WO2009103821A2 - Mittel zur behandlung von virusinfektionen - Google Patents

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Stephan Ludwig
David Mitzner
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    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus

Definitions

  • the invention relates to agents for the treatment of viral infections. It relates in particular to the treatment of influenza A virus infections.
  • Influenza A viral infections include those caused by virus strains expressing the protein PB1-F2. It further relates to a vaccine which is useful for the prophylaxis and / or treatment of viral infections.
  • PB1-F2 was identified in 2001 as the eleventh influenza gene product encoded by the +1 reading frame of the influenza A virus (IAV) PBI gene, ie located within the reading frame of viral polymerase 1, and first as has been described proapoptotically (Chen et al., 2001). It is believed that the alternative reading frame is expressed by the mechanism of "ribosomal scanning", a hypothetical model in which the 40S subunit of the ribosome also "scans" for AUG triplets within a reading frame to initiate translation, which agrees with the finding that there is an ideal initiation sequence at the beginning of the PB1-F2 gene, also known as the Kozak sequence (Kozak 1991).
  • IAV influenza A virus
  • the functionally complete protein has a molecular weight of about 11.5 kD and varies in number of amino acids (AS), varying depending on the virus strain, between 79 and 101 AS (Zell et al., 2007).
  • AS amino acids
  • the human pathogen less relevant influenza B viruses have no PB1-F2 and in pigs (intermediate hosts) only mutant PB 1-F2 variants are found by stop codon mutations (Chen et al., 2007).
  • PB1-F2 can be found in almost all human-pathogenic viruses, including the highly pathogenic isolates of bird flu and Spanish flu (Conennello et al. 2007). However, it has not been established that all influenza strains that have a complete reading frame actually express the protein. [0004] Biochemically and functionally, PB1-F2 exhibits similarities to other viral gene products that have been described as proapoptotic, such as the HTLV type 1 protein p1 (D'Agostino et al., 2002, Silic-Benussi et al HIV-1 Vpr (Muthumani et al., 2002, Sherman and Greene, 2002).
  • PB1-F2 can be detected after IAV infection in the mitochondria, the cytoplasm and / or the nucleus of the host cell. If the protein is transfected, it can not localize at the nucleus, suggesting that at least one viral factor is needed to translocate PB1-F2 into the nucleus.
  • PB1-F2 has a mitochondrial targeting sequence (MTS) in the C-terminal region of the protein that is essential for its localization in the mitochondria (Gibbs et al., 2003).
  • MTS mitochondrial targeting sequence
  • PB1-F2 has a C-terminal ⁇ -helix extending from Ile55 to Lys85 across all hitherto functionally identified regions of the protein, including the MTS and the oligomerization domains responsible for the intrinsic ability of the protein, To generate dimers and multimers.
  • the N-terminus (low helical portion) and the central portion of the protein are unstructured (Bruns et al., 2007).
  • a C-terminal, approximately 57 kD PB1-F2 fragment was also described, which is synthesized by another alternative start codon in the PBI sequence (Zamarin et al., 2006). It is completely unknown whether this truncated peptide has a biological function or is only a random product.
  • PB1-F2 The per capita total function of PB1-F2 has been extensively studied.
  • the expression of the protein in cell culture is not sufficient to trigger apoptosis (Chen et al., 2001), but the protein has a potentiating effect on apoptotic cell death associated with cytotoxic stimuli (Zamarin et al., 2005).
  • PB1-F2 As a mitochondrial interaction partner of PB1-F2, the main components of the "permeability transition pore complex" (PTPC) regulate the collapse of the mitochondrial membrane potential, resulting in the release of cytochrome C and the activation of apoptotic effector caspases (Zamarin et al., 2005) another study showed that PB1-F2 can directly and non-specifically cause pores in lipid bilayer membranes (Chanturiya et al., 2004), which can be considered as an alternative explication of PB1-F2 mitochondrially induced apoptosis.
  • PTPC permeability transition pore complex
  • the PBl gene is located on a segment that is thought to be of high pathogenicity. that by viral "reassortment" on the generation of pandemic isolates from 1957 and 1968 (Kawaoka et al. 1989), suggesting that there is a direct relationship between PB1-F2 and increased virulence.
  • the object of the invention is to provide new and / or better means for the treatment of influenza-generated viral infections available. Solution of the task
  • PB1-F2 can be characterized as a phosphoprotein and thus is part of the complex network of cellular signal transduction and phosphorregulation.
  • PKC protein kinase C
  • the phosphorylation sites identified in the context of the present invention are localized in the central region of the protein, in the case of the amino acids threonine 27 (Thr27) and serine 35 (Ser35), and are therefore located in a region which has hitherto not yet been described as functionally relevant.
  • Thr27 threonine 27
  • Ser35 serine 35
  • EMBODIMENT A The inhibition of PBI-F2-induced apoptosis occurs by specific activation of anti-apoptotic factors which specifically intervene in the mitochondrial apoptosis pathway or are induced by (targeted) blockade of cytochrome C release by PB1-F2) from the mitochondria to inhibit the activation of apoptotic effector caspases.
  • the agents used in the invention can be used in a concentration range of 5 nM to 400 uM.
  • chemical inhibitors in a concentration range of 5 nM to 100 .mu.M, preferably 10 nM to 50 .mu.m, can be used.
  • Peptide inhibitors may be used, for example, in a concentration range from 1 ⁇ M to 400 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 250 ⁇ M.
  • the active substances include, for example:
  • Peptide and non-peptide inhibitors of cellular caspase 3 such as o Z-DEVD-FMK (Alexis Biochemicals) o Ac-DEVD-CHO (Alexis Biochemicals) o Ac-DMQD-CHO (Alexis Biochemicals) o ZD (OMe) E (OMe) VD (OMe) -FMK (Alexis Biochemicals) o ZD (OMe) QMD (OMe) -FMK (Alexis Biochemicals)
  • Peptide and nonpeptide inhibitors of caspase 10 for example o Ac-AEVD-CHO (Alexis Biochemicals) o Z-AEVD-FMK (Alexis Biochemicals) Peptide and non-peptide inhibitors of other caspases or granzyme B and pan caspase inhibitors, for example o Z-VAD-FMK (Alexis Biochemicals) o Z-VAD (OMe) -FMK (Alexis Biochemicals) o Ac-YVAD-CHO (Calbiochem) o Z-YVAD-FMK (Calbiochem) o Z-VDVAD-FMK (Calbiochem) o Ac-LEVD-CHO (Calbiochem)
  • Antisense oligonucleotides which specifically attach to the DNA sequence or m-RNA sequence encoding a cellular caspase and inhibit their transcription or translation;
  • DsRNA oligonucleotides which are suitable for the targeted degradation of the mRNAs of a cellular caspase by RNAi technology according to the method as described by Tuschl et al. (Genes Dev 13: 3191-3197, 1999) and by Zamore et al. (Cell 101: 25-33, 2000); Antibodies or antibody fragments specific for a cellular caspase, or fusion proteins containing at least one antibody fragment, for example an Fv fragment, which inhibit the protease activity of at least one caspase;
  • Inhibitors which indirectly inhibit the expression or activation of cellular caspases in particular caspases 9, 3 and 8; Expression of proteins which inhibit caspases, for example the cellular inhibitors of apoptosis proteins cIAP1, cIAP2, the X-linked inhibitor of apoptosis protein XIAP, the anti-apoptotic protein Bcl-2 or the baculoviral protein p35;
  • Mitochondrial inhibitors such as the Bcl-2-modulating factor (WO 02/097094); Bcl-2 (WO 94/27426), mutated peptides derived from Bad (WO 02/20568), Bad (WO 96/13614), the BH3-interacting domain death agonist (WO 98/09980), Bax inhibitor proteins (WO 98/40397), and BLK genes and gene products (WO 99/50414);
  • Anti-apoptotic proteins of viruses for example the RI subunit of the herpes simplex virus (WO 00/07618) and of the influenza A virus NS1 protein,
  • the kinase MEKK1 and fragments thereof (WO 99/41385), modulators of the survivin (WO 01/64741), modulators of the inhibitor of apoptosis (WO 97/06182, WO 00/77201, WO 01/59108, WO 02/053586) and HIAP2 (WO 00/08144).
  • Specific inhibitors of the mitochondrial apoptosis pathway for example the low molecular weight Bid inhibitor BI-6C9 N- [4 - [(4-aminophenyl) thio] phenyl] -4 - [[(4-methoxyphenyl) sulfonyl] amino] butanamide (Fa SIGMA) or BAX inhibiting peptides V5 (Calbiochem) or BBMP mitochondrial (PTP) inhibitor (Sigma).
  • MAP kinase inhibitors preferably MAP kinase inhibitors, in particular the MAP kinase p38
  • the agents used according to the invention can be used in a concentration range from 5 nM to 400 ⁇ M.
  • chemical inhibitors in a concentration range of 5 nM to 100 .mu.M, preferably 10 nM to 50 .mu.m, can be used.
  • Peptidinhibitoren can For example, in a concentration range of 1 uM to 400 uM, preferably 10 uM to 250 uM, are used.
