KR101993431B1 - 단량체형 및 다량체형 면역원성 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 펩타이드 및 HCV, HIV, CMV 및 플루 (Flu)에 의한 감염 등의 감염성 질환 또는 자가면역 질환의 치료, 진단 및 예후를 위하여 대상체의 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료 및 진단에 유용한 펩타이드를 동정 및 제공하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

단량체형 및 다량체형 면역원성 펩타이드{MONOMERIC AND MULTIMERIC IMMUNOGENIC PEPTIDES}
본 발명은 신규한 펩타이드 및 예컨대 HCV, HIV, CMV 및 플루 (Flu)에 의한 감염 등의 감염성 질환과 관련된 병원체 및 자가면역 질환과 관련된 항원에 의한 감염의 치료, 진단 및 예후에 있어서 체액성 또는 B-세포 면역을 자극하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 예컨대 이러한 질환들의 치료 및 진단에 있어서 체액성 또는 B-세포 면역을 자극하는 데 유용한 펩타이드를 동정 및 제공하기 위한 방법에 관한 것이다.
백신접종 (vaccination)은 감염에 앞서 특정 병원체에 대한 면역 반응을 자극하기 위함이 목적이다. 그 병원체에 한 개체가 노출되는 경우, 감염 확립을 방지하는 메모리 반응이 촉발된다. 그러므로, 선천성 면역과는 달리 오래 유지되고 메모리를 갖는 후천성 면역을 자극한다. 후천성 면역계에는 두 가지 주요한 가지가 있다; 바이러스 입자와 결합할 수 있는 항체들 및 감염을 중화할 수 있는 특정 항체들을 발생시키는 것과 관련된 체액성 면역과, HLA 클래스 I의 맥락에서 바이러스 에피토프를 노출하게 되는 감염된 세포를 죽이는 세포독성 T-세포를 발생시키도록 이끌어, 이러한 방식으로 감염된 세포를 제거하는 세포 매개 면역이 그것이다.
성공적인 백신접종 캠페인 덕분에 제거된 유일한 질환은 천연두이다. 캠페인은 현재 소아마비를 뿌리뽑고자 진행중이다. 백신접종으로 제거될 수 있는 바이러스 감염의 특징은 그들이 안정적인 바이러스 항원 (즉, 매우 낮은 돌연변이 빈도, 극소수 아형)을 갖는 바이러스들에 의하여 야기되고, 다른 동물종에서는 보유되지 않으며, 일단 감염이 종료된 신체에서는 지속되지 않고, 이에 백신접종은 장기적으로 지속되는 면역을 이끌어 내게 된다는 것이다. 소아마비 바이러스와 홍역 바이러스와 같은 바이러스들은 이러한 기준을 충족시키는 반면, 인플루엔자 바이러스, HCV 및 HIV와 같이 그 단백질 서열을 변화시키는 바이러스들은 그렇지 아니하다. 이러한 이유로, 이들 질환에 대한 백신 개발을 위하여는 새로운 대체 접근법이 요구된다.
헤파타이티스 C는 헤파타이티스 C 바이러스 (HCV) 감염으로부터 비롯되는 간 질환이다. 이것은 그 중증도에 있어서, 몇 주간 지속되는 약한 병증으로부터 심각하게 평생 지속되는 병증에 이르는 범위일 수 있다. 헤파타이티스 C는 혈액을 통하여 전파된다; 가장 흔한 전파 형태는 주사바늘 또는 약물 주입에 사용된 기타 기구들을 공유하는 것을 통해서이다. 이 감염은 "급성" 또는 "만성" 중 하나일 수 있다. 급성 HCV 감염은 누군가 헤파타이티스 C 바이러스에 노출된 후 최초 6 개월 이내에 일어나는 무증상의 단기 병증이다. 대부분의 사람들에게서, 급성 감염은 만성 감염의 원인이 되고, 이것은 장기간의 합병증과 심지어 죽음이라는 결과를 낳을 수 있다.
전 세계적으로 1억 7천만 명의 사람들이 HCV에 감염된 것으로 추산되고, 이것은 전세계 인구의 약 3%와 같은 것이다. 또한, 매년 대략 3~4백만 명의 사람들이 감염되고 있고; 이들 새로이 감염된 환자들 중 추산 80%는 만성 감염으로 진행한다.
HCV는 약 50 nm 직경의 엔벨로프형 (enveloped) 양성 가닥 (positive stranded) 리보핵산 (RNA) 바이러스로, 감염된 세포의 세포질에서 복제하는 플라비비리대 (Flaviviridae) 과 헤파시바이러스 (Hepacivirus) 속에 속한다. 이 바이러스가 실험적으로는 침팬지에게 전달됨에도, HCV에 대하여 유일하게 알려진 숙주는 인간이다. HCV의 자연적 타겟은 간세포이고 B-림프구도 가능하다. 2008년 현재, 이 바이러스의 6 가지 상이한 유전자형과 100 가지 이상의 아형이 알려져 있다. 복제는 교정 (proofreading) 기능이 없는 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제를 통하여 이루어지고, 그 결과 돌연변이 비율이 매우 높다. 엔벨로프 단백질을 코딩하는 HCV 게놈의 초가변 부위에서 일어나는 빠른 돌연변이는 바이러스로 하여금 숙주의 면역 감시를 회피할 수 있도록 한다. 그 결과, 대부분의 HCV 감염자들은 만성 감염으로 진행한다.
HCV의 상기 6 가지 유전형은 지리적으로 상이하게 확산된다. 초기 단계에서 상기 질환은 일반적으로 무증상이고; 만성 감염인 대부분의 환자들은 결국 간 섬유증 및 간경변과 같은 합병증으로 진행하고, 1~5%의 경우 간세포 암으로 진행한다.
HCV는 세계적으로 비(非) A형 간염, 비(非) B형 간염의 주요 원인이다. HCV에 의한 급성 감염은 자주 만성 간염의 원인이 되고 말기 간경변의 원인이 된다. HCV 만성 보균자의 최대 20%가 약 20 년이 지난 후 간경변으로 발전할 수 있고 간경변을 앓는 환자들 중 1 내지 5%가 간 암으로 발전할 위험이 있다.
인플루엔자는 전 세계적 사망률 및 이병율의 중요 원인으로 남아있다. 세계보건기구 (WHO)는 시즌형 (seasonal) 전염병이 매년 3~5백만 명의 사람들에게 영향을 미치고 250,000~500,000 명이 사망하는 결과를 낳는다고 추정하고 있다. 인플루엔자는 음성 가닥 RNA 바이러스인 오르소믹소비리대 (Orthomyxoviridae) 과의 바이러스에 의하여 유발된다. 인플루엔자 바이러스는 3 가지 형태, A, B 및 C로 존재하는데, 이들 중 A만이 유행병과 관련되어 있다. A형 바이러스는 인간 및 동물 양자 모두에서 발견되는데, 특히 조류에서 발견되지만 돼지와 같은 다른 포유류에서도 발견된다. A형 바이러스는 바이러스 표면 단백질의 여러가지 종류 및 조합에 따라 아형으로 더욱 유형화된다. 많은 아형들 중, 인플루엔자 A (H1N1) 및 A (H3N2) 아종이 2009년에 인간에게서 유행하였다. 인플루엔자 A와 B는 시즌형 백신에 포함된 반면, 인플루엔자 C는 드물게만 발생하므로 시즌형 백신에 포함되지 않는다. B형 바이러스는 인간 특이적이고 C형 바이러스는 매우 경미한 질환을 일으킨다. 오르소믹소바이러스의 게놈은 분절화 되어 있다. 인플루엔자바이러스 A형과 B형은 8 개의 분절을 갖는 반면, C형은 7개를 갖는다. 2 가지 상이한 A형 바이러스가 동일한 세포를 감염시키는 경우, 유전자 분절의 재배열 결과 유행병 (pandemic)이 발생할 수 있다. 이러한 신규한 재배열 바이러스에 대하여는 어떠한 집단에서도 면역이 존재하지 않는다. 20 세기에 3 번의 유행병이 발생하였다: 1918년 "스페인 인플루엔자", 1957년 "아시아 인플루엔자" 및 1968년 "홍콩 인플루엔자"가 그것이다. 1918년의 유행병은 전 세계적으로 추산, 4천~5천만 명을 사망케 하였다. 이후 유행병은 훨씬 약하여 1957년에는 추산 2백만 명이 사망하고 1968년에는 추산 백만 명이 사망하였다. 2009년 6월에 WHO는 인플루엔자 바이러스 H1N1에 의한 유행병을 선언하였고 (돼지 독감), 2010년 8월 종결 선언하였다.
인간 파필로마바이러스는 피부 및 점막을 감염시키는 파필로마비리대 (Papillomaviridae) 과의 DNA 바이러스군으로 구성된다. 확인된 100 종 이상의 상이한 아형들로부터 유래하는 2 개의 군이 임상 문제의 주요한 원인이다: 사마귀 (양성 및 생식기 사마귀 양자 모두)를 일으키는 것들과, 자궁 경부암을 일으킬 수 있는 12 가지 "고위험" 아형군이 그것이다. 이러한 후자의 군은 거의 모든 종류의 자궁 경부암 발생의 기여 요인으로서 원인이 되고 있다. 전 세계적으로, 여성에게 있어서 자궁 경부암은 두번째로 흔한 악성 질환으로 남아있고, 개발 도상국에서 암 관련 여성 사망의 주된 원인이다. HPV 16 및 18은 주로 자궁 경부암과 관련되어 있으나; 이 바이러스는 남성과 여성 모두에게서 인후 암의 원인이기도 하다. HPV는 접촉에 의하여 전파되고 찰과상을 통하여 피부로 진입한다. 초기 단백질들만이 발현되는 불완전 감염이 암 발생과 연관된다.
대상체에서 체액성 면역을 자극하는 면역원으로 사용될 수 있는 다량체형, 예컨대 이량체형 펩타이드 등의 펩타이드를 제공하는 것이 본 발명 실시 상태의 한 가지 목적이다.
특히, B 림프구 계보의 세포들 (B 세포)을 자극하는, 항원의 에피토프를 포함하는 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드를 제공하여 그 항원에 대한 항체를 분비케 하는 것이 본 발명 실시 상태의 한 가지 목적이다.
본 발명에 따른 펩타이드에 의하여 이루어지는 B 세포 활성화는 T 세포 비의존성 및 T 세포 의존성 양자 모두일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 그 일부는 B 세포 수용체와 반응하여 T 헬퍼 세포 의존적 또는 비의존적 방식 중 어느 하나의 방식을 통하여 B 세포를 활성화시켜 특정 항체를 생산할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 항원 제시 세포 (대식세포 및/또는 수지상 세포)에 의하여 흡수되어 상기 펩타이드 내 에피토프가 정확히 프로세싱되어 T-림프구, 예컨대 헬퍼 T 세포에 제시될 수 있고, 이것은 차례로 효과적인 면역 반응을 자극하기 위하여 B 세포를 활성화시키는 것을 보조한다. 상기 펩타이드는 또한 항원 제시 세포로서 기능할 수도 있는 활성화된 B 세포에 의하여 흡수될 수도 있다. 펩타이드는 B 세포 수용체를 통하여 B 세포와 반응하고, 그 후 세포 내로 내포화된다. 펩타이드 내의 에피토프는 프로세싱되어 헬퍼 세포와 같은 T 림프구에 제시되게 된다.
그러나, 본 발명의 몇 가지 중요한 측면에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드는 효율적으로 침투하지 않고 항원 제시 세포에 의하여 흡수되도록 설계된다. 따라서, 본 발명의 이러한 측면에 있어서, 본 발명의 상기 펩타이드는 B 세포 수용체를 통한 세포 표면에서의 상호작용을 통하여 B 세포 활성화를 제공할 수 있다. 지속적인 B 세포 자극을 제공하기 위하여, 본 발명에 따른 펩타이드는, 대상체에서 효과적인 체액성 면역을 지속시킬 수 있는 CD4+ T 헬퍼 세포를 자극하기 위하여, 항원 제시 세포에 의하여 흡수될 수 있는 헬퍼 에피토프를 포함하도록 설계되는 것이 양호하다는 것을 이해하여야 한다.
또한, 항원으로 사용될 수 있는 펩타이드를 제공하고, 이 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물 및 방법을 제공하는 것이 본 발명의 실시 상태의 한 가지 목적이다.
또한, 진단 시험에서 표적으로 작용할 수 있는, 항원으로서 사용될 수 있는 펩타이드를 제공하는 것이 본 발명의 실시 상태의 한 가지 목적이다.
발명의 요약
본 발명은 펩타이드 설계에 포함된 항원에 대한 체액성 면역 반응의 효과적인 활성화를 촉진하는 그 펩타이드 설계에 관한 것이다.
본 발명의 발명자들은 펩타이드 컨스트럭트 - 특정 패턴 또는 스캐폴드 설계를 함유하는 아미노산 서열, 및 특히 이 설계의 다량체형, 예컨대 이량체형 펩타이드 - 가 이들 펩타이드의 투여에 대한 반응에 있어서 환자의 체액성 면역 반응을 효과적으로 이끌어 내는 능력을 가진다는 것을 알아내었다.
본 발명에 따른 펩타이드 컨스트럭트는 세포 표면에 부착 또는 결합할 수 있도록 설계되었다. 상기 펩타이드 컨스트럭트 또는 이들의 일부는, 그 후 항원 제시 세포 (예컨대, 대식세포 및 수지상 세포)에 의하여 흡수되어, 효과적이고 장기 지속적인 T 세포 의존성 B 세포 활성화를 이끌어내기 위하여 헬퍼 T 세포를 자극할 수 있다. 또는, 상기 B 세포 자체가 B 세포를 활성화시키는 것을 돕기 위하여 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 세포로 침투할 수 있고 대식세포 및 수지상 세포에 의하여 제시될 수 있는 면역적으로 유효한 양의 펩타이드 또는 그 펩타이드의 단편을 세포로 인입하는데 사용될 수 있다. 따라서, 이들 펩타이드 컨스트럭트는 세포 독성 T-림프구 (CTL) 면역 반응 및/또는 체액성 면역 반응 양자 모두를 이끌어낼 수 있다.
그러므로, 본 발명의 제1 측면은 하기 구조를 갖는 60개 이하의 아미노산으로 이루어지는 단리된 단량체형 펩타이드에 관한 것이고,
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (화학식 I),
여기서, X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 노르류신, 글루타민, 세린, 리신, 트립토판, 시스테인 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 임의의 아미노산으로 이루어지는 선형의 서열을 의미하고; X2, X4, 및 임의의 모이어티 X6는 각각 독립적으로 5~17개의 아미노산으로 이루어지는 선형 서열을 의미하되, 이들 선형 서열 각각은 특정한 천연의 항원과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이다.
제2 측면에 있어서, 본 발명은 2 이상의 단량체형 펩타이드를 포함하는 단리된 다량체형 펩타이드에 관한 것이고, 각 단량체형 펩타이드는 독립적으로 하기 구조를 갖는 60개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것이며,
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (화학식 I),
여기서, X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 노르류신, 글루타민, 세린, 리신, 트립토판, 시스테인 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 임의의 아미노산으로 이루어지는 선형의 서열을 의미하고; X2, X4, 및 임의의 모이어티 X6는 각각 독립적으로 5~17개의 아미노산으로 이루어지는 선형 서열을 의미하되, 이들 선형 서열 각각은 특정한 천연의 항원과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이고, 상기 단량체형 펩타이드들은 하나 이상의 분자간 결합에 의하여 공유적으로 연결된 것이다.
제3 측면에 있어서, 본 발명은 하기 구조를 갖는 60개 이하의 아미노산으로 이루어지는 단리된 단량체형 펩타이드에 관한 것이고,
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (화학식 I),
여기서, X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 노르류신, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 세린, 리신, 트립토판, 시스테인, 오르니틴, 디아미노프로피온산 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 임의의 아미노산으로 이루어지는 선형의 서열을 의미하고; X2, X4, 및 임의의 모이어티 X6는 각각 독립적으로 5~17개의 아미노산으로 이루어지는 선형 서열을 의미하되, 이들 선형 서열 각각은 특정한 천연의 항원과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 2 이상의 단량체형 펩타이드를 포함하는 단리된 다량체형 펩타이드에 관한 것이고, 각 단량체형 펩타이드는 독립적으로 하기 구조를 갖는 60개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것이며,
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (화학식 I),
여기서, X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 노르류신, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 세린, 리신, 트립토판, 시스테인 오르니틴, 디아미노프로피온산 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 임의의 아미노산으로 이루어지는 선형의 서열을 의미하고; X2, X4, 및 임의의 모이어티 X6는 각각 독립적으로 5~17개의 아미노산으로 이루어지는 선형 서열을 의미하되, 이들 선형 서열 각각은 특정한 천연의 항원과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이고, 상기 단량체형 펩타이드들은 하나 이상의 분자간 결합에 의하여 공유적으로 연결된 것이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 단량체형 펩타이드로부터 선택되는 2 이상의 화합물 및 본 발명에 따른 단리된 다량체형 펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은, 대상체의 체액성 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명에 따른 단량체형 펩타이드로부터 선택되는 펩타이드 및 본 발명에 따른 단리된 다량체형 펩타이드의 용도에 관한 것이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 단리된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 단량체형 펩타이드, 단리된 다량체형 펩타이드, 펩타이드 조성물, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터를; 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 운반체 및 필요에 따라 면역성 아쥬반트와 조합하여 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 이 면역원성 조성물은 백신 조성물의 형태이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 단량체형 펩타이드, 단리된 다량체형 펩타이드, 펩타이드 조성물, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 질환 항원의 병리학적 효과를 저감 및/또는 지연시키기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 항원은, 예컨대 감염원으로 감염된 대상체 또는 상기 항원에 의하여 야기되는 상기 질환을 앓고 있는 대상체의 감염원 등이며, 상기 방법은 본 발명에 따른 하나 이상의 단량체형 펩타이드, 단리된 다량체형 펩타이드, 펩타이드 조성물, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터 또는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 또는 질환 항원, 예컨대 감염원으로 감염되거나 상기 항원에 의하여 야기되는 상기 질환을 앓는 대상체의 감염원 등의 병리학적 효과를 치료하기 위한 본 발명에 따른 펩타이드에 관한 것이다.
또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 진단 시험에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩타이드에 관한 것이다. 또 한 가지 측면에 있어서, 본 발명은 시험관 내 (in vitro) 시험에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩타이드에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
정의
"하나 (one)" 또는 "하나 (a 또는 an)"라는 용어가 본 명세서에서 사용되는 경우 달리 표시되지 않는 한 이들은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상의"를 의미한다. 또한, "포함한다 (comprising)"라는 용어는 "포함한다 (including)"를 의미하는 것이고, 따라서 명시적으로 기재된 것 외 다른 구성, 특징, 조건 또는 단계의 존재를 허용하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바, "다량체형 펩타이드" 또는 "올리고 펩타이드"는, 좋기로는 하나 이상의 화학 결합 링커에 의하여 상호 연결되거나 모인, 2 이상의 상이하거나 동일한 선형 펩타이드 서열 또는 서브유닛의 회합체를 말한다. 좋기로는 상기 펩타이드 서열은 하나 이상의 결합, 예컨대 하나의 공유 결합, 예컨대 두 Cys 잔기간 이황화 결합 (S-S), N-ε-메틸화 Lys 측쇄와 Asp 또는 Glu 잔기의 측쇄간 메틸화된 펩타이드 결합, 옥심 결합 또는 티오에테르 결합으로 상호 연결된다. 상기 용어는 2 개의 선형 펩타이드 서열의 화학적 연결에 의하여 적절히 형성되는 이량체형 (또는 이량체) 펩타이드를 포함한다. 또한, "다량체형 펩타이드"라는 용어는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 상이하거나 동일한 펩타이드 서열의 회합체를 포함한다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 다량체형 펩타이드는 이량체형 펩타이드이다.
본 명세서에서 사용되는 바, "링커"는 2 이상의 상이하거나 동일한 선형 펩타이드 서열 또는 서브유닛의 다량체형 펩타이드로의 회합에 적합한 임의의 화합물을 말한다. 이 용어는 펩타이드 화학에 있어서 유용하다고 밝혀진 임의의 링커를 포함한다. 상기 다량체형 펩타이드를 표준 펩타이드 결합에 의하여 선형으로 회합 또는 연결될 수 있으므로, 링커라는 용어는 "펩타이드 스페이서"를 포함하기도 하며, "스페이서"로도 일컫는다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 링커는 펩타이드 서열이 아니다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 링커는 분지형 펩타이드 서열이 아니다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 링커는 그 자체가 천연 항원으로부터 유래하거나 그와 동일한 펩타이드 서열을 함유하지 않는다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 링커는 10 kDa 미만, 예컨대 9 kDa 미만, 예컨대 8 kDa 미만, 예컨대 7 kDa 미만, 예컨대 6 kDa 미만, 예컨대 5 kDa 미만, 예컨대 4 kDa 미만, 예컨대 3 kDa 미만, 예컨대 2 kDa 미만, 예컨대 1.5 kDa 미만, 예컨대 1 kDa 미만, 예컨대 0.5 kDa 미만, 예컨대 0.2 kDa 미만의 분자량을 갖는다. 다량체형 펩타이드가 이량체형 펩타이드인 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 링커는 제1 펩타이드의 말단 시스테인과 제2 펩타이드의 두번째 말단 시스테인으로 두 펩타이드 서열을 연결하고 있지 않다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 링커는 펩타이드들 중 어느 하나에 함유된 말단 시스테인을 통하여 2 이상의 펩타이드 서열을 연결하고 있지 않다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 링커는 시스테인 잔기로 연결하고 있지 있다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에 있어서 동일한 펩타이드 내의 X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 서열에 있어 동일하지 않다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에 있어서 동일한 펩타이드 내의 X2, X4 및 임의적 모이어티 X6는 서열에 있어 동일하지 않다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드에 있어서 한 펩타이드 내 X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 임의의 다른 펩타이드 내 X1, X3 및 임의적 모이어티 X5와 서열에 있어 동일하지 않다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드에 있어서 한 펩타이드 내 X2, X4 및 임의적 모이어티 X6는 임의의 다른 펩타이드 내 X2, X4 및 임의적 모이어티 X6와 서열에 있어 동일하지 않다.
"HIV"는 일반적으로 인간 면역결핍 바이러스 I을 의미한다.
"HIV 질환"은 종종 그 자체로 독감 유사 감염처럼 나타나는 급성 HIV 감염 및 초기 및 중기 단계 증상 질환, 예컨대 피부발진, 피로, 야한증, 약간의 체중 감소, 구강 궤양과 피부 진균 및 손톱 감염 등을 포함하는 몇 가지 단계로 이루어진다. 대부분의 HIV 감염자들은 보다 심각한 병증으로 진행되기 전 이와 같은 경미한 증상들을 경험할 것이다. 일반적으로 상기 경미한 증상이 최초로 나타나는 데 5년 내지 7년이 걸린다고 여겨진다. HIV 질환이 진행되면서, 일부 사람들은 HIV 질환의 후기 단계인 에이즈 (하기 참조)로 진단되기 전일지라도 상당히 아플 수 있다. 일반적인 문제는 만성적인 구강과 질의 염증 (진균 발진 또는 반점), 입 (감기 염증) 또는 생식기의 헤르페스 물집의 재발, 지속적 발열, 지속적 설사 및 심각한 체중 감소를 포함한다. "에이즈"는 후기 단계 HIV 질환이고, 점진적으로 면역계의 효율을 저감시키고 사람을 감염 및 종양에 민감하게 하는 질환이다.
