CN106674340B - 一种杂交构树转录因子BpSEM及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杂交构树转录因子BpSEM及其编码基因与应用。实验证明，BpSEM定位于细胞核中；BpSEM基因在杂交构树愈伤组织中高表达，表现出其控制细胞胚性的功能；将本发明的转录因子BpSEM的编码基因在拟南芥中过表达，和野生型拟南芥相比，获得的纯合转基因植物的抗旱性明显提高，说明本发明提供的转录因子BpSEM及其编码基因可以提高植物的抗逆性。不仅对于鉴定和维持杂交构树及其他植物的干细胞系具有重要的理论和实际意义，而且还可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，在农业和经济能源作物领域具有较高的实际应用价值和广阔的应用前景。

Description

一种杂交构树转录因子BpSEM及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杂交构树转录因子BpSEM及其编码基因与应用。
背景技术
植物体的任何一个细胞在适宜条件下，都有长成完整个体的潜在能力，这种潜在能力就叫植物细胞的“全能性”。植物干细胞具有两大特性：一是有很强的自我更新能力，能在无限的时间内保持未分化状态和增殖的能力；二是分化的多能性，能够分化出多种多样的植物前体细胞的能力，这些特化的细胞产生新的植物器官，是植物根、茎、叶和花等器官发生的源泉。植物的顶端分生组织和侧生分生组织中存在着由多种基因编码的蛋白组成的信号调节通路，保证分生组织的正常发育，实现干细胞在自我更新和产生分化细胞之间的平衡。
转录因子(transcription factor)是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用，协助RNA聚合酶II与之结合，调节RNA合成速率的蛋白。它们控制真核生物正常发育和生理功能基因的协同表达。植物发育是十分复杂的过程。DNA与蛋白质在这个过程中发挥着主要的作用，通过它们之间的相互作用来实现对基因表达的调控。蛋白质实现了生物的多样性，因此发育调控的复杂性也必定与蛋白质的结构和功能的多样性密不可分。转录调控是真核生物基因表达调控的重要机制。真核生物的生长发育、逆境反应及信号转导都是由于基因调控而有序表达的结果，而基因表达的此种时空特异性，主要是由于转录因子通过与基因启动子和增强子内的DNA顺式元件相互作用来修饰改变靶基因存在的染色质结构，以及通过转录因子之间及其转录产物之间的直接和间接作用来调节靶基因的转录和表达。因此，转录因子在植物逆境信号传递过程中起着中心调节的作用，转录因子也逐渐成为植物抗逆机理研究的核心内容。植物的抗逆性状是多基因控制的数量性状。植物的抗逆性(即植物对干旱、高盐、低温及病虫害的耐受性)不是由一个基因控制的，其性状受许多基因和环境的影响。转录因子可以调控多个与抗逆性状相关的基因的表达，通过增强一些关键调节因子的作用来促进这些抗逆基因发挥相应的作用，使植物的抗逆性得到改善。在提高植物应对逆境胁迫的分子育种中，与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的方法相比，敲除或增强一个关键的转录因子的调控能力，是提高植物抗逆性的有效方法和途径。
杂交构树(Broussonetia kazinoki×B.papyrifera)是中国科学院植物研究所利用小构树(B.kazinoki)与构树(B.papyrifera)杂交后经多代选育出的新品种。杂交构树是绿化、用材与饲料兼用的具有突出抗逆性的复合型多功能树种，是集造林、造纸、治沙、饲料、生态保护于一体的速生树种。具有生长速度快、丰产性强、耐砍伐、适应性强和开发利用机制达等特点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种的转录因子。
本发明所提供的转录因子，名称为BpSEM，来源于杂交构树(Broussonetiakazinoki×B.papyrifera)，为如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；
b)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
其中序列表中的序列1可由292个氨基酸组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质BpSEM，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质BpSEM可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质BpSEM的编码基因可通过将序列表序列2的第193-1071位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
与所述BpSEM相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的与所述BpSEM相关的生物材料，可为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码所述BpSEM的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述与所述BpSEM相关的生物材料中，A1)所述核酸分子可为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列2的第193-1071位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述BpSEM的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述BpSEM的DNA分子。
