KR102103189B1 - 염분 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법 - Google Patents

염분 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 염분 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 170~230 mM의 염화나트륨을 포함하는 토양에서 8~10일 동안 생육시키는 염 스트레스를 처리하였을 때, 대조구 및 감수성 품종과 비교하여 염 저항성을 가지는 형질전환 식물체는 정상적으로 생육할 수 있으며, 이러한 특징을 통해 염 저항성을 가지는 형질전환 벼 식물체를 조기에 선별할 수 있으므로, 이와 관련된 산업 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

염분 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법{Method for early selecting transgenic plant with salt tolerance}
본 발명은 염분 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법에 관한 것이다.
식물은 건조나 염분과 같은 생육에 불리한 조건에 대응하기 위하여 분자, 세포, 조직, 생리적, 구조적 수준의 복잡한 기작이 발달되었다. 이는 막 시스템과 세포벽 구조의 조절, 그리고 세포 주기와 세포 분열, 대사의 조절로 인해 가능했다(Pastori and Foyer 2002). 또한 비생물학적 스트레스 조건에서 수많은 유전자의 발현이 유도되거나 감소하는데 이는 복잡한 전사 네트워크에 의해 조절된다. 그에 따라 현재 전사 네트워크의 기능을 수행하는 주요 유전자를 비생물학적 스트레스에 대한 저항성을 부여하기 위한 유전자원으로 이용하려는 연구가 진행되고 있다(Yamaguchi and Shinozaki 2006 Plant biology 57:781-803).
염분의 농도가 낮을 경우에는 생산율에 크게 영향을 받지 않지만(Maggio et al. 2001), 높은 경우에는 혐염식물 대부분이 생장하지 못하며, 염화나트륨 100~200 mM에서 생육이 아주 강하게 저해되거나 죽게된다(Munns and Termaat. 1986). 염분의 농도가 높아지면 영양소와 이온 활성이 저하되고 Na+/Ca2+ 나 Na+/K+의 비율이 급격히 높아지는데(Grattan and Grieved 1998 Scientia Horticulturae 78:127-157), 양이온과 염분, 특히 염화나트륨의 양이 증가하면서 토양에서 외부삼투압이 발생하고 그에 따라 물이 뿌리로 흡수되는 것을 막거나 흡수량을 감소시켜 건조 현상과 비슷한 수분 부족 현상이 나타난다.
Munns 등(1995 Functional Plant Biology 13(1):143-160)은 염분 스트레스로 인한 삼투압과 이온의 영향에 대해 2단계 모델로 설명하였다. 1단계에서 뿌리 바깥의 염분 용액에 의한 삼투 영향으로 생육이 저해되고 2단계에서 민감한 개체는 오래된 잎이 먼저 죽고 광합성 능력이 저하된다. 2단계에서 이온, 특히 Na+이 잎에서 축적되며 이는 어린 잎과 달리 흡수된 염분을 희석할 수 없고 더 이상 성장하지 못하는 오래된 잎에서 독성을 갖는다. 또한, Na+의 축적은 효소, 엽록소, 카로테노이드와 같은 광합성 요소에 영향을 미친다(Davenport et al. 2005 Plant Physiology, 137:807-818).
염분 저항성의 유전적 제어 기작은 복잡하기 때문에 아직 완전히 규명되지 않았지만, 환경적 조건에 강하게 반응하는 몇 가지 유전자만이 염분에 대한 저항성 기작을 제어한다. 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)가 염분 스트레스에 처할 경우, Na+ 분출에 대한 반응회로는 다음과 같다. Na+ 이온의 과잉과 고삼투압은 각각 원형질막에 위치하나 기능이 알려지지 않은 센서에 감지되어 세포기질 내에 Ca2+를 유도한다. Ca2+의 양이 증가하면 SOS3(Salt overly sensitive 3)에 의해 감지되고 이는 SOS2를 활성화시킨다. SOS3-SOS2 복합단백질은 원형질막 Na+/H+ 역수송체인 SOS1을 인산화하여 Na+ 이온을 분출한다. 또한, SOS2는 NHX1(Sodium/hydrogen exchanger 1) 역수송체 활성과 V-H+-ATPase 활성을 조절하고, SOS3와는 별개로 SOS3-like Ca2+ binding protein(SCaBP)은 액포막을 표적한다. 염분 스트레스는 ABI1(Protein phosphatase 2C 56)과 ABI2(Protein phosphatase 2C 77)로 인한 ABA(abscisic acid)의 축적을 야기하고 이는 SOS2 또는 SOS1과 NHX1을 음성조절한다(Silva et al. 2009 Plant Signaling Behavior 4(8):718-726).
이와 같이 염분에 관여하는 다양한 유전자의 발굴이 진행되어 왔으나 빠르게 변화하는 소비자 및 재배농가의 선호 품종의 개발 필요성을 충족시키기 위해 생명공학 기술을 이용한 다양한 시도가 이루어지고 있다. 특히 극한 환경에 내성을 갖는 유전자를 다른 유기체에서 분리하여 고등 작물에 도입하는 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, 빠른 시간 내에 유익한 형질들을 유지하면서 단일 유전자의 도입이 가능하기 때문에 유전자 재조합 기술을 이용한 저항성 작물 개발이 진행되고 있다.