  • Clinically tested p38 inhibitors e.g. AMG 548, BIRB 796, VX 702, SCIO 469 and SCIO 323; U0126 [1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis (2-aminophenylthio) butadiene;
  • PD 184352 [2- (2-chloro-4-iodophenylamino-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluorobenzamide];
  • Inhibitors of the various isoforms of protein kinase C such as e.g. Bisindolylmaleimide (BIM), chelerythrine, edelfosine, ET18OCH3, H-7, HA-100, H89, HA-1004, Ro 31-8220, Ro-31-7549, Ro-31-8425, Ro-32-0432; Rottlerin, staurosporine (STS), quercetin, LY333531, CGP41251, Gö 6976, Gö 6983 and UCNOl;
  • Tetrapyrrolic macrocycles such as 5,10,15,20-tetraarylporphyrin and 5,10,15-triarylcorrole;
  • Dominant negative mutants of a kinase such as p38A> F or p38K> M or MKK6 (AIa) or combinations thereof within a kinase module, such as the MKK6 / p38-
  • Antisense oligonucleotides which are specific to the DNA sequence or
  • Fusion proteins which contain at least one antibody fragment, for example an Fv fragment, which inhibit the kinase activity of the kinase module;
  • Peptides which inhibit the interaction of the parent kinase with the downstream kinase or other substrate e.g. Peptides from the interaction domain of MKK6 with p38 and vice versa;
  • Inhibitors of the pro-apoptotic factors TRAIL and FasL e.g. o inhibitory antibodies to TRAIL or FasL; o soluble receptors for TRAIL (TRAIL-RI-TRAIL-R4 or combinations thereof) or FasL; o inhibitory antibodies against the receptors of TRAIL (Rl to R4) or Fas; FasL inhibitors such as FLINT or DcR3 or fragments thereof; o receptor-inhibitory fragments of TRAIL or FasL;
  • inhibitors of signal transduction triggered after receptor binding of TRAIL and FasL e.g. o Low molecular weight inhibitors or peptides that inhibit the interaction of TRAILR with FADD or the interaction of FADD with caspase 8; o antisense molecules or siRNA that inhibit the expression of signal transduction molecules such as FADD;
  • Apoptosis inhibitors preferably intracellular apoptosis inhibitors such as e.g. Interface inhibitors which inhibit the interaction of PB1-F2 with kinases, e.g. sequence-specific peptides.
  • Nucleoside or nucleotide analogs that result in chain termination reactions of viral polymerase-mediated RNA synthesis are used.
  • peptides or peptide fragments or derived therefrom structure-like low molecular weight inhibitors of the interaction of the viral polymerase complex or ribonucleoprotein complex with cellular proteins such as importin-beta 3, PARP-I and nucleophosmin (NPM) or the interaction of viral polymerase proteins, such as PBl with PB2 or PBI with PA, preferably derived from the interaction domains of the cellular interaction partners or the viral proteins PBl, PB2 or PA, are used.
  • Agents according to the invention are also peptides or peptide fragments or nucleic acid analogs or structure-derived low molecular weight inhibitors derived therefrom of the catalytic domain of the polymerase complex.
  • the agents used according to the invention can be used in a concentration range from 5 nM to 400 ⁇ M.
  • chemical inhibitors in a concentration range of 5 nM to 100 .mu.M, preferably 10 nM to 50 .mu.m, can be used.
  • Peptide inhibitors may be used, for example, in a concentration range from 1 ⁇ M to 400 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 250 ⁇ M.
  • Caspase 3 inhibitors which were described in the publication WO / 2004/085682 A2, can be used according to the invention in a concentration range of 5 nM to 400 uM.
  • chemical inhibitors in a concentration range of 5 nM to 100 .mu.M, preferably 10 nM to 50 .mu.m, can be used.
  • Peptide inhibitors may be used, for example, in a concentration range from 1 ⁇ M to 400 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 250 ⁇ M.
  • RNA interference mechanism RNA interference mechanism
  • RNA interference RNA / -
  • RNA interference RNA / -
  • mRNA messenger KNA
  • influenza viruses Since influenza viruses have a segmented RNA genome in a negative orientation, their replication requires a viral polymerase complex which circumscribes the RNA genome into mRNA for protein synthesis.
  • the PBl protein is a component of this complex.
  • the PB1 gene segment ie the same mRNA, also encodes the PB1-F2 protein.
  • RNAi interference for example, synthetically produced and for PBl and / or PB1-F2 m RNA complementary RNA nucleotides could be used.
  • siRNA and / or siRNA fragments can be introduced into cells by standard transfection reagents.
  • transf ⁇ zierbarer siRNA for example, 1 nM to 500 nM, preferably 10 nM to 300 nM, amount.
  • the invention includes the use of substances which prevent the PTPC-induced apoptosis (A) and / or the mitochondrial depolarization (B), for example:
  • Peptides or peptide fragments or structurally-derived low molecular weight inhibitors derived therefrom may also interact with PB1-F2 with cellular proteins such as VDAC, ANT3 or viral proteins such as PB1, preferably derived from the interaction domains of PB1-F2 with PBI, VDAC or ANT3 or the corresponding interacting regions from the cellular or viral interaction partners of PB1-F2.
  • the dose of the substances can be in a concentration range of 5 nM to 400 uM. lie.
  • chemical inhibitors in a concentration range of 5 nM to 100 .mu.M, preferably 10 nM to 50 .mu.m can be used.
  • Peptide inhibitors may be used, for example, in a concentration range from 1 ⁇ M to 400 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 250 ⁇ M.
  • Embodiment G Use of PBI-F2-Specific Antibodies and Vaccines
  • PB1-F2 mediated pathogenicity by means of specific antibodies was carried out by examination of IAV-infected mice using PBl-F2 specific antibodies and by vaccination with PB1-F2 "Füll length protein" or peptides to the experimental animals for to immunize a PB1-F2 enhanced IAV infection.
  • Antibodies against viral proteins such as PB1-F2 or the RNA-forming polymerase proteins PBl, PB2 and PA and the RNA-binding proteins NP and NS1 and antibodies against RNA-binding proteins are used.
  • Embodiment H Molecular inhibition of PB1-F2 oligomerization / inhibition of PB1-F2 oligomerization domains
  • the following substances can be used in a concentration range of 5 nM to 400 uM.
  • chemical inhibitors in a concentration range of 5 nM to 100 .mu.M, preferably 10 nM to 50 .mu.m, can be used.
  • Peptide inhibitors may be used, for example, in a concentration range from 1 ⁇ M to 400 ⁇ M, preferably 10 ⁇ M to 250 ⁇ M.
  • Low molecular weight inhibitors which inhibit amyloid oligomerization and fibril formation and could be transferred to PB1-F2 oligomerization, e.g.
  • Figure IA illustrates virus titers of MDCK cells at 9 hours after one
  • Figure IB illustrates virus titers of MDCK cells after treatment with a p38 inhibitor and DMSO as a control
  • Figure 2 illustrates virus titers of A549 cells at 9 and 24 hours after one
  • Figures 3 A and B show the results of in vivo phosphorylation of sPB1-F2 by SlO cell extract and the effect of PKC kinase inhibitors;
  • Figure 4A shows a comparison of the replication of wild-type virus and a Thr27Iso / Ser35Leu-PBI-F2 virus mutant as well as a PBI-F2 deficient one
  • Figure 4B illustrates the restricted caspase 3 activity of a Thr27Iso / Ser35Leu virus mutant as well as a PBI-F2 deficient mutant
  • Figures 5A and B illustrate virus titers of A549 cells after 8 and 24 hours, respectively, of a PB1-F2 specific siRNA, nonsense-siRN A (ns) and mock as control. embodiments
  • PB1-F2 variants have been shown to induce increased interferon ⁇ , TNF ⁇ and interleukin ⁇ secretion, suggesting that PB1-F2 may be involved, directly or indirectly, in the regulation of these genes (Conenello et al., 2007), for which the localization of PB1-F2 in the nucleus speaks.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • A549 cells stably-retrovirally transduced with a dominant-negative form of p38-activating kinase MKK6 (dnMKK6), as well as non-transduced cells with influenza virus A / FPV / Bratislava / 79 (H7N7) (FPV) infected (MOI 0.005).
  • dnMKK6 p38-activating kinase MKK6
  • H7N7 H7N7
  • the PI3 kinase control inhibitor Wortmannin showed no influence on the PB1-F2 phosphorylation even at high concentrations (FIG. 3B), as a result of which the
  • caspase 3 activity of the infected monocytes was measured in a commercial luciferase assay ( Figure 4B).
  • Caspase 3 activation is a central event of IAV-induced apoptosis, and it has previously been described that caspase 3 activation is essential for the propagation of influenza viruses (Ludwig et al., 2006; Wurzer et al. , 2003).
  • RNAz technology for the selective blocking of the PB1 / PB1-F2 mRNA leads to the inhibition of the influenza virus multiplication.
  • siRNA against the PBl mRNA was used.
  • siRNA is used to reduce virus titers (measured in plaque-forming units (PFU) per milliliter) by 75% (8 h after infection, FIG. 5A) or 80% (24 h after infection, FIG. 5B). in comparison to non-sense siRNA or for control (mock).