其中，序列表中序列2由1280个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列2的第193-1071位核苷酸，编码序列表中序列1所示的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码BpSEM的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的BpSEM的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码BpSEM且与植物抗逆性相关，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述表达盒包括启动子、编码所述BpSEM的核酸分子和终止子。所述启动子可为CaMV35S启动子。
所述重组载体可为将所述BpSEM的编码基因(即序列表序列2的第193-1071位所示的DNA分子)通过含有所述BpSEM的编码基因的表达盒插入出发质粒得到的重组质粒。所述重组载体具体可为先将序列表序列5所示的双链DNA分子插入载体pCAMBIA1300的HindⅢ和XbaI识别位点之间，然后将所述BpSEM的编码基因(即序列表的序列2自5'末端第193-1071位所示的双链DNA分子)插入XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点之间得到的重组载体。
所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。
所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具体可为根癌农杆菌GV3101。
所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述BpSEM的编码基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
所述BpSEM在调控植物抗逆性或制备调控植物抗逆性产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述BpSEM相关的生物材料在调控植物抗逆性或制备调控植物抗逆性产品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述BpSEM作为转录因子的应用也属于本发明的保护范围。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。
本发明所提供的一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入编码所述BpSEM的核酸分子，得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物。
上述培育转基因植物的方法中，所述编码所述BpSEM的核酸分子可为如下1)或2)或3)所示的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列2的第193-1071位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述BpSEM的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述BpSEM的DNA分子。
上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表中序列2由1280个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列2的第193-1071位核苷酸，编码序列表中序列1所示的蛋白质。
上述任一所述抗逆性具体可为抗旱性。
上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。
本发明提供了一个杂交构树转录因子BpSEM及其编码基因。实验证明，BpSEM定位于细胞核中；BpSEM基因在杂交构树愈伤组织中高表达，表现出其控制细胞胚性的功能；将本发明的转录因子BpSEM的编码基因在拟南芥中过表达，和野生型拟南芥相比，获得的纯合转基因植物的抗旱性明显提高，说明本发明提供的转录因子BpSEM及其编码基因可以提高植物的抗逆性。不仅对于鉴定和维持杂交构树及其他植物的干细胞系具有重要的理论和实际意义，而且还可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，在农业和经济能源作物领域具有较高的实际应用价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1为杂交构树幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2为3’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道M为TRANS2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为3’RACE PCR扩增产物。
图3为5’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道M为TRANS2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为5’RACE PCR扩增产物。
图4为PCR扩增BpSEM全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道M为TRANS2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物。
图5为BpSEM基因在不同组织中的表达结果。
图6为BpSEM基因的亚细胞定位结果。其中，图6A和图6E为转化的烟草表皮细胞在蓝光通道下(观察DAPI，确认细胞核的位置)的形态，图6B和图6F为转化的烟草表皮细胞在荧光通道下(GFP荧光蛋白的观察)的形态，图6C和图6G为明视场下的形态，图6D和图6H为三个视场的叠加。
