CN112521467B

CN112521467B - 一种与植物抗逆性相关基因agl103及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN112521467B
Application number: CN201910874834.8A
Authority: CN
Inventors: 向成斌; 赵娉霞
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2019-09-17
Filing date: 2019-09-17
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2039-09-17
Also published as: CN112521467A

Abstract

本发明涉及一种与植物抗逆性相关基因AGL103、其编码蛋白及其在植物抗逆中的应用。本发明提供植物抗逆相关基因ATAGL103在提高植物抗逆性、培育抗逆性转基因植物及选育抗逆性提高的植物品种中的应用，该基因响应逆境胁迫，在逆境胁迫条件下转录水平显著降低。在植株中不表达该基因可显著提高植物的耐盐性和抗渗透胁迫能力，同时过表达该基因则表现出更敏感的表型。证明AGL103是一个负调控植物抗逆的转录因子，当缺失该基因能显著提高植物耐盐和耐渗透胁迫能力。该发现有利于农作物改良，进一步为培育抗逆新品种提供了候选基因。

Description

一种与植物抗逆性相关基因AGL103及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种与植物抗逆性相关基因AGL103、其编码蛋白及其在植物抗逆中的应用。

背景技术

干旱是世界最为严重的自然灾害之一。目前世界上有1/3以上的土地处于干旱和半干旱地带。我国是世界上干旱和半干旱地区面积较大的国家，旱地面积占全国总土地面积的52.5％，干旱严重制约了我国的农业生产。在我国占国土总面积52.5％的干旱和半干旱地区，年降雨量仅250-500mm以下，土壤水分严重亏缺，造成植物体内渗透势改变，细胞膨压降低，改变细胞膜流动性和膜蛋白构象及活性，造成细胞代谢紊乱，产生大量的活性氧毒害植物，严重影响植物的生长发育及产量。据统计全世界由于水分胁迫导致的作物减产，可超过其他因素造成减产的总和。面对日益严重的全球干旱化趋势以及引发的各种问题，如何解决水资源短缺、维持现代农业可持续性发展，越来越受到广泛地关注。

土地的盐碱化严重制约了现代农业的发展。目前盐碱地约占地球陆地面积的25％左右，全世界大约有0.2亿-0.3亿hm²的海岸湿地和红树林盐滩，同时还存在约40亿hm²的人为原因造成的次生盐碱化土地。据调查资料结果显示，全球盐碱地的面积以每年1.0×10⁶-1.5×10⁶公顷的速度增长。在我国，目前约有3000万hm²以上的土地属于盐碱地，相当于现有耕地面积的25％左右。盐胁迫主要包括土壤溶液中的水势降低造成的渗透胁迫、植物细胞质内离子浓度增高而造成的离子毒害以及高盐引起的植物生长期间的营养亏缺和氧化胁迫等一系列的次生胁迫。这些非生物胁迫使得植物光合作用下降，能耗增加，生长受到抑制，进而加速衰老而死亡。

因此，了解植物在干旱胁迫和盐胁迫条件下的生理生化反应和信号转导途径，采取一定的技术手段使植物能够充分合理地利用有限的水资源，对培育抗旱耐盐特性作物品种具有十分重要的作用和意义。

发明内容

本发明的目的在于提供植物抗逆相关基因ATAGL103在提高植物抗逆性、培育抗逆性转基因植物及选育抗逆性提高的植物品种中的应用，该基因响应逆境胁迫，在逆境胁迫条件下转录水平显著降低。在植株中不表达该基因可显著提高植物的耐盐性和抗渗透胁迫能力，同时过表达该基因则表现出更敏感的表型。

为此，本发明第一方面提供了一种抗逆相关蛋白在调节植物抗逆性中的应用，所述蛋白为：

1)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

2)由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上的氨基酸序列组成，且活性与具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白相同的衍生蛋白。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述衍生蛋白具有的氨基酸序列与SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。

在本发明的另一些优选的实施方式中，所述衍生蛋白具有的氨基酸序列与SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列具有至少95％的同源性。

在本发明的一些实施方式中，编码所述抗逆相关蛋白的基因为：

1)SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

2)与SEQ ID NO:2所示的DNA序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上碱基，且与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有至少90％的同源性。

在本发明的另一些优选的实施方式中，所述与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有至少95％的同源性。

在本发明的一些实施方式中，所述抗逆性为抗盐性和/或抗渗透胁迫。

在本发明的另一些实施方式中，编码所述抗逆相关蛋白的基因的DNA序列还可以为在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO:2所示的DNA序列杂交的核苷酸序列；

其中，所述高严谨条件为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

在本发明的一些实施方式中，编码所述抗逆相关蛋白的基因为ATAGL103。

在本发明中，SEQ ID NO:2所示的DNA序列由1161个核苷酸组成，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列由386个氨基酸组成。

