別され、６０コピーのＲＢＤを提示するワクチン候補としてのそれらの評価を可能にする。安定化ＲＢＤアミノ酸配列は、従って、哺乳動物発現のためにベクターにクローニングされ、Ｉ５３－５０Ａ配列Ｃ末端は抗原に融合され、２つのドメインは１６残基可撓性Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーにより連結された。

安定化設計は、Ｉ５３－５０Ａ三量体および陰性対照プラスミドに融合された野生型ＲＢＤ（「ＲＢＤ」）と一緒にＨＥＫ２９３Ｆ細胞から分泌された。細胞培養上清の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、全ての設計に対し、野生型に比べて、高められた発現を示した（図１Ａ）。さらに、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、各設計により形成されたジスルフィド結合二量体の量の著しい差異を示した（図１Ａ）。Ｆ３９２Ｗ変異を含む設計は、著しく低レベルのジスルフィド結合二量体を産生した。ＬＡ結合ポケット空洞を部分的に充填するＦ３９２Ｗに加えて、この変異のＣ３９１～Ｃ５２５のジスルフィドに対する近接は、それがこれらのシステインを含むオフターゲット分子間ジスルフィド形成に適さないことを示す。

２種の設計を単量体および三量体の両方として次記をより詳細な解析のために選択した：Ｒｐｋ４、これは、Ｆ３９２Ｗ単独を特徴とし、およびＲｐｋ９、これはＦ３９２ＷとＤＭＳ特定によるＹ３６５Ｆを組み合わせて、覆い隠された側鎖ヒドロキシル基を除去するために、およびＲｏｓｅｔｔａ特定によるＶ３９５Ｉと組み合わせて、生じた空洞を疎水性充填物で再充填するために（データは示さず）。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞からの規模拡大発現および固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製は、Ｒｐｋ４およびＲｐｋ９両方で、単量体としておよびＩ５３－５０Ａ三量体への融合体として、高められた収率を確証し、Ｒｐｋ９は、Ｉ５３－５０Ａ三量体の明確な利点を示した（図４Ａ＆１０Ａ）。全ての構築物は、低いレベルのオフターゲットジスルフィド結合ダイマー形成を特徴とし、安定化ＲＢＤ設計におけるＦ３９２Ｗ包含の重要性を強調する。単量体および三量体の両方に対し、固有のトリプトファン蛍光を監視して、ナノ示差走査蛍光定量法（ナノＤＳＦ）により融解温度（Ｔ_ｍ）を測定し、野生型対応物と比較して、Ｒｐｋ４タンパク質で１．９～２．４℃の増大およびＲｐｋ９タンパク質で３．８～５．３℃の増大を示した（図４Ｂ）。全ての単量体ＲＢＤは、円偏光二色性分光分析により識別不能であり、９５℃での変性後、リフォールディングするように見えた（図１０Ｂ）。さらに、Ｉ５３－５０Ａ三量体に融合した安定化ＲＢＤの水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）は、野生型ＲＢＤに比べて、ＬＡ結合ポケット中の２つの異なるペプチドセグメント中で減少した重水素取り込みを示し（図４Ｃ、図１１）、安定化設計における改善された局所的秩序化を示す。ＡＣＥ２結合モチーフを含む、ＬＡ結合ポケットから離れたペプチドセグメントは、野生型に比べて、保存された構造規則性を示した。構造規則性をさらに評価するために、３種全ての単量体ＲＢＤを別々にサイプロオレンジ染料と混合し、疎水基の露出を測定した（図４Ｄ）。Ｒｐｋ４とＲｐｋ９の両方は、野生型ＲＢＤに比べて、低減したシグナルを示し、Ｒｐｋ９は、最小の蛍光を生成し、安定化ＲＢＤ中のＬＡ結合ポケットの改善された局所秩序がより少ない疎水性露出を生ずることを示す。ＨＤＸ－ＭＳデータと一致して、抗原部位Ｉａを認識する抗体ＣＶ３０の結合により評価して（Ｈｕｒｌｂｕｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １１：５４１３（２０２０））、どの安定化変異セットもＡＣＥ２結合モチーフの抗原性に影響を与えなかった（図４Ｅ）。位置ＩＩｃおよびＬＡ結合ポケットにより近い位置に対して、非中和抗体ＣＲ３０２２（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３８６：６３０－６４４（２０２０））への親和性は、わずかに減少した（＜３．５倍）。まとめると、両セットの安定化変異は、抗原の発現、熱安定性、および構造規則性を高めたが、一方、抗原性に最小限の影響を与え、Ｒｐｋ９は、単量体ＲＢＤおよびＩ５３－５０Ａ三量体に対するそれらの遺伝子融合体の両方に対し、全ての範疇で優れた改善を示した。

安定化変異は単離ＲＢＤを考慮して設計されたが、このような変異はまた、完全Ｓ外部ドメインに関しても評価された。Ｔ４フィブリチンフォルドンに融合された融合前安定化ヘキサプロ抗原の総収率は、Ｒｐｋ９変異で測定され（Ｒｐｋ９－ヘキサプロ－フォルドン）、野生型バージョン（ヘキサプロ－フォルドン）と比較された。用語「ヘキサプロ」は、４つの有益なプロリン置換（Ｆ８１７Ｐ、Ａ８９２Ｐ、Ａ８９９Ｐ、Ａ９４２Ｐ）ならびにＳ－２Ｐに２つのプロリン置換（９８６および９８７のプロリン）を有するスパイクタンパク質を意味する。Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９：１５０１－０５（２０２０）を参照されたい；Ｒｐｋ９変異で収率のわずかな改善が認められたが、わずかに早期のＳＥＣ溶出体積が観察され、これは、Ｓ外部ドメインに関連する安定性の低減を示し得る。Ｒｐｋ９－ヘキサプローフォルドンは、ヘキサプロ－フォルドンと類似のナノＤＳＦプロファイルを示したが、６０℃超で起こる固有の蛍光の変化は、Ｒｐｋ９－ヘキサプロ－フォルドンでわずかに加速された（図８Ｃ）。陰性染色電子顕微鏡観察（ｎｓＥＭ）は、典型的融合前スパイク形態が、主に変異と共に維持されたことを明らかにした（図８Ｄ）。これらのデータは、ＬＡ結合ポケットに対する変異を融合前スパイク三量体に組み込むことは可能であるが、Ｒｐｋ９変異の安定化効果は、単離ＲＢＤに特有であるように見えることを示す。

