KR101859223B1 - 고병원성 인플루엔자 바이러스 검출용 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고병원성 바이러스 검출용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 포함하는 고병원성 바이러스 검출용 마커, 상기 단백질 변이체를 측정하는 제제를 포함하는 고병원성 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 검출 키트, 상기 단백질 변이체를 측정하는 단계를 포함하는 고병원성 바이러스의 검출방법, 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 PB1-F2 단백질과 DDX3의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물, 및 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 1918 PB1-F2 단백질과 상기 바이러스의 고병원성 간의 상관관계 및 이의 분자기전을 최초로 규명하였는바, 인플루엔자 바이러스의 PB1-F2 단백질 서열에서 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체는 고병원성 바이러스를 검출하기 위한 마커로 이용 가능하며, 상기 변이체를 측정함으로써 고병원성의 바이러스를 유용하게 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서 새롭게 규명한 PB1-F2 단백질 변이체에 의한 바이러스의 선천면역반응 회피 기전은 항바이러스 제제 개발을 위한 새로운 이해를 제공할 것이며, 본 발명에 따른 항바이러스용 조성물은 항바이러스 치료제제 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명에서 새롭게 규명한 PB1-F2 단백질 변이체에 의한 바이러스의 선천면역반응 회피 기전은 항바이러스 제제 개발을 위한 새로운 이해를 제공할 것이며, 본 발명에 따른 항바이러스용 조성물은 항바이러스 치료제제 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 고병원성 인플루엔자 바이러스 검출용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 포함하는 고병원성 바이러스 검출용 마커, 상기 단백질 변이체를 측정하는 제제를 포함하는 고병원성 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 검출 키트, 상기 단백질 변이체를 측정하는 단계를 포함하는 고병원성 바이러스의 검출방법, 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 PB1-F2 단백질과 DDX3의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물, 및 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus; IAV)는 인간 및 동물 모두를 감염시킬 수 있는 병원균으로써 1918년에 5000만 명의 희생자를 낸 스페인 독감을 유발한 바이러스이다. PB1-F2는 +1 open reading frame으로부터 PB1 유전자 부위에 의해 암호화된 인플루엔자 바이러스의 비구조 단백질이다. 현재까지 다양한 연구를 통해 PB1-F2 단백질은 세포사멸(apoptosis) 유도 및 선천면역반응 억제를 포함한 다양한 기능을 가짐이 보고되었으며, 매우 고병원성의 인플루엔자 바이러스에서 병원성과 관련된 바이러스성을 나타내는 중요한 인자로 알려져 있다. 상기 단백질은 사이토카인 생성을 억제하고 이차적 박테리아 감염의 면역병리학을 증가시키며, 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스의 감염 동안 바이러스 소멸(viral clearance)을 지연시킴으로써 발병에 기여한다고 보고되어왔다.
인플루엔자 바이러스 감염에 대한 첫 번째 방어기작 중에서, 제1형 인터페론(type I IFN)은 숙주의 항바이러스 면역반응의 중요한 인자이며, 적응면역반응의 조절자이다. 숙주가 인플루엔자와 같은 바이러스 또는 다른 병원균에 감염되면, 선천 면역반응을 유도하는 PRRs(pattern-recognition receptors)로 알려진 3가지 주요 단백질이 병원균의 PAMPs(pathogen-associated molecular pattern)를 인식한다. 이러한 PRR은 TLR(Toll-like receptors), RLRs(retinoic acid inducible gene-I(RIG-I)-like receptors), 및 NLRs(nucleotide-binding domain-leucine-rich repeat-containing molecules)이며, 인플루엔자 바이러스에 감염되면 RIG-I가 바이러스 RNA의 주요 센서로 작용하여 type I IFN 생성을 유도한다. 이러한 경로에서 DDX3(DEAD box protein 3)와 다른 인산화효소와의 복합체 형성은 type I IFN 생성 유도에 필수적인 것으로 알려져 있다.
비록 IFN 시스템이 강한 항바이러스 활성을 갖는다 하더라도, 인플루엔자 바이러스 역시 숙주 내에서 그들의 복제 및 증식을 위해 IFN 반응을 약화시킬 수 있도록 진화되어 왔다. 예컨대, H5N1 조류 인플루엔자 바이러스와 같은 고병원성 바이러스의 NS1 단백질은 type I IFN에 대한 강한 억제효과를 가지며, 또한 Ifnar1-/- 마우스에서 급격한 중성구 모집, 심각한 폐 손상 및 급격한 염증성 사이토카인 분비를 유도하는 것이 보고되었다(Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:10736?10741).
본 발명에서는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 발병기전에서 고병원성 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질의 영향을 알아보기 위해 바이러스의 병독성과 PB1-F2 단백질의 간의 상관관계를 조사하고 type I IFN 반응 억제와 관련한 분자적 기전을 규명하고자 하였다.
본 발명자들은 고병원성을 나타내는 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인에서 PB1-F2 단백질이 병독성에 미치는 영향 및 상관관계를 조사한 결과, 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질 서열상의 68번째 및 69번째 아미노산이 상기 바이러스의 낮은 안정성을 매개하고, 세포 내 DDX3와의 결합을 통해 항바이러스 반응을 유도하는 IFNβ의 발현을 억제하여 바이러스의 병독성을 증가시키는 것을 확인함으로써 1918 PB1-F2 단백질과 상기 바이러스의 고병원성 간의 상관관계 및 이의 분자기전을 최초로 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 변이체를 측정하는 제제를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 고병원성 바이러스 검출 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 변이체를 측정하는 단계를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 DDX3(DEAD box protein 3)와 PB1-F2 단백질의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 측정하는 제제를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 검출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 측정하는 단계를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 단백질 변이체는 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌(Threonine) 및 프롤린(proline)으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 변이체를 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 DDX3(DEAD box protein 3)와 PB1-F2 단백질의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하며,
상기 PB1-F2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 DDX3는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 결합 억제제는 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer), 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 PB1-F2 단백질은 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌(Threonine) 및 프롤린(proline)으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 PB1-F2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 세포 내 인터페론 베타(IFNβ)의 생성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) In vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 DDX3(DEAD box protein 3)와 PB1-F2 단백질의 결합을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 DDX3와 PB1-F2 단백질의 결합을 감소시키는 물질을 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 물질의 스크리닝 방법을 제공하며,
상기 PB1-F2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
본 발명의 일구현예로, 상기 후보물질은 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer), 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 핵산은 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계는 웨스턴 블롯팅(western blotting), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법을 이용하여 측정하는 것일 수 있다.
본 발명자들은 인플루엔자 A 바이러스 감염의 발병기전에서 고병원성의 1918 스트레인과 낮은 병원성을 나타내는 PR8 스트레인을 이용하여 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질 서열상의 68번째 및 69번째 아미노산이 상기 바이러스의 낮은 안정성을 매개하고, 세포 내 DDX3와의 결합을 통해 항바이러스 반응을 유도하는 IFNβ의 발현을 억제함으로써 바이러스의 병독성을 증가시키는 것을 규명하였는바, 인플루엔자 바이러스의 PB1-F2 단백질 서열에서 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체는 고병원성 바이러스를 검출하기 위한 마커로 이용 가능하며, 상기 변이체를 측정함으로써 고병원성의 바이러스를 유용하게 검출할 수 있다.
또한, 본 발명에서 새롭게 규명한 PB1-F2 단백질 변이체에 의한 바이러스의 선천면역반응 회피 기전은 항바이러스 제제 개발을 위한 새로운 이해를 제공할 것이며, 본 발명에 따른 항바이러스용 조성물은 항바이러스 치료제제 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 A549 및 U937 세포에 PR8 스트레인(PR8), PR8 스트레인에서 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질로 아미노산 서열을 변화시킨 바이러스(PR8-PB1-F2(1918)) 및 PB1-F2 단백질을 결손시킨 PR8 스트레인(이하, PR8-PB1-F2(-))을 각각 MOI 1 또는 5로 24시간 동안 감염시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 PB1-F2 단백질의 발현수준을 측정하여 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질(이하, 1918 PB1-F2)의 낮은 안정성을 확인한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 1918 PB1-F2 단백질이 프로테아좀 의존적 경로에 의해 분해됨을 확인한 결과로서, 도 2a는 A549 세포에 각각 Flag-tagged PR8 또는 1918 PB1-F2 발현 플라스미드를 트랜스펙션하고, 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 후 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 PB1-F2 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이고, 도 2b는 유비퀴틴화 분석을 통해 PB1-F2 단백질이 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 분해됨을 확인한 결과이다.
