KR20220140586A - SARS-CoV-2 백신 - Google Patents

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KR20220140586A
KR20220140586A KR1020227031250A KR20227031250A KR20220140586A KR 20220140586 A KR20220140586 A KR 20220140586A KR 1020227031250 A KR1020227031250 A KR 1020227031250A KR 20227031250 A KR20227031250 A KR 20227031250A KR 20220140586 A KR20220140586 A KR 20220140586A
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KR1020227031250A
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바니 그레이엄
키즈미키아 코빗
올루부콜라 아비오나
제프리 허친슨
제이슨 맥렐란
다니엘 래프
니안슈앙 왕
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더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
트러스티스 오브 다트마우스 칼리지
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Abstract

융합전 형태로 안정화된 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머, 이들 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 벡터, 및 그것들의 사용 방법 및 제조 방법이 개시된다. 여러 구현예에서, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머 및/또는 핵산 분자는 대상체에서 SARS-CoV-2 S에 대한 면역 반응, 예를 들어, 대상체에서 SARS-CoV-2 감염을 억제하는 면역 반응을 생성하기 위해 사용될 수 있다.

Description

SARS-CoV-2 백신
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 2월 11일에 출원된 미국 가출원 제62/972,886호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시는 융합전(prefusion) 형태로 안정화된 재조합 SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질, 및 면역원으로서의 그것의 용도에 관한 것이다.
코로나바이러스는 외피가 있는, 양성 센스 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 그것은 알려진 RNA 바이러스 중에서 가장 큰 게놈(26-32 kb)을 가지고 있고, 계통 발생학적으로 4개의 속(α, β, γ, δ)으로 나누어지며, 베타코로나바이러스는 4개의 계통(A, B, C, D)으로 더 세분화된다. 코로나바이러스는 인간을 포함하여 광범위한 조류 및 포유류 종을 감염시킨다.
2019년에, 신종 코로나바이러스(세계 보건 기구에 의해 SARS-CoV-2로 지정됨)가 중국 우한에서 기원한 것으로 보이는 코로나바이러스 대유행의 원인 병원체로서 확인되었다. 높은 치사율, 모호하게 정의된 역학, 및 코로나바이러스에 대한 예방 또는 치료 조치의 부재로 효과적인 백신 및 관련 치료제에 대한 긴급한 필요성이 발생되었다.
본원에는 S 단백질 트라이머(trimer)를 융합전 형태로 안정화시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 프로토머(protomer)를 포함하는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인(ectodomain) 트라이머가 개시된다.
일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 2의 잔기 16-1208에 적어도 95%(예컨대 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 아미노산 및 서열번호 2의 위치 986 및 987에 프롤린 치환을 포함하는 프로토머를 포함하며, 프롤린은 S 엑토도메인 트라이머를 융합전 형태로 안정화시킨다. 위치 986 및 987의 프롤린은 천연 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 서열과 비교하여, K986P 및 V987P 치환과 같은 아미노산 치환이다. 일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 2의 잔기 16-1208을 포함하는 프로토머를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 추가로 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환 또는 결실, 예컨대 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 융합전 형태로 안정화시키는 아미노산 치환, 또는 S 엑토도메인의 S1/S2 프로테아제 절단 부위에서 프로테아제 절단을 억제 또는 방지하는 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 삼량체화 도메인(예컨대 T4 피브리틴 삼량체화 도메인)에 연결될 수 있다. 추가 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는, 예를 들어, 경막 도메인에의 결합에 의해 막에 고정될 수 있다.
추가 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 자체 조립 단백질 나노입자, 예컨대 페리틴 단백질 나노입자, 또는 합성 단백질 기반 나노입자 상에 포함될 수 있다. 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 코딩하는 핵산 분자가 또한 제공되며, 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 제조하는 방법도 제공된다.
대상체에게 투여하기에 적합한 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하는 면역원성 조성물이 또한 제공되며, 또한 단위 투여 형태에 포함될 수 있다. 조성물은 추가로 보조제를 포함할 수 있다. 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 또한 면역 체계에의 제시를 용이하게 하기 위해 담체에 콘쥬게이션될 수 있다. 대상체에게 유효량의 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머, 핵산 분자, 또는 벡터를 투여함으로써 대상체에서 SARS-CoV-2 감염을 억제 또는 방지하는 방법과 같이, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 개시된다.
본 개시의 전술한 및 다른 특징 및 장점은 첨부 도면을 참조하여 진행되는 여러 구현예의 다음의 상세한 설명으로부터 보다 분명해질 것이다.
도 1a-1d. K986P 및 V987P 아미노산 치환에 의한 융합전 형태로의 SARS-CoV-2 S 단백질의 안정화. (도 1a) SARS-CoV-2 S 일차 구조의 개략도. SS= 신호 서열, NTD= N-말단 도메인, RBD= 수용체 결합 도메인, S1/S2= S1/S2 프로테아제 절단 부위, FP= 융합 펩타이드, HR1= 헵타드 반복(heptad repeat) 1, CH= 중심 나선, CD= 연결기 도메인, HR2= 헵타드 반복 2, TM= 경막 도메인, CT= 세포질 꼬리. 화살표는 프로테아제 절단 부위를 나타낸다. (도 1b) SARS-CoV-2 S-2P 단백질(서열번호 2)의 크기 배제 크로마토그래피는 DNA 플라스미드 및 단백질의 균일한 집단으로부터의 고수준의 단백질 발현을 입증하는 단일한 큰 피크를 초래하였다. 피크 분획은 단백질 크기를 토대로 예상된 것과 같이 용출되었다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 2D 부류 평균(도 1c) 및 4.7 옹스트롬 구조(도 1d)는 융합전 형태만을 나타낸다.
도 2a-2d. SARS-CoV-2 WT 또는 S-2P로의 면역화 후 다수의 마우스 스트레인에서의 항체 반응. BALB/cJ(도 2a, 2d), C57BL/6J(도 2b), 또는 B6C3F1/J(도 2c) 마우스는 0 및 3주에 PBS, Sigma 보조제 시스템(SAS)으로 보조된 0.01 μg, 0.1 μg, 또는 1 μg의 SARS-CoV-2 S WT 또는 SARS-CoV-2 S-2P로 면역화되었고, 혈청은 프라임 후 2주(채워지지 않은 원) 및 부스트 후 2주(채워진 원)에 수집되었다. SARS-CoV-2 S-2P 면역화된 마우스로부터의 혈청은 SARS-CoV-2 S 특이적 IgG에 대해 ELISA에 의해 평가되었다(도 2a-2c). S WT 및 S-2P 면역화된 BALB/cJ 마우스 둘 다로부터의 부스트 후 혈청은 동형(homotypic) SARS-CoV-2 슈도바이러스(도 2d)에 대한 중화 항체에 대해 평가되었다. 프라임 후 및 부스트 후 결합 항체 반응을 각각의 용량 수준내에서 및 부스트 후 용량들 사이에서 비교하기 위하여(도 2a-2c) 그리고 각각의 용량에서 S WT 대비 S-2P에 의해 유도된 중화 항체 및 중화 활성에 미치는 용량의 효과를 비교하기 위하여(도 2d) 다중 비교 테스트를 포함한 이원 분산 분석이 사용되었다. 점선은 검출의 검정 한계를 나타낸다. 회색 파선 = p 값 < 0.05, 회색 선 = p 값 < 0.01, 검은색 파선 = p 값 < 0.001, 검은색 선 = p 값 < 0.0001.
도 3a-3b. SARS-CoV-2 S WT 및 SARS-CoV-2 S-2P의 바이러스 복제에 대해 마우스를 보호하는 능력. BALB/cJ 마우스는 0 및 3주에 PBS, SAS로 보조된 0.01 μg, 0.1 μg, 또는 1 μg의 SARS-CoV-2 S WT 또는 SARS-CoV-2 S-2P로 면역화되었다. 부스트 후 4주 후, 마우스는 마우스 적응된 SARS-CoV-2로 도전되었다. 도전 후 2일 후, 피크 바이러스 부하에서, 폐(도 3a) 및 비갑개(nasal turbinates)(도 3b)가 플라크 검정에 의한 바이러스 부하의 평가를 위해 수득되었다. 그룹은 다중 비교 테스트와 함께 일원 분산 분석에 의해 비교되었다. 점선은 검출의 검정 한계를 나타낸다. 회색 파선 = p 값 < 0.05, 회색 선 = p 값 < 0.01. 주: 0.01 μg S-2P 면역화된 마우스는 실험과 무관한 사망으로 인해 도전받지 않았다(N/T).
도 4a-4e. N-연결 글리칸 및 바이오콘쥬게이션 태그(Spy태그)가 있는 루마진 생성효소(Lumazine Synthase, LuS)- 및 페리틴-나노입자 스캐폴드는 포유류 세포에서 조립된 나노입자로서 잘 발현한다. (도 4a) CnaB2 도메인 태그("Spy태그") 및 CnaB2 도메인("Spy캐처") 바이오콘쥬게이션 쌍을 통해 분자를 공유 연결시키기 위한 수단으로서 아이소펩타이드 결합을 통한 바이오콘쥬게이션을 위한 별도의 Spy태그 및 나머지 Spy캐처를 보여주는 개략도. (도 4b) 나노입자 표면 상에서 항원을 콘쥬게이션하기 위해 포유류 세포에서 Spy태그가 있는 활성화된 나노입자를 생성하기 위한 발현 구성물의 설계. 상부 패널은 DNA 구성물을 보여준다. Spy태그는 절단 가능한 신호 펩타이드 뒤 나노입자 서열의 n-말단에 배치되었다. His 및 Strep 태그는 LuS 나노입자의 C-말단에 배치되었다. N-연결 글리코실화 부위는 단백질 발현을 용이하게 하기 위해 나노입자 서열에 조작되었다. 하부 패널은 LuS-N71-Spy태그 및 페리틴-N96-Spy태그 모노머 및 조립된 나노입자의 예상된 구조를 보여준다. 글리칸 및 Spy태그는 둘 다 나노입자 표면 상에 있다. (도 4c) 크기 배제 크로마토그램은 나노입자의 정확한 크기를 확인시켜주었다. 샘플은 Superdex 200 증가 10/300 GL 칼럼 상에 PBS에 로딩되었다. (도 4d) PNGase F의 존재 또는 부재 하에 LuS-N71-Spy태그 및 페리틴-N96-Spy태그의 SDS-PAGE. PNGase F의 위치가 표시된다. 페리틴의 다중 밴드는 단백질 가수분해성 절단 및 불완전한 글리코실화로 인한 것일 가능성이 있다. (도 4e) LuS-N71-Spy태그 및 페리틴-N96-Spy태그의 음성 염색 EM 이미지(좌측 패널) 및 2D 부류 평균(우측 패널)은 예상된 크기를 가진 정제된 나노입자의 정확한 조립을 보여준다.
도 5a-5e. SARS-CoV-2 S 트라이머의 LuS-Spy태그에의 콘쥬게이션은 LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크 나노입자의 표면 상에 SARS-CoV-2 스파이크 트라이머를 나타낸다. (도 5a) LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크 나노입자를 만들기 위해 Spy캐처 결합 SARS-CoV-2 스파이크 트라이머에 Spy태그 결합 LuS가 콘쥬게이션되는 것을 보여주는 개략도. (도 5b) PBS 중에 Superdex 200 증가 10/300 GL 칼럼 상의 LuS-N71-Spy태그, SARS-CoV-2 스파이크-Spy캐처, 및 콘쥬게이션된 생성물 LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크의 SEC 프로파일. (도 5c) DTT의 존재 하에 LuS-N71-Spy태그(레인 1), SARS-CoV-2 스파이크-Spy캐처(레인 2), 및 LuS-N71-Spy태그와 SARS-CoV-2 스파이크-Spy캐처와의 콘쥬게이션 혼합물(레인 3)의 SDS-PAGE. 콘쥬게이션 혼합물(레인 3)은 미량의 과잉 LuS-N71-Spy태그와 콘쥬게이션된 LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크 나노입자를 보여준다. (도 5d) 대표적인 마이크로그래프(좌측 패널) 및 2D 부류 평균(우측 패널)을 보여주는 SEC 정제 후 LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크 나노입자의 음성 염색 EM. (도 5e) 용액에서 칩 및 나노입자에 결합된 IgG가 있는, RBD 표적화 항체 CR3022 IgG와의 LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크 나노입자 결합에 대한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 반응 곡선. 일련의 나노입자 농도가 분석되었고 나노입자에 결합된 SARS CoV-2 스파이크의 농도는 200 nM 내지 1.56 nM 범위였다. 관찰된 ka 값이 제공되었다.
도 6a-6c. LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크의 면역원성. (도 6a) SARS-CoV-2 스파이크 면역원에 대한 개략적인 면역화 과정. (도 6b) 항-SARS-CoV-2 스파이크 ELISA 역가의 혈청 평가. 면역화 그룹은 색으로 코딩된다. 수직 점선은 면역원 용량 그룹과 프라임 후 주를 구분한다. 출발 상호 혈청 희석(100)은 수평 점선으로 표시된다. 각 동물로부터의 ELISA 역가는 개별 점으로 도시된다. 삼각형 점은 검정 최대값에서 ELISA 역가에 대해 제공되었다. 기하학적 평균은 검은색 수평선으로 표시되었다. 5주째에 높은 ELISA 역가를 보인, 0.08 mg의 LuS-N71-Spy태그로 면역화된 3마리의 동물은 검출 가능한 중화를 보인 이 대조군 그룹의 동일한 3마리 동물이었다. (도 6c) 5주 째에 각각의 동물로부터의 중화 역가는 개별 점으로 도시되며, 기하학적 평균은 각 그룹에 대해 제공된 값과 함께 검은색 수평선으로 표시된다. 면역화 그룹은 도 6b에서와 같이 색으로 코딩된다. 검출 한계(역가 = 40)는 수평 점선으로 표시되었다. P 값은 양측 Mann-Whitney 테스트에 의해 측정된다. *는 P≤0.05를 나타내고, **는 P≤0.01을 나타내며, ***는 P≤0.001을 나타내고 ****는 P≤0.0001을 나타낸다.
서열 목록
첨부되는 서열 목록에 열거된 핵산 및 아미노산 서열은 37 C.F.R. 1.822에서 정의된 것과 같이, 뉴클레오타이드 염기에 대해 표준 문자 약어, 및 아미노산에 대해 3문자 코드를 사용하여 제시된다. 각 핵산 서열의 한 가닥만이 제시되지만, 상보하는 가닥은 나타낸 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 포함되는 것으로 이해된다. 서열 목록은 2021년 2월 11일에 생성되고, "Sequence.txt"(~88 kb)로 명명된 파일 형태로 ASCII 텍스트 파일로서 제출되며, 그것은 본원에 참조로 포함된다.
상세한 설명
본 개시는 융합전 형태로 안정화되고, 예를 들어, 대상체에서 중화 면역 반응을 유도하기에 유용한 SARS-CoV-2 스파이크 당단백질 (S) 엑토도메인 트라이머를 제공한다.
I. 용어의 요약
다르게 명시되지 않는 한, 기술적 용어는 종래 용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 통상적인 용어의 정의는 Jones & Bartlett Publishers에 의해 출판된 Benjamin Lewin, Genes X, 2009; 및 Wiley-VCH에 의해 출판된 Meyers et al.(eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine, 16 volumes, 2008; 및 다른 유사한 참고문헌에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 단수 형태의 용어는 맥락에서 명백하게 다르게 나타내지 않는 한 단수 및 복수를 모두 나타낸다. 예를 들어, 용어 "항원"은 단일한 또는 복수의 항원을 포함하며 "적어도 하나의 항원"이란 구절과 동등한 것으로 간주될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하다(comprise)"는 "포함한다(include)"를 의미한다. 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진 임의의 및 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며, 다르게 표시되지 않는 한 설명의 목적으로 제공된 것이 추가로 이해되어야 한다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 물질이 사용될 수 있지만, 특히 적합한 방법 및 물질이 본원에서 기술된다. 상충하는 경우, 용어의 설명을 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 더불어, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시이며 제한하려는 의도가 아니다. 다양한 구현예의 검토를 용이하게 하기 위하여, 다음의 용어의 설명이 제공된다:
보조제: 항원성을 향상시키기 위하여 사용된 비히클. 일부 구현예에서, 보조제는 항원이 흡착되는 미네랄(명반, 수산화알루미늄, 또는 인산염)의 현탁액; 또는 예를 들어, 추가로 항원성을 향상(항원의 분해를 억제하고/하거나 대식세포의 유입을 유발)시키기 위하여 때때로 사멸된 미코박테리아를 포함하는(프로인트 완전 보조제), 항원 용액이 미네랄 오일에 유화되는(프로인트 불완전 보조제) 유중수 에멀션을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 개시된 면역원성 조성물에 사용된 보조제는 레시틴과 카보머 단일중합체의 조합(예컨대 Advanced BioAdjuvants, LLC사로부터 입수 가능한 ADJUPLEXTM 보조제, 또한 Wegmann, Clin Vaccine Immunol, 22(9): 1004-1012, 2015 참고)이다. 개시된 면역원성 조성물에 사용하기 위한 추가 보조제로는 QS21 정제 식물 추출물, 매트릭스 M, AS01, MF59, 및 ALFQ 보조제를 들 수 있다. 면역조절 올리고뉴클레오타이드(예컨대 CpG 모티프를 포함하는 것들)가 또한 보조제로서 사용될 수 있다. 보조제는 생물학적 분자("생물학적 보조제"), 예컨대 공동자극 분자를 포함한다. 예시의 보조제로는 IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L, 4-1BBL 및 톨 유사(toll-like) 수용체(TLR) 작용물질, 예컨대 TLR-9 작용물질을 들 수 있다. 보조제의 추가적인 설명은, 예를 들어, Singh(ed.) Vaccine Adjuvants and Delivery Systems. Wiley-Interscience, 2007)에서 찾아볼 수 있다. 보조제는 개시된 면역원과 함께 사용될 수 있다.
