WO2007052376A1 - 活性型areb1により植物の乾燥ストレス耐性を向上させる方法 - Google Patents

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WO2007052376A1
WO2007052376A1 PCT/JP2006/305634 JP2006305634W WO2007052376A1 WO 2007052376 A1 WO2007052376 A1 WO 2007052376A1 JP 2006305634 W JP2006305634 W JP 2006305634W WO 2007052376 A1 WO2007052376 A1 WO 2007052376A1
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plant
environmental stress
areb1
transcription factor
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PCT/JP2006/305634
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Kazuko Shinozaki
Yasunari Fujita
Kyonoshin Maruyama
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Incorporated Administrative Agency Japan International Research Center For Agricultural Sciences
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the present invention relates to an active form of protein AREB1 that regulates resistance to dry stress and a method for using the active form.
  • abscisic acid has various functions in plants and is also involved in the adaptive response to environmental stress. Abscisic acid is synthesized under water-deficient conditions and plays an important role in responding to dry stress. Many genes are known that are induced by drought stress, many of which are activated by abscisic acid. ABRE (ABA—responsiveve element) is known as a promoter of genes controlled by such abscisic acid.
  • AREB AREB2 and AREB3 were first reported in Arabidopsis as a protein that binds to ABRE (see Non-Patent Document 1).
  • AREB1 / ABF2, AREB2 / ABF4, AREB3 / DPBF3, ABF1, ABF3 / DPBF5, ABI5 / DPBF EEL / DPBF4, DPBF2 and AT5G42910 have been reported to date (non-patented) References 1-8).
  • AREB is a regulatory factor that transcribes gene expression by ABA, and is known as a factor that controls a dry / salt / low-temperature stress resistance gene. Have.
  • AREB1 binds to ABRE and induces the expression of stress-responsive genes downstream of the plant, thereby imparting drought / salt / low-temperature stress responsiveness to the plant. Does not induce the expression of responsive genes.
  • AREB 1 activation includes stress-induced splicing and AREB 1 protein Of phosphorylation is considered necessary,
  • Non-Patent Document 1 Uno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA97, 11632-11637
  • Non-patent literature 5 Bensmihen et al., Plant Cel 14, 1391-1403 (2002) Non-patent literature 6 Jakoby et al., Trends plant Sci. 7, 106-111 (2002) Non-patent literature 7 Kim et al., Plant Phys iol. 130, 688-697 (2002) Non-Patent Document 8 Suzuki et al., Plant Phys iol. 132, 1664-1677 (2003) Disclosure of the Invention
  • the present invention provides an active AREB1 that improves resistance to dryness / salt / low temperature stress of a plant by high expression in the plant body, and also provides resistance to drought / salt / low temperature stress of the plant using the active AREB1. It aims at providing the method of improving.
  • the present inventor conducted a detailed domain analysis of AREB1 and identified that the transcription activation domain of AREB1 is the N-terminal amino acid 1-60 region. It also has a transcriptional activation domain and
  • AREB1 changes to a constitutively active form when the activation control region (amino acid 65-277) between DNA binding domains is deleted.
  • the target gene of AREB1 was analyzed, and it was shown that various stress resistance genes were highly expressed.
  • Arabidopsis AREB2 and ABF3, which are homologous to AREB1 are genes responsive to dry / salt / cold stress via ABA signals.
  • OsAREBl a homologous gene for dry / salt / cold stress responsiveness in monocotyledonous rice, as well as dicotyledonous rice plants.
  • the N-terminal region identified this time is a region with extremely high homology regardless of the plant species, and creates an active AREB1.
  • the method used in this study can be applied to a wide variety of plant species.
  • the present invention is as follows.
  • Plant environmental stress responsive transcription factor AREB1 an activated environmental stress response that lacks part or all of the activation control region and contains an N-terminal transcriptional activation domain and a DNA-binding domain Sex transcription factor AREB 1 gene.
  • a plant that lacks at least one of the Q, R, S, and T regions of environmental stress-responsive transcription factors and contains a ⁇ -terminal transcriptional activation domain and a U-region that contains a DNA-binding domain
  • the active environmental stress responsive transcription factor AREB1 gene including the region.
  • [4] Encodes a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid sequence from the 65th amino acid to the 277th amino acid is deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 [3] The active environmental stress response of [3] Transcription factor AREB 1 gene.
  • An active environmental stress responsive transcription factor of [3] or [4] consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of the AREB 1 gene.
  • AREB 1 gene an active environmental stress responsive transcription factor that encodes a protein having environmental stress responsive transcriptional activity.
  • the active environmental stress-responsive transcription factor AREB [3] consisting of a base sequence in which the base sequence from base 312 to base 950 is deleted in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. 1 gene.
  • Active environmental stress-responsive transcription factor of [6] DNA that can be hybridized under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence of the AREB 1 gene
  • An active environmental stress responsive transcription factor AREB 1 gene comprising a DNA encoding a protein having a transcriptional activity responsive to environmental stress in plants.
  • [1 0] A plant transformation vector comprising the gene of any one of [1] to [9].
  • FIG. 1A is a diagram relating to the domain analysis of AREB1 using the Arabidopsis thaliana T87 cell protoplasts, showing the effector plasmid and reporter plasmid constructs.
  • FIG. 1B is a diagram related to the domain analysis of AREB1 using protoplasts of Arabidopsis T87 cells, and shows the results of a transduction domain analysis of AREB1 with the N-terminal deleted.
  • Fig. 1C is a diagram related to the domain analysis of AREB1 using protoplasts of Arabidopsis T87 cells, and shows the results of AREBIAQT and AREB1 AP / RT transactivation.
  • FIG. 2A is a photograph showing the results of Northern analysis of active AREB1-expressing Arabidopsis thaliana.
  • FIG. 2B is a photograph showing the growth of activated AREB1-expressing Arabidopsis thaliana in GMK medium.
  • Figure 3 is a photograph showing the results of a dry stress tolerance test of active AREB1-expressing Arabidopsis thaliana.
  • Figure 4A shows a phylogenetic analysis of AREB1 homologous genes in Arabidopsis and rice It is a figure which shows the relative relationship of the AREB 1 homologous gene in the dicotyledonous Arabidopsis thaliana and the monocotyledonous rice by the phylogenetic tree.
  • Figure 4B is a photograph showing the gene expression profile of AEB, desiccation, salt, and water treatment of the AREB 1 homologous gene in Arabidopsis thaliana.
  • Fig. 4C shows gene expression profiles of AREB 1 homologous genes in rice after drying, salting, and low-temperature treatment.
  • FIG. 4D shows a comparison of the amino acid sequences of the transcriptional activation regions of the AREB 1 homologous gene in Arabidopsis and rice.
  • Active environmental stress-responsive transcription which lacks part or all of the activation control region of plant environmental stress-responsive transcription factor AREB 1 and contains an N-terminal transcriptional activation domain and DNA-binding domain
  • the factor AREB1 gene can be prepared by deleting the activation control region from the gene encoding plant AREB1.
  • environmental stress refers to dry stress, salt stress, low temperature stress, and the like.
  • plant AREB1 genes are P (about 60th amino acid from the first amino acid of AREB1 protein), Q (about 1st 16th amino acid from about 61st amino acid of AREB1 protein) , R (about 1st to about 199th amino acid from about 1 17th amino acid of AREB 1 protein), S (about 200th amino acid to about 263th amino acid from about 200th amino acid of AREB 1 protein), T (about 264th of AREB 1 protein) Can be divided into 6 regions: about 317 amino acids from amino acids of) and U (about 417 amino acids from about 318 amino acids of AREB 1 protein). Of these, the U region contains the DNA binding domain bZ IP, and the P region contains the transcriptional activation domain. The Q, R, S and T regions contain the activation control region.
  • the gene of the present invention contains at least the transcriptional activation 1 "region of the cocoon region and the DNA binding domain of the U region, and a part or all of the activation control regions of the Q, R, S and T regions are deleted. However, the function of the activation control region is lost, and the gene of the present invention has the function of the transcriptional active region including the transcriptional activation domain. Examples include at least one region of Q, R, S and T described above, for example, deletions from Q to ⁇ and from R to ⁇ . In addition, it is not always necessary to delete all of each region, and a part of each region may be deleted as long as the activation control function is lost.
  • Examples of the gene of the present invention include, for example, the amino acid sequence of amino acid 61 from amino acid 316 of amino acid sequence AREB1 derived from Arabidopsis thaliana represented by SEQ ID NO: 2, from amino acid 61 to amino acid 316, from amino acid 50 to 100, and from amino acid 61 to amino acid 70.
  • Examples include a gene encoding a protein lacking a continuous amino acid sequence of 100, 150, 200, 250, 300 or 350 starting from the first or amino acid at position 100 to position 130.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which the amino acid sequence from any amino acid at positions 60 to 70 to any amino acid at positions 270 to 280 is deleted, 60 A protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid sequence from any amino acid from the 100th amino acid to any amino acid from the 260th to the 320th is deleted, 260th to 320th from any amino acid from the 100th to the 130th.
  • a protein consisting of an amino acid sequence from which the amino acid sequence up to any of the amino acids is deleted, preferably a protein consisting of an amino acid sequence from which the amino acid sequence from the 65th amino acid to the 277th amino acid is deleted.
  • the gene of the present invention is a base sequence of position 270 to base 420, position 300 to base 330, or position 420 of the Arabidopsis thaliana AREB1 gene represented by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 Is a gene consisting of a base sequence lacking a continuous base sequence of 300, 450, 600, 750, 900 or 1050 starting from the base to the 510th base, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a gene lacking part or all of the activation control region is known gene It can be manufactured by a method of child operation.
  • PCR may be used to bind DNA encoding a transcriptional activation domain and DNA encoding a DNA binding domain (Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, San Diego). It is also possible to link both DNAs by the reciprocal priming method (Uhlmann, 1988, Gene 71: 29-40).
  • AREB1 that lacks part or all of the activation control region of plant environmental stress responsive transcription factor AREB1 and contains an N-terminal transcriptional activation domain and a DNA-binding domain is referred to as activated AREB1.
  • activated AREB1 AREB1 lacking the region from Q to T is referred to as AREBI A QT.
  • the gene of the present invention is a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added in the above amino acid sequence, and has a plant environmental stress-responsive transcription activity. It also includes genes that encode proteins.
  • severe means 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 5 or less, and particularly preferably 2 or 1.
  • a gene comprising a DNA that can hybridize under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA comprising the base sequence of the above gene also has an environmental stress-responsive transcriptional activity of the plant.
  • the stringent condition is that the formamide concentration is 30-50%, 37-50 ° C, 6 X SSC, preferably the formamide concentration is 50%, 42 ° C, 6 X SSC. Review the conditions.
  • a mutation introduction kit for example, site-directed mutagenesis
  • a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method equivalent thereto
  • Mutant-K manufactured by TAKARA
  • Mutant-G manufactured by TAKARA
  • LA PCR invitro Mutagenes is series kit from TAKARA.
  • the plant species from which the gene of the present invention is derived is not limited, and dicotyledonous plants such as Arabidopsis thaliana
  • An AREB1 orthologue gene that lacks the activation control region and contains an N-terminal transcriptional activation domain and a DNA binding domain.
  • the activation control region is deleted and the N-terminal transcriptional activation Includes genes containing main and DNA binding domains.
  • the region to be deleted is a region corresponding to the region to be deleted in the Arabidopsis AREB1 gene, and such a region corresponds to the AREB1 gene derived from Arabidopsis thaliana. This can be determined by aligning the orthologue gene of AREB1 derived from other species.
  • Figure 4D shows the alignment of partial amino acid sequences in the transcriptional active region of Arabidopsis thaliana AREB 1 protein and rice AREB1 (OsAREB 1) protein.
  • OsAREBl The base sequence of OsAREBl is shown in SEQ ID NO: 10 and the amino acid sequence of OsAREBl is shown.