현재까지 개발된 형질전환 벼의 목표 형질은 잡초 방제를 위한 제초제 저항성, 병해충 저항성 등 재배 환경 개선, 영양개선 등 기능성 향상, 생물학적 스트레스에 대한 저항성에 중점을 둔 반면, 비생물학적 스트레스에 저항성을 보이는 형질전환 벼 개발 실적은 미흡한 실정이다. 본 발명은 비생물학적 스트레스에 대한 저항성을 보이는 유전자를 발굴하기 위하여 염분 처리 선발시스템을 확립하고, 복합 내성 형질전환 벼 선발법을 확립하고자 수행하였다.
한편, 한국공개특허 제2015-0127239호에는 "고온 스트레스에 대한 작물 식물의 내성을 증가시키고 고온 스트레스에 대한 증가된 내성을 갖는 작물 식물을 선별하는 방법"이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1140780호에는 '히든 마코브 모델을 이용한 식물 저항성 유전자 동정 및 분류를 위한 시스템 및 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 염분 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 200 mM의 염화나트륨을 포함하는 토양에서 9일 동안 벼를 생육시키는 염 스트레스를 처리하였을 때, 대조구인 동진(모품종, WT) 및 주남(감수성, S) 벼 품종과 달리 석정(저항성, R) 및 염 저항성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 벼 식물체의 경우 생육상태 및 생존율이 높게 나타나는 것을 확인하였고, 이를 통해 상기 염 스트레스 처리 조건이 염 저항성을 가지는 형질전환 벼 식물체를 조기에 선별할 수 있는 시스템임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (1) 염 저항성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 170~230 mM의 염화나트륨을 포함하는 토양에서 8~10일 동안 생육시키는 단계; 및 (2) 상기 염 스트레스에 노출된 식물의 피해 수준을 5단계로 분류하여 형질전환 식물체의 염 저항성의 정도를 결정하는 단계;를 포함하는 염 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법을 제공한다.
본 발명에서 확립된 조기 검정 방법을 이용하면, 온실 및 GM 포장내에서 간단한 과정을 통해 염 저항성 관련 우수 유전자들의 조기 선별이 가능하므로, 형질전환 신품종의 육성 또는 이와 관련된 산업 분야에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 Ankyrin 형질전환 식물체 제조를 위해 사용한 벡터 맵이다.
도 2는 아그로박테리움 매개 형질전환법과 벼 캘러스의 재분화 과정을 보여준다. (A): 캘러스 유도 배지에서 캘러스를 유도하는 모습, (B): 아그로박테리움 감염 및 공배양 모습, (C): PPT(phosphinotricin)를 이용한 형질전환 캘러스 선별, (D): 형질전환된 캘러스의 재분화 첫 단계, (E): 광 조건 하에서 재분화의 2번째 단계동안에 형질전환된 캘러스로부터 줄기 및 뿌리가 재생된 모습.
도 3은 야생형 동진의 표현형에 기반한 염분 처리에 따른 피해 수준의 모습을 나타낸다.
도 4는 T0 Ankyrin 형질전환 식물체에서 Taq-Man PCR을 통한 카피 수 확인 결과이다.
도 5는 T0 Ankyrin 형질전환 식물체의 게노믹 PCR 결과이다. WT: 동진, L: 100 bp Ladder (KapaTM Universal Ladder).
도 6은 정상 조건에서 Ankyrin 형질전환 식물체의 Ankyrin 유전자의 mRNA 발현수준을 확인한 결과이다.
도 7은 PPT(phosphinotricin)를 포함하는 1/2 MS 배지에서 광 조건으로 10일간 배양하여 Ankyrin 형질전환 식물체의 T1 세대를 선별한 모습이다.
도 8은 다양한 농도의 염분 스트레스 조건에서 대조구 품종의 표현형적 반응의 모습이다. WT: 동진, T: 저항성 품종 석정, S: 감수성 품종 주남, DAT: days after transplanting.
도 9는 염분 스트레스 조건 하에서 염분 저항성을 가지는 Ankyrin 형질전환 식물체의 선별 과정이다.
도 10은 염분 스트레스 처리 후 Ankyrin 형질전환 식물체의 생존률(A) 및 이온 누출(B) 분석 결과이다.
도 11은 염분 스트레스 처리 전후의 뿌리 조직의 SEM 분석 결과이다. WT: 야생형 동진, T: 저항성 품종 석정, S: 감수성 품종 주남 및 형질전환체-30.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 염 저항성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 170~230 mM의 염화나트륨을 포함하는 토양에서 8~10일 동안 생육시키는 단계; 및
(2) 상기 염 스트레스에 노출된 식물의 피해 수준을 5단계로 분류하여 형질전환 식물체의 염 저항성의 정도를 결정하는 단계;를 포함하는 염 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법을 제공한다.