투여: 선택된 경로에 의한 작용제, 예컨대 개시된 면역원의 대상체에의 도입. 투여는 국소적이거나 전신적일 수 있다. 예를 들어, 만약 선택된 경로가 비강내라면, 작용제(예컨대 융합전 형태로 안정화된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하는 면역원)는 조성물을 대상체의 비강에 도입함으로써 투여된다. 예시의 투여 경로로는, 한정하는 것은 아니지만, 경구, 주사(예컨대 피하, 근육내, 피내, 복강내, 및 정맥내), 혀 밑, 직장, 경피(예를 들어, 국소적), 비강내, 질, 및 흡입 경로를 들 수 있다.
아미노산 치환: 폴리펩타이드의 한 아미노산의 상이한 아미노산으로의 대체.
항체: SARS-CoV-2 S 단백질, 그것의 항원성 단편, 또는 항원의 다이머 또는 멀티머와 같은 분석물(항원)에 특이적으로 결합하고 인식하는 면역글로불린, 항원 결합 단편, 또는 그것의 유도체. 용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며 한정하는 것은 아니지만 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하여, 다양한 항체 구조를 포함한다. 항체의 비제한적인 예로는, 예를 들어, 항원에 대한 결합 활성을 유지하는 온전한 면역글로불린 및 변이체 및 그것들의 단편을 들 수 있다. 항체 단편의 예로는 한정하는 것은 아니지만 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자(예컨대 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 들 수 있다. 항체 단편으로는 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항원 결합 단편 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 새롭게 합성된 것들을 들 수 있다(예컨대, Kontermann and Dubel(Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2nd Ed., Springer Press, 2010 참고).
담체: 항원이 연결될 수 있는 면역원성 분자. 담체에 연결될 때, 항원은 더 면역원성이 될 수 있다. 담체는 항원의 면역원성을 증가시키고/시키거나 진단적으로, 분석적으로, 및/또는 치료적으로 유익한 담체에 대한 항체를 유도하기 위하여 선택된다. 유용한 담체로는 자연적일 수 있는(예를 들어 박테리아 또는 바이러스로부터 유래) 중합체 담체, 반응 모이어티가 부착될 수 있는 하나 이상의 작용기를 함유한 반합성 또는 합성 물질을 들 수 있다.
보존성 변이체: "보존성" 아미노산 치환은 실질적으로 단백질의 기능, 예컨대 대상체에게 투여될 때 단백질의 면역 반응을 유도하는 능력에 영향을 미치거나 감소시키지 않는 그런 치환이다. 용어 보존성 변이는 또한 비치환 모(parent) 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함한다. 나아가, 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산(예를 들어 5% 미만, 일부 구현예에서 1% 미만)을 변경, 첨가 또는 결실시키는 결실 또는 첨가는 보존성 변이이며 이때 변경은 화학적으로 유사한 아미노산으로의 아미노산의 치환을 초래한다.
다음의 6개 그룹은 서로에 대해 보존성 치환인 것으로 여겨지는 아미노산의 예이다:
1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);
2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
4) 아르기닌(R), 리신(K);
5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및
6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).
비보존성 치환은 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 활성 또는 기능, 예컨대 대상체에게 투여되었을 때 면역 반응을 유도하는 능력을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 만약 아미노산 잔기가 단백질 기능에 필수적이라면, 그렇지 않으면 보존성 치환이라도 그 활성을 방해할 수 있다. 그러므로, 보존성 치환은 관심 있는 단백질의 기본적인 기능을 변경시키지 않는다.
대조군: 참조 표준. 일부 구현예에서, 대조군은 건강한 환자로부터 얻어진 음성 대조군 샘플이다. 다른 구현예에서, 대조군은 SARS-CoV-2 감염, 예컨대 SARS-CoV-2로 진단된 환자로부터 얻어진 양성 대조군 샘플이다. 또 다른 구현예에서, 대조군은 과거 대조군 또는 표준 참조 값 또는 값의 범위이다(예컨대 이전에 테스트된 대조군 샘플, 예컨대 알려진 예후 또는 결과를 가진 SARS-CoV-2로 감염된 환자의 그룹, 또는 기준선 또는 정상 값을 나타내는 샘플의 그룹).
테스트 샘플과 대조군 사이의 차이는 증가 또는 역으로 감소일 수 있다. 차이는 질적 차이 또는 양적 차이, 예를 들어 통계적으로 유의미한 차이일 수 있다. 일부 예에서, 차이는 대조군에 비해, 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500%, 또는 500%보다 큰 증가 또는 감소이다.
코로나바이러스: 중증의 호흡기 질병을 유발하는 것으로 알려진 양성 센스, 단일 가닥 RNA 바이러스 패밀리. 현재 코로나바이러스 패밀리로부터 인간을 감염시키는 것으로 알려져 있는 바이러스는 알파코로나바이러스 및 베타코로나바이러스 속으로부터 유래된다. 추가적으로, 감마코로나바이러스 및 델타코로나바이러스 속이 미래에 인간을 감염시킬 수 있다고 여겨진다.
베타코로나바이러스의 비제한적인 예로는 SARS-CoV-2, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 중증의 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV), 인간 코로나바이러스 HKU1(HKU1-CoV), 인간 코로나바이러스 OC43(OC43-CoV), 쥐과 간염 바이러스(MHV-CoV), 박쥐 SARS 유사 코로나바이러스 WIV1(WIV1-CoV), 및 인간 코로나바이러스 HKU9(HKU9-CoV)를 들 수 있다. 알파코로나바이러스의 비제한적인 예로는 인간 코로나바이러스 229E(229E-CoV), 인간 코로나바이러스 NL63(NL63-CoV), 돼지 전염병 설사 바이러스(PEDV), 및 전염성 위장염 코로나바이러스(TGEV)를 들 수 있다. 델타코로나바이러스의 비제한적인 예로는 백조 델타 코로나바이러스(SDCV)를 들 수 있다.
바이러스 게놈은 캡핑되어 있고, 폴리아데닐화되어 있으며, 뉴클레오캡시드 단백질로 덮여 있다. 코로나바이러스 비리온은 스파이크(S) 단백질로서 언급되는 I형 융합 당단백질을 함유한 바이러스 외피를 포함한다. 대부분의 코로나바이러스는 게놈의 5' 부분에 포함된 복제효소 유전자, 및 게놈의 3' 부분에 포함된 구조 유전자를 가진 공통된 게놈 조직을 가지고 있다.
축퇴성 변이체: 본 개시의 맥락에서, "축퇴성 변이체"는 유전자 코드의 결과로서 축퇴성인 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 20개의 자연적인 아미노산이 있는데, 그것들 대부분은 하나 이상의 코돈에 의해 명시된다. 그러므로, 펩타이드를 코딩하는 모든 축퇴성 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 펩타이드의 아미노산 서열이 변하지 않는 한 포함된다.
유효량: 대상체에서 원하는 반응, 예컨대 면역 반응을 유도하기에 충분한 작용제 예컨대 면역원의 양. 개시된 면역원의 다중 투여는 관심 있는 항원에 대한 보호 면역 반응, 및/또는 부스트 면역원이 프라임 면역원과 상이할 수 있는 프라임 부스트 프로토콜에서 "프라임"으로서 개시된 면역원의 투여를 얻기 위해 필요할 수 있다. 따라서, 개시된 면역원의 유효량은 보호 면역 반응을 유도하기 위하여 동일하거나 상이한 면역원으로 후속적으로 부스팅될 수 있는 대상체에서의 프라임 면역 반응을 유도하기에 충분한 면역원의 양일 수 있다.
한 예에서, 원하는 반응은 SARS-CoV-2 감염을 억제 또는 감소 또는 예방하는 것이다. SARS-CoV-2 감염은 방법이 효과적이기 위하여 완전하게 제거되거나 감소되거나 또는 예방될 필요는 없다. 예를 들어, 유효량의 면역원의 투여는 SARS-CoV-2 감염(예를 들어, 세포의 감염에 의해, 또는 SARS-CoV-2에 의해 감염된 대상체의 백분율에 의해 측정됨)을, 적합한 대조군과 비교하여 원하는 양만큼, 예를 들어 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 100%(검출 가능한 SARS-CoV-2 감염의 제거 또는 예방)만큼 감소시키는 면역 반응을 유도할 수 있다.
에피토프: 항원성 결정기. 이것들은 항원성이어서 특정 면역 반응을 유도하는, 분자 상의 특별한 화학적 그룹 또는 펩타이드 서열이며, 예를 들어, 에피토프는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원의 영역이다. 항체는 특정 항원성 에피토프, 예컨대 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 에피토프는 단백질의 삼차원적 접힘에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 불연속 아미노산으로부터 모두 형성될 수 있다.
발현: 핵산 서열의 전사 또는 번역. 예를 들어, 유전자는 그것의 DNA가 RNA 또는 RNA 단편으로 전사될 때 발현되고, 일부 예에서는 mRNA로 프로세싱된다. 유전자는 또한 그것의 mRNA가 아미노산 서열, 예컨대 단백질 또는 단백질 단편으로 번역될 때 발현될 수 있다. 특정 예에서, 이종성 유전자는 그것이 RNA로 전사될 때 발현된다. 또 다른 예에서, 이종성 유전자는 그것의 RNA가 아미노산 서열로 번역될 때 발현된다. 용어 "발현"은 본원에서 전사 또는 번역을 표시하기 위해 사용된다. 발현의 조절은 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, mRNA와 같은 중간 분자의 분해시, 또는 그것들이 생성된 후 특정 단백질 분자의 활성화, 비활성화, 구획화 또는 분해를 통한 제어를 포함할 수 있다.
발현 제어 서열: 작동 가능하게 연결된 이종성 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열. 발현 제어 서열은 발현 제어 서열이 핵산 서열의 전사 및, 필요에 따라 번역을 제어하고 조절할 때 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 그러므로 발현 제어 서열은 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 단백질 코딩 유전자 앞의 출발 코돈(ATG), 인트론을 위한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하기 위한 그 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지, 및 중단 코돈을 포함할 수 있다. 용어 "제어 서열"은 최소한, 존재가 발현에 영향을 미칠 수 있는 구성요소를 포함하도록 의도되며, 또한 존재가 유익한 추가적인 구성요소, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 프로모터를 포함할 수 있다.
프로모터는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열이다. 또한 프로모터 의존성 유전자 발현이 외부 신호 또는 작용제에 의해 세포 유형 특이적, 조직 특이적, 또는 유도성이 되도록 제어 가능하게 만들기에 충분한 그런 프로모터 요소가 포함된다; 그러한 요소는 유전자의 5' 또는 3' 영역에 위치할 수 있다. 구성성 및 유도성 프로모터가 둘 다 포함된다. 예를 들어, 박테리아 시스템에서 클로닝될 때, 박테리오파지 람다, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 등의 pL과 같은 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 포유류 세포 시스템에서 클로닝될 때, 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예컨대 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터(예컨대 레트로바이러스 긴 말단 반복; 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)가 사용될 수 있다. 재조합 DNA 또는 합성 기법에 의해 생성된 프로모터가 또한 핵산 서열의 전사를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터: 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스- 작용 요소를 포함하며; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터로는 기술분야에 알려져 있는 모든 것, 예컨대 코스미드, 플라스미드(예컨대, 네이키드 또는 리포솜에 함유된) 및 재조합 폴리뉴클레오타이드를 통합하는 바이러스(예컨대, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 관련 바이러스)를 들 수 있다.
페리틴: 제어된 방식으로 철을 저장하고 방출하는 단백질. 단백질은 거의 모든 살아있는 유기체에 의해 생성된다. 페리틴 폴리펩타이드는 24개의 단백질 서브유닛의 구형 단백질 복합체로 조립되고, 24개 서브유닛의 각각은 단일 페리틴 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 예에서, 페리틴은 표면 상에 항원 제공 나노입자, 예를 들어, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 형성하기 위해 사용된다.
이종성: 상이한 유전자 공급원으로부터 기원하는 것. 그것이 발현되는 세포 이외의 유전자 공급원으로부터 기원한 세포에 대해 이종성인 핵산 분자. 한 구체적이고, 비제한적인 예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인을 코딩하는 이종성 핵산 분자는 세포, 예컨대 포유류 세포에서 발현된다. 세포 또는 유기체에 이종성 핵산 분자를 도입하는 방법, 예를 들어 개시된 면역원을 코딩하는 핵산을 함유하는 나노입자의 주입, 또는 전기천공, 리포펙션, 입자 총 가속화, 및 상동성 재조합을 포함하여 핵산으로의 형질전환은 기술분야에 잘 알려져 있다.
숙주 세포: 벡터가 증식되고 그것의 DNA가 발현될 수 있는 세포. 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 용어는 또한 대상 숙주 세포의 임의의 자손을 포함한다. 모든 자손은 복제 중에 일어나는 돌연변이가 있을 수 있기 때문에 모 세포와 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 그러나, 그러한 자손은 용어 "숙주 세포"가 사용될 때 포함된다.
면역 반응: 면역 체계의 세포, 예컨대 B 세포, T 세포, 또는 단핵 세포의 자극에 대한 반응. 한 구현예에서, 반응은 특정 항원에 특이적이다("항원 특이적 반응"). 한 구현예에서, 면역 반응은 T 세포 반응, 예컨대 CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응이다. 또 다른 구현예에서, 반응은 B 세포 반응이고, 특정 항체의 생성을 초래한다.
면역원: 동물에게 주입되거나 동물에 흡수된 조성물을 포함하여, 동물에서 면역 반응을 불러 일으킬 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질(예를 들어, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머). 면역원의 대상체에의 투여는 관심 있는 병원체에 대한 보호 면역을 유도할 수 있다.
면역원성 조성물: 대상체에게 투여되었을 때, SARS-CoV-2에 대해 측정 가능한 CTL 반응을 유도하거나, 또는 SARS-CoV-2에 대해 측정 가능한 B 세포 반응(예컨대 항체의 생성)을 유도하는 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하는 조성물. 그것은 추가로 프로토머를 발현하기 위해 사용될 수 있는(그로써 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머에 대한 면역 반응을 불러 일으키기 위해 사용될 수 있는) 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 코딩하는 단리된 핵산 분자 및 벡터를 나타낸다. 생체내 사용을 위해, 면역원성 조성물은 전형적으로 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머 또는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 코딩하는 핵산 분자를 약학적으로 허용되는 담체에 포함할 것이고 또한 다른 작용제, 예컨대 보조제를 포함할 수 있다.
질환의 억제 또는 치료: 예를 들어, SARS-CoV-2 감염과 같은 질환의 위험이 있는 대상체에서 질환 또는 상태의 완전한 발달을 억제하는 것. "치료"는 질환 또는 병리적 상태가 발달하기 시작한 후 그것의 신호 또는 증상을 개선하는 치료적 개입을 나타낸다. 질환 또는 병리적 상태와 관련하여 용어 "개선하는"은 치료의 임의의 관찰 가능한 유익한 효과를 나타낸다. 질환을 억제하는 것은 질환의 위험을 예방 또는 감소시키는 것, 예컨대 바이러스 감염의 위험을 예방 또는 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 유익한 효과는, 예를 들어, 취약한 대상체에서 질환의 임상적 증상의 지연된 개시, 질환의 일부 또는 전부의 임상 증상의 중증도의 감소, 질환의 느려진 진행, 바이러스 부하의 감소, 대상체의 전체적인 건강 또는 웰빙의 개선에 의해, 또는 특정 질환에 대해 특이적인 다른 파라미터에 의해 증명될 수 있다. "예방적" 치료는 병리학 발병 위험을 감소시키기 위한 목적으로 질환의 신호를 나타내지 않거나 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여된 치료이다.
단리된: "단리된" 생물학적 구성요소는 실질적으로 다른 생물학적 구성요소, 예컨대 구성요소가 자연적으로 발생하는 다른 생물학적 구성요소, 예컨대 다른 염색체 및 염색체외 DNA, RNA, 및 단백질로부터 단리되었거나 정제되었다. "단리된" 단백질, 펩타이드, 핵산, 및 바이러스는 표준 정제 방법에 의해 정제된 것들을 포함한다. 단리된은 절대적인 순도를 필요로 하지 않으며, 적어도 50% 단리된, 예컨대 적어도 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 심지어 99.9% 단리된 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 바이러스 분자를 포함할 수 있다.
링커 및 연결된: 2개의 분자를 하나의 연속적인 분자로 연결하기 위해 사용될 수 있는 이중 기능성 분자. 펩타이드 링커의 비제한적인 예로는 글리신-세린 펩타이드 링커를 들 수 있다. 맥락이 다른 것을 나타내지 않는 한, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 "연결하는 것", 또는 함께 "연결된" 2개의 폴리펩타이드, 또는 제2 폴리펩타이드에 대한 "결합"을 갖는 제1 폴리펩타이드에 대한 언급은 공유 결합을 나타낸다(예를 들어 제1 및 제2 폴리펩타이드가 연속적인 폴리펩타이드 사슬을 형성하도록 펩타이드 링커를 통함). 만약 펩타이드 링커가 포함된다면, 제1 및 제2 폴리펩타이드의 공유 결합은 펩타이드 링커의 N-과 C-말단에 대한 것일 수 있다. 전형적으로, 그러한 결합은 펩타이드 링커에 의해 제2 폴리펩타이드에 연결된 제1 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 유전자적으로 조작하기 위한 분자 생물학 기법을 사용하여 달성된다.
천연 단백질, 서열, 또는 이황화 결합: 예를 들어, 선택적 돌연변이에 의해 변형되지 않은 폴리펩타이드, 서열 또는 이황화 결합. 예를 들어, 항원의 항원성을 표적 에피토프에 집중시키거나, 또는 천연 단백질에서 발생하지 않는 단백질에 이황화 결합을 도입하기 위한 선택적 돌연변이. 천연 단백질 또는 천연 서열은 또한 야생형 단백질 또는 야생형 서열로서 언급된다. 비천연 이황화 결합은 천연 단백질에 존재하지 않는 이황화 결합, 예를 들어, 유전자 조작에 의해 하나 이상의 시스테인 잔기의 단백질에의 도입으로 인해 단백질에서 형성되는 이황화 결합이다.
