TW201514208A - 免疫性胜肽結合物及其誘發抗流感病毒治療性抗體反應之方法 - Google Patents

免疫性胜肽結合物及其誘發抗流感病毒治療性抗體反應之方法 Download PDF

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Abstract

本文所述之免疫性流感血球凝集素衍生胜肽結合物誘發抗流感病毒之特異性治療性抗體反應。該等免疫性胜肽結合物包含流感血球凝集素蛋白質之融合起始區(fusion initiation region，FIR)域的片段結合至載體蛋白質，諸如匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、流感血球凝集素(hemagglutinin，HA)蛋白質(亦即全長HA)及其類似物。本文所述之免疫性胜肽結合物可用於治療或預防流感感染及用於製備干擾流感病毒-宿主細胞膜融合之流感特異性治療性抗體。該胜肽結合物可調配於適用於流感感染之廣泛治療或預防之醫藥組合物中。

Description

免疫性胜肽結合物及其誘發抗流感病毒治療性抗體反應之方法 [相關申請案]
本申請案為在2013年3月14日提出申請之美國第13/828,988號之部分接續申請案，其以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於免疫性流感血球凝集素A2(hemagglutinin A2，HA2)衍生的胜肽結合物及使用該等結合物誘發抗流感病毒的特異性抗體反應之方法。
[併入之序列表]
此申請案之生物序列資訊包括於隨申請案遞交之ASCII正文檔案中，該ASCII正文檔案具有文件名稱「TU-271-5-SEQ.txt」，產生於2013年3月14日且具有29,368字節之檔案大小，其以引用之方式併入本文中。
血球凝集素(Hemagglutinin，HA)為流感病毒(正黏液病毒)之包膜蛋白質且為原型RNA病毒第I類融合蛋白質。HA於感染細胞中作為前驅蛋白質HA0生成，該前驅蛋白質HA0蛋白水解分裂成2個被稱作HA1及HA2之蛋白質。HA2含有被稱作融合胜肽之胺基終端疏水性域，其在血球凝集素前驅蛋白質之分裂期間暴露。反轉錄病毒跨膜蛋 白質含有若干與除融合胜肽以外之HA2之已知結構相同的結構特徵，包括延長的胺基終端螺旋(N-螺旋，通常為「七個重複」或「白胺酸拉鏈」)、羧基終端螺旋(C-螺旋)及接近跨膜結構域之芳族基元。此等五個域中至少四個域之存在定義病毒包膜蛋白質為第I類融合蛋白質。
圖1顯示第I類病毒之六個家族之融合蛋白的六個識別域。融合蛋白起源於疏水性融合胜肽，封端於錨定胜肽中且合併延長胺基終端的α-螺旋(N-螺旋，通常為「七個重複」或「白胺酸拉鏈」)、羧基終端α-螺旋(C-螺旋)及有時接近病毒粒子包膜之芳族基元。第六域在本文中稱作融合起始區(fusion initiation region，FIR)，其揭示於美國專利第7,491,793號及美國專利第8,222,204號(頒予Garry及Wilson)中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
存在A型流感病毒之多種亞型。各病毒亞型包含嵌入於病毒之脂膜包膜中的兩個醣蛋白之型式的一個特定組合。兩個亞型定義之醣蛋白為血球凝集素HA及神經胺糖酸酶(neuraminidase，NA)。存在十七個HA之已知變異體，其分別被稱作H1至H17，及九個神經胺糖酸酶之已知變異體，其分別被稱作N1至N9。指定各病毒亞型分別以其血球凝集素及神經胺糖酸酶變異體編號為特徵。舉例而言，A型流感亞型H3N2為豬流感而亞型H5N1為禽流感。
每年約10至20百分比之美國人口罹患季節性流感。雖然大部分個體於一至兩週中自流感康復，然極幼小者、老年人及伴有慢性醫學病狀者可能患流感後肺炎及其他致死性併發症。流感之病原體為流感病毒，一種容易經由嵌段病毒基因組之再配及突變過程發展新型病毒株之正黏液病毒。
第I類病毒之FIR為涉及病毒包膜-與-宿主細胞膜融合之病毒融合包膜蛋白質的區域，該病毒包膜-與-宿主細胞膜融合為宿主細胞膜結 合病毒中斷宿主細胞膜之完整性以注射病毒遺傳物質至宿主細胞中的過程。此過程涉及合併病毒包膜及宿主細胞膜，其藉由病毒融合蛋白質(例如在流感病毒之情況下為血球凝集素)介導，由此使宿主細胞內部暴露於病毒內部。如揭示於上文所提及之美國專利第7,491,793號及美國專利第8,222,204號(頒予Garry及Wilson)中，包含FIR之片段或由FIR之片段組成的相對較短胜肽可結合至病毒融合蛋白質且干擾發生融合所需的構形變化。該等胜肽由此防止病毒感染宿主細胞，儘管事實為病毒仍可結合至宿主細胞膜之表面。由此，FIR胜肽藉由與傳統疫苗治療相比完全不同的機制抑制病毒感染力，該機制一般包括生產防止病毒與宿主細胞結合之抗體，而非干擾包含瓶融合機制之生物化學事件本身。
A型流感病毒之高毒性病毒株可產生傳染性及流行性。近年來，已出現能夠造成較高死亡率之A型禽流感病毒亞型H5N1之高病原性病毒株。處理由流感病毒造成的對公眾健康及作為潛在的生物恐怖主義試劑之威脅為重要的優先項目。從而，存在研發控制季節性流感及增加的流行性流感及武器化流感之威脅的治療組合物及方法之持續需求。胜肽結合物、抗體及本文所述致力於此等需求。
本文所述之免疫性流感血球凝集素衍生的胜肽結合物誘發抗流感病毒的特異性治療性抗體反應。如本文所述之免疫性胜肽結合物包含藉由鍵聯基團結合至載體蛋白質(例如免疫性載體蛋白質)之血球凝集素(hemagglutinin，HA)融合起始區(fusion initiation region，FIR)胜肽或其變異體。HA FIR胜肽由不超過50個胺基酸殘基組成且包含流感血球凝集素2蛋白質之片段，該流感血球凝集素2蛋白質包括SEQ ID NO：1或與其共享至少50%序列一致性且與SEQ ID NO：1之不同之處在於一或多個選自由V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、 E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M及E14K組成之群之胺基酸取代的SEQ ID NO：1變異體之胺基酸序列。在一些實施例中，流感血球凝集素2蛋白質之片段包括多至25個來自選自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16及H17組成之群之A型流感亞型的血球凝集素2蛋白質之另外的胺基酸殘基。另外的殘基與所選擇的A型流感亞型之血球凝集素2蛋白質的胺基酸序列中之SEQ ID NO：1或其變異體鄰接。視情況，HA FIR胜肽可包括一或多種非來自A型流感血球凝集素2蛋白質之胜肽序列。
本文所述之免疫性胜肽結合物適用於治療或預防流感感染及適用於引發干擾流感病毒-宿主細胞膜融合之流感特異性治療性抗體。胜肽結合物可調配於適用於治療或預防廣泛之流感感染的醫藥組合物中。可採用本文所述之免疫性胜肽結合物治療或預防流感感染及引發干擾流感病毒-宿主細胞融合之流感特異性治療性抗體。胜肽結合物可與醫藥學上可接受之載劑組合且視情況包括一或多種佐劑、賦形劑及其類似物調配於適用於治療或預防流感感染之醫藥組合物中。