  • the P region is from the first methionine to the 63rd glutamic acid,
  • the Q region is the 64th serine to the 126th serine
  • the R region is the 127th threonine to the 192th leucine
  • the S region is the 193rd phenylenolanine to the 236th serine
  • the T region is the 237th asparagine to the 276
  • the second glutamic acid, U region is
  • the gene of the present invention is the amino acid sequence of amino acids 64 to 357 of the amino acid sequence of the OsAREBl protein derived from rice represented by SEQ ID NO: 10, 50th to 100th, 60th And a gene encoding a protein lacking a continuous amino acid sequence of 100, 150, 200, 250 or 300 starting from the 70th or 100th to 130th amino acids, for example, represented by SEQ ID NO: 2.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which the amino acid sequence from any amino acid at positions 60 to 70 to any amino acid at positions 270 to 280 in the amino acid sequence to be deleted is 60;
  • Protein consisting of an amino acid sequence deleted from any amino acid from the 100th amino acid to any amino acid from 260 to 290, 260 ⁇ 290th from any amino acid from the 100th to 130th A protein consisting of an amino acid sequence from which the amino acid sequence up to any of the amino acids is deleted. Preferably, it is a protein consisting of an amino acid sequence from which the amino acid sequence at positions 64 to 276 has been deleted.
  • the gene of the present invention is a base sequence of the OsAREBl gene of rice represented by SEQ ID NO: 9, from the 360th base to the 520th base, from the 390th base to the 430th base, or from the 510th position. 300 consecutive bases starting from the base to the base at position 610,
  • a gene consisting of a nucleotide sequence from which any nucleotide sequence from any of the 390-420th bases to any of the 1030-1060th bases is deleted, and the 390-510th positions
  • a gene consisting of a base sequence from which any base sequence from any base to any of bases from 1000 to 1090 is deleted, or any base from 510 to 600 to any base from 1000 to 90 Includes genes consisting of nucleotide sequences with missing nucleotide sequences.
  • it is a gene consisting of a base sequence from which positions 406 to 1045 are deleted.
  • the transcriptional activation ability of the protein of the present invention can be analyzed by using a transactivation experiment method using an Arabidopsis protoplast ⁇ system.
  • AREB cDNA is ligated to pBI221 plasmid (manufactured by Cl one tech) containing CaMV35S promoter to construct an effector plasmid.
  • a DNA fragment containing ABRE is ligated further upstream of the TATA promoter upstream of the ⁇ _dalcronidase (GUS) gene to construct a reporter plasmid.
  • the two plasmids are then introduced into Arabidopsis protoplasts, and then GUS activity is measured. If an increase in GUS activity is observed by simultaneously expressing the AREB1 protein, it indicates that transcription is activated through the sequence of the AREB 1 protein power ABRE expressed in the protoplast.
  • preparation of a protoplast and introduction of plasmid DNA into the protoplast may be performed by the method of Abel et al. [Abel, S .: Plant J. 5: 421-427 (1994)]. it can.
  • the 3-glucuronidase activity was determined by the method of Jefferson et al. [Jeff erson, RA: E BO J. 83: 8447-8451 (1986)], and the luciferase activity was determined by PiCaGene Luciferase Atase Kit (Toyo-Ink). ) Can be used for measurement.
  • Wild-type AREB1 does not induce the transcriptional activity of the gene downstream of ABRE unless it is in the presence of abscisic acid, but the active AREB1 of the present invention can induce the transcriptional activity of the gene downstream of ABRE even in the absence of abscisic acid.
  • Transgenic plants having resistance can be produced.
  • methods for introducing the gene of the present invention into a plant host include indirect introduction methods such as an agrobacterium infection method, direct introduction methods such as a particle gun method, a polyethylene glycol method, a ribosome method, and a microinjection method. Is mentioned.
  • the transgenic plant of the present invention can be produced as follows.
  • a recombinant vector for introduction into a plant is obtained by cleaving DNA containing the gene of the present invention with an appropriate restriction enzyme, ligating an appropriate linker as necessary, and inserting it into a cloning vector for plant cells.
  • Cloning vectors include pBE2113Not, pBI21 13Not, pBI21 13, pBI 101, pBI 121, pGA482, pGAH, pBIG, and other binary vector vectors such as pLGV23Neo, pNCAT, and pM0N200. Can be used.
  • the target gene is inserted between the boundary sequences (LB, RB) of the above binary vector, and this recombinant vector is amplified in E. coli.
  • the amplified recombinant vector is introduced into Agrobacterium 'Tumefaciens C58, LBA4404, EHA101, C58ClRif', EHA105, etc. by freeze-thaw method, electrorevolution method, etc. Is used for transduction of plants.
  • an agrobacterium for plant infection containing the gene of the present invention is prepared by a triple joining method [Nucleic Acids Research, 12: 871 1 (1984)]. can do. That is, by culturing on a medium containing rifampicillin and kanamycin by culturing a mixed culture of Escherichia coli having a plasmid containing the target gene, Escherichia coli having a helper plasmid (for example, pRK2013, etc.), and agrobacterium. It is possible to obtain a conjugated agrobacterium for plant infection.
  • promoters that can be used in the present invention include 35S transcripts derived from the force reflower mosaic cherry (CaMV) [Jefferson, RA et al .: The EMBO J 6: 3901-3907 (1987)], corn ubiquitin [Chr i stensen, AH et al .: Pl ant Mol. Biol.
  • nopaline synthase (NOS) gene nopaline synthase (NOS) gene
  • OCT tobin synthase gene promoter and the like
  • the terminator sequence includes, for example, the force reflower mosaic virus-derived nopaline synthase gene-derived terminator.
  • promoters and terminators that are known to function in plants are not limited to these.
  • the promoter used is a promoter responsible for the constitutive expression of the target gene (such as the CaMV35S promoter), and if this causes delayed growth or hatching in the transgenic plant, transient expression of the target gene Promoters such as rd29A gene promoter can be used.
  • an intron sequence having a function of enhancing gene expression between the promoter sequence and the gene of the present invention for example, an intron of maize alcohol dehydrogenase (Adhl) [Genes & Development 1: 1] 183-1200 (1987)] can be introduced.
  • an effective selectable marker gene in combination with the gene of the present invention in order to efficiently select a target transformed cell.
  • the selection markers used at that time include the kanamycin resistance gene ( ⁇ ), the hygromycin phosphotransferase (htp) gene that confers resistance to the antibiotic hygromycin, and the resistance to bialaphos.
  • htp hygromycin phosphotransferase
  • bar phosphinothricin acetyltransferase
  • the gene of the present invention and the selectable marker gene may be incorporated together into a single vector, or two types of recombinant DNAs incorporated into separate vectors.
  • the host of the transformant of the present invention is not particularly limited, but is preferably a plant.
  • the plant is a plant cultured cell, the whole plant of a cultivated plant, a plant organ (eg, leaf, petal, stem, root, rhizome, seed, etc.), or a plant tissue (eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, fiber) Any of tube bundles etc. may be used.
  • Plant species are not limited, dicotyledonous plants, rice, corn Monocotyledonous plants such as shrimp and wheat can be used.
  • the plant to be transformed is a dicotyledonous plant, it is preferable to introduce the gene of the present invention derived from a dicotyledonous plant such as Arabidopsis thaliana. If the plant to be transformed is a monocotyledonous plant, it will be multifactorial such as rice. It is preferable to introduce a plant-derived gene of the present invention.
  • the DNA encoding the protein of the present invention can be obtained by adding the vector to the collected plant section using the agrobacterium infection method, particle gun method or polyethylene da It can be introduced by the recall method to transform plant hosts. Alternatively, a transformed plant can be produced by introducing it into the Protoplast IV by the electroporation method.
  • transgenic gene plant introduced with the gene of the present invention can be obtained.
  • transgenes are introduced into the genome of host plants in the same way, but there is a phenomenon called position effect ⁇ where the expression of the transgene differs depending on the location of the transgene.
  • Transformants in which the transgene is expressed more strongly can be selected by assaying by the Northern method using the DNA fragment of the transgene as a probe.
  • the expression level and expression site of the gene are extracted from these cells and tissues according to a conventional method, and a known RT-PCR method or Northern analysis is used. This can be done by detecting the mRNA of the introduced gene.
  • the gene product of the present invention can be directly analyzed by Western analysis using an antibody against the gene product.
  • a gene whose expression level is considered to be altered by the action of the transcription factor of the present invention can be identified by Northern hybridization.
  • a plant grown by hydroponics is given an environmental stress for a predetermined period (for example, 1 to 2 weeks).
  • Environmental stresses include drying, salt, and low temperature.
  • the load of dry straw can be given by removing a plant body from hydroponics and drying it on a filter paper for 10 minutes to 24 hours.
  • the salt stress load can be applied by changing to a 50 to 500 mM NaCl solution and holding for 10 minutes to 24 hours, for example.
  • the low temperature stress can be applied by holding at -15 to 5 ° C for 10 minutes to 24 hours.
  • the load temperature of the low temperature stress can be appropriately determined according to the plant species, the growth stage of the plant, and the like.
  • RNA is prepared from a control plant that does not receive stress and a plant that receives environmental stress, it is electrophoresed, and Northern Hybridization is performed using the probe of the gene that you want to express. The pattern can be analyzed.
  • the resistance of environmentally-stressed lance genie plants introduced with the gene of the present invention is that, for example, trangene plants are planted in plant pots containing soil including vermiculite and pearlite, and various environmental stresses are loaded. If you have And can be evaluated by.
  • environmental stress include drying, salt, and low temperature.
  • resistance to dry stress can be assessed by examining its survival without water for 2-4 weeks.
  • the salt stress can be evaluated by, for example, standing at 100 to 600 mM NaCl for 1 hour to 7 days, growing at 20 to 35 ° C. for 1 to 3 weeks, and examining its survival rate.
  • low-temperature stress is kept at -15 to 5 ° C for 30 minutes to 10 days, then grown at 20 to 35 ° C for 2 to 3 weeks, and the survival rate is examined. Can be evaluated.
  • the transcription level of the gene of the present invention can be determined by RNA gel blot analysis, quantitative PCR, or the like.
  • a probe used for RNA gel plot analysis can be prepared by a known method based on the region of 100 to 1000 bp containing the gene of the present invention and Z or a specific sequence adjacent to the gene.
  • the primer used for quantitative PCR can be prepared using a known method based on the sequence of the coding region of the gene of the present invention or the region adjacent thereto.
  • Plants (Arabidopsi s thaliana ecotype Columbia) are exposed to light in the light period of 16 hours / dark period of 8 hours (40 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ photons / m 2 / s) in Osakabe et al. (2005, Plant Cel 17, 17, 1). 105-1 119) and grown on GM agar for 2-3 weeks (2005, Plant Cell
  • T87 cultured cells of Arabidopsis thaliana were maintained and managed according to the method of Satoh et al. (2004, Plant Cell Physiol. 45, 309-317).
  • the Arabidopsis AREB1 T-DNA insertion mutant (SALK_002984; Col-0 ecotype) Obtained from the Arabidopsis Biological Resource Center, Columbus, Oklahoma, USA. Information on this T-DNA insertion mutant can be found at http: // ⁇ signal, salk at the Balk Institute Genomic Analysis Laboratory in Lifonia, USA. obtained from edu).
  • the T-DNA insertion site into the AREB1 gene is determined by T-DNA left border primer 5'-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3 '(SEQ ID NO: 3) and AREB1-specific primer 5'-TCAAGCTCCACGGTGTAAGCC-3' ( This was confirmed by PCR using SEQ ID NO: 4).
  • an analysis using RT-PCR was performed according to the method of Ito and Shinozaki (2002, Plant Cell Physiol. 3, 1285-1292), and it was confirmed that the AREB1 gene was not expressed in the areblT-DNA insertion mutant. .
  • RNA genomic blot analysis were prepared according to the method of Maruyama et al. (2004, Plant J. 38, 982-993).
  • Transient expression analysis using protoplasts derived from Arabidopsis T87 cells was performed by Fujita et al. (2004, Plant J. 39, 863-876) and Satoh et al. (2004, Plant Cell Physiol. 45, 309-317). A method with some modifications was used. Protoplast isolation and gene transfer were all performed at room temperature (25-28 ° C). The protoplasts into which the gene had been introduced were allowed to stand at 22 ° C for 16-20 hours.
  • Enzyme solution (0.4 M mannitol, 1.5% (w / v) eel lulase Onozuka -10 (Yakult, Tokyo, Japan), 0.3% (w / v) macerozyme R-10 (Yakult), 0.1% (w / v) bovine serum albumin, 10 mM CaC ⁇ ,
  • a DNA fragment containing part or all of the EB1 cDNA is amplified by PCR and cloned into the Notl site of the expression vector pBI35SQ (Abe et al., 1997, Plant Cell 9, 1859-1868). With a bZIPDNA binding domain Were used for transient expression analysis experiments.
  • self-binding ligase reaction was performed after partial cleavage with EcoT14I.