本发明第二方面提供一种抗逆相关蛋白或其编码基因在提高植物抗逆性中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述抗逆相关蛋白为：

1)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

2)由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比存在保守取代、缺失或添加一个以上的氨基酸序列组成，且活性与具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白相同的衍生蛋白。

在本发明的另一些实施方式中，编码所述抗逆相关蛋白的基因为：

1)SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

本发明第三方面提供一种抗逆相关蛋白或其编码基因在培育抗逆性转基因植物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述抗逆相关蛋白为：

1)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

1)SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

在本发明的一些优选的实施方式中，所述植物为拟南芥。

本发明第四方面提供一种抗逆相关蛋白或其编码基因在选育抗逆性提高的植物品种中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述抗逆相关蛋白为：

1)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

1)SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

在本发明的一些优选的实施方式中，所述植物为拟南芥。

本发明第五方面提供一种提高植物抗逆性的方法，使植物中本发明所述的抗逆相关蛋白不存在或所述的基因不表达。

本发明中的“基因不表达”是指在转基因植物中该基因的表达量与野生型植物中该基因的表达量相比小于5％。

本发明中的“抗逆相关蛋白不存在”是指转基因植物中编码该蛋白的基因的表达量与野生型植物中编码该蛋白的基因的表达量相比小于5％，则认为该转基因植物中该蛋白不存在。

在本发明的一些实施方式中，使所述植物中所述的基因相对于野生型降低表达。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述植物为拟南芥。

在本发明的一些实施方式中，所述抗逆相关蛋白为：

1)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

1)SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

在本发明的一些优选的实施方式中，所述植物为拟南芥。

在本发明的具体实施方案中，所述的基因为拟南芥与抗逆相关的基因ATAGL103，“ATAGL103”或“AGL103”均是指拟南芥中的抗逆相关基因ATAGL103。

在本发明的另一些实施方式中，本发明中所用植物为哥伦比亚生态型的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

在本发明中，“Col-0”及“WT”均指未经转基因的野生型的拟南芥哥伦比亚株系。

在本发明中，拟南芥抗逆突变体为Salk_037779，在本发明中被命名为agl103缺失突变体。

本申请的发明人鉴定了一种在拟南芥中能提高植物抗逆相关的基因ATAGL103。所述的植物抗逆的功能是指在盐(NaCl)、甘露醇(Mannitol)处理的条件下在种子萌发和根系延伸阶段具有一定生长优势(种子萌发率和子叶转绿比例高及主根更长)。首先，我们从拟南芥种子库ABRC获得了一个T-DNA插入AT3G18650基因外显子上的缺失突变体Salk_037779，将其命名为agl103缺失突变体。同时，构建了35S启动子驱动AGL103基因过量表达的株系OX(overexpression，过表达)。以拟南芥野生型Col-0作为对照，开展了NaCl、Mannitol、ABA处理条件下的种子萌发、子叶转绿和根系伸长实验。统计结果发现，在NaCl、Mannitol处理条件下，agl103缺失突变体的种子萌发率、子叶转绿比例、主根长和鲜重显著优于对照野生型(Col-0)。证明AGL103是一个负调控植物抗逆的转录因子，当缺失该基因能显著提高植物耐盐和耐渗透胁迫能力。该发现有利于农作物改良，进一步为培育抗逆新品种提供了候选基因。

附图说明

下面将结合附图来说明本发明。

图1.(A)250mM Mannitol处理不同时间条件下，野生型材料中AGL103基因在转录水平的表达；

(B)120mM NaCl处理不同时间条件下，野生型材料中AGL103基因在转录水平的表达；

(C)10μM ABA处理不同时间条件下，野生型材料中AGL103基因在转录水平的表达。

图2.(A)转录水平检测拟南芥AGL103基因在不同时期不同组织的表达模式；

(B)组织定位载体pCB308R-AGL103的构建示意图；

(C)GUS染色试验观察拟南芥AGL103基因在不同时期的组织的表达，其中，a、b：拟南芥种子萌发胚根伸出阶段，黑色方框内为拟南芥种子，黑色箭头所指的深色区域为染色区，背景为MS培养基；c、d、e、f：分别为拟南芥两片、四片、六片、八片子叶生长时期，黑色箭头所指的深色区域为染色区；g：拟南芥五周大成苗时期，黑色方框内的拟南芥根系为染色区；h：拟南芥果荚，黑色箭头所指的深色区域为染色区；i：拟南芥的花，黑色箭头所指的深色区域为染色区；j：拟南芥叶片表皮毛，黑色箭头所指的深色区域为染色区；k：拟南芥幼苗主根根尖，黑色方框内为染色区；l：拟南芥幼苗主根，黑色箭头所指区域为主根中柱染色区；