在一個實施例中，免疫性流感血球凝集素衍生的胜肽結合物之血球凝集素FIR胜肽由SEQ ID NO：1(SEQ ID NO：2之殘基84至99，其為A型流感亞型H3血球凝集素2之代表性序列)或其變異體組成。
本文所述之免疫性胜肽結合物中之任一者之載體蛋白質部分可為任一蛋白質或多肽分子，較佳為當投與個體時可引發免疫反應(例如抗體產生)者。該等多肽之非限制性實例包括例如KLH、似鮑羅螺血氰蛋白(Concholepas concholepas hemocyanin，CCH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、陽離子化BSA、卵白蛋白、流感血 球凝集素蛋白質及其類似物。該等免疫性蛋白質在此項技術中為吾人所熟知。
本發明之另一態樣為本文所述之免疫性胜肽結合物之用途，其用於治療或預防流感感染的方法中。方法包含向個體投與胜肽結合物(例如以治療有效劑量)。胜肽結合物刺激個體之免疫系統產生特異性靶向結合物之FIR胜肽部分的治療性抗體。儘管事實上當投與個體時僅FIR胜肽(不含載體蛋白質)並未引發任何免疫反應但此治療性抗體反應仍發生。免疫性胜肽結合物可與醫藥學上可接受之載劑(視需要)組合包括於醫藥組合物中。
本發明之另一態樣為一種能夠抑制細胞結合之流感病毒與病毒結合之細胞膜融合的經分離治療性抗體。較佳地，治療性抗體為人類、人類化或嵌合單株抗體。該等治療性抗體可藉由以下方式獲得，例如藉由自用如本文所述之免疫性胜肽結合物治療的病患之血清分離抗體，自已用免疫性胜肽結合物治療(亦即投與免疫性胜肽結合物)之人類個體產生人類抗體之重組型式或藉由自適合之已用免疫性胜肽結合物治療(亦即投與免疫性胜肽結合物)之非人類宿主動物(例如兔或山羊)產生抗體之重組嵌合或人類化型式。
提供以下非限制性實施例以說明本發明之某些態樣及特徵。
實施例1為一種免疫性胜肽結合物，其包含藉由鍵聯基團結合至載體蛋白質(例如免疫性載體蛋白質)之血球凝集素(hemagglutinin，HA)融合起始區(fusion initiation region，FIR)胜肽或其變異體；其中HA FIR胜肽由不超過50個胺基酸殘基組成且包含流感血球凝集素2蛋白質之片段，該流感血球凝集素2蛋白質包括SEQ ID NO：1或與其共享至少50%序列一致性且與SEQ ID NO：1之不同之處在於一或多個選自由V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、 K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M及E14K組成之群之胺基酸取代的SEQ ID NO：1變異體之胺基酸序列。
實施例2包含實施例1之免疫性胜肽結合物或由實施例1之免疫性胜肽結合物組成，其中流感血球凝集素2蛋白質之片段包括多至25個另外的來自選自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16及H17組成之群之A型流感亞型之血球凝集素2蛋白質的胺基酸殘基，該等另外的殘基與所選擇的A型流感亞型之血球凝集素2蛋白質之胺基酸序列中的SEQ ID NO：1或其變異體鄰接。
實施例3包含實施例1或實施例2之免疫性胜肽結合物或由實施例1或實施例2之免疫性胜肽結合物組成，其中HA FIR胜肽包括一或多個非來自A型流感血球凝集素2蛋白質之胜肽序列。
實施例4包含實施例1至3中之任一者之免疫性胜肽結合物或由實施例1至3中之任一者之免疫性胜肽結合物組成，其中血球凝集素FIR胜肽具有由SEQ ID NO：1或與其共享至少50%序列一致性且與SEQ ID NO：1之不同之處在於一或多個選自由V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M、A13T、及E14K組成之群之胺基酸取代的SEQ ID NO：1變異體組成的胺基酸序列。
實施例5包含實施例1至4中之任一者之胜肽結合物或由實施例1至4中之任一者之胜肽結合物組成，其中載體蛋白質係選自由腦膜炎雙球菌(Neiserria meningitidis，OMPC)外部膜蛋白質複合物、破傷風類毒素蛋白質、白喉毒素衍生物CRM197、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、陽離子化BSA、似鮑羅螺血氰蛋白(Concholepas concholepas hemocyanin，CCH)、B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)表面抗原蛋白質(hepatitis B virus surface antigen protein，HBsAg)、HBV核心抗原蛋白質、匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、輪狀病毒衣殼蛋白、牛乳突狀瘤病毒(bovine pappiloma virus，BPV)L1蛋白質、人類乳突狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)L1蛋白質、卵白蛋白及全長流感血球凝集素(hemagglutinin，HA)蛋白質組成之群。
實施例6包含實施例1至5中之一者之胜肽結合物或由實施例1至5中之一者之胜肽結合物組成，其中載體蛋白質為全長流感血球凝集素蛋白質。
實施例7包含實施例6之胜肽結合物或由實施例6之胜肽結合物組成，其中全長流感血球凝集素蛋白質為一種亞型之A型流感血球凝集素，例如選自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16及H17組成之群的亞型之血球凝集素。
實施例8包含實施例6之胜肽結合物或由實施例6之胜肽結合物組成，其中全長流感血球凝集素蛋白質為B型流感血球凝集素蛋白質。
實施例9包含實施例1至8中之任一者之胜肽結合物或由實施例1至8中之任一者之胜肽結合物組成，其中鍵聯基團包含硫鍵(例如在本文所述之常見的半胱胺酸至順丁烯二醯亞胺型結合技術的情況下)。
實施例10包含實施例1至8中之任一者之胜肽結合物或由實施例1至8中之任一者之胜肽結合物組成，其中鍵聯基團為式I之4-(N-丁二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羰基：
其中式I之Cys殘基經由其巰基結合至丁二醯亞胺基部分且藉由胜肽鍵結合FIR胜肽之N-末端，視情況在Cys與FIR胜肽之間具有1至5個殘基之另外的間隔胜肽，且式I之環己基部分上的1-羰基藉由醯胺鍵結合至載體蛋白質上的一級胺。
實施例11包含實施例1至10中之任一者之胜肽結合物或由實施例1至10中之任一者之胜肽結合物組成，其中血球凝集素FIR胜肽具有由藉由鍵聯基團結合至載體蛋白質之SEQ ID NO：1組成的胺基酸序列。
實施例12包含用於治療或預防流感感染之醫藥組合物或由用於治療或預防流感感染之醫藥組合物組成，該醫藥組合物包含於醫藥學上可接受之載劑中的實施例1至11中之任一者之免疫性胜肽結合物。
