BRPI0711229A2 - anticorpo humanizado da osteopontina anti-humana, polinucleotÍdeo, vetor de expressço, cÉlula hospedeita, mÉtodo para produzir um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana, fÁrmaco terapÊutico, mÉtodo para prevenir ou tratar doenÇa autoimune e uso do anticorpo humanizado de oesteopontina anti-humana - Google Patents

Abstract

ANTICORPO HUMANIZADO DA OSTEOPONTINA ANTI-HUMANA, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSçO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO HUMANIZADO DE OSTEOPONTINA ANTI-HUMANA, FÁRMACO TERAPÊUTICO, MÉTODO PARA PREPARAR OU TRATAR DOENÇA AUTOIMUNE E USO DO ANTICORPO HUMANIZADO DE OSTEOPONTINA ANTI-HUMANA. A presente invenção provê um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana tendo atividades (atividade de ligação a antígeno, atividade inibidora de migração de leucócitos e similares) e/ou estabilidade (resistência ao calor, condições de baixo pH, desnaturantes, e similares) melhores do que as dos anticorpos de osteopontina anti-humana convencionais.

Description

"ANTICORPO HUMANIZADO DA OSTEOPONTINA ANTI-HUMANA, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO HUMANIZADO DE OSTEOPONTINA ANTI-HUMANA, FÁRMACO TERAPÊUTICO, MÉTODO PARA PREVENIR OU TRATAR DOENÇA AUTO I MUNE E USO DO ANTICORPO HUMANIZADO DE OSTEOPONTINA ANTI-HUMANA". CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana com excelente atividade e estabilidade e a um método terapêutico e diagnóstico para doenças que utilizam o anticorpo.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A osteopontina (adiante designada "OPN") é uma glicoproteína ácida que se liga ao cálcio e que é abundantemente encontrada nos ossos e, no caso de humanos, sabe-se que pelo menos três isoformas podem ocorrer devido a diferenças no alinhamento de mRNA: osteopontina-a (adiante designada "OPN-a"), osteopontina- b (adiante designada "OPN-b") e osteopontina-c (adiante

2 0 designada "OPN-c") (documento não patentário 1). Em

especial, o precursor da OPN-a possui a seqüência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO: 23 na listagem de seqüências fornecida abaixo, considerando-se que sofre clivagem*de peptídeo sinal mediante secreção para formar a OPN-a de I17-N314 na forma madura. A forma madura da OPN é clivada através de trombina in vivo no lado C- terminal do 168° resíduo de arginina (no caso de OPN-a), resultando num fragmento N-terminal e num fragmento C- terminal.

3 0 A OPN acima descrita é responsável por uma ampla

variedade de funções fisiológica e patologicamente importantes, e possui funções, como por exemplo, adesão celular, migração celular, tumorigênese, respostas imunes, inibição de citólise mediada por complemento e 3 5 similares. Essas diversas funções são mediadás por uma ampla variedade de receptores de superfície celular. A OPN possui a seqüência RGD (por exemplo, para OPN-a, do 159° ao 161° resíduos); integrinas que reconhecem essa seqüência RGD, tais como ocV/?3 , ανβΐ e ανβ5, são os principais receptores de OPN, cujas integrinas aV/33, ανβΐ e aV/55 mediam a adesão celular em células de músculo liso vascular; além disso, a aV/33 está associada com a migração de macrófagos, linfócitos, células endoteliais, células de músculo liso e análogos. Além disso, as pesquisas conduzidas até a presente data também demonstraram que a OPN liga-se às integrinas αθβΐ, α401, 0C4/37 através da seqüência SWYGLR (SEQ ID NO.10), tendo também sido constatada uma diferença no modo de ligação em que a α4β1 liga-se tanto à OPN não clivada pela trombina (OPN do tipo não clivada) como a um fragmento N-terminal clivado pela trombina (OPN tipo clivada) , ao passo que a a9j01 liga-se somente à OPN tipo clivada pela trombina (documentos não patentários 2 a 4). Essas subunidades de integrina ot9 e <x4 e βΐ e βΐ são altamente similares entre si em termos de seqüência de aminoácido. As integrinas a4/3l e α4β7 são encontradas

2 0 principalmente em linfócitos e monócitos, porém

expressadas a níveis muitos baixos em neutrófilos. Por outro lado, a9/?l é altamente expressada seletivamente em neutrófilos, sendo responsável pelas funções essenciais para migração de neutrófilos via VCAM-I, Tenascin-C e análogos. A α9β1 é amplamente expressada em miócitos, células epiteliais, hepatócitos e similares. Por conseguinte, os domínios citoplasmáticos das subunidades de integrina a4 e oc9 são consideradas envolvidas em diversas reações inflamatórias, promovendo

3 0 cooperativamente a migração e agregação de leucócitos aos

locais de inflamação através das respectivas vias de transdução de sinal intracelular levemente diferentes para aumentar suas atividades de infiltração. Conforme descrito acima, devido ao fato de uma ampla variedade de integrinas promoverem a migração de leucócitos e estarem envolvidas em reações inflamatórias, supõe-se que fármacos que inibem as atividades dessas integrinas tenham potencial para atuar como agentes antiinf lamatórios. Por exemplo, a integrina aV/53 é expressada em osteoclastos, células endoteliais vasculares, células do músculo liso e similares; já que se espera que a inibição da ligação da integrina aV/?3 e de diversos ligantes de ligação da mesma exerce uma ação supressora sobre a destruição articular, por exemplo, nas articulações, está de fato em andamento o desenvolvimento

1

do anticorpo anti-ccV/33. Porém, pelo fato de os receptores pertencentes à família das integrinas serem universalmente expressados numa ampla gama de tecidos e responsáveis pelas funções essenciais para a manutenção de atividades biológicas, o uso de um anticorpo contra a integrina no tratamento de artrite reumatóide ou de osteoartrite pode causar inibição semelhantes em outros locais e a incidência de reações adversas são de especial interesse. Partindo deste ponto de vista, esforços vem sendo empregados até o momento no sentido de elucidar a etiologia da artrite reumatóide, da osteoartrite e de moléstias análogas, e prover um melhor método terapêutico.

Por exemplo, em W002/081522 (documento patentário 1) , constatou-se que em pacientes com reumatismo e pacientes 2 5 com osteoartrite, a concentração de OPN no fluido da cavidade articular apresentava valores altos, e que nos pacientes reumáticos aumentava a relação de fragmento N- terminal do tipo clivado pela trombina para OPN total, tendo sido confirmado que a OPN estava profundamente associada com a manifestação dessas doenças. No documento patentário 1, foram gerados os anticorpos que reconhecem discretamente o fragmento N-terminal e o fragmento C- terminal resultantes da clivagem de OPN com a trombina, respectivamente, e um estudo utilizando-os demonstrou que em pacientes com artrite reumatóide, o fragmento N- terminal clivado pela trombina, em particular, exibiu altas concentrações na cavidade articular. Neste fragmento N-terminal, a seqüência RGD e a seqüência SWYGLR (SEQ ID NO:10), ambas reconhecidas pelas integrinas do tipo humano, coexistem; um anticorpo que simultaneamente bloqueia essas duas seqüências confirmou inibir amplamente a ligação da OPN e da integrina, e que é eficaz no tratamento de artrite reumatóide, osteoartrite e similares.

Especificamente, no documento patentário 1, um anticorpo que inibe a ligação entre a seqüência RGD de OPN e integrina humana e a ligação entre a seqüência SWYGLR de OPN (SEQ ID NO: 10) e integrina humanas foi gerado e seu efeito confirmado por experimentos sobre adesão celular, migração celular e análogos. Além disso, um anticorpo contra um peptídeo sintético correspondendo à seqüência interna de OPN de camundongo foi adquirido, e seu efeito como fármaco terapêutico confirmado utilizando-se um modelo patológico de artrite de camundongo. Por conseguinte, uma vez que a OPN de camundongo possui a seqüência RGD e a seqüência SLAYGLR (SEQ ID NO:12), ambas reconhecidas pela integrina de camundongo, em posições na seqüência de aminoácido homólogas às da OPN humana, o anticorpo M5 foi adquirido como um anticorpo que simultaneamente bloqueia essas seqüências. Confirmou-se que a ligação deste anticorpo M5 a OPN de camundongo e ao

2 5 produto digerido pela trombina foi inibida pelo peptídeo

GRGDS P, que compreende a s eqüênc i a RGD, e que este anticorpo M5 inibiu a migração de monócitos ativados por TNF-α derivados de baço de camundongo. Quando este anticorpo M5 foi examinado utilizando um sistema de

3 0 cultura orgânico de calvária de camundongo, observou-se a

ação supressora sobre a destruição óssea. Além disso, quando o anticorpo acima descrito foi administrado a um modelo de camundongo de artrite induzida por colágeno, confirmou-se um efeito terapêutico distinto (documento patentário 1 e documento não patentário 5).

Esses resultados sugerem fortemente que um anticorpo que bloqueie simultaneamente a ligação entre a seqüência RGD e a integrina tipo humana e entre a seqüência SWYGLR (SEQ ID NO:10) e integrina do tipo humana inibe a ligação entre a OPN e a integrina, sendo eficaz no tratamento de artrite reumatóide e similares, demonstrando também que se espera que o anticorpo se j a eficaz não apenas no tratamento de formas de reumatismo tais como artrite reumatóide juvenil e reumatismo crônico, mas também no tratamento de artrite psoríatica e psoríase. A rejeição crônica de enxerto após transplante de órgãos é caracterizada por lesões obstrutivas nos vasos sangüíneos e brônquios; das investigações histológicas considera-se que devido ao fato de a ativação de células T e macrófagos causarem a produção de citocinas e de fatores de crescimento e distúrbio celular endotelial vascular, e também pelo fato de o crescimento de músculo liso vascular causar fibrose e condições similares, a condição progride para obstrução vascular (documentos não patentários 6 a 8).

Foi relatado que a OPN funciona como proteína essencial 2 0 na ativação desses macrófagos e na fibrose de músculo liso vascular (documento não patentário 9) ; um anticorpo inibidor de OPN pode suprimir o processo para fibrose suprimindo a migração de monócitos e neutrófilos. Portanto, espera-se que o anticorpo suprima a rejeição de enxerto crônica após transplante de órgão, contribuindo para a retirada de órgãos, e que sej a eficaz no tratamento de doenças autoimunes, tais como doença autoimune sistêmica, lúpus eritematoso, uveíte, doença de Behcet, miosite múltipla, nefrite glomeruloproliferativa, e sarcoidose. Também se confirmou que o nível de expressão da OPN aumenta em diversos tipos de câncer, e que a OPN promove a progressão do câncer e a metástase (documentos não patentários 10 a 12), e que o crescimento de células cancerosas, bem como a metástase são suprimidos por um anticorpo anti-OPN (documento patentário 3, documento não patentário 13). Portanto, também se presume que um anticorpo anti-OPN seja eficaz no tratamento de diversos cânceres.

São descritos em W003/027151 (documento patentário 2) um anticorpo quimérico de osteopontina anti-humana tendo tanto a região variável do anticorpo 2Kl de osteopontina anti-humana de camundongo descrita no documento patentário 1 como a região constante de um anticorpo humano, e um anticorpo humanizado de osteopontina anti- humana possuindo tanto uma região determinante de complementaridade do anticorpo 2K1 como a região estrutural e a região constante de um anticorpo humano.

Entretanto, um grande número de anticorpos monoclonais para o tratamento já estão disponíveis no mercado, inclusive anticorpos para o tratamento de câncer (por exemplo o rituximabe, trastuzumabe, bevacizumabe), anticorpos para tratamento de reumatismo (por exemplo, infliximabe, adalimumabe), anticorpos para o tratamento de supressão de rejeição de enxerto (por exemplo, muromonab, basiliximabe) e similares.

Devido às suas características básicas de alta especificidade e segurança, existe a possibilidade de que a pesquisa e o desenvolvimento de preparações de anticorpo monoclonal, principalmente direcionadas para uma ampla variedade de doenças para as quais é difícil o desenvolvimento de fármacos terapêuticos de baixo peso molecular, serão acelerados.

Por outro lado, o maior problema encontrado no desenvolvimento de tais fármacos de anticorpos relaciona- se com a produtividade do anticorpo. As doses clínicas de anticorpos monoclonais lançados no mercado geralmente são 3 0 da ordem de diversos mg/kg, sendo necessários custos consideráveis de produção.

Por este motivo, para selecionar um anticorpo que exiba excelente atividade e, dentre os anticorpos que demonstrem a mesma atividade, um anticorpo com altos níveis de expressão e alta estabilidade para uma proteína é um requisito muito importante para a efetiva aplicação como fármaco de anticorpo. Documento patentário 1 : Panfleto para a Publicação de

Patente Internacional No. W002/081522.

Documento patentário 2: Panfleto para a Publicação de Patente Internacional No. W003/027151. Documento patentário 3 : Panfleto para a Publicação de Patente Internacional No. W006/043954.

Documento não patentário 1 : Y.Saitoh et al. , (1995) : Laboratory Investigation, 72, 55-63.

Documento não patentário 2 : Y.Yokosaki et al. , (1999) : The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334.

Documento não patentário 3 : P.M.Green et al. , (2001): FEBS Letters 503, 75-79.

Documento não patentário 4 : S.T.Barry et al. , (2000): Experimental Cell Research 258, 342-351. Documento não patentário 5: Yamamoto et al., (2003): The Journal of Clinicai Investigation, 112, 181-188. Documento não patentário 6: P.Freese et al., (2001): Nephrology, dialysis, transplantation, 16, 2401-2406. Documento não patentário 7: J.R.Waller et al. , (2001) : British Journal of Surgery, 88, 1429-1441.

Documento não patentário 8: S.R. Lehtonen et al., (2001): Transplantation, 72, 1138-1144

Documento não patentário 9: A.CTRegan et al., (2000): International Journal of Experimental Pathology, 81, 373-

390

Documento não patentário 10 : G.F.Weber, (2001): Biochimica et Biophysica Acta, 1552, 61-85 Documento não patentário 11: H.Rangaswami et al., (2006): TRENDS in Cell Biology 16, 79-87. Documento não patentário 12 : S.S.Forootan et al., (2006) : Int. J.Câncer: 118, 2255-2261

Documento não patentário 13 : Z.Hu et al. , (2005) : Clin.Câncer Res. 11 4646-4652 DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO 3 5 PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO

A presente invenção foi desenvolvida em vista das circunstâncias acima descritas, e é destinada a prover um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana com at ivi dade s (at ividade de 1igação a ant ígeno, at ivi dade inibidora de migração de leucócitos e similares) e/ou estabilidade {resistência ao calor, condições de baixo pH, desnaturantes e similares) melhores do que as dos anticorpos de osteopontina anti-humana convencionais. Os inventores conduziram pesquisas exaustivas no intuito de executar o objeto da invenção e tiveram êxito em gerar um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana com tais características.