(D)亚细胞定位载体pGWB5-AGL103的构建示意图；

(E)激光共聚焦显微镜观察拟南芥根系中AGL103蛋白的定位结果图，白色箭头所指的白色点状为绿色荧光。

图3.(A)Salk_037779突变体的T-DNA插入位点示意图；

(B)Salk_037779突变体在基因组水平的鉴定；

(C)Salk_037779突变体在RNA水平的鉴定；

(D)过表达载体pCB2004-AGL103的构建示意图；

(E)AGL103过表达株系中AGL103基因在转录水平的表达量。

图4.(A)Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系种子在分别添加0、250mM Mannitol、150mM NaCl和1μΜ ABA的MS培养基上的萌发情况；

(B)Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系种子在分别添加0、250mM Mannitol、150mMNaCl和1μΜ ABA的MS培养基上种子萌发率的统计结果；

(C)Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系种子在分别添加0、250mM Mannitol、150mMNaCl和1μΜ ABA的MS培养基上子叶转绿比例的统计结果。

图5.(A)Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系幼苗在分别添加0、250mM Mannitol、120mM NaCl和10μΜ ABA的MS培养基上的根系生长情况；

(B)Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系在分别添加0、250mM Mannitol、120mM NaCl和10μΜ ABA的MS培养基上的幼苗主根长度的统计结果；

(C)Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系在分别添加0、250mM Mannitol、120mM NaCl和10μΜ ABA的MS培养基上的幼苗鲜重的统计结果。

图6.(A)agl103、Col-0及OX-22株系在分别添加0、250mM Mannitol和120mM NaCl的不同处理条件下主根根尖的细胞分裂活性检测结果，其中，黑色方框内为染色区。

图7.(A)Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系的幼苗在正常(Normal)、干旱处理和复水条件下的表现；

(B)Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系的幼苗在复水后的存活率统计结果。

具体实施方式

以下通过具体的实施例说明本发明的技术方案。然而，这些实施例仅用于举例说明的目的，并不意味着本发明的范围限于此。

下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中使用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明的一些具体的实施方式中，含有本发明AGL103基因的植物表达载体可通过使用农杆菌介导的转化、外源DNA转化(电转、基因枪)、植物病毒载体转化等本领域常规转化方法进行植物细胞或组织的转化。

实施例1拟南芥AGL103基因对非生物胁迫的响应

为了探究拟南芥AGL103基因在植物抗逆中发挥的功能，我们首先检测了AGL103在转录水平是否对非生物胁迫有响应。首先，将哥伦比亚生态型拟南芥Col-0(野生型)种子(购自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC))使用10％Bleach(即100mL Bleach由10mL 84消毒液和90mL超纯水组成)清洗15分钟，继续用无菌纯水再次清洗5遍后，使种子均匀萌发于MS(Murashige and Skoog)固体培养基(0.6％琼脂粉，pH值5.8)，并置于4℃黑暗条件下春化两天。完成春化后，将培养皿竖直置于21-23℃光照培养室。待野生型材料竖直生长7天后，取相同数量的幼苗分别转移至含有250mMMannitol、120mM NaCl、10μM ABA的MS液体培养基(不含琼脂粉)，分别处理0、0.5、1、2、3、6、12、24小时，取样，抽提不同样品的RNA后进行反转录获得cDNA模板。以Ubiqutin5基因作为内参，使用AGL103基因的Q-PCR引物P1和P2，通过qRT-PCR技术检测不同处理和时间点时AGL103的表达情况。

图1统计结果发现，当拟南芥幼苗被120mM NaCl或250mM Mannitol处理时，短时间内AGL103基因的表达量被下调(图1A，B)。当10μM ABA处理时，AGL103基因的转录本在处理1小时达到最高，后迅速下调并长时间趋于平衡(图1C)。总体来说，当面临非生物胁迫时，AGL103基因会快速响应，并处于动态平衡中。

MS培养基配方(1L)：

10×大量元素	100mL
		100×微量元素	10mL
100×铁盐	10mL
		蔗糖	10g
去离子水	定容至1L

10×大量元素配方(1L)：

NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>	16.5g
		KNO<sub>3</sub>	19g
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	4.4g
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	3.7g
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	1.7g
		去离子水	定容至1L

100×微量元素配方(1L)：

100×铁盐配方(1L)：

FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	2.78g
		Na<sub>2</sub>-EDTA·2H<sub>2</sub>O	3.73g
去离子水	定容至1L

注：FeSO₄·7H₂O与Na₂-EDTA·2H₂O试剂需单独溶解于温水中，再混合定容至1L，并置于65℃水浴螯合4小时后再使用。

拟南芥组织材料的RNA提取：

(1)称取约0.1g新鲜拟南芥组织材料(本实施例中使用拟南芥7天幼苗)，少量多次地加入液氮将组织研磨至粉末，并加入1mL的TRIZOL试剂(购自北京全式金生物技术有限公司)将其完全覆盖，若样品超过0.1g可适量增加TRIZOL体积，待样品融化后，充分研磨，并将液体转移至EP管；