實施例13包含治療或預防流感感染之方法或由治療或預防流感感染之方法組成，該方法包含向患有流感或處於感染流感之危險中的個體投與治療有效量之實施例1至11中之任一者之免疫性胜肽結合物。
實施例14包含一種在個體中誘發特異性治療性抗體反應之方法或由一種在個體中誘發特異性治療性抗體反應之方法組成，該方法包含向個體投與實施例1至11中任一者之免疫性胜肽結合物。
實施例15包含實施例14之方法或由實施例14之方法組成，其中特異性治療性抗體反應為抑制流感病毒(例如病毒包膜)與宿主細胞膜之融合。
實施例16包含一種能夠特異性結合至流感病毒血球凝集素蛋白質之FIR區的治療性單株抗體或由一種能夠特異性結合至流感病毒血 球凝集素蛋白質之FIR區的治療性單株抗體組成，該單株抗體包含宿主生物體經投與實施例1至11中任一者之免疫性胜肽結合物後產生的抗體之互補決定區(complementarity determining regions，CDRs)，該抗體特異性結合至流感病毒血球凝集素蛋白質之FIR區。
實施例17包含實施例16之治療性單株抗體或由實施例16之治療性單株抗體組成，其中該治療性單株抗體為人類、人類化或嵌合單株抗體。
實施例18包含實施例16或實施例17之治療性單株抗體之用途或由實施例16或實施例17之治療性單株抗體之用途組成，其用於治療或預防個體的流感病毒感染。
實施例19包含實施例1至11中任一者之免疫性胜肽結合物之用途或由實施例1至11中任一者之免疫性胜肽結合物之用途組成，其用於治療或預防流感感染。
實施例20包含實施例1至11中任一者之免疫性胜肽結合物之用途或由實施例1至11中任一者之免疫性胜肽結合物之用途組成，其用於誘發個體對流感病毒之特異性治療性抗體反應。
已發現具有由VEDTKIDLWSYNAELL，SEQ ID NO：1組成之胺基酸序列的血球凝集素FIR胜肽具有有效抗病毒特性(參見美國專利第8,222,204號)。包含此相同血球凝集素FIR胜肽結合至KLH之免疫性胜肽結合物在小鼠、兔及山羊中引起生產特異性靶向血球凝集素FIR胜肽之抗體。出人意料地，在標準分析中發現此抗體干擾病毒包膜-與-宿主細胞膜融合過程，但未顯著干擾血球凝集。此與典型的抗流感抗體干擾病毒與宿主細胞的實際物理相互作用(例如結合)之作用模式相反。
圖1顯示來自I型病毒之六個家族的融合蛋白之六個識別域，包括 融合起始區(fusion initiation region，FIR)。
圖2提供由比較游離FIR胜肽與ELISA板結合FIR胜肽之胜肽結合競爭分析產生之圖示。
圖3提供ELISA板結合血球凝集素與游離FIR胜肽之間的結合競爭之圖示。
本文所述之免疫性流感血球凝集素衍生胜肽結合物誘發抗流感病毒之特異性治療性抗體反應。免疫性胜肽結合物係由來自結合至載體蛋白質的流感血球凝集素蛋白質(在本文中稱作「血球凝集素FIR胜肽」或「FIR胜肽」)之融合起始區(fusion initiation region，FIR)結構域之片段構成。血球凝集素FIR胜肽具有由SEQ ID NO：1或與其共享至少50%序列一致性且與SEQ ID NO：1之不同之處在於一或多個選自由V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M、A13T及E14K組成之群之胺基酸取代的SEQ ID NO：1變異體組成之胺基酸序列。
SEQ ID NO：1為A型流感血球凝集素(具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列之亞型H3病毒株)之FIR之片段(亦即殘基84至99)。為SEQ ID NO：1之變異體的FIR胜肽與其不同之處在於特定取代(保守取代或取代來自另一血球凝集素亞型(亦即來自H1、H2、H4、H5、H6、H7、H9、H10、H11、H12、H13、H15、H16或H17)之相應胺基酸殘基)。對應於來自此等其他亞型之SEQ ID NO：1的胜肽顯示於表1中。較佳地，變異體等同於SEQ ID NO：1或與SEQ ID NO：1共享較高序列一致性(例如95%或更大序列一致性，較佳地98%或更大序列一致性，更佳地100%序列一致性)。
如本文所使用，術語「保守取代」及其語法變體係指在不同於野生型殘基但在與其相同之胺基酸類型中(亦即非極性殘基替換非極性殘基、芳族殘基替換芳族殘基、極性不帶電殘基替換極性不帶電殘基、帶電殘基替換帶電殘基)的胜肽之序列中存在胺基酸殘基。此外，保守取代可包涵具有相同信號之界面親水性數值及與其所替換之野生型殘基大體上類似量值的殘基。
如本文所使用，術語「非極性殘基」係指甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸及脯胺酸；術語「芳族殘基」係指苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸及組胺酸(亦考慮為帶電胺基酸)；術語「極性不帶電殘基」係指絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；術語「帶電殘基」係指帶負電的胺基酸天冬胺酸及麩胺酸，以及帶正電的胺基酸離胺酸、精胺酸及組胺酸(亦考慮為芳族胺基酸)。
表1中之所有序列與SEQ ID NO：1共享大於50百分比序列一致性，亦即SEQ ID NO：3、4、6、7及12與SEQ ID NO：162.5%一致；及SEQ ID NO：5、8、9、10及11與SEQ ID NO：156.2%一致。由此顯而易見，多種流感血球凝集素亞型在藉由SEQ ID NO：1例示之FIR的16-胺基酸殘基片段中高度同源。在本文所述之免疫性胜肽結合物之FIR胜 肽部分(SEQ ID NO：1)中的取代主要衍生自可見於顯示於表1中之SEQ ID NO：3至12中的變異體，以及可見於SEQ ID NO：1及3至12中之殘基中之一者的常見保守取代，諸如經白胺酸、甘胺酸、絲胺酸或丙胺酸取代纈胺酸殘基；用麩胺酸殘基取代天冬胺酸殘基；經甘胺酸或甲硫胺酸取代絲胺酸殘基；及其類似取代。
除非本文另外指明或上下文明顯矛盾，否則在描述本發明之上下文中(尤其在以下申請專利範圍之上下文中)術語「一」及「該」及類似指示物之使用應理解為涵蓋單個與複數個。除非另外說明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應理解為開放的術語(亦即意謂「包括(但不限於)」)。除非本文另外指明，否則列舉本文中數值之範圍僅意欲充當單獨提及落在該範圍內之各個數值的簡寫方法，且各個數值如同在本文中單獨敍述一般併入本說明書中。除非本文另外指明或上下文明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適合順序進行。除非另外主張，否則本文所提供之任一及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)之使用僅意欲更好地闡明本發明且並不對本發明之範疇造成限制。本說明書中之語言不應視作指明任一未主張之要素對於實施本發明必不可少。