도 3a 내지 도 3d는 1918 PB1-F2 단백질 안정성의 분자적 결정인자를 규명한 결과로서, 도 3a는 PR8 및 1918 PB1-F2의 다양한 변이 플라스미드를 도시한 것이고, 도 3b는 A549 세포에 PB1-F2 키메라 변이체인 PR8-N+1918-C 및 1918-N+PR8-C를 각각 트랜스펙션한 후 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 PB1-F2 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이고, 도 3c는 PR8 PB1-F2 서열의 일부 아미노산을 1918 PB1-F2로 치환하여 제작한 c-말단 점 돌연변이체 발현 플라스미드를 세포에 트랜스펙션 한 후 도 3b와 동일한 방법으로 PB1-F2 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이며, 도 3d는 PR8 및 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질 골격에 68 및 69번째 아미노산을 서로 대체하여 클로닝한 후 각각의 플라스미드를 세포에 트랜스펙션하고 도 3b와 동일한 방법으로 PB1-F2 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이다.
도 4a 내지 도 4d는 1918 PB1-F2 단백질에 의해 IFNβ 유도가 억제됨을 확인한 결과로서, 도 4a는 PR8 및 1918 PB1-F2 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 세포에서 NF-κB 루시퍼레이즈 활성 및 pro-inflammatory 사이토카인(IL6, IL1β, 및 IL32)의 mRNA 발현수준을 측정한 결과이고, 도 4b는 PR8 및 1918 PB1-F2 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 A549 및 U937 세포에서 semi-quantitative PCR 및 real-time PCR을 통해 IFNβ mRNA의 발현수준을 측정한 결과이고, 도 4c는 U937 세포에서 루시퍼레이즈 리포터 분석을 통해 IFNβ의 프로모터 활성을 측정한 결과이며, 도 4d는 A549 및 U937 세포에 PR8 및 1918 스트레인의 인플루엔자 A 바이러스를 MOI 1로 감염시킨 후 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 세포 내 IFNβ mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 1918 PB1-F2 단백질의 프로테아좀 의존적 분해와 type I IFN 유도 억제의 상관관계를 규명한 결과로서, 도 5a는 PR8 및 1918 PB1-F2 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 A549 및 U937 세포에서 semi-quantitative RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 프로테아좀 억제제인 MG132 처리 유무에 따른 IFNβ mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이고, 도 5b는 PR8 PB1-F2 서열의 68 및 69번째 아미노산을 1918 PB1-F2의 것으로 치환하여 제작한 돌연변이체 발현 플라스미드를 세포에 트랜스펙션 한 후 semi-quantitative RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 IFNβ mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이다.
도 6a 내지 도 6f는 1918 PB1-F2의 68 및 69번째 아미노산이 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 병원성에 미치는 영향을 규명한 결과로서, 도 6a 및 도 6b는 마우스에 PR8 및 1918 스트레인의 인플루엔자 바이러스를 각각 5X102 PFU 및 1X103 PFU로 비강투여한 후 14일 동안 마우스의 체중변화 및 생존율을 측정한 결과이고, 도 6c는 PR8 PB1-F2 단백질의 68 및 69번째 아미노산을 1918 PB1-F2의 것으로 치환한 변이 인플루엔자 바이러스를 마우스에 감염시킨 후 체중 및 생존율을 측정한 결과이며, 도 6d 내지 도 6f는 도 6c와 동일한 변이 인플루엔자 바이러스를 다양한 용량(6x102, 8x102, 및 1x103 PFU)으로 감염시킨 후 체중 및 생존율을 측정한 결과이다.
도 7a 내지 도 7d는 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델에서 1918 PB1-F2에 의한 IFNβ 유도 억제를 확인한 결과로서, 도 7a는 PR8, 1918, 및 PB1-F2 결손 1918(PB1-F2(-)) 바이러스를 5X102 PFU로 마우스에 감염시키고 2일 후 웨스턴 블롯을 통해 마우스 폐 조직에서 바이러스 단백질인 PB1-F2, NP(neucleoprotein), 및 HA(hemagglutinin)의 발현수준을 측정한 결과이고, 도 7b는 도 7a의 각 그룹 마우스의 폐 조직 분쇄액을 이용한 plaque assay를 통해 상기 각 인플루엔자 A 바이러스의 역가를 측정한 결과이고, 도 7c는 도 7a의 각 그룹 마우스의 폐 조직을 이용해 RT-PCR을 실시하여 IFNβ mRNA의 발현수준을 측정한 결과이며, 도 7d는 ELISA를 통해 도 7a의 각 그룹 마우스의 폐에서 분비된 IFNβ 단백질 수준을 측정한 결과이다.
도 8a 내지 도 8f는 1918 PB1-F2와 DDX3의 결합을 통한 IFNβ 유도 억제 기전을 규명한 결과로서, 도 8a는 1918 PB1-F2와 상호작용하는 것으로 도출된 단백질 중 바이러스 감염에 관련된 기능을 갖는 단백질들을 도시한 것이고, 도 8b는 A549 세포에 DDX3 발현 플라스미드(HA-tagged DDX3) 및, PR8 또는 1918의 PB1-F2 발현 플라스미드(Flag-tagged PB1-F2)를 트랜스펙션한 후 IP를 실시하거나, PR8 PB1-F2의 68 및 69번째 아미노산을 1918 PB1-F2의 것으로 치환시켜 제작한 변이체(I68T, L69P, 및 I68T/L69P) 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 후 MG132 처리 조건에서 1918의 PB1-F2와 DDX3 단백질의 결합을 확인한 결과이고, 도 8c는 A549 세포를 각각 PR8, 1918, 및 PR8-PB1-F2(-) 바이러스로 감염시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 DDX3 단백질의 발현수준을 측정한 결과이고, 도 8d는 마우스에 상기 각 인플루엔자 A 바이러스를 감염시킨 후 폐 조직에서 DDX3 단백질의 발현수준을 측정한 결과이고, 도 8e는 1918 PB1-F2에 의한 IRF3의 핵 내로의 이동 여부를 측정한 결과이며, 도 8f는 A549 세포에 PR8 및 1918의 PB1-F2 발현 플라스미드 및 DDX3 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 후 IFNβ mRNA 발현 변화를 분석한 결과이다.
도 9a 내지 도 9d는 in vivo 모델에서 재조합 DDX3 처리에 의한 1918 PB1-F2 인플루엔자 바이러스의 병원성 감소를 확인한 결과로서, 도 9a는 in vivo 실험 과정을 그림으로 도시한 것이고, 도 9b는 1918 인플루엔자 A 바이러스를 감염시킨 마우스 모델에서 재조합 DDX3 단백질 투여 후 2주 동안 생존율을 측정한 결과이고, 도 9c는 상기 마우스 모델의 폐 조직에서 1918 인플루엔자 A 바이러스의 역가를 측정한 결과이며, 도 9d는 상기 마우스 모델의 폐 조직에서 IFNβ mRNA의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 선천면역반응 회피를 통한 고병원성 유발 기전을 종합하여 도시한 것이다.
도 2a 및 도 2b는 1918 PB1-F2 단백질이 프로테아좀 의존적 경로에 의해 분해됨을 확인한 결과로서, 도 2a는 A549 세포에 각각 Flag-tagged PR8 또는 1918 PB1-F2 발현 플라스미드를 트랜스펙션하고, 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 후 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 PB1-F2 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이고, 도 2b는 유비퀴틴화 분석을 통해 PB1-F2 단백질이 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 분해됨을 확인한 결과이다.
도 3a 내지 도 3d는 1918 PB1-F2 단백질 안정성의 분자적 결정인자를 규명한 결과로서, 도 3a는 PR8 및 1918 PB1-F2의 다양한 변이 플라스미드를 도시한 것이고, 도 3b는 A549 세포에 PB1-F2 키메라 변이체인 PR8-N+1918-C 및 1918-N+PR8-C를 각각 트랜스펙션한 후 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 PB1-F2 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이고, 도 3c는 PR8 PB1-F2 서열의 일부 아미노산을 1918 PB1-F2로 치환하여 제작한 c-말단 점 돌연변이체 발현 플라스미드를 세포에 트랜스펙션 한 후 도 3b와 동일한 방법으로 PB1-F2 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이며, 도 3d는 PR8 및 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질 골격에 68 및 69번째 아미노산을 서로 대체하여 클로닝한 후 각각의 플라스미드를 세포에 트랜스펙션하고 도 3b와 동일한 방법으로 PB1-F2 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이다.