핵산 분자: RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 형태 및 상기의 혼합 중합체의 센스 및 항-센스 가닥을 모두 포함할 수 있는 뉴클레오타이드의 중합체 형태. 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시뉴클레오타이드 또는 어느 한 유형의 뉴클레오타이드의 변형된 형태를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"와 동의어이다. 핵산 분자는 보통, 다르게 명시되지 않는 한, 적어도 10개 염기의 길이이다. 용어는 DNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 자연적으로 발생하는 및/또는 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오타이드 결합에 의해 함께 연결된 자연적으로 발생하는 및 변형된 뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. "cDNA"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의, mRNA에 상보하거나 동일한 DNA를 나타낸다. "코딩"은 생물학적 프로세스에서 뉴클레오타이드의 규정된 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 규정된 서열을 가지는 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 뉴클레오타이드의 특정 서열의 고유한 특성 및 그것으로부터 비롯되는 생물학적 특성을 나타낸다.
작동 가능하게 연결된: 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 놓일 때 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 만약 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 핵산 서열은 연속적이며, 필요하다면 동일한 리딩 프레임에서 2개의 단백질 코딩 영역을 연결시킨다.
약학적으로 허용되는 담체: 사용되는 약학적으로 허용되는 담체는 관례적이다. E. W. Martin에 의한 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995에는 개시된 면역원의 약학적 전달에 적합한 조성물 및 제형이 기재되어 있다.
일반적으로, 담체의 본질은 사용되는 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 일반적으로 물, 생리 식염수, 평형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약학적으로 및 생리적으로 허용되는 유체를 비히클로서 포함하는 주입 가능한 유체를 포함한다. 고형 조성물(예컨대, 분말, 알약, 정제, 또는 캡슐 형태)의 경우, 종래의 무독성 고체 담체로, 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 또는 스테아르산 마그네슘을 들 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 외에, 투여될 약학적 조성물(예컨대 면역원성 조성물)은 미량의 무독성 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충제 등, 예를 들어 아세트산 나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체에게 투여하기에 적합한 담체는 멸균성이고/이거나 원하는 면역 반응을 유도하기에 적합한 조성물의 하나 이상의 측정된 용량을 함유하는 단위 투여 형태에 현탁되거나 그렇지 않으면 함유될 수 있다. 그것은 또한 치료 목적으로 사용하기 위한 약물이 수반될 수 있다. 단위 투여 형태는, 예를 들어, 멸균된 내용물을 함유하는 밀봉 바이알 또는 대상체에게 주사하기 위한 주사기에 들어 있거나, 또는 후속 가용화 및 투여를 위해 동결건조되거나 또는 고체 또는 제어 방출 투여량으로 있을 수 있다.
폴리펩타이드: 길이 또는 번역 후 변형(예컨대, 글리코실화 또는 인산화)과 관계 없는, 아미노산의 임의의 사슬. "폴리펩타이드"는 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체 및 자연적으로 발생하지 않는 아미노산 중합체를 포함하여 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산, 예를 들어, 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인공 화학적 모방물인 것에도 적용된다. "잔기"는 아미드 결합 또는 아미드 결합 모방물에 의해 폴리펩타이드에 통합된 아미노산 또는 아미노산 모방물을 나타낸다. 폴리펩타이드는 아미노 말단(N-말단) 단부 및 카르복시 말단(C-말단) 단부를 가진다. "폴리펩타이드"는 펩타이드 또는 단백질과 상호교환적으로 사용되며, 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 사용된다.
프라임-부스트 백신 접종: 면역 반응을 유도하기 위하여 대상체에게 제1 면역원성 조성물(프라임 백신)의 투여 후 제2 면역원성 조성물(부스트 백신)의 투여를 포함하는 면역요법. 일부 예에서, 프라임 백신 및/또는 부스트 백신은 면역 반응이 지시되는 항원을 발현하는 벡터(예컨대 바이러스 벡터, RNA, 또는 DNA 벡터)를 포함한다. 부스트 백신은 프라임 백신의 투여로부터 적합한 시간 간격 후 대상체에게 투여되며, 그러한 시간 틀의 예는 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 프라임 백신, 부스트 백신, 또는 둘 다는, 추가적으로 보조제를 포함한다. 한 비제한적인 예에서, 프라임 백신은 DNA 기반 백신(또는 유전자 전달을 기반으로 한 다른 백신)이고, 부스트 백신은 단백질 서브유닛 또는 단백질 나노입자 기반 백신이다.
단백질 나노입자: 다중 서브유닛, 자체 조립하는, 단백질 기반 다면체 모양의 구조. 서브유닛은 각각 단백질(예를 들어 글리코실화된 폴리펩타이드)로 구성되며, 선택적으로 다음: 핵산, 보결기, 유기 및 무기 화합물의 단일 또는 다중 특징으로 구성된다. 일부 구현예에서, 개시된 트라이머 스파이크 단백질의 프로토머는 각각의 단백질 나노입자 상에 트라이머 스파이크의 다중 복사물을 제공하기 위하여 단백질 나노입자의 서브유닛에 융합되거나 콘쥬게이션될 수 있다. 단백질 나노입자의 비제한적인 예로는 페리틴 나노입자(예컨대, 본원에 참조로 포함된 Zhang, Y. Int. J. Mol. Sci., 12:5406-5421, 2011 참고), 엔캡슐린(encapsulin) 나노입자(예컨대, 본원에 참조로 포함된 Sutter et al., Nature Struct. and Mol. Biol., 15:939-947, 2008 참고), 황 산소첨가효소 환원효소(SOR) 나노입자(예컨대, 본원에 참조로 포함된 Urich et al., Science, 311:996-1000, 2006 참고), 루마진 생성효소 나노입자(예컨대, Zhang et al., J. Mol. Biol., 306: 1099-1114, 2001 참고), 및 피루브산염 탈수소효소 나노입자(예컨대, 본원에 참조로 포함된 Izard et al., PNAS 96: 1240-1245, 1999 참고)를 들 수 있다. 페리틴, 엔캡슐린, SOR, 루마진 생성효소, 및 피루브산염 탈수소효소는 일부 경우에 각기 24, 60, 24, 60, 및 60개 단백질 서브유닛으로 이루어지는 구형 단백질로 자체 조립되는 모노머 단백질이다. 추가적인 단백질 나노입자 구조는 Heinze et al., J Phys Chem B., 120(26):5945-52, 2016; Hsia et al., Nature, 535(7610):136-9, 2016; 및 King et al., Nature, 510(7503):103-8, 2014에서 기재되며; 이들의 각각은 본원에 참조로 포함된다.
재조합: 재조합 핵산 분자는 자연적으로 발생하지 않는, 예를 들어, 하나 이상의 핵산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 서열을 가지며/가지거나, 다르게는 서열의 2개의 단리된 분절의 인공적인 조합에 의해 만들어진 서열을 가지는 것이다. 이런 인공적인 조합은 화학적 합성에 의해, 또는 보다 일반적으로, 핵산의 단리된 분절의 인공적인 조작에 의해, 예를 들어, 유전자 조작 기법에 의해 이루어질 수 있다. 재조합 바이러스는 재조합 핵산 분자를 포함하는 게놈을 포함하는 것이다. 재조합 단백질은 자연적으로 발생하지 않는 서열을 가지거나 다르게는 서열의 2개의 단리된 분절의 인공적인 조합에 의해 만들어진 서열을 가지는 것이다. 여러 구현예에서, 재조합 단백질은 숙주 세포, 예컨대 박테리아 또는 진핵 세포에, 또는 재조합 바이러스의 게놈에 도입된 이종성(예를 들어, 재조합) 핵산에 의해 코딩된다.
SARS-CoV-2: 우한 코로나바이러스, 2019-nCoV, 또는 2019 신종 코로나바이러스로도 알려져 있는 SARS-CoV-2는 중증 급성 호흡기 감염의 매우 치명적인 원인으로 부상한 베타코로나바이러스 속의 양성 센스의 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 바이러스 게놈은 캡핑되어 있고, 폴리아데닐화되어 있으며, 뉴클레오캡시드 단백질로 덮여 있다. SARS-CoV-2 비리온은 큰 스파이크 당단백질을 가진 바이러스 외피를 포함한다. SARS-CoV-2 게놈은, 대부분의 코로나바이러스와 같이, 게놈의 5'쪽 2/3에 포함된 복제효소 유전자, 및 게놈의 3'쪽 1/3에 포함된 구조 유전자를 가진 공통된 게놈 조직을 가진다. SARS-CoV-2 게놈은 5' - 스파이크(S) - 외피(E) - 믹(M) 및 뉴클레오캡시드(N) - 3'의 순서로 구조 단백질 유전자의 정식 세트를 코딩한다. SARS-CoV-2 감염의 증상으로는 열 및 호흡기 질병, 예컨대 마른 기침 및 호흡 곤란을 들 수 있다. 중증 감염의 경우는 중증의 폐렴, 다기관 부전, 및 사망으로 진행될 수 있다. 노출로부터 증상의 개시까지의 시간은 대략 2 내지 14일이다.
한정하는 것은 아니지만, 환자 증상 및 배경의 평가 및 역전사-중합효소 연쇄 반응(rRT-PCR)과 같은 유전자 테스트를 포함한, 바이러스 감염을 검출하는 표준 방법은 SARS-CoV-2 감염을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 테스트는 호흡기 또는 혈액 샘플과 같은 환자 샘플에 대해 시행될 수 있다.
SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질: 대략 1270개 아미노산 크기의 전구체 단백질로서 초기에 합성된 부류 I 융합 당단백질. 개별적인 전구체 S 폴리펩타이드는 단일트라이머를 형성하며 골지체 내에서 글리코실화를 진행할뿐만 아니라 신호 펩타이드를 제거하기 위해 프로세싱된다. S 폴리펩타이드는 대략 위치 685/68 사이에서 프로테아제 절단 부위에 의해 분리된 S1 및 S2 단백질을 포함한다. 이 부위에서의 절단은 단일 트라이머 내에 S1/S2 프로토머로서 회합된 채로 유지된 별도의 S1 및 S2 폴리펩타이드 사슬을 생성한다. S1 서브유닛은 바이러스 막에서 먼 곳에 있으며 숙주 수용체에 대한 바이러스 부착은 매개하는 수용체 결합 도메인(RBD)을 함유한다. S2 서브유닛은 융합 단백질 기계, 예컨대 융합 펩타이드, 2개의 헵타드 반복 서열(HR1 및 HR2) 및 융합 당단백질에 전형적인 중심 나선, 경막 도메인, 및 세포질 꼬리 도메인을 함유한다.
개시된 SARS-CoV-2 S 단백질 및 그것의 단편에 사용된 넘버링은 그것의 서열이 서열번호 1로서 제공되고, NCBI Ref. No. YP_009724390.1로 기탁된 SARS-CoV-2의 S 단백질에 상대적이며, 위 서열은 전체가 본원에 참조로 포함된다.
SARS-CoV-2 스파이크(S) 단백질 융합전 형태: 분비 시스템에서 성숙한 SARS-CoV-2 S 단백질로의 프로세싱 후, 및 융합 후 SARS-CoV-2 S의 형태로의 전이로 이어지는 융합 사건의 촉발 전에 SARS-CoV-2 S 단백질의 엑토도메인에 의해 채택된 구조적 형태. 예시의 SARS-CoV-2 S 단백질의 융합전 형태의 3차원 구조는 본원에 개시된다(실시예 1 참고).
"융합전 형태로 안정화된" SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 상응하는 천연 SARS-CoV-2 S 서열로부터 형성된 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머와 비교하여 융합전 형태의 증가된 보유를 제공하는 천연 SARS-CoV-2 S 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다. 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입에 의한 융합전 형태의 "안정화"는, 예를 들어, 에너지 안정화(예를 들어, 융합 후 개방된 형태에 비해 융합전 형태의 에너지를 감소시키는 것) 및/또는 운동 안정화(예를 들어, 융합전 형태로부터 융합 후 형태로의 전이 속도의 감소)일 수 있다. 추가적으로, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 융합전 형태로의 안정화는 상응하는 천연 SARS-CoV-2 S 서열과 비교하여 변성에 대한 내성의 증가를 포함할 수 있다. SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머가 융합전 형태로 있는지를 결정하는 방법으로는 (한정하는 것은 아니지만) 음성 염색 전자 현미경 검사를 들 수 있다.
서열 동일성: 아미노산 서열 사이의 유사성은 서열 사이의 유사성의 관점에서 표시되며, 다르게는 서열 동일성으로 언급된다. 서열 동일성은 자주 백분율 동일성의 측면에서 측정된다; 백분율이 높을수록, 두 서열은 더 유사하다. 폴리펩타이드의 상동체, 오르토로그, 또는 변이체는 표준 방법을 사용하여 정렬될 때 상대적으로 고도의 서열 동일성을 가질 것이다.
비교를 위한 서열의 정렬 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; 및 Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990에 기재되어 있고, 이것들은 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려사항을 나타낸다.
폴리펩타이드(예컨대 SARS-CoV-2 S 엑토도메인)의 상동체 및 변이체는 전형적으로 관심 있는 아미노산 서열과 전장 정렬에 걸쳐 계수된 적어도 약 75%, 예를 들어 적어도 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가지는 것을 특징으로 한다. 참조 서열에 대해 심지어 더 큰 유사성을 가진 단백질은 이 방법에 의해 평가될 때 증가하는 백분율 동일성, 예컨대 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 보일 것이다. 전체 서열보다 적은 서열이 서열 동일성에 대해 비교될 때, 상동체 및 변이체는 전형적으로 10-20개 아미노산의 짧은 윈도우와 적어도 80%의 서열 동일성을 가질 것이며, 참조 서열에 대한 유사성에 따라 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 그러한 짧은 창에 대해 서열 동일성을 측정하는 방법은 인터넷 상에서 NCBI 웹사이트에서 이용 가능한다.
본원에서 사용되는 바, "적어도 90% 동일성"에 대한 언급 또는 유사한 언어는 명시된 참조 서열에 대해 "적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 심지어 100% 동일성"을 나타낸다.
신호 펩타이드: 막(예를 들어, 소포체 막)에 대해 및 막을 통해 새롭게 합성된 분비 또는 막 단백질을 지시하는 짧은 아미노산 서열(예컨대, 대략 10-35개 아미노산 길이). 신호 펩타이드는 전형적으로 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하며 신호 펩티다제에 의해 제거된다. 신호 펩타이드 서열은 전형적으로 3가지의 공통적인 구조적 특징: N-말단 극성 염기성 영역(n-영역), 소수성 코어, 및 친수성 c-영역을 함유한다.
단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인: 단일 연속 폴리펩타이드 사슬로 SARS-CoV-2 S1 및 S2 단백질을 포함하는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인. 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인은 삼량체화하여 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 형성할 수 있다. 단일 SARS-CoV-2 S 엑토도메인은 S1/S2 절단 부위에서 프로테아제 절단을 방지하기 위한 돌연변이를 포함한다. 그러므로, 세포에서 생성될 때, SARS-CoV-2 S 폴리펩타이드는 별도의 S1 및 S2 폴리펩타이드 사슬로 절단되지 않는다.
가용성 단백질: 실온에서 수성 액체에서 용해할 수 있고 용해된 채로 유지될 수 있는 단백질. 단백질의 용해도는 물 기반 액체 중의 단백질의 농도, 액체의 완충 조건, 액체 중의 다른 용질, 예를 들어 염 및 단백질의 농도, 및 액체의 열에 따라 변화할 수 있다. 여러 구현예에서, 가용성 단백질은 실온에서 인산염 완충 식염수(Ph 7.4) 중의 적어도 0.5 mg/ml의 농도로 용해하고 적어도 48시간 동안 용해된 채로 유지되는 것이다.
대상체: 인간 및 비인간 포유류, 예컨대 비인간 영장류, 돼지, 낙타, 박쥐, 양, 소, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하는 범주인 살아있는 다중 세포 척추동물 유기체. 예에서, 대상체는 인간이다. 추가적인 예에서, SARS-CoV-2 감염을 억제하는 것을 필요로 하는 대상체가 선택된다. 예를 들어, 대상체는 감염되지 않고 SARS-CoV-2 감염의 위험이 있거나 감염되고 치료를 필요로 한다.
T4 피브리틴 삼량체화 도메인: 또한 "폴돈(foldon)" 도메인으로서 언급되는 T4 피브리틴 삼량체화 도메인은 자연적으로 트라이머 구조를 형성하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서, T4 피브리틴 삼량체화 도메인은 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 단백질 엑토도메인의 C-말단에 연결될 수 있다. 한 예에서, T4 피브리틴 삼량체화 도메인은 (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF(서열번호 6)로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로테아제 절단 부위(예컨대 트롬빈 절단 부위)는 필요에 따라, 예를 들어, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인의 발현 및 정제 후에 삼량체화 도메인의 제거를 용이하게 하기 위하여 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인의 C-말단과 T4 피브리틴 삼량체화 도메인 사이에 포함될 수 있다.
경막 도메인: 지질 이중층, 예컨대 세포 또는 바이러스 또는 바이러스 유사 입자의 지질 이중층에 삽입되는 아미노산 서열. 경막 도메인은 항원을 막에 고정시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 예에서 경막 도메인은 SARS-CoV-2 S 경막 도메인이다.
백신: 대상체에서 예방적 또는 치료적 면역 반응을 유도하는 약학적 조성물. 일부 경우에, 면역 반응은 보호성 면역 반응이다. 전형적으로, 백신은 병원체, 예를 들어 바이러스 병원체의 항원에 대해, 또는 병리적 상태와 상관이 있는 세포 구성요소에 대해 항원 특이적 면역 반응을 유도한다. 백신은 폴리뉴클레오타이드(예컨대 개시된 항원을 코딩하는 핵산), 펩타이드 또는 폴리펩타이드(예컨대 개시된 항원), 바이러스, 세포 또는 하나 이상의 세포 구성요소를 포함할 수 있다. 비제한적인 예에서, 백신은 SARS-CoV-2 감염과 관련된 증상의 중증도를 감소시키고/거나 대조군과 비교하여 바이러스 부하를 감소시키는 면역 반응을 유도한다. 또 다른 비제한적인 예에서, 백신은 대조군과 비교하여 SARS-CoV-2 감염을 감소시키고/거나 방지하는 면역 반응을 유도한다.