適用於本文所述之胜肽結合物及方法的載體蛋白質包括任何蛋白質，較佳地當投與個體時可引發抗體產生之免疫性蛋白質。該等載體蛋白質及結合載體蛋白質至所關注之胜肽的方法在此項技術中已為吾人所熟知且已在所謂的「結合疫苗」之生產中使用。載體蛋白質、鍵聯基團及結合方法之一些實例描述於PCT國際公開案號WO2012/065034(以申請案號PCT/US2011/060318申請)中，其以全文引用的方式併入本文中。載體蛋白質之一些非限制性實例包括腦膜炎雙球菌(Neiserria meningitidis，OMPC)之外膜蛋白質複合物、破傷風類毒素蛋白質、白喉毒素(CRM197)之衍生物、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、陽離子化BSA、似鮑羅螺血氰蛋白(Concholepas concholepas hemocyanin，CCH)、B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)蛋白質(例如表面抗原蛋白質(hepatitis B virus surface antigen protein，HBsAg)及HBV核心抗原蛋白質)、匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、輪狀病毒衣殼蛋白質、牛乳突狀瘤病毒之L1蛋白質(L1 protein of a bovine pappiloma virus，BPV L1)、人類乳突狀瘤病毒之L1蛋白質(L1 protein of human papilloma virus，HPV L1；例如HPV 6、11或16型)、卵白蛋白及流感血球凝集素(influenza hemagglutinin，HA)蛋白質(諸如來自血球凝集素A亞型H1至H17之HA蛋白質)。流感HA蛋白質之代表性序列包括H1(SEQ ID NO：13)、H2(SEQ ID NO：14)、H3(SEQ ID NO：15)、H5(SEQ ID NO：16)及H7(SEQ ID NO：17)。用於本文所述之免疫性胜肽結合物之載體蛋白質、偶合(結合)技術及鍵聯基團之選擇充分在蛋白質疫苗合成技術中的一般技術者之能力內。
載體蛋白質係藉助於載體蛋白質上之反應性位點結合而所關注之胜肽藉助於鍵聯基團。適用於結合之親核官能基在此項技術中已為吾人所熟知(參見例如美國專利第5,606,030號，其以全文引用的方式併入本文中)。舉例而言，存在於胺基酸殘基上的主要胺基(諸如離胺酸之ε胺基及蛋白質之N-末端胺基酸之α胺基)可用作用於結合之官能基。通常需要將載體蛋白質之一或多種主要胺基轉化成含硫醇的基團(例如來自半胱胺酸或高半胱胺酸殘基)、諸如順丁烯二醯亞胺基之親電子不飽和基團或諸如溴乙醯基之鹵化基團，以便結合至硫醇反應性胜肽。視情況，血球凝集素FIR胜肽上或連接至胜肽之鍵聯部分上的主要胺基可轉化成含硫醇基團，以便與載體蛋白質上之硫醇(巰基)部分偶合，例如藉由雙硫鍵。
血球凝集素FIR胜肽與載體蛋白質可使用任一鍵聯基團及此項技 術中已知之結合方法結合。在一些實施例中，結合可藉由例如使用丁二醯亞胺基4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]環己烷-1-甲酸鹽(succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate，SMCC)、磺基丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸鹽(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate，sSMCC)、ε-[ε-順丁烯二醯亞胺基己醯氧基]-磺基丁二醯亞胺酯(ε-[ε-maleimidocaproyloxy]-sulfosuccinimde ester，sEMCS)、雙-重氮聯苯胺(bis-diazobenzidine，BDB)、N-順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(N-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester，MBS)、戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDCI)或N-乙醯基高半胱胺酸硫代內酯(N-acetyl homocysteine thiolactone，NAHT)來達成。
在SMCC方法中，SMCC將半胱胺酸殘基之SH-基團交聯至載體蛋白質上的離胺酸殘基之胺基。在SMCC方法中，首先藉由使SMCC與一級胺(例如於載體蛋白質之離胺酸殘基上)反應來活化載體蛋白質。隨後自任何過量SMCC及由其得到之副產物分離所得的經活化之載體，且添加含半胱胺酸之胜肽。在SMCC衍生之載體蛋白質之順丁烯二醯亞胺部分的雙鍵兩端添加半胱胺酸之硫醇基團，由此形成將載體偶合至胜肽之共價硫鍵。若血球凝集素FIR胜肽並不包括半胱胺酸殘基，則應添加半胱胺酸殘基至胜肽，較佳地在N-末端或C-末端處。若血球凝集素FIR胜肽之抗原決定基部分含有半胱胺酸或若在胜肽中存在一種以上半胱胺酸基團，則應利用另一並不改質半胱胺酸殘基之結合技術。因為介於載體蛋白質與胜肽之間的鍵聯應不干擾胜肽之抗原決定基部分，視情況可藉由包括一或多種胺基酸殘基作為間隔劑自血球凝集素FIR胜肽分離所添加的半胱胺酸殘基。半胱胺酸、間隔殘基及連接至載體之經改質之SMCC共同構成血球凝集素FIR胜肽結合物 之鍵聯基團。
可使用諸如1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)、1-環己基-2-(2-N-嗎啉基乙基)碳化二亞胺甲-對-甲苯磺酸鹽(1-cyclohexyl-2-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate，CMC)及其類似物之碳化二亞胺交聯劑將羧基共價連接至一級胺基來達成胜肽至載體蛋白質之另一簡單偶合。此方法簡單且提供允許抗諸多可能抗原決定基之抗體產生之相對無規定向。一個缺點為EDC偶合可能產生一定量之聚合作用。此可能降低結合物之溶解度，其可能使材料之操作複雜化。
其他偶合試劑可用於直接或藉助於鍵聯基團將FIR胜肽結合至載體蛋白質。舉例而言，可使用諸如2-N-嗎啉基乙基異氰化物之異氰酸酯偶合試劑；可用於添加硫醇基團至載體蛋白質上(諸如OMPC與順丁烯二醯亞胺或溴乙醯基官能化胜肽偶合)之N-乙醯基高半胱胺酸硫代內酯；或任何其他用於將半抗原(潛在的免疫原)偶合至多肽及蛋白質之試劑來達成結合，其中諸多在蛋白質及疫苗技術中已為吾人所熟知。
非特定交聯劑及其用途在此項技術中已為吾人所熟知。該等試劑及其用途之實例包括與戊二醛反應；在存在或不存在丁二醯化載體之摻合物下與N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺反應；糖基化取代基在存在硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉下過碘酸鹽氧化之後偶合至蛋白質載體之游離胺基；非醯基化末端絲胺酸及蘇胺酸殘基之過碘酸鹽氧化形成末端醛，隨後與胺或醯肼反應產生希夫鹼或腙，其可用氰基硼氫化物還原成二級胺；芳族胺基之重氮化作用之後偶合於蛋白質之酪胺酸側鏈殘基上；與異氰酸酯反應；或混合酸酐之反應。可用間隔基團補充及延長鍵聯劑，間隔基團諸如另外的胺基酸殘基、己二酸二 醯肼及其類似物。