  • the resulting PBI35S Q-AREB1 ⁇ QT is a plasmid with an internal deletion (amino acid residues 65-277) spanning the Q to T region.
  • Two DNA fragments containing part of the AREBl cDNA were generated by PCR using the following two sets of primers: forward primer A, 5'-GGGGCGGCCGCATGACACAAGCCATGGCTAGTG-3 '( ⁇ ⁇ ' J number 5); reverse primer A, 5 '-GCAGAAGCACCTTGACTTCCCCCTACTCCAC-3' ( ⁇ ⁇ ⁇ IJ number 6); forward prime B, 5 '-GTAGGGGGAAGTCAAGGTGCTTCTGCTGC-3' (layout IJ number 7); (SEQ ID NO: 8).
  • the resulting fragments A and B were mixed in a PCR tube, denatured at 94 ° C for 10 minutes, annealed, and then subjected to a polymerase reaction at 72 ° C for 3 minutes.
  • the DNA fragment amplified with forward primer A and reverse primer B was introduced into pBI35S ⁇ .
  • the resulting pBI35S Q-AREB1 ⁇ ⁇ / RT is a plasmid with two internal deletions (amino acid residues 1-60 and 117-277).
  • Expression plasmids (p35S-562) and GAL4-GUS reporter plasmids (pGUS-558) with GAL4DNA binding domains bound to GAL4-activated domains were transferred from Prof. Tsutsuho Hattori (Nagoya University, Japan). Things were used.
  • the expression plasmid having the GAL4 binding domain used in the transient expression analysis experiment was prepared by cloning a PCR fragment containing a part of the AREBl cDNA into the BamHI / SacI site of the expression vector p35S-562.
  • pBE21 13Not-AREB1 ⁇ QT was prepared by amplifying the coding region of AREB1 ⁇ 0 ⁇ by PCR using primers with Xbal and BamHI linkers and introducing it into the Xbal / BamHI site of pBE2113Not in the sense direction.
  • the transformation vectors pBE2113Not-AREB1 and pBE2113Not_AREBl ⁇ QT were used by aspiration infiltration method using C58 strain of Agrobacterium tumefaciens (Osakabe et al., 2005 , Plant Cell 17, 1105-1119) in Arabidopsis (Columbia).
  • the drought tolerance test was carried out using the method of Sakamoto et al. (2004, Plant Physiol. 136, 2734-2746) with some modifications.
  • the plants were grown under the conditions of lighting at 16 hours in the light period and 8 hours in the dark period (50 soils 10 / mol photons / m 2 / s), 22 soils 1 ° C, relative humidity 35, 5%. . Dry stress was applied by stopping the water supply to these plants for 12 days.
  • Plants grown in 2-3 weeks after seeding on GM agar were used for the survival test of plants in a rapidly dry state. These plants were carefully wiped from the agar medium and transferred to a Petri dish (with the lid removed). Then, it was dried for a certain time, and water supply was performed after the drying process was completed. Survival test under acute drought conditions, was carried out under the conditions of 9 Sat l / mol photons / s / m 2 at illumination conditions under 25 Sat 2 ° C (relative humidity 20% soil 10%). After re-watering, move the whole Petri dish to the plant culture room and leave it at 22 ⁇ 2 ° C under continuous light (50 soil 5 imol photons / s / m 2 ) for 1 to 3 days.
  • the inventor showed that in Arabidopsis protoplasts, the AREB1 protein activated transcription of the RD29B promoter-GUS fusion gene (RD29B-GUS) (Uno et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11632-11637).
  • RD29B-GUS RD29B promoter-GUS fusion gene
  • the present inventor has developed a plasmid that constitutively expresses a defective AREB1 having a deletion at the N-terminus with the 35S promoter of cauliflower mosaic virus. It was fabricated (Fig. 1).
  • This reporter plasmid has a sequence in which five 77 base pairs containing two ABREs in the RD29B promoter are arranged in series and connected to the GUS reporter gene ( Figure 1A).
  • Figure 1A shows the effector and reporter plasmid constructs.
  • a 77-bp ABRE sequence which is the RD29B promoter, was repeated 5 times upstream of the GUS gene.
  • the promoter is -51RD29Biminima lTATA Promoter 1 ⁇ -Connected upstream of the GUS construct.
  • Nos-T is a nopaline synthase terminator.
  • the effector plasmid one obtained by inserting the full length of AREB1 or a part containing the bZIP DNA binding domain downstream of the CaMV35S-TMV ⁇ sequence was used. These two plasmids were simultaneously introduced into Arabidopsis thaliana T87 cell protoplasts.
  • the AREB1 protein synthesized in the protoplast binds to the ABRE sequence of the reporter plasmid and induces transcription of the downstream GUS gene.
  • the transcription-inducing activity of the AREB1 protein can be determined by measuring the activity of the GUS protein.
  • Figure 1B shows the results of a transactivation domain analysis of AREB1 with the N-terminal deleted.
  • the protoplasts were simultaneously transfected with the RD29B-GUS reporter construct and the effector construct ⁇ .
  • the vector is pBI-35S Q. Relative activity is expressed in fold relative to pBI-221-35S Q control.
  • the numbers above Figure 1B indicate the amino acid numbers.
  • P, Q, R, S, T, and U represent partial regions of AREB1 cDNA, and black portions of P, Q, R, and U regions represent conserved regions.
  • AREB1 The full-length AREB1 protein showed a marked increase in GUS activity in the presence of 50 ⁇ M abscisic acid (ABA), indicating that AREB1 functions to activate transcriptional induction of AREB1.
  • ABA abscisic acid
  • the present inventor further investigated whether a mutant protein having the AREB1 P region and the binding domain activates transcription of the RD29B-GUS reporter gene in the absence of external ABA.
  • expression plasmids we prepared AREBI A QT and AREB1 ⁇ P / RT, which had the bZIP DNA binding domain of AREB1 and the P or Q region, respectively (Fig. 1C).
  • Figure 1
  • AREB1 AP / RT and other AREB1 mutants lacking the N-terminus had significantly reduced transcriptional activation ability compared to vector control in the presence of ABA.
  • the decrease in transcriptional activation ability seen in these mutants is due to the preferential binding of AREB1 AP / RT and AREB1 mutants lacking the N-terminus to the ABRE motif in the reporter plasmid. This is thought to be due to the fact that the ABA-inducible endogenous transcription factor inherent in plant cells prevented the binding to the ABRE motif (Fig. 1B and Fig. 1C).
  • the deletion mutant in the P region hardly suppressed the activation of the reporter gene in the presence of ABA. This may be because the sequence of the deletion mutant in the P region has some specific effects.
  • the present inventor has so far described two AREB1 proteins in the RD29B promoter.
  • a transformed plant was prepared by expressing QT cDNA with the cauliflower mosaic virus 35S promoter.
  • the expression of the transgene ABREI AQT and the downstream gene RD29B was analyzed without any stress treatment.
  • a line in which no ABA was added externally in all transformation lines examined As a result, the accumulation levels of ABREI A QT and RD29B increased.
  • Eight lines with high expression levels of ABRE1 A QT were selected for phenotypic analysis.
  • the phenotype of these 8 lines was the same, so different lines were sometimes used depending on the experiment.
  • Figure 2 shows the results of wild-type, vector control RNA gel plot analysis. In the experiment of Fig.
  • AREB 1 ⁇ ⁇ active AREB 1
  • AREB 1 ⁇ ⁇ active AREB 1
  • ⁇ ⁇ active AREB 1
  • FIG. 2A shows the results of Northern analysis. Each lane contains 10 g of total RNA. The bottom row is a control stained with ethidium bromide.
  • Northern analysis confirmed the expression of the downstream gene RD29B, which has an ABRE sequence in the promoter region only in the presence of 50 ⁇ M ABA in wild type (WT) and vector control plants (vector).
  • ABREI A QT overexpressed in plants activated transcription of RD29B, a downstream gene, in the absence of external ABA. From this result, ABRE1 A QT is a constitutively active form of ABRE1 in the whole plant, and the P region at the N-terminus of ABRE1 functions as a transcriptional activation domain in the plant as well as Protoplus ⁇ . It was shown that
  • Fig. 2B shows the growth in GMK medium containing 1% sucrose in the photograph 3 weeks after seeding.
  • 35S-ABRE1 A QT plants were slightly smaller than the wild type, but the 35S-ABRE1 plants showed a phenotype similar to the wild type for growth.
  • Microarray analysis was performed using activated AREB1-expressing Arabidopsis thaliana (35S-AREBI A QT).
  • Agilent's Arabidopsis 2 Oligomicroarray which is capable of examining the expression profile of more than 85% of Arabidopsis genes, was used.
  • 8 genes were expressed more than 4 times higher than the vector control plants (Table 1).
  • Four of the eight downstream genes were LEA protein genes involved in water stress resistance, and the remaining four were signal control-related genes. These downstream genes were both ABA and a drought-inducible gene, and two or more ABRE sequences necessary for the binding of AREB1 protein were present in the promoter region.
  • Fig. 4 shows a phylogenetic tree showing the relationship between AREB1 homologous genes in dicotyledonous Arabidopsis and monocotyledonous rice.
  • Figure 4B shows the results in Arabidopsis
  • FIG. 4C shows the gene expression profile of AREB1 homologous genes in rice during drying, salt and cold treatment. In the experiment, we used plants grown for 2 weeks after sowing and showed gene expression by microarray method. The expression level is the control plant It is shown by the magnification when. Numbers indicate processing time.
  • FIG. 4D shows a comparison of the amino acid sequences of the transcriptional activation regions of the AREB1 homologous gene in Arabidopsis thaliana and rice. Industrial applicability
  • the plant of the present invention lacks the activation control region of the environmental stress-responsive transcription factor AREB1, such as dry stress, salt stress, and low-temperature stress, and has an N-terminal transcriptional activation domain and DNA-binding domain. Introducing the over-expressed AREB1 gene, an active environmental stress-responsive transcription factor, including plants, can improve the drought / salt / cold tolerance of plants.