벡터: 관심 있는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되고 코딩 서열을 발현할 수 있는 프로모터(들)를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 함유하는 실체. 비제한적인 예로는 네이키드 또는 포장된(지질 및/또는 단백질) DNA, 네이키드 또는 포장된 RNA, 복제가 불가능할 수 있는 바이러스 또는 박테리아 또는 다른 미생물의 하위 구성요소, 또는 복제가 가능할 수 있는 바이러스 또는 박테리아 또는 다른 미생물을 들 수 있다. 벡터는 때때로 구성물로서 언급된다. 재조합 DNA 벡터는 재조합 DNA를 가지는 벡터이다. 벡터는 숙주 세포에서 복제하는 것을 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기원을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 기술분야에 알려져 있는 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 하나 이상의 바이러스로부터 유래된 적어도 약간의 핵산 서열을 가진 재조합 핵산 벡터이다.
바이러스 유사 입자(VLP): 여러 바이러스 중 임의의 것으로부터 유래된 복제하지 않는 바이러스 껍질. VLP는 일반적으로 하나 이상의 바이러스 단백질, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 캡시드, 코트, 껍질, 표면 및/또는 외피 단백질로서 언급된 단백질, 또는 이들 단백질로부터 유래된 입자 형성 폴리펩타이드로 구성된다. VLP는 별도의 발현 시스템에서 단백질의 재조합 발현시 자발적으로 형성될 수 있다. 바이러스 단백질의 재조합 발현 후 VLP의 존재는 종래 기법을 사용하여, 예컨대 전자 현미경 검사, 생물물리학적 특성화, 등에 의해 검출될 수 있다. 추가로, VLP는 공지된 기법, 예컨대, 밀도 구배 원심분리에 의해 분리되고 특징적인 밀도 밴딩에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, Baker et al.(1991) Biophys. J. 60:1445-1456; 및 Hagensee et al.(1994) J. Virol. 68:4503-4505; Vincente, J Invertebr Pathol., 2011; Schneider-Ohrum and Ross, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 354: 53073, 2012) 참고.
II. 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질
본원에는 융합전 형태로부터 융합 후 형태로의 SARS-CoV-2 S 단백질의 형태적 변화를 억제하고, 따라서 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 융합전 형태로 안정화시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 프로토머를 포함하는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머가 개시된다. 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 융합전 형태로 안정화되지 않는 상응하는 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머와 비교하여 월등한 면역 반응을 유발한다.
천연 SARS-CoV-2 S 단백질의 예시의 서열(엑토도메인 및 TM 및 CT 도메인을 포함함)은 서열번호 1(NCBI Ref. No. YP_009724390.1, 본원에 참조로 포함됨)로서 제공된다:
Figure pct00001
SARS-CoV-2 S 단백질의 잔기에 대해 본원에서 사용된 아미노산 넘버링은 서열번호 1로서 제공된 SARS-CoV-2 S 서열을 참조로 한다. 서열번호 1로서 제공된 SARS-CoV-2 S 서열을 참조로 하여, SARS-CoV-2 S 단백질의 엑토도메인은 약 잔기 16-1208을 포함한다. 잔기 1-15는 세포 프로세싱 중에 제거되는 신호 펩타이드이다. S1/S2 절단 부위는 위치 685/686에 위치한다. HR1은 약 잔기 915-983에 위치한다. 중심 나선은 약 잔기 988-1029에 위치한다. HR2는 약 1162-1194에 위치한다. S2 엑토도메인의 C-말단 단부는 약 잔기 1208에 위치한다. 일부 구현예에서, 융합전 안정화된 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 HR2(예컨대, 위치 1194), 또는 엑토도메인(예컨대, 위치 1208)의, 또는 위치 1194-1208 중 하나에서 C-말단 잔기의 C-말단 잔기(예를 들어 삼량체화 도메인, 또는 경막 도메인에 연결될 수 있음)를 가질 수 있다. S 단백질의 위치 넘버링은 SARS-CoV-2 스트레인 사이에서 달라질 수 있지만, 서열은 관련된 구조적 도메인과 절단 부위를 결정하기 위해 정렬될 수 있다. 엑토도메인의 N- 및 C-말단 단부 상의 소수의 잔기(예컨대 최대 10개)가 면역원으로서 S 엑토도메인 트라이머의 유용성을 감소시키지 않으면서 개시된 면역원에서 제거되거나 변형될 수 있는 것이 인정될 것이다.
일부 구현예에서, 면역원은 S 엑토도메인 트라이머를 융합전 상태로 안정화시키는 HR1 도메인과 중심 나선 도메인 사이에서 또는 사이의 경계 가까이에서 하나 이상의(예컨대 2개, 예를 들어 2개의 연속적인) 아미노산 치환을 포함하는 프로토머를 포함하는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하며, 여기서 아미노산 치환은 글리신 및/또는 프롤린 치환이다. 일부의 그러한 구현예에서, S 엑토도메인을 융합전 형태로 안정화시키는 하나 이상의(예컨대 2개, 예를 들어 2개의 연속적인) 아미노산 치환은 HR1의 C-말단 잔기의 위치 15 아미노산 N-말단과 중심 나선의 N-말단 잔기의 위치 5 아미노산 C-말단 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 융합전 형태로 안정화시키는 하나 이상의(예컨대 2개, 예를 들어 2개의 연속적인) 아미노산 치환은 트라이머의 S 엑토도메인 프로토머의 잔기 975 내지 995(예컨대 981-992) 사이에 위치하며, 여기서 아미노산 치환은 글리신 및/또는 프롤린 치환이다. 일부 구현예에서, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 트라이머의 S 엑토도메인 프로토머의 위치 D985, K986, 및/또는 V987에서 글리신 및/또는 프롤린 치환에 의해 융합전 형태로 안정화된다.
일부 구현예에서, 면역원은 S 엑토도메인 트라이머를 융합전 상태로 안정화시키는 HR1 도메인과 중심 나선 도메인 사이에서 또는 사이의 경계 가까이에서 하나 이상의(예컨대 2개, 예를 들어 2개의 연속적인) 프롤린 치환을 포함하는 프로토머를 포함하는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함한다. 일부의 그러한 구현예에서, S 엑토도메인을 융합전 상태로 안정화시키는 하나 이상의(예컨대 2개, 예를 들어 2개의 연속적인) 프롤린 치환은 HR1의 C-말단 잔기의 위치 15 아미노산 N-말단과 중심 나선의 N-말단 잔기의 위치 5 아미노산 C-말단 사이에 위치한다.
일부 구현예에서, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 융합전 상태로 안정화시키는 하나 이상의(예컨대 2개, 예를 들어 2개의 연속적인) 프롤린 치환은 트라이머의 S 엑토도메인 프로토머의 잔기 975 내지 995(예컨대 981-992) 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 트라이머의 S 엑토도메인 프로토머에서 K986P 및 V987P 치환("2P")에 의해 융합전 형태로 안정화된다. 일부 구현예에서, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 트라이머의 S 엑토도메인 프로토머의 위치 D985, K986, 또는 V987에서 1개 또는 2개의 프롤린 치환에 의해 융합전 형태로 안정화된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 프롤린 치환(예컨대 K986P 및 V987P 치환)에 의해 융합전 형태로 안정화된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 융합전 형태로의 안정화를 위해 하나 이상의 추가적인 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머에서 프로토머의 엑토도메인의 C-말단 잔기는 프로토머의 삼량체화를 촉진하기 위하여, 그리고 트라이머 구성에서 프로토머의 막 근위 측면을 안정화시키기 위하여 연결될 수 있다. 가용성 재조합 단백질의 안정적인 트라이머를 촉진하는 외인성 멀티머화 도메인의 비제한적인 예로는: GCN4 류신 지퍼(Harbury et al. 1993 Science 262:1401-1407), 폐 계면활성제 단백질로부터의 삼량체화 모티프(Hoppe et al. 1994 FEBS Lett 344:191-195), 콜라겐(McAlinden et al. 2003 J Biol Chem 278:42200-42207), 및 파지 T4 피브리틴(Miroshnikov et al. 1998 Protein Eng 11:329-414)을 들 수 있고, 그것들 중 어느 것이든지 본원에 기술된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인에 (예컨대, S2 엑토도메인의 C-말단에 대한 결합에 의해) 연결되어 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인의 삼량체화를 촉진할 수 있다.
일부 예에서, S2 엑토도메인의 C-말단 잔기는 T4 피브리틴 도메인에 연결될 수 있다. 특정 예에서, T4 피브리틴 도메인은 β-프로펠러 형태를 채택하는 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF(서열번호 6)를 포함할 수 있고, 자율적인 방식으로 접혀지고 삼량체화될 수 있다(Tao et al. 1997 Structure 5:789-798).
선택적으로, 이종성 삼량체화는 펩타이드 링커, 예컨대 아미노산 링커를 통해 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인에 연결된다. 사용될 수 있는 펩타이드 링커의 비제한적인 예로는 글리신, 세린, 및 글리신-세린 링커를 들 수 있다.
융합전 형태로 안정화를 위해 이중 프롤린을 포함하고 T4 피브리틴 삼량체화 도메인에 연결된 SARS-CoV-2 S 엑토도메인의 예시의 서열은 서열번호 2로서 제공된다:
Figure pct00002
일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 2의 엑토도메인 서열을 포함하는 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 2의 잔기 16-1208을 포함하는 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 2의 엑토도메인 서열과 적어도 90%(예컨대 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 서열을 포함하는 프로토머를 포함하고, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 본원에 제공된 하나 이상의 변형(예컨대 K986P 및 V987P 치환)으로 융합전 형태로 안정화된다. 일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 2의 잔기 16-1208과 적어도 90%(예컨대 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 서열을 포함하는 프로토머를 포함하며, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 본원에 제공된 하나 이상의 변형(예컨대 K986P 및 V987P 치환)으로 융합전 형태로 안정화된다.
일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 삼량체화 도메인, 예컨대 T4 피브리틴 삼량체화 도메인에 각각 연결된 서열번호 2의 엑토도메인 서열을 포함하는 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 2의 잔기 16-1235를 포함하는 삼량체화 도메인에 연결된 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 2의 잔기 16-1235와 적어도 90%(예컨대 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 서열을 포함하는 삼량체화 도메인에 연결된 프로토머를 포함하며, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 본원에 제공된 하나 이상의 변형(예컨대 K986P 및 V987P 치환)으로 융합전 형태로 안정화된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머가 약화된 바이러스 백신, 또는 바이러스 유사 입자로서 발현되거나, 또는 재조합 핵산(예컨대 mRNA)에 의해 발현되는 구현예의 경우, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 막 고정될 수 있다. 그러한 구현예에서, 트라이머의 프로토머는 전형적으로 각각 경막 도메인, 예컨대 SARS-CoV-2 S 단백질의 경막 도메인(및 선택적으로 세포질 꼬리)에 대한 C-말단 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 펩타이드 링커(예컨대 gly-ser 링커), 예를 들어, 10개 아미노산 글리신-세린 펩타이드 링커가 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머를 경막 도메인에 연결시키기 위해 사용될 수 있다. 경막 도메인에 연결된 프로토머는 경막 도메인에 연결된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머가 원하는 특성(예컨대, SARS-CoV-2 S 융합전 형태)을 유지하는 한 본원에 제공된 임의의 안정화 돌연변이(또는 그것의 조합)를 포함할 수 있다.
융합전 형태로 안정화를 위해 이중 프롤린을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질(엑토도메인 및 TM 및 CT 도메인을 포함함)의 예시의 서열은 서열번호 3으로서 제공된다:
Figure pct00003
일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 각각 경막 도메인 및 또는 세포질 꼬리에 연결된 서열번호 3의 엑토도메인 서열을 포함하는 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 3의 잔기 16-1273을 포함하는 경막 도메인에 연결된 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 3의 잔기 16-1273과 적어도 90%(예컨대 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 서열을 포함하는 경막 도메인에 연결된 프로토머를 포함하며, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 본원에 제공된 하나 이상의 변형(예컨대 K986P 및 V987P 치환)으로 융합전 형태로 안정화된다.
일부 구현예에서, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 각각이 S1 단백질 및 S2 엑토도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 3개의 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머로 구성될 수 있다. 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머는 구별되는 S1 및 S2 폴리펩타이드 사슬의 절단 및 형성을 방지하기 위하여 S1/S2 프로테아제 절단 부위를 돌연변이시킴으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머의 S1 및 S2 폴리펩타이드는 링커, 예컨대 펩타이드 링커에 의해 연합될 수 있다. 사용될 수 있는 펩타이드 링커의 예로는 글리신, 세린, 및 글리신-세린 링커를 들 수 있다. 본원에 개시된 임의의 안정화 돌연변이(또는 그것의 조합)는 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머로 구성된 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머가 원하는 특성(예컨대, 융합전 형태)을 유지하는 한 그러한 프로토머에 포함될 수 있다.
융합전 형태로 안정화를 위해 이중 프롤린을 포함하고 T4 피브리틴 삼량체화 도메인에 연결된 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인의 예시의 서열은 서열번호 4로서 제공된다:
Figure pct00004
일부 구현예에서, 재조합 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 T4 피브리틴 삼량체화 도메인과 같은 삼량체화 도메인에 연결된 서열번호 4의 엑토도메인 서열을 포함하는 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 경막 도메인에 연결된 재조합 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 4의 잔기 16-1233을 포함하는 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 경막 도메인에 연결된 재조합 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 4의 잔기 16-1233과 적어도 90%(예컨대 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 서열을 포함하는 프로토머를 포함하며, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 본원에 제공된 하나 이상의 변형(예컨대 K986P 및 V987P 치환)으로 융합전 형태로 안정화된다.
융합전 형태로 안정화를 위해 이중 프롤린을 포함하는 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 단백질(엑토도메인 및 TM 및 CT 도메인을 포함함)의 예시의 서열은 서열번호 5로서 제공된다:
Figure pct00005
일부 구현예에서, 재조합 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 각각 경막 도메인 및 또는 세포질 꼬리에 연결된 서열번호 5의 엑토도메인 서열을 포함하는 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 5의 잔기 16-1271을 포함하는 경막 도메인에 연결된 프로토머를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 단일 사슬 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 서열번호 5의 잔기 16-1271과 적어도 90%(예컨대 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 동일한 서열을 포함하는 경막 도메인에 연결된 프로토머를 포함하며, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 본원에 제공된 하나 이상의 변형(예컨대 K986P 및 V987P 치환)으로 융합전 형태로 안정화된다.
일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 융합전 안정화를 위해 K986P 및 V987P 치환을 포함하며 추가로 N501Y, K417N, 및 E484K 치환 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 K986P 및 V987P 치환을 포함하며 추가로 N501Y 치환, K417N 치환, E484K 치환, N501Y 및 K417N 치환, K417N 및 E484K 치환, N501Y 및 E484K 치환, 또는 N501Y, K417N, 및 E484K 치환을 포함한다.
재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머 및 그것의 변이체는 재조합 기법을 사용하여 생성되거나, 또는 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있다.
재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 유사체 및 변이체는 본 개시의 방법 및 시스템에 사용될 수 있다. 재조합 기술을 사용함으로써, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 변이체는 기본적인 DNA를 변경시킴으로써 제조될 수 있다. 변이체를 생성하는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 구조에서 그러한 모든 변이 또는 변경은 본 개시의 범위 내에 포함된다. 그러한 변이로는 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 치환, 또는 결실, 글리코실화 변이체, 글리코실화되지 않은 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머, 유기 및 무기 염, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 공유 변형된 유도체, 또는 그것의 전구체를 들 수 있다. 그러한 변이체는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 하나 이상의 기능적, 생물학적 활성, 예컨대 세포 표면 수용체에의 결합을 유지할 수 있다. 그것의 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는, 예를 들어, 페길화에 의해 변형되어, 수령체에서 단백질의 반감기를 증가시키고/거나, 대상체로의 전달을 위해 단백질을 보다 더 안정적으로 만들 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시 내에서 유용한 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 20개의 유전자 코딩된 아미노산(또는 D-아미노산)의 하나 이상의 자연적으로 발생하는 측쇄를 다른 측쇄, 예를 들어 알킬, 저급 알킬, 고리형 4-, 5-, 6-, 내지 7-원 알킬, 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 다이(저급 알킬), 저급 알콕시, 하이드록시, 카르복시 및 그것들의 저급 에스테르 유도체와 같은 기로, 및 4-, 5-, 6-, 내지 7-원 헤테로고리로 대체함으로써 변형된다. 예를 들어, 프롤린 잔기의 고리 크기가 5-원 고리로부터 4-, 6-, 또는 7-원 고리로 변경된 프롤린 유사체가 만들어질 수 있다. 고리형 기는 포화되거나 불포화될 수 있고, 불포화된 경우, 방향족이거나 비방향족일 수 있다. 헤테로고리형 기는 하나 이상의 질소, 산소, 및/또는 황 헤테로원자를 함유할 수 있다.
단백질 나노입자
일부 구현예에서 표면 상에 표시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하는 단백질 나노입자(예컨대 자체 조립 단백질 나노입자)가 제공된다. 자체 조립 단백질 나노입자의 비제한적인 예로는 페리틴 나노입자, 엔캡슐린 나노입자, 황 산소첨가효소 환원효소(SOR) 나노입자, 및 루마진 생성효소 나노입자를 들 수 있고, 그것들은 각각 페리틴 단백질, 엔캡슐린 단백질, SOR 단백질, 및 루마진 생성효소를 포함하는 모노머 서브유닛의 어셈블리로 구성된다. 추가적인 단백질 나노입자 구조는 Heinze et al., J Phys Chem B., 120(26):5945-52, 2016; Hsia et al., Nature, 535(7610):136-9, 2016; 및 King et al., Nature, 510(7503):103-8, 2014에 기재되며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
여러 구현예에서, 그러한 단백질 나노입자를 구성하기 위하여, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 코딩하는 핵산이 단백질 나노입자(예컨대 페리틴 단백질, 엔캡슐린 단백질, SOR 단백질, 또는 루마진 생성효소 단백질)의 서브유닛을 코딩하는 핵산에 융합되고 적절한 조건 하에서 세포에서 발현될 수 있다. 융합 단백질은 나노입자로 자체 조립되고 정제될 수 있다.