  • PFU plaque-forming units

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Abstract

Die Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung von Virusinfektionen. Sie betrifft insbesondere die Behandlung von Influenza A-Virusinfektionen. Influenza A-Virusinfektionen schließen solche Infektionen ein, die von Virusstämmen verursacht werden, die das Protein PB1-F2 exprimieren. Die Mittel zur Behandlung von Virusinfektionen enthalten als wirksame Komponente mindestens eine Substanz, welche die Aktivität des Proteins PB1-F2 reguliert oder hemmt. Ferner betrifft die Erfindung Impfstoffe zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektionen.

Description

Mittel zur Behandlung von Virusinfektionen
Beschreibung
[0001] Die Erfindung betrifft Mittel zur Behandlung von Virusinfektionen. Sie betrifft insbesondere die Behandlung von Influenza A- Virusinfektionen. Influenza A- Virusinfektionen schließen solche Infektionen ein, die von Virusstämmen verursacht werden, die das Protein PB1-F2 exprimieren. Sie betrifft ferner einen Impfstoff, welcher zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektionen verwendbar ist.
Stand der Technik
Das PB 1-F2 Protein
[0002] PB1-F2 wurde 2001 als elftes Influenza-Genprodukt identifiziert, das vom +1 Leserahmen des Influenza A- Virus- (IAV-) PBl -Gens kodiert wird, d.h. innerhalb des Leserahmens der viralen Polymerase 1 lokalisiert ist, und zunächst als proapoptotisch beschrieben wurde (Chen et al. 2001). Es wird angenommen, dass der alternative Leserahmen durch den Mechanismus des „ribosomalen scannings" exprimiert wird, einem hypothetischen Modell, in dem die 40S-Untereinheit des Ribosoms nach weiteren AUG-Triplets auch innerhalb eines Leserahmens „scannt", um die Translation zu initiieren, was mit dem Befund übereinstimmt, dass sich am Beginn des PB1-F2-Gens eine ideale Initiationssequenz befindet, die auch als Kozak-Sequenz bekannt ist (Kozak 1991). [0003] Das funktionell vollständige Protein hat ein Molekulargewicht von etwa 11,5 kD und schwankt in der Anzahl der Aminosäuren (AS), je nach Virusstamm variierend, zwischen 79 und 101 AS (Zell et al. 2007). Für den H INI -Influenza A- Virus- Subtyp gibt es noch eine Reihe verkürzter PB 1-F2- Varianten mit einer Länge von 57 Aminosäuren die jedoch bisher nicht näher beschrieben wurden (Zell et al. 2007). Die humanpathogen weniger relevanten Influenza B-Viren besitzen kein PB1-F2 und in Schweinen (Zwischenwirte) sind nur durch Stop-Codon-Mutationen verstümmelte PB 1-F2 -Varianten zu finden (Chen et al. 2007). Dagegen ist PB1-F2 in fast allen humanpathogenen Viren zu finden, einschließlich den hochpathogenen Isolaten der Vogelgrippe und der spanischen Grippe (Conennello et al. 2007). Es ist jedoch nicht nachgewiesen, ob alle Influenza-Stämme, die über einen vollständigen Leserahmen verfugen, auch tatsächlich das Protein exprimieren. [0004] Biochemisch und funktionell zeigt PB1-F2 Ähnlichkeiten zu anderen viralen Genprodukten, die als proapoptotisch beschrieben wurden, wie dem HTLV-Typ 1 -Protein pl3 (D'Agostino et al. 2002, Silic-Benussi et al. 2004) und dem HIV-1-Vpr (Muthumani et al. 2002, Sherman and Greene 2002). Diese so genannten akzessorischen viralen Proteine zeichnen sich vor allem dadurch aus, nicht essentiell für die Virusreplikation zu sein, aber wichtige Funktionen bezüglich der Pathogenität zu vermitteln. Kohärent hierzu führt eine Infektion mit PBl-F2-defizienten Viren zu einer verminderten Pathogenität in der Maus, zeigt aber keinerlei Einfiuss auf die Influenza- Virusreplikation in Zellkultur (Zamarin et al. 2006). [0005] PB1-F2 kann nach einer IAV-Infektion in den Mitochondrien, dem Zytoplasma und/oder dem Zellkern der Wirtszelle nachgewiesen werden. Wird das Protein transfiziert, kann es nicht im Kern lokalisieren, was darauf hindeutet, dass mindestens ein viraler Faktor nötig ist, um PB1-F2 in den Kern zu translozieren. PB1-F2 besitzt eine „mitochondrial targeting sequence" (MTS) im C-terminalen Bereich des Proteins, die für seine Lokalisation in den Mitochondrien essentiell ist (Gibbs et al. 2003).
[0006] Strukturell besitzt PB1-F2 eine C-terminale α-Helix, die sich von Ile55 bis Lys85 über alle bisher als funktionell identifizierten Regionen des Proteins erstreckt, einschließlich der MTS und den Oligomerisierungsdomänen, welche für die intrinsische Fähigkeit des Proteins verantwortlich sind, Dimere und Multimere zu generieren. Der N-Terminus (geringer helicaler Anteil) und der zentrale Abschnitt des Proteins sind unstrukturiert (Bruns et al. 2007). In infizierten Zellen wurde auch ein C-terminales, ca. 57 kD großes PB1-F2 Fragment beschrieben, das von einem weiteren alternativen Start-Codon in der PBl -Sequenz synthetisiert wird (Zamarin et al. 2006). Dabei ist es völlig unbekannt, ob dieses verkürzte Peptid eine biologische Funktion besitzt oder nur ein Zufallsprodukt ist.
[0007] Die pro apop totische Funktion von PB1-F2 wurde ausführlich untersucht. Die Expression des Proteins in Zellkultur ist nicht ausreichend, um Apoptose auszulösen (Chen et al. 2001), vielmehr hat das Protein einen verstärkenden Effekt auf den apoptotischen Zelltod in Verbindung mit zytotoxischen Stimuli (Zamarin et al. 2005). Als mitochondrialer Interaktionspartner von PB1-F2 gelten die Hauptkomponenten des „permeability transition pore complex" (PTPC), der den Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials reguliert, was zur Freisetzung von Cytochrom C und der Aktivierung apoptotischer Effektorcaspasen führt (Zamarin et al. 2005). In einer weiteren Studie wurde gezeigt, dass PB1-F2 direkt und unspezifisch Poren in Lipid-Doppellayer-Membranen verursachen kann (Chanturiya et al. 2004), was als alternativer Erklärungsversuch der durch PB1-F2 mitochondrial induzierten Apoptose betrachtet werden kann. Die exakten molekularen Mechanismen der PB 1-F2 -vermittelten Apoptose bleiben jedoch hypothetisch und ein direkter Zusammenhang zwischen verstärkter viraler Apoptose und erhöhter Pathogenität durch PB1-F2 konnte bisher noch nicht gezeigt werden (Zamarin et al. 2006). [0008] Die Funktion von PB1-F2 als spezifischer Pathogenitätsfaktor wurde bereits früh beschrieben, basierend auf einer verstärkten Disruption alveolarer Makrophagen durch IAV- Viren, die PB1-F2 exprimieren (Chen et al. 2001). Daraus entwickelte sich die Hypothese, dass das Protein indirekt zu einer erhöhten Pathogenität von Influenza- Viren beiträgt, indem es durch gezielte Schwächung der Immunabwehr Sekundärinfektionen erleichtert (Coleman 2007). Dabei sollte beachtet werden, dass die Sekundärinfektionen bei einer Influenzaerkrankung für die meisten Todesfälle verantwortlich sind (McCullers et al. 2006). Tatsächlich konnte in neueren Arbeiten gezeigt werden, dass die PB 1-F2 -Version aus einem hochpathogenen, pandemischen „spanische Grippe"-Isolat von 1918 signifikant zu einer verstärkten Pathogenese der virusinduzierten bakteriellen Pneumonie beiträgt (McAuley et al. 2007), die damals nur als Lungenentzündung bakteriellen Ursprungs diagnostiziert werden konnte, da Viren zu dieser Zeit noch nicht bekannt waren. Des Weiteren wurde im Mausmodell gezeigt, dass bereits ein singulärer Aminosäureaustausch in Position 66 von Asparagin zu Serin im C-Terminus von PB1-F2 völlig ausreichend ist, um aus einem Virus minderer Pathogenität ein hochpathogenes Virus zu generieren. Dieser Befund ist vor allem deshalb interessant, weil die Präsenz eines pathogenen PB1-F2-Moleküls für die Entstehung eines hochpathogenen Virus mitverantwortlich sein könnte. Tatsächlich befindet sich das PBl -Gen auf einem Segment, das durch virales „reassortment" an der Generierung der pandemischen Isolate von 1957 und 1968 beteiligt war (Kawaoka et al. 1989), was vermuten lässt, dass es einen direkten Zusammenhang zwischen PB1-F2 und der gesteigerten Virulenz gibt.
Aufgabe der Erfindung
[0009] Aufgabe der Erfindung ist, neue und/oder bessere Mittel zur Behandlung von Influenza-generierten Virusinfektionen zur Verfügung zu stellen. Lösung der Aufgabe
[0010] Die Aufgabe wird gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Sie wird ferner durch einen Impfstoff gemäß dem Anspruch 29 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand von Unteransprüchen.