  • AREB1 environmental stress-responsive transcription factor

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Abstract

　植物体内で高発現することにより、植物の乾燥・塩・低温等の環境ストレス耐性を向上させる活性型AREB１の提供ならびに該活性型AREB1を利用して植物の環境ストレス耐性を向上させる方法の提供。　植物の環境ストレス応答性転写因子AREB１の活性化制御領域を欠失し、Ｎ末端の転写活性化ドメインおよびDNA結合ドメインを含む、活性型の環境ストレス応答性転写因子AREB１遺伝子。

Description

活性型 AREB1により植物の乾燥ストレス耐性を向上させる方法 技術分野
本発明は乾燥ス トレス耐性を制御するタンパク質 AREB1の活性型およびその利 用法に関する。
明
背景技術
水の欠乏はあらゆる生命に対して致死的な書ダメージを与える。 このため、 植物 は乾燥ス トレス等の環境ストレスに対応するための複雑なシグナル伝達ネッ トヮ ーク機構を発達させ、 致死的な傷害を回避している。
植物ホルモンであるアブシジン酸（ABA)は植物において種々の機能を有してお り、 環境ス トレスへの適応応答にも関与している。 アブシジン酸は、 水欠乏条件 下で合成され、 乾燥ス ト レスへの応答に対して重要な役割を果たしている。 乾燥 ストレスにより誘導される多くの遺伝子が知られており、 それらの多くはアブシ ジン酸により活性化される。 そのようなアブシジン酸により制御される遺伝子の プロモーターとして ABRE (ABA— respons i ve el ement)力知られてレヽる。
AREB は、 ABRE に結合するタンパク質として最初にシロイヌナズナにおいて AREB AREB2および AREB3が報告された （非特許文献 1参照）。 現在までにシロ ィヌナズナで AREB1/ABF2、 AREB2/ABF4、 AREB3/DPBF3、 ABF1、 ABF3/DPBF5、 ABI5/DPBF EEL/DPBF4、 DPBF2および AT5G42910の 9個の AREBのホモログが報 告されている （非特許文献 1〜8参照）。 AREBは ABAによる遺伝子発現を転写す る制御因子であり、 乾燥 ·塩 ·低温ス トレス耐性遺伝子を制御する因子として知 られており、 乾燥 ·塩 ·低温ストレス耐性の制御に関して DREBと二分する機能を 有している。 AREB1は、 ABREに結合しその下流のストレス応答性遺伝子の発現を 誘導することにより、 植物に乾燥 ·塩 ·低温ストレス応答性を付与するが、 植物 体内でそのまま高発現しても下流のス ト レス応答性遺伝子の発現を誘導しない。 AREB 1 の活性化には、 ス トレス誘導性のスプライシングおよび AREB 1 タンパク質 のリン酸化が必要であると考えられている,
非特許文献 1 Uno et al .， Proc. Na tl. Acad. Sc i . USA97, 11632—11637
(2000)
非特許文献 2 Choi et al. , J， Biol . Chem. 275， 1723-1730 (2000) 非特許文献 3 Finkelstein et al . , Plant Cel l 12, 599 - 609 (2000) 非特許文献 4 Lopez-Mol ina et a l . , Plant Cel l Phys iol . 41, 541-547
(2000)
非特許文献 5 Bensmihen et al . , Plant Cel l 14， 1391-1403 (2002) 非特許文献 6 Jakoby et al . , Trends plant Sci . 7， 106-111 (2002) 非特許文献 7 Kim et al . , Plant Phys iol. 130, 688—697 (2002) 非特許文献 8 Suzuki et al . , Plant Phys iol. 132, 1664—1677 (2003) 発明の開示
本発明は、 植物体内で高発現することにより、 植物の乾燥 ·塩 ·低温ス ト レス 耐性を向上させる活性型 AREB1の提供ならびに該活性型 AREB1を利用して植物の 乾燥 ·塩 ·低温ストレス耐性を向上させる方法の提供を目的とする。
本発明者は、 AREB1 の詳細なドメイン解析を行い、 AREB1 の転写活性化ドメイン が N末端のァミノ酸 1-60の領域であると特定した。 また、 転写活性化ドメインと
DNA 結合ドメインの間の活性化制御領域（ァミノ酸 65-277)を削除すると、 AREB1 が恒常的な活性型に変化することを見出した。 この活性型 AREB1を導入したシロ ィヌナズナを用いてマイクロアレイ解析を行い、 AREB1 のターゲッ ト遺伝子を解 析すると種々のス ト レス耐性遺伝子が高発現していることが示された。 また、 活 性型 AREB1導入シロイヌナズナのストレス耐性試験を行い、 乾燥ス トレス耐性が 向上していることを確認した。 さらに系統樹解析をもとにして、 AREB1 のホモ口 グであるシロイヌナズナの AREB2および ABF3が ABAシグナルを介した乾燥 ·塩 · 低温ス ト レス応答性の遺伝子であることを同定した。 さらに双子葉植物のシロイ ヌナズナにとどまらず、 単子葉植物のイネにおいても乾燥 ·塩 ·低温ス トレス応 答性の相同性遺伝子 OsAREBlの同定に成功した。 今回特定した N末端領域は、 植 物種にかかわらず相同性がきわめて高い領域であり、 活性型 AREB1 を作出するの に用いた手法は、 広く多様な植物種に適用できると考えられる。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
[ 1 ] 植物の環境ス トレス応答性転写因子 AREB1の活性化制御領域の一部また は全部を欠失し、 N末端の転写活性化ドメインおよび DNA結合ドメインを含む、 活性型の環境ス トレス応答性転写因子 AREB 1遺伝子。
[2] 植物の環境ス トレス応答性転写因子の Q、 R、 Sおよび T領域の少なく とも 1つの領域を欠失し、 Ν末端の転写活性化ドメインを含む Ρ領域および DNA結合 ドメインを含む U領域を含む、 活性型の環境ストレス応答性転写因子 AREB1遺伝 子。
[3] シロイヌナズナ由来である [ 1 ]または [2]の活性型の環境ス トレス応答性 転写因子 AREB1遺伝子。
[4] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 65 番目のアミノ酸から 277 番目のアミノ酸までのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質 をコードする [3]の活性型の環境ス トレス応答性転写因子 AREB 1遺伝子。
[5 ] [3 ]または [4]の活性型の環境ス ト レス応答性転写因子 AREB 1遺伝子の アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加され たアミノ酸配列からなり、 植物の環境ストレス応答性転写活性を有するタンパク 質をコードする活性型の環境ストレス応答性転写因子 AREB 1遺伝子。
[6] 配列番号 1で表される塩基配列において 312位の塩基から 950位の塩基ま での塩基配列が欠失した塩基配列からなる [3]の活性型の環境ストレス応答性転 写因子 AREB 1遺伝子。
[ 7] [ 6 ]の活性型の環境ス トレス応答性転写因子 AREB 1遺伝子の塩基配列か らなる DNAに相捕的な塩基配列からなる DNAとス トリンジヱン卜な条件下でハイ ブリダイズしうる DNAであって、 植物の環境ストレス応答性転写活性を有するタ ンパク質をコードする DNAからなる活性型の環境ストレス応答性転写因子 AREB 1 遺伝子。
[8 ] イネ由来の環境ス ト レス応答性転写因子 OsAREBl の活性化制御領域を欠 失し、 転写活性化ドメインおよび DNA結合ドメインを含む、 活性型の環境ス トレ ス応答性転写因子 AREB 1遺伝子。 [9] 環境ス ト レスが乾燥ス ト レス、 塩ス トレスまたは低温ス ト レスである [ 1 ] 〜[ 8]のいずれかの活性型の環境ス トレス応答性転写因子 AREB 1遺伝子。
[ 1 0] [ 1 ]〜[9 ]のいずれかの遺伝子を含む植物形質転換用ベクター。
[ 1 1 ] [ 1 0]の植物形質転換用ベクターで形質転換された環境ス ト レス耐性が 向上したトランスジヱニック植物。
[ 1 2] [ 1；！〜 [9]のいずれかの遺伝子を植物に導入することにより、 該植物の 環境ス ト レス耐性を向上させる方法。
[ 1 3] 環境ス トレス耐性が、乾燥耐性、塩耐性および または低温耐性である、 [ 1 2]の環境ス ト レス耐性を向上させる方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-318871号の明細書 および または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1Aは、 シロイヌナズナ T87細胞のプロ トプラストを用いた AREB1のドメイ ン解析に関する図であり、 エフェクタープラスミ ドとリポータープラスミ ドのコ ンストラク トを示す図である。
図 1 Bは、 シロイヌナズナ T87細胞のプロ トプラストを用いた AREB1 のドメイ ン解析に関する図であり、 N末端を欠失させた AREB1 の トランスァクチべ一ショ ンドメイン分析の結果を示す図である。
図 1 Cは、 シロイヌナズナ T87細胞のプロ トプラストを用いた AREB1のドメイ ン解析に関する図であり、 AREBIAQTおよび AREB1 AP/RT のトランスァクチべ一 ションの結果を示す図である。
図 2Aは、 活性型 AREB1発現シロイヌナズナのノーザン解析の結果を示す写真 である。
図 2Bは、 活性型 AREB1発現シロイヌナズナの GMK培地での生育を示す写真で ある。
図 3は、 活性型 AREB1発現シロイヌナズナの乾燥ス ト レス耐性試験の結果を示 す写真である。
図 4Aは、 シロイヌナズナとイネにおける AREB1相同遺伝子の系統樹解析を示 す図であり、 双子葉植物のシロイヌナズナと単子葉植物のイネにおける AREB 1相 同遺伝子の類縁関係を系統樹により示す図である。
図 4 Bは、 シロイヌナズナにおける AREB 1相同性遺伝子の ABA、 乾燥、 塩、 およ び水処理における遺伝子発現プロファイルを示す写真である。
図 4 Cは、 イネにおける AREB 1相同性遺伝子の乾燥、 塩および低温処理におけ る遺伝子発現プロファイルを示す図である。
図 4 Dは、 シロイヌナズナとイネにおける AREB 1相同遺伝子の転写活性化領域 のアミノ酸配列の比較を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
1 . 本発明の遺伝子
植物の環境ス トレス応答性転写因子 AREB 1の活性化制御領域の一部または全部 を欠失し、 N末端の転写活性化ドメインおよび DNA結合ドメインを含む、 活性型 の環境ス 卜レス応答性転写因子 AREB1遺伝子は、 植物の AREB 1をコードする遺伝 子から、活性化制御領域を欠失させることにより作製することができる。ここで、 環境ス ト レスとは乾燥ス トレス、 塩ス トレス、 低温ス トレス等をいう。
植物の AREB1遺伝子は、 図 1 Bに示すように、 P (AREB1タンパク質の 1番目の アミノ酸から約 60番目のアミノ酸）、 Q (AREB1 タンパク質の約 61番目のァミノ 酸から約 1 16番目のアミノ酸）、 R (AREB 1 タンパク質の約 1 17番目のアミノ酸か ら約 199番目のアミノ酸）、 S (AREB 1 タンパク質の約 200番目のアミノ酸から約 263番目のアミノ酸）、 T (AREB 1 タンパク質の約 264番目のアミノ酸から約 31 7 番目のァミノ酸） および U (AREB 1タンパク質の約 318番目のァミノ酸から約 417 番目のアミノ酸） の 6つの領域に分けることができる。 このうち、 U 領域は DNA 結合ドメインである bZ IPを含み、 P領域は転写活性化ドメインを含む。 Q、 R、 S および T領域は活性化制御領域を含む。
本発明の遺伝子は、 このうち少なく とも Ρ領域の転写活 1 "生化ドメインおよび U 領域の DNA結合ドメインを含み、 Q、 R、 Sおよび T領域の活性化制御領域の一部 または全部を欠失し、活性化制御領域の機能が失われている。本発明の遺伝子は、 転写活性化ドメインを含む転写活性領域がその機能を有している。 欠失領域とし ては、 例えば上記の Q、 R、 Sおよび Tの少なく とも 1つの領域が挙げられ、 例え ば、 Qから Τまで、 Rから Τまでの欠失が挙げられる。 また、 各領域の全てが欠失 している必要は必ずしもなく、 活性化制御機能が喪失している限り、 各領域の一 部が欠失していてもよい。 本発明の遺伝子として、 例えば、 配列番号 2で表され るシロイヌナズナ由来の AREB1タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸 61番目のァ ミノ酸から 316番目のアミノ酸のうち、 50番目から 100番目、 61番目から 70番 目または 100番目から 130番目のアミノ酸から始まる連続した 100、 150、 200、 250、 300または 350のァミノ酸配列を欠失したタンパク質をコードする遺伝子が 挙げられる。例えば、配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 60〜70番目の いずれかのァミノ酸から 270〜280 番目のいずれかのァミノ酸までのァミノ酸配 列が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、 60〜100 番目のいずれかのアミ ノ酸から 260〜320 番目のいずれかのアミノ酸までのアミノ酸配列が欠失したァ ミノ酸配列からなるタンパク質、 100〜 130番目のいずれかのアミノ酸から 260〜 320 番目のいずれかのァミノ酸までのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列から なるタンパク質等があり、好ましくは 65番目のアミノ酸から 277番目のアミノ酸 までのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質をコ一ドする遺 伝子が挙げられる。