MEIOS PARA SOLUCIONAR QS PROBLEMAS

Conseqüentemente, a presente invenção possui as seguintes características:

(1) Um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana compreendendo uma região variável de cadeia pesada

consistindo da seqüência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO: Ie uma região variável de cadeia leve consistindo da seqüência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO: 3.

(2) 0 anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito em (1) acima, sendo que a região constante de

cadeia pesada do anticorpo é Igyl humana.

{3) O ant i corpo humani ζ ado de o st eopont ina ant i-humana descrito em (1) acima, sendo que a região constante de cadeia leve do anticorpo é IgK humana.

2 5 (4) O ant icorpo humani zado de osteopont ina ant i-humana

descrito em (1) acima, sendo que a região constante de cadeia pesada do anticorpo é Igyl humana e a região constante de cadeia leve do anticorpo é IgK humana. (5) Um ant i corpo humani zado de osteopont ina ant i-humana

3 0 compreendendo uma cadeia pesada consistindo da seqüência

de aminoácido mostrada por SEQ ID NO: 25 e uma cadeia leve consistindo da seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID NO: 27.

6). Um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência que 3 5 codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito em (1) acima. (7) . Um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito em (1) acima.

(8) Um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo descrito em (6) e/ou (7) acima.

(9) Uma célula hospedeira incorporando o vetor de expressão descrito em (8) acima.

(10) Um método para produzir um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana, compreendendo uma etapa para

cultivar a célula hospedeira descrita em (9) acima para permitir que a célula expresse o anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana.

(11) Um fármaco terapêutico para doença autoimune, reumatismo, artrite reumatóide ou osteoartrite,

compreendendo o anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito em qualquer um de (1) a (5) acima.

(12) Um método para prevenir ou tratar doença autoimune, reumatismo, artrite reumatóide ou osteoartrite,

2 0 compreendendo uma etapa para administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito em qualquer um de (1) a (5) acima.

(13) Uso do anticorpo humanizado de osteopontina anti-

2 5 humana descrito em qualquer um de (1) a (5) acima, na

manufatura de um fármaco para prevenir ou tratar doença autoimune, reumatismo, artrite reumatóide ou osteoartrite. EFEITO DA INVENÇÃO É provido pela invenção um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana com atividades (atividade de ligação a antígeno, atividade inibidora de migração de leucócitos e similares) e/ou estabilidade (resistência ao calor, condições de baixo pH, desnaturantes e similares)

3 5 melhores do que as dos anticorpos de osteopontina anti-

humana convencionais. Com essas características, o anticorpo da presente invenção é útil na prevenção ou tratamento de diversas doenças inflamatórias, inclusive doença autoimune, reumatismo, artrite reumatóide, e osteoartrite.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a seqüência base (coluna superior): SEQ ID NO:15) e a seqüência de aminoácido (coluna inferior: SEQ ID No: 16) de um DNA compreendendo a região codificadora R2K1-VH1.7 incorporada num vetor (a porção sublinhada é a seqüência líder para a expressão secretória);

A Figura 2 mostra a seqüência base (coluna superior: SEQ ID NO:17) e a seqüência de aminoácido (coluna inferior: SEQ ID NO: 18) de um DNA compreendendo a região codificadora R2K1-VH1.8 incorporada num vetor (a porção sublinhada é a seqüência líder para a expressão secretória);

A Figura 3 mostra a seqüência base (coluna superior: SEQ ID NO:19) e a seqüência de aminoácido (coluna inferior: SEQ ID NO: 20) de um DNA compreendendo a região 2 0 codificadora R2K1-VL1.7 incorporada num vetor (a porção sublinhada é a seqüência líder para a expressão secretória);

A Figura 4 mostra a seqüência base (coluna superior: SEQ ID NO:21) e a seqüência de aminoácido (coluna inferior: 2 5 SEQ ID NO: 22) de um DNA compreendendo a região codificadora R2K1-VL1.8 incorporada num vetor (a porção sublinhada é a seqüência líder para a expressão secretória);

A Figura 5 mostra os resultados de um exame da atividade de ligação ("bindability") de anticorpo quimérico 2K1 e anticorpo humanizado 2K1 ao peptídeo hOPN5 através de um método ELISA;

A Figura 6 mostra os resultados de um exame da atividade de ligação de anticorpo quimérico 2 Kl e de anticorpo humanizado 2K1, tratado termicamente a 70°C, ao peptídeo hOPN5 através de um método ELISA;

São mostradas as relações de atividade de ligação sem o tratamento térmico como 100%;

A Figura 7 mostra os resultados de um exame da atividade de ligação de anticorpo quimérico 2K1 e anticorpo humanizado 2K1, tratados com um tampão a um pH 5, ao peptídeo hOPN5 através de ELISA. São também mostradas as relações de atividade de ligação sem o tratamento com tampão pH 5 como 100%;

A Figura 8 mostra os resultados de um gráfico de comprimentos de onda de pico espectral de fluorescência de anticorpo quimérico 2K1 e anticorpo humanizado 2K1, tratados com tampões contendo diversas concentrações de cloridrato de guanidina;

A Figura 9 mostra os resultados de uma medição dos conteúdos estruturais aleatórios no anticorpo quimérico 2 Kl e humanizado 2K1, tratados com tampões a vários níveis de pH, através de CD;

A Figura 10 é uma ilustração mostrando os resultados de um exame da estabilidade térmica do anticorpo quimérico 2 Kl e anticorpo humanizado 2K1 utilizando calorímetro diferencial exploratório ultra-sensível. A seta pontilhada e a seta contínua indicam a Tm de anticorpo quimérico 2K1 e anticorpo R2Klvl.7, respectivamente; A Figura 11 mostra os efeitos inibidores de adesão celular de R2Klvl.7 e R2Klvo sobre OPN humana; A Figura 12 mostra os efeitos de R2Klvl.7 sobre inchaço articular em artrite induzida por colágeno em macacos. Os dados são mostrados como média±SE para 8 animais, 7 animais e 5 animais no grupo controle, grupo 25 mg/kg e grupo 50 mg/kg, respectivamente. *p<0,05, **p<0,01: significativamente diferentes do grupo controle conforme determinado pelo teste de comparações múltiplas de Dunnet;

A Figura 13 mostra os resultados de uma análise de R2Klvl.7-scFv purificado através de HPLC; A Figura 14 mostra os resultados de um exame da atividade de ligação de R2Klvl.7-scFv purificado ao peptídeo hOPN5 através de método ELISA; A Figura 15 mostra os resultados de SDS-PAGE do anticorpo R2Klvl.7 tipo molécula inteira e de F(ab')2 e F (ab'J2=PEG purificado do anticorpo R2Klvl.7; e

A Figura 16 mostra os resultados de um exame da atividade de ligação do F (ab'J2-PEG de R2Klvl.7 ao peptídeo hOPN5 através de BIAcore.

MELHOR FORMA DE EXECUTAR A INVENÇÃO A presente invenção é descrita em detalhes abaixo. Os inventores conduziram pesquisas exaustivas com o obj etivo de solucionar os problemas acima descritos relacionados com os anticorpos convencionais de osteopontina anti-humana, e obtiveram êxito em adquirir um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana com atividades e/ou estabilidade melhores do que as do anticorpo quimérico 2K1 e anticorpo humanizado 2K1 descritos em W003/027151 (documento patentãrio 2). A estrutura básica de uma molécula de anticorpo é compartilhada por todas as classes, e é configurada com uma cadeia pesada tendo um peso molecular de 50 0 00 a 70000 e uma cadeia leve tendo um peso molecular de 20000 a 30000. Uma cadeia pesada geralmente consiste de uma cadeia polipeptídica compreendendo cerca de 44 0 aminoãcidos; cadeias pesadas possuem estruturas que se caracterizam por classes diferentes, sendo denominadas cadeias γ, μ, α, δ e ε correspondendo a IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Além disso, a IgG ocorre como IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, e as cadeias correspondentes são denominadas γΐ, γ2, γ3 e γ4, respectivamente. Uma cadeia leve geralmente consiste de uma cadeia polipeptídica compreendendo cerca 3 0 de 22 0 aminoácidos; são conhecidos dois tipos, o tipo L e o tipo K, denominados cadeias λ e κ, respectivamente. Em relação à configuração peptídica da estrutura básica de uma molécula de anticorpo, duas cadeias pesadas homólogas e duas cadeias leves homólogas são ligadas via ligações dissulfeto (ligações S-S) e ligações não-covalentes, e o peso molecular é de 150000 a 190000. Os dois tipos de cadeias leves são capazes de parear com qualquer cadeia pesada. Cada molécula de anticorpo consiste sempre de duas cadeias leves idênticas e de duas cadeias pesadas idênticas.

Existem quatro ligações S-S em-cadeia numa cadeia pesada (cinco ligações para cadeias μ e ε) e duas numa cadeia leve; uma alça ("loop")é formada por 100 a 110 resíduos aminoãcido e essa estrutura estérica é parecida entre os laços, sendo denominada unidade ou domínio estrutural. Tanto para as cadeias pesadas como para as cadeias leves, a seqüência de aminoacido do domínio localizado no N- terminal da mesma é inconstante, mesmo num padrão de referência da mesma classe (subclasse) da mesma espécie animal, sendo este domínio denominado região variável (região V, região variável) (os domínios são expressados como Vh e Vl, respectivamente) . A seqüência de aminoácido no lado C-terminal da mesma é quase constante para cada classe ou subclasse, sendo denominada região constante (região C, região constante) (os domínios são expressados como ChI , CH2, CH3 e CL/ respectivamente).

2 0 O sítio antigênico determinante de um anticorpo é

configurado com Vh e Vl e a especificidade de ligação depende da seqüência de aminoãcido neste sítio. Por outro lado, atividades biológicas tais como a ligação a complementos ou a diversas células refletem as diferenças na estrutura da região C entre as diversas classes de Ig. A variedade das regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada demonstrou ser quase limitada a três pequenas regiões hipervariáveis existentes em ambas as cadeias, sendo essas regiões denominadas CDR (região

3 0 determinante de complementaridade). A porção restante da

região variável é denominada região estrutural, e é relativamente constante. Geralmente, somente de 5 a 10 aminoácidos na região determinante de complementaridade de cada região variável formam o sítio de ligação a antígeno.

Na presente descrição, um anticorpo tendo uma região variável derivada de um anticorpo de camundongo (também designado anticorpo heterólogo doador) como a região variável reativa a antígeno e uma região constante derivada de um anticorpo humano como a região constante é designado anticorpo quimérico; um anticorpo quimérico que reconhece a osteopontina e seus fragmentos é designado anticorpo quimérico anti-osteopontina. Um anticorpo recombinante preparado mediante substituição de todas as regiões, exceto a região determinante de complementaridade (sitio de ligação a antígeno), de uma molécula de anticorpo de mamífero não-humano (por exemplo, camundongo) antígeno-específico com aminoácidos de anticorpo humano é designado anticorpo humanizado. Estão incluídos nos anticorpos humanizados os anticorpos que possuem uma modificação no aminoácido (substituição, inserção, deleção, adição), feita na região estrutural do mesmo, como o anticorpo da presente invenção. Geralmente, sabe-se que na preparação de um anticorpo humanizado, quando a seqüência de aminoácido da região determinante de complementaridade somente é simplesmente 2 0 enxertada na estrutura de anticorpo humano padrão, a atividade de ligação a antígeno diminui se comparada com a do anticorpo de camundongo original em muitos casos. Conf i rmou-se que o ant i corpo humani zado 2 Kl ac ima descrito possui atividade inibidora de adesão celular 2 5 extremamente baixa sobre a OPN, sendo assim inadequado para uso como fármaco de anticorpo, embora possa ser capaz de ligar-se a peptídeos de OPN (Exemplo 9 abaixo). Os inventores conduziram pesquisas exaustivas no intuito de melhorar as reduções de atividade em anticorpos humanizados, e de obter um anticorpo humanizado com melhor estabilidade para uso como fármaco de anticorpo, tendo descoberto que um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo da seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID N0:1 e uma região variável de cadeia leve consistindo da seqüência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO:3 apresentava atividades significativamente melhoradas e/ou melhor estabilidade em termos de diversos índices de estabilidade, em comparação com anticorpos humanizados de osteopontina anti-humana. Como tal, o anticorpo humanizado de osteopontina anti- humana da presente invenção foi preparado mediante modificações em alguns aminoácidos nas regiões estruturais da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo humano padrão, e possui uma seqüência diferente da região estrutural em relação a um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana preparada enxertando-se apenas a região determinante de complementaridade (documento patentário 2).

O anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção pode ser facilmente preparado pelos habilitados na técnica com base nas informações de seqüência da região variável de cadeia pesada e da região variável de cadeia leve da mesma conforme aqui descrito, utilizando um método comumente conhecido no estado da técnica. Especificamente, são preparados um fragmento 2 0 gênico de região variável de cadeia pesada tendo uma seqüência base que codifica o aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo da presente invenção (SEQ ID NO:l) e um fragmento gênico da região variável de cadeia leve tendo uma seqüência base que 2 5 codifica o aminoácido da região variável de cadeia leve do anticorpo da presente invenção {SEQ ID NO: 3). Então, os genes da região variável são unidos a um gene de região constante numa classe apropriada de anticorpo humano para preparar um gene de anticorpo humanizado. Em seguida, esse gene de anticorpo humanizado é unido a um vetor de expressão apropriado, e introduzido numa célula cultivada. Finalmente, a célula cultivada é cultivada, e assim um anticorpo humanizado pode ser obtido do sobrenadante da cultura. Cada um dos fragmentos gênicos da região variável acima descrita que codifica os aminoácidos da região variável de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo da presente invenção (SEQ ID NO: Ie SEQ ID NO:3) podem ser preparados, por exemplo, preparando-se um fragmento gênico que codifica a região variável de cadeia pesada ou a região variável de cadeia leve, respectivamente, do anticorpo humanizado 2K1, descrito em W003/027151, de acordo com o método descrito no documento, e induzindo-se uma mutação no sítio específico do fragmento gênico que codifica a região estrutural do anticorpo humanizado 2K1. Para induzir uma mutação no sítio específico na região estrutural, diversos métodos óbvios para os habilitados na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida(Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish.John Wiley & Sons Section 8.1-8.5) podem ser utilizados. Alternativamente, os fragmentos gênicos das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo da presente invenção podem também ser sintetizados com base nas seqüências básicas criadas com base nas seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve (SEQ ID NO :1 e SEQ ID

2 0 NO: 3), ou com base nas seqüências base das regiões

variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo da presente invenção, mostradas pela SEQ ID NO:5 e SEQ ID N0:7, utilizando um método de síntese gênica comumente conhecido no estado da técnica. Como este método de síntese gênica, podem ser empregados diversos métodos óbvios para o habilitado na técnica, tal como o método de síntese gênica de anticorpo descrito em W090/07861. Em seguida, os fragmentos gênicos da região variável acima descritos e o gene da região constante do anticorpo

3 0 humano são unidos para o preparo de um gene de anticorpo

humanizado. Embora qualquer subclasse de região constante possa ser selecionada como a região constante do anticorpo humano utilizado, a Igyl humana como a região constante de cadeia pesada, e a IgK humana como a região 3 5 constante de cadeia leve, podem ser preferivelmente utilizadas.