[0011] Der Erfindung liegt die Beobachtung zugrunde, dass PB1-F2 als Phosphoprotein charakterisiert werden kann und damit Teil des komplexen Netzwerkes zellulärer Signaltransduktion und Phosphoregulation ist. [0012] Als eine Kinase, die in diesem Prozess beteiligt ist, wurde die Proteinkinase C (PKC) identifiziert, von der insgesamt 13 Subtypen bekannt sind (Li and Gobe 2006). Es wurde bereits beschrieben, dass die PKC- Aktivierung in der frühen Phase der IAV-Infektion erfolgt und PKC-Inhibitoren die virale Replikation inhibieren (Arora et al. 1998, Kunzelmann et al. 2000, Root et al. 1995, Root et al. 2000). Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung identifizierten Phosphorylierungsstellen sind im zentralen Bereich des Proteins lokalisiert, bei den Aminosäuren Threonin27 (Thr27) und Serin35 (Ser35), und sind damit in einer Region befindlich, die bisher noch nicht als funktionell relevant beschrieben wurde. Aufgrund aller bisherigen Erkenntnisse rückt die zentrale Bedeutung einer immunmodulatorischen Funktion von PB1-F2 in den Vordergrund. Bei der Aktivierung von Immunzellen spielt die PKC eine entscheidende Rolle, weshalb von einem Zusammenhang dieser Prozesse und der Phosphorylierung von PB1-F2 auszugehen ist.
[0013] Ferner konnte gezeigt werden, dass nach Mutation der Phosphorylierungsstellen das Virus in primären Monozyten schlechter repliziert und die infektionsbedingte Apoptoseinduktion um den Faktor 3-4 reduziert wird.
Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher beschrieben:
Ausführungsform A: [0014] Die Hemmung der PBl-F2-induzierten Apoptose erfolgt durch spezifische Aktivierung antiapoptotischer Faktoren, die gezielt in den mitochondrialen Apoptose- Pathway eingreifen oder durch (gezielte) Blockade der Cytochrom C-Freisetzung (induziert durch PB1-F2) aus den Mitochondrien, um die Aktivierung apoptotischer Effektorcaspasen zu unterbinden.
[0015] Die erfindungsgemäß verwendeten Mittel können in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 400 μM eingesetzt werden. Beispielsweise können chemische Inhibitoren in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 100 μM, vorzugsweise 10 nM bis 50μM, eingesetzt werden. Peptidinhibitoren können beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 1 μM bis 400 μM, vorzugsweise 10 μM bis 250 μM, eingesetzt werden.
[0016] Zu den Wirksubstanzen im Sinne der vorliegenden Erfindung gehören beispielsweise:
• Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren der Caspase 8, beispielsweise o Z-LE(OMe)TD(OMe)-FMK (Fa. Alexis Biochemicals) o Ac-ESMD-CHO (Fa. Alexis Biochemicals) o Ac-IETD-CHO (Fa. Alexis Biochemicals) o Z-IETD-FMK (Fa. Alexis Biochemicals)
• Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren der zellulären Caspase 3, wie beispielsweise o Z-DEVD-FMK (Fa. Alexis Biochemicals) o Ac-DEVD-CHO (Fa. Alexis Biochemicals) o Ac-DMQD-CHO (Fa. Alexis Biochemicals) o Z-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK (Fa. Alexis Biochemicals) o Z-D(OMe)QMD(OMe)-FMK (Fa. Alexis Biochemicals)
• Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren der Caspase 9, beispielsweise o Z-LE(Ome)HD(OMe)-FMK (Fa. Alexis Biochemicals) o Z-LEHD-FMK (Fa. Alexis Biochemicals) o Ac-LEHD-CHO (Fa. Alexis Biochemicals)
• Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren der Caspase 10, beispielsweise o Ac-AEVD-CHO (Fa. Alexis Biochemicals) o Z-AEVD-FMK (Fa. Alexis Biochemicals) • Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren anderer Caspasen bzw. Granzyme B- und pan- Caspase-Inhibitoren, beispielsweise o Z-VAD-FMK (Fa. Alexis Biochemicals) o Z-VAD(OMe)-FMK (Fa. Alexis Biochemicals) o Ac-YVAD-CHO (Fa. Calbiochem) o Z-YVAD-FMK (Fa. Calbiochem) o Z-VDVAD-FMK (Fa. Calbiochem) o Ac-LEVD-CHO (Fa. Calbiochem)
• Dominant negative Mutanten einer zellulären Caspase, im Besonderen der Caspasen 9, 8 und 3;
• Antisense-Oligonukleotide, welche sich spezifisch an die DNA-Sequenz oder m-RNA- Sequenz, kodierend für eine zelluläre Caspase, anlagern und deren Transkription oder Translation inhibieren;
• dsRNA-Oligonukleotide, die geeignet sind zur gezielten Degradierung der mRNAs einer zellulären Caspase durch die RNAi-Technologie entsprechend der Methode, wie von Tuschl et al (Genes Dev 13: 3191-3197, 1999) und von Zamore et al (Cell 101 : 25-33, 2000) beschrieben; • Antikörper oder Antikörperfragmente spezifisch für eine zelluläre Caspase, oder Fusionsproteine, enthaltend mindestens ein Antikörperfragment, beispielsweise ein Fv- Fragment, welche die Proteaseaktivität mindestens einer Caspase inhibieren;
• Inhibitoren, welche indirekt die Expression oder die Aktivierung von zellulären Caspasen, im Besonderen von Caspasen 9, 3 und 8, inhibieren; • Expression von Proteinen, welche hemmend auf Caspasen einwirken, beispielsweise die „cellular inhibitors of apoptosis"-Proteine cIAPl, cIAP2, das „X-linked inhibitor of apoptosis"-Protein XIAP, das antiapoptotische Protein Bcl-2 oder das baculovirale Protein p35;
• Mitochondriale Inhibitoren, wie der Bcl-2-modulating factor (WO 02/097094); Bcl-2 (WO 94/27426), mutierte Peptide abgeleitet von Bad (WO 02/20568), Bad (WO 96/13614), der BH3-interacting domain death agonist (WO 98/09980), Bax-Inhibitor- Proteine (WO 98/40397), und BLK-Gene und -Genprodukte (WO 99/50414);
• Modulatoren der Caspase 9/Apaf-l -Assoziation (W= 02/064128), Antisense-Modulatoren der Apaf-1 -Expression (WO 02/32921), Peptide zur Inhibition der Apoptose (WO 99/43701);
• Anti-apoptotische Proteine von Viren, beispielsweise der Rl -Untereinheit des Herpes- Simplex- Virus (WO 00/07618) und des Influenza A-Virus-NSl -Proteins,
• Die Kinase MEKKl und Fragmente hiervon (WO 99/41385), Modulatoren des Survivins (WO 01/64741), Modulatoren des Inhibitor of Apoptosis (WO 97/06182, WO 00/77201, WO 01/59108, WO 02/053586) und HIAP2 (WO 00/08144).
• spezifische Inhibitoren des mitochondrialen Apoptose-Pathways, beispielsweise der niedermolekulare Bid Inhibitor BI-6C9 N-[4-[(4-Aminophenyl)thio]phenyl]-4-[[(4- methoxyphenyl)sulfonyl]amino]-butanamid (Fa. SIGMA) oder BAX Inhibiting Peptide V5 (Calbiochem) oder BBMP mitochondrial (PTP) inhibitor (Sigma).
Ausfuhrungsform B:
Hemmung der Kinase/n die an der PB1-F2-Phosphorylierung beteiligt sind.
[0017] Experimente zeigen dosisabhängige Effekte bekannter PKC-Inhibitoren im Kontext einer IAV-Infektion unter Verwendung von IAV- Virus, das PB1-F2 exprimieren kann im Vergleich zu einem Virus das kein PB1-F2 exprimieren kann bzw. das eine PB1-F2-Mutante exprimiert, deren Phosphorylierungsstellen (Thr27 / Ser35) mutiert sind. (Dosiseffekte auf z.B. Replikation in Zellen, insbesondere Monozyten und Dosiseffekte der Inhibitoren auf die Induktion viraler Apoptose in Zellen, insbesondere Monozyten).
[0018] Als Inhibitoren werden Kinaseinhibitoren, vorzugsweise MAP-Kinase-Inhibitoren, insbesondere der MAP-Kinase p38, eingesetzt. Die erfindungsgemäß verwendeten Mittel können in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 400 μM eingesetzt werden. Beispielsweise können chemische Inhibitoren in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 100 μM, vorzugsweise 10 nM bis 50μM, eingesetzt werden. Peptidinhibitoren können beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 1 μM bis 400 μM, vorzugsweise 10 μM bis 250 μM, eingesetzt werden.