(2)向样品管中加入10μL的β-巯基乙醇，充分混匀，帮助去除样品中的蛋白，并室温静置5分钟；

(3)向样品管中加入200μL三氯甲烷(氯仿)，充分震荡混匀，室温静置5分钟，帮助样品分相；

(4)4℃低温条件下，以12000rpm转速离心10分钟。取200μL上清(避免DNA污染)转移至新的无菌EP管，并加入等体积的异丙醇，充分混匀后，室温静置10分钟帮助RNA沉淀，4℃低温条件下以12000rpm转速离心10分钟，弃上清，保留沉淀。

(5)继续向管中加入1mL 75％的冰乙醇(乙醇需用DEPC水稀释)，清洗2遍，4℃低温条件下以12000rpm转速离心10分钟。弃上清，将样品管置于室温下晾干RNA，加入20μL DEPC水溶解RNA。

RNA反转录：使用北京全式金生物技术有限公司的EasyScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒，按照如下体系，取适量的RNA产物进行反转录。反转录体系如下(10μL)：

将配制好的反应体系，置于42℃水浴孵育15-30min，然后进行85℃加热5秒，使其失活EasyScript RT/RI和gDNA去除剂，最终将形成的cDNA保存于-20℃冰箱，用于后续qRT-PCR检测。

qRT-PCR技术检测AGL103基因表达量的引物如下：

左端引物P1：5’-ACTCTAGCTTACTTGGGGTACA-3’，如SEQ ID NO:3所示；

右端引物P2：5’-TTGGCTGTTGTACGTTGGAAATT-3’，SEQ ID NO:4所示。

实施例中所有qRT-PCR技术使用的内参基因均为Ubiqutin5，该基因引物序列为：

左端引物P3：5’-AGAAGATCAAGCACAAGCAT-3’，如SEQ ID NO:5所示；

右端引物P4：5’-CAGATCAAGCTTCAACTCCT-3’，如SEQ ID NO:6所示。

通过qRT-PCR技术检测AGL103基因的转录本，该反应体系使用的SYBR green试剂购自北京全式金生物技术有限公司，使用的仪器设备为StepOne real-time PCR system。体系如下(10μL)：

SYBR green	5μL
		20uM P1	0.5μL
20uM P2	0.5μL
		cDNA	0.5μL
ddH<sub>2</sub>O	3.5μL

内参Ubiqutin5基因的qRT-PCR反应体系与检测AGL103基因的转录本的反应体系相同，只是将引物进行了替换。

荧光实时定量PCR的扩增条件：

预变性	20s
		变性	10s
退火温度	60℃
		延伸时间	30s
循环数	40

实施例2拟南芥AGL103的组织定位和蛋白定位

为了探究AGL103基因的表达模式，分别选取了野生型(Col-0)干种子，及4周大野生型中的根、莲台叶、茎生叶、茎、花、果荚等材料，提取各材料的RNA，反转录形成cDNA，通过qRT-PCR技术检测野生型材料中不同部位AGL103的表达。RNA提取、反转录以及qRT-PCR的具体操作如实施例1，qRT-PCR中AGL103基因的上游引物P1、下游引物P2和内参基因的引物皆与实施例1中一致。图2的qRT-PCR结果表明，AGL103基因在各个部位均有一定的表达，然而AGL103基因在莲台叶、花和果荚的表达量较高。