본 명세서에서 사용되는 "세포침투 펩타이드"라는 용어는 겉으로 보기에 에너지 독립적으로 진핵 및/또는 원핵 세포의 세포막을 통과하여 세포질 및/또는 핵 구역 중 어느 구역 내, 예컨대 세포질, 핵, 리소좀, 소포체, 골지체, 미토콘드리아 및/또는 엽록체 내로 위치 이동할 수 있는 펩타이드를 말한다. "세포침투 펩타이드"의 세포막을 가로질러 이동하는 이러한 능력은 비침습적, 에너지 독립적, 비포화절 및/또는 수용체 독립적인 것일 수 있다. 한 가지 실시 상태에 있어서, "세포침투 펩타이드"라는 용어는 실시예에서 제공되는 시험에 의하여 결정되는 바, 세포막을 가로질러 이동하는 것으로 입증된 펩타이드를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 "비(非) 세포침투 펩타이드"라는 용어는 세포침투 펩타이드가 아닌 펩타이드를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 제공원 (예컨대, 바이러스 등)으로부터 유래한 펩타이드를 일컫는 경우 "항원으로부터 유래한"이라는 용어는 상기 제공원으로부터 얻어진 (예컨대, 단리된, 정제된 등등) 펩타이드를 말하는 것이다. 보통, 상기 펩타이드는 최초 제공원으로부터 조정되고 변형된다. 좋기로는, 상기 펩타이드는 유전자 조작되고 및/또는 제공원의 본래 펩타이드와 근본적으로 동일하게 화학적으로 합성될 수 있다. 이 용어는, 공지된 본래 펩타이드 서열의 변이형을 사용하는 것을 포함하는데, 예컨대 상기 본래 펩타이드 서열 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 펩타이드 서열 등, 예컨대 보존 치환을 포함한다. 또는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 아미노산은 제거되거나 본래 펩타이드 서열에 부가된다. 따라서, 몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드 서열은 한 항원으로부터 유래된 5~17개 아미노산으로 이루어진 서열로서 정의되는 서열 X2 및/또는 X4, 및/또는 X6을 포함하고, 여기서 상기 항원의 펩타이드 서열은 상기 항원에 비하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 치환, 부가 또는 결실, 예컨대 아미노산 서열 X2 및/또는 X4, 및/또는 X6의 N-말단 또는 C-말단에 아르기닌의 부가를 포함한다. 본 발명에 따른 아미노산 서열에서 사용되는 아미노산은 L-형 및/또는 D-형 양자 모두일 수 있다. 동일한 펩타이드 서열 내에서 여러 가지 아미노산으로 L-형 및/또는 D-형 양자 모두가 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 펩타이드 서열 내 상기 아미노산들은 L-형, 예컨대 천연 아미노산이다. 본 발명에 따른 컨스트럭트에서 임의의 공지된 항원이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
몇 가지 특정 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 아미노산 서열의 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산은 D-형이다. 이들 세포침투 펩타이드들이 N-말단에 D-형 아미노산을 가짐으로써 N-말단 트리밍과 그에 의한 펩타이드의 분해가 다소 지연된다고 추정된다. 또는 몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 아미노산 서열의 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산은 베타 또는 감마형의 아미노산이다. 베타 아미노산은 그들의 아미노기가 20 종의 천연 표준 아미노산에서와 같이 알파 탄소에 결합되기 보다는 베타 탄소에 결합되어 있다. 아미노산 잔기를 나타내는 문자 뒤 대문자 D 첨자는 본 명세서에서 D-형으로 특정된 아미노산을 지정하고, 예컨대 WD는 D-형의 트립토판을 말한다. 아미노산 잔기를 나타내는 문자 뒤 대문자 L 첨자는 본 명세서에서 L-형으로 특정된 아미노산을 지정하고, 예컨대 WL은 L-형의 트립토판을 말한다.
또는, 본 발명에 따른 아미노산 서열의 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산은 불소를 포함시켜 변형될 수 있고, 또는 환형 아미노산 또는 기타 적절한 비천연 아미노산이 사용된다.
다량체형 펩타이드 하나 이상, 예컨대 모든 펩타이드 가닥은 그 아미노산 서열의 N-말단에 변형 아미노산을 가질 수 있음을 이해하여야 한다. 특히, 하나 이상의 펩타이드 가닥이 아미노산 서열의 N-말단에 변형 아미노산을 갖는다면, 2 이상의 펩타이드 가닥을 연결하는 링커는 펩타이드 가닥 내 어디에도 위치할 수 있다. 또한, 상기 링커는 종종 N-말단 분해와 같은 분해로부터 펩타이드를 보호하는 기능을 할 수도 있다. 따라서, 하나 또는 두 펩타이드 가닥 모두가 분해로부터 보호된다면 상기 링커는 더욱 자유롭게 위치할 수 있다.
펩타이드의 "변이형" 또는 "유사형"은 레퍼런스 펩타이드, 통상 본래 폴리펩타이드 또는 "모(母)" 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 말한다. 상기 펩타이드 변이형은 본래 아미노산 서열 내 특정 위치에서 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다.
"보존적" 아미노산 치환은 한 아미노산 잔기가 유사한 물리화학적 성질의 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유산한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 이 기술 분야에 공지되어 있고, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 플롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 보존적 아미노산 치환의 특정한 형태는 유전자 코드에 의하여 코딩되는 일반적인 20 종의 아미노산에 속하지 않는 아미노산을 이용하는 치환을 포함한다. 본 발명의 양호한 실시 상태들은 합성 펩타이드의 사용을 수반하기 때문에, 본 명세서에 개시된 펩타이드에 이러한 "천연적으로 존재하지 않는" 아미노산 잔기를 제공하는 것은 문제가 없고, 이로써 아미노산 잔기의 측쇄에 있어서 천연의 포화 탄소쇄를 더 짧거나 더 긴 포화 탄소쇄로 교체하는 것이 가능하다 - 예컨대, 리신은 측쇄 -(CH2)nNH3를 갖는 아미노산, 여기서 n은 4가 아닌 아미노산으로 치환될 수 있고, 아르기닌은 측쇄 -(CH2)nNHC(=NH2)NH2을 갖는 아미노산, 여기서 n은 3이 아닌 아미노산으로 치환될 수 있는 등이다. 유사하게, 아스파르트산 및 글루탐산 아미노산은 측쇄 -(CH2)nCOOH를 갖고, n>2인 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
두 아미노산 서열이라는 문맥상에서 "실질적으로 동일한"이라는 용어는 디폴트 갭 웨이트를 이용, GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의하는 등 최적으로 정렬되었을 때, 서열들이 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 2 개의 상이한 펩타이드 서열간 서열 동일성을 측정하는 경우, 상기 두 펩타이드 서열이 서열 동일성 값에 어떠한 영향을 미치지 않고 정렬된다면 하나 또는 2개의 아미노산 차이는 허용된다. 일부 실시 상태에 있어서, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의하여만 다르다. 서열 동일성은 통상 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형, 예컨대 보존적 아미노산 치환 등에 정렬시킨 유사도 측정을 이용하여 유사한 서열을 매치시킨다. 예를 들어, 공공이 이용가능한 GCG 소프트웨어는 밀접 연관된 폴리펩타이드들 간, 예컨대 생물들의 상이한 종으로부터의 상동 폴리펩타이드들 간 또는 야생형 단백질과 그들의 돌연변이 단백질 간 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위하여 디폴트 파라미터를 가지고 이용될 수 있는 "GAP" 및 "BESTFIT"과 같은 프로그램을 포함한다. 예컨대, GCG 버전 6.1을 참고한다. 폴리펩타이드 서열은 디폴트 또는 권장되는 파라미터들을 적용하여 FASTA 또는 ClustalW을 이용하여 비교될 수도 있다. GCG 버전 6.1.의 프로그램인, FASTA (예컨대, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 및 서치 서열 간 최적 오버랩 부위의 얼라인먼트와 서열 동일성 백분율을 제공한다 (Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219). 다양한 생물들로부터의 다수 서열들을 포함하는 데이터베이스와 한 서열을 비교하는 경우 또 다른 양호한 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp이다. 예컨대, 각각이 본 명세서에 참고로 포함된 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990;215:403-410]; [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997)]을 참고한다. 실질적으로 동일한 두 아미노산 서열 중 "대응하는" 아미노산 위치는 통상 디폴트 파라미터를 사용하는, 본 명세서에 언급된 임의의 단백질 분석 소프트웨어에 의하여 정렬된 위치를 말한다.
"단리된" 분자는 그것이 발견되는 조성물 중에서 그것이 속하는 분자류에 대하여 우세한 종인 분자이다 (즉, 이것은 상기 조성물 중 분자 유형의 약 50% 이상을 구성하고, 통상 그 분자종들, 예컨대 조성물 중 펩타이드 중의 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 그 이상을 구성할 것이다). 일반적으로, 특정 펩타이드 서열로 이루어지는 조성물은 그 조성물 중에 존재하는 모든 펩타이드 종들의 맥락에서 펩타이드에 관하여 또는 적어도 제안된 용도의 맥락에서 실질적으로 활성인 펩타이드 종들에 관하여 98%~99% 균질성을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바 "선형 서열"이라는 용어는 N-말단으로부터 C-말단 방향으로의 표준 펩타이드 결합에 의하여 연결되는 특정 아미노산 서열을 말한다. 상기 펩타이드는 펩타이드 결합만을 포함할 수 있다. 그러나, 몇 가지 실시 상태에 있어서, 펩타이드 서열의 제2 부분은 아미노산 서열의 제1 부분의 말단 아미노산의 측쇄와 결합하고 그로부터 계속될 수 있다. 또한, 상기 용어는 X1, X2, X3, X4, 및/또는 X5와 같은 서열 내 아미노산이, 예컨대 측쇄를 통하여 그 펩타이드 서열 내 먼 위치, 예컨대 X1, X2, X3, X4, 및/또는 X5 내의 먼 위치의 다른 아미노산과 연결될 수 있다는 것을 배제하지는 않는다.
본 발명의 문맥상, "치료" 또는 "치료하는"은 문맥상 모순되지 않는 한 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 임상적으로 관계된 징후들을 예방, 완화, 관리, 치료 또는 감소시키는 것을 말한다. 예를 들어, 질환 또는 질병의 어떠한 증상 또는 임상적으로 관계된 징후가 확인되지 않은 환자의 "치료"는 예방적이거나 예방 요법인 반면, 질환 또는 질병의 증상 또는 임상적으로 관계된 징후가 확인된 환자의 "치료"는 일반적으로 예방적이거나 예방 요법을 구성하지 않는다.
"항원"이라는 용어는 면역계의 특이적 인식 요소 (항체, T-세포)에 의하여 인식되는 물질을 의미한다.
본 발명의 문맥상 "면역원"이라는 용어는 개체의 후천성 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 의미하고, 상기 후천적 면역 반응은 상기 면역원을 표적으로 하는 것이다. 본 발명에 있어서, 하나의 면역원은 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응을 유도할 것이다. 달리 말하면, 면역원은 항원이고, 이것은 면역을 유도할 수 있다.
"에피토프", "항원 결정자" 및 "항원 부위"라는 용어들은 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되고, 항체 (항체 결합 에피토프의 경우, "B 세포 에피토프"로도 알려짐) 또는 상기 에피토프가 MHC 분자와 복합화된 경우 T- 세포 수용체 (T 세포 수용체 결합 에피토프의 경우, 즉 "T 세포 에피토프")에 의하여 인식되는 항원 또는 면역원의 부위를 의미한다.
"B 세포 항원"은 B 세포에 의하여 인식되도록 자연적으로 존재하거나 조작될 수 있고, B 세포의 면역 반응을 촉발시키는 임의의 항원을 의미한다 (예컨대, B 세포 상에서 B 세포 수용체에 의하여 특이적으로 인식되는 항원).
"면역원적으로 유효한 양"이라는 용어는 이 기술 분야에서 일반적인 그 의미, 즉 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원의 양이라는 의미를 가지며, 이것은 그 면역원과 면역적 특성을 공유하는 병원체와 크게 관계가 있다.
"백신"이라는 용어는 병리학적 질병 발생의 위험을 감소시킬 수 있거나 병리학적 질병의 치료 (또는 적어도 그 증상의 완화)에 도움을 줄 수 있는 치료적으로 유효한 면역 반응을 유도할 수 있는, 면역원을 포함하고 면역 반응을 유도할 수 있는 조성물에 사용된다.
"약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 이 기술 분야에서 일반적인 그 의미를 가지며, 즉, 문제의 질환을 치료할 때 인간 용도의 의약의 일부로서 허용될 수 있는 물질에 대하여 사용되고, 따라서 상기 용어는 치료되는 대상체의 질병을 개선시키기보다는 악화시키는 고독성 물질의 사용은 유효하게 배제하는 것이다.
"T 헬퍼 림프구 에피토프" (TH 에피토프), "T 헬퍼 에피토프" 또는 "헬퍼 에피토프"는 MHC 클래스 II 분자와 결합하여, 상기 MHC 클래스 II 분자와 결합하고 있는 항원 제시 세포 (APC)의 표면에 제시될 수 있는 펩타이드이다. "면역적 담체"는 일반적으로 하나 또는 다수의 TH 에피토프를 포함하는 물질이고, 이것은 T 헬퍼 림프구가 활성화되고 증식되는 것을 보장함으로써 상기 담체가 커플링되는 항체에 대한 면역 반응을 증가시키는 것이다. 공지의 면역적 담체의 예시로는 파상풍 및 디프테리아 톡소이드 및 키홀 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH)를 들 수 있다.
본 발명에 따른 스캐폴드 설계에 있어서, X2, X4, 및 X6는 항원으로부터 유래된 5~17개의 아미노산으로 이루어지는 서열을 의미한다. 이 항원으로부터 유래한 아미노산 서열을 본 명세서에서는 에피토프라고 일컬을 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 헬퍼 T 림프구 (HTL) 에피토프를 포함하는 HTL 유도 펩타이드일 수 있다. "HTL 유도 펩타이드"는 HTL 반응을 유도할 수 있는 HLA 클래스 II 결합 펩타이드이다. 또한, 다른 실시 상태들에 있어서 본 발명에 따른 펩타이드는 HTL 유도 펩타이드일 뿐 아니라 CTL 에피토프를 포함하는, 또는 HTL 유도 펩타이드의 대체로서 CTL 에피토프를 포함하는 CTL 유도 펩타이드일 수 있다. "CTL 유도 펩타이드"는 CTL 반응을 유도할 수 있는 HLA 클래스 I 결합 펩타이드이다.
다른 대체적 실시 상태에 있어서, X1, X3, 또는 X5로 정의된 서열에서 트립토판 또는 트립토판 유도체가 사용된다. 임의의 적절한 트립토판 유도체가 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바 "트립토판 유도체"는 US 7,232,803에 기재된 것들을 포함하는 비천연 변형 트립토판 아미노산 잔기, 예컨대 트리-tert-부틸트립토판, 디-tert-부틸트립토판, 7-벤질옥시트립토판, 호모트립토판, 5'-아미노에틸트립토판 (RSP Amino Acids Analogues Inc, Boston, Mass., USA의 측쇄 Boc 및 N-알파 FMOC 유도체로서 시판), N-아세틸호모트립토판 (Toronto Research), 7-벤질옥시트립토판 (Toronto Research), 호모트립토판 (Toronto Research), 및 인돌 고리의 1-, 2-, 5- 및/또는 7-위치가 치환된, 좋기로는 1- 또는 2-위치가 치환된 트립토판 잔기, 예컨대 5' 하이드록시 트립토판 등을 의미한다.
"아미노산 유도체", 때때로 특정 아미노산을 언급하며 "그 유도체"라는 문맥으로 사용되는 용어는 그 아미노산 화합물이 상기 아미노산의 유도체이지만 여전히 아민기와 카르복시산기 뿐 아니라 아미노산의 측쇄를 가지고 여전히 펩타이드 결합을 형성할 수 있는, 상기 아미노산에 비하여 하나 이상의 화학기가 변형, 부가 또는 제거된 아미노산 화합물을 의미한다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 아미노산 유도체는 오로지 그 아미노산의 측쇄만이 변형된 표준 아미노산이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 아미노산 유도체는 Dpr과 같은 비천연 아미노산이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 아미노산은 화학적으로 합성된 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 포함되고 활성화 후 다른 펩타이드와 연결될 수 있는 활성화 가능한 기능기를 포함하는 변형 모이어티, 예컨대 Dpr(Ser), Lys(Ser), 또는 오르니틴(Ser)이다.
"항체 반응"이라는 용어는 목적하는 항원과 결합하는 항체 (예컨대, IgM, IgA, IgG)의 생성을 말하며, 이 반응은 예를 들어 항원 ELISA에 의한 혈청 조사로 측정된다.
본 명세서에서 사용되는 "아쥬반트"라는 용어는 항원과 함께 또는 동시에 전달될 때 비특이적으로 그 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 임의의 화합물을 만한다. 예시적인 아쥬반트로는 수중유형 및 유중수형 아쥬반트, 알루미늄계 아쥬반트 (예컨대, AIOH, AIPO4 등) 및 몬타나이드 ISA 720를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
"환자" 및 "대상체"라는 용어는 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 임의의 인간 또는 동물을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바, "면역 반응"이라는 용어는 항원에 대한 반응에 있어서 생물체의 면역계의 반응성을 말한다. 척추 동물에서, 이것은 항체의 생성, 세포-매개 면역의 유도 및/또는 보체 활성화 (예컨대, 척추 동물 면역계의 미생물 감염에 대한 예방 및 해소와 관련된 현상)을 수반할 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 면역 반응이라는 용어는 "림프구 증식 반응", "사이토카인 반응" 및 "항체 반응" 중 하나 이상을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
펩타이드 서열과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "알짜 전하"라는 용어는 상기 펩타이드 서열의 각 개별적인 아미노산 전하의 합으로 나타나는 펩타이드 서열의 총 전하를 말하고, 여기서 각 염기성 아미노산은 +1의 전하를, 각 산성 아미노산은 -1의 전하를, 중성 아미노산 각각은 0의 전하를 부여한다. 따라서, 알짜 전하는 하전된 아미노산의 수와 그 아미노산이 무엇인지에 의존적일 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바, "염기성 아미노산"이라는 용어는 문헌 [Kice & Marvell "Modern Principles of organic Chemsitry" (Macmillan, 1974)] 또는 [Matthews and van Holde "Biochemistry" Cummings Publishing Company, 1996]에 따라 측정된 등전점이 6.3을 넘는 (예컨대, 7.4 초과) 천연 및 비천연 아미노산 양자 모두를 포함하는 임의의 아미노산을 말한다. 이러한 정의에 포함되는 것으로는 아르기닌, 리신, 호모아르기닌 (Har) 및 히스티딘 뿐 아니라 이들의 유도체가 있다. 적절한 비천연 염기성 아미노산은, 예컨대 US 6,858,396에 기재되어 있다. 적절한 양성 전하 아미노산으로는 Bachem AG로부터 구득 가능한 비천연 알파 아미노산을 들 수 있고, 알파-아미노-글리신, 알파,감마-디아미노부티르산, 오르니틴, 알파, 베타-디아미노프로프리온산, 알파-디플루오로메틸-오르니틴, 4-아미노-피페리딘-4카르복시산, 2,6-디아미노-4-헥시논산, 베타-(1-피페라지닐)-알라닌, 4,5-디하이드로-리신, 델타-하이드록시-리신, 오메가-하이드록시-노르아르기닌, 호모아르기닌, 오메가-아미노-아르기닌, 오메가-메틸-아르기닌, 알파-메틸-히스티딘, 2,5-디요오도-히스티딘, 1-메틸-히스티딘, 3-메틸-히스티딘, 베타-(2-피리딜)-알라닌, 베타-(3-피리딜)-알라닌, 베타-(2-퀴놀릴)-알라닌, 3-아미노-티로신, 4-아미노-페닐알라닌, 및 스피나신을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바 "중성 아미노산"이라는 용어는 문헌 [Kice & Marvell "Modern Principles of organic Chemsitry" (Macmillan, 1974)]에 의하여 측정된 등전점이 4.8 내지 6.3 사이인 아미노산을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바 "산성 아미노산"이라는 용어는 문헌 [Kice & Marvell "Modern Principles of organic Chemsitry" (Macmillan, 1974)]에 의하여 측정된 등전점이 4.8 미만인 아미노산을 말한다.
항원
본 발명에 따른 펩타이드 컨스트럭트에 사용되는 특정 천연 항원은 임의의 B 세포 항원, 예컨대 임의의 질환 항원, 예컨대 감염원 유래의 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 적절한 항원은 박테리아 유래 항원, 미코박테리아, 바이러스, 원생동물 등의 기생충, 곰팡이, 암 항원, 예컨대 종양 유전자, 프리온, 아토피 질환 항원, 중독성 물질 또는 남용 물질 또는 독소 또는 예컨대 류마티스 관절염, 인슐린 의존성 당뇨, 다발성 경화증 등과 같은 자가면역 질환의 항원을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바, "질환 항원"은 특정 질환과 관련된다고 의심되거나 확인된 임의의 항원을 말한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 항원은 남용 또는 중독 물질 또는 이들의 일부분이고, 니코틴, 마약, 진해제, 진통제 및 진정제 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 항원은 독소, 예컨대 화학 무기나 천연 자원, 또는 오염물로부터의 독소이다.
항원을 제공할 수 있는 박테리아의 예로는 결핵균 (M. tuberculosis), 미코박테리아, 미코플라즈마, 네이세리아 및 레지오넬라를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 기생충의 예로는 리케치아 및 클라미디아를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
감염성 질환 항원의 예로는 TbH9 (Mtb 39A로도 알려짐), 결핵 항원이 있다. 다른 결핵 항원은 DPV (Mtb8.4로도 알려짐), 381, Mtb41, Mtb40, Mtb32A, MΛ9.9A, Mtb9.8, Mtblo Mtb72f, Mtb59f, Mtb88f, Mtb71f, Mtb46f 및 Mtb31f ("f"는 2 이상의 단백질의 융합임을 나타낸다)를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
암 항원의 예로는 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체 또는 미국특허공개공보 제20080171040호 또는 제20080305044호에 기재된 하나 이상의 종양 관련 항원 또는 세포 표면 수용체일 수 있고, 참조로서 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
기타 본 발명에 의하여 사용될 수 있는 적절한 암 항원은 하기의 것들을 포함할 수 있는데, CD 단백질, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD70, CD79, CD80, CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, 및 CD152; ErbB 수용체 패밀리 중 하나, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-I, Mac1, pi 50.95, VLA-4, ICAM-I, VCAM, EpCAM, 알파4/베타7 인테그린 및 그들의 알파 또는 베타 서브유닛 중 하나를 포함하는 알파 v/베타3 인테그린 (예컨대, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); VEGF와 같은 생장 인자; 조직 인자 (TF); TGF-β; 알파 인터페론 (알파-IFN); 인터류킨, 예컨대 IL-8; IgE; 혈액 그룹 항원 Apo2, 사멸 수용체; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 항원은 IGF-IR, CanAg, EphA2, MUC1 , MUC16, VEGF, TF, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD138, CA6, Her2/neu, EpCAM, CRIPTO (대다수의 인간 유방암 세포에서 생성이 증가되는 단백질), 다르핀 (darpins), 알파v/베타3 인테그린, 알파v/베타5 인테그린, 알파 y/베타 인테그린, TGF-β, CD11a, CD18, Apo2 및 C242로부터 선택된다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 항원은 CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD27, CD34, CD37, CD38, CD46, CD56, CD70 및 CD138; ErbB 수용체 패밀리 중 하나, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-I, Mac1, pl 50.95, VLA-4, ICAM-I, VCAM, EpCAM, 알파4/베타7 인테그린 및 그들의 알파 또는 베타 서브유닛 중 하나를 포함하는 알파 v/베타3 인테그린 (예컨대, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); VEGF와 같은 생장 인자; 조직 인자 (TF); TGF-β; 알파 인터페론 (알파-IFN); 인터류킨, 예컨대 IL-8; IgE; 혈액 그룹 항원 Apo2, 사멸 수용체; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등으로부터 선택된다. 본 명세서에서 가장 양호한 표적은 IGF-IR, CanAg, EGF-R, EGF-RvIII, EphA2, MUC1, MUC16, VEGF, TF, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD70, CD138, CA6, Her2/neu, CRIPTO (대다수의 인간 유방암 세포에서 생성이 증가되는 단백질), 알파v/베타3 인테그린, 알파v/베타5 인테그린, TGF-β, CD11a, CD18, Apo2, EpCAM 및 C242이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 항원은 세포 종양 유전자, 예컨대 ras 또는 myc으로부터 선택된다.