Após a preparação deste gene de anticorpo humanizado, a introdução do gene de anticorpo humanizado num vetor de expressão, a introdução do vetor de expressão em células cultivadas, o cultivo das células cultivadas, a purificação do anticorpo e similares podem ser conduzidos utilizando-se diversos métodos conhecidos no estado da técnica, ou com referência aos métodos para o preparo de um anticorpo quimérico de osteopontina anti-humana ou um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana, descritos em W002/081522 ou W003/027151. Tal como o vetor de expressão a ser unido ao gene de anticorpo humanizado assim obtido, podem ser utilizados os vetores de expressão descritos na Publicação de Patente Internacional W094/20632, tal como AG-γΙ e AG-κ, embora o vetor de expressão não esteja sujeito à limitação, visto que é capaz de expressar o gene de anticorpo humanizado. E preferível utilizar um vetor de expressão que já possua um gene de região constante de Ig humana tal como AG-γΙ ou AG-κ, pois ele se tornaria um vetor de expressão possuindo o gene de anticorpo humanizado simplesmente quando o gene da região variável de anticorpo humanizado estivesse nele inserido.

0 vetor de expressão acima descrito é introduzido em células cultivadas, por exemplo, através do método de fosfato de cálcio e similares. Como exemplos das células cultivadas nas quais o vetor de expressão é introduzido, células cultivadas tais como CH0-DG44 podem ser usadas, podendo ser cultivadas através de um método convencional.

Após o cultivo acima descrito, o anticorpo acumulado no sobrenadante de cultura pode ser purificado, por exemplo, através de diversas cromatografias utilizando uma coluna de Proteína A.

A atividade antigênica do anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana assim obtido pode ser medida, por exemplo, através de um teste ELISA utilizando um peptídeo de osteopontina e similar conforme descrito no Exemplo abaixo, BIACore (BIAcore Company) e similares. A atividade inibidora de migração de leucócitos do anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana pode ser medida, por exemplo, cultivando-se monócitos de sangue periférico humano na presença de um anticorpo de teste e OPN ou OPN do tipo clivada pela trombina, conforme descrito num Exemplo abaixo. 0 anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção possui uma atividade biológica para inibir a migração de monócitos de sangue periférico humano ativada por uma citocina (por

exemplo, TNF-cc)para OPN do tipo clivada pela trombina.

Em seguida, o anticorpo humanizado de osteopontina anti- humana assim gerado é testado quanto a diversos índices de estabilidade. 0 anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção exibe os seguintes

índices de estabilidade (A) a (D)): A). Exibe uma estabilidade térmica, na qual a atividade de ligação a um peptídeo compreendendo a seqüência SWYGLR (SEQ ID NO: 10) após tratamento térmico em PBS a 7O0C por 2 horas não é inferior a 90% em relação àquela sem tratamento térmico.

2 0 B) . A temperatura de transição de ponto médio

("midpoint") (Tm) é pelo menos 5°C maior que a de um anticorpo quimérico tendo uma região variável derivada de um anticorpo heterólogo doador e uma região constante derivada de um anticorpo humano.

C) . Possui uma resistência ao cloridrato de guanidina a concentrações maiores em pelo menos 0,5M em relação às de um anticorpo quimérico tendo uma região variável derivada de um anticorpo heterólogo doador e uma região constante derivada de um anticorpo humano.

3 0 D) . Possui uma resistência a níveis de pH inferiores em

pelo menos 0,3 em relação à de um anticorpo quimérico tendo uma região variável derivada de um anticorpo heterólogo doador e uma região constante derivada de um anticorpo humano.

3 5 Aqui, os índices A) e B) acima descritos são ambos índices de estabilidade térmica; pelo fato de o anticorpo possuir características melhores nesses índices, ele é mais vantajoso em termos de estabilidade de armazenamento a longo prazo e forma de dosagem. Ou seja, uma preparação de anticorpo é freqüentemente problemática com respeito a estabilidade de armazenamento pelo fato de ser uma proteína, às vezes preparada na forma liofilizada (isso é problemático em termos de conveniência no cenário da prática médica, já que a preparação precisa ser dissolvida no momento do uso; em especial, uma preparação de proteína geralmente leva mais de 30 segundos para se dissolver, o que por sua vez freqüentemente representa dificuldades na prática médica); porém, qualquer anticorpo que possua uma boa estabilidade a temperatura pode ser armazenado, mesmo em solução, enquanto se mantém ao mesmo tempo a estabilidade a longo prazo sob refrigeração por 2 anos ou mais. De fato, é assegurado que o R2Klvl. 7, o anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção descrito num Exemplo abaixo, é estável por cerca de 1 ano mesmo à temperatura ambiente (25°C) . Se uma preparação em solução for praticável, será possível criar preparações mais convenientes na forma de seringas pré-carregadas e similares. Um anticorpo com estabilidade a alta temperatura e que satisfaça os índices acima descritos, oferece uma variação mais ampla para se fazer a

2 5 preparação, tornando possível fazer preparações que

atendam a maioria das necessidades médicas, aumentando também as escolhas.

O índice (C) acima descrito é um índice relacionado com a resistência salina; um anticorpo que possua tal

3 0 resistência salina permitirá a pesquisa de uma fórmula

mais vantajosa para se fazer uma preparação farmacêutica. Especialmente em seringas pré-carregadas, esse índice é útil, já que concentrações altamente salinas são freqüentemente utilizadas no planejamento de uma preparação proteica com altas concentrações tais como de 100 a 200 μg/mL.

O índice (D) acima descrito, é um índice relacionado com a resistência ao pH; um anticorpo que possua tal resistência ao pH permite tratamento a níveis mais baixos de pH na etapa de inativação do vírus do processo de produção e purificação do anticorpo, sendo assim útil.

Por este motivo, uma resistência a pH mais baixo, ou seja, cerca de 0,3 mais baixo do que os anticorpos comuns, seria uma vantagem importante.

O método de teste para o índice (A) é descrito abaixo. Primeiramente, um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana de teste é diluído em PBS (preferivelmente 50 μ9/τηΙϋ) e tratado termicamente a 70°C por 2 horas. Em seguida, a diluição é retornada à temperatura ambiente, e a atividade de ligação do anticorpo a um peptídeo compreendendo a seqüência SWYGLR {SEQ ID N0:10) é medida, por exemplo, através do método ELISA de Kon et al. (Journal of Cellular Biology, 88: 420-432 (2002)). A atividade de ligação deste anticorpo tratado termicamente é comparada com a atividade de ligação do mesmo anticorpo, porém medida sem o tratamento térmico. 0 anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção, quando submetido a este tratamento térmico, exibe uma atividade de ligação não inferior a 90% da atividade de ligação do mesmo anticorpo, porém não tratado, ao peptídeo compreendendo a seqüência SWYGLR (SEQ ID NO:10). Preferivelmente, o peptídeo compreendendo a seqüência SWYGLR (SEQ ID NO: 10), utilizado neste teste de índice, é um peptídeo de osteopontina tendo a seqüência CVDTYDGRGDSWYGLRS (SEQ ID NO:13). O método de teste para o índice B) é descrito abaixo. Primeiramente, um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana de teste e o anticorpo quimérico 2K1 em W003/027151(C2K1) são ajustados utilizando uma solução tampão apropriada (preferivelmente 2OmM tampão citrato + 12OmM NaCl (pH 6,0)), e a estabilidade térmica pode ser avaliada utilizando um calorímetro diferencial exploratório (preferivelmente uma plataforma DSC capilar VP da MicroCal Company). A temperatura de transição de ponto médio (Tm), que mostra a temperatura de degeneração, do anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção é pelo menos 5°C maior do que a do C2K1.

0 método de teste para o índice (C) é descrito abaixo. Primeiramente, um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana de teste e o anticorpo quimérico 2Kl acima descrito (C2K1) são dissolvidos numa solução tampão comprendendo cloridrato de guanidina a várias concentrações de 0 a 5M (preferivelmente 20mM de fosfato de sódio + 120mM solução NaCl (pH 7,0)) e as soluções são ajustadas até uma concentração apropriada

(preferivelmente 50 μ9/τη1) . Em seguida, cada amostra de solução é deixada repousar a 10°C da noite para o dia, após o que o espectro fluorescente de cada amostra é medido. Especificamente, a fluorescência emitida pelo triptofano sob luz de excitação a 280 nm é explorada sobre a faixa de comprimento de onda de 320 nm a 370 nm. O comprimento de onda de pico se altera devido ao 2 0 afrouxamento da estrutura estérica da proteína do anticorpo pelo cloridrato de guanidina. A concentração de cloridrato de guanidina para uma mudança no comprimento de onda de pico é medida para cada anticorpo de teste e anticorpo quimérico. Para o anticorpo humanizado de 2 5 osteopontina anti-humana da presente invenção, a concentração de cloridrato de guanidina para uma alteração no comprimento de onda de pico acima descrito é cerca de pelo menos 0,5M maior do que a do C2K1. O método de teste para o índice (D) é descrito abaixo. Primeiramente, um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana de teste e o anticorpo quimérico 2K1 acima descrito (C2K1) são ajustados utilizando uma solução tampão apropriada (preferivelmente 2OmM tampão citrato + 12 0 mM NaCl (pH 6,0)) (preferivelmente 2mg/ml), e enquanto uma solução ácida (preferivelmente HCl 0,IN) e água são adicionados aos mesmos, é preparada uma amostra de cada nível de baixo pH na concentração especificada (lmg/mL). Após esta amostra ser tratada à temperatura ambiente por 1 hora, é medido o espectro de dicroísmo circular (CD). 0 espectro CD é medido na faixa de comprimento de onda de 205 nm a 260 nm, e a relação de conteúdo de estrutura aleatória é medida para cada amostra tratada por pH de cada anticorpo, com base no método analítico espectral CD de Yang et al. (Methods in Enzymology, 130, 208-269 (1986)). 0 pH no qual a relação de conteúdo de estrutura aleatória no anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção começa a aumentar é cerca de pelo menos 0,3 menor do que o do C2K1.

Os inventores conduziram investigações exaustivas utilizando em combinação modificações do gene da região estrutural através de mutagênese sítio-dirigida e similares, e os estudos de estabilidade utilizando os índices de estabilidade A) a D) acima descritos, com base no anticorpo humanizado descrito em W003/027151, e pela primeira vez obtiveram êxito em obter um anticorpo 2 0 humanizado de osteopontina anti-humana com atividades (atividade de ligação a antígeno, atividade inibidora de migração de leucócitos e similares) e/ou estabilidade (resistência térmica, condições de baixo pH, desnaturantes e similares) melhores do que as dos anticorpos convencionais de osteopontina anti-humana, fazendo com que as porções estruturais de anticorpo humano (FRl a 4) se tornassem a seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID NO:1 (números de aminoácido 1 a 30, 36 a 49, 67 a 98, e 106 a 116, respectivamente) e a seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID N0:3(números de aminoácido 1 a 23, 40 a 54, 62 a 93, e 103 a 113, respectivamente). 0 anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção foi testado quanto à atividade de ligação a antígeno, atividade inibidora de migração de leucócitos, e diversos índices de estabilidade, tendo sido constatado que tinha as atividades e que exibia todos os índices de A) a D) como características próprias.

O anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção, compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo da seqüência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia leve consistindo da seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID NO:3, pode ser facilmente adquirido sintetizando- se um DNA que codifique a seqüência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO :1 e um DNA que codifique a seqüência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO: 3 utilizando um método conhecido no estado da técnica, reunindo-os numa classe apropriada de gene de região constante de anticorpo humano, preferivelmente o gene de região constante de Igyl humana para a cadeia pesada e o gene de região constante de IgK humana para a cadeia leve, para construir um gene de anticorpo humanizado, introduzindo o gene de anticorpo humanizado num vetor de expressão utilizando diversos métodos comumente conhecidos no estado da técnica ou o método descrito em WO 02/081522 ou W003/027151 e similares, introduzindo o vetor de expressão nas células cultivadas, cultivando as células cultivadas, e purificando o anticorpo da cultura obtida. Como o gene de cadeia pesada de anticorpo humanizado preferível da presente invenção, obtido unindo-se o gene de região variável de cadeia pesada mostrado através da SEQ ID NOsl e o gene de região constante de cadeia pesada de Igyl humana, pode-se mencionar um gene compreendendo uma seqüência base que codifica a seqüência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO:25, mais preferivelmente um gene compreendendo a seqüência base mostrada pela SEQ ID NO:24. Como o gene de cadeia leve de anticorpo humanizado preferível da presente invenção, obtido unindo-se o gene de região variável de cadeia leve mostrado pela SEQ ID NO: 3 e o 3 5 gene de região constante de cadeia leve de IgK humana, pode-se mencionar um gene compreendendo uma seqüência base que codifica a seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID NO:27, mais preferivelmente um gene compreendendo a seqüência base mostrada pela SEQ ID NO: 26. Como o anticorpo humanizado de anti-osteopontina da presente invenção, codificado por um gene de cadeia pesada compreendendo a seqüência base mostrada pela SEQ ID NO:24 e um gene de cadeia leve compreendendo a seqüência base mostrada pela SEQ ID NO:26, pode-se mencionar R2Klvl.7, descrita num exemplo abaixo.

Alternat ivamente, o ant icorpo humani zado de ant i- osteopontina da presente invenção, compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo da seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve consistindo da seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID NO:3, pode também ser sintetizado com um DNA que codifique a seqüência de aminoácido acima descrita mostrada por SEQ ID NO: 1 e um gene de região constante de cadeia pesada de anticorpo humano, e um DNA que codifique a seqüência de aminoácido através da SEQ ID NO: 3 e um gene de região constante de cadeia leve de anticorpo humano, como os padrões, utilizando um sistema de transcrição/translação sem células. 0 sistema de transcrição/translação sem células utilizado pode ser um sistema disponível no mercado, que pode ser preparado de acordo com um método conhecido, especificamente o método descrito em Pratt J.M.et al. , "Transcription and Translation", Hames B. D. and Higgins S.J. ed. , IRL Press, Oxford 179-209 (1984) e similares para extrato de Escherichia coli. Como o lisado de células disponível no comércio, pode-se mencionar o sistema de extrato de E.coli S30 (fabricado pela Promega Company) , o Sistema de Translação Rápida RTS 500 (fabricado pela Roche Company) e similares derivados de Escherichia coli, bem como o Sistema de Lisado de Reticulócito de Coelho (fabricado pela Promega Company) e similares derivados de reticulócitos de coelho, e PR0TEI0S™( fabricado pela TOYOBO Company) e similares derivados de germe de trigo podem também ser mencionados. Entre eles, os que utilizam lisado de germe de trigo são adequados. Como método para preparar um 1 i sado de germe de trigo, por exemplo, o método descrito em Johnston F.B. et al., Nature, 179, 160-161 (1957) ou Erickson A.H.et al., Meth.Enzymol., 96, 38-50 (1996) e similares podem ser utilizados.