도 4a 내지 도 4d는 1918 PB1-F2 단백질에 의해 IFNβ 유도가 억제됨을 확인한 결과로서, 도 4a는 PR8 및 1918 PB1-F2 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 세포에서 NF-κB 루시퍼레이즈 활성 및 pro-inflammatory 사이토카인(IL6, IL1β, 및 IL32)의 mRNA 발현수준을 측정한 결과이고, 도 4b는 PR8 및 1918 PB1-F2 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 A549 및 U937 세포에서 semi-quantitative PCR 및 real-time PCR을 통해 IFNβ mRNA의 발현수준을 측정한 결과이고, 도 4c는 U937 세포에서 루시퍼레이즈 리포터 분석을 통해 IFNβ의 프로모터 활성을 측정한 결과이며, 도 4d는 A549 및 U937 세포에 PR8 및 1918 스트레인의 인플루엔자 A 바이러스를 MOI 1로 감염시킨 후 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 세포 내 IFNβ mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 1918 PB1-F2 단백질의 프로테아좀 의존적 분해와 type I IFN 유도 억제의 상관관계를 규명한 결과로서, 도 5a는 PR8 및 1918 PB1-F2 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 A549 및 U937 세포에서 semi-quantitative RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 프로테아좀 억제제인 MG132 처리 유무에 따른 IFNβ mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이고, 도 5b는 PR8 PB1-F2 서열의 68 및 69번째 아미노산을 1918 PB1-F2의 것으로 치환하여 제작한 돌연변이체 발현 플라스미드를 세포에 트랜스펙션 한 후 semi-quantitative RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 IFNβ mRNA 및 단백질 발현수준을 측정한 결과이다.
도 6a 내지 도 6f는 1918 PB1-F2의 68 및 69번째 아미노산이 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 병원성에 미치는 영향을 규명한 결과로서, 도 6a 및 도 6b는 마우스에 PR8 및 1918 스트레인의 인플루엔자 바이러스를 각각 5X102 PFU 및 1X103 PFU로 비강투여한 후 14일 동안 마우스의 체중변화 및 생존율을 측정한 결과이고, 도 6c는 PR8 PB1-F2 단백질의 68 및 69번째 아미노산을 1918 PB1-F2의 것으로 치환한 변이 인플루엔자 바이러스를 마우스에 감염시킨 후 체중 및 생존율을 측정한 결과이며, 도 6d 내지 도 6f는 도 6c와 동일한 변이 인플루엔자 바이러스를 다양한 용량(6x102, 8x102, 및 1x103 PFU)으로 감염시킨 후 체중 및 생존율을 측정한 결과이다.
도 7a 내지 도 7d는 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델에서 1918 PB1-F2에 의한 IFNβ 유도 억제를 확인한 결과로서, 도 7a는 PR8, 1918, 및 PB1-F2 결손 1918(PB1-F2(-)) 바이러스를 5X102 PFU로 마우스에 감염시키고 2일 후 웨스턴 블롯을 통해 마우스 폐 조직에서 바이러스 단백질인 PB1-F2, NP(neucleoprotein), 및 HA(hemagglutinin)의 발현수준을 측정한 결과이고, 도 7b는 도 7a의 각 그룹 마우스의 폐 조직 분쇄액을 이용한 plaque assay를 통해 상기 각 인플루엔자 A 바이러스의 역가를 측정한 결과이고, 도 7c는 도 7a의 각 그룹 마우스의 폐 조직을 이용해 RT-PCR을 실시하여 IFNβ mRNA의 발현수준을 측정한 결과이며, 도 7d는 ELISA를 통해 도 7a의 각 그룹 마우스의 폐에서 분비된 IFNβ 단백질 수준을 측정한 결과이다.
도 8a 내지 도 8f는 1918 PB1-F2와 DDX3의 결합을 통한 IFNβ 유도 억제 기전을 규명한 결과로서, 도 8a는 1918 PB1-F2와 상호작용하는 것으로 도출된 단백질 중 바이러스 감염에 관련된 기능을 갖는 단백질들을 도시한 것이고, 도 8b는 A549 세포에 DDX3 발현 플라스미드(HA-tagged DDX3) 및, PR8 또는 1918의 PB1-F2 발현 플라스미드(Flag-tagged PB1-F2)를 트랜스펙션한 후 IP를 실시하거나, PR8 PB1-F2의 68 및 69번째 아미노산을 1918 PB1-F2의 것으로 치환시켜 제작한 변이체(I68T, L69P, 및 I68T/L69P) 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 후 MG132 처리 조건에서 1918의 PB1-F2와 DDX3 단백질의 결합을 확인한 결과이고, 도 8c는 A549 세포를 각각 PR8, 1918, 및 PR8-PB1-F2(-) 바이러스로 감염시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 DDX3 단백질의 발현수준을 측정한 결과이고, 도 8d는 마우스에 상기 각 인플루엔자 A 바이러스를 감염시킨 후 폐 조직에서 DDX3 단백질의 발현수준을 측정한 결과이고, 도 8e는 1918 PB1-F2에 의한 IRF3의 핵 내로의 이동 여부를 측정한 결과이며, 도 8f는 A549 세포에 PR8 및 1918의 PB1-F2 발현 플라스미드 및 DDX3 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 후 IFNβ mRNA 발현 변화를 분석한 결과이다.
도 9a 내지 도 9d는 in vivo 모델에서 재조합 DDX3 처리에 의한 1918 PB1-F2 인플루엔자 바이러스의 병원성 감소를 확인한 결과로서, 도 9a는 in vivo 실험 과정을 그림으로 도시한 것이고, 도 9b는 1918 인플루엔자 A 바이러스를 감염시킨 마우스 모델에서 재조합 DDX3 단백질 투여 후 2주 동안 생존율을 측정한 결과이고, 도 9c는 상기 마우스 모델의 폐 조직에서 1918 인플루엔자 A 바이러스의 역가를 측정한 결과이며, 도 9d는 상기 마우스 모델의 폐 조직에서 IFNβ mRNA의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 선천면역반응 회피를 통한 고병원성 유발 기전을 종합하여 도시한 것이다.
본 발명자들은 고병원성을 나타내는 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인에서 PB1-F2 단백질이 병독성에 미치는 영향 및 상관관계를 조사한 결과, 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질 서열상의 68번째 및 69번째 아미노산이 상기 바이러스의 낮은 안정성을 매개하고, 세포 내 DDX3와의 결합을 통해 항바이러스 반응을 유도하는 IFNβ의 발현을 억제함으로써 바이러스의 병독성을 증가시키는 것을 확인하였으며, 재조합 DDX3 단백질을 1918 PB1-F2 인플루엔자 바이러스가 감염된 마우스에 주입하여 IFNβ의 발현이 복구되고 생존률 증가를 통해 바이러스의 병원성이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 1918 PB1-F2 단백질과 상기 바이러스의 고병원성 간의 상관관계 및 이의 분자기전을 최초로 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 PB1-F2 단백질은 바람직하게는 +1 open reading frame으로부터 PB1 유전자 부위에 의해 암호화된 인플루엔자 바이러스의 비구조 단백질이다. 상기 단백질은 CD8 T 세포 및 폐포대식세포에서 미토콘드리아에 결합하여 사이토크롬 c의 방출을 매개하여 세포사멸(apoptosis)를 유도한다고 알려져 있고, 1차적 바이러스 및 2차적 박테리아 감염 시 심각성을 증가시킨다고 보고된 바 있으며, 인플루엔자 바이러스에서 고병원성과 관련이 있음이 보고되었다.
이에, 본 발명의 실시예에서는 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 고병원성에 대해 PB1-F2 단백질이 미치는 영향을 알아보기 위해 상기 1918 스트레인 및 저병원성의 PR8 스트레인의 PB1-F2 단백질을 비교분석 함으로써 고병원성과 PB1-F2의 상관관계 및 이의 분자기전을 최초로 규명하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 저병원성의 인플루엔자 A 바이러스 PR8 스트레인과 비교하여 고병원성을 나타내는 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질이 현저히 낮은 안정성을 가지며, 이는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통한 빠른 단백질 분해에 의해 일어나는 것을 확인하였다(실시예 2 및 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 고병원성의 1918 스트레인 유래 PB1-F2 단백질에서만 분해가 유도되는 원인을 알아보기 위해 아미노산을 치환시켜 제작한 다양한 PB1-F2 단백질 변이체를 이용하여 PB1-F2 단백질의 발현양상을 분석한 결과, PB1-F2 단백질의 아미노산 서열상에서 68 및 69번째 아미노산이 상기 단백질의 안정성에 영향을 미치는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인플루엔자 A 바이러스 1918 감염 시 PB1-F2 단백질의 불안정성이 숙주의 방어 시스템에 미치는 영향을 알아보기 위해, 선천면역반응에서 바이러스에 대한 방어에 매우 중요한 역할을 하는 type I IFN 유도에 대한 PB1-F2 단백질의 영향을 분석하였다. 그 결과, PR8 스트레인과는 달리 1918 스트레인의 PB1-F2에 의해 IFNβ의 발현이 억제되며, 이의 프로모터 활성 또한 억제되는 것을 확인하였다(실시예 5 참조). 또한, 이러한 현상은 프로테아좀 의존적 분해를 억제하였을 때 나타나지 않았으며, 1918 PB1-F2 단백질에서 불안정성을 결정하는 것으로 확인된 68 및 69번째 아미노산이 type I IFN 유도 억제반응에 영향을 미치는 것을 확인함으로써 1918 PB1-F2 단백질의 프로테아좀 의존적 분해를 통한 불안정성과 type I IFN 유도 억제반응 간에 상관관계가 있음을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, PR8 스트레인 및 1918 스트레인의 인플루엔자 바이러스를 각각 감염시킨 마우스 모델에서 1918 스트레인 감염 시 높은 병독성이 유발됨을 확인하였고, PB1-F2 단백질의 68 및/또는 69번째 아미노산을 치환시켜 제작한 단백질 변이체를 이용하여 PB1-F2 단백질의 68 및 69번째 위치의 아미노산이 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 높은 병원성에 기여하는 것을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인플루엔자 A 바이러스 감염 모델에서 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질이 IFNβ 유도를 억제하며, 결국 바이러스 소멸 반응이 제대로 일어나지 못해 바이러스 역가가 높게 유지되는 것을 알 수 있었다(실시예 8 참조).