用於將FIR胜肽結合至載體蛋白質之典型間隔胜肽基團包括單胺基酸(例如Cys)及連接至FIR胜肽之較短胜肽序列(亦即較短非血球凝集素FIR胜肽序列)，例如含離胺酸之胜肽(諸如flag標籤序列DYKDDDDK(SEQ ID NO：18))、含半胱胺酸之胜肽及其類似物。一些較佳鍵聯基團包含硫鍵(例如如在SMCC及相關偶合方法中)。一些較佳鍵聯基團包括式I之4-(N-丁二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羰基：
其中式I中之半胱胺酸殘基經其巰基側鏈結合至丁二醯亞胺基部分且藉由胜肽鍵結合FIR胜肽之N-末端。視情況，1至5個胺基酸殘基之另外的間隔胜肽可包括於Cys與FIR胜肽之間。式I之環己基部分上之1-羰基藉由醯胺鍵結合至載體蛋白質上的一級胺。
在一些實施例中，胜肽結合物包括連接至載體蛋白質之單個血球凝集素FIR胜肽，而在其他實施例中，兩種或兩種以上血球凝集素FIR胜肽可連接至載體蛋白質。
在另一態樣中，本發明提供一種治療性單株抗體，其對本文所述之免疫性胜肽結合物之血球凝集素FIR胜肽部分具有特異性(亦即能夠特異性及選擇性結合至血球凝集素FIR胜肽部分)且對於其結合至流感病毒之HA2之FIR具有特異性。該等治療性單株抗體包含衍生自特異性結合至如本文所述免疫性胜肽結合物之FIR部分之抗體的互補決定區(complementarity determining regions，CDRs)。治療性抗體可為人類抗體(例如自暴露於胜肽結合物之個體之血清分離的)、非人類抗體(例如自暴露於胜肽結合物之諸如小鼠、大鼠、兔、山羊或其他適 合生物之非人類個體生物分離的)以及該等非人類抗體之嵌合及人類化型式。
當向暴露於流感病毒之個體投與(例如以治療有效劑量)時，治療性單株抗體抑制流感病毒-與-宿主細胞膜融合且由此預防宿主細胞感染流感病毒。此抑制藉由使抗體結合至流感病毒之HA蛋白質之FIR區達成。由此，本文所述之治療性單株抗體具有與免疫性胜肽結合物之血球凝集素FIR胜肽部分相同或極類似之治療機制(參見論述FIR胜肽之治療機制之U.S.8,222,204)。
如本文所使用，術語「治療有效劑量」及其文法變化係指免疫性胜肽結合物投與個體時引發抗流感病毒之特異性治療性抗體反應之量，或治療性抗體足以預防流感感染或提供臨床減少流感感染之量。投與個體之劑量及劑數(例如單劑或多劑)將視多種因素而變化，包括投與途徑、病患病況及特徵(性別、年齡、體重、健康狀況、體形)、症狀程度、並行治療、治療頻率及所需效果、其投與形式中結合物或抗體之濃度及其類似因素。劑量範圍之調節及操作以及測定組合物在個體之治療有效性的活體外及活體內方法完全在醫療技術中之一般技術者之能力內。作為實例，可利用一劑量在約1mL至100mL範圍內包含胜肽結合物或治療性抗體在醫藥學上可接受之載劑中之溶液。胜肽結合物或治療性抗體應以在約0.01μg/mL至約10mg/mL範圍內之濃度存在於溶液中。胜肽或抗體可非經腸(例如藉由靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內注射或輸注)或經黏膜(例如藉由吸入霧化液體或粉末組合物)投與。
本文所述之治療性抗體操作之結合特異性及機制與對於用傳統流感疫苗之疫苗接種反應所形成的抗體呈明顯對比，傳統流感疫苗通常干擾病毒與宿主細胞之物理相互作用且通常為特定病毒株，強調季節性疫苗之每年再調配之必要性以匹配循環流感病毒株。相對地，本 文所述之治療性抗體出人意料地干擾病毒融合過程且廣泛地對流感之不同病毒株(包括A型及B型流感)有反應性。
較佳地，治療性單株抗體為人類、人類化或嵌合單株抗體。製備單株抗體之方法在此項技術中已為吾人所熟知，如常規地自經分離之天然抗體製造單株抗體之商業企業。嵌合及人類化單株抗體及生產該等抗體之方法亦在抗體技術中已為吾人所熟知(參見例如美國專利第5,824,307號；第6,800,738號；第7,070,775號；第7,087,409號；第7,456,260號；及第7,807,161號；其中之每一者以全文引用的方式併入本文中)。
嵌合過程包含用來自人類抗體之相應部分(例如恆定區)替換非人類抗體之部分。進行此過程以預防人類免疫系統進攻如外來蛋白質之非人類抗體。嵌合抗體大體上保持CDRs及或非人類抗體之整個可變區且用人類恆定結構域替換非人類恆定結構域。由此，嵌合抗體保持非人類抗體之抗原特異性，但具有降低程度之針對抗體之非所需免疫反應(例如過敏反應)。
人類化抗體與嵌合抗體類似，除了人類化抗體一般包括較少非人類特徵。此可例如藉由改質嵌合抗體之可變區之序列以更好地反映人類抗體之特徵，例如藉由改質抗體中之CDRs之間的序列或非人類序列之其他部分來達成。並非所有治療性單株抗體可能需要進行人類化，因為一些治療性處理可能具有較短的充分持續時間而不太可能形成過敏性副作用。
亦可採用全人類抗體。該等人類抗體可為例如基因工程改造抗體，例如其中CDRs為人類來源但具有在一或多種態樣中不同於天然產生之人類抗體之人類衍生結構(亦即由用免疫性胜肽結合物治療之人類個體產生之抗體)之抗體；或人類抗體可為獲自用胜肽結合物治療之人類個體之血清的天然抗體之純系。
在另一態樣中，提供醫藥組合物，其包含免疫性胜肽結合物或如本文所述之抗體且可用於治療或預防流感感染。在某些較佳實施例中，此組合物包括於醫藥學上可接受之媒劑或載劑中之免疫性胜肽結合物或抗體，該媒劑或載劑適合於遞送胜肽、類似物、衍生物或抗體至個體，例如藉由非經腸或經腸投與，較佳地藉由注射(例如較佳地藉由靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內注射)或藉由經鼻(例如噴霧劑)投與。適合於遞送活性成份之媒劑及載劑在此項技術中已為吾人所熟知且包括鹽水溶液、緩衝鹽水溶液及其類似物，較佳地在生理pH值(例如約6.5至7.4之pH值)下。載劑亦可包括諸如界面活性劑、防腐劑、分散劑、稀釋劑、穩定劑及其類似物之其他賦形劑成份，其在醫藥調配技術中已為吾人所熟知。醫藥組合物可用作藉由向個體投與治療有效量之醫藥組合物來治療或預防流感感染之方法之一部分。用於胜肽結合物及抗體之載劑可為固體或液體，其選擇藉由所需投與模式確定。
提供以下非限制性實例以進一步說明本文所述之免疫性胜肽結合物及方法之某些態樣及特徵。
實例1. 血球凝集素FIR胜肽-KLH結合物之製備。
用添加的N-末端Cys鍵聯殘基合成SEQ ID NO：1之FIR胜肽；亦即產生SEQ ID NO：19之胜肽，隨後使用SMCC方法將其與KLH結合。簡言之，首先藉由使SMCC與一或多種一級胺基反應(例如於載體蛋白質之離胺酸殘基上)來活化載體KLH蛋白質。隨後自任何過量SMCC及由其得到之副產物分離所得經活化之載體。隨後半胱胺酸衍生FIR胜肽與經活化之KLH反應；在SMCC衍生載體蛋白質之順丁烯二醯亞胺部分之雙鍵兩端添加半胱胺酸之巰基(硫醇)基團，由此形成共價硫鍵。隨後分離所得FIR胜肽-KLH結合物。