본 발명의 조기 검정 방법에 있어서, 상기 염 저항성 유전자는 형질전환된 식물체에서 과발현되어 형질전환 식물체에 염 저항성을 증진시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 식물체는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 또한, 상기 염 저항성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 170~230 mM의 염화나트륨을 포함하는 토양에서 8~10일 동안 생육시키는 염 스트레스를 처리한 후, 물을 공급하여 4~6일 동안 추가로 생육시키는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 염 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법에 있어서, 상기 (1) 단계는 보다 구체적으로는, 200 mM의 염화나트륨을 포함하는 토양에서 염 저항성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 9일 동안 생육시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 염 저항성을 가지는 형질전환 식물체의 조기 검정 방법에 있어서, 상기 (2) 단계의 피해 수준은 하기와 같이 5단계로 분류하는 것을 특징으로 한다:
1단계 : 작물의 줄기가 굵고, 색이 선명하고 진한 녹색이며 잎이 위로 뻗은 튼튼한 초형을 가진 상태
2단계 : 잎의 끝이 말리기 시작하며 식물체 색과 줄기의 굵기는 크게 변하지 않는 상태
3단계 : 잎이 처지지는 않으나 1/3이 말리며 가장 바깥 잎부터 갈변하여 죽어가며, 전체적으로 녹색이 옅어지기 시작하는 상태
4단계 : 잎의 2/3가 말리고 줄기가 가늘어지며, 바깥 잎은 모두 갈변되어 죽은 상태 및
5단계 : 중심 줄기를 제외한 나머지가 완전히 가늘어지고 갈변하여 거의 죽은 상태.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기와 같이 170~230 mM의 염화나트륨을 포함하는 토양에서 8~10일 동안 생육시키는 염 스트레스를 처리할 경우, 대조구 및 염 스트레스 감수성 벼 품종은 회복이 불가할 정도의 생육상태를 보여주었으나, 염 스트레스 저항성 벼 품종은 우수한 생육상태 및 높은 생존율을 보여주었다. 상기와 같이 염 스트레스 저항성 및 감수성 식물체간의 현저한 표현형적 차이에 근거하여, 염 저항성을 가지는 형질전환된 식물체를 조기에 검정할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 염 저항성 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
본 발명의 상기 염 저항성 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한, 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA(Streptomycin 3''-adenylyltransferase) 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어 질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
본 명세서에서 용어 '염분' 또는 '염해'는 염(salt)과 혼용되어 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
식물재료
벼에서 유래된 불량환경 저항성 유전자를 아그로박테리움 매개 방법(Agrobacterium-mediated transformation)으로 도입하여 형질전환체를 육성하였으며, 염분 저항성에 대한 내성 형질전환체 선발 및 분자적 특성을 조사하는데 이용하였다. 해당 유전자에 대한 기능검정을 실시할 수 있는 시스템 구축을 위해 염해 저항성 최적 선발 기간 및 조건 확립에 모품종인 동진벼(Oryza sativa cv. Dongjin)를 대조구로 이용하였으며 저항성 및 감수성 품종을 동시에 비교하였다. 본 발명에 사용된 재료는 유전자 형질전환용 벼 모품종으로 동진(Oryza sativar. japonica)과 염분 조건에 저항성 후보 유전자인 Ankyrin 유전자를 사용하였다. 염분 스트레스 처리에 이용한 대조구로 염분 스트레스 저항성 품종 석정, 감수성 품종 주남을 이용하였다(국립종자원, http://www.seed.go.kr/).
염분 스트레스 처리 조건, 모품종, 저항성 및 감수성 품종
염분 처리 모품종
(wild type)		 저항성
(tolerance)		 감수성
(susceptible)
100, 150, 200, 250 mM 동진 석정 주안
벡터구축 및 형질전환 벼의 육성
pPZP200-Ankyrin 과발현 벡터는 35S 프로모터와 PinⅡ 터미네이터 사이에 Ankyrin 유전자를 삽입하였고 선발마커로서 Bar 유전자를 35S 프로모터와 Nos 터미네이터 사이에 삽입하여 식물형질전환용 벡터를 구축하였다(도 1). 이 pPZP200-Ankyrin 운반체는 아그로박테리움 튜메파시엔스(Arobacterium tumefaciens)의 균계인 LBA4404 10 ㎕에 1 ㎕을 첨가하여 MicroPulser electroporation system(Bio-Rad Laboratories, USA) 기기를 이용하여 LBA4404에 형질전환하였다. pPZP200-Ankyrin를 내재하고 있는 LBA4404를 50 mg/L의 스펙티노마이신(spectinomycine)이 첨가된 AB 아가 배지에 3일간 28℃의 암조건 생장상에서 배양하였다. 유전자 형질전환 방법은 벼 발아초기종자를 이용한 고효율 단기형질전환 방법을 이용하여 진행하였으며(Lee et al. 2011), 조직배양과 형질전환에 사용한 배지의 조성은 표 2와 같다.
Figure 112019087619645-pat00001
모품종 동진 종자의 껍질을 인습기를 이용하여 분리한 후 70% 에탄올에서 1분간 1회 세척하였다. 이후 4% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액으로 10분씩 2회 살균하고 멸균된 증류수로 1분씩 10회 이상 세척하여 최종 살균한 후 종자를 페트리디쉬에 옮겨 담아 클린벤치 에서 1시간 동안 건조하였다. 그리고, 캘러스를 유기하기 위하여 2N6 배지에 종자를 치상하고 28℃ 광 조건에서 7-10일간 배양하였다.
