JP2016519061A - 免疫原性ペプチドコンジュゲート及びそれを用いた抗インフルエンザ治療用抗体応答の誘導方法 - Google Patents

Abstract

本明細書に記載の免疫原性インフルエンザヘマグルチニン由来ペプチドコンジュゲートはインフルエンザウイルスに対する特異的治療用抗体応答を誘導する。免疫原性ペプチドコンジュゲートはキャリアタンパク質、例えばキーホール・リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質（即ち、全長ＨＡ）等にコンジュゲートされたインフルエンザヘマグルチニンタンパク質の融合開始領域（ＦＩＲ）ドメインからのセグメントを含む。本明細書に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートを利用することでインフルエンザ感染を治療又は予防することができ、またインフルエンザウイルス／宿主細胞膜融合を干渉するインフルエンザ特異的治療用抗体を調製することができる。ペプチドコンジュゲートは、インフルエンザ感染症の広域にわたる治療又は予防に有用な医薬組成物に処方し得る。【選択図】なし

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１３年３月１４日に出願の米国特許出願第１３／８２８９８８号の一部継続出願であり、この文献は参照により全て本明細書に援用される。

本発明は、免疫原性インフルエンザヘマグルチニンＡ２（ＨＡ２）由来ペプチドコンジュゲート及びこのコンジュゲートを使用した、インフルエンザウイルスに対する特異的抗体応答の誘導方法に関する。

配列リストの組み込み
本願に関する生物学的配列情報は、本願と共に提出したファイル名「ＴＵ−２７１−５−ＳＥＱ．ｔｘｔ」（２０１３年３月１４日に作成。ファイルサイズ２９３６８バイト。参照により本明細書に援用される）のＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる。

ヘマグルチニン（ＨＡ）はインフルエンザウイルス（オルトミクソウイルス）のエンベロープタンパク質であり、また原型ＲＮＡウイルスクラスＩ融合タンパク質である。ＨＡは感染細胞において前駆体タンパク質ＨＡ０として産生され、タンパク質分解によりＨＡ１及びＨＡ２と称される２つのタンパク質に開裂する。ＨＡ２は融合ペプチドと称されるアミノ末端疎水性ドメインを有し、ヘマグルチニン前駆体タンパク質の開裂中に露出する。レトロウイルスの膜貫通タンパク質は、融合ペプチドに加え、ＨＡ２の公知の構造と共通する幾つかの構造的特徴を有し、長く延びたアミノ末端へリックス（Ｎ−ヘリックス、通常「７アミノ酸繰り返し」又は「ロイシンジッパー」）、カルボキシ末端ヘリックス（Ｃ−ヘリックス）及び膜貫通ドメインの近位にある芳香族モチーフが含まれる。これら５つのドメインのうち少なくとも４つの存在により、ウイルスエンベロープタンパク質はクラスＩ融合タンパク質であると定義される。

図１は、クラスＩウイルスに属する６つのファミリーの融合タンパク質の６つの同定されているドメインを示す。融合タンパク質は疎水性融合ペプチドから始まり、アンカーペプチドで終端し、長く延びたアミノ末端α−へリックス（Ｎ−ヘリックス、通常「７アミノ酸繰り返し」又は「ロイシンジッパー」）、カルボキシ末端α−ヘリックス（Ｃ−ヘリックス）及び場合によってはビリオンエンベロープの近位にある芳香族モチーフが組み込まれている。本明細書において融合開始領域（ｆｕｓｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＩＲ）と称する６番目のドメインは、（Ｇａｒｒｙ及びＷｉｌｓｏｎの）米国特許第７４９１７９３号明細書及び米国特許第８２２２２０４号明細書に開示されており、各文献は参照により全て本明細書に援用される。

インフルエンザＡウイルスには複数のサブタイプがある。各ウイルスサブタイプは、ウイルスの脂質膜エンベロープに埋め込まれた２つの糖タンパク質のある特定の組み合わせパターンを含む。サブタイプを決定するこれら２つの糖タンパク質はヘマグルチニンＨＡ及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。ＨＡにはそれぞれＨ１〜Ｈ１７と称される１７種の公知の変異体があり、ノイラミニダーゼには、それぞれＮ１〜Ｎ９と称される９種の公知の変異体がある。各ウイルスサブタイプはそれぞれそのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ変異体数を特徴として特定される。例えば、インフルエンザＡサブタイプＨ３Ｎ２はブタインフルエンザであり、サブタイプＨ５Ｎ１はトリインフルエンザである。

米国人口の約１０〜２０パーセントが毎年、季節性インフルエンザを患う。殆どの人は１〜２週間でインフルエンザから回復するが、非常に年若い人、高齢者、また慢性的な疾患を抱えた人はインフルエンザ感染後に肺炎及び他の致死的な合併症を発症する場合がある。インフルエンザを引き起こすのはインフルエンザウイルスであり、オルトミクソウイルスの１種であり、ウイルスのゲノムセグメントの再集合及び変異の過程を通して新しい株を簡単に作り出す。

クラスＩウイルスのＦＩＲは、ウイルスエンベロープ／宿主細胞膜融合に関わるウイルス融合エンベロープタンパク質の領域であり、ウイルスエンベロープ／宿主細胞膜融合とは宿主細胞膜に結合したウイルスが宿主細胞膜の完全性を乱してウイルスの遺伝子材料を宿主細胞に注入する過程である。この過程はウイルスエンベロープと宿主細胞膜との合体を伴い、この合体はウイルス融合タンパク質（例えば、インフルエンザウイルスの場合はヘマグルチニン）が仲介し、宿主細胞の内部はウイルスの内部に露出する。上記の米国特許第７４９１７９３号明細書及び米国特許第８２２２２０４号明細書（Ｇａｒｒｙ及びＷｉｌｓｏｎ）に開示されるように、ＦＩＲのセグメントを含む又はそれから成る比較的短いペプチドはウイルス融合タンパク質に結合して融合を起こさせるのに必要な立体構造変化に干渉することができる。ウイルスは依然として宿主細胞膜の表面に結合できるという事実にも関わらず、そのようなペプチドはそうやってウイルスの宿主細胞への感染を防止する。したがって、ＦＩＲペプチドは、ウイルス融合メカニズムそれ自体を含む生化学的な事象に干渉するというよりは概してウイルスの宿主細胞への結合を防止する抗体の産生を伴う従来のワクチン治療とは全く異なるメカニズムでウイルスの感染能を阻害する。

伝染性が高いＡ型インフルエンザウイルス株は流行及び世界的流行を引き起こし得る。近年、高い死亡率をもたらし得るトリインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５Ｎ１の病原性が高い株が出現している。公衆衛生にとって、またバイオテロの潜在的な手段としてのインフルエンザウイルスの脅威に対処することが喫緊の課題である。したがって、季節性インフルエンザ、また世界的流行を引き起こすインフルエンザ及び武器化されたインフルエンザの高まる脅威を制御するための治療用組成物及び方法を開発することが現在、求められている。本明細書に記載のペプチドコンジュゲート、抗体はこれらのニーズに取り組むものである。