ＲＢＤ安定化変異が、グリセロール、Ｌ－アルギニン、および洗浄剤３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）（これは、別の方法では、ナノ粒子免疫原の調製を安定化するために使用され得る）を欠く単純な緩衝液中で、ナノ粒子の安定化を改善するかどうかを次に調査した。相補性Ｉ５３－５０Ｂ．４ＰＴ１五量体成分（配列番号１７）の添加により、野生型および安定化ＲＢＤ－Ｉ５３－５０Ａ三量体をナノ粒子（ＲＢＤ－Ｉ５３－５０、Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０、およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０）に構築した（図５Ａ）。過剰残留成分を、グリセロール、Ｌ－アルギニン、およびＣＨＡＰＳと共にトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）を含む移動相を用いてＳＥＣにより除去し、高度単分散ナノ粒子の形成を陰性染色電子顕微鏡観察（ｎｓＥＭ）により確認した（図５Ｂ）。次に、精製ナノ粒子を小量の賦形剤を含む緩衝液中に透析し、凍結／解凍単一サイクルの前後に溶液安定性を評価した（図５Ｃ～５Ｅ）。グリセロールおよびＬ－アルギニンを補充したＴＢＳ中で、野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０は、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法（図５Ｃ）、動的光散乱（ＤＬＳ）（図５Ｄ）によりわずかな凝集の徴候を示したが、これは、Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０では観察されなかった。溶液安定性の差異は、グリセロールのみを含むＴＢＳ中への透析後さらに対比された：Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０は両方とも、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０より高い凝集耐性であり、固定化ヒトＡＣＥ２（ｈＡＣＥ２－Ｆｃ）およびＣＲ３０２２に対する結合をより良好に維持した（図５Ｅ）。ＴＢＳ単独への透析は、全ての試料の凝集および抗原性の減少の明確な証拠を示し、Ｒｐｋ９－Ｉ５３－５０は、ＲＢＤ－Ｉ５３－５０およびＲｐｋ４－Ｉ５３－５０よりもわずかに良好に抗原性を維持した。安定化ＲＢＤに対し観察された溶液安定性の改善は、それらの高められた熱安定性および構造規則性と一致するように見え、ワクチン製造に高度に関連する配合物安定性におけるわずかであるが、重要な改善を提供する。

次に、安定化ＲＢＤの免疫原性をマウスでの免疫化試験で評価した。野生型および安定化ＲＢＤを含む免疫原は、次の２つのフォーマットで調製された：各抗原を提示するＩ５３－５０ナノ粒子、およびほぼ同等のタンパク質の非構築対照で、この場合、Ｉ５３－５０Ａに対する三量体融合体は、わずかに改変された、ナノ粒子構築を促進する疎水性界面を欠く五量体足場と混合された（「２ＯＢＸ」；配列番号４３；図６Ａ）。三量体およびナノ粒子フォーマット中の異なるＲＢＤの免疫原性の評価を可能にすることに加えて、この比較はまた、ナノ粒子構築の効果も考慮に入れる。全てのナノ粒子免疫原は、グリセロールおよびＬ－アルギニンを補充したトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中で調製され、一方、野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子はまた、他の免疫原性試験との直接比較を可能にするＣＨＡＰＳをさらに含む緩衝液中でも調製された。ヘキサプロ－フォルドン（野生型ＲＢＤを特徴とする）を対照薬として含めた。雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを各免疫原で、３週間隔で２回免疫し、各免疫化の２週間後に血清を収集した（図６Ａ）。全ての投与量をＲＢＤのモル量で投与し、ＡｄｄａＶａｘアジュバントを含めた。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、ヘキサプロ－フォルドンに対する結合力価を測定し、曲線下面積（ＡＵＣ）（図６Ｂ）および中間点力価（図１２Ａ）を測定することにより解析した。全てのナノ粒子群由来の血清は、初回刺激後、ヘキサプロ－フォルドンよりもわずかに高い、および非構築対象よりも顕著に高い特異的抗体レベルを示した。結合シグナルは、２回目の免疫化後、全ての群で増大し、それらの間の区別は少ない。レンチウィルス骨格を用いた偽ウィルス中和は、初回刺激後に類似の傾向を示し、全てのナノ粒子群は、非構築対照に比べて、顕著に高い中和活性を示し、およびヘキサプロ－フォルドンより、ほぼ２桁程度さらに強力な中和を示す（図６Ｃ）。中和は、２回目の免疫化後に全ての群で強く増大し、ナノ粒子およびヘキサプロ－フォルドンは、最高レベルの中和活性を示した。種々のナノ粒子群間または種々の非構築対照群間の各時点で、中和活性の顕著な差異はなかった。マウス白血病ウィルス（ＭＬＶ）骨格を用いた異なる偽ウィルスアッセイで同等の結果が得られた（図１２Ｂ）。これらのデータは、安定化ＲＢＤは、三量体または粒子状、微粒子フォーマットで存在する場合、野生型ＲＢＤと類似の免疫原性であり、ナノ粒子提示は、特に、単回免疫化後に、ＲＢＤ免疫原性を顕著に高めることを確証した。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの貯蔵寿命安定性に対する改善は、製造および配布を簡略化することにより、世界的ワクチン接種の努力を直接高める潜在力を有する。２種の安定化ＲＢＤナノ粒子免疫原の安定性は、－８０℃、２～８℃、２２～２７℃および３５～４０℃での２８日間にわたる貯蔵に関し、ＤＬＳ（図７Ａ）、ＢＬＩ（図７Ｂ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、およびｎｓＥＭ（図７Ｃ）により、野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０と比較された。－８０℃、２～８℃、または２２～２７℃でのいずれの免疫原に関しても、調査期間中、ベースラインからの顕著なずれは観察されなかった。しかし、野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０の３５～４０℃で２８日間の貯蔵は、ＤＬＳおよびｎｓＥＭで検出可能な凝集および顕著な抗原性の低下に繋がった。対照的に、粒子安定性および抗原性の両方は、Ｒｐｋ４－Ｉ５３－５０およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０における、３５～４０℃で２８日間の貯蔵で維持された。これらの結果は、ＲＢＤ中の安定化変異は、それらの強力な免疫原性を損なうことなく、ＲＢＤベースナノ粒子免疫原の製造性および安定性を改善できることを確証した。