また、 本発明の遺伝子は配列番号 1で表されるシロイヌナズナの AREB1遺伝子 の塩基配列において第 270位の塩基から 420位の塩基、 第 300位の塩基から 330 位の塩基、 または第 420位の塩基から 510位の塩基までの塩基から始まる連続し た 300、 450、 600、 750、 900または 1050の塩基配列を欠失した塩基配列からなる 遺伝子であり、例えば、配列番号 1で表される塩基配列において 300〜330位のい ずれかの塩基から 920〜960 位のいずれかの塩基までの塩基配列が欠失した塩基 配列からなる遺伝子、 300〜420位のいずれかの塩基から 1000〜1080位のいずれ かの塩基までの塩基配列が欠失した塩基配列からなる遺伝子または 420〜510位 のいずれかの塩基から 1000〜1080 位のいずれかの塩基までの塩基配列が欠失し た塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。 好ましくは 312位の塩基から 950位の 塩基を欠失した塩基配列からなる遺伝子である。
このように活性化制御領域の一部または全部を欠失した遺伝子は、 公知の遺伝 子操作の手法により作製することができる。 例えば、 PCR を利用し転写活性化ド メインをコードする DNAと DNA結合ドメインをコ一ドする DNAを結合すればよい (Inni s et al . , 1990, PCR Protocol s, Academic Press, San Diego)。 また、 相 互プライミング法により両 DNA を連結することもできる （Uhlmann, 1988， Gene 71 : 29 - 40)。
本発明において、 植物の環境ス トレス応答性転写因子 AREB1の活性化制御領域 の一部または全部を欠失し、 N末端の転写活性化ドメインおよび DNA結合ドメイ ンを含む AREB1を活性型 AREB1 という。 また、 例えば上記の Qから Tまでの領域 を欠失した AREB1を AREBI A QTとレ、う。
また、 本発明の遺伝子は、 上記のアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質であって、 植物の環境ス トレス応答性転写活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含 む。 ここで、 数個とは 20個以下、 好ましくは 10個以下、 さらに好ましくは 5個 以下、 特に好ましくは 2個若しくは 1個を意味する。
さらに、 上記遺伝子の塩基配列からなる DNAに相補的な塩基配列からなる DNA とス ト リンジェントな条件下でハイブリダイズしうる DNAからなる遺伝子も、 植 物の環境ス トレス応答性転写活性を有するタンパク質をコードする限り、 本発明 の遺伝子に含まれる。 ここで、 ス トリ ンジェン卜な条件とは、 ホルムアミ ド濃度 が 30〜50%、 37〜50°C、 6 X SSC の条件、 好ましくはホルムアミ ド濃度が 50%、 42°C、 6 X SSCの条件をレヽう。
本発明の遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped dupl ex法などの公 知の手法又はこれに準ずる方法により、 例えば部位特異的突然変異誘発法を利用 した変異導入用キッ ト （例えば Mutant- K (TAKARA社製）や Mutant-G (TAKARA社製） など） を用いて、 あるレ、は、 TAKARA社の LA PCR i n v itro Mutagenes i s シリーズ キットを用いて行うことができる。
本発明の遺伝子の由来植物種は限定されず、 シロイヌナズナ等の双子葉植物の
AREB1 のォーソログ遺伝子であって、 活性化制御領域を欠失し、 N末端の転写活 性化ドメインおよび DNA結合ドメインを含む遺伝子、イネ等の申-子葉植物の AREB1 のォ一ソ口グ遺伝子であって、 活性化制御領域を欠失し、 N末端の転写活性化ド メインおよび DNA結合ドメインを含む遺伝子が含まれる。 由来植物種がシロイヌ ナズナ以外の植物種である場合、 欠失させる領域は、 シロイヌナズナの AREB1遺 伝子において欠失させる領域に相当する領域であり、 このような領域はシロイヌ ナズナ由来の AREB1遺伝子と他種植物由来の AREB1のォーソ口グ遺伝子をァライ ンメン卜させることにより決定することができる。 例えば、 図 4 D にはシロイヌ ナズナの AREB 1 タンパク質とイネの AREB1 (OsAREB 1 ) タンパク質の転写活性領 域の部分アミ ノ酸配列のアライ ンメ ン トを示す。 配列番号 9にイネ由来の
OsAREBlの塩基配列を、 配列番号 1 0に OsAREBlのアミノ酸配列を示す。 OsAREBl タンパク質において、 P領域は 1番目のメチォニンから 63番目のグルタミン酸、
Q領域は 64番目のセリンから 126番目のセリン、 R領域は 127番目のトレオニン から 192番目のロイシン、 S領域は 193番目のフエニノレアラニンから 236番目の セリン、 T領域は 237番目のァスパラギンから 276番目のグルタミン酸、 U領域は
277番目のアルギニンから 357番目のトリプトファンまでの部位である。 すなわ ち、 本発明の遺伝子は配列番号 1 0で表されるイネ由来の OsAREBlタンパク質の ァミノ酸配列のアミノ酸 64番目のァミノ酸から 357番目のァミノ酸のうち、 50 番目から 100番目、 60番目から 70番目または 100番目から 130番目のアミノ酸 から始まる連続した 100、 150、 200、 250または 300のァミノ酸配列を欠失したタ ンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、 例えば、 配列番号 2で表されるァミノ 酸配列において 60〜70番目のいずれかのァミノ酸から 270〜280番目のいずれか のァミノ酸までのァミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、 60
〜 100番目のいずれかのァミノ酸から 260〜290番目のいずれかのアミノ酸までの アミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質、 100〜130番目のいず れかのァミノ酸から 260〜290 番目のいずれかのアミノ酸までのァミノ酸配列が 欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質を含む。 好ましくは、 64番目から 276 番目のアミノ酸配列が欠失したァミノ酸配列からなるタンパク質である。
さらに、 本発明の遺伝子は、 配列番号 9で表されるイネの OsAREBl遺伝子の塩 基配列において第 360位の塩基から 520位の塩基、 第 390位の塩基から 430位の 塩基、または第 510位の塩基から 610位の塩基までの塩基から始まる連続した 300、
450、 600、 750または 900の塩基配列を欠失した塩基配列からなる遺伝子であり、 例えば、配列番号 9で表される塩基配列において 390〜420位のいずれかの塩基か ら 1030〜1060 位のいずれかの塩基までの塩基配列が欠失した塩基配列からなる 遺伝子、 390〜510位のいずれかの塩基から 1000〜1090位のいずれかの塩基まで の塩基配列が欠失した塩基配列からなる遺伝子または 510〜600 位のいずれかの 塩基から 1000〜1090 位のいずれかの塩基までの塩基配列が欠失した塩基配列か らなる遺伝子を含む。好ましくは 406位から 1045位の塩基配列が欠失した塩基配 列からなる遺伝子である。
本発明のタンパク質の転写活性化能は、 シロイヌナズナのプロ トプラス卜の系 を用いる トランスァクチべ一ション実験法を用いることにより解析することがで きる。 例えば、 AREB l cDNA を CaMV35S プロモーターを含む pBI221 プラスミ ド (Cl one tech社製）に連結し、 エフ-クタ一プラスミ ドを構築する。 一方、 ABREを 含む DNA断片を、 β _ダルクロニダーゼ（GUS)遺伝子上流の TATAプロモーターのさ らに上流に連結し、 レポータープラスミ ドを構築する。 次いでこの 2種のプラス ミ ドをシロイヌナズナのプロ トプラス トに導入した後、 GUS 活性を測定する。 AREB1 タンパク質を同時に発現させることにより、 GUS活性の上昇が見られれば、 プロ トプラスト内で発現した AREB 1タンパク質力 ABREの配列を介して転写を活 性化していることがわかる。
本発明において、 プロ トプラス トの調製及び該プロ トプラストへのプラスミ ド DNAの導入は、 Abel らの方法 [Abel , S. ： Pl ant J. 5： 421- 427 ( 1994) ]により行うこ とができる。 3 -グルクロニダ一ゼ活性は、 Jefferson らの方法 [Jeff erson, R. A. ： E BO J. 83 ： 8447- 8451 (1986) ]により、 ルシフェラーゼ活性は Pi caGeneルシフエ ラーゼアツセィキッ ト（Toyo- Ink 社製）を用いることにより測定することができ る。
野生型の AREB1はァブシジン酸存在下でないと ABRE下流の遺伝子の転写活性を 誘導しないが、本発明の活性型 AREB1はアブシジン酸非存在下でも ABRE下流の遺 伝子の転写活性を誘導しえる。
2 . 本発明の遺伝子を導入したトランスジエニック植物の作製
遺伝子工学的手法を用いて本発明のタンパク質をコードする DNAを植物宿主に 導入することにより、 乾燥耐性、 塩耐性、 低温耐性等の環境ス ト レスに対して抵 抗性を有するトランスジエニック植物を作製することができる。 本発明の遺伝子 の植物宿主への導入方法としては、 ァグロパクテリゥム感染法などの間接導入法 や、 パーティクルガン法、 ポリエチレングリコール法、 リボソーム法、 マイクロ インジヱクション法などの直接導入法などが挙げられる。 ァグロパクテリゥム感 染法を用いる場合、 以下のようにして本発明の遺伝子導入植物を作製ことができ る。
(1) 植物導入用組換えベクターの作製及びァグロパクテリ ゥムの形質転換
植物導入用組換えベクターは、 本発明の遺伝子を含む DNAを適当な制限酵素で 切断後、 必要に応じて適切なリンカ一を連結し、 植物細胞用のクローニングべク ターに挿入することにより得ることができる。クロ一エング用ベクターとしては、 pBE2113Not、 pBI21 13Not、 pBI21 13、 pBI 101、 pBI 121、 pGA482、 pGAH、 pBIG 等の バイナリ一ベクタ一系のプラスミ ドゃ pLGV23Neo、 pNCAT、 pM0N200などの中間べ クタ一系のプラスミ ドを用いることができる。
バイナリーベクター系プラスミ ドを用いる場合、 上記のバイナリーベクターの 境界配列（LB, RB)間に、 目的遺伝子を挿入し、 この組換えベクターを大腸菌中で増 幅する。 次いで、 増幅した組換えべクタ一をァグロバクテリゥム ' チュメファシ エンス C58、 LBA4404, EHA101、 C58ClRif'、 EHA105等に、 凍結融解法、 エレク ト ロボレ一ション法等により導入し、 該ァグロバクテリ ゥムを植物の形質導入用に 用いる。
上記の方法以外にも、本発明においては、三者接合法 [Nuc leic Ac ids Research, 12 : 871 1 (1984) ]によつて本発明の遺伝子を含む植物感染用ァグロパクテリゥムを 調製することができる。 すなわち、 目的遺伝子を含むプラスミ ドを保有する大腸 菌、 ヘルパープラスミ ド（例えば pRK2013など）を保有する大腸菌、 及びァグロバ クテリ ゥムを混合培養し、 リファンピシリン及びカナマイシンを含む培地上で培 養することにより植物感染用の接合体ァグロパクテリ ゥムを得ることができる。 植物体内で外来遺伝子などを発現させるためには、 構造遺伝子の前後に、 それ ぞれ植物用のプロモータ一やターミネータ一などを配置させる必要がある。 本発 明において利用可能なプロモーターとしては、 例えば力リフラワーモザィクウイ ノレ ス （CaMV) 由 来の 35S 転写物 [Jefferson, R. A. et al .： The EMBO J 6 : 3901 -3907 ( 1987) ]、 ト ウモロコシのュビキチン [Chr i stensen, A. H. et a l . ： Pl ant Mol . Biol . 18 : 675-689 ( 1992) ]、 ノパリン合成酵素（NOS)遺伝子、 ォク トビ ン（OCT)合成酵素遺伝子のプロモーターなどが挙げられ、ターミネータ一配列とし ては、 例えば力リフラワーモザィクウィルス由来ゃノパリン合成酵素遺伝子由来 のターミネータ一などが挙げられる。 但し、 植物体内で機能することが知られて いるプロモーターやターミネーターであればこれらのものに限定されるものでは ない。