图7为BpSEM的转录激活活性分析结果。其中，图7A表示各种转基因酵母在平板上的位置；图7B表示转基因酵母在不含His和Trp的SD培养基上的生长状况；图7C表示转基因酵母的β-半乳糖苷酶活性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的不含His和Trp的SD培养基是北京泛基诺科技有限公司的产品，产品编号为YGM003A-17。
下述实施例中的杂交构树是利用小构树与构树杂交后经多代选育出的新品种，公众可以中国科学院植物研究所获得，也可从北京乔纳森科技发展有限公司处购买获得。
下述实施例中的pCAMBIA1302载体是北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司的产品，产品目录号为MCV034-N。
下述实施例中的农杆菌EHA105是北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司的产品，产品目录号为MCC028。
下述实施例中的含有GAL4结合域的酵母表达载体pBridge是美国Clontech公司的产品，产品目录号为630404。
下述实施例中的含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系是美国Clontech公司的产品，产品目录号为K1612-1。
下述实施例中的pBridge-JcERF在文献“M.Tang,J.Sun,Y.Liu,F.Chen,S.Shen,Isolation and functional characterization of the JcERF gene,a putative AP2/EREBP domain-containing transcription factor,in the woody oil plant Jatrophacurcas,Plant Mol.Biol.63(2007)419–428..”中公开过，公众可以中国科学院植物研究所获得。
下述实施例中的烟草品种Nicotiana tabacum cv Xanth在文献“Hoi PX,Quy TD,Nghia PT,Tuteja N:Transfer of gene encoding for DNA unwinding helicase(pdh45)into tobacco plants(Nicotiana tabacum L.cv Xanthi)by using Agrobacterium andAnalysis of the Transformed plants.TAP CHI SINH HOC 2015,25(3):83-92.”中公开过，在下文中烟草品种Nicotiana tabacum cv Xanth简称为烟草。
实施例1、转录因子BpSEM的获得
一、BpSEM基因3’端序列的克隆
1、植物材料处理及总RNA的提取
以杂交构树幼苗(整株幼苗)为材料，提取杂交构树幼苗的总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果如图1所示：从图中看以看出：所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18S RNA。表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。
2、BpSEM基因3’端序列的克隆
(1)以步骤1提取的杂交构树幼苗的总RNA为模板，用PrimeScriptTM 1st StrandcDNA Synthesized Kit试剂盒(Takara公司)并参照试剂盒说明书的要求，反转合成其第一链cDNA。反应体系及反应条件如下：Oligo-dT(10pmol/μl)1μl，Total RNA(≤1μg)2μl，dNTPMixture(10mmol/l each)1.0μl，5×Buffer 4.0μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，PrimeScript RTase(200U/μl)0.5μl，RNase-free distilled water 11μl；65℃5min,42℃45min,70℃15min。将合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。
(2)以步骤(1)获得的第一链cDNA为模板，采用引物F1(5′-AAAGCAGCACAAGATGGACACCAACAAGTG-3′)与引物OligodT-adaptor5′-GATTTCTGTCCGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′进行PCR扩增，得到3’RACE PCR扩增产物。PCR反应体系为：cDNA模板、F1引物与OligodT-adaptor各1μl，10×Buffer 2.5μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)2μl，Taq酶0.25μl，ddH2O 12.25μl；反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，共36个循环；最后72℃延伸10min。
(3)反应结束后，对3’RACE PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道M为TRANS2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为3’RACE PCR扩增产物。结果表明：经PCR扩增获得了长度约为1000bp的目的片段。
(5)回收并纯化3’RACE产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，并对测序结果进行BLAST分析。结果表明，该片段的长度为1006bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示。