AB 배지에서 배양된 아그로박테리움을 AAM-AS 액체 배지에 OD600(optical density)=0.1으로 접종 농도를 맞추어 현탁액을 만들고 유기된 캘러스를 3분간 침종한 후 멸균한 필터페이퍼 위에 올려놓아 캘러스 표면의 아그로박테리움 현탁액 여분을 30분 이상 건조시켰다. 아그로박테리움의 과잉 생장을 막기 위하여 필터 페이퍼를 2N6-AS 배지에 깔아주고 그 위에 건조시킨 캘러스를 옮겨 담았다.
공배양은 3일간 25℃의 암 조건에서 진행하였으며 배양 후 아그로박테리움을 제거하기 위해 500 mg/L 카르베니실린(carbenicillin)이 포함된 멸균수로 10회 이상 세척하였다. 필터페이퍼로 간단히 건조한 뒤 유전자가 삽입된 캘러스의 선발을 위해 2N6-CP 배지에 옮겨 28℃ 광 조건으로 1주일 동안 배양하였다. 1주일 뒤 MSR-CP 배지에 캘러스를 옮겨 심어 뿌리와 줄기의 신장을 유도하고 4 내지 8주간 2주 간격으로 지속적인 계대배양을 실시하였다. 재분화가 된 식물체를 실내 상온에서 순화한 후 포트에 재이식하여 온실에서 재배하였으며 적합한 생육 조건 하에 5개월간 생장하여 얻은 T1 종자를 본 실험에 이용하였다(도 2).
염분 스트레스 처리
(1) 염분 스트레스의 기준 확립
염분 스트레스에 노출되는 작물의 피해 수준은 아래와 같이 1~5 수준으로 설정하였다. 스트레스를 받지 않은 수준을 1, 피해가 아주 심각한 수준을 5로 두어 스트레스를 주었을 때의 형질전환체의 피해 정도를 객관적으로 조사하고자 하였다.
<염분 처리에 따른 피해 수준>
1 : 작물의 줄기가 굵고, 색이 선명하고 진한 녹색이며 잎이 위로 뻗은 튼튼한 초형을 가진 상태.
2 : 잎의 끝이 말리기 시작하며 식물체 색과 줄기의 굵기는 크게 변하지 않는 상태.
3 : 잎이 처지지는 않으나 1/3이 말리며 가장 바깥 잎부터 갈변하여 죽어간다. 전체적으로 녹색이 옅어지기 시작하는 상태.
4 : 잎의 2/3가 말리고 줄기가 가늘어진다. 바깥 잎은 모두 갈변되어 죽은 상태.
5 : 중심 줄기를 제외한 나머지가 완전히 가늘어지고 갈변하여 거의 죽은 상태.
식물체의 스트레스 정도에 따른 피해 기준을 확립함과 동시에 대조구 품종에 대한 선행연구를 실시하여 형질전환체의 저항성을 선발하기 위한 스트레스 처리 기준을 확립하였다.
최적 선발 염분 농도를 선정하기 위해서 모품종인 동진, 염분 저항성 품종인 석정, 그리고, 염분 감수성 품종인 주남을 각각 염분 농도 100, 150, 200 및 250 mM 수용액을 제조하여 한 포트 당 20개체씩 심어 3 반복으로 처리하였으며 각각의 염분농도 수용액이 담긴 플라스틱 박스(60ⅹ45.5ⅹ19 cm)에 식물체 포트를 넣어 염분 스트레스를 받게 하였다.
(2) 형질전환체의 스트레스 저항성 검정
형질전환체 중에서 1 copy number이면서 보통 생육조건에서 유전자 발현량이 높은 계통의 T1 종자를 70% 에탄올과 4% 차아염소산나트륨에 소독 후, 증류수로 세척하여 1/2 MS + phosphinotricin(2 ppm) 배지에 치상하였고 28℃의 명조건 생장상에서 10일간 생육하였다. 선발된 형질전환체들의 생존율을 구하고, 128공 포트에 옮겨 심어 3엽기가 될 때까지 생육 후 한 포트(10.5ⅹ10.5ⅹ11 cm) 당 20개체씩 3반복이 되도록 이식하였다. 염분 처리는 벼 식물체가 3엽기가 될 때까지 생육 시킨 후에 최적선발 농도인 200 mM 염화나트륨(NaCl) 수용액을 제조하여 플라스틱 박스(60ⅹ45.5ⅹ19 cm)에 식물체 포트를 넣어 염분 처리하였으며, 반복은 서로 다른 박스 3개에 담아 처리하였다. 처리기간 중 식물체의 흡수 및 증발로 인하여 염화나트륨 수용액이 줄어들거나 염분 농도가 높아지지 않도록 2일에 한번씩 염화나트륨 수용액을 교체하였다.