ここで、 用いるプロモーターが目的遺伝子の構成的発現を担うプロモーター (CaMV35S プロモーターなど）で、 これによつて、 遺伝子導入植物に生長の遅れや 矮化が生じる場合は、 目的遺伝子の一過性の発現をもたらすようなプロモーター (例えば、 rd29A 遺伝子プロモータ一など）を用いることができる。 また、 必要に 応じてプロモーター配列と本発明の遺伝子の間に、 遺伝子の発現を増強させる機 能を持つイントロン配列、 例えばトウモロコシのアルコールデヒ ドロゲナーゼ (Adhl )のイン トロン [Genes & Development 1： 1 183- 1200 (1987) ]を導入すること ができる。
さらに、 効率的に目的の形質転換細胞を選択するために、 有効な選択マーカー 遺伝子を本発明の遺伝子と併用することが好ましい。 その際に使用する選択マー 力一としては、 カナマイシン耐性遺伝子（ΝΡΤΠ)、抗生物質ハイグロマイシンに対 する抵抗性を植物に付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（htp) 遺伝子及びビアラホス（bi alaphos)に対する抵抗性を付与するホスフィノスリシ ンァセチルトランスフェラーゼ（bar)遺伝子等から選ばれる 1つ以上の遺伝子を 使用することができる。 本発明の遺伝子及び選択マーカー遺伝子は、 単一のべク ターに一緒に組み込んでも良いし、 それぞれ別個のベクターに組み込んだ 2種類 の組換え DNAを用いてもよい。
(2) 宿主への本発明の遺伝子の導入
本発明の形質転換体の宿主は特に限定されないが、植物であることが好ましい。 該植物は、植物培養細胞、栽培植物の植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、 根、 根茎、 種子等）、 又は植物組織（例えば表皮、 師部、 柔組織、 木部、 維管束等） のいずれであってもよい。 植物種は限定されず、 双子葉植物、 イネ、 トウモロコ シ、 コムギ等の単子葉植物を用いることができる。 形質転換する植物が双子葉植 物の場合は、 シロイヌナズナ等の双子葉植物由来の本発明の遺伝子を導入するこ とが好ましく、 形質転換する植物が単子葉植物の場合はイネ等の多因しよう植物 由来の本発明の遺伝子を導入することが好ましい。 植物培養細胞、 植物体、 植物 器官又は植物組織を宿主とする場合、 本発明のタンパク質をコードする DNAは、 採取した植物切片にベクタ一をァグロバクテリゥム感染法、 パーティクルガン法 又はポリエチレンダリコール法などで導入し、 植物宿主を形質転換することがで きる。 あるいはプロ トプラス 卜にエレク ト口ポレーション法で導入して形質転換 植物を作製することもできる。
たとえばァグロパクテリゥム感染法によりシロイヌナズナに遺伝子を導入する 場合、 目的の遺伝子を含むプラスミ ドを保有するァグロパクテリ ゥムを植物に感 染させる工程が必須であるが、 これは、バキュームインフィルトレーション法 [CR Acad. Sc i. Paris, LifeSci ence, 316 ： 1194 (1993) ]により行うことができる。 す なわち、 シロイヌナズナをバーミキユラィ 卜とパーライ トを等量ずつ合わせた土 で生育させ、 生育させたトウモロコシを本発明の遺伝子を含むプラスミ ドを含む ァグロパクテリゥムの培養液に直接浸し、 これをデシケーターに入れバキューム ポンプで 65〜70mmHgになるまで吸引後、 5〜10分間、 室温に放置する。 鉢をトレ 一に移しラップで覆い湿度を保つ。 翌日ラップを取り、 植物をそのまま生育させ 種子を収穫する。
次いで、 種子を目的の遺伝子を保有する個体を選択するために、 適切な抗生物 質を加えた MS寒天培地に播種する。この培地で生育したシロイヌナズナを鉢に移 し、 生育させることにより、 本発明の遺伝子が導入されたトランスジェニネック 植物の種子を得ることができる。 一般に、 導入遺伝子は宿主植物のゲノム中に同 様に導入されるが、 その導入場所が異なることにより導入遺伝子の発現が異なる ポジションイフェク 卜と呼ばれる現象が見られる。 プローブとして導入遺伝子の DNA 断片を用いたノーザン法で検定することによって、 より導入遺伝子が強く発 現している形質転換体を選抜することができる。
本発明の遺伝子を導入したトランスジュニック植物及びその次世代に目的の遺 伝子が組み込まれていることの確認は、 これらの細胞及び組織から常法に従って DNA を抽出し、 公知の PCR法又はサザン分析を用いて導入した遺伝子を検出する ことにより行うことができる。
(3) 本発明の遺伝子の植物組織での発現レベル及び発現部位の分析
本発明の遺伝子を導入したトランスジエニック植物における該遺伝子の発現レ ベル及び発現部位の分析は、 これらの細胞及び組織から常法に従って RNAを抽出 し、 公知の RT-PCR法又はノーザン分析を用いて導入した遺伝子の mRNAを検出す ることにより行うことができる。 また、 本発明の遺伝子産物を、 該遺伝子産物に 対する抗体を用いたウェスタン分析等により直接、 分析することによつても行う ことができる。
(4) 本発明の遺伝子が導入されたトランスジエニック植物体内における各種遺伝 子の mRNA レベルの変化
本発明の遺伝子が導入されたトランスジ-ニック植物体内において、 本発明の 転写因子の作用により、 発現レベルが変化したと考えられる遺伝子はノーザンハ イブリダイゼーションによって同定することができる。
例えば、 水耕栽培などで育てた植物に、 所定期間 （例えば 1〜2週間） の環境 ス トレスを与える。 環境ス トレスとしては、 乾燥、 塩、 低温等が挙げられる。 例 えば乾燥ス 卜レスの負荷は、水耕栽培から植物体を、抜き取り濾紙上で 10分〜 24 時間乾燥させることにより与えることができる。 塩ストレスの負荷は、 例えば 50 〜500mM NaCl溶液に変更し、 10分〜 24時間保持することによって与えることが できる。 また、低温ス トレスの負荷は、例えば、シロイヌナズナの場合、 -15〜5 °C に 10分〜 24時間保持することにより与えることができる。 低温ス トレスの負荷 温度は、 植物種、 植物の成長段階等に応じて適宜決定することができる。
ス ト レスを与えないコントロール植物と環境ス トレスを与えた植物から全 RNA を調製して電気泳動を行い、 発現をみたい遺伝子のプローブを用いてノーザンハ ィブリダイゼーシヨ ンを行えば、 その発現パターンが解析できる。
(5) トランスジュニック植物の環境ス トレスに対する耐性の評価
本発明の遺伝子を導入した卜ランスジエニック植物の環境ス トレスに対する耐 性は、 例えばバーミキユラィ ト、 パ一ライ トなどを含む土を入れた植木鉢にトラ ンスジエニック植物を植え、 各種環境ス トレスを負荷した場合の生存を調べるこ とによって評価することができる。 環境ス トレスとしては、 乾燥、 塩、 低温等が 挙げられる。 例えば、 乾燥ス ト レスに対する耐性は、 2〜4週間、 水を与えずその 生存を調べることにより評価することができる。 また、 塩ス ト レスは例えば 100 〜600mM NaClで 1時間〜 7日間おいた後、 1〜3週間、 20〜35°Cで生育させその生 存率を調べることにより評価することができる。 さらに、 低温ス ト レスは例えば シロイヌナズナの場合、 - 15〜5 °Cに、 30分〜 10日間おいた後、 2日〜 3週間、 20〜35°Cで生育させその生存率を調べることにより評価することができる。
3 . 植物のス ト レスレベルの測定
本発明の遺伝子は、 乾燥ス ト レス、 塩ス トレス、 低温ス ト レス等により転写が 活性化されるため、 本発明の遺伝子の転写レベルを調べることにより、 植物の受 けている乾燥'塩'低温などによる環境ス ト レスのレベルを調べることができる。 本発明の遺伝子の転写レベルは、 RNAゲルブロッ ト分析、 定量的 PCRなどによ り行うことができる。 RNA ゲルプロッ ト分析に用いるプローブは、 本発明の遺伝 子及び Z又は該遺伝子に隣接する特異的な配列を含む 100〜1000bpの領域を基に、 公知の方法を用いて作製することができる。 また定量的 PCRに用いるプライマ一 は、 本発明の遺伝子のコード領域内又はそれに隣接する領域の配列を基に、 公知 の方法を用いて調整することができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によって限定されるものではない。
( 1 ) 方法および材料
本実施例において、 用いた材料および方法は以下のとおりであった。
植物と生育条件
植物 (Arabidopsi s thal iana ecotype Columbia)は、 明期 16時間/暗期 8時間の 照光条件下（40 ± ΙΟ μ πιοΙ photons/m2/s)で、 Osakabe ら（2005, Plant Cel l 17， 1 105- 1 119)の方法に従い、 2〜3週間 GM寒天培地上で育成した（2005, Plant Cel l
17， 1105 - 1 1 19)。 GM寒天培地には 1 %あるいは 3 %のスク ロースを添加し、 実験 によっては ABAをさらに必要量添加した。シロイヌナズナの T87培養細胞は、 Sa toh ら（2004, Plant Cel l Phys iol . 45, 309- 317)の方法に従い、 維持、 管理を行った。 シロイヌナズナの AREB1の T- DNA挿入変異株（SALK_002984 ; Col- 0 ecotype)は、 シロイヌナズナ生物資源センタ一（Arabidopsis Biological Resource Center, コ ロンブス， オクラホマ州， 米国）から入手した。 また、 この T-DNA挿入変異体につ いての情報は、 米国力リ フオリォニァ州にあるソーク研究所ゲノム解析研究室 (balk Institute Genomic Analysis Laboratory) の ゥ エ フ サ 卜 (http：〃 signal, salk. edu)から得た。 さらに、 AREB1遺伝子への T - DNAの挿入部 位は、 T- DNA レフ トボーダープライマ一 5' -GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT- 3' (配列番 号 3) と AREB1-特異的プライマー 5'- TCAAGCTCCACGGTGTAAGCC- 3' (配列番号 4 ) を用いた PCRによって確認した。 また、 Ito および Shinozaki (2002, Plant Cell Physiol. 3, 1285- 1292)の方法に従って RT- PCR 法を用いた解析を行い、 areblT-DNA挿入変異株において AREB1遺伝子が発現していないことを確認した。 RNAゲルブロッ ト解析
植物体からの全 RNAの抽出およびその全 RNAを用いた RNAゲルブロッ ト解析は、 Satoh ら（2004, Plant Cell Physiol. 45, 309- 317)の方法に従い、 Shakemaster 破 碎機 (Bio Medical Science, Tokyo, Japan)を用レヽて行った。 また、 RNA ゲノレブ ロッ ト解析のプローブは Maruyama ら （2004, Plant J. 38， 982- 993)の方法に従 つて調製した。
シロイヌナズナのプロ トプラス トを用いた一過的発現解析
シロイヌナズナの T87細胞由来のプロ トプラス トを用いた一過的発現解析は、 Fujita ら （2004, Plant J. 39, 863-876)および Satoh ら （2004， Plant Cell Physiol. 45, 309- 317)の方法に若干の改変を加えた方法を用いた。 プロ トプラス トの単離、 および遺伝子導入は、 すべて室温（25〜28°C)にて行った。 遺伝子を導 入したプロ トプラス トは 16〜20 時間、 22°Cで喑所に静置した。 酵素溶液 [0.4 M mannitol, 1.5% (w/v) eel lulase Onozuka -10 (Yakult, Tokyo, Japan) , 0.3% (w/v) macerozyme R-10 (Yakult), 0.1% (w/v) bovine serum albumin, 10 mM CaC^,
20 mM KC1, and 20 mM MES, pH 5.7] は Sheen (2002) の 方 法
(httpV/genetics. mgh. harvard, edu/ sheenweb/)に従つて調製した。
A EB1 cDNAの一部または全体を含む DNA断片を PCRで増やして、 発現ベクター である pBI35SQ (Abe et al.， 1997, Plant Cell 9, 1859-1868)の Notlサイ トに クローニングすることにより、 AREB1の bZIPDNA結合ドメインを持ったプラスミ ドを作製し、 これを一過的発現解析実験に用いた。 pBI35S Q -AREBlプラスミ ドか ら EcoT14Iによって部分切断される 640塩基対の断片を除くために、 EcoT14Iで 部分切断した後に自己結合リガーゼ反応を行った。 その結果作製された PBI35S Q -AREB1 Δ QTは、 Qから T領域にまたがる内部欠失（アミノ酸残基 65-277)を持った プラスミ ドである。 以下の二組のプライマーによる PCRによって AREBl cDNAの一 部 を持っ た 2 つ の DNA 断片が作製 さ れた ： forward primer A、 5' -GGGGCGGCCGCATGACACAAGCCATGGCTAGTG-3' (酉己歹 'J番号 5 ) ； reverse primer A、 5' -GCAGAAGCACCTTGACTTCCCCCTACTCCAC-3' (酉己歹 IJ番号 6 ) ； forward pr imer B、 5' -GTAGGGGGAAGTCAAGGTGCTTCTGCTGC-3' (配歹 IJ番号 7 ) ； reverse primer B、 5' -GGGGAGCTCTCACCAAGGTCCCGACTCTG-3' (配列番号 8 )。 その結果作製された断片 Aと Bは PCR用のチューブ内で混合し、 94°C ' 10分間で変性、ァニーリングの後、 72°C · 3分間でポリメラーゼ反応を行った。 この DNA断片を forward primer A と reverse primer Bで増幅したものを、 pBI35S Ωに導入した。 その結果作製された pBI35S Q - AREB1 Δ Ρ/RTは 2箇所の内部欠失（アミノ酸残基 1-60、 1 17-277)を持つ たプラスミ ドである。