本明細書に記載の免疫原性インフルエンザヘマグルチニン由来ペプチドコンジュゲートは、インフルエンザウイルスに対する特異的治療用抗体応答を誘導する。本明細書に記載されるような免疫原性ペプチドコンジュゲートは、キャリアタンパク質（例えば、免疫原性キャリアタンパク質）に連結基でコンジュゲートされたヘマグルチニン（ＨＡ）融合開始領域（ＦＩＲ）ペプチド又はその変異体を含む。ＨＡ ＦＩＲペプチドは５０個以下のアミノ酸残基から成り、また配列番号１又は少なくとも５０％の配列同一性を共有し且つ配列番号１とは、Ｖ１Ｉ、Ｖ１Ｌ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｇ、Ｖ１Ｔ、Ｖ１Ｓ、Ｖ１Ｍ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２Ｒ、Ｄ３Ｅ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｓ、Ｔ４Ｑ、Ｔ４Ａ、Ｋ５Ｆ、Ｋ５Ｍ、Ｋ５Ｉ、Ｋ５Ｖ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ａ、Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｖ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｔ、Ｉ６Ｓ、Ｉ６Ｑ、Ｉ６Ｎ、Ｄ７Ｅ、Ｌ８Ｉ、Ｌ８Ｖ、Ｌ８Ａ、Ｗ９Ｙ、Ｓ１０Ｔ、Ｓ１０Ｇ、Ｓ１０Ａ、Ｓ１０Ｍ及びＥ１４Ｋから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換で異なる配列番号１の変異体のアミノ酸配列を含むインフルエンザヘマグルチニン２タンパク質のセグメントを含む。幾つかの実施形態において、インフルエンザヘマグルチニン２タンパク質のセグメントは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６及びＨ１７から成る群から選択されるインフルエンザＡサブタイプのヘマグルチニン２タンパク質からの最高２５個の追加のアミノ酸残基を含む。追加の残基は、配列番号１又はその変異体に、選択したインフルエンザＡサブタイプのヘマグルチニン２タンパク質のアミノ酸配列において隣接している。任意で、ＨＡ ＦＩＲペプチドは、インフルエンザＡヘマグルチニン２タンパク質由来ではない１つ以上のペプチド配列を含み得る。

本明細書に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートはインフルエンザ感染症の治療又は予防及びインフルエンザウイルス／宿主細胞膜融合を干渉するインフルエンザ特異的治療用抗体の誘発に有用である。このペプチドコンジュゲートは、幅広いインフルエンザ感染症の治療又は予防に有用な医薬組成物に処方し得る。本明細書に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートを利用することでインフルエンザ感染を治療又は予防し且つインフルエンザウイルス／宿主細胞融合を干渉するインフルエンザ特異的治療用抗体を誘発し得る。ペプチドコンジュゲートは、医薬的に許容可能なキャリアと組み合わせて、インフルエンザ感染症の治療又は予防に有用な医薬組成物に処方し得て、任意で、１つ以上のアジュバント、賦形剤等を含む。

一実施形態において、免疫原性インフルエンザヘマグルチニン由来ペプチドコンジュゲートのヘマグルチニンＦＩＲペプチドは、配列番号１（配列番号２の残基８４〜９９。インフルエンザＡサブタイプＨ３ヘマグルチニン２の代表的な配列）又はその変異体から成る。

本明細書に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートのキャリアタンパク質部はいずれのタンパク質又はポリペプチド分子にもなり得て、好ましくは、被験者に投与した場合に免疫反応（例えば、抗体産生）を誘発できるものである。そのようなポリペプチドの非限定的な例には、例えばＫＬＨ、コンコレパス・コンコレパス（Ｃｏｎｃｈｏｌｅｐａｓ ｃｏｎｃｈｏｌｅｐａｓ）ヘモシアニン（ＣＣＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カチオン化ＢＳＡ、オボアルブミン（ovalbumin）、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質等が含まれる。そのような免疫原性タンパク質は当該分野で周知である。

本発明の別の態様は、インフルエンザ感染症の治療又は予防方法における、本明細書に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートの使用である。この方法は、ペプチドコンジュゲート（例えば、治療有効量で）を被験者に投与することを含む。ペプチドコンジュゲートは被験者の免疫系を刺激することで、コンジュゲートのＦＩＲペプチド部を特異的に標的にする治療用抗体を産生させる。ＦＩＲペプチド単独（キャリアタンパク質を伴わない）では被験者に投与しても免疫応答を誘発しない事実にもかかわらず、この治療用抗体応答は起きる。免疫原性ペプチドコンジュゲートは、必要に応じて、医薬的に許容可能なキャリアと組み合わせて医薬組成物に含め得る。

本発明の別の態様は、細胞に結合したインフルエンザウイルスとウイルスが結合した細胞の膜との融合を阻害可能な単離された治療用抗体である。好ましくは、治療用抗体は、ヒト、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体である。そのような治療用抗体は、例えば、本明細書に記載されるような免疫原性ペプチドコンジュゲートで治療した患者の血清から抗体を単離し、免疫原性ペプチドコンジュゲートで治療した（即ち、投与した）ヒト被験者からヒト抗体の組み換えバージョンを作り出す又は免疫原性ペプチドコンジュゲートで治療した（即ち、投与した）適切な非ヒト宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ）から抗体の組み換えキメラ若しくはヒト化バージョンを作り出すことで得ることができる。

本発明の特定の態様及び特徴を説明するために以下の非限定的な実施形態を挙げる。

実施形態１は、連結基によりキャリアタンパク質（例えば、免疫原性キャリアタンパク質）にコンジュゲートされたヘマグルチニン（ＨＡ）融合開始領域（ＦＩＲ）ペプチド又はその変異体を含む免疫原性ペプチドコンジュゲートであり、ＨＡ ＦＩＲペプチドは５０個以下のアミノ酸残基から成り、また配列番号１又は少なくとも５０％の配列同一性を共有し且つ配列番号１とはＶ１Ｉ、Ｖ１Ｌ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｇ、Ｖ１Ｔ、Ｖ１Ｓ、Ｖ１Ｍ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２Ｒ、Ｄ３Ｅ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｓ、Ｔ４Ｑ、Ｔ４Ａ、Ｋ５Ｆ、Ｋ５Ｍ、Ｋ５Ｉ、Ｋ５Ｖ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ａ、Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｖ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｔ、Ｉ６Ｓ、Ｉ６Ｑ、Ｉ６Ｎ、Ｄ７Ｅ、Ｌ８Ｉ、Ｌ８Ｖ、Ｌ８Ａ、Ｗ９Ｙ、Ｓ１０Ｔ、Ｓ１０Ｇ、Ｓ１０Ａ、Ｓ１０Ｍ及びＥ１４Ｋから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換で異なる配列番号１の変異体のアミノ酸配列を含むインフルエンザヘマグルチニン２タンパク質のセグメントを含む。

実施形態２は実施形態１の免疫原性ペプチドコンジュゲートを含む又はそれから成り、インフルエンザヘマグルチニン２タンパク質のセグメントは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６及びＨ１７から成る群から選択されるインフルエンザＡサブタイプのヘマグルチニン２タンパク質からの最高２５個の追加のアミノ酸残基を含み、追加の残基は、配列番号１又はその変異体に、選択したインフルエンザＡサブタイプのヘマグルチニン２タンパク質のアミノ酸配列において隣接している。

実施形態３は実施形態１又は実施形態２の免疫原性ペプチドコンジュゲートを含み又はそれから成り、ＨＡ ＦＩＲペプチドはインフルエンザＡヘマグルチニン２タンパク質由来ではない１つ以上のペプチド配列を含む。

実施形態４は実施形態１〜３のいずれか１つの免疫原性ペプチドコンジュゲートを含み又はそれから成り、ヘマグルチニンＦＩＲペプチドは、配列番号１又は少なくとも５０％の配列同一性を共有し且つ配列番号１とはＶ１Ｉ、Ｖ１Ｌ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｇ、Ｖ１Ｔ、Ｖ１Ｓ、Ｖ１Ｍ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２Ｒ、Ｄ３Ｅ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｓ、Ｔ４Ｑ、Ｔ４Ａ、Ｋ５Ｆ、Ｋ５Ｍ、Ｋ５Ｉ、Ｋ５Ｖ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ａ、Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｖ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｔ、Ｉ６Ｓ、Ｉ６Ｑ、Ｉ６Ｎ、Ｄ７Ｅ、Ｌ８Ｉ、Ｌ８Ｖ、Ｌ８Ａ、Ｗ９Ｙ、Ｓ１０Ｔ、Ｓ１０Ｇ、Ｓ１０Ａ、Ｓ１０Ｍ、Ａ１３Ｔ及びＥ１４Ｋから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換で異なる配列番号１の変異体から成るアミノ酸配列を有する。