A presente invenção também abrange fragmentos de anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana (fragmento de anticorpo) tal como os fragmentos de região variável de fita única (scFv), Fab, Fab', e F(ab')2/ compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo da seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID NO :1 e uma região variável de cadeia leve consistindo da seqüência de aminoácido mostrada por SEQ ID NO:3, e mantendo as atividades.

0 ligante para unir uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL) que pode ser usado para preparar scFv, não está sujeito à limitação, contanto que o fragmento de anticorpo da 2 0 presente invenção possa ter as características acima descritas; por exemplo, um peptídeo consistindo da seqüência de aminoácido mostrada por GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:14) pode ser mencionado. O habilitado na técnica pode preparar um anticorpo fusionado do anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana ou do fragmento de anticorpo e de outro peptídeo ou proteína, e preparar um anticorpo modificado com um agente modificador a ele ligado, com base na presente invenção. O outro peptídeo ou proteína utilizado para a fusão não está sujeito à limitação, contanto que não reduza a atividade de ligação do anticorpo; por exemplo, a albumina de soro humano, diversos peptídeos marcadores ("Tags") peptídeo padrão helicoidal artificial, proteínas ligantes à maltose, glutationa S transferase, diversas toxinas, outros peptídeos ou proteínas capazes de romover a multimerização e similares podem ser mencionados. 0 agente modificador utilizado na modificação não está sujeito à limitação, visto que não reduz a atividade de ligação do anticorpo; por exemplo, polietileno glicol, cadeias de açúcar, fosfolipídeos, lipossomas, compostos de baixo peso molecular, e similares, podem ser mencionados.

0 ant icorpo humani zado de osteopont ina ant i-humana da presente invenção assim obtido ou um fragmento de anticorpo retendo uma atividade devida ao anticorpo, um anticorpo fusionado resultante da fusão do anticorpo ou do fragmento de anticorpo com um peptídeo ou outra proteína, ou um anticorpo modificado consistindo do anticorpo ou do fragmento de anticorpo e um agente modificador ligado ao mesmo, após serem purificados conforme necessário, podem ser preparados na forma de uma preparação farmacêutica de acordo com um método convencional, e podem ser usados para tratar artrite reumatóide, reumatismo, tal como artrite reumatóide juvenil e reumatismo crônico, artrite psoríatica, psoríase e similares, para suprimir câncer e rejeição 2 0 crônica de enxerto após transplante de órgãos, e para tratar doenças autoimunes tais como osteoartrite, doença autoimune sistêmica, lúpus eritematoso, uveíte, doença de Behcet, miosite múltipla, nefrite glomeruloproliferativa e sarcoidose.

O anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção pode ser usado preferivelmente como agente terapêutico de reumatismo, agente terapêutico de doença autoimune, agente terapêutico de osteartrite ou agente terapêutico de artrite reumatóide, mais preferivelmente como agente terapêutico na artrite reumatóide. Como exemplos de formas de dosagem para o agente terapêutico de reumatismo e similares, pode-se preparar uma preparação parenteral tal como uma injeção ou infusão por gotejamento, sendo preferivelmente administrada por via intravenosa, via subcutânea e similares (o mesmo se aplica no caso de agente terapêutico de doença autoimune). Ao preparar uma preparação farmacêutica, podem ser usados portadores e aditivos que combinem com essas formas de dosagem, numa faixa farmaceuticamente aceitável.

A quantidade de anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana adicionada à preparação acima descrita, varia dependendo da gravidade dos sintomas e da idade do paciente, da forma de dosagem da preparação utilizada ou do título de ligação do anticorpo inibidor de OPN recombinante e similares; por exemplo, podem ser usados de cerca de 0,lmg/kg a 100 mg/kg.

Em relação ao agente terapêutico da presente invenção assim obtido, o ingrediente ativo anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana liga-se fortemente à seqüência RGD e à seqüência SWYGLR da OPN (SEQ ID NO: 10) para inibir a ligação entre essa porção de OPN e integrina, resultando na supressão da exacerbação dos sintomas de reumatismo e de artrite reumatóide e de outras doenças autoimunes.

Pelo fato de o anticorpo humanizado de osteopontina anti- humana da presente invenção ligar-se especificamente ao lado OPN ao invés de ao lado integrina, é improvável que iniba qualquer outra função importante da integrina, e espera-se com isso evitar a ocorrência de reações adversas.

Além disso, o anticorpo humanizado de osteopontina anti- humana da presente invenção pode também ser usado como reagente diagnóstico para a artrite reumatóide. Conforme acima citado, comprovou-se que nas articulações de um paciente com artrite reumatóide, um fragmento N-terminal de OPN clivada pela trombina é encontrado em altas concentrações. Portanto, a medição da quantidade de OPN ou do fragmento N-terminal da mesma numa amostra utilizando esse anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana poderia ser útil no diagnóstico de artrite reumatóide. Como a técnica, podem ser usados diversos métodos em uso para ensaios imunoquímicos comuns, tais como o método de imunoensaio com radioisótopo (método RIA), método ELISA (E.Engvall et al. , (1980): Methods in Enzymol. 70, 419-439), método de anticorpo fluorescente, método de placa, método "spot", método da aglutinação, e método Ouchterlony ("Hybridoma Method and Monoclonal Antibodies", publicados por R&D Planning, páginas 30-53, de março de 1982).

Embora um método apropriado possa ser selecionado de entre as técnicas acima descritas de diversos pontos de vista, o método ELISA é preferível em termos de sensibilidade, conveniência, etc. Como exemplo de um método mais preferido, por exemplo o anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana da presente invenção é imobilizado sobre um portador, um anticorpo que reconhece uma porção na OPN que é diferente daquela reconhecida pelo anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana é marcado, por meio do que a OPN ou o fragmento N-terminal da mesma pode ser detectado, e isso pode ser usado como reagente diagnótico para artrite reumatóide. Como substância marcadora utilizada para marcar o anticorpo acima descrito,pode-se mencionar as proteínas/peptídeos para formar uma proteína/peptídeo fusionado, tal como glutationa S-transferase, enzimas tais como "Horseradish peroxidase" (adiante designada "HRP") e fosfatase alcalina (adiante designada "AP"), substâncias fluorescentes tal como o isocianato de fluoresceína e rodamina, substâncias radioativas tais como 32P e 125I, e agentes modif icadores tais como substâncias quimioluminescentes.

Em relação ao método para detectar isoformas de OPN, por exemplo, a detecção pode ser conduzida utilizando um método comumente conhecido no estado da técnica, tal como o método "sanduíche" ou mais especificamente utilizando o mesmo método como método de detecção descrito em WO 02/081522 (documento patentãrio 2) ou W003/02 7151 (documento patentário 3).

A presente invenção também provê um gene que codifica o anticorpo da presente invenção ou um fragmento do mesmo, e um vetor de expressão compreendendo o mesmo. 0 vetor de expressão da presente invenção não está sujeito à limitação, visto que é capaz de expressar um gene que codifica o anticorpo da presente invenção ou um fragmento do mesmo, em diversas células hospedeiras de células procarióticas e/ou de células eucarióticas, e de produzir esses polipeptídeos. Pode-se por exemplo, mencionar os vetores de plasmídeo, vetores virais (por exemplo, adenovírus, retrovírus) e similares. O vetor de expressão da presente invenção pode compreender um gene que codifica o anticorpo da presente invenção ou um fragmento do mesmo, e um promotor funcionalmente unido ao gene. Como o promotor para expressar o polipeptídeo da presente invenção numa bactéria, quando o hospedeiro for uma bactéria do gênero Escherichia, por exemplo, o promotor Trp, promotor Iac, promotor recA, promotor XPL, promotor Ipp, promotor tac e similares podem ser mencionados. Como promotor para expressar o anticorpo da presente invenção ou um fragmento do mesmo em levedura, pode-se mencionar por exemplo, o promotor PHO5, promotor PGK, promotor GAP, e o promotor ADH; quando o hospedeiro for uma bactéria do gênero Bacillus, pode-se mencionar o promotor SL01, promotor SL02, promotor penP, e similares. Quando o

2 5 hospedeiro for uma célula eucariótica, tal como uma

célula de mamífero, o promotor derivado de SV40, promotor de retrovírus, promotor de choque térmico e similares podem ser mencionados.

Quando uma bactéria, especialmente a Escherichia coli,

3 0 for utilizada como célula hospedeira, o vetor de

expressão da presente invenção pode ainda compreender um códon de iniciação, um códon de parada, uma região de terminação e uma unidade replicável. Quando uma levedura, célula animal ou célula de inseto for utilizada como 3 5 hospedeiro, o vetor de expressão da presente invenção pode compreender um códon de iniciação e um códon de parada. Neste caso, uma seqüência intensificadora, regiões não codificadoras no lado 5 "e 3X de um gene que codifica o polipeptídeo da presente invenção, uma junção de alinhamento, um sítio de poliadenilação, ou uma unidade replicavel e similares podem estar contidos. Um marcador de seleção de uso comum (por exemplo, tetraciclina, ampicilina, canamicina) podem estar contidos, de acordo com o uso pretendido.

A presente invenção também prove um transformante incorporando o gene da presente invenção. Tal transformante pode ser preparado, por exemplo, transformando-se uma célula hospedeira com o vetor de expressão da presente invenção. A célula hospedeira utilizada para preparar um transformante não está sujeita a limitações, visto que se combina com o vetor de expressão anteriormente citado e é transformável; diversas células, tais como células naturais ou linhagens de células artificialmente estabelecidas de uso comum no campo técnico da presente invenção (por exemplo, bactérias(bactérias do gênero Escherichia, bactérias do gênero Bacillus), leveduras (o gênero Saccharomyces, o gênero Pichia e similares), células de animais ou de insetos (por exemplo, a Sf 9) e similares) podem ser mencionadas como exemplo. A transformação pode ser conduzida através de um método conhecido.

2 5 A presente invenção também provê um método para produzir

o anticorpo da presente invenção ou um fragmento do mesmo, compreendendo permitir que uma célula hospedeira expresse o gene da presente invenção, ou seja, utilizando tal transformante.

3 0 Ao produzir o anticorpo da presente invenção ou um

fragmento do mesmo, o transformante pode ser cultivado em meio nutriente. 0 meio nutriente preferivelmente contém uma fonte de carbono e uma fonte inorgânica de nitrogênio ou uma fonte orgânica de nitrogênio necessária para o 3 5 crescimento do transformante. Como exemplos de fontes de carbono, pode-se mencionar glicose, dextrano, amido solúvel, sacarose, e similares; como exemplos de fonte inorgânica de nitrogênio e de fonte orgânica de nitrogênio, pode-se mencionar sais de amônio, nitratos, aminoácidos, licor de infusão de milho, peptona, caseína, extrato de carne, torta de soja, extrato de batata e similares. Se desejado, outros nutrientes (por exemplo, sais inorgânicos (por exemplo, cloreto de cálcio, dihidrogeno fosfato de sódio, cloreto de magnésio) , vitaminas, antibióticos(por exemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, canamicina e similares) e similares) podem estar contidos.

O cultivo do transformante pode ser executado através de um método conhecido. Condições de cultivo, por exemplo, temperatura, pH do meio e tempo de cultivo são selecionadas conforme apropriado. Por exemplo, quando o hospedeiro for uma célula animal, um meio MEM contendo cerca de 5 a 20% de soro fetal bovino (Science, vol.122, p.501, 1952), meio DMEM (Virology, vol.8, p.396, 1959), meio RPMI164 0 (J.A.Med.Assoc., Vol.199, p.519, 1967), meio 199 (Proc.Soc.Exp.Biol.Med., vol.73, p.l, 1950) e similares, podem ser usados como meio. 0 pH do meio é preferivelmente de cerca de 6 a 8, o cultivo é normalmente conduzido a cerca de 30 a 4O0C por cerca de a 72 horas, e a cultura poderá ser aerada ou agitada, se necessário. Quando o hospedeiro for uma célula de

2 5 inseto, por exemplo, meio Grace compreendendo soro fetal

bovino (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, vol.82, p.84 04, 1985) e similares podem ser mencionados, sendo seu pH preferivelmente de cerca de 5 a 8. 0 cultivo é normalmente conduzido a cerca de 20 a 4O0C por 15 a 10 0

3 0 horas e a cultura pode ser aerada ou agitada, conforme

necessário. Quando o hospedeiro for uma bactéria, é apropriado o uso de um actinomyces, levedura, ou um fungo filamentoso, por exemplo, um meio líquido compreendendo as fontes nutrientes acima descritas. Um meio com um pH de 5 a 8 é preferível. Quando o hospedeiro for E. coli, meio LB, meio M9 (Miller et al., Exp.Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) e similares, podem ser mencionados como meios preferidos. Neste caso, o cultivo pode ser normalmente conduzido de 14 a 43°C por cerca de 3 a 24 horas, enquanto a cultura é aerada ou agitada, conforme necessário. Quando o hospedeiro for uma bactéria do gênero Bacillus, o cultivo pode ser normalmente conduzido de 30 a 40°C por cerca de 16 a 96 horas, enquanto a cultura é aerada ou agitada. Quando o hospedeiro for uma levedura, meio mínimo de Burkholder's (Bostian, Proc.Natl.Acad.Sei, USA, vol.77, p.4505, 1980)

pode ser mencionado como exemplo de meio, e o pH é desej avelmente de 5 a 8. O cultivo é normalmente conduzido a cerca de 20 a 35°C por cerca de 14 a 144 horas, e a cultura pode ser aerada ou agitada conforme necessário.

O anticorpo da presente invenção ou um fragmento do mesmo pode ser recuperado, preferivelmente isolado e purificado, de um transformante cultivado, conforme acima descrito. Como exemplos do método de isolamento e purificação, métodos baseados em diferenças na

2 0 solubi1idade, tais como separação por salinidade

(" salting out") e precipitação de solvente ,-métodos baseados em diferenças no peso molecular, tais como diál ise, ultrafiltração, filtração em gel, eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio

(SDS_PAGE); métodos baseados em diferenças na carga elétrica, tais como cromatografia de troca iônica, e cromatografia com hidroxiapatita; métodos baseados em afinidade específica, tais como cromatografia de afinidade ,-métodos baseados em diferenças na

3 0 hidrofobicidade, tal como cromatografia líquida de alto

desempenho em fase reversa; métodos baseados em diferenças em ponto isoelétrico, tal como focaiização isoelétrica e similares podem ser mencionados. A presente invenção foi geralmente descrita acima;

exemplos específicos a serem consultados para facilitar a compreensão da mesma estão descritos abaixo, os quais, porém, são para fins de ilustração somente, j amais limitando o escopo da invenção.