[0019] Beispielsweise können folgende Substanzen eingesetzt werden:
• SB203580 [4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfmylphenyl)-5-(4-pyridyl)lH-imidazol bzw. das Analogon SB202190;
• klinisch in Erprobung befindliche p38-Inhibitoren wie z.B. AMG 548, BIRB 796, VX 702, SCIO 469 und SCIO 323; • U0126 [l,4-Diamino-2,3-dicyano-l,4-bis(2-aminophenylthio) butadien;
• PD098059 [2-2'-Amino-3'-methoxyphenyl-oxanaphtalen-4-on)];
• PD 184352 [2-(2-Chlor-4-jodphenylamino-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluorbenzamid];
• 3-Aminomethylenindolin-Derivate, soweit sie nicht eye unabhängige Kinasen inhibieren;
• Mixed-lineage-Kinaseinhibitor CEP- 1347 (KT7515); • Inhibitoren des PI3K/Akt/mTOR-Signalwegs, wie Wortmannin, LY-294002, Rapamycin und CCI-779;
• Inhibitoren der verschiedenen Iso formen der Proteinkinase C, wie z.B. Bisindolylmaleimid (BIM), Chelerythrin, Edelfosin, ET18OCH3, H-7, HA-100, H89, HA-1004, Ro 31-8220, Ro-31-7549, Ro-31-8425, Ro-32-0432; • Rottlerin, Staurosporin (STS), Quercetin, LY333531, CGP41251, Gö 6976. Gö 6983 und UCNOl;
• Tetrapyrrolische Makrocyclen wie 5,10,15,20-Tetraarylporphyrin und 5,10,15- Triarylcorrol;
• Dominant negative Mutanten einer Kinase, wie p38 A>F oder p38 K>M oder MKK6 (AIa) bzw. Kombinationen hiervon innerhalb eines Kinasemoduls, wie des MKK6/p38-
Moduls
• Antisense-Oligonukleotide, welche sich spezifisch an die DNA-Sequenz oder
• m-RNA-Sequenz kodierend für eine Kinase eines Kinasemoduls anlagern und deren Transkription oder Translation inhibieren; • Antikörper- oder Antikörperfragmente spezifisch für eine Kinase eines Kinasemoduls,
• Fusionsproteine, die mindestens ein Antikörperfragment enthalten, beispielsweise ein Fv- Fragment, welche die Kinaseaktivität des Kinasemoduls inhibieren;
• Peptide, welche die Interaktion der übergeordneten Kinase mit der nachgeschalteten Kinase oder eines anderen Substrats inhibieren, z.B. Peptide aus der Interaktionsdomäne von MKK6 mit p38 und umgekehrt;
• Inhibitoren der proapoptotischen Faktoren TRAIL und FasL, wie z.B. o inhibitorische Antikörper gegen TRAIL oder FasL; o lösliche Rezeptoren für TRAIL (TRAIL-Rl -TRAIL-R4 oder Kombinationen hiervon) oder FasL; o inhibitorische Antikörper gegen die Rezeptoren von TRAIL-(Rl bis R4) oder Fas; o FasL-Inhibitoren wie FLINT oder DcR3 oder Fragmente hiervon; o Rezeptor-inhibitorische Fragmente von TRAIL oder FasL;
• Inhibitoren der Signaltransduktion ausgelöst nach Rezeptorbindung von TRAIL und FasL, wie z.B. o Niedermolekulare Inhibitoren oder Peptide, die die Interaktion von TRAILR mit FADD oder die Interaktion von FADD mit Caspase 8 hemmen; o Antisense-Moleküle oder siRNA, welche die Expression von Signaltransduktionsmolekülen wie FADD hemmen;
• Apoptoseinhibitoren, bevorzugt intrazelluläre Apoptoseinhibitoren wie z.B. Interface- Inhibitoren, welche die Wechselwirkung von PB1-F2 mit Kinasen inhibieren, z.B. sequenzspezifische Peptide.
Ausführungsform C:
Hemmung der Wechselwirkung mit der viralen Polymerase (PBl).
[0020] Nucleosid- oder Nucleotidanaloga, die zu Kettenabbruchreaktionen der viralen Polymerase- vermittelten RNA-Synthese führen, werden verwendet. [0021] Außerdem können Peptide oder Peptidfragmente oder hiervon abgeleitete strukturähnliche niedermolekulare Hemmstoffe der Interaktion des viralen Polymerasekomplexes oder des Ribonucleoproteinkomplexes mit zellulären Proteinen wie Importin-beta 3, PARP-I und Nucleophosmin (NPM) oder der Interaktion viraler Polymeraseproteine, wie PBl mit PB2 oder PBl mit PA, bevorzugt abgeleitet aus den Interaktionsdomänen der zellulären Interaktionspartner oder der viralen Proteine PBl, PB2 oder PA, eingesetzt werden.
[0022] Erfindungsgemäße Mittel sind weiterhin Peptide oder Peptidfragmente oder Nucleinsäureanaloga oder hiervon abgeleitete strukturähnliche niedermolekulare Hemmstoffe der katalytischen Domäne des Polymerasekomplexes. Die erfindungsgemäß verwendeten Mittel können in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 400 μM eingesetzt werden. Beispielsweise können chemische Inhibitoren in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 100 μM, vorzugsweise 10 nM bis 50μM, eingesetzt werden. Peptidinhibitoren können beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 1 μM bis 400 μM, vorzugsweise 10 μM bis 250 μM, eingesetzt werden.
Ausführungsform D:
Hemmung des Kernimports von PB1-F2 durch kernporenspezifische Inhibitoren.
[0023] Caspase 3 -Inhibitoren, die in der Offenlegungsschrift WO/2004/085682 A2 beschrieben wurden, können erfindungsgemäß in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 400 μM eingesetzt werden. Beispielsweise können chemische Inhibitoren in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 100 μM, vorzugsweise 10 nM bis 50μM, eingesetzt werden. Peptidinhibitoren können beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 1 μM bis 400 μM, vorzugsweise 10 μM bis 250 μM, eingesetzt werden.
Ausführungsform E:
Hemmung der PB1-F2 Expression und Reduktion der PB1-F2 vermittelten Pathogenität durch den RNA-Interferenz-Mechanismus (RNAi).
[0024] Durch die RNA interference- (RNA/-) Technologie kann die Translation bestimmter Proteine selektiv inhibiert werden. Dazu wird eine so genannte small interfering-KNA (siRNA) verwendet, die mit der messenger-KNA (mRNA) des zu inhibierenden Proteins hybridisiert und auf diese Weise zur Degradation der mRNA oder zur Blockierung der Translation führt.
[0025] Da Influenza- Viren ein segmentiertes RNA-Genom in negativer Orientierung aufweisen, wird für ihre Replikation ein viraler Polymerase-Komplex benötigt, der das RNA- Genom in mRNA für die Proteinsynthese umschreibt. Das PBl -Protein ist ein Bestandteil dieses Komplexes. Auf dem Gensegment des PBl, also von der gleichen mRNA, wird ebenfalls das PB1-F2-Protein kodiert.
[0026] Zur Induktion der RNAi Interferenz könnten beispielsweise synthetisch hergestellte und zur PBl- und/oder PB1-F2 m-RNA komplementäre RNA-Nukleotide eingesetzt werden. siRNA und/oder siRNA-Fragmente können beispielsweise durch gängige Transfektionsreagenzien in Zellen eingebracht werden.
[0027] Geeignete Konzentrationen an transfϊzierbarer siRNA können beispielsweise 1 nM bis 500 nM, bevorzugterweise 10 nM bis 300 nM, betragen.
Ausführungsform F:
Hemmung der Wechselwirkung mit zellulären Faktoren (VDAC, PTPC).
[0028] Zur Erfindung gehört die Verwendung von Substanzen, welche die PTPC-induzierte Apoptose (A) und/oder die mitochondriale Depolarisation (B) verhindern, z.B.:
• (A) Exogene Faktoren: CsA (cyclosporine A), D609, Dibucain, Flupirtin, Propranolol, Propargylamine, Valproinsäure;
• Endogene Faktoren: L-Carnitin, Melatonin;
• (B) Exogene Faktoren: Diazoxid, Minocyclin; • Endogene Faktoren: Creatin, Cyclocreatin, Östrogen.
[0029] Es können auch Peptide oder Peptidfragmente oder hiervon abgeleitete strukturähnliche niedermolekulare Hemmstoffe der Interaktion von PB1-F2 mit zellulären Proteinen wie VDAC, ANT3 oder viralen Proteinen wie PBl, bevorzugt abgeleitet aus den Interaktionsdomänenen von PB1-F2 mit PBl, VDAC oder ANT3 oder den entsprechenden interagierenden Bereichen aus den zellulären oder viralen Interaktionspartnern von PB1-F2, Verwendung finden. [0030] Die Dosis der Substanzen kann in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 400 μM. liegen. Beispielsweise können chemische Inhibitoren in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 100 μM, vorzugsweise 10 nM bis 50μM, eingesetzt werden. Peptidinhibitoren können beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 1 μM bis 400 μM, vorzugsweise 10 μM bis 250 μM, eingesetzt werden.
Ausfuhrungsform G: Verwendung von PBl-F2-spezifischen Antikörpern und Impfstoffen
[0031] Die Auswirkungen auf die PB1-F2 vermittelte Pathogenität mittels spezifischer Antikörper erfolgte durch Untersuchung von IAV-infizierten Mäusen unter Einsatz von PBl- F2 spezifischen Antikörpern und durch Vakzinierung mit PB1-F2 „Füll length protein" oder Peptiden, um die Versuchstiere für eine PB1-F2 verstärkte IAV-Infektion zu immunisieren.