實例2. 小鼠單株抗-FIR胜肽抗體之產生。
使用如實例1中製備的結合物注射五個Balb/C小鼠。在第0天第一 次注射採用與完全弗氏(Freund's)佐劑混合之FIR胜肽-KLH結合物。在第21、35、49及63天，使用在不完全弗氏佐劑中的FIR-胜肽-KLH結合物注射小鼠。在第45、59及73天，自小鼠採集血清樣品，且使用ELISA方法用被動結合至96孔塑膠培養盤之孔的FIR胜肽(SEQ ID NO：1)測試抗-FIR胜肽抗體之存在。殺死三個具有最高抗-FIR抗體效價之小鼠且採集脾。使用標準技術採集脾細胞且與sp2/0細胞融合，且藉由ELISA識別產生抗-FIR抗體之融合瘤及藉由限制稀釋法次選殖。識別若干純系且在進一步分析中使用一個指定MAF3-2。
實例3. 山羊中的治療性抗-FIR胜肽抗體之產生。
使用如實例1中製備之結合物注射山羊。第一次注射使用500μg在完全弗氏佐劑中之FIR胜肽-KLH結合物。使用250μg劑量之在不完全弗氏佐劑中的結合物以兩週為間隔進行後續注射。在總共三次注射之後，在第一注射之後5週時製備血清樣品。在培養盤ELISA測試中發現血清樣品含有對於FIR胜肽可偵測之效價。
再一次使用250μg之FIR胜肽-KLH注射山羊且在第7週及第8週製備血清樣品。針對來自第7週及第8週之血清樣品對FIR胜肽(SEQ ID NO：1)之反應性使用培養盤ELISA分析對其進行滴定。培養盤塗佈有未結合FIR胜肽且發現在血清樣品中之抗體特異性結合至經塗佈之培養盤。
實例4. 兔中的治療性抗-FIR胜肽抗體之產生。
使用如實例1中製備之結合物注射兩隻兔。第一次注射使用200μg在完全弗氏佐劑中之FIR胜肽-KLH結合物。使用100μg劑量之在不完全弗氏佐劑中之結合物以兩週為間隔進行後續注射。在總共三次注射之後，在第一注射之後5週自各動物抽取血清樣品。在培養盤ELISA測試中發現血清樣品含有對FIR胜肽可偵測之效價。
再一次注射兔且在第7週及第8週採集收集血清樣品。針對來自 第7週及第8週之血清樣品對FIR胜肽之反應性使用培養盤ELISA分析對其進行滴定。藉由標準方法用未結合FIR胜肽塗佈培養盤且發現血清樣品特異性結合至經塗佈之培養盤。藉由結合至連接至固體層析載體之FIR胜肽自血清樣品分離抗體。抗體因低pH值(亦即約pH 2.68)而釋放。
發現經分離之抗體對FIR胜肽具有特異性，如一般藉由在培養盤結合FIR胜肽與溶液中之游離FIR胜肽之間的競爭所定義。為展現特異性，96孔免疫分析培養盤孔塗佈有溶解於碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液中之FIR胜肽。用緩衝脫脂乳粉/清潔劑懸浮液阻斷在塑膠上之未結合帶電位點。經純化之兔抗-FIR胜肽抗體偶合至生物素。隨後在添加至培養盤之前藉由連續稀釋FIR胜肽約45分鐘來中和約0.1mL生物素標記抗體溶液之等分試樣。在進一步培育之後，用含有清潔劑之緩衝鹽水洗滌孔。藉由用抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶結合物培育來偵測結合之抗-FIR抗體，之後洗滌及塗覆比色試劑3,3',5,5'-四甲基聯苯胺。圖2提供在培養盤結合與游離FIR胜肽之間的結合競爭之圖示。
實例5. 小鼠單株抗體之廣泛結合。
發現經分離之來源於小鼠的針對來自實例2之FIR胜肽(MAF3-2)之單株抗體識別且更特異性結合至多種亞型之血球凝集素(hemagglutinin，HA)，如一般藉由與FIR胜肽抗原之競爭所定義。為展現特異性，96孔免疫分析培養盤孔塗佈有多種亞型之溶解於碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液中之市售血球凝集素(HA：H1病毒株A/California/04/2009(H1N1)pdm09；H3病毒株A/Uruguay/716/07(H3N2)；H3病毒株A/Wisconsin/67/2005(H3N2)；H5病毒株A/斑頭雁/Qinghai/1A/05(H5N1))。用緩衝脫脂乳粉/清潔劑懸浮液阻斷在塑膠上的未結合帶電位點。經純化之MAF3-2抗體偶合至生物素(btn-MAF3-2)。隨後在添加至經HA塗佈之培養盤之前藉由連續稀釋FIR胜 肽約45分鐘中和約0.1mL抗體溶液的等分試樣。在進一步培育之後，用含有清潔劑之緩衝鹽水洗滌孔。藉由用抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶結合物培育來偵測結合之FIR抗體，之後洗滌及塗覆比色試劑3,3',5,5'-四甲基聯苯胺。圖3提供在ELISA培養盤結合之HA與游離FIR胜肽之間的結合競爭之圖示，其再次展示抗-FIR胜肽抗體對於FIR抗原之特異性。
實例6. 抗流感病毒之治療性抗-FIR胜肽抗體之評價。
細胞及病毒：馬丁達比犬腎細胞(Madin Darby Canine Kidney cells，MDCK)用於所有實驗。在補充有青黴素/鏈黴素溶液、碳酸氫鈉溶液、非必需胺基酸溶液及熱非活化胎牛血清之完全杜爾貝科氏最低必需培養基(complete Dulbecco's Minimum Essential Medium，cDMEM)中維持及繁殖細胞。包括在表2內之流感病毒用於所有感染/抗體結合研究。使用標準方法在9天大之含胚雞蛋中繁殖所有病毒且藉由自尿囊液離心來純化。以5.0之感染倍率進行所有感染。
抗體及試劑：在4℃下維持來自實例3之山羊抗-FIR胜肽抗體血清直至用於結合研究中。在於補充有1%牛血清白蛋白之磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline，PBS)中1：500稀釋抗體之情況下進行結合研究。作為A型流感或B型流感感染之對照物，使用1：1000稀釋於PBS/BSA中之針對A型流感或B型流感核蛋白(nucleoprotein，NP)(Santa Cruz Biotechnology)而產生之小鼠單株抗體對複製培養物進行染色。結合至辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)或ALEXA 488(分子探針)之二級抗體(抗-山羊或抗-小鼠)用於觀測結合之 初級抗體。