GAL4 活性化ドメィンに結合した GAL4DNA 結合ドメインを持つ発現プラスミ ド (p35S- 562)と、 GAL4- GUS レポータープラスミ ド（pGUS- 558)は服部束穂先生（名古 屋大学、 日本）から譲渡されたものを用いた。 一過的発現解析実験で用いた GAL4 結合ドメインを持つ発現プラスミ ドは、 AREBl cDNAの一部を含む PCR断片を発現 ベクター p35S- 562の BamHI/SacI サイ トにクローニングして作製した。 浦尾剛先 生（国際農林水産業研究センタ一， 日本）から譲渡された植物の発現べクタ一 pBI221- (- 46/ Q ) LUCの H indll l/BamHIサイ 卜に、 pBI- 35SLUC (Urao et al . , 1996， Plant J. 10, 1 145- 1148)から得た 900塩基対の Hindl ll/BamHI断片を爭入した。 その結果作製された pBI35S Q - LUC は内部標準として一過的転写活性化実験に用 いた。
形質転換植物用のコンス トラク ト
pBE21 13Not_AREBlプラスミ ドを作製するために、 Notl リンカ一付きのプライマ 一を用いて、 PCRで AREB1 のコード領域全体を増幅し、 pBE2113Not (Liu et a l ,，
1998, Pl ant Ce l l 10, 1391- 1406)にセンス方向に導入した。 pBE21 13Not - AREB1 △ QTは、 AREB1 Δ0Τのコード領域を Xbal、 BamHI リンカ一付きのプライマーを使 つた PCRで増幅し、 pBE2113Notの Xbal/BamHIサイ 卜にセンス方向で導入して作 製した。
35S-AREB1 および 35S- AREB1 AQTの形質換植物を作製するために、 形質転換べ ク タ一 pBE2113Not- AREB1 および pBE2113Not_AREBl Δ QT を Agrobacterium tumefaciensの C58系統を用いた吸引浸潤法（Osakabe et al. , 2005, Plant Cell 17, 1105-1119)によってシロイヌナズナ（Columbia) に導入した。
乾燥耐性試験
乾燥耐性試験は Sakamotoら （2004， Plant Physiol. 136, 2734-2746) の方法 に若干の改変を加えた方法を用いた。 植物は、 明期 16時間/暗期 8時間の照光条 件下（50 土 10/ mol photons/m2/s)で、 22 土 1 °C、 相対湿度 35 士 5%の条件下 で育成した。これらの植物への給水を 12 日間停止することで乾燥ス トレスをかけ た。
急激な乾燥状態での植物の生存試験には、 GM寒天培地上で播種後 2〜3週間育 成した植物を用いた。これらの植物を寒天培地から注意深くぬきとり（ふたをとり はらった）ペトリ皿に移した。 その後、 一定時間乾燥させ、 乾燥処理終了後、 給水 を行った。 急激な乾燥状態での生存試験は、 9 土 l/ mol photons/s/m2の照光条 件下で 25 土 2°C (相対湿度 20% 土 10%)の条件下で行った。再給水後、ペトリ皿 ごと植物培養室に移し、 22 ± 2 °C、 連続光 （50 土 5 imol photons/s/m2)照射 下で 1〜3 日間置き、 植物の色で生存あるいは枯死を判断した。 組織の 50%以上 が緑色であった植物は生きていると判断した。 植物体の大きさによる影響を最小 限にとどめるために、 同程度の大きさの植物を使用した。 全ての実験は少なく と も 5回繰り返し、 各比較実験で少なく とも 3ライン、 40植物体以上を用いた。 マイクロアレイ解析
GM寒天培地で 2週間得育てた 35S- AREBl AQTとベクターコントロールの植物体 をそのまま、 あるいは ABAで 7時間処理した後に回収し、 Agilent Arabidopsis 2
Oligo Microarray (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)で角?析した。 生 物学的反復のために、 RNA抽出では 8個体をまとめて一^ のサンプルとした。 各 実験では独立した 2 ライ ンの形質転換体を用いた。 全 RNA は Trizol 試薬 (Invitrogen)で抽出され、 Cy5および Cy3でラベルした cDNAプローブの調製に使 用した。 マイクロアレイ実験はデータ解析も含めて全て、 製品に添付されたプロ 卜 コ ー ノレ (http://www. chem. agilent. com/scripts/generic. asp?lpage = 11617&indcol=Nandprodcol=Y)に従って行った。 マイクロアレイ解析の再現性を 評価するために色素（Cy5 と Cy3)を交換しても同じ結果が出ることをそれぞれの 実験に対して確認する実験を行った。 私達の経験的な知見では、 コントロール植 物で Cy5または Cy3のシグナル強度が 500〜1000以下のものは、 RNAゲルブロッ ト解析での再現性が必ずしも確認できない場合があった。 このため、 我々の実験 条件下では、 コン トロール植物において Cy5 と Cy3 の両方でシグナル値が 1000 以下の遺伝子は解析に用いなかった。 また、 我々は P値が 0.001以下のものにつ いて解析を行った。 また、 これまでのわれわれの研究データから、 マイクロアレ ィ実験における遺伝子発現の変化が 3倍以上の遺伝子では、 RNAゲルブロッ ト解 析と定量リアルタイム RT- PCR 解析によって再現性よく顕著にその発現の変化を 確認できた（Rabbani et al.， 2003, Plant Physiol. 133, 1755-1767； Fujita et al. , 2004, Plant J. 39， 863-876； Maruyama et al. , 2004, Plant J. 3, 982 - 993 など)。 Feature extraction and image analysis software (version A.6.1.1;
Agilent Technologies)を用いて、 アレイ上の各スポッ トを特定して定量化し、
Lowess 法による標準化を行った。 遺伝子のクラスタリ ング解析には Genespring
6.1 software (Silicon Genetics, San Carlos, カリフオノレニァ' J'I'I, 米国）を用レヽ た。 シロイヌナズナのゲノム中にある At4g25580は、 RD29B と非常に良く似た塩 基配列を持っている。 RD29Bに特異的な配列を用いた定量リアルタイム RT- PCR解 析と RNAゲルブロッ ト解析によって、 35S- AREB1AQTの植物体では RD29Bの遺伝 子発現だけが上昇していることを確認した。
植物の水分生理学的解析
植物の水分の消失量と相対水分含量は、 Yoshida ら （2002, Plant Cell Physiol.
43, 1473-1483) および Ma ら （2004, Plant J. 40, 845- 859)の方法に若-下-の改 変を加えた方法を用いて測定した。 土を詰めたポッ 卜で育てた 4週間 Sの植物体 から地上部を切り取り、 経時的に新鮮重の測定を行った。 切り取った植物体の地 上部は一定時間乾燥させた後、 180°Cで 3.5時間乾熱処理を行って、 その乾燥重量 を測定した。 植物の大きさや乾燥重量による値のばらつきの影響を最小限にする ために、 相対水分含量は [(FWi_DW)/ (FWo-DW)] X100の式を用いて算出し、 地上部 の最初の水分含量に対する百分率で示した。 と FWeは、 それぞれ特定の時間で の新鮮重とはじめの新鮮重、 また、 DWは乾燥重量を示している。 これらの試験は 実験室のベンチの上で行った（24 土 1 °C、相対湿度 65% 土 5%、 照光条件は 9 土
1 μ mol photons/ s/m )。
系統樹解析
3つの N末端保存領域（C1、C2および C3:図 1 A)と bZIP領域の配列から、 ClustalX プログラム（version 1.83)によってアラインメントを作製した。 ただし変数は以 卜のよつに 5¾¾Eした ： gap open penal ty = ο.00， gap extension penalty = 0. Oo (Supplemental Fig. 1)。なお、最終的には手作業でァラインメントを微調整した。 系統樹は、 Fujita ら（2004, Plant J. 39， 863- 876)の方法に従って、 MEGA software (version 3)を用いて、 近隣結合法により作製された。 単系統群の信頼 度は、 ブーツストラップ解析（1000回反復）により計算した。
( 2) シロイヌナズナ T87培養細胞 AREB1由来プロ トプラス トを用いた AREB1の N末端保領域のトランスァクチべーシヨン活性の検討
以前の研究で本発明者は、 シロイヌナズナのプロ トプラストで、 AREB1 タンパ ク質が RD29Bプロモータ一 - GUSの融合遺伝子（RD29B-GUS)の転写を活性化したこ とを示した（Uno et al.， 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA97, 11632—11637)。 今回、 本発明者は、 AREB1の転写活性化ドメインを同定するために、 N末端に欠失 を持った欠損型 AREB1を、 カリフラヮーモザィクウィルスの 35Sプロモーターで 恒常的に発現させるプラスミ ドを作製した（図 1)。 発現プラスミ ドはリポーター プラスミ ドの RD29B-GUS とあわせて、 シロイヌナズナの T87培養細胞から調整し たプロ トプラス トに導入された。 このリポータープラスミ ドは、 RD29B プロモー タ一中にある 2つの ABREを含む 77塩基対を直列に 5つ並べて、 GUS レポ一ター 遺伝子につないだ配列を持っている（図 1 A)。
図 1 A に、 エフェクタープラスミ ドとリポータープラスミ ドのコンス トラク ト を示す。 リポータープラスミ ドとして、 GUS遺伝子の上流に RD29Bプロモーター である 77bpの ABRE配列を 5回繰り返し配置したものを用いた。プロモーターは、 -51RD29Bmi n ima lTATAプロモータ1 ~- GUS コンストラク トの上流に連結した。 Nos - T は、ノパリン合成酵素ターミネータ一である。エフェクタープラスミ ドとしては、 CaMV35S-TMV Ω 配列の下流に AREB1の全長または bZI P DNA結合ドメインを含む —部を挿入したものを用いた。 これら二つのプラスミ ドを、 シロイヌナズナ T87 細胞のプロ トプラス トに同時に導入した。 プロ トプラスト中で合成された AREB1 タンパク質は、 リポータープラスミ ドの ABRE配列に結合し、 下流に存在する GUS 遺伝子の転写を誘導する。 AREB1タンパク質の転写誘導活性は、 GUSタンパク質の 活性を測定することで求められる。
AREB 1の N末端にある 60アミノ酸残基の短い領域（P領域）を欠失させた場合で は、 ΙΟΟ μ Μの ABAを加えても加えなくても、 プロ トプラス 卜でのレポーター遺伝 子の転写活性が有意に低下し、 この領域に正の制御ドメインがあることが示唆さ れた（図 1 B)。
図 1 Bに、 N末端を欠失させた AREB1のトランスァクチべーションドメイン分析 の結果を示す。 プロ トプラス トを RD29B- GUS リポーターコンス トラク トおよびェ フエクタ一コンス トラク 卜で同時トランスフエク トした。 ベクターは pBI-35S Q である。 相対活性は pBI- 221- 35S Qコントロールに対する発現を倍数で示す。 図 1 Bの上の数字はアミノ酸番号を示す。 P、 Q、 R、 S、 Tおよび Uは AREB1 cDNAの 部分領域を示し、 P、 Q、 Rおよび U領域の黒部分は保存領域を示す。 全長の AREB1 タンパク質では、 50 μ Mのアブシジン酸（ABA)存在下で顕著に GUS活性の上昇がみ られ、 AREB1の転写誘導の活性化には AREB1が機能することを示した。一方、 AREB1 タンパク質の N末端領域、 アミノ酸 1-60の領域が失われると、 ABA存在下におい ても GUS活性がバックグランドレベルまで低下し、 この領域に AREB 1タンパク質 の転写活性化ドメインが存在することが示唆された。
本発明者は、さらに、 AREB1の P領域と結合ドメインを持った変異タンパクが、 外的な ABAの非存在下で RD29B- GUS レポーター遺伝子の転写を活性化させるかど うかを調べた。 発現プラスミ ドとして、 AREB1の bZIP DNA結合ドメインと Pまた は Q領域をそれぞれ持った、 AREBI A QTと AREB1 Δ P/RTを作製した（図 1 C)。 図 1