実施形態５は実施形態１〜４のいずれかのペプチドコンジュゲートを含み又はそれから成り、キャリアタンパク質は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイドタンパク質、ジフテリア毒素誘導体ＣＲＭ₁₉₇、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カチオン化ＢＳＡ、コンコレパス・コンコレパスヘモシアニン（ＣＣＨ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶコア抗原タンパク質、キーホール・リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ロタウイルスカプシドタンパク質、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）Ｌ１タンパク質、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質、オボアルブミン及び全長インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質から成る群から選択される。

実施形態６は実施例１〜５のいずれかのペプチドコンジュゲートを含み又はそれから成り、キャリアタンパク質は全長インフルエンザヘマグルチニンタンパク質である。

実施形態７は実施形態６のペプチドコンジュゲートを含み又はそれから成り、全長インフルエンザヘマグルチニンタンパク質はサブタイプのインフルエンザＡヘマグルチニンであり、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６及びＨ１７から成る群から選択されるヘマグルチニンである。

実施形態８は実施形態６のペプチドコンジュゲートを含み又はそれから成り、全長インフルエンザヘマグルチニンタンパク質は、インフルエンザＢヘマグルチニンタンパク質である。

実施形態９は実施形態１〜８のいずれかのペプチドコンジュゲートを含み又はそれから成り、連結基はスルフィド結合を含む（例えば、本明細書に記載の一般的なシステイン−マレイミドタイプのコンジュゲーション技法の場合のように）。

実施形態１０は実施形態１〜８のいずれかのペプチドコンジュゲートを含み又はそれから成り、連結基は式Ｉ：
の４−（Ｎ−スクシンイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボニル基であり、式ＩのＣｙｓ残基はそのスルフヒドリル基を介してスクシンイミド部分に結合され、またペプチド結合によりＦＩＲペプチドのＮ末端に結合され、任意でＣｙｓとＦＩＲペプチドとの間には１〜５個の残基の追加のスペーサペプチドがあり、式Ｉのシクロヘキシル部分上の１−カルボニル基はアミド結合によりキャリアタンパク質上の一級アミンに結合している。

実施形態１１は実施形態１〜１０のいずれかのペプチドコンジュゲートを含み又はそれから成り、ヘマグルチニンＦＩＲペプチドは、連結基によりキャリアタンパク質にコンジュゲートされた配列番号１から成るアミノ酸配列を有する。

実施形態１２はインフルエンザ感染症を治療又は予防するための医薬組成物を含み又はそれから成り、実施形態１〜１１のいずれかの免疫原性ペプチドコンジュゲートを医薬的に許容可能なキャリア中に含む。

実施形態１３はインフルエンザ感染症を治療又は予防するための方法を含み又はそれから成り、治療有効量の実施形態１〜１１のいずれかの免疫原性ペプチドコンジュゲートをインフルエンザに罹患している又はインフルエンザに罹る恐れがある被験者に投与することを含む。

実施形態１４は特異的治療用抗体応答を被験者において誘導する方法を含み又はそれから成り、実施形態１〜１１のいずれかの免疫原性ペプチドコンジュゲートを被験者に投与することを含む。

実施形態１５は実施形態１４の方法を含み又はそれから成り、特異的治療用抗体応答はインフルエンザウイルス（例えば、ウイルスのエンベロープ）と宿主細胞の膜との融合を阻害する。

実施形態１６はインフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質のＦＩＲ領域に特異的に結合可能な治療用モノクローナル抗体を含み又はそれから成り、モノクローナル抗体は実施形態１〜１１のいずれかの免疫原性ペプチドコンジュゲートの投与後に宿主生物内で産生された抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、抗体はインフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質のＦＩＲ領域に特異的に結合する。

実施形態１７は実施形態１６の治療用モノクローナル抗体を含み又はそれから成り、治療用モノクローナル抗体はヒト、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体である。

実施形態１８は、被験者においてインフルエンザウイルス感染症を治療又は予防するための実施形態１６又は実施形態１７の治療用モノクローナル抗体の使用を含む又はそれから成る。

実施形態１９は、インフルエンザ感染症を治療又は予防するための実施形態１〜１１のいずれかの免疫原性ペプチドコンジュゲートの使用を含む又はそれから成る。

実施形態２０は、被験者においてインフルエンザウイルスに対する特異的治療用抗体応答を誘導するための実施形態１〜１１のいずれかの免疫原性ペプチドコンジュゲートの使用を含む又はそれから成る。

ＶＥＤＴＫＩＤＬＷＳＹＮＡＥＬＬから成るアミノ酸配列配列番号１を有するヘマグルチニンＦＩＲペプチドは強力な抗ウイルス特性を有すると判明している（米国特許第８２２２２０４号明細書を参照のこと）。ＫＬＨにコンジュゲートさせたこの同じヘマグルチニンＦＩＲペプチドを含む免疫原性ペプチドコンジュゲートはマウス、ウサギ及びヤギにおいて、ヘマグルチニンＦＩＲペプチドを特異的に標的とする抗体の産生を誘発した。驚くべきことに、この抗体はウイルスエンベロープ／宿主細胞膜融合過程を干渉するが、標準的なアッセイにおいては赤血球凝集を有意に干渉しないことが判明した。これは、ウイルスの宿主細胞との実際の物理的な相互作用（例えば、結合）を干渉する典型的な抗インフルエンザ抗体の作用様式と対照的である。

タイプＩウイルスの６つのファミリーの融合タンパク質の６つの同定されているドメインを示し、融合開始領域（ＦＩＲ）を含む。 遊離ＦＩＲペプチドとＥＬＩＳＡプレート結合ＦＩＲペプチドとを比較するペプチド結合競合アッセイの結果のグラフである。 ＥＬＩＳＡプレート結合ヘマグルチニンと遊離ＦＩＲペプチドとの間での結合競合のグラフである。

本明細書に記載の免疫原性インフルエンザヘマグルチニン由来ペプチドコンジュゲートは、インフルエンザウイルスに対する特異的治療用抗体応答を誘導する。免疫原性ペプチドコンジュゲートは、キャリアタンパク質にコンジュゲートされたインフルエンザヘマグルチニンタンパク質の融合開始領域（ＦＩＲ）ドメインのセグメント（本明細書においては「ヘマグルチニンＦＩＲペプチド」又は「ＦＩＲペプチド」と称される）から構成される。ヘマグルチニンＦＩＲペプチドは、配列番号１又は少なくとも５０％の配列同一性を共有し且つ配列番号１とはＶ１Ｉ、Ｖ１Ｌ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｇ、Ｖ１Ｔ、Ｖ１Ｓ、Ｖ１Ｍ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２Ｒ、Ｄ３Ｅ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｓ、Ｔ４Ｑ、Ｔ４Ａ、Ｋ５Ｆ、Ｋ５Ｍ、Ｋ５Ｉ、Ｋ５Ｖ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ａ、Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｖ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｔ、Ｉ６Ｓ、Ｉ６Ｑ、Ｉ６Ｎ、Ｄ７Ｅ、Ｌ８Ｉ、Ｌ８Ｖ、Ｌ８Ａ、Ｗ９Ｙ、Ｓ１０Ｔ、Ｓ１０Ｇ、Ｓ１０Ａ、Ｓ１０Ｍ、Ａ１３Ｔ及びＥ１４Ｋから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換で異なる配列番号１の変異体から成るアミノ酸配列を有する。

配列番号１は、配列番号２のアミノ酸配列を有するインフルエンザＡヘマグルチニンサブタイプＨ３株のＦＩＲのセグメント（即ち、残基８４〜９９）である。配列番号１の変異体であるＦＩＲペプチドは、保存的置換である又は別のヘマグルチニンサブタイプ（即ち、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１５、Ｈ１６又はＨ１７）由来の対応するアミノ酸残基の置換である特定の置換で配列番号１とは異なる。これらの他のサブタイプ由来の配列番号１に対応するペプチドを表１に示す。好ましくは、変異体は配列番号１と同一である又は高い配列同一性（例えば、９５％以上の配列同一性、好ましくは９８％以上の配列同一性、より好ましくは１００％の配列同一性）を共有する。