여러 구현예에서, 그러한 단백질 나노입자를 구성하기 위하여, 정제된 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머가 (예를 들어, 생체콘쥬게이션을 통해) 정제된 자체 조립 단백질 나노입자(예컨대 페리틴 단백질, 엔캡슐린 단백질, SOR 단백질, 또는 루마진 생성효소 단백질)의 서브유닛에 연결될 수 있고 결과적으로 생성된 나노입자/S 트라이머는 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는, 예를 들어, Votteler et al., "Designed proteins induce the formation of nanocage-containing extracellular vesicles", Nature 540, 292-29, 2016에 기재되어 있는 것과 같이, 바이러스를 닮은 방식으로 작은 소포 내부에서 세포로부터 자체 방출을 지시하는 자체 조립 단백질 나노케이지(nanocage)에 포함된다. 이 하이브리도 생체물질은 그것의 막을 표적 세포와 융합시켜서 내용물을 전달함으로써, 운반물(cargo)을 한 세포로부터 또 다른 세포로 옮길 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 페리틴 서브유닛에 연결되어 페리틴 나노입자를 구성할 수 있다. 페리틴 나노입자 및 그것의 면역화 목적의(예컨대 인플루엔자 항원에 대한 면역화를 위한) 용도는 기술분야에 개시되어 있다(예컨대, 전문이 본원에 참조로 포함된 Kanekiyo et al., Nature, 499:102-106, 2013 참고). 페리틴은 모든 동물, 박테리아, 및 식물에서 발견되는 구형 단백질로, 주로 수화된 철 이온과 양성자의 광물화된 코어로의 및 코어로부터의 수송을 통해 다핵 Fe(III)2O3 형성의 속도와 위치를 제어하는 역할을 한다. 페리틴 나노입자의 구형 형태는 대략 17-20 kDa의 분자량을 가지는 폴리펩타이드인 모노머 서브유닛으로 만들어진다. 그러한 한 모노머 페리틴 서브유닛의 아미노산 서열의 예는 다음으로 표시된다:
Figure pct00006
(서열번호 7).
각각의 모노머 서브유닛은 4개의 역평행 나선 모티프를 포함하는 나선 다발의 토폴로지를 가지며, 5번째 더 짧은 나선(c-말단 나선)은 4개 나선 다발의 장축에 대해 대략 수직으로 놓여 있다. 관례에 따르면, 나선은 N-말단으로부터 각각 'A, B, C, D 및 E'로 표지된다. N-말단 서열은 캡시드 3중 축에 인접하여 놓이고 표면으로 확장되는 한편, E 나선은 캡시드 코어로 연장되는 C-말단과 함께 4중 축에서 함께 패킹된다. 이런 패킹의 결과는 캡시드 표면에 2개의 구멍을 생성한다. 이들 구멍 중 하나 또는 둘 다는 수화된 철이 캡시드 안팎으로 확산되는 지점을 나타낼 것으로 예상된다. 생성된 후, 이들 모노머 서브유닛 단백질은 구형 페리틴 단백질로 자체 조립된다. 그러므로, 페리틴의 구형 형태는 24개의 모노머, 서브유닛 단백질을 포함하며, 432 대칭을 가진 캡시드 유사 구조를 가진다. 페리틴 나노입자를 구성하는 방법은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 알려져 있고 추가로 본원에서 기술된다(예컨대, 본원에 전문이 참조로 포함된 Zhang, Int. J. Mol. Sci., 12:5406-5421, 2011 참고).
구체적인 예에서, 페리틴 폴리펩타이드는 대장균 페리틴, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 페리틴, 인간 경쇄 페리틴, 황소 개구리 페리틴 또는 그것의 하이브리드, 예컨대 대장균-인간 하이브리드 페리틴, 대장균-황소 개구리 하이브리드 페리틴, 또는 인간-황소 개구리 하이브리드 페리틴이다. 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인을 포함하는 페리틴 나노입자를 만들기 위해 사용하기 위한 페리틴 폴리펩타이드 및 페리틴 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 예시의 아미노산은 GENBANK®에서, 예를 들어 등록 번호 ZP_03085328, ZP_06990637, EJB64322.1, AAA35832, NP_000137 AAA49532, AAA49525, AAA49524 및 AAA49523로 찾아볼 수 있고, 이것들은 2015년 4월 10일자로 그 전체가 여기에 참조로 구체적으로 포함된다. 일부 구현예에서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인은 서열번호 8로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%(예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 페리틴 서브유닛에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 루마진 생성효소 서브유닛에 연결되어 루마진 생성효소 나노입자를 구성할 수 있다. 루마진 생성효소 나노입자의 구형 형태는 모노머 서브유닛으로 구성되며; 하나의 그러한 루마진 생성효소 서브유닛의 서열의 예는 다음과 같이 제시된 아미노산 서열로서 제공된다:
Figure pct00007
(서열번호 8).
일부 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 서열번호 8로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%(예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 루마진 생성효소 서브유닛에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 엔캡슐린 나노입자 서브유닛에 연결되어 엔캡슐린 나노입자를 구성할 수 있다. 엔캡슐린 나노입자의 구형 형태는 모노머 서브유닛으로 구성되며; 하나의 그러한 엔캡슐린 서브유닛의 서열의 예는 다음과 같이 제시된 아미노산 서열로서 제공된다:
Figure pct00008
(서열번호 9).
일부 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 서열번호 9로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%(예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 엔캡슐린 서브유닛에 연결될 수 있다. 엔캡슐린 단백질은 효소를 포장하기 위한 최소한의 구획으로서 기능하는 큰 단백질 어셈블리를 형성하는 리노신 유사 단백질로서도 알려진 박테리아 단백질의 보존된 패밀리이다. 엔캡슐린 어셈블리는 대략 30 kDa의 분자량을 가진 폴리펩타이드인 모노머 서브유닛으로 구성된다. 생성된 후, 모노머 서브유닛은 60개, 또는 일부 경우에는 180개의 모노머 서브유닛을 포함하는 구형 엔캡슐린 어셈블리로 자체 조립된다. 엔캡슐린 나노입자를 구성하는 방법은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 알려져 있고, 추가로 본원에서 기술된다(예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 Sutter et al., Nature Struct. and Mol. Biol., 15:939-947, 2008 참고). 구체적인 예에서, 엔캡슐린 폴리펩타이드는 박테리아 엔캡슐린, 예컨대 써머토가 마리티마(Thermotoga maritima) 또는 (Pyrococcus furiosus) 또는 로도코쿠스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 또는 믹소코쿠스 크산투스(Myxococcus xanthus) 엔캡슐린이다.
일부 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 황 산소첨가효소 환원효소(SOR) 서브유닛에 연결되어 재조합 SOR 나노입자를 구성할 수 있다. 일부 구현예에서, SOR 서브유닛은 다음과 같이 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
Figure pct00009
(서열번호 10).
일부 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 서열번호 10으로서 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%(예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 97%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 SOR 서브유닛에 연결될 수 있다.
SOR 단백질은 24개 서브유닛 단백질 어셈블리를 형성하는 미생물 단백질(예를 들어 호열호산성 고세균인 아키디아누스 암비발렌스(Acidianus ambivalens)로부터 유래됨)이다. SOR 나노입자를 구성하는 방법은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 알려져 있다(예컨대, 전문이 본원에 참조로 포함된 Urich et al., Science, 311:996-1000, 2006 참고). SOR 나노입자를 만들기 위해 사용하기 위한 SOR 단백질의 아미노산 서열의 예는 전문이 본원에 참조로 포함된 Urich et al., Science, 311:996-1000, 2006에 제시된다.
생성 목적으로, 일부 구현예에서, 나노입자 서브유닛에 연결된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인은 세포 프로세싱 중에 절단되는 N-말단 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 나노입자 서브유닛에 연결된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머는 그것의 N-말단에, 예를 들어, 천연 코로나바이러스 S 신호 펩타이드를 포함하여, 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.
단백질 나노입자는 적절한 세포(예컨대, HEK 293 자유형 세포)에서 발현될 수 있고 융합 단백질은 나노입자로 자체 조립된 세포로부터 분비된다. 나노입자는 공지된 기법을 사용하여, 예를 들어 몇몇 상이한 크로마토그래피 과정, 예컨대 Mono Q(음이온 교환) 후 크기 배제(SUPEROSE® 6) 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
여러 구현예는 모노머 서브유닛의 단백질 구형 형태로의 자체 조립을 지시할 수 있는 페리틴, 엔캡슐린, SOR, 또는 루마진 생성효소 단백질의 모노머 서브유닛, 또는 그것들의 임의의 부분을 포함한다. 임의의 공지된 페리틴, 엔캡슐린, SOR, 또는 루마진 생성효소 단백질의 모노머 서브유닛으로부터의 아미노산 서열은, 모노머 서브유닛이 표면 상에 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 또는 그것의 면역원성 단편을 나타내는 나노입자로 자체 조립될 수 있는 한, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 또는 그것의 면역원성 단편과의 융합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
융합 단백질은 페리틴, 엔캡슐린, SOR, 또는 루마진 생성효소 단백질의 모노머 서브유닛 폴리펩타이드의 전장 서열을 포함할 필요는 없다. 모노머 서브유닛 폴리펩타이드의 부분, 또는 영역은 그 부분이 모노머 서브유닛의 단백질 구형 형태로의 자체 조립을 지시하는 아미노산 서열을 포함하는 한 이용될 수 있다.
III. 폴리뉴클레오타이드 및 발현
임의의 개시된 재조합 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 제공된다. 이들 폴리뉴클레오타이드는 프로토머를 코딩하는 DNA, cDNA 및 RNA 서열뿐만 아니라, DNA, cDNA 및 RNA 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 면역화에 사용된 DNA 또는 RNA 벡터를 포함한다. 다양한 기능적으로 동등한 핵산, 예컨대 서열을 상이하지만 동일한 단백질 서열을 코딩하거나, 또는 핵산 서열을 포함한 콘쥬게이트 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 구성하기 위한 유전자 코드.
SARS-CoV-2 S 단백질을 코딩하는 예시의 핵산 서열은 서열번호 11로서 제공된다:
Figure pct00010
위에서 제공된 예시의 SARS-CoV-2 S 프로토머의 DNA 서열은 융합전 안정화를 위해 본원에 개시된 아미노산 치환 및 결실을 도입하기 위해 변형될 수 있다.
여러 구현예에서, 핵산 분자는 적절한 세포에서 발현될 때 상응하는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머로 자체 조립할 수 있는 개시된 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머로 프로세싱되는 프로토머의 전구체를 코딩한다. 예를 들어, 핵산 분자는 세포에서 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인의 프로세싱 중에 단백질 분해로 절단되는 세포의 분비 시스템에 진입하기 위한 N-말단 신호 서열을 포함하는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인을 코딩할 수 있다.
여러 구현예에서, 핵산 분자는 적절한 세포에서 발현될 때 S1 및 S2 폴리펩타이드를 포함하는 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머로 프로세싱되는 전구체 SARS-CoV-2 S 폴리펩타이드를 코딩하며, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머는 본원에 기술된 안정화 변형을 포함하고, 선택적으로 삼량체화 도메인, 예컨대 T4 피브리틴 삼량체화 도메인에 연결될 수 있다.
예시의 핵산은 클로닝 기법에 의해 제조될 수 있다. 적절한 클로닝 및 서열분석 기법, 및 많은 클로닝 연습을 통해 숙련된 사람들에게 지시하기에 충분한 지침의 예는 알려져 있다(예컨대, Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) 및 Ausubel et al.(In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013) 참고).
핵산은 또한 증폭 방법에 의해 제조될 수 있다. 증폭 방법으로는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 결찰효소 연쇄 반응(LCR), 전사 기반 증폭 시스템(TAS), 자체 지속성 서열 복제 시스템(3SR)을 들 수 있다. 광범위한 클로닝 방법, 숙주 세포, 및 시험관내 증폭 방법들이 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다.
개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 벡터(예컨대 발현 벡터)에 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스로 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA로 통합되거나, 또는 다른 서열과 무관한 별도의 분자(예컨대 cDNA)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 어느 하나의 뉴클레오타이드의 변형된 형태일 수 있다. 용어는 DNA의 단일 및 이중 형태를 포함한다.
개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 발현 제어 서열과 부합하는 조건 하에서 이루어지도록 결찰된다. 발현 제어 서열로는, 한정하는 것은 아니지만, 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 단백질 코딩 유전자 앞의 시작 코돈(즉, ATG), 인트론을 위한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하기 위한 그 유전자의 정확한 리딩 프레임의 유지, 및 중단 코돈을 들 수 있다.
개시된 재조합 S 엑토도메인 프로토머를 코딩하는 DNA 서열은 적합한 숙주 세포로의 DNA 전달에 의해 시험관내에서 발현될 수 있다. 세포는 원핵세포이거나 진핵세포일 수 있다. 용어는 또한 대상체 숙주 세포의 임의의 자손을 포함한다. 모든 자손은 복제 중에 일어나는 돌연변이가 있을 수 있기 때문에 모 세포와 동일할 수 없는 것이 이해된다. 외래 DNA가 숙주에서 지속적으로 유지되는 것을 의미하는 안정적 전달 방법은 기술분야에 알려져 있다.
숙주로는 미생물, 효모, 곤충 및 포유류 유기체를 들 수 있다. 진핵 또는 바이러스 서열을 가진 DNA 서열을 원핵세포에서 발현시키는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포의 비제한적인 예로는 박테리아, 고세균, 곤충, 진균(예를 들어, 효모), 식물, 및 동물 세포(예를 들어, 포유류 세포, 예컨대 인간)를 들 수 있다. 사용되는 예시의 세포로는 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus subtilis), 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), SF9 세포, C129 세포, 293 세포, 뉴로스포라(Neurospora), 및 불멸화된 포유류 골수 및 림프양 세포주를 들 수 있다. 배양에서 포유류 세포를 증식시키기 위한 기법은 잘 알려져 있다(예컨대, Helgason and Miller(Eds.), 2012, Basic Cell Culture Protocols(Methods in Molecular Biology), 4th Ed., Humana Press 참고). 일반적으로 사용되는 포유류 숙주 세포주의 예는 VERO 및 HeLa 세포, CHO 세포, 및 WI38, BHK, 및 COS 세포주이지만, 더 높은 발현, 바람직한 글리코실화 패턴, 또는 다른 특징을 제공하도록 설계된 세포와 같은 세포주가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포로 HEK293 세포 또는 그것의 유도체, 예컨대 GnTI-/- 세포(ATCC® No. CRL-3022), 또는 HEK-293F 세포를 들 수 있다.
숙주 세포의 재조합 DNA로의 형질전환은 종래 기법에 의해 수행될 수 있다. 숙주가 원핵세포, 예컨대, 한정하는 것은 아니지만, 대장균인 경우, DNA 흡수가 가능한 적격 세포는 기하급수적 성장 단계 후에 수득된 세포로부터 제조될 수 있고 후속해서 표준 과정을 사용하여 CaCl2 방법에 의해 처리될 수 있다. 대안으로, MgCl2 또는 RbCl이 사용될 수 있다. 형질전환은 또한 필요하다면 숙주 세포의 원형질체의 형성 후에, 또는 전기천공에 의해 수행될 수 있다.
숙주가 진핵세포인 경우, 칼슘 포스페이트 공동침전과 같은 DNA의 형질주입 방법, 미세주입, 전기천공, 리포솜에 싸인 플라스미드의 삽입, 또는 바이러스 벡터와 같은 종래의 기계적 과정이 사용될 수 있다. 진핵 세포는 또한 개시된 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 선택 가능한 표현형을 코딩하는 제2 외래 DNA 분자, 예컨대 단순 헤르페스 티미딘 키나제 유전자로 공동 형질전환될 수 있다. 또 다른 방법은 진핵 세포를 일시적으로 감염 또는 형질전환시키고 단백질을 발현시키기 위하여 진핵 바이러스 벡터, 예컨대 유인원 바이러스 40(SV40) 또는 소 유두종 바이러스를 사용하는 것이다(예를 들어, Viral Expression Vectors, Springer press, Muzyczka ed., 2011 참고). COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주와 같은 고등 진핵 세포를 포함하는 세포에서 단백질을 생산하는 데 사용되는 플라스미드 및 벡터와 같은 적절한 발현 시스템.
비제한적인 한 예에서, 개시된 면역원은 pVRC8400 벡터를 사용하여 발현된다(본원에 참조로 포함된 Barouch et al., J. Virol., 79 ,8828-8834, 2005에 기재됨).
변형은 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머를 코딩하는 핵산에 대해 그것의 생물학적 활성을 감소시키지 않으면서 이루어질 수 있다. 일부 변형은 표적화 분자의 클로닝, 발현, 또는 융합 단백질로의 통합을 용이하게 하기 위해 이루어질 수 있다. 그러한 변형은 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, 종결 코돈, 개시 부위를 제공하기 위해 아미노 말단에 첨가된 메티오닌, 편리하게 위치한 제한 부위를 생성하기 위해 어느 한 쪽의 말단에 배치된 추가 아미노산, 또는 정제 단계를 돕기 위한 추가 아미노산(예컨대 폴리 His)을 들 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머가 세포로부터 세포 배지로 분비되는 트라이머로 자체 조립될 수 있는 조건 하에서 세포에서 발현될 수 있다. 그러한 구현예에서, 각각의 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머는 단백질이 분비 시스템으로 진입하도록 하는 리더 서열(신호 펩타이드)을 함유하며, 세포 배지로 분비되기 전에 신호 펩타이드는 절단되고 프로토머는 트라이머를 형성한다. 배지는 원심분리되고 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 상층액으로부터 정제될 수 있다.
IV. 바이러스 벡터
개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 코딩하는 핵산 분자는, 예를 들어, 숙주 세포에서 면역원의 발현을 위해, 또는 본원에 개시된 것과 같이 대상체의 면역화를 위해 바이러스 벡터에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 프라임-부스트 백신 접종의 일부로서 대상체에게 투여된다. 여러 구현예에서, 바이러스 벡터는 프라임-부스트 백신 접종에 사용하기 위하여 백신, 예컨대 프라이머 백신 또는 부스터 백신에 포함된다.