二、BpSEM基因5’端序列的克隆
(1)根据上述步骤一获得的BpSEM基因3’端cDNA序列设计引物：R1:5′-TGATGAATATTATTAGTAGTAGAAGTAGCATT-3′。
(2)以步骤一提取的经低温处理的杂交构树幼苗的总RNA为模板，采用Promega公司的5’RACE试剂盒并参照试剂盒说明书，反转录合成其第一链cDNA。反应体系及条件如下：1μl RNA，1μl 5'-CDS primer A，1μl SMART II A oligo，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl MMLV ReverseTranscriptase，2μl 5X First-Strand Buffer，2μl sterileH2O；70℃ 2min，冰上2min，42℃ 1.5h，72℃ 7min。
(3)以步骤(2)获得的第一链cDNA为模板，采用引物R1与引物UPM(Promega公司：Long(0.4μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，Short(2μM)：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3')配对进行PCR扩增，得到5’RACE PCR扩增产物。PCR反应体系为：1μl 50X Advantage 2Polymerase Mix，34.5μl PCR-Grade Water，5μl 10XAdvantage 2PCR Buffer，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl 50X Advantage 2Polymerase Mix，5μlUPM，1μl引物R，2.5μlcDNA模板；反应条件为：94℃30s；68℃30s，70℃60s，共40个循环；最后70℃延伸10min。
(4)反应结束后，对5’RACE PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。其中，泳道M为TRANS2000 DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为5’RACE PCR扩增产物。结果表明，经PCR扩增获得了长度约为500bp的目的片段。
(5)回收并纯化5’RACE产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，对测序结果进行BLAST分析。结果表明，该片段的长度为532bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。
三、BpSEM全长cDNA序列的获得及PCR检测
1、BpSEM全长cDNA序列的获得
利用上述步骤一和步骤二获得的长度为1006bp和532bp片段之间的重叠区，借助Contig软件拼接得到的全长cDNA序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示，将序列2所示的基因命名为BpSEM，其中，自5’端第193-1071为ORF，编码由292个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白命名为BpSEM，该蛋白的氨基酸序列为序列1。
2、PCR检测
(1)根据BpSEM基因全长cDNA序列设计如下引物：
F2：5′-GACCATCCCACATAACATTTTCACTTTC-3′；
R2：5′-GTGTCAAGACCATCGTCATATATAATAATCACAC-3′。
(2)以上述步骤一提取的经低温处理的杂交构树幼苗的总RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板，采用F2和R2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
(3)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。其中，泳道M为TRANS2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物。结果表明，经PCR扩增获得了长度约为1200bp的片段。
(4)回收并纯化该产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。
测序结果表明，该PCR扩增产物具有序列2所示的核苷酸序列。
实施例2、BpSEM在杂交构树不同组织和细胞中的表达模式分析
分别提取杂交构树不同组织和细胞(正常生长8周的杂交构树幼苗的顶芽、侧芽、根、叶片，杂交构树的雄花、雌花和果实，及对杂交构树诱导的胚性愈伤)的总RNA，反转录获得cDNA，并采用定量PCR方法分析BpSEM基因在不同组织和细胞中的表达模式。具体步骤如下：
1、引物的设计
根据杂交构树BpSEM的cDNA序列设计其特异性引物QF和QR：并以Bpactin基因作为反应的内参，引物序列如下：
QF：5′-TGAGCTAACCCTCAACTCCTACG-3′；
QR：5′-TCACACAATCATCATAAATAGAGCATG-3′；
Bpactin-F：5′-CCGTGCTCAATGGGATACTTC-3′；
Bpactin-R：5′-CCCTCGTCTGTGACAATGGTAC-3′。
2、定量PCR
分别以正常生长8周的杂交构树幼苗的顶芽、侧芽、根、叶片，杂交构树的雄花、雌花和果实，及对杂交构树诱导的胚性愈伤的cDNA为模板，采用上述步骤1设计的引物进行Q-PCR扩增。反应体系为：SYBR Green Mix 10μL，QF 0.4μL，QR0.4μL，dd H2O7.2μL，cDNA模板2μL(将反转录产物稀释10倍后作为模板)总体积：20μL。实时定量PCR反应采用两步法完成；反应程序为：95℃60s；95℃15s,65℃45s；40个循环。所得数据及Ct值的分析用Mx3000p软件进行。