本明細書において、用語「保存的置換」及びその文法的な変化形は、異なってはいるが野生型残基と同じアミノ酸種類である、あるペプチドの配列におけるあるアミノ酸残基の存在のことである（即ち、非極性残基は非極性残基に置き換わり、芳香族残基は芳香族残基に置き換わり、極性非荷電残基は極性非荷電残基に置き換わり、荷電残基は荷電残基に置き換わる）。加えて、保存的置換は、置き換わる野生型残基と同じ符号の界面ハイドロパシー値を有し且つ概して同様の規模の残基を包含し得る。

本明細書において、用語「非極性残基」とはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンのことであり、用語「芳香族残基」とはフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジン（荷電アミノ酸ともみなされる）のことであり、用語「極性非荷電残基」とはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンのことであり、用語「荷電残基」とは負に帯電したアミノ酸アスパラギン酸及びグルタミン酸、また正に帯電したアミノ酸リジン、アルギニン及びヒスチジンのことである（芳香族アミノ酸ともみなされる）。

表１の配列は全て配列番号１と５０％を超える配列同一性を共有し、即ち配列番号３、４、６、７及び１２は配列番号１と６２．５％同一であり、配列番号５、８、９、１０及び１１は配列番号１と５６．２％同一である。したがって、様々なインフルエンザヘマグルチニンサブタイプが配列番号１で例示されるＦＩＲの１６アミノ酸残基セグメントにおいて高く相同性であることは明らかである。本明細書に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートのＦＩＲペプチド部（配列番号１）における置換は主に、表１に挙げた配列番号３〜１２にみられる違い、また配列番号１及び３〜１２にみられる残基の１つについての共通保存的置換由来であり、例えばロイシン、グリシン、セリン又はアラニンによるバリン残基の置換、グルタミン酸残基でのアスパラギン酸残基の置換、グリシン又はメチオニンでのセリン残基の置換等である。

本発明を説明するにあたって（特には以下の請求項の文脈において）の不定冠詞、定冠詞及び同様の指示物の使用は、本明細書において別段の定めがない限り又は文脈と明らかに矛盾していない限り、単数及び複数の両方をカバーすると解釈される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は別段の定めがない限り制限のない語句であると解釈される（即ち、「〜を含むが〜に限定されない」を意味する）。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の定めがない限り、その範囲にはいる別々の各値に個別に言及する簡略的な方法としたに過ぎず、別々の各値は、あたかも本明細書において個別に列挙されたがごとく本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は本明細書で別段の定めがない限り又は文脈に明らかに矛盾していない限り、いずれの適切な順序でも実行し得る。本明細書で挙げる任意及び全ての実施例又は例示を意味する語句（例えば、「例えば」）の使用は本発明をよりわかりやすくするためだけのものであり、そうでないとの主張がない限り、本発明の範囲を限定しない。明細書中のいずれの語句も、請求していない要素を本発明の実施に必須であると示すものと解釈されるべきではない。

本明細書に記載のペプチドコンジュゲート及び方法で有用なキャリアタンパク質には全てのタンパク質が含まれ、好ましくは被験者に投与すると抗体産生を誘発できる免疫原性タンパク質である。そのようなキャリアタンパク質及びキャリアタンパク質を対象のペプチドにコンジュゲートする方法は当該分野で周知であり、またいわゆる「結合型ワクチン」の製造に使用されている。キャリアタンパク質、連結基及びコンジュゲーション法の幾つかの例は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６０３１８号として出願された国際公開ＷＯ２０１２／０６５０３４号パンフレットに記載されており、この文献は参照により本明細書に全て援用される。キャリアタンパク質の幾つかの非限定的な例には、髄膜炎菌の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイドタンパク質、ジフテリア毒素誘導体（ＣＲＭ１９７）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カチオン化ＢＳＡ、コンコレパス・コンコレパスヘモシアニン（ＣＣＨ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質（例えば、表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶコア抗原タンパク質）、キーホール・リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ロタウイルスカプシドタンパク質、ウシパピローマウイルスのＬ１タンパク質（ＢＰＶ Ｌ１）、ヒトパピローマウイルスのＬ１タンパク質（ＨＰＶ Ｌ１、例えばＨＰＶタイプ６、１１又は１６）、オボアルブミン及びインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、例えばヘマグルチニンＡサブタイプＨ１〜Ｈ１７由来のＨＡタンパク質が含まれる。インフルエンザＨＡタンパク質の代表的な配列には、Ｈ１（配列番号１３）、Ｈ２（配列番号１４）、Ｈ３（配列番号１５）、Ｈ５（配列番号１６）及びＨ７（配列番号１７）が含まれる。本明細書に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートで用いるためのキャリアタンパク質、カップリング（コンジュゲーション）技法及び連結基の選択は、タンパク質ワクチン合成分野の当業者の能力の範囲に十分入る。

キャリアタンパク質はキャリアタンパク質及び対象ペプチド上の反応部位で連結基を介してコンジュゲートされる。コンジュゲーションに有用な求核性官能基は当該分野で周知である（例えば、米国特許第５６０６０３０号明細書を参照のこと。この文献は参照により全て本明細書に援用される）。例えば、アミノ酸残基上に存在する一級アミノ基、例えばリジンのεアミノ基及びタンパク質のＮ末端アミノ酸のαアミノ基をコンジュゲーション用の官能基として使用し得る。多くの場合、キャリアタンパク質の１つ以上の一級アミノ基をチオール含有基（例えば、システイン又はホモシステイン残基から）、求電子性不飽和基、例えばマレイミド基又はハロゲン化基、例えばブロモアセチル基にチオール反応性ペプチドへのコンジュゲーションのために変換することが望ましい。任意で、ヘマグルチニンＦＩＲペプチド上又はペプチドに付着しているリンカー部分上の一級アミノ基を、例えばジスルフィド結合によるキャリアタンパク質上でのチオール（スルフヒドリル）部分とのカップリングのためにチオール含有基に変換し得る。

ヘマグルチニンＦＩＲペプチド及びキャリアタンパク質は、当該分野で公知のいずれの連結基及びコンジュゲーション法を用いてもコンジュゲートさせ得る。幾つかの実施形態において、コンジュゲーションは、例えば、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ）、ε−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］−スルホスクシンイミドエステル（ｓＥＭＣＳ）、ビス−ジアゾベンジジン（ＢＤＢ）、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、グルタルアルデヒド、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）又はＮ−アセチルホモシステインチオールアクトン（ＮＡＨＴ）を用いて達成し得る。

ＳＭＣＣ法において、ＳＭＣＣはシステイン残基のＳＨ基をキャリアタンパク質上のリジン残基のアミノ基に架橋する。ＳＭＣＣ法において、キャリアタンパク質はまず、ＳＭＣＣを一級アミンと反応させることで活性化される（例えば、キャリアタンパク質のリジン残基上）。得られた活性化キャリアを次に過剰なＳＭＣＣ及びその副産物から分離し、システイン含有ペプチドが追加される。システインのチオール基がＳＭＣＣ誘導体化キャリアタンパク質のマレイミド部分の二重結合を越えて加わり、キャリアをペプチドにカップリングする共有スルフィド結合が形成される。ヘマグルチニンＦＩＲペプチドがシステイン残基を含まないならば、システイン残基をペプチドに、好ましくはＮ末端又はＣ末端で加えるべきである。ヘマグルチニンＦＩＲペプチドのエピトープ部がシステインを含有する又は２つ以上のシステイン基がペプチドにあるならば、システイン残基を修飾しない別のコンジュゲーション技法を利用すべきである。キャリアタンパク質とペプチドとの連結はペプチドのエピトープ部を干渉すべきではないことから、追加するシステイン残基を任意で、１つ以上のアミノ酸残基をスペーサとして含めることでヘマグルチニンＦＩＲペプチドから分離し得る。キャリアに付着したシステイン、スペーサ残基及び修飾ＳＭＣＣが一緒になってヘマグルチニンＦＩＲペプチドコンジュゲートの連結基を構成する。