構造に基づくタンパク質設計は、可能な設計空間を特に有用な領域および変異に絞る実験的情報により大きく促進できる。本命書で、ウィルス糖タンパク質安定化の指針となるＤＭＳデータの有用性が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ ＲＢＤのＬＡ結合ポケットを構造上準最適な領域として特徴付け、潜在的安定化変異の識別点を提供することにより、実証された。これらのデータに導かれて、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）での構造的モデル化は、追加の安定化変異ならびに有望な変異の組み合わせを特定した。実験的に選別された全ての設計は、野生型ＲＢＤの発現の改良に成功し、これは、多くの純粋に構造に基づく設計実験に比べて、異常に高効率である。

ＲＢＤバリアントのこの完全な生化学的および生物物理学的特徴付けは、発現を高め；オフターゲットジスルフィドを最小化し；ローカル構造規則性を改善し；および熱、溶液、および貯蔵寿命安定性を増大させる設計を発明者らが選択するのを可能にし、同時に、Ｉ５３－５０ナノ粒子上に提示される野生型ＲＢＤの強力な免疫原性を維持した。詳細に試験した２種の変異体の内の、Ｒｐｋ４（Ｆ３９２Ｗ）は、より保存的で、単一アミノ酸変化のみを特徴とするが、特に発現および熱安定性を改善する追加の変異を含むＲｐｋ９（Ｙ３６５Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｖ３９５Ｉ）に比べて安定化が小さかった。理論に束縛されることを意図するものではないが、発明者らは、Ｒｐｋ４－およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０の改善された溶液特性が、ＨＤＸ－ＭＳおよびサイプロオレンジ蛍光により示されるように、局所構造規則性の改善および低減した疎水性表面領域露出に由来する可能性が最も高いと推測した。より一般的には、これらの結果は、他のＲＢＤ抗原は、ＬＡ結合ポケットの開放および密閉状態の間の遷移状態などの、Ｓ外部ドメインの既存の構造または単離ＲＢＤで観察されない動的高次構造を取るかもしれないという可能性を生じさせる。

野生型ＲＢＤ－Ｉ５３－５０ナノ粒子に比べて、Ｒｐｋ４－およびＲｐｋ９－Ｉ５３－５０の同様に強力な免疫原性は、ＲＢＤに対する中和応答の主要焦点である、ＡＣＥ２結合モチーフの天然様の抗原性、および安定化変異は、抗原の表面上には露出していないという事実と一致する。これらの免疫原性データはまた、高い原子価ＲＢＤナノ粒子免疫原は、特に、単回免疫化後に、三量体型のＲＢＤよりはるかに高い免疫原性であることを明確に実証する。三量体スパイク（ヘキサプロ－フォルドン）は、三量体ＲＢＤよりも高いレベルの中和活性を誘発する。この結果は、スパイクの状況からＲＢＤを除去し、同時に、そのオリゴマー状態を維持することは、ＲＢＤに対する抗体応答を改善するために本質的に好都合ではなく、ＲＢＤベースワクチンにおけるナノ粒子提示の重要性を明確に示すことを実証する。

観察された製造性、安定性、および溶液特性の改善は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのタンパク質ベースワクチンの製造および配布に大きな影響を与えたであろう。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンは、抗原変異に対応して、既に更新されているので、このような改善は、新規ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株から得られた抗原の安定性または溶液特性の予期しない変化に対するワクチン作製の規模と速度ならびにバッファリングを最大化するために重要であり得る。さらに、種々の温度での改善された変性に対する抵抗性および貯蔵寿命安定性は、低温流通体系を欠く世界の発展途上の領域での信頼性の高い配布に対し特に顕著な効果があり得る。最後に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の出現の前の融合前安定化「２Ｐ」変異の知識は、世界的流行応答への取り組みにとって不可欠であることが立証されたので、ＲＢＤに対する安定化変異を用いた確実にワクチン製造性を改善する能力は、ヒトへクロスオーバーする恐れがある人獣共通感染症の新たな感染源中で循環する他のコロナウィルスに対するワクチン設計を最適化するための重要なツールであり得る。

Claims (73)

1. 配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、配列番号１のＲＢＤに比べて、少なくとも２つの変異をさらに含む非天然起源ポリペプチドであって、前記少なくとも２つの変異が、
   Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；
   Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
   Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
   Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
   Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
   Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
   Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
   Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；
   Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；
   Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
   Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；および
   Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ
   からなる群より選択されるか、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある、非天然起源ポリペプチド。
2. 配列番号１の残基３２８～５３１と、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルスの受容体結合ドメインの対応する残基と、少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、
   配列番号１のＲＢＤまたは前記第２のコロナウィルス中の対応する残基に比べて、少なくとも２つの変異をさらに含み、
   前記少なくとも２つの変異が、前記少なくとも２つの変異を欠く野生型ポリペプチドの安定性に比べて、前記ポリペプチドの安定性を高める、非天然起源ポリペプチド。
3. 前記少なくとも２つの変異が、配列番号１のアミノ酸位置：
   ３３８＆３６５；
   ３６５＆５１３；
   ３６５＆３９２；
   ３３８、３６３、３６５＆３７７；
   ３６５＆３９２；
   ３６５＆３９５；
   ３６５、３９２＆３９５；
   ３６５、５１３＆５１５；
   ３３８、３６３＆３６５；
   ３３８、３５８＆３６５；
   ３５８、３６５＆５１３；
   ３５８、３６５＆３９２；
   ３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；
   ３５８、３６５＆３９２；
   ３５８、３６５＆３９５；
   ３５８、３６５、３９２＆３９５；
   ３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または
   ３３８、３５８、３６３＆３６５
   にあるか、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、前記第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある、請求項２に記載のポリペプチド。
4. 前記少なくとも２つの変異が、配列番号１の：
   Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；
   Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
   Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
   Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
   Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
   Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
   Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
   Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；
   Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；
   Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
   Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
   Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；および
   Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ
   からなる群より選択されるか、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある、請求項２または３に記載のポリペプチド。
5. 配列番号１のＲＢＤ以外の追加のアミノ酸残基をさらに含む、請求項２～４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
6. 前記コロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が、配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９５％の同一性を含む、請求項２～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
7. 配列番号１のアミノ酸位置：
   ３３８＆３６５；
   ３６５＆５１３；
   ３６５＆３９２；
   ３３８、３６３、３６５＆３７７；
   ３６５＆３９２；
   ３６５＆３９５；
   ３６５、３９２＆３９５；
   ３６５、５１３＆５１５；
   ３３８、３６３＆３６５；
   ３３８、３５８＆３６５；
   ３５８、３６５＆５１３；
   ３５８、３６５＆３９２；
   ３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；
   ３５８、３６５＆３９２；
   ３５８、３６５＆３９５；
   ３５８、３６５、３９２＆３９５；