结果如图5所示：从图中看以看出：BpSEM基因在杂交构树胚性愈伤中的表达水平最高，表现出干细胞维持的特性；在叶片、顶芽、侧芽等细胞分裂活动旺盛的区域，BpSEM基因的表达也相对较高；在杂交构树其他成熟组织中，如根和果实，BpSEM基因的表达量较低。
实施例3、转录因子BpSEM的功能验证
一、转录因子BpSEM的亚细胞定位
1、用限制性内切酶NcoI和SpeI分别对实施例1中的BpSEM基因(序列2)和载体pCAMBIA1302进行双酶切，连接，得到重组表达载体，将其命名为重组载体pCAMBIA1302-BpSEM。并对其进行测序。
经过测序表明：重组载体pCAMBIA1302-BpSEM为将序列表中序列2自5'末端第193-1071位所示的DNA分子替换载体pCAMBIA1302的NcoI和SpeI酶切位点间的DNA片段，且保持载体pCAMBIA1302的其他序列不变得到的载体。
2、将5μg上述重组载体pCAMBIA1302-BpSEM转入到农杆菌EHA105中，得到重组菌pCAMBIA1302-BpSEM/EHA105；
将5μg空载体pCAMBIA1302转入到农杆菌EHA105中，得到重组菌pCAMBIA1302/EHA105。
3、将重组菌pCAMBIA1302-BpSEM/EHA105和重组菌pCAMBIA1302/EHA105分别转化烟草表皮细胞进行瞬时表达，分别得到转入重组载体pCAMBIA1302-BpSEM的转基因细胞(图6A-D)和转入空载体pCAMBIA1302的转基因细胞(图6E-H)。
4、将上述转化后的细胞培养24-48小时后，于DAPI(10mM)中染色10～20min，在激光共聚焦扫描显微镜(Bio-Rad MRC 1024)下观察并照相。
结果如图6所示：其中，图6A和图6E为转化的烟草表皮细胞在蓝光通道下(观察DAPI，确认细胞核的位置)的形态，图6B和图6F为转化的烟草表皮细胞在荧光通道下(GFP荧光蛋白的观察)的形态，图6C和图6G为明视场下的形态，图6D和图6H为三个视场的叠加。从图中可以看出，转入空载体pCAMBIA1302的转基因细胞中表达的蛋白分布在整个细胞内，如图6F和图6H；而转入重组载体pCAMBIA1302-BpSEM的转基因细胞中表达的蛋白则定位于细胞核内，如图6B和图6D。结果表明：BpSEM定位于细胞核内。
二、转录因子BpSEM的转录激活活性分析
1、用限制性内切酶BamHI和SalI分别对实施例1中扩增得到的BpSEM基因(序列2)和含有GAL4结合域的酵母表达载体pBridge进行双酶切，连接，得到的重组载体pBridge-BpSEM。并对其进行测序。
测序结果表明：重组载体pBridge-BpSEM为将序列表中序列2自5'末端第193-1071位所示的DNA分子替换酵母表达载体pBridge的BamHI和SalI酶切位点间的DNA片段，且保持酵母表达载体pBridge的其他序列不变得到的载体。
2、将重组载体pBridge-BpSEM导入到含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系中，得到含有重组载体pBridge-BpSEM的转基因酵母；
将pBridge载体导入到含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系中，得到含有pBridge的转基因酵母，作为阴性对照；
将重组载体pBridge-JcERF导入到含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系中，得到含有pBridge-JcERF的转基因酵母，作为阳性对照。
3、将上述步骤2获得的含有重组载体pBridge-JcERF的转基因酵母、含有pBridge的转基因酵母和含有pBridge-JcERF的转基因酵母分别在不含His和Trp的SD培养基(SD/-His-Trp)上进行培养。
结果如图7所示。图7A表示各种转基因酵母在平板上的位置，图7B表示转基因酵母在不含His和Trp的SD培养基上的生长状况，图7C表示转基因酵母的β-半乳糖苷酶活性。结果表明，含有pBridge的转基因酵母在不含His和Trp的SD培养基上不能生长，而含有重组载体pBridge-BpSEM的转基因酵母和含有pBridge-JcERF的转基因酵母均能够在不含His和Trp的SD培养基上生长并显蓝色。说明BpSEM具有转录激活活性。
实施例4、转基因植物的获得
一、重组质粒的构建
以载体pCAMBIA1300(CAMBIA公司产品)为骨架载体，在Hind III和XbaI酶切位点之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子(CaMV35S启动子)，XbaⅠ和KpnⅠ酶切位点之间插入序列表的序列2自5'末端第193-1071位所示的双链DNA分子，得到重组质粒甲。
以载体pCAMBIA1300(CAMBIA公司产品)为骨架载体，在Hind III和XbaI酶切位点之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子(CaMV35S启动子)，得到重组质粒乙。
二、转基因植株的获得
1、将步骤一得到的重组质粒甲导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
2、取步骤1得到的重组农杆菌，通过浸花法转染哥伦比亚生态型拟南芥，然后培育植株并收获种子，即为T1代种子。
3、将步骤2得到的种子播种于含300mg/L潮霉素的MS固体培养基，筛选抗性植株(T1代植株)。
4、提取T1代植物的基因组DNA，进行PCR鉴定。
PCR鉴定的引物对如下：
QF：5′-TGAGCTAACCCTCAACTCCTACG-3′；
QR：5′-TCACACAATCATCATAAATAGAGCATG-3′。
如果PCR鉴定为阳性(PCR扩增得到约280bp的扩增产物)，该植株即为转基因植株。每个植株的后代即为一个株系。
5、将步骤4中PCR鉴定为阳性的植株自交并收获种子(T2代种子)。