상기와 같은 본 발명의 실시예를 통해 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질, 바람직하게는 1918 스트레인과 동일하게 각각 트레오닌 및 프롤린으로 치환된 PB1-F2 단백질 변이체를 고병원성 바이러스 검출용 마커로 이용할 수 있으며, 상기 변이체를 측정하여 고병원성 바이러스 검출용도에 활용할 수 있다.
따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 측정하는 제제를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 고병원성 바이러스 검출 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 변이체는 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌(Threonine) 및 프롤린(proline)으로 치환된 것일 수 있으며, 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 바람직하게 인플루엔자 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 변이체를 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명의 검출 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 측정하는 단계를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질에 의한 IFNβ 유도 억제반응이 상기 PB1-F2 단백질과 세포 내 DDX3 단백질 간의 결합을 통해 DDX3의 기능을 저해함으로써 일어나며(실시예 9 참조), 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질이 존재하는 경우에도 재조합 DDX3 단백질을 처리하는 경우 IFNβ 유도 억제가 복구되며 이를 통해 바이러스 소멸 반응이 유도되는 것을 확인하였다(실시예 10 참조).
따라서 1918 스트레인과 같이 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌 및 프롤린으로 치환된 PB1-F2 단백질 및 세포 내 DDX3의 결합을 억제함으로써 고병원성 인플루엔자 A 바이러스의 증식을 저해하는데 이용할 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 DDX3(DEAD box protein 3)와 PB1-F2 단백질의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물을 제공하며, 상기 PB1-F2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PB1-F2 단백질은 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌(Threonine) 및 프롤린(proline)으로 치환된 것일 수 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “항바이러스”란 체내에서 바이러스의 증식을 억제하여 체내에 침입한 바이러스의 작용을 약하게 하거나 소멸하게 하는 것을 의미하고, 보다 상세하게는 바이러스의 핵산합성과정, 유전자 발현과정, 또는 바이러스 복제 과정 등을 저해함으로써 바이러스의 증식을 억제하는 것을 의미하며, 본 발명에서는 인플루엔자 A 바이러스, 보다 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인(A/Brevig Mission/1/1918(H1N1))을 대상으로 한다.
상기 DDX3는 세포내에서 다양한 기능을 하는 DEAD box family RNA helicase로서, 유전자 발현의 여러 단계 즉, 전사, 핵 및 미토콘드리아 mRNA의 성숙, 번역 시작, 리보솜 및 스플라이세오좀(spliceosome)의 재배열 등에 관여하며, C형 간염 바이러스(HCV) RNA 복제에 관여하고, HBV 감염에 의한 간암에서 발현이 감소되어 있다고 보고된 바 있으며, 종양 억제 단백질로서 기능함이 알려져 있다. 또한, TBK1(TANK-binding kinase 1) 및 IκBKε(Iκ-B kinase-epsilon) 의존적 IRF3 활성화에 의한 IFNβ유도에 관여한다고 알려져 있다. 상기 DDX3 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 결합 억제제는 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer), 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) In vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 DDX3(DEAD box protein 3)와 PB1-F2 단백질의 결합을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 DDX3와 PB1-F2 단백질의 결합을 감소시키는 물질을 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 물질의 스크리닝 방법을 제공하며, 상기 PB1-F2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer), 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 상기 핵산은 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계에서 DDX3와 PB1-F2 단백질의 결합을 측정하는 단계는 웨스턴 블롯팅(western blotting), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 세포배양
A549 및 293T 세포는 열처리하여 비활성화시킨 10% FBS(fetal bovine serum)(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) 배지에서 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다. U937 세포는 상기 세포와 동일한 조건으로 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 배지(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)에서 배양하였다. 트랜스펙션은 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다.
1-2. 플라스미드 제작
PR8 PB1-F2 및 1918 PB1-F2의 발현 플라스미드는 EcoR I 및 Xho I 제한효소 부위를 이용해 pcDNA3.1 (+) 벡터(Invitrogen)에 PCR을 통해 클로닝하였다. 키메라 변이체 즉, PR8 스트레인 유래 PB1-F2의 N-말단 도메인 및 1918 스트레인의 C-말단 도메인; 및 1918 스트레인 유래 PB1-F2의 N-말단 및 PR8 스트레인의 C-말단 도메인 변이체는 PCR로 증폭시켜 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝하였다. 이에 더하여, 아미노산 치환을 통한 PR8 유래 PB1-F2의 변이체(R59K, R60Q, R59K/R60Q, R59K/R60Q/N66S, R59K/R60Q/N66S/I68T, R59K/R60Q/N66S/I68T/L69P)는 PCR로 증폭한 후 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝하였다. 본 실험에서 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 또한, DDX3 발현 플라스미드는 Hind III 및 Xho I 제한효소 부위를 이용해 pcDNA3.1(+) 벡터에 클로닝하였으며, IRF3 및 TLR3 발현벡터는 연세대학교 다른 연구팀으로부터 제공받아 사용하였다.
| primer | 서열 | 서열번호 | |
| PB1-F2 | Forward | 5'-acc gaa ttc atg gac tac aag gat gac gac-3' | 4 |
| Reverse | 5'-acc ctc gag cta ctc gtg ttt gct gaa-3 | 5 | |
| R59K | Forward | 5'-gtg tat tgg aag cga tgg ctt tcc ttg-3' | 6 |
| Reverse | 5'-caa gga aag cca tcg ctt cca ata cac-3' | 7 | |
| R59K/R60Q | Forward | 5'-gtg tat tgg agg caa tgg ctt tcc ttg-3' | 8 |
| Reverse | 5'-caa gga aag cca ttg cct cca ata cac-3’ | 9 | |
| R59K/R60Q/N66S | Forward | 5'-gtg tat tgg aag cga tgg ctt tcc ttg-3' | 10 |
| Reverse | 5'-caa gga aag cca tcg ctt cca ata cac-3' | 11 | |
| R59K/R60Q/N66S/ I68T |
Forward | 5'-ctt tcc ttg agg aat ccc acc ccg-3' | 12 |
| Reverse | 5'-cgg ggt ggg att cct caa gga aag-3' | 13 | |
| R59K/R60Q/N66S/ I68T/L69P |
Forward | 5'-ctt gag gag tcc cat ccc ggt atc ttt-3' | 14 |
| Reverse | 5'-caa aga tac cgg gat ggg act cct caa-3' | 15 | |
| I68T | Forward | 5'-ttg agg aat ccc acc ctg gta ttt ttg-3' | 16 |
| Reverse | 5'-caa aaa tac cag ggt ggg att cct caa-3' | 17 | |
| L69P | Forward | 5'-agg aat ccc atc ccg gta ttt ttg aaa-3' | 18 |
| Reverse | 5'-ttt caa aaa tac cgg gat ggg att cct-3' | 19 | |
| I68T/L69P | Forward | 5'-ttg agg aat ccc acc ccg gta ttt ttg aaa-3' | 20 |
| Reverse | 5'-ttt caa aaa tac cgg ggt ggg att cct caa-3' | 21 | |
| T68I | Forward | 5'-ctt gag gag tcc cat ccc ggt atc ttt g-3' | 22 |
| Reverse | 5'-caa aga tac cgg gat ggg act cct caa-3' | 23 | |
| P69L | Forward | 5'-gga gtc cca ccc tggta tct ttg aaa ac-3' | 24 |
| Reverse | 5'-gtt ttc aaa gat acc agg gtg gga ctc c-3' | 25 | |
| T68I/P69L | Forward | 5'-ttg agg agt ccc atc ctg gta tct ttg aaa-3' | 26 |
| Reverse | 5'-ttt caa aga tac cag gat ggg act cct caa-3' | 27 | |
1-3. 항체 및 시약
anti-FLAG M2 단일클론 항체, anti-HA, 및 anti-β-actin 항체는 Sigma(St. Louis, MO)에서 구입하였고, Lamin A/C 항체는 Cell signaling Technology(Beverly, MA)에서 구입하여 사용하였다. 바이러스 PB1-F2 단백질 검출을 위한 마우스 다클론 항체는 대장균(E.coli)에서 발현시킨 전체 서열의 재조합 PB1-F2 단백질을 이용하여 제조하였다. DDX3 항체, Anti-mouse, 및 anti-rabbit IgG HRP(horseradish peroxidase) 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입하였고, Anti-NP 항체는 NP 단백질로 면역시킨 토끼(LabFrontier)로부터 얻었다. 본 실시예에서 사용한 MG132 및 Poly(I:C)는 각각 Calbiochem(Germany) 및 InvivoGen에서 구입하였다.