형질전환체의 분자학적 특성
(1) 게노믹(Genomic) DNA 추출
액체질소로 냉각시킨 0.25 g의 벼 잎을 1.7 ㎖의 튜브에 담아 곱게 갈은 후 DNA 추출용액(500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM EDTA, 1.25 % SDS, Sodium bisulfite 0.38 g/100 ㎖) 1 ㎖을 첨가하여 65℃에 1시간 동안 처리하였다. 이후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액에 클로로포름:이소아밀 알코올(chloroform:isoamyl alcohol, 24:1) 용액 500 ㎕을 첨가한 후 볼텍스 기기를 이용하여 충분히 혼합하였다. 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하고 분리된 상층액을 얻어 이소프로판올(isopropanol) 300 ㎕을 첨가하고 20분 동안 -20℃ 냉동고에 처리하였다. 4℃, 12,000 rpm 에서 15분간 원심분리한 후 튜브 바닥의 침전물이 떨어지지 않게 조심하여 상층액을 따라 버렸다. DNA의 세척을 위해 70% 에탄올 400 ㎕을 첨가하여 4℃, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 후 피펫으로 에탄올을 제거하여 건조시켰다. 건조 후 TE 버퍼 50 ㎕에 DNA를 녹였고, RNase(RNase stock 20 ㎕, nuclease free-water 10 ㎖) 1 ㎕를 첨가하고 37℃에 10분 동안 반응시켰다(Cho et al. 2007).
(2) PCR 분석
추출된 DNA의 농도를 측정하기 위하여 NanoDrop One(Thermo fisher scientific, USA) 기기를 이용하였고 PCR 실험에 적정 농도인 20 ng/㎕으로 맞추었다. 반응액은 주형 DNA 20 ng, Ankyrin과 PinⅡ 터미네이터에 특이적인 프라이머 10 pmol, 10ⅹ buffer 2 ㎕, dNTP 5 mM, Taq polymerase 2.5 units/㎕ 0.2 ㎕로 조성하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 전변성(pre-denaturation) 시킨 후, 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 60℃에서 30초 결합(annealing), 72℃ 30초간 신장(extension) 과정을 35 cycles이 되도록 설정하였으며, 마지막 72℃에서 1분간 최종신장(post-extension)을 실시하였다. PCR 기기는 Thermal Cycler(Bio-Rad laboratory)를 사용하였다(표 3).
프라이머 정보
Name Orientation Sequence (5'→3') Tm (℃)
Ankyrin Fw CTGGATAAGGTCAGGGGCC (서열번호 1) 60
PinII Rw AGTCTAGGGTCACATTGCAG (서열번호 2) 60
Actin Fw TGTATGCCAGTGGTCGTACC (서열번호 3) 55
Rw CCAGCAAGGTCGAGACGAA (서열번호 4) 55
Ankyrin-RT Fw CGCCTCCAGGAGGTGGTGGA (서열번호 5) 60
Rw ACCCCTTTGCCAGCAACGTT (서열번호 6) 60
(3) RNA 추출
액체질소로 냉각시킨 0.25 g의 잎을 1.7 ㎖ 튜브에 담아 blue pencil로 곱게 갈은 후 RNA iso(=Trizol)을 1 ㎖ 첨가하여 볼텍스 기기로 5초간 섞어준 뒤 상온에서 5분간 처리하였다. 원심분리기의 온도를 4℃로 설정하여 12,000 rpm에서 1분간 돌린 후 상등액을 얻어 클로로포름 200 ㎕을 첨가하여 15초간 세게 흔들어주었다. 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상등액을 얻어 -20℃에서 냉각한 이소프로판올을 500 ㎕ 첨가한 후 가볍게 손으로 흔들어주었다. 상온에서 2분 처리 후 4℃, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 펠렛(pellet)이 떨어지지 않게 상등액을 조심히 따라버렸다. 그 후 70% 에탄올 400 ㎕를 첨가하여 펠렛이 떨어질 정도로만 볼텍스 기기로 흔들어준 뒤 4℃ 8,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 에탄올을 버린 후 마지막으로 스핀다운하여 남은 에탄올을 피펫으로 제거하고 상온에서 건조시킨 뒤에 Nuclease-free water를 50~100 ㎕을 첨가하였다(MacRae 2007).
(4) cDNA 합성
cDNA 합성에 사용한 시약은 추출된 RNA의 농도를 NanoDrop One으로 측정하여 1 ng/㎕로 맞춘 후, 65℃에서 5분간 처리하였다. RNA를 담은 튜브를 얼음에 차갑게 유지하고 DNaseⅠ과 oligo dT, random 프라이머가 함유된 4ⅹ Master mix(Toyobo, Japan) 2 ㎕ 과 nuclease-free water, RNA 6 ㎕을 첨가하여 총 8 ㎕이 되게 하여 37℃에서 5분간 처리하였다. 이후 5ⅹ RT master mixⅡ를 2 ㎕ 첨가하여 PCR 기기(Bio-Rad, USA)를 37℃ 1시간, 98℃ 5분으로 설정하여 역전사(reverse transcription)를 진행하였다.
