CN114516907B - 一种植物抗逆性相关基因atagl70及其编码蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明鉴定了一种涉及植物抗逆性相关基因ATAGL70、编码蛋白及其应用。本发明提供了一种由SEQ ID NO：1所示的DNA核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；本发明提供植物抗逆相关基因ATAGL70在提高植物抗逆性、培育抗逆性转基因植物及选育抗逆性提高的植物品种中的应用。经实验证明，本发明提供的基因ATAGL70负调控抗逆性，其缺失造成植物在主根延伸方面更耐渗透胁迫；同时拥有较少的气孔密度和较小的气孔孔径，使其缺失突变体具有显著的抗旱功能。该发现有有利于全面认识和揭示干旱胁迫对农作物的影响机制，利于农作物抗逆新品种的培育。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及一种提高植物抗逆性相关基因ATAGL70及其编码蛋白在农业中的应用。具体地，所述“抗逆性”是耐渗透胁迫及抗旱性。
背景技术
目前世界上有三分之一的土地处于干旱和半干旱地区，其他地区在植物生长季节也常发生干旱，干旱在所有非生物胁迫中位居首位，成为世界上严重制约农业生产的自然灾害之一。有研究表明，每年因干旱导致的作物减产达50％以上。
植物的抗旱性是由多基因控制的复杂性状，存在从分子、细胞、组织到整体植株不同层次的抗旱机制。因此，对植物抗旱机制的研究显得尤为重要，深入研究干旱对作物的影响机理，有利于全面认识和揭示干旱胁迫对农作物的影响规律，为进一步加强作物耐旱、抗旱机制及其应用的发掘和创新提供基础。通过应用基因技术综合改良植物的抗旱性，对培育抗旱性较强的农作物品种具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于鉴定了一个拟南芥抗逆性相关基因ATAGL70及其编码蛋白，该基因缺失造成植物在主根延伸方面更耐渗透胁迫；同时拥有较少的气孔密度和较小的气孔孔径，使其缺失突变体具有显著的抗旱功能。该发明为提高植物抗逆性、培育抗逆性转基因植物及选育抗逆性提高的植物品种提供了新方法。
一方面，本发明鉴定了一种抗逆性相关基因，其核苷酸序列如下：
1)SEQ ID NO:1所示的DNA序列；
2)与SEQ ID NO:1所示的DNA序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上碱基，且与SEQ ID NO:1所示的DNA序列具有相同功能的DNA序列；或
3)在高严谨条件下能够与SEQ ID NO:1所示的DNA序列杂交的核苷酸序列。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述与SEQ ID NO:1所示的DNA序列具有相同功能的DNA序列与SEQ ID NO:1所示的DNA序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述高严谨条件为：在6×柠檬酸钠缓冲溶液(SSC)，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％ SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。
另一方面，本发明涉及一种抗逆性相关蛋白，其氨基酸序列如下：
1)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
2)与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比存在经过一个或几个氨基酸残基的取代和缺失和/或添加，且具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列相同的活性的衍生蛋白。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述衍生蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。
另一方面，本发明提供一种所述抗逆性相关基因或所述抗逆性相关蛋白在培育或选育抗逆性转基因植物中的应用，所述抗逆性为耐渗透胁迫或抗旱性。
本领域技术人员应该理解，缺失ATAGL70基因能增强植物的耐渗透胁迫和抗旱性。因此，可以通过基因敲除(knock-out)技术获得缺失ATAGL70基因的植株。
另一方面，本发明提供一种所述抗逆性相关基因或所述抗逆性相关蛋白在调节植物叶片的气孔密度和气孔孔径中的应用。其中，通过促进所述抗逆性相关基因的表达或提高所述抗逆性相关蛋白的浓度可以增大气孔密度和气孔孔径，而抑制所述抗逆性相关基因的表达或降低所述抗逆性相关蛋白的浓度可以减小气孔密度和气孔孔径。