1-4. 인플루엔자 바이러스
Influenza A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스(IAV (PR8)), PB1-F2 단백질을 결손시킨 바이러스(IAV PB1-F2(-)), 또는 PR8 바이러스 골격에서 A/Brevig Mission/1/1918(H1N1) 바이러스(IAV(1918))의 PB1-F2 단백질로 아미노산 서열을 치환시킨 바이러스를 in vitro 및 in vivo 실험에서 이용하였다. 부위 특이적 변이를 이용해 PB1-F2 변이 바이러스를 제조하기 위하여 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)의 PB1-F2 단백질 내 68Ile(ATC) 또는 69Leu(CTG) 잔기를 각각 Thr(ACC) 및 Pro(CCG)으로 치환하였다. 변이된 PB1-F2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 얻기 위하여, 역유전학 기술을 이용하였다. 간단하게, 야생형의 유전자 부위를 암호화하는 7개의 cDNA와 하나의 변이된 PB1 부위를 pHW2000 벡터에 클로닝하고 293T 세포에 함께 트랜스펙션하였다. 3일 후 상층액을 회수하여 용균반검사(plaque assay)를 실시하였다. 정제한 플라크는 바이러스를 증폭시키기 위해 MDCK 세포에 접종하였다.
1-5. 인플루엔자 바이러스 감염
6주령 내지 8주령의 암컷 Balb/c 마우스를 이용하여, 마취된 마우스에 인플루엔자 바이러스를 50 ㎕의 양으로 비강을 통해 감염시켰다. 본 동물실험은 건국대학교의 실험동물운영위원회의 승인을 받아 진행하였다. 세포 내 인플루엔자 바이러스 감염을 위해서는, A549 및 U937 세포를 PBS로 세척하고 인플루엔자 바이러스를 MOI 1로 감염시켰다. 24시간 후 세포를 회수하고 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.
1-6. Real-time PCR
세포 및 마우스 조직에 Trizol을 처리하여 용해시켜 총 RNA를 추출하였다. 상기 추출된 RNA 2 ㎍ 및 M-MLV 역전사효소(iNtRON, Seoul, Korea)를 이용하여 최종 양이 20 ㎕가 되도록 반응용액을 제조하여 cDNA를 합성하고 이를 주형으로 PCR을 실시하였다. 반응조건은 하기 조건 즉, 1차 변성 94℃에서 5분간 수행 후 94℃ (30초), 55~60℃ (30초), 및 72℃ (30초)로 25-30 사이클 반복, 및 최종 연장과정 72℃에서 5분간 실시하여 증폭시켰다. 본 실험에서 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다. 정량적 실시간 PCR(Quantitative Real-time PCR)은 SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems)를 이용해 수행하였고, PCR 증폭은 Applied Biosystems(ABI7500) real-time PCR 장치를 이용하였다. 상대적인 mRNA 발현량의 정량적 분석은 ΔΔCt 방법을 이용해 수행하였으며, 결과는 calibrator(RQ=2-ΔΔCt)에 상대적인 n-fold 차이로 나타내었다.
| primer | 서열 | 서열번호 | |
| IFNβ | Forward | 5'-gcc tgg ctt cca tca tga ac-3' | 28 |
| Reverse | 5'-gag gca tca act gac agg tc-3 | 29 | |
| PB1-F2 | Forward | 5'-atg gga ccg gaa cag gat aca cca-3' | 30 |
| Reverse | 5'-cta ctc gtg ttt gct gaa caa cct-3' | 31 | |
| IL-1β | Forward | 5'-tca ggc agg ccg cgt cag tt-3' | 32 |
| Reverse | 5'-ttg ctg tga gtc ccg gag cgt-3’ | 33 | |
| IL-6 | Forward | 5'-agc gcc ttc ggt cca gtt gc-3' | 34 |
| Reverse | 5'-tgc cag tgc ctc ttt gct gct-3' | 35 | |
| IL-32 | Forward | 5'-gaa ggc ccg aat ggt aat gc-3' | 36 |
| Reverse | 5'-tcg gca ccg taa tcc atc tc-3' | 37 | |
| GAPDH | Forward | 5'-cgt ctt cac cac cat gga ga-3' | 38 |
| Reverse | 5'-cgg cca tca cgc cac agt tt-3' | 39 | |
1-7. 웨스턴 블롯
세포에 lysis buffer(25 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP40 및 단백질분해효소 칵테일)를 처리하고 원심분리하여 세포 내 단백질이 용출된 상층액을 얻었다. 50 ㎍의 단백질을 12-15%의 아크릴아마이드 겔 상에 로딩한 후 SDS-PAGE를 실시하여 단백질이 크기별로 분리되도록 한 후 웨스턴 블롯을 실시하였다. 화학적 발광을 통한 단백질 검출은 ECL Detection Reagents(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)를 이용하였고, Bio-Imaging analyzer(LAS-4000, Fuji, Tokyo, Japan)를 이용해 표적 단백질의 발현수준을 확인하였다.
1-8. 루시퍼레이즈 리포터 분석법
세포에 Lipofectamine 2000을 이용하여 트랜스펙션을 실시하고 48시간 후 luciferase assay system(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다. 모든 샘플에 대하여 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)의 활성을 측정하여 결과를 보정하였고, 실험은 독립적으로 3회 실시하여 평균±표준편차 값으로 나타내었다.
1-9. IFNβ 함량 측정
마우스의 폐 조직 분쇄액을 10,000 x g로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하고, 상기 상층액을 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 IFNβ ELISA kit(R&D)를 이용하여 IFNβ 단백질 수준을 측정하였다.
1-10. 단백질 발현 플라스미드 제작
LysRS-R9-DDX3를 암호화하는 pGE-LysRS-R9-DDX3의 발현 플라스미드는 T7 프로모터-LysRS-TEV 단백질 분해효소 인식 서열-multicloning sites(KpnI-BamHI-EcoRV-SalI-HindIII) 및 히스티딘 tag로 구성된 pGE-LysRS-4 벡터를 이용해 제작하였다. LysRS-R9-DDX3 유전자는 하기 표 3의 프라이머 서열을 이용해 PCR로 증폭시켰으며, 증폭산물은 KpnI/SalI로 절단하여 pGE-LysRS-4의 KpnI/SalI 사이트에 도입하여 제작하였다.
| primer | 서열 | 서열번호 | |
| LysRS-R9-DDX3 | Forward | 5’-gtc acg ggt acc cgt cgc cgt cgc cgt cgc cgt cgc cgt atg agt cat gtg gca gtg-3’ | 40 |
| Reverse | 5’-gtc acg gtc gac gtt acc cca cca gtc aac ccc ctg gga gtt a-3’ | 41 | |
실시예 2. 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질 안정성 분석
다양한 연구들을 통해 인플루엔자 바이러스의 PB1-F2 단백질이 다양한 기능을 가지고 있음이 알려져 왔으며, 최근에는, 1918 유행성 인플루엔자의 높은 사망률이 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질과 관련이 있음이 보고된 바 있다. 이에, 본 실시예에서는 1918 인플루엔자 바이러스 PB1-F2 단백질의 분자 및 기능적 특성을 알아보기 위해, 먼저 A/Brevig Mission/1/1918(H1N1)(이하, 1918 스트레인)과 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(이하, PR8 스트레인) 인플루엔자 바이러스의 PB1-F2 단백질을 비교분석하였다.
이를 위해, A549 및 U937 세포를 상기 각 인플루엔자 바이러스 즉, PR8 스트레인(PR8), PR8 스트레인에서 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질로 아미노산 서열을 변화시킨 바이러스(PR8-PB1-F2(1918)) 및 PB1-F2 단백질을 결손시킨 PR8 스트레인(PR8-PB1-F2(-))을 MOI 1 또는 5로 24시간 동안 감염시킨 후 세포에서 웨스턴 블롯을 통해 PB1-F2 단백질의 발현양상을 관찰하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, PR8의 PB1-F2 단백질은 발현되는 반면 1918의 PB1-F2 단백질은 검출되지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 PR8 스트레인과 비교하여 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질 안정성이 낮은 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 프로테아좀 의존적 경로에 의한 1918 PB1-F2 단백질 분해 확인
상기 실시예 2의 결과를 바탕으로, PR8 스트레인과 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질 발현양상이 다르게 나타나는 이유가 프로테아좀 매개 단백질 분해에 의해 나타나는 것인지 알아보기 위해, 프로테아좀 억제제인 MG132를 처리한 조건에서 PB1-F2 단백질의 발현양상을 관찰하였다.