   ３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または
   ３３８、３５８、３６３＆３６５
   にあるか、または前記第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある前記少なくとも２つの変異が、野生型に比べて、前記受容体結合ドメイン中の変異のみである、請求項２～６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
8. 前記ＲＢＤポリペプチドの発現が、細胞中で発現される場合、前記少なくとも２つの変異を欠く前記野生型ＲＢＤポリペプチドの発現に比べて、増大する、請求項２～７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
9. 前記ＲＢＤポリペプチドが、コロナウィルス抗体に結合する、またはコロナウィルスの同族受容体に結合する、請求項２～８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
10. 前記コロナウィルス抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
11. 前記ポリペプチドに対応するコロナウィルスのための前記受容体が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）受容体を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
12. 前記ＡＣＥ受容体が、ＡＣＥ２受容体である、請求項１１に記載のポリペプチド。
13. 前記第２のコロナウィルスが、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）；中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）；２２９Ｅ；ＮＬ６３；ＯＣ４３；またはＨＫＵ１から選択されるコロナウィルスの配列を含む、請求項２～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
14. 配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項２～１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
15. 前記ＲＢＤが第２の異種ポリペプチドに融合される、請求項２～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
16. 前記ＲＢＤが、ナノ粒子、ナノ構造体または異種の足場タンパク質に融合される、請求項１５に記載のポリペプチド。
17. 前記ＲＢＤポリペプチドおよび／または前記第２のポリペプチドが、抗原性のポリペプチドである、請求項２～１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
18. 請求項１～１７のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
19. アジュバントをさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記組成物の貯蔵寿命が、前記少なくとも２つの変異を欠く野生型ＲＢＤポリペプチドを含む組成物より長い、請求項１８または１９に記載の組成物。
21. ワクチンとして処方される、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の組成物。
22. 少なくとも２つの変異を含み、前記少なくとも２つの変異が、少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも第２の変異を含む、非天然起源コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチド。
23. 前記少なくとも２つの変異が、前記少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも第２の変異を欠く野生型ポリペプチドの安定性に比べて、前記コロナウィルスポリペプチドの安定性を高める、請求項２２に記載のコロナウィルスポリペプチド。
24. 前記少なくとも１つの空洞充填変異が、前記コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１のリノール酸結合ポケット中の残基の変異を含む、請求項２２または２３に記載のコロナウィルスポリペプチド。
25. 前記少なくとも１つの空洞充填変異が、配列番号１の残基３２８～５３１内の残基の変異、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基にある変異を含む、請求項２２～２４のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
26. 前記少なくとも１つの空洞充填変異が、残基３３５～３４５；３５５～３７５、または３７８～３９５の間の配列番号１の残基の変異、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基にある変異を含む、請求項２２～２５のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
27. 前記少なくとも１つの空洞充填変異が、アミノ酸３３６、３３８、３４１、３４２、３５８、３６１、３６３、３６５、３６８、３７４、３７７、３８７、または３９２にある配列番号１の残基の変異、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルスの配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基の変異を含む、請求項２２～２６のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
28. 前記少なくとも１つの空洞充填変異および前記少なくとも１つの第２の変異が、配列番号１の残基
    ３３８＆３６５；