(5) 동형접합성(homozygous) 형질전환체 선발
Ankyrin 유전자 형질전환체 T0 개체에서 single copy로 도입된 개체를 얻기 위해 Taq-Man probe real-time PCR 분석을 수행하였다. 추출한 주형 DNA 30 ng에 2ⅹ brilliantⅡ QPCR master mix(Roche, Switzerland) 10 ㎕, 20ⅹ Tublin(reporter VIC, Quancher TAMRA) 1 ㎕, 20ⅹ Nos(reporter FAM, Quancher none) 1 ㎕를 PCR tube에 3반복으로 넣었으며, 양성 대조군은 검증된 동형접합(homo) 계통 형질전환체의 DNA를 이용하였고, 음성 대조군은 동진의 DNA를 사용하였다. 만들어진 반응액을 SteponeTM real-time PCR system(Life technologies, USA) 기기를 이용하여 Taq-Man PCR을 수행하였으며, 반응 조건은 95℃에서 10분간 효소 활성화(enzyme activation), 95℃에서 15초간 변성, 55℃에서 1분간 결합으로 60 cycles을 설정하였다.
mRNA의 발현량을 확인하기 위하여 qRT-PCR을 수행하였으며 반응액은 cDNA 4 ㎕와 iQTM SYBR® green supermix(Bio Lad, USA) 10 ㎕, 그리고, ankyrin에 특이적인 프라이머 10pmol, nuclease-free water를 총 20 ㎕이 되도록 첨가하였으며 Light Cycler(Bio-Rad CFX96TM real-time PCR detection system, USA) 기기로 mRNA의 발현량을 3반복을 두어 분석하였다. 반응조건은 95℃에서 10분간 전변성, 95℃에서 10초간 변성, 55℃에서 20초간 결합, 72℃에서 1분간 신장, 총 60 cycles이 되게 하였다. PCR 산물의 용융곡선(melting curve)은 65℃에서 95℃로 온도를 높이며 확인하였다.
이후 선발된 ankyrin 형질전환체의 T1 종자를 일반 1/2 MS 배지에서 자란 저항성, 감수성 품종과 함께 생육 정도가 비슷한 개체들만 선정하여 실험에 이용하였다.
생리활성 분석 - 전해질 침출법에 의한 이온함량 측정
무처리일 때 식물체의 잎 0.1 g을 5 mm 간격으로 잘라서 10 ㎖의 증류수와 함께 50 ㎖ 튜브에 담았다. 32℃로 설정된 중탕기에서 2시간 처리 후 Multi-range EC meter(Hanna instru ments, Romania)로 수치를 측정하는데, 이 때의 측정값이 EC1이다. 이후 고압증기멸균기(autoclave)로 20분간 고온·고압 처리하고 다시 상온이 되었을 때, 한번 더 EC meter로 수치를 측정하여 EC2 값을 얻었다. 구해진 EC1과 EC2로 EL값을 구하고 스트레스 처리 전후 측정치인 EL1과 EL2 값을 구하여 비교하였다(Dionisio-Sese and Tobita 1998).
EL= EC1/EC2 ⅹ 100
세포의 조직학적 분석
야생형(Wild type) 동진과 ankyrin 형질전환체에 스트레스 처리 전 후의 세포 구조를 관찰하기 위하여 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope)을 이용하였다. 전자현미경은 ULTRA PLUS(Zeiss, Germany) 모델을 사용하여 스트레스 처리 전후의 세포 구조 특성 등을 형질전환체와 모품종 및 대조구 품종의 표층 형태 변화를 관찰하였다.
세포의 분석에 사용한 조직은 염분 스트레스 처리 전과 후 뿌리를 이용하였다. 채취한 뿌리를 0.5~1 m3로 절단한 후 2.5% 글루타르알데하이드(Glutaraldehyde) 용액에 3시간 고정한 다음, 0.1M 인산염 버퍼(phosphate buffer)로 20분씩 3회 수세한 시료를 에탄올(30, 50, 70, 80, 90, 95 및 100%)로 각 15분씩 탈수하였다. 탈수된 시료는 100% 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate)에 20분 동안 치환시켜 클린벤치에서 건조시키고 백금 코팅 후 주사 전자현미경으로 관찰하였다.
실시예 1. 형질전환체의 분자적 특성
벼 유래 Ankyrin 유전자를 형질전환하여 얻어진 T0 식물체를 대상으로 도입 유전자가 벼 게놈 내 싱글 카피로 도입여부를 알아보기 위해 Taq-Man PCR 분석을 수행하였다. 총 46 개체로부터 총 DNA를 추출하여 정량한 다음, 이미 알고 있는 대조식물, 2 copy(homo)로 도입된 계통의 PCR 산물을 정량적으로 비교한 결과, 1 copy 개체와 유사한 정량을 가진 개체는 15개이었으며, 2 copy 개체와 유사한 정량을 가진 개체는 31개였다(도 4).
1 copy인 형질전환체에서 T-DNA 영역을 확인하기 위해, Ankyrin의 정방향과 PinⅡ-터미네이터 영역의 특이 역방향 프라이머를 사용하여 게노믹 PCR 분석 후 1.5% 아가로스 겔에 전기영동한 결과, 435 bp 크기의 밴드를 보였고 1 copy 15개체가 형질전환체임을 확인하였다(도 5).