EXEMPLOS

Exemplos são dados abaixo. Os procedimentos envolvendo o uso de um kit e similares foram conduzidos conforme orientações do protocolo anexo ao kit, salvo se especificado de outra forma. (1. Preparação de anticorpo humanizado 2K1) Na presente invenção, dois tipos de anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana preparados humanizando-se o anticorpo 2K1, que é um anticorpo de osteopontina anti- humana derivado de camundongo, descrito no Diário Oficial de Publicação de Patente Internacional W02003/027151 (também adiante designado anticorpo humanizado 2K1 ou anticorpo R2K1 humanizado) foram preparados. Uma vez que cada anticorpo humanizado 2K1 foi preparado geralmente de acordo com o método descrito no diário oficial acima descrito, abaixo é provido um esboço. Primeiramente, DNAs que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada (VHs) de 2 tipos de anticorpo humanizado anti-OPN tendo as seqüências base mostradas na Figura 1 e Figura 2 e DNAs que codificam as regiões variáveis de cadeia Ieve(VLs) de 2 tipos de anticorpo humanizado anti- OPN tendo as seqüências base mostradas na Figura 3 e Figura 4 foram preparados através de PCR utilizando um oligo-DNA sintético. Na descrição abaixo, para distingui- los, as VHs de anticorpo humanizado de OPN anti-humana mostradas na Figura 1 e Figura 2 são designadas R2K1- VHl. 7 e R2Kl-VHl.8, respectivamente. Da mesma forma, as VLs de anticorpo humanizado de OPN anti-humana mostradas na Figura 3 e Figura 4 são designadas R2K1-VL1.7 e R2K1- VLl.8, respectivamente.

Em seguida, cada um dos DNAs acima descritos que codificam as VHs de anticorpo humanizado de OPN anti- humana foi inserido em AG-γΙ, que é um vetor de expressão 3 5 compreendendo o gene para a cadeia γΐ da região constante de imunoglobulina humana, utilizando um sítio de reconhecimento HindIII de endonuclease de restrição e o sitio de reconhecimento de BamHI, por meio do que um plasmídeo de expressão de cadeia pesada tendo R2K1-VH1.7 e um plasmídeo de expressão de cadeia pesada tendo R2K1- VHl.8 foram preparados. Da mesma forma, cada um dos DNAs acima descritos que codificam as VLs de anticorpo humanizado de OPN anti-humana foi inserido em AG-κ, que é um vetor de expressão compreendendo o gene para a cadeia κ da região constante de imunoglobulina humana, por meio do que foram preparados o plasmídeo de expressão de cadeia leve tendo R2K1-VL1.8 e um plasmídeo de expressão de cadeia leve tendo R2K1-VL1.7. Esses plasmídeos de expressão foram introduzidos e proliferados em Escherichi coli e purificados utilizando um kit de purificação de plasmídeo disponível no mercado {QIAGEN Company). Finalmente, diversas combinações dos plasmídeos de expressão purificados acima descritos foram transfectados para células CH0-DG44 através do método de fosfato de cálcio, e células foram selecionadas num meio MEM (Invitrogen Company) compreendendo Geneticina (Invitrogen 2 0 Company) e FCS dialisado (Invitrogen Company), por meio do que foram obtidas células expressando dois tipos de anticorpo humanizado 2Kl. Ou seja, o anticorpo R2Klvl.8, que é um ant icorpo humani zado 2 Kl cons ist indo de uma cadeia pesada tendo R2K1-VH1.8 e uma cadeia leve tendo 2 5 R2K1-VLl.8 e o anticorpo R2Klvl.7, que é um anticorpo humanizado 2K1 consistindo de uma cadeia pesada tendo R2K1-VHl.7 e uma cadeia leve tendo R2K1-VL1.7, foram expressados.

Células produzindo cada anticorpo R2K1, obtido através dos procedimentos acima descritos, foram deixadas crescer completamente num meio MEM suplementado com FCS dialisada a 10%, semeadas num frasco giratório (BD Biosciences Company) e cultivadas sob as condições de 37°C e uma taxa de rotação de 1 rpm. Vários dias depois, constatou-se que as células aderiam e cresciam na parede do frasco, o caldo de cultura foi descartado, o meio trocado por 500 ml de meio MEM livre de soro, e as células cultivadas sob as condições abaixo descritas. Cerca de 2 semanas depois, quando muitas células foram suspensas da parede do frasco, a cultura foi interrompida, e o sobrenadante da cultura filtrado em filtro de 0,22 μτη e recuperado para produzir um sobrenadante de cultura contendo cada anticorpo R2K1.

Com esses sobrenadantes de cultura como materiais de partida, e utilizando a coluna de Proteína A (MILLIPORE Company) e uma coluna de troca iônica (Amersham Company), diversas miligramas de cada um dos dois tipos de anticorpo humanizado purificado, ou seja, o anticorpo R2Klvl.8 e o anticorpo R2Klvl.7, foram obtidos. Nos diversos experimentos descritos abaixo, foram utilizados os anticorpos purificados obtidos conforme descrito acima. 0 anticorpo quimérico 2K1 (adiante também designado anticorpo C2K1) utilizado foi obtido através do método descrito no Diário Oficial de Publicação de Patente Internacional acima mencionado W02003/027151. (2. Confirmação de atividade de ligação com peptídeo de

2 0 osteopontina humana através de ELISA).

As atividades de ligação de cada anticorpo R2K1 e do anticorpo C2K1 a um peptídeo de osteopontina humana (CVDTYDGRGDSWYGLRS: SEQ ID NO:13) foram comparadas com referência ao método ELISA de Kon et al. (Journal of Cellular Biology, 88:420-432 (2002)). Um esboço é fornecido abaixo.

0 peptídeo tendo a seqüência acima descrita (adiante também designado peptídeo hOPN5) foi reagido com BSA incorporando um grupo maleimida introduzido utilizando-se Sulfo-EMCS (Dojindo Laboratories) para preparar um conjugado hOPN5-BSA. 0 conjugado hOPN5-BSA foi imobilizado a 200 ng/100^L/cavidade numa placa ELISA (Nunc Company) a 4°C da noite para o dia, e a placa foi lavada, após o que o bloqueio foi realizado com PBS

3 5 suplementada com BSA a 1% a 4°C da noite para o dia. Uma

amostra de anticorpo diluída com PBS suplementada com BSA a 1% foi adicionada à placa a 100μL/cavidade, e foram reagidos a 3 7°C por 1 hora. A detecção foi conduzida uti1izando um anticorpo de IgG anti-humana marcado com (HRP) peroxidase (H+L) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) . A absorbância a um comprimento de onda de 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas (Molecular Devices Company).

Como resultado, confirmou-se que as atividades de ligação do anticorpo R2Klvl.7 e do anticorpo R2Klvl.8 ao peptídeo de hOPN5 eram equivalentes às do anticorpo C2K1 (Figura 5). (3. Atividade inibidora do anticorpo R2K1 sobre a migração de monócitos de sangue periférico humano). A atividade inibidora de anticorpo purificado sobre a migração de monócito de sangue periférico ativada por citocina foi examinada conforme abaixo descrito. Primeiramente, sangue heparinizado colhido de uma pessoa sadia foi diluído duas vezes com meio RPMI1640. 0 sangue diluído foi depositado sobre Ficoll-Paque (Pharmacia K.K.) e centrifugado a 400xg e à temperatura ambiente por 3 0 minutos. A camada branca observada na interface entre 2 0 o plasma e o Ficoll-Paque foi recuperada e utilizada como monócitos. Os monócitos assim obtidos foram cultivados e ativados com TNF-a (20 ng/ml) da noite para o dia, e utilizados em experimentos de migração.

Os experimentos de migração foram conduzidos utilizando

2 5 uma câmara de microquimiotaxia de 48 cavidades (Neuro

Probe Inc.) . A OPN humana foi clivada através de uma reação com trombina bovina (Sigma) a 3 7°C por 2 horas. Cada anticorpo R2K1 e o anticorpo C2K1 foi adicionado em diversas concentrações, e a mistura foi deixada repousar a 370C por 15 minutos, após o que foi adicionada à câmara inferior (a concentração final de OPN humana foi de ΙΟμς/πιΙ) . Sobre a câmara foi montado um filtro de policarbonato (tamanho de poro 5 μηι) e 50μ1 de uma suspensão de células (2 χ IO6 células/mL) foram

3 5 adicionados à câmara superior.

Após cultivo a 37°C na presença de CO2 a 5% por 2 horas, o filtro de policarbonato foi removido, as células retiradas da superfície do filtro superior, após o que as células foram coradas com Diff-Quick (Baxter Company). 0 número de células presentes na superfície do filtro superior foi contado sob um aumento de 4 0 vezes, e os resultados foram expressados como a contagem média de células (células/mm3) ±SEM para β cavidades (Tabela 1) . Desses resultados, tanto o anticorpo R2Klvl.7 como o anticorpo R2Klvl.8 inibiram a migração de monócitos de sangue periférico humano ativados por TNF-α para a osteopontina humana clivada por trombina, como acontece com o anticorpo C2K1. Tabela 1

R2K1V.1 e R2K1V1.8

Contagem média de células SEM Meio 701, 7 24, 8 Thr-OPN 881,7 24, 0 R2Klvl.7 50/ig/ml 723, 3 43, 0 R2Klvl.8 50^g/ml 688, 3 16, 6 Contagem média de células SEM Meio 686, 7 15,9 Thr-OPN 860, 0 30,7 C2K1 50^g/ml 671, 7 48,5

4. Avaliação de Estabilidade Térmica através de ELISA

Cada anticorpo C2K1 e os dois tipos de anticorpo R2K1 foram diluídos até 50μg/mL com PBS, e tratados em banho maria a 70°C por 2 horas. Em seguida, cada diluição foi retornada à temperatura ambiente, e a relação da absorbância obtida pelo teste ELISA acima descrito para a absorbância de uma amostra não tratada foi representada graficamente como atividade residual. A atividade residual foi calculada utilizando valores de absorbância enquadrados na faixa de 0,2 a 2,0 com linearidade (o mesmo aplica-se abaixo). Como resultado, constatou-se que a atividade residual após o tratamento acima descrito foi maior para o anticorpo R2Klvl.7 e o anticorpo R2Klvl.8 do que para o anticorpo C2K1 (Figura 6). Particularmente, o anticorpo R2Klvl.7 exibiu uma atividade residual que excedia 90%. Isso demonstrou que o anticorpo R2Klvl.7 e o anticorpo R2Klvl.8 havia melhorado a estabilidade térmica em comparação com o anticorpo C2K1. (5. Avaliação de resistência a baixo pH através de ELISA).

Cada um dos estoques purificados do anticorpo C2K1 e os dois tipos de anticorpo R2K1 foi diluído com PBS até 50μ g/mL. Cada diluição teve seu pH ajustado em 5 com HCl IN utilizando um pHmetro (HORIBA Company) e tratada a 25°C por 2 horas. Em seguida, a diluição teve seu pH ajustado em 7 com Tris-HCl IM (pH 9,5), e a relação da absorbância obtida pelo ELISA acima descrito para a absorbância de uma amostra não tratada foi representada graficamente como atividade residual. Como resultado, constatou-se que a atividade residual após o tratamento acima descrito foi significativamente maior para o anticorpo R2Klvl.7 do que para o anticorpo C2K1 e anticorpo R2Klvl.8 (Figura 7). Isso demonstrou que o anticorpo R2Klvl.7 apresentava

2 0 resistência melhorada a baixo pH se comparado com o

anticorpo R2Klvl.8 e o anticorpo C2K1.

(6. Avaliação de resistência de cloridrato de guanidina através de espectrometria fluorescente).

Cada anticorpo C2K1 e os dois tipos de anticorpo R2K1 foi ajustado em 50μg/ml utilizando um tampão fosfato de sódio mM + NaCl 120 mM (pH 7) contendo diversas concentrações de cloridrato de guanidina (para controle, não foi adicionado cloridrato de guanidina) e deixado repousar a 10°C da noite para o dia, após o que o

3 0 espectro de fluorescência de cada amostra foi medido. A

medição do espectro de fluorescência foi conduzida utilizando um Espectrofluorômetro FP-6500 (JASCO Company). Utilizando uma célula com comprimento de trajetória de luz de 3mm, a fluorescência emitida pelo 3 5 triptofano excitada por 280 nm luz foi explorada numa faixa de comprimento de onda de 320 nm a 370 nm. A relação entre a concentração de cloridrato de guanidina e o comprimento de onda de pico foi comparada entre os anticorpos. Como resultado, observou-se uma mudança no comprimento de onda de pico devido ao afrouxamento da estrutura estérica da proteína de um ponto no tempo em que a concentração de cloridrato de guanidina excedeu exatamente IM para C2K1 ou 2M para R2Klvl.8, ao passo que o comprimento de onda de pico não mudou até 3, 8M para R2Klvl.7 (Figura 8) . Isso demonstrou que o anticorpo R2Klvl.7 tinha resistência melhorada ao cloridrato de guanidina se comparado com o anticorpo R2Klvl.8 e o anticorpo C2K1.

(7. Avaliação da resistência a baixo pH por CD). Cada anticorpo C2K1 e R2Klvl.7 foi ajustado para 2mg/ml com tampão citrato 20mM + 120 mM NaCl (pH 6). HCl O7IN e água destilada foram adicionados aos mesmos para preparar amostras com diversos níveis de pH com uma concentração de anticorpo de lmg/ml; após ser tratado à temperatura ambiente por 1 hora, o espectro CD de cada amostra foi medido.

2 0 As medições de CD (dicroísmo circular) foram realizadas utilizando um Espectropolarímetro J-820 (JASCO Company). Utilizando uma célula com comprimento de trajetória de luz de 0,1 mm, o espectro CD foi medido numa faixa de comprimento de onda de 205 nm a 260 nm. A análise

2 5 espectral empregou o programa de análise de estrutura

secundária de proteína modelo JWSSE-480 (JASCO Company), baseado no método analítico espectral de CD de Yang et al. (Methods in Enzymology, 130, 208-269 (1986)). A relação entre a razão de conteúdo de estrutura aleatória

3 0 calculada através deste método e o pH de tratamento foi

comparada entre os anticorpos. Como resultado, a relação de conteúdo de estrutura aleatória aumentou a partir de pH 3 para o anticorpo C2K1, ao passo que nenhum aumento foi observado na estrutura aleatória até pH de 2.7 para R2Klvl.7 (Figura 9). Isso confirma que o anticorpo R2Klvl. 7 possui uma resistência a um nível de pH 0,3 inferior ao do anticorpo C2K1. (8. Avaliação da estabilidade térmica utilizando calorímetro diferencial exploratório).