ペプチドのキャリアタンパク質への別の単純なカップリングはカルボジイミド架橋剤、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−２−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）等を用いてカルボキシル基を一級アミン基に共有結合させることで達成し得る。この方法は単純であり、また多くの考えられ得るエピトープに対する抗体産生を可能にする比較的ランダムな配向性をもたらす。欠点は、ＥＤＣカップリングがある程度の重合を引き起こし得ることである。これによりコンジュゲートの溶解性が低下して材料の取り扱いが複雑になる可能性がある。

他のカップリング剤を用いてＦＩＲペプチドをキャリアタンパク質に、直接又は連結基を介してコンジュゲートし得る。例えば、コンジュゲーションをイソシアネートカップリング剤（例えば、２−モルホリノエチルイソシアニド、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン。チオール基をキャリアタンパク質に追加するために使用し得て、例えばマレイミド又はブロモアセチル官能化ペプチドとのＯＭＰＣカップリング）又はハプテン（潜在的な免疫原）をポリペプチド及びタンパク質にカップリングするための他の物質を用いて達成し得て、その多くはタンパク質及びワクチン分野で周知である。

非特異的架橋剤及びその使用は当該分野で周知である。そのような試薬及びその使用の例には、グルタルアルデヒドとの反応；Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとの反応（スクシニル化キャリアの混合を伴う又は伴わない）；グリクシル化置換基の過ヨウ素酸酸化とそれに続くナトリウムボロヒドリド又はナトリウムシアノボロヒドリドの存在下でのタンパク質キャリアの遊離アミノ基へのカップリング；非アシル化末端セリン及びトレオニン残基の過ヨウ素酸酸化による末端アルデヒドの生成。次にアミン又はヒドラジドと反応させることでシッフ塩基又はヒドラゾンを生成し得て、二級アミンにシアノボロヒドリドで還元し得る；芳香族アミノ基のジアゾ化とそれに続くタンパク質のチロシン側鎖残基上でのカップリング；イソシアネートとの反応；又は混合無水物の反応が含まれる。リンカーは、スペーサ基、例えば追加のアミノ酸残基、アジピン酸ジヒドラジド等で補い得る及び延長し得る。

ＦＩＲペプチドのキャリアタンパク質へのコンジュゲーションで使用するための典型的なスペーサペプチド基には、単一アミノ酸（例えば、Ｃｙｓ）及びＦＩＲペプチドに付着した短ペプチド配列（即ち、短非ヘマグルチニンＦＩＲペプチド配列）、例えばリジン含有ペプチド、例えばフラッグタグ配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１８）、システイン含有ペプチド等が含まれる。幾つかの好ましい連結基はスルフィド結合（例えば、ＳＭＣＣ及び関連するカップリング法の場合のように）を含む。幾つかの好ましい連結基には、式Ｉ：
の４−（Ｎ−スクシンイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボニル基が含まれ、式Ｉ中のＣｙｓ残基はそのスルフヒドリル側鎖を介してスクシンイミド部分に結合され、またＦＩＲペプチドのＮ末端にペプチド結合により結合される。任意で、１〜５個のアミノ酸残基の追加のスペーサペプチドをＣｙｓとＦＩＲペプチドとの間に含め得る。式Ｉのシクロヘキシル部分上の１−カルボニル基は、アミド結合によりキャリアタンパク質上の一級アミンに結合される。

幾つかの実施形態において、ペプチドコンジュゲートはキャリアタンパク質に付着した単一のヘマグルチニンＦＩＲペプチドを含み、他の実施形態においては、２つ以上のヘマグルチニンＦＩＲペプチドをキャリアタンパク質に付着させ得る。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートのヘマグルチニンＦＩＲペプチド部に特異的な（即ち、特異的に及び選択的に結合可能である）及びインフルエンザウイルスのＨＡ２のＦＩＲに結合する治療用モノクローナル抗体を提供する。そのような治療用モノクローナル抗体は、本明細書に記載されるような免疫原性ペプチドコンジュゲートのＦＩＲ部に特異的に結合する抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。治療用抗体はヒト抗体（例えば、ペプチドコンジュゲートに曝露された被験者の血清から単離）、非ヒト抗体（例えば、ヒト以外の被験体生物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はペプチドコンジュゲートに曝露される他の適切な生物から単離）、またそのような非ヒト抗体のキメラ及びヒト化バージョンになり得る。

インフルエンザウイルスに曝露された被験者に投与すると（例えば、治療有効量で）、治療用モノクローナル抗体はインフルエンザウイルス／宿主細胞膜融合を阻害することでインフルエンザウイルスによる宿主細胞の感染を予防する。この阻害は、抗体がインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質のＦＩＲ領域に結合することで達成される。したがって、本明細書に記載の治療用モノクローナル抗体は、免疫原性ペプチドコンジュゲートのヘマグルチニンＦＩＲペプチド部と同じ又は極めて似た治療メカニズムを有する（ＦＩＲペプチドの治療メカニズムの考察については米国特許第８２２２２０４号明細書を参照のこと）。

本明細書において、用語「治療有効量」及びその文法的な変化形は、被験者に投与した時にインフルエンザウイルスに対する特異的治療用抗体応答を誘発するような免疫原性ペプチドコンジュゲートの量又はインフルエンザ感染症を予防する若しくは臨床的に軽減するのに十分な治療用抗体の量を意味する。被験者に投与する用量及び投与回数（例えば、単回又は複数回）は多種多様な要因に応じて異なり、投与経路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の度合い、併用療法、治療頻度及び望む効果、その投与形態におけるコンジュゲート又は抗体の濃度等が含まれる。用量範囲の調節及び操作、また個体における組成物の治療有効性を決定するインビトロ及びインビボの方法は、医学分野の通常の技術を有する人の能力の範囲に十分はいっている。例えば、医薬的に許容可能なキャリア中にペプチドコンジュゲート又は治療用抗体を含む約１〜１００ｍＬの溶液の範囲内の用量を利用し得る。ペプチドコンジュゲート又は治療用抗体は溶液中、約０．０１μｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在する。ペプチド又は抗体は非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内注射又は注入）又は経粘膜的（例えば、エアロゾル化された液体又は粉末組成物の吸入）に投与し得る。

本明細書に記載の治療用抗体の結合特異性及び作用メカニズムは従来のインフルエンザワクチンのワクチン接種に応答して生成される抗体（典型的にはウイルスと宿主細胞との物理的な相互作用を干渉し、通常、株特異的であり、流行しているインフルエンザ株にあわせて季節のワクチンを毎年製剤しなおす必要性が強調される）とは極めて対照的である。対照的に、本明細書に記載の治療用抗体は驚くべきことにウイルスの融合過程に干渉し、またインフルエンザの様々な株（インフルエンザＡ及びＢの両方を含む）に対して広く反応性である。

好ましくは、治療用モノクローナル抗体はヒト、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体の調製方法は、単離した天然抗体からルーチン的にモノクローナル抗体を作り出す営利事業なのだが、当該分野で周知である。キメラ及びヒト化モノクローナル抗体並びにそのような抗体の製造方法もまた、抗体分野で周知である（例えば、米国特許第５８２４３０７号、第６８００７３８号、第７０７０７７５号、第７０８７４０９号、第７４５６２６０号及び第７８０７１６１号の明細書を参照のこと。各文献は参照により全て本明細書に援用される）。

キメラ化工程は、非ヒト抗体の一部をヒト抗体の対応する一部（例えば、定常部）と置き換えることを含む。これは、ヒトの免疫系が非ヒト抗体を異質なタンパク質として攻撃するのを防止するために行われる。キメラ抗体は概して、非ヒト抗体のＣＤＲ及び又は可変部全体を保持し、非ヒト定常ドメインをヒト定常ドメインと置き換える。このため、キメラ抗体は非ヒト抗体の抗原特異性を保持するが、抗体に対する望ましくない免疫反応（例えば、アレルギー反応）のレベルは低い。