본 발명에서 이용하기 위한 바이러스 항원의 예로는, 예컨대 HIV, HCV, CMV, HPV, 플루, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 피코르나바이러스 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 레트로바이러스 항원의 비제한적 예시는, 예컨대 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 항원으로부터의 레트로바이러스 항원, 예컨대 gag, pol, 및 env 유전자의 유전자 생성물, Nef 단백질, 역전사 효소, 및 기타 HIV 성분을 들 수 있고; 헤파타이티스 바이러스 항원의 비제한적 예시는, 예컨대 헤파타이티스 B 바이러스의 S, M, 및 L 단백질, 헤파타이티스 B 바이러스의 프리-S 항원, 및 기타 헤파타이티스, 예컨대 헤파타이티스 A, B, 및 C 바이러스 성분, 예컨대 헤파타이티스 C 바이러스 RNA를 들 수 있으며; 인플로엔자 바이러스 항원의 비제한적 예시는, 예컨대 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 및 기타 인플루엔자 바이러스 성분을 들 수 있고; 홍역 바이러스 항원의 비제한적 예시는, 예컨대 홍역 바이러스 융합 단백질, 기타 홍역 바이러스 성분; 풍진 바이러스 항원의 비제한적 예시는, 단백질 E1 및 E2 및 기타 풍진 바이러스 성분을 들 수 있고; 로타바이러스 항원의 비제한적 예시는, 예컨대 VP7sc 및 기타 로타바이러스 성분을 들 수 있고; 사이토메갈로바이러스 항원의 비제한적 예시로는, 예컨대 엔벨로프 당단백질 B 및 기타 사이토메갈로바이러스 항원 성분을 들 수 있고; 호흡기세포융합바이러스 항원의 비제한적 예시로는, 예컨대 RSV 융합 단백질, M2 단백질 및 기타 호흡기세포융합바이러스 항원 성분을 들 수 있고; 단순 헤르페스바이러스 항원의 비제한적 예시는, 예컨대 극초기 단백질, 당단백질 D, 및 기타 단순 헤르페스 바이러스 항원 성분을 들 수 있고; 수두-대상포진바이러스 항원의 비제한적 예시는, 예컨대 gpl, gpll, 및 기타 수두 대상포진바이러스 항원 성분을 들 수 있고; 일본뇌염바이러스 항원의 비제한적 예시는, 예컨대 단백질 E, M-E, M-E-NSl, NSl, NS1-NS2A, 80% E, 및 기타 일본뇌염바이러스 항원 성분을 들 수 있고; 광견병바이러스 항원의 비제한적인 예시는, 예컨대 광견병 당단백질, 광견병 핵단백질 및 기타 광견병바이러스 항원 성분을 들 수 있다. 바이러스 항원의 추가적인 예시는 문헌 [Fundamental Virology, Second Edition, eds. Fields, B. N. and Knipe, D. M. (Raven Press, New York, 1991)]을 참고.
본 발명에 따른 스캐폴드 설계에 포함되는 에피토프는 하기 바이러스 패밀리의 바이러스로부터 유래할 수 있고, 예컨대 아데노비리대, 레트로비리대, 피코르나비리대, 헤르페스비리대, 로타바이러스들 (레오비리대), 한타바이러스 (부니아비리대), 코로나비리대, 토가비리대, 플라비르비리대, 랍도비리대, 파라믹소비리대, 오르소믹소비리대, 부니아비리대, 아레나비리대, 레오비리대, 파필로마비리대, 파르보비리대, 폭스비리대, 헤파드나비리대 또는 해면상 바이러스를 들 수 있다. 특정 비제한적 예시에 있어서, 상기 바이러스 항원은 HIV, CMV, 헤파타이티스 A, B, 및 C, 인플루엔자, 홍역, 소아마비, 천연두, 풍진; 호흡기 세포융합, 단순 헤르페스, 수두 대상포진, 엡스타인-바, 일본뇌염, 광견병, 독감 및/또는 감기 바이러스 중 적어도 하나로부터 유래하는 펩타이드이다.
본 발명에 따른 펩타이드는 공지의 항원을 포함할 수 있다. HCV 유래 항원으로, 이들 항원은 헤파타이티스 C 바이러스의 코어, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4 (NS4A 및 NS4B) 및 NS5 (NS5A 및 NS5B) 단백질로부터 유래할 수 있다. 상기 에피토프들은 면역화되는 숙주에서 HLA 클래스 I 및/또는 클래스 II 한정적인 T 림프구 반응을 이끌어내는 것이다. 본 발명의 더욱 특이적인 HLA 클래스 I 한정적 펩타이드는 하기 HLA 클래스 I 그룹 중 하나 이상의 HLA 분자와 결합할 수 있다: HLA-A*01, HLA-A*02, HLA-A*03, HLA-A*11, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*40, HLA-B*44, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw6 또는 HLA-Cw7. 본 발명의 HLA 클래스 II 한정적 펩타이드는 하기 HLA 클래스 II 그룹 중 하나 이상의 HLA 분자와 결합할 수 있다: HLA-DRB1, -DRB2, -DRB3, -DRB4, -DRB5, -DRB6, -DRB7, -DRB8 또는 -DRB9.
본 발명에 따라 에피토프로서 사용될 수 있는 MHC 결합 HCV 펩타이드는, 예컨대 WO02/34770 (Imperial College Innovations Ltd), WO01/21189 및 WO02/20035 (Epimmune), WO04/024182 (Intercell), WO95/25122 (The Scripps Research Institute), WO95/27733 (Government of the USA, Department of Health and Human Services), EP 0935662 (Chiron), WO02/26785 (Immusystems GmbH), WO95/12677 (Innogenetics N.V), WO97/34621 (Cytel Corp), 및 EP 1652858 (Innogenetics N.V.)에 기재되어 있다.
다른 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 스캐폴드 설계는 PADRE 펩타이드, 예컨대 그 내용이 참조로서 본 명세서에 포함되는 WO95/07707 (Epimmune)에 개시된 PADRE라 불리우는 통용의 T 세포 에피토프를 포함한다. "'PanDR 결합 펩타이드 또는 PADRE 펩타이드"는 하나 이상의 HLA 클래스 II DR 분자에 결합하는 분자 패밀리의 한 구성원이다. PADRE는 대부분의 HLA-DR 분자와 결합하여 시험관 내 및 생체 내 (in vivo)에서 인간의 헬퍼 T 림프구 (HTL) 반응을 자극한다. 또는, 널리 통용되는 백신으로부터의 T-헬프 에피토프, 예컨대 파상풍 톡소이드가 사용될 수 있다.
또 다른 실시 상태에 있어서, 조성물 중의 펩타이드 또는 폴리에피토프 펩타이드는 HCV 단백질, 특히 하기의 HCV 구역 중 적어도 하나로부터 유래함을 특징으로 하고, 이들 구역은 코어, E1, E2/NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 이들이 1a, 1b 및/또는 3a 유전자형의 HCV 공통 서열 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 펩타이드라면 더욱 좋다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 기타 HLA 클래스 I 및 II 결합 펩타이드는 WO03/105058 - Algonomics에 기재된 방법, Epimmune의 WO01/21189에 기재된 방법 및/또는 3 가지 공용 데이터베이스 예측 서버, 각각 Syfpeithi, BIMAS 및 nHLAPred에 의하여 동정될 수 있다. 본 발명의 스캐폴드 설계 내에서 각 펩타이드가, 다중 반복되는 동일한 펩타이드 또는 임의의 다른 펩타이드(들) 또는 에피토프(들)과 함께 조합하여 사용될 수 있다는 것 역시 본 발명의 한 측면이다.
CMV:
본 발명에 따른 스캐폴드 설계에 포함되는 에피토프는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 당단백질 gB 및 gH를 포함하는 사이토메갈로바이러스로부터 유래할 수 있다.
플루:
본 발명에 따른 스캐폴드 설계에 포함되는 에피토프는 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 또는 인플루엔자 뉴라미다아제 (NA), 핵단백질 (NP), 예컨대 H1N1, H2N2 또는 H3N2와 같은 서브그룹 각각에 대한 M1, M2, NS1, NEP, PA, PB1, PB1-F2, PB2의 분절 또는 일부분으로부터 유래할 수 있다.
적절한 에피토프는 1종의, 또는 1종 이상의 아형의 HA 단백질로부터 유래할 수 있는데, 예컨대 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16 또는 이들의 분절 또는 일부분이다. 이러한 HA 단백질을 포함하는 아형의 예시로는 A/New Caledonia/20/99 (H1N1) A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/chicken/New York/1995, A/herring gull/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/mallard/MN/33/00, A/duck/Shanghai/1/2000, A/northern pintail/TX/828189/02, A/Turkey/Ontario/6118/68 (H8N4), A/shoveler/Iran/G54/03, A/chicken/Germany/N/1949 (H10N7), A/duck/England/56 (H11N6), A/duck/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gull/Maryland/704/77 (H13N6), A/Mallard/Gurjev/263/82, A/duck/Australia/341/83 (H15N8), A/black-headed gull/Sweden/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburg/66, A/PuertoRico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapore/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1), A/Equine/Prague/56 (H7N7), A/HongKong/1073/99 (H9N2)를 들 수 있다.
본 발명의 몇 가지 실시 상태에 있어서, HA 단백질은 H1, H2, H3, H5, H6, H7 또는 H9 아형일 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 상기 H1 단백질은 A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/PuertoRico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), 또는 A/Solomon Islands 3/2006 (H1N1) 균주로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 H3 단백질은 또한 A/Brisbane 10/2007 (H3N2) 또는 A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) 균주로부터 유래한 것일 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 상기 H2 단백질은 A/Singapore/1/57 (H2N2) 균주로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 H5 단백질은 A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), 또는 A/Indonesia/5/2005 균주로부터 유래한 것일 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 상기 H6 단백질은 A/Teal/HongKong/W312/97 (H6N1) 균주로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 H7 단백질은 A/Equine/Prague/56 (H7N7) 균주로부터 유래한 것일 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 상기 H9 단백질은 A/HongKong/1073/99 (H9N2) 균주로부터 유래한 것일 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 상기 HA 단백질은 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 것일 수 있고, B형 바이러스, 예컨대 B/Malaysia/2506/2004 또는 B/Florida/4/2006로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스 HA 단백질은 H5 Indonesia일 수 있다.
인간 면역결핍 바이러스 (HIV):
HIV의, 본 발명에 따른 스캐폴드 설계에 포함되는 에피토프는 gp120, gp160, gp41, p24gag 또는 p55gag 다양한 유전적 아형의 구성원들을 포함하는 HIV의 조절 단백질 (예컨대, Tat, Rev, Nef) 및 바이러스 효소 (예컨대, 폴리머라아제, 인테그라아제 또는 단백질분해효소)로 이루어지는 바이러스 단백질로부터 유래한 것일 수 있다.
인간 파필로마바이러스 (HPV):
HPV의, 본 발명에 따른 스캐폴드 설계에 포함되는 에피토프는 E1, E2, E3, E4, E6 및 E7, L1 및 L2로 이루어지는 군으로부터 유래하는 것일 수 있다. 상기 에피토프는 유형 8, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59 등의 임의의 유형으로부터 유래한 것일 수 있다.
담체, 아쥬반트 및 운반체 - 전달
본 발명에 따른 펩타이드는 본 명세서에서 "조성물", "백신 조성물" 또는 "약학적 조성물"로 일컫는 다양한 조성물 내에 포함되어, 다양한 수단에 의하여 전달될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 및 약학적 조성물과 백신 조성물은, 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하는 데 있어서 동물들, 에컨대 포유 동물과, 특히 인간에게 투여하기에 유용하다. 본 발명의 상기 펩타이드를 함유하는 백신 조성물은 문제의 바이러스에 감염된 환자, 또는 바이러스 감염이 의심되거나 다르게는 그 위험이 있는 개체에게 투여되어 그 특정 항원에 대한 면역 반응을 이끌어내고 따라서 환자 자신의 면역 반응 능력을 증강시키게 된다.
상기 펩타이드를 적절한 세포로 전달하는데 이 기술 분야에 알려져 있는 다양한 전달 시스템을 사용할 수 있다. 상기 펩타이드는 약학적으로 허용 가능한 담체 내에서 또는 콜로이드 현탁액, 또는 분말로서, 희석제를 포함하거나 포함하지 않고 전달될 수 있다. 이들은 "그대로 (naked)" 또는 전달 운반체와 조합될 수 있고, 이 기술 분야에 공지된 전달 시스템, 예컨대 재조합 바이러스 입자, 나노입자, 예컨대 나노골드 또는 시클로타이드 (cyclotide)를 이용하여 전달될 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "약학적으로 허용 가능한 아쥬반트"는 스스로 그 조성물을 받은 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않고 방어를 이끌어 내지도 않는 임의의 적절한 첨가제, 희석제, 담체 및/또는 아쥬반트이다. 좋기로는, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 아쥬반트는 항원에 의하여 이끌어지는 면역 반응을 강화시킨다. 적절한 담체 또는 아쥬반트는 통상적으로 하기 비제한적 목록에 포함된 화합물을 하나 이상 포함한다: 대형의 느린 대사 고분자, 예컨대 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자; 수산화알루미늄, 인산알루미늄 (국제특허공개공보 제WO93/24148호 참고), 알룸 (KAl(SO4)2.12H2O), 또는 이들 중 하나와 조합되는 3-0-디아실화 모노포스포릴 리피드 A (국제특허공개공보 제WO93/19780호 참고); N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (미국특허등록공보 제4,606,918호 참고), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타밀-L-알라닌2-(1',2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시) 에틸아민; 모노포스포릴 리피드 A (즉, 해독된 내독소)를 함유하는 RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, USA), 트레할로스-6,6-디미콜레이트, 및 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀전 중의 세포벽 골격 (MPL + TDM + CWS). 3 가지 성분 MPL, TDM 또는 CWS 중 임의의 것을 단독으로 또는 2 가지씩 결합한 것; 아쥬반트, 예컨대 스티뮬론 (Stimulon)(Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA), SAF-1 (Syntex); 아쥬반트, 예컨대 QS21 및 3-디-O-아세틸화 모노포스포릴 리피드 A (국제출원 제WO94/00153호)의 조합, 이것은 수중유 에멀전으로 더 보충될 수 있고 (예컨대, 국제출원 제WO95/17210호, 제WO97/01640호 및 제WO9856414호 참고) 상기 수중유 에멀전은 대사 가능한 오일 및 사포닌 또는 대사 가능한 오일, 사포닌 및 스테롤을 포함하며 또는 이것은 사이토카인 (국제출원 제WO98/57659호 참고)으로 더 보충될 수 있다; 아쥬반트, 예컨대 MF-59 (Chiron), 또는 폴리[디(카르복실아토페녹시) 포스파젠]계 아쥬반트 (Virus Research Institute); 블록공중합체계 아쥬반트, 예컨대 옵티박스 (Optivax)(Vaxcel, Cytrx) 또는 인슐린계 아쥬반트,, 예컨대 알가뮬린 및 감말뉼린 (Anutech); 완전 또는 불완전 프로운트 아쥬반트 (Freund's Adjuvant)(각각 CFA 또는 IFA, ) 또는 게르뷰 제제 (Gerbu preparations)(Gerbu Biotechnik); 사포닌, 예컨대 정제 사포닌인 QuilA, 예컨대 QS21, QS7 또는 QS17, -escin 또는 디지토닌; 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드, 예컨대 [퓨린-퓨린-CG-피리미딘-피리미딘] 올리고뉴클레오티드. 이들 면역자극 올리고뉴클레오티드는 CpG 클래스 A, B, 및 C 분자 (Coley Pharmaceuticals), ISS (Dynavax), 이뮤노머 (Hybridon)를 포함한다. 면역자극 올리고뉴클레오티드는 또한 예컨대 Riedl et al. (2002)에 의하여 개시되는 바 양이온성 펩타이드와 조합될 수 있고; 사포닌을 포함하는 면역 자극 복합체, 예컨대 Quil A (ISCOMS); 본질적으로 비독성 및 비약성인 첨가제 및 희석제, 예컨대 물, 염용액, 글리세롤, 에탄올, 이소프로필 알코올, DMSO, 습윤제 또는 에멀전화제, pH 완충제, 보존제 등등; 예컨대 1 내지 10% 또는 2,5 내지 5% 농도의 생분해성 및/또는 생체적합성 오일, 예컨대 스쿠알렌, 에이코산, 테트라테트라콘탄, 글리세롤, 땅콩유, 식물유; 비타민, 예컨대 비타민 C (아스코르브산 또는 그의 염 또는 에스테르), 비타민 E (토코페롤), 또는 비타민 A; 카로티노이드, 또는 천연 또는 합성 플라보노이드; 미량원소, 예컨대 셀레늄; Barton과 Medzhitov 에 의하여 보고된 (2002) 임의의 톨-유사 수용체 리간드.
전술한 3-디-O-아세틸화 모노포스포릴 리피드 A를 포함하는 임의의 아쥬반트는 소입자를 형성할 수 있다 (국제출원 제WO94/21292호 참조).
전술한 임의의 아쥬반트에 있어서, MPL 또는 3-디-O-아세틸화 모노포스포릴 리피드 A는 RC-529로 일컬어지는 합성 유사체 또는 기타 임의의 아미노-알킬 글루코사미니드 4-포스페이트 (Johnson et al. 1999, Persing et al. 2002)에 의하여 대체될 수 있다. 또는, 다른 리피드 A 유사체, 예컨대 OM-197 (Byl et al. 2003)에 의하여 대체될 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 운반체"는 운반체, 예컨대 물, 생리학적 염용액, 글리세롤, 에탄올 등을 포함한다. 첨가 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀전화제, pH 완충제, 보존제가 이러한 운반체에 포함될 수 있다. 이 기술 분야에 공지된 전달 시스템은, 예컨대 리포펩타이드, 폴리-DL-락타이드-코-글리콜라이드 ("PLG") 내로 캡슐화된 펩타이드 조성물, 마이크로스피어, 면역 자극 복합체 내에 함유된 펩타이드 조성물 (ISCOMS), 다중 항원 펩타이드 시스템 (MAPs), 바이러스 전달 벡터, 바이러스 입자, 합성 기원 입자, 아쥬반트, 리포좀, 지질, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐, 금 입자, 나노입자, 고분자, 압축제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, QS21, 흡착 증강 물질, 지방산 또는 그대로의 (naked) 또는 입자 흡수 cDNA 등이 있다.
펩타이드는 오일 중에서, 예컨대 EndocineTM 및 MontanideTM (Eurocine) MontanideTM ISA 51 VG 또는 MontanideTM ISA 720 VG (Seppic)으로 전달될 수 있다.
상기 아쥬반트는 펩타이드와는 별개로 주어질 수 있는 선천적 면역계의 자극제, 예컨대 류코트리엔 B4 (LTB4)와 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 예컨대 사르그라모스팀/류킨 (Sargramostim/Leukine)(당화된 GM-CSF) 및 몰그라모스팀 (Molgramostim)(비당화 GM-CSF)일 수 있다.
통상적으로, 백신 또는 백신 조성물은 주입 가능한 것으로, 액체 용액 또는 현탁액 중 하나로 제조된다. 주입은 피하, 근육내, 정맥, 복강내, 척수강내, 피내, 또는 표피내 주입일 수 있다. 다른 유형의 투여는 전기천공, 이식, 좌제, 경구 섭취, 장내 적용, 흡입, 분무주입 또는 비강 스프레이 또는 드롭을 포함한다. 주입 전에 액체 운반체 내에서 용해 또는 현탁되기 적합한 고체 형태 역시 제조될 수 있다. 또한, 아쥬반트 효과를 증강시키기 위하여 상기 제제는 에멀전화 또는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다.
액체 제형은 오일, 고분자, 비타민, 탄수화물, 아미노산, 염, 완충액, 알부민, 계면활성제 또는 증량제를 포함할 수 있다. 양호한 탄수화물은 당 또는 당 알코올, 예컨대 모노-, 디-, 트리-, 올리고- 또는 폴리새커라이드, 또는 수용성 글루칸을 포함한다. 새커라이드 또는 글루칸은 프럭토오스, 덱스트로오스, 락토오스, 글루코오스, 만노오스, 소르보오스, 자일로오스, 말토오스, 슈크로오스, 덱스트란, 풀룰란, 덱스트린, 알파 및 베타 시클로덱스트린, 수용성 전분, 하이드록시에틸 전분 및 카르복시메틸셀룰로오스 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 슈크로오스가 가장 양호하다. "당 알코올"은 -OH기를 갖는 C4 내지 C8 탄화수소로서 정의되고 갈락시톨, 이노시톨, 만니톨, 자일리톨, 소르비톨, 글리세롤 및 아라비톨을 포함한다. 만니톨이 가장 양호하다. 이들 전술한 당 및 당 알코올들은 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 당 또는 당 알코올이 수성 제제에서 용해되는 한 사용량에 정해진 한계는 없다. 좋기로는, 당 또는 당 알코올 농도는 1,0% (w/v)와 7,0% (w/v) 사이, 더욱 좋기로는 2,0% (w/v)과 6,0% (w/v) 사이이다. 좋기로는 아미노산은 좌선성 (L) 형태의 카르니틴, 아르기닌, 및 베타인을 포함하나; 다른 아미노산을 첨가할 수 있다. 양호한 고분자는 평균 분자량 2,000 내지 3,000 사이인 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 또는 평균 분자량 3,000 내지 5,000인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 동결건조 전 또는 재구성 이후 용액 중 pH의 변화를 최소하하기 위하여 상기 조성물 중에 완충액을 사용하는 것 역시 바람직하다. 임의의 생리학적 완충액이 사용될 수 있으나, 시트레이트, 포스페이트, 숙시네이트 및 글루타메이트 완충액 또는 그 혼합물이 바람직하다. 가장 양호한 것은 시트레이트 완충액이다. 좋기로는, 농도는 0.01 내지 0.3 몰이다. 제제에 첨가될 수 있는 계면활성제는 유럽등록특허공보 EP 0 270 799 및 EP 0 268 110에 나타나 있다.