Cada anticorpo C2K1 e anticorpo R2Klvl.7 foi dissolvido em 20 mM de tampão citrato + tampão 120 mM NaCl (pH 6,0) a uma concentração de 1 mg/ml e sua estabilidade térmica foi examinada utilizando um calorímetro diferencial exploratório ultra-sensível da MicroCal Company (plataforma DSC capilar VP). Os resultados são mostrados na Figura 10. A temperatura de transição de ponto médio (Tm), que indica temperatura mais alta de desnaturação estrutural, foi de 76,0°C para o anticorpo C2K1 e 82,8°C para o anticorpo R2Klvl.7; um aumento de cerca de 60°C foi confirmado. Isso demonstrou que o anticorpo R2Klvl.7 apresentava uma estabilidade térmica notavelmente melhorada.

(9. Efeito Inibidor de Adesão Celular de R2Klvl.7 sobre OPN) .

Para comparar os efeitos farmacológicos do R2Klvl.7 da presente invenção e um anticorpo anti-OPN humanizado 2 0 comumente conhecido (vide W003/02 7151; adiante designado R2Klv0), foram examinados os efeitos inibidores de adesão celular desses dois anticorpos sobre OPN humana.

1. Cultura e Passagem de Células

Células Jurkat E6.1 foram adquiridas da Dainippon 2 5 Pharmaceutical Co., Ltd. e transitadas e cultivadas utilizando RPMI1640 (FCS 10%, penicilina-estreptomicina).

2. Preparação de Reagentes

Tampão de adesão (meio L-15, BSA 1%, 50 mM HEPES, pH 7.4) Solução PMA (40 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) [SIGMA] em tampão de adesão).

Solução corante CV (violeta cristal 0,5%, formamida 1%, metanol 20%) .

Solução GST (5 μg/mL glutationa-S-transferase (GST) [SIGMA] em PBS (-)). Solução de IgGl humana (500 μg/mL em PBS (-)) [CALBIOCHEM]

3. Preparação de osteopontina N-terminal humana clivada por trombina (OPN) . ]

OPN N-terminal humana clivada por trombina fundida com GST (N-OPN GST-humana, 1,6 mg/mL) foi preparada conforme descrito em WOO2/0 81522, e utilizada nos experimentos após ser diluída com PBS (-) até 5 μ9/τη1.

4. Preparação dos Fármacos de Teste

Cada R2Klvl.7 (18,6 mg/mL) e R2KlvO (4,39 mg/ml foi diluído com PBS (-) até 4, 12, 40, 120 e 400 (pg/mL) ; IgGl humana foi adicionada a todas essas soluções diluídas para se obter uma concentração total de proteína de 400 μg/mL.

5. Agrupamento Grupo "branco" (GST) Grupo controle

Grupo de fármaco de teste R2Klvl .7 (1, 3, 10, 30, 100 μg/mL)

R2KlvO (1, 3, 10, 30, 100 μg/mL)

6. Experimentos de Adesão Celular

A todas as cavidades, com exceção das cavidades vazias ("blank"), de uma microplaca de 96 cavidades, adicionou- se 2 5 μΐϋ da solução de N-OPN GST-humana ou 25 μ1> da solução GST foi adicionada para o grupo branco, e a placa foi incubada a 37°C por 1 hora, após o que a placa foi lavada duas vezes com PBS (-). 50 μΐ da solução PMA foram 2 5 adicionados, e a placa incubada a 37°C por 3 0 minutos, após o que adicionou-se 25μ1> da solução de fármaco de teste (grupo fármaco de teste) ou a solução de IgGl humana (grupo branco e grupo controle). Células Jurkat E6.1 foram suspensas no tampão de adesão para se obter uma densidade celular de 2xl06 células/mL, e 25 μΐί foram adicionados em todas as cavidades. A suspensão foi centrifugada a 15xg por 1 minuto para precipitar as células no fundo da placa, após o que a placa foi incubada a 3 7°C por 1 hora. Concluída a reação, a placa foi invertida e centrifugada a 47xg por 2 minutos, e o sobrenadante (células não aderentes) removido. Para a quantificação da contagem de célula aderente, 25 μΐϋ da solução corante CV foram adicionados, a placa foi deixada repousar à temperatura ambiente por 10 minutos para corar e fixar as células, após o que a placa foi lavada com água pura três vezes, 25 μΐι de solução Triton-XlOO a 1% foram adicionados a todas as cavidades, e em seguida confirmou-se a solubilização das células, a absorbância (medição do comprimento de onda 595 nm) foi medida utilizando um leitor de microplacas (SPECTRAmax2 5 0, Molecular Devices). 7. Análise

Os experimentos empregaram 5 cavidades por grupo. 0 valor médio de absorbância e a taxa de supressão para cada grupo foram calculados, bem como os valores IC50 (concentrações de fármaco teste para uma taxa de supressão de 50%) . A taxa de supressão para o grupo "branco" foi definida como 100% e a do grupo controle como 0%. Os valores IC50 foram calculados plotando-se a concentração logarítmica de fármaco teste sobre o eixo X e a taxa de supressão sobre o eixo Y e aplicando os dados a uma equação de regressão linear pelo método dos quadrados mínimos. Os cálculos dos valores IC50 empregaram dados obtidos a concentrações de fármaco teste mostrando uma relação dose-resposta linear. Dos resultados mostrados na Figura 11, fica entendido que o efeito inibidor de adesão celular de um anticorpo humanizado de OPN anti-humana comumente conhecido é extremamente baixo, ao passo que o R2Klvl.7 possui um excelente efeito inibidor de adesão celular (valor IC50:6,4) .

(10. Efeitos de R2Klvl.7 sobre artrite induzida por colágeno em macaco cinomolgo).

Colágeno bovino tipo II (Collagen Gijyutsu Kenshukai) em emulsão em adjuvante completo de Freund (Becton Dickinson and Company). foi imunizado no dorso e na cauda de macacas cinomolgo 36 dias antes da medicação, e um reforço foi administrado 15 dias antes da medicação. Os animais foram randomizados em três grupos tratados com medicação (n=10) com base nas alterações percentuais de peso corporal e área oblonga de articulação intefalangeana proximal em comparação com os níveis de pré-imunização. R2Klvl.7 ou controle de solvente foi administrado a uma dose de 25 mg/kg ou 50 mg/kg através de inj eção intravenosa uma vez por semana, totalizando 8 vezes. O primeiro dia da medicação foi definido como dia 0. Nos dias 0, 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48 e 55 durante o período de administração, como sinal de inchaço articular, a área oblonga de articulação interfalangeana proximal foi monitorada. Os eixos maior e menor das articulações interfalangeanas proximais das pernas anteriores e posteriores foram medidas utilizando calibradores, as áreas oblongas calculadas, e o valor médio das áreas oblongas de 16 dedos utilizado como a área oblonga de articulação interfalangeana proximal. As alterações percentuais na área oblonga de articulação interfalangeana proximal foram calculadas em relação ao valor de pré-medicação como 100. No dia 0, e nos dias 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48 e 55 (β dias após medicação) , o plasma foi coletado, e medidos os anticorpos R2Klvl.7 e anti-R2Klvl.7. Essa concentração medida de R2Klvl.7 no plasma corresponde ao nível mais baixo ("nível de vale") . A análise de dados foi conduzida após deletar os dados sobre animais positivos para anticorpo anti-R2Klvl.7 e animais que morreram durante o período de estudo.

No 1 animal no grupo R2Klvl.7 à dose de 25 mg/kg e em 4 animais no grupo R2Klvl.7 ã dose de 50 mg/kg, o anticorpo anti-R2Klvl.7 foi gerado. Dois animais no grupo controle 3 0 de solvente, 2 animais no grupo R2Klvl.7 à dose de 25 mg/kg, e 1 animal no grupo R2Klvl.7 à dose de 50 mg/kg morreram após a medicação. Os casos de morte foram atribuídos à debilidade geral causada por inflamação grave. 0 tratamento com 50 mg/kg de R2Klvl.7 reduziu significativamente o inchaço nos pés medido pela alteração percentual na área oblonga de articulação interfalangeana proximal em comparação com o grupo controle de solvente entre o dia 27 e o dia 55 (Figura 12) . R2Klvl. 7 a uma dose de 25 mg/kg não teve efeito significativo sobre a alteração na área oblonga de articulação interfalangeana proximal. A doses de 25 mg/kg e 50 mg/kg, as concentrações plasmãticas mais baixas de R2Klvl.7 foram de 38,41 a 76,13 μ9/πι1 e 73,91 a 125,3 μ9/Γη1, respectivamente. A seqüência SWYGLR de OPN humana, ao contrário da seqüência correspondente de OPN de macaco (SVAYGLR) (SEQ ID NO:11), a afinidade de ligação de R2Klvl. 7 para esse peptídeo de OPN humana é mais de 100 vezes maior do que a afinidade de ligação para o peptídeo de OPN de macaco correspondente. Com esses achados em mente, a concentração plasmática efetiva de R2Klvl.7 no tratamento da artrite é estimada em mais de 100 μ9/τη1.

(11. Preparação de scFv de R2Klvl.l).

Através de PCR com o plasmídeo de expressão de cadeia pesada acima descrito tendo R2K1.VH1.7 e plasmídeo de expressão de cadeia leve tendo R2K1-VLl.7 como padrões,

2 0 preparou-se um fragmento de DNA que codifica um fragmento

de região variável de fita única (scFv) tendo a estrutura de VHl.7-ligante-VLl.7 (o ligante era a seqüência base que codifica a seqüência de aminoácido mostrada por GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:14). Adicionada na extremidade deste fragmento de DNA encontra-se uma seqüência reconhecida pelas endonucleases de restrição SfiI e NotI. Esse fragmento de DNA foi digerido com as endonucleases de restrição SfiI e NotI, e inserido no sítio SfiI e no sítio NotI do vetor ρCANTAB5E (Marks, J.D., et al. ,

3 0 J.Mol.Biol., vol.22 2 , p581-97, 1991), também previamente

digerido com SfiI e NotI, por meio do qual um plasmídeo de expressão scFv de R2K1-VH1.7 foi preparado. Neste plasmídeo de expressão, uma seqüência base que codifica E-Tag é adicionada a j usante da região codifiçadora de scFv. Esse plasmídeo foi introduzido na cepa HB2151 de Escherichia coli de acordo com um método convenconal e semeado numa placa de agar SOBAG (uma placa SOB contendo glicose a 2% e 100 μ9/πι1 de ampicilina) para produzir um clone transformante. Do clone obtido, extraiu-se um DNA de plasmídeo; a seqüência da região codificadora de scFv foi confirmada por análise de seqüência base de DNA, tendo o DNA de plasmídeo como padrão. A análise de seqüência base de DNA empregou o FTCS-Quick Start Kit e o sistema de Análise de DNA CEQ2 0 00XL (ambos da Beckman Coulter, K.K.). A seqüência base obtida é mostrada pela SEQ ID NO:9.

Após o clone de Escherichia coli, cuja seqüência base foi confirmada, ser cultivado utilizando um meio 2xYT contendo glicose a 2% e 100 μg/ml de ampicilina, uma porção do mesmo foi suspensa num meio 2xYT suplementado com 1 mM IPTG e 100 μg/ml de ampicilina, e também cultivado da noite para o dia para induzir a expressão de scFv. Concluído o cultivo, as células foram recuperadas por centrifugação, suspensas num PBS contendo ImM EDTA, e deixadas repousar em gelo por 30 minutos. Em seguida, a suspensão foi centrifugada a 10.000 rpm por 15 minutos, e o sobrenadante recuperado e filtrado em filtro de 0,45 μπι, por meio do que obteve-se uma fração de periplasma contendo scFv. 0 scFv de R2klvl.7 (adiante designado R2Klvl.7-scFv) foi purificado dessa fração de periplasma através de cromatografia de afinidade utilizando anticorpo anti-E-Tag.

0 R2Klvl.7-scFv assim preparado foi submetido a cromatografia de filtração em gel; do padrão de separação mostrado na Figura 13, confirmou-se que quase todo ele era monomérico.

(12. Confirmação de atividade de ligação de R2Klvl.7-scFv a peptídeo de osteopontina humana) .

A atividade de ligação de R21Klvl.7-scFv ao peptídeo hOPN5 foi medida através do método ELISA. O método foi geralmente o mesmo descrito acima; nessa medição, o anticorpo anti-E-Tag marcado com HRP foi usado como o anticorpo marcado. Os resultados constam da Figura 14. Confirmou-se que o R2Klvl.7-scFv purificado não se ligou ao BSA de controle negativo, ligando-se, porém, especificamente ao peptídeo hOPN5.

{13. Preparação de fragmento de anticorpo modificado com polietileno glicol).

Após o anticorpo R2Klvl.7 ser pepsinizado através de um método padrão, F (ab')2 purificado foi obtido utilizando uma coluna HP de Proteína G (ambos da Amersham Biosciences K.K.) e Coluna de alta resolução HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 (Amersham Biosciences

Κ.K.).Posteriormente, o F(ab')2 purificado, foi reduzido com 0, IM DTT para ativar o grupo tiol, após o que foi realizada filtração em gel utilizando uma coluna Sephadex G-25 (Amersham Biosciences K.K.) para remover o DTT. 0 Fab' assim obtido foi misturado com polietileno glicol maleimidado SUNBRIGHT ME-120MA (NO F Corporation) numa razão molar de 1:10, e deixado repousar a 4°C da noite para o dia para causar uma reação de acoplamento. Após iodoacetamida (Nacalai Tesque) ser adicionada para interromper a reação de acoplamento, um F (ab')2 modificado com polietileno glicol (adiante também designado F(ab')2-PEG) foi obtido através de filtração em gel utilizando uma coluna de alta resolução HiPrep 16/60 Sephacryl S-200. Os resultados de SDS-PAGE são mostrados na Figura 15. Através de uma comparação com F (ab')2 submetido â eletroforese para controle de referência, confirmou-se um aumento no peso molecular através da modificação com polietileno glicol.