ヒト化抗体はキメラ抗体と似ているが、ヒト化抗体の非ヒト特性は概してより少ない。これは、例えばキメラ抗体の可変部の配列を修飾してヒト抗体の特徴をより反映させる、例えば抗体における非ヒト配列のＣＤＲ又は他の部分間の配列を修飾することで達成し得る。全ての治療用モノクローナル抗体をヒト化する必要があるわけではない。これは一部の治療的処置の期間は短くなり得て、アレルギー性の副作用が起きにくいからである。

完全なヒト抗体も利用し得る。そのようなヒト抗体は、例えば、遺伝子操作された抗体、例えばＣＤＲはヒト由来であるが、天然で産生されるヒト抗体とは１つ以上の点で異なるヒト由来構造を有する抗体になり得て（即ち、免疫原性ペプチドコンジュゲートで治療されたヒト被験者が産生する抗体）、あるいはヒト抗体は、ペプチドコンジュゲートで治療されたヒト被験者の血清から得られる天然抗体のクローンになり得る。

別の態様においては、医薬組成物を提供し、この医薬組成物は本明細書に記載されるような免疫原性ペプチドコンジュゲート又は抗体を含み、インフルエンザ感染症の治療又は予防に使用し得る。特定の好ましい実施形態において、この組成物は、ペプチド、類似体、誘導体又は抗体を被験者に、例えば非経口又は経腸投与、好ましくは注射（例えば、好ましくは静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内注射により）又は経鼻投与（例えば、エアロゾル）により送達するのに適した医薬的に許容可能なビヒクル又はキャリア中に免疫原性ペプチドコンジュゲート又は抗体を含む。有効成分の送達に適したビヒクル及びキャリアは当該分野で周知であり、生理食塩水、緩衝生理食塩水等を好ましくは生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ約６．５〜７．４）で含む。キャリアは他の賦形剤成分、例えば界面活性剤、防腐剤、分散剤、希釈剤、安定剤等も含み、これらは製剤分野で周知である。医薬組成物は、治療有効量の医薬組成物を被験者に投与することでインフルエンザ感染症を治療又は予防する方法の一部として使用し得る。ペプチドコンジュゲート及び抗体用のキャリアは固体又は液体になり得て、その選択は所望の投与方式により決定される。

以下の非限定的な実施例は、本明細書に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート及び方法の特定の態様及び特徴をさらに詳しく説明するためのものである。

実施例１：ヘマグルチニンＦＩＲペプチド−ＫＬＨコンジュゲートの調製
配列番号１のＦＩＲペプチドをＮ末端Ｃｙｓ連結残基を追加して合成し、即ち配列番号１９のペプチドを生成し、次にＳＭＣＣ法を用いてＫＬＨとコンジュゲートした。簡単に説明すると、キャリアＫＬＨタンパク質をまず、ＳＭＣＣを１つ以上の一級アミン基（例えば、キャリアタンパク質のリジン残基上）と反応させることで活性化した。得られた活性化キャリアを次に過剰なＳＭＣＣ及びその副産物から分離した。次に、システイン誘導化ＦＩＲペプチドを活性化ＫＬＨと反応させた。システインのスルフヒドリル（チオール）基がＳＭＣＣ誘導体化キャリアタンパク質のマレイミド部分の二重結合を越えて加わって共有スルフィド結合を形成する。次に、得られたＦＩＲペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを単離した。

実施例２：マウスモノクローナル抗ＦＩＲペプチド抗体の産生
５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスに実施例１で調製したコンジュゲートを注射した。最初の注射は、０日目に完全フロインドアジュバントと混合したＦＩＲペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを利用した。２１、３５、４９及び６３日目に、マウスに、不完全フロインドアジュバント中のＦＩＲ−ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを注射した。血清サンプルをマウスから４５、５９及び７３日目に採取し、９６ウェルプラスチックプレートのウェルにＦＩＲペプチド（配列番号１）が受動的に結合したＥＬＩＳＡ法を用いて抗ＦＩＲペプチド抗体の存在について試験した。高力価の抗ＦＩＲ抗体を有する３匹のマウスを屠殺し、脾臓を回収した。標準的な技法を用いて、脾細胞を回収し、ｓｐ２／０細胞とを融合させ、抗ＦＩＲ抗体を産生するハイブリドーマをＥＬＩＳＡにより同定し、限界希釈によりサブクローニングした。幾つかのクローンが同定され、ＭＡＦ３−２と称されるものをさらなる分析において使用した。

実施例３：ヤギにおける治療用抗ＦＩＲペプチド抗体の産生
ヤギに実施例１で調製したコンジュゲートを注射した。１回目の注射は、完全フロインドアジュバント中の５００μｇのＦＩＲペプチド−ＫＬＨコンジュゲートで行われた。続く注射（２週間間隔）は不完全フロインドアジュバント中の２５０μｇ用量のコンジュゲートで行われた。全部で３回の注射後、最初の注射から５週目に血清サンプルを用意した。プレートＥＬＩＳＡ試験において、血清サンプルがＦＩＲペプチドに対して検出可能な力価を有すると判明した。

ヤギに２５０μｇのＦＩＲペプチド−ＫＬＨを再度注射し、血清サンプルを７週目及び８週目に用意した。７週目及び８週目の血清サンプルをＦＩＲペプチド（配列番号１）に対するその反応性についてプレートＥＬＩＳＡアッセイで滴定した。プレートは非コンジュゲートＦＩＲペプチドでコーティングされ、血清サンプル中の抗体はコーティングを施したプレートに特異的に結合すると判明した。

実施例４：治療用抗ＦＩＲペプチド抗体ウサギの用意
２羽のウサギに実施例１で調製したコンジュゲートを注射した。１回目の注射は、完全フロインドアジュバント中の２００μｇのＦＩＲペプチド−ＫＬＨコンジュゲートで行われた。続く注射（２週間間隔）は不完全フロインドアジュバント中の１００μｇ用量のコンジュゲートで行われた。全部で３回の注射後、最初の注射から５週目に血清サンプルを各ウサギから採取した。プレートＥＬＩＳＡ試験において、血清サンプルがＦＩＲペプチドに対して検出可能な力価を有すると判明した。

ウサギに再度注射し、血清サンプルを７週目及び８週目に採取した。７週目及び８週目の血清サンプルをＦＩＲペプチドに対するその反応性についてプレートＥＬＩＳＡアッセイで滴定した。プレートは標準的な方法により非コンジュゲートＦＩＲペプチドでコーティングされ、血清サンプルはコーティングを施したプレートに特異的に結合すると判明した。固体クロマトグラフィ担体に付着させたＦＩＲペプチドに結合させることで血清サンプルから抗体を単離した。抗体を低ｐＨ（即ち、約ｐＨ２．６８）で放出させた。

単離した抗体は、プレートに結合しているＦＩＲペプチドと溶液中の遊離ＦＩＲペプチドとの間での競合により一般に定義されるように、ＦＩＲペプチドに対して特異的であると判明した。特異性を実証するために、９６ウェルイムノアッセイプレートウェルに、カーボネート／バイカーボネートバッファに溶解させたＦＩＲペプチドをコーティングした。プラスチック上の非結合荷電部位は緩衝脱脂粉乳／洗浄剤懸濁液でブロックされた。精製されたウサギ抗ＦＩＲペプチド抗体をビオチンにカップリングした。次に、ビオチン化抗体溶液の約０．１ｍＬのアリコートを、プレートに加える前の約４５分間にわたってＦＩＲペプチドの段階希釈により中和した。さらなるインキュベーション後、ウェルを緩衝生理食塩水含有洗浄剤で洗浄した。結合した抗ＦＩＲ抗体は、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートとのインキュベーションと続く洗浄及び比色試薬である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの適用により検出された。図２は、プレートに結合したＦＩＲペプチドと遊離ＦＩＲペプチドとの間での結合競合のグラフである。