另一方面，本发明提供一种提高植物抗逆性的方法，所述方法包括在植物中抑制所述抗逆性相关基因的表达或促进所述抗逆性相关蛋白的降解。
在本发明的一些实施方案中，所述植物为拟南芥、油菜、烟草、大豆、棉花、水稻等。
本发明中的“抗逆性相关基因不表达”是指在转基因植物中该基因的表达量与对照(野生型)植物中该基因的表达量相比小于5％，则认为该基因不表达。
本发明中的“抗逆性相关蛋白不存在”是指转基因植物该基因的编码蛋白的表达量与对照(野生型)植物中该基因的编码蛋白的表达量相比小于5％，则认为该转基因植物中该蛋白不存在。
在本发明中，所述的拟南芥抗逆性相关基因为ATAGL70(SEQ ID NO:1)，“ATAGL70”或“AGL70”均是指拟南芥中的抗逆性相关基因ATAGL70。
在本发明中，所用植物的背景均为哥伦比亚生态型的拟南芥(Arabidopsisthaliana)。
在本发明中，“Col-0”或对照植株均指未经转基因的野生型拟南芥哥伦比亚株系。
在本发明中，拟南芥抗逆性突变体为Salk_147237，在本发明中被命名为agl70缺失突变体。
在本发明中，发明人鉴定了一种涉及拟南芥抗逆性相关基因ATAGL70，该基因具有负调控植物抗逆功能。本发明中所述的植物抗逆功能主要是指在渗透胁迫条件下，该功能缺失突变体在根系延伸方面相比于对照具有显著优势；在土壤干旱处理条件下，该功能缺失突变体具有显著的抗旱功能。发明人从拟南芥种子库ABRC获得了一个T-DNA插入位于AT5G65060基因3’端UTR区的突变体Salk_147237，并将其命名为agl70。为了研究其功能，以拟南芥野生型Col-0作为对照，开展了根系延伸、土壤干旱处理、叶片气孔密度及气孔孔径统计等实验。统计结果发现，在250mM甘露醇处理条件下，agl70缺失突变体的主根显著长于对照野生型(Col-0)；进一步的土壤干旱实验结果证明agl70突变体的存活率显著高于野生型Col-0；由于植物的抗旱性与气孔密度和气孔孔径密切相关，发明人发现agl70突变体的气孔密度明显减少，并且在ABA处理条件下气孔孔径小于对照。较少的气孔密度和较小的气孔孔径均能减少叶片水分的散失，提高植株的抗旱能力。该发现有利于全面认识和揭示干旱胁迫对农作物的影响机制，并提供新的抗逆候选基因，有利于农作物抗逆新品种的培育。
附图说明
下面将结合附图来对本发明做具体说明。
图1.(A)功能缺失突变体agl70的T-DNA插入位点示意图；
(B)功能缺失突变体agl70的纯合体鉴定；
图2.(A)拟南芥野生型Col-0和功能缺失突变体agl70株系在正常条件和渗透胁迫处理条件下的根系延伸情况；
(B)不同处理条件下野生型Col-0和功能缺失突变体agl70株系的主根长度统计。
图3.(A)拟南芥野生型Col-0和功能缺失突变体agl70株系的土壤干旱实验；
(B)土壤干旱实验处理条件下不同株系的存活率统计；
图4.拟南芥野生型Col-0和功能缺失突变体agl70株系的叶片气孔密度统计；
图5.(A)拟南芥野生型Col-0和功能缺失突变体agl70株系的叶片气孔孔径；
(B)不同株系叶片气孔孔径的统计；
具体实施方式
发明人将结合以下具体实施例对本发明做进一步详细说明。但这些实施例仅用于举例说明的目的，并不意味着本发明的范围限于此。
下述实施例中的实验方法，如果没有特殊说明，均为常规实验方法。实施例中所用到的实验仪器和试剂等，如无特殊说明，均可在生物仪器和试剂公司购买到。
实施例1拟南芥缺失突变体agl70的材料鉴定
为了研究其功能，发明人从拟南芥种子库ABRC(Arabidopsis BiologicalResource Center，The Ohio State University Rightmire Hall 1060 Carmack Road，Columbus，OH 43210 USA)获得了一个T-DNA插入位于AT5G65060基因3’端UTR区的突变体Salk_147237(图1中的A)，并将其命名为agl70突变体。取适量的拟南芥野生型(Col-0)和agl70突变体种子，用10％ Bleach清洗15分钟，再用无菌水清洗4-5遍后，将其铺于MS培养皿，置于4℃春化2天。当完成春化后，将培养皿放置于22℃、16h光照及8h黑暗条件下竖直培养5-7天，并将其幼苗转移至土壤中生长。为了在基因组水平鉴定突变体是否为纯合株系，我们取土壤中生长4周的成苗叶片进行植物基因组的抽提，获得模板后，以野生型作为阳性对照，选择SIGnALiSect Primer Design网站上提供的LP、RP双引物及中间引物LBb1.3，通过PCR扩增技术，完成基因组水平鉴定。从图1中B的检测结果来看，只有野生型Col-0株系能扩增出1100bp的阳性片段，而agl70突变体株系只能扩增出845bp的条带，因此认为agl70突变体为纯合株系。