(14. Confirmação de atividade de ligação de F(ab')2-PEG a peptídeo de osteopontina). 3 0 A atividade de ligação do F (ab') 2-PEG purificado de R2Klvl.7 ao peptídeo hOPN5 foi confirmada utilizando ensaio de ressonância plasmônica de superfície. 0 peptídeo de hOPN5 biotinizado foi imobilizado sobre Sensor Chip SA (BIAcore Company) e sua atividade de ligação confirmada utilizando-se F(ab')2-PEG, previamente diluído a 5 μg/ml com tampão HBS-EP (BIAcore Company); os resultados são mostrados na Figura 16. Devido a um aumento no sinal, confirmou-se que esse F(ab^)2-PEG tem a mesma atividade de ligação ao peptídeo hOPN5 do R2Klvl.7. Aplicabilidade Industrial

Pelo fato de o anticorpo humanizado de osteopontina anti- humana da presente invenção ser excelente quanto às atividades (atividade de ligação a antígeno, atividade inibidora de migração de leucócitos e análogos) e/ou estabilidade (resistência ao calor, condições de baixo pH, desnaturantes e similares) , ele é útil como um fármaco mais eficaz do que os anticorpos convencionais de osteopontina anti-humana na prevenção ou tratamento de diversas doenças inflamatórias, inclusive doença autoimune, reumat ismo, artrite reumatóide, e osteoartrite.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com ênfase nas concretizações preferidas, é evidente para os habilitados na técnica que as concretizações preferidas podem ser modificadas. A presente invenção pode ser concretização através de métodos que não os descritos em 2 0 detalhes no presente relatório. Conseqüentemente, a presente invenção abrange todas as modificações contidas na essência e escopo das reivindicações em anexo. O presente pedido baseia-se no pedido de patente No. 2006-152892 depositado no Japão, cu j o conteúdo é aqui incorporado por referência. Além disso, os conteúdos descritos em qualquer publicação aqui citada, inclusive patentes e pedidos de patente, são aqui incorporados por referência, em sua totalidade, na medida em que forem descritos. LISTAGEM DAS SEQUENCIAS

<110> Astellas Pharma Inc.

Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute

<12 O > " ANTICORPO HUMANIZADO DA OSTEOPONTINA ANTI-HUMANA, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO HUMANIZADO DE OSTEOPONTINA ANTI- HUMANA, FÁRMACO TERAPÊUTICO, MÉTODO PARA PREVENIR OU TRATAR DOENÇA AUTOIMUNE E USO DO ANTICORPO HUMANIZADO DE OSTEOPONTINA ANTI-HUMANA" .

<13 0> 091084

<150> JP 2006-152892 <151> 2006-05-31

<160> 27

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 116

<212 > PRT

<213 > Artificial

<22 0>

<223> Constructo sintético <4 00> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala 1 5

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Leu

25

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro

40

Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly 50 55

Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

30

Val His Gly Leu Glu Trp Ile 45

Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala

65 70

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser

85

Thr Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp

100

Thr Val Ser Ser 115

Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

75 80

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

90 95

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 105 110

<210> 2

<211> 116

<212 > PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400 > 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His 35 Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu 40 45 Glu Trp Ile Gly Ala 50 Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 55 60 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 90 Tyr Tyr 95 Cys Thr Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser 115 Ser

<210 > 3

<211> 113

<212 > PRT

<213 > Artificial

<22 0> <223 >

Constructo sintético <400> 3 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 4 <211 > 113 <212 > PRT <213 > Artificial <22 0> <223 > Constructo sintético <4 00> 4 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg <210> 5

<211> 348

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Região R2K1-VH1.7 <220 >

<221> CDS

<222> (1) . . (348)

<400> 5

cag gtg cag ctg cag cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15

tcc gtg aag gtc tcc tgc aag gct ttg ggg tat acc ttc act gac tat 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

25 30

gaa atg cac tgg gtg aag cag acc cct gta cat ggg ctt gag tgg att 144 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

40 45

gga gct att cat cca gga aga ggt ggt act gcc tac aat cag aag ttc 192 Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

aag ggc aag gcc acg ctg acc gcg gac aaa tcc act agt aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

atg gag ctg age age ctg aca tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

aca aga att act ggg tac ttc gat gtc tgg ggg caa ggg acc acg gtc 336 Thr Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

acc gtc tcc tca 348

Thr Val Ser Ser 115

<210> 6

<211> 348

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220 > <223> Região R2K1-VH1.8

<22 0>

<221> CDS

<222> (1) . . (348)

<40 0> 6

cag gtg cag ctg gtg cag Gln Val Gln Leu Val Gln 1 5

tcc gtg aag gtc tcc tgc Ser Val Lys Val Ser Cys 20

gaa atg cac tgg gtg aag

Glu Met His Trp Val Lys 35

gga gct att cat cca gga

Gly Ala Ile His Pro Gly 50

aag ggc aag gcc acg ctg Lys Gly Lys Ala Thr Leu 65 70

atg gag ctg age age ctg Met Glu Leu Ser Ser Leu 85

aca aga att act ggg tac Thr Arg Ile Thr Gly Tyr

100

acc gtc tcc tca Thr Val Ser Ser 115

tet ggg gct gag ctg gtg Ser Gly Ala Glu Leu Val 10

aag gct tet ggg tat acc Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

25

cag acc cct gta cat ggg

Gln Thr Pro Val His Gly 40

aga ggt ggt act gcc tac Arg Gly Gly Thr Ala Tyr 55 60

acc gcg gac aaa tcc act Thr Ala Asp Lys Ser Thr 75

aca tet gag gac acg gcc Thr Ser Glu Asp Thr Ala

90

ttc gat gtc tgg ggg caa Phe Asp Val Trp Gly Gln 105

agg cct ggg tcc 48 Arg Pro Gly Ser

15

ttc act gac tat 96 Phe Thr Asp Tyr

30

ctt gag tgg att 144 Leu Glu Trp Ile 45

aat cag aag ttc 192 Asn Gln Lys Phe

agt aca gcc tac 240 Ser Thr Ala Tyr

80

gtg tat tac tgt 288 Val Tyr Tyr Cys

95

ggg acc acg gtc 336 Gly Thr Thr Val 110

348

<210> 7

<211> 339

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> Região R2K1-VL1.7 <22 0>

<221> CDS

<222> (1) . . (339) <400> 7

gat gtt gtg atg act cag Asp Val Val Met Thr Gln 1 5

cag ccg gcc tcc ate tcc Gln Pro Ala Ser Ile Ser 20

aat gga aac acc tat ttg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

35

cca cag ctc ctg ate tat Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

50

gac aga ttc age ggc agt Asp Arg Phe Ser Gly Ser 65 70

age agg gtt gaa gct gaa Ser Arg Val Glu Ala Glu 85

tca cat gtt ccg ctc acg Ser His Val Pro Leu Thr

100

cgt Arg

tet cca ctc tcc ctg Ser Pro Leu Ser Leu

10

tgc agg age tet caa Cys Arg Ser Ser Gln

25

gaa tgg tac ctg cag Glu Trp Tyr Leu Gln

40

aaa gtt tcc aac cga Lys Val Ser Asn Arg

55

ggg tca ggc act gat Gly Ser Gly Thr Asp 75

gac gtc gga gtt tat Asp Val Gly Val Tyr

90

ttt ggc cag ggg acc

Phe Gly Gln Gly Thr 105

age gtc acc ctt gga 48 Ser Val Thr Leu Gly 15

age att gta cat agt 96 Ser Ile Val His Ser

30

aag cca ggg cag tet 144 Lys Pro Gly Gln Ser

45

ttt tet ggg gtc cca 192 Phe Ser Gly Val Pro

60

ttc aca ctg aaa ate 240 Phe Thr Leu Lys Ile

80

tac tgc ttt caa ggt 288 Tyr Cys Phe Gln Gly 95

aag ctg gag ate aaa 33 6 Lys Leu Glu Ile Lys

110

339

<210 > 8

<211> 339

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Região R2K1-VL1.8

<22 0>

<221> CDS

<222> (1) . . (339)

<4 00 > 8

gat gtt gtg atg act cag tet cca ctc tcc ctg ccc gtc acc ctt gga 48

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

10 15

cag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg age tet caa age att gta cat agt 96

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 25 30 aat gga aac acc tat ttg gaa tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

40 45

cca cag ctc ctg ate tat aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca 192 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

gac aga ttc age ggc agt ggg tca ggc act gat ttc aca ctg aaa ate 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

age agg gtt gaa gct gaa gac gtc gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

tca cat gtt ccg ctc acg ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate aaa 336 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

cgt 339

Arg

<210> 9

<211> 732

<212 > DNA

<213 > Artificial

<22 0>

<223 > R2Klvl.7-scFv <400> 9

caggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag tcctgcaagg ctttggggta taccttcact cctgtacatg ggcttgagtg gattggagct aatcagaagt tcaagggcaa ggccacgctg atggagctga gcagcctgac atctgaggac gggtacttcg atgtctgggg gcaagggacc tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga tccctgagcg tcacccttgg acagccggcc gtacatagta atggaaacac ctatttggaa cagctcctga tctataaagt ttccaaccga agtgggtcag gcactgattt cacactgaaa gtttattact gctttcaagg ttcacatgtt gagatcaaac gt

gtgaagaagc ctggggcctc cgtgaaggtc 60 gactatgaaa tgcactgggt gaagcagacc 120 attcatccag gaagaggtgg tactgcctac 180 accgcggaca aatccactag tacagcctac 240 acggccgtgt attactgtac aagaattact 300 acggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt 360 tcggatgttg tgatgaccca gtctccactc 420 tccatctcct gcaggagctc tcaaagcatt 480 tggtacctgc agaagccagg gcagtctcca 540 ttttctgggg tcccagacag attcagcggc 600 atcagcaggg ttgaagctga agacgtcgga 660 ccgctcacgt ttggccaggg gaccaagctg 720

732

<210> 10

<211> 7

<212 > PRT

<213 > Artificial <22 0>

<223> Peptídeo parcial de osteopontina humana ou de porco <400> 10

Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5

<210 > 11

<211> 7

<212 > PRT

<213 > Artificial

<22 0>

<223> Peptídeo parcial de osteopontina de macaco

<400 > 11

Ser Val Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5

<210 > 12

<211> 7

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> Peptídeo parcial de osteopontina de camundongo ou rato

<400> 12

Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 13

<211> 18

<212 > PRT

<213 > Artificial

<22 O >

<223> Peptídeo parcial de osteopontina

<4 O O > 13

Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu 10 15

Arg Ser

<210 > 14

<211> 15

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> Ligante <4 00> 14

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 10 15

<210> 15

<211> 441

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> R2K1-VH1.7 descrito na Fig.l <22 0 >

<221> CDS

<222> (20) . . (424)

<4 00 > 15

cagcaagctt gccgccacc atg gaa tgg age tgg ate ttt ctc ttc ctc ctg 52

Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu 10

tca gta act gea ggt gtc caa tcc cag gtg cag ctg cag cag tet ggg 100 Ser Val Thr Ala Gly Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

20 25

gct gag gtg aag aag cct ggg gcc tcc gtg aag gtc tcc tgc aag gct 148 Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala

35 40

fct9 999 tat acc ttc act gac tat gaa atg cac tgg gtg aag cag acc 196 Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr

45 50 55

.cct gta cat ggg ctt gag tgg att gga gct att cat cca gga aga ggt 244 Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly 60 65 70 75

ggt act gcc tac aat cag aag ttc aag ggc aag gcc acg ctg acc gcg 2 92 Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala

80 85 90

gac aaa tcc act agt aca gcc tac atg gag ctg age age ctg aca tet 340 Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser

95 100 105

gag gac acg gcc gtg tat tac tgt aca aga att act ggg tac ttc gat 388 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp

110 115 120

gtc tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca ggtgagtgga 434

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 125 130 135

tccgcga 441

<210 > 16

<211> 135

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> Constructo sintético

<400> 16 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu 1 5 Val Gln Ser Gln 20 Val Gln Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 35 40 Thr Asp 50 Tyr Glu Met His Trp 55 Val Glu Trp Ile Gly Ala Ile His Pro 65 70 Gln Lys Phe Lys Gly 85 Lys Ala Thr Thr Ala Tyr Met 100 Glu Leu Ser Ser Tyr Tyr Cys 115 Thr Arg Ile Thr Gly 120 Thr Thr 130 Val Thr Val Ser Ser 135

Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

15

Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 30

Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe 45

Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu

60

Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn

75 80

Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser

90 95

Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 105 110

Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 125

<210 > 17

<211> 441

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> R2Kl-VHl.8 descrito na Fig.2 <22 0>

<221> CDS

<222> (20) . . (424)

<4 00> 17

cagcaagctt gccgccacc atg gaa tgg age tgg ate ttt ctc ttc ctc ctg 52

Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu 10

tca gta act gea ggt gtc caa tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg 100 Ser Val Thr Ala Gly Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 15 20 25 gct gag ctg gtg agg CCt ggg tcc tcc gtg aag gtc tcc tgc aag gct 148 Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 30 35 40 tct ggg tat acc ttc act gac tat gaa atg cac tgg gtg aag cag acc 196 Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr

45 50 55 cct gta cat ggg ctt gag tgg att gga Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly 60 65

ggt act gcc tac aat cag aag ttc aag Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 80

gac aaa tcc act agt aca gcc tac atg Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 95 100

gag gac acg gcc gtg tat tac tgt aca Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

110 115

gtc tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

125 130

tccgcga

gct att cat cca gga aga ggt 244 Ala Ile His Pro Gly Arg Gly

70 75

ggc aag gcc acg ctg acc gcg 2 92 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala 85 90

gag ctg age age ctg aca tet 340 Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser 105

aga att act ggg tac ttc gat 388 Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp

120

gtc tcc tca ggtgagtgga 434

Val Ser Ser

135

441

<210> 18

<211> 135

<212 > PRT

<213> Artificial

<22 0>

<223 > Constructo sintético <400 > 18 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 19

<211> 455

<212 > DNA

<213 > Artificial

<22 0>

<223> R2K1-VL1.7 descrito na Fig.3 <22 0 >

<221> CDS

<222 > (20) . . (415)

<4 00> 19

cagcaagctt gccgccacc atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg 52

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met 10

ttc tgg att cct gct tcc age agt gat gtt gtg atg act cag tet cca 100 Phe Trp Ile Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro

20 25

ctc tcc ctg age gtc acc ctt gga cag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg 148 Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg

35 40

age tet caa age att gta cat agt aat gga aac acc tat ttg gaa tgg 196 Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp

45 50 55

tac ctg cag aag cca ggg cag tet cca cag ctc ctg ate tat aaa gtt 244 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val 60 65 70 75

tcc aac cga ttt tet ggg gtc cca gac aga ttc age ggc agt ggg tca 2 92 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

80 85 90

ggc act gat ttc aca ctg aaa ate age agg gtt gaa gct gaa gac gtc 340 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

95 100 105

gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt tca cat gtt ccg ctc acg ttt ggc 388 Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly

110 115 120

cag ggg acc aag ctg gag ate aaa cgt gagtagaatt taaactttgc 435

Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

125 130

ttcctcagtt ggatccgcga 455 <210> 20

<211> 132

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220 >

<223> Constructo sintético

<400 > 20

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val

25 30

Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile

40 45

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg 130

<210 > 21

<211> 455

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220 >

<223 > R2K1-VL1.8 descrito na Fig.4 <220 >

<221> CDS

<222> (20) . . (415)

<400 > 21 cagcaagctt gccgccacc atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg 52

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met 10

ttc tgg att cct gct tcc age agt gat gtt gtg atg act cag tet cca 100 Phe Trp Ile Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro

20 25

ctc tcc ctg ccc gtc acc ctt gga cag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg 148 Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg

35 40

age tet caa age att gta cat agt aat gga aac acc tat ttg gaa tgg 196 Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp

45 50 55

tac ctg cag aag cca ggg cag tet cca cag ctc ctg ate tat aaa gtt 244 Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val 60 65 70 75

tcc aac cga ttt tet ggg gtc cca gac aga ttc age ggc agt ggg tca 2 92 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

80 85 90

ggc act gat ttc aca ctg aaa ate age agg gtt gaa gct gaa gac gtc 340 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val

95 100 105

gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt tca cat gtt ccg ctc acg ttt ggc 3 88 Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly

110 115 120

caS S<39 acc aag ctg gag ate aaa cgt gagtagaatt taaactttgc 435

Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

125 130

ttcctcagtt ggatccgcga 455

<210> 22

<211> 132

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220 >

<223> Constructo sintético

<400 > 22

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 10 15

Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val

25 30

Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile

40 45

Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg 130

<210> 23

<211> 314

<212 > PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 23

Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala 10 15

Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu

25 30

Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro

40 45

Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu

50 55 60

Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu 65 70 75 80

Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His

85 90 95

Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp

100 105 110

Asp Thr Asp Asp Ser His Gln Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Glu

115 120 125

Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu

130 135 140

Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly 145 150 155 160

Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg

165 170 175

Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His

180 185 190

Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala

195 200 205

Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser 210 215 220

Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His

225 230 235 240

Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu

245 250 255 His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu

260 265 270

Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Glu Asp Met Leu Val Val Asp

275 280 285

Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg Ile Ser His

290 295 300

Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn 305 310

<210> 24

<211> 1338

<212 > DNA

<213 > Artificial

<22 0 >

<223> Cadeia R2Klvl.7 H

<220 >

<221> GDS <222> (1) . . (1338)

<400> 24 cag gtg cag ctg cag Gln Val Gln Leu Gln 1 5

tcc gtg aag gtc tcc Ser Val Lys Val Ser 20

gaa atg cac tgg gtg

Glu Met His Trp Val 35

gga gct att cat cca Gly Ala Ile His Pro

50

aag ggc aag gcc acg Lys Gly Lys Ala Thr

65

atg gag ctg age age Met Glu Leu Ser Ser 85

aca aga att act ggg Thr Arg Ile Thr Gly

100

acc gtc tcc tca gcc Thr Val Ser Ser Ala 115

cag tet ggg gct

Gln Ser Gly Ala

tgc aag gct ttg Cys Lys Ala Leu

25

aag cag acc cct Lys Gln Thr Pro

40

gga aga ggt ggt Gly Arg Gly Gly 55

ctg acc gcg gac Leu Thr Ala Asp

70

ctg aca tet gag Leu Thr Ser Glu

tac ttc gat gtc Tyr Phe Asp Val

105

tcc acc aag ggc Ser Thr Lys Gly 120

gag gtg aag aag Glu Val Lys Lys

10

ggg tat acc ttc Gly Tyr Thr Phe

gta cat ggg ctt Val His Gly Leu 45

act gcc tac aat Thr Ala Tyr Asn

60

aaa tcc act agt Lys Ser Thr Ser

75

gac acg gcc gtg Asp Thr Ala Val

90

tgg ggg caa ggg Trp Gly Gln Gly

cca tcg gtc ttc Pro Ser Val Phe 125

cct ggg gcc 48 Pro Gly Ala 15

act gac tat 96 Thr Asp Tyr

30

gag tgg att 144 Glu Trp Ile

cag aag ttc 192 Gln Lys Phe

aca gcc tac 240 Thr Ala Tyr

80

tat tac tgt 288 Tyr Tyr Cys

95

acc acg gtc 336 Thr Thr Val

110

ccc ctg gea 384 Pro Leu Ala ccc tcc tcc aag age Pro Ser Ser Lys Ser

130

gtc aag gac tac ttc Val Lys Asp Tyr Phe

145

gcc ctg acc age ggc Ala Leu Thr Ser Gly

165

gga ctc tac tcc ctc Gly Leu Tyr Ser Leu

180

ggc acc cag acc tac Gly Thr Gln Thr Tyr

195

aag gtg gac aag aaa Lys Val Asp Lys Lys

210

tgc cca ccg tgc cca Cys Pro Pro Cys Pro

225

ctc ttc ccc cca aaa Leu Phe Pro Pro Lys

245

gag gtc aca tgc gtg

Glu Val Thr Cys Val 260

aag ttc aac tgg tac Lys Phe Asn Trp Tyr

275

aag ccg cgg gag gag Lys Pro Arg Glu Glu

290

ctc acc gtc ctg cac Leu Thr Val Leu His

305

aag gtc tcc aac aaa Lys Val Ser Asn Lys 325

aaa gcc aaa ggg cag Lys Ala Lys Gly Gln

340

tcc cgg gat gag ctg Ser Arg Asp Glu Leu

355

aaa ggc ttc tat ccc Lys Gly Phe Tyr Pro

370

cag ccg gag aac aac Gln Pro Glu Asn Asn 385

acc tet ggg ggc aca gcg Thr Ser Gly Gly Thr Ala

135

ccc gaa ccg gtg acg gtg Pro Glu Pro Val Thr Val 150 155

gtg cac acc ttc ccg gct Val His Thr Phe Pro Ala 170

age age gtg gtg acc gtg

Ser Ser Val Val Thr Val 185

ate tgc aac gtg aat cac Ile Cys Asn Val Asn His

200

gtt gag ccc aaa tet tgt Val Glu Pro Lys Ser Cys

215

gea cct gaa ctc ctg ggg Ala Pro Glu Leu Leu Gly 230 235

ccc aag gac acc ctc atg Pro Lys Asp Thr Leu Met 250

9t9 9fc9 9ac 9^9 a9c cac

Val Val Asp Val Ser His 265

gtg gac ggc gtg gag gtg

Val Asp Gly Val Glu Val 280

cag tac aac age acg tac Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

295

cag gac tgg ctg aat ggc Gln Asp Trp Leu Asn Gly 310 315

gcc ctc cca gcc ccc ate Ala Leu Pro Ala Pro Ile 330

ccc cga gaa cca cag gtg Pro Arg Glu Pro Gln Val

345

acc aag aac cag gtc age Thr Lys Asn Gln Val Ser

360

age gac ate gcc gtg gag Ser Asp Ile Ala Val Glu

375

tac aag acc acg cct ccc Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 390 395

gcc ctg ggc tgc ctg 432 Ala Leu Gly Cys Leu

140

tcg tgg aac tca ggc 480 Ser Trp Asn Ser Gly

160

gtc cta cag tcc tca 528 Val Leu Gln Ser Ser

175

ccc tcc age age ttg 576 Pro Ser Ser Ser Leu

190

aag ccc age aac acc 624 Lys Pro Ser Asn Thr

205

gac aaa act cac aca 672 Asp Lys Thr His Thr

220

gga ccg tca gtc ttc 720 Gly Pro Ser Val Phe

240

ate tcc cgg acc cct 768 Ile Ser Arg Thr Pro

255

gaa gac cct gag gtc 816 Glu Asp Pro Glu Val 270

cat aat gcc aag aca 864 His Asn Ala Lys Thr

285

cgt gtg gtc age gtc 912

Arg Val Val Ser Val 300

aag gag tac aag tgc 960 Lys Glu Tyr Lys Cys

320

gag aaa acc ate tcc 1008 Glu Lys Thr Ile Ser

335

tac acc ctg ccc cca 1056 Tyr Thr Leu Pro Pro

350

ctg acc tgc ctg gtc 1104 Leu Thr Cys Leu Val

365

tgg gag age aat ggg 1152 Trp Glu Ser Asn Gly

380

gtg ctg gac tcc gac 1200 Val Leu Asp Ser Asp 400 ggc tcc ttc ttc ctc tac Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

405

cag cag ggg aac gtc ttc

Gln Gln Gly Asn Val Phe 420

aac cac tac acg cag aag Asn His Tyr Thr Gln Lys 435

age aag ctc acc gtg gac Ser Lys Leu Thr Val Asp

410

tca tgc tcc gtg atg cat Ser Cys Ser Val Met His

425

age ctc tcc ctg tet ccg Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440

aag age agg tgg 1248 Lys Ser Arg Trp 415

gag gct ctg cac 1296 Glu Ala Leu His

430

ggt aaa 1338

Gly Lys

445

<210> 25

<211> 446

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220 >

<223> Constructo sintético

<400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His 35 Trp Val Lys Gln Thr Pro 40 Val His Gly Leu 45 Glu Trp Ile Gly Ala Ile His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala 90 Val Tyr Tyr 95 Cys Thr Arg Ile Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser 115 Ser Ala Ser Thr Lys Gly 120 Pro Ser Val Phe 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser 180 Leu Ser Ser Val Val 185 Thr Val Pro Ser Ser 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val 210 Asp Lys Lys Val Glu 215 Pro Lys Ser Cys Asp 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys 245 Pro Lys Asp Thr Leu 250 Met Ile Ser Arg Thr 255 Pro Glu Val Thr Cys 260 Val Val Val Asp Val 265 Ser His Glu Asp Pro 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys 325 Ala Leu Pro Ala Pro 330 Ile Glu Lys Thr Ile 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp 355 Glu Leu Thr Lys Asn 360 Gln Val Ser Leu Thr 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn 420 Val Phe Ser Cys Ser 425 Val Met His Glu Ala 430 Leu His Asn His Tyr 435 Thr Gln Lys Ser Leu 440 Ser Leu Ser Pro Gly 445 Lys

<210> 26

<211> 657

<212> DNA

<213 > Artificial

<22 0>

<223> Cadeia R2Klvl.7 L <22 0>

<221> CDS

<222> (1) . . (657)

<400> 26

gat gtt gtg atg act cag tct cca etc tcc ctg age gtc acc ctt gga Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 10 15 cag ccg gcc tcc ate tcc Gln Pro Ala Ser Ile Ser

20

aat gga aac acc tat ttg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu

35

cca cag ctc ctg ate tat Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

50

gac aga ttc age ggc agt Asp Arg Phe Ser Gly Ser 65 70

age agg gtt gaa gct gaa

Ser Arg Val Glu Ala Glu 85

tca cat gtt ccg ctc acg Ser His Val Pro Leu Thr

100

cga act gtg gct gea cca Arg Thr Val Ala Ala Pro

115

cag ttg aaa tet gga act Gln Leu Lys Ser Gly Thr

130

tat ccc aga gag gcc aaa Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 145 150

tcg ggt aac tcc cag gag Ser Gly Asn Ser Gln Glu 165

acc tac age ctc age age Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

180

aaa cac aaa gtc tac gcc Lys His Lys Val Tyr Ala

195

ccc gtc aca aag age ttc Pro Val Thr Lys Ser Phe 210

tgc agg age tet caa Cys Arg Ser Ser Gln

25

gaa tgg tac ctg cag Glu Trp Tyr Leu Gln

40

aaa gtt tcc aac cga Lys Val Ser Asn Arg 55

ggg tca ggc act gat Gly Ser Gly Thr Asp

75

gac gtc gga gtt tat Asp Val Gly Val Tyr

90

ttt ggc cag ggg acc Phe Gly Gln Gly Thr 105

tet gtc ttc ate ttc

Ser Val Phe Ile Phe 120

gcc tet gtt gtg tgc Ala Ser Val Val Cys

135

gta cag tgg aag gtg Val Gln Trp Lys Val 155

agt gtc aca gag cag

Ser Val Thr Glu Gln 170

acc ctg acg ctg age Thr Leu Thr Leu Ser

185

tgc gaa gtc acc cat Cys Glu Val Thr His

200

aac agg gga gag tgt Asn Arg Gly Glu Cys 215

age att gta cat agt 96

Ser Ile Val His Ser 30

aag cca ggg cag tet 144 Lys Pro Gly Gln Ser

45

ttt tet ggg gtc cca 192

Phe Ser Gly Val Pro 60

ttc aca ctg aaa ate 240 Phe Thr Leu Lys Ile

80

tac tgc ttt caa ggt 288 Tyr Cys Phe Gln Gly

95

aag ctg gag ate aaa 336 Lys Leu Glu Ile Lys 110

ccg cca tet gat gag 384 Pro Pro Ser Asp Glu

125

ctg ctg aat aac ttc 432 Leu Leu Asn Asn Phe

140

gat aac gcc ctc caa 480 Asp Asn Ala Leu Gln

160

gac age aag gac age 528 Asp Ser Lys Asp Ser

175

aaa gea gac tac gag 576 Lys Ala Asp Tyr Glu

190

cag ggc ctg age tcg 624 Gln Gly Leu Ser Ser

205

657 <210> 27

<211> 219

<212 > PRT

<213 > Artificial

<22 0>

<223> Constructo sintético

<400> 27 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Ser 25 Ser Gln Ser Ile Val 30 His Ser Asn Gly Asn 35 Thr Tyr Leu Glu Trp 40 Tyr Leu Gln Lys Pro 45 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu 130 Lys Ser Gly Thr Ala 135 Ser Val Val Cys Leu 140 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln 165 Glu Ser Val Thr Glu 170 Gln Asp Ser Lys Asp 175 Ser Thr Tyr Ser Leu 180 Ser Ser Thr Leu Thr 185 Leu Ser Lys Ala Asp 190 Tyr Glu Lys His Lys 195 Val Tyr Ala Cys Glu 200 Val Thr His Gln Gly 205 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (13)

1. Anticorpo humanizado da osteopontina anti-humana, caracterizado pelo fato de compreender uma região variável de cadeia pesada consistindo da seqüência de aminoãcido mostrada pela SEQ ID NO:1 e uma região variável de cadeia leve consistindo da seqüência de aminoãcido mostrada pela SEQ ID NO:3.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação I7 caracterizado pelo fato de a região constante de cadeia pesada do anticorpo ser Igyl humana.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a região constante de cadeia leve do anticorpo ser IgK humana.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a região constante de cadeia pesada do anticorpo ser Igyl humana e a região constante de cadeia leve do anticorpo ser IgK humana.

5. Ant i corpo humani zado da os t eopont ina ant i-humana, caracterizado pel o fato de compreender uma cadeia pesada consistindo da seqüência de aminoãcido mostrada pela SEQ ID NO: 25 e uma cadeia leve consistindo da seqüência de aminoácido mostrada pela SEQ ID NO:27.

6. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência que codifica a região variável de cade ia pesada do ant icorpo humani zado de osteopont ina anti-humana, conforme definido na reivindicação 1.

7. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana, conforme definido na reivindicação 1.

8. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 e/ou 7.

9. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de incorporar o vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 8.

10. Método para produzir um anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 9, para permitir que a célula expresse o anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana.

11. Fãrmaco terapêutico, para doença autoimune, reumatismo, artrite reumatóide ou osteoartrite, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.

12. Método para prevenir ou tratar doença autoimune, reumatismo, artrite reumatóide ou osteoartrite, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo humanizado de osteopontina anti-humana, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.

13. Uso do anticorpo humanizado de osteopontina anti- humana, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser aplicado na manufatura de um fármaco para prevenir ou tratar doença autoimune, reumatismo, artrite reumatóide ou osteoartrite.