여러 예에서, 바이러스 벡터는 복제할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하지 않는 바이러스 게놈의 돌연변이를 가질 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 조건부로 복제할 수 있다. 다른 예에서, 바이러스 벡터는 숙주 세포에서 복제할 수 없다.
폴리오마 바이러스, 즉, SV40(Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol., 73:1533-1536), 아데노바이러스(Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-6; Berliner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al., 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet et al., 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), 백시니아 바이러스(Mackett et al., 1992, Biotechnology, 24:495-499), 아데노 관련 바이러스(Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123; On et al., 1990, Gene, 89:279-282), HSV 및 EBV를 포함하는 헤르페스 바이러스(Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson et al., 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield et al., 1987, Mol. Neurobiol., 1:337-371; Fresse et al., 1990, Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199), 신드비스 바이러스(H. Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; 미국 특허 제 5,091,309호 및 5,2217,879로), 알파바이러스(S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11371-11377) 및 조류 기원의 레트로바이러스(Brandyopadhyay et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos et al., 1992, J. Virol., 66:3391-3397), 쥐과 기원의 레트로바이러스(Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24; Miller et al., 1985, Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:1730-1737; Mann et al., 1985, J. Virol., 54:401-407), 및 인간 기원의 레트로바이러스(Page et al., 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher et al., 1992, J. Virol., 66:2731-2739)를 포함하여, 개시된 항원을 발현하기 위해 사용될 수 있는 많은 바이러스 벡터가 구성되었다. 배큘로바이러스(Autographa 캘리포니아 다핵 다면체증 바이러스; AcMNPV) 벡터가 또한 기술분야에 알려져 있고, 상업적 공급처(예컨대 PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif.)로부터 얻어질 수 있다.
여러 구현예에서, 바이러스 벡터는 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 다양한 기원으로부터의 아데노바이러스, 하위유형, 또는 하위유형의 혼합물이 아데노바이러스 벡터에 대한 바이러스 게놈의 공급원으로서 사용될 수 있다. 비인간 아데노바이러스(예컨대, 유인원, 침팬지, 고릴라, 조류, 개, 양, 또는 소 아데노바이러스)가 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 유인원 아데노바이러스는 아데노바이러스 벡터의 바이러스 게놈의 공급원으로서 사용될 수 있다. 유인원 아데노바이러스는 혈청형 1, 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, 39, 48, 49, 50, 또는 임의의 다른 유인원 아데노바이러스 혈청형의 것일 수 있다. 유인원 아데노바이러스는 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 약어, 예컨대, 예를 들어, SV, SAdV, SAV 또는 sAV를 사용하여 언급될 수 있다. 일부 예에서, 유인원 아데노바이러스 벡터는 혈청형 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, 또는 39의 유인원 아데노바이러스 벡터이다. 한 예에서, 침팬지 혈청형 C Ad3 벡터가 사용된다(예컨대, Peruzzi et al., Vaccine, 27:1293-1300, 2009 참고). 인간 아데노바이러스는 아데노바이러스 벡터에 대한 바이러스 게놈의 공급원으로서 사용될 수 있다. 인간 아데노바이러스는 다양한 하위그룹 또는 혈청형의 것일 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 하위그룹 A(예컨대, 혈청형 12, 18, 및 31), 하위그룹 B(예컨대, 혈청형 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 및 50), 하위그룹 C(예컨대, 혈청형 1, 2, 5, 및 6), 하위그룹 D(예컨대, 혈청형 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36-39, 및 42-48), 하위그룹 E(예컨대, 혈청형 4), 하위그룹 F(예컨대, 혈청형 40 및 41), 미분류 혈청그룹(예컨대, 혈청형 49 및 51), 또는 임의의 다른 아데노바이러스 혈청형의 것일 수 있다. 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람은 복제 가능 및 결핍 아데노바이러스 벡터(단일 및 다중 복제 결핍 아데노바이러스 벡터 포함)에 친숙하다. 다중 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 포함하여, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터의 예는 미국 특허 제 5,837,511호; 5,851,806호; 5,994,106호; 6,127,175호; 6,482,616호; 및 7,195,896호, 및 국제 특허 출원 번호 WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/16772, WO 95/34671, WO 96/22378, WO 97/12986, WO 97/21826, 및 WO 03/022311에서 개시된다.
V. 바이러스 유사 입자
일부 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하는 바이러스 유사 입자(VLP)가 제공된다. 전형적으로 그러한 VLP는 C-말단 경막 도메인에 의해 막 고정된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하며, 예를 들어 트라이머의 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 프로토머는 각각 경막 도메인 및 SARS-CoV-2 S 단백질로부터의 세포질 꼬리에 연결될 수 있다. VLP는 바이러스 복제에 필요한 바이러스 구성요소가 없으며 따라서 바이러스의 매우 약화된, 복제 불능 형태를 나타낸다. 그러나, VLP는 감염성 바이러스 입자 상에 발현되는 것과 유사한 폴리펩타이드(예컨대, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머)를 나타낼 수 있고 대상체에게 투여될 때 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바이러스 유사 입자 및 그것의 제조 방법은 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게 알려져 있고 친숙하며, 인간 유두종 바이러스, HIV(Kang et al., Biol. Chem. 380: 353-64(1999)), 셈리키 숲(Semliki-Forest) 바이러스(Notka et al., Biol. Chem. 380: 341-52(1999)), 인간 폴리오마 바이러스(Goldmann et al., J. Virol. 73: 4465-9(1999)), 로타바이러스(Jiang et al., 백신 17: 1005-13(1999)), 파보바이러스(Casal, Biotechnology and Applied Biochemistry, Vol 29, Part 2, pp 141-150(1999)), 개의 파보바이러스(Hurtado et al., J. Virol. 70: 5422-9(1996)), E형 간염 바이러스(Li et al., J. Virol. 71: 7207-13(1997)), 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스를 포함하여, 여러 바이러스로부터의 바이러스 단백질이 VLP를 형성하는 것으로 알려진다. 그러한 VLP의 형성은 임의의 적합한 기법에 의해 검출될 수 있다. 배지에서 VLP의 검출을 위해 기술분야에 알려져 있는 적합한 기법의 예로는, 예컨대, 전자 현미경검사 기법, 동적 광 산란(DLS), 선택적 크로마토그래피 분리(예컨대, VLP의 이온 교환, 소수성 상호작용, 및/또는 크기 배제 ㅋ크로마토그래피 분리) 및 밀도 구배 원심분리를 들 수 있다.
VI. 면역원성 조성물
개시된 면역원(예컨대, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머 또는 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 코딩하는 핵산 분자) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물이 또한 제공된다. 그러한 약학적 조성물은 기술분야의 통상적인 지식을 가진 사람에게 알려져 있는 다양한 투여 방식, 예를 들어, 근육내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내, 관절내, 복강내, 비강내, 혀 밑, 편도, 구인두, 또는 기타 비경구 및 점막 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 투여 가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있거나 분명해질 것이며 Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995와 같은 출판물에서 보다 상세하게 기술된다.
그러므로, 본원에 기술된 면역원은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되어 생물학적 활성을 유지하는 한편 또한 허용되는 온도 범위 내에서 보관하는 중에 증가된 안정성을 촉진하는 것을 도울 수 있다. 잠재적인 담체로는, 한정하는 것은 아니지만, 생리적으로 균형 잡힌 배양 배지, 인산연 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼(예컨대, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼), 다양한 유형의 습윤제, 한랭보호 첨가제 또는 단백질, 펩타이드 또는 가수분해물(예컨대, 알부민, 젤라틴)과 같은 안정화제, 당(예컨대, 수크로스, 락토스, 소르비톨), 아미노산(예컨대, 글루탐산 나트륨), 또는 다른 보호제를 들 수 있다. 결과적으로 생성된 수성 용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제제는 단일 또는 다중 투약을 위해 투여 전에 멸균 용액과 조합된다.
제형화된 조성물, 특히 액체 제형은 한정하는 것은 아니지만 유효 농도(일반적으로
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1% 중량/부피)의 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올, 메틸파라벤, 및/또는 프로필파라벤을 포함하여, 보관 중에 분해를 방지 또는 최소화하기 위한 정균제를 함유할 수 있다. 정균제는 일부 환자의 경우 금기일 수 있고; 따라서, 동결건조된 제형은 그러한 구성요소를 함유하거나 함유하지 않는 용액에 재구성될 수 있다.
본 개시의 면역원성 조성물은 약학적으로 허용되는 비히클로서 생리적 조건과 비슷하게 하기 위해 필요한 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 등장성 조정제, 습윤제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 락트산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 및 트라이에탄올아민 올레에이트를 함유할 수 있다.
면역원성 조성물은 숙주의 면역 반응을 증강시키기 위하여 선택적으로 보조제를 포함할 수 있다. 적합한 보조제는, 예를 들어, 톨 유사 수용체 작용물질, 명반, AlPO4, 알하이드로겔, 지질 A 및 그것의 유도체 또는 변이체, 오일 에멀젼, 사포닌, 중성 리포솜, 백신 및 사이토카인을 함유한 리포솜, 비이온성 블록 공중합체, 및 케모카인이다. 기술분야에 알려져 있는 많은 다른 적합한 보조제 중에서 폴리옥시에틸렌(POE) 및 폴리옥실프로필렌(POP)을 함유한 비이온성 블록 중합체, 예컨대 POE-POP-POE 블록 공중합체, MPLTM(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; Corixa, Hamilton, IN) 및 IL-12(Genetics Institute, Cambridge, MA)가 보조제로서 사용될 수 있다(Newman et al., 1998, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15:89-142). 이들 보조제는 비특이적 방식으로 면역 시스템을 자극하는 것을 도움으로써 약학적 제품에 대한 면역 반응을 증강시킨다는 점에서 장점을 가진다.
일부 경우에 개시된 면역원을 다른 작용제에 대한 보호 반응을 유도하는 다른 약학적 제품(예컨대, 백신)과 조합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하는 조성물은 대상 연령 그룹(대략 1 내지 6개월 유아)에 대해 미국 예방접종 자문 위원회(ACIP; cdc.gov/vaccines/acip/index.html)에 의해 권장된 다른 백신, 예컨대 인플루엔자 백신 또는 수두 대상포진 백신과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 그와 같이, 본원에 기술된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하는 개시된 면역원은 예를 들어, B형 간염(HepB), 디프테리아, 파상풍 및 백일해(DTaP), 폐렴구균(PCV), 헤모필루스 인플루엔자 b형(Hib), 소아마비, 인플루엔자 및 로타 바이러스에 대한 백신과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 멸균 조성물로서 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 전형적으로 유효량의 개시된 면역원을 함유하며 종래 기법에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 면역원성 조성물의 각각의 용량 중의 면역원의 양은 유의미한 해로운 부작용 없이 면역 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 일부 구현예에서, 조성물은 대상체에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용하기 위한 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 단위 투여 형태는 대상체에게 투여하기 위한 적합한 단일한 사전 선택된 투여량, 또는 둘 이상의 사전 선택된 단위 투여량의 적합한 표시된 또는 측정된 다수, 및/또는 단위 용량 또는 그것의 다중 용량을 투여하기 위한 계량 메커니즘을 함유한다. 다른 구현예에서, 조성물은 보조제를 추가로 포함한다.
VII. 면역 반응의 유도 방법
개시된 면역원(예컨대, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 코딩하는 핵산 분자(예컨대 RNA 분자) 또는 벡터, 또는 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하는 단백질 나노입자 또는 바이러스 유사 입자)은 대상체에서 SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 예에서, 대상체는 인간이다. 면역 반응은 보호 면역 반응, 예를 들어 SARS-CoV-2에 의한 후속 감염을 억제하는 반응일 수 있다. 면역 반응의 유도는 또한 SARS-CoV-2 감염 및 SARS-CoV-2 감염과 관련된 질병을 치료하거나 억제하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어 SARS-CoV-2에 대한 노출 또는 노출 가능성 때문에 SARS-CoV-2 감염이 있거나 발병할 위험이 있는 대상체가 면역화를 위해 선택될 수 있다. 개시된 면역원의 투여 후, 대상체는 감염 또는 SARS-CoV-2 감염과 관련된 증상에 대해 모니터링될 수 있다.
본 개시의 면역원 및 방법으로 면역화하기 위해 의도된 전형적인 대상체로는 인간뿐만 아니라, 비인간 영장류 및 다른 동물을 들 수 있다. 개시의 방법에 따라 면역화하기 위한 대상체를 확인하기 위해, 표적화된 또는 의심되는 질환 또는 상태와 관련된 위험 인자를 측정하기 위해, 또는 대상체에서 기존의 질환 또는 상태의 상황을 측정하기 위해 허용된 선별 방법이 사용된다. 이들 선별 방법으로는, 예를 들어, 표적화된 또는 의심되는 질환 또는 상태와 관련될 수 있는 환경, 가족, 직업 및 기타 위험 요인을 측정하기 위한 종래의 작업뿐만 아니라, 코로나바이러스 감염을 검출 및/또는 특성화하기 위한 진단 방법, 예컨대 다양한 ELISA 및 다른 면역검정 방법을 들 수 있다. 이들 및 다른 일상적인 방법은 임상의가 본 개시의 방법 및 약학적 조성물을 사용하여 면역화를 필요로 하는 환자를 선택할 수 있게 한다.
개시된 면역원의 투여는 예방 또는 치료 목적을 위한 것일 수 있다. 예방적으로 제공될 때, 면역원은 임의의 증상에 앞서, 예를 들어 감염에 앞서 제공된다. 면역원의 예방적 투여는 임의의 후속 감염의 과정을 방지 또는 개선하는 작용을 한다. 치료적으로 제공될 때, 면역원은 감염의 증상이 개시될 때 또는 그 후에, 예를 들어, SARS-CoV-2 감염의 증상의 발생 후에 또는 SARS-CoV-2 감염으로 진단된 후에 제공된다. 그러므로 면역원은 감염 및/또는 관련된 질환 증상의 예상된 중증도, 기간 또는 정도를 약화시키기 위해 SARS-CoV-2에 대한 예상된 노출 전에, SARS-CoV-2에 대한 노출 또는 의심되는 노출 후에, 또는 감염의 실제 개시 후에 제공될 수 있다.
본원에 기술된 면역원, 및 그것의 면역원성 조성물은 대상체, 바람직하게는 인간에서 SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 면역 반응을 유도 또는 향상시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 제공된다. 개시된 면역원의 실제 투여량은 질환 적응증 및 대상체의 특별한 상황(예를 들어, 대상체의 연령, 체격, 체력, 증상의 정도, 감수성 요인, 등), 투여 시간 및 경로, 동시에 투여되는 다른 약물 또는 치료, 뿐만 아니라 대상체에서 원하는 활성 또는 생물학적 반응을 유도하기 위한 조성물의 특정 약물학과 같은 요인들에 따라 달라질 것이다. 투여 요법은 최적의 예방적 또는 치료적 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다.
하나 이상의 개시된 면역원을 포함하는 면역원성 조성물은 조정(또는 프라임-부스트) 백신 접종 프로토콜 또는 조합 제형에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 신규한 조합 면역원성 조성물 및 조정 면역화 프로토콜은 별도의 면역원 또는 제형을 사용하며, 각각은 항-바이러스 면역 반응, 예컨대 SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 향해 지시된다. 항-바이러스 면역 반응을 유도하는 별도의 면역원성 조성물은 대상체에게 단일 면역화 단계에서 투여된 다가 면역원성 조성물에서 조합될 수 있거나, 또는 조정(또는 프라임-부스트) 면역화 프로토콜에서 별도로(일가 면역원성 조성물로) 투여될 수 있다.
여러 번의 부스트가 있을 수 있고, 각각의 부스트는 상이한 개시된 면역원일 수 있다. 일부 예에서, 부스트는 또 다른 부스트, 또는 프라임과 동일한 면역원일 수 있다. 프라임 및 부스트는 단일 용량으로 또는 다중 용량으로서 투여될 수 있고, 예를 들어 2회 용량, 3회 용량, 4회 용량, 5회 용량, 6회 용량 또는 그 이상의 용량이 대상체에게 여러 날, 수 주 또는 수 개월에 걸쳐 투여될 수 있다. 다중 부스트, 예컨대 1 내지 5회(예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5회 부스트)가 또한 제공될 수 있다. 상이한 투여량이 일련의 순차적인 면역화에 사용될 수 있다. 예를 들어 일차 면역화에서 상대적으로 큰 용량 후 부스트에서 상대적으로 적은 용량.
일부 구현예에서, 부스트는 프라임 후 약 2주, 약 3주 내지 8주, 또는 약 4주 후에, 또는 프라임 후 약 수 개월 후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 부스트는 프라임 후 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 10, 약 12, 약 18, 약 24개월 후에, 또는 프라임 후 더 많거나 더 짧은 시간에 투여될 수 있다. 대상체의 "면역 기억"을 향상시키기 위하여 주기적인 추가 부스트가 또한 적절한 시점에 사용될 수 있다. 선택된 백신 접종 매개변수의 적절성, 예를 들어 제형, 용량, 요법 등은 대상체로부터 혈청의 분취량을 취하고 면역 프로그램 과정 동안 항체 역가를 검정함으로써 결정될 수 있다. 더불어, 대상체의 임상 상태는 원하는 효과, 예컨대, 감염의 예방 또는 질환 상태의 개선(예컨대, 바이러스 부하의 감소)에 대해 모니터링될 수 있다. 만약 그러한 모니터링이 백신 접종이 최적이 아닌 것을 나타내면, 대상체는 추가 용량의 면역원성 조성물로 부스트될 수 있고, 백신 접종 매개변수는 면역 반응을 강화할 것으로 예상된 방식으로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 프라임-부스트 방법은 DNA-프라이머 및 대상체에 대한 단백질-부스트 백신 접종 프로토콜을 포함할 수 있다. 방법은 핵산 분자 또는 단백질의 2회 이상의 투여를 포함할 수 있다.
단백질 치료제의 경우, 전형적으로, 각각의 인간 용량은 1-1000 μg의 단백질, 예컨대 약 1 μg 내지 약 100 μg, 예를 들어, 약 1 μg 내지 약 50 μg, 예컨대 약 1 μg, 약 2 μg, 약 5 μg, 약 10 μg, 약 15 μg, 약 20 μg, 약 25 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 또는 약 50 μg의 단백질을 포함할 것이다.