또한, 예컨대 순환 반감기를 증가시키기 위하여 고분자에 공유 컨쥬게이션시킴으로써 폴리펩타이드를 화학적으로 변형할 수 있다. 양호한 고분자와 이들을 펩타이드에 부착시키는 방법은 미국등록특허공보 제4,766,106호; 제4,179,337호; 제4,495,285호; 및 제4,609,546호에 나타나 있다. 양호한 고분자는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이다. PEG는 실온에서 수용성이고 화학식: R(O-CH2-CH2)nO-R이며, R은 수소 또는 알킬 또는 알칸올기 등의 보호기일 수 있다. 좋기로는, 상기 보호기는 1개 내지 8개의 탄소를 함유하고, 더욱 좋기로는 메틸이다. 심볼 n은 양의 정수로, 좋기로는 1 내지 1000의 정수, 더 좋기로는 2 내지 500의 정수이다. 양호한 PEG의 평균 분자량은 1000 내지 40000이고, 더욱 좋기로는 2000 내지 20000, 가장 좋기로는 3000 내지 12000이다. 좋기로는, PEG는 하나 이상의 하이드록시기를 갖고, 더욱 좋기로는 말단 하이드록시기를 갖는다. 좋기로는 활성화되는 것은 이 하이드록시기이다. 그러나, 공유적으로 컨쥬게이트된 본 발명의 PEG/폴리펩타이드를 완성하기 위한 반응기의 유형과 양은 달라질 수 있음을 이해하여야 한다.
수용성의 폴리옥시에틸화 폴리올 역시 본 발명에서 유용하다. 이들은 폴리옥시에틸화 소르비톨, 폴리옥시에틸화 글루코오스, 폴리옥시에틸화 글리세롤 (POG) 등을 포함한다. POG가 양호하다. 한 가지 이유는 폴리옥시에틸화 글리세롤의 글리세롤 백본이, 예컨대 동물 및 인간의 자연적으로 존재하는 모노-, 디-, 트리글리세리드의 백본과 동일하기 때문이다. 그러므로, 필연적으로 이 분지는 체내에서 외부 물질로 보이지 않을 것이다. POG의 양호한 분자량은 PEG의 그것과 동일한 범위이다. POG의 구조는 문헌 [Knauf et al., 1988]에 나타나 있고, POG/IL-2 컨쥬게이트에 관한 논의는 미국특허 제4,766,106호에서 볼 수 있다.
순환 반감기를 증가시키기 위한 또 다른 약물 전달 시스템은 리포좀이다. 또한, 본 발명의 펩타이드 및 핵산은 리포좀을 통하여 투여될 수 있는데, 이것은 특정한 조직, 예컨대 림프 조직을 표적화하거나, 감염된 세포를 선택적으로 표적화 및 상기 펩타이드와 핵산 조성물의 반감기를 증가시키는 데 기여한다. 리포좀은 에멀전, 발포체, 미셸, 불용성 단일막, 액정, 인지질 분산체, 엽편상 막 등등을 포함한다. 이들 제제에서, 상기 전달될 펩타이드 또는 핵산은 단독으로, 또는 림프 세포에 일반적으로 존재하는 수용체에 결합하는 분자, 예컨대 CD45 항원과 결합하는 모노클로날 항체 등 또는 기타 치료적 또는 면역원성 조성물과 함께 짝지워져 리포좀의 일부로서 포함되거나 함입된다. 그러므로, 원하는 펩타이드 또는 핵산으로 충전되거나 수식된 본 발명의 리포좀은 림프 세포의 위치로 향하여, 그 후 상기 리포좀은 상기 펩타이드 및 핵산 조성물을 전달할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 리포좀은 표준 소포 형성 지질로부터 형성되는데, 이것은 일반적으로 중성 및 음으로 하전된 인지질 및 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함한다. 지질의 선택은 일반적으로, 예컨대 리포좀 크기, 산 불안정성 및 혈류 내에서의 리포좀의 안정성 등을 고려하여 이루어진다. 예컨대, 문헌 [Szoka et al, 1980] 및 미국특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호에 기재되어 있는 것과 같이 리포좀을 제조할 수 있는 다양한 방법이 가능하다.
면역계 세포를 표적화하기 위하여, 상기 리포좀에 포함될 리간드는, 예컨대 원하는 면역계 세포의 세포 표면 결정자에 특이적인 항체 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 펩타이드를 함유하는 리포좀 현탁액은 정맥으로, 부분적으로, 국소적 등등으로 투여될 수 있는데, 특히 투여 방식, 전달될 펩타이드 및 치료될 질환의 단계에 따라 달라지는 투여량으로 투여될 수 있다. 예컨대, 면역원성 폴리펩타이드를 담고 있는 리포좀은 생체 내에서 CTL 반응을 이끌어 내는 것으로 알려져 있다 (Reddy et al., 1992; Collins et al., 1992; Fries et al., 1992; Nabel et al., 1992).
액체 약학 조성물이 제조된 후에는, 분해를 방지하고 멸균성을 보존하기 위하여 동결건조되는 것이 좋다. 액체 조성물을 동결건조하는 방법은 이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있다. 사용 직전에, 상기 조성물은 추가 성분을 포함할 수 있는 멸균 희석제 (예컨대, 링거액, 증류수, 또는 멸균 염용액)를 사용하여 재구성될 수 있다. 재구성하여, 상기 조성물은 이 기술 분야의 숙련자에게 알려진 방법을 이용하여 대상체에게 투여되는 것이 좋다.
면역 반응을 평가하기 위한 펩타이드의 용도:
본 발명에 따른 펩타이드는 진단 시약으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드는 상기 펩타이드 또는 관련 펩타이드를 사용하는 치료 투약에 대한 특정인의 민감성을 결정하는 데 사용될 수 있고, 따라서 치료 프로토콜을 변경하거나 수립하는데 또는 대상 개체의 예후를 결정하는데 도움이 될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 어떤 개체가 만성 바이러스 감염으로 진행할 실질적 위험에 있는지를 예측하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 질환 항원, 예컨대 감염원, 예컨대 병원체에 노출된 대상체에 대하여 그 결과를 결정하는 방법에 관한 것으로, 상기 대상체가 본 발명에 따른 하나 이상의 펩타이드에 대한 면역 반응을 가지는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 양호한 실시 상태에 있어서, 본 명세서에 기재된 펩타이드는 면역 반응을 평가하는 시약으로서 사용될 수 있다. 평가될 면역 반응은, 시약으로서 사용되는 펩타이드(들)을 인식하고 결합하는 항원 특이적 CTLs 또는 HTLs 생성이라는 결과를 일으킬 수 있는 임의의 제제를 면역원으로서 사용함으로써 유도될 수 있다. 상기 펩타이드 시약이 면역원으로서 사용될 필요는 없다. 이러한 분석용으로 사용될 수 있는 시험 시스템은 비교적 최근의 개발 기술들, 예컨대 세포 내 림포카인 염색 및 인터페론 방출 시험을 위한 사합체, 또는 ELISPOT 시험 등을 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 펩타이드는 항원 또는 면역원에 노출된 후 항원 특이적 CTLs의 존재에 대한 말초 혈액 단핵구 (PBMC) 평가를 위한 사합체 염색 시험에 사용될 수 있다. HLA- 사합체형 복합체는 항원 특이적 CTLs를 직접적으로 시각화하여 (예컨대, Ogg et al., 1998; 및 Altman et al., 1996 참조) 말초 혈액 단핵구 시료 중의 항원 특이적 CTL 수의 빈도를 측정하는 데 사용된다. 본 발명의 펩타이드를 이용하는 테트라머 시약은 다음과 같이 형성될 수 있다: HLA 분자와 결합하는 펩타이드를 대응 HLA 헤비 체인 및 베타2-마이크로글로불린의 존재 하에서 재구성하여 3분자 복합체를 형성. 이 복합체는 이미 단백질 내로 조작된 위치에서 헤비 체인의 카르복시 말단에 비오틴화가 이루어지게 된다. 그 후, 테트라머 제형은 스트렙타비딘의 첨가로 유도화된다. 형광 표지된 스트렙타비딘을 이용하여, 상기 테트라머는 항원 특이적 세포를 염색하는 데 사용될 수 있다. 그 후, 세포는, 예컨대 유세포 분석에 의하여 확인될 수 있다. 이러한 분석은 진단 또는 예후 목적으로 사용될 수 있다. 상기 과정으로 확인된 세포들은 치료 목적으로 사용될 수도 있다. 사합체의 대용으로서, 오합체 또는 이합체 역시 사용될 수 있다 (Current Protocols in Immunology (2000) unit 17.2 supplement 35).
또한, 본 발명의 펩타이드는 면역 상기 반응 (immune recall response)를 평가하는 시약으로서 사용될 수 있다 (예컨대, Bertoni et al., 1997 and Perma et al., 1991. 참고). 예를 들어, 특정 펩타이드를 사용하여, 항원 특이적 CTLs 또는 HTLs의 존재에 대하여 HCV 감염된 개개인 환자의 PBMC 시료가 분석될 수 있다. 단핵구 세포를 함유하는 혈액 시료는 PBMC를 배양하고 본 발명의 펩타이드로 세포를 자극함으로써 평가될 수 있다. 적절한 배양 기간 후, 증가된 세포들을, 예컨대 세포독성 활성 (CTL) 또는 HTL 활성에 대하여 분석할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 백신 효능 평가를 위한 시약으로 사용될 수 있다.
면역원으로 백신접종된 환자로부터 얻은 PBMC는, 예컨대 전술한 방법들 중 하나를 이용하여 분석될 수 있다. 상기 환자는 HLA 유형 분석되고, 그 환자 체내에 존재하는 대립형질 특이적 분자를 인식하는 펩타이드 에피토프 시약이 분석을 위하여 선택된다. 백신의 면역원성도 (immunogenicity)은 PBMC 시료 중의 에피토프 특이적 CTLs 및/또는 HTLs의 존재에 의하여 표시된다.
본 발명의 펩타이드는 또한, 이 기술 분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다 (예컨대, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; and Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 참조). 이러한 항체들은 HLA 분자 맥락에서 펩타이드를 인식하는 것들, 즉 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 항체를 포함한다.
특정 실시 상태에 있어서, 제1 단량체형 펩타이드와 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드는 링커를 통하여 연결된다; 상기 링커는 임의의 펩타이드 링커 또는 펩타이드 스페이서, 예컨대 글리신, 리신 또는 아르기닌 링커/스페이서, 폴리히스티딘 태그, G 단백질과 A 단백질을 포함할 수 있지만, 비스-말레이미드 링커/스페이스, 이황화 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커를 사용하는 것 역시 가능하다. 실시에 있어서, 펩타이드 화학 분야에서 유용하다고 알려진 임의의 링커 역시 본 발명에 따른 링커로서 유용하다. 그러므로, 본 발명은 서로 컨쥬게이트되거나 융합된 "단순" 선형 펩타이드의 이용을 고려하지만, 각각의 천연 항원으로부터 유래한 펩타이드들을 비펩타이드 링커로 연력한 펩타이드 조합의 이용 역시 고려한다. 다수 유형의 링커를 사용하는 것 역시 본 발명의 범위 내이고, 예컨대 체인 내 이황화 링커를 포함하는 선형 펩타이드를 이용하는 것 역시 본 발명의 일부인 것이다.
본 발명에서 특히 흥미로운 펩타이드 조합이 실시예 서론부에 개시되어 있다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 펩타이드 조합의 하나 이상의 제1 펩타이드 및 하나 이상의 제2 펩타이드는 N- 또는 C-말단 변형, 예컨대 아미드화, 아실화 또는 아세틸화를 포함한다.
상기 펩타이드 조합이 백신 제제 또는 진단 제제로서 고려되기 때문에, 특정 실시 상태에 있어서 이들은 담체 분자, 예컨대 면역원성 담체와 짝을 이룬다. 그러므로, 상기 펩타이드 조합의 펩타이드들은 재조합 융합체 (예컨대, CLIP 기술을 통하여)로서, 또는 배향된 (예컨대, 헤테로2기능성 (heterobifunctional) 크로스-링커를 이용) 또는 비배향된 방식으로 화학적 연결부를 통하여 다른 분자와 연결될 수 있다. 예컨대, 디프테리아 독소, 라텍스 비드 (진단 및 예후 실시 상태에 있어서 편리함), 자성 비드 (역시 진단 및 예후 실시 상태에 있어서 편리함), 폴리리신 컨스트럭트 등과 같은 담체 분자들과 연결하는 것 모두가 본 발명에 따라 가능하다.
면역원성 담체는 이 기술 분야에서 관용적으로 사용되는 것들 등의 담체 단백질 (예컨대, 디프테리아 또는 파상풍 톡소이드, KLH 등)로부터 편히 선택되지만, 집단의 대다수에서 T 세포 면역을 유도할 수 있는 짧은 펩타이드 (T 헬퍼 에피토프)를 사용하는 것 역시 가능하다. 이러한 T 헬퍼 에피토프에 대한 상세는, 예컨대 WO 00/20027에 기재되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다 - 이 문헌에서 논의되는 모든 면역적 담체들 및 "이러 저러한" (즉, 통용되는) T 헬퍼 에피토프가 본 발명에서 면역원성 담체로서 유용하다.
특정 실시 상태에 있어서, 상기 담체는 바이러스 유사 입자, 즉 감염없이 비리온과 성질을 공유하는 입자이다. 이러한 바이러스 유사 입자는 화학적으로 (예컨대, Jennings and Bachmann Ann Rev Pharmacol. Toxicol. 2009. 49:303-26 Immunodrugs: Therapeutic VLP-based vaccines for chronic diseases) 또는 융합 단백질을 생성하는 클로닝 기법을 이용하여 (예컨대, Peabody et al. 　J. Mol. Biol. 2008; 380: 252-63. Immunogenic display of diverse peptides on virus-like particles of RNA phage MS2) 제공될 수 있다. 또 다른 예시는 Immune Response Corporation사에서 최초로 만든 HIV 백신인 "리뮨 (Remune)"으로, 이것은 바이러스 게놈을 파괴하기 위하여 방사선 조사된 포르말린 비활성화된 HIV로 이루어진다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 핵산은 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드 중 하나 이상의 단량체형 펩타이드를 코딩하고, 여기서, 코딩되는 다량체형 펩타이드의 제1 펩타이드 및 하나 이상의 제2 펩타이드는 펩타이드 링커, 예컨대 펩타이드 스페이서 및/또는 이황화 다리를 통하여 연결된다. 상기 펩타이드 링커/스페이서는 통상적으로 글리신, 아르기닌, 리신 링커/스페이스, 또는 글리신-리신 링커/스페이서로 이루어지는 군으로부터 선택되지만, 이 기술 분야에 알려진 임의의 펩타이드 링커가 유용할 수 있다. 또한, 그러므로 펩타이드 링커라는 용어는 제1 펩타이드 및 제2 펩타이드 사이를 펩타이드 결합을 통하여 커플링시키는 것을 의미하는 것이다. 제1 펩타이드 와 제2 펩타이드를 표준 펩타이드 결합으로 연결시키는 펩타이드 링커는 펩타이드 스페이서라고도 일컬어질 수 있다. 또한, 제1 펩타이드와 제2 펩타이드는 펩타이드 링커 및 이황화 결합을 통하여 연결될 수 있는데, 체인 내 이황화 결합이 존재하는 경우라면 그러하다.
한 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 핵산은 펩타이드 조합을 코딩하고, 이것은 면역원성 담체와 같은 담체 분자와 커플링 (융합에 의함)된다; 유용한 담체는 전술하였다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 링커는 비스-말레이미드 링커, 이황화 링커, 폴리에틸렌 글리콘 (PEG) 링커, 글리신 링커/스페이서, 리신 링커/스페이서 및 아르기닌 링커/스페이서로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 이량체형 펩타이드와 같은 다량체 펩타이드는 한 단량체형 펩타이드와 다른 단량체형 펩타이드를 연결하는 상기 단량체형 펩타이드의 N-말단의 자유 아미노기에 링커를 포함한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 이량체형 펩타이드와 같은 다량체 펩타이드는 한 단량체형 펩타이드와 다른 단량체형 펩타이드를 연결하는 상기 단량체형 펩타이드의 C-말단의 자유 카르복실기에 링커를 포함한다.
이러한 링커들 중 적어도 두 가지 옵션이 문헌 [A.R Jacobson et al, J. Med. Chem. 1989, 32, 1708-1717] 및 [D Giannotti et al, Journal of Medicinal Chemistry, 2000, Vol. 43, No. 22]에 개시되어 있고, 이들 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다.
또는, 펩타이드 N-말단들 간 연결은 Br-(CH2)n-Br을 이용한 반응에 의하여 이루어질 수 있다.
링커의 길이는 글리신 잔기의 첨가에 의하여 변할 수 있는데, 예컨대 Fmoc-NH-CH2CH2-NH-Gly-NH2가 사용될 수 있다.
이러한 합성의 예시로서, 숙신산을 통하여 컨쥬게이션되어 제조된 이량체형 펩타이드는 다음과 같을 수 있다:
(H-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2)E(H-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Glu-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2)F (Gly1E 및 Gly1F 사이에 숙신산 링커)
이 이량체는 하기 2개의 단량체의 반응으로 제조되었다.
단량체 E
H-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2 (SEQ ID NO:143).
단량체 F
H-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Glu-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2 (SEQ ID NO:144).
하기 개요된 반응 모식에 따라, 두 단량체는 반응하여 헤테로이량체를 생성하고, 여기서 연결은 체인 E의 Gly1의 N-말단과 체인 F의 Gly1의 N-말단 사이에 있다.
단량체 E 및 F는 Sieber Amid 수지에서 개별적으로 합성된다. N-말단 글리신의 Fmoc기는 펩타이드가 여전히 수지상에 존재하는 동안에 제거된다. 펩타이드는 수지로부터 분리된다. 그 결과 보호된 펩타이드 E는 숙신산 무수물과 반응하고 그 후 보호된 펩타이드 F와 반응한다. 보호기는 그 후 95% TFA를 이용하여 제거된다. 형성된 헤테로이량체는 이 기술 분야의 숙련자에게 공지된 관용적 정제 방법에 의하여 미반응 단량체들로부터 정제될 수 있다.
합성의 예시로서, 디-아미노 프로판을 통하여 컨쥬게이션되어 제조된 이량체형 펩타이드는 다음과 같을 수 있다:
(H-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Gly)G(H-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Glu-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly)H 트리플루오로아세테이트염 (Gly23 및 Gly23 사이에 디아미노 프로판 링커)
이 이량체는 하기 2개의 단량체의 반응으로 제조되었다.
단량체 G
H-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Gly-COOH (SEQ ID NO:145)
단량체 H
H-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Glu-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-COOH (SEQ ID NO:146)
하기 개요된 반응 모식에 따라, 두 단량체 G 및 H는 반응하여 헤테로이량체를 생성하고, 여기서 연결은 체인 G의 Gly23의 C-말단과 체인 H의 Gly23의 C-말단 사이에 있다.
단량체 G 및 H는 2-클로로트리틸 수지에서 개별적으로 합성된다. 수지로부터 분리되기 전, Boc-Gly-OH가 수지 상에서 상기 펩타이드에 커플링된다. 그 후 결과물 펩타이드는 Boc-보호되거나 또는 수지로부터 분리되기 전에 아세틸화될 수 있다. 결과물인 보호된 펩타이드 G는 Fmoc-디아미노프로판과 반응하고, Fmoc은 탈보호되어 G는 보호된 펩타이드 G의 C-말단과 펩타이드 결합을 통하여 커플링된다. 보호기는 그 후 95% TFA를 이용하여 제거된다. 형성된 헤테로이량체는 이 기술 분야의 숙련자에게 공지된 관용적 정제 방법에 의하여 미반응 단량체들로부터 정제될 수 있다.
Cys-Lys 가교의 합성 방법:
BI400-B 트리플루오로아세테이트염의 제조로 예시
(H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys(2-옥소-에틸)-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2)A(H-Gly-Lys-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Glu-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2)B 트리플루오로아세테이트염 (Cys(2-옥소-에틸)9A 및 Lys2B 사이에 티오에테르 결합)
이 이량체는 하기 2개의 단량체의 반응으로 제조되었다.
단량체 A
H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2 (SEQ ID NO:121)
단량체 B
H-Gly-Lys(브로모아세틸)-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Glu-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2 ; (SEQ ID NO:122)
또는 400-Seq B 트리플루오로아세테이트염의 제조로 예시
(H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys(2-옥소-에틸)-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2)A(H-Gly-Lys-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2)B 트리플루오로에세테이트염 (Cys(2-옥소-에틸)9A 및 Lys2B 사이에 티오에테르 결합)
이 이량체는 하기 2개의 단량체의 반응으로 제조되었다.
단량체 A
H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Cys-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2 (SEQ ID NO:121)
단량체 B
H-Gly-Lys(브로모아세틸)-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg- Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2 (SEQ ID NO:147)
하기 개요된 반응 모식에 따라, 두 단량체는 반응하여 헤테로이량체를 생성하고, 여기서 연결은 체인 B의 Lys 2 (브로모아세틸) 측쇄와 체인 A의 Cys 사이에 형성된다.
실온, 중성 pH에서, 완충 수용액 중의 브로모아세틸 모이어티는 SH 함유 모이어티, 예컨대 시스테인의 티올기에 매우 반응성이다. 그러므로, 다른 펩타이드 서열에 시스테인이 존재한다면, 상기 SH가 브로모아세틸을 공격하여 분자간 티올에테르 다리를 형성할 것이다. 이 반응이 나트륨 함유 완충액, 예컨대 NaHCO3으로 완충되는 경우, 이 반응의 유일한 부산물은 무해한 염인 NaBr 뿐이다.
형성된 헤테로이량체는 이 기술 분야의 숙련자에게 공지된 관용적 정제 방법에 의하여 미반응 단량체들로부터 정제될 수 있다.
두 펩타이드 서열 간 옥심 결합, 분자간 결합의 합성 방법:
400-Seq B* 트리플루오로아세테이트염의 제조로 예시
(H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Dpr(COCHO)-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2)D(H-Gly-Lys(아미노옥시아세틸화)--Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg- Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2)C 트리플루오로아세테이트염 (Dpr(COCHO)-)9D와 Lys(아미노옥실아세틸화)2C 사이에 옥심이 형성)
이 이량체는 하기 2개의 단량체의 반응으로 제조된다.
단량체 C
H-Gly-Lys(아미노옥시아세틸화)-Gly-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Asp- Arg-Asp-Arg-Gly-Gly-Gln-Asp-Arg-Asp-Arg-NH2 (SEQ ID NO:148)
단량체 D
H-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gly-Gly-Dpr(Ser)-Gly-Gly-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-Gly-Glu-Arg-Glu-Lys-Arg-Ala-NH2. (SEQ ID NO:149)
하기 개요된 반응 모식에 따라, 두 단량체는 반응하여 헤테로이량체를 생성하고, 여기서 연결은 체인 C의 Lys2 (아미노옥시아세틸화) 측쇄와 체인 D의 산화된 Dpr(Ser) 사이에 형성된다.
Lys으로부터 Mtt기가 제거된 후, 상기 펩타이드가 여전히 수지에 부착되어 있는 동안 아미노옥시아세트산을 Lys에 커플링시킴으로써 아미노옥시아세틸화 (AoA) 단량체형 C가 합성되었다. 그 후, 펩타이드는 고체상 지지체로부터 분리되어 관용적인 정제 방법에 의하여 정제된다. 수지로부터 분리 및 정제된 후 세린 함유 (serinyl) 디아미노프로피온산 잔기 (Dpr(Ser)를 알데히드 관능기로, 과옥소산염을 이용하여 산화시킴으로써 단량체 D가 형성된다. 균등 몰량의 단량체 A 및 B가 아세토니트릴 및 아세테이트 완충액 (pH 4)에서 용해되었다. 실온에서 16 시간 반응시킨 후, 생성물 C-옥심-D를 이 기술 분야의 숙련자에게 공지된 관용의 정제 방법으로 분리하였다.