6、将步骤5得到的种子培育为植株(T2代植株)并单株收种子(T3代种子)。
7、将T3代种子播种到含300mg/L潮霉素的MS固体培养基，筛选抗性不分离的纯合单株(即筛选其T3代种子不发生抗性分离的T2代植株，该植株为纯合的转基因植株)，将其种子(T3代种子)进行步骤三的各项检测和鉴定。
三、转空载体植株的获得
用重组质粒乙代替重组质粒甲进行步骤二，得到转空载体植株。
四、抗旱性
待测种子如下：L4株系(100粒T3代种子)、L15株系(100粒T3代种子)、转空载体植株(100粒T3代种子)和哥伦比亚生态型拟南芥(100粒种子)。L4株系和L15株系为随机取的两个纯合的转基因株系。
在装有相同重量土的花盆中播种待测种子并培养，从播种开始计时，第1-14天正常管理，第15-25天干旱处理(干旱处理即持续不浇水)，第26天开始正常管理(恢复浇水，简称复水)。第28天结束时(复水3天后)统计存活率。
哥伦比亚生态型拟南芥的存活率为5％，转空载植株的存活率为5％，L4株系的存活率为100％，L15株系的存活率为99％。结果表明，与哥伦比亚生态型拟南芥相比，L4株系和L15株系的抗旱性显著增加。
Figure IDA0000842396120000011
Figure IDA0000842396120000021
Figure IDA0000842396120000031
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Figure IDA0000842396120000061

Claims (28)

1.一种蛋白质，是如下a）或b）的蛋白质：
a）氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；
b）在序列表中序列1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子。
3.含有权利要求2所述核酸分子的表达盒。
4.含有权利要求2所述核酸分子的重组载体。
5.含有权利要求3所述表达盒的重组载体。
6.含有权利要求2所述核酸分子的重组微生物。
7.含有权利要求3所述表达盒的重组微生物。
8.含有权利要求4所述重组载体的重组微生物。
9.含有权利要求5所述重组载体的重组微生物。
10.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列2的第193-1071位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子。
11.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：与权利要求10所述核酸分子的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
12.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：在严格条件下与权利要求10或11所述核酸分子的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
13.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下a1）或a2）：
a1）在调控植物抗逆性中的应用；
a2）在制备调控植物抗逆性产品中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性。
15.权利要求2或10或11或12所述核酸分子的应用，为如下b1）或b2）：
b1）在调控植物抗逆性中的应用；
b2）在制备调控植物抗逆性产品中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性。
17.权利要求3所述表达盒的应用，为如下b1）或b2）：
b1）在调控植物抗逆性中的应用；
b2）在制备调控植物抗逆性产品中的应用。
18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性。
19.权利要求4或5所述重组载体的应用，为如下b1）或b2）：
b1）在调控植物抗逆性中的应用；
b2）在制备调控植物抗逆性产品中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性。
21.权利要求6-9任一所述重组微生物的应用，为如下b1）或b2）：
b1）在调控植物抗逆性中的应用；
b2）在制备调控植物抗逆性产品中的应用。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性。
23.权利要求1所述蛋白质作为转录因子的应用。
24.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子，得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子为序列表中序列2的第193-1071位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子。
26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子为与权利要求25中所述核酸分子的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于：所述编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子为在严格条件下与权利要求25或26中所述核酸分子的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
28.根据权利要求24-27任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性。
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