면역원성 조성물에 사용된 양은 대상체 집단(예컨대, 유아 또는 고령자)을 토대로 선택된다. 특정 조성물에 대한 최적의 양은 항체 역가 및 대상체에서의 다른 반응의 관찰을 포함한 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 면역원성 조성물 중의 개시된 면역원, 예컨대 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머, 바이러스 벡터, 또는 핵산 분자의 유효량은 단일 용량의 투여에 의해 면역 반응을 유도하는데 비효과적이지만, 다중 투여량의 투여시, 예를 들어 프라임-부스트 투여 프로토콜에서 효과적인 양을 포함할 수 있다.
본 개시의 면역원의 투여시, 대상체의 면역 체계는 전형적으로 면역원에 포함된 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머에 대해 특이적인 항체를 생성함으로써 반응한다. 그러한 반응은 면역학적으로 유효한 용량이 대상체에게 전달된 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 대상체의 항체 반응은 유효한 투여량/면역화 프로토콜을 평가하는 맥락에서 측정될 것이다. 대부분의 경우 대상체로부터 얻어진 혈청 또는 혈장에서 항체 역가를 평가하는 것으로 충분할 것이다. 부스터 접종을 투여할지 및/또는 개체에게 투여되는 치료제의 양을 변경할지에 대한 결정은 적어도 부분적으로 항체 역가 수준을 토대로 할 수 있다. 항체 역가 수준은, 예를 들어, 면역원에 포함된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 포함하여, 항원에 결합하는 혈청 중의 항체의 농도를 측정하는, 예를 들어, 면역결합 검정을 토대로 할 수 있다.
SARS-CoV-2 감염은 방법이 효과적이기 위해 완전히 제거되거나 감소되거나 또는 예방될 필요는 없다. 예를 들어, 개신된 면역원 중 하나 이상으로 SARS-CoV-2에 대한 면역 반응의 유도는 SARS-CoV-2 감염을, 면역원의 부재시 SARS-CoV-2 감염과 비교하여 원하는 양만큼, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 100%(검출 가능한 감염 세포의 제거 또는 예방) 만큼 감소 또는 억제할 수 있다. 추가적인 예에서, SARS-CoV-2 복제는 개시된 방법에 의해 감소 또는 억제될 수 있다. SARS-CoV-2 복제는 방법이 효과적이기 위해 완전히 제거될 필요는 없다. 예를 들어, 개시된 면역원 중 하나 이상을 사용하여 유도된 면역 반응은 SARS-CoV-2 복제를, 면역 반응의 부재시 SARS-CoV-2 복제와 비교하여 원하는 양만큼, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 100%(검출 가능한 복제의 제거 또는 예방) 만큼 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 면역원은 대상체에게 보조제의 투여와 동시에 투여된다. 다른 구현예에서, 개시된 면역원은 대상체에게 보조제의 투여 후에 및 면역 반응을 유도하기에 충분한 양의 시간 내에 투여된다.
핵산을 투여하기 위한 한 가지 접근법은 플라스미드 DNA로, 예컨대 포유류 발현 플라스미드로의 직접적인 면역화이다. 핵산 구성물에 의한 면역화는 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 미국 특허 제 5,643,578호(세포 매개된 또는 체액 반응을 유도하기 위하여 원하는 항원을 코딩하는 DNA를 도입함으로써 척추동물을 면역화하는 방법을 기술함), 및 미국 특허 제 5,593,972호 및 미국 특허 제 5,817,637호(항원을 코딩하는 핵산 서열을 발현을 가능하게 하는 조절 서열에 작동 가능하게 연결시키는 것을 기술함)에서 교시된다. 미국 특허 제 5,880,103호는 면역원성 펩타이드 또는 다른 항원을 코딩하는 핵산을 유기체에 전달하는 여러 방법을 기술하고 있다. 방법은 핵산(또는 합성 펩타이드 자체), 및 면역 자극 구성물, 또는 콜레스테롤과 Quil ATM(사포닌)의 혼합시 자발적으로 형성된 30-40 nm 크기의 음전하 케이지 유사 구조인 ISCOMSTM의 리포솜 전달을 포함한다. 보호 면역은 톡소플라즈마증 및 엡스타인 바 바이러스 유도 종양을 포함한, 감염의 다양한 실험 모델에서 항원에 대한 전달 비히클로서 ISCOMSTM을 사용하여 생성되었다(Mowat and Donachie, Immunol. Today 12:383, 1991). ISCOMSTM 에 캡슐화된 1 mg 정도로 낮은 항원의 용량이 부류 I 매개 CTL 반응을 유발하는 것으로 나타났다(Takahashi et al., Nature 344:873, 1990).
일부 구현예에서, 대상체에서 개시된 면역원을 발현시키기 위해 플라스미드 DNA 백신이 사용된다. 예를 들어, 개시된 면역원을 코딩하는 핵산 분자는 면역원에 포함된 SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 DNA 면역화를 위한 플라스미드 벡터, 예컨대 pVRC8400 벡터(본원에 참조로 포함된 Barouch et al., J. Virol, 79, 8828-8834, 2005에 기술됨)에 포함될 수 있다.
면역화를 위해 핵산을 사용하는 또 다른 접근법에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 또는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머가 약화된 바이러스 숙주 또는 벡터 또는 바이러스 벡터에 의해 발현될 수 있다. 재조합 백시니아 바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 사이토메갈로 바이러스 또는 다른 바이러스 벡터가 펩타이드 또는 단백질을 발현시키고, 그로써 CTL 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역화 프로토콜에 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 미국 특허 제 4,722,848호에 기술되어 있다. BCG(바실러스 칼멧 게린)는 펩타이드의 발현을 위한 또 다른 벡터를 제공한다(Stover, Nature 351:456-460, 1991 참고).
한 구현예에서, 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 또는 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 코딩하는 핵산은 세포에 직접 도입된다. 예를 들어, 핵산은 표준 방법에 의해 금 미세구체 위에 로딩되고 Bio-Rad HELIOSTM 유전자 총과 같은 장치에 의해 피부에 도입될 수 있다. 핵산은 "네이키드"일 수 있고, 강력한 프로모터의 제어 하에 플라스미드로 이루어진다. 전형적으로, DNA는 근육에 주입되지만, 또한 다른 부위에 직접 주입될 수 있다. 주입을 위한 투여량은 일반적으로 약 0.5 μg/kg 내지 약 50 mg/kg이며, 전형적으로 약 0.005 mg/kg 내지 약 5 mg/kg이다(예컨대, 미국 특허 제 5,589,466호 참고).
예를 들어, 핵산은 표준 방법에 의해 금 미세구체 위에 로딩되고 Bio-Rad HELIOSTM 유전자 총과 같은 장치에 의해 피부에 도입될 수 있다. 핵산은 "네이키드"일 수 있고, 강력한 프로모터의 제어 하에 플라스미드로 이루어진다. 전형적으로, DNA는 근육에 주입되지만, 또한 다른 부위에 직접 주입될 수 있다. 주입을 위한 투여량은 일반적으로 약 0.5 μg/kg 내지 약 50 mg/kg이며, 전형적으로 약 0.005 mg/kg 내지 약 5 mg/kg이다(예컨대, 미국 특허 제 5,589,466호 참고).
또 다른 구현예에서, mRNA 기반 면역화 프로토콜이 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인을 코딩하는 핵산을 세포에 직접 전달하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA를 토대로 한 핵산 기반 백신은 이전에 언급된 접근법에 대한 강력한 대안을 제공할 수 있다. mRNA 백신은 숙주 게놈으로의 DNA 통합에 대한 안전성 문제를 배제하고 숙주 세포 세포질에서 직접 번역될 수 있다. 더욱이, RNA의 간단한 세포 유리, 시험관내 합성은 바이러스 벡터와 관련된 제조 상의 복잡한 문제를 피한다. 개시된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인을 코딩하는 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 RNA 기반 백신 접종의 2가지 예시적인 형태로는 종래의 비증폭 mRNA 면역화(예컨대, Petsch et al., "Protective efficacy of in vitro synthesized, specific mRNA vaccines against influenza A virus infection", Nature biotechnology, 30(12):1210-6, 2012 참고) 및 자체 조립 mRNA 면역화(예컨대, Geall et al., "Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines", PNAS, 109(36): 14604-14609, 2012; Magini et al., "Self-Amplifying mRNA Vaccines Expressing Multiple Conserved Influenza Antigens Confer Protection against Homologous and Heterosubtypic Viral Challenge", PLoS One, 11(8):e0161193, 2016; 및 Brito et al., "Self-amplifying mRNA vaccines", Adv Genet., 89:179-233, 2015)를 들 수 있다.
개시된 면역원 중 하나 이상의 유효량의 대상체에의 투여는 대상체에서 중화 면역 반응을 유도한다. 중화 활성을 평가하기 위하여, 대상체의 면역화 후에, 적절한 시점에 혈청이 대상체로부터 수집되고, 중화 테스트를 위해 보관될 수 있다. 중화 활성을 검정하는 방법으로는, 한정하는 것은 아니지만, 플라크 감소 중화(PRNT) 검정, 미세중화 검정, 유동 세포분석 기반 검정, 단일 주기 감염 검정을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 혈청 중화 활성은 SARS-CoV에 대해 사용된 것과 유사한 SARS-CoV-2 슈도바이러스를 사용하여 검정될 수 있다(Martin et al., Vaccine 26, 6338, 2008; Yang et al., Nature 428, 561, 2004; Naldini et al., PNAS 93, 11382, 1996; Yang et al., PNAS 102, 797, 2005).
실시예
다음의 실시예는 특정 구현예의 구체적인 특징을 예시하기 위해 제공되지만, 청구범위의 범위는 예시된 특징에 제한되지 않아야 한다.
실시예 1
융합전 안정화된 SARS-CoV-2 S 단백질
이 실시예는 융합전 형태로 안정화된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 개발을 기술한다.
SARS-CoV-2 S 단백질의 서열을 조사하여 그것의 구조에 대한 세부 사항을 나타냈다. 이것으로부터, S 단백질을 그것의 융합전 형태로 안정화시키기 위해 아미노산 치환을 사용할 가능성을 평가하였다. 2개의 돌연변이: K986P 및 V987P가 SARS-CoV-2 S 단백질을 그것의 융합전 형태로 안정화시키는 데 특히 효과적인 것으로 확인되었다. K986P 및 V987P 치환이 있는 SARS-CoV-2 S를 "S-2P"로서 언급한다. 이들 2개의 프롤린 치환은 SARS-CoV-2 S2의 상부 부분(막에서 원위임), 중심 나선과 HR1 사이에 위치하며, 융합 전에서 융합 후 형태 변화를 방지한다. 도 1a는 SARS-CoV-2 S 도메인의 개략도를 도시한다.
융합전 SARS-CoV-2 S 단백질(K986P 및 V987P가 있음)은 C-말단 T4 피브리틴 삼량체화 도메인을 가진 가용성 단백질(TM 및 CT가 없음)로서 발현되었다. 신호 펩타이드 및 T4 피브리틴 삼량체화 도메인을 포함하여, K986P 및 V987P 치환이 있는 SARS-CoV-2 S 트라이머의 프로토머 서열은 서열번호 2로서 제공된다. 삼량체화 도메인에 대해 C-말단, 발현된 단백질은 HRV3C 절단 부위, 6xHis-태그 및 Twin-Strep-태그를 포함하여 정제 및 검출 태그를 포함하였다. 서열 검증 후, 발현 플라스미드를 프리스타일293 세포에 일시적으로 형질주입하였다. 배양물을 6일 후 수득하고, 분비된 단백질을 단백질의 C-말단에 대한 친화성 태그를 사용하여 Ni2+-NTA 및 StrepTactin 수지 위로 통과시킴으로써 상층액으로부터 정제하였다. 그런 다음 정제된 단백질을 크기 배제 칼럼 위로 통과시켜서 올리고머 상태를 평가하고(도 1b) 트라이머 엑토도메인에 상응하는 단분산 분획을 단리하였다. 그런 다음 단백질 발현 수준을 SDS-PAGE에 의해 평가하였다.
SARS-CoV-2 S 단백질의 융합전 안정화를, 상응하는 야생형 단백질과 비교하여 이들 돌연변이가 조합될 때 증가된 발현 수준에 의해 예비적으로 표시한다.
이중 프롤린 돌연변이체 SARS-CoV-2 S 변이체의 형태를 음성 염색 전자 현미경검사에 의해 평가하였다(도 1c 및 1d). 이중 프롤린 돌연변이가 있는 S 변이체는 균일하였고 예상된 융합전 모양으로 트라이머를 형성하였다. 이들 엑토도메인 트라이머의 각각을 단일 피크로서 정제하였고 전형적인 융합전 형태로 트라이머를 형성하였다. 대조적으로, 천연 서열을 가진 상응하는 S 단백질은 혼합된 형태의 트라이머를 형성하였고, 일부 트라이머는 전형적인 융합전 형태였으며 다른 것은 전형적인 신장된 융합 후 형태였다.
실시예 2
융합전 안정화된 SARS-CoV-2 S 단백질은 동물 모델에서 중화 면역 반응을 유도한다
이 실시예는 융합전 안정화된 SARS-CoV-2 S 단백질을 면역원으로서 사용하여 동물 모델에서 SARS-CoV-2 감염에 대한 중화 면역 반응의 유도를 기술한다.
가용성 융합전 안정화된 SARS-CoV-2 S 단백질을 실시예 1에서 기술한 것과 같이 제조하였다. 대조군으로서, K986P 및 V987P 치환이 없는 SARS-CoV-2 S를 C-말단 T4 피브리틴 삼량체화 도메인이 있는 가용성 단백질(TM 및 CT가 없음)로서 발현시켰다. 조작된 치환이 없는 SARS-CoV2 S 서열을 SARS-CoV-2 S WT로서 언급한다.
3개의 상이한 마우스 스트레인, BALB/cJ, C57BL/6J, 및 B6C3F1/J 마우스를 0 및 3주에 PBS, Sigma 보조제 시스템(SAS)으로 보조된 0.01 μg, 0.1 μg, 또는 1 μg의 가용성 SARS-CoV-2 S WT 또는 가용성 SARS-CoV-2 S-2P로 면역화하고, 혈청을 프라임 후 2주 및 부스트 후 2주 후에 수집하였다. SARS-CoV-2 S-2P 면역화된 마우스로부터의 혈청을 SARS-CoV-2 S 특이적 IgG에 대해 ELISA에 의해 평가하였다(도 2a-2C). S WT 및 S-2P 면역화된 BALB/cJ 마우스 둘 다로부터의 부스트 후 혈청을 동형 SARS-CoV-2 슈도바이러스에 대한 중화 항체에 대해 평가하였다(도 2d). 결과는 가용성 SARS-CoV-2 S-2P가 프라임 및 부스트 조건 후에 용량 의존성 S 특이적 결합 항체를 유도하는 것과, 1 μg의 가용성 SARS-CoV-2 S-2P 면역원이 동물 모델에서 활발한 중화 항체 반응을 유도했음을 보여준다.
용성 SARS-CoV-2 S WT 및 가용성 SARS-CoV-2 S-2P 면역화가 바이러스 복제에 대해 마우스를 보호하는 능력을 평가하였다. BALB/cJ 마우스를 0 및 3주에 PBS, SAS로 보조된 0.01 μg, 0.1 μg, 또는 1 μg의 가용성 SARS-CoV-2 S WT 또는 가용성 SARS-CoV-2 S-2P로 면역화하였다. 부스트 후 4주 후, 마우스를 마우스 적응된 SARS-CoV-2로 도전시켰다(본원에 참조로 포함된 Dinnon, et al. "a mouse adapted SARS-CoV-2 model for the evaluation of COVID-19 medical countermeasures", BioRxiv., 2020.05.06.081497에 기술됨). 도전 후 2일 후, 피크 바이러스 부하에서, 폐(도 3a) 및 비갑개(도 3b)를 플라크 검정에 의한 바이러스 부하의 평가를 위해 수득하였다. 그룹을 다중 비교 테스트와 함께 일원 분산 분석에 의해 비교하였다. 결과는 0.1 μg 및 1 μg 조건이 상하부 기도에서 바이러스 복제를 제거하였음을 보여준다; 0.01 μg S WT는 보호하지 못하였는데, 이것은 S WT에 대한 배경 용량인 것을 시사한다. 0.01 μg S-2P 면역화된 마우스는 실험과 무관한 사망으로 인해 도전받지 않았다(N/T).
실시예 3
융합전 안정화된 SARS-CoV-2 S 단백질을 면역원으로서 함유한 단백질 나노입자
이 실시예는 단백질 나노입자 스캐폴드에 콘쥬게이션된 융합전 안정화된 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머 및 그것의 면역원으로서의 용도를 예시한다.
LuS- 및 페리틴-나노입자 스캐폴드의 글리칸 변형. 항원의 나노입자 제공을 위한 믿을 수 있는 플랫폼을 구성하기 위하여, 나노입자 표면 상에 항원을 나타내기 위한 Spy태그:Spy캐처 시스템(Brune, K. D. et al. Plug-and-Display: decoration of Virus-Like Particles via isopeptide bonds for modular immunization. Sci Rep 6, 19234, 2016)으로서 언급된 아이소펩타이드 결합 콘쥬게이션 시스템과 함께, 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus) 루마진 생성효소(LuS) 및 헬리코박터 파일로리 페리틴을 나노입자 스캐폴드로서 선택하였다. Spy태그:Spy캐처 시스템은 아이소펩타이드 결합으로 매우 특이적이고 안정적이며 나노입자 표면 상에 항원의 콘쥬게이션을 위해 사용되었다(도 4a)(Zakeri, B. et al. "Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin". Proc Natl Acad Sci U S A 109, E690-697,(2012); Brune, K. D. et al. Plug-and-Display: decoration of Virus-Like Particles via isopeptide bonds for modular immunization. Sci Rep 6, 19234,(2016) 참고). LuS 및 페리틴은 임상 연구에서 나노입자 면역원을 위한 스캐폴드로서 작용하였다. 페리틴 및 LuS 둘 다의 N-말단은 나노입자 표면에 노출되고 따라서 Spy태그 또는 Spy캐처 부착을 위해 접근 가능하다(도 4b). LuS의 C-말단은 또한 나노입자 표면에 접근 가능하고 정제 태그를 나타내기 위해 사용될 수 있다. LuS 또는 페리틴이 있는 Spy태그 또는 Spy캐처의 융합 단백질을 발현하는 포유류 발현 구성물을 설계하였다. 구성물은 발현된 단백질의 배지로의 분비를 위한 신호 펩타이드와 함께, 정제 목적으로 His- 및 Strep-태그를 모두 포함하였다(도 4b).