Dpr=디아미노프로피온산
Fmoc-Dpr (Boc-Ser(tBu))-OH Merck 04-12-1186
PEG 링커를 이용한 이량체의 합성 방법:
하기의 프로토콜에 의하여 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드, 예컨대 헤테로이량체형 펩타이드가 합성될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다:
탈블록화 Asp 또는 Glu 잔기를 함유하고 있는 펩타이드 수지에 (단량체 1) DMF 중의 HBTU, DIPEA 및 Trt-아미노 PEG를 첨가한다. 이 혼합물을 밤새 커플링되도록 한다. 용액으로부터 수지를 여과시키고 표준 프로토콜에 의하여 수세한다. Trt-PEG화 펩타이드로부터 Trt기를 제거한다. 그 후, HBTU 및 DIPEA를 이용하여 노출된 아미노기에 탈블록화 Asp 또는 Glu 잔기를 함유하고 있는 단량체 2를 커플링시킨다. 분리 후, 임의의 적절한 기법을 이용하여 원하는 생성물을 정제하여 원하는 다량형체형의 펩타이드를 얻는다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 단리된 단량체형의 펩타이드는 분자 내 결합, 예컨대 분자 내 Cys-Cys 결합의 형태의 결합을 함유한다. "체인 내 결합"과 상호교환적으로 사용되는 "분자 내 결합"은 동일한 펩타이드 체인 내의 두 상이한 아미노산 사이의 결합으로 이해되어야 하지만, 상기 아미노산들이 펩타이드 서열에서 서로 필연적으로 인접해야 하는 것은 아니다. 따라서, 몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 단리된 다량체형 펩타이드는, 하나 이상의 단량체 내에서 분자 내 결합 및 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체의 두 체인 간 분자간 결합을 모두 포함할 수 있다. 이 분자 내 결합은 동일한 펩타이드 서열 내의 시스테인 잔기로 형성된 Cys-Cys 결합의 형태일 수 있다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 단량체는 Lys 잔기 또는 다른 아미노산 잔기, 예컨대 결합을 이룰 수 있는 Ser, Cys, Asp 또는 Glu로부터 유래하는 분자 내 결합, 예컨대 티올에테르 결합 또는 옥심 결합 또는 PEG 링커를 통하여 다른 단량체 펩타이드 서열상의 아미노산 잔기와의 결합을 포함한다.
폴리Lys 또는 MAPS를 이용한 다량체형 펩타이드의 합성 방법:
폴리Lys 또는 MAPS (다중 항원 펩타이드) - 는 강력한 면역원성 반응을 생성시키기 위한 담체 단백질로서 지난 20년 동안 널리 사용되어 왔다. MAP 시스템은 표준 고체상 화학을 이용하여 목적하는 에피토프 서열이 평행하게 세워질 수 있는 백본을 형성하기 위하여 3개 이상의 방사상 분지형의 리신 코어로 이루어진 펩타이드 코어를 이용한다.
상기 MAP 시스템은 AnaSpec, Bio-synthesis Inc. 및 기타 몇몇 회사로부터 구득 가능한 시판품이다. 상기 제품은, 카탈로그에 제시된 바와 같이 폴리Lys 코어에 오직 2개의 (동일한) 펩타이드 서열의 부착만을 허용한다. 그러나, 2개의 상이한 펩타이드 서열 상의 리신의 알파- 및 엡실론-아미노 기능기에 대하여 상이한 보호기를 사용함으로써 상기 2개의 상이한 펩타이드 서열의 연결 역시 가능하다.
MAP의 사용은 하기의 참고 문헌들에 개시되어 있다: [Wang, C. Y et al. "Long-term high-titer neutralizing activity induced by octameric synthetic HIV antigen" Science 254, 285-288 (1991)], [Posnett, D. et al. "A novel method for producing anti-peptide antibodies" J. Biol. Chem. 263, 1719-1725 (1988)], 및 [Tam, J. P. "Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system" PNAS USA 85, 5409-5413 (1988)].
MAP 시스템은 또한 펩타이드 항원을 함유하는 적절히 관능화된 4가 또는 8가 폴리리신 컨스트럭트의 화학적 (티오에테르, 옥심, 하이드라존) 연결에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 화학적 연결 (chemical ligation)을 이용하여, 함께 연결되는 두 펩타이드 서열은, 이들이 개별적으로 합성되기 때문에 동일할 필요가 없게 된다.
또한, MAP 기반 시스템의 새로운 응용법은, 고체 지지체 상에서 MAP의 수지상 분지에 폴리(에틸렌 글리콜 (PEG) 체인을 함유하는 "프로브"를 합성하는 것이다.
MAP 시스템의 사용은 다량체형 복합체의 크기를 증가시킬 것이고 면역원성 반응을 증가시킬 수 있다.
PEG를 이용한 다량체형 펩타이드의 합성 방법:
PEG 링커용으로 사용될 적절한 다분지 활성화 PEG는, 예컨대 하기 구조의 화합물로 시판중이다:
Figure 112013071276988-pct00001
여기서, X는 다른 것들보다 에탄티올 - CH2CH2SH (에피토프 또는 티오에테르 링커로 S-S 다리를 형성하는 데 사용될 수 있다) 또는 프로필아민 -CH2CH2CH2NH2일 수 있다. 이들 핸들은 2개의 동일한 펩타이드 서열의 연결을 가능케 하는 데 바람직하고 폴리-단량체형의 에피토프 제시 컨스트럭트와 같이 보일 수 있다. 그러나, 상기 PEG에 이량체 (함께 연결된 두 에피토프)를 고정시킬 수 있다.
펩타이드 - 폴리-L-Lys (PLL) - 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 컨스트럭트의 합성 방법:
펩타이드-PLL-PEG 컨스트럭트는 하기의 프로토콜에 의하여 합성될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다:
Fmoc-폴리-L-Lys-수지 (시판품)을 20% 피페리핀-DMF로 탈보호한다. CH2Cl2-NMP의 혼합 용매에서 Fmoc-NH-PEG4-COOH를 첨가하고, 뒤이어 HBTU 및 DIPEA를 첨가한 후 24 시간 반응이 진행되도록 한다. 결과물인 PEG화 폴리-L-Lys-수지를 수세하고 PEG화 단계를 반복한다. 음성의 결과를 얻을 때까지 Kaiser's 닌하이드린 테스트로 이 반응을 모니터링한다. Fmoc기를 탈보호한 후, 단계별 고체상 공정으로 분지형 폴리-L-Lys-폴리에틸렌 글리콜 코어 상에서 직접 4개의 동일한 펩타이드 체인을 합성한다. HBTU 및 DIPEA로 활성화된 모든 잔기들이 커플링 되도록 2 시간 동안 둔다. 커플링을 Kaiser's 닌하이드린 테스트로 모니터링하고 필요하다면 반복한다. 분리 후, 임의의 적절한 기법을 이용하여 원하는 생성물을 정제하고 원하는 펩타이드-컨스트럭트를 얻는다.
표 1 (밑줄 친 아미노산은 이량체형 분자에서 링커의 위치를 말한다; 글자 크기가 큰 문자 C는 필요에 따라 동일한 펩타이드 서열 내의 다른 시스테인 잔기와 분자 내 결합을 이르는 시스테인 잔기를 말한다. 호모아르기닌은 Har로 약기, 노르류신은 Nle으로 약기하거나 한 글자 "Z"로 약기, N-ε-메틸화 Lys은 Lys(Me)로, 시트룰린은 한 글자 "B"로, 디아미노프로피온산은 Dpr로, 세린 함유 디아미로프로피온산은 Dpr(Ser)으로 약기한다. 플루는 인플루엔자의 약어이다.)
Figure 112013071276988-pct00002
Figure 112013071276988-pct00003
Figure 112013071276988-pct00004
Figure 112013071276988-pct00005
Figure 112013071276988-pct00006
Figure 112013071276988-pct00007

발명의 특정 실시 상태
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1, X3 및 임의의 모이어티 X5는 각각 독립적으로 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 임의의 아미노산으로 이루어지는 선형의 서열을 의미한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 노르류신, 글루타민, 세린, 리신, 트립토판, 시스테인 또는 이들의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 이루어진다. 상기 유도체는 상기 특정된 아미노산 중 임의의 것의 유도체일 수 있다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 노르류신, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 세린, 리신, 트립토판, 시스테인 오르니틴, 디아미노프로피온산 (Dpr) 또는 이들의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로 이루어진다. 상기 유도체는 상기 특정된 아미노산 중 임의의 것의 유도체일 수 있다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X5 및/또는 모이어티 X6는 존재하지 않는다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 특정 천연 항원에 대하여 55% 이상, 예컨대 60% 이상, 예컨대 65% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 100%의 서열 동일성을 갖는다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 특정 천연 항원은 질환 항원, 예컨대 감염원, 예컨대 박테리아, 바이러스, 기생충, 곰팡이, 또는 암 항원, 예컨대 종양 유전자 (폐암, 위암, 유방암)로부터 유래한 단백질 또는 펩타이드 서열, 또는 자가면역 질환, 예컨대 당뇨, 다발성 경화증 (MS), 복강 질환, 근육통 뇌척수염 (ME), 건선 및/또는 크론병을 야기하는 항원으로부터 유래한 단백질 또는 펩타이드 서열이다.
따라서, 관련 항원들이 유래하는 자가면역 질환으로 확인되고 의심되는 질환은 무위산 자가면역 활성 만성 간염, 급성 전파 뇌척수염, 급성 출혈성 백질뇌염, 애디슨 병, 무감마글로불린혈증, 탈모증, 루게릭 병, 강직성 척추염, 항 -GBM/TBM 신염, 항 인지질 증후군, 무합성효소 증후군, 관절염, 아토피 알레르기, 아토피 피부염, 자가 면역 재생 불량성 빈혈, 자가 면역 심근 병증, 자가 면역 용혈성 빈혈, 자가 면역 간염, 자가 면역 내이 질환, 자가 면역 림프구 증식 증후군, 자가 면역 말초 신경 병증, 자가 면역 췌장염, 자가 면역 다내분비선 증후군 유형 I, II, 및 III, 면역 프로게스테론 피부염, 면역 혈소판 감소성 자반증, 자가 면역 포도막염, 발로병/발로 동심 경화증, 베체트 증후군, 버거씨병, 비커스태프 뇌염, 블라 증후군, 수포성 유천포창, 캐슬만씨병, 샤가스병, 만성 피로 면역 부전 증후군, 만성 염증성 탈수 초성 다발성 신경 병증, 만성 재발성 다발성 골수염, 만성 라임 병, 만성 폐쇄성 폐 질환, 척-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 체강 질병, 코간 증후군, 냉 응집소 질환, 보체 성분 2 결핍, 두개골 동맥염, CREST 증후군, 크론병 (특발성 염증성 장 질환 "IBD"의 두 가지 유형 중 하나), 쿠싱 증후군, 피부 백혈구파괴 혈관염, DEGO병, 더큠병, 피부염 포진, 피부 근염, 1형 당뇨병, 미만성 피부 전신 경화증, 드레슬러 증후군, 원반 모양 홍반 루푸스, 습진, 자궁 내막증, 힘줄부착부위 관련 관절염, 호산구성 근막염, 표피 수포증, 결절성 홍반, 필수 혼합 한랭 글로불린 혈증, 에반 증후군, 진행성 골화성 섬유이형성증, 주창, 섬유근육통, 섬유화 아베올리티스, 위염, 위장 천포창, 거대 세포 동맥염, 사구체 신염, 굿패스처 증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군 (GBS), 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-숀라인 자반증, 임신 포진, 화농성 한선염, 휴즈 증후군 (항 인지질 증후군 참조), 저감마글로불린혈증, 특발성 염증성 탈수 초성 질환, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증 (자가면역 혈소판 감소성 자반증 참조), IgA 신증 (또한 버거씨병), 인클루전바디 근염, 염증성 탈수 초성 다발성 신경병증, 간질성 방광염, 과민성 대장 증후군 (IBS), 청소년 특발성 관절염, 청소년 류마티스 관절염, 가와사키 병, 램버트-이튼 근무력 증후군, 백혈구파괴 혈관염, 편평 태선, 경화성 태선, 선형 IgA 질환 (LAD), 루게릭병 (또한 루게릭 경화증), 루포이드 간염, 루푸스, 마지드 증후군, 메니에르병, 현미경 다발성 맥관염, 밀러-피셔 증후군, 혼합 결합 조직 질환, 경화증, 무차-하버만 질환, 머클-웰스 증후군, 다발성 골수종, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시신경척수염 (또한 데빅병), 신경근육기장증, 안구 반흔 천포창, 안구간대경련-근간대경련 증후군, 오드 갑상선염, 재발성 관절염, 판다스 (스트렙토코쿠스 관련 소아 면역 신경 정신 장애), 부신 생물 소뇌 변성, 발작성 야간 혈색소뇨 증 (PNH), 패리 롬베르그 증후군, 파르소니지-터너 증후군, 중간부 포도막염, 천포창, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 정맥주위 뇌척수염, POEMS 증후군, 다발성 결절성 다발 동맥염, 다발성 근육통, 다발성 근염, 원발성 담즙 간경변, 원발성 경화성 담관염, 진행성 염증성 신경 병증, 건선, 건선 관절염, 괴저성 농피증, 순수 적혈구 무형성증, 라스무센 뇌염, 레이노 현상, 재발성 다발 연골염, 라이터 증후군, 하지불안 증후군, 후 복막 섬유증, 류마티스 관절염, 류마티스 열, 사르코 이드, 정신 분열증, 슈미트 증후군, 슈니츨러 증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 척추 관절 병증, 접착성 혈액 증후군, 스틸병, 전신근강직 증후군, 급성 세균성 심내막염 (SBE), 수사크 증후군, 스위트 증후군, 시드 무도병, 교감 안염, 타카야의 동맥염, 측두 동맥염 (또한 "거대 세포 동맥염"라고도 함), 톨 로사 헌트 증후군, 횡단성 척수염, 궤양성 대장염 (특발성 염증성 장 질환 "IBD"의 두 가지 유형 중 하나), 미분화 결체 조직 질환, 미분화 척추 관절 병증, 혈관염, 백반증, 베게너 육아종증, 윌슨 증후군 및 위스코트-올드리치 증후군을 들 수 있다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 특정 천연 항원은 바이러스 단백질, 예컨대 구조 단백질, 예컨대 캡시드 단백질, 조절 단백질, 효소 단백질 및 단백질분해효소 단백질이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 바이러스 단백질은 단백질, 예컨대 구조 단백질, 예컨대 헤파타이티스 C 바이러스로부터 선택되는 바이러스의, 코어 또는 엔벨로프 단백질; 인플루엔자 바이러스, 예컨대 M2 단백질, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 및 인간 파필로마바이러스 (HPV)의 단백질이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 바이러스 단백질은 특정 유전자형, 예컨대 1, 예컨대 아형 1a 및 1b, 유전자형 2, 예컨대 2a 및 2b, 유전자형 3, 예컨대 3a, 유전자형 4, 유전자형 5, 및 유전자형 6의 HCV 공통 서열 중 임의의 하나로부터 선택되는 헤파타이티스 C의 바이러스 단백질이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1-X2-X3-X4-X5-X6으로 정의되는 아미노산 서열은 상기 천연 항원의 본래 서열 중에서는 발견되지 않는다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1-X2-X3-X4로 정의되는 아미노산 서열은 상기 천연 항원의 본래 서열중에서는 발견되지 않는다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1-X2-X3으로 정의되는 아미노산 서열은 상기 천연 항원의 본래 서열중에서는 발견되지 않는다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형의 펩타이드는 18~60개의 아미노산, 예컨대 19~60개의 아미노산, 예컨대 20~60개의 아미노산, 예컨대 21~60개의 아미노산, 예컨대 22~60개의 아미노산, 예컨대 23~60개의 아미노산, 예컨대 24~60개의 아미노산, 예컨대 25~60개의 아미노산, 예컨대 26~60개의 아미노산, 예컨대 27~60개의 아미노산, 예컨대 28~60개의 아미노산, 예컨대 29~60개의 아미노산, 예컨대 30~60개의 아미노산, 예컨대 31~60개의 아미노산, 예컨대 32~60개의 아미노산, 예컨대 33~60개의 아미노산, 예컨대 34~60개의 아미노산, 예컨대 35~60개의 아미노산, 예컨대 36~60개의 아미노산, 예컨대 37~60개의 아미노산, 예컨대 38~60개의 아미노산, 예컨대 39~60개의 아미노산, 예컨대 40~60개의 아미노산, 예컨대 42~60개의 아미노산, 예컨대 44~60개의 아미노산, 예컨대 46~60개의 아미노산, 예컨대 48~60개의 아미노산, 예컨대 50~60개의 아미노산, 예컨대 52~60개의 아미노산, 예컨대 54~60개의 아미노산, 예컨대 56~60개의 아미노산, 예컨대 58~60개의 아미노산으로 이루어진다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형 펩타이드는 18~60개의 아미노산, 예컨대 18~58개의 아미노산, 예컨대 18~56개의 아미노산, 예컨대 18~54개의 아미노산, 예컨대 18~52개의 아미노산, 예컨대 18~50개의 아미노산, 예컨대 18~48개의 아미노산, 예컨대 18~46개의 아미노산, 예컨대 18~44개의 아미노산, 예컨대 18~42개의 아미노산, 예컨대 18~40개의 아미노산, 예컨대 18~39개의 아미노산, 예컨대 18~38개의 아미노산, 예컨대 18~37개의 아미노산, 예컨대 18~36개의 아미노산, 예컨대 18~35개의 아미노산, 예컨대 18~34개의 아미노산, 예컨대 18~33개의 아미노산, 예컨대 18~32개의 아미노산, 예컨대 18~31개의 아미노산, 예컨대 18~30개의 아미노산, 예컨대 18~29개의 아미노산, 예컨대 18~28개의 아미노산, 예컨대 18~27개의 아미노산, 예컨대 18~26개의 아미노산, 예컨대 18~25개의 아미노산, 예컨대 18~24개의 아미노산, 예컨대 18~23개의 아미노산, 예컨대 18~22개의 아미노산, 예컨대 18~21개의 아미노산, 예컨대 18~20개의 아미노산, 예컨대 18~19개의 아미노산으로 이루어진다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형의 펩타이드는 약 55개 이하의 아미노산, 예컨대 약 50개 이하의 아미노산, 예컨대 약 45개 이하의 아미노산, 예컨대 약 40개 이하의 아미노산, 예컨대 약 38개 이하의 아미노산, 예컨대 약 36개 이하의 아미노산, 예컨대 약 34개 이하의 아미노산, 예컨대 약 32개 이하의 아미노산, 예컨대 약 30개 이하의 아미노산, 예컨대 약 28개 이하의 아미노산, 예컨대 약 26개 이하의 아미노산, 예컨대 약 24개 이하의 아미노산, 예컨대 약 22개 이하의 아미노산, 예컨대 약 20개 이하의 아미노산, 예컨대 약 18개 이하의 아미노산, 예컨대 약 16개 이하의 아미노산, 예컨대 약 14개 이하의 아미노산, 예컨대 약 12개 이하의 아미노산, 예컨대 약 10개 이하의 아미노산으로 이루어진다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형의 펩타이드는 약 10개 이상의 아미노산, 예컨대 약 12개 이상의 아미노산, 예컨대 약 14개 이상의 아미노산, 예컨대 약 16개 이상의 아미노산, 예컨대 약 18개 이상의 아미노산, 예컨대 약 20개 이상의 아미노산, 예컨대 약 22개 이상의 아미노산, 예컨대 약 24개 이상의 아미노산, 예컨대 약 26개 이상의 아미노산, 예컨대 약 28개 이상의 아미노산, 예컨대 약 30개 이상의 아미노산, 예컨대 약 32개 이상의 아미노산, 예컨대 약 34개 이상의 아미노산, 예컨대 약 36개 이상의 아미노산, 예컨대 약 38개 이상의 아미노산, 예컨대 약 40개 이상의 아미노산, 예컨대 약 45개 이상의 아미노산, 예컨대 약 50개 이상의 아미노산, 예컨대 약 55개 이상의 아미노산, 예컨대 약 60개 이상의 아미노산으로 이루어진다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X2, X4, 및 임의의 모이어티 X6 각각은 독립적으로 5~12개의 아미노산, 예컨대 5~10개의 아미노산, 예컨대 5~8개의 아미노산으로 이루어지는 선형 서열로 정의된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1, X3 및 임의의 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 트립토판 및 시스테인과 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 임의의 아미노산 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개로 이루어진 선형 서열로 정의된다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1-X2-X3-X4-X5-X6의 총 알짜 전하는 0 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 또는 5 이상이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1, X3 및 임의의 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 노르류신, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 세린, 리신, 트립토판, 시스테인, 오르니틴, 디아미노프로피온산 (Dpr) 및 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 임의의 아미노산 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개로 이루어진 선형 서열로 정의된다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1-X2-X3-X4-X5-X6의 총 알짜 전하는 0 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 또는 5 이상이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1, X3 및 임의의 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 트립토판 및 시스테인과 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 임의의 아미노산 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개로 이루어진 선형 서열로 정의된다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1-X2-X3-X4-X5-X6의 총 알짜 전하는 0 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 또는 5 이상이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 X1, X2, X3, X4, X5, 및 X6로부터 선택되는 임의의 한 가지 서열의 총 알짜 전하는 0 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 또는 5 이상이다.
상기 단량체형 펩타이드, 예컨대 X1, X2, X3, X4, X5, 및 X6로부터 선택되는 임의의 한 가지 서열, 예컨대 X3 또는 X5의 일부분은, 상기 단량체형 펩타이드, 예컨대 X1, X2, X3, X4, X5, 및 X6로부터 선택되는 임의의 한 가지 서열의 다른 부분이 0을 초과하는 총 알짜 전하를 갖는다면, 0 미만의 총 알짜 전하를 가질 수 있음을 이해하여야 한다.