이후 보통 생육 조건일 때 형질전환체의 Ankyrin 유전자 발현량을 알기 위해 real-time PCR 분석한 결과, 과발현 벡터 구축으로 인하여 유전자의 발현이 모품종인 동진에 비해 최소 10배(Ank-40)에서 최대 80배(Ank-29)까지 높은 것으로 확인되었다(도 6). 카피 수와 mRNA의 발현량, 그리고 앞서 시험적으로 반복 수행하였던 형질전환체의 염분 스트레스 선행연구 결과를 종합적으로 고려하여 Ank-8, -30, -31, -33, -44번을 선정하여 본 발명에 이용하였다.
선발된 형질전환체의 세대를 증진하여 얻은 T1 종자 중 homo인 개체를 얻고자 1/2 MS + phosphinotricin 배지에 심었으며, 그 결과 대조구 품종들은 생육하지 못하였고 Ank-8은 71%, Ank-30은 66%, Ank-31은 61%, Ank-33은 75%, Ank-44는 80%의 생존율을 나타냈다(도 7).
실시예 2. 스트레스 처리에 따른 생장 반응
(1) 스트레스의 처리기준
모품종 동진과 염분 저항성 품종 석정, 감수성 품종 주남을 염분 처리하여, 처리 시간에 따른 품종들의 변화를 도 3의 염분 피해 수준 지침표에 대입하여 관찰하였다.
그 결과, 염화나트륨 100 mM 처리구에서는 염분 처리 5일 후부터 저항성 품종을 제외한 모품종과 감수성 품종이 피해수준 2 정도의 양상을 나타내었으며, 9일차에는 피해수준 2-3정도로 피해 증상이 완만하게 나타났다(도 8). 염화나트륨 150 mM 처리구에도 역시 5일차부터 피해 양상이 나타나기 시작했으며 7일차에 저항성품종 2, 모품종과 감수성 품종이 3정도의 피해 수준을 나타내었고 9일차까지 같은 피해 수준을 유지하였다. 염화나트륨 200 mM 처리구에서는 3일차부터 피해 양상이 나타나기 시작하여 5일차에는 저항성품종 2, 모품종과 감수성이 4의 피해 수준을 나타내었으며 9일차에는 저항성 품종 3, 모품종과 감수성이 5의 피해 수준을 나타냈다. 염화나트륨 250 mM 처리구에서는 5일차까지 200 mM 처리구와 비슷한 피해 양상을 보이다 7일차에 모든 품종에 피해 수준 4정도를 나타내었고 9일차에는 저항성 품종의 몇 개체 만을 제외하고 모두 5의 피해 수준을 나타내었다. 높은 염분 농도로 인하여 모든 품종들이 염분 피해를 크게 받아, 저항성 개체의 선발에 어려움이 있었다.
종합적으로 각 농도별 처리 시간 및 생육상태를 살펴본 결과, 200 mM 염화나트륨 처리 9일차에 저항성 품종 석정은 생육상태 및 생존율이 높게 나타났고 야생형 품종과 감수성 품종은 회복이 불능할 정도의 염분 피해 증상이 나타났다. 따라서, 염분 저항성 최적 선발 농도를 200 mM 염화나트륨으로 설정하여 형질전환체 염분 저항성 검정을 위한 염분 농도로 이용하였다.
(2) 형질전환체 스트레스 처리 결과
동진, 석정, 주남을 포함한 Ank-8, -30, -31, -33, -44의 염분 스트레스 처리 결과, 처리 5일 후에 초기 피해를 입기 시작하였고 7일 후에 동진, 주남, 석정, Ank-33, -44의 피해 수준이 3인 것에 비해 Ank-8, -30, -31은 피해 수준 2로 나타났다. 최적 선발 날짜인 염분 처리 9일 후에 Ank-8, -30, -31은 4의 피해 수준으로 나타났고, 대조구와 Ank-33, -44 형질전환체들은 모두 5의 피해수준으로 염분에 대한 저항성 차이가 크게 나타났다. 따라서, Ank-8, -30, -31 계통을 염분 저항성 형질전환체로 판단하여 두 개의 계통을 이후 실험에 사용하였다(도 9).
염분 처리 9일 후에 물을 주어 5일간 회복시킨 후의 생육 상태로 회복률을 관찰한 결과, 모품종 동진과 저항성 품종 석정이 20%, 감수성 품종 주남은 5%로 매우 낮은 생존율을 나타내었으나, Ankyrin 유전자 형질전환 벼 Ank-8, -30, -31은 각각 75%, 70%, 100%로 높은 회복률을 나타내었다(도 10A).
실시예 3. 염분 처리 후 Ankyrin 형질전환 벼의 생리활성 분석
무처리와 염분 처리 후 10일차(회복 바로 전)에 채취한 잎 샘플에서 전해질 누출(electrolyte leakage)의 수치를 대조 분석한 결과, 무처리일 때 이온 방출량은 석정과 주남이 약 20%, Ankyrin 형질전환체는 약 15%, 동진이 11.4 %로 가장 낮은 수치를 나타내었다. 염분 처리 후 가장 피해가 심한 9일차의 측정값에서는 동진과 주남이 약 85%로 높은 수치를 나타내었고 석정은 그보다 낮은 63%를 나타내었다. Ankyrin 유전자 형질전환 벼 Ank-8, -30, -31은 각각 41%, 35%, 48%로 대조구보다 낮은 수치를 나타냈다(도 10B).