보다 구체적으로, A549 세포에 PR8 스트레인 및 1918 스트레인의 Flag-tagged PB1-F2 발현 플라스미드를 각각 트랜스펙션한 후, MG132를 6시간 동안 처리하고 세포를 회수하여 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 PB1-F2 mRNA 및 단백질의 발현수준을 분석하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, MG132를 처리하거나 처리하지 않은 경우 모두 1918 PB1-F2의 mRNA가 검출된 반면, PB1-F2 단백질은 MG132가 처리된 경우에만 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 1918 PB1-F2 단백질의 낮은 안정성이 프로테아좀 의존적 경로와 관련이 있는 것을 알 수 있었다.
유비퀴틴-프로테아좀 시스템(Ubiquitin-proteasome system)은 단백질 분해를 유도하고 많은 단백질의 기능을 조절한다고 알려져 있다. PB1-F2 단백질이 상기 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 분해되는 것인지 확인하기 위하여, 유비퀴틴화 분석(ubiquitination assay)을 실시하였다. 그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, PB1-F2 단백질은 유비퀴틴 의존적 프로테아좀 경로를 통해 분해되는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. 1918 PB1-F2 단백질 안정성의 분자적 결정인자 규명
상기 실시예 2 및 3의 결과를 바탕으로, PB1-F2 단백질의 안정성을 결정하는 분자적 인자를 규명하기 위하여, PR8 및 1918 PB1-F2의 다양한 변이 플라스미드를 제작하였으며, 도 3a에 그림으로 도시하였다.
보다 구체적으로, A549 세포에 도 3a에 도시한 PB1-F2 키메라 변이체(chimeric mutants)인 PR8-N+1918-C 및 1918-N+PR8-C를 각각 트랜스펙션한 후 상기 실시예 3의 방법과 동일하게 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 실시하여 PB1-F2의 mRNA 및 단백질의 발현수준을 측정하였다. 그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 프로테아좀 억제제인 MG132가 처리되지 않은 경우 PR8-N+1918-C를 트랜스펙션한 세포에서 PB1-F2 단백질이 발현되지 않았으며, 이를 통해 PB1-F2의 C-말단 부분에 상기 단백질의 안정성을 결정하는 부위가 존재함을 알 수 있었다.
다음으로, PB1-F2 단백질의 안정성 결정 부위를 보다 자세히 알아보기 위하여, PR8 PB1-F2 서열의 일부 아미노산을 1918 PB1-F2로 치환하는 방법을 이용해 c-말단 점 돌연변이체를 제작한 후 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, MG132가 처리되지 않은 조건에서 R59K/R60Q/N66S 변이체를 도입시킨 경우에는 PB1-F2 단백질이 발현되는 반면에 R59K/R60Q/N66S/I68T 변이체 및 R59K/R60Q/N66S/I68T/L69P 변이체를 도입시킨 경우에는 PB1-F2 단백질이 발현되지 않는 것을 관찰하였다. 이를 통해 PB1-F2 단백질의 68 및 69번째 위치가 상기 단백질의 안정성에 매우 중요하다는 것을 알 수 있었다.
나아가 PB1-F2 단백질의 68 및 69번 째 아미노산 위치가 상기 단백질의 불안정성을 결정하는 인자임을 다시 검증하기 위하여, PR8 및 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질상에서 68 및 69번째 아미노산을 서로 대체하여 각각 클로닝한 후 각각의 플라스미드를 세포에 트랜스펙션하고 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 실시하였다. 그 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이, MG132가 처리되지 않은 조건에서 68, 69번째 아미노산 각각을 치환한 경우 및 68과 69번째 아미노산 모두를 치환한 경우 PR8 스트레인 골격의 경우 PB1-F2 단백질의 발현이 저해되고, 1918 스트레인 골격의 경우 상기 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 PB1-F2 단백질의 안정성이 68 및 69번째 아미노산에 의존적임을 알 수 있었다.
더욱이, 각 PB1-F2 클론의 세포내 위치를 분석한 결과, PR8 PB1-F2 단백질은 일차적으로 미토콘드리아에 위치하는 반면, 1918 PB1-F2 단백질은 세포질에 확산되어 있거나 핵에 존재하였다. 따라서 PB1-F2 단백질의 68 및 69번째 아미노산은 PB1-F2 단백질의 세포내 위치를 결정하는데 중요함을 알 수 있었다. 상기 결과들은 Ile68 및 Leu69가 PB1-F2 단백질의 안정성을 결정하는 분자적 인자임을 의미하는 것이다.
실시예 5. 1918 PB1-F2 단백질에 의한 IFNβ 분비 억제 확인
숙주에서 1918 PB1-F2 단백질의 불안정성이 미치는 영향을 알아보기 위하여, pro-inflammatory 사이토카인의 mRNA 발현 및 NF-kB 루시퍼레이즈 활성을 분석하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, PR8과 1918 스트레인간의 PB1-F2 단백질에 의한 차이가 크게 나타나지 않는 것을 확인하였다.
선천면역반응 체계의 중요한 구성 요소인 type I IFN 반응은 바이러스 병원체에 대한 방어에 매우 중요하다고 알려져 있다. 예컨대, 많은 연구들을 통해 인플루엔자 감염에 대한 숙주의 방어체계에서 type I IFN이 매우 중요한 역할을 하는 것이 보고되어 왔다. 이에, 본 발명자들은 PB1-F2 단백질에 의해 IFNβ 유도가 영향을 받는지 검증하기 위하여, A549 및 U937 세포에 각각 PR8 또는 1918 스트레인의 PB1-F2 단백질을 발현하는 플라스미드를 트랜스펙션한 후 semi-quantitative PCR 및 real-time PCR을 실시하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 두 종류의 세포 모두에서 1918 PB1-F2의 경우 PR8 스트레인과 대조적으로 세포에서 IFNβ 유도를 강하게 억제하는 것을 관찰하였으며, 또한 도 4c에서 볼 수 있는 바와 같이, U937 세포에 IFNβ 루시퍼레이즈 리포터 플라스미드와 각 PB1-F2 또는 NS1 발현 플라스미드를 함께 트랜스펙션하고 세포를 회수하기 12시간 전에 polyI:C를 처리한 후 루시퍼레이즈 분석을 실시한 결과, 1918 PB1-F2에 의해 IFNβ 프로모터의 활성이 억제되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로 실제로 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에서 1918 PB1-F2 단백질의 발현이 IFNβ 유전자의 발현에 영향을 미치는지 알아보기 위해, A549 및 U937 세포에 각각의 인플루엔자 A 바이러스 즉, PR8 및 1918 스트레인을 MOI 1로 세포에 감염시킨 후 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 실시하여 세포 내 IFNβ mRNA 및 단백질 발현변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이, 바이러스 감염에 의해 유도되는 세포 내 IFNβ mRNA의 발현이 1918 PB1-F2 단백질에 의해 억제되는 것을 확인하였다.
이러한 결과들은 바이러스가 감염된 세포에서 1918 PB1-F2 단백질이 type I IFN 반응을 억제하는 것을 의미하는 것이다.
실시예 6. 1918 PB1-F2 단백질의 프로테아좀 의존적 분해와 type I IFN 유도 억제의 상관관계 규명
상기 실시예 2 및 3의 결과를 통해 1918 PB1-F2 단백질이 현저히 낮은 안정성을 가지는 것을 확인하였는바, 이를 바탕으로 1918 PB1-F2의 안정성과 상기 단백질에 의한 IFNβ 유도 억제능 간의 상관관계가 있는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, A549 및 U937 세포에 PR8 및 1918 PB1-F2 발현 플라스미드를 트랜스펙션하고 18시간 후 프로테아좀 억제제인 MG132를 6시간 동안 처리한 다음 semi-quantitative RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 실시하여 IFNβ의 발현을 관찰하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, MG132가 처리되지 않은 조건에서는 1918 PB1-F2에 의해 IFNβ의 mRNA 및 단백질 발현이 억제된 반면, MG132가 처리된 경우 IFNβ의 발현 억제가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 1918 PB1-F2에 의한 IFNβ 유도 억제에 PB1-F2의 안정성이 중요한 영향을 미치는 것을 의미한다.
나아가, PB1-F2 단백질의 안정성을 결정하는 분자적 인자로 규명된 1918 PB1-F2의 68 및 69번째 위치의 아미노산이 IFNβ의 발현 억제에 영향을 미치는지 검증하기 위해, A549 세포에 PB1-F2의 68 및 69번째 아미노산을 치환시킨 변이체를 트랜스펙션시킨 후 semi-quantitative RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 실시하여 IFNβ의 발현을 관찰하였다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, PB1-F2의 68 및 69번째 아미노산에 T(트립토판) 및/또는 P(프롤린)이 위치하는 경우(I68T, L69P, I68T/L69P) IFNβ의 mRNA 및 단백질발현이 억제되는 것을 확인하였다.