実施例５：マウスモノクローナル抗体による広域結合
実施例２のＦＩＲペプチドに対する単離されたマウス由来モノクローナル抗体（ＭＡＦ３−２）は、ＦＩＲペプチド抗原との競合により一般に定義されるようにヘマグルチニン（ＨＡ）の様々なサブタイプを認識し、特異的に結合すると判明した。特異性を実証するために、９６ウェルイムノアッセイプレートのウェルに、カーボネート／バイカーボネートバッファに溶解させた様々なサブタイプの市販のヘマグルチニン（ＨＡ：Ｈ１株Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９；Ｈ３株Ａ／ウルグアイ／７１６／０７（Ｈ３Ｎ２）；Ｈ３株Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）；Ｈ５株Ａ／インドガン／青海／１Ａ／０５（Ｈ５Ｎ１））をコーティングした。プラスチック上の非結合荷電部位は緩衝脱脂粉乳／洗浄剤懸濁液でブロックされた。精製されたＭＡＦ３−２抗体をビオチンにカップリングした（ｂｔｎ−ＭＡＦ３−２）。次に、抗体溶液の約０．１ｍＬのアリコートを、ＨＡコーティングプレートに加える前の約４５分間にわたってＦＩＲペプチドの段階希釈により中和した。さらなるインキュベーション後、ウェルを緩衝生理食塩水含有洗浄剤で洗浄した。結合したＦＩＲ抗体は、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートとのインキュベーションと続く洗浄及び比色試薬である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの適用により検出された。図３は、ＥＬＩＳＡプレート結合ＨＡと遊離ＦＩＲペプチドとの間での結合競合のグラフであり、抗ＦＩＲペプチド抗体のＦＩＲ抗原に対する特異性をここでも実証している。

実施例６：インフルエンザウイルスに対する治療用抗ＦＩＲペプチド抗体の評価
細胞及びウイルス：メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）を全ての実験に使用した。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液、炭酸水素ナトリウム溶液、非必須アミノ酸溶液及び熱失活ウシ胎仔血清を補充した完全ダルベッコ最小必須培地（ｃＤＭＥＭ）で維持し、増殖させた。表２に含まれるインフルエンザウイルスを全ての感染／抗体結合研究に使用した。全てのウイルスを標準的な方法を用いて生後９日の発育鶏卵で増殖させ、尿膜液からの遠心分離により精製した。全ての感染を、５．０の感染多重度で行った。

抗体及び試薬：実施例３のヤギ抗ＦＩＲペプチド抗体血清を、結合研究で使用するまで４℃で維持した。結合研究を、１％ウシ血清アルブミンを補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で１：５００に希釈された抗体を使用して行った。インフルエンザＡ又はＢ感染のコントロールとして、重複培養物の染色を、ＰＢＳ／ＢＳＡにおける希釈１：１０００のインフルエンザＡ又はインフルエンザＢ核タンパク質（ＮＰ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対して産生させたマウスモノクローナル抗体を用いて行った。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はＡＬＥＸＡ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）にコンジュゲートさせた二次抗体（抗ヤギ又は抗マウス）を結合一次抗体の可視化に使用した。

ＭＤＣＫ感染及び抗体結合プロトコル：ＭＤＣＫ細胞を、標準的な方法を用いてチャンバスライドにおいて９０％コンフルエンスまで増殖させた。ウイルス感染に関し、培地は除去され、各ウイルスを適当なチャンバに体積２００μＬで１時間にわたって３７℃、加湿ＣＯ₂インキュベータにおいて加えた。インキュベーション後、結合していないウイルスを洗浄を伴う吸引により除去し、培地を、ＴＰＣＫトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国）を補充した血清無含有ｃＤＭＥＭと置き換えた。感染したＭＤＣＫ細胞を３５℃／５％ＣＯ₂で２４時間にわたってインキュベートすることでウイルスを複製した。抗体結合研究のために、培地を各チャンバから取り出し、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で３０分間にわたって４℃で固定した。洗浄後、細胞を透過処理し、残留アルデヒドをＰＢＳ＋２０ｍＭグリシン／０．０１％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００界面活性剤との室温での２０分間にわたるインキュベーションによりブロックした。洗浄に続いて、ヤギ抗ＦＩＲ血清（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中で１：５００）をチャンバに３時間にわたって室温で添加した。非結合抗体をＰＢＳ中での洗浄により除去した。結合した抗ＦＩＲペプチドの可視化を、蛍光又は可視検出顕微鏡法用にＡＬＥＸＡ４８８又は西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体（抗ヤギ）との３０分間にわたるインキュベーションにより行った。非結合二次抗体の洗浄（ＢＰＳ／ＢＳＡ）による除去後、ＨＲＰコンジュゲート処理チャンバを、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基質試薬（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ ＵＳＡ）の添加により、製造業者の指示に従って展開した。ＡＬＥＸＡ４８８コンジュゲートチャンバを、ヨウ化プロピジウム対比染色剤を補充したＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ水性マウンティングメディア（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ ＵＳＡ）を用いてマウントし、カバースリップの追加後にスライドをマニキュア液で封止した。

抗体結合の顕微鏡による評価：スライドチャンバを、デジタル画像キャプチャ能力を有するＥＶＯＳ光学顕微鏡（ＡＭＧ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）を使用して可視光顕微鏡法により評価した。代表画像を機器ソフトウェアでキャプチャし、ＴＩＦ（ｔａｇｇｅｄ ｉｍａｇｅ ｆｉｌｅ）として保存した。蛍光標識した（ＡＬＥＸＡ４８８）染色チャンバをＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｊｅｎａ Ｇｅｒｍａｎｙ）、それぞれ緑及び赤の蛍光を可視化するための４８８ｎｍ及び４５５ｎｍレーザー線を使用して調査した。ＬＳＭソフトウェアを使用して代表画像をＴＩＦとして保存した。

可視画像を、固定及び抗体結合前の感染細胞に関して得た。感染から２４時間後のウイルス感染の細胞変性効果をＡ／香港／２３６９／２００９、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ５Ｎ１）及びＢ／上海／３６２／２００２感染ＭＤＣＫ細胞培養物において観察した。インフルエンザＡ／カリフォルニア／０４／２００４は感染後のこの時点でＣＰＥを誘導しなかった。

抗ＦＩＲペプチド抗体又は抗インフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）抗体（Ａ又はＢ）の可視（ＡＥＣ）及び蛍光（Ａｌｅｘａ４８８）染色画像を視覚的に評価した。調査した全てのウイルスにおいて、観察された様々な反応性を有するＮＰ及び抗ＦＩＲ抗体の両方でポジティブ染色が観察された。両方の可視化状態において、Ｈ１、Ｈ３又はインフルエンザＢ感染細胞よりＨ５発現細胞（Ａ／ＰＲ／８／１９３４＋Ｈ５Ｎ１）でより拡散した染色が観察された。表３は、観察された結合特性をまとめたものである。表３の＋記号の数は、記載のウイルスに感染した細胞への抗体の結合の度合いを示す。＋記号の数が多ければ多いほど、結合度は高い。

まとめると、これらの結果は、配列番号１のＦＩＲペプチドに対して産生させた抗体のインフルエンザＡ及びＢウイルスに関する結合の広い特異性を示す。この広さは、ＦＩＲペプチドが由来する領域における様々なサブタイプのヘマグルチニンタンパク質の高い相同性に起因し得る。インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）を認識するコントロール抗体の結合は、ＭＤＣＫ細胞が各ウイルスに感染していることを裏付け、インフルエンザウイルスに対する抗ＦＩＲペプチド抗体の特異性を裏付けている。