[0032] Es werden Antikörper gegen virale Proteine wie PB1-F2 oder die RNA-bildenden Polymeraseproteine PBl, PB2 und PA sowie die RNA-bindenden Proteine NP und NSl sowie Antikörper gegen RNA-bindende Proteine, verwendet.
Ausfuhrungsform H: Molekulare Inhibition der PB1-F2-Oligomerisierung / Inhibierung der PB1-F2-Oligomerisierungsdomänen
[0033] Folgende Substanzen können in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 400 μM eingesetzt werden. Beispielsweise können chemische Inhibitoren in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 100 μM, vorzugsweise 10 nM bis 50μM, eingesetzt werden. Peptidinhibitoren können beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 1 μM bis 400 μM, vorzugsweise 10 μM bis 250 μM, eingesetzt werden.
• Interface-Inhibitoren, welche die Oligomerisierung von PB1-F2 in Membranen blockieren.
• Peptide, welche die PB1-F2 Oligomerisierungsdomänen funktionell blockieren.
• Niedermolekulare Inhibitoren, welche die Amyloid-Oligomerisierung und Fibrillenausbildung inhibieren und auf die PB1-F2-Oligomerisierung übertragen werden könnten, z.B.
• Hemin, Rolitetracyclin, Azure C, Meclocyclinsulfosalicylat, Apigenin. • Ionenkanal-Inhibitoren, welche die Membranporenaktivität von PB1-F2 blockieren.
[0034] Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher beschrieben werden, ohne sie auf diese Beispiele zu reduzieren.
Es gilt:
Fig. IA veranschaulicht Virustiter von MDCK-Zellen nach 9 Stunden nach einer
Behandlung mit p38-Inhibitoren oder DMSO als Kontrolle;
Fig. IB veranschaulicht Virustiter von MDCK-Zellen nach einer Behandlung mit einem p38-Inhibitor und DMSO als Kontrolle;
Fig. 2 veranschaulicht Virustiter von A549-Zellen nach 9 und 24 Stunden nach einer
Behandlung mit p38-Inhibitoren oder nicht-transfiziert als Kontrolle;
Fig. 3 A und B zeigen die Ergebnisse einer in vzYro-Phosphorylierung von sPBl-F2 mittels SlO-Zellextrakt und den Effekt von PKC Kinase-Inhibitoren;
Fig. 4A zeigt einen Vergleich der Replikation von Wildtyp-Virus und einer Thr27Iso/Ser35Leu-PBl-F2-Virusmutante sowie einer PBl-F2-defizienten
Mutante (delta PB1-F2) nach der Infektion von primären humanen Monozytenzellen;
Fig. 4B veranschaulicht die eingeschränkte Caspase 3-Aktivität einer Thr27Iso/Ser35Leu-Virus-Mutante sowie einer PBl-F2-defizienten Mutante
(delta PB1-F2) im Vergleich zum Wildtyp-Virus;
Fig. 5A und B veranschaulichen Virustiter von A549-Zellen nach 8 bzw. 24 Stunden nach einer PB1-F2 spezifischen siRNA, nonsense- siRN A (n.s.) und mock als Kontrolle. Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 :
[0035] Im Mausmodell wurde gezeigt, dass pathogene PB 1-F2 -Varianten eine gesteigerte Interferon γ-, TNF α- und Interleukin ß-Sekretion induzieren, was darauf schließen lässt, dass PB1-F2 möglicherweise direkt oder indirekt an der Regulation dieser Gene beteiligt ist (Conenello et al. 2007), wofür auch die Lokalisation von PB1-F2 im Zellkern spricht.
Beispiel 2:
[0036] Der in der Einleitung beschriebene Austausch der Aminosäure Asn66 zu Ser, der in den PB1-F2-Proteinen hochpathogener IAV- Viren zu finden ist, lässt den Schluss zu, dass das Protein eine neue potenzielle Phosphorylierungsstelle erhält. Nach Sequenzanalysen konnten wir zeigen, dass sich durch den Aminosäureaustausch in Position 66 von PB1-F2 eine Bindestelle für die p38-MapKinase (MAPK) ergibt, welche nach einer Influenza-Infektion für die positive Regulation der zuvor erwähnten Zytokine von entscheidender Bedeutung ist (Ludwig et al. 2006). Insofern war zu prüfen, ob die Inhibition der p38-MAPK oder deren Aktivatorkinase MKK6 zu einer Hemmung der Virusvermehrung führt. Hierzu wurden MDCK-Zellen mit den p38-Inhibitoren SB203580 und SB202190 oder mit Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kontrolle, für 30 Minuten in Konzentrationen von 10 μM (Figur IA) bzw. 30 μM (Figur IB) vorinkubiert. Anschließend erfolgte die Infektion (Multip lizität der Infektion (MOI) = 0,002) mit dem Influenza- Virus A/FPV/Bratislava/79 (H7N7). Das nach der Infektion verwendete Infektionsmedium enthielt wieder die jeweiligen SB-Inhibitoren oder DMSO als Kontrolle. Nach 9 h (Figur 1 A, B) oder nach 24 h und 36 h (Figur IB) wurde der virushaltige Mediumüberstand entnommen und der Virustiter (pfu, plaque-forming units/ml) mittels Plaque- Assay auf MDCK-Zellen bestimmt.
[0037] In einem alternativen Ansatz wurden A549-Zellen, die mit einer dominant-negativen Form der p38-aktivierenden Kinase MKK6 (dnMKK6) stabil-retroviral-transduziert wurden, sowie nicht-transduzierte Zellen mit dem Influenza- Virus A/FPV/Bratislava/79 (H7N7) (FPV) infiziert (MOI =0,005). Nach 9 h und 24 h wurde der virushaltige Mediumüberstand entnommen und der Virustiter mittels Plaque- Assay auf MDCK-Zellen bestimmt (Figur 2). [0038] Im Ergebnis zeigten beide Ansätze, dass Hemmung des MKK6/p38-Signalwegs zu signifikant reduzierten Titern von Nachkommenviren führt (Figur 1 und 2). Eine Hemmung der Phosphorylierung an Ser66 des PB1-F2-Proteins in hochpathogenen IAV-Stämmen legt die Hemmung der Pathogenität nahe.
Beispiel 3 :
[0039] Die in vzYro-Phosphorylierung von sPB-F2 wurde unter Verwenden von zytoplasmatischem SlO-Zellextrakt aus HeLa-Zellen untersucht. Die Inkubation von sPBl-F2 mit [γ-32]ATP und S10-Extrakt führte zu einer deutlichen Phosphorylierung des Proteins, die dosisabhängig durch Staurosporin (STS) bzw. Bisindolylmaleimid (BIM) gehemmt werden konnte (Figur 3A). BIM ist ein selektiverer Inhibitor, der die konventionellen PKC-Iso formen inhibiert (Gescher, 1998; Toullec et al, 1991).
[0040] Der PI3-Kinase-Kontroll-Inhibitor Wortmannin zeigte selbst in hohen Konzentrationen keinen Einfluss auf die PB1-F2 Phosphorylierung (Figur 3B), wodurch die
Selektivität der PKC-Inhibitoren für die Inhibition der PB1-F2-Phosphorylierung erneut bestätigt wurde.
Beispiel 4:
[0041] Es wurde untersucht, inwieweit die Integrität der PB1-F2-Phosphorylierungsstellen für die Aminosäuren Threonin 27 (Thr27) und Serin 35 (Ser35) für eine effiziente Virusreplikation in primären humanen Monozyten von Bedeutung ist. Es wurden mehrere Replikationsversuche mit aufgereinigten humanen Monozyten durchgeführt. Figur 4A zeigt ein solches Replikationsexperiment. Für 24 bis 36 Stunden nach der Infektion (MOI=2) wurden von den mit Wildtyp-Virus infizierten Zellen deutlich mehr infektiöse Partikel gebildet als von den Zellen die mit den Phosphorylierungsstellen-mutierten Viren oder der PBl-F2-defizienten Mutante infiziert wurden. Daraus kann geschlossen werden, dass die Phosphorylierung der Aminosäuren Thr27 und Ser35 für eine effiziente IAV-Replikation in diesen Zellen von Bedeutung ist. Um den Einfluss der PB1-F2-Phosphorylierung auf die virale Apoptoseinduktion zu untersuchen, wurde die Caspase 3 -Aktivität der infizierten Monozyten in einem kommerziellen Luziferaseassay gemessen (Figur 4B). [0042] Die Aktivierung der Caspase 3 ist ein zentrales Ereignis der IAV-induzierten Apoptose und es wurde zuvor beschrieben, dass die Caspase 3 -Aktivierung für die Vermehrung von Influenza- Viren essentiell ist (Ludwig et al., 2006; Wurzer et al., 2003). Die Messung der Caspase 3-Aktivität für 24 h nach der Infektion (MOI=0,5) zeigt, dass das Wildtyp-Virus, welches in der Lage ist das funktionelle PB1-F2-Protein zu exprimieren, eine 3-4 fach stärkere Caspase 3-Aktivität induziert als die mutierten Viren, die für die PKC- Phosphorylierungsstellen in Position Thr27 und Ser35 mutiert sind (Figur 4B). Die eingeschränkte Apoptoseinduktion ist vergleichbar mit einer Virusmutante die nicht mehr in der Lage ist, PB1-F2 zu exprimieren (deltaPBl-F2). Zusammen genommen kann aus den Abbildungen 3 A und B sowie 4 A und B geschlossen werden, dass eine Hemmung der Phosphorylierung von PB1-F2 an Thr27 und/oder Ser35 durch die PCK sowohl die effektive Virusreplikation hemmt als auch eine PBl-F2-induzierte Apoptoseinduktion verhindert.