초기 구성물은 나노입자-Spy태그 또는 Spy캐처 융합 단백질에 대해 저수준의 가용성 단백질을 생산하였다. 단백질 용해도 및 발현을 개선하기 위하여, 글리칸을 나노입자의 표면에 첨가하였다. Spy태그 및 Spy캐처가 있는 LuS 및 페리틴 구성물 및 첨가된 N-연결 글리코실화 부위의 패널을 설계하였다(표 1 및 2). LuS 구성물의 경우, 위치 71(PDB 1HQK 넘버링)에서 글리코실화 부위를 첨가하였다. 페리틴 구성물의 경우, 2개의 잠재적인 글리코실화 부위(96 및 148)를 테스트하였다. N-연결 글리코실화 부위의 첨가는 포유류 세포 배양 상층액에서 용성 나노입자의 발현을 용이하게 하였다. 구성물 중 3개가 월등한 수율의 잘 조립된 나노입자, N71 및 N-말단에 Spy태그가 있는 LuS(이하 LuS-N71-Spy태그로 언급됨), N96 및 Spy태그가 있는 페리틴, 및 S148(N146에 글리칸) 및 Spy태그가 있는 페리틴을 생성하였다(표 1). 2개의 페리틴 구성물 중에서, N96 및 Spy태그가 있는 페리틴이 더 높은 수율을 가졌고 추가 연구를 위해 선택되었다(페리틴-N96-Spy태그로 언급됨). 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 전자 현미경검사(EM) 분석은 LuS-N71-Spy태그가 용액에서 균일한 나노입자 집단을 형성하였음을 나타냈다(도 4c 및 4e). 페리틴-N96-Spy태그 샘플은 주로 온전한 나노입자를 포함하였고 일부 미량이 미조립된 종을 가졌다(도 4c 및 4D). 음성 염색 전자 현미경검사(EM) 이미지는 두 나노입자가 모두 예상된 크기로 잘 조립된 것을 나타냈다(도 4e). 이차원 부류 평균은 나노입자의 보다 상세한 구조적 특징을 나타냈고, 이것은 두 나노입자의 이전에 공개된 구조와 일치하였다. 이들 데이터는 페리틴과 LuS 나노입자가 Spy태그 및 글리코실화 부위 첨가와 부합하였음을 나타냈다. 이들 변경은 잘 견디어졌고, 강력한 나노입자 어셈블리를 허용하였다. LuS- 및 페리틴-Spy태그 나노입자의 글리코실화를 검증하기 위하여, PNGase F 분해를 수행하였고 글리칸 절단을 SDS-PAGE를 사용하여 평가하였다(도 4d). 두 나노입자 모두 PNGase F의 존재 하에 밴드 이동을 보였고, 이것은 나노입자 상의 N-연결 글리칸의 존재 및 아미다제 분해에 의한 그것의 제거를 나타냈다. LuS-N71-Spy태그에서 글리칸 절단은 뚜렷하지만, 페리틴-N96-Spy태그에서는, 페리틴-N96-Spy태그의 불완전한 글리코실화 및 SDS-PAGE 상에서의 페리틴의 다중 밴드로 인한 가능성으로 덜 분명하다. 페리틴은 일부 연구에서는 SDS-PAGE 상에서 단일 밴드를 나타내지만, 다른 연구에서는 C 말단에서의 프로테아제 절단 또는 불완전한 글리코실화로 인한 가능성으로 다중 밴드를 나타내는 것으로 관찰되었다. 그러나, 이들 상이한 크기의 페리틴 분자는 SEC 및 EM에 의해 표시된 것과 같이 예상된 치수의 나노입자로서 정확하게 조립되었다(도 4c, 4e).
Figure pct00012
Figure pct00013
*이 아미노산 서열은 단일 사슬 Fc 정제 태그를 포함함(참고문헌 38 참고).
SARS-CoV-2 스파이크 트라이머의 LuS 나노입자에의 Spy태그:Spy캐처를 통한 콘쥬게이션은 나노입자 표면 상에서 균일하게 스파이크 트라이머를 나타낸다. C-말단 Spy캐처(서열번호 14)와 융합된 SARS-CoV-2 스파이크를 발현시키고, 정제하여 정제된 LuS-N71-Spy태그 나노입자에 콘쥬게이션하였다(도 5a-5c). 이 구성물을 위해, 융합전 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 S1/S2 절단 부위를 제거하기 위한 GSAS 치환을 포함하는 프로토머, 융합전 안정화를 위한 K986P 및 V987P 치환 및 C-말단 T4 파지 피브리틴 삼량체화 도메인을 함유하였다. 정제 목적으로, 단백질은 단일 사슬 Fc 태그를 포함하였다(단일 사슬 Fc 태그의 설명에 대해서는, Zhou, T. et al. Structure-Based Design with Tag-Based Purification and In-Process Biotinylation Enable Streamlined Development of SARS-CoV-2 Spike Molecular Probes. bioRxiv, 2020.2006.2022.166033 참고). 콘쥬게이션 혼합물을 SEC 칼럼 상에 로딩하여 콘쥬게이션된 나노입자 생성물인 LuS-N71-Spy연결-CoV 스파이크를 콘쥬게이션되지 않은 LuS-N71-Spy태그 및 SARS-CoV-2 스파이크-Spy캐처로부터 정제하였다(도 5b). SDS-PAGE 분석은 콘쥬게이션 생성물이 예상된 분자량을 가지며, 콘쥬게이션되지 않은 스파이크-Spy캐처가 콘쥬게이션 후에 관찰되지 않은 것을 나타냈다(도 5c).
콘쥬게이션 효율을 추정하기 위하여, 콘쥬게이션된 나노입자 생성물의 SDS-PAGE 겔 이미지 상의 각각의 밴드의 강도(도 5c)를 각각의 구성요소에 대한 질량의 대리물로서 측정하였다. 각각의 구성요소의 분자량을 고려하여, 샘플 중의 총 단백질에 대한 각 구성요소의 몰비를 계산하였다. 이것을 토대로, 모든 LuS 나노입자 서브유닛의 91%가 스파이크 트라이머에 콘쥬게이션된 것으로 추정한다. 음성 염색 EM은 LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크 나노입자가 LuS 나노입자 표면 상에 표시되는 스파이크 트라이머와 함께 예상된 크기를 나타냈음을 보였다(도 5d). SPR 측정은 LuS-N71-Spy연결-SARS-CoV-2 스파이크가 수용체 결합 도메인(RBD)을 표적화하는 항체인 CR3022에 결합하는 것을 보였고(ter Meulen, J. et al. Human monoclonal antibody combination against SARS coronavirus: synergy and coverage of escape mutants. PLoS Med 3, e237, 2006; Yuan, M. et al. A highly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Science, 2020), 이것은 LuS-Spy태그:Spy캐처 시스템을 사용하는 스파이크 트라이머의 성공적인 나노입자 제공을 나타낸다(도 5e).
Spy연결-나노입자는 SARS-CoV-2 스파이크의 중화 항체를 유도하는 잠재력을 증가시킨다. 면역원성을 평가하기 위하여, 마우스를 LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크 나노입자 또는 가용성 스파이크 트라이머(실시예 1에서처럼 2P 돌연변이에 의해 안정화됨), 또는 mock(LuS-N71-Spy태그) 나노입자로 0 및 3주째에 주입하였다(도 6a). 혈청 샘플을 각각의 면역화 후 2주 후에 수집하였다. 제1 면역화 후에, 0.08 μg의 최저 면역원 용량에서, 스파이크 나노입자-면역 혈청은 5,116의 항-SARS-CoV-2 스파이크 ELISA 기하학적 평균 역가를 나타낸 반면, 10개의 트라이머 스파이크 면역화된 혈청 중 1개만이 측정 가능한 역가를 나타냈고(도 6b); 제2 면역화 후에, 스파이크 나노입자-면역 혈청에 대한 역가는 대략 25배 만큼, 실질적으로 증가하였다. 더 높은 용량의 스파이크 나노입자(0.4 및 2.0 μg)로의 면역화는 2주 및 5주째에 모두 역가를 더 점진적으로 증가시켰다. 대조적으로, 스파이크 트라이머의 용량의 증가는 ELISA 역가를 더 실질적으로 상승시켰고, 2.0 μg 스파이크-트라이머 면역 혈청에서 2마리의 마우스가 1,638,400의 역가로 검정 상한 한계에 도달하였다(도 6b).
추가로, 슈도바이러스 중화 검정은 LuS-N71-Spy연결-CoV-2 스파이크 나노입자가 각각 0.08, 0.4, 및 2 μg의 면역화 용량에 대해 412, 1820, 및 1501의 기하학적 평균 ID50 역가로 강력한 중화 반응을 이끌어내는 것을 나타냈다(도 6c). 이에 비해, 가용성 트라이머 스파이크의 2회 용량은 0.4 및 2 μg 조건에서 각각 49 및 315의 기하학적 평균 ID50으로 중화 역가를 이끌어냈고, 0.08 μg 용량에서는 측정 가능한 중화가 없었다. 본질적으로, 0.08 μg의 스파이크 나노입자는 2 μg의 트라이머 스파이크와 통계적으로 구별할 수 없지만, 더 높은 중화 반응을 이끌어냈다. 이것은 스파이크 단독에 비해 중량 대 중량 기준으로 스파이크 나노입자에 대해 약 25배 더 높은 면역원성을 나타냈으며, 이것은 실질적인 "용량 절약" 효과를 시사한다. 전체적으로, LuS 나노입자 표면 상에 SARS-CoV-2 스파이크의 제공은 그것의 면역원성을 상당히 개선시켰고 트라이머 형태와 비교하여 강력한 중화 반ㅇ을 이끌어내기 위해 더 적은 면역원 용량을 필요로 하였다.
기술된 방법 또는 조성물의 정확한 세부사항은 기술된 구현예의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 달라지거나 변형될 수 있음이 명백할 것이다. 본 발명자들은 아래의 청구범위의 범위 및 사상에 속하는 모든 그러한 변형 및 변이를 주장한다.
SEQUENCE LISTING <110> The United States of America as Represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Board of Regents, the University of Texas System Trustees of Dartmouth College <120> SARS-CoV-2 Vaccine <130> 4239-104089-02 <150> US62/972886 <151> 2020-02-11 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1273 <212> PRT <213> coronavirus <400> 1 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile 115 120 125 Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe 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Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala 340 345 350 Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro 370 375 380 Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe 385 390 395 400 Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly 405 410 415 Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys 420 425 430 Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn 435 440 445 Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe 450 455 460 Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys 465 470 475 480 Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly 485 490 495 Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val 500 505 510 Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys 515 520 525 Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn 530 535 540 Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu 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Asn His 210 215 220 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 260 265 270 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 275 280 285 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 290 295 300 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 305 310 315 320 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 325 330 335 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 340 345 350 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 355 360 365 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 370 375 380 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 385 390 395 400 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 405 410 415 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 420 425 430 Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 435 440 445 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 450 455 460 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 465 470 475 480 Ser Gly Gly Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gln Cys Val Asn Leu 485 490 495 Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg 500 505 510 Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser 515 520 525 Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His 530 535 540 Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro 545 550 555 560 Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser 565 570 575 Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr 580 585 590 Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val 595 600 605 Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His 610 615 620 Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser 625 630 635 640 Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp 645 650 655 Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe 660 665 670 Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile 675 680 685 Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu 690 695 700 Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu 705 710 715 720 Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp 725 730 735 Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr 740 745 750 Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp 755 760 765 Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe 770 775 780 Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro 785 790 795 800 Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe 805 810 815 Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn 820 825 830 Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn 835 840 845 Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys 850 855 860 Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile 865 870 875 880 Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile 885 890 895 Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile 900 905 910 Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn 915 920 925 Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg 930 935 940 Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly 945 950 955 960 Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln 965 970 975 Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser 980 985 990 Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser 995 1000 1005 Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly 1010 1015 1020 Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu 1025 1030 1035 Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala 1040 1045 1050 Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys 1055 1060 1065 Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser 1070 1075 1080 Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val 1085 1090 1095 Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val 1100 1105 1110 Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu 1115 1120 1125 Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro 1130 1135 1140 Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser 1145 1150 1155 Pro Gly Ser Ala Ser Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr 1160 1165 1170 Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn 1175 1180 1185 Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu 1190 1195 1200 Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met 1205 1210 1215 Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln 1220 1225 1230 Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile 1235 1240 1245 Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val 1250 1255 1260 Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe 1265 1270 1275 Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg 1280 1285 1290 Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp 1295 1300 1305 Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala 1310 1315 1320 Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val 1325 1330 1335 Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser 1340 1345 1350 Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala 1355 1360 1365 Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg 1370 1375 1380 Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln 1385 1390 1395 Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln 1400 1405 1410 Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp 1415 1420 1425 Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln 1430 1435 1440 Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile 1445 1450 1455 Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg 1460 1465 1470 Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln 1475 1480 1485 Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala 1490 1495 1500 Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val 1505 1510 1515 Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser 1520 1525 1530 Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala 1535 1540 1545 Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly 1550 1555 1560 Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr 1565 1570 1575 His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile 1580 1585 1590 Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile 1595 1600 1605 Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu 1610 1615 1620 Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr 1625 1630 1635 Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser 1640 1645 1650 Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala 1655 1660 1665 Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys 1670 1675 1680 Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly 1685 1690 1695 Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr 1700 1705 1710 Phe Leu Gly Arg Ser Gly Gly Gly Leu Val Pro Gln Gln Ser Gly 1715 1720 1725 Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly 1730 1735 1740 Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly 1745 1750 1755 Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe 1760 1765 1770 Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro 1775 1780 1785 Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu 1790 1795 1800 Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala 1805 1810 1815 His Ile 1820

Claims (30)

  1. 면역원으로서,
    서열번호 2의 잔기 16-1208과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 2의 위치 986 및 987에, S 엑토도메인(ectodomain) 트라이머를 융합전 형태로 안정화시키는 프롤린 치환을 포함하는 프로토머(protomer)를 포함하는 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머
    를 포함하는 면역원.
  2. 제1항에 있어서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 서열번호 2의 잔기 16-1208과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 2개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역원.
  3. 제2항에 있어서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 서열번호 2의 잔기 16-1208과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 2개의 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역원.
  4. 제1항에 있어서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 서열번호 2의 잔기 16-1208로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 면역원.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 또는 2개의 아미노산 치환은, 서열번호 1로서 제시된 천연 SARS-CoV-2 S 서열에 비해 K986P 및 V987P 치환인 면역원.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 융합전 형태로 안정화시키는 하나 이상의 추가적인 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것인 면역원.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 프로토머는 N501Y, K417N 및 E484K 치환 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것인 면역원.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 엑토도메인 내의 프로토머의 C-말단 잔기는 펩타이드 링커에 의해 삼량체화 도메인에 연결되거나, 또는 삼량체화 도메인에 직접 연결되는 것인 면역원.
  9. 제8항에 있어서, 삼량체화 도메인은 T4 피브리틴 삼량체화 도메인인 면역원.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, T4 피브리틴 삼량체화 도메인에 연결된 프로토머는, 서열번호 2의 잔기 16-1235와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, S 엑토도메인 트라이머를 융합전 형태로 안정화시키는 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역원.
  11. 제9항에 있어서, T4 피브리틴 삼량체화 도메인에 연결된 프로토머는 서열번호 2의 잔기 16-1235를 포함하는 것인 면역원.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, S 엑토도메인의 S1/S2 프로테아제 절단 부위는 프로테아제 절단을 억제하도록 돌연변이되는 것인 면역원.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머는 가용성인 면역원.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 엑토도메인 내의 프로토머의 C-말단 잔기는 펩타이드 링커에 의해 경막 도메인에 연결되거나, 또는 경막 도메인에 직접 연결되는 것인 면역원.
  15. 제14항에 있어서, 경막 도메인에 연결된 프로토머는 서열번호 3의 잔기 16-1273과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, S 엑토도메인 트라이머를 융합전 형태로 안정화시키는 아미노산 치환을 포함하는 것인 면역원.
  16. 제14항에 있어서, 경막 도메인에 연결된 프로토머는 서열번호 3의 잔기 16-1273으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 면역원.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 프로토머의 C-말단 잔기는 펩타이드 링커에 의해 단백질 나노입자 서브유닛에 연결되거나, 또는 단백질 나노입자 서브유닛에 직접 연결되는 것인 면역원.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 면역원을 포함하는 단백질 나노입자.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 면역원을 포함하는 바이러스 유사 입자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 재조합 SARS-CoV-S 엑토도메인 트라이머의 프로토머를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  21. 제20항에 있어서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자.
  22. 제20항 또는 제21항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 면역원, 단백질 나노입자, 바이러스 유사 입자, 핵산 분자 또는 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  25. 융합전 형태로 안정화된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머의 제조 방법으로서,
    제20항 내지 제23항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 벡터를 숙주 세포에서 발현시켜, 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 생성하는 단계; 및
    재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머를 정제하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  26. 제25항의 제조 방법에 의해 제조된 재조합 SARS-CoV-2 S 엑토도메인 트라이머.
  27. 대상체에서 SARS-CoV-2 S 엑토도메인에 대한 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원, 단백질 나노입자, 바이러스 유사 입자, 핵산 분자, 벡터, 또는 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하여 면역 반응을 생성하는 것을 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 면역 반응은 SARS-CoV-2에 의한 감염을 억제하는 것인 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 면역 반응을 생성하는 것은 대상체에서 SARS-CoV-2의 복제를 억제하는 것인 방법.
  30. 유효량의 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 면역원, 단백질 나노입자, 바이러스 유사 입자, 핵산 분자, 벡터, 또는 면역원성 조성물의, 대상체에서 SARS-CoV-2 S 엑토도메인에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 용도.
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