同时，为了验证qRT-PCR的结果，我们构建了pCB308R-AGL103的转基因材料。本实施例中采用Gateway^TM克隆技术(汪宗桂，郑文岭，马文丽；通路克隆系统：DNA重组技术的新进展.中国生物工程杂志(2003)，第23卷第7期)，将AGL103基因启动子区域构建到组织定位载体pCB308R(High-throughput Binary Vectors for Plant Gene Function Analysis,Zhi-Yong Lei et al.,Journal of Integrative Plant Biology 2007,49(4):556-567)。首先选取距离AGL103基因启动子ATG前2300bp处设计前端带attB1接头的上游引物P5和前端带attB2接头的下游引物P6，采用KOD酶PCR扩增系统，获得目的片段。通过Gateway^R BPClonase^TM II Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen)将目的片段克隆到pDONR207的穿梭载体(购自Invitrogen)中，再次通过Gateway^R LR Clonase^TM II Enzyme Mix试剂盒(Invitrogen)将pDONR207-AGL103中的目的片段克隆到pCB308R终载体(Xiang et al.,1999；Lei etal.,2007)的attR1和attR2之间，通过酶切鉴定获得正确的pCB308R-AGL103载体(图2B)。经测序确定pCB308R-AGL103载体无突变。将pCB308R-AGL103载体通过电转技术导入农杆菌感受态C58C1(该菌株由美国ISU大学Oliver D.J.教授惠赠，也可通过市售购得)，并通过LB液体培养基大量表达后浸花转化野生型材料(Steven J,Clough and Andrew F.Bent(1998)Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.The Plant Journal 16(6),735–743.)，获得转基因种子。将收到的T1代种子进行无菌清洗后，使其萌发于含有50mg/L除草剂(glufosinate ammonium，商用名为Liberty，法国Aventis作物科学公司)的MS培养基(配制方法见上述实施例1)。筛选出能在抗性培养基上生长的阳性苗，进行土壤扩繁，单株收种T2代。然后分别将种子无菌清洗后萌发于含有除草剂的MS培养基，筛选阳性株系：野生型分离比为3:1的融合GUS基因的报告株系，土壤扩繁。将T3代种子继续萌发于含除草剂的MS培养基上，选取能在含除草剂的MS培养基上正常萌发且没有野生型分离的株系作为纯合体株系。通过GUS染色(GUS配方和染色步骤如下)，观察AGL103在种子萌发、幼苗以及成苗不同时期不同部位的时空表达。图2C的GUS染色结果显示，AGL103在种子萌发阶段伸出的胚根中有表达(图2C中，a、b)；在两片、四片、六片、八片子叶生长时期，AGL103主要在子叶(图2C中，c-f)和主根(图2C中，k(幼苗主根根尖)、l(主根中柱))表达；在五周大成苗时期，AGL103主要在根系中表达(图2C中，g)，同时在果荚(图2C中，h)、花(图2C中，i)和叶片表皮毛(图2C中，j)有一定的表达。

为了进一步确定AGL103蛋白的定位，获得pGWB5-AGL103转基因株系。首先从AGL103的编码区启动子设计上游引物P7且前端带attB1接头，同时从AGL103的终止密码子(不含终止密码子)前设计下游引物P8且前端带有attB2接头。采用KOD酶PCR扩增，获得目的片段。利用Gateway^R BP Clonase^TM II Enzyme Mix试剂盒(购自Invitrogen)将目的片段克隆到pDONR207的穿梭载体中，再次使用Gateway^R LR Clonase^TM II Enzyme Mix试剂盒(购自Invitrogen)将目的片段重组克隆到35S启动子驱动的pGWB5(购于BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)终载体，通过酶切鉴定获得正确的pGWB5-AGL103载体(图2D)。再次测序确定终载体无突变。将正确的pGWB5-AGL103载体电转入农杆菌感受态C58C1中，通过浸花转化野生型材料，获得转基因种子。将收到的T1代种子无菌清洗春化后使其萌发于含50mg/L卡那霉素(购于北京索莱宝科技有限公司)的MS培养基上筛选出含有抗性的融合GFP基因的报告株系。将抗卡那霉素的T2代阳性苗进行土壤扩繁，单株收种。再将T2代种子萌发于含卡那霉素的MS培养基上，筛选阳性株系：野生型分离比为3:1的融合GUS基因的报告株系，继续土壤扩繁单株收种获得T3代种子。取在含有卡那霉素的MS培养基上全萌发的纯合体株系，进行制片，使用OLYMPUSIX-880激光共聚焦显微镜观察拟南芥根部荧光，设置激发波长为488nm，发射波长为510nm。结果如图2E所示，AGL103绿色荧光蛋白定位在根系细胞核中。

AGL103组织定位转基因材料构建使用的PCR引物如下：

上游引物P5(小写字母表示attB1接头)：

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct GATATAAACTGGGACGATGTGA-3’，如SEQ IDNO:7所示；

下游引物P6(小写字母表示attB2接头)：

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggt GGTTGTGTATATTCTCTGTGAAT-3’，如SEQ IDNO:8所示。

AGL103蛋白定位转基因材料构建使用的PCR引物如下：

上游引物P7(小写字母表示attB1接头)：

5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctATGGCTTCTTCTTCGTCCTCT-3’，如SEQ ID NO:9所示；

下游引物P8(小写字母表示attB2接头)：

5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtCGAGAGACCTAGTATTGTTTC-3’，如SEQ ID NO:10所示。

载体构建过程中目的片段扩增使用KOD FX酶(购自TOYOBO)体系，如下(50μL)：

KOD FX酶的PCR扩增条件：

98℃预变性	3min
		98℃变性	10s
60℃退火	30s
		68℃延伸	60s
循环数	40

完成后保存于25℃。

GUS染液配方如下(100mL)：

X-Gluc	0.05g
		N-N-二甲基甲酰胺	1mL
0.1M磷酸缓冲液(PH＝7.0)	78mL
		5mM亚铁氰化钾	10mL
5mM铁氰化钾	10mL
		1％Triton-X 100	100uL
去离子水	补足为100mL