    ３６５＆５１３；
    ３６５＆３９２；
    ３３８、３６３、３６５＆３７７；
    ３６５＆３９２；
    ３６５＆３９５；
    ３６５、３９２＆３９５；
    ３６５、５１３＆５１５；
    ３３８、３６３＆３６５；
    ３３８、３５８＆３６５；
    ３５８、３６５＆５１３；
    ３５８、３６５＆３９２；
    ３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；
    ３５８、３６５＆３９２；
    ３５８、３６５＆３９５；
    ３５８、３６５、３９２＆３９５；
    ３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または
    ３３８、３５８、３６３＆３６５
    にあるか、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基にある、請求２２～２７のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
29. 前記少なくとも１つの空洞充填変異および前記少なくとも１つの第２の変異が、配列番号１の：
    Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；
    Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
    Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
    Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
    Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
    Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
    Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
    Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；
    Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；
    Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
    Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；および
    Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ
    からなる群より選択されるか、またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の対応する残基から選択される、請求項２２～２８のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
30. 前記コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドが、配列番号１の残基３２８～５３１またはプロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の配列との配列アラインメントにより決定される前記第２のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１の受容体結合ドメイン配列と少なくとも９５％の同一性を含む、請求項２２～２９のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
31. 配列番号１のアミノ酸位置：
    ３３８＆３６５；
    ３６５＆５１３；
    ３６５＆３９２；
    ３３８、３６３、３６５＆３７７；
    ３６５＆３９２；
    ３６５＆３９５；
    ３６５、３９２＆３９５；
    ３６５、５１３＆５１５；
    ３３８、３６３＆３６５；
    ３３８、３５８＆３６５；
    ３５８、３６５＆５１３；
    ３５８、３６５＆３９２；
    ３３８、３５８、３６３、３６５＆３７７；
    ３５８、３６５＆３９２；
    ３５８、３６５＆３９５；
    ３５８、３６５、３９２＆３９５；
    ３５８、３６５、５１３＆５１５；および／または
    ３３８、３５８、３６３＆３６５
    にあるか、または前記第２のコロナウィルス受容体結合ドメインの対応する残基にある前記少なくとも２つの変異が、配列番号１に比べて、前記スパイクタンパク質サブユニット１中の変異のみである、請求項２２～３０のいずれか１項に記載のコロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチド。
32. 前記コロナウィルスポリペプチドが、配列番号１、または第２のコロナウィルスの野生型スパイクタンパク質サブユニット１アミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を含む、請求項２２～３１のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
33. 前記コロナウィルスポリペプチドの発現が、細胞中で発現される場合、前記少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも１つの第２の変異を欠く野生型ポリペプチドの発現と同じ発現条件下で比較して、増大する、請求項２２～３１のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
34. コロナウィルス抗体に結合する、または同族コロナウィルス受容体に結合する、請求項２２～３３のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
35. 前記コロナウィルス抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を含む、請求項３４に記載のコロナウィルスポリペプチド。