상기 결과들은 1918 PB1-F2 단백질의 프로테아좀 의존적 분해와 type I IFN의 강한 발현 억제능 간에 상관관계가 있음을 의미하는 것이다.
실시예 7. 1918 PB1-F2의 68 및 69번째 아미노산이 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 병원성에 미치는 영향 규명
인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인이 숙주에 감염될 때 PB1-F2 단백질이 바이러스 병원성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 마우스에 PR8 및 1918 스트레인의 인플루엔자 바이러스를 5X102 PFU 또는 1X103 PFU로 비강투여한 후 14일 동안 마우스의 체중변화 및 생존율을 관찰하였다.
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, PR8 스트레인에 비하여 1918 스트레인의 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 경우 마우스에서 높은 병독성이 유발됨을 확인하였다.
나아가 상기 실시예 4 및 6의 결과를 통해 PB1-F2 단백질의 68 및 69번째 아미노산 위치가 상기 단백질의 불안정성 및 IFNβ 유도를 결정하는 인자임을 확인하였는바, 이를 바탕으로 상기 아미노산 위치가 인플루엔자 바이러스의 병원성에 중요한 영향을 미치는지 검증하고자 하였다. 이를 위해, PR8 PB1-F2 단백질의 68 및 69번째 아미노산을 1918 PB1-F2의 것으로 치환한 변이 인플루엔자 바이러스를 마우스에 감염시킨 후 체중 및 생존율 변화를 관찰하였다.
그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, PR8 스트레인 및 PB1-F2 단백질 결손 바이러스(PB1-F2(-))를 감염시킨 경우와 비교할 때 변이 바이러스(I68T, L69P, I68T/L69P)를 감염시킨 마우스에서는 1918 PB1-F2 바이러스를 감염시킨 경우와 유사한 정도로 체중이 감소하였다.
이에 더하여 1918 PB1-F2의 병독성에 상기 위치의 아미노산이 미치는 영향을 알아보기 위하여 I68T, L69P, 및 I68T/L69P 변이 바이러스를 다양한 용량(6x102, 8x102, 및 1x103 PFU)으로 마우스에 감염시킨 후 체중 및 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 6d 내지 도 6f에 나타낸 바와 같이, 1918 PB1-F2 단백질의 68 및 69번째 아미노산 모두 바이러스의 병독성에 기여하는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통해 PB1-F2 단백질의 68 및 69번째 위치의 아미노산이 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 높은 병원성에 기여하는 것을 알 수 있었다.
실시예 8.
In vivo
에서 1918 PB1-F2에 의한 IFNβ 유도 억제 확인
1918 PB1-F2 단백질이 실제로 인플루엔자 바이러스 감염 모델에서 IFNβ의 유도를 억제하는지 검증하기 위하여, 각 인플루엔자 바이러스 즉, PR8, 1918, 및 PB1-F2 결손 1918(PB1-F2(-))을 5X102 PFU로 마우스에 감염시키고 2일 후 웨스턴 블롯을 통해 마우스 폐 조직에서 바이러스 단백질인 PB1-F2, NP(neucleoprotein), 및 HA(hemagglutinin)의 발현수준을 분석하였다. 그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 1918 스트레인 바이러스를 감염시킨 경우 HA 및 NP 바이러스 단백질이 PR8 스트레인 바이러스를 감염시킨 마우스에 비해 더 높게 발현된 것을 확인하였다.
이러한 바이러스 단백질의 발현 수준이 바이러스 복제와 관련이 있는지 알아보기 위하여 폐 조직 분쇄액에서 plaque assay을 통해 바이러스 역가를 측정하였다. 그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 1918 스트레인 바이러스의 역가가 PR8 스트레인 및 PB1-F2 결손 바이러스에 비해 약 10배 높은 것을 확인하였으며, 이는 1918 스트레인의 바이러스 소멸 과정에 결손이 있음을 의미하는 것이다.
따라서 상기 결과를 바탕으로 각 바이러스가 감염된 마우스 폐 조직에서 1918 스트레인 바이러스의 감염이 IFNβ 유도를 억제하는지 검증하기 위해 RT-PCR을 실시하여 IFNβ mRNA의 발현수준을 측정하였다. 그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 1918 스트레인 바이러스가 감염된 경우에만 IFNβ의 발현이 현저히 억제된 것을 확인하였다.
이에 더하여, ELISA를 통해 상기 각 바이러스가 감염된 마우스 폐에서 IFNβ 단백질의 분비량을 측정한 결과, 도 7d에 나타낸 바와 같이, PR8 스트레인 및 PB1-F2 결손 바이러스를 감염시킨 경우에 비해 1918 스트레인 바이러스가 감염된 마우스에서 IFNβ 단백질 분비량이 더 낮은 것을 확인하였다.
상기 결과들은 1918 스트레인 바이러스가 감염된 마우스에서 PB1-F2이 IFNβ 유도를 억제하는 것을 의미한다.
실시예 9. 1918 PB1-F2와 DDX3의 결합을 통한 IFNβ 유도 억제 규명
1918 PB1-F2에 의한 IFNβ 유도 억제의 분자적 기전을 규명하기 위해, IP를 실시하여 1918 PB1-F2와 상호작용하는 단백질을 분석하였다. 그 결과, LC-MS/MS 분석을 통해 총 134종의 단백질이 1918 PB1-F2과 상호작용 하는 것으로 나타났다. 나아가 Ingenuity Pathway Analysis(IPA) 프로그램을 이용해 PB1-F2와 상호작용하는 단백질들에 대한 생물학적 기능에 따른 분석을 실시하였으며, 바이러스 감염에 관련된 단백질들에 초점을 맞추어 분석하였다. 그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, DDX3X, HSP90AA1, 및 HSPD1 단백질들이 도출되었으며, 상기 단백질들은 바이러스 감염과 관련된 것으로써 TBK1, IRF3 및 INFA2 단백질과 상호작용한다고 알려져 있다.
이에, 상기 결과를 통해 도출된 DDX3에 초점을 맞추어 1918 PB1-F2와 DDX3 간의 상호작용을 평가하기 위해, A549 세포에 DDX3를 발현하는 플라스미드(HA-tagged DDX3) 및, PR8 또는 1918의 PB1-F2 발현 플라스미드(Flag-tagged PB1-F2)를 트랜스펙션한 후 MG132 처리조건에서 IP를 실시하였다. 그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이 1918 PB1-F2와 DDX3가 결합하는 것을 확인하였다. 나아가 PR8 PB1-F2의 68 및 69번째 아미노산을 1918 PB1-F2의 것으로 치환시켜 제작한 변이 단백질(I68T, L69P, 및 I68T/L69P)의 발현 플라스미드를 트랜스펙션하여 동일한 실험을 수행한 결과를 통해서도 역시 DDX3와 상호작용하는 것을 확인하였다.
다음으로 1918 PB1-F2 단백질에 의한 DDX3 억제여부를 검증하기 위해, A549 세포를 각 인플루엔자 바이러스로 감염시켰다. 그 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이, 1918 PB1-F2 단백질에 의해 DDX3의 발현이 감소하였다. 또한, 각 인플루엔자 바이러스로 감염시킨 마우스의 폐 조직에서도 도 8d와 같이 세포내 DDX3의 발현이 감소된 것을 확인하였다.
나아가, IFNβ 유도 반응에서 IRF3의 인산화 및 핵 내로의 이동이 나타나므로, 본 발명자들은 1918 PB1-F2가 IRF3의 핵 내로의 이동을 억제하는지 알아보기 위해 IRF3의 핵 내로의 이동을 평가하였다. 그 결과, 도 8e에 나타낸 바와 같이, 1918 PB1-F2 단백질에 의해 IRF3의 핵내로의 이동이 감소하는 반면, DDX3 첨가에 의해 이러한 현상이 복구되는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 1918 PB1-F2가 DDX3와의 상호작용을 통해 IFNβ 유도를 억제하는 것을 의미한다.
상기 결과를 다시 한 번 검증하기 위해, A549 세포에 PR8 및 1918의 PB1-F2 발현 플라스미드 및 DDX3 발현 플라스미드를 트랜스펙션한 후 IFNβ mRNA 발현량 변화를 trans-complementation assay를 통해 분석한 결과, 도 8f에 나타낸 바와 같이, 1918 PB1-F2에 의해 IFNβ mRNA의 발현이 감소되었으나 DDX3 발현에 의해 FNβ mRNA의 발현이 다시 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과들은 1918 PB1-F2 단백질이 DDX3와의 결합을 통해 IFNβ 유도를 억제하는 것을 의미하는 것이다.
실시예 10.