Beispiel 5 :
[0043] Die Anwendung der RNAz-Technologie zur selektiven Blockierung der PB1/PB1-F2- mRNA führt zur Inhibition der Influenza Virus-Vermehrung.
[0044] Um einen möglichen negativen Einfluss von PBl/PBl-F2-spezifϊscher siRNA auf die virale Replikation zu untersuchen, wurde eine siRNA gegen die PBl-mRNA, und damit auch gegen die mRNA für PB1-F2, verwendet. Humane Lungenepithelzellen (A549) wurden hierzu mit der siRNA PBl (250 pmol) oder einer Kontroll-siRNA (n.s. = non-sense) an zwei aufeinander folgenden Tagen transfϊziert. 24 h nach der letzten Trans fektion wurden die Zellen mit dem humanen Influenza- Virus A/Puerto Rico/8/34 (HlNl; PR8) (Multip lizität der Infektion (MOI) = 0,5) infiziert. Zellüberstände wurden 8 h (Figur IA) und 24 h (Figur 5A) nach der Infektion auf den Gehalt an infektiösen Nachkommenviren im Plaque-Assay untersucht. Im Ergebnis zeigt sich, dass die Virusreplikation durch die siRNA, die gegen die mRNA für PB1/PB1-F2 gerichtet ist, gehemmt werden kann. Durch die siRNA erfolgt eine Reduktion der Virustiter (gemessen in Plaque-bildenden Einheiten (plague forming units, PFU) pro Milliliter) um 75% (8 h nach Infektion, Figur 5A) bzw. 80 % (24 h nach Infektion, Figur 5B) im Vergleich zur non-sense-siRNA oder zur Kontrolle (mock).
Abkürzungen HTLV Humanes T-Zell-lymphotropes Virus
Vpr regulatorisches Virusprotein R des Humanen Immunodefizienzvirus
HIV Humanes Immunodefizienzvirus
IAV Influenza- A- Virus
FasL Fas-Ligand
FLINT
DcR3 Decoy Receptor 3
TRAILR
FADD Fas (TNFRSFβ)-associated Via Death Domain Antikörper
PARP-I
VDAC
PTPC
ANT3

Claims

Patentansprüche
1. Mittel zur Behandlung von Virusinfektionen, die als wirksame Komponente mindestens eine Substanz enthalten, welche die Aktivität des Proteins PB1-F2 reguliert oder hemmt.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Virusinfektionen um Influenza- Virusinfektionen, insbesondere um Influenza- A- Virusinfektionen, handelt.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, welche die Phosphorylierung des Proteins PB1-F2 hemmen.
4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Inhibitoren von Caspase handelt, insbesondere um
4.1. Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren der Caspase 8, wie
4.1.1. Z-LE(OMe)TD(OMe)-FMK oder
4.1.2. Ac-ESMD-CHO oder
4.1.3. Ac-IETD-CHO oder
4.1.4. Z-IETD-FMK oder
4.1.5. Kombinationen aus mindestens 2 der unter 4.1.1. bis 4.1.4 genannten Substanzen oder
4.2. Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren der zellulären Caspase 3, wie
4.2.1. Z-DEVD-FMK oder
4.2.2. Ac-DEVD-CHO oder
4.2.3. Ac-DMQD-CHO oder
4.2.4. Z-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK oder
4.2.5. Z-D(OMe)QMD(OMe)-FMK oder
4.2.6. Kombinationen aus mindestens 2 der unter 4.2.1. bis 4.2.5 genannten Substanzen oder
4.3. Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren der Caspase 9, wie
4.3.1. Z-LE(0me)HD(0Me)-FMK oder
4.3.2. Z-LEHD-FMK oder
4.3.3. Ac-LEHD-CHO oder
4.3.4. Kombinationen aus mindestens 2 der unter 4.3.1. bis 4.3.3 genannten Substanzen oder
4.4. Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren der Caspase 10, wie
4.4.1. Ac-AEVD-CHO oder
4.4.2. Z-AEVD-FMK oder
4.4.3. Kombinationen aus Ac-AEVD-CHO und Z-AEVD-FMK oder
4.5. Peptid- und Nichtpeptid-Inhibitoren anderer Caspasen, insbesondere Granzyme B und pan-Caspase-Inhibitoren, wie
4.6.1. Z-VAD-FMK oder
4.6.2. Z-VAD(OMe)-FMK oder
4.6.3. Ac-YVAD-CHO oder
4.6.4. Z-YVAD-FMK oder
4.6.5. Z-VDVAD-FMK oder
4.6.6. Ac-LEVD-CHO oder
4.6.7. Kombinationen aus mindestens 2 der unter 4.6.1. bis 4.6.6 genannten Substanzen.
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um
5.1. dominant negative Mutanten einer zellulären Caspase, insbesondere der Caspasen 9, 8 und 3 oder
5.2. Antisense-Oligonukleotide, welche sich spezifisch an die DNA-Sequenz oder m- RNA-Sequenz kodierend für eine zelluläre Caspase anlagern und deren Transkription oder Translation inhibieren oder
5.3. dsRNA-Oligonukleotide, die geeignet sind zur gezielten Degradierung der mRNAs einer zellulären Caspase durch die RNAi-Technologie oder
5.4. Antikörper oder Antikörperfragmente, spezifisch für eine zelluläre Caspase oder Fusionsproteine, die mindestens ein Antikörperfragment enthalten, insbesondere ein Fv-Fragment und die Proteaseaktivität mindestens einer Caspase inhibieren oder
5.5. Inhibitoren, welche indirekt die Expression oder die Aktivierung von zellulären Caspasen, insbesondere von Caspasen 9, 3 und 8, inhibieren oder
5.6. Proteine, die hemmend auf Caspasen einwirken, wie die „cellular inhibitors of apoptosis"-Proteine cIAPl, cIAP2, das „X-linked inhibitor of apoptosis"-Protein XIAP, das antiapoptotische Protein Bcl-2 oder das baculovirale Protein p35 oder
5.7. Mitochondriale Inhibitoren, wie der Bcl-2-modulating factor, Bcl2, mutierte Peptide abgeleitet von Bad, der BH3-interacting domain death agonist, das Bax- Inhibitorprotein oder BLK-Gene und deren Genprodukte oder
5.8. Modulatoren der Caspase 9/Apaf- 1 -Assoziation, Antisense-Modulatoren der Apaf- 1 - Expression oder Peptide zur Inhibition der Apoptose oder
5.9. Anti-apoptotische Proteine von Viren ,wie die Rl -Untereinheit des Herpes-Simplex- Virus oder das Influenza A-Virus-NS 1 -Protein oder
5.10. die Kinase MEKKl und Fragmente hiervon oder Modulatoren des Survivins oder, Modulatoren des Inhibitor of Apoptosis oder HIAP2 oder
5.11. spezifische Inhibitoren des mitochondrialen Apoptose-Pathways, wie der niedermolekulare Bid-Inhibitor BI-6C9 N-[4-[(4-Aminophenyl)thio]phenyl]-4-[[(4- methoxyphenyl)sulfonyl]amino]-butanamid oder BAX Inhibiting Peptide V5 oder BBMP mitochondrial (PTP) inhibitor handelt.