상기 단량체형 펩타이드의 일부가 세포 표면, 예컨대 헬퍼 세포 표면에 부착할 수 있는 것은 필수적인데, 이 결합은 세포막과 결합하는 위치에서 상기 서열의 알짜 양전하에 의하여 촉진되는 것이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형 펩타이드는 체액성 면역 반응을 유도할 수 있다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 서열 X1 및/또는 X3 및/또는 X5는 K, Lys(Me), RRG, G(Dpr(Ser))G, Dpr, Dpr(ser), GG(Dpr(Ser))GG (SEQ ID NO:150), GEG, CS, GDG, E, G(Lys(Me))G, D, RR, WWGC (SEQ ID NO: 54), RRG, RRZC (SEQ ID NO: 55), WWQC (SEQ ID NO: 56), WW, RR-Har, Har, WDWGC (SEQ ID NO: 57), CGG, CGGG (SEQ ID NO: 58), GCGG (SEQ ID NO: 59), G, GKG, GC, GG, C, R, GCG, CG, GRR, GGCGG (SEQ ID NO: 60), CGGKG (SEQ ID NO: 61), CGGKGG (SEQ ID NO: 62), GGKGG (SEQ ID NO: 63), KG, 및 GWK로부터 선택된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 서열 X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 SLLTEVETP (SEQ ID NO: 64), SLZTDIETP (SEQ ID NO: 65), TDIET (SEQ ID NO: 66), CSLLT (SEQ ID NO: 67), SLLTEVQTPIRN (SEQ ID NO: 68), TPIRSEWGCRSN (SEQ ID NO: 69), IDTPIR (SEQ ID NO: 70), AKRRV (SEQ ID NO: 71), IEEEG (SEQ ID NO: 72), AKRRVV (SEQ ID NO: 73), DQQLL (SEQ ID NO: 74), AEEEVV (SEQ ID NO: 75), GIEEE (SEQ ID NO: 76), IEEEGGRDRDR (SEQ ID NO: 77), CAKRRVVC (SEQ ID NO: 78), IEEEGGERDRDR (SEQ ID NO: 79), IEEEGGQDRDR (SEQ ID NO: 80), IEEEGGEQDRDR (SEQ ID NO: 81), EEEIGGRDRD (SEQ ID NO: 82), RLEPWKH (SEQ ID NO: 83), FHSQV (SEQ ID NO: 84), FITKGLGISY (SEQ ID NO: 85), LLADARVCS (SEQ ID NO: 86), GV(Nle)AGIAYFS (SEQ ID NO: 87), VETPIR (SEQ ID NO: 88), VETPIRN (SEQ ID NO: 89), SNDSS (SEQ ID NO: 90), TPIBQDWG (SEQ ID NO: 91), AKRRVVQREKRA (SEQ ID NO: 92), IEEEGGERDR (SEQ ID NO: 93), AEEEIV (SEQ ID NO: 94), RDRDR (SEQ ID NO: 95), ERDRDR (SEQ ID NO: 96), AKRRVVEREKRA (SEQ ID NO: 97), QDRDR (SEQ ID NO: 98), EQDRDR (SEQ ID NO: 99), RDRDQ (SEQ ID NO: 100), GSQPKTA (SEQ ID NO: 101), FITKGLGISYGRK (SEQ ID NO: 102), LLADARVSA (SEQ ID NO: 103), GVLAGIAYYS (SEQ ID NO: 104), TPIRNEWG (SEQ ID NO: 105), SEWGSRSN (SEQ ID NO: 106), SLZTDIETPG (SEQ ID NO: 107), QREKRAV (SEQ ID NO: 108), QREKR (SEQ ID NO: 109), IEEEGG (SEQ ID NO: 110), EREKRA (SEQ ID NO: 111), QREKRA (SEQ ID NO: 112), ERDRD (SEQ ID NO: 113), HPGSQ (SEQ ID NO: 114), TPIXQEW (SEQ ID NO: 151), EQDRDRGG (SEQ ID NO: 152), GNWAKVL (SEQ ID NO: 153), LLADARV (SEQ ID NO: 154), NWAKVI (SEQ ID NO: 155),및 SGADRV (SEQ ID NO: 156)로부터 선택된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형 펩타이드는 Cys, Lys, Ser, Asp, 및 Glu 또는 그 유도체로부터 선택되는 하나 이상의, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산을 포함한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형의 펩타이드는 하나 이상의 시스테인, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 시스테인을 포함한다.
몇 개의 시스테인은 분자 내 Cys-Cys 결합에 포함될 수 있는 반면, 나머지는 다른 펩타이드 단량체와의 결합, 즉 분자간 결합에 포함될 수 있다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 서열 X1 및/또는 X3 및/또는 X5는 표 1에 정의된 바와 같다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 서열 X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 표 1에 정의된 바와 같다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, X1-X2-X3-X4-X5-X6 구조를 갖는 펩타이드는 표 1에 정의된 바와 같다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형의 펩타이드는 이량체형의 펩타이드이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드는 표 1에 정의된 바와 같은 X1-X2-X3-X4-X5-X6 구조를 갖는 단량체형 펩타이드 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개를 포함한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 서열 X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 4~17개 아미노산으로 이루어지는 서열, 예컨대 5~16개, 예컨대 5~15개, 예컨대 5~14개, 예컨대 5~13개, 예컨대 5~12개, 예컨대 5~10개의 아미노산으로 이루어지는 서열로 정의된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 서열 X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 5개 이상의, 예컨대 6개 이상의, 예컨대 7개 이상의, 예컨대 8개 이상의, 예컨대 9개 이상의, 예컨대 10개 이상의, 예컨대 11개 이상의, 예컨대 12개 이상의, 예컨대 13개 이상의, 예컨대 14개 이상의, 예컨대 15개 이상의, 예컨대 16개 이상의 아미노산으로 이루어지는 서열로 정의된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 서열 X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 17개 미만의, 예컨대 16개 미만의, 예컨대 15개 미만의, 예컨대 14개 미만의, 예컨대 13개 미만의, 예컨대 12개 미만의, 예컨대 11개 미만의, 예컨대 10개 미만의, 예컨대 9개 미만의, 예컨대 8개 미만의, 예컨대 7개 미만의, 예컨대 6개 미만의 아미노산으로 이루어지는 서열로 정의된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 서열 X1 및/또는 X3 및/또는 X5는 글리신 (G), 아르기닌 (R), 노르류신 (Nle), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q), 세린 (S), 리신 (K), 트립토판 (W), 시스테인 (C), 오르니틴, 디아미노프로피온산 (Dpr) 및 이들의 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 함유하는 서열로 정의된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형 펩타이드는 하나 이상의 분자 내 결합, 예컨대 하나 이상의 Cys-Cys 결합을 함유한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형 펩타이드는, 예컨대 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산으로 D-형 아미노산이 포함됨으로써, 또는 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산으로 베타 또는 감마형 아미노산이 포함됨으로써 그 N-말단의 단백질 분해가 지연된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 2개 이상의 단량체형 펩타이드는 서열상 동일하다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 2개 이상의 단량체형 펩타이드는 서열상 상이하다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 상기 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드의 펩타이드 가닥 중 1개, 2개 또는 그 이상은, 예컨대 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산으로 D-형 아미노산이 포함됨으로써, 또는 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산으로 베타 또는 감마형 아미노산이 포함됨으로써 그 N-말단의 단백질 분해가 지연된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 링커는 X1, X2, X3, X4, X5 및 X6로부터 선택되는 임의의 서열, 예컨대 제1 단량체형 펩타이드의 X1, X2 또는 X3 서열 내에서부터, 제2 단량체형 펩타이드, 예컨대 X1, X2 또는 X3 서열 내 어디에도 위치한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 링커는 제1 단량체형 펩타이드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60번 위치로부터 선택되는 위치의 아미노산에서부터, 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60번 위치로부터 선택되는 위치의 아미노산에까지 위치한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 링커는 제1 단량체형 펩타이드의 X1, X2 또는 X3 서열 내에서부터, 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드, 예컨대 X1, X2 또는 X3 서열 내 어디에도 위치한다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 상기 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드는 12개 이상의 아미노산, 예컨대 13개, 14개, 15개 또는 17개의 아미노산으로 이루어지는 헬퍼 에프토프를 함유하는데, 헬퍼 에피토프는 아미노산으로 이루어지는 서열의 조합으로 구성되고, 상기 서열은 제1 단량체형 펩타이드로부터의 아미노산 서열과 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드로부터의 아미노산 서열이며, 예컨대 제1 단량체형 펩타이드로부터 2~12개의 아미노산과 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드로부터 2~12개의 아미노산이 유래하는 것이다.
에피토프가 상기 단량체형 펩타이드 서열 내에만 존재할 수 있는 것이 아님을 이해하여야 한다. 에피토프는 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드 서열에서 제1 단량체형 펩타이드와 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 아미노산과 조합하여서도 존재할 수 있는데, 여기서 이 아미노산의 조합은 제1 단량체 펩타이드 서열로부터 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 서열까지 펼쳐져 있는 것이다. 이 에피토프는 연속적인 아미노산 서열이거나 두 단량체형 펩타이드에서 발견되는 아미노산을 함유하는 3차원 에피토프일 수 있다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 분자간 결합은 두 Cys 잔기들 사이의 이황화 결합 (S-S)이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 상기 분자간 결합은 N-ε-메틸화 Lys 측쇄와 Asp 또는 Glu 잔기의 측쇄 사이의 메틸화 펩타이드 결합이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 상기 분자간 결합은 제1 단량체형 펩타이드 중의 Cys 잔기와 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 중의 변형된 Lys 잔기 간의 티오에테르 결합이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 상기 분자간 결합은 옥심 결합이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 상기 분자간 결합은 제1 단량체형 펩타이드 중의 유도화된 Lys 잔기와 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 중의 유도화된 Ser 잔기 간의 옥심 결합이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 상기 분자간 결합은 제1 단량체형 펩타이드 중의 유도화된 리신, 오르니틴 또는 디아미노프로피온산 잔기와, 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 중의 유도화된 세린 모이어티, 예컨대 세린 잔기, 예컨대 세린 함유 디아미노프로피온산 잔기, 예컨대 세린 함유 리신 잔기 또는 예컨대 세린 함유 오르니틴 잔기 간의 옥심 결합이다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 상기 단량체형 펩타이드는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커로 연결되는데, 예컨대 제1 단량체형 펩타이드 중의 Asp 또는 Glu 잔기와 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 중의 Asp 또는 Glu 잔기를 통한 링커로 연결된다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드에서 상기 단량체형 펩타이드들 중 임의의 하나는 독립적으로 본 명세서에서 정의된 것과 같다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드는 근본적으로 비(非) 세포침투 펩타이드이다. 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 상기 펩타이드는 세포침투 펩타이드이다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드는 항원 제시 세포의 세포막에 부착할 수 있다.
펩타이드의, 세포, 예컨대 항원 제시 세포에 부착 및 진입하는 능력을 말할 때, 그 펩타이드의 완전한 서열 및 그 단편, 예컨대 에피토프를 대표하는 단편을 고려할 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 전체 서열은 근본적으로 비 세포침투 펩타이드인 반면, 그 펩타이드의 단편은 세포, 예컨대 항원제시 세포에 효율적으로 들어갈 수 있는 경우가 있을 수 있다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드는 국제특허출원 제PCT/DK2011/050460호에 구체적으로 개시된 펩타이드 또는 이량체형 펩타이드가 아니다.
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드는 국제특허출원 제PCT/EP2010/059513호에 구체적으로 개시된 펩타이드 또는 이량체형 펩타이드, 예컨대 하기의 것들로부터 선택되는 것이 아니다:
CGGAKRRVVGGAKRRVVGQREKRAV (SEQ ID NO:115)
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGGERDRDR (SEQ ID NO:116)
CGGAKRRVVGGAKRRVVGGQREKR (SEQ ID NO:117)
CGGGDQQLLGGAEEEIVGGIEEEGG (SEQ ID NO:118)
CGGAEEEVVGGDQQLL (SEQ ID NO:119)
GCGGAKRRVVGGAKRRVV (SEQ ID NO:120)
GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA (SEQ ID NO:121)
GKGGIEEEGGRDRDRGGEQDRDR (SEQ ID NO:122)
GAKRRVVGGCGGAKRRVVQREKRAGEREKRA (SEQ ID NO:123)
GKGGIEEEGGERDRDRGGQDRDR (SEQ ID NO:124)
GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA (SEQ ID NO:125)
GKGGIEEEGGQDRDRGGRDRDR (SEQ ID NO:126)
GAKRRVVGGCGGAKRRVVEREKRAGQREKRA (SEQ ID NO:127)
GKGGIEEEGGEQDRDRGGERDRD (SEQ ID NO:128)
몇 가지 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드는 하기의 것들로부터 선택되는 이량체형 펩타이드가 아니다 (이 펩타이드들은 밑줄 친 아미노산을 통하여 연결된다):
Figure 112013071276988-pct00008
Figure 112013071276988-pct00009
Figure 112013071276988-pct00010

본 발명에 따른 순번화된 실시 상태는 하기와 같다:
1. 하기 구조를 갖는, 60개 이하의 아미노산으로 이루어지는 단리된 단량체형 펩타이드로서,
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (화학식 I),
여기서, X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 노르류신, 글루타민, 세린, 리신, 트립토판, 시스테인 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 임의의 아미노산으로 이루어지는 선형 서열로 정의되고; X2, X4, 및 임의의 모이어티 X6는 각각 독립적으로 5~17개의 아미노산으로 이루어지는 선형 서열을 의미하되, 이들 선형 서열 각각은 특정한 천연의 항원과 50% 이상의 서열 동일성을 갖는 단리된 단량체형 펩타이드.
2. 제1 실시 상태에 있어서, X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 특정 천연 항원에 대하여 55% 이상, 예컨대 60% 이상, 예컨대 65% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 75% 이상, 예컨대 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예컨대 90% 이상, 예컨대 95% 이상, 예컨대 96% 이상, 예컨대 97% 이상, 예컨대 98% 이상, 예컨대 99% 이상, 예컨대 100%의 서열 동일성을 갖는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
3. 제1 실시 상태 또는 제2 실시 상태에 있어서, 상기 특정 천연 항원은 질환 항원, 예컨대 감염원, 예컨대 박테리아, 바이러스, 기생충, 곰팡이, 또는 암 항원, 예컨대 종양 유전자 (폐암, 위암, 유방암)로부터 유래한 단백질 또는 펩타이드 서열, 또는 자가면역 질환, 예컨대 당뇨, 다발성 경화증 (MS), 복강 질환, 근육통 뇌척수염 (ME), 건선 및/또는 크론병을 야기하는 항원으로부터 유래한 단백질 또는 펩타이드 서열인 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
4. 제1 실시 상태 내지 제3 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 특정 천연 항원은 바이러스 단백질, 예컨대 구조 단백질, 예컨대 캡시드 단백질, 조절 단백질, 효소 단백질 및 단백질분해효소 단백질인 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
5. 제1 실시 상태 내지 제4 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 단백질은 단백질, 예컨대 헤파타이티스 C 바이러스의, 코어 단백질; 인플루엔자 바이러스, 예컨대 M2 단백질, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 사이토메갈로바이러스 (CMV) 및 인간 파필로마바이러스 (HPV)의 단백질인 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
6. 제5 실시 상태에 있어서, 상기 바이러스 단백질은 특정 유전자형, 예컨대 1, 예컨대 아형 1a 및 1b, 유전자형 2, 예컨대 2a 및 2b, 유전자형 3, 예컨대 3a, 유전자형 4, 유전자형 5, 및 유전자형 6의 HCV 공통 서열 중 임의의 하나로부터 선택되는 헤파타이티스 C의 바이러스 단백질인 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
7. 제1 실시 상태 내지 제3 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, X1-X2-X3-X4-X5-X6으로 정의되는 아미노산 서열은 상기 천연 항원의 본래 서열 중에서는 발견되지 않는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
8. 제1 실시 상태 내지 제7 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단량체형의 펩타이드는 18~60개의 아미노산, 예컨대 19~60개의 아미노산, 예컨대 20~60개의 아미노산, 예컨대 21~60개의 아미노산, 예컨대 22~60개의 아미노산, 예컨대 23~60개의 아미노산, 예컨대 24~60개의 아미노산, 예컨대 25~60개의 아미노산, 예컨대 26~60개의 아미노산, 예컨대 27~60개의 아미노산, 예컨대 28~60개의 아미노산, 예컨대 29~60개의 아미노산, 예컨대 30~60개의 아미노산, 예컨대 31~60개의 아미노산, 예컨대 32~60개의 아미노산, 예컨대 33~60개의 아미노산, 예컨대 34~60개의 아미노산, 예컨대 35~60개의 아미노산, 예컨대 36~60개의 아미노산, 예컨대 37~60개의 아미노산, 예컨대 38~60개의 아미노산, 예컨대 39~60개의 아미노산, 예컨대 40~60개의 아미노산, 예컨대 42~60개의 아미노산, 예컨대 44~60개의 아미노산, 예컨대 46~60개의 아미노산, 예컨대 48~60개의 아미노산, 예컨대 50~60개의 아미노산, 예컨대 52~60개의 아미노산, 예컨대 54~60개의 아미노산, 예컨대 56~60개의 아미노산, 예컨대 58~60개의 아미노산으로 이루어지는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
9. 제1 실시 상태 내지 제8 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단량체형 펩타이드는 18~60개의 아미노산, 예컨대 18~58개의 아미노산, 예컨대 18~56개의 아미노산, 예컨대 18~54개의 아미노산, 예컨대 18~52개의 아미노산, 예컨대 18~50개의 아미노산, 예컨대 18~48개의 아미노산, 예컨대 18~46개의 아미노산, 예컨대 18~44개의 아미노산, 예컨대 18~42개의 아미노산, 예컨대 18~40개의 아미노산, 예컨대 18~39개의 아미노산, 예컨대 18~38개의 아미노산, 예컨대 18~37개의 아미노산, 예컨대 18~36개의 아미노산, 예컨대 18~35개의 아미노산, 예컨대 18~34개의 아미노산, 예컨대 18~33개의 아미노산, 예컨대 18~32개의 아미노산, 예컨대 18~31개의 아미노산, 예컨대 18~30개의 아미노산, 예컨대 18~29개의 아미노산, 예컨대 18~28개의 아미노산, 예컨대 18~27개의 아미노산, 예컨대 18~26개의 아미노산, 예컨대 18~25개의 아미노산, 예컨대 18~24개의 아미노산, 예컨대 18~23개의 아미노산, 예컨대 18~22개의 아미노산, 예컨대 18~21개의 아미노산, 예컨대 18~20개의 아미노산, 예컨대 18~19개의 아미노산으로 이루어지는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
10. 제1 실시 상태 내지 제9 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단량체형의 펩타이드는 약 55개 이하의 아미노산, 예컨대 약 50개 이하의 아미노산, 예컨대 약 45개 이하의 아미노산, 예컨대 약 40개 이하의 아미노산, 예컨대 약 38개 이하의 아미노산, 예컨대 약 36개 이하의 아미노산, 예컨대 약 34개 이하의 아미노산, 예컨대 약 32개 이하의 아미노산, 예컨대 약 30개 이하의 아미노산, 예컨대 약 28개 이하의 아미노산, 예컨대 약 26개 이하의 아미노산, 예컨대 약 24개 이하의 아미노산, 예컨대 약 22개 이하의 아미노산, 예컨대 약 20개 이하의 아미노산, 예컨대 약 18개 이하의 아미노산, 예컨대 약 16개 이하의 아미노산, 예컨대 약 14개 이하의 아미노산, 예컨대 약 12개 이하의 아미노산, 예컨대 약 10개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
11. 제1 실시 상태 내지 제10 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 본 발명에 따른 펩타이드에서 상기 단량체형의 펩타이드는 약 10개 이상의 아미노산, 예컨대 약 12개 이상의 아미노산, 예컨대 약 14개 이상의 아미노산, 예컨대 약 16개 이상의 아미노산, 예컨대 약 18개 이상의 아미노산, 예컨대 약 20개 이상의 아미노산, 예컨대 약 22개 이상의 아미노산, 예컨대 약 24개 이상의 아미노산, 예컨대 약 26개 이상의 아미노산, 예컨대 약 28개 이상의 아미노산, 예컨대 약 30개 이상의 아미노산, 예컨대 약 32개 이상의 아미노산, 예컨대 약 34개 이상의 아미노산, 예컨대 약 36개 이상의 아미노산, 예컨대 약 38개 이상의 아미노산, 예컨대 약 40개 이상의 아미노산, 예컨대 약 45개 이상의 아미노산, 예컨대 약 50개 이상의 아미노산, 예컨대 약 55개 이상의 아미노산, 예컨대 약 60개 이상의 아미노산으로 이루어지는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
12. 제1 실시 상태 내지 제11 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, X1-X2-X3-X4-X5-X6의 총 알짜 전하는 0 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4, 또는 5 이상인 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
13. 제1 실시 상태 내지 제12 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단량체형 펩타이드는 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
14. 제1 실시 상태 내지 제13 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 X1 및/또는 X3 및/또는 X5는 RR, WWGC (SEQ ID NO: 54), RRG, RRZC (SEQ ID NO: 55), WWQC (SEQ ID NO: 56), WW, RR-Har, Har, WDWGC (SEQ ID NO: 57), CGG, CGGG (SEQ ID NO: 58), GCGG (SEQ ID NO: 59), G, GKG, GC, GG, C, R, GCG, CG, GRR, GGCGG (SEQ ID NO: 60), CGGKG (SEQ ID NO: 61), CGGKGG (SEQ ID NO: 62), GGKGG (SEQ ID NO: 63), KG, 및 GWK로부터 선택되는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
15. 제1 실시 상태 내지 제14 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 서열 X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 SLLTEVETP (SEQ ID NO: 64), SLZTDIETP (SEQ ID NO: 65), TDIET (SEQ ID NO: 66), CSLLT (SEQ ID NO: 67), SLLTEVQTPIRN (SEQ ID NO: 68), TPIRSEWGCRSN (SEQ ID NO: 69), IDTPIR (SEQ ID NO: 70), AKRRV (SEQ ID NO: 71), IEEEG (SEQ ID NO: 72), AKRRVV (SEQ ID NO: 73), DQQLL (SEQ ID NO: 74), AEEEVV (SEQ ID NO: 75), GIEEE (SEQ ID NO: 76), IEEEGGRDRDR (SEQ ID NO: 77), CAKRRVVC (SEQ ID NO: 78), IEEEGGERDRDR (SEQ ID NO: 79), IEEEGGQDRDR (SEQ ID NO: 80), IEEEGGEQDRDR (SEQ ID NO: 81), EEEIGGRDRD (SEQ ID NO: 82), RLEPWKH (SEQ ID NO: 83), FHSQV (SEQ ID NO: 84), FITKGLGISY (SEQ ID NO: 85), LLADARVCS (SEQ ID NO: 86), GV(Nle)AGIAYFS (SEQ ID NO: 87), VETPIR (SEQ ID NO: 88), VETPIRN (SEQ ID NO: 89), SNDSS (SEQ ID NO: 90), TPIBQDWG (SEQ ID NO: 91), AKRRVVQREKRA (SEQ ID NO: 92), IEEEGGERDR (SEQ ID NO: 93), AEEEIV (SEQ ID NO: 94), RDRDR (SEQ ID NO: 95), ERDRDR (SEQ ID NO: 96), AKRRVVEREKRA (SEQ ID NO: 97), QDRDR (SEQ ID NO: 98), EQDRDR (SEQ ID NO: 99), RDRDQ (SEQ ID NO: 100), GSQPKTA (SEQ ID NO: 101), FITKGLGISYGRK (SEQ ID NO: 102), LLADARVSA (SEQ ID NO: 103), GVLAGIAYYS (SEQ ID NO: 104), TPIRNEWG (SEQ ID NO: 105), SEWGSRSN (SEQ ID NO: 106), SLZTDIETPG (SEQ ID NO: 107), QREKRAV (SEQ ID NO: 108), QREKR (SEQ ID NO: 109), IEEEGG (SEQ ID NO: 110), EREKRA (SEQ ID NO: 111), QREKRA (SEQ ID NO: 112), ERDRD (SEQ ID NO: 113) 및 HPGSQ (SEQ ID NO: 114)로부터 선택되는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
16. 제1 실시 상태 내지 제15 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단량체형 펩타이드는 Cys, Lys, Ser, Asp, 및 Glu 또는 그 유도체로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
17. 제1 실시 상태 내지 제16 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 X1 및/또는 X3 및/또는 X5는 표 1에 정의된 것과 같은 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
18. 제1 실시 상태 내지 제17 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열 X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 표 1에 정의된 것과 같은 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
19. 제1 실시 상태 내지 제18 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 서열 X2 및/또는 X4 및/또는 X6는 4~17개 아미노산으로 이루어지는 서열, 예컨대 5~16개, 예컨대 5~15개, 예컨대 5~14개, 예컨대 5~13개, 예컨대 5~12개, 예컨대 5~10개의 아미노산으로 이루어지는 서열로 정의되는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
20. 제1 실시 상태 내지 제19 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 단량체형 펩타이드는 하나 이상의 분자 내 결합, 예컨대 하나 이상의 Cys-Cys 결합을 함유하는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
21. 제1 실시 상태 내지 제20 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 단량체형 펩타이드는, 예컨대 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산으로 D-형 아미노산이 포함됨으로써, 또는 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산으로 베타 또는 감마형 아미노산이 포함됨으로써 그 N-말단의 단백질 분해가 지연되는 것인 단리된 단량체형 펩타이드.