10％ Bleach配方(100L)如下：
| 84消毒液(蓝月亮) | 10mL |
| ddH2O | 90mL |
植物DNA提取缓冲液的配方如下：
| 0.5M EDTA pH＝8.0(50mM) | 50mL |
| 1M Tris pH 8.0(100mM) | 50mL |
| NaCl(500mM) | 14.61g |
| SDS | 1.5％ |
加水定容至500mL，其中β-巯基乙醇现用现加，10μL即可。
基因组DNA的具体提取步骤如下：
(1)取约0.1g的新鲜拟南芥组织放入研钵中，快速将其磨碎，并向其中加入420uLDNA抽提缓冲液和5uL 10mg/mL RNA酶继续充分研磨。将液体转移至EP管并置于65℃温浴15分钟，每隔3分钟取出颠倒混匀使其充分反应。
(2)充分反应结束后，向各管中分别加入等210uL不饱和酚和三氯甲烷，颠倒混匀。
(3)10000rpm高速离心10分钟，取300uL上清转移至新的EP管，再分别向其中加入0.7倍体积的异丙醇和0.1倍体积3M醋酸钠，颠倒混匀，室温静置10分钟，促进DNA沉淀。
(4)10000rpm高速离心10分钟，弃上清，并向管中加入1mL 70％酒精清洗DNA沉淀。
(5)重复步骤(4)一遍。
(6)10000rpm高速离心10分钟，弃上清，室温下晾干沉淀。最后向管里加入20uLddH2O溶解沉淀，并将其保存于-20℃，作为PCR模板。
PCR扩增使用的引物如下：
上游引物LP：5’-TGTGACCCTGAAAGATAACCG-3’(SEQ ID NO:3)
下游引物RP：5’-GGAGTTTGATGGAAGCTAGGC-3’(SEQ ID NO:4)中间引物LBb1.3：5’-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3’(SEQ ID NO:5)
PCR扩增体系如下：(其中2x Taq Master mix酶购自南京诺唯赞生物技术有限公司)
| 2x Taq Master mix酶 | 10uL |
| 10uM LP | 0.5uL |
| 10uM RP | 0.5uL |
| 10uM LBb1.3 | 0.5uL |
| DNA模板 | 1uL |
| ddH2O | 7.5uL |
PCR具体程序设置如下：
PCR完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测样品的扩增情况。
实施例2拟南芥野生型Col-0和突变体agl70株系的主根延伸实验
为了研究AGL70的功能，首先我们开展了根系延伸实验。取适量拟南芥野生型Col-0和突变体agl70种子分别置于2mL EP管，将其进行无菌清洗后，分别铺于多个MS培养皿，并置于4℃黑暗条件下春化2天。将春化后的种子置于22℃、16h光照及8h黑暗条件下竖直培养5天后，分别选取长势一致且主根长度接近的野生型Col-0和突变体agl70幼苗转移至多个含有不同浓度0、250mM甘露醇MS培养皿上，并将其置于22℃、16h光照及8h黑暗条件下竖直培养5天后，观察并统计野生型Col-0和突变体agl70材料的平均主根长度。由图2中A和B的结果发现，在正常生长的MS培养皿上，野生型和突变体的主根长度没有明显差异；当在250mM甘露醇处理条件下，agl70突变体的主根长度显著优于对照野生型Col-0。该结果说明拟南芥AGL70在甘露醇处理(即渗透胁迫)条件下具有负调控的功能。当AGL70缺失，植株对渗透胁迫的抗性增强，使其突变体株系的主根受抑制程度减弱。
MS培养基配方如下：
| 10x大量元素 | 100mL |
| 100x微量元素 | 10mL |
| 100x铁盐 | 10mL |
| 蔗糖 | 10g |
| ddH2O | 补足至1L |
10x大量元素配方如下：
| NH4NO3 | 16.5g |
| KNO3 | 19g |
| CaCl2·2H2O | 4.4g |
| MgSO4·7H2O | 3.7g |
| KH2PO4 | 1.7g |
| ddH2O | 补足至1L |
100x微量元素配方如下：
| KI | 0.083g |
| H3BO3 | 0.62g |
| ZnSO4·7H2O | 0.86g |
| MnSO4·4H2O | 2.23g |
| Na2MoO4·2H2O | 0.025g |
| CuSO4·5H2O | 0.0025g |
| CoCl2·6H2O | 0.0025g |
| ddH2O | 补足至1L |
100x铁盐配方如下：
| FeSO4·7H2O | 2.78g |
| Na2-EDTA·2H2O | 3.73g |
| ddH2O | 补足至1L |