36. 前記同族コロナウィルス受容体が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）受容体を含む、請求項３５に記載のコロナウィルスポリペプチド。
37. 前記ＡＣＥ受容体が、ＡＣＥ２受容体である、請求項３６に記載のコロナウィルスポリペプチド。
38. 重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウィルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）；中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）；２２９Ｅ；ＮＬ６３；ＯＣ４３；またはＨＫＵ１から選択されるコロナウィルスの改変された変異ポリペプチドである、請求項２２～３７のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
39. 前記コロナウィルススパイクタンパク質サブユニット１ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項２２～３８のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
40. 第２の異種ポリペプチドに融合される、請求項２２～３９のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
41. ナノ粒子、ナノ構造体または足場タンパク質に融合される、請求項２２～４０のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチド。
42. 前記コロナウィルスポリペプチドまたは前記第２の異種ポリペプチドが、抗原性ポリペプチドである、請求項４０に記載のコロナウィルスポリペプチド。
43. 請求項２２～４２のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
44. アジュバントをさらに含む、請求項４３に記載の組成物。
45. 同じ貯蔵条件下での貯蔵した場合、前記少なくとも１つの空洞充填変異および少なくとも第２の変異を欠く野生型コロナウィルスポリペプチドを含む組成物よりも組成物の貯蔵寿命が長い、請求項４３または４４に記載の組成物。
46. ワクチンとして処方される、請求項４３～４５のいずれか１項に記載の組成物。
47. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の受容体結合ドメインまたは請求項２２～４２のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドを発現している細胞。
48. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の受容体結合ドメインまたは請求項２２～４２のいずれか１項に記載のコロナウィルスポリペプチドをコードする核酸配列。
49. 対象にコロナウィルスに対するワクチンを接種する方法であって、請求項２１または請求項４６に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
50. 請求項１～１５または請求項２２～４２のいずれか１項に記載の組成物を、アジュバントおよび薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、ワクチンの製造方法。
51. 請求項１～２５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、コロナウィルススパイクタンパク質。
52. プロトコル１の前記Ｂｌａｓｔ－ｐパラメーターが、下記を含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法または組成物：
    アルゴリズム：ｂｌａｓｔｐ（タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴ）
    期待値の閾値：０．１
    ワードサイズ：６
    クエリー範囲内の最大マッチ：０
    マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２
    ギャップコスト：
    存在：１１
    伸長：１
    低複雑度領域のフィルター？：オフ
    マスク：
    ルックアップテーブルのみ？：オフ
    小文字？：オフ
53. プロトコル２の前記Ｂｌａｓｔ－ｐパラメーターが、下記を含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法または組成物：
    ｂｌａｓｔｐ －ｑｕｅｒｙ ｑｕｅｒｙ．ｆａｓｔａ －ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｂｊｃｔ．ｆａｓｔａ －ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２ －ｅｖａｌｕｅ ０．１－ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ ６ －ｇａｐｏｐｅｎ １１ －ｇａｐｅｘｔｅｎｄ １ －ｏｕｔ ｒｅｓｕｌｔｓ．ｔｘｔ
54. 配列番号１のコロナウィルスポリペプチドに比べて、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される変異またはそのバリアントを含むコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、ポリペプチド。
55. 前記変異が、Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、およびＦ３９２Ｗからなる群より選択される、請求項５４に記載のポリペプチド。
56. Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される第２の変異を含む、請求項５４または請求項５５に記載のポリペプチド。
57. Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌからなる群より選択される第３の変異を含む、請求項５４～５６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
58. 配列番号４または配列番号５のポリペプチド配列を含む、請求項５７に記載のポリペプチド。
59. 異種の足場タンパク質を含む、請求項５４～５８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
60. 前記異種の足場タンパク質が、配列番号３のポリペプチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の同一性を有する、請求項５９に記載のポリペプチド。
61. 前記異種の足場タンパク質が、配列番号３のポリペプチドを含む、請求項５９に記載のポリペプチド。
62. 配列番号６または配列番号７のポリペプチド配列を含む、請求項６１に記載のポリペプチド。
63. 請求項５９～６２のいずれか１項に記載のポリペプチドからなる第１の成分、および配列番号１３～１８のいずれか１つと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する第２の成分を含むまたはこれらからなる、ポリペプチド複合体。
64. 請求項５４～６２のいずれか１項に記載の組成物または請求項６３に記載のポリペプチド複合体を含む、ワクチン組成物。
65. 薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項６４に記載のワクチン組成物。
66. アジュバントをさらに含む、請求項６４または請求項６５に記載のワクチン組成物。
67. 請求項５４～６２のいずれか１項に記載のポリペプチド発現している細胞。
68. 請求項５４～６２のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
69. 対象にコロナウィルスに対するワクチンを接種する方法であって、請求項５４～６２のいずれか１項に記載ポリペプチド、請求項６３に記載のタンパク質複合体、または請求項６４～６８のいずれか１項に記載のワクチン組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
70. ワクチンの製造方法であって、請求項５４～６２のいずれか１項に記載のポリペプチドを、アジュバントおよび薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、方法。
71. ワクチンの製造方法であって、請求項５９～６２のいずれか１項に記載のポリペプチドからなる第１の成分；配列番号１３～１８のいずれか１つと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する第２の成分；薬学的に許容可能な担体；および任意選択でアジュバントを、混合することを含む、方法。
72. 非天然起源ポリペプチドであって、
    配列番号１の残基３２８～５３１と少なくとも９０％の同一性を含む第１のコロナウィルス受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、配列番号１の前記ＲＢＤに比べて、少なくとも１つの変異をさらに含み、前記少なくとも１つの変異が、配列番号１の
    Ｉ３５８Ｆ、Ｙ３６５Ｆ、Ｙ３６５Ｗ、Ｖ３６７Ｆ、Ｆ３９２Ｗ、Ｇ５０２Ｄ、Ｎ５０１Ｆ、Ｎ５０１Ｔ、Ｑ４９８Ｙ、Ｆ３３８Ｌ、Ｆ３３８Ｍ、Ａ３６３Ｌ、Ｙ３６５Ｍ、Ｆ３７７Ｖ、Ｖ３９５Ｉ、Ｌ５１３Ｉ、Ｌ５１３Ｍ、およびＦ５１５Ｌ、または第２のコロナウィルス基準配列から選択され、前記第２のコロナウィルス基準配列の対応する位置が、プロトコル１またはプロトコル２のＢｌａｓｔ－ｐパラメーターを用いて、配列番号１と、前記第２のコロナウィルス受容体結合ドメインのスパイクタンパク質配列との配列アラインメントにより決定される、非天然起源ポリペプチド。
73. 下記から選択される２つ以上の変異を含む、請求項７２に記載のポリペプチド：
    Ｆ３３８Ｌ／Ｙ３６５Ｗ；
    Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
    Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
    Ｆ３３８Ｍ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
    Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
    Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
    Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
    Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；
    Ｆ３３８Ｌ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ；
    Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｍ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｆ３９２Ｗ；
    Ｆ３３８Ｍ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３７７Ｖ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｖ３９５Ｉ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｆ／Ｆ３９２Ｗ／Ｖ３９５Ｉ；
    Ｉ３５８Ｆ／Ｙ３６５Ｗ／Ｌ５１３Ｉ／Ｆ５１５Ｌ；および
    Ｆ３３８Ｌ／Ｉ３５８Ｆ／Ａ３６３Ｌ／Ｙ３６５Ｍ。
    
    

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