22. 2 이상의 단량체형 펩타이드를 포함하는 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드로서, 각 단량체형 펩타이드는 독립적으로 하기 구조를 가지며 60개 이하의 아미노산으로 이루어지는 것이고,
X1-X2-X3-X4-X5-X6 (화학식 I),
여기서, X1, X3 및 임의적 모이어티 X5는 각각 독립적으로 글리신, 아르기닌, 노르류신, 글루타민, 세린, 리신, 트립토판, 시스테인 또는 이들의 유도체로부터 독립적으로 선택되는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 임의의 아미노산으로 이루어지는 선형 서열로 정의되고; X2, X4, 및 임의의 모이어티 X6는 각각 독립적으로 5~17개의 아미노산으로 이루어지는 선형 서열을 의미하되, 이들 선형 서열 각각은 특정한 천연의 항원과 50% 이상의 서열 동일성을 갖고, 상기 단량체형 펩타이드는 하나 이상의 분자간 결합에 의하여 상호 공유적으로 연결되는 단리된 다량체형, 예컨대 이량체형 펩타이드.
23. 제22 실시 상태에 있어서, 2 이상의 단량체형 펩타이드는 서열상 동일한 것인 단리된 이량체형 펩타이드.
24. 제22 실시 상태에 있어서, 2 이상의 단량체형 펩타이드는 서열상 상이한 것인 단리된 이량체형 펩타이드.
25. 제22 실시 상태 내지 제24 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드의 하나 이상의 펩타이드 가닥은, 예컨대 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산으로 D-형 아미노산이 포함됨으로써, 또는 N-말단의 최초 1개, 2개 또는 3개의 아미노산으로 베타 또는 감마형 아미노산이 포함됨으로써 그 N-말단의 단백질 분해가 지연되는 것인 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드.
26. 제22 실시 상태 내지 제25 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 링커는 X1, X2, X3, X4, X5 및 X6로부터 선택되는 임의의 서열, 예컨대 제1 단량체형 펩타이드의 X1, X2 또는 X3 서열 내에서부터, 제2 단량체형 펩타이드, 예컨대 X1, X2 또는 X3 서열 내 어디에라도 위치하는 것인 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드.
27. 제22 실시 상태 내지 제26 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드는 12개 이상의 아미노산, 예컨대 13개, 14개, 15개 또는 17개의 아미노산으로 이루어지는 헬퍼 에프토프를 함유하는데, 헬퍼 에피토프는 아미노산 서열의 조합으로 구성되고, 상기 서열은 제1 단량체형 펩타이드로부터의 아미노산 서열과 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드로부터의 아미노산 서열이며, 예컨대 제1 단량체형 펩타이드로부터 2~12개의 아미노산과 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드로부터 2~12개의 아미노산이 유래하는 것인 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드.
28. 제22 실시 상태 내지 제27 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자간 결합은 두 Cys 잔기 간의 이황화 결합 (S-S)으로부터 선택되는 것인 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드.
29. 제22 실시 상태 내지 제28 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자간 결합은 제1 단량체형 펩타이드 중의 Cys 잔기와 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 중의 변형된 Lys 잔기 간의 티오에테르 결합인 것인 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드.
30. 제22 실시 상태 내지 제29 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자간 결합은 제1 단량체형 펩타이드 중의 유도화된 Lys 잔기와 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 중의 유도화된 Ser 잔기 간의 옥심 결합인 것인 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드.
31. 제22 실시 상태 내지 제30 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자간 결합은 제1 단량체형 펩타이드 중의 N-ε-메틸화 Lys 측쇄와 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 중의 Asp 또는 Glu 잔기의 측쇄 사이의 메틸화 펩타이드 결합인 것인 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드.
32. 제22 실시 상태 내지 제31 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단량체형 펩타이드는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커, 예컨대 제1 단량체형 펩타이드 중의 Asp 또는 Glu 잔기와 하나 이상의 제2 단량체형 펩타이드 중의 Asp 또는 Glu 잔기를 통하거나, 또는 폴리Lys 코어에 의하여 연결되는 것인 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드.
33. 제22 실시 상태 내지 제31 실시 상태 중 어느 하나에 있어서, 상기 단량체형 펩타이드 중 임의의 하나는 독립적으로 제1 실시 상태 내지 제21 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 정의된 바와 같은 것인 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드.
34. 제1 실시 상태 내지 제21 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 정의된 바와 같은 단량체형 펩타이드 및 제22 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 정의된 바와 같은 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드로부터 선택되는 2 이상의 화합물을 포함하는 조성물.
35. 제1 실시 상태 내지 제21 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 정의된 바와 같은 단량체형 펩타이드 및 제22 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 정의된 바와 같은 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드로부터 선택되는 펩타이드의, 대상체에서 체액성 면역 반응을 유도하기 위한 용도.
36. 제1 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 어느 하나에 기재된 펩타이드를 코딩하는 단리된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드.
37. 제36 실시 상태에 기재된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
38. 제37 실시 상태에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포.
39. 제1 실시 상태 내지 제21 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 단량체형 펩타이드 하나 이상, 제22 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드, 제34 실시 상태에 기재된 펩타이드 조성물, 제36 실시 상태에 기재된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제37 실시 상태에 기재된 벡터를; 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 운반체와 조합하여 포함하고, 면역적 아쥬반트를 포함하여도 좋은 면역원성 조성물.
40. 제39 실시 상태에 있어서, 백신 조성물 형태인 것인 면역원성 조성물.
41. 제1 실시 상태 내지 제21 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 단량체형 펩타이드 하나 이상, 제22 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드, 제34 실시 상태에 기재된 펩타이드 조성물, 제36 실시 상태에 기재된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제37 실시 상태에 기재된 벡터; 또는 제39 실시 상태 내지 제40 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 조성물의 투여를 포함하는, 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 유도하기 위한 방법.
42. 질환 항원, 예컨대 감염원의 병리학적 결과를 감소 및/또는 지연시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 감염원으로 감염되거나 상기 항원에 의하여 야기되는 질환을 앓고 있는 대상체에 대한 것이고,
제1 실시 상태 내지 제21 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 단량체형 펩타이드 하나 이상, 제22 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 단리된 다량체형 펩타이드, 예컨대 이량체형 펩타이드, 제34 실시 상태에 기재된 펩타이드 조성물, 제36 실시 상태에 기재된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제37 실시 상태에 기재된 벡터; 또는 제39 실시 상태 내지 제40 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
43. 의약으로서 사용하기 위한 제1 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 펩타이드.
44. 질환 항원, 예컨대 감염원의 병리학적 결과를 치료하기 위한 제1 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 상기 감염원으로 감염되거나 상기 항원에 의하여 야기되는 질환을 앓고 있는 대상체에 대한 것인 펩타이드.
45. 예컨대, 진단 목적으로 시험관 내 (in vitro) 시험, 예컨대 ELISA 시험에 사용하기 위한 제1 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 펩타이드.
46. 예컨대, 진단 목적으로 시험관 내 (in vitro) 시험, 예컨대 ELISA 시험에 사용하기 위한 제1 실시 상태 내지 제33 실시 상태 중 임의의 어느 하나에 기재된 펩타이드의 용도.
서열 목록 (굵은 글씨의 아미노산은 본 발명의 화학식 I에 정의된 바 X2 및/또는 X4 및/또는 X6 중 임의의 것으로 사용될 수 있는 적절한 항원성 서열을 나타낸다.)
Figure 112013071276988-pct00011
Figure 112013071276988-pct00012
Figure 112013071276988-pct00013
Figure 112013071276988-pct00014
Figure 112013071276988-pct00015
Figure 112013071276988-pct00016
Figure 112013071276988-pct00017
Figure 112013071276988-pct00018
Figure 112013071276988-pct00019
Figure 112013071276988-pct00020
Figure 112013071276988-pct00021
실시예 1
본 발명에 따른 펩타이드는 문헌 [Sheppard, (1978) J.Chem.Soc., Chem. Commun., 539]의 Fmoc-전략을 이용하여 c-말단 아미드로 Schafer-N을 사용함으로써 합성될 수 있다.
세포 침투 시험
한 세트의 펩타이드를 N-말단에 비오틴화하고, 길이 및 유형에 있어서 여러 가지 조합의 아미노산을, 하기 다이어그램에 나타난 바와 같이 펩타이드 X1, X2, X3, X4, X5 및 X6 서열 박스에 첨가한다. 이 펩타이드는 한 개체의 혈액 공여자로부터 생장된 세포 상에서 테스트된다.
본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열에 관한 모식적 다이어그램 (각 X는 아미노산 서열을 의미한다.):
Figure 112013071276988-pct00022

비오틴화 펩타이드에 대한 세포 내 염색
96-웰 U-보텀 폴리스티렌 플레이트 (NUNC, cat no: 163320)가 인간 PBMCs의 염색용으로 사용된다. 간단히, 표 1에 따라 N- 또는 C-말단 비오틴화된 펩타이드 (즉, 각 펩타이드에 대하여 5 mM, 2.5 mM 및 1.25 mM 테스트) 8 μl를 37℃에서 2 시간 동안 혈액 공여자로부터의 PBMC (12.5 x 106 세포/ml) 40 μl와 함께 배양한다. 그 후, 세포를 150 μl의 Cellwash (BD, cat no: 349524)로 3회 수세한 후, 각 세포 펠렛을 100 μl의 트립신-EDTA (Sigma, cat no: T4424)로 재현탁하고, 그 후 37℃에서 5 분간 반응시킨다. 그 후, 제조사의 안내에 따라 트립신 처리된 세포를 150 μl의 Cellwash (BD, cat no: 349524)로 3회 수세한 후, BD Cytofix/CytopermTM plus (BD, cat no: 554715)로 재현탁 후, 4℃에서 20 분간 반응시킨다. 그 후, 세포를 150 μl의 PermWash (BD, cat no: 554715)로 2회 수세한다. 그 후, 각각 비오틴화된 펩타이드 및 수지상 세포를 시각화하기 위하여 제조사의 안내에 따라 4℃에서 30 분간 세포를 스트렙타비딘-APC (BD, cat no: 554067) 및 항-hCD11c (eBioscience, cat no: 12-0116)로 염색한다. 그 후, 유세포 분석 전에 세포를 150 μl의 PermWash로 3회 수세하고 염색 완충액 (BD, cat no: 554656)에 재현탁한다. 수지상 세포는 림프구 외부 위치에서 (즉, 림프구보다 FSC 및 SSC 신호가 높다) CD11c+ 현상이 일어나면서 관문이 된다. HTS 로더를 이용하여, 총 200　000개의 세포들이 FACSCanto II 유세포 분석기에 주어지고 펩타이드 형광에 관한 총 세포 및 수지상 세포의 히스토그램이 준비된다 (즉, 기하평균 (GeoMean)).
비오틴화 펩타이드에 대한 세포 외 염색
96-웰 U-보텀 폴리스티렌 플레이트 (NUNC, cat no: 163320)가 인간 PBMCs의 염색용으로 사용된다. 간단히, 표 1에 따라 N- 또는 C-말단 비오틴화된 펩타이드 (즉, 각 펩타이드에 대하여 5 mM, 2.5 mM 및 1.25 mM 테스트; 모든 펩타이드는 Schafer에서 제조) 8 μl를 37℃에서 2 시간 동안 혈액 공여자로부터의 PBMC (12.5 x 106 세포/ml) 40 μl와 함께 배양한다. 그 후, 세포를 150 μl의 Cellwash (BD, cat no: 349524)로 3회 수세한 후, 각각 비오틴화된 펩타이드 및 수지상 세포를 시각화하기 위하여 제조사의 안내에 따라 4℃에서 30 분간 세포를 스트렙타비딘-APC (BD, cat no: 554067) 및 항-hCD11c (eBioscience, cat no: 12-0116)로 염색한다. 그 후, 유세포 분석 전에 세포를 150 μl의 Cellwash (BD, cat no: 349524)로 3회 수세하고 염색 완충액 (BD, cat no: 554656)에 재현탁한다. 수지상 세포는 림프구 외부 위치에서 (즉, 림프구보다 FSC 및 SSC 신호가 높다) CD11c+ 현상이 일어나면서 관문이 된다. HTS 로더를 이용하여, 총 200　000개의 세포들이 FACSCanto II 유세포 분석기에 주어지고 펩타이드 형광에 관한 총 세포 및 수지상 세포의 히스토그램이 준비된다 (즉, 기하평균 (GeoMean)).
이것은 펩타이드가 세포로 들어갈 능력이 있다면 보일 수 있다.
실시예 2
양성 CTL 반응은 ELISPOT 시험으로 평가될 수 있다.
ELISPOT 시험에 의한 인간 IFN -감마 세포독성 T-세포 ( CTL ) 반응
간단히, 제1일에 단핵구를 부착시키기 위하여 HCV 환자의 PBMC 시료를 플라스크에서 (430　000 PBMCs/cm2), 5% CO2, 37℃에서 2 시간 동안 L-글루타민 (MedProbe Cat. No. 13E17-605E), 10% 피탈 보바인 세럼 (FBS)(Fisher Scientific Cat. No. A15-101) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Fisher Acientific Cat. No. P11-010)으로 보충된 배양 배지 (RPMI 1640 Fisher Scientific; Cat No. PAAE15-039)를 커버하는 양으로 배양한다. 비부착된 세포들은 분리, 수세하여 추후 사용 때까지 FBS 중 10% V/V DMSO에서 동결시킨다. 부착된 세포들을 배양 배지로 조심히 수세한 후, 최종 농도 2 μg/ml의 hrGM-CSF (Xiamen amoytop biotech co, cat no: 3004.9090.90) 및 1 μg/ml의 hrIL-4 (Invitrogen, Cat no: PHC0043)를 함유하는 배양 배지에서 제3일까지 37℃에서 배양하고, 그 후 이 과정을 제6일에 반복한다. 제7일에, 배양된 수지상 세포 (웰당 5000~10000)를, 0.5 μg/웰의 항-인간 γ 인터페론, 항원 시료 (펩타이드 항원에 대하여 최종 농도 1~8 μg/ml; 콘카나발린 A (Sigma, Cat no: C7275) 또는 PHA (Sigma, Cat no: L2769)에 대하여 최종 농도 5 μg/ml) 및 항-Anergy 항체 (항-PD-1 (eBioscience, cat no: 16-9989-82) 및 항-PD-L1 (eBioscience, cat no: 16-5983-82) 모두에 대하여 최종 농도 0.03~0.05 μg/ml)로 코팅된 ELISPOT (Millipore multiscreen HTS) 플레이트에, 해동시킨 자가조직 비부착 세포 (웰당 200000 per well)와 함께 첨가한다. 플레이트를 밤새 배양하고, 제조사의 안내에 따라 스폿을 현상한다. 스폿을 ELISPOT 리더 (CTL-ImmunoSpot® S5 UV Analyzer)로 읽는다.
실시예 3
REVEAL & ProVE ® 신속 에피토프 발견 시스템 상세
본 발명에 따른 펩타이드의 HLA에 대한 결합 특성을 하기 클래스 I의 HLA 유형에 대하여 테스트할 수 있고: HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A29, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B40, 하기 클래스 II의 HLA 유형에 대하여 테스트할 수 있다: HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DR11, HLA-DR13, HLA-DR15. 펩타이드는 Prospector PEPscreen®: 커스텀 펩타이드 라이브러리로서 합성된다. 평균 순도가 높은 0.5~2 mg의 양으로 8~15개의 아미노산 길이의 펩타이드가 합성된다. 시료 100%에 대하여 MALDI-TOF 질량 분석에 의한 품질 제어가 이루어진다.
REVEALTM 결합 시험은 각 후보 펩타이드의 하나 이상의 MHC 클래스 I 대립형질에 결합할 수 있는 능력 및 그 MHC-펩타이드 복합체를 안정화를 측정한다. 친화력이 높고 중간 정도인 T 세포 에피토프의 그에 대한 결합을 비교함으로써, 단백질 서열 중의 대부분의 면역원성 펩타이드는 동정될 수 있다. 검출은 MHC-펩타이드 복합체의 본래 형태가 존재하는지 부재하는지에 기반한다.
각 펩타이드에 대하여 T 세포 에피토프로 알려진 양성 대조군 펩타이드와 비교한 점수가 주어진다. 테스트 펩타이드의 점수는 양성 대조군 펩타이드에 의하여 생성된 시그널의 백분율로서 정량적으로 기록되고, 이 펩타이드는 추정 합격 또는 불합격 결과를 갖는 것으로 나타난다. 시험능은 조사 조건 하에서 상기 대립형질에 대하여 약한 친화도로 결합한다고 알려진 중간 정도의 대조군 펩타이드를 포함시킴으로써 확인된다.
실시예 4: 이량체형 펩타이드의 제조
두 단량체형 펩타이드 서열을 연결하는 아미노산은 밑줄로 나타낸다.
인플루엔자 ( M2e ):
인플루엔자 단백질 M2의 세포외 도메인 (M2e-도메인)으로부터 유래한 컨스트럭트
본래 도메인:
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD
하기 서열들이 제조되었거나 제조중이다. 상이한 부분, X1-X6,은 괄호로 분리된다.
Figure 112013071276988-pct00023
이 컨스트럭트는 단량체형 펩타이드들을, 제1 펩타이드의 Dpr(Aoa)를 통하여 제2 펩타이드의 Dpr(Ser) 잔기 (NaIO4에 의하여 산화됨)로 연결한다.
Dpr(Aoa) = N-α-Fmoc-N-β-(N-t.-Boc-아미노-옥시아세틸)-L-디아미노프로피온산
설명:
서열 내 사용된 괄호는 상이한 부분/박스들을 나타내는 것을 의미한다. BI100_CGnat / BI100_CG에 대하여, 박스들은 하기의 아미노산 서열을 가질 것이다:
Figure 112013071276988-pct00024
다른 서열들의 부분에 대한 박스도 유사한 방식으로 찾아볼 수 있다.
실시예 C5 -서열
Figure 112013071276988-pct00025
이황화결합 연결된 컨스트럭트의 예시는 하기 연결된 펩타이드 서열일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다:
Figure 112013071276988-pct00026
상기 이황화결합 연결된 컨스트럭트는, 예컨대 2-피리딘술페닐(SPyr)-보호된 시스테인 함유 펩타이드를 티올-비보호된 펩타이드로 적정함으로써 합성될 수 있다. 이것이 호모이량체의 형성을 막으면서 이황화결합-연결된 펩타이드 헤테로이량체를 선택적으로 생성시키는 우수한 방법임이 입증되었다 (Schutz A et al., Tetrahedron, Volume 56, Issue 24, 9 June 2000, Pages 3889-3891). SEQ ID NO: 115가 SEQ ID NOs 118 또는 120에 이황화결합 연결, 또는 SEQ ID NO: 117가 SEQ ID NOs: 116 또는 120에 이황화결합 연결, 또는 SEQ ID NO: 119가 SEQ ID NOs: 116 또는 118에 이황화결합 연결되는 유사한 컨스트럭트가 제조될 수 있다.
티오-에스테르 연결된 컨스트럭트의 예시가, 모두 Bachem (UK) Ltd로부터 얻어진 하기 연결된 펩타이드 서열들일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
Figure 112013071276988-pct00027
(펩타이드들은 밑줄 친 Cys 및 Lys 잔기를 통하여 연결된다; 전체 컨스트럭트를 본 명세서에서는 BI400-B로 명명한다).
Figure 112013071276988-pct00028
(펩타이드들은 밑줄 친 Cys 및 Lys 잔기를 통하여 연결된다; 전체 컨스트럭트를 본 명세서에서는 BI400-Bu1로 명명한다).
Figure 112013071276988-pct00029
(펩타이드들은 밑줄 친 Cys 및 Lys 잔기를 통하여 연결된다; 전체 컨스트럭트를 본 명세서에서는 BI400-Bu2로 명명한다).
Figure 112013071276988-pct00030
(펩타이드들은 밑줄 친 Cys 및 Lys 잔기를 통하여 연결된다; 전체 컨스트럭트를 본 명세서에서는 BI400-Bu3로 명명한다).
Cys-Lys 링커는 통상적으로 한 펩타이드의 시스테인과 다른 펩타이드의 브로모아세틸 유도화된 리신 간의 티오에티르 결합의 형태로 이루어진다.
SEQ ID NO: 121가 SEQ ID NOs 126 또는 128에 Cys-Lys 연결된, 또는 SEQ ID NO: 125가 SEQ ID NOs: 122 또는 124에 Cys-Lys 연결된 유사한 컨스트럭트가 제조될 수 있다.
기타 링커로 연결되는 컨스트럭트가 하기 연결된 펩타이드 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
Figure 112013071276988-pct00031
(펩타이드들은 밑줄 친 Ser 및 Lys 잔기를 통하여 연결된다).
Ser-Lys 링커는 통상적으로 한 펩타이드의 산화된 (알데히드) 세린과 다른 펩타이드의 (아미노옥시아세틸화) 유도체화 리신 간의 옥심 결합의 형태로 이루어진다.
실시예 5
HCV 이량체형 펩타이드의 컨스트럭트화:
Figure 112013071276988-pct00032
이 컨스트럭트는 술포-SMCC 링커를 이용, 제1 펩타이드의 리신 잔기를 통하여 제2 펩타이드의 시스테인 잔기로 단량체형 펩타이드들을 연결한다.
Figure 112013071276988-pct00033
이 컨스트럭트는 제1 펩타이드의 Dpr(Aoa)를 통하여 제2 펩타이드의 Dpr(Ser) (NaIO4에 의하여 산화됨) 잔기로 단량체형 펩타이드들을 연결한다.
Dpr(Aoa) = N-α-Fmoc-N-β-(N-t.-Boc-아미노-옥시아세틸)-L-디아미노프로피온산
또는, K 또는 C는 N-ε-메틸화 Lys으로 치환될 수 있고, 이것은 Asp 또는 Glu에 연결된다.
따라서, N-ε-메틸화 Lys은 측쇄-측쇄 펩타이드 결합에 의하여 Asp 또는 Glu에 연결될 수 있고, N 메틸화는 이 결합을 더욱 안정하게 만든다.
상기 서열들은 그 후 하기와 같아질 수 있다 (Lys(Me)는 N-ε-메틸화 Lys 잔기를 말한다):
Figure 112013071276988-pct00034
또는
Figure 112013071276988-pct00035
또는 다르게는, 결합이 역전된다면:
Figure 112013071276988-pct00036
Figure 112013071276988-pct00037
또는
Figure 112013071276988-pct00038

인플루엔자 이량체형 펩타이드의 컨스트럭트화:
Figure 112013071276988-pct00039
Dpr은 디아미노프로피온산이고, Dpr(Ser)은 세린 함유 디아미노프로피온산이다.
(이 출원의 다른 부분에서 설명된 바와 같이 Dpr-Dpr(Ser) 옥심 결합을 형성하기 위하여이다)
테스트에 사용된, 상기 컨스트럭트가 표적하는 인플루엔자 M2e 단백질의 본래 서열 펩타이드는:
BI100-cg2 MSLLTEVETPIRNEWGCRC (SEQ ID NO: 142)
실시예 6
면역학적 연구
래빗 면역화
뉴질랜드 화이트 래빗 암컷 (n=3)을 제0, 2 및 6주에 50% V/V Freund 아쥬반트 (즉, 완전 Freund 아쥬반트를 프라이밍용으로 사용한 후, 불완전 Freund 아쥬반트로 부스팅) 중에 500 μg의 BI400-B로 이루어진 BI400-B 항체 1 ml로 피내 면역화하였다. 각각의 혈액 혈청을 ELISA 용으로 분리하였다.