注：X-Gluc需在N-N-二甲基甲酰胺中溶解，待完全溶解后，再添加其他成分。

GUS染色步骤：

(1)首先将融合GUS基因的纯合体报告株系种子，经无菌清洗春化后使其萌发于MS培养基。取种子萌发时期，两片、四片、六片、八片叶子，成苗以及花和果荚浸泡于GUS染液中，置于37℃黑暗培养箱。

(2)观察各样品的染色情况，及时终止染色，防止染色时间过长。

(3)终止染色后，弃染液，用清水清洗两遍，然后逐级脱色。首先使用30％酒精，脱色30分钟，再次使用70％酒精，脱色30分钟，最后使用100％酒精继续脱色直到将叶片颜色洗脱干净。

(4)脱色完成后需逐级复水，首先使用70％酒精，浸泡30分钟，再更换30％酒精，浸泡30分钟，最后置于水中观察及拍照，长期保存需置于30％酒精中。

制片观察步骤：

(1)将幼苗置于载玻片上，加入无菌水，防止载玻片干燥。

(2)将盖玻片轻轻放于幼苗下胚轴以下，保持材料周围无气泡。

(3)将玻片置于OLYMPUSIX-880激光共聚焦显微镜的载物台，设置激发波长为488nm，发射波长为510nm。观察拟南芥根部荧光。

实施例3拟南芥agl103缺失突变体和AGL103过表达株系的获取

为进一步研究AGL103基因的具体功能，从拟南芥种子库ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center，The Ohio State University Rightmire Hall1060Carmack Road，Columbus，OH 43210USA)获得了一个T-DNA插入AT3G18650基因中后段编码区的外显子上的缺失突变体Salk_037779(图3A)。首先将缺失突变体种子无菌清洗后萌发于MS培养基，待生长7天后，转移至土壤中生长。生长4周左右，取成体苗叶片进行DNA抽提(方法如下所示)，获得纯化后的基因组。通过使用2×Taq Master mix酶的PCR技术鉴定缺失突变体纯合体株系。在5个缺失突变体和Col-0中，使用内参β-Tublin基因的上、下游引物(P11、P12)进行PCR扩增，我们发现6个株系中的β-Tublin基因能正常表达；但使用AGL103基因的上、下游引物(P9、P10)进行PCR扩增，结果表明仅Col-0株系能有阳性条带，其他缺失突变体株系均无明显条带(图3B)，证明5个缺失突变体均为纯合体株系。同时取已在基因组水平鉴定的株系的叶片进行RNA提取，获得纯化后的RNA，然后进行反转录获得cDNA，通过qRT-PCR技术检测AGL103在缺失突变体中的表达。RNA提取、反转录以及qRT-PCR的具体操作如实施例1，qRT-PCR中AGL103基因的上游引物、下游引物和内参基因的引物皆与实施例1中一致。图3C的结果表明，5个agl103缺失突变体株系中的AT3G18650(即AGL103)基因均几乎不表达，即表示均为功能缺失纯合体株系。

获得了缺失突变体后，继续通过Gateway^TM克隆技术成功构建了AGL103过表达株系。首先从AGL103的编码区启动子设计上游引物P13且前端带attB1接头，同时从AGL103的终止密码子前(包含终止密码子)设计下游引物P14且前端带有attB2接头。构建技术采用实施例1中的步骤及试剂盒。将AGL103的编码区构建过表达载体pCB2004(High-throughputBinary Vectors for Plant Gene Function Analysis,Zhi-Yong Lei et al.,Journalof Integrative Plant Biology 2007,49(4):556-567)，获得酶切鉴定正确的且无突变的pCB2004-AGL103终载体(图3D)。同时再根据实施例1中的转化和筛选步骤，获得纯合pCB2004-AGL103转基因株系。再将纯合的转基因株系种子萌发于MS培养基，待生长7天后，提取RNA。RNA抽提、反转录以及qRT-PCR的具体操作如实施例1，qRT-PCR中AGL103基因的上游引物P1、下游引物P2和内参基因的引物皆与实施例1中一致。qRT-PCR鉴定结果表明，各转基因株系中AGL103基因的表达量均高于Col-0，因此我们获得了多个过表达纯合株系OX(图3E)。

拟南芥组织材料中基因组的提取：

(1)称取大约0.1g的新鲜材料(本实施例中使用拟南芥莲台叶片)置于研钵中，并向其中加入420uL的DNA抽提缓冲液进行充分研磨；

(2)将液体转移至1.5mL的EP管，并向管中加入5uL 10mg/mL的RNA酶，充分混匀，置于65℃温浴15分钟，使其充分反应；

(3)向样品中分别加入等体积的酚和三氯甲烷，充分混匀，去除多余的蛋白；

(4)室温下以12000rpm转速离心10分钟，将上清转移至新的EP管，同时向管中分别加入0.7倍体积的异丙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠，帮助DNA沉淀；