6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Kinaseinhibitoren, insbesondere der MAP-Kinase p38 und/oder der Proteinkinase C handelt, wie mindestens eine der folgenden Substanzen:
6.1. SB203580 [4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfmylphenyl)-5-(4-pyridyl)lH- imidazol bzw. das Analogon SB202190
6.2. p38-Inhibitoren wie z.B., AMG 548, BIRB 796, VX 702, SCIO 469 und SCIO 323
6.3. UO 126 [l,4-Diamino-2,3-dicyano-l,4-bis(2aminophenylthio)butadien,
6.4. PD098059 [2-2'-amino-3'-methoxyphenyl)-oxanaphtalen-4-on),
6.5. PD 184352 [2-(2-chlor-4-jodphenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluor benzamid
6.6. 3 - Aminomethylenindo lin-Derivate
6.7. Mixed-lineage-Kinaseinhibitor CEP- 1347 (KT7515)
6.8. Inhibitoren des PI3K/Akt/mTOR- Signalwegs, wie Wortmannin, LY-294002, Rapamycin und CCI-779
6.9. Inhibitoren der verschiedenen Isoformen der Proteinkinase C, wie Bisindolylmaleimid (BIM), Chelerythrin, Edelfosin, ET18OCH3, H-7, HA-100, H89, HA-1004, Ro 31-8220, Ro-31-7549, Ro-31-8425, Ro-32-0432
6.10. Rottlerin, Staurosporin (STS), Quercetin, LY333531, CGP41251, Gö 6976. Gö 6983, und UCNOl
6.11. Tetrapyrrolische Makrocyclen wie 5,10,15,20-Tetraarylporphyrin und 5,10,15- Triarylcorrol
6.12. Dominant negative Mutanten einer Kinase, wie p38 A>F oder p38 K>M, oder MKK6 (AIa) bzw. Kombinationen hiervon innerhalb eines Kinasemoduls, wie des MKK6/p38-Moduls
6.13. Antisense-Oligonukleotide, welche sich spezifisch an die DNA-Sequenz oder m- RNA Sequenz kodierend für eine Kinase eines Kinasemoduls anlagern und deren Transkription oder Translation inhibieren
6.14. Antikörper- oder Antikörperfragmente spezifisch für eine Kinase eines Kinasemoduls oder Fusionsproteine, enthaltend mindestens ein Antikörperfragment, wie ein Fv-Fragment, welche die Kinaseaktivität des Kinasemoduls inhibieren.
6.15. Peptide, welche die Interaktion der übergeordneten Kinase mit der nachgeschalteten Kinase oder eines anderen Substrats inhibieren, z.B. Peptide aus der Interaktionsdomäne von MKK6 mit p38 und umgekehrt.
7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Inhibitoren handelt, welche Subtypen von Kinasen, vorzugsweise MAP-Kinasen, insbesondere der MAP- Kinase p38, hemmen.
8. Mittel nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Staurosporin oder Bisindolylmaleiimid handelt
9. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um 9.1. Inhibitoren der proapoptotischen Faktoren TRAIL und FasL, wie mindestens eine der folgenden Substanzen:
9.1.1. inhibitorische Antikörper gegen TRAIL oder FasL
9.1.2. lösliche Rezeptoren für TRAIL (TRAIL-Rl -TRAIL-R4 oder Kombinationen hiervon) oder FasL
9.1.3. inhibitorische Antikörper gegen die Rezeptoren von TRAIL-(Rl bis R4) oder Fas
9.1.4. FasL-Inhibitoren wie FLINT oder DcR3 oder Fragmente hiervon
9.1.5. Rezeptor-inhibitorische Fragmente von TRAIL oder FasL
9.2. Inhibitoren der Signaltransduktion ausgelöst nach Rezeptorbindung von TRAIL und FasL, wie
9.2.1. Niedermolekulare Inhibitoren oder Peptide, die die Interaktion von TRAILR mit FADD oder die Interaktion von FADD mit Caspase 8 hemmen oder
9.2.2. Antisense-Moleküle oder siRNA, welche die Expression von Signaltransduktionsmolekülen wie FADD hemmen, handelt.
10. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Apoptoseinhibitoren, insbesondere intrazelluläre Apoptoseinhibitoren, wie Interface- Inhibitoren, welche die Wechselwirkung von PB1-F2 mit Kinasen inhibieren, vorzugsweise sequenzspezifϊsche Peptide, handelt.
11. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um
11.1. Nucleosid- oder Nucleotidanaloga, die zu Kettenabbruchreaktionen der viralen Polymerase- vermittelten RNA Synthese führen, oder
11.2. Peptide oder Peptidfragmente oder hiervon abgeleitete strukturähnliche niedermolekulare Hemmstoffe der Interaktion des viralen Polymerasekomplexes oder des Ribonucleoproteinkomplexes mit zellulären Proteinen wie Importin-beta 3, PARP-I und Nucleophosmin (NPM) oder der Interaktion viraler Polymeraseproteine, wie PBl mit PB2 oder PBl mit PA, bevorzugt abgeleitet aus den Interaktionsdomänen der zellulären Interaktionspartner oder der viralen Proteine PBl, PB2 oder PA) handelt.
12. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um zur PBl- und/oder PBl-F2-mRNA-sequenzspezifische siRNA handelt.
13. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, welche die PTPC-induzierte Apoptose (A) oder die mitochondriale Depolarisation (B) verhindern, wie
13.1. (A) Exogene Faktoren: CsA (cyclosporine A), D609, Dibucain, Flupirtin, Propranolol, Propargylamine, Valproinsäure oder
13.2. Endogene Faktoren: L-Carnitin, Melatonin, oder
13.3. (B) Exogene Faktoren: Diazoxid, Minocyclin oder
13.4. Endogene Faktoren: Creatin, Cyclocreatin, Östrogen
14. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Peptide oder Peptidfragmente oder hiervon abgeleitete strukturähnliche niedermolekulare Hemmstoffe der Interaktion von PB1-F2 mit zellulären Proteinen handelt, wie VDAC, ANT3 oder viralen Proteinen wie PBl, bevorzugt abgeleitet aus den Interaktionsdomänen von PB1-F2 mit PBl, VDAC, oder ANT3 oder den entsprechenden interagierenden Bereichen aus den zellulären oder viralen Interaktionspartnern von PB1-F2.
15. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Antikörper gegen virale Proteine wie PB1-F2 oder das RNA-bildende Polymeraseprotein PBl handelt.
16. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um mindestens eine der folgenden Substanzen handelt:
16.1. Interface-Inhibitoren, welche die Oligomerisierung von PB1-F2 in Membranen blockieren
16.2. Peptide, welche die PB1-F2 Oligomerisierungsdomänen funktionell blockieren
16.3. Niedermolekulare Inhibitoren, welche die Amyloid Oligomerisierung und Fibrillenausbildung inhibieren und auf die PB1-F2-Oligomerisierung übertragen werden könnten, z.B.
16.4. Hemin, Rolitetracyclin, Azure C, Meclocyclinsulfosalicylat, Apigenin
16.5. Ionenkanal-Inhibitoren, welche die Membranporenaktivität von PB 1 -F2 blockieren.
17. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, welche die PBl-F2-induzierte Apoptose hemmen.
18. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, die antiapoptotische Faktoren, die gezielt in den mitochondrialen Apoptose-Pathway eingreifen, spezifisch aktivieren.
19. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, welche die durch PB1-F2 induzierte Cytochrom C-Freisetzung gezielt blockieren.
20. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, welche die an der Phosphorylierung von PB1-F2 beteiligte/n Kinase/n hemmen.
21. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, welche die Wechselwirkung der viralen Polymerase mit PB1-F2 hemmen.
22. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, die den Kernimport von PB1-F2 hemmen.
23. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, welche die PB1-F2-Expression und/oder die PB1-F2 vermittelte Pathogenität hemmen.
24. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, die den RNA-Interferenz-Mechanismus aktivieren.
25. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Substanzen handelt, welche die Wechselwirkung von PB1-F2 mit zellulären Faktoren wie VDAC oder PTPC hemmen.
26. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um gegen PB1-F2 gerichtete Antikörper handelt.
27. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Mittel handelt, die eine molekulare Inhibition der PB1-F2-Oligomerisierung bewirken und/oder die PB1-F2-Oligomerisierungsdomänen inhibieren.
28. Mittel nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 400 μM eingesetzt werden können, wobei chemische Inhibitoren in einem Konzentrationsbereich von 5 nM bis 100 μM, vorzugsweise 10 nM bis 50μM, Peptidinhibitoren in einem Konzentrationsbereich von
1 μM bis 400 μM, vorzugsweise 10 μM bis 250 μM, und siRNA in einem Konzentrationsbereich von 1 nM bis 500 nM, vorzugsweise 10 nM bis 300 nM eingesetzt werden können.
29. Mittel in Form eines Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, dass er a) eine oder mehrere Substanzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektionen induziert und/oder b) einen oder mehrere Protein- und/oder Peptidbausteine enthält, die in der Aminosäuresequenz von PBl und/oder PB1-F2 vorhanden sind.
30. Impfstoff nach Anspruch 29 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektionen.
31. Impfstoff nach Anspruch 30 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Influenza- A- Virusinfektionen.
32. Impfstoff nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der wenigstens einen Antikörper und/oder ein Fragment desselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektionen induziert.
33. Impfstoff nach einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend wenigstens einen Antikörper und/oder ein Fragment desselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektionen.
34. Impfstoff nach Anspruch 33, umfassend wenigstens einen für PBl- und/oder PB1-F2- spezifischen Antikörper und/oder ein Fragment desselben.
35. Impfstoff nach Anspruch 34, wobei der für PBl- und/oder PBl-F2-spezifϊsche Antikörper und/oder ein Fragment desselben in eine IAV-infϊzierte Zelle eingebracht wird.
36. Impfstoff nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine oder mehrere Zellen des Immunsystems induziert und/oder aktiviert und die Aktivität des Proteins PB1-F2 reguliert oder hemmt.
37. Impfstoff nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine oder mehrere Zellen des Immunsystems induziert und/oder aktiviert und die Phosphorylierung des Proteins PB1-F2 hemmt.
38. Impfstoff nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die induzierten und/oder aktivierten Zellen CD8-positive cytotoxische T-Zellen sind.
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