벼에서 염분 스트레스의 영향은 유묘기와 개화기에 가장 크게 영향을 미치며, 특히 유묘기에 잎의 조기 노화를 촉진하는 것으로 알려졌다. 이에 관여하는 요소로 독성 이온(Na+와 Cl-) 축적과 K+ 및 Ca2+의 감소가 있으며, 이러한 이온의 변화는 곧 전해질 누출과 연계된다. 전해질 누출 수치가 낮은 Ank-8, -30, -31이 독성 이온의 함유량이 적고 염분 스트레스에서 세포막의 구조가 안정적이라는 것을 의미하기 때문에 염분 저항성 개체로 판단되었다.
실시예 4. 세포의 조직학적 변화
염분 저항성을 보인 각각의 형질전환체를 대상으로 뿌리의 특성 변화를 세포 형태 수준에서 해석하기 위해서 염분 처리에 의한 모품종 동진, 염분 저항성 및 감수성 품종과 형질전환체의 뿌리 단면 조직 변화를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscopes, SEM)을 이용하여 1,000배 확대하여 살펴보았다. 염분 처리 후 비정상적으로 통기 조직이 발달하는 특성이 나타났는데 뿌리 세포 내 산소 부족에 의한 세포 파괴를 최소화하기 위한 방어적 현상으로 추정된다. 통기 조직의 크기 정도를 비교해 볼 때, 형질전환체와 저항성 품종들의 거대화 정도가 모품종 및 감수성 품종들에 비해 더욱 크게 나타났다(도 11). 뿌리에서의 통기 조직의 발달은 산소 수송 기능의 발달을 의미하는데 식물이 침수될 경우 산소요구도가 높아지기 때문에 통기 조직의 양과 크기가 더 늘어난다. 또한, 염분 조건에서 산소의 흡수가 어렵기 때문에 이에 대응하기 위하여 통기 조직이 뚜렷하게 형성되어 산소의 이동을 원활하게 한다.
반면에 모품종 및 감수성 품종의 중심주내 물관의 크기 및 형태 정도가 형질전환체에 비해 크게 형성되어있다. 이는 형질전환체의 물관부와 체관부의 조직 치밀도 정도가 높아 통기조직의 크기를 더욱 확보하여 염분에 저항성을 나타내는 것으로 판단된다. Ma 등(2015 Molecular Soil Biology 6(2):1-6)의 보고에 의하면, 염분 조건에서 세포가 피해를 입어 실질적 조직들이 파열되거나, 세포 사이의 공간이 줄어들어 통기구조의 크기를 확보한다고 하였다. 따라서 각 스트레스 처리구에서, 세포구조의 수축과 파괴 정도가 낮고 산소 공급이 원활할 수 있게 통기조직이 커지며 내피조직이 밀집한 형질전환체 Ankyrin 계통이 염분 조건에 저항성인 것으로 사료된다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for early selecting transgenic plant with salt tolerance <130> PN19279 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctggataagg tcaggggcc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agtctagggt cacattgcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgtatgccag tggtcgtacc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccagcaaggt cgagacgaa 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgcctccagg aggtggtgga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acccctttgc cagcaacgtt 20

Claims (5)

  1. (1) 염 저항성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 3엽기의 동진벼(Oryza sativa cv. Dongjin) 식물체를 200 mM의 염화나트륨을 포함하는 토양에서 9일 동안 생육시키는 단계; 및
    (2) 상기 염화나트륨에 노출된 식물체의 피해 수준을 5단계로 분류하여 형질전환 동진벼 식물체의 염 저항성의 정도를 결정하는 단계;를 포함하는 염 저항성을 가지는 형질전환 동진벼 식물체의 조기 검정 방법으로서,
    상기 (2) 단계의 피해 수준을 하기와 같이 5단계로 분류하는 것을 특징으로 하는 방법:
    1단계 : 작물의 줄기가 굵고, 색이 선명하고 진한 녹색이며 잎이 위로 뻗은 튼튼한 초형을 가진 상태
    2단계 : 잎의 끝이 말리기 시작하며 식물체 색과 줄기의 굵기는 크게 변하지 않는 상태
    3단계 : 잎이 처지지는 않으나 1/3이 말리며 가장 바깥 잎부터 갈변하여 죽어가며, 전체적으로 녹색이 옅어지기 시작하는 상태
    4단계 : 잎의 2/3가 말리고 줄기가 가늘어지며, 바깥 잎은 모두 갈변되어 죽은 상태 및
    5단계 : 중심 줄기를 제외한 나머지가 완전히 가늘어지고 갈변하여 거의 죽은 상태.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 염 저항성 유전자는 상기 유전자가 과발현되어 동진벼 식물체에 염 저항성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2016103994A (ja) * 2014-11-19 2016-06-09 国立大学法人名古屋大学 環境ストレス耐性を付与する遺伝子及びその利用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
농사로 농업기술포털. 벼 내염성 검정 (2017.11.07.)* *

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