(5)室温下以12000rpm转速离心10分钟，弃上清，加入1mL 70％酒精清洗沉淀，重复两遍；

(6)室温下晾干沉淀后，向EP管中加入20uL去离子水溶解DNA，作为基因组模板。

DNA抽提缓冲液配方(500mL)：

agl103缺失突变体纯合株系鉴定过程中使用的PCR引物如下：

上游引物P9：5’-CCTTTTTCCCTTTTTAATGCG-3’，如SEQ ID NO:11所示；

下游引物P10：5’-GGGCAGAGGAGGGTACAGTAC-3’，如SEQ ID NO:12所示。

内参β-Tublin基因的PCR引物如下：

上游引物P11：5’-CTTAAGCTCACCACTCCAAGCT-3’，如SEQ ID NO:13所示；

下游引物P12：5’-GCACTTCCACTTCGTCTTCTTC-3’，如SEQ ID NO:14所示。

AGL103过表达株系材料构建过程中使用的PCR引物如下：

上游引物P13(小写字母表示attB1接头)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctATGGCTTCTTCTTCGTCCTCTT-3’，如SEQ ID NO:15所示；

下游引物P14(小写字母表示attB2接头)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtTTAGAGAGACCTAGTATTGTTTC-3’，如SEQ ID NO:16所示。

10uL PCR扩增体系如下：(其中使用的2×Taq Master mix酶购自南京诺唯赞生物技术有限公司)

2x Taq Master mix酶	5uL
		20uM LP	0.5uL
20uM RP	0.5uL
		DNA	0.5uL
去离子水	3.5uL

2×Taq Master mix酶的PCR扩增条件：

完成后保存于25℃。

实施例4拟南芥种子萌发表型分析

首先，将Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系种子无菌清洗春化后分别萌发于含有0、250mM Mannitol、150mM NaCl、1μΜ ABA的MS培养皿，保证每个处理5个皿，每个皿上4个株系的种子数目一致。将培养皿水平置于22℃、16h光照及8h黑暗条件下的培养间观察培养。将种子白色胚根的伸出定义为种子已萌发，从实验的第二天开始计算，统计一周内每天的种子萌发率和子叶变绿比例。此实验已进行多次重复。图4的统计结果发现Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系在MS培养皿上的萌发率及子叶变绿比例没有明显差异。在Mannitol和NaCl处理条件下，agl103株系的种子萌发率和子叶转绿比例显著高于Col-0(对照)；相反，OX-20、OX-22过表达株系的种子萌发率和子叶转绿比例相对于Col-0明显降低。在ABA处理条件下，agl103株系表现为更加敏感，而两个过表达株系则相反。以上结果说明了在非生物胁迫条件下，AGL103基因负调控种子萌发以及子叶变绿。在种子萌发期间，缺失该基因，植物具有更耐盐和耐渗透胁迫的表型。

实施例5拟南芥根系生长表型分析

首先，将Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系种子无菌清洗春化后，使其分别萌发于MS培养皿，保证少量多个。待生长4-5天后，选取4个株系中子叶和主根长势一致且主根长度约1.5cm左右的幼苗被转移至分别含有不同浓度0、250mM Mannitol、120mM NaCl、10μM ABA的MS培养皿。保证每种处理5个皿，每个皿上的4个株系主根数目一致，此实验已进行多次重复。从移苗的当天开始，观察并统计不同株系材料一周内的主根生长曲线和鲜重。结果表明，在正常MS培养条件下，Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系的主根长没有明显差异。当面临Mannitol和NaCl胁迫，agl103缺失突变体的主根长度显著长于Col-0株系，而过表达株系OX-20、OX-22的主根对Mannitol和NaCl处理更敏感，表现为较短的主根。然而agl103缺失突变体的主根相对于Col-0株系对ABA处理更为敏感，同时两个过表达株系呈现相反的表型(图5A，B)。同时统计4个株系在不同处理皿上生长7天后的鲜重。图5C的鲜重统计结果和5B的主根长结果一致。此结果与实施例4中种子萌发率的结果相吻合，进一步证明了在盐胁迫和渗透胁迫条件下，AGL103负调控种子萌发、子叶变绿及主根延伸。当AGL103基因缺失，缺失突变体具有显著的耐逆功能；相反过表达转基因株系对盐胁迫和渗透胁迫表现为更敏感，严重抑制主根延伸。