MDCK感染及抗體結合方案：使用標準方法使MDCK細胞生長至90%匯合於腔室載片中。對於病毒感染，移除培養基且在37℃下在潮濕CO2保溫箱中以200μL之體積添加各病毒至適當的腔室歷時一小時。在培育之後，在洗滌情況下藉由抽吸來移除未結合病毒，且用補充有TPCK胰蛋白酶(Worthington Chemicals，USA)之不含血清之cDMEM替換介質。在35℃/5% CO2下培育經感染之MDCK細胞24小時以允許病毒複製。對於抗體結合研究，自各腔室移除培養基且在4℃下用4%多聚甲醛(在PBS中)固定細胞30分鐘。在洗滌之後，滲透細胞及藉由在室溫下用PBS+20mM甘胺酸/0.01% TRITON X-100界面活性劑培育二十分鐘來阻斷殘餘醛。在洗滌之後，在室溫下添加山羊抗-FIR血清(1：500在PBS中+1% BSA)至腔室歷時三個小時。在洗滌情況下在PBS中移除未結合抗體。藉由用結合至用於螢光或可見偵測顯微法之ALEXA 488或辣根過氧化酶之二次抗體(抗-山羊)培育30分鐘來觀測結合之抗-FIR胜肽。在藉由洗滌(PBS/BSA)移除未結合二次抗體之後，藉由根據製造商之說明書添加3-胺基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC)受質試劑(Vector labs USA)使經HRP結合物處理之腔室染色。使用補充有碘化丙錠複染劑之VECTASHIELD水性封固劑(Vector labs USA)封固ALEXA 488結合腔室且在添加蓋玻片之後使用指甲油密封載片。
抗體結合之微觀評價：藉由使用具有數位影像捕獲能力之EVOS光學顯微鏡(AMG Instruments，USA)之可見光顯微法評價載片腔室。使用儀器軟體捕獲代表性影像且以帶標圖像檔案(Tagged Image Files，TIF)保存。使用Zeiss LSM 700雷射掃描共焦顯微鏡(Jena Germany)(使用488nm及455nm雷射線以分別觀察綠螢光及紅螢光)檢測螢光標記(ALEXA 488)之染色腔室。LSM軟體用於儲存帶標圖像檔 案(Tagged Image Files，TIF)形式之代表性影像。
獲得感染細胞在固定及抗體結合之前的可見影像。觀測A/Hong Kong/2369/2009、A/PR/8/34(H5N1)及B/Shanghai/362/2002感染之MDCK細胞培養物中之感染後24小時下的病毒感染之細胞病變效應。流感A/California/04/2004在感染後此時間點並未誘發CPE。
視覺上評價抗-FIR胜肽抗體或抗-流感核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)抗體(A或B)之可見(AEC)及螢光(Alexa488)染色影像。在所有檢測病毒中，對於NP及抗-FIR抗體觀察到陽性染色以及觀察到一系列反應性。在兩種觀測條件中，對於H5表達細胞(A/PR/8/1934+H5N1)觀察到與H1、H3或B型流感感染細胞相比更多的擴散染色。表3提供觀察到的結合特性之彙總。在表3中+號之數量表明抗體結合至經指定病毒感染之細胞的程度；更大+號之數量表明更高之結合程度。
綜合而言，此等結果表明對於針對SEQ ID NO：1之FIR胜肽而產生之抗體而言關於A型流感及B型流感病毒之廣泛結合特異性。此寬度可能歸因於在衍生FIR胜肽之區域中的多種亞型之血球凝集素蛋白質之較高同源性。識別流感核蛋白(nucleoprotein，NP)之對照物抗體之結合確認MDCK細胞經各病毒感染，確認抗-FIR胜肽抗體對於流感病毒之特異性。
總體而言，投與由與KLH結合之SEQ ID NO：1之血球凝集素FIR 胜肽構成的胜肽結合物至兔、小鼠及山羊刺激動物生產抗-FIR胜肽抗體。在對A型流感(H1、H3及H5)及B型流感病毒之測試中，出人意料地發現來自此等動物之血清結合至FIR胜肽自身，結合至暴露於病毒之細胞且抑制病毒感染性。如使用可見及螢光技術所偵測，抗體與在暴露細胞之表面上的HA反應。來自已接種最新流感疫苗之個體之血清產生穩固抗-HA反應，但出人意料地呈現未產生抗SEQ ID NO：1之FIR胜肽的抗體。
本發明之較佳實施例描述於本文中，包括本發明人已知之進行本發明的最佳模式。在閱讀前文描述之後，彼等較佳實施例之變化對於一般熟習此項技術者可變得顯而易見。本發明人期望熟練的技術人員適當時採用該等變化，且本發明人意欲以不同於本文中特定描述之其他方式來實施本發明。相應地，若適用法律允許，則本發明包括在此隨附之申請專利範圍中所陳述之標的物的所有修改及等效物。此外，除非本文另外指明或者與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素在其所有可能變化中之任一組合。本文中所引用之各參考文獻包括美國及非美國專利、美國及非美國公開專利申請案、期刊文章、書、書章節及本文所提及之任何其他文件，在此以全文(包括其所有細節)引用的方式併入本文中，如同其單獨併入一般。
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<212> PRT
<213> A型流感病毒
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<223> A/H3型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H3型流感血球凝集素2
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<223> A/H1型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H5型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H7型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H9型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<223> A/H2及A/H6型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<223> A/H10型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<223> A/H13型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<223> A/H15型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H16型流感血球凝集素2之殘基84-99
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<213> B型流感病毒
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<223> A型流感血球凝集素2/H17之殘基84-99
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H1型流感血球凝集素
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H2型流感血球凝集素
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H3型流感血球凝集素
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H5型流感血球凝集素
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<213> A型流感病毒