In vivo
에서 재조합 DDX3 처리에 의한 1918 PB1-F2 인플루엔자 바이러스의 병원성 감소 확인
상기 실시예 결과들을 통해 규명된 1918 PB1-F2와 DDX3의 상호작용에 의한 IFNβ의 분비억제 기전을 증명하기 위하여, IFNβ 유도에서 DDX3의 역할을 검증하고자 하였다. 이를 위해, in vivo 실험을 통해 1918 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 마우스 모델에서 재조합 DDX3 단백질 투여에 의해 IFNβ 유도 억제가 복구될 수 있는지 검증하고자 하였으며, 실험 과정을 도 9a에 그림으로 도시하였다.
그 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이, DDX3를 투여한 마우스 모두 2주 동안 생존한 것을 확인하였다. 이에 더하여, 마우스 폐의 바이러스 역가를 측정한 결과, 도 9c에서 볼 수 있듯이 대조군 그룹에 비해 DDX3 단백질을 투여한 마우스에서 37배 정도 낮은 것을 확인하였으며, 이는 DDX3 첨가에 의해 바이러스 소멸이 일어난 것을 의미하는 것이다. 또한, 도 9d를 통해 마우스 폐 조직에서 DDX3 단백질 발현에 의해 세포 내 IFNβ의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통해 DDX3가 1918 PB1-F2 바이러스 감염으로부터 마우스를 보호하는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 실시예를 통해 규명한 고병원성의 인플루엔자 A 바이러스 1918 스트레인의 선천면역반응 회피 모델을 도 10에 그림으로 정리하여 도시하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation
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thereof
<130> MP16-468
<160> 41
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 87
<212> PRT
<213> PB1-F2
<400> 1
Met Gly Gln Glu Gln Asp Thr Pro Trp Ile Leu Ser Thr Gly His Ile
1 5 10 15
Ser Thr Gln Lys Arg Gln Asp Gly Gln Gln Thr Pro Lys Leu Glu His
20 25 30
Arg Asn Ser Thr Arg Leu Met Gly His Cys Gln Lys Thr Met Asn Gln
35 40 45
Val Val Met Pro Lys Gln Ile Val Tyr Trp Lys Gln Trp Leu Ser Leu
50 55 60
Arg Asn Pro Ile Leu Val Phe Leu Lys Thr Arg Val Leu Lys Arg Trp
65 70 75 80
Arg Leu Phe Ser Lys His Glu
85
<210> 2
<211> 90
<212> PRT
<213> PB1-F2 mutant
<400> 2
Met Gly Gln Glu Gln Asp Thr Pro Trp Ile Leu Ser Thr Gly His Ile
1 5 10 15
Ser Thr Gln Lys Arg Glu Asp Gly Gln Gln Thr Arg Lys Leu Glu His
20 25 30
His Asn Ser Thr Arg Leu Met Asp His Cys Gln Lys Thr Met Asn Gln
35 40 45
Val Val Met Pro Lys Gln Ile Val Tyr Trp Lys Gln Trp Leu Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Pro Thr Pro Val Ser Leu Lys Thr Arg Val Leu Lys Arg Trp
65 70 75 80
Arg Leu Phe Ser Lys His Glu Trp Thr Ser
85 90
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<211> 612
<212> PRT
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<400> 3
Met Ser His Val Ala Val Glu Asn Ala Leu Gly Leu Asp Gln Gln Phe
1 5 10 15
Ala Gly Leu Asp Leu Asn Ser Ser Asp Asn Gln Ser Gly Gly Ser Thr
20 25 30
Ala Ser Lys Gly Arg Tyr Ile Pro Pro His Leu Arg Asn Arg Glu Ala
35 40 45
Thr Lys Gly Phe Tyr Asp Lys Asp Ser Ser Gly Trp Ser Ser Ser Lys
50 55 60
Asp Lys Asp Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Ser Arg Ser Asp Ser Arg Gly
65 70 75 80
Lys Ser Ser Phe Phe Ser Asp Arg Gly Ser Gly Ser Arg Gly Arg Phe
85 90 95
Asp Asp Arg Gly Arg Ser Asp Tyr Asp Gly Ile Gly Ser Arg Gly Asp
100 105 110
Arg Ser Gly Phe Gly Lys Phe Glu Arg Gly Gly Asn Ser Arg Trp Cys
115 120 125
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Glu Lys Tyr Asp Asp Ile Pro Val Glu Ala Thr Gly Asn Asn Cys Pro
165 170 175
Pro His Ile Glu Ser Phe Ser Asp Val Glu Met Gly Glu Ile Ile Met
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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Gln Ile Tyr Ser Asp Gly Pro Gly Glu Ala Leu Arg Ala Met Lys Glu
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Asp Ile Gly Gln Gln Ile Arg Asp Leu Glu Arg Gly Cys His Leu Leu
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Val Ala Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Met Met Glu Arg Gly Lys Ile
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Gly Leu Asp Phe Cys Lys Tyr Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met
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Leu Asp Met Gly Phe Glu Pro Gln Ile Arg Arg Ile Val Glu Gln Asp
355 360 365
Thr Met Pro Pro Lys Gly Val Arg His Thr Met Met Phe Ser Ala Thr
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Phe Pro Lys Glu Ile Gln Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu Asp Glu Tyr
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Ile Phe Leu Ala Val Gly Arg Val Gly Ser Thr Ser Glu Asn Ile Thr
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Glu Thr Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu Glu Asp Phe Leu Tyr His Glu
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Gly Tyr Ala Cys Thr Ser Ile His Gly Asp Arg Ser Gln Arg Asp Arg
465 470 475 480
Glu Glu Ala Leu His Gln Phe Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ile Leu Val
485 490 495
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Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ile Glu Glu Tyr Val His Arg
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Ser Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Gly Gly
565 570 575
Gly His Gly Ser Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Phe
580 585 590
Tyr Asn Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asn Ser Gln Gly Val Asp
595 600 605
Trp Trp Gly Asn
610
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<211> 24
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<223> PB1-F2_Reverse
<400> 31
ctactcgtgt ttgctgaaca acct 24
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1b_Forward
<400> 32
tcaggcaggc cgcgtcagtt 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1b_Reverse
<400> 33
ttgctgtgag tcccggagcg t 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6_Forward
<400> 34
agcgccttcg gtccagttgc 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-6_Reverse
<400> 35
tgccagtgcc tctttgctgc t 21
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-32_Forward
<400> 36
gaaggcccga atggtaatgc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-32_Reverse
<400> 37
tcggcaccgt aatccatctc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH_Forward
<400> 38
cgtcttcacc accatggaga 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH_Reverse
<400> 39
cggccatcac gccacagttt 20
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LysRS-R9-DDX3_Forward
<400> 40
gtcacgggta cccgtcgccg tcgccgtcgc cgtcgccgta tgagtcatgt ggcagtg 57
<210> 41
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LysRS-R9-DDX3_Reverse
<400> 41
gtcacggtcg acgttacccc accagtcaac cccctgggag tta 43
Claims (26)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체 포함하는, 고병원성 바이러스 검출용 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 단백질 변이체는 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌(Threonine) 및 프롤린(proline)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 측정하는 제제를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 단백질 변이체는 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌(Threonine) 및 프롤린(proline)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 단백질 변이체를 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 검출용 조성물.
- 제5항의 검출용 조성물을 포함하는, 고병원성 바이러스 검출 키트.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 PB1-F2 단백질의 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 단백질 변이체를 측정하는 단계를 포함하는, 고병원성 바이러스 검출방법.
- 제11항에 있어서,
상기 단백질 변이체는 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌(Threonine) 및 프롤린(proline)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 검출방법.
- 제12항에 있어서,
상기 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 검출방법.
- 제11항에 있어서,
상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는, 검출방법.
- DDX3(DEAD box protein 3)와 PB1-F2 단백질의 결합 억제제를 유효성분으로 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로서,
상기 PB1-F2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 DDX3는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 결합 억제제는 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer), 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 PB1-F2 단백질은 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌(Threonine) 및 프롤린(proline)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제18항에 있어서,
상기 PB1-F2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제15항에 있어서,
상기 조성물은 세포 내 인터페론 베타(IFNβ)의 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- (a) In vitro 상에서 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 DDX3(DEAD box protein 3)와 PB1-F2 단백질의 결합을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 DDX3와 PB1-F2 단백질의 결합을 감소시키는 물질을 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 물질의 스크리닝 방법으로서,
상기 PB1-F2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 68번째 및 69번째 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
- 제21항에 있어서,
상기 후보물질은 핵산, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 펩타이드, 기질 유사체, 압타머(aptamer), 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
- 제22항에 있어서,
상기 핵산은 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
- 제21항에 있어서,
상기 (b) 단계는 웨스턴 블롯팅(western blotting), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
- 제21항에 있어서,
상기 PB1-F2 단백질은 68번째 및 69번째 아미노산이 각각 트레오닌(Threonine) 및 프롤린(proline)으로 치환된 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
- 제25항에 있어서,
상기 PB1-F2 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
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