注：先在烧杯中加入300mL水和2.78g FeSO4·7H2O，待溶解。在另一个烧杯中加入300mL温水和3.73g Na2EDTA·2H2O，直到两个烧杯中固体完全溶解后，再将二者溶液混匀，置于65℃水浴4h，最后加水定容体积为1L，避光保存于4℃。
实施例3拟南芥野生型Col-0和突变体agl70株系的土壤干旱实验
为了进一步去验证AGL70在渗透胁迫中扮演的功能，我们开展了土壤干旱实验。首先将野生型Col-0和突变体agl70种子无菌清洗后，分别铺于MS培养皿，并置于4℃黑暗条件下春化2天。完成后将其放置于22℃、16h光照及8h黑暗条件下竖直培养7天后，选择将不同株系幼苗移栽至多个小盆，并保证每小盆移栽的幼苗数量、幼苗状态、含土量和土壤松弛度尽量一致，同时控制幼苗生长于22-24℃、16h光照及8h黑暗的最适条件。当野生型Col-0和突变体agl70株系生长到3周左右并且苗尚未抽苔时，充分浇灌，使每小盆充分吸水，拍照记录正常生长条件下苗的生长状态，两个株系的地上部分均无明显差异。待干旱处理16天后，观察到野生型Col-0和突变体agl70材料的地上部分叶片出现明显变化，野生型Col-0株系出现不同程度的萎焉或植株死亡(图3中的A)。此时停止干旱处理，并拍照记录。继续充分浇灌干旱实验组，使其材料复水，拍照记录并统计Col-0和突变体agl70株系的存活率。图3中B的统计结果说明，复水后的agl70突变体株系的存活率远高于野生型Col-0，且差异显著。该结果进一步验证了AGL70负调控植株抗旱。
实施例4拟南芥野生型Col-0和突变体agl70株系的气孔密度统计
野生型Col-0和突变体agl70株系的培养如同实施例3，当植株生长到3周大小，分别取野生型Col-0和突变体agl70材料的相同叶位的叶片若干，用镊子小心撕取下表皮，制片，置于显微镜下，分别选取多个视野观察并统计两个材料的叶片气孔数目。图4的统计结果证明了突变体agl70株系的气孔密度显著低于对照野生型(Col-0)。该结果更加验证了实施例3中AGL70负调控植株抗旱的结论，当AGL70基因缺失后，植株气孔密度减少，从而降低叶片水分的散失，提高植株的抗旱能力。
实施例5拟南芥野生型Col-0和突变体agl70株系的气孔孔径统计
野生型Col-0和突变体agl70材料的培养如同实施例3，当植株生长到3周大小，分别取野生型Col-0和突变体agl70材料的相同叶位的叶片若干，开展气孔对脱落酸(ABA，购自Sigma)的响应灵敏程度实验。首先野生型Col-0和突变体agl70材料的多个叶片分别浸泡于气孔开放缓冲液中，在一定光强条件下过夜处理12小时，使气孔充分打开，然后再将叶片转移至分别添加0、10uM ABA的气孔关闭缓冲液中，继续处理2小时后，用镊子小心撕取叶片下表皮，制片，置于显微镜下拍照并统计气孔孔径大小。图5中A和B的结果显示：当0uM ABA处理时，野生型Col-0和突变体agl70株系的气孔孔径无明显差异；当10uM ABA处理时，野生型Col-0的气孔孔径显著大于突变体agl70株系。该结果说明：当面临干旱胁迫，植株快速诱导合成大量ABA，由于agl70突变体的气孔对ABA处理响应更敏感，会快速关闭气孔，使其具有更小的气孔孔径，进一步减少叶片水分的散失，从而抗旱。
气孔开放缓冲液具体配方如下：
| 50mM KCl | 3.726g |
| 10mM K+-MES | 1.952g |
| 10μM CaCl2 | 0.0012g |
| ddH2O | 补足至1L |
所述气孔开放缓冲液pH＝6.15。
气孔关闭缓冲液具体配方如下：
| 10mM KCl | 0.746g |
| 5mM K+-MES | 0.976g |
| 50μM CaCl2 | 0.006g |
| ddH2O | 补足至1L |
所述气孔关闭缓冲液pH＝5.6。
在以上实施例中，研究了抗逆性相关基因ATAGL70在拟南芥中的作用，在例如油菜、烟草、大豆、棉花、水稻等植物中存在其同源基因，初步研究表明，这些同源基因在这些植物中发挥着类似的作用。
在本发明中，应当理解，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以对实施方案中的细节做出相应的改变或进行各种实施方案的任意组合。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (1)
1.一种提高拟南芥抗逆性的方法，所述方法包括在拟南芥中基因敲除抗逆性相关基因，所述抗逆性为耐渗透胁迫或抗旱性，所述抗逆性相关基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗逆性相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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