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<223> A/H7型流感血球凝集素
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<213> 人造序列
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<223> 合成的胜肽鍵聯劑
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<213> 人造序列
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<223> 鍵聯至Cys之合成的FIR胜肽
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Claims (18)

  1. 一種免疫性胜肽結合物，其包含血球凝集素(hemagglutinin，HA)融合起始區(fusion initiation region，FIR)胜肽或其變異體藉由鍵聯基團結合至載體蛋白質；其中該HA FIR胜肽由不超過50個胺基酸殘基組成且包含流感血球凝集素2蛋白質之片段，該流感血球凝集素2蛋白質包括胺基酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1之變異體，該變異體與SEQ ID NO：1共享至少50%序列一致性且與SEQ ID NO：1之不同之處在於一或多個選自由V1I、V1L、V1A、V1G、V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M、及E14K組成之群之胺基酸取代。
  2. 如請求項1之免疫性胜肽結合物，其中該流感血球凝集素2蛋白質之片段包括多至25個另外選自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16及H17組成之群之A型流感亞型的血球凝集素2蛋白質之胺基酸殘基，該等另外殘基與該所選擇的A型流感亞型之血球凝集素2蛋白質之胺基酸序列中的SEQ ID NO：1或其變異體鄰接。
  3. 如請求項1或請求項2之免疫性胜肽結合物，其中該HA FIR胜肽包括一或多種非來自A型流感血球凝集素2蛋白質之胜肽序列。
  4. 如請求項1或2之免疫性胜肽結合物，其中該血球凝集素FIR胜肽具有胺基酸序列由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1之變異體組成，該變異體與SEQ ID NO：1共享至少50%序列一致性且與SEQ ID NO：1之不同之處在於一或多個選自由V1I、V1L、V1A、V1G、 V1T、V1S、V1M、E2D、E2K、E2R、D3E、T4G、T4S、T4Q、T4A、K5F、K5M、K5I、K5V、K5L、K5A、I6L、I6V、I6A、I6T、I6S、I6Q、I6N、D7E、L8I、L8V、L8A、W9Y、S10T、S10G、S10A、S10M及E14K組成之群之胺基酸取代。
  5. 如請求項1或2之免疫性胜肽結合物，其中該載體蛋白質係選自由腦膜炎雙球菌(Neiserria meningitidis，OMPC)之外膜蛋白質複合物、破傷風類毒素蛋白質、白喉毒素衍生物CRM197、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、陽離子化BSA、似鮑羅螺血氰蛋白(Concholepas concholepas hemocyanin，CCH)、B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)表面抗原蛋白質(hepatitis B virus surface antigen protein，HBsAg)、HBV核心抗原蛋白質、匙孔螺血氰蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、輪狀病毒衣殼蛋白、牛乳突狀瘤病毒(bovine pappiloma virus，BPV)L1蛋白質、人類乳突狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)L1蛋白質、卵白蛋白及全長流感血球凝集素蛋白質組成之群。
  6. 如請求項1或2之免疫性胜肽結合物，其中該載體蛋白質為全長流感血球凝集素蛋白質。
  7. 如請求項6之免疫性胜肽結合物，其中該全長流感血球凝集素蛋白質為選自由H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16及H17組成之群之A型流感亞型的血球凝集素。
  8. 如請求項6之免疫性胜肽結合物，其中該全長流感血球凝集素蛋白質為B型流感血球凝集素蛋白質。
  9. 如請求項1或2之免疫性胜肽結合物，其中該鍵聯基團包含硫鍵。
  10. 如請求項1或2之免疫性胜肽結合物，其中該鍵聯基團包含實施 例1至6中任一項之胜肽結合物，其中該鍵聯基團為式I之4-(N-丁二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羰基： 其中式I之Cys殘基經由其巰基結合至丁二醯亞胺基部分且藉由胜肽鍵結合該FIR胜肽之N端，視情況在該Cys與該FIR胜肽之間具有1至5個殘基之另外間隔胜肽，且式I之環己基部分上的1-羰基藉由醯胺鍵結合至該載體蛋白質上的一級胺。
  11. 如請求項1或2之免疫性胜肽結合物，其包含具有由SEQ ID NO：1組成之胺基酸序列之血球凝集素2 FIR胜肽，該胜肽藉由該鍵聯基團結合至該載體蛋白質。
  12. 一種治療或預防流感感染之醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之免疫性胜肽結合物於醫藥學上可接受之載劑中。
  13. 一種如請求項1至11中任一項之免疫性胜肽結合物之用途，其用於製造用以治療或預防流感感染之藥劑。
  14. 一種如請求項1至11中任一項之免疫性胜肽結合物之用途，其用於製造用以在個體中誘發對流感病毒之特異性治療性抗體反應之藥劑。
  15. 如請求項14之用途，其中該特異性治療性抗體反應為抑制流感病毒與宿主細胞膜之融合。
  16. 一種能夠特異性結合至流感病毒血球凝集素之FIR區之治療性單株抗體，該單株抗體包含宿主生物體經投與如請求項1至11中任一項之免疫性胜肽結合物後所產生的抗體之互補決定區(complementarity determining regions，CDRs)，該抗體特異性結 合至流感病毒血球凝集素蛋白質之FIR區。
  17. 如請求項16之治療性單株抗體，其中該治療性單株抗體為人類、人類化或嵌合單株抗體。
  18. 一種如請求項16或請求項17之治療性單株抗體之用途，其用於製造用以治療或預防流感感染之藥劑。
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