实施例6拟南芥主根分生区分裂活性分析

进一步从细胞水平分析Col-0、agl103、OX-22株系中主根的变化，我们将agl103、OX-22株系作为母本，分别与父本CycB1；1::GUS(中国科学院上海植物逆境生物学研究中心朱健康教授惠赠，父本CycB1；1::GUS为CycB1；1基因的启动子启动GUS基因表达的转基因株系，其中CycB1；1基因为指示根系的分生区细胞分裂的一个Marker基因)材料杂交。通过将杂交种子扩繁两代后，从基因组水平单株鉴定agl103杂交材料中AGL103基因的表达，确定纯合株系。同时将OX-22杂交材料单株种子分别萌发于含有50mg/L除草剂的MS培养皿，选择没有野生型分离的株系作为纯合株系。进一步通过GUS染色确定杂交株系中CycB1；1基因的纯合。首先分别将Col-0、agl103、OX-22杂交纯合株系种子无菌清洗春化后使其萌发于MS培养基。采用实施例5中的具体培养方法将幼苗转移至分别含有0、250mM Mannitol、120mMNaCl的MS培养皿生长3天后，分别取样将其浸泡于GUS染液中，37℃黑暗处理5小时(染色的具体步骤如实施例2)。结果发现，生长于MS培养皿的Col-0、agl103、OX-22杂交株系的主根分生区染色情况大致相同。在Mannitol和NaCl处理条件下，agl103缺失突变体杂交材料的主根尖分生区的细胞分裂活性显著高于对照Col-0杂交材料；而OX-22杂交材料的主根尖分生区着色明显浅于对照，说明细胞分裂活性较低(图6)。此结果在细胞水平上证明了agl103缺失突变体在盐和渗透胁迫下的主根分生区分裂活性强，导致主根延伸不受抑制，因此具有耐逆表型。

实施例7拟南芥土壤干旱处理地上部分的表型分析

实施例4和5的研究结果证明了，在渗透胁迫条件下，拟南芥AGL103基因具有负调控种子萌发、子叶变绿及幼苗主根伸长的功能。为了继续探究AGL103基因是否在成苗时期也具有调控植物抗逆的功能。首先，我们将Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系种子清洗春化后，使其萌发于MS培养皿，待生长一周后，将不同株系幼苗转移至土壤中(保证每小盆的幼苗数量相同)，将幼苗置于22℃温度和16h光照及8h黑暗条件下的植物生长间培养。将生长4周的幼苗，进行充分浇灌，使其充分吸水，并且拍照记录，此作为“正常”(Normal)。然后，将不同株系的材料置于相同环境下进行干旱处理，严格控制温湿度，时刻观察不同株系地上部分发生的变化。当干旱处理17天后，我们发现不同株系之间出现较明显的变化并拍照记录，此作为“干旱”(Drought)。再充分浇灌，复水，统计Col-0、agl103、OX-20、OX-22株系材料的存活率并拍照记录，此作为“复水”(Rehydration)。图7A的结果显示，在正常生长条件下，4个株系地上部分的生长无明显差异。当干旱处理后，agl103缺失突变体株系的存活率远高于Col-0株系，而两个过表达株系几乎全部死亡。图7B的复水统计结果进一步证明了agl103缺失突变体株系具有抗旱功能。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种抗逆相关蛋白在调节植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述蛋白为：由SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白，所述植物是拟南芥，所述抗逆性为抗渗透胁迫。

2.一种抗逆相关蛋白在调节植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述蛋白为：由SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白，所述植物是拟南芥，所述抗逆性为抗盐性。

3.编码抗逆相关蛋白的基因在调节植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述基因为：SEQ ID NO:2所示的DNA分子，所述植物是拟南芥，所述抗逆性为抗渗透胁迫。

4.编码抗逆相关蛋白的基因在调节植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述基因为：SEQ ID NO:2所示的DNA分子，所述植物是拟南芥，所述抗逆性为抗盐性。

5.一种抗逆相关蛋白或其编码基因在提高植物抗逆性、培育抗逆转基因植物或选育抗逆性提高的植物品种中的应用，其特征在于，所述抗逆相关蛋白为权利要求1中所述的蛋白，编码所述抗逆相关蛋白的基因为权利要求3中所述的基因，所述植物为拟南芥，所述抗逆性为抗渗透胁迫。

6.一种抗逆相关蛋白或其编码基因在提高植物抗逆性、培育抗逆转基因植物或选育抗逆性提高的植物品种中的应用，其特征在于，所述抗逆相关蛋白为权利要求2中所述的蛋白，编码所述抗逆相关蛋白的基因为权利要求4中所述的基因，所述植物为拟南芥，所述抗逆性为抗盐性。

7.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，使所述植物中的权利要求1中所述的抗逆相关蛋白不存在或权利要求3中所述的基因不表达，所述植物是拟南芥，所述抗逆性为抗渗透胁迫。

8.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，使所述植物中的权利要求2中所述的抗逆相关蛋白不存在或权利要求4中所述的基因不表达，所述植物是拟南芥，所述抗逆性为抗盐性。

9.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，使所述植物中的权利要求3中所述的基因相对于野生型降低表达，所述植物是拟南芥，所述抗逆性为抗渗透胁迫。

10.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，使所述植物中的权利要求4中所述的基因相对于野生型降低表达，所述植物是拟南芥，所述抗逆性为抗盐性。