要約すると、ＫＬＨとコンジュゲートゲートさせた配列番号１のヘマグルチニンＦＩＲペプチドを含むペプチドコンジュゲートのウサギ、マウス及びヤギへの投与は、動物による抗ＦＩＲペプチド抗体の産生を刺激した。インフルエンザＡ（Ｈ１、Ｈ３及びＨ５）及びインフルエンザＢウイルスでの試験において、これらの動物から採取した血清は驚くべきことに、ＦＩＲペプチドそれ自体に結合する、ウイルスに曝露された細胞に結合する、またウイルス感染能を阻害すると判明した。可視及び蛍光の両方の技法を用いて検出されたように、抗体は曝露された細胞の表面上のＨＡと反応した。昨今のインフルエンザワクチンを接種された被験者から採取した血清は強い抗ＨＡ応答を生じさせたが、驚くべきことに、配列番号１のＦＩＲペプチドに対する抗体を産生しないようだった。

本発明を実行するための発明者が知る最良のモードを含め、本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載している。これらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことで当業者に明らかとなる。発明者は当業者がそのような変化形を適当なものとして用いることを予期し、また発明者は本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは違う形で実施されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法が認めるように、本明細書に添付の請求項に記載の主題の全ての改変物及び同等物を含む。さらに、全ての考えられ得るその変化形における上記の要素のいずれの組み合わせも、別段の定めがない限り又は文脈に明らかに矛盾していない限り、本発明の範囲に含まれる。本明細書で引用の各文献は（米国及び米国以外の特許、米国及び米国以外の公開特許出願、雑誌論文、書籍、書籍の章並びに本明細書で言及する他の文書を含む）は参照により、その詳細全てを含め、全て本明細書で、あたかも個別に援用されたがごとく同程度まで援用される。

Claims (20)

1. キャリアタンパク質に連結基でコンジュゲートされたヘマグルチニン（ＨＡ）融合開始領域（ＦＩＲ）ペプチド又はその変異体を含む免疫原性ペプチドコンジュゲートであって、前記ＨＡ ＦＩＲペプチドが、５０個以下のアミノ酸残基から成り、また配列番号１又は少なくとも５０％の配列同一性を共有し且つ配列番号１とは、Ｖ１Ｉ、Ｖ１Ｌ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｇ、Ｖ１Ｔ、Ｖ１Ｓ、Ｖ１Ｍ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２Ｒ、Ｄ３Ｅ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｓ、Ｔ４Ｑ、Ｔ４Ａ、Ｋ５Ｆ、Ｋ５Ｍ、Ｋ５Ｉ、Ｋ５Ｖ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ａ、Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｖ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｔ、Ｉ６Ｓ、Ｉ６Ｑ、Ｉ６Ｎ、Ｄ７Ｅ、Ｌ８Ｉ、Ｌ８Ｖ、Ｌ８Ａ、Ｗ９Ｙ、Ｓ１０Ｔ、Ｓ１０Ｇ、Ｓ１０Ａ、Ｓ１０Ｍ及びＥ１４Ｋから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換で異なる配列番号１の変異体のアミノ酸配列を含むインフルエンザヘマグルチニン２タンパク質のセグメントを含むことを特徴とする、免疫原性ペプチドコンジュゲート。
2. 前記インフルエンザヘマグルチニン２タンパク質のセグメントは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６及びＨ１７から成る群から選択されるインフルエンザＡサブタイプのヘマグルチニン２タンパク質からの２５個までの追加のアミノ酸残基を含み、前記追加の残基が、配列番号１又はその変異体に、選択したインフルエンザＡサブタイプのヘマグルチニン２タンパク質のアミノ酸配列において隣接している、請求項１に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
3. 前記ＨＡ ＦＩＲペプチドが、インフルエンザＡヘマグルチニン２タンパク質由来ではない１つ以上のペプチド配列を含む、請求項１又は２に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
4. 前記ヘマグルチニンＦＩＲペプチドが、配列番号１又は少なくとも５０％の配列同一性を共有し且つ配列番号１とはＶ１Ｉ、Ｖ１Ｌ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｇ、Ｖ１Ｔ、Ｖ１Ｓ、Ｖ１Ｍ、Ｅ２Ｄ、Ｅ２Ｋ、Ｅ２Ｒ、Ｄ３Ｅ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｓ、Ｔ４Ｑ、Ｔ４Ａ、Ｋ５Ｆ、Ｋ５Ｍ、Ｋ５Ｉ、Ｋ５Ｖ、Ｋ５Ｌ、Ｋ５Ａ、Ｉ６Ｌ、Ｉ６Ｖ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｔ、Ｉ６Ｓ、Ｉ６Ｑ、Ｉ６Ｎ、Ｄ７Ｅ、Ｌ８Ｉ、Ｌ８Ｖ、Ｌ８Ａ、Ｗ９Ｙ、Ｓ１０Ｔ、Ｓ１０Ｇ、Ｓ１０Ａ、Ｓ１０Ｍ及びＥ１４Ｋから成る群から選択される１つ以上のアミノ酸置換で異なる配列番号１の変異体から成るアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
5. 前記キャリアタンパク質が、髄膜炎菌の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、破傷風トキソイドタンパク質、ジフテリア毒素誘導体ＣＲＭ₁₉₇、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カチオン化ＢＳＡ、コンコレパス・コンコレパスヘモシアニン（ＣＣＨ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）、ＨＢＶコア抗原タンパク質、キーホール・リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ロタウイルスカプシドタンパク質、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）Ｌ１タンパク質、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ１タンパク質、オボアルブミン及び全長インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
6. 前記キャリアタンパク質は全長インフルエンザヘマグルチニンタンパク質である、請求項１〜５のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
7. 前記全長インフルエンザヘマグルチニンタンパク質が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６及びＨ１７から成る群から選択されるインフルエンザＡサブタイプ由来のヘマグルチニンである、請求項６に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
8. 前記全長インフルエンザヘマグルチニンタンパク質が、インフルエンザＢヘマグルチニンタンパク質である、請求項６に記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
9. 前記連結基が、スルフィド結合を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
10. 前記連結基が、実施形態１〜６のいずれかに記載のペプチドコンジュゲートを含み、前記連結基が、式Ｉ、
    の４−（Ｎ−スクシンイミドメチルシクロヘキサン−１−カルボニル基であり、式ＩのＣｙｓ残基が、そのスルフヒドリル基を介してスクシンイミド部分に結合され、またペプチド結合によりＦＩＲペプチドのＮ末端に結合され、任意でＣｙｓとＦＩＲペプチドとの間には１〜５個の残基の追加のスペーサペプチドがあり、式Ｉのシクロヘキシル部分上の１−カルボニル基が、アミド結合により前記キャリアタンパク質上の一級アミンに結合している、請求項１〜８のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
11. 前記連結基により前記キャリアタンパク質にコンジュゲートされた配列番号１から成るアミノ酸配列を有するヘマグルチニン２ＦＩＲペプチドを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲート。
12. 請求項１〜１１のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートを医薬的に許容可能なキャリア中に含む、インフルエンザ感染症を治療又は予防するための医薬組成物。
13. 治療有効量の請求項１〜１１のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートをインフルエンザに罹患している又はインフルエンザに罹る恐れがある被験者に投与することを含む、インフルエンザ感染症を治療又は予防するための方法。
14. 請求項１〜１１のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートを被験者に投与することを含む、インフルエンザウイルスに対する特異的治療用抗体応答を被験者において誘導する方法。
15. 前記特異的治療用抗体応答はインフルエンザウイルスと宿主細胞の膜との融合を阻害する、請求項１４に記載の方法。
16. 請求項１〜１１のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートの投与後に宿主生物内で産生された抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質のＦＩＲ領域に特異的に結合する、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質のＦＩＲ領域に特異的に結合可能な治療用モノクローナル抗体。
17. ヒト、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の治療用モノクローナル抗体。
18. インフルエンザ感染症を治療又は予防するための請求項１６又は１７に記載の治療用モノクローナル抗体の使用。
19. インフルエンザ感染症を治療又は予防するための請求項１〜１１のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートの使用。
20. 被験者においてインフルエンザウイルスに対する特異的治療用抗体応答を誘導するための請求項１〜１１のいずれかに記載の免疫原性ペプチドコンジュゲートの使用。