인간 또는 래빗 혈청에 대한 직접 ELISA
4℃에서 밤새 50~100 μl의 BI400-B (코팅 완충액 - 0.05M Na2CO3 pH9.6에서 미리 인큐베이션; CB로 표시 - 코팅 전 1~3일에 각 펩타이드에 대하여 16 μg/ml로 냉각시킴) 또는 CB (백그라운드 대조군)만을 마이크로타이터 플레이트의 웰을 코팅하는 데 사용한다. 그 후 마이크로타이터 플레이트를 수세 완충액 (PBS + 1% v/v 트리톤-X100; WB로 표시)으로 3회 수세한 후, 200 μl/웰의 블로킹 완충액 (PBS + 1% w/v BSA)으로 실온 (RT)에서 2 시간 블로킹한다. 그 후, 플레이트를 WB로 3회 수세한 후, 50~70 μl/웰의 인간 (또는 래빗) 혈청 (희석 완충액 (PBS + 1% v/v 트리톤-X100 + 1% w/v BSA; DB로 표시)으로 1:1 ~ 1:250로 순차 희석)을 첨가하여 37℃에서 1 시간 반응시킨다. 그 후 플레이트를 WB로 6회 수세한 후, 70 μl/웰의 알칼리 포스파타아제-컨쥬케이티드 단백질 G (DB 중 3 μg/ml ; Calbiochem 539305)과 함께 실온에서 1 시간 반응시킨다. 그 후, 플레이트를 WB로 6회 수세한 후, 100 μl/웰의 0.3% w/v 페놀프탈레인 모노포스페이트 (Sigma P-5758)로 실온에서 10~60 분간 반응시킨다. 100 μl/웰의 퀀치 용액 (0.1M TRIS + 0.1M EDTA + 0.5M NaOH + 0.01% w/v NaN3; pH14)을 첨가하여 플레이트를 최종 소광시킨 후, 550 nm에서 ELISA 리더 (ASYS UVM 340)로 측정한다.
결과
BI400-B를 이용한 상기 면역화 연구의 결과는 효과적인 항체 반응을 이끌어내는 펩타이드의 제조가 가능하다는 것을 입증한다. 이들 항체 반응의 특이성은 경쟁적 ELISA로 확인될 수 있다. 동물 모델에서 BI400-B에 대하여 생성된 항체들은 천연 HIV 감염으로 나타나지는 항체와 비견할만 하고 장기간 미진행과 연관이 있다. 이들 결과는 이들 펩타이드들이 진단 뿐 아니라 HIV 및 다른 병원체에 의한 유도 면역 활성화를 표적화하는 백신의 개발에도 적합함을 보여준다.
실시예 7
ELISPOT 시험에 의한 인플루엔자 특이적 M2e 반응
제1일에, 혈액 공여자의 PBMC 시료를 따뜻한 배지로 해동, 수세하고, 해동 후 세포가 회복할 수 있도록 배양 배지 (RPMI 1640, 울트라-글루타민 포함, Lonza, BE12-702F701; 10% 피탈 보바인 세럼 (FBS), Fisher Scientific Cat. No. A15-101; 페니실린/스트렙토마이신, Fisher Scientific Cat. No. P11-010)를 커버하는 양으로 5% CO2의 플라스크에서 37℃로 24 시간 배양하였다 (250000PBMCs/cm2). 제2일에, 세포를 96웰 편평 바닥의 Falcon Microtest Tissue Culture 플레이트에, 총 200 μl 부피의 배지 내 웰당 500000 세포로 첨가하였다. 자극 표시된 2 세트 또는 대조군으로 배지만을 넣은 동일한 조건 (parallel)의 웰을 첨가하여 5% CO2., 37℃에서 6일간 배양하였다. 배양 6일 후, 100 μl의 세포 현탁액을 1 μg/ml의 본래 인플루엔자 M2e 단백질로 코팅된 ELISPOT (Millipore multiscreen HTS) 플레이트로 옮겼다. 24 시간 배양 후, 플레이트를 PBS + 0,05% 트윈20으로 4회 수세하고 PBS, 200μl/웰로 5회 수세하였다. 마우스 항-인간 IgH 또는 IgM 비오틴 (Southern Biotech 9040-08 및 9020-08)을 0.5% FBS를 함유한 PBS에서 희석하여 37℃에서 90 분간 인큐베이션 하였다. 각 웰에 80 μl의 스트렙타비딘-알칼리-포스파타아제 (Sigma Aldrich, S289)를 첨가하기 전에 전술한 바와 같이 수세를 반복하고, 실온의 암실에서 60 분간 반응시켰다. 그 후 세포를 기질, Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate kit III (Vector Blue, SK-5300 )를 첨가하기 전에 PBS + 0.05% 트윈20으로 2회 수세 및 PBS, 200 μl/웰로 4회 수세하고, 실온에서 7 분간 현상되도록 두었다. 흐르는 물로 반응을 종결시키고, 플레이트를 건조하게 둔 후 ELISPOT 리더 (CTL-ImmunoSpot® S5 UV Analyzer)로 스폿을 계수하였다.
ELISA 에 의한 인플루엔자 특이적 M2e 반응
4℃에서 100 μl의 표시된 항원 (코팅 완충액 - 0.05M Na2CO3 pH9.6에서 미리 인큐베이션; CB로 표시 - 1~3일에 8 μg/ml로 냉각시킴) 또는 단순 CB (백그라운드 대조군)를 마이크로타이터 플레이트의 웰을 코팅하는 데 사용한다. 그 후 마이크로타이터 플레이트를 수세 완충액 (PBS + 1% v/v 트리톤-X100; WB로 표시)으로 3회 수세한 후, 200 μl/웰의 블로킹 완충액 (PBS + 1% w/v BSA)으로 실온 (RT)에서 2 시간 블로킹한다. 그 후, 플레이트를 WB로 3회 수세한 후, 50~70 μl/웰의 인간 (또는 래빗 또는 쉽 (sheep)) 혈청 (희석 완충액 (PBS + 1% v/v 트리톤-X100 + 1% w/v BSA; DB로 표시)으로 1:5 ~ 1:250로 순차 희석)을 첨가하여 37℃에서 1 시간 반응시킨다. 그 후 플레이트를 WB로 6회 수세한 후, 70 μl/웰의 알칼리 포스파타아제-컨쥬케이티드 단백질 G (DB 중 3 μg/ml ; Calbiochem 539305) 또는 고트 항-마우스 IgG 비오틴 (1 μg/ml, Southern Biotech, 1030-08)과 함께 실온에서 1 시간 반응시킨다. 고트 항-마우스 IgG 비오틴의 경우 100 μl의 스트렙타비딘-알칼리-포스파타아제 (1 μg/ml, Sigma Aldrich, S289)를 첨가하기 전에 추가로 플레이트를 1회 수세하여 실온에서 1 시간 반응시킨다. 그 후, 플레이트를 WB로 6회 수세한 후, 100 μl/웰의 0.3% w/v 페놀프탈레인 모노포스페이트 (Sigma P-5758)로 실온에서 10~60 분간 반응시킨다. 100 μl/웰의 퀀치 용액 (0.1M TRIS + 0.1M EDTA + 0.5M NaOH + 0.01% w/v NaN3; pH14)을 첨가하여 플레이트를 최종 소광시킨 후, 550 nm에서 ELISA 리더 (ASYS UVM 340)로 측정한다. 그 후, 혈청의 세기, 즉 체액성 면역 반응의 크기는, 설명된 광학 밀도 (OD) 값으로 결과되는 혈청의 희석, 또는 표시된 혈청 희석시의 OD 값으로서 보고된다.
결과
표 2에는 비자극된 PBMC의 베이스라인 증식과 비교하여 증식된 B-세포의 비교 수량이 나타나 있다. 이 표는 반응이 IgG 특이적인 것이기 때문에 BI150-2mod가 인간의 기억 세포에 의하여 인식되었음을 명백히 보여주며, 이것은 BI150-2mod가, 생산된 항체로 하여금 BI150-2mod가 유래된 본래 서열에 결합할 수 있도록 하는 방식으로 클래스-스위치된 B 세포를 자극할 수 있다는 것을 의미하는 것이다. 인플루엔자 M2 단백질에 대하여 기 존재하는 인간 집단의 체액성 기억에 있어서 그 편차가 클 것이기 때문에 개개인 공여자 간의 큰 편차가 예상된다. 표 2로부터, BI150-2mod는 IgM B 세포의 증식을 유도할 수도 있다는 것 역시 알 수 있다.
표 2. 본래 서열에 대한, BI150-2mod로 자극된 인간 PBMC의 B 세포 반응
Figure 112013071276988-pct00040
BALB/c 마우스의 백신접종은 제1, 3, 7주에 100 μg 펩타이드를 이용, 피하로 (s.c.), 제9주에 1 mg 알루미늄을 함유하여 1.3% 알하이드로겔 형태로 혈청으로 이루어졌다. 표 3에서, 그 결과는 상기 백신 항원이 인식되었으므로 BI350-1mod1이 BALB/c 마우스에서 특이적인 면역 반응을 유도했음을 보여준다. 또한, 이 결과적인 면역 반응은 상기 면역 반응이 IgG 특이적인 것이기 때문에 클래스 스위칭 사건이 일어난 결과로서 비롯된 것임이 명백하다.
표 3. 백신 항원에 대한, 마우스에서의 BI350-1mod1 + 알하이드로겔 백신접종의 혈청 IgG 반응 (OD)
Figure 112013071276988-pct00041
쉽에 대한 백신접종은 하기의 아쥬반트와 함께 PBS 중의 500 μg 펩타이드를 이용하여 이루어졌다: ISA51 (제1, 2, 3, 4주에 백신접종, 제6주의 혈청) 및 Freunds 아쥬반트 (제1, 12, 26주에 백신접종, 제28주의 혈청). 표 4에서, 상기 결과는 시험 백그라운드 3배인 OD 값에 해당하는 혈청의 희석을 보여준다. 상기 표는 두 가지 상이한 표준 아쥬반트와 함께 BI100-CG 및 BI100-CGcyc가 스스로 면역 반응을 유도하였음을 명백히 보여준다. 이것은 상기 컨스트럭트가 여러가지 아쥬반트와 조합되어 IgG 반응, 쉽에서 면역적 기억이 이끌어졌다는 신호를 유도할 수 있음을 나타낸다.
표 4. BI100-cg2 항원에 대한, BI100 컨스트럭트로 백신접종된 쉽에서의 백그라운드 3배의 혈청 희석 IgG 반응
Figure 112013071276988-pct00042
SEQUENCE LISTING <110> Bionor Immuno AS <120> Multimeric peptide <130> 18302PCT00 <160> 156 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 97 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ala Ile Ala Ala Asn Ile 20 25 30 Ile Gly Ile Leu His Leu Thr Leu Trp Ile Leu Asp Arg Leu Phe Phe 35 40 45 Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Lys Gly Gly Pro Ser 50 55 60 Thr Glu Gly Val Pro Lys Ser Met Arg Glu Glu Tyr Arg Lys Glu Gln 65 70 75 80 Gln Ser Ala Val Asp Ala Asp Asp Gly His Phe Val Ser Ile Glu Leu 85 90 95 Glu <210> 2 <211> 86 <212> PRT <213> HIV <400> 2 Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 1 5 10 15 Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe 20 25 30 His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly 35 40 45 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr 50 55 60 His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Pro Arg Gly Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Pro Lys Glu 85 <210> 3 <211> 511 <212> PRT <213> HIV <400> 3 Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg 1 5 10 15 Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu 20 25 30 Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala 35 40 45 Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu 50 55 60 Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn 65 70 75 80 Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp 85 90 95 Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp 100 105 110 Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser 115 120 125 Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser 130 135 140 Gly Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn 145 150 155 160 Ile Ser Thr Ser Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe 165 170 175 Tyr Lys Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Lys 180 185 190 Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val 195 200 205 Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala 210 215 220 Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr 225 230 235 240 Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser 245 250 255 Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile 260 265 270 Arg Ser Val Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu 275 280 285 Asn Thr Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg 290 295 300 Lys Arg Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile 305 310 315 320 Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala 325 330 335 Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gln Ile Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gln 340 345 350 Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp 355 360 365 Pro Glu Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr 370 375 380 Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp 385 390 395 400 Ser Thr Glu Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu 405 410 415 Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Lys 420 425 430 Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn 435 440 445 Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Ser Asn Asn Glu 450 455 460 Ser Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg 465 470 475 480 Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val 485 490 495 Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg 500 505 510 <210> 4 <211> 345 <212> PRT <213> HIV <400> 4 Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln 20 25 30 Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile 35 40 45 Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln 50 55 60 Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln 65 70 75 80 Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala 85 90 95 Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp 100 105 110 Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr 115 120 125 Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys 130 135 140 Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn 145 150 155 160 Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met 165 170 175 Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser 180 185 190 Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr 195 200 205 His Leu Pro Thr Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu 210 215 220 Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ile Arg Leu Val Asn Gly 225 230 235 240 Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser 245 250 255 Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg Ile Val Glu 260 265 270 Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu 275 280 285 Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu 290 295 300 Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu 305 310 315 320 Val Val Gln Gly Ala Cys Arg Ala Ile Arg His Ile Pro Arg Arg Ile 325 330 335 Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu 340 345 <210> 5 <211> 192 <212> PRT <213> HCV <400> 5 Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Gly Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr 20 25 30 Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp 35 40 45 Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Arg Ser Ile Pro Thr 50 55 60 Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe 65 70 75 80 Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val 85 90 95 Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg Tyr Glu Thr Val Gln Asp 100 105 110 Cys Asn Cys Ser Leu Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met Ala 115 120 125 Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ser 130 135 140 Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val 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Glu Ala Ala Asp Ala Ile Leu His Thr Pro 210 215 220 Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Val 225 230 235 240 Ala Val Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Thr Thr 245 250 255 Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys 260 265 270 Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Gly 275 280 285 Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Asp Cys 290 295 300 Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp 305 310 315 320 Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val Ala Gln 325 330 335 Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Met Asp Met Ile Ala Gly Ala His 340 345 350 Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met Val Gly Asn Trp 355 360 365 Ala Lys Val Leu Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu 370 375 380 Thr His Val Thr Gly Gly Ser Ala Gly Arg Thr Thr Ala Gly Leu Val 385 390 395 400 Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr 405 410 415 Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Ser Thr Ala Leu Asn Cys Asn Glu Ser 420 425 430 Leu Asn Thr Gly Trp Leu Ala Gly Leu Phe Tyr Gln His Lys Phe Asn 435 440 445 Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Arg Leu Thr Asp 450 455 460 Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser Gly Leu 465 470 475 480 Asp Glu Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro Pro Arg Pro Cys Gly Ile 485 490 495 Val Pro Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser 500 505 510 Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr Tyr Ser 515 520 525 Trp Gly Ala Asn Asp Thr Asp Val Phe Val Leu Asn Asn Thr Arg Pro 530 535 540 Pro Leu Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe 545 550 555 560 Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Asn 565 570 575 Asn Thr Leu Leu Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala 580 585 590 Thr Tyr Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Met 595 600 605 Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile Asn Tyr 610 615 620 Thr Ile Phe Lys Val Arg Met 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Ser Trp Cys Met Trp Trp Leu Gln Tyr 835 840 845 Phe Leu Thr Arg Val Glu Ala Gln Leu His Val Trp Val Pro Pro Leu 850 855 860 Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Val Ile Leu Leu Met Cys Val Val 865 870 875 880 His Pro Thr Leu Val Phe Asp Ile Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Phe 885 890 895 Gly Pro Leu Trp Ile Leu Gln Ala Ser Leu Leu Lys Val Pro Tyr Phe 900 905 910 Val Arg Val Gln Gly Leu Leu Arg Ile Cys Ala Leu Ala Arg Lys Ile 915 920 925 Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Ile Ile Lys Leu Gly Ala Leu 930 935 940 Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp Ala 945 950 955 960 His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Val Phe 965 970 975 Ser Arg Met Glu Thr Lys Leu Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala 980 985 990 Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Gln 995 1000 1005 Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys Gly Trp 1010 1015 1020 Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly 1025 1030 1035 Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser 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Gln 1 5 <210> 115 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 115 Cys Gly Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Ala Lys Arg Arg Val 1 5 10 15 Val Gly Gln Arg Glu Lys Arg Ala Val 20 25 <210> 116 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 116 Cys Gly Gly Gly Asp Gln Gln Leu Leu Gly Gly Ala Glu Glu Glu Ile 1 5 10 15 Val Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg 20 25 30 <210> 117 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 117 Cys Gly Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Ala Lys Arg Arg Val 1 5 10 15 Val Gly Gly Gln Arg Glu Lys Arg 20 <210> 118 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 118 Cys Gly Gly Gly Asp Gln Gln Leu Leu Gly Gly Ala Glu Glu Glu Ile 1 5 10 15 Val Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly 20 25 <210> 119 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 119 Cys Gly Gly Ala Glu Glu Glu Val Val Gly Gly Asp Gln Gln Leu Leu 1 5 10 15 <210> 120 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 120 Gly Cys Gly Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Val <210> 121 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 121 Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Cys Gly Gly Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Gly Glu Arg Glu Lys Arg Ala 20 25 30 <210> 122 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 122 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Arg Asp Arg Asp Arg Gly 1 5 10 15 Gly Glu Gln Asp Arg Asp Arg 20 <210> 123 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 123 Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Cys Gly Gly Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Gly Glu Arg Glu Lys Arg Ala 20 25 30 <210> 124 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 124 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg 1 5 10 15 Gly Gly Gln Asp Arg Asp Arg 20 <210> 125 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 125 Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Cys Gly Gly Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Val Glu Arg Glu Lys Arg Ala Gly Gln Arg Glu Lys Arg Ala 20 25 30 <210> 126 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 126 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Gln Asp Arg Asp Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Asp Arg Asp Arg 20 <210> 127 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 127 Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Cys Gly Gly Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Val Glu Arg Glu Lys Arg Ala Gly Gln Arg Glu Lys Arg Ala 20 25 30 <210> 128 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 128 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Gln Asp Arg Asp Arg 1 5 10 15 Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp 20 <210> 129 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 129 Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Gly Glu Arg Glu Lys Arg Ala 20 25 30 <210> 130 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 130 Arg Arg Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Lys Asn Trp Ala Lys Val Ile 1 5 10 15 <210> 131 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 131 Arg Arg Gly Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Gly Cys Gly Ser Gly Ala 1 5 10 15 Asp Arg Val Cys Ser 20 <210> 132 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X at position 10 is Dpr <400> 132 Arg Arg Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Xaa Asn Trp Ala Lys Val Ile 1 5 10 15 <210> 133 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X in position 12 is Dpr(Ser) <400> 133 Arg Arg Gly Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Gly Xaa Gly Ser Gly Ala 1 5 10 15 Asp Arg Val Cys Ser 20 <210> 134 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequenc <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X in position 10 is an N-epsilon-methylated Lys residue <400> 134 Arg Arg Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Xaa Asn Trp Ala Lys Val Ile 1 5 10 15 <210> 135 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 135 Arg Arg Gly Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Gly Glu Gly Ser Gly Ala 1 5 10 15 Asp Arg Val Cys Ser 20 <210> 136 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 136 Arg Arg Gly Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Gly Asp Gly Ser Gly Ala 1 5 10 15 Asp Arg Val Cys Ser 20 <210> 137 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 137 Arg Arg Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Glu Asn Trp Ala Lys Val Ile 1 5 10 15 <210> 138 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X in position 12 is N-epsilon-methylated Lys residue <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 138 Arg Arg Gly Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Gly Lys Xaa Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ala Asp Arg Val Cys Ser 20 <210> 139 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 139 Arg Arg Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Asp Asn Trp Ala Lys Val Ile 1 5 10 15 <210> 140 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X in position 11 is Dpr <400> 140 Arg Ser Leu Glx Thr Asp Ile Glu Thr Pro Xaa Ile Asp Thr Pro Ile 1 5 10 15 Arg Gly Thr Pro Ile Asx Gln Asp Trp Gly 20 25 <210> 141 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X in position 14 is Har <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X in position 18 is Dpr(ser) <400> 141 Arg Arg Ile Asp Thr Pro Ile Arg Gly Gly Thr Pro Ile Xaa Gln Glu 1 5 10 15 Trp Xaa Ser Leu Glx Thr Asp Ile Glu Thr Pro Gly 20 25 <210> 142 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 142 Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly 1 5 10 15 Cys Arg Cys <210> 143 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 143 Gly Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Gly Glu 1 5 10 15 Arg Glu Lys Arg Ala 20 <210> 144 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 144 Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Arg Asp Arg Asp Arg Gly Gly Glu 1 5 10 15 Gln Asp Arg Asp Arg 20 <210> 145 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 145 Gly Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Gly Glu 1 5 10 15 Arg Glu Lys Arg Ala Gly Gly 20 <210> 146 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 146 Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Arg Asp Arg Asp Arg Gly Gly Glu 1 5 10 15 Gln Asp Arg Asp Arg Gly Gly 20 <210> 147 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 147 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Arg Asp Arg Asp Arg Gly 1 5 10 15 Gly Gln Asp Arg Asp Arg 20 <210> 148 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 148 Gly Lys Gly Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Arg Asp Arg Asp Arg Gly 1 5 10 15 Gly Gln Asp Arg Asp Arg 20 <210> 149 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X in position 10 is Dpr(Ser) <400> 149 Gly Ala Lys Arg Arg Val Val Gly Gly Xaa Gly Gly Ala Lys Arg Arg 1 5 10 15 Val Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Gly Glu Arg Glu Lys Arg Ala 20 25 30 <210> 150 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X in position 3 is Dpr(Ser) <400> 150 Gly Gly Xaa Gly Gly 1 5 <210> 151 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X in position 4 is Har <400> 151 Thr Pro Ile Xaa Gln Glu Trp 1 5 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 152 Glu Gln Asp Arg Asp Arg Gly Gly 1 5 <210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 153 Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu 1 5 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 154 Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val 1 5 <210> 155 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 155 Asn Trp Ala Lys Val Ile 1 5 <210> 156 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide sequence <400> 156 Ser Gly Ala Asp Arg Val 1 5

Claims (47)

  1. 하기 구조:
    Figure 112018053904611-pct00043

    를 갖는, 단량체형 펩타이드들을 포함하는 이량체형 펩타이드로서,
    상기 단량체형 펩타이드들은 SEQ ID NO: 121의 C(-2-옥소-에틸)10과 SEQ ID NO: 147의 K2 간의 티오에테르 결합을 통해 상호 연결된 것인 이량체형 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단량체형 펩타이드들의 N-말단 또는 C-말단은 아미드화 또는 아세틸화에 의해 변형된 것인 이량체형 펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단량체형 펩타이드들의 C-말단은 아미드인 것인 이량체형 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 트리플루오로아세테이트염의 형태인 것인 이량체형 펩타이드.
  5. 하기 구조들을 갖는 보호된 펩타이드 단량체들의 반응에 의해 제조된 이량체형 펩타이드
    Figure 112018053904611-pct00044
  6. 하기 구조들을 갖는 보호된 펩타이드 단량체들을 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 이량체형 펩타이드의 제조방법.
    Figure 112018053904611-pct00045
  7. 삭제
  8. 제1항에 따른 이량체형 펩타이드를 약학적으로 허용 가능한 희석제 또는 운반체 및 면역성 아쥬반트와 조합하여 포함하는 면역원성 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 대상자에서 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 사용되는 것인 이량체형 펩타이드.
  10. 삭제
  11. 삭제
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