Cに、 AREB 1 A QTおよび AREB 1 Δ Ρ/RTのトランスァクチべーションの結果を示す。 アミノ酸 65- 277の領域を削除した AREB1変異体（AREB1 Δ QT)では、 ABA非存在下 においても顕著に転写活性が誘導された。 AREBI AQT と RD29B-GUS を同時に導入 することで ABA 非存在下でも有意に GUS レポーター遺伝子が活性化されたが、 AREB1 ΔΡ/RTの場合では ABAの有無に関わらずレポータ一遺伝子は活性化されな かった。 これらの結果から、 AREB1の N末端にある P領域は転写活性化ドメイン を含んでいて、 プロ トプラス トでは AREBI AQTが恒常的な活性型であることが示 唆された。
また、 AREB1 AP/RTやその他 N末端を欠失させた多くの AREB1変異体では、 ABA 存在下のベクタ一コントロールに比べて有意に転写活性化能が低下していた。 こ れら変異体でみられる転写活性化能の低下は、 AREB1 AP/RTや N末端を欠失させ た AREB1変異体が、レポ一タープラスミ ド中にある ABREモチーフへ優先的に結合 することによって、 植物細胞にもともとある ABA 誘導性の内在性の転写因子が ABRE モチーフに結合することを妨げたことが原因であると考えられる（図 1 B お よび図 1 C)。 ただし N末端欠失変異体の中で、 P領域の欠失変異体だけは ABA存 在下でレポ一ター遺伝子の活性化の抑制がほとんどみられなかった。 この原因と して、 P 領域の欠失変異体の配列が特異的になんらかの影響を与えている可能性 が考えられる。
なお、すべのトランスァクチべーション実験は 3から 10回繰り返し、代表的な 1回の結果を示してある。棒グラフのバーは標準偏差を示す。 n=3〜 5であった。 ( 3) AREBI AQTの発現検討
本発明者は、 これまで AREB1 タンパク質が RD29B プロモーターにある 2つの
ABRE 配列に結合し、 遺伝子発現を活性化することを示した（Uno et al. , 2000,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA97, 11632-11637)。 一方、 先に述べたように外的 ABA の非存在下では、 ABRE1 は下流の RD29B遺伝子の発現を活性化しなかった。 ここ では、 シロイヌナズナでの ABREI AQT の過剰発現が、 外的な ABA の非存在下で
RD29Bのような下流遺伝子の転写を活性化するかどうかを調べた。 まず、 ABRE1厶
QTの cDNA を、 カリフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーターで発現させた 形質転換植物を作製した。 この形質転換体の独立した 33 ラインにおいて、 ス トレ ス処理をしない状態で導入遺伝子の ABREI AQTと下流遺伝子の RD29Bについて発 現を解析した。 調べた全ての形質転換ラインにおいて外的に ABAを添加しない条 件で ABREI A QTと RD29Bの蓄積レベルが上昇していた。 表現型の解析をするため に ABRE1 A QTの発現レベルが高い 8ラインを選んだ。 なお、 また各ラインの種子 数が統計的な解析をするには時に不十分だったため、 この 8 ラインの表現型が同 様であったことから、 実験によって異なったラインを用いた場合があった。 図 2 に、 野生型、 ベクターコントロール RNAゲルプロッ ト分析の結果を示す。 図 1の 実験において、 ABA 非存在下においても恒常的に転写活性を誘導する活性型 AREB 1 (AREB 1 Δ ΟΤ)を、 CaMV 35Sプロモーターと TMV Ω配列によりシロイヌナズナ 中で発現させた。 2週間の実生をアブシジン酸で 7時間処理するかまたは処理し なかった。 図 2 Aに、 ノーザン解析の結果を示す。 各レーンは 10 gのトータル RNA を含む。 最下段はェチジゥムブロミ ドで染色したコントロールである。 ノー ザン解析により、 野生型（WT)およびベクターコントロール植物（vec tor)では、 50 μ M ABA 存在下においてのみプロモーター領域に ABRE 配列を持つ下流遺伝子 RD29Bの発現を確認できた。一方、全長の AREB l cDNAを発現させた植物（35S-AREB1 ) では ABA非存在下で RD29B遺伝子の発現がみられなかったのに対し、活性型 AREB 1 を発現させた植物（35S-AREB1 A QT)では ABA非存在下においても下流の RD29B遺伝 子の発現が誘導されていた。 植物で過剰発現した ABREI A QTは外的な ABAの非存 在下で、 下流遺伝子である RD29Bの転写を活性化した。 この結果から、 ABRE1 A QT が植物全体で見ても ABRE 1の恒常的な活性型であり、 プロ トプラス 卜と同様に植 物体でも ABRE1の N末端にある P領域が転写活性化ドメインとして機能している ことが示された。
図 2 Bに 1 %スクロースを含む GMK培地での生育を播種後 3週間後の写真で示 した。 全長の AREB 1 cDNAをシロイヌナズナ中で発現させた場合（35S-AREB 1 )、 コ ントロール植物（WT)と生育の差はほとんどみられないが、 活性型 AREB 1 を発現さ せた植物（35S-AREB 1 A QT)では、 若 Τ·の生育遅延がみられた。 これは、 環境ス トレ ス耐性が改善された DREB1A 発現植物においてもみられる現象である。 播種後 3 週間の時点で、 35S-ABRE1 A QT 植物のロゼッタ葉の最大半径は、 平均して野生型 の 70%であった。 生育の全過程において、 35S- ABRE1 A QT植物は野生型よりわず かに小さかったが、 35S-ABRE1 植物は成長に関して野生型と同様な表現型を示し た。 ( 4 ) 活性型 AREB1発現シロイヌナズナのマイクロアレイ解析
活性型 AREB1発現シロイヌナズナ（35S- AREBI A QT)を用いて、マイクロアレイ解 析を行った。 マイクロアレイはシロイヌナズナの 85%以上の遺伝子の発現プロフ アイルを調べることができるアジレント 'テクノロジ一社アジレント · ァラビド プシス 2オリゴマイクロアレイを用いた。 ABA非存在下の無処理時の活性型 AREB1 発現植物においてべクタ一コン トロール植物よりも発現量が 4倍以上高く誘導さ れていた遺伝子は、 8個あった （表 1 )。 その 8個の下流遺伝子のうち 4個は、 水 ス ト レス耐性に関与する LEAタンパク質遺伝子であり、 残りの 4個は、 シグナル 制御関連遺伝子であった。 これらの下流遺伝子は、 いずれも ABAおよび乾燥誘導 性遺伝子であり、 そのプロモータ一領域には、 AREB1 タンパク質が結合するのに 必要な 2つ以上の ABRE配列が存在していた。
表 1
Figure imgf000025_0001
(5) 活性型 AREBl発現シロイヌナズナの乾燥ス ト レス耐性試験
ス トレス応答遺伝子の中で、 LEA タンパク質をコ一ドする遺伝子は乾燥耐性に 関係していると考えられている（Ingram and Bartels, 1996, Plant Mol. Biol. 47, 377-403； Thomashow, 1999， Pl ant ol . B i ol . 50, 571—599)。 ス トレス処理をし ない状態の 35S- ABRE1 植物で発現がきわめて顕著に上昇した 8遺伝子の内、
4遺伝子が LEAタンパク質だった。 このため、 35S-ABRE1 Δ 0Τ植物では乾燥耐性 が向上していると予想された。 このことを確認するために、 本発明者は ABRE1 A
QTの過剰発現が乾燥ス トレスへの耐性に影響するかを調べた。 いくつかの独立し たライン間を比較しても同様の表現型を示したので（データは示していない）、 ラ イン 12と 26について詳細な解析を行った。活性型 DREB2A過剰発現シロイヌナズ ナのス トレス耐性を確認した。 播種後 4週間の植物の灌水を 2週間停止し、 乾燥 耐性試験を行った。 灌水を停止して 2週間経過後に、 植物体の生死を明確に判別 するために、 再び灌水を開始し 5日経過した後に撮影した。 図 3に示す写真の下 の数字は、 試験に用いた植物体数（分母）と生存していた植物個体数（分子）を示し ている。この乾燥ス トレス実験において、多くののベクターコン トロール植物（WT) が枯死したのに対し、ほとんどの活性型 AREB1発現植物（35S - AREB1 Δ 0Τ)では健全 な状態を保っていた。 活性型 AREB1を発現することにより、 植物の環境ス トレス 耐性が改善されることが示された。 図 3に示したように、給水を 12時間停止する と、 ほとんど全ての野生型植物は完全に萎れてしまった。 一方、 ABREI A QT植物 の両ラインでは再吸水するとほぼかわりなく成長を続けた。 乾燥ス トレス実験の 期間中、 全てのポッ トの間で土壌水分含量の違いは 5 %以内に収まっていた （デ ータは示していない）。 このように、 35S-ABRE1 Δ ζ|Τ植物は急激な脱水状態におけ る生存能力が高く、 乾燥ス ト レスへの耐性が向上していた。
( 6 ) シロイヌナズナとイネにおける AREB1相同遺伝子の系統樹解析
図 4 Αは、 双子葉植物のシロイヌナズナと単子葉植物のイネにおける AREB1相 同遺伝子の類縁関係を系統樹により示した。 図 4 B は、 シロイヌナズナにおける
AREB1相同性遺伝子の ABA、 乾燥、 塩、 および水処理における遺伝子発現プロファ ィルを示す。 実験には、 GMK 培地上で生育させた播種後 2週間の植物を用い、 ノ
—ザン法により遺伝子発現を示した。数字は、処理時間を示している。 図 4 Cは、 イネにおける AREB1相同性遺伝子の乾燥、 塩および低温処理における遺伝子発現 プロファイルを示す。 実験には、 水耕栽培で育てた播種後 2週間の植物を用い、 マイクロアレイ法により遺伝子発現を示した。 発現レベルは、 コン トロール植物 を 1 とした時の倍率で示した。 数字は、 処理時間を示している。 図 4 Dは、 シロ ィヌナズナとイネにおける AREB1相同遺伝子の転写活性化領域のァミノ酸配列の 比較を示す。 産業上の利用可能性
本発明の植物の乾燥ス トレス、 塩ス トレス、 低温ス トレス等の環境ス トレス応 答性転写因子 AREB1の活性化制御領域を欠失し、 N末端の転写活性化ドメインぉ よび DNA結合ドメインを含む、 活性型の環境ス トレス応答性転写因子 AREB1遺伝 子を植物に導入し、 過剰発現させることにより、 植物の乾燥 ·塩 ·低温耐性を向 上させることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリ一テキス ト
配列番号 3〜 8 -プライマー

Claims

請求の範囲
1 . 植物の環境ス トレス応答性転写因子 AREB 1の活性化制御領域の一部または 全部を欠失し、 N末端の転写活性化ドメインおよび DNA結合ドメインを含む、 活 性型の環境ス トレス応答性転写因子 AREB1遺伝子。
2 . 植物の環境ス ト レス応答性転写因子の Q、 R、 Sおよび T領域の少なく とも 1つの領域を欠失し、 Ν末端の転写活性化ドメインを含む Ρ領域および DNA結合 ドメインを含む U領域を含む、 活性型の環境ス トレス応答性転写因子 AREB1遺伝 子。
3 . シロイヌナズナ由来である請求項 1または 2に記載の活性型の環境ス ト レ ス応答性転写因子 AREB1遺伝子。
4 . 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 65 番目のアミノ酸から 277 番目のアミノ酸までのァミノ酸配列が欠失したァミノ酸配列からなるタンパク質 をコードする請求項 3記載の活性型の環境ス トレス応答性転写因子 AREB1遺伝子。
5 . 請求項 3または 4に記載の活性型の環境ス ト レス応答性転写因子 AREB 1遺 伝子のアミノ酸配列において 1若しくは数個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付 加されたァミノ酸配列からなり、 植物の環境ストレス応答性転写活性を有するタ ンパク質をコードする活性型の環境ス ト レス応答性転写因子 AREB 1遺伝子。
6 . 配列番号 1で表される塩基配列において 312位の塩基から 950位の塩基ま での塩基配列が欠失した塩基配列からなる請求項 3記載の活性型の環境ストレス 応答性転写因子 AREB 1遺伝子。
7 . 請求項 6記載の活性型の環境ス ト レス応答性転写因子 AREB 1遺伝子の塩基 配列からなる DNAに相補的な塩基配列からなる DNAとスト リンジェントな条件下 でハイブリダイズしうる DNAであって、 植物の環境ス トレス応答性転写活性を有 するタンパク質をコードする DNAからなる活性型の環境ス ト レス応答性転写因子 AREB 1遺伝子。
8 . ィネ由来の環境ス トレス応答性転写因子 OsAREB 1の活性化制御領域を欠失 し、 転写活性化ドメインおよび DNA結合ドメインを含む、 活性型の環境ス ト レス 応答性転写因子 AREB 1遺伝子。
9 . 環境ス ト レスが乾燥ス ト レス、 塩ス トレスまたは低温ス ト レスである請求 項 1〜 8のいずれか 1項に記載の活性型の環境ス トレス応答性転写因子 AREB 1 遺伝子。
1 0 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の遺伝子を含む植物形質転換用べク ター。
1 1 . 請求項 1 0記載の植物形質転換用ベクターで形質転換された環境ス ト レ ス耐性が向上したトランスジヱニック植物。
1 2 . 請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の遺伝子を植物に導入することによ り、 該植物の環境ス ト レス耐性を向上させる方法。
1 3 . 環境ス ト レス耐性が、乾燥耐性、塩耐性および または低温耐性である、 請求項 1 2記載の環境ス ト レス耐性を向上させる方法。
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